Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов



Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов
C07K2317/41 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2772771:

ЧУГАИ СЕЙЯКУ КАБУСИКИ КАЙСЯ (JP)

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая антигенсвязывающую молекулу для элиминации антигенов из плазмы, способ уменьшения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме, способ увеличения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы, способ получения антигенсвязывающей молекулы для уменьшения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме (варианты). В одном из вариантов реализации антигенсвязывающая молекула содержит антигенсвязывающий домен, где домен обладает антигенсвязывающей активностью, которая изменяется в зависимости от pH, где значение KD (pH 5,8) / KD (pH 7,4), равное 2 или более, представляет собой отношение KD для антигена в условиях диапазона кислых значений pH к KD в условиях диапазона нейтральных значений pH. Изобретение расширяет арсенал средств для элиминации антигенов из плазмы. 5 н. и 23 з.п. ф-лы, 81 ил., 54 табл., 52 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам с усиленным внутриклеточным захватом связанного антигена, антигенсвязывающим молекулам, в которых количество антигенов, которое может связываться на одну молекулу, увеличено, антигенсвязывающим молекулам с улучшенной фармакокинетикой, антигенсвязывающим молекулам с усиленной внутриклеточной диссоциацией внутриклеточно связанного антигена, антигенсвязывающим молекулам с усиленным внеклеточным высвобождением в не связанном с антигеном состоянии, антигенсвязывающим молекулам, имеющим функцию снижения общей концентрации антигена или свободной концентрации антигена в плазме, фармацевтическим композициям, содержащим такие антигенсвязывающие молекулы, и способам их получения.

Уровень техники

Антитела привлекают внимание в качестве лекарственных средств, так как они обладают высокой стабильностью в плазме и обладают малым количеством побочных эффектов. В настоящее время ряд подобных фармацевтических средств IgG-типа являются коммерчески доступными, и на сегодняшний день разрабатываются многие лекарственные средства на основе антител (непатентные документы 1 и 2). Между тем, описаны различные способы, применимые для второго поколения лекарственных средств на основе антител, включающие способы, которые усиливают эффекторную функцию, антигенсвязывающую способность, фармакокинетику и стабильность, и способы, которые снижают риск развития иммуногенности (непатентный документ 3). Как правило, требуемая доза лекарственного средства на основе антитела является очень высокой. Это, в свою очередь, привело к возникновению проблем, таких как высокая стоимость производства, а также к трудностям при получении подкожных составов. В теории, доза фармацевтического средства на основе антитела может быть снижена путем улучшения фармакокинетики антитела или повышения аффинности между антителами и антигенами.

В литературе описаны способы улучшения фармакокинетики антител с использованием искусственных замен аминокислот в константных областях (непатентные документы 4 и 5). Аналогично описано созревание аффинности в качестве способа улучшения антигенсвязывающей способности или активности нейтрализации антигена (непатентный документ б). Этот способ дает возможность увеличения антигенсвязывающей способности посредством внесения аминокислотной мутации в CDR вариабельной области и т.п. Повышение антигенсвязывающей способности обеспечивает улучшение биологической активности in vitro или обеспечивает возможность снижения дозы и дополнительно обеспечивает повышенную эффективность in vivo (непатентный документ 7).

Способность одной молекулы антитела нейтрализовать антиген зависит от ее аффинности. Путем увеличения аффинности антиген можно нейтрализовать меньшим количеством антитела. Для увеличения аффинности антитела можно использовать различные способы (непатентный документ б). Далее, если бы аффинность можно было сделать бесконечной посредством ковалентного связывания антитела с антигеном, одна молекула антитела могла бы нейтрализовать одну молекулу антигена (двухвалентное антитело могло бы нейтрализовать две молекулы антигена). Однако, стехиометрия нейтрализации одного антитела против одного антигена (одного двухвалентного антитела против двух антигенов) является лимитирующим фактором для предшествующих способов, и, таким образом, невозможно полностью нейтрализовать антиген количеством антитела, меньшим, чем количество антигена. Другими словами, эффект, усиливающий аффинность, имеет лимитирующее значение (непатентный документ 9). Для увеличения периода действия нейтрализующего эффекта нейтрализующего антитела в течение определенного периода антитело должно быть введено в дозе, более высокой, чем количество антигена, продуцируемое в организме в течение такого же периода. Таким образом, в случае улучшения только фармакокинетики антител или технологии созревания аффинности, как описано выше, существует ограничение в отношении снижения требуемой дозы антитела. Таким образом, для поддержания эффекта антител в отношении нейтрализации антигена в течение заданного периода времени с помощью антител в количестве, меньшем, чем количество антигена, одно антитело должно нейтрализовать множество антигенов. Недавно было описано антитело, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом, в качестве нового способа для достижения описанной выше задачи (патентный документ 1). Антитела с рН-зависимым связыванием антигена, которые прочно связываются с антигеном при нейтральных условиях в плазме и диссоциируют от антигена при кислых условиях в энодосоме, могут диссоциировать от антигена в эндосоме. Когда антитело с рН-зависимым связыванием антигена диссоциирует от антигена и рециркулирует в плазму посредством FcRn, оно может повторно связываться с другим антителом. Таким образом, антитело с рН-зависимым связыванием антигена может многократно связываться с несколькими антигенами.

Кроме того, время удержания антигена в плазме является очень коротким по сравнению со временем удержания антител, рециркулирующих в плазму путем связывания с FcRn. Если антитело с таким продолжительным временем удержания в плазме связывает антиген, время удержания в плазме комплекса антиген-антитело увеличивается до того же времени удержания, что и у антитела. Таким образом, вследствие связывания с антителом повышается время удержания антигена, и, таким образом, концентрация антигена в плазме увеличивается.

Таким образом, антитела с рН-зависимым связыванием антигена обладают эффектами, которые не могут быть осуществлены с помощью нормальных антител, поскольку они могут ускорять элиминацию антигенов из плазмы по сравнению с нормальными антигенами, посредством связывания одного антитела с множеством антигенов. Однако способы инженерии антител для улучшения эффектов антител с рН-зависимым связыванием антигена, которые могут многократно связываться с антигенами и которые ускоряют элиминацию антигенов из плазмы, до настоящего времени не были описаны.

IgG-антитела имеют длительное время удержания в плазме вследствие их связывания с FcRn. Связывание между IgG и FcRn наблюдают только в кислых условиях (рН 6,0), и связывание практически не наблюдается в нейтральных условиях (рН 7,4). IgG антитела захватываются в клетки неспецифически, но посредством связывания с FcRn в эндосоме в кислых условиях внутри эндосомы, они возвращаются на клеточную поверхность и диссоциируют от FcRn в нейтральных условиях в плазме. Когда в Fc-область IgG вносят мутации так, что связывание с FcRn в диапазоне кислых значений рН утрачивается, рециклирование антитела из эндосомы в плазму не происходит и время удержания антител в плазме значительно снижается. Способ повышения связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН описан в качестве способа увеличения времени удержания в плазме IgG-антитела. Повышение связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН посредством внесения аминокислотных замен в Fc-область IgG-антитела приводит к увеличенной эффективности рециклирования антитела из эндосомы в плазму и, в результате, увеличивается время удержания в плазме.

До настоящего времени было проведено множество исследований антителозависимой клеточной цитотоксичности (далее обозначаемой как ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (далее обозначаемой как CDC), которые являются эффекторными функциями антител класса IgG. Было описано, что в классе IgG человека, антитела полкласса IgG1 обладают наиболее высокой активностью ADCC и активностью CDC (непатентный документ 13). Более того, также полагают, что одной из эффекторных функций антител является антителозависимый клеточно-опосредуемый фагоцитоз (ADCP), который представляет собой фагоцитоз клеток-мишеней, опосредуемый антителами класса IgG (непатентные документы 14 и 15). Поскольку антитела подкласса IgG1 могут индуцировать эти эффекторные функции против опухолей, антитела подкласса IgG1 используют для большинства фармацевтических средств против антигенов злокачественной опухоли.

Для того, чтобы IgG-антитела опосредовали активность ADCC и ADCP, Fc-область IgG-антитела должна связываться с рецепторами антител (далее обозначаемыми как Fcγ-рецептор или FcγR), которые присутствуют на поверхности эффекторных клеток, таких как киллерные клетки, натуральные киллерные клетки и активированные макрофаги. У человека описаны изоформы FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa и FcγRIIIb в качестве представителей семейства Fcγ-рецепторов, и также описаны их соответствующие аллотипы (непатентный документ 16).

Усиление цитотоксических эффекторных функций, таких как ADCC и ADCP, привлекло внимание в качестве перспективных средств для усиления противоопухолевых эффектов антител против

злокачественной опухоли. Важность опосредуемых Fcγ-рецептором эффекторных функций, являющихся целью противоопухолевых эффектов антител, описана с использованием моделей на мышах (непатентные документы 17 и 18). Более того, было выявлено, что клинические эффекты у человека коррелировали с высокоаффинным полиморфным аллотипом (VI58) и низкоаффинным полиморфным аллотипом (F158) FcγRIIIa (непатентный документ 19). В этих сообщениях указано, что антитела с Fc-областью, оптимизированной для связывания с конкретными Fcγ-рецепторами, опосредуют более мощные эффекторные функции, и, тем самым, проявляют более эффективные противоопухолевые эффекты. Баланс между аффинностью антител против активирующих рецепторов, включая FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa и FcγRIIIb, и ингибирующих рецепторов, включающих FcγRIIb, является важным фактором при оптимизации эффекторных функций антител. Повышение аффинности к активирующим рецепторам может обеспечить антитела со свойством опосредования более мощных эффекторных функций (непатентный документ 20), и, таким образом, описано в различных сообщениях до настоящего времени в качестве способа модификации с помощью инженерии антител для повышения или усиления противоопухолевой активности фармацевтических средств на основе антител против антигенов злокачественной опухоли.

Что касается связывания между Fc-областью и Fcγ-рецептором, было показано, что несколько остатков в шарнирной области антитела и СН2-домене антитела и цепь сахаров, связанная с Asn в положении 297 (нумерация EU) в СН2-домене, являются важными (непатентные документы 13, 21 и 22). Фокусируясь на этих участках связывания, до настоящего времени проводили исследования на мутантах Fc-области, имеющих различные свойства связывания Fcγ-рецептора, и были получены мутанты Fc-области с более высокой аффинностью в отношении активирующего Fcγ-рецептора (патентные документы 2 и 3). Например, Lazar et al. успешно увеличили связывание IgG1 человека с FcγRIIIa человека (V158) приблизительно в 370 раз посредством замены Ser в положении 239, Ala в положении 330 и Не в положении 332 (нумерация EU) IgG1 человека на Asp, Leu и Glu, соответственно (непатентный документ 19 и патентный документ 2). Соотношение связывания FcγRIIIa и FcγRIIb (соотношение А/1) для этого мутанта было приблизительно в 9 раз выше, чем для дикого типа. Более того, Shinkawa et al. успешно увеличили связывание с FcγRIIIa вплоть до приблизительно 100 раз посредством удаления фукозы из цепи сахара, связанной с Asn в положении 297 (нумерация EU) (непатентный документ 24). Эти способы могут значительно повысить активность IgG1 человека в отношении ADCC по сравнению со встречающимся в природе IgG1 человека.

Таким образом, поскольку активность связывания Fcγ-рецептора играет важную роль в цитотоксической активности в антителах, нацеленных на антигены мембранного типа, изотип IgG1 человека с высокой активностью связывания FcγR используют, когда требуется цитотоксическая активность. Увеличение цитотоксической

активности посредством усиления активности связывания Fcγ-рецептора также является широко используемым способом. С другой стороны, роль, которую играет активность связывания Fcγ-рецептора в антителах, нацеленных на растворимые антигены, неизвестна, и полагают, что отсутствуют отличия между IgG1 человека с высокой активностью связывания Fcγ-рецептора и IgG2 человека и IgG4 человека с низкой активностью связывания FcγR. Таким образом, до настоящего времени не предпринимали попыток усиления активности связывания Fcγ-рецептора для антител, нацеленных на растворимые антигены, и их эффекты не описаны.

[Документы уровня техники]

Патентные документы

[Патентный документ 1] WO 2009/125825

[Патентный документ 2] WO 2000/042072

[Патентный документ 3] WO 2006/019447

Непатентные документы

[Непатентный документ 1] Janice М Reichert, Clark J Rosensweig, Laura В Faden & Matthew С Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078

[Непатентный документ 2] Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396

[Непатентный документ 3] Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. (2005) 20 (1), 17-29

[Непатентный документ 4] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J. Immunol. (2006) 176 (1), 346-356

[Непатентный документ 5] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat. Biotechnol. (1997) 15 (7), 637-640

[Непатентный документ 6] Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2005) 102 (24), 8466-8471

[Непатентный документ 7] Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA., Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract., J. Mol. Biol. (2007) 368, 652-665

[Непатентный документ 8] Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S., Catalytic antibodies and their applications., Curr Opin Biotechnol. (2005) 16 (6), 631-636

[Непатентный документ 9] Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J., Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2005) 334 (4), 1004-1013

[Непатентный документ 10] Dall'Acqua WF, Woods RM, Ward ES, Palaszynski SR, Patel NK, Brewah YA, Wu H, Kiener PA, Langermann S., Increasing the affinity of a human IgG1 for the neonatal Fc receptor: biological consequences., J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180

[Непатентный документ 11] Yeung YA, Leabman MK, Marvin JS, Qiu J, Adams CW, Lien S, Starovasnik MA, Lowman HB., Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates., J. Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671

[Непатентный документ 12] Datta-Mannan A, Witcher DR, Tang Y, Watkins J, Wroblewski VJ., Monoclonal antibody clearance. Impact of modulating the interaction of IgG with the neonatal Fc receptor., J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717

[Непатентный документ 13] Clark, M., Antibody Engineering IgG Effector Mechanisms., Chemical Immunology (1997) 65, 88-110

[Непатентный документ 14] Horton НМ, Bernett MJ, Pong E, Peipp M, Karki S, Chu SY, Richards JO, Vostiar I, Joyce PF, Repp R, Desjarlais JR, Zhukovsky EA., Potent in vitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19 monoclonal antibody against lymphoma and leukemia., Cancer Res. (2008) 68, 8049-8057

[Непатентный документ 15] Zalevsky J, Leung IW, Karki S, Chu SY, Zhukovsky EA, Desjarlais JR, Carmichael DF, Lawrence CE., The impact of Fc engineering on an anti-CD19 antibody: increased Fey receptor affinity enhances B-cell clearing in nonhuman primates., Blood (2009) 113, 3735-3743

[Непатентный документ 16] Jefferis R, Lund J., Interaction sites on human IgG-Fc for FcgammaR: current models., Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65

[Непатентный документ 17] Clynes, R., Yoshizumi, Т., Moroi, Y., Houghton, A.N., and Ravetch, J.V., Fc Receptors are required for passive and active immunity to melanoma., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1998) 95, 652-656

[Непатентный документ 18] Clynes RA, Towers TL, Presta LG, Ravetch JV., Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets., Nat. Med. (2000) 6, 443-446

[Непатентный документ 19] Cartron G, Dacheux L, Salles G, Solal-Celigny P, Bardos P, Colombat P, Watier H., Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene., Blood (2002) 99, 754-758

[Непатентный документ 20] Nimmerjahn F, Ravetch JV., Divergent immunoglobulin g subclass activity through selective Fc receptor binding., Science (2005) 310, 1510-1512

[Непатентный документ 21] Greenwood J, Clark M, Waldmann H., Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions., Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104

[Непатентный документ 22] Morgan A, Jones ND, Nesbitt AM, Chaplin L, Bodmer MW, Emtage JS., The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for Clq, Fc gamma RI and Fc gamma RIII binding., Immunology (1995) 86, 319-324

[Непатентный документ 23] Lazar GA, Dang W, Karki S, Vafa 0, Peng JS, Hyun L, Chan C, Chung HS, Eivazi A, Yoder SC, Vielmetter J, Carmichael DF, Hayes RJ, Dahiyat BI., Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function., Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. (2006) 103, 4005-4010

[Непатентный документ 24] Shinkawa T, Nakamura K, Yamane N, Shoji-Hosaka E, Kanda Y, Sakurada M, Uchida K, Anazawa H, Satoh M, Yamasaki M, Hanai N, Shitara K., The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity., J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473

Сущность изобретения

[Проблемы, решаемые с помощью изобретения]

Настоящее изобретение было осуществлено ввиду описанных выше обстоятельств. Задачей настоящего изобретения является предоставление антигенсвязывающей молекулы с усиленным внутриклеточным захватом связанного антигена, антигенсвязывающих молекул, в которых количество антигенов, которое может связаться на одну молекулу, увеличено, антигенсвязывающих молекул с улучшенной фармакокинетикой, антигенсвязывающих молекул с усиленной внутриклеточной диссоциацией внеклеточно связанного антигена, антигенсвязывающих молекул с усиленным внеклеточным высвобождением в не связанном с антигеном состоянии, антигенсвязывающих молекул, имеющих функцию снижения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме, фармацевтических композиций, содержащих такие антигенсвязывающие молекулы, и способов их получения.

[Средства для решения проблем]

В результате проведения тщательного исследования для достижения упомянутых выше задач, авторы настоящего изобретения создали антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, где антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы изменяется в зависимости от концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, более высокой, чем у связывающего Fcγ-рецептор домена Fc-области нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, присоединенная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров. Более того, авторы настоящего изобретения разработали способ усиления внутриклеточного захвата связанных антигенов, способ увеличения количества антигенов, которые могут связываться с одной антигенсвязывающей молекулой, способ улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы, способ ускорения внутриклеточной диссоциации антигена, который внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой, от антигенсвязывающей молекулы, способ ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы, не связанной с антигеном, и способ снижения общей концентрации антигена и концентрации свободного антигена в плазме, где способы включают контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или in vitro. Более того, авторы изобретения разработали способы получения антигенсвязывающих молекул, обладающих упомянутыми выше свойствами, и также открыли применение фармацевтических композиций, содержащих в качестве активного ингредиента, такую антигенсвязывающую молекулу или антигенсвязывающую молекулу, полученную способом получения по настоящему изобретению, и, тем самым, осуществили настоящее изобретение.

Иными словами, более конкретно, настоящее изобретение относится к [1]-[46] ниже:

[1] Фармацевтическая композиция, которая содержит антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, и где антигенсвязывающий домен обладает антигенсвязывающей активностью, которая изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью в отношении Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

[2] Фармацевтическая композиция согласно [1], где антиген представляет собой растворимый антиген.

[3] Фармацевтическая композиция согласно [1] или [2], где концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция.

[4] Фармацевтическая композиция согласно [3], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях высокой концентрации ионов кальция является более высокой, чем в условиях низкой концентрации ионов кальция.

[5] Фармацевтическая композиция согласно [1] или [2], где условия концентрации ионов представляют собой условия рН.

[6] Фармацевтическая композиция согласно [5], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем в условиях диапазона кислых значений рН.

[7] Фармацевтическая композиция согласно любому из [1]-[6], где антигенсвязывающая молекула обладает нейтрализующей активностью против антигена.

[8] Фармацевтическая композиция согласно любому из [1]-[7], где связывающий Fcγ-рецептор домен содержит Fc-область антитела.

[9] Фармацевтическая композиция согласно [8], где Fc-область представляет собой Fc-область, в которой по меньшей мере одна или несколько аминокислот выбраны из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU, отличаются от аминокислот в соответствующих участках в нативной Fc-области.

[10] Фармацевтическая композиция согласно [9], где Fc-область представляет собой Fc-область, которая содержит по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:

либо Lys, либо Tyr в положении аминокислоты 221;

любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 222;

любой из Phe, Trp, Glu и Lys в положении аминокислоты 203;

любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 224;

любой из Glu, Lys и Trp в положении аминокислоты 225;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 227;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 228;

любой из Ala, Glu, Gly и Tyr в положении аминокислоты 230;

любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 2 32;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 233;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 234;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 235;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 23 6;

любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 237;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 238;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 239;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 240;

любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 241;

любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 243;

His в положении аминокислоты 244;

Ala в положении аминокислоты 245;

любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 246; любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 247;

любой из Glu, His, Gln и Tyr в положении аминокислоты 249; либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 250; Phe в положении аминокислоты 251;

любой из Phe, Met и Tyr в положении аминокислоты 254; любой из Glu, Leu и Tyr в положении аминокислоты 255; любой из Ala, Met и Pro в положении аминокислоты 256; любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 258;

любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 260; любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr в положении аминокислоты 262;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 263;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 264;

любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 265;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 266;

любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 267;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 268;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 269;

любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 270;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 271;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 272;

либо Phe, либо Не в положении аминокислоты 273;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 274;

либо Leu, либо Trp в положении аминокислоты 275;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 276;

любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 278;

Ala в положении аминокислоты 279;

любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 280;

любой из Asp, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 281; любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 282;

любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr в положении аминокислоты 283;

любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr в положении аминокислоты 284;

любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 285;

любой из Glu, Gly, Pro и Tyr в положении аминокислоты 286;

любой из Asn, Asp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 288;

любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 290;

любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln и Thr в положении аминокислоты 291;

любой из Ala, Asp, Glu, Pro, Thr и Tyr в положении аминокислоты 292;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 293;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 294;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 295;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 296;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 297;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 298;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 299;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 300; любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 301; Не в положении аминокислоты 302;

любой из Asp, Gly и Tyr в положении аминокислоты 303;

любой из Asp, His, Leu, Asn и Thr в положении аминокислоты 304;

любой из Glu, Ile, Thr и Tyr в положении аминокислоты 305;

любой из Ala, Asp, Asn, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 311;

Phe в положении аминокислоты 313; Leu в положении аминокислоты 315;

либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 317;

любой из His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 318;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 320;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 322;

Не в положении аминокислоты 32 3;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 324;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 325;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 326;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 327;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 328;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 329;

любой из Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 330;

любой из Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 331;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 332;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 333;

любой из Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro и Thr в положении аминокислоты 334;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 335;

любой из Glu, Lys и Tyr в положении аминокислоты 336;

любой из Glu, His и Asn в положении аминокислоты 337;

любой из Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser и Thr в положении аминокислоты 33 9;

либо Ala, либо Val в положении аминокислоты 376;

либо Gly, либо Lys в положении аминокислоты 377;

Asp в положении аминокислоты 378;

Asn в положении аминокислоты 379;

любой из Ala, Asn и Ser в положении аминокислоты 380;

либо Ala, либо Ile в положении аминокислоты 382;

Glu в положении аминокислоты 385;

Thr в положении аминокислоты 392;

]Leu в положении аминокислоты 396;

Lys в положении аминокислоты 421;

Asn в положении аминокислоты 427;

либо Phe, либо Leu в положении аминокислоты 428;

Met в положении аминокислоты 429;

Trp в положении аминокислоты 434;

Не в положении аминокислоты 436; и

любой из Gly, His, Ile, Leu и Tyr в положении аминокислоты 440,

в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.

[11] Фармацевтическая композиция согласно любому из [1]-[10], где Fc-область нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, представляет собой Fc-область любого из нативного IgG1 человека, нативного IgG2 человека, нативного IgG3 человека и нативного IgG4 человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

[12] Фармацевтическая композиция согласно любому из [1]-[11], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(V) или FcγRIIIa(F).

[13] Фармацевтическая композиция согласно любому из [1]-[11], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIIb.

[14] Фармацевтическая композиция согласно любому из [8]-[13], где Fc-область представляет собой Fc-область, которая содержит по меньшей мере одно или несколько из

Asp в положении аминокислоты 238 и

Glu в положении аминокислоты 328

в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.

[15] Способ, включающий стадию контактирования антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен, который обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с Fc-областью нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, который представляет собой способ согласно любому из:

(i) способа увеличения количества антигенов, которое может связать единичная антигенсвязывающая молекула;

(ii) способа элиминации антигенов плазмы;

(iii) способа улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы;

(iv) способа ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой;

(v) способа ускорения высвобождения наружу клетки антигенсвязывающей молекулы, не связанной с антигеном; и

(vi) способа снижения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме.

[16] Способ согласно [15], где антиген представляет собой растворимый антиген.

[17] Способ согласно [15] или [16], где концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция.

[18] Способ согласно [17], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях высокой концентрации ионов кальция является более высокой, чем в условиях низкой концентрации ионов кальция.

[19] Способ согласно [15] или [16], где условия концентрации ионов представляют собой условия рН.

[20] Способ согласно [19], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем в условиях диапазона кислых значений рН.

[21] Способ согласно любому из [15]-[20], где антигенсвязывающая молекула обладает нейтрализующей активностью против антигена.

[22] Способ согласно любому из [15]-[21], где связывающий Fcγ-рецептор домен содержит Fc-область антитела.

[23] Способ согласно [22], где Fc-область представляет собой Fc-область, в которой по меньшей мере одна или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU, отличаются от аминокислот в соответствующих участках в нативной Fc-области.

[24] Способ согласно [23], где Fc-область представляет собой Fc-область, которая содержит по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:

либо Lys, либо Tyr в положении аминокислоты 221;

любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 222;

любой из Phe, Trp, Glu и Lys в положении аминокислоты 22 3;

любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 224;

любой из Glu, Lys и Trp в положении аминокислоты 225;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 227;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 228;

любой из Ala, Glu, Gly и Tyr в положении аминокислоты 230;

любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 231;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 232; любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 233; любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 234;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 235;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 236;

любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 237;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 238;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 239;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 240;

любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 241;

любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 243;

His в положении аминокислоты 244;

Ala в положении аминокислоты 245;

любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 246;

любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 247;

любой из Glu, His, Gln и Tyr в положении аминокислоты 249;

либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 250;

Phe в положении аминокислоты 251;

любой из Phe, Met и Tyr в положении аминокислоты 254;

любой из Glu, Leu и Tyr в положении аминокислоты 255;

любой из Ala, Met и Pro в положении аминокислоты 256;

любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 258;

любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 260;

любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr в положении аминокислоты 262;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 263;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 264;

любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 265;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 266;

любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 267;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 268;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 269;

любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 270;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 271;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 272;

либо Phe, либо Не в положении аминокислоты 273;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 274;

либо Leu, либо Trp в положении аминокислоты 275;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 276;

любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 278;

Ala в положении аминокислоты 279;

любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 280;

любой из Asp, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 281; любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 282;

любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr в положении аминокислоты 283;

любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr в положении аминокислоты 284;

любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 285;

любой из Glu, Gly, Pro и Tyr в положении аминокислоты 286;

любой из Asn, Asp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 288;

любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 290;

любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln и Thr в положении аминокислоты 291;

любой из Ala, Asp, Glu, Pro, Thr и Tyr в положении аминокислоты 292;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 293;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 294;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 295;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 296;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 297;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 298;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 299;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 300; любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 301; Не в положении аминокислоты 302;

любой из Asp, Gly и Tyr в положении аминокислоты 303;

любой из Asp, His, Leu, Asn и Thr в положении аминокислоты 304;

любой из Glu, Ile, Thr и Tyr в положении аминокислоты 305;

любой из Ala, Asp, Asn, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 311;

Phe в положении аминокислоты 313;

Leu в положении аминокислоты 315;

либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 317;

любой из His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 318;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 320;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 322;

Не в положении аминокислоты 323;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 324;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 325;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 326;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 327;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 328;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 329;

любой из Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 330;

любой из Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 331;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 332;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 333;

любой из Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro и Thr в положении аминокислоты 334;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 335;

любой из Glu, Lys и Tyr в положении аминокислоты 336;

любой из Glu, His и Asn в положении аминокислоты 337;

любой из Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser и Thr в положении аминокислоты 339;

либо Ala, либо Val в положении аминокислоты 376;

либо Gly, либо Lys в положении аминокислоты 377;

Asp в положении аминокислоты 378;

Asn в положении аминокислоты 379;

любой из Ala, Asn и Ser в положении аминокислоты 380;

либо Ala, либо Не в положении аминокислоты 382;

Glu в положении аминокислоты 385;

Thr в положении аминокислоты 392;

Leu в положении аминокислоты 396;

Lys в положении аминокислоты 421;

Asn в положении аминокислоты 427;

либо Phe, либо Leu в положении аминокислоты 428;

Met в положении аминокислоты 429;

Trp в положении аминокислоты 434;

Ile в положении аминокислоты 436; и

любой из Gly, His, Ile, Leu и Tyr в положении аминокислоты 440,

в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.

[25] Способ согласно любому из [15]-[24], где Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, представляет собой Fc-область согласно любому из нативного IgG1 человека, нативного IgG2 человека, нативного IgG3 человека и нативного IgG4 человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

[26] Способ согласно любому из [15]-[25], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(V) или FcγRIIIa(F).

[27] Способ согласно любому из [15]-[25], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIIb.

[28] Способ согласно любому из [22]-[27], где Fc-область представляет собой Fc-область, которая содержит по меньшей мере одно или несколько из

Asp в положении аминокислоты 238 и

Glu в положении аминокислоты 328

в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.

[29] Способ, включающий стадию усиления активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативной Fc-областью IgG-человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, который представляет собой способ согласно любому из:

(i) способа изменения антигенсвязывающей молекулы, где внутриклеточный захват антигена, с которым она связывается, усиливается;

(ii) способа увеличения количества антигенов, которые могут связываться одной молекулой антигенсвязывающей молекулы;

(iii) способа повышения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы;

(iv) способа улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы;

(v) способа ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой;

(vi) способа ускорения высвобождения наружу клетки антигенсвязывающей молекулы, не связанной с антигеном, где антигенсвязывающая молекула была захвачена в клетку в связанной с антигеном форме; и

(vii) способа изменения антигенсвязывающей молекулы, который может снижать общую концентрацию антигена или концентрацию свободного антигена в плазме.

[30] Способ согласно [29], где антиген представляет собой растворимый антиген.

[31] Способ согласно [29] или [30], где концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция.

[32] Способ согласно [31], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях высокой концентрации ионов кальция является более высокой, чем в условиях низкой концентрации ионов кальция.

[33] Способ согласно [29] или [30], где условия концентрации ионов представляют собой условия рН.

[34] Способ согласно [33], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем в условиях диапазона кислых значений рН.

[35] Способ согласно любому из [29]-[34], где антигенсвязывающая молекула обладает нейтрализующей активностью против антигена.

[36] Способ согласно любому из [29]-[35], где связывающий Fcγ-рецептор домен содержит Fc-область антитела.

[37] Способ согласно [36], где Fc-область представляет собой Fc-область, в которой по меньшей мере одна или несколько аминокислот выбраны из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU, отличается от аминокислот в соответствующих участках в нативной Fc-области.

[38] Способ согласно [33], где Fc-область представляет собой Fc-область, содержащую по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:

либо Lys или Tyr в положении аминокислоты 221;

любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 222;

любой из Phe, Trp, Glu и Lys в положении аминокислоты 22 3;

любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 224;

любой из Glu, Lys и Trp в положении аминокислоты 225;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 227;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 228;

любой из Ala, Glu, Gly и Tyr в положении аминокислоты 230;

любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 231;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 232;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,

Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 233;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 234;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 235;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 236;

любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 237;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 238;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 239;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 240;

любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 241;

любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 243;

His в положении аминокислоты 244;

Ala в положении аминокислоты 245;

любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 246; любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 247;

любой из Glu, His, Gln и Tyr в положении аминокислоты 249;

либо Glu, либо Gin в положении аминокислоты 250;

Phe в положении аминокислоты 251;

любой из Phe, Met и Tyr в положении аминокислоты 254; любой из Glu, Leu и Tyr в положении аминокислоты 255; любой из Ala, Met и Pro в положении аминокислоты 256; любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 258;

любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 260; любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr в положении аминокислоты 262;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 263;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 264;

любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 265;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 266;

любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 267;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 268;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 269;

любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 270;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 271;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 272;

либо Phe, либо Не в положении аминокислоты 273;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 274;

либо Leu, либо Trp в положении аминокислоты 275;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 276;

любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 278;

Ala в положении аминокислоты 27 9;

любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 280;

любой из Asp, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 281; любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 282;

любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr в положении аминокислоты 283;

любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr в положении аминокислоты 284;

любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 285;

любой из Glu, Gly, Pro и Tyr в положении аминокислоты 286;

любой из Asn, Asp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 288;

любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 290;

любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln и Thr в положении аминокислоты 291;

любой из Ala, Asp, Glu, Pro, Thr и Tyr в положении аминокислоты 292;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 293;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 294;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 295;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 296;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 297;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 298;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 299;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 300; любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 301; Не в положении аминокислоты 302;

любой из Asp, Gly и Tyr в положении аминокислоты 303;

любой из Asp, His, Leu, Asn и Thr в положении аминокислоты 304;

любой из Glu, Ile, Thr и Tyr в положении аминокислоты 305;

любой из Ala, Asp, Asn, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 311;

Phe в положении аминокислоты 313;

Leu в положении аминокислоты 315;

либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 317;

любой из His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 318;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 32 0;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 322;

Ile в положении аминокислоты 32 3;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 324;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 325;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 326;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 327;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 328;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 329; любой из Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,

Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 330;

любой из Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 331;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 332;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 333;

любой из Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro и Thr в положении аминокислоты 334;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 335;

любой из Glu, Lys и Tyr в положении аминокислоты 336;

любой из Glu, His и Asn в положении аминокислоты 337;

любой из Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser и Thr в положении аминокислоты 33 9;

либо Ala, либо Val в положении аминокислоты 376;

либо Gly, либо Lys в положении аминокислоты 377;

Asp в положении аминокислоты 378;

Asn в положении аминокислоты 379;

любой из Ala, Asn и Ser в положении аминокислоты 380;

либо Ala, либо Ile в положении аминокислоты 382;

Glu в положении аминокислоты 385;

Thr в положении аминокислоты 392;

Leu в положении аминокислоты 396;

Lys в положении аминокислоты 421;

Asn в положении аминокислоты 427;

либо Phe, либо Leu в положении аминокислоты 428;

Met в положении аминокислоты 429;

Trp в положении аминокислоты 434;

Ile в положении аминокислоты 436; и

любой из Gly, His, Ile, Leu и Tyr в положении аминокислоты 440,

в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.

[39] Способ согласно любому из [29]-[38], где Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, представляет собой Fc-область согласно любому из нативного IgGl человека, нативного IgG2 человека, нативного IgG3 человека и нативного IgG4 человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

[40] Способ согласно любому из [29]-[39], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIa, FcγRIIa (R), FcγRIIa (H), FcγRIIb, FcγRIIIa (V) или FcγRIIIa (F).

[41] Способ согласно любому из [29]-[39], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIIb.

[42] Способ согласно любому из [36]-[41], где Fc-область представляет собой Fc-область, которая содержит по меньшей мере одно или несколько из:

Asp в положении аминокислоты 238 и

Glu в положении аминокислоты 328

в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.

[43] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, который содержит стадии:

(a) определения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях высокой концентрации ионов кальция;

(b) определения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях низкой концентрации ионов кальция;

(c) выбора антигенсвязывающего домена, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);

(d) связывания полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен, выбранный согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и в котором активность связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;

(e) культивирования клеток, в которые введен вектор, в котором полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и

(f) сбора антигенсвязывающих молекул из культуры согласно (е).

[44] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, который включает стадии:

(a) определения антигенсвязывающей активности антитела в условиях высокой концентрации ионов кальция;

(b) определения антигенсвязывающей активности антитела в условиях низкой концентрации ионов кальция;

(c) выбора антитела, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);

(d) связывания полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен антитела, выбранного согласно (с) с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и в котором активность связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;

(e) культивирования клеток, в которые введен вектор, в котором полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и (f) сбора антигенсвязывающих молекул из клеточной культуры согласно (е).

[45] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, который включает стадии:

(a) определения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях диапазона нейтральных значений рН;

(b) определения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях диапазона кислых значений рН;

(c) выбора антигенсвязывающего домена, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);

(d) связывания полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен, выбранный согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и в котором активность связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;

(e) культивирования клеток, в которые введен вектор, в котором полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и

(f) сбора антигенсвязывающих молекул из клеточной культуры согласно (е).

[46] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, который включает стадии:

(a) определения антигенсвязывающей активности антитела в условиях диапазона нейтральных значений рН;

(b) определения антигенсвязывающей активности антитела в условиях диапазона кислых значений рН;

(c) выбора антитела, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);

(d) связывания полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен антитела, выбранный согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, в котором активность связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;

(e) культивирования клеток, в которые введен вектор, в котором полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и

(f) сбора антигенсвязывающих молекул из клеточной культуры согласно (е).

[47] Способ получения согласно любому из [43]-[46], где антиген представляет собой растворимый антиген.

[48] Способ получения согласно любому из [43]-[47], где связывающий Fcγ-рецептор домен содержит Fc-область антитела.

[49] Способ получения согласно [48], где Fc-область представляет собой Fc-область, в которой по меньшей мере одна или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU, отличаются от аминокислот в соответствующих участках в нативной Fc-области.

[50] Способ получения согласно [49], где Fc-область содержит по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:

либо Lys, либо Tyr в положении аминокислоты 221;

любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 222;

любой из Phe, Trp, Glu и Lys в положении аминокислоты 223;

любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 224;

любой из Glu, Lys и Trp в положении аминокислоты 225;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 227;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 228;

любой из Ala, Glu, Gly и Tyr в положении аминокислоты 230;

любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 231;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 232;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 233;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 234;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 235;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 236;

любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 237;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 238;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 239;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 240;

любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 241;

любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 243;

His в положении аминокислоты 244;

Ala в положении аминокислоты 245;

любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 246;

любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 247;

любой из Glu, His, Gln и Tyr в положении аминокислоты 249;

либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 250;

Phe в положении аминокислоты 251;

любой из Phe, Met и Tyr в положении аминокислоты 254;

любой из Glu, Leu и Tyr в положении аминокислоты 255;

любой из Ala, Met и Pro в положении аминокислоты 256;

любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 258;

любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 260;

любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr в положении аминокислоты 262;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 263;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 264;

любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 265;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 266;

любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 267;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 268;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 269;

любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 270;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 271;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 272;

либо Phe, либо Ile в положении аминокислоты 273;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 274;

либо Leu, либо Trp в положении аминокислоты 275;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 276;

любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 278;

Ala в положении аминокислоты 279;

любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 280;

любой из Asp, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 281;

любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 282;

любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr в положении аминокислоты 283;

любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr в положении аминокислоты 284;

любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 285;

любой из Glu, Gly, Pro и Tyr в положении аминокислоты 286;

любой из Asn, Asp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 288;

любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 290;

любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln и Thr в положении аминокислоты 291;

любой из Ala, Asp, Glu, Pro, Thr и Tyr в положении аминокислоты 292;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 293;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 294;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 295;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 296;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 297;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 298;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 299;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 300;

любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 301;

Ile в положении аминокислоты 302;

любой из Asp, Gly и Tyr в положении аминокислоты 303;

любой из Asp, His, Leu, Asn и Thr в положении аминокислоты 304;

любой из Glu, Ile, Thr и Tyr в положении аминокислоты 305;

любой из Ala, Asp, Asn, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 311;

Phe в положении аминокислоты 313;

Leu в положении аминокислоты 315;

либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 317;

любой из His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 318;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 320;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 322;

Ile в положении аминокислоты 323;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 324;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 325;

любой из Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 326;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 327;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 328;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 329;

любой из Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 330;

любой из Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 331;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 332;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 333;

любой из Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro и Thr в положении аминокислоты 334;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 335;

любой из Glu, Lys и Tyr в положении аминокислоты 336;

любой из Glu, His и Asn в положении аминокислоты 337;

любой из Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser и Thr в положении аминокислоты 339;

либо Ala, либо Val в положении аминокислоты 376;

либо Gly, либо Lys в положении аминокислоты 377;

Asp в положении аминокислоты 378;

Asn в положении аминокислоты 379;

любой из Ala, Asn и Ser в положении аминокислоты 380;

либо Ala, либо Ile в положении аминокислоты 382;

Glu в положении аминокислоты 385;

Thr в положении аминокислоты 392;

Leu в положении аминокислоты 396;

Lys в положении аминокислоты 421;

Asn в положении аминокислоты 427;

либо Phe, либо Leu в положении аминокислоты 428;

Met в положении аминокислоты 429;

Trp в положении аминокислоты 434;

Ile в положении аминокислоты 436; и

любой из Gly, His, Ile, Leu и Tyr в положении аминокислоты 440,

в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.

[51] Способ получения согласно любому из [43]-[50], где связывающий Fcγ-рецептор домен представляет собой Fc-область любого из нативного IgG1 человека, нативного IgG2 человека, нативного IgG3 человека и нативного IgG4 человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

[52] Способ получения согласно любому из [43]-[51], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIa, FcγRIIa (R), FcγRIIa (H), FcγRIIb, FcγRIIIa (V) или FcγRIIIa (F).

[53] Способ получения согласно любому из [43]-[51], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIIb.

[54] Способ получения согласно любому из [48]-[53], где Fc-область содержит по меньшей мере одну или несколько аминокислот из:

Asp в положении аминокислоты 238 и

Glu в положении аминокислоты 328

в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлен неограниченный механизм действия для элиминации растворимого антигена из плазмы посредством введения антитела, которое связывается с антигеном зависимым от концентрации ионов образом и связывание которого с Fcγ-рецептором усилено при нейтральных значениях рН по сравнению с существующими нейтрализующими антителами.

На фиг. 2 представлена концентрация рецептора IL-6 человека с течением времени в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, которое связывается с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом, или H54/L28-IgG1.

На фиг. 3 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, которое связывается с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом, Fv4-IgG1-F760, которое представляет собой вариант Fv4-IgG1, который лишен связывания FcγR мыши, Fv4-IgG1-F1022, которое представляет собой вариант Fv4-IgG1 с усиленным связыванием FcγR мыши, или Fv4-IgG1-Fuc, которое представляет собой антитело Fv4-IgG1 с низким содержанием фукозы.

На фиг. 4 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, или антигенсвязывающие молекулы, содержащие в качестве тяжелой цепи Fv4-IgGl-F1022 или Fv4-IgG1-F1093, которое является вариантом Fv4-IgG1-F1022 с повышенным связыванием FcRn в диапазоне кислых значений рН.

На фиг. 5 представлена концентрация с течением времени введенных антигенсвязывающих молекул в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, или антигенсвязывающие молекулы, содержащие в качестве тяжелой цепи Fv4-IgG1-F1022 или Fv4-IgG1-F1093, которое представляет собой вариант Fv4-IgG1-F1022 с повышенным связыванием FcRn в диапазоне кислых значений рН.

На фиг. 6 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1087, которое является вариантом Fv4-IgG1 с усиленным связыванием FcγR мыши (в частности, усиленным связыванием мыши FcγRIIb и связыванием FcγRIII мыши) и Fv4-IgG1-F1182, которое представляет собой вариант Fv4-IgG1 с усиленным связыванием FcγR (в частности, усиленным связыванием FcγRI и связыванием FcγRIV).

На фиг. 7 представлена концентрация с течением времени введенных антигенсвязывающих молекул в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1087 и Fv4-IgG1-F1180 и Fv4-IgG1-F1412, которые представляют собой варианты Fv4-IgG1-F1087 с повышенным связыванием FcRn в диапазоне кислых значений рН.

На фиг. 8 представлена концентрация с течением времени введенных антигенсвязывающих молекул в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1182 и Fv4-IgG1-F1181, которое является вариантом Fv4-IgG1-F1182 с повышенным связыванием FcRn в диапазоне кислых значений рН.

На фиг. 9 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1087 и Fv4-IgG1-F1180 и Fv4-IgG1-F1412, которые являются вариантами Fv4-IgG1-F1087 с повышенным связыванием FcRn в диапазоне кислых значений рН.

На фиг. 10 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1182 и Fv4-IgG1-F1181, которое является вариантом Fv4-IgG1-F1182 с повышенным связыванием FcRn, в диапазоне кислых значений рН.

На фиг. 11 представлены результаты изменения концентрации в плазме Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1782 или Fv4-IgG1-F1087 у трансгенной мыши с FcRn человека, когда мыши вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1782 или Fv4-IgG1-F1087.

На фиг. 12 представлены результаты изменения концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека у трансгенной мыши с FcRn человека, когда мыши вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1782 или Fv4-IgG1-F1087.

На фиг. 13 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме нормальных мышей, которым вводили Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши, и Fv4-mIgG1-mF46, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с дополнительно усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши.

На фиг. 14 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме мышей с дефицитом FcγRIII, которым вводили Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши, и Fv4-mIgG1-mF46, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с дополнительно усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши.

На фиг. 15 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме мышей с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора, которым вводили Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши, и Fv4-mIgG1-mF46, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с дополнительно усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши.

На фиг. 16 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме мышей с дефицитом FcγRIIb, которым вводили Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши, и Fv4-mIgG1-mF46, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с дополнительно усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши.

На фиг. 17 представлен результат оценки способности к агрегации тромбоцитов иммунокомплекса омализумаб-G1d-v3/IgE с помощью анализа агрегации тромбоцитов с использованием тромбоцитов, происходящих из доноров с аллотипом FcγRIIa (R/H).

На фиг. 18 представлен результат оценки способности к агрегации тромбоцитов иммунокомплекса омализумаб-G1d-v3/IgE с помощью анализа агрегации тромбоцитов с использованием тромбоцитов, происходящих из доноров с аллотипом FcγRIIa (Н/Н).

На фиг. 19 представлен результат оценки экспрессии CD62p на поверхности мембраны промытых тромбоцитов. Закрашенная черным цветом область на графике указывает на результат стимуляции посредством ADP после реакции с PBS. Область, которая не закрашена на графике, указывает на результат стимуляции посредством ADP после реакции с иммунокомплексом.

На фиг. 20 представлен результат оценки экспрессии активного интегрина на поверхности мембраны тромбоцитов. Закрашенная черным цветом область на графике указывает на результат стимуляции посредством ADP после реакции с PBS. Область, которая не закрашена на графике, указывает на результат стимуляции посредством ADP после реакции с иммунокомплексом.

На фиг. 21 представлены результаты оценки активности агрегации тромбоцитов, индуцируемой иммунокомплексом омализумаб-BP230/IgE и иммунокомплексом омализумаб-G1d-v3/IgE в анализе агрегации тромбоцитов с использованием тромбоцитов, происходящих из донора с полиморфизмом FcγRIIa (R/H).

На фиг. 22 представлены результаты оценки экспрессии CD62p на поверхности мембраны промытых тромбоцитов. Закрашенный серым цветом график указывает на результат, когда стимуляцию посредством добавления ADP проводили после реакции с PBS, сплошная линия и пунктирная линия указывают на результаты, когда стимуляцию посредством ADP проводили после реакции с иммунокомплексом омализумаб-G1d-v3/IgE и иммунокомплексом омализумаб-ВР230/IgE, соответственно.

На фиг. 23 представлены результаты оценки активации экспрессии интегринов на поверхности мембраны промытых тромбоцитов. Закрашенный серым цветом график указывает на результат, когда стимуляцию посредством добавления ADP проводили после реакции с PBS, сплошная линия и пунктирная линия указывают на результаты, когда стимуляцию посредством ADP проводили после реакции с иммунокомплексом омализумаб-G1d-v3/IgE и иммунокомплексом омализумаб-ВР230/IgE, соответственно.

На фиг. 24 представлен график, на котором на горизонтальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для каждого варианта PD, а на вертикальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIa типа R для каждого варианта PD. Значение величины связывания каждого варианта PD с каждым FcγR делили на значение величины связывания IL6R-F652/IL6R-L, которое представляет собой контрольное антитело до внесения изменения (IL6R-F652, соответствующая SEQ ID NO: 142, представляет собой тяжелую цепь антитела, содержащую измененную Fc с заменой Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp), с каждым FcγR; а затем полученную величину умножали на 100 и использовали в качестве относительной величины активности связывания для каждого варианта PD с каждым FcγR. На графике F652 на фигуре показана величина для IL6R-F652/IL6R-L.

На фиг. 25 показан график, на котором на вертикальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для вариантов, полученных путем внесения каждого изменения в GpH7-B3 (SEQ ID NO: 159)/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 160), которое не имеет изменения P238D, и на горизонтальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для вариантов, полученных путем внесения каждого изменения в IL6R-F652 (SEQ ID NO: 142)/IL6R-L, имеющего изменение P238D. Значение величины связывания FcγRIIb каждого варианта делили на значение величины связывания FcγRIIb предварительно измененного антитела; а затем полученную величину умножали на 100 и использовали в качестве величины относительной активности связывания. В этом случае, область А содержит изменения, которые проявляют эффект усиления связывания FcγRIIb в обоих случаях, когда изменение вносят в GpH7-B3/GpL16-k0, которое не имеет P238D, и когда изменение вносят в IL6R-F652/IL6R-L, которое имеет P238D. Область В содержит изменения, которые проявляют эффект усиления связывания FcγRIIb при внесении в GpH7-B3/GpL16-k0, которое не имеет P238D, но не проявляют эффекта усиления связывания FcγRIIb при внесении в IL6R-F652/IL6R-L, которое имеет P238D.

На фиг. 26 показана кристаллическая структура комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 27 представлено изображение наложения кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и модельной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb, в отношении внеклеточной области FcγRIIb и СН2-домена А Fc путем аппроксимации методом наименьших квадратов на основании расстояний между парами атомов Сα.

На фиг. 28 показано сравнение детальной структуры в области P238D после наложения кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и модельной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb, в отношении только СН2-домена A Fc или только СН2-домена В Fc путем аппроксимации методом наименьших квадратов на основании расстояний между парами атомов Сα.

На фиг. 29 показано, что водородная связь может находиться между основной цепью Gly в положении 237 (указанном согласно нумерации EU) в СН2-домене A Fc, и Tyr в положении 160 в FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc (P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 30 показано, что между Asp в положении 270 (указанном согласно нумерации EU) в СН2-домене В Fc, и Arg в положении 131 FcγRIIb может быть выявлено электростатическое взаимодействие в кристаллической структуре комплекса внеклеточной области Fc(P238D)/FcγRIIb.

На фиг. 31 представлен график, на котором на горизонтальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для каждого варианта 2В, и на вертикальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIa типа R для каждого варианта 2В. Значение величины связывания каждого варианта 2В с каждым FcγR делили на значение величины связывания контрольного антитела перед изменением (измененная Fc с заменой Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp) для каждого FcγR; а затем полученную величину умножали на 100, и использовали в качестве величины относительной активности связывания каждого варианта 2В в отношении каждого FcγR.

На фиг. 32 показан Glu в положении 233 (указанном согласно нумерации EU) в цепи A Fc и окружающие остатки во внеклеточной области FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 33 показан Ala в положении 330 (указанном согласно нумерации EU) в цепи A Fc и окружающие остатки во внеклеточной области FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.

На фиг. 34 показаны структуры Pro в положении 271 (указанном согласно нумерации EU) цепи В Fc после наложения кристаллических структур комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa путем аппроксимации методом наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Сα, в отношении В-цепи Fc.

На фиг. 35 представлено изображение комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенное посредством рентгеноструктурного анализа. Для каждого из доменов СН2 и СН3 в Fc-области, домены слева обозначены как домен А и домены справа обозначены как домен В.

На фиг. 36 представлено сравнение после наложения структур комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb и комплекса Fc (WT)/внеклеточная область FcγRIIa (код PDB: 3RY6), определенных с помощью рентгеноструктурного анализа, в отношении СН2-домена А Fc-области посредством аппроксимации методом наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Сα. На этой диаграмме структура, изображенная с помощью жирной линии, демонстрирует комплекс Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, в то время как структура, изображенная тонкой линией, указывает на структуру Fc (WT)/внеклеточная область FcγRIIa. Только СН2-домен А Fc-области изображен для комплекса Fc (WT)/внеклеточная область FcγRIIa.

На фиг. 37 представлена рентгеновская кристаллическая структура комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, детальная структура в области Asp в положении 237 (нумерация EU) в СН2-домене А Fc-области, который образует водородную связь с Tyr в положении 160 в FcγRIIb в структуре основной цепи.

На фиг. 38 представлена рентгеновская кристаллическая структура комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, структура аминокислотных остатков в области Asp в положении 237 (нумерация EU) в СН2-домене А Fc-области, который образует водородную связь с Tyr в положении 160 в FcγRIIb в структуре основной цепи.

На фиг. 39 представлено сравнение в области петли в положениях 266-271 (нумерация EU) после наложения рентгеновских кристаллических структур комплекса Fc (P238D)/внеклеточный домен FcγRIIb, представленного в примере 10, и комплекса Fc (Р208)/внеклеточный домен FcγRIIb в отношении СН2-домена В Fc-области посредством аппроксимации методом наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Сα. По сравнению с Fc (P238D), Fc (Р208) имеет изменение H268D в положении 268 (нумерация EU) и изменение P271G в положении 271 (нумерация EU) в петле.

На фиг. 40 представлена диаграмма, на которой показана структура в области Ser239 в СН2-домене В Fc-области в рентгеновской кристаллической структуре комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, вместе с электронной плотностью, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа с использованием коэффициента 2Fo-Fc.

На фиг. 41 представлено сравнение после наложения трехмерных структур комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR и комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенных с помощью рентгеноструктурного анализа посредством аппроксимации методом наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Сα.

На фиг. 42 представлено сравнение в области Asp в положении 237 (нумерация EU) в СН2-домене А Fc-области между рентгеновскими кристаллическими структурами комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR и комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, вместе с электронной плотностью, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа с использованием коэффициента 2Fo-Fc.

На фиг. 43 представлено сравнение в области Asp в положении 237 (нумерация EU) в СН2-домене В Fc-области между рентгеновскими кристаллическими структурами комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR и комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, вместе с электронной плотностью, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа с использованием коэффициента 2Fo-Fc.

На фиг. 44 представлено сравнение между последовательностями константной области G1d и G4d. На диаграмме аминокислоты, заключенные в жирную рамку, указывают на положения с отличающимися аминокислотными остатками между G1d и G4d.

На фиг. 45 представлено изменение концентрации в плазме антитела GA2-IgG1 и GA2-F1087 у нормальных мышей.

На фиг. 46 представлено изменение концентрации в плазме hIgA у нормальных мышей, которым вводили GA2-IgG1 и GA2-F1087.

На фиг. 47 представлено изменение концентрации в плазме антител 278-IgG1 и 278-F1087 у мышей C57BL/6J.

На фиг. 48 представлено изменение концентрации в плазме hIgE (Asp6) у мышей C57BL/6J, которым вводили 278-IgG1 и 278-F1087.

На фиг. 49 представлена структура CDR3 тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела 6RL#9, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа. На (i) представлена кристаллическая структура CDR3 тяжелой цепи, полученная в условиях кристаллизации в присутствии ионов кальция. На (ii) представлена кристаллическая структура CDR3 тяжелой цепи, полученная в условиях кристаллизации в отсутствие ионов кальция.

На фиг. 50 представлена концентрация в плазме с течением времени каждого антитела у нормальных мышей, которым вводили антитело H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 или 6RL#9-IgG1.

На фиг. 51 представлена концентрация в плазме с течением времени растворимого рецептора IL-6 человека (hsIL-6R) у нормальных мышей, которым вводили антитело H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 или 6RL#9-IgG1.

На фиг. 52 представлены ионообменные хроматограммы для антитела, имеющего последовательность Vk5-2 человека, и антитела, имеющего последовательность hVk5-2_L65, которая имеет измененную последовательность гликозилирования в последовательности Vk5-2 человека. Сплошная линия показывает хроматограмму для антитела, имеющего последовательность Vk5-2 человека (тяжелая цепь: CIM_H (SEQ ID NO: 67); легкая цепь: hVk5-2 (SEQ ID NO: 4)); пунктирная линия показывает хроматограмму для антитела, имеющего последовательность hVk5-2_L65 (тяжелая цепь: CIM_H (SEQ ID NO: 67); легкая цепь: hVk5-2_L65 (SEQ ID NO: 70)).

На фиг. 53А представлены ионообменные хроматограммы для антитела, имеющего последовательность LfVk1_Ca (тяжелая цепь: GC_H (SEQ ID NO: 51); легкая цепь: LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83)) и антитела, имеющего последовательность, в которой Asp (D) в последовательности LfVk1_Ca заменен на Ala, (А) после хранения при 5°С (сплошная линия) или 50°С (пунктирная линия). После хранения при 5°С, наиболее высокий пик в хроматограмме для каждого антитела определяется как основной пик и ось у каждой ионообменной хроматографии нормализовывали к главному пику. На графике представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83) в качестве легкой цепи.

На фиг. 53В представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Cal (SEQ ID NO: 85) в качестве легкой цепи.

На фиг. 53С представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Ca2 (SEQ ID NO: 86) в качестве легкой цепи.

На фиг. 53D представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Ca3 (SEQ ID NO: 87) в качестве легкой цепи.

На фиг. 54А представлены ионообменные хроматограммы для антитела, имеющего последовательность LfVk1_Ca (тяжелая цепь: GC_H (SEQ ID NO: 51); легкая цепь: LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83)) и антитела, имеющего последовательность LfVk1_Ca6 (тяжелая цепь: GC_H (SEQ ID NO: 51); легкая цепь: LfVk1_Ca6 (SEQ ID NO: 88)), в котором Asp (D) в положении 30 (нумерация Kabat) в последовательности LfVk1_Ca заменен на Ser (S), после хранения при 5°С (сплошная линия) или 50°С (пунктирная линия). После хранения при 5°С наиболее высокий пик на хроматограмме для каждого антитела определяется как основной пик и ось у каждой ионообменной хроматограммы нормализовывали к основному пику. На графике представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83) в качестве легкой цепи.

На фиг. 54В представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Ca6 (SEQ ID NO: 88) в качестве легкой цепи.

На фиг. 55 представлена взаимосвязь между модельным распределением аминокислот (указанным как "Модель") и распределением аминокислот для информации о последовательности из 290 клонов, выделенных из Е. coli, в которые была введена библиотека генов антител, которые связываются с антигеном Са-зависимым образом (указанным как "Библиотека"). На горизонтальной оси указано положение аминокислот (нумерация Kabat). На вертикальной оси указан процент распределения аминокислот.

На фиг. 56 представлены сенсограммы для антитела против IL-6R (тоцилизумаб), антитела 6RC1IgG_010, антитела 6RC1IgG_012 и антитела 6RC1IgG_019 в условиях высокой концентрации ионов кальция (1,2 мМ). На горизонтальной оси представлено время и на вертикальной оси представлена величина RU.

На фиг. 57 представлены сенсограммы для антитела против IL-6R (тоцилизумаб), антитела 6RC1IgG_010, антитела 6RC1IgG_012 и антитела 6RC1IgG_019 в условиях низкой концентрации ионов кальция (3 мкМ). На горизонтальной оси показано время и на вертикальной оси представлена величина RU.

На фиг. 58 представлена взаимосвязь между модельным распределением аминокислот (указанным как "Модель") и распределением аминокислот для информации о последовательности из 132 клонов, выделенных из Е. coli, в которые введена библиотека генов антител, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом (указанным как "Библиотека"). На горизонтальной оси представлено положение аминокислот (нумерация Kabat). На вертикальной оси представлен процент распределения аминокислот.

На фиг. 59 представлены сенсограммы для антитела против IL-6R (тоцилизумаб), антитела 6RpH#01, антитела 6RpH#02 и антитела 6RpH#03 при рН 7,4. На горизонтальной оси представлено время и на вертикальной оси представлена величина RU.

На фиг. 60 представлены сенсограммы для антитела против IL-6R (тоцилизумаб), антитела 6RpH#01, антитела 6RpH#02 и антитела 6RpH#03 при рН 6,0. На горизонтальной оси показано время и на вертикальной оси представлена величина RU.

На фиг. 61А представлена график ответов ECL на нативную Fc и измененную Fc из сывороток, полученных от 15-30 независимых пациентов с ревматизмом. На графиках ответов ECL на нативную Fc (фиг. 61А), представлены Fv4-YTE (фиг. 61В), Fv4-F1166 (=YTE+Q438R/S440E) (фиг. 61С), Fv4-F1167 (=YTE+S424N) (фиг. 61D), Fv4-LS (фиг. 61Е), Fv4-F1170 (=LS+Q438R/S440E) (фиг. 61F), Fv4-F1171 (=LS+S424N) (фиг. 61G, Fv4-N434H (фиг. 61Н), Fv4-F1172 (=N434H+Q438R/S440E) (фиг. 61I), Fv4-F1173 (=N434H+S424N) (фиг. 61J), соответственно.

Фиг. 61В является продолжением фиг. 61А.

Фиг. 61С является продолжением фиг. 61В.

Фиг. 61D является продолжением фиг. 61С.

Фиг. 61Е является продолжением фиг. 61D.

Фиг. 61Е является продолжением фиг. 61Е.

Фиг. 61G является продолжением фиг. 61F.

Фиг. 61Н является продолжением фиг. 61G.

Фиг. 61I является продолжением фиг. 61Н.

Фиг. 61J является продолжением фиг. 61I.

На фиг. 62А представлен график ответов ECL на измененную Fc из сывороток, полученных от 30 независимых пациентов с ревматизмом. На графиках ответов ECL на Fv4-LS (фиг. 62А), представлены Fv4-F1380 (фиг. 62В), Fv4-F1384 (фиг. 62С), Fv4-F1385 (фиг. 62D), Fv4-F1386 (фиг. 62Е), Fv4-F1388 (фиг. 62F) и Fv4-F1389 (фиг. 62G), соответственно.

Фиг. 62В является продолжением фиг. 62А.

Фиг. 62С является продолжением фиг. 62В.

Фиг. 62D является продолжением фиг. 62С.

Фиг. 62Е является продолжением фиг. 62D.

Фиг. 62F является продолжением фиг. 62Е.

Фиг. 62G является продолжением фиг. 62F.

[Способы осуществления изобретения]

Ниже предоставлены определения и подробное описание, чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, проиллюстрированного в настоящем описании.

Аминокислоты

В рамках настоящего изобретения аминокислоты описаны с помощью однобуквенного или трехбуквенного кодов или обоих из них, например, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I или Val/V.

Изменение аминокислот

Для изменений аминокислот в аминокислотной последовательности антигенсвязывающей молекулы, можно соответствующим образом использовать известные способы, такие как способы сайт-направленного мутагенеза (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и перекрывающаяся ПЦР. Вставки, делеции и/или замены аминокислот вносят соответствующим образом с помощью этих известных способов. Замена аминокислотных остатков означает замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком для цели изменения аспектов, таких как следующие:

(a) структура основной цепи полипептида в области спиральной структуры или области структуры слоя;

(b) заряд или гидрофобность заданного участка; или

(c) длина боковой цепи.

Аминокислотные остатки подразделяют на следующие группы, исходя из свойств боковых цепей, включенных в их структуры:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu и Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn и Gln;

(3) кислые: Asp и Glu;

(4) основные: His, Lys и Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly и Pro; и

(6) ароматические: Trp, Tyr и Phe.

Замену между аминокислотными остатками в каждой из этих групп называют консервативной заменой. С другой стороны, замену между аминокислотными остатками из различных групп аминокислот называют неконсервативной заменой. Замены в рамках настоящего изобретения могут представлять собой консервативные замены или неконсервативные замены или комбинацию консервативных и неконсервативных замен. Более того, в качестве способов изменения аминокислот для замены на ненативные аминокислоты можно использовать множество известных способов (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; и Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Например, можно использовать бесклеточную систему трансляции (Clover Direct (Protein Express)), содержащую тРНК, которая имеет ненативную аминокислоту, связанную с комплементарной амбер-супрессорной тРНК кодона UAG (амбер-кодон), который является одним из стоп-кодонов.

Более того, в качестве обозначения аминокислотного изменения можно использовать обозначение, в котором используются однобуквенные коды аминокислот для аминокислоты до лигирования и аминокислоты после изменения, перед и после номера, указывающего на конкретное положение, соответственно. Например, изменение P238D, которое используют при замене аминокислоты Fc-области, включенной в константную область антитела, обозначает замену Pro в положении 238 (в соответствии с нумерацией EU) на Asp. Иными словами, номер указывает на положение аминокислоты в соответствии с нумерацией EU, однобуквенный код аминокислоты, находящийся перед номером, указывает на аминокислоту до замены и однобуквенный код аминокислоты, находящийся после номера, указывает на аминокислоту после замены.

И/или

Как используют в рамках изобретения, термин "и/или" означает комбинацию терминов до и после выражения "и/или" и включает каждую комбинацию, где "и" и "или" пригодным образом комбинируются. В частности, например, выражение "аминокислоты в положениях 326, 328 и/или 428 являются замещенными" включает следующие варианты изменений аминокислот:

аминокислота(ы) в (а) положении 326, (b) положении 328, (с) положении 428, (d) положениях 326 и 328, (е) положениях 326 и 428, (f) положениях 328 и 428 и (g) положениях 326, 328 и 428.

Антигены

Как используют в рамках изобретения, структура "антигена", в частности, не ограничивается конкретной структурой при условии, что она включает эпитоп, который связывается антигенсвязывающим доменом. В другом значении антиген может представлять собой неорганический материал или органический материал и предпочтительно он представляет собой растворимый антиген, который присутствует в жидкости организма и который в одном варианте осуществления может связываться антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению. Примерами антигенов являются следующие молекулы:

17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-кето-PGF1a, 8-изо-PGF2a, 8-оксо-dG, аденозиновый рецептор A1, A33, ACE, ACE-2, активны, активны A, активны AB, активны В, активин С, активин RIA, активин RIA ALK-2, активин RIB ALK-4, активин RIIA, активин RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/ТАСЕ, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, адрессин, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсин, антагонист альфа-V/бета-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, артемин, анти-Id, ASPARTIC, предсердный натрийуретический пептид, интегрин av/b3, Ax1, b2M, В7-1, В7-2, В7-Н, В-лимфоцитарный стимулирующий фактор (BlyS), ВАСЕ, ВАСЕ-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, ВАK, Вах, ВСА-1, ВСАМ, Bcl, ВСМА, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 остеогенин, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, бомбезин, костный нейротрофический фактор, BPDE, BPDE-DNA, BTC, фактор комплемента 3 (С3), С3а, С4, С5, С5а, С10, СА125, CAD-8, кальцитонин, сАМР, карциноэмбриональный антиген (СЕА), ассоциированный со злокачественной опухолью, катепсин А, катепсин В, катепсин C/DPPI, катепсин D, катепсин Е, катепсин Н, катепсин L, катепсин О, катепсин S, катепсин V, катепсин X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белок р67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (В7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, токсин Botulinum, токсин Clostridium perfringens, CKb8-l, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, цитокератиновый ассоциированный с опухолью антиген, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, регулирующий фактор комплемента (фактор, ускоряющий распад), дез-(1-3)-IGF-I (IGF-1 головного мозга), Dhh, дигоксин, ДНКМ-1, ДНКаза, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, рецептор эндотелина, энкефалиназа, eNOS, Eot, эотаксин 1, EpCAM, эфрин B2/EphB4, EPO, ERCC, Е-селектин, ET-1, фактор IIa, фактор VII, фактор VIIIc, фактор IX, фактор активации фибробластов (FAP), Fas, FcRI, FEN-1, ферритин, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, фибрин, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующий гормон, фракталкин, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа1, GFR-альфа2, GFR-альфа3, GITR, глюкагон, Glut4, гликопротеин IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp 130, gp72, GRO, рилизинг-фактор гормона роста, гаптен (NP-cap или NIP-cap), НВ-EGF, НСС, гликопротеин оболочки gB HCMV, гликопротеин оболочки дН HCMV, UL HCMV, гемопоэтический фактор роста (HGF), НерВ gp120, гепараназа, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеин gB вируса простого герпеса (HSV), гликопротеин gD HSV, HGFA, высокомолекулярный ассоциированный с меланомой антиген (HMW-MAA), gp120 HIV, петля V3 gp 120 IIIB HIV, HLA, HLA-DR, HM1,24, HMFG РЕМ, HRG, Hrk, сердечный миозин человека, цитомегаловирус человека (HCMV), гормон роста человека (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, рецептор IgA, IgE, IGF, IGF-связывающий белок, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, интерферон (INF)-альфа, INF-бета, INF-гамма, ингибин, iNOS, А-цепь инсулина, В-цепь инсулина, инсулиноподобный фактор роста 1, интегрин альфа-2, интегрин альфа-3, интегрин альфа-4, интегрин альфа4/бета1, интегрин альфа4/бета7, интегрин альфа5 (альфа V), интегрин альфа5/бета1, интегрин альфа5/бета3, интегрин альфа6, интегрин бета1, интегрин бета2, интерферон-гамма, IP-10, I-TAC, JE, калликреин 2, калликреин 5, калликреин 6, калликреин 11, калликреин 12, калликреин 14, калликреин 15, калликреин LI, калликреин L2, калликреин L3, калликреин L4, КС, KDR, фактор роста кератиноцитов (KGF), ламинин 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), латентный TGF-1, латентный TGF-1 bpl, LBP, LDGF, LECT2, lefty, антиген Lewis-Y, ассоциированный с Lewis-Y антиген, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеин, LIX, LKN, Lptn, L-селектин, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, белок поверхности легких, лютеинизирующий гормон, рецептор лимфотоксина-бета, Мас-1, MAdCAM, MAG, МАР2, MARC, МСАМ, МСАМ, МСК-2, МСР, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеазы, рецептор MGDF, MGMT, МНС (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, МК, ММАС1, ММР, ММР-1, ММР-10, ММР-11, ММР-12, ММР-13, ММР-14, ММР-15, ММР-2, ММР-24, ММР-3, ММР-7, ММР-8, ММР-9, MPIF, Мро, MSK, MSP, муцин (Muc1), MUC18, мюллерово ингибиторное вещество, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, адгерин N-C, NCA90, NCAM, NCAM, неприлизин, нейротрофин-3, -4 или -6, нейротурин, фактор роста нервов (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGGI, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, pl50, p95, PADPr, паратиреоидный гормон, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, Р-кадгерин, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, РЕМ, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, плацентарная щелочная фосфатаза (PLAP), P1GF, PLP, PP14, проинсулин, прорелаксин, белок С, PS, PSA, PSCA, простат-специфический мембранный антиген (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, А-цепь релаксина, В-цепь релаксина, ренин, респираторно-синцитиальный вирус (RSV) F, RSV Fgp, Ret, ревматоидный фактор, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, сывороточный альбумин, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (ассоциированный с опухолью гликопротеин-72), TARC, ТСА-3, Т-клеточный рецептор (например, Т-клеточный рецептор альфа/бета), TdT, ТЕСК, ТЕМ1, ТЕМ5, ТЕМ7, ТЕМ8, TERT, PLAP-подобная щелочная фосфатаза семенников, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, панспецифический TGF-бета, TGF-бета RI (ALK-5), TGF-бета RII, TGF-бета RIIb, TGF-бета RIII, TGF-бета 1, TGF-бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4, TGF-бета 5, тромбин, Ck-1 тимуса, тиреотропный гормон, Tie, TIMP, TIQ, тканевой фактор, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа-бета, TNF-бета 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 R5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD 120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD 120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (0X40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL Rl TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (лиганд Apo-2 TRAIL, TL2), TNFSF11 (лиганд ODF TRANCE/RANK, лиганд OPG), TNFSF12 (лиганд Apo-3 TWEAK, лиганд DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (лиганд IVEM LIGHT I, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (лиганд AITR лиганда GITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a коннектин, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (лиганд gp34 OX40, TXGP1), TNFSF5 (лиганд CD154 CD40, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (лиганд Apo-1 Fas-лиганда, лиганд APT1), TNFSF7 (лиганд CD70 CD27), TNFSF8 (лиганд CD153 CD30), TNFSF9 (лиганд CD137 лиганда 4-1ВВ), TP-1, t-PA, Тро, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептор трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, ассоциированный с опухолью CA125, ассоциированный с опухолью антиген, экспрессирующий ассоциированные с Lewis-Y углеводы, TWEAK, ТХВ2, Ung, uPAR, uPAR-1, урокиназа, VE-кадгерин-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, вирусный анотиген, VLA, VLA-1, VLA-4, интегрин VNR, фактор Виллебранда, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, αβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, окисленный LDL, PCSK9, прекалликреин, RON, TMEM16F, SOD1, хромогранин А, хромогранин В, tau, VAP1, высокомолекулярный кининоген, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, Clr, Cls, C2, C2a, C2b, С3, С3а, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, С6, C7, C8, C9, фактор В, фактор D, фактор H, пропердин, склеростин, фибриноген, фибрин, протромбин, тромбин, тканевой фактор, фактор V, фактор Va, фактор VII, фактор VIIa, фактор VIII, фактор VIIIa, фактор IX, фактор IXa, фактор X, фактор Ха, фактор XI, фактор XIa, фактор XII, фактор Xlla, фактор XIII, фактор XIIIa, TFPI, антитромбин III, EPCR, тромбомодулин, TAPI, tPA, плазминоген, плазмин, PAI-1, PAI-2, GPC3, синдекан-1, синдекан-2, синдекан-3, синдекан-4, LPA, SIP; рецептор ацетилхолина, AdipoRl, AdipoR2, ADP рибозилциклазу-1, альфа-4/бета-7 интегрин, альфа-5/бета-1 интегрин, альфа-v/бета-6 интегрин, альфа-v/бета-1 интегрин, лиганд ангиопоэтина-2, Angptl2, Anthrax, кадгерин, карбоангидразу-IX, CD105, CD155, CD158a, CD37, CD49b, CD51, CD70, CD72, клаудин 18, токсин Clostridium difficile, CS1, лиганд Delta-подобного белка 4, оксидазу DHICA, лиганд Dickkopf-1, дипептидилпептидазу IV, EPOR, F-белок RSV, фактор Ia, FasL, рецептор фолатов альфа, рецептор глюкагона, рецептор глюкагон-подобного пептида 1, глутаматкарбоксипептидаза II, GMCSFR, гликопротеин Е2 вируса гепатита С, гепцидин, рецептор IL-17, рецептор IL-22, рецептор IL-23, рецептор IL-3, тирозинкиназу Kit, лейцин-блогатый альфа-2-гликопротеин 1 (LRG1), рецептор лизосфинголипидов, мембранный гликопротеин OX2, мезотелин, МЕТ, MICA, MUC-16, ассоциированный с миелином гликопротеин, нейропилин-1, нейропилин-2, рецептор Nogo, PLXNA1, PLXNA2, PLXNA3, PLXNA4A, PLXNA4B, PLXNB1, PLXNB2, PLXNB3, PLXNC1, PLXND1, лиганд запрограммированной гибели клеток 1, конвертазу пробелков РС9, лиганд 1 гликопротеина Р-селектина, RAGE, ретикулон 4, RF, RON-8, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SEMA4A, SEMA4B, SEMA4C, SEMA4D, SEMA4F, SEMA4G, SEMA5A, SEMA5B, SEMA6A, SEMA6B, SEMA6C, SEMA6D, SEMA7A, шига-подобный токсин II, рецептор 1 сфингозин-1-фосфата, ST2, стафилококковую липотейхоевую кислоту, тенасцин, TG2, тимический стромальный рецептор лимфопротеинов, рецептор 12А суперсемейства TNF, трансмембранный гликопротеин NMB, TREM-1, TREM-2, трофобластный гликопротеин, рецептор TSH, TTR, тубулин и ULBP2; и рецепторы для факторов роста и гормонов, молекулы, которые существуют в их растворимой форме и не заякорены на клетках в жидкостях организма. Например, среди рецепторов растворимые антигены, присутствующие в жидкости организма вследствие некоторого механизма, включающего опосредуемое протеазой расщепление рецепторов и т.п., экспрессируемых на клеточной поверхности, также являются пригодными примерами растворимых антигенов по настоящему изобретению. Примеры таких молекул могут включать растворимую молекулу IL-6R (J. Immunol. (1994) 152, 4958-4968) и CD20, а также CD52 (Br. J. Haematol. (2003) 123 (5), 850-857), описанные в настоящем описании. Более того, также примерами растворимых антигенов по настоящему изобретению являются не только молекулы, по своей природе экспрессируемые в живом организме, но также растворимые антигены, существующие в жидкости организма, которые являются инфекционными молекулами, такими как или антигены, представляемые инфекционными организмами, такими как вирусы, или представляемые на таких организмах. Пригодные примеры жидкости организма включают кровь, плазму, сыворотку, мочу, лимфу, слюну и слезную жидкость.

Эпитоп

"Эпитоп" означает антигенную детерминанту в антигене и относится к антигенному центру, с которым связывается антигенсвязывающий домен антигенсвязывающей молекулы, описанной в настоящем описании. Таким образом, например, эпитоп может быть определен в соответствии с его структурой. Альтернативно эпитоп может быть определен в соответствии с антигенсвязывающей активностью антигенсвязывающей молекулы, которая распознает эпитоп. Когда антиген представляет собой пептид или полипептид, эпитоп может быть указан с помощью аминокислотных остатков, образующих эпитоп. Альтернативно, когда эпитоп представляет собой цепь сахаров, эпитоп может быть указан с помощью его определенной структуры цепи сахаров.

Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, который содержит эпитоп, в котором распознается его первичная аминокислотная последовательность. Такой линейный эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере три и наиболее часто по меньшей мере пять, например, от приблизительно 8 до приблизительно 10 или 6-20 аминокислот в его конкретной последовательности.

В противоположность линейному эпитопу, "конформационный эпитоп" представляет собой эпитоп, в котором первичная аминокислотная последовательность, содержащая эпитоп, не является единственной детерминантой распознаваемого эпитопа (например, первичная аминокислотная последовательность конформационного эпитопа не обязательно распознается определяющим эпитоп антителом). Конформационные эпитопы могут содержать большее количество аминокислот по сравнению с линейными эпитопами. Антитело, распознающее конформационный эпитоп, распознает трехмерную структуру пептида или белка. Например, когда молекула белка сворачивается и формирует трехмерную структуру, аминокислоты и/или основные цепи полипептида, которые образуют коноформационный эпитоп, располагаются рядом друг с другом, и эпитоп становится распознаваемым для антитела. Способы определения конформаций эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию, двумерный ядерный магнитный резонанс, сайт-специфическое спиновое мечение и электронный парамагнитный резонанс, он они не ограничиваются ими. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.).

Активность связывания

Примеры способа оценки связывания эпитопа исследуемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, описаны ниже. В соответствии с примерами ниже, также можно соответствующим образом проводить способы оценки связывания эпитопа исследуемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей антигенсвязывающий домен, с антигеном, отличным от IL-6R.

Например, то, что исследуемая антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен для IL-6R, распознает линейный эпитоп в молекуле IL-6R, можно подтвердить, например, как описано ниже. Для указанной выше цели синтезируют линейный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен IL-6R. Пептид можно синтезировать химически или его можно получать способами генетической инженерии с использованием области, кодирующей аминокислотную последовательность, соответствующую внеклеточному домену в кДНК IL-6R. Затем исследуемую антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен для IL-6R, оценивают в отношении ее активности связывания с линейным пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен. Например, иммобилизованный линейный пептид можно использовать в качестве антигена в ELISA для оценки активности связывания антигенсвязывающей молекулы с пептидом. Альтернативно активность связывания с линейным пептидом можно оценивать, исходя из уровня, на котором линейный пептид ингибирует связывание антигенсвязывающей молекулы с клетками, экспрессирующими IL-6R. Эти исследования могут продемонстрировать активность связывания антигенсвязывающей молекулы с линейным пептидом.

Наличие распознавания исследуемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, конформационного эпитопа можно оценивать следующим образом. Для указанной выше цели получают экспрессирующие IL-6R клетки. Наличие распознавания исследуемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей антигенсвязывающий домен IL-6R, конформационного эпитопа, можно определять, когда она прочно связывается с экспрессирующими IL-6R клетками при контакте, но по существу не связывается с иммобилизованным линейным пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен IL-6R. В рамках настоящего изобретения "по существу не связывает" означает, что активность связывания составляет 80% или менее, как правило, 50% или менее, предпочтительно 30% или менее, и особенно предпочтительно 15% или менее по сравнению с активностью связывания с клетками, экспрессрующими IL-6R человека.

Способы оценки активности связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, с экспрессирующими IL-6R клетками, включают, например, способы, описанные в Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). В частности, оценку можно проводить на основе принципа ELISA или активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS) с использованием в качестве антигена экспрессирующих IL-6R клеток.

В формате ELISA активность связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, с экспрессирующими IL-6R клетками можно оценивать количественно путем сравнения уровней сигнала, генерируемого ферментативной реакцией. В частности, исследуемую антигенсвязывающую молекулу комплекс добавляют в планшет для ELISA, на котором иммобилизованы эксперессирующие IL-6R клетки. Затем антигенсвязывающую молекулу, связанную с клетками, выявляют с использованием меченного ферментом антитела, которое распознает исследуемую антигенсвязывающую молекулу. Альтернативно, когда используют FACS, приготавливают серии разведении исследуемой антигенсвязывающей молекулы и можно определять титр связывания антитела с экспрессирующими IL-6R клетками для сравнения активности связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующими IL-6R клетками.

Связывание исследуемой антигенсвязывающей молекулы с антигеном, экспрессируемым на поверхности клеток, суспендированных в буфере или сходных с ним, можно выявлять с использованием проточного цитометра. Известные проточные цитометры включают, например, следующие устройства:

FACSCanto™ II

FACSAria™

FACSArray™

FACSVantage™ SE

FACSCalibur™ (все являются торговыми названиями BD Biosciences)

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (все являются торговыми названиями Beckman Coulter).

Предпочтительные способы оценки активности связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, с антигеном, включают, например, следующий способ. Сначала экспрессирующие IL-6R клетки подвергают реакции с исследуемой антигенсвязывающей молекулой, а затем их окрашивают меченным FITC вторичным антителом, которое распознает антигенсвязывающую молекулу. Исследуемую антигенсвязывающую молекулу надлежащим образом разбавляют подходящим буфером с получением молекулы с желаемой концентрацией. Например, молекулу можно использовать в концентрации в диапазоне от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Затем определяют интенсивность флуоресценции и количество клеток с использованием FACSCalibur (BD). Интенсивность флуоресценции, полученную с помощью анализа с использованием программного обеспечения CELL QUEST (BD), т.е. среднее геометрическое значение, отражает количество антитела, связанного с клетками. Следовательно, активность связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, которую отражает количество связанной исследуемой антигенсвязывающей молекулы, можно определять путем определения геометрического среднего значения.

То, обладает ли исследуемая антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен для IL-6R, общим эпитопом с другой антигенсвязывающей молекулой, можно оценивать на основе конкуренции между двумя молекулами за один и тот же эпитоп. Конкуренцию между антигенсвязывающими молекулами можно выявлять с помощью анализа перекрестного блокирования и т.п. Например, предпочтительным анализом перекрестного блокирования является конкурентный анализ ELISA.

В частности, в анализе перекрестного блокирования белок IL-6R, иммобилизованный на лунках микропланшета для титрования, предварительно инкубируют в присутствии или в отсутствие являющейся кандидатом конкурентной антигенсвязывающей молекулы, а затем к ним добавляют антигенсвязывающую молекулу. Количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с белком IL-6R в лунках, непрямо коррелирует со связывающей способностью являющейся кандидатом конкурентной антигенсвязывающей молекулы, которая конкурирует за связывание с тем же эпитопом. Следовательно, чем более высокой является аффинность конкурентной антигенсвязывающей молекулы к тому же эпитопу, тем более низкой является активность связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы с покрытыми белком IL-6R лунками.

Количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с лунками через IL-6R, можно без труда определить путем предварительного мечения антигенсвязывающей молекулы. Например, меченную биотином антигенсвязывающую молекулу определяют с использованием конъюгата авидин/пероксидаза и соответствующего субстрата. В частности, анализ перекрестного блокирования, в котором используются ферментные метки, такие пероксидаза, называют "конкурентным анализом ELISA". Антигенсвязывающую молекулу также можно метить другими агентами для мечения, которые обеспечивают выявление или измерение. В частности, известны радиоактивные метки, флуоресцентные метки и т.п.

Когда являющаяся кандидатом конкурентная антигенсвязывающая молекула может блокировать связывание исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 20-50%, и более предпочтительно по меньшей мере на 50% по сравнению с активностью связывания в контрольном эксперименте, проведенном в отсутствие конкурентной антигенсвязывающей молекулы, то определяют, что исследуемая антигенсвязывающая молекула по существу связывается с тем же эпитопом, с которым связывается конкурентная антигенсвязывающая молекула, или конкурирует за связывание с тем же эпитопом.

Когда структура эпитопа, с которым связывается исследуемая антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен для IL-6R, уже идентифицирована, тогда то, имеют ли исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы общий эпитоп, можно оценивать путем сравнения активности связывания двух антигенсвязывающих молекул с пептидом, полученным путем внесения аминокислотных мутаций в пептид, формирующий эпитоп.

Для измерения указанной выше активности связывания, например, активность связывания исследуемых и контрольных антигенсвязывающих молекул в отношении линейного пептида, в который внесена мутация, сравнивают в описанном выше формате ELISA. Помимо способов ELISA, активность связывания с мутантным пептидом, связанным с колонкой, можно определять путем пропускания исследуемых и контрольных антигенсвязывающих молекул через колонку, а затем количественного определения антигенсвязывающей молекулы, элюированной в элюирующем растворе. Способы адсорбции мутантного пептида на колонку, например, в форме слитого пептида с GST, известны.

Альтернативно, когда идентифицированный эпитоп представляет собой конформационный эпитоп, тогда то, обладают ли исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы общим эпитопом, можно оценивать следующим способом. Сначала получают экспрессирующие IL-6R клетки и клетки, экспрессирующие IL-6R с мутацией, внесенной в эпитоп. Исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы добавляют в суспензию клеток, полученную суспендированием этих клеток в соответствующем буфере, таком как PBS. Затем клеточные суспензии надлежащим образом промывают буфером, и к ним добавляют меченное FITC антитело, которое распознает исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы. Интенсивность флуоресценции и количество клеток, окрашенных меченым антителом, определяют с использованием FACSCalibur (BD). Исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы надлежащим образом разбавляют с использованием подходящего буфера и используют в желаемых концентрациях. Например, их можно использовать в концентрации в диапазоне от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Интенсивность флуоресценции, определенная с помощью анализа с использованием программного обеспечения CELL QUEST (BD), т.е. геометрическое среднее значение, отражает количество меченного антитела, связавшегося с клетками. Следовательно, активность связывания исследуемых и контрольных антигенсвязывающих молекул, которую отражает количество связавшегося меченого антитела, можно определять путем измерения геометрического среднего значения.

В описанном выше способе то, что антигенсвязывающая молекула "по существу не связывается с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R," можно оценивать, например, следующим способом. Сначала исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы, связанные с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R, окрашивают меченым антителом. Затем определяют интенсивность флуоресценции клеток. Когда используют FACSCalibur для выявления флуоресценции проточной цитометрией, определенную интенсивность флуоресцении можно анализировать с использованием программного обеспечения CELL QUEST. Из геометрических средних значений в присутствии и в отсутствие антигенсвязывающей молекулы можно вычислять сравнительное значение (ΔGeo-Mean) по следующей формуле для определения соотношения увеличения интенсивности флуоресценции в результате связывания антигенсвязывающей молекулой.

ΔGeo-Mean = Geo-Mean (в присутствии антигенсвязывающей молекулы)/Geo-Mean (в отсутствие антигенсвязывающей молекулы)

Геометрическое среднее сравнительное значение (значение ΔGeo-Mean для мутантной молекулы IL-6R), определенное с помощью описанного выше анализа, которое отражает количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R, сравнивают со сравнительным значением ΔGeo-Mean, которое отражает количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с экспрессирующими IL-6R клетками. В этом случае, особенно предпочтительно, чтобы концентрации исследуемой антигенсвязывающей молекулы, используемой для определения сравнительных значений ΔGeo-Mean для экспрессирующих IL-6R клеток и клеток, экспрессирующих мутантный IL-6R, были скорректированы так, чтобы они были равными или по существу равными. В качестве контрольной антигенсвязывающей молекулы используют антигенсвязывающую молекулу, для которой подтверждено, что она распознает эпитоп в IL-6R.

Если сравнительное значение ΔGeo-Mean исследуемой антигенсвязывающей молекулы для клеток, экспрессирующих мутантный IL-6R, меньше чем сравнительное значение ΔGeo-Mean исследуемой антигенсвязывающей молекулы для экспрессирующих IL-6R клеток по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 50%, более предпочтительно на 30%, и особенно предпочтительно на 15%, тогда исследуемая антигенсвязывающая молекула "по существу не связывается с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R". Формула для определения значения Geo-Mean (геометрического среднего значения) описана в руководстве пользователя программного обеспечения CELL QUEST (BD biosciences). Если сравнение показывает, что сравнительные величины по существу эквивалентны, то может быть определено, что эпитоп для исследуемой и контрольной антигенсвязывающих молекул является одним и тем же.

Антигенсвязывающий домен

В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающий домен" может представлять собой любую структуру при условии, что она связывается с представляющим интерес антигеном. Такие домены предпочтительно включают, например:

вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей антител;

модуль приблизительно из 35 аминокислот, называемый А-доменом, который содержится в мембранном белке клеток авимере in vivo (WO 2004/044011, WO 2005/040229);

аднектин, содержащий домен 10Fn3, который связывается с белковой частью фибронектина - гликопротеина, экспрессирующегося на клеточной мембране (WO 2002/032925);

аффитело, которое состоит из трехспирального пучка из 58-аминокислот на основе каркаса связывающего IgG домена белка А (WO 1995/001937);

Смоделированные белки анкиринового повтора (DARPin), которые представляют собой область, экспонированную на молекулярной поверхности анкириновых повторов (AR), имеющих структуру, в которой субъединица, состоящая из поворота, содержащего 33 аминокислотных остатка, две антипараллельных спирали и петли многократно сложены в стопку (WO 2002/020565);

антикалины и т.п., которые представляют собой домены, состоящие из четырех петель, которые поддерживают одну сторону структуры бочки, состоящей из восьми расположенных по кругу антипараллельных нитей, которые являются высоко консервативными среди молекул липокалина, таких как ассоциированный с желатином липокалин нейтрофилов (NGAL) (WO 2003/029462); и

вогнутая область, образованная структурой параллельных слоев внутри структуры в форме подковы, образованной уложенными в стопку повторами модуля лейцин-богатого повтора (LRR) вариабельного рецептора лимфоцитов (VLR), который не имеет иммуноглобулине вой структуры и используется в системе приобретенного иммунитета у бесчелюстных позвоночных, таких как минога и миксина (WO 2008/016854). Предпочтительные антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению включают, например, антигенсвязывающие домены, имеющие вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей антител. Предпочтительные примеры антигенсвязывающих доменов включают "одноцепочечный Fv (scFv)", "одноцепочечное антитело", "Fv", "одноцепочечный Fv2 (scFv2)", "Fab" и "F(ab')2".

Антигенсвязывающие домены антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению могут связываться с идентичным эпитопом. Такой эпитоп может присутствовать, например, в белке, содержащем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Альтернативно эпитоп может присутствовать в белке, содержащем аминокислоты в положениях 20-365 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Альтернативно, каждый из антигенсвязывающих доменов антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению может связываться с отличающимся эпитопом. В рамках настоящего изобретения, отличающийся эпитоп может присутствовать, например, в белке, содержащем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Альтернативно, эпитоп может присутствовать в белке, содержащем аминокислоты в положениях 20-365 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Специфичность

"Специфичный" означает, что одна из молекул, которая специфически связывается, не проявляет никакого существенного связывания с молекулами, отличными от одной или нескольких молекул-партнеров по связыванию. Более того, "специфичный" также используют, когда антигенсвязывающий домен является специфичным к конкретному эпитопу среди множества эпитопов в антигене. Когда эпитоп, связываемый антигенсвязывающим доменом, содержится в нескольких различных антигенах, антигенсвязывающие молекулы, содержащие антигенсвязывающий домен, могут связываться с различными антигенами, которые имеют этот эпитоп.

Антитела

В рамках настоящего изобретения "антитело" относится к природному иммуноглобулину или иммуноглобулину, полученному частичным или полным синтезом. Антитела можно выделять из природных источников, таких как природная плазма и сыворотка, или из культуральных супернатантов продуцирующих антитела гибридом. Альтернативно антитела можно частично или полностью синтезировать с использованием способов, таких как генетическая рекомбинация. Предпочтительные антитела включают, например, антитела изотипа иммуноглобулине в или принадлежащего ему подкласса. Известные иммуноглобулины человека включают антитела следующих девяти классов (изотипов): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM. Из этих изотипов антитела по настоящему изобретению включают IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Константные области IgG включают мутантов, образованных из них естественным образом. Ряд аллотипических последовательности вследствие генетического полиморфизма описан в "Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication No. 91-3242, для константных областей антител IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека и IgG4 человека и любую из них можно использовать в рамках настоящего изобретения. В частности, для последовательности IgG1 человека, аминокислотная последовательность положений 356-358 (нумерация EU) может быть либо DEL, либо ЕЕМ.

Способы получения антитела с желаемой активностью связывания известны специалистам в данной области. Ниже приведен пример, в котором описан способ получения антитела, которое связывается с IL-6R (антитело против IL-6R). Антитела, которые связываются с антигеном, отличным от IL-6R, также можно получать в соответствии с примером, описанным ниже.

Антитела против IL-6R можно получать в качестве поликлональных или моноклональных антител с использованием известных способов. Продуцируемые антитела против IL-6R предпочтительно представляют собой моноклональные антитела, происходящие из млекопитающих. Такие происходящие из млекопитающих моноклональные антитела включают антитела, продуцируемые гибридомами или клетками-хозяевами, трансформированными экспрессирующим вектором, несущим ген антитела, способами генетической инженерии. Моноклональные антитела по настоящему изобретению включают "гуманизированные антитела" или "химерные антитела".

Продуцирующие моноклональные антитела гибридомы можно получать с использованием известных способов, например, как описано ниже. В частности, млекопитающих иммунизируют общепринятыми способами иммунизации с использованием белка IL-6R в качестве сенсибилизирующего антигена. Полученные иммунные клетки подвергают слиянию с известными родительскими клетками общепринятыми способами слияния клеток. Затем гибридомы, продуцирующие антитело против IL-6R, можно отбирать путем скрининга продуцирующих моноклональное антитело клеток с использованием общепринятых способов скрининга.

В частности, моноклональные антитела получают так, как описано ниже. Сначала можно экспрессировать ген IL-6R, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2, для получения белка IL-6R, представленного в SEQ ID NO: 1, который будет использован в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела. Для этого последовательность гена, кодирующего IL-6R, встраивают в известный экспрессирующий вектор, и подходящие клетки-хозяева трансформируют этим вектором. Желаемый белок IL-6R человека очищают из клеток-хозяев или их культуральных супернатантов известными способами. Для получения растворимого IL-6R из культуральных супернатантов, например, белок, состоящий из аминокислот в положениях 1-357 в полипептидной последовательности IL-6R SEQ ID NO: 1, такой как описан в Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968), экспрессируют в качестве растворимого IL-6R вместо белка IL-6R SEQ ID NO: 1. Также в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать очищенный природный белок IL-6R.

Очищенный белок IL-6R можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена для иммунизации млекопитающих. Также в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать неполный пептид IL-6R. В этом случае, неполный пептид можно получать путем химического синтеза на основе аминокислотной последовательности IL-6R человека, или путем встраивания неполного гена IL-6R в экспрессирующий вектор для экспрессии. Альтернативно неполный пептид можно получать путем деградации белка IL-6R протеазой. Длина и область неполного пептида IL-6R не ограничены конкретными вариантами осуществления. Предпочтительная область может быть произвольным образом выбрана из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-357 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Количество аминокислот, образующих пептид, подлежащий применению в качестве сенсибилизирующего антигена, предпочтительно составляет по меньшей мере пять или более, шесть или более, или семь или более. Более конкретно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать пептид из 8-50 остатков, более предпочтительно, из 10-30 остатков.

Альтернативно, для сенсибилизирующего антигена можно использовать слитый белок, полученный путем слияния желаемого неполного полипептида или пептида белка IL-6R с отличающимся полипептидом. Например, предпочтительно в качестве сенсибилизирующих антигенов используют Fc-фрагменты антител и пептидные метки. Векторы для экспрессии таких слитых белков можно конструировать путем слияния в рамке считывания генов, кодирующих два или более желаемых полипептидных фрагментов, и встраивания слитого гена в экспрессирующий вектор, как описано выше. Способы получения слитых белков описаны в Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Способы получения IL-6R для применения в качестве сенсибилизирующего антигена и способы иммунизации с использованием IL-6R конкретно описаны в WO 2003/000883, WO 2004/022754, WO 2006/006693 и т.п.

Отсутствуют конкретное ограничение на млекопитающих, подлежащих иммунизации сенсибилизирующим антигеном. Однако предпочтительно выбирать млекопитающих, учитывая их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, предпочтительно используют грызунов, таких как мыши, крысы и хомячки, кроликов и обезьян.

Указанных выше животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном известными способами. Как правило, выполняемые способы иммунизации включают, например, внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующего антигена млекопитающим. В частности, сенсибилизирующий антиген соответствующим образом разбавляют PBS (фосфатно-солевой буфер), физиологическим солевым раствором или сходными с ними. Если желательно, общепринятый адъювант, такой как полный адъювант Фрейнда, смешивают с антигеном и смесь эмульгируют. Затем сенсибилизирующий антиген вводят млекопитающем несколько раз с интервалами 4-21 суток. При иммунизации сенсибилизирующим антигеном можно использовать подходящие носители. В частности, когда в качестве сенсибилизирующего антигена используют низкомолекулярный неполный пептид, иногда желательно связывать сенсибилизирующий антигенный пептид с белком-носителем, таким как альбумин или гемоцианин лимфы улитки, для иммунизации.

Альтернативно гибридомы, продуцирующие желаемое антитело, можно получать с использованием способов иммунизации ДНК, как описано ниже. Иммунизация ДНК представляет собой способ иммунизации, который обеспечивает стимуляцию иммунной системы путем экспрессии сенсибилизирующего антигена у животного, имунизированного в результате введения векторной ДНК, сконструированной для обеспечения экспрессии гена, кодирующего антигенный белок, у животного. По сравнению с общепринятыми способами иммунизации, в которых белковый антиген вводят животным, подлежащим иммунизации, иммунизация ДНК является лучшей в том, что:

- может быть обеспечена стимуляция иммунной системы при сохранении структуры мембранного белка, такого как IL-6R; и

- отсутствует необходимость в очистке антигена для иммунизации.

Для получения моноклонального антитела по настоящему изобретению с использованием иммунизации ДНК, сначала ДНК, экспрессирующую белок IL-6R, вводят животному, подлежащему иммунизации. ДНК, кодирующую IL-6R, можно синтезировать известными способами, такими как ПЦР. Полученную ДНК встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор, а затем его вводят животному, подлежащему иммунизации. Предпочтительно используемые экспрессирующие векторы включают, например, коммерчески доступные экспрессирующие векторы, такие как pcDNA3.1. Векторы можно вводить в организм с использованием общепринятых способов. Например, иммунизацию ДНК проводят с использованием генной пушки для введения покрытых экспрессирующим вектором частиц золота в клетки организма животного, подлежащего иммунизации. Антитела, которые распознают IL-6R. также можно получать способами, описанными в WO 2003/104453.

После иммунизации млекопитающего, как описано выше, подтверждают увеличение титра связывающего IL-6R антитела в сыворотке. Затем иммунные клетки собирают от млекопитающего, а затем подвергают слиянию клеток. В частности, предпочтительно в качестве иммунных клеток используют спленоциты.

В качестве клетки, подлежащей слиянию с упомянутыми выше иммунными клетками, используют клетки миеломы млекопитающих. Клетки миеломы предпочтительно содержат подходящий селективный маркер для скрининга. Селективный маркер придает клеткам характеристики для их выживания (или гибели) в конкретных условиях культивирования. В качестве селективных маркеров известны дефицит гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (далее сокращенно обозначаемый как дефицит HGPRT) и дефицит тимидинкиназы (далее сокращенно обозначаемый как дефицит TK). Клетки с дефицитом HGPRT или TK обладают чувствительностью к гипоксантину-аминоптерину-тимидину (далее сокращенно обозначаемой чувствительностью HAT). Чувствительные к HAT клетки не могут синтезировать ДНК в селективной среде HAT, и, таким образом, погибают. Однако, когда клетки слиты с нормальными клетками, они могут продолжать синтезировать ДНК с использованием пути спасения нормальных клеток, и, таким образом, они могут расти в селективной среде HAT.

Селекцию клеток с дефицитом HGPRT и TK можно проводить в среде, содержащей 6-тиогуанин, 8-азагуанин (далее сокращенно обозначаемый как 8AG) или 5'-бромдезоксиуридин, соответственно. Нормальные клетки погибают, поскольку они включают аналоги пиримидина в их ДНК. Между тем, клетки, которые являются дефицитными по этим ферментам, могут выживать в селективной среде, поскольку они не могут включать эти аналоги пиримидина. Кроме того, селективный маркер, называемый устойчивостью к G418, обеспечиваемый геном устойчивости к неомицину, обеспечивает устойчивость к 2-дезоксистрептаминовым антибиотикам (аналоги гентамицина). Известны различные типы миеломных клеток, которые пригодны для слияния клеток.

Например, предпочтительно можно использовать миеломные клетки, включающие следующие клетки:

Р3(P3x63Ag8, 653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550);

P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology и Immunology (1978) 81, 1-7);

NS-1 (С. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519);

MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415);

SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270);

FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21);

3194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323);

R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), и т.д.

Слияние клеток между иммуноцитами и клетками миеломы по существу проводят с использованием известных способов, например, способа Kohler and Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).

Более конкретно, слияние клеток можно проводить, например, в общепринятой культуральной среде в присутствии агента, обеспечивающего слияние клеток. Агенты, обеспечивающие слияние клеток, включают, например, полиэтиленгликоль (PEG) и вирус Сендай (HVJ). Если необходимо, также можно добавлять вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид, для повышения эффективности слияния.

Соотношение иммунных клеток и клеток миеломы можно определять самостоятельно, предпочтительно, например, оно составляет одну клетку миеломы на каждые от одного до десяти иммуноцитов. Культуральные среды, используемые для слияния клеток, включают, например, среды, которые пригодны для выращивания клеточных линий, такие как среда RPMI1640 и среда MEM, и другие общепринятые культуральные среды, используемые для этого типа клеточной культуры. Кроме того, предпочтительно в культуральную среду можно добавлять сывороточные добавки, такие как эмбриональная телячья сыворотка (FCS).

Для слияния клеток заданные количества указанных выше иммунных клеток и миеломных клеток смешивают в описанной выше культуральной среде. Затем добавляют раствор PEG (например, средняя молекулярная масса составляет приблизительно от 1000 до 6000), предварительно нагретый до приблизительно 37°С, в концентрации, как правило, от 30% до 60% (масс./об.). Затем эту смесь осторожно перемешивают для получения желаемых слитых клеток (гибридом). Затем к клеткам постепенно добавляют подходящую культуральную среду, упомянутую выше, и смесь многократно центрифугируют для удаления супернатанта. Таким образом, можно удалить агенты слияния клеток и т.п., которые являются неблагоприятными для роста гибридомы.

Селекцию полученных таким образом гибридом можно проводить путем культивирования с использованием общепринятой селективной среды, например, среды HAT (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Клетки, отличные от желаемых гибридом (неслитые клетки) можно уничтожать путем продолжения культивирования в описанной выше среде HAT в течение достаточного периода времени. Как правило, период составляет от нескольких суток до нескольких недель. Затем, гибридомы, продуцирующие желаемое антитело, подвергают скринингу и клонируют по отдельности общепринятыми способами лимитирующих разведении.

Селекцию полученных таким образом гибридом можно проводить с использованием селективной среды на основе селективного маркера, которым обладает миелома, используемая для слияния клеток. Например, селекцию клеток с дефицитом HGPRT или ТК можно проводить путем культивирования с использованием среды HAT (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). В частности, когда для слияния клеток используют чувствительные к HAT миеломные клетки, клетки, успешно слитые с нормальными клетками, могут селективно пролиферировать в среде HAT. Клетки, отличные от желаемых гибридом (неслитые клетки), можно уничтожать путем продолжения культивирования в описанной выше среде HAT в течение достаточного периода времени. В частности, селекцию желаемых гибридом можно проводить путем культивирования, как правило, в течение от нескольких суток до нескольких недель. Затем гибридомы, продуцирующие желаемое антитело, подвергают скринингу и по отдельности клонируют общепринятыми способами лимитирующих разведении.

Желаемые антитела можно предпочтительно отбирать и по отдельности клонировать способами скрининга на основе известной реакции антиген/антитело. Например, связывающее IL-6R моноклональное антитело может связываться с IL-6R, экспрессированным на поверхности клетки. Такое моноклональное антитело можно подвергать скринингу с помощью активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS). FACS представляет собой систему, которая оценивает связывание антитела с клеточной поверхностью путем анализа клеток, контактирующих с флуоресцентным антителом, с использованием лазерного луча и измерения флуоресценции, испускаемой индивидуальными клетками.

Для скрининга гибридом, которые продуцируют моноклональные антитело по настоящему изобретению, с помощью FACS, сначала получают экспрессирующие IL-6R клетки. Клетки, предпочтительно используемые для скрининга, представляют собой клетки млекопитающих, в которых IL-6R экспрессируется неестественным образом. В качестве контроля можно проводить селективное выявление активности антитела, которое связывается с IL-6R клеточной поверхности, с использованием в качестве клеток-хозяев нетрансформированных клеток млекопитающих. В частности, гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело против IL-6R, можно выделять путем селекции гибридом, которые продуцируют антитело, которое связывается с клетками, в которых экспрессируется IL-6R неестественным образом, но не с клетками-хозяевами.

Альтернативно активность связывания антитела с иммобилизованными экспрессирующими IL-6R клетками можно оценивать на основе принципа ELISA. Например, экспрессирующие IL-6R клетки иммобилизуют на лунках планшета для ELISA. Культуральные супернатанты гибридом контактируют с иммобилизованными клетками в лунках и выявляют антитела, которые связываются с иммобилизованными клетками. Когда моноклональные антитела происходят из мыши, антитела, связанные с клетками, можно выявлять с использованием антитела против иммуноглобулина мыши. Селекцию гибридом, продуцирующих желаемое антитело, обладающее антигенсвязывающей способностью, проводят с помощью описанного выше скрининга, и их можно клонировать способом лимитирующих разведении и т.п.

Продуцирующие моноклональное антитело гибридомы, полученные таким образом, можно пассировать в общепринятой культуральной среде и хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.

Описанные выше гибридомы культивируют общепринятым способом, и желаемые моноклональные антитела можно получать из культуральных супернатантов. Альтернативно гибридомы вводят совместимым млекопитающим и выращивают в них, и моноклональные антитела получают из асцитной жидкости. Первый из этих способов пригоден для получения антител с высокой чистотой.

Предпочтительно также можно использовать антитела, кодируемые генами антител, которые клонированы из антителопродуцирующих клеток, таких как описанные выше гибридомы. Клонированный ген антитела встраивают в подходящий вектор, и его вводят в клетку-хозяина для экспрессии антитела, кодируемого геном. Способы выделения генов антител, встраивания генов в векторы и трансформации клеток-хозяев, уже разработаны, например, Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775). Способы продуцирования рекомбинантных антител также известны, как описано ниже.

Например, кДНК, кодирующую вариабельную область (V-область) антитела против IL-6R, получают из клеток гибридомы, экспрессирующих антитело против IL-6R. Для этой цели сначала из гибридом экстрагируют тотальную РНК. Способы, используемые для экстракции мРНК из клеток, включают, например:

- способ ультрацентрифугирования с гуанидином (Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299), и

- способ AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)

Экстрагированные мРНК можно очищать с использованием набора для очистки мРНК mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience) и т.п. Альтернативно также коммерчески доступны наборы для экстракции тотальной мРНК непосредственно из клеток, такие как набор для очистки мРНК QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience). мРНК можно получать из гибридом с использованием таких наборов. кДНК, кодирующие V-область антитела, можно синтезировать из полученных мРНК с использованием обратной транскриптазы. кДНК можно синтезировать с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК с обратной транскриптазой AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Co.) и т.п. Более того, для синтеза и амплификации кДНК можно соответствующим образом использовать набор для амплификации кДНК SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech) и способ 5'-RACE на основе ПЦР (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932). В таком способе синтеза кДНК на оба конца кДНК можно вносить подходящие участки для ферментов рестрикции, описанные ниже.

Представляющий интерес фрагмент кДНК очищают из полученного продукта ПЦР, а затем его лигируют в векторную ДНК. Таким образом, конструируют рекомбинантный вектор и вводят в Е. coli и т.п. После селекции колоний из образующих колонии Е. coli можно получать желаемый рекомбинантный вектор. Затем исследуют, имеет ли рекомбинантный вектор представляющую интерес нуклеотидную последовательность кДНК, известным способом, таким как способ с терминацией цепи дидезоксинуклеотидами.

Способ 5'-RACE, в котором используются праймеры для амплификации гена вариабельной области, удобно использовать для выделения гена, кодирующего вариабельную область. Сначала конструируют библиотеку кДНК 5'-RACE с помощью синтеза кДНК с использованием РНК, экстрагированных из клеток гибридом в качестве матрицы. Для синтеза библиотеки кДНК 5'-RACE соответствующим образом используют коммерчески доступный набор, такой как набор для амплификации кДНК SMART RACE.

Ген антитела амплифицируют способом ПЦР с использованием полученной библиотеки кДНК 5'-RACE в качестве матрицы. Праймеры для амплификации гена антитела мыши можно конструировать на основе известных последовательностей генов антител. Нуклеотидные последовательности праймеров варьируют, в зависимости от подкласса иммуноглобулине в. Таким образом, предпочтительно, чтобы подкласс был определен заранее с использованием коммерчески доступного набора, такого как набор для изотипирования моноклональных антител мыши Iso Strip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Diagnostics).

В частности, например, праймеры, которые обеспечивают амплификацию генов, кодирующих тяжелые цепи γ1, γ2а, γ2b и γ3 и легкие цепи κ и λ, используют для выделения генов, кодирующих IgG мыши. Как правило, для амплификации гена вариабельной области gG используют праймер, который гибридизуется с областью константной области вблизи вариабельной области, в качестве 3'-праймера. Между тем, в качестве 5'-праймера используют праймер, прилагаемый к набору для конструирования библиотеки кДНК 5'-RACE.

Продукты ПЦР, амплифицированные таким образом, используют для переформировывания иммуноглобулине в, состоящих из комбинации тяжелых и легких цепей. Селекцию желаемого антитела можно проводить с использованием активности связывания IL-6R переформированного иммуноглобулина в качестве индикатора. Например, когда задачей является выделение антитела против IL-6R, более предпочтительно, чтобы связывание антитела с IL-6R было специфическим. Скрининг связывающего IL-6R антитела можно проводить, например, с помощью следующих стадий:

(1) контактирование экспрессирующей IL-6R клетки с антителом, содержащим V-область, кодируемую кДНК, выделенной из гибридомы;

(2) выявление связывания антитела с эксперессирующей IL-6R клеткой; и

(3) селекция антитела, которое связывается с экспрессирующей IL-6R клеткой.

Способы выявления связывания антитела с экспрессирующими IL-6R клетками известны. В частности, связывание антитела с экспрессирующими IL-6R клетками можно выявлять с помощью описанных выше способов, таких как FACS. Для оценки активности связывания антитела соответствующим образом используют иммобилизованные образцы экспрессирующих IL-6R клеток.

Предпочтительные способы скрининга антител, в которых в качестве индикатора используется активность связывания, также включают способы пэннинга с использованием фаговых векторов. Способы скрининга с использованием фаговых векторов являются преимущественными, когда гены антител выделяют из библиотек подклассов тяжелых цепей и легких цепей из популяции клеток, экспрессирующей поликлональное антитело. Гены, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей, можно связывать соответствующей линкерной последовательностью с получением одноцепочечного Fv (scFv). Фаги, представляющие scFv на их поверхности, можно получать встраиванием гена, кодирующего scFv, в фаговый вектор. Фаги контактируют с представляющим интерес антигеном. Затем ДНК, кодирующую scFv, обладающие представляющей интерес активностью связывания, можно выделять путем сбора фагов, связанных с антигеном. Этот процесс можно повторять при необходимости для увеличения содержания scFv, обладающих представляющий интерес активностью связывания.

После выделения кДНК, кодирующей V-область представляющего интерес антитела против IL-6R, кДНК расщепляют ферментами рестрикции, которые распознают участки рестрикции, встроенные на обоих концах кДНК. Предпочтительные ферменты рестрикции распознают и расщепляют нуклеотидную последовательность, которая встречается в нуклеотидной последовательности гена антитела с низкой частотой. Более того, предпочтительно в представляющий интерес вектор вводят участок рестрикции для фермента, который образует липкий конец, для встраивания одной копии расщепленного фрагмента в правильной ориентации. Кодирующую кДНК V-область антитела против IL-6R расщепляют, как описано выше, и ее встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор для конструирования экспрессирующего вектора для антитела. В этом случае, если ген, кодирующий константную область антитела (С-область) и ген, кодирующий описанную выше V-область, слить в рамке считывания, то получится химерное антитело. В рамках настоящего изобретения "химерное антитело" означает, что происхождение константной области отличается от вариабельной области. Таким образом, в дополнение к гетерохимерным антителам мыши/человека, химерные антитела по настоящему изобретению включают аллохимерные антитела человека/человека. Экспрессирующий вектор для химерного антитела можно конструировать путем встраивания гена V-области в экспрессирующий вектор, который уже имеет константную область. В частности, например, последовательность, распознаваемая первым ферментом рестрикции, который расщепляет выше гена V-области, можно соответствующим образом помещать на 5'-конец экспрессирующего вектора, содержащего ДНК, кодирующую желаемую константную область (С-область) антитела. Экспрессирующий вектор для химерного антитела конструируют путем слияния в рамке считывания двух генов, расщепленных одной и той же комбинацией ферментов рестрикции.

Для получения моноклонального антитела против IL-6R, гены антител встраивают в экспрессирующий вектор так, чтобы гены экспрессировались под контролем регулирующей экспрессию области. Регулирующая экспрессию область для экспрессии антитела включает, например, энхансеры и промоторы. Более того, на N-конец можно присоединять подходящую сигнальную последовательность, так чтобы экспрессируемое антитело секретировалось наружу клеток. В примерах, описанных ниже, в качестве сигнальной последовательности используют пептид, имеющий аминокислотную последовательность MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 3). Между тем, можно присоединять другие подходящие сигнальные последовательности. Экспрессированный полипептид расщепляется на С-конце описанной выше последовательности, и полученный полипептид секретируется из клеток в качестве зрелого полипептида. Затем подходящие клетки-хозяева трансформируют экспрессирующим вектором и получают рекомбинантные клетки, экспрессирущие ДНК, кодирующую антитело IL-6R.

ДНК, кодирующие тяжелую цепь (Н-цепь) и легкую цепь (L-цепь) антитела по отдельности встраивают в различные экспрессирующие векторы для экспрессии гена антитела. Молекулу антитела, имеющую Н- и L-цепи, можно экспрессировать путем котрансфекции одной и той же клетки-хозяина векторами, в которые соответственно встроены гены Н-цепи и L-цепи. Альтернативно клетки-хозяева можно трансформировать одним эрепрессирующим вектором, в который встроены ДНК, кодирующие Н- и L-цепи (см. WO 1994/011523).

Существуют различные известные комбинации клетка-хозяин/экспрессирующий вектор для получения антител путем введения выделенных генов антител в соответствующих хозяев. Все из этих экспрессирующих систем пригодны для выделения антигенсвязывающих доменов по настоящему изобретению. Подходящие эукариотические клетки, используемые в качестве клеток-хозяев, включают клетки животных, клетки растений и клетки грибов. В частности, клетки животных включают, например, следующие клетки.

(1) клетки млекопитающих: СНО, COS, клетки миеломы, клетки почки китайского хомячка (BHK), HeLa, Vero клетки почки эмбриона человека (HEK) 293, Freestyle™293 и т.п.;

(2) клетки земноводных: ооциты Xenopus и т.п.; и

(3) клетки насекомых: sf9, sf21, Tn5 и т.п.

Кроме того, в качестве клетки растений известна экспрессирующая система для генов антител с использованием клеток, происходящих из рода Nicotiana, таких как Nicotiana tabacum. Для трансформации клеток растений можно соответствующим образом использовать культивированные клетки каллуса.

Более того, в качестве клеток грибов можно использовать следующие клетки:

- дрожжи: род Saccharomyces, как например, Saccharomyces serevisiae, и род Pichia, как например, Pichia pastoris; и

- нитчатые грибы: род Aspergillus, как например, Aspergillus niger.

Более того, также известны экспрессирующие системы для генов антител, в которых используются прокариотические клетки. Например, при использовании бактериальных клеток, в рамках настоящего изобретения можно подходящим образом использовать клетки Е. coli, клетки Bacillus subtilis и т.п. Экспрессирующие векторы, несущие представляющие интерес гены антитела, вводят в клетки путем трансфекции. Трансфицированные клетки культивируют in vitro, и из культуры трансформированных клеток можно получать желаемое антитело.

В дополнение к описанным выше клеткам-хозяевам, также для получения рекомбинантного антитела можно использовать трансгенных животных. Следовательно, антитело можно получать из животного, которому введен ген, кодирующий представляющее интерес антитело. Например, ген антитела можно конструировать в качестве слитого гена путем встраивания в рамке считывания в ген, который кодирует белок, специфически продуцируемый в молоке. В качестве белка, секретируемого в молоке, можно использовать, например, β-казеин козы и т.п. Фрагменты ДНК, содержащие слитый ген, в который встроен ген антитела, инъецируют в эмбрион козы, а затем этот эмбрион имплантируют самке козы. Желаемые антитела можно получать в качестве белка, слитого с белком молока, из молока, продуцируемого трансгенной козой, родившейся от козы, являющейся реципиентом эмбриона (или ее потомства). Кроме того, для увеличения объема молока, содержащего желаемое антитело, продуцируемого трансгенной козой, трансгенной козе при необходимости можно вводить гормоны, Ebert, K.М. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).

Когда антигенсвязывающую молекулу, описанную в настоящем описании, вводят человеку, антигенсвязывающий домен, происходящий из генетически рекомбинантного антитела, которое является искусственно модифицированным для снижения гетерологической антигенности против человека и т.п., можно соответствующим образом использовать в качестве антигенсвязывающего домена молекулы. Такие генетически рекомбинантные антитела включают, например, гуманизированные антитела. Эти модифицированные антитела получают соответствующим образом известными способами.

Вариабельная область антитела, используемая для получения антигенсвязывающего домена антигенсвязывающей молекулы, описанной в настоящем описании, как правило, образована тремя определяющими комплементарность областями (CDR) которые разделены четырьмя каркасными областями (FR). CDR представляет собой область, которая по существу определяет специфичность связывания антитела. Аминокислотные последовательности CDR являются в высокой степени разнообразными. С другой стороны, образующие FR аминокислотные последовательности часто обладают высокой идентичностью, даже среди антител с отличающейся специфичностью связывания. Таким образом, как правило, специфичность связывания определенного антитела можно вносить в другое антитело путем пересадки CDR.

Гуманизированное антитело также называют переформированным антителом человека. В частности, известны гуманизированные антитела, полученные пересадкой CDR антитела не являющегося человеком животного, такого как антитело мыши, в антитело человека и т.п. Также известны стандартные способы генной инженерии для получения гуманизированных антител. В частности, например, в качестве способа пересадки CDR антитела мыши в FR человека известна перекрывающаяся ПЦР с удлинением. В перекрывающейся ПЦР с удлинением нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR антитела мыши, подлежащую пересадке, добавляют к праймерам для синтеза FR антитела человека. Праймеры получают для каждой из четырех FR. Является общепризнанным, что при пересадке CDR мыши в FR человека, выбор FR человека, который имеет высокую идентичность FR мыши, является преимущественным для сохранения функции CDR. Таким образом, как правило, предпочтительно использовать FR человека, содержащую аминокислотную последовательность, которая обладает высокой идентичностью с аминокислотной последовательностью FR, соседней с CDR мыши, подлежащей пересадке.

Нуклеотидные последовательности, подлежащие лигированию, конструируют так, чтобы они были соединены друг с другом в рамке считывания. FR человека синтезируют по отдельности с использованием соответствующих праймеров. В результате получают продукты, в которых ДНК, кодирующая CDR мыши, связана с индивидуальными ДНК, кодирующими FR. Нуклеотидные последовательности, кодирующие CDR мыши, каждого продукта конструируют так, чтобы они перекрывались друг с другом. Затем проводят синтез комплементарной цепи для гибридизации перекрывающихся CDR продуктов, синтезированных с использованием гена антитела человека в качестве матрицы. С помощью этой реакции FR человека лигируют через последовательности CDR мыши.

Полноразмерный ген V-области, в котором в конечном итоге лигированы три CDR и четыре FR, амплифицируют с использованием праймеров, которые гибридизуются с его 5'- или 3'-концом, в которые добавлены подходящие последовательности, распознаваемые ферментом рестрикции. Экспрессирующий вектор для гуманизированного антитела можно получать путем встраивания ДНК, полученной, как описано выше, и ДНК, которая кодирует С-область антитела человека, в экспрессирующий вектор, так чтобы они лигировались в рамке считывания. После трансфекции рекомбинантным вектором хозяина для получения рекомбинантных клеток, рекомбинантные клетки культивируют и ДНК, кодирующую гуманизированное антитело, экспрессируют с получением гуманизированного антитела в клеточной культуре (см., публикацию патента Европы № ЕР 239400 и международную публикацию патента № WO 1996/002576).

Путем качественного или количественного определения и оценки антигенсвязывающей активности гуманизированного антитела, полученного, как описано выше, можно пригодным образом отобрать FR антитела человека, которые позволяют CDR образовывать подходящий антигенсвязывающий центр при лигировании через CDR. Аминокислотные остатки в FR можно заменять при необходимости, так чтобы CDR переформированного анитетела человека образовывали соответствующий антигенсвязывающий центр. Например, мутации аминокислотной последовательности можно вносить в FR с использованием способа ПЦР, который используется для пересадки CDR мыши в FR человека. Более конкретно, в праймеры, которые гибридизуются с FR, можно вносить частичные мутации нуклеотидной последовательности. Мутации нуклеотидной последовательности вносятся в FR, синтезированные с использованием таких праймеров. Мутантные последовательности FR, имеющие желаемые характеристики, можно отбирать путем измерения и оценки активности мутанта антитела с замененной аминокислотой в отношении связывания с антигеном с помощью упомянутого выше способа (Cancer Res. (1993) 53: 851-856).

Альтернативно желаемые антитела человека можно получать путем иммунизации трансгенных животных, имеющих полный набор генов антител человека (см. WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) путем иммунизации ДНК.

Более того, также известны способы получения антител человека путем пэннинга с использованием библиотек антител человека. Например, V-область антитела человека экспрессируют в качестве одноцепочечного антитела (scFv) на поверхности фага способом фагового дисплея. Можно отбирать фаги, экспрессирующие scFv, которые связываются с антигеном. Последовательность ДНК, кодирующую V-область антитела человека, которая связывается с антигеном, можно определять путем анализа генов выбранных фагов. Определяют последовательность ДНК scFv, которая связывается с антигеном. Получают экспрессирующий вектор путем слияния последовательности V-области в рамке считывания с последовательностью С-области желаемого антитела человека, и встраивания ее в соответствующий экспрессирующий вектор. Экспрессирующий вектор вводят в клетки, пригодные для экспрессии, такие как клетки, описанные выше. Антитело человека можно получать путем экспрессии гена, кодирующего антитело человека, в клетках. Эти способы уже известны (см. WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).

В дополнение к способам, описанным выше, для выделения генов антител можно соответствующим образом использовать способы клонирования В-клеток (идентификация каждой кодирующей антитело последовательности, ее клонирование и выделение; использование при конструировании экспрессирующего вектора для получения каждого антитела (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в частности); и т.п.), как описано, например Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) или в WO 2008/081008.

Система нумерации EU и система нумерации Kabat

В соответствии со способами, используемыми в рамках настоящего изобретения, положения аминокислот, приписываемые CDR и FR антитела, указаны в соответствии с нумерацией по Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 и 1991)). В рамках настоящего изобретения, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, аминокислоты вариабельной области указаны в соответствии с нумерацией по системе Kabat, в то время как аминокислоты константной области указаны в соответствии с системой нумерации EU на основе положений аминокислот по Kabat.

Условия концентрации ионов

Условия концентрации ионов металлов

В одном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация ионов относится к концентрации ионов металлов.

"Ионы металлов" относятся к ионам элементов группы I, за исключением водорода, таких как щелочные металлы и элементы группы меди, ионам элементов группы II, таких как щелочноземельные металлы и элементы группы цинка, ионам элементов группы III, за исключением бора, ионам элементов группы IV, за исключением углерода и кремния, ионам элементов группы VIII, таких как элементы группы железа и элементы группы платины, ионам элементов, принадлежащих подгруппе А групп V, VI и VII, и элементов металлов, таких как сурьма, висмут и полоний. Атомы металлов обладают свойством высвобождения валентных электронов так, что они становятся катионами. Это называют тенденцией к ионизации. Металлы с высокой тенденцией к ионизации считаются химически активными.

В рамках настоящего изобретения предпочтительные ионы металлов включают, например, ион кальция. Ион кальция вовлечен в модулирование множества биологических явлений, включая сокращение мышц, таких как скелетные, гладкие и сердечная мышцы; активацию движения, фагоцитоза и т.п. лейкоцитов; активацию изменения формы, секреции и т.п. тромбоцитов; активацию лимфоцитов; активацию тучных клеток, включая секрецию гистамина; клеточные ответы, опосредуемые рецептором катехоламина а или рецептором ацетилхолина; экзоцитоз; высвобождение веществ-передатчиков из окончаний нейронов; и поток аксоплазмы в нейронах. Известные внутриклеточные рецепторы ионов кальция включают тропонин С, кальмодулин, парвальбумин и легкую цепь миозина, которые имеют несколько участков связывания ионов кальция и, как полагают, имеют общее происхождение с точки зрения молекулярной эволюции. Также существует множество известных кальций-связывающих мотивов. Такие хорошо известные мотивы включают, например, домены кадгерина, EF-hand кальмодулина, С2-домен протеинкиназы С, Gla-домен белка фактора свертывания крови IX, лектины С-типа рецептора ациарогликопротеинов и манноза-связывающего рецептора, А-домены рецепторов LDL, аннексии, домен тромбоспондина 3 типа и EGF-подобные домены.

В рамках настоящего изобретения, когда ион металла представляет собой ион кальция, условия концентрации ионов кальция включают низкие концентрации ионов кальция и высокие концентрации ионов кальция. "Активность связывания варьирует, в зависимости от концентраций ионов кальция" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует вследствие различий между условиями низкой и высокой концентрации ионов кальция. Например, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы может быть более высокой при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция. Альтернативно антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы может быть более высокой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция.

В рамках настоящего изобретения высокая концентрация ионов кальция, в частности, не ограничена конкретной величиной; однако концентрация предпочтительно может быть выбрана из величин в пределах от 100 мкМ до 10 мМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 200 мкМ до 5 мМ. В альтернативном варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 500 мкМ до 2,5 мМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 200 мкМ до 2 мМ. Более того, концентрация может быть выбрана из величин в переделах от 400 мкМ до 1,5 мМ. В частности, предпочтительной является концентрация, выбранная из величин в пределах от 500 мкМ до 2,5 мМ, которая является близкой к концентрации ионов кальция в плазме (крови) in vivo.

В рамках настоящего изобретения низкая концентрация ионов кальция, в частности, не ограничена конкретной величиной; однако концентрация предпочтительно может быть выбрана из величин в пределах от 0,1 мкМ до 30 мкМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 0,2 мкМ до 20 мкМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 0,5 мкМ до 10 мкМ. В альтернативном варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 1 мкМ до 5 мкМ. Более того, концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 2 мкМ до 4 мкМ. В частности, предпочтительной является концентрация, выбранная из величин в пределах от 1 мкМ до 5 мкМ, которая является близкой к концентрации ионизированного кальция в ранних эндосомах in vivo.

В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая активность является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более слабой при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 0,1 мкМ до 30 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 100 мкМ до 10 мМ. Предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более слабой при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 0,5 мкМ до 10 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 200 мкМ до 5 мМ. Особенно предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность при концентрации ионов кальция в ранней эндосоме in vivo является более слабой, чем при концентрации ионов кальция в плазме in vivo; и, в частности, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более слабой при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 1 мкМ до 5 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 500 мкМ до 2,5 мМ.

То, изменяется ли антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов металлов, можно определять, например, с использованием известных способов измерения, таких как способы, описанные в разделе "Активность связывания" выше. Например, для подтверждения того, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы становится более высокой при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция, сравнивают антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы при низкой и высокой концентрациях ионов кальция.

В рамках настоящего изобретения выражение "антигенсвязывающая активность является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция" также может быть выражено как "антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более высокой при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция". В настоящем описании "антигенсвязывающая активность является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция" иногда представлено как "антигенсвязывающая способность является более слабой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция". Также "антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов кальция снижена так, чтобы она была ниже, чем антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов кальция" может быть представлено как "антигенсвязывающую способность при низкой концентрации ионов кальция ослабили по сравнению с антигенсвязывающей способностью при высокой концентрации ионов кальция".

При определении антигенсвязывающей активности, условия, отличные от концентрации ионов кальция, могут быть соответствующим образом выбраны специалистами в данной области, и они конкретно не ограничены. Например, активность можно определять при 37°С в буфере HEPES. Например, для определения можно использовать Biacore (GE Healthcare) и т.п. Когда антиген представляет собой растворимый антиген, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы можно оценивать путем пропускания антигена в качестве анализируемого соединения над чипом, на котором иммобилизована антигенсвязывающая молекула. Когда антиген представляет собой антиген мембраны, активность связывания антигенсвязывающей молекулы с антигеном мембраны можно оценивать путем пропускания антигенсвязывающей молекулы в качестве анализируемого соединения над чипом, на котором иммобилизован антиген.

При условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению при низкой концентрации ионов кальция является более слабой, чем при высокой концентрации ионов кальция, соотношение антигенсвязывающей активности между антигенсвязывающей активностью между низкой концентрацией ионов кальция и высокой концентрацией ионов кальция конкретно не ограничено; и величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 2 мМ), которая представляет собой соотношение константы диссоциации (KD) в отношении антигена при низкой концентрации ионов кальция и KD при высокой концентрация ионов кальция, предпочтительно составляет 2 или более; более предпочтительно величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 2 мМ) составляет 10 или более; и еще более предпочтительно величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 2 мМ) составляет 40 или более. Верхний предел величины KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 2 мМ) конкретно не ограничен и он может представлять собой любую величину, такую как 4 00, 1000 или 10000, при условии что молекула может быть получена способами, известными специалистам в данной области. Альтернативно указывается величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 1,2 мМ). Следовательно, величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 1,2 мМ) составляет 2 или более; более предпочтительно величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 1,2 мМ) составляет 10 или более; и еще более предпочтительно величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 1,2 мМ) составляет 40 или более. Верхний предел величины KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 1,2 мМ) конкретно не ограничен и он может представлять собой любую величину, такую как 400, 1000 или 10000, при условии что молекулу можно получать способами, известными специалистам в данной области.

Когда антиген представляет собой растворимый антиген, для отображения антигенсвязывающей активности можно использовать KD (константа диссоциации). Между тем, когда антиген представляет собой антиген мембраны, для отображения активности можно использовать кажущуюся KD (кажущаяся константа диссоциации). KD (константа диссоциации) и кажущуюся KD (кажущаяся константа диссоциации) можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare), графика Скэтчарда или проточного цитометра.

Альтернативно, например, также в качестве показателя для отображения соотношения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению при низкой и высокой концентрациях кальция предпочтительно можно использовать константу скорости диссоциации (kd). Когда константу скорости диссоциации (kd) используют вместо константы диссоциации (KD) в качестве показателя для отображения соотношение активностей связывания, соотношение констант скорости диссоциации (kd) при низкой и высокой концентрациях кальция, т.е. величина kd (низкая концентрация кальция)/kd (высокой концентрация кальция), предпочтительно равна 2 или более, более предпочтительно 5 или более, еще более предпочтительно 10 или более, и еще более предпочтительно 30 или более. Верхний предел величины Kd (низкая концентрация кальция)/kd (высокая концентрация кальция) конкретно не ограничен, и он может представлять собой любую величину, такую как 50, 100 или 200, при условии что можно получить молекулу способами, известными специалистам в данной области.

Когда антиген представляет собой растворимый антиген, для отображения антигенсвязывающей активности можно использовать kd (константа скорости диссоциации). Между тем, когда антиген представляет собой антиген мембраны, для отображения антигенсвязывающей активности можно использовать кажущуюся kd (кажущуюся константу скорости диссоциации). kd (константа скорости диссоциации) и кажущуюся kd (кажущаяся константа скорости диссоциации) можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare) или проточного цитометра. В рамках настоящего изобретения, когда антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы определяют при различных концентрациях ионов кальция, предпочтительно использовать одни и те же условия, за исключением концентраций кальция.

Например, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которого является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител, включающего стадии:

(а) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела при низкой концентрации кальция;

(b) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела при высокой концентрации кальция; и

(c) выбор антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которого является более низкой при низкой концентрации кальция, чем при высокой концентрации кальция.

Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител, или их библиотеки, включающего стадии:

(a) контактирование антигена с антигенсвязывающим доменом или антителом или их библиотекой при высокой концентрации кальция;

(b) инкубация при низкой концентрации кальция антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с антигеном на стадии (а); и

(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, диссоциировавших на стадии (b).

Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител или их библиотеки, включающего стадии:

(a) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител при низкой концентрации кальция;

(b) выбор антигенсвязывающего домена или антитела, которые не связались с антигеном на стадии (а);

(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, выбранным на стадии (b), связываться с антигеном при высокой концентрации кальция; и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с антигеном на стадии (с).

Кроме того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга, включающего стадии:

(a) контактирование при высокой концентрации кальция библиотеки антигенсвязывающих доменов или антител с колонкой, на которой иммобилизован антиген;

(b) элюирование антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с колонкой на стадии (а), из колонки при низкой концентрации кальция; и

(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, элюированных на стадии (b).

Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга, включающего стадии:

(a) позволение библиотеке антигенсвязывающих доменов или антител при низкой концентрации кальция пройти через колонку, на которой иммобилизован антиген;

(b) сбор антигенсвязывающего домена или антитела, которые элюировались без связывания с колонкой на стадии (а);

(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, собранным на стадии (b), связаться с антигеном при высокой концентрации кальция; и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с антигеном на стадии (с).

Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга, включающего стадии:

(a) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител при высокой концентрации кальция;

(b) получение антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с антигеном на стадии (а);

(c) инкубация при низкой концентрации кальция антигенсвязывающего домена или антитела, полученных на стадии (b); и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых на стадии (с) является более слабой, чем критерий для выбора на стадии (b).

Описанные выше стадии можно повторять два или более раз. Таким образом, настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим доменам или антителам, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые получают способами скрининга, которые дополнительно включают стадию повторения два или более раз стадий (а)-(с) или (a)-(d) в описанных выше способах скрининга. Количество циклов стадий (а)-(с) или (a)-(d) конкретно не ограничено, однако обычно составляет 10 или менее.

В способах скрининга по настоящему изобретению антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при низкой концентрации кальция конкретно не ограничена, при условии, что она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 0,1 мкМ до 30 мкМ, но предпочтительно она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 0,5 мкМ до 10 мкМ. Более предпочтительно, она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция в ранней эндосоме in vivo, в частности, от 1 мкМ до 5 мкМ. Между тем, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при высокой концентрации кальция конкретно не ограничена, при условии что она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 100 мкМ до 10 мМ, но предпочтительно она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 200 мкМ до 5 мМ. Более предпочтительно, она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция в плазме in vivo, в частности, от 0,5 мМ до 2,5 мМ.

Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно измерять способами, известными специалистам в данной области. Условия, отличные от концентрации ионизированного кальция, могут быть определены специалистами в данной области. Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно оценивать в качестве константы диссоциации (KD), кажущейся константы диссоциации (кажущаяся KD), константы скорости диссоциации (kd), кажущейся константы диссоциации (кажущаяся kd) и т.п. Их можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare), графика Скэтчарда или FACS.

В рамках настоящего изобретения стадия выбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых является более высокой при высокой концентрации кальция, чем при низкой концентрации кальция, является тождественной стадии выбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрация кальция, чем при высокой концентрации кальция.

При условии, что антигенсвязывающая активность является более высокой при высокой концентрации кальция, чем при низкой концентрации кальция, различие в антигенсвязывающей активности между высокой и низкой концентрациями концентрация конкретно не ограничено; однако антигенсвязывающая активность при высокой концентрации кальция предпочтительно в два раза или более, более предпочтительно в 10 раз или более, и еще более предпочтительно в 40 раз или более превышает низкую концентрацию кальция.

Антигенсвязывающие домены или антитела по настоящему изобретению, подлежащие скринингу способами скрининга, описанными выше, могут представлять собой любые антигенсвязывающие домены и антитела. Например, можно проводить скрининг описанных выше антигенсвязывающих доменов или антител. Например, можно проводить скрининг антигенсвязывающих доменов или антител, имеющих природные последовательности или последовательности с замещенными аминокислотами.

Библиотеки

В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен или антитело по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, которая в основном состоит из множества антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и антигенсвязывающие домены которых имеют по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов. Концентрации ионов предпочтительно включают, например, концентрацию ионов металлов и концентрацию ионов водорода.

В рамках настоящего изобретения "библиотека" относится к множеству антигенсвязывающих молекул или множеству слитых полипептидов, содержащих антигенсвязывающие молекулы, или нуклеиновых кислот или полинуклеотидов, кодирующих их последовательности. Последовательности множества антигенсвязывающих молекул или множества слитых полипептидов, содержащих антигенсвязывающие молекулы, в библиотеке не идентичны, а отличаются друг от друга.

В рамках настоящего изобретения выражение "последовательности отличаются друг от друга" в выражении "множество антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга", означает, что последовательности антигенсвязывающих молекул в библиотеке отличаются друг от друга. В частности, в библиотеке количество последовательностей, отличающихся друг от друга, отражает количество независимых клонов с различными последовательностями, и также может называться "размером библиотеки". Размер библиотеки для обычной библиотеки фагового дисплея находится в диапазоне от 106 до 1012. Размер библиотеки может быть увеличен вплоть до 1014 с использованием известных способов, таких как рибосомный дисплей. Однако истинное количество фаговых частиц, используемых в селекции способом пэннинга фаговой библиотеки, как правило, в 10-10000 раз превышает размер библиотеки. Эту избыточную множественность также называют "количеством эквивалентов библиотеки", и она означает, что существует от 10 до 10000 индивидуальных клонов, которые обладают одной и той же аминокислотной последовательностью. Таким образом, в рамках настоящего изобретения выражение "последовательности отличаются друг от друга" означает, что последовательности независимых антигенсвязывающих молекул в библиотеке, исключая эквиваленты библиотеки, отличаются друг от друга. Более конкретно, указанное выше означает, что существует от 106 до 1014 антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, предпочтительно от 107 до 1012 молекул, более предпочтительно от 108 до 1011 молекул, и особенно предпочтительно от 108 до 1012 молекул, последовательности которых отличаются друг от друга.

В рамках настоящего изобретения выражение "множество" в выражении "библиотека в основном состоит из множества антигенсвязывающих молекул" в случае, например, антигенсвязывающих молекул, слитых полипептидов, полинуклеотидных молекул, векторов или вирусов по настоящему изобретению, главным образом, относится к группе из двух или более типов вещества. Например, когда два или более вещества отличаются друг от друга конкретной характеристикой, это означает, что существует два или более типов вещества. Такие примеры могут включать, например, мутантные аминокислоты, наблюдаемые в конкретных аминокислотных положениях аминокислотной последовательности. Например, когда существует две или более антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых являются по существу одинаковыми или предпочтительно одинаковыми, за исключением нестрогих остатков или за исключением конкретных мутантных аминокислот в гипервариабельных положениях, экспонированных на поверхности, существует множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. В другом примере, когда существует две или более полинуклеотидных молекулы, последовательности которых являются по существу одинаковыми или предпочтительно одинаковыми, за исключением нуклеотидов, кодирующих нестрогие остатки, или нуклеотидов, кодирующих мутантные аминокислоты гипервариабельных положений, экспонированных на поверхности, существует множество полинуклеотидных молекул по настоящему изобретению.

Кроме того, в рамках настоящего изобретения выражение "в основном состоит из" в выражении "библиотека в основном состоит из множества антигенсвязывающих молекул" отражает количество антигенсвязывающих молекул, антигенсвязывающая активность которых варьирует, в зависимости от концентрации ионов, среди независимых клонов с отличающимися последовательностями в библиотеке. Особенно предпочтительно, чтобы в библиотеке существовало по меньшей мере 104 антигенсвязывающих молекул, имеющих такую активность связывания. Более предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 105 антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Еще более предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 106 антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Особенно предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 107 антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Еще более предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 108 антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Альтернативно это также предпочтительно может быть выражено как соотношение количества антигенсвязывающих молекул, антигенсвязывающая активность которых варьирует, в зависимости от концентрации ионов, и количества независимых клонов, имеющих различные последовательности, в библиотеке. В частности, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в которой антигенсвязывающие молекулы, имеющие такую активность связывания, составляют от 0,1% до 80%, предпочтительно от 0,5% до 60%, более предпочтительно от 1% до 40%, еще более предпочтительно от 2% до 20%, и особенно предпочтительно от 4% до 10% независимых клонов с отличающимися последовательностями в библиотеке. В случае слитых полипептидов, полинуклеотидных молекул или векторов, могут быть возможными сходные выражения, в которых используются количества молекул или отношение к общему количеству молекул. В случае вирусов, также могут быть возможными сходные выражения, в которых используется количество вирионов или отношение к общему количеству вирионов.

Аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих доменов в зависимости от концентрации ионов кальция

Антигенсвязывающие домены или антитела по настоящему изобретению, подлежащие скринингу описанными выше способами скрининга, можно получать любым путем. Например, когда ион металла представляет собой ион кальция, можно использовать заранее существующие антитела, заранее существующие библиотеки (фаговая библиотека, и т.д.), антитела или библиотеки, полученные из гибридом, полученных путем иммунизации животных или из В-клеток иммунизированных животных, антитела или библиотеки, полученные внесением аминокислот, способных хелатировать кальций (например, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), или неприродных аминокислотных мутаций в описанные выше антитела или библиотеки (хелатирующие кальций аминокислоты (такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), библиотеки с увеличенным содержанием неприродных аминокислот, библиотеки полученные путем внесения хелатирующих кальций аминокислот (таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислотных мутаций в конкретные положения, и т.п.

Примеры аминокислот, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов кальция, как описано выше, могут представлять собой любые типы аминокислот, при условии что аминокислоты формируют кальций-связывающий мотив. Кальций-связывающие мотивы хорошо известны специалистам в данной области и подробно описаны (например, Springer et al. (Cell (2000) 102, 275-277); Kawasaki и Kretsinger (Белок Prof. (1995) 2, 305-490); Moncrief et al. (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562); Chauvaux et al. (Biochem. J. (1990) 265, 261-265); Bairoch и Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456); Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419); Schaefer et al. (Genomics (1995) 25, 638-643); Economou et al. (EMBO J. (1990) 9, 349-354); Wurzburg et al. (Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)). В частности, любые известные кальций-связывающие мотивы, включая лектины С-типа, такие как ASGPR, CD23, MBR и DC-SIGN, могут быть включены в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению. Предпочтительные примеры таких предпочтительных кальций-связывающих мотивов также включают, в дополнение к кальций-связывающим мотивам, описанным выше, например, кальций-связывающий мотив в антигенсвязывающем домене SEQ ID NO: 62.

Более того, в качестве аминокислот, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов кальция, например, предпочтительно можно использовать аминокислоты, имеющие активность хелатирования металлов. Примеры таких хелатирующих металлы аминокислот включают, например, серии (Ser(S)), треонин (Thr(T)), аспарагин (Asn(N)), глутамин (Gln(Q)), аспарагиновую кислоту (Asp(D)) и глутаминовую кислоту (Glu(E)).

Положения в антигенсвязывающих доменах, в которых содержатся описанные выше аминокислоты, конкретно не ограничены конкретными положениями, и они могут представлять собой любые положения в вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, которые образуют антигенсвязывающий домен, при условии, что они изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов кальция. В частности, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и антигенсвязывающие домены тяжелых цепей которых содержат аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекулы в зависимости от концентраций ионов кальция. В другом неограничивающем варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены тяжелой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислоты. В другом неограничивающем варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены тяжелых цепей которых содержат упомянутые выше аминокислоты в положениях 95, 96, 100а и/или 101, как указано в соответствии с системой нумерации Kabat.

Между тем, в неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и антигенсвязывающие домены легкой цепи которых содержат аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов кальция. В другом варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR1-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислот. В другом варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR1-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислоты в положениях 30, 31 и/или 32, как указано в соответствии с системной нумерации Kabat.

В другом неограничивающем варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR2-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к библиотекам, в основном состоящим из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR2-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки в положении 50, как указано в соответствии с системой нумерации Kabat.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки. В альтернативном варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки в положении 92, как указано в соответствии с системной нумерации Kabat.

Более того, в различных вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и в которых две или три CDR, выбранных из описанных выше CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержат упомянутые выше аминокислотные остатки. Более того, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и легкие цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки в любом одном или нескольких из положений 30, 31, 32, 50 и/или 92, как указано в соответствии с системной нумерации Kabat.

В особенно предпочтительном варианте осуществления каркасные последовательности вариабельной области легкой цепи и/или тяжелой цепи антигенсвязывающей молекулы предпочтительно содержат каркасные последовательности человека эмбрионального типа. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда каркасные последовательности представляют собой полностью человеческие последовательности, ожидается, что при введении такой антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению человеку (например, для лечения заболеваний), она индуцирует небольшой иммуногенный ответ или не индуцирует иммуногенного ответа. В указанном выше контексте выражение "содержащий последовательность эмбрионального типа" в рамках настоящего изобретения означает, что часть каркасных последовательностей по настоящему изобретению идентична части любых каркасных последовательностей человека эмбрионального типа. Например, когда последовательность FR2 тяжелой цепи антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению представляет собой комбинацию последовательностей FR2 тяжелой цепи различных каркасных последовательностей человека эмбрионального типа, такая молекула также представляет собой антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, "содержащую последовательность эмбрионального типа".

Предпочтительные примеры каркасных областей включают, например, последовательности полностью человеческих каркасных областей человека, известные в настоящее время, которые включены в web-сайт V-Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) или другие. Эти последовательности каркасных областей можно соответствующим образом использовать в качестве последовательности эмбрионального типа, содержащейся в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению. Последовательности эмбрионального типа могут быть подразделены на категории в соответствии с их сходством (Tomlinson et al. (J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798); Williams и Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461); Cox et al. (Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). Соответствующие последовательности эмбрионального типа могут быть выбраны из Vκ, которые подразделяются на семь подгрупп; Vλ, которые подразделяются на десять подгрупп; и VH, которые подразделяются на семь подгрупп.

Полностью человеческие последовательности VH предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, например, последовательности VH:

подгруппы VH1 (например, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58 и VH1-69);

подгруппы VH2 (например, VH2-5, VH2-26 и VH2-70);

подгруппы VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73 и VH3-74);

подгруппы VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59 и VH4-61);

подгруппы VH5 (VH5-51);

подгруппы VH6 (VH6-1); и

подгруппы VH7 (VH7-4 и VH7-81).

Они также описаны в известных документах (Matsuda et al. (J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975)) и т.п., и, таким образом, специалисты в данной области могут соответствующим образом моделировать антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, исходя из информации об этих последовательностях. Также предпочтительно использовать другие полностью человеческие каркасные области или каркасные субобласти.

Полностью человеческие последовательности VK предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, например:

А20, А30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14 и O18, выделенные в подгруппу Vk1;

A1, А2, A3, А5, А7, А17, А18, А19, А23, O1 и O11, выделенные в подгруппу Vk2;

A11, А27, L2, L6, L10, L16, L20 и L25, выделенные в подгруппу Vk3;

В3, выделенная в подгруппу Vk4;

В2 (также обозначаемая как Vk5-2), выделенная в подгруппу Vk5; и

А10, А14 и А26, выделенные в подгруппу VK6.

(Kawasaki et al. (Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028); Schable and Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022); Brensing-Kuppers et al. (Gene (1997) 191, 173-181)).

Полностью человеческие последовательности VL предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, например:

V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20 и V1-22, выделенные в подгруппу VL1;

V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17 и V2-19, выделенные в подгруппу VL1;

V3-2, V3-3 и V3-4, выделенные в подгруппу VL3;

V4-1, V4-2, V4-3, V4-4 и V4-6, выделенные в подгруппу VL4; и

V5-1, V5-2, V5-4 и V5-6, выделенные в подгруппу VL5 (Kawasaki et al. (Genome Res. (1997) 7, 250-261)).

Обычно эти каркасные последовательности отличаются друг от друга одним или несколькими аминокислотными остатками. Эти каркасные последовательности можно использовать в комбинации с "по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов" по настоящему изобретению. Другие примеры полностью человеческих каркасных областей, используемых в комбинации с "по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов" по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, например, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и РОМ (например, Kabat et al. (1991), выше, Wu et al. (J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).

Без связи с конкретной теорией полагают, что одна из причин для того, чтобы ожидать, что использование последовательностей эмбрионального типа предотвратит неблагоприятные иммунные ответы у большинства индивидуумов, состоит в следующем. В результате процесса созревания аффинности в ходе нормальных иммунных ответов, часто в вариабельных областях иммуноглобулинов происходят соматические мутации. Такие мутации чаще всего происходят в области CDR, последовательности которых являются гипервариабельными, но также затрагивают остатки каркасных областей. Такие мутации каркасной области не существуют в генах эмбрионального типа, но также с меньшей вероятностью будут иммуногенными у пациентов. Это является следствием того, что в нормальной человеческой популяции присутствует большинство каркасных последовательностей, экспрессируемых с генов эмбрионального типа и в результате иммунной толерантности, ожидается, что эти каркасные области эмбрионального типа будут иметь низкую иммуногенность у пациентов или не иметь иммуногенности у пациентов. Для максимизации возможности иммунной толерантности можно выбирать гены, кодирующие вариабельную область, из группы часто встречающихся функциональных генов эмбрионального типа.

Для получения антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, в которых описанные выше каркасные последовательности содержат аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов кальция, можно соответствующим образом использовать известные способы, такие как сайт-направленный мутагенез (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и перекрывающаяся ПЦР.

Например, библиотеку, которая содержит множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей тяжелой цепи, полученных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, где вариабельную область легкой цепи выбирают в качестве каркасной последовательности, первоначально содержащей по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция. В качестве неограничивающего примера, когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, такие предпочтительные библиотеки включают, например, библиотеки, сконструированные посредством комбинирования последовательности вариабельной области легкой цепи, принадлежащая семейству Vk5-2, соответствующая SEQ ID NO: 62 (Vk5-2), и вариабельной области тяжелой цепи, полученными в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области.

Альтернативно последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную в качестве каркасной области, первоначально содержащей по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы, как упоминалось выше, можно конструировать так, чтобы она содержала различные аминокислотные остатки, отличные от упомянутых выше аминокислотных остатков. В настоящем описании такие остатки называют нестрогими остатками. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено, при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению варьирует в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или последовательности FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Например, когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры нестрогих остатков, подлежащих внесению в последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 62 (Vk5-2), включают аминокислотные остатки, приведенные в таблицах 1 или 2.

В настоящем описании нестрогие остатки относятся к варьированию аминокислотных остатков, имеющемуся в гипервариабельных положениях, в которых присутствует несколько различных аминокислот, в вариабельных областях легкой цепи и тяжелой цепи, когда сравнивают аминокислотные последовательности известных и/или нативных антител или антигенсвязывающих доменов. Гипервариабельные положения, как правило, расположены в CDR. В одном варианте осуществления для определения гипервариабельных положений в известных и/или нативных антителах пригодны данные, предоставленные Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health Bethesda Md.) (1987 и 1991). Более того, в базах данных в Интернете (http://vbase.mrc-сре.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html) предоставлены собранные последовательности многих легких цепей и тяжелых цепей человека и их положения. Информация о последовательностях и положениях пригодна для определения гипервариабельных положений в рамках настоящего изобретения. В соответствии с настоящим изобретением, когда определенное положение аминокислоты имеет предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 20 возможных вариантов аминокислотных остатков, предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 19, предпочтительно от приблизительно 4 до приблизительно 18, предпочтительно от 5 до 17, предпочтительно от 6 до 16, предпочтительно от 7 до 15, предпочтительно от 8 до 14, предпочтительно от 9 до 13, и предпочтительно от 10 до 12 возможных вариантов аминокислотных остатков, это положение является гипервариабельным. В некоторых вариантах осуществления определенное положение аминокислоты может иметь предпочтительно по меньшей мере приблизительно 2, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 4, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 6, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 8, предпочтительно приблизительно 10 и предпочтительно приблизительно 12 вариантов аминокислотных остатков.

Альтернативно библиотеку, содержащую множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей тяжелой цепи, полученных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, с вариабельными областями легкой цепи, в которые внесен по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов, как упоминалось выше. Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры таких библиотек предпочтительно включают, например, библиотеки, в которых вариабельные области тяжелой цепи, полученные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, комбинируют с последовательностями вариабельной области легкой цепи, в которых конкретный остаток(и) в последовательности эмбрионального типа, такой как SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) или SEQ ID NO: 8 (Vk4) заменен по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция. Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки в CDR1 легкой цепи. Более того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки в CDR2 легкой цепи. Кроме того, другие неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков также включают аминокислотные остатки в CDR3 легкой цепи.

Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR1 легкой цепи, включают остатки в положениях 30, 31 и/или 32 в CDR1 вариабельной области легкой цепи, как указано согласно нумерации Kabat. Более того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR2 легкой цепи, включают аминокислотный остаток в положении 50 в CDR2 вариабельной области легкой цепи, как указано согласно нумерации Kabat. Более того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR3 легкой цепи, включают аминокислотный остаток в положении 92 в CDR3 вариабельной области легкой цепи, как указано согласно нумерации Kabat. Эти аминокислотные остатки могут содержаться отдельно или в комбинации, при условии что они образуют кальций-связывающий мотив и/или при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует, в зависимости от концентрации ионов кальция. Между тем, поскольку известны тропонин С, кальмодулин, парвальбумин и легкая цепь миозина, которые обладают несколькими участками связывания ионов кальция и, как полагают, имеют общее происхождение с точки зрения молекулярной эволюции, можно конструировать CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи так, чтобы они имели их связывающие мотивы. Например, можно использовать домены кадгерина, EF-hand кальмодулина, С2-домен протеинкиназы С, Gla-домен белка фактора свертывания крови IX, лектины С-типа рецептора ациарогликопротеинов и манноза-связывающего рецептора, А-домены рецепторов LDL, аннексин, домена тромбоспондина 3 типа, и EGF-подобные домены соответствующим образом для описанных выше целей.

Когда вариабельные области тяжелой цепи, полученные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, и вариабельные области легкой цепи, в которые внесен по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов, комбинируют, как описано выше, последовательности вариабельных областей легкой цепи можно конструировать так, чтобы они содержали нестрогие остатки аналогично тому, как описано выше. Количество и положение таких нестрогих остатков конкретно не ограничивается конкретными вариантами осуществления, при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению варьирует в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или последовательности FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры нестрогих остатков, вносимых в последовательность вариабельной области легкой цепи, включают аминокислотные остатки, приведенные в таблицах 1 и 2.

Предпочтительные вариабельные области тяжелой цепи, подлежащие комбинированию, включают, например, рандомизированные библиотеки вариабельной области. Для получения рандомизированной библиотеки вариабельной области известные способы комбинируют соответствующим образом. В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области предпочтительно можно использовать иммунную библиотеку, сконструированную на основе генов антител, происходящих из лимфоцитов животных, иммунизированных конкретным антигеном, пациентов с инфекциями, индивидуумов с повышенным титром антител в крови в результате вакцинации, пациентов со злокачественной опухолью или пациентов с аутоиммунным заболеванием.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также предпочтительно можно использовать синтетическую библиотеку, полученную путем замены последовательностей CDR V-генов в геномной ДНК или функциональных реконструированных V-генов набором синтетических олигонуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие наборы кодонов соответствующей длины. В этом случае, поскольку в последовательности CDR3 тяжелой цепи наблюдают разнообразие, также можно заменять только последовательность CDR3. Критерием возникновения разнообразия аминокислот в вариабельной области антигенсвязывающей молекулы является то, что разнообразие возникает у аминокислотных остатков в экспонированных на поверхности положениях антигенсвязывающей молекулы. Экспонированное на поверхности положение относится к положению, которое считается способным экспонироваться на поверхности и/или контактировать с антигеном, исходя из структуры, группы структур и/или смоделированной структуры антигенсвязывающей молекулы. Как правило, такие положения представляют собой CDR. Предпочтительно, экспонированные на поверхности положения определяют с использованием координат из трехмерной модели антигенсвязывающей молекулы с использованием компьютерной программы, такой как программа InsightII (Accelrys). Экспонированные на поверхности положения можно определять с использованием алгоритмов, известных в данной области (например, Lee and Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Определение экспонированных на поверхности положений можно проводить с использованием программного обеспечения, пригодного для моделирования белка, и информации о трехмерной структуре, полученной для антитела. Программное обеспечение, которое можно использовать для этих целей, предпочтительно включает программное обеспечение SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Главным образом или предпочтительно, когда алгоритм требует введения пользователем параметра размера, "размер" образца, который используют в вычислении, устанавливают как радиус, равный приблизительно 1,4 Ангстрем или менее. Более того, способы определения экспонированных на поверхности областей и участков с использованием программного обеспечения для персональных компьютеров описаны Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также особенно предпочтительно можно использовать наивную библиотеку, которая сконструирована из генов антител, происходящих из лимфоцитов здоровых индивидуумов, и набор генов которой состоит из наивных последовательностей, которые представляют собой последовательности антител без предпочтений (Gejima et al. (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). В настоящем описании, аминокислотная последовательность, содержащая наивную последовательность, относится к аминокислотной последовательности, полученной из такой наивной библиотеки.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, полученных путем комбинирования вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области, где вариабельная область тяжелой цепи, выбрана в качестве каркасной последовательности, которая первоначально содержит "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов". Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры таких библиотек предпочтительно включают библиотеки, сконструированные путем комбинирования вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) или SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1). Альтернативно такую библиотеку можно конструировать путем выбора соответствующих вариабельных областей легкой цепи из вариабельных областей легкой цепи, которые имеют последовательности эмбрионального типа, вместо вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области. Такие предпочтительные библиотеки включают, например, библиотеки, в которых последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) или SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1) комбинируют с вариабельными областями легкой цепи, имеющими последовательность эмбрионального типа.

Альтернативно последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную в качестве каркасной последовательности, которая первоначально содержит "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы", как упоминалось выше, можно конструировать так, чтобы она содержала нестрогие остатки. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено, при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению варьирует в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры нестрогих остатков, вносимых в последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1), включают все аминокислотные остатки CDR1 и CDR2 тяжелой цепи и аминокислотные остатки CDR3 тяжелой цепи, за исключением остатков в положениях 95, 96 и/или 100а. Альтернативно неограничивающие примеры нестрогих остатков, вносимых в последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1), включают все аминокислотные остатки CDR1 и CDR2 тяжелой цепи и аминокислотные остатки CDR3 тяжелой цепи, за исключением остатков в положениях аминокислоты 95 и/или 101.

Альтернативно библиотеку, содержащую множество антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, или вариабельных областей легкой цепи, имеющих последовательности эмбрионального типа, с вариабельными областями тяжелой цепи, в которые внесен "по меньшей мере один аминокислотный остаток, ответственный за зависимое от концентрации ионов изменение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы". Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры таких библиотек предпочтительно включают библиотеки, в которых вариабельные области легкой цепи, сконструированные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, или вариабельные области легкой цепи, имеющие последовательности эмбрионального типа, комбинируют с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи, в которой конкретный остаток(остатки) заменен по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция. Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки CDR1 тяжелой цепи. Следующие неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки CDR2 тяжелой цепи. Кроме того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков также включают аминокислотные остатки CDR3 тяжелой цепи. Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков CDR3 тяжелой цепи включают аминокислоты в положениях 95, 96, 100а и/или 101 в CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, как указано согласно нумерации Kabat. Более того, эти аминокислотные остатки могут содержаться отдельно или в комбинации, при условии что они образуют кальций-связывающий мотив и/или антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует в зависимости от концентрации ионов кальция.

Когда вариабельные области легкой цепи, сконструированные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, или вариабельные области легкой цепи, имеющие последовательность эмбрионального типа, комбинируют с вариабельной областью тяжелой цепи, в которую внесен по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов, как упоминалось выше, последовательность вариабельной области тяжелой цепи также можно конструировать так, чтобы она содержала нестрогие остатки, аналогично тому, как описано выше. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено, при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению варьирует, в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или FR тяжелой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Более того, рандомизированные библиотеки вариабельной области можно предпочтительно использовать в качестве аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, отличных от аминокислотных остатков, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы. Когда в качестве вариабельных областей легкой цепи используют последовательности эмбрионального типа, неограничивающие примеры таких последовательностей включают последовательности SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) и SEQ ID NO: 8 (Vk4).

Предпочтительно можно использовать любую из описанных выше аминокислот, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов кальция, при условии что они образуют кальций-связывающий мотив. В частности, такие аминокислоты включают электронодонорные аминокислоты. Предпочтительные примеры таких электронодонорных аминокислот включают серин, треонин, аспарагин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.

Условия концентраций ионов водорода

В одном варианте осуществления настоящего изобретения условия концентраций ионов относятся к условиям концентраций ионов водорода или условиям рН. В рамках настоящего изобретения концентрация протона, т.е. ядра атома водорода, используется в качестве синонима водородного показателя (рН). Когда активность ионов водорода в водном растворе отображают как аН+, рН определяется как -log10aH+. Когда ионная сила водного раствора является низкой (например, ниже 10-3), аН+ практически равна ионной силе водорода. Например, ионное произведение воды при 25°С и 1 атмосфере составляет Kw=aH+aOH=10-14, и, таким образом, в чистой воде аН+=аОН=10-7. В этом случае, рН=7 является нейтральным; водный раствор, рН которого ниже 7, является кислым, или рН которого больше 7, является щелочным.

В рамках настоящего изобретения, когда условия рН используют в качестве условий концентрации ионов, условия рН включают высокие концентрации ионов водорода или низкие значения рН, т.е. диапазон кислых значений рН, и низкие концентрации ионов водорода или высокие значения рН, т.е. диапазон нейтральных значений рН. "Активность связывания варьирует в зависимости от условий рН" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует вследствие различий в условиях высокой концентрации ионов водорода или низких значений рН (диапазон кислых значений рН) и низкой концентрации ионов водорода или высоких значений рН (диапазон нейтральных значений рН). Это включает, например, случай, когда антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более высокой в диапазоне нейтральных значений рН, чем в диапазоне кислых значений рН, и случай, когда антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более высокой в диапазоне кислых значений рН, чем в диапазоне нейтральных значений рН.

В настоящем описании диапазон нейтральных значений рН не ограничивается конкретной величиной и предпочтительно выбран из диапазона от рН6,7 до рН10,0. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН6,7 до рН 9,5. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН7,0 до рН9,0. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН7,0 до рН8,0. Особенно предпочтительное значение рН включает рН 7,4, которое является близким к рН плазмы (крови) in vivo.

В настоящем описании диапазон кислых значений рН не ограничивается конкретной величиной и предпочтительно выбран из диапазона от рН4,0 до рН6,5. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН4,5 до рН6,5. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН5,0 до рН6,5. В другом варианте осуществления рН может быть выбрано из диапазона от рН5,5 до рН6,5. Особенно предпочтительное значение рН включает рН 5,8, что является близким к концентрации ионизированного кальция в ранней эндосоме in vivo.

В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН (диапазон кислых значений рН) является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН (диапазон нейтральных значений рН)" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН4,0 до рН6,5, является более слабой, чем при значении рН, выбранном из диапазона от рН6,7 до рН10,0; предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН4,5 до рН6,5, является более слабой, чем при рН, выбранном из диапазона от рН6,7 до рН9,5; более предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН5,0 до рН6,5, является более слабой, чем при значении рН, выбранном из диапазона от рН7,0 до рН9,0; еще более предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН5,5 до рН6,5 является более слабой, чем при значении рН, выбранном из диапазона от рН7,0 до рН8,0; особенно предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность при значении рН в ранней эндосоме in vivo является более слабой, чем антигенсвязывающая активность при значении рН в плазме in vivo; и, конкретно, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при рН5,8 является более слабой, чем антигенсвязывающая активность при рН 7,4.

Определение того, изменяется ли антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий рН можно проводить, например, с использованием известных способов измерения, таких как способы, описанные в разделе "Активность связывания" выше. В частности, активность связывания измеряют в различных условиях рН с использованием способов измерения, описанных выше. Например, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы сравнивают в условиях диапазона кислых значений рН и диапазона нейтральных значений рН, чтобы подтвердить, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы изменяется так, что она является более высокой в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем в условиях диапазона кислых значений рН.

Более того, в рамках настоящего изобретения выражение "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН" также может быть выражено как "антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН". В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН" может быть описана как "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более слабой, чем антигенсвязывающая способность при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН". Альтернативно "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, снижена так, чтобы она была более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН" может быть описана как "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, снижена так, чтобы она была слабее, чем антигенсвязывающая способность при низкой концентрации ионов водорода или высоких значениях рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН".

Условия, отличные от концентрации ионов водорода или рН для измерения и антигенсвязывающей активности, могут быть соответствующим образом выбраны специалистами в данной области и они конкретно не ограничены. Измерение можно проводить, например, при 37°С с использованием буфера HEPES. Измерение можно проводить, например, с использованием Biacore (GE Healthcare). Когда антиген представляет собой растворимый антиген, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы можно определять путем оценки активности связывания с растворимым антигеном путем нанесения антигена в качестве анализируемого соединения на чип, на который иммобилизована антигенсвязывающая молекула. Когда антиген представляет собой антиген мембраны, активность связывания с антигеном мембраны можно оценивать путем нанесения антигенсвязывающей молекулы в качестве анализируемого соединения на чип, на который иммобилизован антиген.

При условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более слабой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, соотношение антигенсвязывающей активности между антигенсвязывающей активностью при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, и при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН конкретно не ограничено, и величина KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4), которая представляет собой соотношение константы диссоциации (KD) для антигена при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, и KD при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, предпочтительно составляет 2 или более; более предпочтительно величина KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) составляет 10 или более; и еще более предпочтительно величина KD (pH 5,8)/KD (рН 7,4) составляет 40 или более. Верхний предел величины KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) конкретно не ограничен и он может представлять собой любую величину, такую как 400, 1000 или 10000, при условии что молекулу можно получать способами, известными специалистам в данной области.

Когда антиген представляет собой растворимый антиген, константу диссоциации (KD) можно использовать в качестве величины антигенсвязывающей активности. Между тем, когда антиген представляет собой мембранный антиген, можно использовать кажущуюся константу диссоциации (KD). Константу диссоциации (KD) и кажущуюся константу диссоциации (KD) можно измерять способами, известными специалистам в данной области, и можно использовать Biacore (GE healthcare), график Скэтчарда, проточный цитометр и т.п.

Альтернативно, например, константу скорости диссоциации (kd) можно соответствующим образом использовать в качестве показателя, указывающего на соотношение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению между активностью при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, и при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН. Когда kd (константа скорости диссоциации) используют в качестве показателя, указывающего на соотношение активностей связывания вместо KD (константа диссоциации), величина kd (в диапазоне кислых значений рН)/kd (в диапазоне нейтральных значений рН), которая представляет собой соотношение kd (константа скорости диссоциации) в отношении антигена при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений, рН и kd (константа скорости диссоциации) при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, предпочтительно составляет 2 или более, более предпочтительно 5 или более, еще более предпочтительно 10 или более и еще более предпочтительно 30 или более. Верхний предел величины kd (в диапазоне кислых значений рН)/kd (в диапазоне нейтральных значений рН) конкретно не ограничен, и он может представлять собой любую величину, такую как 50, 100 или 200, при условии, что можно молекулу можно получать способами, известными специалистам в данной области.

Когда антиген представляет собой растворимый антиген, в качестве величины антигенсвязывающей активности можно использовать константу скорости диссоциации (kd), и когда антиген представляет собой антиген мембраны, можно использовать кажущуюся константу скорости диссоциации (kd). Константу скорости диссоциации (kd) и кажущуюся константу скорости диссоциации (kd) можно определять способами, известными специалистам в данной области, и можно использовать Biacore (GE healthcare), проточный цитометр и т.п. В рамках настоящего изобретения, когда антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы измеряют при различных концентрациях ионов водорода, т.е. рН, условия, отличные от концентрации ионов водорода, т.е. рН, предпочтительно являются одинаковыми.

Например, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются одним из вариантов осуществления, предусматриваемых настоящим изобретением, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител, включающего следующие стадии (а)-(с):

(a) получение значения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела в диапазоне кислых значений рН;

(b) получение значения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела в диапазоне нейтральных значений рН; и

(c) выбор антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН.

Альтернативно антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются одним из вариантов осуществления, предусматриваемых настоящим изобретением, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител или их библиотеки, включающего следующие стадии (а)-(с):

(a) контактирование антигенсвязывающего домена, или антитела, или их библиотеки, в диапазоне нейтральных значений рН с антигеном;

(b) помещение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (а), в диапазон кислых значений рН; и

(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, диссоциировавших на стадии (b).

Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов, или антител, или их библиотеки, включающего следующие стадии (a)-(d):

(a) контактирование в диапазоне кислых значений рН антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител;

(b) отбор антигенсвязывающего домена или антитела, которые не связываются с антигеном на стадии (а);

(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, отобранным на стадии (b), связываться с антигеном в диапазоне нейтральных значений рН; и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (с).

Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать способом скрининга, включающим следующие стадии (а)-(с):

(a) контактирование в диапазоне нейтральных значений рН библиотеки антигенсвязывающих доменов или антител с колонкой, на которой иммобилизован антиген;

(b) элюирование в диапазоне кислых значений рН из колонки антигенсвязывающего домена или антитела, связавшегося с колонкой на стадии (а); и

(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, элюированных на стадии (b).

Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать способом скрининга, включающим следующие стадии (a)-(d):

(a) позволение в диапазоне кислых значений рН библиотеке антигенсвязывающих доменов или антител проходить через колонку, на которую иммобилизован антиген;

(b) сбор антигенсвязывающего домена или антитела, элюированных без связывания с колонкой на стадии (а);

(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, собранным на стадии (b), связываться с антигеном в диапазоне нейтральных значений рН; и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (с).

Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать способом скрининга, включающим следующие стадии (a)-(d):

(а) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител в диапазоне нейтральных значений рН;

(b) получение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (а);

(c) помещение антигенсвязывающего домена или антитела, полученных на стадии (b), в диапазон кислых значений рН; и

(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых на стадии (с) является более слабой, чем стандарт, выбранный на стадии (b).

Описанные выше стадии можно повторять два или более раз. Таким образом, настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим доменам и антителам, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН, которые получают способом скрининга, который дополнительно включает стадии повторения два или более раз стадий (а)-(с) или (a)-(d) в описанных выше способах скрининга. Количество повторений стадий (а)-(с) или (a)-(d) конкретно не ограничено; однако обычно количество составляет 10 или менее.

В способах скрининга по настоящему изобретению антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, конкретно не ограничена, при условии что она представляет собой антигенсвязывающую активность при рН от 4,0 до 6,5, и включает антигенсвязывающую активность при рН от 4,5 до 6,6 в качестве предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН от 5,0 до 6,5, и антигенсвязывающую активность при рН от 5,5 до 6,5 в качестве других предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН в ранней эндосоме in vivo в качестве более предпочтительного значения рН, и, в частности, антигенсвязывающую активность при рН 5,8. Между тем, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, конкретно не ограничена, при условии, что она представляет собой антигенсвязывающую активность при рН от 6,7 до 10, и включает антигенсвязывающую активность при рН от 6,7 до 9,5 в качестве предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН от 7,0 до 9,5 и антиген связывающую активность при рН от 7,0 до 8,0 в качестве других предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН плазмы in vivo в качестве более предпочтительных значений рН, и, в частности, антигенсвязывающую активность при рН 7,4.

Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно измерять способами, известными специалистам в данной области. Специалисты в данной области могут соответствующим образом определить условия, отличные от концентрации ионизированного кальция. Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно оценивать, основываясь на константе диссоциации (KD), кажущейся константе диссоциации (KD), константе скорости диссоциации (kd), кажущейся константе скорости диссоциации (kd) и т.п. Их можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare), графика Скэтчарда или FACS.

В рамках настоящего изобретения стадия отбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой, чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является синонимичной стадии отбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН.

При условии, что антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой, чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, отличие между антигенсвязывающей активностью при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, и антигенсвязывающей активностью при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, конкретно не ограничено; однако антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, предпочтительно в два или более раз, более предпочтительно в 10 или более раз, и еще более предпочтительно в 40 или более раз превышает антигенсвязывающую активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН.

Антигенсвязывающий домен или антитело по настоящему изобретению, подвергаемые скринингу способами скрининга, описанными выше, могут представлять собой любой антигенсвязывающий домен или антитело, и можно проводить скрининг упомянутого выше антигенсвязывающего домена или антитела. Например, можно проводить скрининг антигенсвязывающего домена или антитела, имеющих нативную последовательность, и можно проводить скрининг антигенсвязывающего домена или антитела, в которых их аминокислотные последовательности были заменены.

Антигенсвязывающий домен или антитело по настоящему изобретению, подлежащие скринингу описанными выше способами скрининга, можно получать любым способом. Например, можно использовать общепринятые антитела, общепринятые библиотеки (фаговая библиотека и т.д.), антитела или библиотеки, полученные из В-клеток иммунизированных животных или из гибридом, полученных путем иммунизации животных, антитела или библиотеки (библиотеки с увеличенным содержанием аминокислот с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот, библиотеки, в которые внесены аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислотные мутации в конкретных положениях и т.д.), полученные путем внесения аминокислот с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислотных мутаций в описанные выше антитела или библиотеки.

Способы получения антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой, чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, из антигенсвязывающих доменов или антител, полученных из гибридом, полученных иммунизацией животных или из В-клеток иммунизированных животных, предпочтительно включают, например, антигенсвязывающую молекулу или антитело, в которых по меньшей мере одна из аминокислот антигенсвязывающего домена или антитела заменена аминокислотой с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или мутацией на неприродную аминокислоту, или антигенсвязывающий домен или антитело, в которые встроена аминокислота с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродная аминокислота, такая как описана в WO 2009/125825.

Участки внесения мутаций на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты конкретно не ограничены, и они могут представлять собой любое положение, при условии что антигенсвязывающая активность в диапазоне кислых значений рН становится более слабой, чем в диапазоне нейтральных значений рН (величина KD (в диапазоне кислых значений рН)/KD (в диапазоне нейтральных значений рН) или kd (в диапазоне кислых значений рН)/kd (в диапазоне нейтральных значений рН) увеличивается) по сравнению с величиной до замены или вставки. Например, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело, являются пригодными вариабельная область и CDR антитела. Специалисты в данной области могут соответствующим образом определить количество аминокислот, подлежащих замене, или количество аминокислот с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот, подлежащих встраиванию. Можно осуществить замену на одну аминокислоту, имеющую pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или одну неприродную аминокислоту; можно осуществить встраивание одной аминокислоты, имеющей pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или одной неприродной аминокислоты; можно осуществить замену на две или более аминокислоты, имеющих pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или на две или более неприродных аминокислоты; и можно осуществить встраивание двух или более аминокислот, имеющих pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или двух или более неприродных аминокислот. Альтернативно другие аминокислоты можно параллельно удалять, добавлять, встраивать и/или заменять, помимо замены на аминокислоты, имеющие pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, или встраивания аминокислот, имеющих pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот. Замену на или встраивание аминокислот с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот можно проводить случайным образом способами, такими как сканирование гистидином, в которых аланин в способе сканирования аланином, известном специалистам в данной области, заменяют на гистидин. Антигенсвязывающие молекулы, проявляющие более высокую величину KD (в диапазоне кислых значений рН)/KD (в диапазоне нейтральных значений рН) или kd (в диапазоне кислых значений рН)/kd (в диапазоне нейтральных значений рН) по сравнению с величиной до внесения мутации можно выбирать из антигенсвязывающих доменов или антител, в которые внесены случайные инсерции или мутации с заменой на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты.

Предпочтительные примеры антигенсвязывающих молекул, содержащих мутацию на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, как описано выше, и антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН, включают антигенсвязывающие молекулы, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне нейтральных значений рН после мутации на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты сравнима с антигенсвязывающей активностью до мутации на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты. В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая молекула после мутации на аминокислоты, имеющие pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или неприродные аминокислоты имеет антигенсвязывающую активность, сравнимую с антигенсвязывающей активностью до мутации на аминокислоты, имеющие pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты" означает, что, при принятии антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы до мутации на аминокислоты, имеющие pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или неприродные аминокислоты, как 100%, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы после мутации на аминокислоты, имеющие pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или неприродные аминокислоты составляет по меньшей мере 10% или более, предпочтительно 50% или более, более предпочтительно 80% или более, и еще более предпочтительно 90% или более. Антигенсвязывающая активность после мутации на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты при рН 7,4 может быть более высокой, чем до мутации на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты при рН 7,4. Если антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы снижается вследствие встраивания или замены на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, антигенсвязывающую активность можно сделать сравнимой с антигенсвязывающей активностью до встраивания или замены на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, путем внесения замены, делеции, вставки и/или инсерции одной или нескольких аминокислот антигенсвязывающей молекулы. Настоящее изобретение также включает антигенсвязывающие молекулы, активность связывания которых скорректирована так, чтобы она была сравнимой, путем замены, делеции, вставки и/или инсерции одной или нескольких аминокислот после замены на или вставки аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродной аминокислоты.

Между тем, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой вещество, содержащее константную область антитела, предпочтительные варианты осуществления антигенсвязывающих молекул, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН, включают способы, в которых константные области антитела, содержащиеся в антигенсвязывающих молекулах, модифицированы. Конкретные примеры модифицированных константных областей антител предпочтительно включают константные области SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 14.

Аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена в зависимости от условий концентрации ионов водорода

Антигенсвязывающие домены или антитела по настоящему изобретению, подлежащие скринингу описанными выше способами скрининга, можно получать любым способом. Например, когда условия концентрации ионов представляют собой условия концентрации ионов водорода или условия рН, можно использовать общепринятые антитела, общепринятые библиотеки (фаговая библиотека и т.д.), антитела или библиотеки, полученные из В-клеток иммунизированных животных или из гибридом, полученных иммунизацией животных, антитела или библиотеки (библиотеки с увеличенным содержанием аминокислот с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот, библиотеки, в которые внесены мутации на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты в конкретных положениях и т.д.), полученные путем внесения мутаций на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты в описанные выше антитела или библиотеки.

В одном неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения библиотеку, содержащую множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, также можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей тяжелой цепи, полученных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, с вариабельными областями легкой цепи, в которые внесен "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода".

Такие аминокислотные остатки включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR1 легкой цепи. Аминокислотные остатки также включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR2 легкой цепи. Аминокислотные остатки также включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR3 легкой цепи.

Описанные выше аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR1 легкой цепи, включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки в положениях 24, 27, 28, 31, 32 и/или 34 согласно нумерации Kabat в CDR1 вариабельной области легкой цепи. Между тем, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR2 легкой цепи, включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки в положениях 50, 51, 52, 53, 54, 55 и/или 56 согласно нумерации Kabat в CDR2 вариабельной области легкой цепи. Более того, аминокислотные остатки в CDR3 легкой цепи включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки в положениях 89, 90, 91, 92, 93, 94 и/или 95А согласно нумерации Kabat, в CDR3 вариабельной области легкой цепи. Более того, аминокислотные остатки могут содержаться отдельно или они могут содержаться в комбинации из двух или более аминокислот, при условии, что они позволяют изменять антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов водорода.

Даже когда вариабельную область тяжелой цепи, полученную в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, комбинируют с описанной выше вариабельной областью легкой цепи, в которую внесен "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода", ее можно конструировать так, чтобы нестрогие остатки содержались в последовательности вариабельной области легкой цепи аналогично тому, как описано выше. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено конкретным вариантом осуществления, при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению изменяется в зависимости от условий концентрации ионов водорода. В частности, последовательности CDR и/или FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Например, нестрогие остатки, подлежащие внесению в последовательности вариабельных областей легкой цепи, включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, приведенные в таблице 3 и 4. Между тем, аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи, отличные от нестрогих остатков, и аминокислотные остатки, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода, соответственно включают, но не ограничиваются ими, последовательности эмбрионального типа, такие как Vk1 (SEQ ID NO: 5), Vk2 (SEQ ID NO: 6), Vk3 (SEQ ID NO: 7) и Vk4 (SEQ ID NO: 8).

(положение указано согласно нумерации Kabat)

(положение указано согласно нумерации Kabat)

Любой аминокислотный остаток можно соответствующим образом использовать в качестве описанных выше аминокислотных остатков, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода. В частности, такие аминокислотные остатки включают аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0. Такие электроноотдающие аминокислоты предпочтительно включают, например, встречающиеся в природе аминокислоты, такие как гистидин и глутаминовая кислота, а также неприродные аминокислоты, такие как аналоги гистидина (US 20090035836), m-NO2-Tyr (pKa 7,45), 3.5-Br2-Tyr (pKa 7,21) и 3.5-I2-Tyr (pKa 7,38) (Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-2768). Особенно предпочтительные аминокислотные остатки включают, например, аминокислоты с pKa боковой цепи 6,0-7,0. Такие электроноотдающие аминокислотные остатки предпочтительно включают, например, гистидин.

Для модификации аминокислот антигенсвязывающих доменов можно соответствующим образом использовать известные способы, такие как сайт-направленный мутагенез (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и перекрывающаяся ПЦР. Более того, различные известные способы также можно использовать в качестве способа модификации аминокислот для замены аминокислот на аминокислоты, отличные от природных аминокислот (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Например, можно соответствующим образом использовать бесклеточную систему трансляции (Clover Direct (Protein Express)), содержащую тРНК, в которых амбер-супрессорная тРНК, которая комплементарна кодону UAG (амбер-кодон), который является стоп-кодоном, связана с неприродной аминокислотой.

Предпочтительная вариабельная область тяжелой цепи, которую используют в комбинации, включает, например, рандомизированные библиотеки вариабельной области. Известные способы соответствующим образом комбинируют в качестве способа получения рандомизированной библиотеки вариабельной области. В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области можно использовать иммунную библиотеку, сконструированную на основе генов антител, происходящих из животных, иммунизированных конкретными антигенами, пациентов с инфекцией или индивидуумов с повышенным титром антител в крови в результате вакцинации, пациентов со злокачественной опухолью или лимфоцитов от пациентов с иммунными заболеваниями.

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения, аналогично тому, как описано выше, в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также пригодным образом можно использовать синтетическую библиотеку, полученную путем замены последовательностей CDR V-генов в геномной ДНК или функциональных реконструированных V-генов набором синтетических олигонуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие наборы кодонов соответствующей длины. В этом случае, поскольку в последовательности CDR3 тяжелой цепи наблюдают разнообразие, также можно заменять только последовательность CDR3. Основанием для получения вариантов аминокислот в вариабельной области антигенсвязывающей молекулы является получение вариантов аминокислотных остатков экспонированных на поверхности положений антигенсвязывающей молекулы. Экспонированное на поверхности положение относится к положению, которое считается способным экспонироваться на поверхности и/или контактировать с антигеном, исходя из структуры, группы структур и/или смоделированной структуры антигенсвязывающей молекулы, и, как правило, такие положения представляют собой CDR. Предпочтительно, экспонированные на поверхности положения определяют с использованием координат из трехмерной модели антигенсвязывающей молекулы с использованием компьютерной программы, такой как программа InsightII (Accelrys). Экспонированные на поверхности положения можно определять с использованием алгоритмов, известных в данной области (например. Lee and Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Определение экспонированных на поверхности положений можно проводить на основе информации о трехмерной структуре с использованием программного обеспечения, пригодного для моделирования белка. Программное обеспечение, которое можно использовать для этих целей, предпочтительно включает программное обеспечение SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Когда алгоритм требует введения пользователем параметра размера, "размер" образца, который используют в вычислении, устанавливают как радиус, приблизительно равный 1,4 Ангстрем или менее. Более того, способы определения экспонированных на поверхности областей и участков с использованием программного обеспечения для персонального компьютера описаны Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).

В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также особенно пригодным является использование наивной библиотеки, которая сконструирована из генов антител, происходящих из лимфоцитов здоровых индивидуумов, и набор генов которой состоит из наивных последовательностей, которые представляют собой последовательности антител без предпочтений (Gejima et al. (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)).

Нейтрализующая активность

Неограничивающий вариант осуществления настоящего изобретения относится к антигенсвязывающей молекуле, обладающей активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН, включающей антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, и имеющей нейтрализующую активность против антигена, где антигенсвязывающий домен обладает антигенсвязывающей активностью, которая изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем Fc-область нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров; и фармацевтической композиции, содержащей антигенсвязывающую молекулу. Главным образом, нейтрализующая активность относится к активности ингибирования биологической активности лиганда, такого как вирусы и токсины, обладающие биологической активностью в отношении клеток. Таким образом, вещества, обладающие нейтрализующей активностью, относятся к веществам, которые связываются с лигандом или рецептором, с которым связывается лиганд, и ингибируют связывание между лигандом и рецептором. Рецепторы, связывание которых с лигандом блокировано вследствие нейтрализующей активности, не способны проявлять биологическую активность через этот рецептор. Когда антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело, такое антитело, обладающее нейтрализующей активностью, обычно называют нейтрализующим антителом. Нейтрализующую активность исследуемого вещества можно измерять путем сравнения биологической активности в присутствии лиганда между ситуациями, когда исследуемое вещество присутствует и отсутствует.

Например, основные возможные лиганды для рецептора IL-6 предпочтительно включают IL-6, как показано в SEQ ID NO: 15. Рецептор IL-6, который представляет собой мембранный белок типа I, N-конец которого образует внеклеточный домен, образует гетеротетрамер с рецептором gp130, который индуцируется к димеризации посредством IL-6 (Heinrich et al. (Biochem. J. (1998) 334, 297-314)). Образование гетеротетрамера активирует Jak, которая ассоциирована с рецептором gp130. Jak претерпевает аутофосфорилирование и фосфорилирует рецептор. Участок фосфорилирования рецептора и Jak служит в качестве участка связывания для содержащих SH2 молекул, принадлежащих семейству Stat, таких как Stat3; МАР-киназа; PI3/Akt; и другие содержащие SH2 белки и адаптеры. Далее, Stat, связанный с рецептором gp130, фосфорилируется посредством Jak. Фосфорилированный Stat димеризуется и перемещается в ядро, и регулирует транскрипцию генов-мишеней. Jak или Stat также могут быть вовлечены в каскады передачи сигнала через рецепторы других классов. Нарушенную регуляцию каскадов передачи сигнала IL-6 наблюдают при воспалительных и патологических состояниях аутоиммунных заболеваний и злокачественных опухолей, таких как рак предстательной железы и множественная миелома. Stat3, который может действовать в качестве онкогена, конститутивно активируется во многих злокачественных опухолях. При раке предстательной железы и множественной миеломе существует перекрестная связь между каскадом передачи сигнала через рецептор IL-6 и каскадом передачи сигнала через представителей семейства рецептора эпителиального фактора роста (EGFR) (Ishikawa et al. (J. Clin. Exp. Hematopathol. (2006) 46 (2), 55-66)).

Такие внутриклеточные каскады передачи сигнала различаются для каждого типа клеток; таким образом, соответствующие молекулы-мишени можно определять для каждой представляющей интерес клетки-мишени, и они не ограничиваются упомянутыми выше факторами. Активность нейтрализации можно оценивать путем измерения активации передачи сигнала in vivo. Более того, активацию передачи сигнала in vivo можно выявлять с использованием в качестве показателя действия индукции транскрипции гена-мишени, который располагается ниже каскада передачи сигнала in vivo. Изменение активности транскрипции гена-мишени можно выявлять по принципу репортерных анализов. В частности, репортерный ген, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или люцифераза, помещают ниже промоторной области или фактора транскрипции гена-мишени, его репортерную активность измеряют, и, тем самым, можно измерять изменение активности транскрипции в качестве активности репортера. Можно соответствующим образом использовать коммерчески доступные наборы для измерения активации передачи сигнала in vivo (например. Mercury Pathway Profiling Luciferase System (Clontech)).

Более того, для способов измерения активности нейтрализации рецепторов/лигандов семейства рецепторов EGF и т.п., которая обычно воздействует на каскады передачи сигнала, которые действуют в направлении стимуляции пролиферации клеток, активность нейтрализации нейтрализующих антител можно оценивать путем измерения активности пролиферации клеток-мишеней. Например, когда пролиферация клеток стимулируется факторами роста семейства EGF, такими как HB-EGF, ингибиторный эффект на пролиферацию таких клеток, основанный на нейтрализующей активности антитела против HB-EGF, можно пригодным образом оценивать или измерять следующими способами: для оценки или измерения активности ингибирования пролиферации клеток in vitro используют способ измерения включения [3Н]-меченного тимидина, добавленного в среду, жизнеспособными клетками в качестве показателя способности к репликации ДНК. В качестве более удобных способов используют способ исключения красителя, в котором измеряют способность клеток исключать краситель, такой как трипановый синий, из клетки под микроскопом, и способ с МТТ. В последнем из этих способов используется способность живых клеток преобразовывать МТТ (бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия), который представляет собой соль тетразолия, в синий продукт формазан. Более конкретно, исследуемое антитело добавляют вместе с лигандом в культуральный раствор исследуемых клеток, и после определенного периода времени в культуральный раствор добавляют МТТ и его оставляют стоять в течение некоторого периода времени для включения МТТ в клетку. В результате, МТТ, который представляет собой желтое соединение, преобразуется в синее соединение под действием сукцинатдегидрогеназы в митохондриях клеток. После растворения этого синего продукта для окрашивания, его поглощение измеряют и используют в качестве показателя количества живых клеток. В дополнение к МТТ, также являются коммерчески доступными реагенты, такие как MTS, XTT, WST-1 и WST-8 (Nacalai Tesque и т.п.) и их можно пригодным образом использовать. Для измерения активности связывающее антитело, которое представляет собой антитело того же изотипа, что и антитело против HB-EGF, но не обладает активностью ингибирования пролиферации клеток, можно использовать в качестве контрольного антитела аналогично тому, как и антитело против HB-EGF, и активность можно определять, когда антитело против HB-EGF демонстрирует более высокую активность ингибирования пролиферации клеток, чем контрольное антитело.

Клетки, которые предпочтительно можно использовать для оценки активности, включают, например, клетки, пролиферация которых стимулируется посредством HB-EGF, такие как клеточная линия рака яичника RMG-1 и клетки мыши Ba/F3, трансформированные вектором для экспрессии гена, кодирующего hEGFR/mG-CSFR, который представляет собой слитый белок, в котором внеклеточный домен EGFR человека слит в рамке считывания с внутриклеточным доменом рецептора GCSF мыши. Таким образом, специалисты в данной области могут соответствующим образом выбрать клетки для применения для оценки активности и использовать их для измерения активности пролиферации клеток, как упоминалось выше.

Поскольку антигенсвязывающая молекула, предусматриваемая настоящим изобретением, может элиминировать антигены из плазмы, антигенсвязывающая молекула сама по себе не обязательно должна обладать нейтрализующей активностью. Однако является более удобным блокирование функции антигена, присутствующего в плазме, посредством осуществления нейтрализующей активности против антигена до тех пор, пока антиген не будет захвачен с антигенсвязывающей молекулой в экспрессирующие Fcγ-рецептор клетки посредством опосредуемого Fcγ-рецептором эндоцитоза.

Более того, поскольку антигенсвязывающая молекула, предусматриваемая настоящим изобретением, может ускорять внутриклеточную диссоциацию антигена, который может быть внеклеточно связанным с антигенсвязывающей молекулой, от антигенсвязывающей молекулы, антиген, который диссоциировал от антигенсвязывающей молекулы внутри клетки деградируется в лизосоме. Таким образом, сама по себе антигенсвязывающая молекула не обязательно должна обладать нейтрализующей активностью. Однако более удобно блокировать функцию антигена, присутствующего в плазме, посредством нейтрализующей активности против антигена до тех пор, пока антиген не будет захвачен с антигенсвязывающей молекулой в клетки, экспрессирующие Fcγ-рецептор посредством опосредуемого Fcγ-рецептором эндоцитоза.

Более того, поскольку антигенсвязывающая молекула, предусматриваемая в рамках настоящего изобретения, может снижать общую концентрацию антигена или концентрацию свободного антигена в плазме, антигенсвязывающая молекула сама по себе не обязательно должна обладать нейтрализующей активностью. Однако более удобно блокировать функцию антигена, присутствующего в плазме, посредством нейтрализующей активности против антигена до тех пор, пока антиген не будет захвачен с антигенсвязывающей молекулой в экспрессирующие Fcγ-рецептор клетки посредством опосредуемого Fcγ-рецептором эндоцитоза.

Fcγ-рецептор

Fcγ-рецептор относится к рецептору, способному связываться с Fc-областью моноклональных антител IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, и включает всех представителей, принадлежащих семейству белков, по существу кодируемых геном Fcγ-рецептора. У человека это семейство включает FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc; FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa (включая аллотип Н131 и R131), FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2), и FcγRIIc; и FcγRIII (CD16) включая изоформу FcγRIIIa (включая аллотип V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотип FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2); a также неидентифицированные FcγR человека, изоформы FcγR и их аллотипы. Однако Fcγ-рецептор не ограничивается этими примерами. Не ограничиваясь этим, FcγR включает FcγR человека, мыши, крысы, кролика и обезьяны. FcγR может происходить из любых организмов. FcγR мыши включает, но не ограничивается ими, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIII-2 (FcγRIV, CD16-2), а также неидентифицированные FcγR мыши, изоформы FcγR и их аллотипы. Такие предпочтительные Fcγ-рецепторы включают, например, FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), FcγRIIb (CD32), FcγRIIIa (CD16) и/или FcγRIIIb (CD16) человека. Полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRI представлены в SEQ ID NO: 16 (NM_00056.3) и 17 (NP_000557.1), соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIa (аллотип Н131) представлены в SEQ ID NO: 18 (ВС020823.1) и 19 (ААН20823.1) (аллотип R131 представляет собой последовательность, в которой аминокислота в положении 166 SEQ ID NO: 19 заменена на Arg), соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγIIB представлены в SEQ ID NO: 20 (ВС146678.1) и 21 (AAI46679.1), соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIa представлены в SEQ ID NO: 22 (ВС033678.1) и 23 (ААН33678.1), соответственно; и полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIb представлены в SEQ ID NO: 24 (ВС128562.1) и 25 (AAI28563.1), соответственно (номер доступа RefSeq представлен в каждом случае в скобках). То, обладает ли Fcγ-рецептор активностью связывания с Fc-областью моноклонального антитела IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, можно оценивать с помощью скрининга ALPHA (анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции), способа BIACORE на основе поверхностного плазменного резонанса (SPR) и другие (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010), в дополнение к описанным выше форматам FACS и ELISA.

Между тем, "Fc-лиганд" или "эффекторный лиганд" относится к молекуле и предпочтительно полипептиду, которые связываются с Fc-областью антитела, образуя комплекс Fc/Fc-лиганд. Молекула может происходить из любых организмов. Связывание Fc-лиганда с Fc предпочтительно индуцирует одну или несколько эффекторных функций. Такие Fc-лиганды включают, но не ограничиваются ими, Fc-рецепторы, FcγR, FcγR, FcγR, FcRn, C1q и С3, маннан-связывающий лектин, рецептор маннозы, белок A Staphylococcus, белок G Staphylococcus и вирусные FcγR. Fc-лиганды также включают гомологи Fc-рецептора (FcRH) (Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136), которые являются семейством Fc-рецепторов, гомологичных FcγR. Fc-лиганды также включают неидентифицированные молекулы, которые связываются с Fc.

В FcγRI (CD64), включая FcγRIa, FcγRIb, и FcγRIc, и FcγRIII (CD16), включающий изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2), α-цепь, которая связывается с Fc-частью IgG, ассоциирована с общей γ-цепью, имеющей ITAM, ответственный за передачу внутриклеточного активирующего сигнала. Между тем, цитоплазматический домен FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa (включая аллотипы H131 и R131) и FcγRIIc содержит ITAM. Эти рецепторы экспрессируются на многих клетках, таких как макрофаги, тучные клетки и антигенпредставляющие клетки. Активирующий сигнал, передаваемый при связывании этих рецепторов с Fc-частью IgG, приводит к усилению фагоцитарной активности макрофагов, продукции воспалительных цитокинов, дегрануляции тучных клеток и усилению функции антигенпредставляющих клеток. Fcγ-рецепторы, обладающие способностью передавать активирующий сигнал, как описано выше, также называют активирующими Fcγ-рецепторами.

Между тем, внутрицитоплазматический домен FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2) содержит ITIM, ответственный за передачу ингибиторных сигналов. Связывание между FcγRIIb и В-клеточным рецептором (BCR) на В-клетках подавляет активирующий сигнал от BCR, что приводит к подавлению продукции антитела через BCR. Связывание FcγRIII и FcγRIIb на макрофагах подавляет фагоцитарную активность и продукцию воспалительных цитокинов. Fcγ-рецепторы, обладающие способностью передавать ингибирующий сигнал, как описано выше, также называют ингибиторным Fcγ-рецептором.

Активность связывания с Fcγ-рецептором

Активность связывания FcγR-связывающего домена, который включен в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, с любым из Fcγ-рецепторов человека, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa и/или FcγRIIIb, может быт подтверждена с помощью описанного выше формата FACS и ELISA, а также скрининга ALPHA (анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции), способа BIACORE, который основан на явлении поверхностного плазменного резонанса (SPR) и т.п. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010). Внеклеточный домен Fcγ-рецептора человека можно использовать в качестве растворимого антигена в этих анализах.

Скрининг ALPHA проводят с помощью технологии ALPHA на основе принципа, описанного ниже, где используется два типа гранул: донорные и акцепторные. Люминесцентный сигнал выявляется только когда молекулы, связанные с донорными гранулами, биологически взаимодействуют с молекулами, связанными с акцепторными гранулами, и эти два типа гранул находятся вблизи друг друга. Возбуждаемый лазерным пучком фотосенсибилизатор в донорных гранулах преобразует кислород вокруг гранулы в возбужденный синглетный кислород. Когда синглетный кислород распространяется среди донорных гранул и достигает акцепторных гранул, расположенных близко, в акцепторных гранулах индуцируется хемилюминесцентная реакция. Это в конечном итоге приводит к испусканию света. Когда молекулы, связанные с донорными гранулами, не взаимодействуют с молекулами, связанными с акцепторными гранулами, синглетный кислород, продуцируемый донорными гранулами, не достигает акцепторных гранул и хемилюминесцентная реакция не происходит.

Например, меченную биотином антигенсвязывающую молекулу, содержащую Fc-область, иммобилизуют на донорных гранулах, и Fcγ-рецептор, меченный глутатион-S-трансферазой (GST) иммобилизуют на акцепторных гранулах. В отсутствие антигенсвязывающей молекулы, содержащей конкурирующий вариант Fc-области, Fcγ-рецептор взаимодействует с антигенсвязывающей молекулой, содержащей нативную Fc-область, что приводит к индукции сигнала в области 520-620 нм. Антигенсвязывающая молекула, имеющая немеченый вариант Fc-области, конкурирует с антигенсвязывающей молекулой, содержащей нативную Fc-область, для взаимодействия с Fcγ-рецептором. Относительную аффинность связывания можно определять путем количественного определения снижения флуоресценции в результате конкуренции. Способы биотинилирования антигенсвязывающих молекул, таких как антитела, с использованием сульфо-NHS-биотина и т.п., известны. Соответствующие способы добавления GST-метки к Fcγ-рецептору включают способы, которые вовлекают слияние полипептидов, кодирующих Fcγ и GST в рамке считывания, экспрессию слитого гена с использованием клеток, в которые введен вектор, с которым ген функционально связан, а затем очистку с использованием колонки с глутатионом. Индуцированный сигнал предпочтительно можно анализировать, например, путем аппроксимации его к односторонней модели конкуренции на основе нелинейного регрессионного анализа с использованием программного обеспечения, такого как GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).

Одно из веществ при наблюдении их взаимодействия иммобилизуют в качестве лиганда на тонкую золотую пленку на сенсорном чипе. Когда свет падает на заднюю поверхность сенсорного чипа, так чтобы общее отражение происходило на поверхности контакта между тонкой золотой пленкой и стеклом, интенсивность отраженного света частично снижается в определенной области (сигнал SPR). Другое из веществ при выявлении взаимодействия инжектируют в качестве анализируемого соединения на поверхность сенсорного чипа. Когда анализируемое соединение связывается с лигандом, масса иммобилизованной молекулы лиганда возрастает. Изменение индекса рефракции вызывает сдвиг положения сигнала SPR (с другой стороны, диссоциация вызывает сдвиг сигнала обратно в исходное положение). В системе Biacore величину сдвига, упомянутую выше (т.е. изменение массы на поверхности сенсорного чипа) наносят на график по вертикальной оси, и, таким образом, изменение массы с течением времени показывают в качестве данных измерения (сенсограмма). Параметры кинетики (константа скорости ассоциации (ka) и константу скорости диссоциации (kd)), определяют из кривых сенсограммы, и аффинность (KD) определяют из соотношения этих двух констант. В способе BIACORE, предпочтительно используют анализ ингибирования. Примеры такого анализа ингибирования описаны в Proc. Natl. Acad. Sci USA (2006) 103 (11): 4005-4010.

Связывающий Fcγ-рецептор домен

Связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий более высокой активностью связывания Fcγ-рецептора, чем Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, можно получать посредством изменения аминокислоты нативной Fc-области IgG человека. Более того, для связывающего Fcγ-рецептор домена можно использовать любую структуру антигенсвязывающего домена, описанную ранее, которая характеризуется тем, что она связывается с Fcγ-рецептором. В таком случае связывающий Fcγ-рецептор домен можно получать без необходимости во внесении аминокислотных изменений, или аффинность в отношении Fcγ-рецептора можно увеличивать путем внесения дополнительных изменений. Примеры такого связывающего Fcγ-рецептор домена включают Fab-фрагмент антитела, который связывается с FcγRIIIa, который описан в Protein Eng Des Sel. 2009 Mar; 22(3):175-88, Protein Eng Des Sel. 2008 Jan; 21(1):1-10 и J Immunol. 2002 Jul 1; 169(1):137-44, происходящее из верблюда однодоменное антитело и одноцепочечное Fv-антитело и связывающий FcγRI циклический пептид, описанный в FASEB J. 2009 Feb; 23(2):575-85. То, является ли активность связывания FcγR связывающего Fcγ-рецептор домена более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, можно определять соответствующим образом с использованием способа, описанного в упомянутом выше разделе об активности связывания.

В рамках настоящего изобретения Fc-область IgG человека является пригодным примером связывающего Fcγ-рецептор домена, являющегося исходным материалом. В рамках настоящего изобретение "изменение аминокислоты" или "аминокислотное изменение" Fc-области включает изменение аминокислотной последовательности Fc-области, являющейся исходным материалом, на отличающуюся аминокислотную последовательность. При условии, что модифицированный вариант Fc-области, являющейся исходным материалом, может связываться с Fcγ-рецептором человека в диапазоне нейтральных значений рН, любую Fc-область можно использовать в качестве Fc-области, являющейся исходным материалом. Более того, Fc-область, полученная путем дальнейших изменений уже измененной Fc-области, используемой в качестве исходной Fc-области, также можно предпочтительно использовать в качестве Fc-области по настоящему изобретению. "Исходная Fc-область" может относиться к самому полипептиду, композиции, содержащей исходную Fc-область, или аминокислотной последовательности, кодирующей исходную Fc-область. Исходные Fc-области могут содержать Fc-область известного IgG-антитела, полученную путем рекомбинации, кратко описанной в разделе "Антитела". Источник исходных Fc-областей не ограничен, и их можно получать от человека или любых не являющихся человеком организмов. Такие организмы предпочтительно включают мышей, крыс, морских свинок, хомячков, песчанок, кошек, кроликов, собак, коз, овец, животных семейства бычьих, лошадей, верблюдов и организмов, выбранных из не являющихся человеком приматов. В другом варианте осуществления исходные связывающие Fcγ-рецептор домены также можно получать из яванских макаков, мартышек, макаков-резус, шимпанзе или людей. Исходные Fc-области можно предпочтительно получать из IgG1 человека; однако они не ограничиваются каким-либо конкретным классом IgG. Это означает, что в качестве исходной Fc-области можно соответствующим образом использовать Fc-область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, и в рамках настоящего изобретения это также означает, что предпочтительно в качестве исходной Fc-области можно использовать Fc-область произвольного класса или подкласса IgG, происходящую из любых организмов, описанных выше. Примеры встречающихся в природе вариантов или модифицированных форм IgG описаны в опубликованных документах (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; WO 2009/086320; WO 2008/092117; WO 2007/041635 и WO 2006/105338); однако они не ограничиваются этими примерами.

Примеры изменений включают изменения с одной или несколькими мутациями, например, мутациями путем замены другими аминокислотными остатками аминокислот исходных Fc-областей, путем встраивания одного или нескольких аминокислотных остатков в исходные Fc-области, или путем делеции одной или нескольких аминокислот из исходной Fc-области. Предпочтительно, аминокислотные последовательности измененных Fc-областей включают по меньшей мере часть аминокислотной последовательности ненативной Fc-области. Такие варианты обязательно обладают идентичностью или сходством последовательности с их исходной Fc-областью, меньшим чем 100%. В предпочтительном варианте осуществления варианты обладают идентичностью или сходством аминокислотной последовательности приблизительно от 75% до менее чем 100%, более предпочтительно приблизительно от 80% до менее чем 100%, еще более предпочтительно приблизительно от 85% до менее чем 100%, еще более предпочтительно, приблизительно от 90% до менее чем 100%, и еще более предпочтительно приблизительно от 95% до менее чем 100% с аминокислотной последовательностью их исходной Fc-области. В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна аминокислота отличается между модифицированной Fc-областью по настоящему изобретению и ее исходной Fc-областью. Аминокислотное отличие между модифицированной Fc-областью по настоящему изобретению и ее исходной Fc-областью также может быть предпочтительно указано на основе аминокислотных отличий в описанных выше конкретных положениях аминокислот в соответствии с системой нумерации EU.

Для модификации аминокислот Fc-областей можно соответствующим образом использовать известные способы, такие как сайт-направленный мутагенез (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и перекрывающаяся ПЦР. Более того, различные известные способы также можно использовать в качестве способа модификации аминокислот для замены аминокислот на аминокислоты, отличные от природных аминокислот (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Например, можно соответствующим образом использовать бесклеточную систему трансляции (Clover Direct (Protein Express)), содержащую тРНК, в которых амбер-супрессорная тРНК, которая комплементарна кодону UAG (амбер-кодон), который является стоп-кодоном, связана с неприродной аминокислотой.

Fc-область, обладающую активностью связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН, которая содержится в антигенсвязывающих молекулах по настоящему изобретению, можно получать любым способом, однако, в частности, Fc-область, обладающая активностью связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН, можно получать путем изменения аминокислот IgG-иммуноглобулина человека, используемого в качестве исходной Fc-области. Предпочтительные Fc-области IgG-иммуноглобулинов, подлежащие изменению, включают, например, Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и их варианты). Fc-области IgG включают мутантов, естественным образом образованных из них. Ряд аллотипических последовательностей вследствие генетического полиморфизма описан в "Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication No.91-3242, для Fc-областей антител IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека и IgG4 человека и любую из них можно использовать в рамках настоящего изобретения. В частности, для последовательности IgG1 человека, аминокислотной последовательностью в положениях 356-358 (нумерация EU) может быть либо DEL, либо ЕЕМ.

Аминокислоты в любых положениях можно изменять на другие аминокислоты при условии, что Fc-область обладает активностью связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН, или ее активность связывания Fcγ-рецептора в нейтральном диапазоне может быть усилена. Когда антигенсвязывающая молекула содержит Fc-область IgG1 человека, предпочтительно вносить изменения, которые приводят к усилению связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека. Аминокислотные изменения для усиления активности связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН описаны, например, в WO 2007/024249, WO 2007/021841, WO 2006/031370, WO 2000/042072, WO 2004/029207, WO 2004/099249, WO 2006/105338, WO 2007/041635, WO 2008/092117, WO 2005/070963, WO 2006/020114, WO 2006/116260 и WO 2006/023403.

Примеры таких аминокислот, которые могут быть изменены, включают по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в соответствии с нумерацией EU. Изменение этих аминокислот усиливает связывание Fcγ-рецептора Fc-области IgG-иммуноглобулина диапазоне нейтральных значений рН.

Особенно предпочтительные изменения для применения в рамках настоящего изобретения включают следующие изменения:

аминокислота в положении 221 либо на Lys, либо на Tyr;

аминокислота в положении 222 на любой из Phe, Trp, Glu и Tyr;

аминокислота в положении 223 на любой из Phe, Trp, Glu и Lys;

аминокислота в положении 224 на любой из Phe, Trp, Glu и Tyr;

аминокислота в положении 225 на любой из Glu, Lys и Trp;

аминокислота в положении 227 на любой из Glu, Gly, Lys и Tyr;

аминокислота в положении 228 на любой из Glu, Gly, Lys и Tyr;

аминокислота в положении 230 на любой из Ala, Glu, Gly и Tyr;

аминокислота в положении 231 на любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr;

аминокислота в положении 232 на любой из Glu, Gly, Lys и Tyr;

аминокислота в положении 233 на любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 234 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 235 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 236 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 237 на любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 238 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 239 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 240 на любой из Ala, Ile, Met и Thr;

аминокислота в положении 241 на любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 243 на любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 244 на His;

аминокислота в положении 245 на Ala;

аминокислота в положении 246 на любой из Asp, Glu, His и Tyr;

аминокислота в положении 247 на любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr;

аминокислота в положении 249 на любой из Glu, His, Gln и Tyr;

аминокислота в положении 250 либо на Glu, либо на Gln;

аминокислота в положении 251 на Phe;

аминокислота в положении 254 на любой из Phe, Met и Tyr;

аминокислота в положении 255 на любой из Glu, Leu и Tyr;

аминокислота в положении 256 на любой из Ala, Met и Pro;

аминокислота в положении 258 на любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr;

аминокислота в положении 260 на любой из Asp, Glu, His и Tyr;

аминокислота в положении 262 на любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr;

аминокислота в положении 263 на любой из Ala, Ile, Met и Thr;

аминокислота в положении 264 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 265 на любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 266 на любой из Ala, Ile, Met и Thr;

аминокислота в положении 267 на любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 268 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp;

аминокислота в положении 269 на любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 270 на любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 271 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 272 на любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 273 либо на Phe, либо на Ile;

аминокислота в положении 274 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 275 либо на Leu, либо на Trp;

аминокислота в положении 276 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 278 на любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp;

аминокислота в положении 279 на Ala;

аминокислота в положении 280 на любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 281 на любой из Asp, Lys, Pro и Tyr;

аминокислота в положении 282 на любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr;

аминокислота в положении 283 на любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr;

аминокислота в положении 284 на любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr;

аминокислота в положении 285 на любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 286 на любой из Glu, Gly, Pro и Tyr;

аминокислота в положении 288 на любой из Asn, Asp, Glu и Tyr;

аминокислота в положении 290 на любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 291 на любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln и Thr;

аминокислота в положении 292 на любой из Ala, Asp, Glu, Pro, Thr и Tyr;

аминокислота в положении 293 на любой из Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 294 на любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 295 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 296 на любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr и Val;

аминокислота в положении 297 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 298 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 299 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 300 на любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp;

аминокислота в положении 301 на любой из Asp, Glu, His и Tyr;

аминокислота в положении 302 на Ile;

аминокислота в положении 303 на любой из Asp, Gly и Tyr;

аминокислота в положении 304 на любой из Asp, His, Leu, Asn и Thr;

аминокислота в положении 305 на любой из Glu, Ile, Thr и Tyr;

аминокислота в положении 311 на любой из Ala, Asp, Asn, Thr, Val и Tyr;

аминокислота в положении 313 на Phe;

аминокислота в положении 315 на Leu;

аминокислота в положении 317 либо на Glu, либо на Gln;

аминокислота в положении 318 на любой из His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Tyr;

аминокислота в положении 320 на любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 322 на любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 323 на Ile;

аминокислота в положении 324 на любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 325 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 326 на любой из Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 327 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 328 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 329 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 330 на любой из Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 331 на любой из Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 332 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 333 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Tyr;

аминокислота в положении 334 на любой из Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro и Thr;

аминокислота в положении 335 на любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr;

аминокислота в положении 336 на любой из Glu, Lys и Tyr;

аминокислота в положении 337 на любой из Glu, His и Asn;

аминокислота в положении 339 на любой из Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser и Thr;

аминокислота в положении 376 либо на Ala, либо на Val;

аминокислота в положении 377 либо на Gly, либо на Lys;

аминокислота в положении 378 на Asp;

аминокислота в положении 379 на Asn;

аминокислота в положении 380 на любой из Ala, Asn и Ser;

аминокислота в положении 382 либо на Ala, либо на Ile;

аминокислота в положении 385 на Glu;

аминокислота в положении 392 на Thr;

аминокислота в положении 396 на Leu;

аминокислота в положении 421 на Lys;

аминокислота в положении 427 на Asn;

аминокислота в положении 428 либо на Phe, либо на Leu;

аминокислота в положении 429 на Met;

аминокислота в положении 434 на Trp;

аминокислота в положении 436 на Ile; и

аминокислота в положении 440 на любой из Gly, His, Ile, Leu и Tyr,

в соответствии с нумерацией EU в Fc-области.

Количество аминокислот, которые изменены, конкретно не ограничено. Может быть изменена аминокислота только в одном положении или могут быть изменены аминокислоты в двух или более положениях. Примеры комбинаций изменений аминокислот в двух или более положениях включают комбинации, представленные в таблице 5 (таблицы с 5-1 по 5-3).

Для условий рН для измерения активности связывания связывающего Fcγ-рецептор домена, содержащегося в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, и Fcγ-рецептора, можно пригодным образом использовать условия в диапазоне кислых значений рН или в диапазоне нейтральных значений рН. Диапазон нейтральных значений рН в качестве условий для измерения активности связывания связывающего Fcγ-рецептор домена, содержащегося в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, и Fcγ-рецептора, как правило, указывают как от рН 6,7 до рН 10,0. Предпочтительно, он представляет собой диапазон, указываемый произвольными величинами рН от рН 7,0 до рН 8,0; и предпочтительно он выбран из рН 7,0, рН 7,1, рН 7,2, рН 7,3, рН 7,4, рН 7,5, рН 7,6, рН 7,7, рН 7,8, рН 7,9 и рН 8,0; и особенно предпочтительно он представляет собой значение рН 7,4, которое является близким к рН плазмы (крови) in vivo. В рамках настоящего изобретения диапазон кислых значений рН в качестве условий наличия активности связывания связывающего Fcγ-рецептор домена, содержащегося в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, и Fcγ-рецептора, как правило, указывают как с рН 4,0 по рН 6,5. Предпочтительно, его указывают как с рН 5,5 по рН 6,5 и особенно предпочтительно его указывают как с рН 5,8 по рН 6,0, что является близким к значению рН в ранней эндосоме in vivo. Что касается температуры, используемой в качестве условий измерения, аффинность связывания между связывающим Fcγ-рецептор доменом и Fcγ-рецептором человека можно оценивать при любой температуре от 10°С до 50°С. Предпочтительно, для определения аффинности связывания между связывающим Fcγ-рецептор доменом человека и Fcγ-рецептором используют температуру от 15°С до 40°С. Более предпочтительно, для определения аффинности связывания между связывающим Fcγ-рецептор доменом и Fcγ-рецептором можно сходным образом использовать любую температуру от 20°С до 35°С, такую как любая из 20°С, 21°С, 22°С, 23°С, 24°С, 25°С, 26°С, 27°С, 28°С, 29°С, 30°С, 31°С, 32°С, 33°С, 34°С или 35°С. Температура 25°С является неограничивающим примером в одном варианте осуществления настоящего изобретения.

В рамках настоящего изобретения, "активность связывания связывающего Fcγ-рецептор домена в отношении Fcγ-рецептора является более высокой, чем активность связывания нативной Fc-области в отношении активирующего Fcγ-рецептора" означает, что активность связывания связывающего Fcγ-рецептор домена в отношении любого из рецепторов Fc(человека из FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa и/или FcγRIIIb является более высокой, чем активность связывания нативного связывающего Fcγ-рецептор домена в отношении этих Fcγ-рецепторов человека.

Например, она относится к активности связывания антигенсвязывающей молекулы, включающей связывающий Fcγ-рецептор домен, которая составляет 105% или более, предпочтительно 110% или более, 115% или более, 120% или более, 125% или более, особенно предпочтительно 130% или более, 135% или более, 140% или более, 145% или более, 150% или более, 155% или более, 160% или более, 165% или более, 170% или более, 175% или более, 180% или более, 185% или более, 190% или более, 195% или более, превышает в два раза или более, в 2,5 раза или более, в три раза или более, в 3,5 раза или более, в четыре раза или более, в 4,5 раз или более, в пять раз или более, в 7,5 раз или более, в десять раз или более, в 20 раз или более, в 30 раз или более, в 40 раз или более, в 50 раз или более, в 60 раз или более, в 70 раз или более, в 80 раз или более, в 90 раз или более или в 100 раз или более активность связывания антигенсвязывающей молекулы, включающей Fc-область нативного IgG человека, который используют в качестве контроля, исходя из упомянутого выше способа анализа. Для нативного связывающего Fcγ-рецептор домена можно использовать связывающий Fcγ-рецептор домен, являющийся исходным материалом, и также можно использовать связывающий Fcγ-рецептор домен нативного антитела, принадлежащий тому же подклассу.

В рамках настоящего изобретения, в частности, Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная с аминокислотой в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, пригодным образом используют в качестве Fc-области нативного IgG человека, подлежащей применению в качестве контроля. То, является ли цепь сахаров, связанная с аминокислотой в положении 297 (нумерация EU) содержащей фукозу цепью сахаров, можно определять с использованием способа, описанного в непатентном документе 24. Например, такой способ, как указано ниже, обеспечивает определение того, является ли цепь сахаров, связанная с нативной Fc-областью IgG человека, содержащей фукозу цепью сахаров. Посредством реакции N-гликозидазы F (Roche diagnostics) с нативным IgG человека, подлежащим исследованию, цепь сахаров диссоциирует от нативного IgG человека, подлежащего исследованию (Weitzhandler et al. (J. Pharma. Sciences (1994) 83, 12, 1670-1675)). Далее концентрированный сгущенный материал реакционного раствора, из которого были удалены белки посредством реакции с этанолом (Schenk et al. (J. Clin. Investigation (2001) 108 (11) 1687-1695)), метят флуоресцентной меткой 2-аминопиридином (Bigge et al. (Anal. Biochem. (1995) 230 (2) 229-238)). Флуоресцентно меченную модифицированную посредством 2-АВ цепь сахаров, полученную посредством удаления реагента твердофазной экстракцией с использованием целлюлозной кассеты, анализируют с помощью нормально-фазовой хроматографии. Наблюдение обнаруживаемого пика хроматограммы обеспечивает определение того, является ли цепь сахаров, связанная с нативной Fc-областью IgG человека, содержащей фукозу цепью сахаров. Неограничивающие примеры такой Fc-области нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная с аминокислотой в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, включают Fc-области, включенные в антитела, полученные посредством экспрессии в клетках СНО, таких как СНО-K1 (American Туре Culture Collection, АТСС №CRL-61) или DXB11 (American Туре Culture Collection, АТСС №CRL-11397), генов, кодирующих антитела, содержащие нативную Fc-область IgG человека. С использованием активности связывания Fc-областей, включенных в таких антитела в качестве контролей, в отношении Fcγ-рецептора, сравнивали активность Fc-областей по настоящему изобретению в отношении связывания Fcγ-рецептора. Это обеспечивает определение того, имеет ли связывающий Fcγ-рецептор домен по настоящему изобретению более высокую активность связывания Fcγ-рецептора, чем Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров. Более того, количество фукозы, связанной с цепью сахаров, включенной по сравнению с Fc-областями, можно сравнивать посредством определения количества фукозы в цепи, связанной с Fc-областью, включенной в эти антитела, и количества фукозы в цепи сахаров, связанной с Fc-областями по настоящему изобретению с использованием таких способов, как упоминались выше.

В качестве антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область нативного антитела того же подкласса, которое используют в качестве контроля, можно пригодным образом использовать антигенсвязывающие молекулы, имеющие Fc-область моноклонального IgG-антитела. Структуры таких Fc-областей представлены в SEQ ID NO: 11 (А добавлен на N-конец последовательности с номером доступа RefSeq ААС82527.1), SEQ ID NO: 12 (А добавлен на N-конец последовательности с номером доступа RefSeq ААВ59393.1), SEQ ID NO: 13 (номер доступа RefSeq САА27268.1) и SEQ ID NO: 14 (A добавлен на N-конец последовательности с номером доступа RefSeq ААВ59394.1). Более того, при использовании в качестве исследуемого вещества антигенсвязывающей молекулы, обладающей Fc-областью, полученной путем изменения антитела определенного изотипа, используемого в качестве исходной Fc-области, антигенсвязывающую молекулу, обладающую Fc-областью моноклонального IgG-антитела этого изотипа используют в качестве контроля для подтверждения эффектов на активность связывания с Fcγ-рецепторами антигенсвязывающей молекулы, имеющей измененную Fc-область. Таким образом, антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-область, для которой подтверждено, что она обладает высокой активностью связывания Fcγ-рецептора, как описано выше, отбирают соответствующим образом.

Примеры связывающих Fcγ-рецептор доменов, пригодных для применения в рамках настоящего изобретения, включают связывающие Fcγ-рецептор домены со свойством наличия более высокой активности связывания с определенными Fcγ-рецепторами, чем с другими Fcγ-рецепторами (связывающие Fcγ-рецептор домены с селективной активностью связывания Fcγ-рецептора). Когда антитело используют в качестве антигенсвязывающей молекулы (когда Fc-область используют в качестве связывающего Fcγ-рецептор домена), поскольку одна молекула антитела может связываться только с одним Fcγ-рецептором, одна антигенсвязывающая молекула, которая связалась с ингибиторным Fcγ-рецептором, не может связаться с другим активирующим FcγR, и одна антигенсвязывающая молекула, которая связалась с активирующим Fcγ-рецептором, не может связываться ни с другим активирующим Fcγ-рецептором ни с ингибиторным Fcγ-рецептором.

Как описано выше, пригодными примерами активирующего Fcγ-рецептора являются FcγRI (CD64), включая FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc и FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2). FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2) является пригодным примером ингибиторного Fcγ-рецептора.

FcγR-связывающий домен, обладающий селективной активностью связывания с Fcγ-рецептором

То, обладает ли FcγR-связывающий домен по настоящему изобретению селективной активностью связывания, может быть подтверждено посредством сравнения активности связывания с соответствующими Fcγ-рецепторами, определенной способом, описанным в представленном выше разделе об активности связывания Fcγ-рецепторов. Связывающий FcγR домен с более высокой активностью связывания с ингибиторными Fcγ-рецепторами, чем с активирующими Fcγ-рецепторами, можно использовать в качестве селективного FcγR-связывающего домена, включенного в антигенсвязывающую молекулу, предусматриваемую в рамках настоящего изобретения. В одном неограничивающем варианте FcγR-связывающий домен с более высокой активностью связывания с FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2), чем с активирующим Fcγ-рецептором, выбранным из группы, состоящей из FcγRI(CD64), включая FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIII(CD16), включая изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2) и FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa и FcγRIIc (включая аллотипы H131 и R131), можно использовать в качестве селективного FcγR-связывающего домена, включенного в антигенсвязывающую молекулу, предусматриваемую в рамках настоящего изобретения. Более того, в неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения FcγR-связывающий домен с более высокой активностью связывания с FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2, чем с FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa, включая аллотип H131, FcγRIIa, включая аллотип R131 и/или FcγRIIc, можно использовать в качестве селективного FcγR-связывающего домена, включенного в антигенсвязывающую молекулу, предусматриваемую в рамках настоящего изобретения. То, обладает ли FcγR-связывающий домен, подлежащий исследованию, селективной активностью связывания с Fcγ-рецепторами, можно определять посредством сравнения величины (соотношения), полученной делением величин KD FcγR-связывающего домена в отношении FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa, включая аллотип H131, FcγRIIa, включая аллотип R131 и/или FcγRIIc, на величины KD для FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2, где величины KD определяют способом, описанным в упомянутом выше разделе об активности связывания с Fcγ-рецепторами или, более конкретно, посредством сравнения показателей селективности FcγR, представленных в уравнении 1.

[Уравнение 1]

Показатель селективности FcγR = величина KD для активирующего FcγR/величина KD для ингибиторного FcγR

В уравнении 1, упомянутом выше, "активирующий FcγR" относится к FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa, включая аллотип H131, FcγRIIa, включая аллотип R131 и/или FcγRIIc и ингибиторный FcγR относится к FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2. Хотя активирующий FcγR и ингибиторный FcγR, используемые для измерений величины KD, могут быть выбраны из любой комбинации, в неограничивающем варианте осуществления можно использовать величину (соотношение), полученную делением величины KD для FcγRIIa, включая аллотип Н131, на величину KD для FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2.

Например, показатели селективности FcγR имеют величины 1,2 или более, 1,3 или более, 1,4 или более, 1,5 или более, 1,6 или более, 1,7 или более, 1,8 или более, 1,9 или более, 2 или более, 3 или более, 5 или более, 6 или более, 7 или более, 8 или более, 9 или более, 10 или более, 15 или более, 20 или более, 25 или более, 30 или более, 35 или более, 40 или более, 45 или более, 50 или более, 55 или более, 60 или более, 65 или более, 70 или более, 75 или более, 80 или более, 85 или более, 90 или более, 95 или более, 100 или более, 110 или более, 120 или более, 130 или более, 140 или более, 150 или более, 160 или более, 170 или более, 180 или более, 190 или более, 200 или более, 210 или более, 220 или более, 230 или более, 240 или более, 250 или более, 260 или более, 270 или более, 280 или более, 290 или более, 300 или более, 310 или более, 320 или более, 330 или более, 340 или более, 350 или более, 360 или более, 370 или более, 380 или более, 390 или более, 400 или более, 410 или более, 420 или более, 430 или более, 440 или более, 450 или более, 460 или более, 470 или более, 480 или более, 490 или более, 500 или более, 520 или более, 540 или более, 560 или более, 580 или более, 600 или более, 620 или более, 640 или более, 660 или более, 680 или более, 700 или более, 720 или более, 740 или более, 760 или более, 780 или более, 800 или более, 820 или более, 840 или более, 860 или более, 880 или более, 900 или более, 920 или более, 940 или более, 960 или более, 980 или более, 1000 или более, 1500 или более, 2000 или более, 2500 или более, 3000 или более, 3500 или более, 4000 или более, 4500 или более, 5000 или более, 5500 или более, 6000 или более, 6500 или более, 7000 или более, 7500 или более, 8000 или более, 8500 или более, 9000 или более, 9500 или более, 10000 или более или 100000 или более.

Неограничивающий вариант осуществления селективного FcγR-связывающего домена в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению включает, например, Fc-области, полученные посредством модификации FcγR-связывающего домена, включенного в Fc-область (Fc-область класса IgG относится к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющую часть константной области представленной в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека. Пример способа получения модифицированных Fc-областей включает способ, описанный в упомянутом выше разделе об аминокислотных изменениях. Примеры таких измененных Fc-областей включают Fc-область, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp, или Fc-область, в которой аминокислота в положении 328 (нумерация EU) представляет собой Glu в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Fc-область, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp, или Fc-область, в которой аминокислота в положении 328 (нумерация EU) представляет собой Glu в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую Fc-область, демонстрируют более высокую активность связывания с FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2, чем с FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa, включая аллотип H131, FcγRIIa, включая аллотип R131 и/или FcγRIIc.

Константные области, содержащие селективный FcγR-связывающий домен, которые включены в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую константную область, также могут представлять собой Fc-области и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую Fc-область, которая сохраняет или демонстрирует сниженную активность связывания с активирующим FcγR (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa, включая аллотип H131, FcγRIIa, включая аллотип R131 и/или FcγRIIc) по сравнению с Fc-областью (Fc-область класса IgG относится к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющей часть IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека (далее обозначаемой как Fc-область дикого типа) и антигенсвязывающую молекулу, содержащую такую Fc-область дикого типа.

По сравнению с Fc-областью дикого типа и антигенсвязывающей молекулой, содержащей Fc-область дикого типа, степень упомянутого выше уменьшения активности связывания с активирующим FcγR Fc-области, содержащей селективный FcγR-связывающий домен, включенный в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, и антигенсвязывающей молекулы, содержащей такую Fc-область, составляет, например, 99% или менее, 98% или менее, 97% или менее, 96% или менее, 95% или менее, 94% или менее, 93% или менее, 92% или менее, 91% или менее, 90% или менее, 8 8% или менее, 86% или менее, 84% или менее, 82% или менее, 80% или менее, 78% или менее, 76% или менее, 74% или менее, 72% или менее, 70% или менее, 68% или менее, 66% или менее, 64% или менее, 62% или менее, 60% или менее, 58% или менее, 56% или менее, 54% или менее, 52% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее, 1% или менее, 0,5% или менее, 0,4% или менее, 0,3% или менее, 0,2% или менее, 0,1% или менее, 0,05% или менее, 0,01% или менее или 0,005% или менее.

Fc-области, содержащие селективный FcγR-связывающий домен, и константные области, содержащие такую Fc-область, и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую константную область, которые включены в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, также могут представлять собой Fc-области и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую Fc-область, которые демонстрируют усиленную активностью связывания с ингибиторным FcγR (FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2) по сравнению с Fc-областью (Fc-область класса IgG относится к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющей часть константной области, присутствующей в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека (далее обозначаемой как Fc-область дикого типа), и антигенсвязывающую молекулу, содержащую такую Fc-область дикого типа.

По сравнению с Fc-областью дикого типа и антигенсвязывающей молекулой, содержащей Fc-область дикого типа, степень упомянутого выше усиления активности связывания с ингибиторным FcγR Fc-области, содержащей селективный FcγR-связывающий домен, включенный в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, и антигенсвязывающей молекулы, содержащей такую Fc-область, составляет, например, 101% или более, 102% или более, 103% или более, 104% или более, 105% или более, 106% или более, 107% или более, 108% или более, 109% или более, 110% или более, 112% или более, 114% или более, 116% или более, 118% или более, 120% или более, 122% или более, 124% или более, 126% или более, 128% или более, 130% или более, 132% или более, 134% или более, 136% или более, 138% или более, 140% или более, 142% или более, 144% или более, 146% или более, 148% или более, 150% или более, 155% или более, 160% или более, 165% или более, 170% или более, 175% или более, 180% или более, 185% или более, 190% или более, 195% или более, превышает в 2 раза или более, в 3 раза или более, в 4 раза или более, в 5 раз или более, в 6 раз или более, в 7 раз или более, в 8 раз или более, в 9 раз или более, в 10 раз или более, в 20 раз или более, в 30 раз или более, в 40 раз или более, в 50 раз или более, в 60 раз или более, в 70 раз или более, в 80 раз или более, в 90 раз или более, в 100 раз или более, в 200 раз или более, в 300 раз или более, в 400 раз или более, в 500 раз или более, в 600 раз или более, в 700 раз или более, в 800 раз или более, в 900 раз или более, в 1000 раз или более, в 10000 раз или более или в 100000 раз или более.

Более того, Fc-область, содержащая селективный FcγR-связывающий домен, включенный в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, и антигенсвязывающая молекула, содержащая такую Fc-область, могут представлять собой Fc-область и антигенсвязывающую молекулу, содержащую такую Fc-область, которая сохраняет или демонстрирует сниженную активность связывания с активирующим FcγR (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa включая аллотип H131, FcγRIIa включая аллотип R131 и/или FcγRIIc) по сравнению с Fc-областью (Fc-область класса IgG относится, например, к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющей часть константной области, присутствующей в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека (далее обозначаемой как Fc-область дикого типа), и антигенсвязывающей молекулой, содержащей такую Fc-область дикого типа; и демонстрирует усиленную активность связывания с ингибиторным FcγR (FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2) по сравнению с Fc-областью (Fc-область класса IgG относится, например, к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющей часть константной области, присутствующей в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека (далее обозначаемой как Fc-область дикого типа), и антигенсвязывающей молекулой, содержащей такую Fc-область дикого типа.

Более того, Fc-область, содержащая селективный FcγR-связывающий домен, включенный в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, и антигенсвязывающая молекула, содержащая такую Fc-область, могут представлять собой Fc-область и антигенсвязывающую молекулу, содержащую такую как Fc-область с более высокой степенью усиления активности связывания с ингибиторным Fcγ-рецептором (FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2), чем с активирующим Fcγ-рецептором (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa включая аллотип V158, FcγRIIIa включая аллотип F158, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa включая аллотип H131, FcγRIIa включая аллотип R131), по сравнению с Fc-областью (Fc-область класса IgG относится, например, к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющую часть константной области, присутствующей в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека (далее обозначаемой как Fc-область дикого типа) и антигенсвязывающей молекулой, содержащей такую Fc-область дикого типа.

В рамках настоящего изобретения по меньшей мере одно другое изменение Fc-области можно добавлять к Fc-области, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp, и Fc-области, в которой аминокислота в положении 328 (нумерация EU) представляет собой Glu, согласно вариантам осуществления и т.п., описанным в упомянутом выше разделе об аминокислотных изменениях. В дополнение к этим изменениям также можно добавлять дополнительные изменения. Дополнительные изменения можно выбирать из любых замен, делеций и модификаций аминокислот и их комбинаций. Например, можно добавлять изменения, которые усиливают активность связывания с FcγRIIb при сохранении или снижении активности связывания с FcγRIIa (Н-тип) и FcγRIIa (R-тип). Добавление таких изменений повышает селективность связывания с FcγRIIb относительно FcγRIIa.

Среди них, изменения, которые повышают селективность в отношении FcγRIIb относительно FcγRIIa (R-тип) являются благоприятными, и изменения, которые повышают селективность связывания с FcγRIIb относительно FcγRIIa (Н-тип), являются более благоприятными. Примеры предпочтительных аминокислотных замен для таких изменений включают: изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Asn в положении 325 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Gly в положении 236 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ala в положении 327 (нумерация EU) на Asn; изменение посредством замены Asn в положении 325 (нумерация EU) на Ser; изменение посредством замены Leu в положении 235 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Val в положении 266 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Leu в положении 235 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Leu в положении 235 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Gly; изменение посредством замены Ala в положении 327 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Ala в положении 327 (нумерация EU) на Gly; изменение посредством замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Thr; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Ser; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Pro в положении 331 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Pro в положении 331 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Pro в положении 331 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Ala в положении 327 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Pro в положении 271 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Arg; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Gly; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Asn; изменение посредством замены Ser в положении 324 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Val в положении 266 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Pro в положении 271 (нумерация EU) на Gly; изменение посредством замены Ile в положении 332 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Ser в положении 324 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Glu в положении 333 (нумерация EU) на Pro; изменение посредством замены Tyr в положении 300 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ser в положении 337 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Tyr в положении 300 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Thr в положении 335 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Asn; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Pro; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на His; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Val в положении 266 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Tyr в положении 300 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Thr; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Ser; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на His; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Pro; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Gln в положении 295 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Asn; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Leu в положении 234 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Leu в положении 234 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Lys; изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Arg; изменение посредством замены Glu в положении 233 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Ser; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Thr; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Tyr в положении 296 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Asn; и изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Met.

Благоприятными аминокислотными заменами среди этих изменений являются, например, изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Asn; изменение посредством замены Pro в положении 271 (нумерация EU) на Gly; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Gin; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Leu в положении 234 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Leu в положении 234 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Lys; изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Arg; изменение посредством замены Glu в положении 233 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Ser; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Thr; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Tyr в положении 296 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Asn; и изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Met.

Упомянутое выше изменение может представлять собой изменение в одном положении, или можно комбинировать изменения в двух или более положениях. Подходящие примеры таких изменений представляют собой изменения, описанные в таблицах 14-15, таблицах 17-24 и таблицах 26-28.

Fc-область, полученная путем изменения FcγR-связывающего домена, включенного в Fc-область, представленную в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека, может быть приведена в качестве примера другого неограничивающего варианта осуществления селективного FcγR-связывающего домена, включенного в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению. Способ получения модифицированных Fc-областей представляет собой, например, способ, описанный в упомянутом выше разделе об аминокислотных изменениях. Примеры таких измененных Fc-областей включают Fc-область, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp и аминокислота в положении в положении 271 (нумерация EU) представляет собой Gly в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Fc-область, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp и аминокислота в положении в положении 271 (нумерация EU) представляет собой Gly в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую Fc-область, демонстрируют более высокую активность связывания с FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2, чем с FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa включая аллотип V158, FcγRIIIa включая аллотип F158, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NAl, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa включая аллотип Н131, FcγRIIa включая аллотип R131 и/или FcγRIIc.

В рамках настоящего изобретения по меньшей мере одно другое изменение Fc-области можно добавлять к Fc-области, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp и аминокислота в положении 271 (нумерация EU) представляет собой Gly, посредством вариантов осуществления и т.п., описанных в упомянутом выше разделе об аминокислотных изменениях. В дополнение к этим изменениям также можно добавлять дополнительные изменения. Дополнительные изменения могут быть выбраны из любых из замен, делеций и модификаций аминокислот и их комбинаций. Например, можно добавлять изменения, которые сохраняют или снижают активность связывания с активирующими Fcγ-рецепторами (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa включая аллотип V158, FcγRIIIa включая аллотип F158, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NAl, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa включая аллотип H131, FcγRIIa включая аллотип R131). Можно добавлять изменения, которые усиливают активность связывания с ингибиторными Fcγ-рецепторами (FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2) при сохранении или снижении активности связывания с FcγRIIa (Н-тип) и FcγRIIa (R-тип). Более того, также можно добавлять изменения, где степень усиления активности связывания с ингибиторными Fcγ-рецепторами (FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2) является более высокой, чем степень усиления активности связывания с активирующими Fcγ-рецепторами (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa включая аллотип V158, FcγRIIIa включая аллотип F158, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa включая аллотип H131, FcγRIIa включая аллотип R131). Добавление таких изменения повышает селективность связывания с FcγRIIb относительно FcγRIIa.

Пример неограничивающего варианта осуществления измененной Fc-области, содержащей селективный FcγR-связывающий домен, включает измененную Fc-область, в которой одно или несколько из положений 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333 и 396 (нумерация EU) заменены в Fc-области, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp и аминокислота в положении 271 (нумерация EU) представляет собой Gly в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4).

Кроме того, примером неограничивающего варианта осуществления измененной Fc-области, содержащей селективный FcγR-связывающий домен, является измененная Fc-область, содержащая любой один или несколько из

Asp в положении аминокислоты 233,

Tyr в положении аминокислоты 234,

Asp в положении аминокислоты 237,

Ile в положении аминокислоты 264,

Glu в положении аминокислоты 265,

любой из Phe, Met и Leu в положении аминокислоты 266,

любой из Ala, Glu, Gly и Gln в положении аминокислоты 267,

Asp или Glu в положении аминокислоты 268,

Asp в положении аминокислоты 269,

любой из Asp, Phe, Ile, Met, Asn и Gln в положении аминокислоты 272,

Asp в положении аминокислоты 296,

Ala или Asp в положении аминокислоты 326,

Gly в положении аминокислоты 327,

Lys или Arg в положении аминокислоты 330,

Ser в положении аминокислоты 331,

Thr в положении аминокислоты 332,

любой из Thr, Lys и Arg в положении аминокислоты 333,

любой из Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg и Tyr в положении аминокислоты 396,

показанные с помощью нумерации EU, в Fc-области, в которой аминокислота в положении 238 представляет собой Asp и аминокислота в положении 271 (нумерация EU) представляет собой Gly в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4).

Примеры неограничивающего варианта осуществления Fc-области, которая дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное изменение Fc-области, и дополнительно содержит дополнительные изменения, упомянутые выше, включает Fc-области, представленные в таблицах с 6-1 по 6-7.

(Таблица 6-2 является продолжением Таблицы 6-1.)

(Таблица 6-3 является продолжением Таблицы 6-2.)

(Таблица 6-4 является продолжением Таблицы 6-3.)

(Таблица 6-5 является продолжением Таблицы 6-4.)

(Таблица 6-6 является продолжением Таблицы 6-5.)

(Таблица 6-7 является продолжением Таблицы 6-6.)

У мышей было идентифицировано четыре типа FcγR: FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII и FcγRIV. У человека также в качестве соответствующих FcγR были идентифицированы FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIa и FcγRIIIb. FcγRIIb, который считается только ингибиторным типом среди этих FcγR, является консервативным как у человека, так и у мышей. Другие FcγR, за исключением FcγRIIIb, передают сигналы активации через иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM), в то время как FcγRIIb передает ингибиторные сигналы через иммунорецепторный тирозиновый ингибиторный мотив (ITIM), присутствующий внутри клеток (Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47).

FcγRIIb1 и FcγRIIb2 описаны в качестве вариантов по сплайсингу FcγRIIb. Как у человека, так и у мышей, FcγRIIb1 имеет более длинный внутриклеточный домен, чем FcγRIIb2. Было подтверждено, что FcγRIIb1 экспрессируется в В-клетках, и было подтверждено, что FcγRIIb2 экспрессируется в макрофагах, тучных клетках, дендритных клетках, базофилах, нейтрофилах и эозинофилах (J. Clin. Immunol. (2005) 25 (1), 1-18).

До настоящего времени было описано, что у человека, дисфункция и сниженная экспрессия FcγRIIb коррелирует с возникновением аутоиммунных заболеваний. Например, было описано, что у некоторых пациентов с SLE, связывание активаторов транскрипции ослаблено вследствие полиморфизма в области промотора экспрессии FcγRIIb, что приводит к сниженной экспрессии FcγRIIb (Hum. Genet. (2005) 117, 220-227; J. Immunol. (2004) 172, 7192-7199; и J. Immunol. (2004) 172, 7186-7191). Более того, среди пациентов с SLE описано два типа аллотипов, где аминокислота в положении 233 представляет собой Ile или Thr в FcγRIIb. Это положение находится в трансмембранной области FcγRIIb и, согласно сообщением, FcγRIIb менее вероятно существует в липидном рафте, когда аминокислота в положении 233 представляет собой Thr по сравнению с тем, когда аминокислота представляет собой Ile и в результате, функция передачи сигнала FcγRIIb снижается (Nat. Med. (2005) 11, 1056-1058; Hum. Mol. Genet., (2005) 14, 2881-2892). Равным образом у мышей, сообщалось, что у мышей с нокаутом, полученных путем нарушения гена FcγRIIb у мышей C57BL/6, присутствуют SLE-подобные симптомы, такие как продукция аутоантител и гломерулонефрит (Immunity 13 (2000) 277-285; J. Exp. Med. (2002) 195, 1167-1174). Более того, до настоящего времени был описан сниженный уровень экспрессии FcγRIIb и т.п. у мышей, которых считают моделями с естественным возникновением SLE (Immunogenetics (2000) 51, 429-435; Int. Immunol. (1999) 11, 1685-1691; Curr. Biol. (2000) 10, 227-230; J. Immunol. (2002) 169, 4340-4346). Из этих сообщений считается, что FcγRIIb регулирует гуморальный иммунитет у мышей, как и у человека.

Когда антитело, содержащее Fc по настоящему изобретению, элиминирует антигены через FcγRIIb, считается, что функция эндоцитоза FcγRIIb вносит наиболее важный вклад среди функций FcγRIIb. Как описано выше, FcγRIIb1 и FcγRIIb2 существуют в качестве вариантов по сплайсингу FcγRIIb, однако описано, что последний в основном вовлечен в эндоцитоз иммунокомплекса антитела и антигена (J. Immunol. (1994), 152 574-585; Science (1992) 256, 1808-1812; Cell (1989) 58, 317-327). До настоящего времени сообщалось, что FcγRIIb2 мыши включен в покрытое клатрином углубление и подвергается эндоцитозу (Cell (1989) 58, 317-327). Более того, сообщалось, что дилейциновый мотив является необходимым для опосредуемого FcγRIIb2 эндоцитоза, и дилейциновый мотив является консервативным как у человека, так и у мышей (EMBO J. (1994) 13 (13), 2963-2969). Исходя из этого, FcγRIIb2 может обладать активностью эндоцитоза у человека, как и у мышей.

С другой стороны, в отличие от FcγRIIb2, сообщалось, что FcγRIIb1 не вызывает эндоцитоза. FcγRIIb1 обладает встроенной последовательностью в его внутриклеточном домене, который не встречается в FcγRIIb2. Считается, что эта последовательность ингибирует захват FcγRIIb1 в покрытое клатрином углубление и в результате ингибируется эндоцитоз (J. Cell. Biol. (1992) 116, 875-888; J. Cell. Biol. (1989) 109, 3291-3302). Равным образом у человека FcγRIIb1 обладает последовательностью вставки в участке, сходном с участком FcγRIIb2, как и у мышей; таким образом, предположительно, отличие в способности к эндоцитозу между FcγRIIb1 и FcγRIIb2 обеспечивается сходным механизмом. Более того, сообщалось, что как у человека, так и у мышей, приблизительно 40% иммунокомплексов на поверхности клеток захватываются в клетку в течение 20 минут (Mol. Immunol. (2011) 49, 329-337; Science (1992) 256, 1808-1812). Таким образом, равным образом у человека FcγRIIb2 предположительно захватывает иммунокомплексы в клетки на уровнях, сходных с мышами.

Поскольку FcγRIIb является единственным, который имеет ITIM внутри клетки как у человека, так и у мышей, среди семейства FcγR и распределение экспрессирующих клеток является одинаковым, предположительно, их функция в иммунном контроле является сходной. Более того, учитывая тот факт, что иммунокомплексы захватывается в клетки на сходных уровнях у человека и у мышей, эффекты антител в отношении элиминации антигена, опосредуемые FcγRIIb, у человека могут быть предсказуемыми с использованием мышей. Антигенсвязывающие молекулы mF44 и mF46 обладают свойствами связывания с растворимыми антигенами рН-зависимым образом и обладает усиленной аффинностью в отношении FcγRIIb и FcγRIII мыши по сравнению с mIgG1, который является антигенсвязывающей молекулой, обладающей свойством связывания растворимого антигена рН-зависимым образом. Действительно, в примере 5 показано, что выведение антигена возрастало, когда mF44 или mF46 вводили нормальным мышам по сравнению с тем, когда вводили mIgG1.

Более того, в описанном ниже примере 6 сходный эксперимент проводили с использованием мышей с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора. Сообщалось, что FcγR, отличные от FcγRIIb, экспрессируются только в совместном присутствии гамма-цепи у мышей. Таким образом, только FcγRIIb экспрессируется у мышей с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора. Введение mF44 или mF46, которые являются антигенсвязывающими молекулами, обладающими свойством связывания с растворимыми антигенами рН-зависимым образом, мышам с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора позволяет оценку эффектов ускорения элиминации антигена, когда связывание FcγRIIb селективно усиливалось. Из результатов примера 6, когда mF44 или mF46 (которые являются антигенсвязывающими молекулами, обладающими свойством связывания растворимых антигенов рН-зависимым образом) вводили мышам с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора, было показано, что выведение антигена было увеличено по сравнению с тем, когда мышам вводили mIgG1 (который является антигенсвязывающей молекулой, обладающей свойством связывания с растворимыми антигенами рН-зависимым образом). Более того, результаты примера 6 демонстрируют, что при введении мышам с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора mF44 или mF46 вызывают сходную степень элиминации антигена по сравнению с нормальными мышами.

В примере 6 проводили сходный эксперимент с использованием мышей с дефицитом FcγRIII. Поскольку mIgG1, mF44 и mF46 связываются только с FcγRIIb и FcγRIII среди mFcγR, введение антител мышам с дефицитом FcγRIII позволяет оценку эффектов ускорения элиминации антигена, когда связывание FcγRIIb селективно усилено. Результаты примера 6 указывают на то, что, когда mF44 или mF46 вводили мышам с FcγRIII, выведение антигена увеличивалось по сравнению с тем выведением антигена у мышей, когда им вводили mIgG1. Более того, результаты примера 6 показали, что при введении мышам с дефицитом FcγRIII, mF44 и mF46 обеспечивают сходные степени элиминации антигена по сравнению с тем, когда их вводили мышам с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора и при введении нормальным мышам.

Эти результаты показали, что элиминация антигена может быть ускорена посредством усиления селективного связывания с FcγRIIb отдельно без усиления связывания с активными FcγR.

В дополнение к сообщенным документам, рассмотренным до настоящего времени, на основе упомянутых выше результатов оценки с использованием мышей, считается, что захват иммунокомплексов в клетки через FcγRIIb происходит in vivo у человека, как и у мышей, и в результате антитела, которые обладают Fc с селективно усиленным связыванием с FcγRIIb человека, могут ускорять элиминацию его антигенов. Более того, как рассмотрено выше, поскольку считается, что захват иммунокомплексов в клетки через FcγRIIb происходит при сходных скоростях у мышей и человека, эффекты ускорения элиминации антигена по сравнению с эффектами антител, имеющих Fc с усиленной аффинностью в отношении FcγRIIb мыши, могут быть достигнуты in vivo у человека с использованием Fc, в которой аффинность в отношении FcγRIIb человека усилена до сходной степени.

Как описано в WO 2009/125825, Fv4-IgG1 представляет собой антитело, которое является результатом сообщения гуманизированному антителу против рецептора IL-6 H54/L28-IgG1 активности связывания с антигеном рН-зависимым образом, т.е. изменения вариабельной области так, чтобы сообщить ей свойство связывания с антигеном при рН 7,4 и диссоциации от антигена при рН 5,8. В WO 2009/125825 показано, что элиминация растворимого рецептора IL-6 человека значительно ускорена у мышей, которым совместно вводили IgG1 Fv4 и растворимый рецептор IL-6 человека в качестве антигена по сравнению с мышами, которым вводили совместно H54/L28-IgG1 и антиген. В этом случае, тяжелая цепь H54-IgG1 и легкая цепь L28-CK, включенные в H54/L28-IgG1, представлены в SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37, соответственно; и тяжелая цепь VH3-IgG1 и легкая цепь VL3-CK, включенные в Fv4-IgG1, представлены в SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, соответственно.

Растворимый рецептор IL-6 человека, связанный с антителом H54/L28-IgG1, которое связывается с растворимым рецептором IL-6 человека, рециклирует в плазму вместе с антителом через FcRn. Между тем, антитело Fv4-IgG1, которое связывается с растворимым рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом диссоциирует от растворимого рецептора IL-6 человека, который связался с антителом в кислых условиях в эндосоме. Поскольку диссоциированный растворимый рецептор IL-6 человека деградируется в лизосоме, элиминация растворимого рецептора IL-6 человека может быть значительно ускорена и антитело Fv4-IgG1, которое связывается с растворимым рецептором IL-6 человека рН зависимым образом, рециклирует в плазму после связывания с FcRn в эндосоме. Поскольку рециклированное антитело может вновь связываться с растворимым рецептором IL-6 человека, связывание с антигеном (растворимый рецептор IL-6 человека) и рециклирование в плазму через FcRn повторяется. В результате одна молекула антитела может многократно связываться с растворимым рецептором IL-6 человека множество раз (WO 2009/125825).

С другой стороны, как описано в рамках настоящего изобретения, было обнаружено, что концентрация в плазме растворимого антигена может быть значительно снижена посредством введения антигенсвязывающей молекулы с усиленной активностью связывания FcγR связывающего Fcγ-рецептор домена, включенного в антигенсвязывающую молекулу, которая содержит антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, такой как рН, FcRn-связывающий домен, обладающий активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, и связывающий Fcγ-рецептор домен.

Не ограничиваясь конкретной теорией, неожиданное снижение концентрации растворимого антигена в плазме, наблюдаемое при введении антигенсвязывающей молекулы с усиленным связыванием с FcγR, которая содержит антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, таких как рН, и FcRn-связывающий домен, обладающий активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН может быть объяснено следующим образом.

Как описано выше, антигенсвязывающая молекула, такая как Fv4-IgG1, содержащая антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, может быть способна неоднократно связываться с антигеном множество раз, однако эффект диссоциации растворимого антигена в эндосоме в отношении ускорения элиминации антигена из плазмы может зависеть от скорости захвата комплекса антигена и антигенсвязывающей молекулы в эндосому. Антигенсвязывающие молекулы с усиленной активностью связывания с различными FcγR, которые содержат антигенсвязывающий домен, в котором антигенсвязывающая активность изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, активно захватываются в клетки посредством связывания с различными FcγR, экспрессируемыми на клеточной мембране, и могут вновь циркулировать в плазме посредством рециклирования через связывание между FcRn и FcRn-связывающим доменом в молекуле, обладающей активностью связывания с FcRn, в условиях диапазона кислых значений рН. Более конкретно, поскольку упомянутые выше антигенсвязывающие молекулы, которые образовали комплексы с растворимыми антигенами в плазме, активно захватываются в клетки через FcγR, экспрессируемые на клеточной мембране, эффект ускорения элиминации растворимых антигенов в плазме может быть более выраженным, чем у антигенсвязывающих молекул, активность связывания которых с различными FcγR не усилена.

FcγR-связывающая активность антител, которые связываются с мембранными антигенами, играет важную роль в цитотоксической активности антител. Таким образом, когда цитотоксическая активность необходима для антитела, подлежащего применению в качестве фармацевтического средства, используют IgG1-изотип человека, который обладает высокой активностью связывания FcγR, и широко используют способ усиления активности связывания FcγR антител для усиления цитотоксической активности антитела. С другой стороны, роль FcγR-связывающей активности антител, которые связываются с растворимыми антигенами и которые используют в качестве фармацевтических средств, не известна и отличия в физиологических эффектах на организмы, которым вводили IgG1 человека с высокой активностью связывания FcγR и IgG2 человека и IgG4 человека с низкой активностью связывания FcγR, вследствие их отличий в активности связывания FcγR, до настоящего времени полностью не исследовались. Как описано ниже в разделе "Примеры", было в действительности подтверждено, что в плазме индивидуумов, которым вводили антитела, активность связывания которых с FcγR была утрачена, не было влияния на изменения концентрации растворимого антигена. С другой стороны, в рамках настоящего изобретения было обнаружено, что концентрация растворимых антигенов в плазме значительно снижена у индивидуумов, которым вводили антигенсвязывающие молекулы, обладающие усиленной активностью связывания FcγR и содержащие антигенсвязывающий домен, активность связывания которого с растворимыми антигенами изменяется в зависимости от условий концентрации ионов. Более конкретно, посредством комбинирования FcRn-связывающего домена, обладающего активностью связывания FcRn в условия диапазона кислых значений рН и антигенсвязывающим доменом, связывание которого с растворимыми антигенами изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, которые представляют собой домены, включенные в антигенсвязывающие молекулы, нацеленные на растворимые антигены, впервые было выявлено преимущество усиления связывания с FcγR.

Антигенсвязывающая молекула

В рамках настоящего изобретения, термин "антигенсвязывающая молекула" используют в наиболее широком значении для обозначения молекулы, обладающей активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и содержащей антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен. В частности, антигенсвязывающие молекулы включают различные типы молекул, при условии, что они проявляют антигенсвязывающую активность. Молекулы, в которых антигенсвязывающий домен связан с Fc-областью, включают, например, антитела. Антитела могут включать единичные моноклональные антитела (включая антитела-агонисты и антитела-антагонисты), антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела и т.п. Альтернативно при использовании в качестве фрагментов антител, они предпочтительно включают антигенсвязывающие домены и антигенсвязывающие фрагменты (например, Fab, F(ab')2, scFv и Fv). Каркасные молекулы, где трехмерные структуры, такие как уже известная стабильная белковая структура α/β-бочонок, используются в качестве каркаса (основы) и только некоторые части структур преобразованы в библиотеки для конструирования антигенсвязывающих доменов, также включены в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению.

Антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере некоторые части Fc-области, которые опосредуют связывание с FcRn и Fcγ-рецептором. В неограничивающем варианте осуществления антигенсвязывающая молекула включает, например, антитела и слитые белки Fc. Слитый белок относится к химерному полипептиду, содержащему полипептид, имеющий первую аминокислотную последовательность, который связан с полипептидом, имеющим вторую аминокислотную последовательность, которые не связаны в природе. Например, слитый белок может содержать аминокислотную последовательность по меньшей мере части Fc-области (например, часть Fc-области, ответственная за связывание с FcRn, или часть Fc-области, ответственная за связывание с Fcγ-рецептором) и не являющегося иммуноглобулином полипептида, содержащего, например, аминокислотную последовательность лиганд-связывающего домена рецептора или рецептор-связывающего домена лиганда. Аминокислотные последовательности могут находиться в отдельных белках, которые переносят вместе в слитый белок, или, как правило, они могут находиться в одном белке, но они включены в слитый полипептид в новом порядке. Слитые белки можно получать, например, посредством химического синтеза или способами генетической рекомбинации для экспрессии полинуклеотида, кодирующего области пептидов в желаемом порядке.

Соответствующие домены по настоящему изобретению могут быть связаны вместе через линкеры или прямо через связывание полипептида.

Линкеры включают произвольные пептидные линкеры, которые можно вносить способами генетической инженерии, синтетические линкеры и линкеры, описанные, например, в Protein Engineering (1996) 9(3), 299-305. Однако пептидные линкеры являются предпочтительными в рамках настоящего изобретения. Длина пептидных линкеров конкретно не ограничена, и ее могут надлежащим образом выбирать специалисты в данной области в зависимости от назначения. Длина предпочтительно составляет пять аминокислот или более (без конкретных ограничений, верхний предел обычно составляет 30 аминокислоты или менее, предпочтительно 20 аминокислоты или менее), и особенно предпочтительно 15 аминокислот.

Например, такие пептидные линкеры предпочтительно включают:

Ser

Gly⋅Ser

Gly⋅Gly⋅Ser

Ser⋅Gly⋅Gly

Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 26)

Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 27)

Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 28)

Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 29)

Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 30)

Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 31)

Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 32)

Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 33)

(Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 28))n

(Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 29))n

где n представляет собой целое число, равное 1 или более. Длину или последовательности пептидных линкеров могут соответствующим образом выбирать специалисты в данной области, в зависимости от назначения.

Обычно для сшивания пептидов используют синтетические линкеры (химические сшивающие агенты), и например:

N-гидроксисукцинимид (NHS),

дисукцинимидилсуберат (DSS),

бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS3),

дитиобис(сукцинимидил пропионат) (DSP),

дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP),

этиленгликоль бис(сукцинимидилсукцинат) (EGS),

этиленгликоль бис(сульфосукцинимидилсукцинат) (сульфо-EGS),

дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST),

бис[2-(сукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (BSOCOES),

и бис[2-(сульфосукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (сульфо-BSOCOES). Эти сшивающие агенты являются коммерчески доступными.

Когда используют множество линкеров для связывания соответствующих доменов, все они могут быть одного типа или они могут быть различных типов.

В дополнение к линкерам, проиллюстрированным выше, также можно соответствующим образом использовать линкеры с пептидными метками, такими как His-метка, НА-метка, myc-метка и FLAG-метка. Более того, также можно соответствующим образом использовать образование водородных связей, образование дисульфидных связей, образование ковалентных связей, ионное взаимодействие и свойства связывания друг с другом в результате их комбинации. Например, можно использовать аффинность между СН1 и CL антитела, и также можно использовать Fc-области, происходящие из описанных выше биспецифических антител для гетероассоциации Fc-областей. Более того, также можно соответствующим образом использовать дисульфидные связи, образующиеся между доменами.

Для связывания соответствующих доменов пептидной связью, полинуклеотиды, кодирующие домены, связывают вместе в рамке считывания. Известные способы связывания полинуклеотидов в рамке считывания включают способы, такие как лигирование фрагментов рестрикции, ПЦР со слиянием и перекрывающаяся ПЦР. Такие способы можно соответствующим образом использовать отдельно или в комбинации для конструирования антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. В рамках настоящего изобретения термины "связанный" и "слитый", или "связывание" и "слияние" используют взаимозаменяемо. Эти термины означают, что два или более элементов или компонентов, таких как полипептиды, слиты вместе с образованием единой структуры любыми способами, включая описанные выше способы химического связывания и способы генетической рекомбинации. Слияние в рамке считывания означает, когда два или более элементов или компонентов представляют собой полипептиды, связывание двух или более элементов рамок считывания с образованием непрерывной более длинной рамки считывания при сохранении правильных рамок считывания полипептидов. Когда две молекулы Fab используют в качестве антигенсвязывающего домена, в качестве предпочтительной антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению можно использовать антитело, которое представляет собой антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, где антигенсвязывающий домен связан в рамке считывания с Fc-областью через пептидную связь без линкера.

FcRn

В отличие от Fcγ-рецептора, принадлежащего семейству иммуноглобулинов, FcRn, в частности, FcRn человека, структурно сходен с полипептидами главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I, проявляя 22%-29% идентичность последовательности с молекулами МНС класса I (Ghetie el al., Immunol. Today (1997) 18 (12): 592-598). FcRn экспрессируется в качестве гетеродимера, состоящего из растворимой β- или легкой цепи (β2-микроглобулин) в комплексе с трансмембранной α- или тяжелой цепью. Подобно МНС, α-цепь FcRn содержит три внеклеточных домена (α1, α2 и α3) и ее короткий цитоплазматический домен заякоривает белок на клеточной поверхности, α1- и α2-домены взаимодействуют с FcRn-связывающим доменом Fc-области антитела (Raghavan et al., Immunity (1994) 1: 303-315).

FcRn экспрессируется в материнской плаценте и желточном мешке млекопитающих, и он вовлечен в перенос IgG от матери к плоду. Кроме того, в тонком кишечнике новорожденных грызунов, где FcRn экспрессируется, FcRn вовлечен в перенос материнских IgG через эпителий щеточной каемки из проглоченного молозива или молока. FcRn экспрессируется во множестве других тканей и системах эндотелиальных клеток различных видов. FcRn также экспрессируется у взрослого человека в эндотелии, кровеносных сосудах мышц и синусоидных капиллярах печени. Полагают, что FcRn участвует в поддержании концентрации IgG в плазме путем опосредования рециклирования IgG в сыворотку при связывании с IgG. Как правило, связывание FcRn с молекулами IgG строго зависит от рН. Оптимальное связывание наблюдают при кислом диапазоне рН ниже 7,0.

FcRn человека, предшественником которого является полипептид, имеющий сигнальную последовательность SEQ ID NO: 34 (полипептид с сигнальной последовательностью представлен в SEQ ID NO: 35), образует комплекс с β2-микроглобулином человека in vivo. Как показано в справочных примерах, описанных ниже, растворимый FcRn человека в комплексе с β2-микроглобулином получают с использованием общепринятых способов рекомбинантной экспрессии. FcRn-связывающий домен по настоящему изобретению можно оценивать в отношении его активности связывания с таким растворимым FcRn человека в комплексе с β2-микро глобулином. В рамках настоящего изобретения, если нет иных указаний, FcRn человека относится к форме, способной связываться с FcRn-связывающим доменом по настоящему изобретению. Примеры включают комплекс между FcRn человека и β2-микроглобулином человека.

Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению обладают FcRn-связывающим доменом. FcRn-связывающий домен конкретно не ограничен при условии, что антигенсвязывающие молекулы обладают активностью связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН, и он может представлять собой домен, который обладает прямой или непрямой активностью связывания с FcRn. Предпочтительные примеры такого домена включают Fc-область IgG-иммуноглобулина, альбумин, домен 3 альбумина, антитело против FcRn, пептид против FcRn, каркасную молекулу против FcRn и т.п., которые обладают активностью прямого связывания с FcRn, или молекулы, которые связываются с IgG или альбумином, которые обладают активностью непрямого связывания с FcRn. В рамках настоящего изобретения предпочтительным является домен, обладающий активностью связывания с FcRn в диапазоне кислых значений рН и в диапазоне нейтральных значений рН. Когда домен уже обладает активностью связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН, его предпочтительно можно использовать как есть. Когда домен не обладает или обладает слабой активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, аминокислоты в антигенсвязывающей молекуле можно модифицировать для сообщения активности связывания FcRn. Альтернативно аминокислоты можно изменять в домене, уже обладающем активностью связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН для увеличения активности связывания FcRn. Для изменения аминокислот в FcRn-связывающем домене, представляющее интерес изменение можно идентифицировать посредством сравнения активности связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН до и после изменения аминокислот.

Предпочтительным FcRn-связывающим доменом человека является область, которая прямо связывается с FcRn. Такие предпочтительные FcRn-связывающие домены включают, например, Fc-области антител. Между тем, области, способные связываться с полипептидом, таким как альбумин или IgG, который обладает активностью связывания FcRn, могут непрямо связываться с FcRn через альбумин, IgG и т.п. Таким образом, для FcRn-связывающей области по настоящему изобретению, предпочтительно можно использовать область, которая связывается с полипептидом, обладающим активностью связывания FcRn. Fc-область содержит аминокислотную последовательность, происходящую из константной области тяжелой цепи антитела. Fc-область является частью константной области тяжелой цепи антитела, начинающейся с N-конца шарнирной области в участке расщепления папаином, который расположен приблизительно в положении аминокислоты 216 в соответствии с нумерацией EU, и включающей шарнирную область, СН2- и СН3-домены.

Активность связывания FcRn-связывающего домена с FcRn, в частности FcRn человека, или антигенсвязывающей молекулы, содержащей домен

Активность связывания FcRn-связывающего домена по настоящему изобретению с FcRn, в частности FcRn человека, можно измерять способами, известными специалистам в данной области, как описано в разделе "Активность связывания" выше. Специалисты в данной области могут соответствующим образом определить условия, отличные от рН. Антигенсвязывающую активность и активность связывания с FcRn человека антигенсвязывающей молекулы можно оценивать, основываясь на константе диссоциации (KD), кажущейся константе диссоциации (KD), константе скорости диссоциации (kd), кажущейся константе скорости диссоциации (kd) и т.п. Их можно измерять способами, известными специалистам в данной области. Например, можно использовать Biacore (GE healthcare), график Скэтчарда или проточный цитометр.

Когда измеряют активность связывания FcRn человека Fc-области по настоящему изобретению, условия, отличные от рН, конкретно не ограничены, и их могут соответствующим образом выбирать специалисты в данной области. Измерения можно проводить, например, при 37°C с использованием буфера MES, как описано в WO 2009/125825. Альтернативно активность связывания FcRn человека Fc-области по настоящему изобретению можно измерять способами, известными специалистам в данной области, и ее можно измерять с использованием, например, Biacore (GE Healthcare) и т.п. Активность FcRn-связывающего домена в отношении связывания с FcRn человека можно оценивать путем нанесения в качестве анализируемого соединения FcRn человека, FcRn-связывающего домена или антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, содержащей FcRn-связывающий домен, на чип, на который иммобилизован FcRn-связывающий домен, антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, содержащая FcRn-связывающий домен, или FcRn человека.

Диапазон кислых значений рН, указываемый в качестве условий для наличия активности связывания между FcRn и FcRn-связывающим доменом в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, как правило, относится к рН 4,0-рН 6,5. Предпочтительно он относится к рН 5,5-рН 6,5 и особенно предпочтительно он относится к рН 5,8-рН 6,0, что является близким к рН в ранней эндосоме in vivo. Диапазон нейтральных значений рН, указываемый в качестве условий для наличия активности связывания между FcRn и антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению или FcRn-связывающим доменом, включенным в такую молекулу, как правило, относится к от рН 6,7 до рН 10,0. Предпочтительно, диапазон нейтральных значений рН представляет собой диапазон, указанный с помощью произвольных величин рН от рН 7,0 до рН 8,0, и предпочтительно он выбран из рН 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 и 8,0, и особенно предпочтительно рН 7,4, что близко к значению рН плазмы (крови) in vivo. Когда оценка аффинности связывания между FcRn человека и FcRn-связывающим доменом человека или антигенсвязывающей молекулой, содержащей этот домен при рН 7,4, затруднена вследствие низкой аффинности связывания, вместо рН 7,4 можно использовать рН 7,0. В качестве температуры, подлежащей применению в условиях анализа, аффинность связывания между FcRn-связывающим доменом и FcRn можно оценивать при любой температуре от 10°С до 50°С. Предпочтительно, температуру от 15°С до 40°С используют для определения аффинности связывания между FcRn-связывающим доменом и FcRn человека. Более предпочтительно, также для определения аффинности связывания между FcRn-связывающим доменом и FcRn в равной степени можно использовать любую температуру от 20°С до 35°С, такую как любая из 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35°С. Неограничивающим примером варианта осуществления настоящего изобретения является температура 25°С.

Согласно Yeung et al. (J. Immunol. (2009) 182, 7663-7671), активность связывания природного IgG1 человека с FcRn человека в диапазоне кислых значений рН (рН 6,0) составляет KD 1,7 мкМ, в то время как эта активность практически не поддается выявлению в диапазоне нейтральных значений рН. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления можно использовать антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, обладающую активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН, которая включает антигенсвязывающие молекулы, активность связывания с FcRn человека которых в условиях диапазона кислых значений рН составляет KD 20 мкМ или сильнее и активность связывания с FcRn человека которых в условиях диапазона нейтральных значений рН эквивалентна активности связывания FcRn человека у IgG человека. В более предпочтительном варианте осуществления можно использовать антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, включающую антигенсвязывающие молекулы, активность связывания с FcRn человека которых в условиях диапазона кислых значений рН составляет KD 2,0 мкМ или сильнее. В еще более предпочтительном варианте осуществления можно использовать антигенсвязывающие молекулы, активность связывания FcRn человека которых в диапазоне диапазона кислых значений рН равна KD 0,5 мкМ или сильнее. Упомянутые выше величины KD определяют способом, описанным в The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671 (посредством иммобилизации антигенсвязывающей молекулы на чип и загрузки FcRn человека в качестве анализируемого образца).

В рамках настоящего изобретения предпочтительной является Fc-область, которая обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН. Если домен представляет собой Fc-область, уже обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, ее можно использовать как есть. Если домен не обладает или обладает слабой активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, аминокислоты в антигенсвязывающей молекуле можно изменять для получения Fc-области, обладающей желаемой активностью связывания FcRn. Fc-область, обладающую желаемой активностью связывания FcRn или усиленной активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, также можно предпочтительно получать посредством изменения аминокислот в Fc-области. Изменение аминокислот в Fc-области, которое сообщает такую желаемую активность связывания, можно идентифицировать посредством сравнения активности связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН до и после изменения аминокислот. Специалисты в данной области могут внести соответствующие аминокислотные изменения с использованием хорошо известного способа, сходного с упомянутым выше способом, используемым для изменения активности связывания Fcγ-рецептора.

Fc-область, обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, которая включена в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, можно получать любым способом; но, в частности, FcRn-связывающий домен, обладающий активностью связывания FcRn или обладающий усиленной активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, можно получать посредством изменения аминокислот IgG-иммуноглобулина человека, используемого в качестве исходной Fc-области. Предпочтительные Fc-области IgG-иммуноглобулинов для изменения включают Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и их варианты). Для изменения на другие аминокислоты, можно изменять аминокислоты в любом положении при условии, что Fc-область обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН или что активность связывания с FcRn человека в условиях кислого диапазона может увеличиваться. Когда антигенсвязывающая молекула включает Fc-область IgG1 человека в качестве Fc-области, она предпочтительно включает изменение, которое обладает эффектом усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека. Предпочтительные примеры таких аминокислот, которые можно изменять, включают аминокислоты в положениях 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и/или 447 (нумерация EU), как описано в WO 2000/042072. Аналогично, предпочтительные примеры аминокислот, которые можно изменять, также включают аминокислоты в положениях 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 и/или 436 (нумерация EU), как описано в WO 2002/060919. Более того, такие аминокислоты, которые можно изменять, также включают аминокислоты в положениях 250, 314 и 428 (нумерация EU), как описано в WO 2004/092219. Такие аминокислоты, которые можно изменять, дополнительно включают аминокислоты в положениях 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 и/или 436 (нумерация EU), как описано в WO 2010/045193. Эти аминокислотные изменения усиливают связывание FcRn в условиях диапазона кислых значений рН Fc-области IgG-иммуноглобулина.

В рамках настоящего изобретения предпочтительной является Fc-область, которая обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН. Если домен представляет собой Fc-область, уже обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, его можно использовать как есть. Если домен не обладает или обладает слабой активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, аминокислоты в антигенсвязывающей молекуле можно изменять с получением Fc-области, обладающей желаемой активностью связывания FcRn. Fc-область, обладающую желаемой активностью связывания FcRn или усиленной активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, предпочтительно можно получать посредством изменения аминокислот в Fc-области. Изменения аминокислот Fc-области, которые сообщают такую желаемую активность связывания, можно идентифицировать посредством сравнения активности связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН до и после изменения аминокислот. Специалисты в данной области могут вносить соответствующие аминокислотные изменения с использованием хорошо известного способа, сходного с упомянутым выше способом, используемым для изменения активности связывания Fcγ-рецептора.

Fc-область, обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, которая включена в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, можно получать любым способом; но, в частности, FcRn-связывающий домен, обладающий активностью связывания или обладающий усиленной активностью связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, можно получать посредством изменения аминокислот IgG-иммуноглобулина человека, используемого в качестве исходной Fc-области. Предпочтительные примеры Fc-областей IgG-иммуноглобулинов для изменения включают Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и их варианты). Для изменений на другие аминокислоты, можно изменять аминокислоты в любом положении при условии, что Fc-область обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, или активность связывания с FcRn человека в условиях кислого диапазона кислых значений может повышаться. Когда антигенсвязывающая молекула содержит Fc-область IgG1 человека в качестве Fc-области, она предпочтительно включает изменение, которое обеспечивает усиление связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека. Примеры таких аминокислот, которые можно изменять, включают аминокислоты в положениях 252, 254, 256, 309, 311, 315, 433 и/или 434, а также аминокислоты, которые можно комбинировать с ними, которые представляют собой аминокислоты в положениях 253, 310, 435 и/или 426 (нумерация EU), как описано в WO 1997/034631. Предпочтительные аминокислоты представляют собой аминокислоты в положениях 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и/или 447 (нумерация EU), как описано в WO 2000/042072. Аналогично, предпочтительные примеры таких аминокислот, которые можно изменять, также включают аминокислоты в положениях 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 и/или 436 (нумерация EU), как описано в WO 2002/060919. Более того, такие аминокислоты, которые можно изменять, включают аминокислоты в положениях 250, 314 и 428 (нумерация EU), как описано в WO 2004/092219. Кроме того, предпочтительные примеры таких аминокислот, которые можно изменять, включают аминокислоты в положениях 238, 244, 245, 249, 252, 256, 257, 258, 260, 262, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 307, 311, 312, 316, 317, 318, 332, 339, 341, 343, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 423, 427, 430, 431, 434, 436, 438, 440 и/или 442, как описано в WO 2006/020114. Другие предпочтительные примеры таких аминокислот, которые можно изменять, также включают аминокислоты в положениях 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 и/или 436 (нумерация EU), как описано в WO 2010/045193. Эти аминокислотные изменения усиливают связывание FcRn в условиях диапазона кислых значений рН Fc-области IgG-иммуноглобулина.

В неограничивающем варианте осуществления изменений, которые вызывают эффект усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, когда Fc-область IgG1 человека включена в качестве Fc-области, примеры включают по меньшей мере одно или несколько аминокислотных изменений, выбранных из группы, состоящей из:

либо Arg, либо Leu в положении аминокислоты 251;

любой из Phe, Ser, Thr и Tyr в положении аминокислоты 252;

либо Ser, либо Thr в положении аминокислоты 254;

любой из Arg, Gly, Ile и Leu в положении аминокислоты 255;

любой из Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu и Thr в положении аминокислоты 256;

либо Ile, либо Thr в положении аминокислоты 308;

Pro в положении аминокислоты 309;

любой из Glu, Leu и Ser в положении аминокислоты 311;

либо Ala, либо Asp в положении аминокислоты 312;

либо Ala, либо Leu в положении аминокислоты 314;

любой из Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser и Thr в положении аминокислоты 385;

любой из Arg, Asp, ILe, Lys, Met, Pro, Ser и Thr в положении аминокислоты 386;

любой из Ala, Arg, His, Pro, Ser и Thr в положении аминокислоты 387;

любой из Asn, Pro и Ser в положении аминокислоты 389;

любой из Leu, Met, Phe, Ser и Thr в положении аминокислоты 428;

любой из Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro и Ser в положении аминокислоты 433;

любой из His, Phe и Tyr в положении аминокислоты 434; и

любой из Arg, Asn, His, Lys, Met и Thr в положении аминокислоты 436

в соответствии с нумерацией EU. Количество аминокислот, подлежащих изменению, конкретно не ограничено и аминокислоту можно изменять только в одном положении или в двух или более положениях.

Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Ile в положении аминокислоты 308, Pro в положении аминокислоты 309 и/или Glu в положении аминокислоты 311 в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут представлять собой Thr в положении аминокислоты 308, Pro в положении аминокислоты 309, Leu в положении аминокислоты 311, Ala в положении аминокислоты 312 и/или Ala в положении аминокислоты 314. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут представлять собой Ile или Thr в положении аминокислоты 308; Pro в положении аминокислоты 309; Glu, Leu или Ser в положении аминокислоты 311; Ala в положении аминокислоты 312; и/или Ala или Leu в положении аминокислоты 314. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут представлять собой Thr в положении аминокислоты 308, Pro в положении аминокислоты 309, Ser в положении аминокислоты 311, Asp в положении аминокислоты 312 и/или Leu в положении аминокислоты 314.

Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Leu в положении аминокислоты 251, Tyr в положении аминокислоты 252, Ser или Thr в положении аминокислоты 254, Arg в положении аминокислоты 255 и/или Glu в положении аминокислоты 256 в соответствии с нумерацией EU.

Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее любой из Leu, Met, Phe, Ser и Thr в положении аминокислоты 428; любой из Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro и Ser в положении аминокислоты 433; любой из His, Phe и Tyr в положении аминокислоты 434; и/или любой из Arg, Asn, His, Lys, Met и Thr в положении аминокислоты 436, указанные в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменения(ий), изменение(я) может включать His или Met в положении аминокислоты 428 и/или His или Met в положении аминокислоты 434.

Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Arg в положении аминокислоты 385, Thr в положении аминокислоты 386, Arg в положении аминокислоты 387 и/или Pro в положении аминокислоты 389 в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменение(я) может представлять собой Asp в положении аминокислоты 385, Pro в положении аминокислоты 386 и/или Ser в положении аминокислоты 389.

Более того, когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, включают изменения по меньшей мере одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:

либо Gln, либо Glu в положении аминокислоты 250; и

либо Leu, либо Phe в положении аминокислоты 428

в соответствии с нумерацией EU. Количество аминокислот, подлежащее изменению, конкретно не ограничено, и аминокислота может быть изменена только в одном положении или в двух или более положениях.

Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Gln в положении аминокислоты 250 и/или либо Leu, либо Phe в положении аминокислоты 428 в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут представлять собой изменения, включающие Glu в положении аминокислоты 250 и/или либо Leu, либо Phe в положении аминокислоты 428.

Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, примеры включают изменения по меньшей мере двух или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:

либо Asp, либо Glu в положении аминокислоты 251;

Tyr в положении аминокислоты 252;

Gln в положении аминокислоты 307;

Pro в положении аминокислоты 308;

Val в положении аминокислоты 378;

Ala в положении аминокислоты 380;

Leu в положении аминокислоты 428;

либо Ala, либо Lys в положении аминокислоты 430;

любой из Ala, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 434; и

Ile в положении аминокислоты 436

в соответствии с нумерацией EU. Количество аминокислот, подлежащих изменению, конкретно не ограничено и аминокислоту можно изменять только в двух положениях или в трех или более положениях.

Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Gln в положении аминокислоты 307 и либо Ala, либо Ser в положении аминокислоты 434 в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Pro в положении аминокислоты 308 и Ala в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Tyr в положении аминокислоты 252 и Ala в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Val в положении аминокислоты 378 и Ala в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Leu в положении аминокислоты 428 и Ala в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Ala в положении аминокислоты 434 и Ile в положении аминокислоты 436. Более того, в другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Pro в положении аминокислоты 308 и Tyr в положении аминокислоты 434. Более того, в другом отличающемся неограничивающем варианте осуществления изменений, изменения могут включать Gln в положении аминокислоты 307 и Ile в положении аминокислоты 436.

Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Gln в положении аминокислоты 307, Ala в положении аминокислоты 380 и Ser в положении аминокислоты 434 as в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Gln в положении аминокислоты 307, Ala в положении аминокислоты 380 и Ala в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Tyr в положении аминокислоты 252, Pro в положении аминокислоты 308 и Tyr в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Asp в положении аминокислоты 251, Gln в положении аминокислоты 307 и His в положении аминокислоты 434.

Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, примеры неограничивающего варианта осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, включают изменения по меньшей мере два или более аминокислоты выбранный из группы, состоящей из:

Leu в положении аминокислоты 238;

Leu в положении аминокислоты 244;

Arg в положении аминокислоты 245;

Pro в положении аминокислоты 249;

Tyr в положении аминокислоты 252;

Pro в положении аминокислоты 256;

любой из Ala, Ile, Met, Asn, Ser и Val в положении аминокислоты 257;

Asp в положении аминокислоты 258;

Ser в положении аминокислоты 260;

Leu в положении аминокислоты 262;

Lys в положении аминокислоты 270;

либо Leu, либо Arg в положении аминокислоты 272;

любой из Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 279;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 283;

Asn в положении аминокислоты 285;

Phe в положении аминокислоты 286;

либо Asn, либо Pro в положении аминокислоты 288;

Val в положении аминокислоты 293;

любой из Ala, Glu и Met в положении аминокислоты 307;

любой из Ala, Ile, Lys, Leu, Met, Val и Trp в положении аминокислоты 311;

Pro в положении аминокислоты 312;

Lys в положении аминокислоты 316;

Pro в положении аминокислоты 317;

либо Asn, либо Thr в положении аминокислоты 318;

любой из Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser и Trp в положении аминокислоты 332;

любой из Asn, Thr и Trp в положении аминокислоты 339;

Pro в положении аминокислоты 341;

любой из Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr и Tyr в положении аминокислоты 343;

Arg в положении аминокислоты 375;

любой из Gly, Ile, Met, Pro, Thr и Val в положении аминокислоты 376;

Lys в положении аминокислоты 377;

либо Asp, либо Asn в положении аминокислоты 378;

любой из Asn, Ser и Thr в положении аминокислоты 380;

любой из Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 382;

Asn в положении аминокислоты 423;

Asn в положении аминокислоты 427;

любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 430;

либо His, либо Asn в положении аминокислоты 431;

любой из Phe, Gly, His, Trp и Tyr в положении аминокислоты 434;

любой из Ile. Leu и Thr в положении аминокислоты 436;

любой из Lys, Leu, Thr и Trp в положении аминокислоты 438;

Lys в положении аминокислоты 440; и

Lys в положении аминокислоты 442;

в соответствии с нумерацией EU. Количество аминокислот, подлежащих изменению, конкретно не ограничено и аминокислоту можно изменять только в двух положениях или в трех или более положениях.

Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменения, включающие Ile в положении аминокислоты 257 и Ile в положении аминокислоты 311 в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Ile в положении аминокислоты 257 и His в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Val в положении аминокислоты 376 и His в положении аминокислоты 434.

Более того, как описано ниже, для FcRn-связывающего домена, включенного в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, также предпочтительно можно использовать Fc-область, обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН. Такую Fc-область можно получать любым способом в соответствии с упомянутым выше способом получения Fc-областей, обладающих активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, но, в частности, FcRn-связывающий домен, обладающий активностью связывания или обладающий усиленной активностью связывания с FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, можно получать посредством изменения аминокислот IgG-иммуноглобулина человека, используемого в качестве исходной Fc-области. Предпочтительные Fc-области IgG-иммуноглобулинов для изменения включают Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и их варианты). Для изменений на другие аминокислоты, можно изменять аминокислоту в любом положении при условии, что Fc-область обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН или активность связывания с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН может увеличиваться. Когда антигенсвязывающая молекула включает Fc-область IgG1 человека в качестве Fc-области, она предпочтительно включает изменение, которое обладает эффектами усиления связывания с FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека. Предпочтительные примеры таких измененных Fc-областей включают FcRn-связывающие домены человека, в которых по меньшей мере одна или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот в положениях 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436 в участке исходной Fc-области в соответствии с нумерацией EU, отличаются от соответствующих аминокислот в нативной Fc-области.

Предпочтительные примеры таких измененных Fc-областей включают Fc-области, содержащие по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:

Met в положении аминокислоты 237;

Ala в положении аминокислоты 238;

Lys в положении аминокислоты 239;

Ile в положении аминокислоты 248;

любой из Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 250;

любой из Phe, Trp и Tyr в положении аминокислоты 252;

Thr в положении аминокислоты 254;

Glu в положении аминокислоты 255;

любой из Asp, Glu и Gln в положении аминокислоты 256;

любой из Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 257;

His в положении аминокислоты 258;

Ala в положении аминокислоты 265;

Phe в положении аминокислоты 270;

либо Ala, либо Glu в положении аминокислоты 286;

His в положении аминокислоты 289;

Ala в положении аминокислоты 297;

Gly в положении аминокислоты 298;

Ala в положении аминокислоты 303;

Ala в положении аминокислоты 305;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 307;

любой из Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln и Thr в положении аминокислоты 308;

любой из Ala, Asp, Glu, Pro и Arg в положении аминокислоты 309;

любой из Ala, His и Ile в положении аминокислоты 311;

либо Ala, либо His в положении аминокислоты 312;

либо Lys, либо Arg в положении аминокислоты 314;

либо Ala, либо His в положении аминокислоты 315;

Ala в положении аминокислоты 317;

Gly в положении аминокислоты 325;

Val в положении аминокислоты 332;

Leu в положении аминокислоты 334;

His в положении аминокислоты 360;

Ala в положении аминокислоты 376;

Ala в положении аминокислоты 380;

Ala в положении аминокислоты 382;

Ala в положении аминокислоты 384;

либо Asp, либо His в положении аминокислоты 385;

Pro в положении аминокислоты 386;

Glu в положении аминокислоты 387;

либо Ala, либо Ser в положении аминокислоты 389;

Ala в положении аминокислоты 424;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 428;

Lys в положении аминокислоты 433;

любой из Ala, Phe, His, Ser, Trp и Tyr в положении аминокислоты 434; и

His в положении аминокислоты 436;

в Fc-области в соответствии с нумерацией EU.

Например, с использованием этих аминокислотных изменений отдельно или множества изменений в комбинации, связывание Fc-области IgG с FcRn в диапазоне кислых значений рН и/или в диапазоне нейтральных значений рН может быть усилено; однако аминокислотные изменения, подлежащие внесению, конкретно не ограничены, и при условии, что сообщается эффект увеличения времени удержания в плазме, можно вносить любое аминокислотное изменение.

Фармацевтические композиции

Когда вводят общепринятое нейтрализующее антитело против растворимого антигена, ожидается, что удержание антигена в плазме будет пролонгированным вследствие связывания с антителом. Как правило, антитела имеют длительное время полужизни (от одной недели до трех недель), в то время как время полужизни антигена обычно является коротким (одни сутки или менее). Между тем связанные с антителом антигены имеют значительно более длительное время полужизни в плазме по сравнению с тем, когда антигены присутствуют отдельно. По этой причине введение существующего нейтрализующего антитела приводит к увеличению концентрации антигена в плазме. Такие случаи описаны для различных нейтрализующих антител, которые нацелены на растворимые антигены, включая, например, IL-6 (J. Immunotoxicol. (2005) 3, 131-139), амилоид-бета (mAbs (2010) 2 (5), 1-13), MCP-1 (ARTHRITIS & RHEUMATISM (2006) 54, 2387-2392), гепцидин (AAPS J. (2010) 4, 646-657) и рецептор sIL-6 (Blood (2008) 112 (10), 3959-64). Описано, что введение существующих нейтрализующих антител увеличивает общую концентрацию антигена в плазме приблизительно в 10-1000 раз (уровень увеличения варьирует, в зависимости от антигена) от исходного уровня. В рамках настоящего изобретения общая концентрация антигена в плазме относится к концентрации в качестве общего количества антигена в плазме, т.е. сумме концентраций связанного с антителом и не связанного с антителом антигена. Увеличение общей концентрации антигена в плазме является нежелательным для таких фармацевтических средств на основе антител, которые нацелены на растворимый антиген. Причина этого состоит в том, что концентрация антитела должна быть более высокой, чем по меньшей мере общая концентрация антигена в плазме, для нейтрализации растворимого антигена. В частности, "общая концентрация антигена в плазме увеличивается в 10-1000 раз" означает, что для нейтрализации антигена концентрация антитела в плазме (т.е. доза антитела) должна быть в 10-1000 раз более высокой по сравнению с тем, когда увеличение общей концентрации антигена в плазме не происходит. Напротив, если общая концентрация антигена в плазме может быть снижена в 10-1000 раз по сравнению с существующим нейтрализующим антителом, дозу антитела также можно снижать в аналогичной степени. Таким образом, антитела, способные снижать общую концентрацию антигена в плазме путем элиминации растворимого антигена из плазмы, в высокой степени пригодны по сравнению с существующими нейтрализующими антителами.

Хотя настоящее изобретение не ограничено конкретной теорией, причина увеличения количества антигенов, которые могут связываться с одной антигенсвязывающей молекулой, и причина усиленного снижения концентрации антигена в плазме, когда антигенсвязывающую молекулу вводят в живой организм, что приводит к увеличению захвата антигенсвязывающей молекулы в клетки in vivo, где антигенсвязывающая молекула содержит антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, так что антигенсвязывающая активность является более низкой в условиях диапазона кислых значений рН, чем в условиях диапазона нейтральных значений рН, и FcRn-связывающий домен, такой как константная область антитела, обладающая активностью связывания Fcγ-рецептора человека в условиях диапазона нейтральных значений рН, может быть объяснена следующим образом.

Например, когда антитело, которое связывается с антигеном мембраны, вводят in vivo, после связывания с антигеном антитело в связанном с антигеном состоянии включается в эндосому путем внутриклеточной интернализации. Затем антитело переносится в лизосому, оставаясь связанным с антигеном, и деградируется там вместе с антигеном. Опосредуемую интернализацией элиминацию из плазмы называют антиген-зависимой элиминацией, и она была описана для многих молекул антител (Drug Discov Today (2006) 11(1-2), 81-88). Когда одна молекула IgG-антитела связывается с антигенами двухвалентным образом, одна молекула антитела интернализуется, оставаясь связанной с двумя антигенами, и деградируется в лизосоме. В случае типичных антител, таким образом, одна молекула IgG-антитела не может связываться с тремя молекулами антигена или более. Например, одна молекула IgG-антитела, обладающая нейтрализующей активностью, не может нейтрализовать три или более молекулы антигена.

Время удержания молекулы IgG в плазме является относительно длительным (элиминация является медленной), поскольку функционирует FcRn, который известен как рецептор спасения для молекулы IgG. Молекулы IgG, включенные в эндосомы путем пиноцитоза, связываются в кислых условиях эндосом с FcRn, экспрессируемым в эндосомах. Молекулы IgG, которые не могут связываться с FcRn, переносятся в лизосомы и деградируются в них. Между тем, молекулы IgG, связанные с FcRn, переносятся на клеточную поверхность. Молекулы IgG диссоциируют от FcRn человека в нейтральных условиях в плазме и, таким образом, рециклируют обратно в плазму.

Альтернативно, когда антигенсвязывающие молекулы представляют собой антитела, которые связываются с растворимым антигеном, вводимые in vivo антитела связываются с антигенами, а затем антитела включаются в клетки, оставаясь связанными с антигенами. Большинство антител, включенных в клетки, связываются с FcRn в эндосоме, а затем переносятся на клеточную поверхность. Антитела диссоциируют от FcRn в нейтральных условиях плазмы и высвобождаются во внешнюю среду клеток. Однако антитела, имеющие типичные антигенсвязывающие домены, антигенсвязывающая активность которых не варьирует, в зависимости от условий концентрации ионов, таких как рН, высвобождаются во внешнюю среду клеток, оставаясь связанными с молекулами и, таким образом, они не могут связываться вновь с антигеном. Таким образом, подобно антителам, которые связываются с антигенами мембраны, единичная типичная молекула IgG-антитела, антигенсвязывающая активность которой не варьирует, в зависимости от условий концентрации ионов, таких как рН, не может связываться с тремя молекулами антигенов или более.

Антитела, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциируют от антигенов в условиях диапазона кислых значений рН в эндосоме (антитела, которые связываются в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциируют в условиях диапазона кислых значений рН), и антитела, которые связываются с антигенами зависимым от концентрации ионов кальция образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях низкой концентрации ионов кальция в эндосоме (антитела, которые связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциируют в условиях низкой концентрации ионов кальция) могут диссоциировать от антигена в эндосоме. Антитела, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом или зависимым от концентрации ионов кальция образом, когда рециклируют в плазму посредством FcRn, после диссоциации от антигенов могут вновь связываться с антигеном. Таким образом, такая единичная молекула антитела может многократно связываться с несколькими молекулами антигена. Между тем, антиген, связанный с антигенсвязывающими молекулами, диссоциируют от антитела в эндососме и деградируют в лизосоме без рециклирования в плазму. Путем введения таких антигенсвязывающих молекул in vivo, захват антигена в клетки ускоряется и является возможным снижение концентрации антигена в плазме.

Захват антигенов, связанных антигенсвязывающими молекулами, в клетки далее усиливается путем сообщения или усиления активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН (рН 7,4) антителам, связывающимся с антигенами рН-зависимым образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях диапазона кислых значений рН в эндосоме (антитела, которые связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциируют в условиях диапазона кислых значений рН), и антителам, которые связываются с антигенами зависимым от концентрации ионов кальция образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях низкой концентрации ионов кальция в эндосоме (антитела, которые связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциируют в условиях низкой концентрации ионов кальция). В частности, путем введения таких антигенсвязывающих молекул in vivo ускоряется элиминация антигена, и является возможным снижение концентрации антигена в плазме. Типичные антитела, которые не обладают способностью связываться с антигенами рН-зависимым образом или зависимым от концентрации ионов кальция образом, и комплексы антиген-антитело таких антител включаются в клетки посредством неспецифического эндоцитоза и транспортируются на клеточную поверхность путем связывания с FcRn в кислых условиях эндосом. Они диссоциируют от FcRn в нейтральных условиях на клеточной поверхности и рециклируют в плазму. Таким образом, когда антитело, которое связывается с антигеном полностью рН-зависимым образом (которое связывается в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциирует в условиях диапазона кислых значений рН) или полностью зависимым от концентрации ионов кальция образом (которое связывается в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциирует в условиях низкой концентрации ионов кальция) связывается с антигеном в плазме и диссоциирует от антигена в эндосоме, скорость элиминации антигена считается равной скорости захвата в клетки антитела или комплекса антиген-антитело посредством неспецифического эндоцитоза. Когда зависимость от рН или концентрации ионов кальция связывания антиген-антитело является недостаточной, антигены, которые не диссоциировали от антител в эндосоме, рециклируют в плазму вместе с антителами. С другой стороны, когда зависимость от рН является достаточно высокой, скорость-лимитирующей стадией элиминации антигена является клеточный захват посредством неспецифического эндоцитоза. Между тем, FcRn транспортирует антитела из эндосомы на клеточную поверхность и ожидается, что часть FcRn также распределена на клеточной поверхности.

Авторы настоящего изобретения сделали заключение, что IgG-иммуноглобулины, обладающие активностью связывания или обладающие усиленной активностью связывания с Fcγ-рецепторами в условиях диапазона нейтральных значений рН, могут связываться с Fcγ-рецепторами, присутствующими на поверхности клетки, и что IgG-иммуноглобулины захватываются в клетки зависимым от Fcγ-рецептора образом посредством связывания с Fcγ-рецепторами, присутствующими на клеточной поверхности. Скорость захвата в клетки через Fcγ-рецепторы является более высокой, чем скорость захвата в клетки посредством неспецифического эндоцитоза. Таким образом, полагают, что скорость элиминации антигена антигенсвязывающими молекулами можно далее увеличить посредством усиления способности связываться с Fcγ-рецепторами в условиях диапазона нейтральных значений рН. Следовательно, антигенсвязывающие молекулы, обладающие способностью связываться с Fcγ-рецепторами в условиях диапазона нейтральных значений рН, захватывают антигены в клетки быстрее, чем обычные (нативные человеческие) IgG-иммуноглобулины и после связывания с FcRn в эндосоме и диссоциации антигенов они рециклируют вновь в плазму и они вновь связываются с антигенами и захватываются в клетки через Fcγ-рецепторы. Поскольку оборачиваемость этого цикла может быть увеличена посредством увеличения способности связываться с Fcγ-рецепторами в условиях диапазона нейтральных значений рН, скорость элиминации антигена из плазмы увеличится. Более того, посредством получения антигенсвязывающих молекул, которые обладают сниженной антигенсвязывающей активностью в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с антигенсвязывающей активностью в условиях диапазона нейтральных значений рН, скорость элиминации антигена из плазмы может быть далее увеличена. Посредством увеличения количества циклов в результате увеличения оборачиваемости этого цикла может увеличиваться количество молекул антигенов, которые могут связываться одной антигенсвязывающей молекулой. Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению включают антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен и, поскольку связывающий Fcγ-рецептор домен не влияет на связывание антигена и основываясь на упомянутом выше механизме, считается, что, независимо от типа антигенов, захват антигена в клетки антигенсвязывающими молекулами может быть усилен и скорость элиминации антигена может быть увеличена посредством снижения активности связывания (связывающей способности) антигенсвязывающей молекулы с антигенами в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или условия низкой концентрации ионов кальция, по сравнению с активностью связывания (связывающей способностью) с антигенами в условиях концентрации ионов кальция, таких как диапазон нейтральных значений рН, или условия высокой концентрации ионов кальция и/или усиление активности связывания с Fcγ-рецепторами при рН в плазме. Таким образом, антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению могут проявлять лучшие эффекты, чем общепринятые терапевтические антитела, с точки зрения снижения побочных эффектов, вызываемых антигенами, увеличения дозы антитела и улучшения кинетики антител in vivo.

На фиг. 1 представлен вариант осуществления механизма элиминации растворимых антигенов из плазмы путем введения антител с зависимым от концентрации ионов связыванием антигена, обладающих усиленным связыванием с Fcγ-рецепторами при нейтральных значениях рН, по сравнению с общепринятыми нейтрализующими антителами. Далее в настоящем описании описаны антитела с зависимым от концентрации ионов водорода (т.е. рН) связыванием антигена в качестве примера антител с зависимым от концентрации ионов связыванием антигена, однако механизмы не ограничиваются концентрацией ионов водорода. Существующие нейтрализующие антитела, которые не обладают способностью к рН-зависимому связыванию антигена, могут постепенно захватываться, главным образом, посредством неспецифических взаимодействий с клетками после связывания с растворимыми антигенами в плазме. Комплексы нейтрализующих антител и растворимых антигенов, которые захватились в клетки, перемещаются в кислые эндосомы и рециклируют в плазму посредством FcRn. С другой стороны, антитело с рН-зависимым связыванием антигена с усиленным связыванием с Fcγ-рецепторами в нейтральных условиях, связывается с растворимым антигеном в плазме и после этого оно может быстро захватываться в клетки, экспрессирующие Fcγ-рецепторы на поверхности клеток посредством взаимодействия с Fcγ-рецептором помимо неспецифического взаимодействия. В этом случае растворимые антигены, связанные с антителом с рН-зависимым связыванием антигена, диссоциируют от антитела вследствие способности к рН-зависимому связыванию в кислых эндосомах. Растворимые антигены, которые диссоциировали от антитела, затем перемещаются в лизосомы и деградируются посредством протеолиза. Между тем, антитела, которые высвободили растворимые антигены, связываются с FcRn в кислой эндосоме, а затем рециклируют на мембрану клетки посредством FcRn, и вновь высвобождаются в плазму. Таким образом, свободные антитела, которые рециклируют, могут вновь связываться с другими растворимыми антигенами. Такие антитела с рН-зависимым связыванием антигена, связывание которых с Fcγ-рецепторами в нейтральных условиях может перемещать большое количество растворимых антигенов в лизосомы, снижают общую концентрацию антигена в плазме посредством повторяющегося цикла из: захвата в клетки через Fcγ-рецепторы; диссоциации и деградации растворимых антигенов; и рециклирования антитела.

В частности, настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, антигенсвязывающим молекулам, полученным способами изменения по настоящему изобретению, или антигенсвязывающим молекулам, полученным способами получения по настоящему изобретению.

Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению или антигенсвязывающие молекулы, полученные способами получения по настоящему изобретению, пригодны в качестве фармацевтических композиций, поскольку они при введении обладают мощным эффектом снижения концентрации антигена в плазме по сравнению с типичными антигенсвязывающими молекулами, и проявляют улучшенный иммунный ответ in vivo, фармакокинетику и т.п. у животных, которым вводят молекулы. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемые носители.

В рамках настоящего изобретения фармацевтические композиции, как правило, относятся к средствам для лечения или профилактики или исследования и диагностики заболеваний.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть составлены способами, известными специалистам в данной области. Например, их можно использовать парентерально в форме инъекций стерильных растворов или суспензий, включающих воду или другую фармацевтически приемлемую жидкость. Например, такие композиции могут быть составлены путем смешения в форме единичной дозы, требуемой повсеместно одобренной практикой производства лекарственных средств, путем комбинирования надлежащим образом с фармакологически приемлемыми носителями или средами, в частности, со стерильной водой, физиологическим раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспензией, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, вкусовой добавкой, эксципиентом, носителем, консервантом, связующим веществом и т.п. В таких составах количество активного ингредиента корректируют так, чтобы получить соответствующее количество в заданном диапазоне.

Стерильные композиции для инъекций могут быть составлены с использованием носителей, таких как дистиллированная вода для инъекций, в соответствии со стандартной практикой составления.

Водные растворы для инъекций включают, например, физиологический солевой раствор и изотонические растворы, содержащие декстрозу или другие адъюванты (например, D-сорбит, D-маннозу, D-маннит и хлорид натрия). Также их можно использовать в комбинации с соответствующими солюбилизаторами, например, спиртами (этанол и т.п.), полиспиртами (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.), неионными поверхностно-активными веществами (полисорбат 80(ТМ), НСО-50 и т.п.).

Масла включают кунжутное масло и соевые масла. В комбинации с солюбилизаторами можно использовать бензилбензоат и/или бензиловый спирт. Также можно комбинировать буферы (например, фосфатный буфер натрий-ацетатный буфер), успокаивающие средства (например, прокаина гидрохлорид), стабилизаторы (например, бензиловый спирт и фенол) и/или антиоксиданты. Полученными инъекционными препаратами заполняют подходящие ампулы.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно вводят парентерально. Например, вводят композиции в дозированной форме для инъекций, трансназального введения, введения через легкие или чрескожного введения. Например, их можно вводить системно или локально путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции и т.п.

Способы введения можно надлежащим образом выбирать, учитывая возраст и симптомы пациента. Доза фармацевтической композиции, содержащей антигенсвязывающую молекулу, может составлять, например, от 0,0001 до 1,000 мг/кг для каждого введения. Альтернативно доза может составлять, например, от 0,001 до 100000 мг на пациента. Однако настоящее изобретение не ограничивается числовыми величинами, описанными выше. Дозы и способы введения варьируют, в зависимости от массы тела пациента, возраста, симптомов и т.п. Специалисты в данной области могут установить подходящие дозы и способы введения, учитывая факторы, описанные выше.

Аминокислоты, содержащиеся в аминокислотных последовательностях по настоящему изобретению, могут быть посттрансляционно модифицированными (например, модификация N-концевого глутамина в пироглутаминовую кислоту путем пироглутамилирования хорошо известна специалистам в данной области). Естественно, такие посттрансляционно модифицированные аминокислоты включены в аминокислотные последовательности по настоящему изобретению.

Способы, в которых используются антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению

Настоящее изобретение также относится к способу, включающему контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где способ представляет собой любой из следующих:

(i) способ увеличения количества антигенов, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула;

(ii) способ элиминации антигенов плазмы;

(iii) способ улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы;

(iv) способ ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой;

(v) способ ускорения высвобождения наружу клетки антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме; и

(vi) способ снижения концентрации свободного антигена или общей концентрации антигена в плазме.

Более того, настоящее изобретение относится к способу, включающему усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, где способ представляет собой любой из следующих:

(i) способ изменения антигенсвязывающей молекулы, в которой внутриклеточный захват антигена, подлежащего связыванию, усилен;

(ii) способ увеличения количества антигенов, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула;

(iii) способ увеличения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы;

(iv) способ улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы;

(v) способ ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой;

(vi) способ ускорения высвобождения антигенсвязывающей молекулы наружу клетки в не связанной с антигеном форме, где антигенсвязывающая молекула была захвачена в клетку в связанной с антигеном форме; и

(vii) способ изменения антигенсвязывающей молекулы, который может снижать общую концентрацию антигена или концентрацию свободного антигена в плазме.

Примеры способов контактирования антигенсвязывающей молекулы с экспрессиирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo включают (1) так называемый способ ex vivo, где плазму, содержащую антигенсвязывающие молекулы и антигены, которые связываются с антигенсвязывающими молекулами, временно извлекают из живого организма; подвергают контактированию с клетками, экспрессирующими Fcγ-рецепторы; а затем, после определенного периода времени, плазму, содержащую внеклеточные рециклированные (или также обозначаемые ресекретированные и рециркулированные) антигенсвязывающие молекулы без связанных антигенов возвращают в живой организм, и (2) способ введения антигенсвязывающих молекул в живой организм. В способе (1), также можно использовать способ: временного извлечения из живого организма плазмы, содержащей антигены, с которыми связываются антигенсвязывающие молекулы; контактирования с клетками, экспрессирующими Fcγ-рецепторы и антигенсвязывающие молекулы; и, после определенного периода времени, возвращения плазмы в живой организм.

В рамках настоящего изобретения экспрессирующие Fcγ-рецептор клетки не ограничиваются конкретными клетками и можно использовать клетки любого типа при условии, что они представляют собой клетки, которые экспрессируют желаемый Fcγ-рецептор(ы). Для идентификации клеток, которые экспрессируют желаемый Fcγ-рецептор(ы), можно использовать общеизвестные базы данных, такие как Human Protein Atlas (http://www.proteinatlas.org/). Более того, то, экспрессируются ли рецепторы в клетках, используемых для контактирования антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, можно подтверждать способом, которые подтверждают экспрессию гена, кодирующего желаемый Fcγ-рецептор(ы), или иммунологическим способом, в котором используются антитела, которые связываются с желаемым Fcγ-рецептором(ами). Эти способы также являются общеизвестными. Поскольку контакт экспрессирующих Fcγ-рецептор клеток с антигенсвязывающими молекулами и антигенами, которые связываются с антигенсвязывающими молекулами, осуществляют также in vivo, контактирование экспрессирующих Fcγ-рецептор клеток с антигенсвязывающими молекулами в рамках настоящего изобретения включает введение антигенсвязывающих молекул в живые организмы. Длительность контакта представляет собой, например, подходящую длительность от одной минуты до нескольких недель, от 30 минут до одной недели, от одного часа до трех суток и от двух часов до одних суток. Более конкретно, длительность, необходимую для захвата антигенсвязывающих молекул или антигенов, связавшихся с антигенсвязывающими молекулами, в клетки посредством эндоцитоза, опосредуемого Fcγ-рецепторами, соответствующим образом используют в качестве длительности контакта. Например, различные иммунные клетки можно использовать для экспрессирующих Fcγ-рецептор клеток.

Способ усиления активности связывания связывающего Fcγ-рецептор домена с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, относительно нативного связывающего Fcγ-рецептор домена, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, описан в представленном ниже разделе в отношении способа получения антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению.

Способ изменения антигенсвязывающей молекулы с усиленным внутриклеточным захватом антигенов, которые связываются с антигенсвязывающей молекулой

Настоящее изобретение относится к способам изменения антигенсвязывающей молекулы с усиленным внутриклеточным захватом антигенов, которые связываются с антигенсвязывающей молекулой, где способ включает усиление, в условиях диапазона нейтральных значений рН, активности связывания Fcγ-рецептора связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.

В рамках настоящего изобретения "внутриклеточный захват антигенов" посредством антигенсвязывающей молекулы означает, что антигены захватываются в клетки опосредуемым Fcγ-рецептором эндоцитозом и интернализацией. В рамках настоящего изобретения "усиление захвата в клетки" означает, что скорость захвата в клетки антигенсвязывающих молекул, связанных с антигенами в плазме, увеличивается и/или количество захваченных антигенов, которые рециклировали в плазму, снижается и только необходимо, чтобы скорость захвата в клетки увеличивалась по сравнению с антигенсвязывающей молекулой перед снижением антигенсвязывающей активности (связывающей способности) антигенсвязывающей молекулы в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция по сравнению с антигенсвязывающей активностью в условиях концентрации ионов, таких как диапазон нейтральных значений рН или высокая концентрация ионов кальция, в дополнение к усилению активности связывания антигенсвязывающей молекулы с Fcγ-рецептором в диапазоне нейтральных значений рН, и предпочтительно, чтобы скорость увеличивалась по сравнению с нативным IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, и особенно предпочтительно, чтобы скорость увеличивалась по сравнению с любым из нативных IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. Таким образом, в рамках настоящего изобретения то, усиливается ли захват антигенов антигенсвязывающими молекулами, можно определять посредством наблюдения того, увеличивается ли скорость захвата антигенов в клетки. Скорость захвата антигенов в клетки можно вычислять, например, добавлением антигенсвязывающей молекулы и антигена в культуральную среду, содержащую экспрессирующие Fcγ-рецептор клетки, и измерением снижения концентрации антигена в культуральной среде с течением времени или измерением количества антигенов, захваченных в экспрессирующие Fcγ-рецептор клетки с течением времени. С использованием способа увеличения скорости захвата антигенов в клетки антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению, например, посредством введения антигенсвязывающей молекулы, может быть увеличена скорость элиминации антигена из плазмы. Таким образом, то, усиливается ли захват антигена в клетки антигенсвязывающей молекулой, также можно подтверждать, например, посредством оценки того, увеличивается ли скорость элиминации антигена из плазмы и того, снижает ли введение антигенсвязывающей молекулы общую концентрацию антигена в плазме.

В рамках настоящего изобретения "общая концентрация антигена в плазме" означает сумму концентраций антигенов, связанных с антигенсвязывающими молекулами и не связанных антигенов или "концентраций свободного антигена в плазме", которая представляет собой концентрацию антигенов, не связанных с антигенсвязывающими молекулами. Различные способы измерения "общей концентрации антигена в плазме" или "концентраций свободного антигена в плазме" хорошо известны в данной области, как описано в настоящем описании ниже.

В рамках настоящего изобретения "нативный IgG человека" означает немодифицированный IgG человека и он не ограничивается конкретным классом IgG. Более того, в "нативном IgG человека" желательно, чтобы цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляла собой содержащую фукозу цепь сахаров. Это означает, что при условии, что IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека может связываться с FcRn человека в диапазоне кислых значений рН, их можно использовать в качестве "нативного IgG человека". Предпочтительно, "нативный IgG человека" может представлять собой IgG1 человека.

Способ увеличения количества антигенов, которые могут связываться одной антигенсвязывающей молекулой

Настоящее изобретение относится к способу увеличения количества антигенов, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула, где способ включает контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

Более того, настоящее изобретение относится к способу увеличения количества антигенов, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.

Выражение "количество антигенов, с которым может связываться одна антигенсвязывающая молекула" в рамках настоящего изобретения означает количество антигенов, с которым может связываться антигенсвязывающая молекула до тех пор, пока молекула не деградирует или не элиминируется. Выражение "увеличение количества антигенов, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула" в рамках настоящего изобретения относится к увеличению количества раз диссоциации молекулы антигена, связанной с антигенсвязывающей молекулой, и связывания антигенсвязывающей молекулы вновь с молекулой антигена. Молекулы антигена, которые связываются с антигенсвязывающей молекулой, могут представлять собой одну и ту же молекулу антигена или различные молекулы, существующие в реакционной системе, где присутствуют обе молекулы. Иными словами, оно относится к общему количеству раз связывания антигенсвязывающей молекулы с антигеном в реакционной системе. В другом выражении, когда принимают, что один цикл представляет собой внутриклеточный захват антигенсвязывающей молекулы, связанной с антигеном, диссоциацию антигена в эндосоме, а затем возвращение антигенсвязывающей молекулы наружу клетки, выражение относится к увеличению количества раз, когда этот цикл может повторяться до тех пор, пока антигенсвязывающая молекула не деградирует или не элиминируется. После связывания с Fcγ-рецептором, антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, обладающие активностью связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН, захватываются в клетку, экспрессирующую этот Fcγ-рецептор, посредством эндоцитоза. Антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, которая диссоциировала от Fcγ-рецептора в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, вновь рециклирует наружу клетки посредством связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН. Антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, которая рециклирует наружу клетки после диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, может вновь связываться с антигеном. Таким образом, то, увеличивается ли количество циклов, можно оценивать посредством определения того, происходит ли вышеупомянутое "усиление внутриклеточного захвата" или происходит ли описанное ниже "улучшение фармакокинетики".

Способ элиминации антигенов плазмы или способ повышения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы

Настоящее изобретение относится к способу элиминации антигенов из плазмы, который включает контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором активность связывания антигена антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

Более того, настоящее изобретение относится к способу повышения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен, и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.

В рамках настоящего изобретения выражение "способ повышения способности элиминировать антигены плазмы" имеет то же значение, что и "способ увеличения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены из плазмы".

В рамках настоящего изобретения "способность элиминировать антигены плазмы" относится к способности элиминировать из плазмы антигены, присутствующие в плазме, когда антигенсвязывающие молекулы вводят in vivo или антигенсвязывающие молекулы секретируются in vivo. Таким образом, в рамках настоящего изобретения все это выражение "способность антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы повышается" означает, что, когда вводят антигенсвязывающую молекулу, скорость элиминации антигена из плазмы увеличивается по сравнению со скоростью до снижения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, по сравнению с антигенсвязывающей активностью в диапазоне нейтральных значений рН или при высокой концентрации ионов кальция, в дополнение к усилению активности связывания антигенсвязывающей молекулы с Fcγ-рецептором в диапазоне нейтральных значений рН. То, увеличивается ли способность антигенсвязывающих молекул элиминировать антигены плазмы, можно определять, например, путем введения растворимых антигенов и антигенсвязывающих молекул в живой организм и измерения концентрации в плазме растворимых антигенов после введения. Когда концентрация растворимых антигенов в плазме снижается после введения растворимых антигенов и антигенсвязывающих молекул посредством усиления активности связывания антигенсвязывающих молекул с Fcγ-рецепторами в условиях диапазона нейтральных значений рН или посредством снижения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы в условиях концентрации ионов, такой как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, по сравнению с антигенсвязывающей активностью в условиях концентрации ионов, такой как диапазон нейтральных значений рН или высокая концентрация ионов кальция, в дополнение к усилению активности связывания Fcγ-рецептора, может быть определено, что способность антигенсвязывающих молекул элиминировать антигены плазмы усиливается. Растворимые антигены могут представлять собой антигены, с которыми антигенсвязывающие молекулы фактически связываются (антигены в форме комплекса антиген/антигенсвязывающая молекула), или антигены, с которыми антигенсвязывающие молекулы не связываются, и их концентрации могут быть определены как "концентрация связанных с антигенсвязывающей молекулой антигенов в плазме" и "концентрация не связанных с антигенсвязывающей молекулой антигенов в плазме", соответственно (последняя обладает тем же значением, что и "концентрация свободного антигена в плазме"). Поскольку "общая концентрация антигена в плазме" означает сумму концентраций связанных с антигенсвязывающей молекулой антигенов и не связанных с антигенсвязывающей молекулой антигенов или "концентрацию свободных антигенов в плазме", которая представляет собой концентрацию не связанных с антигенсвязывающей молекулой антигенов, растворимый антиген концентрация может быть определен как "общая концентрация антигена в плазме". Различные способы измерения "общей концентрации антигена в плазме" или "концентрации свободного антигена в плазме" хорошо известны в данной области, как описано в настоящем описании ниже.

Способ улучшения фармакокинетики антигенсвязывающих молекул

Настоящее изобретение относится к способу улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы, который включает контактирование антигенсвязывающей молекулы с клеткой, экспрессирующей Fcγ-рецептор, in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

Более того, настоящее изобретение относится к способу улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула, обладающая активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.

В настоящем описании "усиление фармакокинетики", "улучшение фармакокинетики" и "превосходящая фармакокинетика" можно переформулировать как "усиление удержание в плазме (крови)", "улучшение удержания в плазме (крови)", "превосходящее удержание в плазме (крови)", и "пролонгированное удержание в плазме (крови)". Эти термины являются синонимами.

В настоящем описании "улучшение фармакокинетики" означает не только пролонгирование периода времени до элиминации из плазмы (например, пока антигенсвязывающая молекула не деградирует внутреклеточно и т.п. и может вернуться в плазму) после введения антигенсвязывающей молекулы человеку или не являющимся человеком животным, таким как мыши, крысы, обезьяны, кролики и собаки, но также пролонгирование удержания в плазме антигенсвязывающих молекул в форме, которая обеспечивает связывание антигена (например, в свободной от антигена форме антигенсвязывающей молекулы) в ходе периода введения до элиминации вследствие деградации. Нативный IgG может связываться с FcRn из не являющихся человеком животных. Например, мышь можно предпочтительно использовать для введения в целях подтверждения свойства антигенсвязывающей молекулы по изобретению, поскольку нативный IgG может связываться с FcRn мыши прочнее, чем с FcRn человека (Int Immunol. (2001) 13(12): 1551-1559). В качестве другого примера, также в качестве индивидуума для введения в целях подтверждения свойства антигенсвязывающей молекулы по изобретению, описанного далее, предпочтительно можно использовать мышь с дефицитом ее нативных генов FcRn и с трансгеном гена FcRn человека (Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104). В частности, "улучшение фармакокинетики" также включает пролонгирование периода времени до элиминации вследствие деградации антигенсвязывающей молекулы, не связанной с антигенами (свободная от антигена форма антигенсвязывающей молекулы). Антигенсвязывающая молекула в плазме не может связываться с новым антигеном, если антигенсвязывающая молекула уже связана с антигеном. Таким образом, чем более длительным является период времени, когда антигенсвязывающая молекула не связана с антигеном, тем более длительным является период времени, когда она может связываться с новым антигеном (более высокая вероятность связывания с другим антигеном). Это обеспечивает уменьшение периода времени, когда антиген свободен от антигенсвязывающей молекулы in vivo, и продление периода времени, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой. Концентрация в плазме свободной от антигена формы антигенсвязывающей молекулы может увеличиваться и период времени, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой, может продлеваться путем ускорения элиминации антигена из плазмы посредством введения антигенсвязывающей молекулы. В частности, в настоящем описании "улучшение фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы" включает улучшение фармакокинетического параметра свободной от антигена формы антигенсвязывающей молекулы (любое из продления времени полужизни в плазме, продления среднего времени удержания в плазме и снижения клиренса из плазмы), продление периода времени, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой, после введения антигенсвязывающей молекулы, и ускорение опосредуемой антигенсвязывающей молекулой элиминации из плазмы. Улучшение фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы можно оценивать путем определения любого из параметров: время полужизни в плазме, среднее время удержания в плазме и клиренс из плазмы, для антигенсвязывающей молекулы или ее свободной от антигена формы ("Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nanzando). Например, концентрацию в плазме антигенсвязывающей молекулы или ее свободной от антигена формы определяют после введения антигенсвязывающей молекулы мышам, крысам, обезьянам, кроликам, собакам или человеку. Затем, определяют каждый параметр. Когда время полужизни в плазме или среднее время удержания в плазме пролонгируются, можно считать, что фармакокинетика антигенсвязывающей молекулы в плазме повышается. Параметры можно определять способами, известными специалистам в данной области. Параметры можно оценивать соответствующим образом, например, с помощью некомпартментного анализа с использованием программного обеспечения для фармакокинетического анализа WinNonlin (Pharsight) в соответствии с инструкцией по применению. Концентрацию в плазме свободной от антигена антигенсвязывающей молекулы можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием известного способа анализа (Clin Pharmacol. 2008 Apr; 48(4): 406-417).

В рамках настоящего изобретения "улучшение фармакокинетики" также включает пролонгирование периода, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой, после введения антигенсвязывающей молекулы. Оценку того, пролонгируется ли период, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой после введения антигенсвязывающей молекулы, можно проводить путем определения концентрации в плазме свободного антигена. Заключение о пролонгировании можно делать, исходя из определенной концентрации в плазме свободного антигена или периода времени, требуемого для увеличения соотношения концентрации свободного антигена и концентрации общего антигена.

Концентрацию свободного антигена, не связанного с антигенсвязывающей молекулой, или соотношение концентрации свободного антигена и концентрации общего антигена можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, можно использовать способ определения, представленный в Pharm Res. 2006 Jan; 23 (1): 95-103. Альтернативно, когда антиген проявляет конкретную функцию in vivo, определение того, связан ли антиген с антигенсвязывающей молекулой, которая нейтрализует функцию антигена (антагонистическая молекула), можно проводить путем исследования того, нейтрализуется ли функция антигена. Оценку того, нейтрализуется ли функция антигена, можно проводить путем анализа маркера in vivo, который отражает функцию антигена. Оценку того, связан ли антиген с антигенсвязывающей молекулой, которая активирует функцию антигена (молекула-агонист), можно проводить путем анализа маркера in vivo, который отражает функцию антигена.

Определение концентрации в плазме свободного антигена и соотношения количества свободного антигена в плазме и количества общего антигена в плазме, анализ маркеров in vivo и сходные способы определения конкретно не ограничены; однако анализы предпочтительно проводят после того, как проходит определенный период времени после введения антигенсвязывающей молекулы. В рамках настоящего изобретения период после введения антигенсвязывающей молекулы конкретно не ограничен; специалисты в данной области могут определить соответствующий период, в зависимости от свойств и т.п. вводимой антигенсвязывающей молекулы. Такие периоды включают, например, одни сутки после введения антигенсвязывающей молекулы, трое суток после введения антигенсвязывающей молекулы, семь суток после введения антигенсвязывающей молекулы, 14 суток после введения антигенсвязывающей молекулы и 28 суток после введения антигенсвязывающей молекулы. В настоящем описании "концентрация антигена в плазме" относится либо к "общей концентрации антигена в плазме", которая представляет собой сумму концентрации антигена, связанного и не связанного антигенсвязывающей молекулой, либо к "концентрации свободного антигена в плазме", которая представляет собой концентрацию антигена, не связанного антигенсвязывающей молекулой.

Путем введения антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению общую концентрацию антигена в плазме можно снижать в 2 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 200 раз, в 500 раз, в 1000 раз или даже больше по сравнению с введением эталонной антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой цепь сахаров, имеющую фукозу, в качестве связывающего Fcγ-рецептор домена или по сравнению с тем, когда молекулу с антигенсвязывающим доменом, содержащую антигенсвязывающий домен, по настоящему изобретению не вводят.

Молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно вычислять, как показано ниже;

величина А: Молярная концентрация антигена в каждый момент времени

величина В: Молярная концентрация антигенсвязывающей молекулы в каждый момент времени

величина С: Молярная концентрация антигена на молярную концентрацию антигенсвязывающей молекулы (молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула) в каждый момент времени

С=А/В.

Меньшая величина С указывает на более высокую эффективность элиминации антигена на антигенсвязывающую молекулу, в то время как более высокая величина С указывает на более низкую эффективность элиминации антигена на антигенсвязывающую молекулу.

Молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно вычислять, как описано выше.

Молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно снижать путем введения антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению в 2 раз, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 200 раз, в 500 раз, в 1000 раз или даже выше по сравнению с введением эталонной антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область IgG человека дикого типа в качестве связывающего Fcγ-рецептор домена человека.

В рамках настоящего изобретения нативный IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 предпочтительно используют в качестве нативного IgG человека, который используют в качестве эталонного нативного IgG человека, подвергаемого сравнению с антигенсвязывающими молекулами в отношении их активности связывания Fcγ-рецептора или активности in vivo. Предпочтительно, можно соответствующим образом использовать эталонную антигенсвязывающую молекулу, содержащую тот же антигенсвязывающий домен, что и представляющая интерес антигенсвязывающая молекула, и Fc-область нативного IgG человека в качестве связывающего Fcγ-рецептор домена. Более предпочтительно, нативный IgG1 человека используют в качестве эталонного нативного IgG человека, подлежащего сравнению с антигенсвязывающими молекулами в отношении их активности связывания Fcγ рецептора или активности in vivo. Более того, в рамках настоящего изобретения, в качестве эталонной антигенсвязывающей молекулы, подвергаемой сравнению с антигенсвязывающими молекулами по настоящему изобретению, также можно соответствующим образом использовать антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого не изменяется в зависимости от концентрации ионов, антигенсвязывающую молекулу, содержащую FcRn-связывающий домен, активность связывания FcRn которого в условиях диапазона кислых значений рН не усилена, антигенсвязывающую молекулу, содержащую связывающий Fcγ-рецептор домен, который не обладает активностью селективного связывания с Fcγ-рецепторами и т.п.в зависимости от цели.

Снижение общей концентрации в плазме или молярного соотношения антиген/антитело можно оценивать, как описано в примерах 6, 8 и 13. Более конкретно, с использованием трансгенной линии мышей с FcRn человека 32 или 276 (Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104), их можно оценивать либо с помощью модели совместного введения антиген-антитело, либо стационарной инфузионной модели, когда антигенсвязывающая молекула не реагирует перекрестие с антигеном-аналогом мыши. Когда антигенсвязывающая молекула перекрестие реагирует с аналогом мыши, их можно оценивать путем простого введения антигенсвязывающей молекулы мышам линии трансгенных мышей с FcRn человека 32 или 276 (Jackson Laboratories). В модели совместного введения мыши вводят смесь антигенсвязывающей молекулы и антигена. В стационарной инфузионной модели, мыши имплантируют инфузионный насос, содержащий раствор антигена, для достижения постоянной концентрации антигена в плазме, а затем мыши вводят антигенсвязывающую молекулу. Исследуемую антигенсвязывающую молекулу вводят в той же дозировке. Общую концентрацию антигена в плазме, концентрацию свободного антигена в плазме и концентрацию антигенсвязывающей молекулы в плазме измеряют в соответствующий момент времени с использованием способа, известного специалистам в данной области.

Для оценки эффектов связывающего Fcγ-рецептор домена, обладающего селективной активностью связывания с Fcγ-рецепторами, когда антигенсвязывающая молекула не реагирует перекрестно с аналогичным антигеном мыши, общую концентрацию антигена в плазме или снижение молярного соотношения антиген/антитело можно оценивать либо посредством модели одновременной инъекции антиген-антитело, либо посредством модели инъекции антигена в стационарном состоянии с использованием традиционно используемых мышей C57BL/6J (Charles River Japan). Когда антигенсвязывающая молекула перекрестно реагирует с аналогом мыши, антигенсвязывающую молекулу можно просто инъецировать традиционно используемым мышам C57BL/6J (Charles River Japan) для проведения оценки.

Концентрацию общего или свободного антигена в плазме и молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно измерять через 2, 4, 7, 14, 28, 56 или 84 суток после введения для оценки долговременного эффекта настоящего изобретения. Иными словами, долговременную концентрацию антигена в плазме определяют путем измерения концентрации общего или свободного антигена в плазме и молярного соотношения антиген/антигенсвязывающая молекула через 2, 4, 7, 14, 28, 56 или 84 суток после введения антигенсвязывающей молекулы для оценки свойств антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению. То, достигается ли с помощью антигенсвязывающей молекулы, описанной в рамках настоящего изобретения, снижение концентрации антигена в плазме или молярного соотношения антиген/антигенсвязывающая молекула, можно определять путем оценки снижения в любой один или несколько из моментов времени, описанных выше.

Концентрацию общего или свободного антигена в плазме и молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно измерять через 15 мин, 1, 2, 4, 8, 12 или 24 часов после введения для оценки кратковременного эффекта настоящего изобретения. Иными словами, кратковременную концентрацию антигена в плазме определяют путем измерения концентрации общего или свободного антигена в плазме и молярного соотношения антиген/антигенсвязывающая молекула через 15 мин, 1, 2, 4, 8, 12 или 2 4 часов после введения антигенсвязывающей молекулы для оценки свойства антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению.

Путь введения антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению можно выбирать из внутрикожной, внутривенной, проводимой в стекловидное тело, подкожной, внутрибрюшинной, парентеральной и внутримышечной инъекции.

В рамках настоящего изобретение улучшение фармакокинетики у человека является предпочтительным. Когда удержание в плазме у человека трудно определить, его можно предсказать, исходя из удержания в плазме у мышей (например, здоровых мышей, трансгенных мышей, экспрессирующих антиген человека, трансгенных мышей, экспрессирующих FcRn человека) или обезьян (например, яванские макаки).

Способ ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой

Настоящее изобретение относится к способу ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой, где способ включает контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, где антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен имеет более высокую активность связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

Настоящее изобретение относится к способу ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внутриклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.

В рамках настоящего изобретения место, где антиген диссоциирует от антигенсвязывающей молекулы, может быть любым при условии, что он находится в клетке, однако предпочтительно он находится в ранней эндосоме. В рамках настоящего изобретения "внутриклеточная диссоциация антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой," не означает, что все антигены, захваченные в клетки после связывания с антигенсвязывающими молекулами, внутриклеточно диссоциируют от антигенсвязывающих молекул, и соотношение внутриклеточной диссоциации антигенов от антигенсвязывающих молекул только должно быть более высоким по сравнению с соотношением до снижения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающих молекул в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, чем в условиях концентрации ионов, таких как диапазон нейтральных значений рН или высокая концентрация ионов кальция, и происходит увеличение активности связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН. Более того, способ ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы может быть указан как способ, который усиливает внутриклеточный захват связанных с антигеном антигенсвязывающих молекул и сообщает антигенсвязывающим молекулам свойство облегчения ускорения внутриклеточной диссоциации антигенов от антигенсвязывающих молекул.

Способ ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме

Настоящее изобретение относится к способу ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме, где способ включает контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, где антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

Более того, настоящее изобретение относится к способу ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме, где антигенсвязывающая молекула была захвачена в клетку в связанной с антигеном форме, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.

В рамках настоящего изобретения выражение "внеклеточное высвобождение антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме, где антигенсвязывающая молекула была захвачена в клетку в связанной с антигеном форме" не должно означать, что все антигенсвязывающие молекулы, которые были захвачены в клетку в связанной с антигеном форме, внеклеточно высвобождаются в не связанной с антигеном форме и соотношение антигенсвязывающих молекул, внеклеточно высвободившихся в не связанной с антигеном форме, только должно быть более высоким по сравнению с соотношением до снижения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающих молекул в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, чем в условиях концентрации ионов, таких как диапазон нейтральных значений рН или высокая концентрация ионов кальция, и происходит увеличение активности Fc-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН. Внеклеточно высвобожденные антигенсвязывающие молекулы предпочтительно сохраняют антигенсвязывающую активность. Более того, способ ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме, где антигенсвязывающая молекула была захвачена в клетку в связанной с антигеном форме, может быть указан как способ, который усиливает захват связанных с антигеном антигенсвязывающих молекул в клетки и сообщает антигенсвязывающим молекулам свойство облегчения ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме.

Способ снижения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме или способ изменения антигенсвязывающей молекулы, который может снижать общую концентрацию антигена или концентрацию свободного антигена в плазме

Настоящее изобретение относится к способу снижения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме, где способ включает контактирвоание антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

Более того, настоящее изобретение относится к способу изменения антигенсвязывающей молекулы, который может снижать общую концентрацию антигена или концентрацию свободного антигена в плазме, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.

Способ оценки снижения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме описан в упомянутом выше разделе о способе улучшения фармакокинктики антигенсвязывающих молекул.

Способ элиминации антигенов из плазмы ex vivo

Пример неограничивающего варианта осуществления применения антигенсвязывающей молекулы для способа элиминации антигенов из плазмы, который предусматривается настоящим изобретением, включает применение антигенсвязывающей молекулы для так называемого способа элиминации антигенов из плазмы ex vivo, который включает контактирование антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению с плазмой, выделенной от индивидуумов, чтобы позволить образование иммунокомплексов и позволить иммунокомплексам контактировать с клетками, экспрессирующими Fcγ-рецепторы и FcRn. Скорость элиминации антигенов плазмы может быть увеличена посредством замены/комбинирования способа введения антигенсвязывающих молекул in vivo с так называемым способом ex vivo, где плазму, содержащую антигенсвязывающие молекулы и антигены, которые связываются с антигенсвязывающими молекулами, временно извлекают из живого организма, а затем контактируют с клетками, экспрессирующими Fcγ-рецепторы и FcRn, и плазму, содержащую внеклеточно рециклированные (или также называемые ресекретированными или рециркулированными) антигенсвязывающие молекулы без связанного антигена после определенного периода времени, возвращают в живой организм.

Более того, примером неограничивающего варианта осуществления применения антигенсвязывающей молекулы для способа элиминации антигенов из плазмы, который предусматривается в рамках настоящего изобретения, включат применение антигенсвязывающей молекулы для так называемого способа элиминации антигенов из плазмы ex vivo, который включает контактирование иммунокомплексов, присутствующих в плазме, выделенной от индивидуумов, которым вводили антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, с клетками, экспрессирующими FcRn и Fcγ-рецепторы.

Подтверждение того, элиминируются ли антигены из плазмы можно проводить, например, посредством оценки того, ускоряется ли скорость элиминации из плазмы антигенов, упомянутых выше, когда вместо антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, в качестве контроля для сравнения используют антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен, в котором антигенсвязывающая активность не изменяется в зависимости от концентрации ионов, антигенсвязывающую молекулу, содержащую FcRn-связывающий домен, активность связывания FcRn которого в условиях диапазона кислых значений рН не усиливается, или антигенсвязывающую молекулу, содержащую связывающий Fcγ-рецептор домен, который не обладает активностью селективного связывания с Fcγ-рецепторами.

Способ получения антигенсвязывающих молекул

Настоящее изобретение также относится к способу получения антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен и обладающей активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, где антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.

В частности, настоящее изобретение относится к способу получения антигенсвязывающей молекулы, который включает следующие стадии (a)-(f):

(a) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях высокой концентрации ионов кальция;

(b) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях низкой концентрации ионов кальция;

(c) выбор антигенсвязывающего домена, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);

(d) связывание полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен, выбранный согласно (с) с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН, который обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;

(e) культивирование клеток, в которые введен вектор, с которым полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и

(f) сбор антигенсвязывающих молекул из культуры клеток согласно (е).

Настоящее изобретение также относится к способу получения антигенсвязывающей молекулы, который включает следующие стадии (a)-(f):

(a) определение антигенсвязывающей активности антитела в условиях высокой концентрации ионов кальция;

(b) определение антигенсвязывающей активности антитела в условиях низкой концентрации ионов кальция;

(c) выбор антитела, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);

(d) связывание полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен антитела, выбранного согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и обладающий более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;

(e) культивирование клеток, в которые введен вектор, с которым полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и

(f) сбор антигенсвязывающих молекул из культуры клеток согласно (е).

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения антигенсвязывающей молекулы, который включает следующие стадии (a)-(f):

(а) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях диапазона нейтральных значений рН;

(b) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях диапазона кислых значений рН;

(c) выбор антигенсвязывающего домена, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);

(d) связывание полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен, выбранный согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, который обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;

(e) культивирование клеток, в которые введен вектор, с которым полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и

(f) сбор антигенсвязывающих молекул из клеточной культуры согласно (е).

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения антигенсвязывающей молекулы, который включает следующие стадии (a)-(f):

(a) определение антигенсвязывающей активности антитела в условиях диапазона нейтральных значений рН;

(b) определение антигенсвязывающей активности антитела в условиях диапазона кислых значений рН;

(c) выбор антитела, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);

(d) связывание полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен антитела, выбранного согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и обладающий более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;

(e) культивирование клеток, в которые введен вектор, с которым полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и

(f) сбор антигенсвязывающих молекул из клеточной культуры согласно (е).

Термины "клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" используют в настоящем описании синонимично и такие обозначения могут включать любого потомка клетки или клеточной линии. Таким образом, например, термины "трансформанты" и "трансформированные клетки" включают первичные рассматриваемые клетки и культуры, происходящие из них, не зависимо количества переносов. Также понятно, что все потомки могут не быть точно идентичными по содержанию ДНК вследствие преднамеренных или случайных мутаций. Также могут быть включены мутантные потомки, которые обладают по существу теми и же функциями или биологической активностью, в отношении которых проводили скрининг первоначально трансформированных клеток. Если подразумевается другое обозначение, это будет очевидно из контекста описания.

При указании на экспрессию кодирующей последовательности, термин "последовательность контроля" относится к нуклеотидным последовательностям ДНК, которые необходимы для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Последовательности контроля, пригодные, например, для прокариот, включают промотор, необязательную последовательность оператора, участок связывания рибосом и, возможно, другие последовательности, которые все еще предстоит изучить. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры для экспрессии кодирующей последовательности.

Для нуклеиновой кислоты термин "функционально связанный" означает, что нуклеиновая кислота имеет функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК препоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК полипептида, если он экспрессируется в качестве белка-предшественника, который участвует в секреции полипептида. Промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. Участок связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы способствовать трансляции. Обычно выражение "функционально связанный" означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторного лидера, являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Связывание осуществляют посредством лигирования в подходящих участках рестрикции. Если такие участки не существуют, используют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой. Более того, связанные нуклеиновые кислоты можно получать с помощью упомянутой выше технологии перекрывающейся ПЦР.

"Лигирование" относится к способу формирования фосфодиэфирной связи между двумя фрагментами нуклеиновой кислоты. Для лигирования двух фрагментов концы этих фрагментов должны быть совместимыми друг с другом. В некоторых случаях эти концы обладают совместимостью сразу после расщепления эндонуклеазой. Однако может быть необходимо, чтобы сначала липкие концы, обычно образующиеся при расщеплении эндонуклеазой, были преобразованы в тупые концы, чтобы они стали совместимыми для лигирования. Для преобразования в тупые концы ДНК обрабатывают в подходящем буфере в течение по меньшей мере 15 минут при 15°С приблизительно 10 единицами фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I или ДНК-полимеразой Т4 в присутствии четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в соответствующем буферном растворе. Далее ДНК очищают экстракцией фенолом-хлороформом и преципитацией этанолом, или очисткой на диоксиде кремния. Фрагменты ДНК, подлежащие слиянию, добавляют в эквимолярных количествах к раствору. Этот раствор содержит АТР и буфер лигазы, а также приблизительно 10 единиц лигазы, такой как ДНК-лигаза Т4 на 0,5 мкг ДНК. Если ДНК подлежит лигированию с вектором, вектор сначала линеаризуют посредством расщепления соответствующей эндонуклеазами рестрикции. Затем линеаризованный фрагмент обрабатывают бактериальной щелочной фосфатазой или фосфатазой кишечника теленка, тем самым препятствуя самолигированию фрагмента на стадии лигирования.

В способах получения по настоящему изобретению, антигенсвязывающие домены или антитела, обладающие более высокой антигенсвязывающей активностью в условиях высокой концентрации ионов кальция, чем в условиях низкой концентрации ионов кальция, которые выбраны способом, описанным в упомянутом выше разделе "условия концентрации ионов", являются выделенными. Более того, антигенсвязывающие домены или антитела, обладающие более высокой антигенсвязывающей активностью в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем в условиях диапазона кислых значений рН, которые выбраны способом, описанным в упомянутом выше разделе "условия концентрации ионов", являются выделенными. Например, когда антигенсвязывающие домены, выделенные таким образом, выбирают из библиотеки, как описано ниже в примерах, полинуклеотиды, кодирующие антигенсвязывающие домены, выбирают посредством общепринятой амплификации генов из вирусов, таких как фаги. Альтернативно, когда антигенсвязывающие домены или антитела, выделенные таким образом, представляют собой антитела, выбранные из культур клеток, таких как гибридомы, как указано в упомянутом выше разделе об антителах, гены антител и т.п. выделяют посредством общепринятой амплификации генов из этих клеток.

Далее, полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающий домен, выделенный как описано выше, связывают в рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и обладающий более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров. Пригодный пример связывающего Fcγ-рецептор домена включает Fc-область антитела, как описано в упомянутом выше разделе о связывающем Fcγ-рецептор домене. Более того, примеры Fcγ-рецептора включают FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(V) или FcγRIIIa(F).

Пригодные примеры Fc-области антитела включают Fc-области, имеющие по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU, которые отличаются от аминокислот в соответствующих участках в нативной Fc-области. Пригодным примером нативной Fc-области является Fc-область согласно любому из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

В неограничивающем варианте осуществления пригодным примером Fc-области антитела является Fc-область, содержащая по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:

либо Lys, либо Tyr в положении аминокислоты 221;

любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 222;

любой из Phe, Trp, Glu и Lys в положении аминокислоты 223;

любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 224;

любой из Glu, Lys и Trp в положении аминокислоты 225;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 227;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 228;

любой из Ala, Glu, Gly и Tyr в положении аминокислоты 230;

любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 231;

любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 232;

любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 233;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 234;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 235;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 236;

любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 237;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 238;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 239;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 240;

любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 241;

любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 243;

His в положении аминокислоты 244;

Ala в положении аминокислоты 245;

любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 246;

любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 247;

любой из Glu, His, Gln и Tyr в положении аминокислоты 249;

либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 250;

Phe в положении аминокислоты 251;

любой из Phe, Met и Tyr в положении аминокислоты 254;

любой из Glu, Leu и Tyr в положении аминокислоты 255;

любой из Ala, Met и Pro в положении аминокислоты 256;

любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 258;

любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 260;

любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr в положении аминокислоты 262;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 263;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 264;

любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 265;

любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 266;

любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 267;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 268;

любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 269;

любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 270;

любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 271;

любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 272;

либо Phe, либо Ile в положении аминокислоты 273;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 274;

либо Leu, либо Trp в положении аминокислоты 275;

любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 276;

любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 278;

Ala в положении аминокислоты 279;

любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 280;

любой из Asp, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 281;

любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 282;

любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr в положении аминокислоты 283;

любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr в положении аминокислоты 284;

любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 285;

любой из Glu, Gly, Pro и Tyr в положении аминокислоты 286;

любой из Asn, Asp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 288;

любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr в по