Рекомбинантная плазмида pvbl-rbdomik, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (rbd) коронавируса sars-cov-2 линии b.1.1.529 в клетках млекопитающих.
Владельцы патента RU 2772905:
Общество с ограниченной ответственностью "ЭС ДЖИ" (ООО "ЭС ДЖИ") (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Описана плазмида pVBL-RBDomik, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок RBD SARS-CoV-2 линии B.1.1.529, и обеспечивающая экспрессию белка этого RBD в клетках млекопитающих и дальнейшую очистку с помощью аффинной хроматографии. При этом получаемый белок RBD предназначен для непосредственного производства вакцинного препарата против SARS-CoV-2 линии B.1.1.529. Изобретение может быть использовано для получения белка RBD - рекомбинантного структурного домена гликопротеина spike сарбековируса SARS-CoV-2 линии B.1.1.529. 1 ил., 1 табл., 4 пр.
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения белка RBD (с англ.: receptor-binding-domain) – рекомбинантного структурного домена гликопротеина spike сарбековируса SARS-CoV-2 линии B.1.1.529. Получаемый белок RBD предназначен для непосредственного производства вакцинного препарата против SARS-CoV-2 линии B.1.1.529(Yang et al., 2020; Min, Sun 2021). Способ включает дизайн генетических конструкций, методы трансфекции клеточных линий, очистки и оценки экспрессии целевого белка.
Уровень техники
Рецептор-связывающий домен RBD является частью субъединицы S1 белка S (spike). Использование рекомбинантного структурного домена RBD в качестве антигена при производстве вакцинных препаратов против SARS-CoV-2 имеет ряд преимуществ, связанных с выработкой большого числа нейтрализующих антител в ответ на введение антигена (Zhou et al., 2019; Shang et al., 2020; Song et al., 2018; Yang et al., 2020; Min, Sun 2021; Yang, Du, 2011), что было продемонстрировано рядом научных исследований, а также высокой консервативностью региона. На данный момент известно 13 кандидатных вакцин, основанных на использовании домена RBD (https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines).
В связи с высоким молекулярно-генетическим полиморфизмом вируса SARS-CoV-2 и появлением новых линий с мутациями, ассоциированными с повышенной трансмиссивностью и тяжестью течения инфекционного заболевания (https://www.ecdc.europa.eu/en/covid-19/variants-concern; https://www.gisaid.org), а также вероятностью снижения эффективности ранее разработанных вакцин, в изобретении использован вариант антигена RBD линии B.1.1.529коронавируса SARS-CoV-2.
Известен патент «Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение» (RU2723008C9, https://patents.google.com/patent/RU2723008C9), однако основным назначением получаемого рекомбинантного белка – применение для диагностических целей, а не для использования в составе вакцинных препаратов. К недостаткам данного способа также следует отнести относительно низкий уровень экспрессии целевого белка (до 10 мг/л), что связано, прежде всего, с особенностями проведённого дизайна молекулярно-генетической векторной конструкции.
Наиболее близким по сущности к заявленному изобретению является изобретение «SARS-CoV-2-RBD eucaryotic protein expression vector and its preparation method and use» (CN112831523A, https://patents.google.com/patent/CN112831523A), где для экспрессии белка использован вектор pcDNA3.1, содержащий сигнальный пептид tPA. Экспрессия осуществляется в клетках 293F. Отличием является использование другой экспрессионной системы. К недостаткам данного способа следует отнести используемый дизайн ДНК, кодирующей последовательность RBD, не учитывающий современные представления о молекулярно-генетическом полиморфизме вируса SARS-CoV-2. Также
Также известен патент «SARS-CoV-2N/S1(RBD) recombinant protein and its preparation method and application» (CN111607003A, https://patents.google.com/patent/CN111607003A), в котором приводится способ получения и применение рекомбинантных белков нуклеокапсида (N) и RBD. К недостаткам данного изобретения относится выбранная экспрессионная система (прокариотическая), не позволяющая проводить полноценные посттрансляционные преобразования (фолдинг, гликозилирование и пр.). К недостаткам также следует отнести используемый дизайн фрагмента RBD, не учитывающий современные представления о молекулярно-генетическом полиморфизме вируса SARS-CoV-2.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения являлась разработка рекомбинантной плазмиды и структуры антигена для получения рекомбинантного белка RBDomik, соответствующего линии B.1.1.529 коронавируса SARS-CoV-2.
Техническим результатом изобретения является получение рекомбинантной плазмиды, содержащей нуклеотидную последовательность домена RBDomicron с оптимизированными кодонами и обеспечивающей экспрессию белка RBD линии B.1.1.529 SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих.
Поставленная техническая проблема решается получением кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности, имеющей последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующей белок RBD SARS-CoV-2, а также тем, что получена рекомбинантная плазмида pVBL-RBDomik (фиг. 1), содержащая оптимизированную нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2 и обеспечивающая экспрессию белка RBD в клетках млекопитающих.
Поставленная техническая проблема решается также тем, что разработан способ получения белка RBD с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, включающий культивирование клеток эукариот и экспрессию целевого белка, выделение белка с помощью аффинной хроматографии и скрининг экспрессии.
Изобретение имеет ряд преимуществ по сравнению с близкими по сущности аналогами. Использование белка RBD, характерного для линии B.1.1.529 коронавируса SARS-CoV-2, позволит его использовать для создания эффективных вакцинных препаратов, действующих в том числе против высокопатогенной и высококонтагиозной линии B.1.1.529. Проведенная оптимизация кодонов фрагмента ДНК, кодирующего белок RBD, обеспечивает высокий уровень экспрессии белка. Экспрессия белка в эукариотических системах позволяет получать белок с необходимыми посттрансляционными модификациями. Использование в составе продуцируемого белка последовательности HisTag делает возможным оптимизацию способа выделения и очистки белка RBD.
Краткое описание фигур
Рекомбинантная плазмида pVBL-RBDomik проиллюстрирована на фиг. 1, где показаны основные структурно-функциональные регионы:
- cat promoter (76–178п.н.);
- последовательность NeoR/KanR (179-994 п.н.)
- участок начала репликации ori (1057–1644 п.н.);
- CMV энхансер (2035–23п.н.38 п.н.);
- IR/DR-L (1760–2024п.н.);
- SinPro (2339-2721)
- Chimeric intron (2726–3670 п.н.) – предназначен для усиления экспрессии целевого гена;
- лидерный пептид Lid (3742-3795 п.н.), обеспечивающий экспорт белка из клетки;
- нуклеотидная последовательность гена RBD (3796–4497 п.н.);
- последовательность PuroR(5714–6313п.н.);
- SV40 poly(A) signal(6487–6608 п.н.)– необходим для полиаденилирования;
- последовательность IR/DR-R (6642–6937 п.н);
- Mer (4498–4581 п.н.) – необходим для правильной тримеризации и фолдинга белка.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Ниже приведены примеры 1–3 конкретного осуществления изобретения.
Осуществление изобретения
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pVBL-RBDomicron для синтеза RBDomicron SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих
Последовательность гена, кодирующего домен RBDomik (308V – 541F) коронавируса SARS-CoV-2 (GenBank OL677199.1) заимствовали из базы данных GenBank и проводили оптимизацию частот встречаемости кодонов для млекопитающих при помощи сервиса JCat (http://www.jcat.de/), при этом индекс адаптации кодонов CAI достиг 0,85.
На основе вектора pVBL получали рекомбинантную плазмиду pVBL-RBDomik (фиг. 1), содержащую нуклеотидную последовательность RBDomik (SEQ ID NO:1)и лидерный пептид Lid белка люциферазы гауссии (MGVKVLFALICIAVAEAS), а также последовательность Mer,которая необходима для правильной тримеризации и фолдинга белка.
Нуклеотидную последовательность сигнального пептида Lid, С-концевой домен фибритина бактериофага Citrobacter Merlin и сайты рестрикции PspCI и EcoICRI вводили в последовательность RBDomik одновременно с помощью ПЦР. Использовались пары праймеров F_RBDomik_ PspCI и R_RBDH_EcoICRI (таблица 1).
Таблица 1 – Нуклеотидные последовательности праймеров
Пример 2. Создание рекомбинантной плазмиды (pVBL-RBDomik).
2.1. Амплификация методом ПЦР нуклеотидной последовательности, кодирующей RBDomikSARS-CoV-2
Амплификацию фрагментов проводили по стандартному протоколу. Реакционная смесь, объемом 50 мкл содержала 10×буфер, 25 мМ dNTP, олигонуклеотидные праймеры (таблица 1) в количестве 10 пмоль каждого, 5 ед. а Pfu-полимеразы, 1 мкл раствора плазмидной ДНК. Реакцию проводили в амплификаторе Veriti™ 96-Well Thermal Cycler. Температурно-временной профиль ПЦР: плавление – 95ºС – 5 мин. (1 цикл). 95ºС – 30 секунд. Отжиг – 58ºС – 30 секунд, элонгация – 72ºС – 30 секунд (30 циклов).
2.2.Выделение ДНК из агарозного геля
После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле, вырезали из геля и элюировали при помощи набора «Евроген» CleanupStandard (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.
2.3. Ферментативный гидролиз вектора pVBL и ПЦР-продукта (последовательность участка генома SARS-CoV-2, кодирующей RBDomik)
Для клонирования гена RBDomikSARS-CoV-2 в составе вектора pVBL были использованы эндонуклеазы рестрикции PspCI и EcoICRI (фирма «Сибэнзим», Россия) с прилагаемыми к ним буферами. Реакционную смесь готовили в соответствии с активностью фермента (2-5 е.а. на 1 мкг ДНК) и концентрации плазмидной ДНК. Условия реакции: температура, состав буфера и длительность проведения ферментативного гидролиза ДНК подбирали в соответствии с инструкциями производителя “Сибэнзим”.
2.4. Лигирование ПЦР-продукта (последовательность участка генома SARS-CoV-2, кодирующей RBDomik) и вектора pVBL
Реакцию лигирования проводили в течение 30 мин. при комнатной температуре, используя смесь из 2 мкг ампликонов с ДНК-матрицы, 1 мкг векторной плазмиды и 20 е.а. ДНК-лигазы фага Т4 в прилагаемом к коммерческому набору реакционном буфере. Полученную лигазную смесь использовали для трансформирования культуры компетентных клеток E. coli штамм Neb Stable.
2.5 Heat-shock трансформация
К «компетентным» клеткам E.coli штамм Neb Stable добавляли 10 мкл лигазной смеси (отношение 1:10), инкубировали на льду в течение 30 мин. После этого клетки подвергали «температурному шоку» при 42ºС в течение 45 сек. Охлаждали клетки на льду в течение 2 мин, затем добавляли 200 мкл среды SOB и инкубировали при 37ºС в течение 60 мин. По окончании инкубации трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твёрдой питательной средой LB, содержащей антибиотик.
2.6 Отбор клонов для рестрикционного анализа
Клетки E. coli штамма Neb Stable, трансформированные ДНК-вакцинной конструкцией селективно культивировали в 10 мл жидкой питательной среды LB с добавлением антибиотика в рабочей концентрации 25 мкг/мл.
2.7 Определение нуклеотидной последовательности ДНК
Секвенирование проводили по методу Сэнгера. Использовался набор CEQ2000Dye Terminator Cycle Sequencing Kit и 16-капилярный автоматический секвенатор ABI 3130xl.
Пример 3. Трансфекция клеточной линии CHO-K1, рекомбинантной плазмидой pVBL-RBDomik
Клетки CHO-K1 культивировали в CO2-инкубаторе при содержании углекислого газа5% и влажности 80%. Трансфекцию проводили при достижении плотности монослоя 80%.
При достижении 80% плотности монослоя проводили трансфекцию клеток рекомбинантной плазмиды pVBL-RBDomik с помощью реагента Lipofectamine 3000 (ThermoFisher).
Пример 4. Получение рекомбинантного белка RBDomik
Клетки CHO-K1, трансфецированные рекомбинантной плазмидой pVBL-RBDomik, культивировали на роллерных установках и собирали культуральную среду. Наличие целевого белка определяли с помощью ДСН-ПААГ и иммуноблоттинга с использованием сывороток, переболевших COVID-19.
Культуральную жидкость центрифугировали, фильтровали с использованием фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. Очитку рекомбинантного белка проводили ионообменной хроматографией на соединенных последовательно колонках с катионообменным (SP-сефароза) и анионообменным (Q-сефароза) сорбентами, уравновешенными 20мМ Трис-HCl, рН 8,2. После нанесения белка колонки промывали 20мМ Трис-HCl, рН 8,2. Затем колонку с сорбентом SP-сефароза, на которую RBD не сорбируется в этих условиях (рН 8,2), отсоединяли, а белки, связавшиеся с сорбентом Q-сефароза, элюировали в линейном градиенте концентрации NaCl от 0 до 1М в 20мМ Трис-HCl, рН 8,2.
Полученные фракции анализировали с помощью вертикального гель-электрофореза в денатурирующих условиях, при условии, что целевой белок имеет молекулярный вес около 31,4 кДа. Фракции с целевым белком диализовали против фосфатно-солевого буфера, далее проводили стерилизующую фильтрацию. Концентрация белка, определенная спектрофотометрически, составила 5-10 мг на литр культуральной среды.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Общество с ограниченной ответственностью «Эс Джи»
<120> Рекомбинантная плазмида pVBL-RBDomik, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 линии B.1.617 в клетках млекопитающих.
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<223> Нуклеотидная последовательность RBDomik
<210> 1
<211> 702
<400>
GTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGA 50
ATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGACGAGG 100
TGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGG 150
ATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACCTGGCCCCCTT 200
CTTCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGT 250
GCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTG 300
CGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAACATCGCCGACTACAACTACAA 350
GCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAAGC 400
TGGACTCCAAAGTCTCCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGG 450
AAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCA 500
GGCCGGCAACAAGCCTTGTAACGGCGTGGCCGGCTTCAACTGCTACTTCC 550
CACTGAAGTCCTACTCCTTTCGGCCCACATACGGCGTGGGCCACCAGCCC 600
TACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGT 650
GTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACT 700
TCAACTTCAAC
<223> Нуклеотидная последовательность вектора pVBL-RBDomik
<210> 2
<211> 7110
<400> TCAATACTGACCATTTAAATCATACCTGACCTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGGCTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCAGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACGGCGATCGCGTATTTCGTCTGGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGGTGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCACTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATGAGGGCCCAAATGTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTGCAGTCCAGTTACGCTGGAGTCTGAGGCTCGTCCTGAATGGATGGAAGTTTACATACACTTAAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTTTACAGACAGATTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATTCCAGTGGGTCAGAAGTTTACATACACTAAGTTGACTGTGCCTTTAAACAGCTTGGAAAATTCCAGAAAATGATGTCATGGCTTTAGAAGCCTGCAGGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGATGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGACTAGTCAGGGCCCCAACCCCCCCAAGCCCCCATTTCACAACACGCTGGCGCTACAGGCGCGTGACTTCCCCTTGCTTTGGGGCGGGGGGCTGAGACTCCTATGTGCTCCGGATTGGTCAGGCACGGCCTTCGGCCCCGCCTCCTGCCACCGCAGATTGGCCGCTAGGCCTCCCCGAGCGCCCTGCCTCCGAGGGCCGGCGCACCATAAAAGAAGCCGCCCTAGCCACGTCCCCTCGCAGTTCGGCGGTCCCGCGGGTCTGTCTCAAGCTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCATGCCCCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCTTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCTAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGCTAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATAACCAGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCGAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAACTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCCCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCTTCCTCATCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGCCTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGCTCCTGGGCAACGTTAGCCTCGAGAATTCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGCCGCCACCATGGGAGTGAAGGTGCTGTTCGCCCTGATCTGTATTGCCGTGGCCGAAGCTTCTGTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGACGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACCTGGCCCCCTTCTTCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAAGCTGGACTCCAAAGTCTCCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAACAAGCCTTGTAACGGCGTGGCCGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGAAGTCCTACTCCTTTCGGCCCACATACGGCGTGGGCCACCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACACCTACATTCCTGAGGCTCCCAGAGATGGCAAGGCCTACGTCAGAAAGGATGGCGCTTGGGTCGACCTGGAAACCCTGTTGCCTTAAGTCGACCGAGCTCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATTAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTGCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCCAAGTTAAACAATTTAAAGGCAATGCTACCAAATACTAATTGAGTGTATGTAAACTTCTGACCCACTGGGAATGTGATGAAAGAAATAAAAGCTGAAATGAATCATTCTCTCTACTATTATTCTGATATTTCACATTCTTAAAATAAAGTGGTGATCCTAACTGACCTAAGACAGGGAATTTTTACTAGGATTAAATGTCAGGAATTGTGAAAAAGTGAGTTTAAATGTATTTGGCTAAGGTGTATGTAAACTTCCGACTTCAACTGTATAGGGTTCCTCTA
<223> Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка RBDomik
<210> 3
<211> 234
<400>
1 VEKGIYQTSN FRVQPTESIV RFPNITNLCP FDEVFNATRF ASVYAWNRKR
51 ISNCVADYSV LYNLAPFFTF KCYGVSPTKL NDLCFTNVYA DSFVIRGDEV
101 RQIAPGQTGN IADYNYKLPD DFTGCVIAWN SNKLDSKVSG NYNYLYRLFR
151 KSNLKPFERD ISTEIYQAGN KPCNGVAGFN CYFPLKSYSF RPTYGVGHQP
187 YRVVVLSFEL LHAPATVCGP KKSTNLVKNK CVNFNFN
Рекомбинантная плазмида pVBL-RBDomik, предназначенная для синтеза и секреции белка RBD вируса SARS-CoV-2 линии B.1.617.2 в клетках млекопитающих, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2
TCAATACTGACCATTTAAATCATACCTGACCTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGGCTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCAGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACGGCGATCGCGTATTTCGTCTGGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGGTGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCACTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATGAGGGCCCAAATGTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTGCAGTCCAGTTACGCTGGAGTCTGAGGCTCGTCCTGAATGGATGGAAGTTTACATACACTTAAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTTTACAGACAGATTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATTCCAGTGGGTCAGAAGTTTACATACACTAAGTTGACTGTGCCTTTAAACAGCTTGGAAAATTCCAGAAAATGATGTCATGGCTTTAGAAGCCTGCAGGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGATGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGACTAGTCAGGGCCCCAACCCCCCCAAGCCCCCATTTCACAACACGCTGGCGCTACAGGCGCGTGACTTCCCCTTGCTTTGGGGCGGGGGGCTGAGACTCCTATGTGCTCCGGATTGGTCAGGCACGGCCTTCGGCCCCGCCTCCTGCCACCGCAGATTGGCCGCTAGGCCTCCCCGAGCGCCCTGCCTCCGAGGGCCGGCGCACCATAAAAGAAGCCGCCCTAGCCACGTCCCCTCGCAGTTCGGCGGTCCCGCGGGTCTGTCTCAAGCTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCATGCCCCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCTTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCTAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGCTAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATAACCAGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCGAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAACTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCCCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCTTCCTCATCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGCCTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGCTCCTGGGCAACGTTAGCCTCGAGAATTCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGCCGCCACCATGGGAGTGAAGGTGCTGTTCGCCCTGATCTGTATTGCCGTGGCCGAAGCTTCTGTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGACGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACCTGGCCCCCTTCTTCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAACATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAAGCTGGACTCCAAAGTCTCCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAACAAGCCTTGTAACGGCGTGGCCGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGAAGTCCTACTCCTTTCGGCCCACATACGGCGTGGGCCACCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACACCTACATTCCTGAGGCTCCCAGAGATGGCAAGGCCTACGTCAGAAAGGATGGCGCTTGGGTCGACCTGGAAACCCTGTTGCCTTAAGTCGACCGAGCTCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATTAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTGCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCCAAGTTAAACAATTTAAAGGCAATGCTACCAAATACTAATTGAGTGTATGTAAACTTCTGACCCACTGGGAATGTGATGAAAGAAATAAAAGCTGAAATGAATCATTCTCTCTACTATTATTCTGATATTTCACATTCTTAAAATAAAGTGGTGATCCTAACTGACCTAAGACAGGGAATTTTTACTAGGATTAAATGTCAGGAATTGTGAAAAAGTGAGTTTAAATGTATTTGGCTAAGGTGTATGTAAACTTCCGACTTCAACTGTATAGGGTTCCTCTA