Аминотиазольные соединения в качестве ингибиторов протеинкиназ

Изобретение относится к соединению формулы (I) или к его фармацевтически приемлемой соли, где R₁ представляет собой C_1-6алкил; X представляет собой NR_a; Y представляет собой CR_bR_c или NR_d, в котором R_c представляет собой Н, N(CH₃)₂, R_b вместе с R_a, атомом углерода, связанным с R_b, и атомом азота, связанным с R_a, представляет собой пиперидинил и R_d вместе с R_a и атомами азота, связанными с R_d и R_a, представляет собой пиперазинил; R₂ представляет собой -CH₂CH₂R_e или NR_fR_g, в которой R_e представляет собой Н, галоген или OR_h и каждый из R_f и R_g представляет собой C_1-6 алкил, R_h представляет собой Н и R₃ представляет собой пиридил или пиримидинил. Изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения рака, ассоциированного с тирозинкиназой, на основе соединения формулы (I). Технический результат – получены новые соединения и фармацевтическая композиция на их основе, которые могут найти применение в медицине для лечения рака. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 5 пр., 1 табл.

 

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Протеинкиназы важны в клеточных путях передачи сигналов, которые регулируют различные клеточные функции, в том числе дифференцировку, пролиферацию, миграцию и апоптоз. Нарушение регуляции протеинкиназ вовлечено в развитие рака и ряда других заболеваний.

Тирозинкиназы, подкласс протеинкиназ, регулируют функционирование белка-мишени посредством переноса фосфата с АТФ на гидроксильную группу тирозина в белке-мишени. FMS-подобная тирозинкиназа 3 («FLT3»), рецептор фактора роста сосудистого эндотелия («VEGFR») и тирозиновая протеинкиназа Kit («с-Kit») представляют собой три тирозинкиназы, которые подверглись изучению в качестве привлекательных мишеней для терапевтического воздействия при лечении рака.

Мутации в FLT3, рецепторной тирозинкиназе, могут вести к развитию рака, например, острого миелоидного лейкоза. См. Pratz et al., Current Drug Targets, 2010, 11(7), 781-9.

При связывании с VEGFR и его активации посредством трансфосфорилирования фактор роста сосудистого эндотелия, сигнальный белок, стимулирует рост новых кровеносных сосудов. VEGFR идентифицировали как главный регулятор опухолевого ангиогенеза. См. Hicklin et al., J Clin Oncol, 2005, 23, 1011-1027.

c-Kit, также рецепторная тирозинкиназа, вовлечена во внутриклеточную передачу сигнала. Мутированная форма c-Kit играет решающую роль в возникновении некоторых разновидностей рака. Доказано, что ингибирование c-Kit является эффективным в лечении гастроинтестинальной стромальной опухоли, острого миелоидного лейкоза и меланомы. См. Babaei et al., DrugDesDevel Ther., 2016 10, 2443-2459.

Аминотиазольные соединения, всесторонне изучаемые как эффективные ингибиторы тирозинкиназ, имеют несколько проблем в качестве лекарственных средств-кандидатов. Они обладают слабой селективностью в отношении киназы, часто вызывают гибель животного в исследованиях токсичности, и, в целом, у них отсутствует достаточное воздействие in vivo для проявления желательной эффективности в доклинических или клинических исследованиях.

Существует потребность в разработке новых аминотиазольных соединений, которые специфически ингибируют определенные тирозинкиназы, демонстрируют желательные профили безопасности и проявляют достаточную эффективность in vivo в лечении являющихся их мишенями разновидностей рака.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение основывается на неожиданных открытиях, что определенные аминотиазольные соединения эффективно ингибируют несколько тирозинкиназ, например, FLT3, VEGFR и c-Kit.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к аминотиазольным соединениям формулы (I):

в которой R₁ представляет собой C_1-6 алкил или C_1-6 тиоалкил; X представляет собой О или NR_a, где R_a представляет собой Н или C_1-6 алкил; Y представляет собой CR_bR_c или NR_d, в котором каждый из R_b и R_c независимо представляет собой Н, галоген, C_1-6 алкил, C_1-6 алкоксил или амино, или R_b, вместе с R_a, атомом углерода, связанным с R_b, и атомом азота, связанным с R_a, представляет собой С_3-10 гетероциклоалкил и R_d представляет собой Н или C_1-6 алкил, или R_d, вместе с R_a и атомами азота, связанными с R_d и R_a, представляет собой С_3-10 гетероциклоалкил; R₂ представляет собой -CH₂CH₂R_e или NR_fR_g, в котором R_e представляет собой Н, галоген, C_1-6 алкил или OR_h и каждый из R_f и R_g независимо представляет собой C_1-6 алкил или С_3-8 циклоалкил, R_h представляет собой Н или C_1-6 алкил, или R_h, вместе с R_d, атомом кислорода, связанным с R_h, и атомом азота, связанным с R_d, представляет собой С_3-10 гетероциклоалкил; и R₃ представляет собой гетероарил.

Термин «алкил» в настоящем описании относится к насыщенному, неразветвленному или разветвленному углеводородному фрагменту, такому как -СН₃ или разветвленный -С₃Н₇. Термин «циклоалкил» относится к неароматическому, моноциклическом, бициклическому, трициклическому или тетрациклическому углеводородному фрагменту, такому как циклогексил, циклогексен-3-ил или адамантил. Термин «алкоксил» относится к -О-алкильному радикалу. Примеры алкоксила включают в себя без ограничения метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси и трет-бутокси. Термин «тиоалкил» относится к -S-алкильному радикалу. Примеры тиоалкила включают в себя без ограничения метилтиол, этилтиол и бензилтиол. Термин «гетероциклоалкил» относится к неароматическому, моноциклическому, бициклическому, трициклическому или тетрациклическому фрагменту, содержащему один или несколько кольцевых гетероатомов (например, N, О или S). Примеры гетероциклоалкила включают в себя без ограничения 4-морфолинил, 1-пиперазинил, 4-тетрагидропиранил и 4-пиранил. Термин «гетероарил» относится к фрагменту, содержащему одно или несколько ароматических колец, которые содержат по меньшей мере один гетероатом (например, N, О или S). Примеры гетероарильных фрагментов включают в себя фурил, фурилен, флуоренил, пирролил, тиенил, оксазолил, имидазолил, тиазолил, пиридил, пиримидинил, хиназолинил, хинолинил, изохинолил и индолил.

Алкил, тиоалкил, алкоксил, циклоалкил, гетероциклоалкил и гетероарил, упомянутые в настоящем изобретении, включают в себя как замещенные, так и не замещенные фрагменты, если не отмечено иное. Возможные заместители на циклоалкиле, гетероциклоалкиле и гетероариле включают в себя С_1-10 алкил, С_2-10 алкенил, С_2-10 алкинил, С_3-20 циклоалкил, С_3-20 циклоалкенил, С_1-20 гетероциклоалкил, С_1-20 гетероциклоалкенил, С_1-10 алкокси, арил, арилокси, гетероарил, гетероарилокси, амино, С_1-10 алкиламино, С_1-20 диалкиламино, ариламино, диариламино, гидроксил, галоген, тио, С_1-10 алкилтио, арилтио, С_1-10 алкилсульфонил, арилсульфонил, ациламино, аминоацил, аминотиоацил, амидино, гуанидин, уреидо, циано, нитро, ацил, тиоацил, ацилокси, карбоксил и сложные эфиры карбоновой кислоты. С другой стороны, возможные заместители на алкиле включают в себя все вышеуказанные заместители, за исключением С_1-10 алкила, С_2-10 алкенила и С_2-10 алкинила. Циклоалкил, гетероциклоалкил, арил и гетероарил также могут быть конденсированы друг с другом.

Аминотиазольные соединения, описанные выше, включают в себя соединения сами по себе, а также их соли, пролекарства и сольваты, если применимо. Соль, например, может быть образована между анионом и положительно заряженной группой (например, амино) на аминотиазольном соединении. Подходящие анионы включают в себя хлорид, бромид, йодид, сульфат, нитрат, фосфат, цитрат, метансульфонат, трифторацетат, ацетат, малат, тозилат, тартрат, фумарат, глутамат, глюкуронат, лактат, глутарат и малеат. Аналогичным образом, соль также может быть образована между катионом и отрицательно заряженной группой (например, карбоксилатом) на аминотиазольном соединении. Подходящие катионы включают в себя ион натрия, ион калия, ион магния, ион кальция и аммонийный катион, такой как ион тетраметиламмония. Аминотиазольные соединения также включают в себя такие соли, содержащие четвертичные атомы азота. Примеры пролекарств включают в себя сложные эфиры и другие фармацевтически приемлемые производные, которые после введения субъекту способны обеспечивать активные аминотиазольные соединения. Сольват относится к комплексу, образованному между активным аминотиазольным соединением и фармацевтически приемлемым растворителем. Примеры фармацевтически приемлемого растворителя включают в себя воду, этанол, изопропанол, этилацетат, уксусную кислоту и этаноламин.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к способу ингибирования тирозинкиназы, например, FLT3, VEGFR и c-Kit. Способ включает в себя обеспечение контакта тирозинкиназы с эффективным количеством одного или нескольких из вышеописанных аминотиазольных соединений.

В пределах объема настоящего изобретения также находится способ лечения рака, ассоциированного с тирозинкиназой. Способ включает в себя введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества одного или нескольких из аминотиазольных соединений формулы (I), описанной выше.

Тирозинкиназа, ассоциированная с раком, может представлять собой тирозинкиназу дикого типа или мутантную тирозинкиназу. Примеры тирозинкиназы включают в себя, без ограничения, FLT3, FLT4, VEGFR, рецептор фактора роста тромбоцитов (PDGFR) A, PDGFR В, c-Kit, c-Src (SRC), тирозиновую протеинкиназу Lyn (LYN) A, LYN В, перестроенную в ходе трансфекции тирозинкиназу (RET), тирозинкиназу лимфоцит-специфического белка, гомолог вирусного онкогена вируса саркомы кошек штамма Гарднер-Рашид, рецептор домена дискоидина 1, рецептор, содержащий домен вставки киназы, киназу В-лимфоцитов, тирозиновую протеинкиназу Yes, гомолог 1 вирусного онкогена вируса лейкоза мышей Абельсона (ABL1), тирозиновую протеинкиназу Tek, RET V804L, RET Y791F, FLT3 D835Y, PDGFR A V561D или ABL1 T315I.

В иллюстративном способе аминотиазольные соединения формулы (I) применяют для лечения рака, ассоциированного с FLT3, VEGFR или c-Kit.

Примеры рака включают в себя острый миелоидный лейкоз, хлорлейкоз, хронический миелогенный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, В-клеточную лимфому, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, миелодиспластический синдром, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак ободочной и прямой кишки, рак молочной железы, рак мужских половых путей, рак почки, печеночно-клеточный рак, рак легкого, рак яичника, рак шейки матки, рак матки, гестационную трофобластическую болезнь, рак желудка, рак желчного протока, рак желчного пузыря, рак тонкого кишечника, рак пищевода, рак ротоглотки, гипофарингеальный рак, рак глаза, рак нервной ткани, рак головы и шеи, меланому, плазмацитому, новообразование эндокринных желез, нейроэндокринный рак, опухоль головного мозга, рак кости и саркому (например, гастроинтестинальную стромальную опухоль или GIST).

Дополнительно в пределах объема настоящего изобретения представлены фармацевтическая композиция, содержащая одно или несколько из вышеописанных аминотиазольных соединений формулы (I). Фармацевтическая композиция может быть использована для лечения рака.

Настоящее изобретение также охватывает применение одного или нескольких вышеописанных аминотиазольных соединений формулы (I) для изготовления медикамента для лечения рака.

Термин «обработка» или «лечение» относится к введению одного или нескольких аминотиазольных соединений субъекту, у которого вышеописанное заболевание, т.е., рак, симптом такого заболевания или предрасположенность к такому заболеванию, с целью обеспечения терапевтического эффекта, например, для лечения, облегчения, изменения, поражения, улучшения состояния или предупреждения вышеописанного заболевания, его симптома или предрасположенности к нему. «Эффективное количество» относится к количеству активного соединения, которое необходимо для оказания терапевтического эффекта. Эффективные дозы будут варьировать, как признано специалистами настоящей области техники, в зависимости от типов заболевания, которое лечили, пути введения, применения вспомогательного вещества и возможности совместного применения с другим терапевтическим лечением.

Для практического осуществления способа по настоящему изобретению композиция, содержащая одно или несколько вышеописанных аминотиазольных соединений, может быть введена парентерально, перорально, назально, ректально, местно или буккально. Используемый в настоящем описании термин «паретнеральный» относится к подкожной, внутрикожной, внутривенной, интраперитонеальной, внутримышечной, внутрисуставной, внутриартериальной, интрасиновиальной, интрастернальной, интратекальной, внутриочаговой или внутричерепной инъекции, а также любой подходящей методике инфузии.

Стерильная инъекционная композиция может быть раствором или суспензией в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, таком как раствор в использованы, являются маннит, вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, жирные масла традиционно использовали в качестве растворителя или суспендирующей среды (например, синтетические моно- или диглицериды). Жирные кислоты, такие как масляная кислота и ее глицеридные производные, применимы при получении инъекционных растворов, как и природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло и касторовое масло, в частности в своих полиоксиэтилированных вариантах. Такие масляные растворы или суспензии также могут содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или диспергатор, карбоксиметилцеллюлозу или подобные диспергирующие средства. Другие традиционно используемые поверхностно-активные вещества, такие как доступности, которые традиционно использовали при изготовлении фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм, также могут быть применимы для состава.

Композиция для перорального введения может быть любой перорально приемлемой лекарственной формой, включая капсулы, таблетки, эмульсии и водные суспензии, дисперсии и растворы. В случае таблеток традиционно используемые носители включают в себя лактозу и кукурузный крахмал. Также типично добавляли смазывающие вещества, такие как стеарат магния. Для перорального введения в форме капсулы применимые разбавители включают в себя лактозу и высушенный кукурузный крахмал. При пероральном введении водных суспензий или эмульсий активный ингредиент может быть суспендирован или растворен в масляной фазе, объединенной с эмульгирующими или суспендирующими средствами. При необходимости могут быть добавлены определенные подсластители, ароматизаторы или красители.

Назальный аэрозоль или ингаляционная композиция могут быть получены согласно методикам, хорошо известным из области фармацевтического состава. Например, такая композиция может быть получена в виде раствора в солевом растворе с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, стимуляторов абсорбции для усиления биологической активности, фторуглеродов и/или других солюбилизирующих или диспергирующих средств, известных из области техники.

Композиция, содержащая одно или несколько вышеописанных аминотиазольных соединений, также может быть введена в форме суппозиториев для ректального введения.

Носитель в фармацевтической композиции должен быть «приемлемым» в том смысле, что он является совместимым с активным ингредиентом композиции (и предпочтительно, способен стабилизировать активный ингредиент) и не является вредным для субъекта, которого лечили. Один или несколько солюбилизирующих средств могут быть использованы в качестве фармацевтических наполнителей для доставки активного 1,5-дифенилпента-1,4-диен-3-онового соединения. Примеры других носителей включают в себя коллоидный оксид кремния, стеарат магния, целлюлозу, лаурилсульфат натрия и D&C Желтый №10.

Подробности одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения изложены в описании ниже. Другие признаки, объекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания или из формулы изобретения.

Подробное описание настоящего изобретения

Подробно раскрыты аминотиазольные соединения формулы (I):

в которой переменные R₁, R₂, R₃, X и Y определены в разделе краткого описания выше.

Как правило, соединение формулы (I) содержит R₃, который представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, замещенный одним или несколькими (CH₂)_nZ фрагментами независимо, в которых n представляет собой 0 или 1 и Z представляет собой Н, галоген, CN, ОН, CF₃, C_1-6 алкил или C_1-6 алкоксил; или содержит R₃, который представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, конденсированный с фенильным кольцом, замещенный одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из Н, галогена, CN, ОН, CF₃, C_1-6 алкила и C_1-6 алкоксила. Иллюстративные соединения содержат R₃, который представляет собой 6-членный гетероарил, замещенный одним или несколькими (CH₂)_nZ фрагментами независимо, в которых n представляет собой 0 или 1 и Z представляет собой Н, галоген, CN, ОН, CF₃, C_1-6 алкил или C_1-6 алкоксил. Двумя примерами R₃ являются пиридил и пиримидил.

Группой вышеописанных новых аминотиазольных соединений являются соединения формулы (II):

в которой R₁ представляет собой C_1-6 алкил.

В одной подгруппе соединения формулы (II) содержат X, который представляет собой О, Y, который представляет собой NR_d, и R₂, который представляет собой -CH₂CH₂R_e, в котором R_e представляет собой OR_h, R_h, вместе с R_d, атомом кислорода, связанным с R_h, и атомом азота, связанным с R_d, представляет собой С_3-10 гетероциклоалкил. Соединения такой подгруппы могут содержать R₃, который представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, замещенный одним или несколькими (CH₂)_nZ фрагментами независимо, в которых n представляет собой 0 или 1 и Z представляет собой Н, галоген, CN, ОН, CF₃, C_1-6 алкил или C_1-6 алкоксил; или представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, конденсированный с фенильным кольцом, замещенный одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из Н, галогена, CN, ОН, CF₃, C_1-6 алкила и C_1-6 алкоксила. Например, R₃ может быть пиридилом или пиримидилом. Иллюстративные соединения включают в себя без ограничения следующие соединения:

В другой подгруппе соединения формулы (II) содержат X, который представляет собой NR_a, и Y, который представляет собой CR_bR_c или NR_d, в котором R_a, вместе с R_b, атомом азота, связанным с R_a, и атомом углерода, связанным с R_b, представляет собой С_3-10 гетероциклоалкил; R_c представляет собой Н, галоген, C_1-6 алкил, C_1-6 алкоксил или амино; и R_a, вместе с R_a и атомами азота, связанными с R_a и R_d, представляет собой С_3-10 гетероциклоалкил.

Следует отметить, что такие соединения могут содержать X, который представляет собой NR_a, Y, который представляет собой CR_bR_c, и R₂, который представляет собой NR_fR_g, в котором R_a, вместе с R_b, атомом азота, связанным с R_a, и атомом углерода, связанным с R_b, представляет собой С_3-10 гетероциклоалкил; R_c представляет собой Н, галоген, C_1-6 алкил, C_1-6 алкоксил или амино; и каждый из R_f и R_g представляет собой C_1-6 алкил. Они типично содержат R₃, который представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, замещенный одним или несколькими (CH₂)_nZ фрагментами независимо, в которых n представляет собой 0 или 1 и Z представляет собой Н, галоген, CN, ОН, CF₃, C_1-6 алкил или C_1-6 алкоксил; или представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, конденсированный с фенильным кольцом, замещенный одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из Н, галогена, CN, ОН, CF₃, C_1-6 алкила и C_1-6 алкоксила. R₃ может быть пиридилом или пиримидилом. Иллюстративные соединения включают в себя без ограничения следующие соединения:

С другой стороны, соединения в такой подгруппе могут содержать X, который представляет собой NR_a, Y, который представляет собой NR_d, и R₂, который представляет собой -CH₂CH₂R_e, в котором R_a, вместе с R_d и атомами азота, связанными с R_a и R_d, представляет собой С_3-10 гетероциклоалкил; и R_e представляет собой Н, галоген, или OR_h, R_h представляет собой Н или C_1-6 алкил. В общем, такие соединения содержат R₃, который представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, замещенный одним или несколькими (CH₂)_nZ фрагментами независимо, в которых n представляет собой 0 или 1 и Z представляет собой Н, галоген, CN, ОН, CF₃, C_1-6 алкил или C_1-6 алкоксил; или представляет собой 5- или 6-членный гетероарил, конденсированный с фенильным кольцом, замещенный одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из Н, галогена, CN, ОН, CF₃, C_1-6 алкила и C_1-6 алкоксила. Например, R₃ представляет собой пиридил или пиримидил. Иллюстративные соединения включают в себя без ограничения следующие соединения:

Другой группой новых аминотиазольных соединений, изложенных выше, является соединение формулы (III):

в которой R₁ представляет собой C_1-6 алкил.

Иллюстративным соединение формулы (III) является

Ниже представлены иллюстративные соединения по настоящему изобретению, каждое подписано номером соединения.

Также в пределах настоящего изобретения находится фармацевтическая композиция, содержащая одно или несколько аминотиазольных соединений формулы (I) для лечения рака.

Дополнительно в настоящем изобретении раскрыт способ лечения рака, причем способ включает в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы (I).

Превращения в химии синтеза и методики защитных групп (введение и снятие), используемые для синтеза соединений формулы (I), хорошо известны из области техники. См., например, R. Larock, Comprehensive Organic Transformations (2^nd Ed., VCH Publishers 1999); P.G.M. Wuts and T.W. Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (4^th Ed., John Wiley and Sons 2007); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1994); L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (2^nd ed., John Wiley and Sons 2009); и G.J. Yu et al., J. Med. Chem. 2008, 51, 6044-6054.

Полученные таким образом соединения формулы (I) можно вначале подвергнуть скринингу с применением биохимических анализов, например, анализов киназ, описанных в примерах 2-4 ниже, или клеточных анализов, например, анализа противораковой активности in vitro, описанного в примере 5 ниже, в отношении их активности ингибирования тирозинкиназ или ингибирования роста раковых клеток, экспрессирующих определенные тирозинкиназы. Затем их можно оценивать с применением анализов in vivo, например, анализа в модели с ксенотрансплантатом на животных, в отношении их активности подавления опухолевого роста у млекопитающего. Выбранные соединения можно дополнительно исследовать для подтверждения их эффективности в лечении рака. Например, соединение можно вводить животному (например, мыши), имеющему рак, а затем оценивают его терапевтический эффект. На основании результатов можно изучать и определять соответствующие диапазоны доз и пути введения.

Без дальнейших уточнений предполагают, что специалист в данной области техники, исходя из вышеприведенного описания, может использовать настоящее изобретение в его полном объеме. Таким образом, следующие конкретные примеры следует толковать только как иллюстративные, а не ограничивающие остальную часть настоящего раскрытия каким-либо образом. Все публикации, цитируемые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте.

В примере 1 ниже представлен синтез и характеристика 13 иллюстративных соединений формулы (I). Данные анализа для полученных таким образом соединений также изложены в примере 1, а процедуры для исследования этих соединений описаны в следующих примерах 2-5.

Все химические реактивы и растворители приобретали у коммерческих поставщиков и использовали непосредственно после получения. Все реакции осуществляли в атмосфере сухого азота. Реакции отслеживали с помощью TLC (тонкослойная хроматография) с использованием пластинок с силикагелем на стеклянной подложке Merck 60 F254 (5×10 см) и зоны выявляли визуально под ультрафиолетовым излучением (254 нм) или посредством опрыскивания реактивом на основе фосфорномолибденовой кислоты (Aldrich) с последующим нагревом до 80°С. Все эксперименты с колоночной флэш-хроматографией осуществляли с использованием силикагеля ASTM 230-400 меш Merck Kieselgel 60, №9385, в качестве неподвижной фазы. Спектры ядерного магнитного резонанса для протонов (¹Н) измеряли на спектрометре Varian Mercury-300 или Varian Mercury-400. Химические сдвиги регистрировали в частях на миллион (ppm) на дельта(δ)-шкале относительно резонанса пика растворителя. Следующие сокращения использовали для описания связи: s = синглет; d = дублет; t = триплет; q = квартет; quin = квинтет; br = широкий; и m = мультиплет. Данные LCMS (жидкостная хроматография-масс-спектрометрия) измеряли на системах Agilent MSD-1100 ESI-MS/MS, Agilent 1200 series LC/MSD VL и Waters Acquity UPLC-ESI-MS/MS.

Пример 1: Синтез соединений 1-13

Соединения 1-13 получали согласно пути синтеза, показанному на схеме 1 ниже. Среди перечисленных реагентов TEA представляет собой триэтиламин, KOAc представляет собой ацетат калия, Pd(PPh₃)₄ представляет собой тетракис(трифенилфосфин)палладий(0), DMAc представляет собой N,N-диметилацетамид, CsF представляет собой фторид цезия, HCl представляет собой хлористоводородную кислоту, NaHCO₃ представляет собой бикарбонат натрия, NaH представляет собой гидрид натрия, NMP представляет собой 1-метил-2-пирролидинон, KOH представляет собой гидроксид калия и DMSO представляет собой диметилсульфоксид.

Схема 1. Реагенты и условия: (a) TEA, CH₂Cl₂, от 0°С до к. т.; (b) KOAc, Pd(PPh₃)₄, DMAc, 150°С (KOAc заменяли CsF для Ру = пиридин-2-ил); (с) 12 н HCl, H₂O, нагрев, с обр. холод.; (d) NaHCO₃, Н₂О, к. т.; (е) NaH, NMP, 0°С; (f) DMSO, RH, 100°С или диглим, KOH, 160°С для RH = 4-(2-гидроксиэтил)-морфолин; и (g) 6 н HCl, 0°С.

Стадия I. Синтез 2,2-диметил-N-тиазол-2-илпропионамида В

К смеси 2-аминотиазола А (300 ммоль) и триэтиламина (330 ммоль) в безводном CH₂Cl₂ (250 мл) при 0°С добавляли триметилацетилхлорид (310 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 1 ч. Смесь промывали 6 н HCl (60 мл) и органический слой отделяли, сушили над сульфатом магния (MgSO₄) и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали методом хроматографии на силикагеле (20% EtOAc/гексан) с получением указанного продукта В в виде грязно-белого твердого вещества (72%). ¹Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 11.75 (s, 1H), 7.46 (d, J=6.0 Гц, 1H), 7.17 (d, J=6.0 Гц, 1.22 (s, 9Н); MS (ES⁺) m/z рассчит.для C₈H₁₂N₂OS: 184.07; получено: 185.1 (М+Н⁺).

Стадия II. Синтез соединения С (Ру = пиридин-3-ил, пиридин-4-ил и пиримидин-5-ил)

Смесь 2,2-диметил-N-тиазол-2-илпропионамида В (30 ммоль), хлорпиридина (30 ммоль), ацетата калия (120 ммоль) и тетракис(трифенилфосфин)палладия(0) (1,5 ммоль) в N,N-диметилацетамиде (60 мл) нагревали при 150°С в атмосфере аргона в течение 24 ч. Большую часть растворителя удаляли дистилляцией (120°С/160 мм Hg) и остаток промывали водой (250 мл). Осадок собирали фильтрацией, повторно растворяли в 10% CH₃OH/CH₂Cl₂ (200 мл) и фильтровали через слой целита. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и очищали методом хроматографии на силикагеле (1% MeOH/CdH₂Cl₂) с получением требуемого продукта в виде грязно-белого твердого вещества (40-85%).

Стадия II. Синтез соединения С (Ру = пиридин-2-ил)

Смесь 2,2-диметил-N-тиазол-2-илпропионамида В (10 ммоль), хлорпиридина (10 ммоль), фторида цезия (20 ммоль) и тетракис(трифенилфосфии)палладия(0) (0,5 ммоль) в диметилсульфоксиде (20 мл) нагревали при 160°С в атмосфере аргона в течение 16 ч. Полученную смесь разделяли между 0,5 н HCl (150 мл) и CH₂Cl₂ (150 мл). Органический слой отделяли, сушили над MgSO₄, концентрировали при пониженном давлении и очищали методом хроматографии на силикагеле (3% ацетона/CH₂Cl₂) с получением требуемого продукта в виде бледно-коричневого твердого вещества (20%)

Только одно из соединений С было выбрано для показа своего ЯМР спектра и масс-спектра.

2,2-Диметил-N-(5-пиридин-4-илтиазол-2-ил)-пропионамид. ¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 9.28 (bs, 1H), 8.61 (dd, J=4.8, 1.6 Гц, 2Н), 7.84 (s, 1H), 7.42 (dd, J=4.8, 1.6 Гц, 2Н), 1.38 (s, 9Н); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₁₃H₁₅N₃OS: 261.09; получено: 262.1 (М+Н⁺).

Стадия III. Синтез соединения D

Смесь соединения С (5 ммоль) и 12 н HCl (5 мл) в воде (5 мл) нагревали до температуры образования флегмы в течение 2 ч. Большую часть растворителя удаляли при пониженном давлении и остаток разбавляли СН₃ОН (15 мл). Большую часть растворителя удаляли дистилляцией и остаток сушили в вакууме с получением соединения D гидрохлорида в виде бледно-коричневого твердого вещества.

Значение рН вышеуказанной суспензии вышеуказанного твердого вещества в воде (30 мл) при комнатной температуре доводили до 7 при помощи бикарбоната натрия и смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Осадок собирали фильтрацией и сушили в вакууме с получением требуемого продукта D в виде бледно-коричневого твердого вещества (85-90%).

Только одно из соединений D было выбрано для показа своего ЯМР спектра и масс-спектра.

5-Пиридин-4-илтиазол-2-иламин. ¹Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 8.41 (dd, J=4.8,1.5 Гц, 2Н), 7.73 (s, 1H), 7.48 (s, 2Н), 7.35 (dd, J=4.8, 1.5 Гц, 2Н); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₈H₇N₃S: 177.04; получено: 178.1 (М+Н⁺).

Стадия IV. Синтез соединения Е

К смеси соединения D или коммерчески доступного 4-пиридин-3-илтиазол-2-иламина (4 ммоль) и 4,6-дихлор-2-метилпиримидина (8 ммоль) в 1-метил-2-пирролидиноне (20 мл) при 0°С добавляли гидрид натрия (60% в масле, 10 ммоль) и смесь перемешивали при 0°С в атмосфере аргона в течение 1 ч. Реакцию гасили водой (100 мл) при 0°С и доводили значение рН до 2 при помощи 6 н HCl. Значение рН взвеси доводили до 7 при помощи бикарбоната натрия и осадок собирали фильтрацией, промывали водой (50 мл) и сушили в вакууме. Остаток очищали методом хроматографии на силикагеле (20% EtOAc/CH₂Cl₂, затем от 5% до 10% МеОН/CH₂Cl₂ градиент) с получением требуемого продукта Е в виде коричневого твердого вещества (45-60%).

Только одной из соединений Е было выбрано для показа своего ЯМР спектра и масс-спектра.

(6-Хлор-2-метилпиримидин-4-ил)-(5-пиридин-4-илтиазол-2-ил)-амин. ¹Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 12.15 (s, 1H), 8.53 (dd, J=4.5, 1.5 Гц, 2Н), 8.18 (s, 1H), 7.59 (dd, J=4.5, 1.5 Гц, 2Н), 6.90 (s, 1H), 2.59 (s, 3Н); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₁₃H₁₀ClN₅S: 303.03; получено: 304.1 (M+H⁺).

Стадия V. Синтез соединений 1-4 и 7-13

Смесь соединения Е (2 ммоль) и 1-этилпиперазина (8 ммоль) в диметилсульфоксиде (2 мл) нагревали при 100°С в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры смесь разбавляли водой (50 мл). Осадок собирали фильтрацией, промывали водой (10 мл) и сушили в вакууме. Остаток очищали методом хроматографии на оксиде алюминия (от 0,5% до 1,5% МеОН/CH₂Cl₂ градиент) с получением свободного основания каждого из соединений 1-4 и 7-13 в виде грязно-белого твердого вещества.

К перемешиваемой 6 н HCl (10 мл) при 0°С добавляли вышеуказанное твердое вещество и раствор фильтровали через 0,45 мкм PVDF мембрану. К перемешиваемому фильтрату добавляли по каплям ацетон (40 мл) в течение 1 ч и перемешивали дополнительно в течение 1 ч при 0°С. Осадок собирали фильтрацией, промывали ацетоном (15 мл) и сушили в вакууме с получением соли HCl каждого из соединений 1-4 и 7-13 в виде желтого твердого вещества (90-95%).

[6-(4-Этилпиперазин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-ил]-(5-пиридин-4-илтиазол-2-ил)-амина гидрохлоридная соль (соединение 1). ¹ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 11.55 (bs, 1H), 8.72 (d, J=5.6Гц, 2Н), 8.61 (s, 1H), 8.14 (d, J=5.2 Гц, 2Н), 6.27 (s, 1H), 4.35 (d, J=13.2 Гц, 2Н), 3.55 (d, J=12.0 Гц, 2Н), 3.45 (t, J=13.0 Гц, 2Н), 3.13 (t, J=5.8 Гц, 2Н), 3.02 (q, J=10.0 Гц, 2Н), 2.50 (s, 3Н), 1.28 (t, J=6.8 Гц, 3H); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₁₉H₂₃N₇S: 381.17; получено: 382.2 (М+H⁺).

{6-[4-(2-Фторэтил)-пиперазин-1-ил]-2-метилпиримидин-4-ил}-(5-пиридин-4-илтиазол-2-ил)-амина гидрохлоридная соль (соединение 2). ¹Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ11.89 (bs, 1H), 8.73 (d, J=6.3 Гц, 2Н), 8.62 (s, 1H), 8.15 (d, J=5.7 Гц, 2Н), 6.26 (s, 1H), 4.95 (d, J=47.4 Гц, 2Н), 4.38 (s, 2Н, перекрывание пиком воды), 3.70-3.35 (m, 6Н), 3.18 (bs, 2Н), 2.50 (s, 3H); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₁₉H₂₂FN₇S: 399.16; получено: 400.1 (М+Н⁺).

2-{4-[2-Метил-6-(5-пиридин-4-илтиазол-2-иламино)-пиримидин-4-ил]-пиперазин-1-ил}-этанла гидрохлоридная соль (соединение 3). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 11.03 (s, 1H), 8.73 (d, J=7.2 Гц, 2Н), 8.63 (s, 1H), 8.15 (d, J=7.2 Гц, 2Н), 6.26 (s, 1H), 4.34 (d, J=12.4 Гц, 2Н), 3.82 (t, J=5.2 Гц, 2Н), 3.62 (d, J=12.0 Гц, 2Н), 3.43 (t, J=12.4 Гц, 2Н), 3.30-3.09 (m, 4Н), 2.49 (s, 3H); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₁₉H₂₃N₇OS: 397.17; получено: 398.1 (М+Н⁺).

[6-(4-Диметиламинопиперидин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-ил]-(5-пиридин-4-илтиазол-2-ил)-амина гидрохлоридная соль (соединение 4). ¹Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 11.07 (s, 1H), 8.73 (d, J=6.9 Гц, 2Н), 8.62 (s, 1H), 8.15 (d, J=6.9 Гц, 2Н), 6.25 (s, 1H), 4.43 (d, J=12.9 Гц, 2Н), 3.44 (квин., J=5.2 Гц, 1H), 2.94 (t, J=12.5 Гц, 2Н), 2.69 (d, J=4.5 Гц, 6Н), 2.49 (s, 3H), 2.15 (d, J=10.5 Гц, 2Н), 1.60 (q, J=11.0 Гц, 2Н); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₂₀H₂₅N₇S: 395.19; получено: 396.1 (М+Н⁺).

[6-(4-Этилпиперазин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-ил]-(5-пиридин-3-илтиазол-2-ил)-амина гидрохлоридная соль (соединение 7). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 11.23 (bs, 1H), 9.15 (s, 1H), 8.68 (d, J=5.2Гц, 1H), 8.60 (d, J=8.0 Гц, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.93 (t, J=6.2 Гц, 1H), 6.21 (s, 1H), 4.35 (d, J=14.4 Гц, 2Н), 3.55 (d, J=11.6 Гц, 2Н), 3.40 (t, J=13.2 Гц, 2Н), 3.13 (t, J=5.8 Гц, 2Н), 3.01 (q, J=6.9 Гц, 2Н), 2.50 (s, 3H), 1.28 (t, J=6.6 Гц, 3H); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₁₉H₂₃N₇S: 381.17; получено: 382.2 (М+Н⁺).

{6-[4-(2-Фторэтил)-пиперазин-1-ил]-2-метилпиримидин-4-ил}-(5-пиридин-3-илтиазол-2-ил)-амина гидрохлоридная соль (соединение 8). ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 11.80 (bs, 1H), 9.16 (s, 1H), 8.68 (d, J=5.6 Гц, 1H), 8.62 (d, J=8.0 Гц, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.95 (t, J=6.8 Гц, 1H), 6.22 (s, 1H), 4.98 (d, J=46.8 Гц, 2Н), 4.34 (bs, 2Н), 3.70-3.35 (m, 6Н), 3.16 (bs, 2Н), 2.49 (s, 3H); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₁₉H₂₂FN₇S: 399.16; получено: 400.1 (М+Н⁺).

2-{4-[2-Метил-6-(5-пиридин-3-илтиазол-2-иламино)-пиримидин-4-ил]-пиперазин-1-ил}-этанола гидрохлоридная соль (соединение 9). ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 11.02 (bs, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.64 (d, J=7.6 Гц, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.96 (d, J=5.2 Гц, 1H), 6.25 (s, 1H), 4.33 (d, J=11.2 Гц, 2Н), 3.80 (s, 1H), 3.60 (d, J=11.6 Гц, 2Н), 3.19 (s, 2Н), 3.13 (s, 2Н), 2.48 (s, 3H); MS (ES⁺) rn/z рассчит. для C₁₉H₂₃N₇OS: 397.17; получено: 398.1 (М+Н⁺).

[6-(4-Диметиламинопиперидин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-ил]-(5-пиридин-3-илтиазол-2-ил)-амина гидрохлоридная соль (соединение 10). ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 11.27 (bs, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.69 (d, J=5.2 Гц, 1H), 8.64 (d, J=8.0 Гц, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.97 (t, J=6.8 Гц, 1H), 6.36 (bs, 1H), 4.42 (d, J=8.8 Гц, 2Н), 3.43 (bs, 1H), 2.99 (t, J=12.4 Гц, 2Н), 2.68 (s, 3H), 2.67 (s, 3H), 2.55 (s, 3H), 2.17 (d, J=10.8 Гц, 2Н), 1.64 (q, J=9.2 Гц, 2Н); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₂₀H₂₅N₇S: 395.19; получено: 396.2 (М+Н⁺).

[6-(4-Этилпиперазин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-ил]-(5-пиридин-2-илтиазол-2-ил)-амина гидрохлоридная соль (соединение 11). ¹Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 11.34 (s, 1H), 8.54 (d, J=4.8 Гц, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.01-7.96 (m, 2Н), 7.40-7.34 (m, 1H), 6.31 (s, 1H), 4.37 (d, J=13.2 Гц, 2Н), 3.62-3.38 (т, 4Н), 3.20-2.90 (т, 4Н), 2.47 (s, 3H), 1.26 (t, J=7.4 Гц, 3H); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₁₉H₂₃N₇S: 381.17; получено: 382.2 (М+Н⁺).

[6-(4-Этилпиперазин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-ил]-(5-пиримидин-5-илтиазол-2-ил)-амина гидрохлоридная соль (соединение 12). ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 11.35 (bs, 1H), 9.20-9.03 (m, 3H), 8.09 (s, 1H), 6.28 (s, 1H), 4.40 (s, 2Н), 3.56 (d, J=12.4 Гц, 2Н), 3.44 (d, J=7.4 Гц, 2Н), 3.13 (bs, 2Н), 3.02 (d, J=8.0 Гц, 2Н), 1.28 (bs, 3H); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₁₈H₂₂N₈S: 382.17; получено: 383.3 (М+Н⁺).

[6-(4-Этилпиперазин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-ил]-(4-пиридин-3-илтиазол-2-ил)-амина гидрохлоридная соль (соединение 13). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 11.80 (bs, 1H), 11.54 (bs, 1H), 9.28 (s, 1H), 8.94 (d, J=8.4 Гц, 1H), 8.84 (d, J=5.2 Гц, 1H), 8.15-8.07 (т, 2Н), 6.31 (bs, 2Н), 4.35 (d, J=14.0 Гц, 2Н), 3.55 (d, J=12.0 Гц, 2Н), 3.45 (t, J=13.0 Гц, 2Н), 3.15-3.07 (m, 2Н), 3.00 (q, J=10.0 Гц, 2Н), 2.49 (s, 3H), 1.27 (t, J=7.4 Гц, 3H); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₁₉H₂₃N₇S: 381.17; получено: 382.1 (М+Н⁺).

Стадия V. Синтез соединений 5 и 6

К смеси соединения Е (1 ммоль) и 4-(2-гидроксиэтил)-морфолина (4 ммоль) в диглиме (1 мл) при 100°С добавляли гидроксид калия (10 ммоль) и смесь перемешивали при 160°С в атмосфере аргона в течение 10 мин. Реакцию гасили водой (20 мл) при 0°С и значение рН доводили до 2 при помощи 6 н HCl. Значение рН взвеси доводили до 7 при помощи бикарбоната натрия и осадок собирали фильтрацией, промывали водой (10 мл) и сушили в вакууме. Остаток очищали методом хроматографии на оксиде алюминия (от 0,5% до 1,5% МеОН/CH₂Cl₂ градиент) с получением свободного основания соединения 6 в виде грязно-белого твердого вещества.

К суспензии вышеуказанного твердого вещества в МеОН (10 мл) при 0°С добавляли 6 н HCl (1 мл) с перемешиванием. Большую часть растворителя удаляли при пониженном давлении и остаток обрабатывали EtOH (10 мл). Осадок собирали фильтрацией, промывали ацетоном (10 мл) и сушили в вакууме с получением HCl соли каждого из соединений 5-6 в виде желтого твердого вещества (45-50%).

[2-Метил-6-(2-морфолин-4-ил-этокси)-пиримидин-4-ил]-(5-пиридин-4-илтиазол-2-ил)-амина гидрохлоридная соль (соединение 5). ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 11.61 (s, 1H), 8.74 (d, J=5.2 Гц, 2Н), 8.64 (s, 1H), 8.17 (d, J=5.2 Гц, 2Н), 6.37 (s, 1H), 4.72 (s, 2Н), 4.00-3.80 (m, 4Н), 3.64-3.42 (m, 4Н), 3.16 (bs, 2Н), 2.59 (s, 3H); MS (ES⁺) rn/z рассчит. для C₁₉H₂₂N₆O₂S: 398.15; получено: 399.2 (М+Н⁺).

[2-Метил-6-(2-морфолин-4-ил-этокси)-пиримидин-4-ил]-(5-пиридин-3-илтиазол-2-ил)-амина гидрохлоридная соль (соединение 6). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ 11.51 (bs, 1H), 9.20 (s, 1H), 8.71 (d, J=5.6 Гц, 1H), 8.66 (d, J=8.4 Гц, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.98 (dd, J=8.0, 5.6 Гц, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.72 (t, J=4.8 Гц, 2Н), 3.96 (d, J=10.8 Гц, 2Н), 3.85 (t, J=12.0 Гц, 2Н), 3.55 (bs, 2Н), 3.47 (d, J=12.4 Гц, 2Н), 3.19 (bs, 2Н), 2.59 (s, 3H); MS (ES⁺) m/z рассчит. для C₁₉H₂₂N₆O₂S: 398.15; получено: 399.1 (М+Н⁺).

Пример 2. Ингибирование активности FLT3

Для исследования определенных соединений, полученных в соответствии с примером 1, в отношении ингибирования активности FLT3 осуществляли следующее исследование.

GST-FLT3-KD^WT, содержащий каталитический домен киназы FLT3 (остатки Y567-S993), экспрессировали в клетках насекомого Sf9, трансфицированных бакуловирусом, содержащим плазмиду pBac-PAK8-GST-FLT3-KD. Анализ киназы Kinase-Glo FLT3^{WT осуществляли в 96-луночных планшетах при 30°С в течение 4 часов для исследования соединения в конечном объеме 50 мкл, включающем в себя следующие компоненты: 75 нг белков GST-FLT3-KDWT, 25 мМ HEPES, рН 7,4, 4 мМ MnCl₂, 10 мМ MgCl₂, 2 мМ DTT, 0,02% Triton Х-100, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 25 мкМ пептидный субстрат Her2, 0. 5 мМ Na₃VO₄ и 1 мкМ АТФ. После инкубирования 50 мкл реактива Kinase-Glo Plus Reagent (Promega, Мадисон, Висконсин, США) добавляли в каждую лунку и смесь инкубировали при 25°С в течение 20 минут. Аликвоту каждой реакционной смеси объемом 70 мкл переносили в черный микротитровальный планшет и люминесценцию измеряли на многофункциональном счетчике для работы с несколькими метками Wallac Vector 1420 (PerkinElmer, Шелтон, Коннектикут, США).}

Исследовали несколько соединений. Неожиданно, соединения 1-11 демонстрировали значения концентрации IC₅₀ (концентрация ингибитора, при которой ответ снижается наполовину) ниже 100 нМ.

Пример 3. Ингибирование активности VEGFR2

Для исследования определенных соединений, полученных в соответствии с примером 1, в отношении ингибирования активности VEGFR2 осуществляли следующее исследование. Следует отметить, что VEGFR2 является одним из трех основных подтипов VEGFR.

Рекомбинантный GST-VEGFR2 (остатки V789-V1356), содержащий киназный домен, экспрессировали в клетках насекомого Sf9. Анализ киназы осуществляли в 96-луночных планшетах с исследуемым соединением в конечном объеме 50 мкл реакционной смеси при 30°С в течение 120 минут со следующими компонентами: 25 Мм HEPES, рН 7,4, 10 Мм MgCl₂, 4 мМ MnCl₂, 0,5 мМ Na₃VO₄, 2 мМ DTT, 0,02% Triton X100, 0,01% BSA, 1 мкМ АТФ, 2 мкМ пептидом полиGlu4:Tyr, 50~100 нг рекомбинантного VEGFR2. После инкубирования 50 мкл реактива Kinase-Glo Plus Reagent (Promega, Мадисон, Висконсин, США) добавляли в каждую лунку и смесь инкубировали при 25°С в течение 20 минут. Аликвоту каждой реакционной смеси объемом 70 мкл переносили в черный микротитровальный планшет и люминесценцию измеряли на многофункциональном счетчике для работы с несколькими метками Wallac Vector 1420 (PerkinElmer, Шелтон, Коннектикут, США).

Несколько соединений исследовали в анализе VEGFR2. Соединения 1, 9 и 10 неожиданно демонстрировали значения IC₅₀ ниже 30 нМ.

Пример 4. Ингибирование активности c-Kit

Для исследования определенных соединений, полученных в соответствии с примером 1, в отношении ингибирования активности c-Kit осуществляли следующее исследование.

Несущие на N-конце His-метку рекомбинантные белки человеческой c-KIT (остатки T544-V976), экспрессируемые в экспрессионных системах на основе трансфицированных бакуловирусом клеток насекомого Sf9, очищали для анализа c-Kit ADP Kinase-Glo. Анализ с-Kit-ADP Kinase-Glo осуществляли в 96-луночных планшетах при 30°С в течение 150 минут с использованием конечного объема 10 мкл, включающего в себя 40 мМ Tris, рН 7,4, 20 мМ MgCl₂, 2 мМ MnCl₂, 2 мМ DTT, 0,01% BSA, 20 мкМ АТФ, 20 мкМ пептид поли(Glu, Tyr) 4:1, 0,1 мМ Na₃VO₄, 250 нг рекомбинантных белков c-Kit и исследуемое соединение в указанной концентрации. Реакции останавливали посредством добавления 5 мкл реактива ADP-Glo™ (Promega, Мадисон, Висконсин, США) при 25°С с 40-минутным инкубированием, за которым следовало добавление 10 мкл реактива для выявления киназы в течение дополнительных 30 минут. Наконец, аликвоту каждой реакционной смеси объемом 30 мкл переносили в черный микротитровальный планшет и люминесценцию измеряли на многофункциональном счетчике для работы с несколькими метками Wallac Vector 1420 (Perkin-Elmer, Шелтон, Коннектикут, США).

Исследовали несколько соединений. Неожиданно, соединения 1-7 и 11-12 демонстрировали значения IC₅₀ ниже 100 нМ.

Пример 5. Противораковая активность in vitro

Для оценки противораковой активности in vitro определенных соединений, полученных в соответствии с примером 1, осуществляли следующее исследование с использованием клеточных линий и MTS-анализов клеточной жизнеспособности (MTS представляет собой 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий).

Линии лейкозных клеток MOLM-13, MV4:11 и Kasumin-1 приобретали у Американской коллекции типовых культур (АТСС, Манассас, Виргиния, США). Линию клеток гастроинтестинальной стромальной опухоли GIST-T1 приобрели у Cosmo Bio Co., LTD (Токио, Япония). Все линии лейкозных клеток поддерживали в среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 Ед./мл пенициллина и 10 г/мл стрептомицина при 37°С и 5% СО₂. Линию клеток GIST-T1 культивировали в среде DMEM, дополненной 10% FBS, 0,01% заменимых аминокислот, 10 Ед./мл пенициллина и 10 г/мл стрептомицина.

Все из клеток GIST882, GIST48 и GIST430 культивировали в инкубаторах, поддерживаемых при 37°С и 5% СО₂. GIST882 культивировали в RPMI-1640, дополненной 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS). GIST48 культивировали с F10, дополненной 20% FBS, 0,5% усилителем сыворотки Mito (BD Bioscience, 355006) и 1% экстрактом гипофиза быка (BD Bioscience 354123). GIST430 культивировали в IMDM, дополненной 20% FBS. Клетки GIST882, GIST430 и GIST48 были предоставлены доктором Джонатаном А. Флетчером (Гарвардская медицинская школа, США).

MTS-анализы MOLM-13, MV4:11 и Kasumin-1

Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты с плотностью 1×10⁴ клеток/100 мкл/лунка в трех параллелях и обрабатывали в течение 72 часов указанной концентрацией исследуемого соединения в диапазоне от 1 нМ до 10 мкМ. Колориметрический анализ клеточной пролиферации Colorimetric CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation assay (MTS-анализ; Promega, Мадисон, Висконсин, США) использовали для определения цитотоксичности. Оптическую плотность при длине волны 492 нм измеряли с использованием микропланшетного фотометра (Victor2; Perkin-Elmer, Уолтем, Массачусетс, США). Значения IC₅₀ определяли посредством MTS-анализа, когда клетки обрабатывали исследуемым соединением в течение 72 часов, и рассчитывали с использованием GraphPad Prism 6. Каждый эксперимент проводили в трех параллелях.

MTS-анализ GIST-T1

Клетки GIST-T1 высевали в 96-луночные культуральные планшеты с плотностью 8000 клеток/100 мкл/лунка в трех параллелях и обрабатывали в течение 72 часов указанной концентрацией исследуемого соединения в диапазоне от 1 нМ до 10 мкМ. Колориметрический анализ клеточной пролиферации Colorimetric CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation assay (MTS-анализ; Promega, Мадисон, Висконсин, США) использовали для определения цитотоксичности. Оптическую плотность при длине волны 492 нм измеряли с использованием микропланшетного фотометра (Victor2; Perkin-Elmer, Уолтем, Массачусетс, США). Значения IC₅₀ определяли посредством MTS-анализа, когда клетки обрабатывали исследуемым соединением в течение 72 часов, и рассчитывали с использованием GraphPad Prism 6. Каждый эксперимент проводили в трех параллелях.

MTS-анализы GIST882, GIST48 и GIST430

Клетки GIST (4×10⁴) обрабатывали разной дозой соединений. Обработанные клетки GIST882 инкубировали в течение 144 часов, а клетки GIST48 и GIST430 инкубировали в течение 120 часов при 37°С в 5% СО₂. Клеточную пролиферацию определяли посредством инкубирования клеток с метиленовым синим (Clontech, Калифорния, США) в течение 1 часа. Спектральную поглощательную способность измеряли при длине волны 450 нм с использованием микропланшет-ридера SpectraMax М5 (Molecular Devices, США).

Значения GI50 (концентрация для 50% от максимального ингибирования клеточной пролиферации) для определенных соединений формулы (I) представлены в таблице ниже:

Другие варианты осуществления

Все признаки, раскрытые в настоящей заявке, могут быть объединены в любой комбинации. Каждый признак, раскрытый в настоящем описании, может быть заменен альтернативным признаком, который служит в качестве такой же, эквивалентной или подобной цели. Таким образом, если четко не указано иное, каждый раскрытый признак является только примером общих серий эквивалентных или подобных признаков.

Из вышеуказанного описания специалист настоящей области техники может легко установить существенные характеристики настоящего изобретения и без отклонения от его сущности и объема может делать различные изменения и модификации настоящего изобретения для его адаптации к различным применениям и условиям. Таким образом, другие варианты осуществления также находятся в пределах объема следующей формулы изобретения.

1. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль:

где

R₁ представляет собой C_1-6алкил;

X представляет собой NR_a;

Y представляет собой CR_bR_c или NR_d, в котором R_c представляет собой Н, N(CH₃)₂, R_b вместе с R_a, атомом углерода, связанным с R_b, и атомом азота, связанным с R_a, представляет собой пиперидинил и R_d вместе с R_a и атомами азота, связанными с R_d и R_a, представляет собой пиперазинил;

R₂ представляет собой -CH₂CH₂R_e или NR_fR_g, в которой R_e представляет собой Н, галоген или OR_h и каждый из R_f и R_g представляет собой C_1-6 алкил, R_h представляет собой Н; и

R₃ представляет собой пиридил или пиримидинил.

2. Соединение или соль по п. 1, где соединение представляет собой соединение формулы (II):

3. Соединение или соль по п. 2, где X представляет собой NR_a, Y представляет собой CR_bR_c и R₂ представляет собой NR_fR_g, где R_a вместе с R_b, атомом азота, связанным с R_a, и атомом углерода, связанным с R_b, представляет собой пиперидинил.

4. Соединение или соль по п. 2, где X представляет собой NR_a, Y представляет собой NR_d и R₂ представляет собой -CH₂CH₂R_e, где R_a вместе с R_d и атомами азота, связанными с R_a и R_d, представляет собой пиперазинил; и R_e представляет собой Н, галоген или OR_h, R_h представляет собой Н.

5. Соединение или соль по п. 3, где соединение представляет собой

6. Соединение или соль по п. 4, где соединение является одним из следующих соединений:

7. Соединение или соль по п. 1, где соединение является одним из следующих соединений:

8. Соединение или соль по п. 1, где соединение представляет собой соединение формулы (III):

9. Фармацевтическая композиция для лечения рака, ассоциированного с тирозинкиназой, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество соединения или соли по п. 1.

10. Способ ингибирования тирозинкиназы, причем способ предусматривает приведение в контакт тирозинкиназы с эффективным количеством соединения или соли по п. 1 и тирозинкиназа представляет собой FMS-подобную тирозинкиназу 3 (FLT3), рецептор фактора роста сосудистого эндотелия (VEGFR) или тирозиновую протеинкиназу Kit (с-KIT).

11. Способ лечения рака, связанного с тирозинкиназой, причем способ предусматривает введение субъекту при необходимости такого лечения эффективного количества соединения или соли по п. 1 и тирозинкиназа представляет собой FMS-подобную тирозинкиназу 3 (FLT3), рецептор фактора роста сосудистого эндотелия (VEGFR) или тирозиновую протеинкиназу Kit (c-KIT).

12. Способ по п. 11, при котором рак представляет собой лейкоз или саркому.

13. Фармацевтическая композиция по п. 12, где тирозинкиназа представляет собой FMS-подобную тирозинкиназу 3 (FLT3), рецептор фактора роста сосудистого эндотелия (VEGFR) или тирозиновую протеинкиназу Kit (c-KIT).