Химерные рецепторы, содержащие traf-6-индуцирующие домены, и связанные с ними композиции и способы

Группа изобретений относится к химерным антигенным рецепторам (CAR) для сконструированных клеток для адоптивной терапии. Предложен CAR для применения в конструировании клеток, экспрессирующих CAR, для адоптивной терапии CD19+ опухолей. CAR содержит (а) антигенсвязывающий домен, содержащий SEQ ID NO: 27; (b) трансмембранный домен, содержащий SEQ ID NO: 6; (c) спейсер, соединяющий антигенсвязывающий домен и трансмембранный домен и содержащий SEQ ID NO: 1; и (d) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (i) активирующий цитоплазматический сигнальный домен, содержащий сигнальный домен цепи CD3-дзета с SEQ ID NO: 21, и (ii) костимулирующий сигнальный домен, полученный из человеческого CD40, содержащий SEQ ID NO: 12. В некоторых аспектах также предложены способ для конструирования клеток для экспрессии указанного CAR, композиции, содержащие клетки, и их применение в способе лечения пациента, имеющего CD19+ опухоль. Изобретения обеспечивают повышенную активность, эффективность и жизнестойкость генетически сконструированных иммунных клеток для использования в адоптивной клеточной терапии. 10 н. и 36 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 пр.

 

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Эта заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США № 62/251590, поданной 5 ноября 2015 года, озаглавленной «Химерные рецепторы, содержащие Traf-индуцирующие домены и связанные с ними композиции и способы», содержание которой включено посредством ссылки в полном объеме.

Включение посредством ссылки на список последовательностей

Настоящая заявка подана вместе со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей представлен в виде файла с названием 735042002940SeqList.txt, созданного 3 ноября 2016 года, который имеет размер 37708 байт. Информация в электронном формате списка последовательностей включена посредством ссылки в полном объеме.

Область техники

Настоящее раскрытие относится в некоторых аспектах к химерным рецепторам для сконструированных клеток для адоптивной терапии, включающей Т-клетки и генетически сконструированные клетки. В некоторых аспектах раскрытие дополнительно относится к способам и композициям для конструирования и получения клеток, композиций, содержащих клетки, и к способу их введения пациентам. В некоторых вариантах осуществления клетки, такие как Т-клетки, содержат генетически сконструированные антигенные рецепторы, которые специфично связываются с антигенами, такие как химерный антигенный рецептор (CAR), и которые содержат внутриклеточный сигнальный домен, который индуцирует TRAF6-опосредованную сигнализацию. В некоторых вариантах осуществления признаки клеток и способов обеспечивают повышенную или улучшенную активность, эффективность и/или жизнестойкость.

Уровень техники

Существуют различные стратегии для получения и введения сконструированных клеток для адоптивной терапии. Например, существуют стратегии для конструирования иммунных клеток, экспрессирующих генетически сконструированные антигенные рецепторы, такие как CAR, и для введения композиций, содержащих такие клетки, пациентам. Для повышения эффективности клеток необходимы улучшенные стратегии, например, улучшение жизнестойкости и/или выживаемости клеток при введении пациентам. Предложены способы, клетки, композиции, наборы и системы, отвечающие таким требованиям.

Сущность изобретения

В настоящей заявке в некоторых аспектах предложен химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий домен, индуцирующий фактор 6, связанный с TNF-рецептором, ((TRAF-6)-индуцирующий домен) и активирующий цитоплазматический сигнальный домен.

В настоящем описании также предложен химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен, полученный из человеческого CD40. Также предложен химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен, полученный из человеческого CD28, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен, полученный из CD40. В некоторых случаях CD40 является человеческим CD40. В некоторых из любых таких вариантов осуществления сигнальный домен, полученный из CD40, содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 12, или функциональный вариант, содержащий последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12.

Также предложен химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен, полученный из CD40, представленный в SEQ ID NO: 12. В некоторых случаях трансмембранный домен получен из CD40.

В некоторых из любых таких вариантов осуществления трансмембранный домен представляет собой или содержит трансмембранный домен, полученный из CD4, CD28 или CD8. В некоторых примерах трансмембранный домен представляет собой или содержит трансмембранный домен, полученный из CD28. В некоторых случаях трансмембранный домен является человеческим или получен из человеческого белка.

В некоторых из любых таких вариантов осуществления трансмембранный домен, полученный из CD28, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6.

В некоторых из любых таких вариантов осуществления химерный рецептор дополнительно содержит активирующий цитоплазматический сигнальный домен. В некоторых случаях активирующий цитоплазматический сигнальный домен, который способен индуцировать первичный активирующий сигнал в Т-клетке, является компонентом T-клеточного рецептора (TCR) и/или содержит мотив активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). В некоторых вариантах осуществления активирующий цитоплазматический сигнальный домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен дзета-цепи CD3-дзета (CD3ζ) или его функциональный вариант или сигнальную часть.

В некоторых из таких вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит по порядку от своего N-конца к С-концу сигнальный домен, полученный из CD2, и активирующий цитоплазматический сигнальный домен. В некоторых из любых таких вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен не содержит внутриклеточного сигнального домена дзета-цепи CD3-дзета (CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен дополнительно содержит дополнительный костимулирующей сигнальный домен.

В некоторых из любых таких вариантов осуществления дополнительный костимулирующий сигнальный домен содержит внутриклеточный сигнальный домен костимулирующей молекулы Т-клетки или его сигнальную часть, отличную от полученной из CD40. В некоторых аспектах дополнительный костимулирующий сигнальный домен содержит сигнальный домен, полученный из CD28, 4-1BB или ICOS, или его сигнальную часть.

В некоторых вариантах осуществления лигандсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен. В некоторых примерах антигенсвязывающий домен представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела. В некоторых случаях антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, который представляет собой одноцепочечный фрагмент. В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит вариабельные области антитела, соединенные гибким линкером иммуноглобулина. В некоторых случаях антигенсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

В другом аспекте предложен мультимерный химерный рецепторный комплекс, содержащий первый и второй химерные рецепторы. В других аспектах предложена нуклеиновая кислота или вектор, кодирующий химерный рецептор или мультимерный химерный рецепторный комплекс, клетка, экспрессирующая химерный рецептор или мультимерный химерный рецепторный комплекс, композиция, содержащая клетки, экспрессирующие химерный рецептор, или клетки, экспрессирующие мультимерный химерный рецепторный комплекс, и способ лечения, включающий введение таких клеток.

В некоторых вариантах осуществления предлагается химерный рецептор, содержащий (а) лигандсвязывающий домен; и (b) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (i) связанный с TNF-рецептором фактор 6 (TRAF-6)-индуцирующий домен, который способен индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6 и/или способен индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию; и (ii) активирующий цитоплазматический сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен содержит TRAF-6-связывающий домен или домен, способный связываться с молекулой, которая содержит TRAF-6-связывающий домен или который рекрутирует молекулу, содержащую TRAF-6-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, содержащую Pro-Xxa-Glu-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 26); и/или TRAF-6-связывающий домен не связывается специфично с молекулой TRAF, отличной от TRAF-6; и/или химерный рецептор не содержит связывающий домен, способный специфично связываться и/или рекрутировать молекулу, которая специфично связывается с любой другой молекулой TRAF, TRAF-1, TRAF-2, TRAF-3 и/или TRAF-5. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен представляет собой или содержит TRAF-6-индуцирующий домен молекулы, выбранной из группы, состоящей из членов семейства TNF-R, рецепторов цитокинов и Toll-подобных рецепторов (TLR) или представляет собой функциональный фрагмент или вариант TRAF-6-индуцирующего домена молекулы, выбранной из группы, состоящей из членов семейства TNF-R, рецепторов цитокинов и Toll-подобных рецепторов (TLR).

В некоторых вариантах осуществления, согласно любому из химерных рецепторов, описанных выше, молекула не содержит какого-либо другого TRAF-индуцирующего домена, полученного из молекулы; молекула не содержит TRAF-1-индуцирующего домена, полученного из молекулы; молекула не содержит какого-либо другого TRAF-2-индуцирующего домена, полученного из молекулы; молекула не содержит какого-либо другого TRAF-3-индуцирующего домена, полученного из молекулы; молекула не содержит какого-либо другого TRAF-4-индуцирующего домена, полученного из молекулы; молекула не содержит какого-либо другого TRAF-5-индуцирующего домена, полученного из молекулы; молекула не содержит домен молекулы, который способен индуцировать активацию или клеточную локализацию другого TRAF или TRAF-1, TRAF-2, TRAF-3 или TRAF-5, и/или молекула не содержит домен молекулы, который способен индуцировать сигнализацию через другой TRAF и/или TRAF-1, TRAF-2, TRAF-3 или TRAF-5.

В некоторых вариантах осуществления, согласно любому из описанных выше химерных рецепторов, TRAF-6-индуцирующий домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен молекулы суперсемейства рецептора фактора некроза опухоли (TNF) или является его функциональным вариантом или фрагментом; или TRAF-6-индуцирующий домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен молекулы семейства Toll/IL-1 или является его функциональным вариантом или фрагментом. В некоторых вариантах осуществления молекула выбрана из CD40, RANK и рецептора типа 1 интерлейкина-1 (IL1R1). В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен содержит последовательность аминокислот, выбранную из: (i) последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 12, 14 или 16; (ii) функционального варианта, содержащего последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12, 14 или 16; (iii) функционального варианта, содержащего последовательность аминокислот, которая имеет менее чем 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12 и по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12 или (iv) функционального фрагмента (i), (ii) или (iii). В некоторых вариантах осуществления функциональный вариант или функциональный фрагмент способен индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6 и/или способен индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию и/или содержит TRAF-6-связывающий домен или домен, способный связываться с молекулой, которая содержит TRAF-6-связывающий домен или которая рекрутирует молекулу, содержащую TRAF-6-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующая часть рекрутирует молекулу, содержащую TRAF-6-связывающий домен, и рекрутированная молекула представляет собой или содержит IRAK, и/или TRAF-6-индуцирующая часть содержит домен TIR, способный рекрутировать IRAK. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен не представляет собой или не содержит цитоплазматического сигнального домена CD40 или OX40 и/или не представляет собой или не содержит полного цитоплазматического домена CD40 или OX40, не представляет собой или не содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 12 (кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 34) или SEQ ID NO: 20 или 32 (кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 33), и/или не содержит TRAF-связывающий домен OX40 или CD40, отличный от TRAF-6-связывающего домена. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит по порядку от его N-конца к С-концу: лигандсвязывающий домен, (TRAF-6)-индуцирующий домен и активирующий цитоплазматический сигнальный домен.

В некоторых вариантах осуществления, согласно любому из химерных рецепторов, описанных выше, TRAF-6-индуцирующий домен содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1R1 или его функциональный вариант или его фрагмент, а при связывании лиганда химерный рецептор способен образовывать мультимерный комплекс со вторым химерным рецептором, содержащим вспомогательный сигнальный домен, причем мультимерный комплекс способен индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6 и/или способен индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию. В некоторых вариантах осуществления вспомогательный сигнальный домен содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1RAP или его функциональный вариант или фрагмент, достаточные для образования мультимерного комплекса с первым химерным рецептором. В некоторых вариантах осуществления мультимерный комплекс представляет собой гетеродимерный комплекс.

В некоторых вариантах осуществления предложен химерный рецептор, содержащий (а) лигандсвязывающий домен; и (b) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий: (i) TRAF-6-индуцирующий домен и вспомогательный сигнальный домен, причем при связывании лиганда TRAF-6-индуцирующий домен и вспомогательный сигнальный домен способны взаимодействовать с индукцией активации или клеточной локализации TRAF-6 и/или способны индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию; и (ii) активирующий цитоплазматический сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1R1 или его функциональный вариант или его фрагмент; и вспомогательный сигнальный домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1RAP или его функциональный вариант или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен и вспомогательный сигнальный домен связаны прямо или косвенно, в тандеме.

В некоторых вариантах осуществления, согласно любому из химерных рецепторов, описанных выше, активирующий цитоплазматический сигнальный домен, который способен индуцировать первичный активирующий сигнал в Т-клетке, представляет собой компонент Т-клеточного рецептора (TCR) и/или содержит мотив активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). В некоторых вариантах осуществления активирующий цитоплазматический сигнальный домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен цепи CD3-дзета (CD3ζ) или его функциональный вариант или сигнальную часть. В некоторых вариантах осуществления лигандсвязывающий домен представляет собой функциональный антигенный рецептор, отличный от TCR, или трансгенный TCR. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR), где лигандсвязывающий домен является антигенсвязывающим доменом. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой антитело или фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, который является одноцепочечным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления фрагмент содержит вариабельные области антитела, соединенные гибким линкером иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления фрагмент содержит scFv.

В некоторых вариантах осуществления, согласно любому из химерных рецепторов, описанных выше, лигандсвязывающий домен специфично связывается с антигеном, который ассоциирован с заболеванием или расстройством. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляют собой инфекционное заболевание или патологическое состояние, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание или опухоль или злокачественное новообразование; лигандсвязывающий домен специфично связывается с опухолевым антигеном; и/или лигандсвязывающий домен специфично связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из ROR1, антигена созревания В-клеток (BCMA), tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA, поверхностного антигена гепатита B, антитела фолатного рецептора, CD23, CD24, CD30, CDF3, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, erbB димеров, EGFR vIII, FBP, FCRL5, FCRH5, фетального рецептора ацетилхолина е, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-альфа, IL-13R-альфа2, kdr, легкой цепи каппа, Lewis Y, молекулы адгезии L1-клеток (L1-CAM), ассоциированного с меланомой антигена MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, предпочтительно экспрессированного антигена меланомы (PRAME), сурвивина, EGP2, EGP40, TAG72, B7-H6, рецептора IL-13 a2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, фолатного рецептора а, CD44v6, CD44v7/8, интегрина avb6, 8H9, NCAM, рецепторов VEGF, 5T4, фетального AchR, NKG2D-лигандов, CD44v6, двойного антигена и антигена, ассоциированного с универсальным маркером, антиген рака яичек, мезотелина, MU C1, MUC16, PSCA, NKG2D-лигандов, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкофетального антигена, ROR1, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбрионального антигена (CEA), простата-специфичного антигена, PSMA, Her2/neu, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфрина B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, O-ацетилированного GD2 (OGD2), MAGE A3, CE7, Опухоли Вильмса 1 (WT-1) и циклина A1 (CCNA1), циклина, циклина A2, CCL-1, CD138 и патогенспецифичного антигена. В некоторых из любых таких вариантов осуществления лигандсвязывающий домен специфично связывается с CD19.

В некоторых из любых таких вариантов осуществления химерный рецептор дополнительно содержит спейсер, соединяющий лигандсвязывающий домен и трансмембранный домен. В некоторых случаях спейсер получают из человеческого IgG. В некоторых примерах спейсер содержит аминокислотную последовательность ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 1). В некоторых случаях спейсер содержит внеклеточную часть из CD28, которая необязательно представляет собой человеческий CD28. В некоторых аспектах внеклеточная часть, полученная из CD28, содержит 1-50 аминокислот в длину, 1-40 аминокислот в длину, 1-30 аминокислот в длину, 1-20 аминокислот в длину или 1-10 аминокислот в длину.

В некоторых из любых таких вариантов осуществления спейсер и трансмембранный домен содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах осуществления, согласно любому из химерных рецепторов, описанных выше, химерный рецептор дополнительно содержит трансмембранный домен, связывающий лигандсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен связан с TRAF-6-индуцируемым доменом, в результате чего TRAF-6-индуцируемый домен находится между трансмембранным доменом и активирующим сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит трансмембранный домен молекулы, содержащей TRAF-6-индуцируемый домен или его функциональный фрагмент или вариант. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен или его функциональный фрагмент или вариант, выбранный из группы, состоящей из членов семейства TNF-R, рецепторов цитокинов и Toll-подобных рецепторов (TLR). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен и TRAF-6-индуцируемый домен являются одной и той же молекулой. В некоторых вариантах осуществления молекула выбрана из CD40, RANK и рецептора типа 1 интерлейкина-1 (IL1R1). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит последовательность аминокислот, выбранную из: (i) последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 11, 13 или 15; (ii) функционального варианта, содержащего последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 11, 13 или 15; (iii) функционального фрагмента (i) или (ii).

В некоторых вариантах осуществления, согласно любому из химерных рецепторов, описанных выше, внутриклеточный сигнальный домен дополнительно содержит (iii) костимулирующий сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен содержит цитоплазматический сигнальный домен костимулирующей молекулы Т-клетки или его функциональный вариант или сигнальную часть. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен содержит домен, индуцирующий фосфоинозитид-3-киназу ((PI3K)-индуцирующий домен). В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен содержит цитоплазматический сигнальный домен CD28, 4-1BB или молекулы ICOS или является функциональным вариантом его сигнальной части. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен находится между TRAF-6-индуцирующим доменом и активирующим сигнальным доменом; или TRAF-6-индуцирующий домен находится между костимулирующим сигнальным доменом и активирующим сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит трансмембранный домен костимулирующей молекулы.

В некоторых вариантах осуществления предложен мультимерный химерный рецепторный комплекс, содержащий (1) первый химерный рецептор, содержащий: (а) первый лигандсвязывающий домен; и (b) первый внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (i) TRAF-6-индуцирующий домен и (ii) активирующий цитоплазматический сигнальный домен; и (2) второй химерный рецептор, содержащий: (c) второй лигандсвязывающий домен, причем указанный второй лигандсвязывающий домен, способный связывать тот же лиганд, что и первый лигандсвязывающий домен; и (d) второй внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (iii) вспомогательный сигнальный домен, где при связывании лиганда TRAF-индуцирующий домен и вспомогательный сигнальный домен способны взаимодействовать с индуцированием активации или клеточной локализации TRAF-6 и/или способны индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1R1 или функциональный вариант его фрагмента; и вспомогательный сигнальный домен содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1RAP или его функциональный вариант или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления первый лигандсвязывающий домен и второй лигандсвязывающий домен являются одинаковыми или, по существу, одинаковыми.

В некоторых вариантах осуществления, согласно любому из мультимерных химерных рецепторных комплексов, описанных выше, второй химерный рецептор дополнительно содержит второй активирующий цитоплазматический сигнальный домен, который необязательно является таким же или по существу таким же, как первый активирующий цитоплазматический домен. В некоторых вариантах осуществления активирующий цитоплазматический сигнальный домен, который может быть первым и/или вторым активирующим цитоплазматическим сигнальным доменом, независимо представляет собой Т-клеточный рецептор (TCR) и/или содержит мотив активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). В некоторых вариантах осуществления активирующий цитоплазматический сигнальный домен, который может быть первым и/или вторым активирующим цитоплазматическим сигнальным доменом, независимо содержит цитоплазматический сигнальный домен цепи CD3-дзета (CD3ζ) или его сигнальную часть.

В некоторых вариантах осуществления, согласно любому из мультимерных химерных рецепторных комплексов, описанных выше, первый и/или второй химерный рецептор содержит костимулирующий сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен, который может быть первым и/или вторым костимулирующим сигнальным доменом, независимо содержит цитоплазматический сигнальный домен костимулирующей молекулы Т-клетки или его сигнальную часть. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен, который может быть первым и/или вторым костимулирующим сигнальным доменом, независимо содержит цитоплазматический сигнальный домен CD28, 4-1BB или ICOS или его сигнальную часть. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй лигандсвязывающий домен является функциональным антигенным рецептором, отличным от TCR, или трансгенным TCR.

В некоторых вариантах осуществления, согласно любому из мультимерных химерных рецепторных комплексов, описанных выше, первый и/или второй химерный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR), где первый и/или второй лигандсвязывающий домен является антигенсвязывающим доменом. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой антитело или фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, который является одноцепочечным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления фрагмент содержит вариабельные области антитела, соединенные гибким линкером иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления фрагмент содержит scFv.

В некоторых вариантах осуществления, согласно любому из мультимерных химерных рецепторных комплексов, описанных выше, первый и/или второй химерный рецептор дополнительно содержат трансмембранный домен, связывающий лигандсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен.

В некоторых вариантах осуществления предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный рецептор в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных выше. В некоторых из любых таких вариантов осуществления молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеотидов, кодирующую первый химерный рецептор, содержащий: (а) первый лигандсвязывающий домен; и (b) первый внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (i) TRAF-6-индуцирующий домен и (ii) активирующий цитоплазматический сигнальный домен; и/или последовательность нуклеотидов, кодирующую второй химерный рецептор, содержащий: (c) второй лигандсвязывающий домен, причем указанный второй лигандсвязывающий домен способен связываться с тем же лигандом, что и первый лигандсвязывающий домен; и (d) второй внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (iii) вспомогательный сигнальный домен.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой одиночный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеотидов, кодирующую первый химерный рецептор, и последовательность нуклеотидов, кодирующую второй химерный рецептор, и, необязательно, дополнительно содержит по меньшей мере один промотор, который функционально связан с контролем экспрессии первого химерного рецептора и/или второго химерного рецептора. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеотидов, кодирующая первый химерный рецептор, функционально связана с первым промотором, а последовательность нуклеотидов, кодирующая второй химерный рецептор, функционально связана со вторым промотором, причем первый и второй промоторы могут быть одинаковыми или разными; или первый химерный рецептор и второй химерный рецептор разделены сайтом внутренней посадки рибосомы (IRES), и первый и второй химерные рецепторы экспрессируются под контролем одного и того же промотора. В некоторых вариантах осуществления кодируемый первый химерный рецептор и/или кодируемый второй химерный рецептор являются первым и/или вторым химерным рецептором мультимерного комплекса в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления первый и второй полинуклеотиды разделены сайтом внутренней посадки рибосомы (IRES) или нуклеотидной последовательностью, кодирующей саморасщепляющийся пептид или пептид, который вызывает прыжок рибосомы, и который необязательно представляет собой T2A или P2A.

В некоторых вариантах осуществления предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных выше. В некоторых случаях вектор представляет собой экспрессирующий вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой ретровирусный вектор, который необязательно представляет собой лентивирусный вектор или гаммаретровирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор не кодирует модифицированную молекулу каспазы или индуцируемую молекулу каспазы, где молекула каспазы необязательно представляет собой модифицированную каспазу-9 или индуцируемую каспазу 9.

В некоторых вариантах осуществления предложена сконструированная клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты или вектор в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных выше, или экспрессирующая химерный рецептор в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка содержит первый химерный рецептор, содержащий: (а) первый лигандсвязывающий домен; и (b) первый внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (i) TRAF-6-индуцирующий домен и (ii) активирующий цитоплазматический сигнальный домен; и/или второй химерный рецептор, содержащий: (c) второй лигандсвязывающий домен, причем указанный второй лигандсвязывающий домен способен связывать тот же лиганд, что и первый лигандсвязывающий домен; и (d) второй внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (iii) вспомогательный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления первый химерный рецептор и/или второй химерный рецептор являются первым и/или вторым химерным рецептором мультимерного комплекса в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления клетка не экспрессирует модифицированную молекулу каспазы или индуцируемую молекулу каспазы, где молекула каспазы необязательно представляет собой модифицированную каспазу-9 или индуцируемую каспазу 9. В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка представляет собой Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления сконструированная Т-клетка представляет собой CD8+ Т-клетку.

Также предложен способ получения сконструированной клетки, включающий введение в клетку описанной молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, описанного выше, в результате чего получают сконструированную клетку. Также предложена сконструированная клетка, полученная способом, описанным выше.

В некоторых вариантах осуществления предложена композиция, содержащая сконструированную клетку в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных выше, и необязательно фармацевтически приемлемый буфер. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит сконструированную CD8+ клетку, экспрессирующую химерный рецептор в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных выше, или экспрессирующую первый и/или второй химерный рецептор мультимерного комплекса в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных выше; сконструированную CD4+ клетку, содержащую другой химерный рецептор, по сравнению с химерным рецептором, экспрессируемым в CD8+ клетке, причем другой химерный рецептор содержит другой костимулирующий сигнальный домен; и, необязательно, фармацевтически приемлемый буфер. В некоторых вариантах осуществления соотношение первой сконструированной клетки и второй сконструированной клетки равно или составляет примерно 1:1, 1:2, 2:1.

В некоторых вариантах осуществления единственное различие в химерном рецепторе, экспрессируемом в CD4+ клетке, по сравнению с CD8+ клеткой, представляет собой наличие другого костимулирующего сигнального домена. В некоторых вариантах осуществления другой костимулирующий сигнальный домен не содержит TRAF-6-индуцирующий домен, способный индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6 и/или способный индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию. В некоторых вариантах осуществления другой костимулирующий сигнальный домен представляет собой или содержит PI3K-индуцирующий домен, способный индуцировать активацию или клеточную локализацию фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и/или способный индуцировать сигнализацию PI3K/Akt. В некоторых вариантах осуществления другой костимулирующий сигнальный домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен молекулы CD28, 4-1BB или ICOS или представляет собой функциональный вариант его сигнальной части.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из композиций, описанных выше, при стимулировании с помощью стимулирующего агента или агентов in vitro, сконструированные клетки в композиции демонстрируют повышенную способность к пролиферации или наращиванию по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании с помощью того же стимулирующего агента или агентов. В некоторых вариантах осуществления, при стимулировании в присутствии стимулирующего агента или агентов in vitro, сконструированные клетки в композиции демонстрируют повышенное количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании тем же стимулирующим агентом или агентами. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD62L+. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются Т-клетками центральной памяти (Т_СМ), Т-клетками долговременной памяти или стволовыми Т-клетками памяти (T_SCM). В некоторых вариантах осуществления Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти дополнительно содержат фенотип, содержащий: а) CD127+; и/или b) любой один или более из CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ и CD27+ и любой один или более из t-bet^low, IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+.В некоторых вариантах осуществления Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD8+. В некоторых вариантах осуществления количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти, полученных из вводимых сконструированных клеток, содержат увеличение или больший процент Т-клеток центральной памяти (Т_СМ), Т-клеток долговременной памяти или стволовых Т-клеток памяти (T_SCM) по сравнению с эталонной композицией.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из композиций, описанных выше, при стимулировании с помощью стимулирующего агента или агентов in vitro сконструированные клетки в композиции демонстрируют повышенную жизнестойкость и/или выживаемость по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании с помощью того же стимулирующего агента или агентов. В некоторых вариантах осуществления стимулирующий агент или агенты включают антиген, антитело против CD3/CD28 и/или включают цитокин IL-2, IL-15 и/или IL-7. В некоторых вариантах осуществления увеличение наблюдается в течение 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней или 14 дней после начала стимулирования.

В некоторых вариантах осуществления предложен способ лечения, включающий введение сконструированной клетки в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных выше, пациенту, имеющему заболевание или патологическое состояние. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор специфично связывается с лигандом или антигеном, ассоциированным с заболеванием или патологическим состоянием. В некоторых вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование, опухоль, аутоиммунное заболевание или расстройство или инфекционное заболевание. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки в композиции демонстрируют повышенное или более продолжительное наращивание и/или жизнестойкость у пациента, в отличие от пациента, которому вводили такое же или примерно такое же количество дозы эталонной клеточной композиции. В некоторых вариантах осуществления существует увеличение или большее количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти и/или увеличенная или более длительная жизнестойкость Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти у пациента, полученных из введенных сконструированных клеток, по сравнению с количеством или жизнестойкостью Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти у пациента, полученных из эталонной клеточной композиции, вводимой в той же или примерно той же дозировке. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD62L+. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются Т-клетками центральной памяти (Т_СМ), Т-клетками долговременной памяти или стволовыми Т-клетками памяти (T_SCM). В некоторых вариантах осуществления Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти дополнительно содержат фенотип, содержащий: а) CD127+; и/или b) любой один или более из CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ и CD27+ и любой один или более из t-bet^low, IL-7Ra+, CD95+, IL-2R β+, CXCR3+ и LFA-1+. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD8+.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов лечения, описанных выше, количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти, полученных из вводимых генетически сконструированных клеток, содержит увеличение или больший процент Т-клеток центральной памяти (T_CM), Т-клеток долговременной памяти или стволовых Т-клеток памяти (T_SCM) по сравнению с количеством таких клеток, полученных из эталонной клеточной композиции, вводимой в той же или примерно той же дозировке. В некоторых вариантах осуществления существует увеличение или большее количество не-терминально дифференцированных Т-клеток у пациента, полученных из введенных генетически сконструированных Т-клеток, по сравнению с количеством не-терминально дифференцированных клеток у пациента, полученных из эталонной клеточной композиции, вводимой в том же или примерно том же количестве дозы. В некоторых вариантах осуществления клетки у пациента, полученные из введенных сконструированных клеток, демонстрируют увеличение активации или пролиферации при повторном стимулировании ex vivo в присутствии стимулирующего агента или агентов по сравнению с активацией или пролиферацией клеток у пациента, полученных из эталонной клеточной композиции, вводимой в той же или примерно той же дозировке при повторном стимулировании ex vivo в присутствии того же самого стимулирующего агента или агентов. В некоторых вариантах осуществления стимулирующий агент или агенты содержат антиген, антитело против CD3 /CD28 или содержит цитокин IL-2, IL-15 и/или IL-7.

В некоторых вариантах осуществления увеличение наблюдается в течение 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней или 14 дней после начала стимулирования. В некоторых вариантах осуществления увеличение является по меньшей мере 1,2-кратным, в 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным или 5-кратным. В некоторых вариантах осуществления существует уменьшенная или пониженная экспрессия маркера истощения в клетках у пациента, полученных из введенных сконструированных клеток, по сравнению с экспрессией маркера истощения в клетках у пациента, которому вводили такое же или примерно такое же количество дозы эталонной клеточной композиции. В некоторых вариантах осуществления маркер истощения выбран из CD244, CD160 и PD-1. В некоторых вариантах осуществления экспрессия уменьшается или снижается в 1,2 раза, в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз, в 10 раз или более. В некоторых вариантах осуществления увеличение или уменьшение наблюдается или присутствует в течение месяца, в течение двух месяцев, в течение шести месяцев или в течение одного года после введения клеток. В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из композиций, описанных выше, увеличение наблюдается при соотношении эффектора и мишени, составляющем более чем или более чем примерно или примерно 3:1, более чем или более чем примерно или примерно 5:1 или более чем или более чем примерно или примерно 9:1. В некоторых вариантах осуществления, в соответствии с любой из композиций, описанных выше, при стимулировании с помощью стимулирующего агента или агентов in vitro, генетически сконструированные клетки в композиции продуцируют больше IL-2 по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании тем же стимулирующим агентом или агентами. В некоторых вариантах осуществления, в соответствии с любой из описанных выше композиций или способов лечения, эталонная клеточная композиция содержит сконструированные клетки, которые являются по существу одинаковыми, за исключением того, что экспрессированный химерный рецептор содержит внутриклеточный сигнальный домен, полученный из отличной или другой костимулирующей молекулы сравнительного химерного рецептора. В некоторых вариантах осуществления эталонная клеточная композиция содержит сконструированные клетки, экспрессирующие химерный рецептор, содержащий внутриклеточный сигнальный домен, который не содержит TRAF-6-индуцирующий домен (например, полученный из CD4 сигнальный домен) и/или содержит сигнальный домен, полученный из костимулирующего сигнального домена, способного индуцировать сигнализацию PI3K/Akt и/или содержит костимулирующий домен CD28, 4-1BB или ICOS, например человеческого CD28, 4-1BB или ICOS. В некоторых вариантах осуществления эталонная клеточная композиция содержит сконструированные клетки, экспрессирующие химерный рецептор, содержащий внутриклеточный сигнальный домен, полученный из ICOS, например человеческого ICOS. В некоторых случаях другая костимулирующая молекула представляет собой другую костимулирующую молекулу, содержащую TRAF-6-индуцирующий домен, необязательно, внутриклеточный сигнальный домен, полученный из OX40.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из композиций, описанных выше, в анализе in vitro после множества раундов антигенспецифичного стимулирования Т-клетки из композиции демонстрируют или, как наблюдается, демонстрируют стойкий или повышенный уровень фактора, являющегося показателем функции, здоровья или активности Т-клеток по сравнению с эталонной композицией, содержащей популяцию Т-клеток, по сравнению с одним раундом стимулирования и/или по сравнению с уровнем в том же анализе при оценке после одного раунда стимулирования и/или нескольких раундов стимулирования, где несколько составляет менее чем множество.

В некоторых из любых таких вариантов осуществления эталонная клеточная композиция содержит генетически сконструированные клетки, которые являются по существу одинаковыми, за исключением экспрессированного химерного рецептора, включающего другую костимулирующую молекулу, которая не содержит внутриклеточный сигнальный домен, полученный из CD40.

В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из композиций, описанных выше, множество раундов стимулирования включает по меньшей мере 3, 4 или 5 раундов, и/или их проводят в течение по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 дней.

В некоторых из любых таких вариантов осуществления композиции, описанные выше, предназначены для применения при лечении заболевания или патологического состояния у пациента, имеющего болезнь или патологическое состояние. В некоторых из любых таких вариантов осуществления композиции, описанные выше, предназначены для лечения заболевания или патологического состояния у пациента, имеющего болезнь или патологическое состояние. В некоторых из любых таких вариантов осуществления также предложено применение любой из описанных выше композиций для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или патологического состояния у пациента, имеющего болезнь или патологическое состояние.

Также предложены любые из композиций, описанных выше, для любого из применений, описанных выше, где лигандсвязывающий рецептор специфично связывается с лигандом или антигеном, ассоциированным с заболеванием или патологическим состоянием. В некоторых из любых таких вариантов осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование, опухоль, аутоиммунное заболевание или расстройство или инфекционное заболевание.

В некоторых из любых таких вариантов осуществления лигандсвязывающий домен не связывается специфично с CD40L и/или не получен из CD40.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На ФИГ. 1 изображено уничтожение экспрессирующих CD19 клеток-мишеней (клетки K562-CD19) различными CD19-направленными CAR-T-клетками, каждая из которых имеет внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен CD3-дзета («z»), и либо 1) костимулирующий сигнальный домен, полученный из 41BB (41BBz, сплошной квадрат), 2) костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD28 (CD28z, темный треугольник), 3), костимулирующий сигнальный домен, полученный из ICOS (ICOSz, направленный вниз), 4) костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40 (CD40z, круг с контуром) или 5) костимулирующий сигнальный домен, полученный из OX40 (OX40z, квадрат с контуром). Индекс уничтожения рассчитывали с помощью 1/AUC кривых роста клеток-мишеней после совместного культивирования при соотношении CAR-T-клетки : клетки-мишени 9:1, 3:1 и 1:1. Также изображен индекс уничтожения контрольных лунок только с клетками-мишенями (только мишень, светлый треугольник) или с Т-клетками, не трансдуцированными CAR (пустой контроль, сплошной круг).

На ФИГ. 2А-D показано высвобождение цитокинов из супернатантов 4-го дня после инкубации клеток, экспрессирующих CAR, с антиген-экспрессирующими клетками-мишенями K562-CD19 при соотношениях E:T 1:1, 3:1 и 9:1. TNF-α (ФИГ. 2А), GM-CSF (ФИГ. 2B), IFNγ (ФИГ. 2C) и IL-2 (ФИГ. 2D). Тестируемые CAR-T-клетки содержали костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, костимулирующий сигнальный домен, полученный из OX40, костимулирующий сигнальный домен, полученный из ICOS, костимулирующий сигнальный домен, полученный из 4-1BB, или костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD28. Также изображено высвобождение цитокинов из Т-клеток, не трансдуцированных CAR (пустой контроль, сплошной круг)

На ФИГ. 3A-E показана экспрессия внутриклеточных цитокинов для различных цитокинов в подгруппах CD8+ T-клеток, экспрессирующих CAR, содержащих либо костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, либо костимулирующий сигнальный домен, полученный из OX40, костимулирующий сигнальный домен, полученный из ICOS, костимулирующий сигнальный домен, полученный из 4-1BB или костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD28, после стимулирования CAR-сконструированных Т-клеток либо с использованием клеток-мишеней CD19-K562 (черные), либо контрольных родительских клеток (светло-серый). Показана экспрессия внутриклеточных цитокинов для TNF-альфа и IFN-γ (внизу справа); IL-17A и Гранзима B (вверху справа); IL-13 и IL-22 (внизу слева); или IL-10 и IL-2 (вверху слева).

На ФИГ. 4А-Е показана экспрессия внутриклеточных цитокинов для различных цитокинов в подгруппах CD4+ T-клеток, экспрессирующих CAR, содержащий либо костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, костимулирующий сигнальный домен, полученный из OX40, костимулирующий сигнальный домен, полученный из ICOS, костимулирующий сигнальный домен, полученный из 4-1BB, или костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD28 после стимулирования CAR-сконструированных Т-клеток либо с использованием клеток-мишеней CD19-K562 (черный), либо контрольных родительских клеток (светло-серый). Показана экспрессия внутриклеточных цитокинов для TNF-альфа и IFN-γ (внизу справа); IL-17A и Гранзима B (вверху справа); IL-13 и IL-22 (внизу слева); или IL-10 и IL-2 (вверху слева).

На ФИГ. 5 показано количество удвоений количества клеток для анти-CD19 CAR-сконструированных клеток, экспрессирующих CAR, содержащий костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, OX40, ICOS, CD28, или 4-1BB, по сравнению с группой исследования пустого контроля после каждого раунда повторного стимулирования с использованием CD19-экспрессирующих клеток-мишеней в последовательном анализе стимулирования.

На ФИГ. 6А показана опухолевая нагрузка мышей, которым вводили CAR-сконструированные клетки, экспрессирующие CAR, содержащий либо костимулирующий сигнальный домен CD40, OX40, ICOS, CD28, или 4-1BB, по сравнению с группой исследования только опухоли, и группой исследования пустого контроля в мышиной модели с ксенотрансплантацией диссеминированной опухоли. Опухолевую нагрузку оценивали путем измерения средней энергетической яркости (импульс/с/см²/ср) у мышей.

На ФИГ. 6В показана выживаемость мышей, которым вводили CAR-сконструированные клетки, экспрессирующие CAR, содержащий костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, OX40, ICOS, CD28, или 4-1BB, по сравнению с группой исследования только опухоли и группой исследования пустого контроля в мышиной модели ксенотрансплантации диссеминированной опухоли.

На ФИГ. 7А-С показано количество опухолевых клеток в крови, селезенке и костном мозге у мышей на 28-й день после введения CAR-сконструированных клеток, экспрессирующих CAR, содержащий костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, OX40, ICOS, CD28 или 4-1BB, по сравнению с группой исследования пустого контроля.

На ФИГ. 7D-E показано абсолютное количество EGFRt+ CAR-T-клеток на 28-й день после переноса CAR-T-клеток в костный мозг мышей, которым вводили CAR-сконструированные клетки, экспрессирующие CAR, содержащий костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, OX40, ICOS, CD28 или 4-1BB, по сравнению с группой исследования пустого контроля.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не указано иное, все термины данной области техники, обозначения и другие технические и научные термины или терминология, используемые в настоящем описании, имеют тот же смысл, который обычно понимается специалистом в данной области, к которой относится заявленный объект изобретения. В некоторых случаях термины с общепринятыми значениями определены в настоящем описании для ясности и/или для готовой ссылки, и включение таких определений в настоящем описании необязательно должно толковаться как существенное отличие от того, что обычно понимается в данной области техники.

Все публикации, в том числе патентные документы, научные статьи и базы данных, упомянутые в настоящей заявке, включены посредством ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была индивидуально включена посредством ссылки. Если определение, изложенное в настоящем описании, противоречит или иным образом не согласуется с определением, изложенным в патентах, заявках, опубликованных заявках, и других публикациях, которые включены в настоящее описание посредством ссылки, то определение, изложенное в настоящем описании, превалирует над определением, которое включено сюда посредством ссылки.

Заголовки разделов, используемые в настоящем описании, предназначены только для организационных целей и не должны истолковываться как ограничивающие описываемый объект изобретения.

I. Обзор

В настоящем описании предложены рекомбинантные рецепторы, включающие химерные рецепторы, например, химерные антигенные рецепторы, которые включают внутриклеточный сигнальный домен, который содержит TRAF-индуцирующий сигнальный домен, который способен индуцировать активацию или клеточную локализацию молекулы TRAF и/или способен индуцировать TRAF-опосредованную сигнализацию. В некоторых вариантах осуществления TRAF-индуцирующий сигнальный домен получен из цитоплазматического сигнального домена сигнальной молекулы клетки, такой как сигнальная молекула Т-клетки, например, костимулирующая молекула или рецептор цитокина. В некоторых вариантах осуществления TRAF-индуцирующий сигнальный домен представляет собой TRAF-6-индуцирующий сигнальный домен, который способен индуцировать активацию или клеточную локализацию молекулы TRAF-6 и/или способен индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию и/или прямо или косвенно активирует один или более медиаторов нисходящей сигнализации. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен представляет собой или получен из цитоплазматического сигнального домена члена суперсемейства TNF-рецептора или члена семейства IL-1 или Toll, который способен индуцировать или который индуцирует активацию или клеточную локализацию молекулы TRAF-6 и/или способен индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию и/или активирует один или более медиаторов нисходящей сигнализации. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен представляет собой или получен из CD40, RANK или IL-1R.

В некоторых вариантах осуществления TRAF-индуцирующий домен представлен в виде части химерного рецептора, такого как химерный антигенный рецептор, который также объединяет лигандсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела), который обеспечивает специфичность для целевого антигена (например, опухолевого антигена), с активирующей частью внутриклеточного домена, такого как активирующий домен Т-клеток, обеспечивая первичный активирующий сигнал. В некоторых вариантах осуществления предложенные химерные рецепторы при генетическом конструировании в иммунных клетках могут модулировать активность Т-клеток и, в некоторых случаях, могут модулировать дифференцировку или гомеостаз Т-клеток, тем самым приводя к созданию генетически сконструированных клеток с повышенной продолжительностью жизни, выживаемостью и/или жизнестойкостью in vivo, например, для использования в методах адоптивной клеточной терапии.

Адоптивная клеточная терапия (в том числе включая введения клеток, экспрессирующих химерные рецепторы, специфичные для интересующего заболевания или расстройства, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR) и/или другие рекомбинантные антигенные рецепторы, а также другие адаптивные иммунноклеточные и адоптивные Т-клеточные терапии) может быть эффективной при лечении злокачественного новообразования и других заболеваний и расстройств. В определенных контекстах доступные подходы адоптивной клеточной терапии не всегда могут быть полностью удовлетворительными. В некоторых контекстах оптимальная эффективность может зависеть от способности вводимых клеток распознавать и связываться с мишенью, например целевым антигеном, транспортироваться, локализоваться и успешно вводиться в соответствующие сайты в организме пациента, в опухоли и их окружение, чтобы активироваться, наращиваться, выполнять различные эффекторные функции, включая цитотоксическое уничтожение и секрецию различных факторов, таких как цитокины, для выживания, включая продолжительность выживания, для дифференцировки, перехода или участия в перепрограммировании в определенные фенотипические состояния (такие как эффекторные, долговременная память, менее дифференцированные и эффекторные состояния), чтобы обеспечить эффективные и надежные ответы после клиренса и повторного воздействия целевого лиганда или антигена и чтобы избежать или уменьшить истощение, анергию, терминальную дифференцировку и/или дифференцировку в супрессивное состояние.

В некоторых случаях методы адоптивной терапии не являются полностью удовлетворительными во всех этих аспектах. Например, в некоторых случаях существующие химерные рецепторы (например, CAR), которые включают те, которые включают костимулирующие сигнальные домены молекул, таких как CD28 или 4-1BB, могут быть связаны с отсутствием жизнестойкости. Хотя клетки, генетически сконструированные с помощью химерных рецепторов (например, CAR), включающие такие костимулирующие сигнальные домены, как полученные из CD28 или 4-IBB, могут способствовать устойчивой пролиферации Т-клеток или ответам, включающим уничтожение клеток-мишеней и продуцирование цитокинов, они также могут приводить к слишком сильному сигналу, что в конечном итоге приводит к истощению Т-клеток и/или отсутствию жизнестойкости генетически модифицированных клеток. Например, в некоторых случаях определенные клеточные сигнальные пути, такие как путь PI3K/Akt, индуцированный костимулирующими сигнальными доменами CD28 и другими костимулирующими молекулами, могут приводить к изменению дифференцировки или состояния активации T-клеток, которые могут приводить и/или приводят к уменьшенной жизнестойкости in vivo, когда генетически сконструированные клетки вводят пациенту. Среди изменений в состоянии дифференцировки, которые могут произойти, включают, в некоторых случаях, потерю наивного фенотипа, потерю фенотипов Т-клеток памяти и/или стимулирование истощения или анергии, тем самым генерируя эффекторные клетки с истощенным фенотипом Т-клеток. Истощение Т-клеток может приводить к прогрессирующей потере функций Т-клеток и/или к истощению клеток (Yi et al. (2010) Immunology, 129:474-481). Истощение Т-клеток и/или отсутствие жизнестойкости Т-клеток являются препятствием для эффективности и терапевтических результатов адоптивной клеточной терапии; клинические испытания выявили корреляцию между большей и/или более высокой степенью воздействия на клетки, экспрессирующие антигенные рецепторы (например, CAR), и на результаты лечения.

Таким образом, в то время как использование определенных костимулирующих сигнальных доменов (например, костимулирующих сигнальных доменов PI-3-киназы и/или цитоплазматических костимулирующих сигнальных доменов CD28 или 4-1BB), включенных в химерные рецепторы (например, CAR), экспрессированные в генетически сконструированных Т-клетках, может способствовать их эффекторной функции, которая может не быть оптимально долгосрочной из-за ухудшения способности сконструированных клеток к долгосрочному выживанию в компартменте памяти и/или к дифференцировке в подгруппу клеток памяти, которые могут иметь важное значение для долгосрочного воздействия и противоопухолевой эффективности. В некоторых случаях такие события могут способствовать созданию генетически сконструированных (например, CAR+) Т-клеток, приобретающих истощенный фенотип после связывания антиген-антигенный рецептор, что, в свою очередь, может приводить к снижению функциональности. В некоторых случаях это может уменьшить количество или процент этих клеток с фенотипом памяти или центральной памяти с течением времени, например, приводя к уменьшению компартмента Т-клеток долговременной памяти и/или центральной памяти, как например компартмента центральной памяти (например, CD8+ Т-клеток долговременной памяти и/или CD8+ Т-клеток центральной памяти) и/или уменьшает потенциал этих клеток для долгосрочного выживания.

Предложенные химерные рецепторы и клетки, содержащие такие химерные рецепторы, могут обладать преимуществами по сравнению с клетками, сконструированными с использованием таких других существующих химерных рецепторов, благодаря наличию альтернативных сигнальных доменов, которые индуцируют сигнализацию от других клеточных путей. В частности, предложенные химерные рецепторы включают сигнальные модальности из семейства сигнальных белков TRAF, таких как TRAF-6. TRAF или «факторы, связанные с рецептором фактора некроза опухоли», являются сигнальными адапторами, которые координируют или соединяются с определенными молекулами клеточной поверхности, чтобы индуцировать или опосредовать внутриклеточную сигнализацию. В частности, TRAF-6 представляет собой белок TRAF, который способен передавать сигналы от рецепторов суперсемейства рецепторов TNF и семейства рецепторов IL-1/Toll-пододбных рецепторов и тем самым опосредовать внутриклеточную сигнализацию в иммунных клетках, из которых такие рецепторы экспрессируются. В некоторых вариантах осуществления связывание лиганда с такими рецепторами индуцирует конформационные изменения в рецепторе, включающие, в некоторых случаях, олигомеризацию рецептора, которая может делать рецепторы компетентными для сигнализации путем рекрутинга TRAF, например TRAF-6, который затем может активировать внутриклеточные сигнальные пути. В некоторых вариантах осуществления рекрутированные или активированные TRAF, например TRAF-6, могут приводить к образованию димеров или тримеров TRAF и/или приводят к локализации TRAF на клеточной мембране. В некоторых вариантах осуществления рекрутинг и/или активация TRAF-6 при связывании лиганда может приводить к активации киназ IκB (IKK) и MAP и, в некоторых случаях, к активации семейства тирозинкиназ Src, приводя к активации Akt киназы. Иллюстративные медиаторы или игроки, участвующие в нисходящей сигнализации TRAF-6, могут включать MAP3K TAK1, TAB2, IRAK, ECSIT, Pellinio.

В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-опосредованная сигнализация ассоциирована с гомеостазом иммунной клетки и дифференцировкой Т-клеток и, в некоторых случаях, может действовать в качестве отрицательного регулятора сильных антигенных сигналов, которые в противном случае могут привести к терминальной дифференцировке. Например, имеется присутствие гиперактивированных CD4+ Т-клеток у мышей Traf6 -/-, и TRAF6, как было обнаружено, быстро подвергается положительной регуляции в активированных Т-клетках, тем самым указывая на роль TRAF6 в поддержании иммунного гомеостаза (King et al. (2006) Nature Medicine, 12:1088). Было также отмечено, что TRAF6 регулирует развитие жизнестойких долгоживущих Т-клеток памяти, поскольку делеция TRAF6 в CD8+ T-клетках подвергает риску генерацию Т-клеток долговременной памяти без влияния на ответы эффекторных Т-клеток (Pearce et al. (2009) Nature, 40:103-107). Таким образом, эти результаты демонстрируют, что включение TRAF-6-опосредованного сигнального домена в химерный рецептор может проявлять сигналы, которые искажают или способствуют перепрограммированию памяти, тем самым приводя к генерации клеток долговременной памяти, в которых экспрессируются такие химерные рецепторы.

В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированные клетки с использованием предложенных TRAF-6-индуцирующих химерных рецепторов, могут приводить к популяциям компартментов Т-клеток долговременной памяти и Т-клеток центральной памяти (например, CD8+ Т-клеток долговременной памяти и/или CD8+ Т-клеток центральной памяти) и/или увеличивает потенциал этих клеток для выживания в течение длительного времени. В некоторых случаях срок жизни, дифференцировка и жизнестойкость Т-клеток памяти (например, Т-клеток долговременной и/или центральной памяти) со временем были бы полезны для повышения терапевтической эффективности клеток, сконструированных с помощью химерных рецепторов, например CAR-сконструированных T-клеток.

В некоторых вариантах осуществления предложенные химерные рецепторы могут быть экспрессированы в клетках для продуцирования генетически сконструированных Т-клеток, которые при введении пациенту демонстрируют одно или более свойств, которые улучшены по сравнению с эталонной клеточной композицией. В некоторых случаях одно или более свойств вводимых генетически сконструированных клеток, которое может быть улучшено или увеличено или становится выше по сравнению с введением эталонной клеточной композиции, включают увеличенное или более продолжительное наращивание и/или жизнестойкость таких вводимых клеток у пациента, увеличение или большее количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти (например, центральной памяти, долговременной памяти или стволовые Т-клетки памяти), увеличение или более продолжительная жизнестойкость Т-клеток памяти или Т-клеток памяти пациента (например, центральной памяти, долговременной памяти или стволовых Т-клеток памяти), увеличение или большее количество не-терминально дифференцированных Т-клеток, увеличенный или больший вторичный ответ на повторное стимулирование антигеном или уменьшенная или более низкая экспрессии маркера истощения. В некоторых вариантах осуществления увеличение или уменьшение может быть по меньшей мере 1,2-кратным, по меньшей мере в 1,5-кратным, по меньшей мере 2-кратным, по меньшей мере 3-кратным, по меньшей мере 4-кратным, по меньшей мере 5-кратным, по меньшей мере 6-кратным, по меньшей мере 7-кратным, по меньшей мере 8-кратным, по меньшей мере 9-кратным или по меньшей мере 10-кратным увеличением или уменьшением такого свойства или признака по сравнению с тем же свойством или признаком при введении эталонной клеточной композиции. В некоторых вариантах осуществления увеличение или уменьшение одного или нескольких таких свойств или признаков может наблюдаться или присутствует в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев или 12 месяцев после введения генетически сконструированных клеток.

В некоторых вариантах осуществления предложенные химерные рецепторы, которые включают TRAF-6-индуцирующие химерные рецепторы, способные индуцировать TRAF-6-опосредующую сигнализацию, способны индуцировать сигнализацию в иммунных клетках, в которых они экспрессируются, что приводит к искажению или перепрограммированию таких иммунных клеток до менее дифференцированного или не-терминально дифференцированного фенотипа, тем самым производя или генерируя большой процент или количество Т-клеток памяти. В некоторых вариантах осуществления такое перепрограммирование или искажение приводит к получению клеток, проявляющих снижение или уменьшение маркеров истощения, так что генетически сконструированные Т-клетки отвечают на повторное стимулирование антигеном. В некоторых вариантах осуществления эти признаки предлагаемых химерных рецепторов и генетически сконструированных клеток, содержащих такие химерные рецепторы, могут приводить к долговременной жизнестойкости генетически сконструированных иммунных клеток, например, для использования в адоптивной клеточной терапии.

В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие предлагаемые химерные антигенные рецепторы, содержащие TRAF-6-индуцирующий внутриклеточный домен, например внутриклеточный домен, полученный из CD40, отвечают на стимулирование антигеном. В некоторых вариантах осуществления ответ на повторное стимулирование антигеном можно наблюдать в анализе последовательного стимулирования in vitro. Способность клеток наращиваться ex vivo после повторных стимулирований в некоторых аспектах может указывать на способность CAR-T-клеток выживать (например, после начальной активации) и/или указывать на функцию in vivo (Zhao et al. (2015) Cancer Cell, 28: 415-28). В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие предлагаемые химерные антигенные рецепторы, содержащие TRAF-6-индуцирующий внутриклеточный домен, например внутриклеточный домен, полученный из CD40, проявляют устойчивый или повышенный уровень фактора, показателя функции, здоровья или активности Т-клеток после множества раундов антигенспецифичного стимулирования. В некоторых вариантах осуществления увеличение или поддержание уровня фактора, показателя активности или функции Т-клеток представляет собой или включает степень наращивания клеток, выживаемость клеток, антигенспецифичную цитотоксичность и/или секрецию цитокинов. В некоторых вариантах осуществления такое увеличение или поддержание уровня фактора, являющегося показателем активности Т-клеток, наблюдается после множества раундов антигенспецифичного стимулирования, как например после по меньшей мере 3, 4 или 5 раундов и/или которое проводится в течение периода по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 дней. В некоторых вариантах осуществления уровень фактора активности или функции Т-клеток увеличивается по сравнению с эталонной клеточной композицией, такой как любая описанная. В некоторых вариантах осуществления фактор, являющийся показателем активности или функции Т-клеток, представляет собой устойчивый или повышенный уровень по сравнению с уровнем в том же анализе при оценке после одного раунда стимулирования и/или после нескольких раундов стимулирования, которых менее чем множество. В некоторых вариантах осуществления уровень фактора не уменьшается по сравнению с эталонной популяцией или уровнем в том же анализе при оценке после одного раунда стимулирования и/или после нескольких раундов стимулирования, которых менее чем множество.

Эталонная клеточная композиция может представлять собой композицию Т-клеток или клеток, полученных, выделенных, сгенерированных, продуцированных и/или инкубированных при одинаковых или по существу одинаковых условиях, за исключением того, что Т-клетки или популяция Т-клеток экспрессируют другой химерный рецептор, который отличается от сравнительного химерного рецептора и/или содержит внутриклеточный сигнальный домен, содержащий отличный TRAF-6-индуцирующий домен сравнительных генетически сконструированных клеток. В некоторых вариантах осуществления эталонная клеточная композиция содержит генетически сконструированные клетки, которые по существу одинаковы, за исключением того, что экспрессированный химерный рецептор содержит внутриклеточный сигнальный домен, содержащий часть, полученную из другой костимулирующей молекулы, которая не содержит TRAF-6-индуцирующий домен и/или содержит костимулирующий сигнальный домен, способный индуцировать PI3K/Akt-сигнализацию и/или содержащий костимулирующий домен CD28, 4-1BB или ICOS, например, человеческий или имеющий человеческое происхождение. В некоторых вариантах осуществления эталонная клеточная композиция содержит генетически сконструированные клетки, содержащие химерный рецептор, содержащий внутриклеточный сигнальный домен, полученный из OX40, например человеческого OX40. В некоторых вариантах осуществления эталонная клеточная композиция содержит генетически сконструированные клетки, содержащие химерный рецептор, содержащий внутриклеточный сигнальный домен, полученный из ICOS, например человеческого ICOS. В некоторых таких вариантах осуществления единственное различие или, по существу, единственное различие в химерном рецепторе эталонной композиции включает в себя другой костимулирующий сигнальный домен по сравнению с химерным рецептором сравнительных клеток.

В некоторых аспектах эталонная клеточная композиция, за исключением введения другого химерного рецептора, такие клетки или Т-клетки обрабатываются идентично или по существу идентично как Т-клетки или клетки, которым был введен TRAF-6-индуцирующий химерный рецептор, таким образом что любое одно или более условий, которые могут влиять на активность или свойства клетки, не изменяются или по существу не изменяются между клетками. Например, химерный рецептор, экспрессируемый клетками эталонной клеточной композиции, содержит тот же антигенсвязывающий домен (например, scFv), те же активирующие цитоплазматические сигнальные домены, но может содержать альтернативный или другой костимулирующий сигнальный домен. Кроме того, количество дозы эталонной клеточной композиции, которое вводят пациенту, составляет примерно одинаковое или одинаковое или является относительным количеством по сравнению с количеством дозы вводимых клеток в сравнительной композиции.

В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие предлагаемый химерный рецептор (например, содержащий внутриклеточный сигнальный домен CD40), или подгруппа таких клеток, проявляют один или более факторов, являющихся показателями функции, здоровья или активности Т-клеток, которые являются одинаковыми или по существу одинаковыми, как в клетках, экспрессирующих химерный рецептор, содержащий костимулирующий сигнальный домен, способный индуцировать PI3K/Akt сигнализацию, такой как химерный рецептор, содержащий костимулирующий домен, полученный из CD28 или 4-1BB. В некоторых случаях такой фактор представляет собой или содержит степень наращивания клеток, выживаемость клеток, антигенспецифичную цитотоксичность и/или секрецию цитокинов. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированные Т-клетки являются CD3+ Т-клетками или содержат CD4+ или CD8+ Т-клетки.

В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие предлагаемый химерный рецептор (например, содержащий внутриклеточный сигнальный домен CD40), являются CD8+клетками, и такие клетки проявляют один или несколько факторов, являющихся показателями функции, здоровья или активности Т-клеток, которые улучшены или составляют больше, чем у аналогичных CD8+ клеток, экспрессирующих химерный рецептор, содержащий костимулирующий сигнальный домен, способный индуцировать PI3K/Akt сигнализацию, например химерный рецептор, содержащий костимулирующий домен, полученный из CD28 или 4-1BB. В некоторых случаях такой фактор представляет собой или включает степень наращивания клеток, выживаемость клеток, антигенспецифичную цитотоксичность и/или секрецию цитокинов.

В некоторых вариантах осуществления предложенные химерные рецепторы могут быть экспрессированы в клетках для продуцирования генетически сконструированных Т-клеток, которые при введении пациенту проявляют повышенную жизнестойкость и/или уменьшенное истощения Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления такие генетически сконструированные клетки, экспрессирующие предложенный химерный рецептор, например содержащий внутриклеточный сигнальный домен CD40, являются CD8+ Т-клетками или содержат CD8+ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления такая генетически сконструированная клетка с повышенной жизнестойкостью и/или уменьшенным истощением может проявлять лучшую эффективность или длительную или более долговременную активность у пациента, которому ее вводят. В некоторых вариантах осуществления жизнестойкость генетически сконструированных клеток, таких как CAR-экспрессирующие Т-клетки, у пациента при введении будет больше по сравнению с теми показателями, которых можно было бы достичь с помощью альтернативных способов, таких как способы, включающие введение описанной эталонной клеточной композиции. В некоторых вариантах осуществления жизнестойкость увеличивается по меньшей мере или примерно по меньшей мере в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 30 раз, в 50 раз, в 60 раз, в 70 раз, в 80 раз, в 90 раз, в 100 раз или более.

В некоторых вариантах осуществления степень или величина жизнестойкости вводимых клеток может быть детектирована или детектируется количественно после введения пациенту. Например, в некоторых аспектах количественная ПЦР (кПЦР)) используется для оценки количества клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR-экспрессирующие клетки) в крови или сыворотке или органе или ткани (например, участок заболевания) пациента. В некоторых аспектах жизнестойкость количественно определяется как копии ДНК или плазмиды, кодирующей рецептор, например CAR, на микрограмм ДНК или как число клеток, экспрессирующих рецептор, например, CAR-экспрессирующих клеток на микролитр образца, например, крови или сыворотки или общее количество мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или лейкоцитов или Т-клеток на микролитр образца. В некоторых вариантах осуществления могут быть выполнены проточные цитометрические анализы, детектирующие клетки, экспрессирующие рецептор, обычно с использованием антител, специфичных для рецепторов. Клеточные анализы также могут быть использованы для детектирования количества или процента функциональных клеток, таких как клетки, способные связываться и/или нейтрализовать и/или индуцировать ответы, например цитотоксические ответы, против клеток заболевания или патологического состояния, или экспрессировать антиген, распознаваемый рецептором. В любом из таких вариантов осуществления степень или уровень экспрессии другого маркера, ассоциированного с рекомбинантным рецептором (например, CAR-экспрессирующие клетки), можно использовать для того, чтобы отличать вводимые клетки от эндогенных клеток у пациента.

В некоторых вариантах осуществления предложенные химерные рецепторы могут быть экспрессированы в клетках для продуцирования генетически сконструированных Т-клеток, которые при введении пациенту проявляют уменьшенную экспрессию одного или более маркеров истощения. В некоторых вариантах осуществления маркер истощения может представлять собой CD244, CD160 или PD-1.

В некоторых вариантах осуществления предлагаемые химерные рецепторы могут быть экспрессированы в клетках для продуцирования генетически сконструированных Т-клеток, которые при введении пациенту проявляют измененный профиль экспрессии маркера поверхности по сравнению с эталонной клеточной композицией. В некоторых вариантах осуществления измененный профиль экспрессии поверхностных маркеров обусловлен изменением количества или процента одной или более подгрупп Т-клеток, которые являются положительными, отрицательными или с низким содержанием для одного или нескольких поверхностных маркеров, выбранных из CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69, CCR7, CD27, CD28, CD122, t-bet, IL-7Rα, CD95, IL-2Rβ, CXCR3, LFA-1 и KLRG1. В некоторых вариантах осуществления существует увеличение в подгруппе Т-клеток из введенных генетически сконструированных клеток, которые являются положительными по CD62L и/или IL-7Rα (CD127) и/или отрицательным или имеют низкое содержание t-bet. В некоторых вариантах осуществления наблюдается увеличение в подгруппе Т-клеток из введенных генетически сконструированных клеток, которые являются положительными по CD45RA и/или отрицательными по CD45RO или с низким содержанием CD45RO. В некоторых вариантах осуществления существует увеличение в подгруппе Т-клеток из введенных генетически сконструированных клеток Т-клеток, которые являются положительными по одному или более из CCR7, CD45RA, CD62L, CD27, CD28, IL-7Rα (CD127), CD95, IL-2Rβ, CXCR3 и LFA-1 и/или отрицательными по CD45RO. В некоторых вариантах осуществления существует увеличение в подгруппе Т-клеток из введенных генетически сконструированных клеток, которые являются CD62L+, и a) по любому одному или более из CD45RA^low/+, CD45RO ^low/+, CCR7+ и CD27+ и b) по любому одному или более из t-bet^low, IL-7Rα+ (CD127+), CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+. В некоторых вариантах осуществления количество или процент подгруппы Т-клеток увеличивается по меньшей мере примерно в 2 раза (например, по меньшей мере примерно в любое количество раз из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или более) по сравнению с количеством или процентом подгруппы Т-клеток, возникающих в результате введения эталонной композиции пациенту. В некоторых вариантах осуществления увеличение наблюдается в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев или 12 месяцев после введения.

В некоторых вариантах осуществления подгруппа Т-клеток, такая как подгруппа CD62L+Т-клеток, которая увеличивается у пациентов при введении генетически сконструированных клеток, имеет или включает или разделяет фенотипические характеристики с Т-клетками памяти или их конкретными подгруппами, такими как Т-клетки долговременной памяти. В некоторых вариантах осуществления такие Т-клетки памяти представляют собой Т-клетки центральной памяти (Т_СМ) или стволовые Т-клетки памяти (T_SCM). В некоторых вариантах осуществления Т-клетки памяти являются клетками T_SCM. Клетки T_SCM могут быть описаны как имеющие одно или более фенотипических различий или функциональных признаков по сравнению с другими подгруппами Т-клеток памяти или по сравнению с наивными Т-клетками, такими как менее дифференцированные или более наивные (см., например, Ahlers and Belyakov (2010) Blood, 115:1678 г.); Cieri et al. (2015) Blood, 125:2865; Flynn et al. (2014) Clinical & Translational Immunology, 3, e20; Gattinoni et al. (2012) Nat. Med., 17:1290-1297; Gattinoni et al. (2012) Nat. Reviews, 12:671; Li et al. (2013) PLOS ONE, 8:e67401; и опубликованная PCT Appl. No. WO2014/039044). В некоторых случаях клетки T_SCM считаются единственными Т-клетками памяти, способными генерировать эффекторные Т-клетки и все три подгруппы Т-клеток памяти (T_SCM, T_CM и T_EM). В некоторых аспектах клетки T_SCM имеют самую высокую выживаемость и ответ пролиферации на антигенные или гомеостатические стимулы всех подгрупп T-клеток памяти и наименее истощенный отсутствующий распознаваемый антиген. В некоторых вариантах осуществления менее дифференцированные клетки T_SCM могут демонстрировать большее наращивание, долгосрочную жизнеспособность и разрушение клеток-мишеней после адоптивного переноса, чем другие Т-клетки памяти, и, таким образом, могут быть способны опосредовать более эффективное лечение с меньшим количеством переносимых клеток, чем было бы возможно для клеток T_CM или клеток Т_ЕМ.

В некоторых аспектах примеры фенотипических или функциональных признаков, которые были зарегистрированы или известны для T_SCM-клеток, включают, например, такие клетки, которые а) CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+, CD27+, CD28+, IL-7Rα+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+; b) представляют собой CD45RA+, CCR7+, CD62L+ и CD95+; c) представляют собой CD45RA+, CD45RO+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+ и IL-2Rβ+; d) представляют собой CD45RO-, CD45RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD127+ и CD95+; e) представляют собой CD45RA+, CD44+/-, CD62L+, CD127+, IL-2Rβ+, CD28+, CD43-, KLRG1-, Пефорин- и ГранзимВ-; f) экспрессируют на высоком уровне CCR7, CD62L, CD27 и CD28, на среднем уровне CD95 и IL-2Rβ, на низком уровне CD45RA и не экспрессируют CD45RO или KLRG-1; или g) экспрессируют на высоком уровне CD62L, на низком уровне CD44 и t-bet и являются Sca-1+; и/или обладают средней способностью продуцировать IL-2, низкой способностью генерировать IFNγ, низкой цитотоксичностью и высокой способностью к самообновлению.

В уровне техники известны способы и методы оценки экспрессии и/или уровней маркеров Т-клеток. Антитела и реагенты для детектирования таких маркеров хорошо известны в данной области и легко доступны. Анализы и способы детектирования таких маркеров включают, но не ограничиваются ими, проточную цитометрию, включая внутриклеточную проточную цитометрию, ИФА, ELISPOT, метод CBA или другие мультиплексные методы, Вестерн-блот и другие методы на основе иммуноаффинности. В некоторых вариантах осуществления оценка поверхностной экспрессии маркеров на Т-клетках включает в себя детектирование введенных клеток, экспрессирующих антигенный рецептор (например, CAR) у пациента после введения. В пределах уровня квалификации специалиста детектировать клетки, экспрессирующие антигенный рецептор (например, CAR), у пациента и оценить уровень поверхностного маркера. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие антигенный рецептор (например, CAR), такие как клетки, полученные из периферической крови пациента, могут быть детектированы проточной цитометрией или другим методом на основе иммуноаффинности для экспрессии маркера, уникального для таких клеток, а затем такие клетки могут быть совместно окрашены для другого поверхностного маркера или маркеров Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки, экспрессирующие антигенный рецептор (например, CAR), также могут быть сгенерированы для экспрессии укороченного EGFR (EGFRt) в качестве неиммуногенного эпитопа селекции (например, путем введения конструкта, кодирующего CAR и EGFRt, разделенных рибосомным переключателем T2A для экспрессии двух белков из одного конструкта), который затем может использоваться в качестве маркера для детектирования таких клеток (см., например, патент США №8802374).

Также предложены способы и применения клеток, как например, в адоптивной терапии при лечении злокачественных новообразований. Также предложены способы для конструирования, приготовления и получения клеток, композиций, содержащих клетки, и наборы и устройства для применения, получения и введения клеток. Также предложены способы, соединения и композиции для получения сконструированных клеток. Предлагаются нуклеиновые кислоты, такие как конструкты, например, вирусные векторы, кодирующие генетически сконструированные антигенные рецепторы, и способы введения таких нуклеиновых кислот в клетки, такие как трансдукция. Также предложены композиции, содержащие сконструированные клетки, и способы, наборы и устройства для введения клеток и композиций пациентам, как например, для адоптивной клеточной терапии. В некоторых аспектах клетки выделены из тканей пациента, сконструированы и введены тому же пациенту. В других аспектах они выделены из тканей одного пациента, сконструированы и введены другому пациенту.

II. РЕКОМБИНАНТНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, например, ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ

Предложены сконструированные или рекомбинантные рецепторы и клетки, экспрессирующие такие рецепторы. В некоторых вариантах осуществления сконструированные или рекомбинантные рецепторы включают химерные рецепторы, в том числе содержащие лигандсвязывающие домены или их связывающие фрагменты, такие как функциональные антигенные рецепторы, отличные от TCR, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR), а также включают Т-клеточные рецепторы (TCR) и их компоненты. Химерный рецептор, такой как CAR, обычно включает внеклеточный антигенсвязывающий (или лигандсвязывающий) домен, связанный с одним или более внутриклеточными сигнальными компонентами, в некоторых аспектах посредством линкеров и/или трансмембранного домена(ов). В некоторых вариантах осуществления такие молекулы обычно имитируют или аппроксимируют сигнал через естественный антигенный рецептор в комбинации с сигналом через костимулирующий рецептор, который опосредует сигнализацию TRAF, такую как TRAF-6-опосредованная сигнализация.

В конкретных вариантах осуществления рекомбинантные рецепторы, такие как химерные рецепторы, содержат внутриклеточный сигнальный домен, который включает i) TRAF-индуцирующий домен, который способен индуцировать активацию или клеточную локализацию медиатора TRAF, участвующего в сигнализации и/или способен индуцировать TRAF-опосредуемую сигнализацию; ii) трансмембранный домен и, необязательно, (ii) активирующий цитоплазматический сигнальный домен, такой как активирующий цитоплазматический домен, способный индуцировать первичный активирующий сигнал в Т-клетке, например цитоплазматический сигнальный домен Т-клеточного рецептора (TCR) (например, цитоплазматический сигнальный домен дзета-цепи CD3-дзета (CD3ζ) или его функциональный вариант или сигнальная часть) и/или который содержит мотив активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). В некоторых вариантах осуществления TRAF-индуцирующий домен способен связываться с молекулой, которая содержит TRAF-индуцирующий домен или который рекрутирует молекулу, содержащую TRAF-индуцирующий домен.

В некоторых вариантах осуществления TRAF-индуцирующий домен представляет собой TRAF-6-индуцирующий домен, который способен индуцировать активацию или клеточную локализацию медиатора TRAF-6, вовлеченного в сигнализацию, и/или способный индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию, как например, способен связываться с молекулой, которая содержит домен TRAF-6, и/или который рекрутирует молекулу, содержащую TRAF-6-индуцирующий домен. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен в рекомбинантном рецепторе, например в химерном рецепторе, способен прямо или косвенно активировать один или более медиаторов нисходящей сигнализации.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который специфично связывается с антигеном лиганда (например, антигеном). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор представляет собой CAR, который содержит внеклеточный антиген-распознающий домен, который специфично связывается с антигеном. В некоторых вариантах осуществления лиганд, такой как антиген, представляет собой белок, экспрессируемый на поверхности клеток. В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой TCR-подобный CAR, а антиген представляет собой процессированный пептидный антиген, такой как пептидный антиген внутриклеточного белка, который, подобно TCR, распознается на поверхности клетки в контексте молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC).

Иллюстративные рекомбинантные рецепторы, включающие CAR и рекомбинантные TCR, а также способы для конструирования и введения рецепторов в клетки, включают в себя те, которые описаны, например, в публикациях международных патентных заявках WO 200014257, WO 2013126726, WO 2012/129514, WO 2014031687, WO 2013/166321, WO 02013/071154, WO 02013/123061, в публикация патентных заявок США US 2002131960, US 2013287748, US 20130149337, в патентах США 6451995, 7446190, 8252592, 8339645, 8398282, 7446179, 6410319, 7070995, 7265209, 7354762, 7446191, 8324353, и 8479118, и в Европейской патентной заявке EP 2537416 и/или те, которые описаны Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2):160-75. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированные антигенные рецепторы включают CAR, как описано в патенте США №7446190, и описаны в международной патентной заявке № WO/2014055668 A1. В некоторых вариантах осуществления аналогичные способы для конструирования и введения или переноса в иммунные клетки могут быть использованы для предложенных химерных рецепторов.

A. Лигандсвязывающий домен

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как химерный рецептор (например, CAR), включает лигандсвязывающий домен, который связывается, например, специфично связывается с антигеном (или лигандом). Среди антигенов, на которые направленно воздействуют химерные рецепторы, присутствуют те, которые экспрессируются в контексте заболевания, патологического состояния, или типа клеток, которые подлежат направленному воздействию посредством адоптивной клеточной терапии. К числу заболеваний и патологических состояний относятся пролиферативные, неопластические и злокачественные заболевания и расстройства, включающие злокачественные новообразования и опухоли, включая гемабластозы, онкологические заболевания иммунной системы, такие как лимфомы, лейкозы и/или миеломы, такие как B-, T- и миелоидные лейкозы, лимфомы и множественные миеломы.

В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления это углевод или другая молекула. В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) селективно экспрессируется или сверхэкспрессируется на клетках при заболевании или патологическом состоянии, например на опухолевых или патогенных клетках, по сравнению с нормальными или не являющимися мишенями клетками или тканями. В других вариантах осуществления антиген экспрессируется в нормальных клетках и/или экспрессируется в сконструированных клетках.

В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) является опухолевым антигеном или онкомаркером. В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) представляет собой или включает орфанный рецептор тирозинкиназы ROR1, антиген созревания B-клеток (BCMA), tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелин, CEA и поверхностный антиген гепатита B, антитело против фолатного рецептора, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 или 4, димеры erbB, EGFR vIII, FBP, FCRL5, FCRH5, фетальный рецептор ацетихолина, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-альфа, IL-13R-альфа2, kdr, легкая цепь каппа, Lewis Y, молекула адгезии L1-клеток, (L1-CAM), ассоциированный с меланомой антиген (MAGE) -A1, MAGE-A3, MAGE-A6, предпочтительно экспрессируемый антиген меланомы (PRAME), сурвивин, EGP2, EGP40, TAG72, B7-H6, рецептор IL-13 a2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, фолатный рецептор-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6-интегрин, 8H9, NCAM, VEGF-рецепторы, 5T4, Fetal AchR, NKG2D-лиганды, CD44v6, двойной антиген и антиген, ассоциированный с универсальным маркером, антиген рака яичек, мезотелин, MUC1, MUC1 6, PSCA, NKG2D-лиганды, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкофетальный антиген, ROR1, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбриональный антиген (CEA), простата-специфичный антиген, PSMA, Her2/neu, рецептор эстрогена, рецептор прогестерон, эфринВ2, CD123, c-Met, GD-2, O-ацетилированный GD2 (OGD2), CE7, Опухоль Вильмса 1 (WT-1), циклин, циклин A2, CCL-1, CD138 и/или биотинилированные молекулы, и/или патоген-специфичный антиген, такой как молекулы, экспрессированные HIV, HCV, HBV или другие патогены.

В некоторых вариантах осуществления антиген является патоген-специфичном антигеном. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой вирусный антиген (такой как вирусный антиген HIV, HCV, HBV и т.д.), бактериальные антигены и/или паразитарные антигены.

1. Антигенный рецептор

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор включает CAR. В некоторых вариантах осуществления CAR сконструирован со специфичностью для конкретного антигена (или маркера или лиганда), такого как антиген, экспрессируемый в конкретном типе клеток, которые подлежат направленному воздействию адоптивной терапии, например онкомаркер и/или антиген, предназначенный для индуцирования ослабляющего ответа, такой как антиген, экспрессируемый на нормальном или не больном типе клеток. Таким образом, CAR обычно включает в своей внеклеточной части одну или более антигенсвязывающих молекул, таких как один или более антигенсвязывающих фрагментов, домен или часть или один или более вариабельных доменов антитела и/или молекулы антитела. В некоторых вариантах осуществления CAR включает антигенсвязывающую часть или части молекул антител, такие как одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), полученный из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального антитела (mAb).

Термин «антитело» используется в настоящем описании в самом широком смысле и включает в себя поликлональные и моноклональные антитела, включая интактные антитела и функциональные (антигенсвязывающие) фрагменты антитела, включая антигенсвязывающие фрагменты (Fab), F(ab')₂-фрагменты, Fab'-фрагменты, Fv-фрагменты, фрагменты рекомбинантного IgG (rIgG), вариабельные области тяжелой цепи (VH), способные специфично связывать антигены, фрагменты одноцепочечных антител, включая одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) и фрагменты однодоменных антител (например, sdAb, sdFv, нанотело). Термин охватывает генетически сконструированные и/или иным образом модифицированные формы иммуноглобулинов, такие как интратела, пептитела, химерные антитела, полностью человеческие антитела, гуманизированные антитела и гетероконъюгатные антитела, мультиспецифичные, например, биспецифичное, антитела, диатела, триатела и тетратела, тандем di-scFv, тандем tri-scFv. Если не указано иное, термин «антитело» следует понимать как охватывающий его функциональные фрагменты. Термин также охватывает интактные или полноразмерные антитела, включая антитела любого класса или подкласса, включая IgG и его подклассы, IgM, IgE, IgA и IgD.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие белки, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты специфично распознают антиген полноразмерного антитела. В некоторых вариантах осуществления тяжелая и легкая цепи антитела могут быть полноразмерными или могут представлять собой антигенсвязывающую часть (Fab, F(ab')₂, Fv или одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv)). В других вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела выбрана, например, из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE, особенно, например, из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, более конкретно, IgG1 (например, из человеческого IgG1). В другом варианте осуществления константная область легкой цепи антитела выбрана, например, из каппа или лямбда, в частности, каппа.

Среди предложенных антител присутствуют фрагменты антител. «Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, который содержит часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; димеры; линейные антитела; вариабельные области тяжелой цепи (VH), одноцепочечные молекулы антител, такие как scFvs и однодоменные содержащие только VH антитела; и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. В конкретных вариантах осуществления антитела представляют собой одноцепочечные фрагменты антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, такие как scFv.

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причем каждый домен состоит из четырех консервативных каркасных областей (FR) и трех CDR. (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). Один домен VH или VL может быть достаточным для придания антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, могут быть выделены с использованием домена VH или VL из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).

Однодоменными антителами являются фрагменты антител, содержащие цельный или часть вариабельного домена тяжелой цепи или цельный или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит домен тяжелой цепи антитела, который специфично связывается с антигеном, таким как онкомаркер или антиген клеточной поверхности клетки или заболевания, подлежащих направленному воздействию, таких как опухолевая клетка или раковая клетка, такой антиген, как любой из антигенов-мишеней, представленных в настоящем описании или известных в данной области.

Фрагменты антитела могут быть получены различными методами, включающими, но не ограничиваясь ими, протеолитический гидролиз интактного антитела, а также продуцирование рекомбинантными клетками-хозяевами. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой рекомбинантно продуцируемые фрагменты, такие как фрагменты, содержащие композиции, которые не встречаются в природе, такие как те, у которых две или более областей антител или цепей, соединенных синтетическими линкерами, например пептидными линкерами, и/или которые нельзя получить ферментативным гидролизом встречающегося в природе интактного антитела. В некоторых вариантах осуществления фрагменты антител представляют собой scFv.

«Гуманизированное» антитело представляет собой антитело, в котором все или по существу все аминокислотные остатки CDR получены из нечеловеческих CDR, и все или по существу все аминокислотные остатки FR получены из человеческих FR. Гуманизированное антитело необязательно может включать по меньшей мере часть константной области антитела, полученную из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» нечеловеческого антитела относится к варианту нечеловеческого антитела, которое подверглось гуманизированию, как правило, для снижения иммуногенности у человека, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского нечеловеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления некоторые FR-остатки в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого получены остатки CDR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv), который специфично распознает антиген, такой как интактный антиген, экспрессируемый на поверхности клетки.

В некоторых вариантах осуществления CAR содержит TCR-подобное антитело, такое как антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv), который специфично распознает внутриклеточный антиген, такой как опухолеспецифичный антиген, представленный на поверхности клетки как MHC-пептидный комплекс. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть, которая распознает комплекс MHC-пептид, может быть экспрессирована на клетках в виде части рекомбинантного рецептора, такого как антигенный рецептор. Среди рецепторов антигена представлены функциональные рецепторы антигенов, отличных от TCR, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR). Как правило, CAR, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который проявляет TCR-подобную специфичность, направленную против комплексов пептид-MHC, также может обозначаться как TCR-подобный CAR.

Ссылка на «Основной комплекс гистосовместимости» (MHC) относится к белку, обычно к гликопротеину, который содержит полиморфный пептидный связывающий сайт или связывающее углубление, который в некоторых случаях может образовывать комплекс с пептидными антигенами полипептидов, включая пептидные антигены, процессированные клеточным аппаратом. В некоторых случаях молекулы MHC могут презентироваться или экспрессироваться на поверхности клетки, в том числе в виде комплекса с пептидом, то есть комплекса MHC-пептид, для презентирования антигена в конформации, распознаваемой антигенным рецептором на Т-клетках, таким как TCR или TCR-подобное антитело. Как правило, молекулы МНС класса I представляют собой гетеродимеры, содержащие охватывающую мембрану α-цепь, в некоторых случаях с тремя α-доменами и нековалентно связанным β2-микроглобулином. Как правило, молекулы MHC класса II состоят из двух трансмембранных гликопротеинов α и β, оба из которых обычно охватывают мембрану. Молекула MHC может включать эффективную часть MHC, которая содержит антигенсвязывающий сайт или сайты для связывания пептида и последовательности, необходимые для распознавания соответствующим антигенным рецептором. В некоторых вариантах осуществления молекулы МНС класса I доставляют пептиды, происходящие из цитозоля, к поверхности клетки, где МНС-пептидный комплекс распознается Т-клетками, такими как обычно CD8+ Т-клетки, но в некоторых случаях CD4+ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления молекулы МНС класса II доставляют пептиды, происходящие из везикулярной системы, к поверхности клетки, где они обычно распознаются CD4+ Т-клетками. Как правило, молекулы MHC кодируются группой связанных локусов, которые в совокупности называются H-2 у мыши и человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA) у людей. Следовательно, обычно человеческий MHC можно также назвать человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA).

Термин «комплекс МНС-пептид» или «комплекс пептид-МНС» или его вариации относится к комплексу или ассоциации пептидного антигена и молекулы МНС, как например, в общем, образованным путем нековалентных взаимодействий пептида в углублении связывания или в щели молекулы МНС. В некоторых вариантах осуществления комплекс MHC-пептид присутствует или презентируется на поверхности клеток. В некоторых вариантах осуществления комплекс MHC-пептид может специфично распознаваться антигенным рецептором, таким как TCR, TCR-подобный CAR или его антигенсвязывающие части.

В некоторых вариантах осуществления пептид, такой как пептидный антиген или эпитоп полипептида может связываться с молекулой MHC, как например для распознавания антигенным рецептором. Как правило, пептид получают из или на основе фрагмента более длинной биологической молекулы, такой как полипептид или белок. В некоторых вариантах осуществления пептид обычно имеет длину примерно от 8 до 24 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептид имеет длину от или примерно от 9 до 22 аминокислот для распознавания в комплексе MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления пептид имеет длину от или примерно от 8 до 13 аминокислот для распознавания в комплексе МНС класса I. В некоторых вариантах осуществления после распознавания пептида в контексте молекулы MHC, такой как комплекс MHC-пептид, антигенный рецептор, такой как TCR или TCR-подобный CAR, продуцирует или запускает активирующий сигнал для Т-клетки, которая индуцирует Т-клеточный ответ, такой как Т-клеточная пролиферация, продуцирование цитокинов, цитотоксический ответ Т-клеток или другой ответ.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть, которая специфично связывается с комплексом МНС-пептид, могут быть получены путем иммунизации хозяина эффективным количеством иммуногена, содержащего специфичный комплекс МНС-пептид. В некоторых случаях пептид комплекса МНС-пептид представляет собой эпитоп антигена, способного связываться с МНС, такого как опухолевый антиген, например, универсальный опухолевый антиген, антиген миеломы или другой антиген, как описано ниже. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество иммуногена затем вводят хозяину для вызова иммунного ответа, где иммуноген сохраняет его трехмерную форму в течение периода времени, достаточного для получения иммунного ответа против трехмерной презентации пептида в углублении связывания молекулы МНС. Затем сыворотку, собранную из хозяина, анализируют для определения того, будут ли получены целевые антитела, которые распознают трехмерную презентацию пептида в углублении для связывания молекулы МНС. В некоторых вариантах осуществления полученные антитела можно оценить для подтверждения того, что антитело может дифференцировать комплекс MHC-пептид от индивидуальной молекулы MHC, от индивидуального интересующего пептида и комплекса MHC и нерелевантного пептида. Затем целевые антитела могут быть выделены.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть, которая специфично связывается с комплексом MHC-пептид, могут быть получены с использованием методов дисплея библиотеки антител, таких как фаговые библиотеки антител. В некоторых вариантах осуществления библиотеки фагового дисплея мутантных Fab, scFV или других форм антител могут быть сгенерированы, например, в которых члены библиотеки подвергнуты мутации по одному или более остаткам одной CDR или нескольких CDR. Пример таких способов известен в данной области (см., например, опубликованную в США заявку № US 20020150914, US 2014/0294841 и Cohen CJ. Et al. (2003) J Mol. Recogn. 16: 324-332).

2. TCR

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные рецепторы включают рекомбинантные Т-клеточные рецепторы (TCR) и/или TCR, клонированные из встречающихся в природе Т-клеток.

В некоторых вариантах осуществления Т-клеточный рецептор (TCR) содержит вариабельные α и β-цепи (также известные как TCRα и TCRβ, соответственно) или вариабельные цепи γ и δ (также известные как TCRγ и TCRδ, соответственно) или их функциональный фрагмент, так что молекула способна специфично связываться с антигенным пептидом, связанным с рецептором МНС. В некоторых вариантах осуществления TCR находится в форме αβ. Как правило, TCR, которые существуют в формах αβ и γδ, обычно структурно подобны, но T-клетки, экспрессирующие их, могут иметь различные анатомические локализации или функции. TCR можно обнаружить на поверхности клетки или в растворимой форме. Как правило, TCR обнаруживается на поверхности Т-клеток (или Т-лимфоцитов), где он, как правило, отвечает за распознавание антигенов, связанных с главными молекулами комплекса гистосовместимости (МНС). В некоторых вариантах осуществления TCR также может содержать константный домен, трансмембранный домен и/или короткий цитоплазматический хвост (см., например, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). Например, в некоторых вариантах осуществления каждая цепь TCR может иметь один N-концевой вариабельный домен иммуноглобулина, один константный домен иммуноглобулина, трансмембранную область и короткий цитоплазматический хвост на С-конце. В некоторых вариантах осуществления TCR ассоциируется с инвариантными белками комплекса CD3, участвующим в опосредовании сигнала трансдукции.

Если не указано иное, термин «TCR» следует понимать как охватывающий функциональные TCR-фрагменты. Этот термин также охватывает интактные или полноразмерные TCR, включая TCR в форме αβ или γδ. Таким образом, для целей настоящего изобретения ссылка на TCR включает любой TCR или функциональный фрагмент, такой как антигенсвязывающая часть TCR, которая связывается со специфичным антигенным пептидом, связанным в молекуле MHC, то есть с комплексом MHC-пептид. «Антигенсвязывающая часть» или антигенсвязывающий фрагмент TCR, которые могут использоваться взаимозаменяемо, относятся к молекуле, которая содержит часть структурных доменов TCR, но которая связывает антиген (например, комплекс MHC-пептид), с которым связывается полный TCR. В некоторых случаях, антигенсвязывающая часть содержит вариабельные домены TCR, такие как вариабельная α-цепь и вариабельная β-цепь TCR, достаточная для образования сайта связывания для связывания с определенным комплексом MHC-пептид, где, как правило, каждая цепь содержит три области, определяющие комплементарность.

В некоторых вариантах осуществления вариабельные домены цепей TCR связывают с образованием петель или областей, определяющих комплементарность (CDR), аналогично иммуноглобулинам, которые придают специфичность распознавание антигена и определяют специфичность пептида путем образования сайта связывания молекулы TCR и определяют пептидную специфичность. Как правило, подобно иммуноглобулинам, CDR разделены каркасными областями (FR) (см., например, Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; см. также Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). В некоторых вариантах осуществления CDR3 является основной CDR, ответственной за распознавание процессированного антигена, хотя также было показано, что CDR1 альфа-цепи взаимодействует с N-концевой частью антигенного пептида, тогда как CDR1 бета-цепи взаимодействует с С-концевой частью пептида. Считается, что CDR2 распознает молекулу MHC. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область β-цепи может содержать дополнительную область гипервариабельности (HV4).

В некоторых вариантах осуществления цепи TCR содержат константный домен. Например, как и иммуноглобулины, внеклеточная часть цепей TCR (например, α-цепь, β-цепь ) может содержать два домена иммуноглобулина, вариабельный домен (например, Vα или Vβ; обычно аминокислоты 1-116 на основе нумерации Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.) на N-конце и один константный домен (например, константная область α-цепи или Cα, обычно аминокислоты 117-259 на основе нумерации Kabat, константный домен β-цепи или Cβ, обычно аминокислоты 117-295 на основе нумерации Kabat), смежные с клеточной мембраной. Например, в некоторых случаях внеклеточная часть TCR, образованная двумя цепями, содержит два мембранно-проксимальных константных домена и два мембранно-дистальных вариабельных домена, содержащих CDR. Константный домен TCR-домена содержит короткие связывающие последовательности, в которых остаток цистеина образует дисульфидную связь с получением связи между двумя цепями. В некоторых вариантах осуществления TCR может иметь дополнительный остаток цистеина в каждой из α- и β-цепей, так что TCR содержит две дисульфидные связи в константных доменах.

В некоторых вариантах осуществления цепи TCR могут содержать трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен положительно заряжен. В некоторых случаях цепи TCR содержат цитоплазматический хвост. В некоторых случаях структура позволяет TCR ассоциироваться с другими молекулами, такими как CD3. Например, TCR, содержащий константные домены с трансмембранной областью, может закреплять белок в клеточной мембране и ассоциировать с инвариантными субъединицами сигнального аппарата или комплекса CD3.

Как правило, CD3 представляет собой мультибелковый комплекс, который может обладать тремя различными цепями (γ, δ и ε) у млекопитающих и ζ-цепью. Например, у млекопитающих комплекс может содержать цепь CD3γ, цепь CD3δ, две цепи CD3ε и гомодимер цепей CD3ζ. Цепи CD3γ, CD3δ и CD3ε представляют собой близкородственные белки клеточной поверхности суперсемейства иммуноглобулинов, содержащие единственный иммуноглобулиновый домен. Трансмембранные области цепей CD3γ, CD3δ и CD3ε отрицательно заряжены, что является характеристикой, которая позволяет этим цепям связываться с положительно заряженными цепями Т-клеточных рецепторов. Каждый из внутриклеточных хвостов цепей CD3γ, CD3δ и CD3ε содержит один консервативный мотив, известный как мотив активации иммунорецептора на основе тирозина или ITAM, тогда как каждая цепь CD3ζ имеет три мотива. Как правило, ITAM участвуют в сигнальной способности комплекса TCR. Эти вспомогательные молекулы имеют отрицательно заряженные трансмембранные области и играют роль в распространении сигнала от TCR в клетку. CD3- и ζ-цепи вместе с TCR образуют так называемый комплекс Т-клеточных рецепторов.

В некоторых вариантах осуществления TCR может быть гетеродимером двух цепей α и β (или необязательно γ и δ), или он может быть одноцепочечной конструкцией TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой гетеродимер, содержащий две отдельные цепи (α и β цепи или γ и δ цепи), которые связаны, например, дисульфидной связью или дисульфидными связями.

В некоторых вариантах осуществления TCR для антигена-мишени (например, опухолевого антигена) идентифицируют и вводят в клетки. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая TCR, может быть получена из множества источников, как например амплификацией с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) общедоступных последовательностей ДНК TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR получают из биологического источника, как например из клеток, как например, из Т-клеток (например, цитотоксических Т-клеток), Т-клеточных гибридом или других общедоступных источников. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки могут быть получены из in vivo выделенных клеток. В некоторых вариантах осуществления как например высокоаффинный Т-клеточный клон может быть выделен из клеток пациента и выделен TCR. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки могут представлять собой культивированную Т-клеточную гибридому или клон. В некоторых вариантах осуществления клон TCR для антигена-мишени генерируется у трансгенных мышей, сконструированных с человеческими генами иммунной системы (например, системы человеческого лейкоцитарного антигена или HLA). См., например, опухолевые антигены (см., например, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 и Cohen et al. (2005) J Immunol. 175: 5799-5808. В некоторых вариантах осуществления фаговый дисплей используется для выделения TCR против антигена-мишени (см., например, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395 и Li (2005) Nat Biotechnol. 23: 349-354. В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающая часть могут быть синтетически получены на основе знания последовательности TCR.

В некоторых вариантах осуществления, после получения клона Т-клеток, альфа- и бета-цепи TCR выделяют и клонируют в вектор экспрессии гена. В некоторых вариантах осуществления альфа- и бета-гены TCR связаны через рибосомный пептид 2А (пептид прыжка рибосомы) пикорнавируса, так что обе цепи коэкспрессируются. В некоторых вариантах осуществления генетический перенос TCR осуществляется через ретровирусные или лентивирусные векторы или через транспозоны (см., например, Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; an Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18: 674-683.

B. Внутриклеточный сигнальный домен

В некоторых вариантах осуществления лигандсвязывающий домен, такой как компонент антигенспецифичного связывания или компонент распознавания, связан с одним или более трансмембранными и внутриклеточными сигнальными доменами. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления лигандсвязывающий домен, такой как домен распознавания антигена, связан с одним или более модулями клеточной сигнализации. Лигандсвязывающий домен, такой как домен распознавания антигена, обычно связан с внутриклеточным доменом, содержащим один или более внутриклеточных сигнальных компонентов, таких как сигнальные компоненты, которые способны индуцировать сигнализацию TRAF-6 и/или связывание или рекрутинг TRAF-6 (т.е. представляют собой или содержат TRAF-6-индуцирующий домен) и активирующий сигнальный домен, который способен или может имитировать активацию через комплекс антигенного рецептора, такой как комплекс TCR, и/или сигнал через другой рецептор клеточной поверхности. В некоторых случаях TRAF-6-индуцирующий домен может представлять собой цитоплазматический сигнальный домен, полученный из костимулирующей молекулы, которая содержит консенсусную последовательность связывания TRAF-6 (например, представленную в SEQ ID NO: 26) и/или которая иным способом может рекрутировать и/или активировать TRAF-6 при или после связывания антигена (например, лиганда).

Активация Т-клеток в некоторых аспектах описана как опосредованная двумя классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: те, которые инициируют антигензависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности) и те, которые действуют антиген-независимым образом, обеспечивая вторичный или ко-стимулирующий сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор (например, CAR) включает один или оба из таких сигнальных компонентов, где по меньшей мере часть вторичного сигнала опосредуется через TRAF-6-опосредованный путь путем включения в химерный рецептор (например, CAR) TRAF-6-индуцирующего домена, способного связывать и/или рекрутировать TRAF-6 и другие ассоциированные сигнальные молекулы. В некоторых вариантах осуществления дополнительный костимулирующий сигнал также может быть включен как часть сигнального компонента химерного рецептора, который в некоторых случаях может включать в себя костимулирующий сигнал, который индуцирует сигнализацию от другого сигнального пути, такого как сигнальный путь PI3K/Akt.

В некоторых вариантах осуществления среди активирующего сигнального домена внутриклеточных сигнальных доменов присутствуют те, которые имитируют или аппроксимируют сигнал через природный антигенный рецептор, сигнал через такой рецептор в комбинации с костимулирующим рецептором и/или сигнал через костимулирующий рецептор индивидуально. В некоторых вариантах осуществления рецептор включает внутриклеточный компонент комплекса TCR, такой как CD3-цепь TCR, который опосредует активацию и цитотоксичность Т-клеток, например дзета-цепь CD3. В некоторых вариантах осуществления активирующий сигнальный домен представляет собой или включает в себя трансмембранный домен CD3, внутриклеточные сигнальные домены CD3 и/или другие трансмембранные домены CD. В некоторых вариантах осуществления рецептор, например CAR, дополнительно включает часть одной или более дополнительных молекул, таких как Fc-рецептор γ, CD8, CD4, CD25 или CD16. Например, в некоторых вариантах осуществления CAR включает химерную молекулу между CD3-дзета (CD3-ζ) или Fc-рецептором γ и CD8, CD4, CD25 или CD16.

В некоторых вариантах осуществления при лигировании химерного рецептора (например, CAR) цитоплазматический домен или внутриклеточный сигнальный домен химерного рецептора (например, CAR) активирует по меньшей мере одну из нормальных эффекторных функций или ответов иммунной клетки, например T клетки, сконструированной для экспрессии химерного рецептора (например, CAR). Например, в некоторых контекстах CAR индуцирует функцию Т-клетки, такую как цитолитическая активность или Т-хелперная активность, такая как секреция цитокинов или других факторов. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или домены включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR), а в некоторых аспектах также включают корецепторы, которые в контексте природных соединений действуют совместно с таким рецептором, чтобы инициировать сигнальную трансдукцию после привлечения антигенного рецептора и/или любое производное или любого производного или варианта таких молекул и/или любой синтетической последовательности, которая имеет такую же функциональную способность.

В некоторых вариантах осуществления CAR включает в себя первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, которая регулирует первичную активацию комплекса TCR. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как мотивы активации иммунорецепторов на основе тирозина или ITAM. Примеры ITAM, содержащих первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, включают те, которые получены из TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD8, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматическая сигнальная молекула(ы) в CAR содержит(ат) цитоплазматический сигнальный домен, его часть или последовательность, полученную из CD3-дзета.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен химерного рецептора, например CAR, содержит сигнальный домен активации человеческого CD3-дзета или его функциональный вариант, такой как цитоплазматический домен 112 АА изоформы 3 человеческого CD3ζ (№ регистрации: P20963.2) или сигнальный домен для активации CD3-дзета, как описано в патенте США №744690 или в патенте США №8911993. Например, в некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит активирующий сигнальный домен, содержащий последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO: 21-23 (кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 41), или последовательность аминокислот, которые имеют по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 21-23.

В контексте природного TCR полная активация обычно требует не только сигнализации через TCR, но также и костимулирующего сигнала. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления для ускорения полной активации TRAF-6-индуцирующий сигнальный домен для генерации вторичного или костимулирующего сигнала также включен в химерный рецептор, такой как CAR. В других вариантах осуществления химерный рецептор, такой как CAR, содержащий активирующий сигнальный домен, не включает компонент для генерации костимулирующего сигнала, и в этом случае TRAF-6-индуцирующий сигнальный домен может быть обеспечен на втором химерном рецепторе, как например на дополнительном CAR, который экспрессируется в той же клетке.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, такой как CAR, включает в себя сигнальный домен или функциональную часть или его вариант, полученный из костимулирующей TRAF-6-индуцирующей сигнальной молекулы. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующая сигнальная молекула может быть членом суперсемейства рецепторов TNF или членом суперсемейства IL-1/Toll. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующая сигнальная молекула может быть получена из или содержать все или часть цитоплазматической последовательности CD40, RANK, IL1R-1, BAFF-R, BCMA, TACI, OX40, Troy, XEDAR или FN14. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующая сигнальная молекула представляет собой или содержит цитоплазматический домен, полученный из CD40, RANK или IL1R-1. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующая сигнальная молекула способна индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию, но не содержит полную цитоплазматическую последовательность CD40 или OX40, например, не содержит цитоплазматическую последовательность, которая способна индуцировать сигнализацию через другой TRAF и/или не содержит одного или более доменов, которые способны индуцировать сигнализацию через TRAF-1, TRAF-2, TRAF-3 или TRAF-5. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен не является или не содержит цитоплазматический домен CD40 или OX40. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен представляет собой или содержит цитоплазматический домен, полученный из CD40. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая TRAF-6-индуцирующая сигнальная молекула не является проапоптотической.

В некоторых из таких вариантов осуществления TRAF-6 индуцирующий сигнальный домен является человеческим или получен из цитоплазматической последовательности человеческого белка, такого как человеческий CD40, RANK, IL1R-1, BAFF-R, BCMA, TACI, OX40, Troy, XEDAR или Fn14. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6 индуцирующий сигнальный домен получен из цитоплазматического сигнального домена человеческого CD40.

В некоторых вариантах осуществления лигандсвязывающий домен иллюстративного химерного рецептора, например CAR, не получен из CD40, RANK, IL1R-1, BAFF-R, BCMA, TACI, OX40, Troy, XEDAR или Fn14,

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен рекомбинантного рецептора, например CAR, содержит цитоплазматический сигнальный домен человеческого CD40 или его функциональный вариант или его часть. Например, внутриклеточный домен может содержать цитоплазматический сигнальный домен, содержащий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 12 (кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 34), или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен рекомбинантного рецептора, например CAR, содержит цитоплазматический сигнальный домен человеческого RANK или его функциональный вариант или его часть. Например, внутриклеточный домен может содержать цитоплазматический сигнальный домен, содержащий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 14, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен рекомбинантного рецептора, например CAR, содержит цитоплазматический сигнальный домен человеческого IL1R-1 или его функциональный вариант или его часть. Например, внутриклеточный домен может содержать цитоплазматический сигнальный домен, содержащий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 16, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 16.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, такой как CAR, дополнительно содержит вспомогательный сигнальный домен и/или взаимодействует в виде комплекса со вторым химерным рецептором, содержащим вспомогательный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления присутствие вспомогательного сигнального домена может увеличивать TRAF-6-индуцирующую активность TRAF-6-индуцирующего домена, например, путем облегчения рекрутинга одной или более молекул в комплекс, который содержит TRAF-6-связывающий домен для облегчения TRAF-6-опосредованной сигнализации. Например, в некоторых случаях, при связывании лиганда с рецептором IL1R-1 образует комплекс с вспомогательным белком IL1R (IL-1RAcP) для облегчения рекрутирования белка (IRAK), ассоциированного с рецептором IL-1, к комплексу, который содержит TRAF-6-связывающий домен для связывания TRAF-6 и опосредованной сигнализации из комплекса.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, который содержит TRAF-6-индуцирующий домен, который является или содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1R-1 или его функциональный вариант или его часть, может также содержать, например, в тандеме, вспомогательный сигнальный домен. В некоторых случаях, могут быть обеспечены первый и второй химерные рецепторы, как изложено в настоящем описании, в которых первый химерный рецептор содержит TRAF-6-индуцирующий домен, который является или содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1R-1 или его функциональный вариант или его часть, и второй химерный рецептор, который содержит вспомогательный сигнальный домен. В некоторых случаях, первый и второй химерные рецепторы экспрессируются в одной и той же клетке, что приводит к образованию мультимерного комплекса, который способен индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию при стимулировании антигеном или при стимулировании, которое имитирует или аппроксимирует сигнал через природный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления вспомогательный сигнальный домен является компонентом внутриклеточного домена химерного рецептора, например CAR. В некоторых вариантах осуществления вспомогательный сигнальный домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен человеческого IL1R-1AcP или его функциональный вариант или его часть. Например, внутриклеточный домен может содержать цитоплазматический сигнальный домен, содержащий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 18, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах осуществления тот же CAR включает внутриклеточный сигнальный домен, содержащий как активирующие, так и костимулирующие компоненты. В некоторых вариантах осуществления активирующий домен (например, CD3-дзета) включен в один CAR, тогда как костимулирующий компонент (например, CD40, RANK, IL1R-1 или IL1R-1AcP) предоставляется другим CAR, распознающим другой антиген. В некоторых вариантах осуществления CAR включают активирующие или стимулирующие CAR и костимулирующие CAR, причем оба экспрессируются на одной и той же клетке (см. WO 02015/055668).

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, такой как CAR, дополнительно включает в себя цитоплазматический сигнальный домен другой дополнительной костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический сигнальный домен представляет собой или получен из цитоплазматического сигнального домена CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, ICOS или CD27. В некоторых вариантах осуществления дополнительная костимулирующая молекула способна опосредовать PI3K/Akt-сигнализацию. Например, в некоторых вариантах осуществления дополнительный цитоплазматический костимулирующий домен представляет собой или получен из CD28, 4-1BB или ICOS.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, такой как CAR, содержит TRAF-6-индуцирующий домен, полученный из цитоплазматического домена костимулирующей молекулы, опосредующей TRAF-6-сигнализацию, связанной с активирующим сигнальным доменом CD3 (например, CD3-дзета). В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующая сигнальная молекула получена из цитоплазматического сигнального домена CD40, RANK, IL1R-1 и/или IL1R-1AcP. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующая сигнальная молекула не является проапоптотической. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, такой как CAR, дополнительно содержит дополнительный костимулирующий сигнальный домен, такой как полученный из цитоплазматического сигнального домена CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, ICOS или CD27.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, например CAR, охватывает один или более, например, два или более, костимулирующих домена и активирующий домен, например, первичный активирующий домен, в цитоплазматической части. Иллюстративные CAR включают внутриклеточные компоненты, полученные из CD3-дзета, TRAF-6-индуцирующей сигнальной молекулы (например, полученной из цитоплазматического сигнального домена CD40, RANK, IL1R-1 и/или IL1R-1AcP) и, необязательно, CD28, ICOS, или 4-1BB. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующая сигнальная молекула не является проапоптотической.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен химерного рецептора, например CAR, дополнительно содержит цитоплазматический сигнальный домен человеческого CD28 или его функциональный вариант или его часть, как например домен с заменой LL на GG в положениях 186-187 нативного белка CD28. Например, внутриклеточный домен может дополнительно содержать цитоплазматический сигнальный домен, содержащий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 8 или 9, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 8 или 9.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит цитоплазматический сигнальный домен ICOS или его функциональный вариант или его часть, такую как последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 35 (кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 36) или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен дополнительно содержит цитоплазматический сигнальный домен 4-1BB (например, регистрационный № Q 07011.1) или его функциональный вариант или его часть, такую как последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 10, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 10.

В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно включают ингибирующие CAR (iCAR, см. Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013), такие как CAR, распознающие антиген, отличный от антигена-мишени, посредством чего активирующий сигнал, передаваемый через целевой антигенсвязывающий CAR, ослабляется или ингибируется связыванием ингибирующего CAR с его лигандом, например, для уменьшения эффектов отклонения от цели.

В некоторых вариантах осуществления лигандсвязывающий домен (например, антитело) связан с внутриклеточным сигнальным доменом через один или более трансмембранных доменов. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен слит с внеклеточным доменом. В одном варианте осуществления используется трансмембранный домен, который, в естественной среде ассоциирован с одним из доменов в рецепторе, например CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен выбирают или модифицируют путем аминокислотной замены, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами одних и тех же или разных поверхностных мембранных белков, чтобы минимизировать взаимодействие с другими членами рецепторного комплекса.

В некоторых вариантах осуществления присутствует короткий олиго- или полипептидный линкер, например линкер длиной от 2 до 10 аминокислот, такой как содержащий глицины и серины, например глицин-сериновый дублет, и образует связь между трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом химерного рецептора.

Трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления получают либо из природного, либо из синтетического источника. Когда источник является природным, домен в некоторых аспектах происходит из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные области включают те, которые получены из (т.е. содержат по меньшей мере трансмембранную область (области)) альфа, бета или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD40, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, RANK, рецептора типа 1 интерлейкина-1 (IL1R-1), вспомогательного белка рецептора типа 1 интерлейкина-1 (IL1R-1AcP), и/или трансмембранные области, содержащие их функциональные варианты, такие как те, которые сохраняют значительную часть структурных, например трансмембранных, свойств. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления является синтетическим. В некоторых вариантах осуществления синтетический трансмембранный домен содержит преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых вариантах осуществления триплет фенилаланина, триптофана и валина будет обнаружен на каждом конце синтетического трансмембранного домена. В некоторых вариантах осуществления связь осуществляется посредством линкеров, спейсеров и/или трансмембранного домена(ов).

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен, полученный из TRAF-6-индуцирующей сигнальной молекулы. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен, полученный из CD40, RANK, IL1R-1 или IL1R-1AcP, или его функциональный вариант.

Например, в некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен химерного рецептора, например CAR, представляет собой трансмембранный домен человеческого CD40 (например, регистрационный № P 25942) или его вариант, такой как трансмембранный домен, который содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 11, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен химерного рецептора, например CAR, представляет собой или включает трансмембранный домен человеческого RANK (например, регистрационный № Q9Y6Q6) или его вариант, такой как трансмембранный домен, который содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 13, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 13.

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен химерного рецептора, например CAR, представляет собой трансмембранный домен человеческого IL1R-1 (например, регистрационный № P 14778) или его вариант, такой как трансмембранный домен, который содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 15, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 15.

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен химерного рецептора, например CAR, представляет собой трансмембранный домен человеческого IL1R-1AcP (например, регистрационный № Q9NPH3) или его вариант, такой как трансмембранный домен, который содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 17, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 17.

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен, полученный из другой костимулирующей молекулы или из другой молекулы, которая, как известно, экспрессируется на поверхности Т-клеток в виде мембранного белка. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен, полученный из CD4, CD28 или CD8, например CD8-альфа или его функциональный вариант.

Например, в некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен химерного рецептора, например CAR, представляет собой трансмембранный домен человеческого CD28 (например, регистрационный № P 10747.1) или его вариант, такой как трансмембранный домен, который содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 6, или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 6; в некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен, содержащий часть рекомбинантного рецептора, содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 7, или последовательность аминокислот, имеющую с ней по меньшей мере или примерно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, такой как CAR, такой как его часть антитела, дополнительно включает спейсер, который может представлять собой или включает по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина или ее вариант или модифицированный вариант, как например, шарнирную область, например, шарнирную область IgG4, и/или область CH1/CL и/или Fc. В некоторых вариантах осуществления часть константной области служит в качестве спейсерной области между лигандсвязывающим доменом, таким как компонент распознавания антигена, например scFv, и трансмембранным доменом. Спейсер может иметь длину, которая обеспечивает повышенную чувствительность клетки после связывания антигена по сравнению с отсутствием спейсера. В некоторых примерах спейсер имеет длину примерно 12 аминокислот или длину не более чем 12 аминокислот. Иллюстративные спейсеры включают те, которые содержат по меньшей мере примерно 10-229 аминокислот, примерно 10-200 аминокислот, примерно 10-175 аминокислот, примерно 10-150 аминокислот, примерно 10-125 аминокислот, примерно 10-100 аминокислот, примерно 10-75 аминокислот, примерно 10-50 аминокислот, примерно 10-40 аминокислот, примерно 10-30 аминокислот, примерно 10-20 аминокислот или примерно 10-15 аминокислот и включая любое целое число между конечными точками любого из перечисленных диапазонов. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область содержит примерно 12 аминокислот или менее, примерно 119 аминокислот или менее или примерно 229 аминокислот или менее. Иллюстративные спейсеры включают шарнир IgG4 индивидуально, шарнир IgG4, связанный с доменами CH2 и CH3, или шарнир IgG4, связанный с доменом CH3. Иллюстративные спейсеры включают, но не ограничиваются ими, описанные в Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19: 3153, в публикации международной патентной заявки номер WO 2014031687, патенте США № 8822647 или в опубликованном приложении № US 2014/0271635.

В некоторых вариантах осуществления константная область или часть относится к человеческому IgG, такому как IgG4 или IgG1. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность ESKYGPPCPPCP (представленную в SEQ ID NO: 1) и кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть относится к IgD. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 1-5.

В некоторых вариантах осуществления спейсер содержит только шарнирную область IgG, такую как шарнир IgG4 или IgG1 индивидуально, как например шарнир, представленный в SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления спейсер представляет собой или содержит шарнир Ig, например шарнир, полученный из IgG4, необязательно связанный с доменами CH2 и/или CH3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например шарнир IgG4, связанный с доменами CH2 и CH3, такой как представленный в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например шарнир IgG4, связанный только с доменом СН3, такой как представленный в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой или содержит последовательность, богатую глицин-серином, или другой гибкий линкер, такой как известные гибкие линкеры.

В некоторых вариантах осуществления конструкция, содержащая химерный рецептор, такой как CAR или другой антигенный рецептор, дополнительно включает маркер, такой как маркер клеточной поверхности, который может использоваться для подтверждения трансдукции или конструирования клетки для экспрессии рецептора, такого как укороченный вариант рецептора клеточной поверхности, как например, укороченный EGFR (tEGFR). В некоторых вариантах осуществления маркер включает все или часть (например, укороченную форму) CD34, NGFR или рецептор эпидермального фактора роста (например, tEGFR) или его функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая маркер, функционально связана с полинуклеотидом, кодирующим линкерную последовательность, такую как расщепляемая линкерная последовательность, например T2A. Например, маркер и, необязательно, линкерная последовательность могут быть любыми, как раскрыто в опубликованной патентной заявке WO 02014031687. Например, маркер может представлять собой укороченный EGFR (tEGFR), который, необязательно, связан с линкерной последовательностью, такой как расщепляемая линкерная последовательность T2A. Иллюстративный полипептид для укороченного EGFR (например, tEGFR) содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 25 или 31 (кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 30), или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности с SEQ ID NO: 25 или 31. Иллюстративная линкерная последовательность T2A содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 24 или 29 (кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 40), или последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 24 или 29.

В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой молекулу, например белок клеточной поверхности или его часть, который в природе не встречается на Т-клетках или не встречается в природе на поверхности Т-клеток.

В некоторых вариантах осуществления молекула представляет собой чужеродную молекулу, например, чужеродный белок, то есть тот, который не распознается как «свой» иммунной системой хозяина, в который клетки будут адотпивно перенесены.

В некоторых вариантах осуществления маркер не выполняет никакой терапевтической функции и/или не производит никакого эффекта, кроме того, что он используется в качестве маркера для генетического конструирования, например, для селекции успешно сконструированных клеток. В других вариантах осуществления маркер может представлять собой терапевтическую молекулу или молекулу, иным образом оказывающую некоторый целевой эффект, как например лиганд для клетки, который должен встречаться in vivo, такой как костимулирующая или иммунная контрольная молекула для усиления и/или ослабления ответов клеток при адоптивном переносе и встрече с лигандом.

В некоторых случаях последовательность нуклеотидов, кодирующая генетически сконструированный рецептор, и/или маркер поверхности содержит сигнальную последовательность, которая кодирует сигнальный пептид. В некоторых аспектах сигнальная последовательность может кодировать сигнальный пептид, полученный из нативной молекулы клеточной поверхности. В других аспектах сигнальная последовательность может кодировать гетерологичный или не нативный сигнальный пептид, такой как иллюстративный сигнальный пептид альфа-цепи GMCSFR, представленный в SEQ ID NO: 37 и кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 38 или 39. В некоторых случаях, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный антигенный рецептор (CAR) и/или маркер клеточной поверхности, содержит сигнальную последовательность, которая кодирует сигнальный пептид. Неограничивающие иллюстративные примеры сигнальных пептидов включают, например, сигнальный пептид альфа-цепи GMCSFR, представленный в SEQ ID NO: 37.

В некоторых случаях химерный рецептор, например CAR, упоминается как CAR первого, второго и/или третьего поколения. В некоторых аспектах CAR первого поколения представляет собой тот, который обеспечивает исключительно сигнал, индуцированный CD3-цепью при связывании антигена; в некоторых аспектах CAR второго поколения - это тот, который обеспечивает такой сигнал и костимулирующий сигнал, такой как включающий внутриклеточный сигнальный домен, который представляет собой TRAF-6-индуцирующий домен, способный индуцировать сигнализацию, опосредуемую TRAF-6, такую как от костимулирующего рецептора, такого как CD40, RANK, IL1R-1 или IL1R-1AcP; в некоторых аспектах, CAR третьего поколения - это тот, который включает множество костимулирующих доменов различных костимулирующих рецепторов.

В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает внеклеточную часть, содержащую описанное в настоящем документе антитело или фрагмент, и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент включает scFv, а внутриклеточный домен содержит ITAM. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен включает сигнальный домен дзета-цепи CD3-дзета (CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает трансмембранный домен, связывающий внеклеточный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит трансмембранную часть TRAF-6-индуцирующей сигнальной молекулы. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит трансмембранную часть CD40, RANK, IL1R-1 или IL1R-1AcP. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит трансмембранную часть, полученную из CD4, CD28 или CD8, такую как полученная из человеческого CD4, CD28 или CD8. Внеклеточный домен и трансмембранный домен могут быть связаны прямо или косвенно. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен и трансмембранный связаны спейсером, таким как любой описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий сигнальный домен или его функциональный вариант, полученный из TRAF-6-индуцирующей сигнальной молекулы. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующую сигнальную молекулу получают из цитоплазматического домена CD40, RANK, IL1R-1 или IL1R-1AcP. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен дополнительно содержит еще костимулирующий сигнальный домен, как описано.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, например CAR, включает лигандсвязывающий домен, такой как домен распознавания антигена, описанный в настоящем документе, спейсер, такой как спейсер, содержащий часть молекулы иммуноглобулина, такую как шарнирная область и/или одна или более константных областей молекулы тяжелой цепи, такой как спейсер, содержащий Ig-шарнир, трансмембранный домен, например, из TRAF-6-индуцирующей сигнальной молекулы или полученный из CD4, CD28 или CD8, костимулирующий сигнальный домен, полученный из TRAF-6-индуцирующей сигнальной молекулы, и активирующий сигнальный домен CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен находится между трансмембранным доменом и активирующим сигнальным доменом.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, например CAR, включает лигандсвязывающий домен, такой как домен распознавания антигена, описанный в настоящем документе, спейсер, такой как спейсер, содержащий часть молекулы иммуноглобулина, такую как шарнирная область и/или одну или несколько константных областей молекулы тяжелой цепи, такую как спейсер, содержащий Ig-шарнир, трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, полученный из CD40, или полученный из CD4, CD28 или CD8), TRAF-6-индуцирующий домен, который представляет собой полученный из CD40 цитоплазматический сигнальный домен и активирующий сигнальный домен CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен находится между трансмембранным доменом и активирующим сигнальным доменом.

Иллюстративный химерный рецептор, например CAR, представляет собой такой, который включает антигенсвязывающий домен, например scFv, который специфично связывает любой из антигенов, как описано в настоящем документе, например, анти-CD19-связывающий домен; полученный из Ig спейсер (например, представленный в SEQ ID NO: 1, например, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2), трансмембранный домен, полученный из человеческого CD28 (например, представленный в SEQ ID NO: 6, например, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 46); полученный из CD34 внутриклеточный сигнальный домен, например полученный из человеческого CD40 (например, представленный в SEQ ID NO: 12, например, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 34); и сигнальный домен, полученный из CD3-дзета (SEQ ID NO: 21, например, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 41). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит компоненты по порядку от N- к С-концу, как изображено выше. В некоторых вариантах осуществления лигандсвязывающий домен иллюстративного химерного рецептора, например CAR, который не связывается специфично с CD40L и/или не получен из CD40.

В некоторых вариантах осуществления CAR включает лигандсвязывающий домен, такой как домен распознавания антигена, описанный в настоящем документе, спейсер, такой как спейсер, содержащий часть молекулы иммуноглобулина, такую как шарнирная область и/или одна или более константных областей молекулы тяжелой цепи, такой как спейсер, содержащий Ig-шарнир, трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, полученный из RANK или полученный из CD4, CD28 или CD8), TRAF-6-индуцирующий домен, который представляет собой полученный из RANK цитоплазматический сигнальный домен и активирующий сигнальный домен CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен находится между трансмембранным доменом и активирующим сигнальным доменом.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, например CAR, включает лигандсвязывающий домен, такой как домен распознавания антигена, описанный в настоящем документе, спейсер, такой как спейсер, содержащий часть молекулы иммуноглобулина, такую как шарнирная область и/или одну или более константных областей молекулы тяжелой цепи, такую как спейсер, содержащий Ig-шарнир, трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, полученный из IL1R-1 или полученный из CD4, CD28 или CD8), TRAF-6-индуцирующий домен который представляет собой цитоплазматический сигнальный домен, полученный из IL1R-1, и активирующий сигнальный домен CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-индуцирующий домен находится между трансмембранным доменом и активирующим сигнальным доменом. В некоторых случаях, такой химерный рецептор представляет собой первый химерный рецептор, который может образовывать комплекс со вторым химерным рецептором, содержащим вспомогательный сигнальный домен IL1R-1Acp.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, например CAR, дополнительно включает вспомогательный сигнальный домен, который является цитоплазматическим доменом, полученным из IL1R-1AcP. В некоторых вариантах осуществления предложен второй химерный рецептор, который содержит вспомогательный сигнальный домен, который является цитоплазматическим доменом, полученным из IL1R-1Acp. В некоторых вариантах осуществления второй химерный рецептор включает лигандсвязывающий домен (который необязательно может быть таким же, как первый лигандсвязывающий домен), такой как домен распознавания антигена, описанный в настоящем документе, спейсер, такой как спейсер, содержащий часть молекулы иммуноглобулина, такую как шарнирная область и/или одна или более константных областей молекулы тяжелой цепи, такой как спейсер, содержащий Ig-шарнир, трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, полученный из IL1R-1AcP или полученный из CD4, CD28 или CD8), вспомогательный сигнальный домен, который является цитоплазматическим сигнальным доменом, полученным из IL1R-1AcP, и активирующий сигнальный домен CD3-дзета.

В некоторых вариантах осуществления два химерных рецептора, например CAR, в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, могут ассоциировать с образованием мультимерного комплекса, такого как функциональный гетеродимер. В некоторых аспектах первая TRAF-6-индуцирующая сигнальная молекула включена в один химерный рецептор, например CAR, а TRAF-6-свпомогательная сигнальная молекула включена в другой химерный рецептор, например CAR, где первый и второй химерные рецепторы оба экспрессируются в одной и той же клетке и взаимодействуют для опосредования TRAF-6-сигнализации. В некоторых вариантах осуществления TRAF-6-зависимая сигнальная молекула не является проапоптотической. Например, в некоторых вариантах осуществления предложены два химерных рецептора, например CAR, которые ассоциируют с образованием функционального гетеродимера, содержащего: a) первый химерный рецептор, например CAR, который включает лигандсвязывающий домен, такой как домен распознавания антигена, описанный в настоящем документе, спейсер, такой как спейсер, содержащий часть молекулы иммуноглобулина, такую как шарнирная область и/или одна или более константных областей молекулы тяжелой цепи, такой как спейсер, содержащий Ig-шарнир, трансмембранный домен, полученный из IL1R-1 цитоплазматический сигнальный домен и активирующий сигнальный домен CD3-дзета; и b) второй химерный рецептор, например CAR, который включает лигандсвязывающий домен, такой как домен распознавания антигена, описанный в настоящем документе, спейсер, такой как спейсер, содержащий часть молекулы иммуноглобулина, такую как шарнирная область и/или одну или несколько константных областей молекулы тяжелой цепи, такой как спейсер, содержащий Ig-шарнир, трансмембранный домен, вспомогательный сигнальный домен, полученный из IL1R-1AcP, и активирующий сигнальный домен CD3-дзета.

В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, CAR, дополнительно включает дополнительный костимулирующий сигнальный домен, такой как полученный из PI3K-индуцирующей сигнальной молекулы и/или полученный из костимулирующей сигнальной молекулы CD28, 4-1BB или ICOS. В некоторых вариантах осуществления дополнительный костимулирующий сигнальный домен находится между костимулирующим сигнальным доменом, полученным из TRAF-6-индуцирующей сигнальной молекулы, и активирующим сигнальным доменом.

В некоторых аспектах молекула нуклеиновой кислоты может быть модифицирована для использования в описанных в настоящем документе конструкциях. В некоторых случаях, последовательности могут быть сконструированы так, чтобы содержать концевые последовательности сайтов рестрикции для целей клонирования в векторы. В некоторых случаях последовательности могут быть модифицированы путем оптимизации кодонов. Оптимизация кодонов включает в себя баланс процентного содержания кодонов, отобранных по опубликованным данным об относительном содержании человеческих транспортных РНК, так что ни одна из них не будет перегружена или не будет ограничена. Это может быть необходимо в некоторых случаях, поскольку большинство аминокислот кодируются более чем одним кодоном, а использование кодонов варьируется от организма к организму. Различия в использовании кодонов между трансфецированными генами и клетками-хозяевами могут оказывать влияние на экспрессию белка и иммуногенность конструкции нуклеиновой кислоты. В общем случае для оптимизации кодонов выбирают такие кодоны, которые находятся в равновесии с частотой использования у человека. Как правило, избыточность кодонов для аминокислот такова, что разные кодоны кодируют одну аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления при выборе кодона для замены может быть желательным, чтобы полученная мутация была молчащей мутацией, так чтобы замена кодонов не влияла на аминокислотную последовательность. Как правило, последний нуклеотид кодона может оставаться неизменным, не затрагивая аминокислотной последовательности.

III. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОРЫ И СКОНСТРУИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ

Предложены способы, нуклеиновые кислоты, композиции и наборы для получения генетически сконструированных клеток. Генетическое конструирование обычно включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный рецептор, в композицию, содержащую культивируемые клетки, как например с помощью ретровирусной трансдукции, трансфекции или трансформации.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует рекомбинантные рецепторы, например химерный рецептор, такой как любой описанный выше. Также предложены векторы или конструкции, содержащие такие молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления векторы или конструкции содержат один или более промоторов, функционально связанных с нуклеотидом, кодирующим рецептор, для управления его экспрессией. В некоторых вариантах осуществления промотор функционально связан с одной или более молекулами нуклеиновой кислоты.

В некоторых случаях, когда сигнализация химерного рецептора облегчается ассоциацией в комплексе с другим химерным рецептором, таким как гомодимер или гетеродимер, то каждый химерный рецептор может кодироваться из той же нуклеиновой кислоты или из отдельных молекул нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления первый химерный рецептор и второй химерный рецептор кодируются отдельными молекулами нуклеиновых кислот, и каждый может быть индивидуально перенесен или введен в клетку для экспрессии обоих химерных рецепторов в клетке. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой одиночный полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления первый химерный рецептор и второй химерный рецептор оба кодируются на одном полинуклеотиде. В некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность для каждого химерного рецептора может быть функционально связана с промотором, которые могут быть одинаковыми или различными.

В некоторых вариантах осуществления вектор или конструкция может содержать один промотор, который управляет экспрессией одной или более молекул нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления такие промоторы могут быть мультицистронными (бицистронные или трицистронные, см., например, патент США № 6060273). Например, в некоторых вариантах осуществления транскрипционные единицы могут быть сконструированы в виде бицистронной единицы, содержащей IRES (внутренний сайт посадки рибосомы), который позволяет коэкспрессировать генные продукты (например, кодирующие первый и второй химерные рецепторы) сообщением от одного промотора. Альтернативно, в некоторых случаях один промотор может направлять экспрессию РНК, которая содержит в одной открытой рамке считывания (ORF) два или три гена (например, кодирующая первый и второй химерный рецептор), отделенные друг от друга последовательностями, кодирующими саморасщепляющийся пептид (например, T2A) или сайт распознавания протеазы (например, фурин). Таким образом, ORF кодирует один полипротеин, который либо во время (в случае T2A), либо после трансляции расщепляется на отдельные белки. В некоторых случаях пептид, такой как Т2А, может заставлять рибосому пропускать (рибосомный прыжок) синтез пептидной связи на С-конце 2А-элемента, что приводит к разделению между концом последовательности 2А и последующим ниже расположенным пептидом. Примерами расщепляющихся пептидов 2А, включая те, которые могут индуцировать рибосомный прыжок, являются T2A, P2A, E2A и F2A. Иллюстративные последовательности для 2A-элементов включают последовательности 2A из вируса ящура (F2A, например SEQ ID NO: 45), вируса лошадиного ринита A (E2A, например SEQ ID NO: 44), вируса Thosea asigna (T2A, например SEQ ID NO: 24 или 29) и свиного теховируса-1 (P2A, например SEQ ID NO: 42 или 43), как описано в публикации патента США №20070116690.

Также предложены клетки, такие как клетки, которые содержат сконструированный химерный рецептор, как описано в настоящем документе. Также предложены популяции таких клеток, композиции, содержащие такие клетки и/или обогащенные такими клетками, как например, в которых клетки, экспрессирующие химерный рецептор, составляют по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и более процентов от общего количества клеток в композиции или клеток определенного типа, таких как Т-клетки или CD8+ или CD4+ клетки. Среди композиций предложены фармацевтические композиции и составы для введения, например, для адоптивной клеточной терапии. Также предложены терапевтические способы введения клеток и композиций инивидуумам, например пациентам.

Таким образом, также предложены генетически сконструированные клетки, экспрессирующие химерные рецепторы, например клетки, содержащие CAR. Клетки обычно представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, и обычно являются человеческими клетками. В некоторых вариантах осуществления клетки получают из крови, костного мозга, лимфы или лимфоидных органов, являются клетками иммунной системы, такими как клетки врожденного или адаптивного иммунитета, например миелоидные или лимфоидные клетки, включая лимфоциты, обычно T клетки и/или NK-клетки. Другие иллюстративные клетки включают стволовые клетки, такие как мультипотентные и плюрипотентные стволовые клетки, включая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Клетки обычно являются первичными клетками, такими как те, которые выделены непосредственно из тканей пациента и/или выделены из тканей пациента и заморожены. В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более подгрупп Т-клеток или других типов клеток, таких как вся популяция Т-клеток, CD4+клетки, CD8+клетки и их субпопуляции, такие как те, которые определены по функции, состоянию активации, зрелости, потенциалу для дифференцировки, распространению, рециркуляции, локализации и/или способностям жизнестойкости, антиген-специфичности, типу антигенного рецептора, присутствию в определенном органе или компартменте, по маркеру или профилю секреции цитокинов и/или степени дифференцировки. Что касается пациента, подлежащего лечению, то клетки могут быть аллогенными и/или аутологичными. Среди методов включены стандартные методы. В некоторых аспектах, например, для стандартных технологий, клетки являются плюрипотентными и/или мультипотентными, такими как стволовые клетки, такие как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs). В некоторых вариантах осуществления способы включают выделение клеток у пациента, подготовку, обработку, культивирование и/или их конструирование, как описано в настоящем документе, и повторное введение их тому же пациенту до или после криоконсервации.

Среди подтипов и субпопуляций Т-клеток и/или CD4+ и/или CD8+ Т-клеток представлены наивные T (T_N) -клетки, эффекторные Т-клетки (T_EFF), Т-клетки памяти и их подтипы, такие как стволовые Т-клетки памяти (T_SCM), Т-клетки центральной памяти (TCM), Т-клетки эффекторной памяти (T_EM) или терминально дифференцированные Т-клетки эффекторной памяти, опухоль-инфильтрующие лимфоциты (TIL), незрелые Т-клетки, зрелые Т-клетки, хелперные Т-клетки, цитотоксические Т-клетки, связанные со слизистой инвариантные Т-клетки (MAIT), природные и адаптивные регуляторные Т-клетки (Treg), хелперные Т-клетки, такие как клетки TH1, клетки TH2, клетки TH3, клетки TH17, клетки TH9, клетки TH22, фолликулярные хелперные T-клетки, альфа/бета Т-клетки и дельта/гамма Т-клетки.

В некоторых вариантах осуществления клетки являются естественными киллерами (NK). В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой моноциты или гранулоциты, например миелоидные клетки, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы и/или базофилы.

В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более нуклеиновых кислот, вводимых посредством генетического клнструирования, и тем самым экспрессируют рекомбинантные или генетически сконструированные продукты таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, т.е. обычно не присутствуют в клетке или образце, полученном из клетки, таком как образец, полученный из другого организма или клетки, который, например, обычно не обнаруживается в клетке, которая была сконструирована, и/или в организме, из которого получена такая клетка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не являются природными, такие как нуклеиновая кислота, не обнаруженная в природе, включая нуклеиновую кислоту, содержащую химерные комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих различные домены из множества различных типов клеток.

A. Приготовление клеток для конструирования

В некоторых вариантах осуществления приготовление сконструированных клеток включает одну или более стадий культивирования и/или получения. Клетки для введения химерного рецептора, например CAR, могут быть выделены из образца, такого как биологический образец, например, полученный или выделенный из тканей пациента. В некоторых вариантах осуществления пациентом, из тканей которого выделена клетка, является пациент, имеющий заболевание или патологическое состояние или нуждающийся в клеточной терапии, или к которому будет применяться клеточная терапия. Пациентом в некоторых вариантах осуществления является человек, нуждающийся в конкретном терапевтическом вмешательстве, таком как адоптивная клеточная терапия, для которой клетки выделяют, процессируют и/или конструируют.

Соответственно, клетки в некоторых вариантах осуществления представляют собой первичные клетки, например первичные человеческие клетки. Образцы включают ткани, жидкости и другие образцы, взятые непосредственно у пациента, а также образцы, полученные в результате одной или более стадий процессирования, таких как разделение, центрифугирование, генетическое конструирование (например, трансдукция вирусным вектором), промывка и/или инкубация. Биологический образец может представлять собой образец, полученный непосредственно из биологического источника или процессированного образца. Биологические образцы включают, но не ограничиваются ими, биологические жидкости, такие как кровь, плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы тканей и органов, включая полученные из них процессированные образцы.

В некоторых аспектах образец, из которого получены или выделены клетки, является кровью или образцом, полученным из крови, или он представляет собой или получен из продукта афереза или лейкафереза. Иллюстративные образцы включают цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), лейкоциты, костный мозг, тимус, ткани биопсии, опухоль, лейкоз, лимфому, лимфатический узел, лимфоидную ткань, ассоциированную с кишечником, лимфоидную ткань, ассоциированную со слизистой оболочкой, селезенку, другие лимфоидные ткани, печень, легкие, желудок, кишечник, толстую кишку, почки, поджелудочную железу, грудь, кости, предстательную железу, шейку матки, яички, яичники, миндалины или другой орган и/или клетки, полученные из них. Образцы включают, в контексте клеточной терапии, например, адоптивной клеточной терапии, образцы из аутологичных и аллогенных источников.

В некоторых вариантах осуществления клетки получают из клеточных линий, например, Т-клеточных линий. Клетки в некоторых вариантах осуществления получают из ксеногенного источника, например, из мыши, крысы, примата, не являющегося человеком, или свиньи.

В некоторых вариантах выделение клеток включает одну или более стадий получения и/или неаффинного разделения клеток. В некоторых примерах клетки промывают, центрифугируют и/или инкубируют в присутствии одного или более реагентов, например, для удаления нежелательных компонентов, обогащения целевыми компонентами, лизиса или удаления клеток, чувствительных к конкретным реагентам. В некоторых примерах клетки разделяют на основе одного или более свойств, таких как плотность, адгезионные свойства, размер, чувствительность и/или устойчивость к конкретным компонентам.

В некоторых примерах клетки из циркулирующей крови пациента получают, например, путем афереза или лейкафереза. Образцы в некоторых аспектах содержат лимфоциты, в том числе Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядерные лейкоциты, эритроциты и/или тромбоциты, а в некоторых аспектах содержат клетки, отличные от эритроцитов и тромбоцитов.

В некоторых вариантах осуществления клетки крови, собранные у пациента, промывают, например, для удаления фракции плазмы и помещения клеток в соответствующий буфер или среду для последующих стадий обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают фосфатно-буферным солевым раствором (PBS). В некоторых вариантах осуществления в промывочном растворе отсутствуют кальций и/или магний и/или многие или все двухвалентные катионы. В некоторых аспектах стадию промывки выполняют полуавтоматически с помощью «проточной» центрифуги (например, процессор клеток Cobe 2991, Baxter) в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых аспектах стадию промывки осуществляют посредством фильтрации из тангенциального потока (TFF) в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых вариантах осуществления клетки ресуспендируют во множестве биосовместимых буферов после промывки, таких как, например, свободный от Ca⁺/Mg⁺⁺ PBS. В некоторых вариантах осуществления компоненты образца клеток крови удаляют, и клетки ресуспендируют непосредственно в культуральной среде.

В некоторых вариантах осуществления способы включают способы разделения клеток на основе плотности, такие как получение лейкоцитов из периферической крови путем лизиса эритроцитов и центрифугирования через градиент Перколла или Фикола.

В некоторых вариантах осуществления способы выделения включают разделение различных типов клеток на основе экспрессии или присутствия в клетке одной или более конкретных молекул, таких как поверхностные маркеры, например поверхностные белки, внутриклеточные маркеры или нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления может использоваться любой известный способ разделения на основе таких маркеров. В некоторых вариантах осуществления разделение представляет собой аффинное или иммуноаффинное разделение. Например, выделение в некоторых аспектах включает разделение клеток и клеточных популяций на основе экспрессии в клетках или уровня экспрессии одного или более маркеров, обычно маркеров клеточной поверхности, например, путем инкубации с антителом или партнером по связыванию, который специфично связывается с такими маркерами, обычно за этим следуют стадии промывки и разделения клеток, связанные с антителом или партнером по связыванию, от тех клеток, которые не связаны с антителом или партнером по связыванию.

Такие стадии разделения могут быть основаны на положительной селекции, в которой клетки, связанные с реагентами, сохраняются для дальнейшего использования, и/или на отрицательной селекции, в которой сохраняются клетки, не связанные с антителом или партнером по связыванию. В некоторых примерах обе фракции сохраняются для дальнейшего использования. В некоторых аспектах отрицательная селекция может быть особенно полезна там, где нет доступного антитела, которое конкретно идентифицирует тип клетки в гетерогенной популяции, так что отделение лучше всего проводить на основе маркеров, экспрессируемых клетками, отличными от целевой популяции.

Разделение не должно приводить к 100%-ному обогащению или удалению конкретной популяции клеток или клеток, экспрессирующих конкретный маркер. Например, положительная селекция или обогащение клеток определенного типа, таких как клетки, экспрессирующие маркер, относятся к увеличению количества или процента таких клеток, но необязательно приводит к полному отсутствию клеток, не экспрессирующих маркер. Аналогичным образом, отрицательная селекция, удаление или истощение клеток определенного типа, таких как те, которые экспрессируют маркер, относится к уменьшению количества или процента таких клеток, но не требует полного удаления всех таких клеток.

В некоторых примерах проводят несколько раундов разделения, где положительно или отрицательно селектированную фракцию из одной стадии подвергают другой стадии разделения, такой как последующая положительная или отрицательная селекция. В некоторых примерах одна стадия разделения может истощать клетки, экспрессирующие сразу несколько маркеров, например, путем инкубации клеток с множеством антител или партнеров по связыванию, каждые из которых специфичны для маркера, предназначенного для отрицательной селекции. Аналогично, множество типов клеток могут одновременно положительно селектированы путем инкубации клеток со множеством антител или партнеров по связыванию, экспрессированных на различных типах клеток.

Например, в некоторых аспектах специфичные субпопуляции Т-клеток, такие как клетки, положительные по или экспрессирующие высокий уровень одного или более поверхностных маркеров, например CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ и/или CD45RO+ Т-клетки, выделяют с помощью методов положительной или отрицательной селекции.

Например, CD3+, CD28+ Т-клетки могут быть положительно селектированы с использованием конъюгированных магнитных микросфер CD3/CD28 (например, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).

В некоторых вариантах осуществления выделение осуществляют путем обогащения определенной популяции клеток путем положительной селекции или путем истощения конкретной популяции клеток путем отрицательной селекции. В некоторых вариантах осуществления положительную или отрицательную селекцию осуществляют путем инкубации клеток с одним или более антителами или другим агентом связывания, которые специфично связываются с одним или более экспрессированным поверхностным маркером или экспрессированным (маркер +) на относительно более высоком уровне (маркер^{высокий}) на положительно или отрицательно селектированных клетках, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления Т-клетки отделяют от образца РВМС отрицательной селекцией маркеров, экспрессируемых на клетках, отличных от Т-клеток, на таких как В-клетки, моноциты или другие лейкоциты, такие как CD14. В некоторых аспектах стадию селекции CD4+ или CD8+ используют для разделения CD4+ хелперных и CD8+ цитотоксических Т-клеток. Такие популяции CD4+ и CD8+ могут быть дополнительно отсортированы на субпопуляции путем положительной или отрицательной селекции для экспрессированных маркеров или экспрессированных с относительно более высокой степенью на одной или более субпопуляциях наивных Т-клеток, Т-клеток памяти и/или эффекторных Т-клеток.

В некоторых вариантах осуществления CD8+клетки дополнительно обогащены или истощены по наивным клеткам, клеткам центральной памяти, клеткам эффекторной памяти и/или стволовым клеткам центральной памяти, как например, с помощью положительной или отрицательной селекции на основе поверхностных антигенов, связанных с соответствующей субпопуляцией. В некоторых вариантах осуществления обогащение для Т-клеток центральной памяти (TCM) осуществляют для повышения эффективности, например для улучшения долговременной выживаемости, распространения и/или трансплантации после введения, которые в некоторых аспектах особенно устойчивы в таких подгруппах. См. Terakuraet al. (2012) Blood.1: 72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701. В некоторых вариантах осуществления комбинирование TCM-обогащенных CD8+ T-клеток и CD4+ -T-клеток дополнительно повышает эффективность.

В вариантах осуществления Т-клетки памяти присутствуют как в CD62L+, так и в CD62L-подгруппах CD8+ лимфоцитов периферической крови. PBMC могут быть обогащены или обеднены фракциями CD62L-CD8+ и/или CD62L+ CD8+, например, с использованием антител против CD8 и анти-CD62L.

В некоторых вариантах осуществления обогащение для клеток центральной памяти (T_CM) основано на положительной или высокой поверхностной экспрессии CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD 127; в некоторых аспектах оно основано на отрицательной селекции для клеток, экспрессирующих или высоко экспрессирующих CD45RA и/или гранзим B. В некоторых аспектах выделение популяции CD8+, обогащенной клетками T_CM, осуществляют путем истощения клеток, экспрессирующих CD4, CD14, CD45RA, и положительной селекции или обогащения клеток, экспрессирующих CD62L. В одном аспекте осуществляют обогащение Т-клеток центральной памяти (T_CM), начиная с отрицательной фракции клеток, селектированных на основе экспрессии CD4, которую подвергают отрицательной селекции на основе экспрессии CD14 и CD45RA и положительной селекции на основе CD62L. Такую селекцию в некоторых аспектах осуществляют одновременно и в других аспектах выполняются последовательно, в любом порядке. В некоторых аспектах одна и та же стадия селекции на основе экспрессии CD4, используемая при получении популяции или субпопуляции CD8+клеток, также используется для генерации популяции или субпопуляции CD4+клеток, так что как положительная, так и отрицательная фракции, полученные после разделения на основе CD4, сохраняются и используются на последующих стадиях способов, необязательно после одной или более дополнительных стадий положительной или отрицательной селекции.

В конкретном примере образец РВМС или другой образец лейкоцитов подвергают селекции CD4+ клеток, где сохраняются как отрицательные, так и положительные фракции. Затем отрицательную фракцию подвергают отрицательной селекции на основе экспрессии CD14 и CD45RA или ROR1, и положительной селекции на основе характеристики маркеров Т-клеток центральной памяти, таких как CD62L или CCR7, где положительную и отрицательную селекцию проводят в любом порядке.

CD4+ T-хелперные клетки сортируются на наивные, клетки центральной памяти и эффекторные клетки путем идентификации популяций клеток, которые имеют антигены клеточной поверхности. CD4+ лимфоциты могут быть получены стандартными методами. В некоторых вариантах осуществления наивные CD4+ Т-лимфоциты представляют собой CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления CD4+ клетки центральной памяти являются CD62L+ и CD45RO+. В некоторых вариантах осуществления эффекторные CD4+ клетки представляют собой CD62L- и CD45RO-.

В одном примере для обогащения CD4+ клеток с помощью отрицательной селекции коктейль моноклональных антител обычно включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах осуществления антитело или партнер по связыванию связывают с твердой подложкой или матрицей, такой как магнитная микросфера или парамагнитная микросфера, чтобы обеспечить разделение клеток для положительной и/или отрицательной селекции. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки и популяции клеток разделяют или выделяют с использованием иммуномагнитных (или аффинно-магнитных) методов разделения (см. Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S.A. Brooks and U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).

В некоторых аспектах образец или композицию клеток, подлежащих разделению, инкубируют с небольшим намагничиваемым или магниточувствительным материалом, таким как магниточувствительные частицы или микрочастицы, такие как парамагнитные микросферы (например, такие как Dynalbeads или MACS). Магниточувствительный материал, например частица, как правило, прямо или косвенно прикрепляется к партнеру по связыванию, например антителу, которое специфично связывается с молекулой, например маркером поверхности, присутствующей на клетке, клетках или популяции клеток, которую целесообразно отделить, например, для отрицательной или положительной селекции.

В некоторых вариантах осуществления магнитная частица или микросфера содержит магниточувствительный материал, связанный с определенным связывающим элементом, таким как антитело или другой партнер по связыванию. Существует много хорошо известных магниточувствительных материалов, используемых в методах магнитного разделения. Подходящие магнитные частицы включают те, которые описаны в Molday, US Pat. №4452773 и в европейской патентной заявке EP 452342 B, которые включены в настоящее описание путем ссылки. Другие примеры - это частицы коллоидного размера, такие как описанные в патенте США Owen. №4795698 и Liberti et al., Пат. США №5200084.

Инкубацию обычно проводят в условиях, когда антитела или партнеры по связыванию или молекулы, такие как вторичные антитела или другие реагенты, которые специфично связываются с такими антителами или партнерами по связыванию, которые присоединены к магнитной частице или микросфере, специфично связываются с молекулой клеточной поверхности, если они присутствуют на клетках в образце.

В некоторых аспектах образец помещается в магнитное поле, и те клетки, которые прикреплены к ним магниточувствительными или намагничиваемыми частицами, будут притягиваться к магниту и отделяться от немеченых клеток. Для положительной селекции клетки, притягиваемые к магниту, сохраняются; для отрицательной селекции клетки, которые не притягиваются (немеченые клетки), сохраняются. В некоторых аспектах комбинацию положительной и отрицательной селекции выполняют на той же стадии селекции, где положительные и отрицательные фракции сохраняются и обрабатываются далее или подвергаются дополнительным стадиям разделения.

В некоторых вариантах осуществления магниточувствительные частицы покрывают первичными антителами или другими партнерами по связыванию, вторичными антителами, лектинами, ферментами или стрептавидином. В некоторых вариантах осуществления магнитные частицы прикрепляются к клеткам посредством покрытия первичных антител, специфичных для одного или более маркеров. В некоторых вариантах осуществления клетки, а не микросферы, метят первичным антителом или партнером по связыванию, а затем добавляют магнитные частицы с покрытием в виде специфичного для клеток вторичного антитела или другого партнера по связыванию (например, стрептавидина). В некоторых вариантах изобретения магнитные частицы, покрытые стрептавидином, используют в комбинации с биотинилированными первичными или вторичными антителами.

В некоторых вариантах осуществления магниточувствительные частицы остаются прикрепленными к клеткам, которые должны затем инкубироваться, культивироваться и/или конструироваться; в некоторых аспектах частицы остаются прикрепленными к клеткам для введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые или магниточувствительные частицы удаляются из клеток. Способы удаления намагничиваемых частиц из клеток известны и включают, например, использование конкурирующих немеченых антител, намагничиваемых частиц или антител, конъюгированных с отщепляемыми линкерами и т.д. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые частицы являются биодеградируемыми.

В некоторых вариантах осуществления селекцию на основе аффинности осуществляют посредством сортировки с использованием магнитно-активированных клеток (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Системы магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) способны к высокочистой селекции клеток, содержащих намагниченные частицы, прикрепленными к ним. В некоторых вариантах осуществления MACS работает в режиме, в котором нецелевые и целевые виды последовательно элюируются после применения внешнего магнитного поля. То есть клетки, прикрепленные к намагниченным частицам, удерживаются на месте, в то время как неприкрепленные образцы элюируются. Затем, после того как эта первая стадия элюирования завершена, образцы, которые были захвачены в магнитном поле и не могут быть элюированы, освобождаются некоторым образом, так что их можно элюировать и извлечь. В некоторых вариантах осуществления клетки, не являющиеся мишенями, помечены и истощены в гетерогенной популяции клеток.

В некоторых вариантах осуществления выделение или разделение осуществляют с использованием системы, устройства или аппарата, который выполняет одну или более операций получения, выделения, разделения, обработки, инкубации, культивирования и /или стадий смешивания состава. В некоторых аспектах система используется для выполнения каждой из этих стадий в закрытой или стерильной среде, например, для сведения к минимуму ошибок, операций пользователей и/или загрязнения. В одном примере система представляет собой систему, описанную в международной патентной заявке, номер публикации WO 2009/072003 или US 20110003380 A1.

В некоторых вариантах осуществления система или аппарат выполняет одну или более стадий, например, все стадии выделения, обработки, конструирования и приготовления состава в интегрированной или автономной системе и/или автоматизированным или программируемым способом. В некоторых аспектах система или аппарат включает компьютер и/или компьютерную программу, сообщающуюся с системой или аппаратом, которая позволяет пользователю программировать, контролировать, оценивать результаты и/или корректировать различные аспекты стадий обработки, выделения, конструирования и приготовления состава.

В некоторых аспектах разделение и/или другие стадии осуществляют с использованием системы CliniMACS (Miltenyi Biotic), например, для автоматизированного разделения клеток на уровне клинического масштаба в закрытой и стерильной системе. Компоненты могут включать интегрированный микрокомпьютер, блок магнитного разделения, перистальтический насос и различные зажимные клапаны. Интегрированный компьютер в некоторых аспектах контролирует все компоненты инструмента и направляет систему на выполнение повторных процедур в стандартизованной последовательности. Блок магнитного разделения в некоторых аспектах включает подвижный постоянный магнит и держатель для колонки селекции. Перистальтический насос управляет скоростью потока во всем наборе трубок и вместе с зажимными клапанами обеспечивает контролируемый поток буфера через систему и постоянную суспензию клеток.

Система CliniMACS в некоторых аспектах использует связанные с антителом намагничиваемые частицы, которые поставляются в стерильном непирогенном растворе. В некоторых вариантах осуществления после мечения клеток магнитными частицами клетки промывают для удаления избытка частиц. Затем контейнер для подготовки клеток соединяется с набором трубок, которые, в свою очередь, соединены с контейнером, содержащим буфер и контейнером для сбора клеток. Комплект трубок состоит из предварительно собранных стерильных трубок, включая колонку предварительного разделения и колонку разделения, и предназначен только для одноразового использования. После запуска программы разделения система автоматически наносит образец клеток в колонку для разделения. Меченые клетки сохраняются внутри колонки, а немеченые клетки удаляются с помощью серии стадий промывки. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для использования с описанными в настоящем документе способами являются немечеными и не сохраняются в колонке. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для использования в описанных в настоящем документе способах являются мечеными и сохраняются в колонке. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для использования в описанных в настоящем документе способах элюируются из колонки после удаления магнитного поля и собираются внутри контейнера для сбора клеток.

В некоторых вариантах осуществления разделение и/или другие стадии осуществляют с использованием системы CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). Система CliniMACS Prodigy в некоторых аспектах оснащена блоком для обработки клеток, что позволяет автоматизировать промывку и фракционирование клеток центрифугированием. Система CliniMACS Prodigy может также включать программное обеспечение бортовой камеры и распознавания изображений, которое определяет оптимальную конечную точку фракционирования клеток, определяя макроскопические слои продукта исходной клетки. Например, периферическая кровь может быть автоматически разделена на слои эритроцитов, лейкоцитов и плазмы. Система CliniMACS Prodigy может также включать встроенную камеру культивирования клеток, которая выполняет протоколы клеточного культивирования, такие как, например, дифференцировка и наработка клеток, загрузка антигена и продолжительное культивирование клеток. Входные порты могут обеспечивать стерильное удаление и пополнение среды, а клетки можно контролировать с помощью встроенного микроскопа. См., например, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82, и Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем документе, собирают и обогащают (или истощают) с помощью проточной цитометрии, в которой клетки, окрашенные на множественных маркеров клеточной поверхности, переносят в жидкостной поток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем документе, собирают и обогащают (или истощают) посредством (FACS)-сортировка препаративного масштаба. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем документе, собирают и обогащают (или истощают) с использованием чипов микроэлектромеханических систем (MEMS) в комбинации с системой обнаружения на основе FACS (см., например, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; и Godin et al. (2008) J Biophoton. 1 (5): 355-376. В обоих случаях клетки могут быть помечены несколькими маркерами, что позволяет выделять четко определенные подгруппы T-клеток с высокой степенью чистоты.

В некоторых вариантах осуществления антитела или партнеры по связыванию помечены одним или более детектируемыми маркерами для облегчения разделения для положительной и/или отрицательной селекции. Например, разделение может быть основано на связывании с флуоресцентно мечеными антителами. В некоторых примерах разделение клеток на основе связывания антител или других партнеров связывания, специфичных для одного или более маркеров клеточной поверхности, переносится в жидкостной поток, как например, с помощью флуоресцентно активированной сортировки клеток (FACS), включая препаративный масштаб (FACS) и/или чипы микроэлектромеханических систем (MEMS), например, в комбинации с проточно-цитометрической системой обнаружения. Такие методы позволяют проводить положительную и отрицательную селекцию на основе множества маркеров одновременно.

В некоторых вариантах осуществления способы получения включают стадии замораживания, например, криоконсервацию клеток, до или после выделения, инкубации и/или конструирования. В некоторых вариантах осуществления стадия замораживания и последующего оттаивания удаляет гранулоциты и, в некоторой степени, моноциты из популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки суспендируют в замораживающемся растворе, например, после стадии промывки для удаления плазмы и тромбоцитов. В некоторых аспектах может использоваться любой из множества известных растворов и параметров замораживания. Один пример включает использование PBS, содержащего 20% ДМСО и 8% человеческого сывороточного альбумина (HSA), или других подходящих клеточных замораживающих сред. Затем его разбавляют средой 1:1, так что конечная концентрация ДМСО и HSA составляет 10% и 4%, соответственно. Затем клетки замораживают до -80 °С со скоростью 1 °С в минуту и хранят в газообразной фазе в резервуара для хранения жидкого азота.

В некоторых вариантах осуществления предлагаемые способы включают в себя стадии культивирования, инкубации, культивирования и/или генетического конструирования. Например, в некоторых вариантах осуществления предложены способы инкубации и/или конструирования популяций обедненных клеток и композиций для инициации культивирования.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления популяции клеток инкубируют в композиции для инициации культивирования. Инкубацию и/или конструирование можно проводить в сосуде для культивирования, таком как блок, камера, лунка, колонка, трубка, комплект трубок, клапан, флакон, культуральная чашка, контейнер или другой контейнер для культуры или культивирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют и/или культивируют до или в связи с генетическим конструированием. Стадии инкубации могут включать культуру, культивирование, стимулирование, активацию и/или наращивание. В некоторых вариантах осуществления композиции или клетки инкубируют в присутствии стимулирующих условий или стимулирующего агента. Такие условия включают те, которые предназначены для индуцирования пролиферации, распространения, активации и/или выживания клеток в популяции, для имитации воздействия антигена и/или для стимулирования клеток для генетического конструирования, как например, для введения рекомбинантного антигенного рецептора.

Условия могут включать одну или более конкретных сред, температуру, содержание кислорода, содержание диоксида углерода, время, агенты, например, питательные вещества, аминокислоты, антибиотики, ионы и/или стимулирующие факторы, такие как цитокины, хемокины, антигены, партнеры по связыванию, слитые белки, рекомбинантные растворимые рецепторы и любые другие агенты, предназначенные для активации клеток.

В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия или агенты включают один или более агентов, например лиганд, который способен активировать внутриклеточный сигнальный домен комплекса TCR. В некоторых аспектах агент включает или инициирует внутриклеточный сигнальный каскад TCR/CD3 в Т-клетке. Такие агенты могут включать антитела, такие как те, которые специфичны для компонента TCR и/или костимулирующего рецептора, например, антитело против CD3, антитело против CD28, например, связанные с твердой подложкой, такой как микросфера, и/или один или более цитокинов. Необязательно, способ распространения может дополнительно включать стадию добавления антитела против CD3 и/или антитела против CD28 к культуральной среде (например, при концентрации по меньшей мере примерно 0,5 нг/мл). В некоторых вариантах осуществления стимулирующие агенты включают IL-2 и/или IL-15, например, IL-2 в концентрации, по меньшей мере, примерно 10 единиц/мл.

В некоторых аспектах инкубацию проводят в соответствии с методами, описанными в патенте США №6040177, Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1: 72-82 и/или Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.

В некоторых вариантах осуществления Т-клетки наращиваются путем добавления фидерных клеток к композиции инициации культивирования, такие как не делящиеся мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) (например, такие, что результирующая популяция клеток содержит по меньшей мере примерно 5, 10, 20 или 40 или более фидерных клеток РВМС для каждого Т-лимфоцита в исходной популяции, подлежащей наращиванию); и инкубации культуры (например, в течение времени, достаточного для наращивания числа Т-клеток). В некоторых аспектах не делящиеся фидерных клетки могут содержать гамма-облученные фидерных клетки РВМС. В некоторых вариантах осуществления РВМС облучают гамма-лучами в диапазоне примерно от 3000 до 3600 рад для предотвращения деления клеток. В некоторых аспектах фидерных клетки добавляют в культуральную среду до добавления популяций Т-клеток.

В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают температуру, подходящую для роста человеческих Т-лимфоцитов, например, по меньшей мере, примерно 25 градусов по Цельсию, обычно по меньшей мере примерно 30 градусов и обычно при температуре ровно или примерно 37 градусов по Цельсию. Необязательно, инкубация может дополнительно включать добавление не делящихся EBV-трансформированных лимфобластоидных клеток (LCL) в качестве фидерных клеток. LCL может облучаться гамма-лучами в диапазоне от 6000 до 10000 рад. Фидерные клетки LCL в некоторых аспектах предоставляются в любом подходящем количестве, таком как при соотношении фидерных клеток LCL к исходным Т-лимфоцитам, составляющем по меньшей мере, примерно 10:1.

В вариантах осуществления антигенспецифичные Т-клетки, такие как антигенспецифичные CD4+ и/или CD8+ Т-клетки, получают путем стимулирования наивных или антигенспецифичных Т-лимфоцитов антигеном. Например, антигенспецифичные Т-клеточные линии или клоны могут быть сгенерированы в цитомегаловирусные антигены путем выделения Т-клеток у инфицированных пациентов и стимулирования клеток in vitro тем же антигеном.

B. Векторы и методы для генетического конструирования

Различные методы введения генетически сконструированных компонентов, например антигенных рецепторов, например CAR или TCR, хорошо известны и могут быть использованы с помощью предлагаемых способов и композиций. Иллюстративные методы включают методы переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы, в том числе посредством вирусных векторов, например ретровирусных или лентивирусных, невирусных векторов или транспозонов, например с помощью системы транспозонов Sleeping Beauty. Методы переноса гена могут включать трансдукцию, электропорацию или другой метод, который приводит к переносу гена в клетку.

В некоторых вариантах осуществления перенос гена осуществляется сначала стимулированием клетки, например, путем ее объединения со стимулом, который индуцирует ответ, такой как пролиферация, жизнеспособность и/или активация, например, как измерено с помощью экспрессии цитокина или маркера активации, с последующей трансдукцией активированных клеток и наращиванием в культуре до количеств, достаточных для клинических применений.

В некоторых контекстах сверхэкспрессия стимулирующего фактора (например, лимфокина или цитокина) может быть токсичной для пациента. Таким образом, в некоторых контекстах сконструированные клетки включают сегменты генов, которые заставляют клетки быть восприимчивыми к отрицательной селекции in vivo, например, при введении в адоптивной иммунотерапии. Например, в некоторых аспектах клетки сконструированы так, что их можно устранить в результате изменения in vivo состояния пациента, которому их вводят. Отрицательный селектированный фенотип может быть результатом вставки гена, который обеспечивает чувствительность к вводимому агенту, например, к соединению. Отрицательные селектируемые гены включают ген тимидинкиназы вируса простого герпеса типа 1 (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell II: 223, I777), который придает чувствительность ганцикловира; гена клеточной гипоксантин-фосфоризилтрансферазы (HPRT), гена клеточной аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT), бактериальной цитозиндезаминазы (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в клетки с использованием рекомбинантных инфицирующих вирусных частиц, таких как, например, векторы, полученные из обезьяньего вируса 40 (SV40), аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в Т-клетки с использованием рекомбинантных лентивирусных векторов или ретровирусных векторов, таких как гамма-ретровирусные векторы (см., например, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi:10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10):1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557.

В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор имеет последовательность длинных концевых повторов (LTR), например ретровирусный вектор, полученный из вируса лейкоза мыши Moloney (MoMLV), вируса миелопролиферативной саркомы (MPSV), мышиного эмбрионального вируса стволовых клеток (MESV), мышиного вируса стволовых клеток (MSCV), вирус некроза селезенки (SFFV) или аденоассоциированного вируса (AAV). Большинство ретровирусных векторов получают из мышиных ретровирусов. В некоторых вариантах осуществления ретровирусы включают те, которые получены из любого источника клеток птиц или млекопитающих. Ретровирусы обычно являются амфотропными, что означает, что они способны инфицировать клетки-хозяева нескольких видов, включая людей. В одном варианте осуществления экспрессируемый ген заменяет ретровирусные последовательности gag, pol и/или env. Был описан ряд иллюстративных ретровирусных систем (например, патенты США №№ 5219740, 6207453, 5219740, Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7: 980-990, Miller, AD (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; и Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

Известны способы лентивирусной трансдукции. Иллюстративные методы описаны, например, в Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; и Cavalieri et al. (2003) Blood. 102 (2): 497-505.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в Т-клетки посредством электропорации (см., например, Chicaybam et al., (2013) PLoS ONE 8 (3): e60298 и Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7 (16):1431-1437). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в Т-клетки посредством транспозиции (см., например, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21 (4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; и Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506:115-126). Другие методы введения и экспрессии генетического материала в иммунных клетках включают трансфекцию фосфатом кальция (например, как описано в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. NY), слияние протопластов, катионная опосредованная липосомами трансфекция; бомбардировка микрочастицами, облегченная вольфрамовой частицей (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и копреципитация ДНК и фосфата стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

Другие подходы и векторы для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантные продукты, представляют собой те, которые описаны, например, в международной патентной заявке, публикация № WO 02014055668 и в патенте США № 7446190.

В некоторых вариантах осуществления клетки, например, Т-клетки, могут трансфецироваться либо во время, либо после наращивания, например, Т-клеточным рецептором (TCR) или химерным антигенным рецептором (CAR). Эта трансфекция для введения гена целевого рецептора может быть проведена, например, с использованием любого подходящего ретровирусного вектора. Затем генетически модифицированную клеточную популяцию можно освободить от исходного стимула (например, стимула CD3/CD28), а затем стимулировать с использованием стимулирования второго типа, например, через вводимый рецептор de novo). Этот второй тип стимула может включать антигенный стимул в форме молекулы пептида/МНС, родственного (перекрестно связывающегося) лиганда генетически вводимого рецептора (например, природного лиганда CAR) или любого лиганда (такого как антитело), который непосредственно связывается внутри каркаса нового рецептора (например, путем распознавания константных областей внутри рецептора). См., например, Cheadle et al, «Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy» Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 or Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014).

Среди дополнительных нуклеиновых кислот, например, гены для введения, представляют собой такие, которые повышают эффективность терапии, например, способствуя жизнеспособности и/или функции переносимых клеток; гены для обеспечения генетического маркера для селекции и/или оценки клеток, такие как для оценки in vivo выживаемости или локализации; гены для повышения безопасности, например, которые делают клетку восприимчивой к отрицательной селекции in vivo, как описано Lupton SD et al., Mol. и Cell Biol., 11: 6 (1991); и Riddell et al., Human Gene Therapy 3: 319-338 (1992); см. также публикации PCT/US 91/08442 и PCT/US 94/05601 от Lupton et al., описывающие использование бифункциональных селективных слитых генов, полученных в результате слияния доминанатного положительного маркера селекции с отрицательным маркером селекции. См., например, Riddell и др., Патент США №6040177, в столбцах 14-17.

IV. КОМПОЗИЦИИ, СОСТАВЫ И МЕТОДЫ ВВЕДЕНИЯ

Также представлены композиции, содержащие химерный рецептор, такой как CAR, например содержащий сигнальный домен, полученный из CD40, и композиции, содержащие сконструированные клетки, включая фармацевтические композиции и составы. Также предложены способы применения и применение композиций, например, при лечении заболеваний, патологических состояний и расстройств, при которых экспрессируется антиген, или в методах дететктирования, диагностики и прогностики.

A. Композиции/Составы

Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить эффективную биологическую активность активного ингредиента, содержащегося в нем, и которая не содержит дополнительных компонентов, которые неприемлемо токсичны для пациента, которому эту композицию будут вводить.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для пациента. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается ими, буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.

В некоторых аспектах выбор носителя определяется частично конкретной клеткой и/или способом введения. Соответственно, существует множество подходящих составов. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. В некоторых аспектах используется смесь из двух или более консервантов. Консервант или их смеси обычно присутствуют в количестве примерно от 0,0001% примерно до 2% от общей массы композиции. Носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980 г.). Фармацевтически приемлемые носители, как правило, нетоксичны для реципиентов при используемых дозах и концентрациях и включают, но не ограничиваются ими: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмонийхлорид, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Буферные агенты в некоторых аспектах включены в композиции. Подходящие буферные агенты включают, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. В некоторых аспектах используется смесь двух или более буферных агентов. Буферный агент или их смеси обычно присутствуют в количестве примерно от 0,001% примерно до 4% от общей массы композиции. Известны способы получения фармацевтических композиций для введения. Иллюстративные методы описаны более подробно, например, в Remington: Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21^st ed. (May 1, 2005).

Состав или композиция могут также содержать более одного активного ингредиента, пригодного для конкретного показания, заболевания или патологического состояния, подвергаемого лечению клетками, предпочтительно с активностями, дополняющими клетку, где соответствующие активности не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга. Такие активные ингредиенты подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для назначенной цели. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает другие фармацевтически активные агенты или лекарственные средства, такие как химиотерапевтические агенты, например, аспарагиназу, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевину, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и т.д.

Фармацевтическая композиция в некоторых вариантах осуществления содержит клетки в количествах, эффективных для лечения или предотвращения заболевания или патологического состояния, таких как терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество. Терапевтическая или профилактическая эффективность в некоторых вариантах осуществления контролируется путем периодического обследования подвергнутых лечению пациентов. При повторных введениях в течение нескольких дней или продолжительнее, в зависимости от состояния, лечение повторяют до тех пор, пока не произойдет целевое подавление симптомов заболевания. Однако другие режимы дозировки могут быть полезными и могут быть определены. Целевую дозу можно доставлять посредством одного болюсного введения композиции, путем множественных болюсных введений композиции или путем непрерывной инфузии композиции.

Клетки могут вводиться с использованием стандартных методов введения, составов и/или устройств. Предусмотрены составы и устройства, такие как шприцы и флаконы, для хранения и введения композиций. Введение клеток может быть аутологичным или гетерологичным. Например, иммуноположительные клетки или предшественники могут быть получены от одного пациента и введены тому же пациенту или другому совместимому пациенту. Полученные из периферической крови иммуноположительные клетки или их потомство (например, in vivo, ex vivo или in vitro) можно вводить посредством локализованной инъекции, включающей введение катетера, системной инъекции, местной инъекции, внутривенной инъекции или парентерального введения. При введении терапевтической композиции (например, фармацевтической композиции, содержащей генетически модифицированную иммунореактивную клетку) ее обычно готовят в виде стандартной лекарственной формы (раствор, суспензия, эмульсия).

Составы включают средства для перорального, внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, легочного, трансдермального, внутримышечного, интраназального, буккального, сублингвального или суппозиторального введения. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток вводят парентерально. Используемый в настоящем описании термин «парентеральное» включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное и внутрибрюшинное введение. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток вводят пациенту с использованием периферической системной доставки путем внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции.

Композиции в некоторых вариантах осуществления представлены в виде стерильных жидких препаратов, например, в виде изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий, дисперсий или вязких композиций, которые в некоторых аспектах могут быть забуферены до выбранного рН. Жидкие препараты обычно легче для приготовления чем гели, другие вязкие композиции и твердые композиции. Кроме того, жидкие композиции несколько более удобны для введения, особенно путем инъекции. С другой стороны, вязкие композиции могут быть приготовлены в соответствующем диапазоне вязкости, чтобы обеспечить более длительные периоды контакта с конкретными тканями. Жидкие или вязкие композиции могут содержать носители, которые могут быть растворителем или диспергирующей средой, содержащей, например, воду, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и их подходящие смеси.

Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения клеток в растворитель, как например, в смеси с подходящим носителем, разбавителем или вспомогательным веществом, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза, декстроза или тому подобное. Композиции также могут быть лиофилизированы. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие, диспергирующие или эмульгирующие агенты (например, метилцеллюлоза), буферные агенты рН, добавки для повышения гелеобразования или повышения вязкости, консерванты, ароматизаторы, красители и тому подобное, в зависимости от пути введения и целевого препарата. В некоторых аспектах могут быть проведены стандартные тесты с целью приготовления подходящих препаратов.

Могут быть добавлены различные добавки, которые повышают стабильность и стерильность композиций, включая антимикробные консерванты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и буферы. Предотвращение воздействия микроорганизмов может быть обеспечено с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и тому подобного. Пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы может быть достигнуто путем использования агентов, задерживающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

Составы, используемые для in vivo-введения, обычно являются стерильными. Стерильность может быть легко достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

B. Методы введения

Предлагаются методы введения клеток, популяций и композиций и использования таких клеток, популяций и композиций для лечения или предотвращения заболеваний, патологических состояний и расстройств, включая злокачественные новообразования. В некоторых вариантах осуществления клетки, популяции и композиции вводят индивидууму или пациенту, имеющему конкретное заболевание или патологическое состояние, подлежащее лечению, например, посредством адоптивной клеточной терапии, такой как адоптивная Т-клеточная терапия. В некоторых вариантах осуществления клетки и композиции вводят пациенту, например пациенту, имеющему заболевание или патологическое состояние или подверженному риску заболевания или патологического состояния. В некоторых аспектах методы, таким образом, подвергают лечению, например, улучшают один или несколько симптомов заболевания или патологического состояния, например, путем уменьшения опухолевой нагрузки при злокачественном новообразовании, клетки которого экспрессируют антиген, распознаваемый сконструированной Т-клеткой.

Методы введения клеток для адоптивной клеточной терапии известны и могут быть использованы в связи с предложенными способами и композициями. Например, методы адоптивной Т-клеточной терапии описаны, например, в публикации патентной заявки США №2003/0170238 на имя Gruenberg et al. Патент США №4690915 на имя Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10): 577-85). См., например, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1): 84-9; Davila et al. (2013) PLOS ONE 8 (4): e61338.

Используемый в настоящем описании термин «пациент» представляет собой млекопитающее, такое как человек или другое животное, и обычно является человеком. В некоторых вариантах осуществления пациент, например пациент, которому вводят клетки, клеточные популяции или композиции, является млекопитающим, обычно приматом, таким как человек. В некоторых вариантах осуществления приматом является обезьяна или человекообразная обезьяна. Пациент может быть мужского пола или женского и может быть любого подходящего возраста, включая младенцев, молодежь, подростков, взрослых и гериатрических пациентов. В некоторых вариантах осуществления пациент является млекопитающим, не являющимся приматом, таким как грызун.

Используемый в настоящем описании термин «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «лечащий») относится к полному или частичному улучшению или ослаблению заболевания или патологического состояния или расстройства, или симптома, неблагоприятного эффекта или результата или связанного с ним фенотипа. Целевые эффекты лечения включают, но не ограничиваются ими, предотвращение возникновения или рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазов, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или ослабление болезненного состояния, ремиссию или улучшение прогноза. Эти термины не подразумевают полного излечения болезни или полного устранения каких-либо симптомов или эффектов по всем симптомам или результатам.

Используемый в настоящем описании термин «задержка развития заболевания» означает отсрочку, затруднение, замедление, задержку, стабилизацию, подавление и/или отсрочку развития заболевания (например, злокачественного новообразования). Эта задержка может быть разной продолжительности по времени, в зависимости от истории болезни и/или от индивидуума, который подвергается лечению. Как очевидно специалисту в данной области, достаточная или значительная задержка может, по сути, охватывать предотвращение, в случае которого у индивидуума не развивается заболевание. Например, может задерживаться злокачественное новообразование поздней стадии, такое как развитие метастазов.

Используемый в настоящем описании термин «предотвращение» включает обеспечение профилактики в отношении возникновения или рецидива заболевания у пациента, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого это заболевание еще не диагностировали. В некоторых вариантах осуществления предлагаемые клетки и композиции используются для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.

Используемый в настоящем описании термин «подавление» функции или активности заключается в уменьшении функции или активности по сравнению с другими аналогичными состояниями, за исключением состояния или параметра, представляющего интерес, или, альтернативно, по сравнению с другим состоянием. Например, клетки, которые подавляют рост опухоли, уменьшают скорость роста опухоли по сравнению со скоростью роста опухоли при отсутствии клеток.

«Эффективное количество» агента, например фармацевтической композиции, клеток или композиции в контексте введения, относится к количеству, эффективному в дозах/количествах и в течение периодов времени, необходимых для достижения целевого результата, такого как терапевтический или профилактический результат.

«Терапевтически эффективное количество» агента, например фармацевтической композиции или клеток, относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения целевого терапевтического результата, такого как лечение заболевания, патологического состояния, или расстройства, и/или фармакокинетического или фармакодинамического эффекта лечения. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и масса пациента, а также популяции вводимых клеток. В некоторых вариантах осуществления предлагаемые способы включают введение клеток и/или композиций в эффективных количествах, например, терапевтически эффективных количествах.

«Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения целевого профилактического результата. Обычно, но необязательно, поскольку профилактическая доза используется у пациентов до или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше терапевтически эффективного количества.

Заболеванием или патологическим состоянием, которое подвергают лечению, может быть любое, при котором экспрессия антигена ассоциирована и/или участвует в этиологии патологического состояния или расстройства, например, вызывает, усугубляет или иным образом участвует в таком заболевании, патологическом состоянии или расстройстве. Примерами заболеваний и патологических состояний могут быть заболевания или патологические состояния, ассоциированные со злокачественными новообразованиями или трансформацией клеток (например, рак), аутоиммунным или воспалительным заболеванием или инфекционным заболеванием, например, вызванным бактериальным, вирусным или другим патогеном. Выше описаны иллюстративные антигены, которые включают в себя антигены, ассоциированные с различными заболеваниями и патологическими состояниями, которые могут быть подвергнуты лечению. В конкретных вариантах осуществления химерный антигенный рецептор или трансгенный TCR специфично связывается с антигеном, ассоциированным с заболеванием или патологическим состоянием.

В некоторых вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой опухоль, такую как солидная опухоль, лимфома, лейкоз, гемобластоз, метастатическая опухоль или другой тип злокачественного новообразования или опухоли.

В некоторых вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой инфекционное заболевание или патологическое состояние, такие как, но не ограничиваясь ими, вирусные, ретровирусные, бактериальные и протозойные инфекции, иммунодефицит, цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барра (EBV), аденовирус, BK полиомавирус. В некоторых вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние являются аутоиммунным или воспалительным заболеванием или патологическое состоянием, таким как артрит, например, ревматоидный артрит (РА), диабет типа I, системная красная волчанка (СКВ), воспалительное заболевание кишечника, псориаз, склеродермия, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, болезнь Грейвса, болезнь Крона, рассеянный склероз, астма и/или заболевания или патологические состояния, ассоциированные с трансплантацией.

В некоторых вариантах осуществления антиген, ассоциированный с заболеванием или расстройством, выбран из группы, состоящей из орфанного рецептора ROR1 тирозинкиназы, антигена созревания В-клеток (BCMA), tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA, поверхностного антигена гепатита В, антитела против фолатного рецептора, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 или 4, димеров erbB, EGFR vIII, FBP, FCRL5, FCRH5, фетального рецептор ацетихолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-альфа, IL-13R-альфа2, kdr, легкой цепи каппа, Lewis Y, молекулы адгезии L1-клеток, (L1-CAM), Меланома-ассоциированного антигена (MAGE) - A1, MAGE-A3, MAGE-A6, предпочтительно экспрессируемого антигена меланомы (PRAME), сурвивина, EGP2, EGP40, TAG72, B7-H6, рецептора IL-13 a2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, рецептора фолата-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6-интегрина, 8H9, NCAM, VEGF-рецепторов, 5T4, фетального AchR, NKG2D-лигандов, CD44v6, двойного антигена и антигена, ассоциированного с универсальным маркером, антигена рака яичек, мезотелина, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D-лигандов, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкофетального антигена, ROR1, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбрионального антигена (CEA), простата-специфичного антигена, PSMA, Her2/neu, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфринаВ2, CD123, c-Met, GD-2, O-ацетилированного GD2 (OGD2), CE7, Опухоли Вильмса 1 (WT-1), циклина, циклина A2, CCL-1, CD138 и/или биотинилированных молекул и/или патогенспецифичного антигена, такого как молекулы, экспрессируемые HIV, HCV, HBV или другими патогенами.

Таким образом, предлагаемые способы и применения включают способы и применения для адоптивной клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение клеток или композиции, содержащей клетки, пациенту, в ткань или в клетку, таким пациентам, как те, что имеют риск или предрасположенность к наличию заболевания, патологического состояния или расстройства. В некоторых вариантах осуществления клетки, популяции и композиции вводят пациенту, имеющему конкретное заболевание или патологическое состояние, подлежащие лечению, например, с помощью адоптивной клеточной терапии, такой как адоптивная Т-клеточная терапия. В некоторых вариантах осуществления клетки или композиции вводят пациенту, например пациенту, имеющему или подверженному риску заболевания или патологического состояния, для улучшения одного или более симптомов заболевания или патологического состояния.

В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную Т-клеточную терапию, осуществляют путем аутологичного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают у пациента, который должен получать клеточную терапию, или из образца, полученного у такого пациента. Таким образом, в некоторых аспектах клетки получают от пациента, например пациента, нуждающегося в лечении, и клетки, после выделения и обработки, вводят тому же пациенту.

В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную Т-клеточную терапию, осуществляют путем аллогенного переноса, в которой клетки выделяют и/или иным образом получают от пациента, отличного от пациента, который должен получить или который в конечном итоге получает клеточную терапию, например, первого пациента. В таких вариантах осуществления клетки затем вводят другому пациенту, например второму пациенту того же вида. В некоторых вариантах осуществления первый и второй пациенты генетически идентичны. В некоторых вариантах осуществления первый и второй пациенты генетически схожи. В некоторых вариантах осуществления второй пациент экспрессирует тот же класс HLA или супертип как первый пациент. Клетки могут вводиться любым подходящим способом. Дозировка и введение могут частично зависеть от того, является ли введение кратковременным или постоянным. Различные схемы дозирования включают, но не ограничиваются ими, однократное или множественное введение в различные моменты времени, болюсное введение и импульсную инфузию.

В некоторых вариантах осуществления клетки или отдельные популяции подтипов клеток вводят пациенту в диапазоне примерно от одного миллиона примерно до 100 миллиардов клеток и/или такое количество клеток на килограмм массы тела, как например, от 1 миллиона примерно до 50 миллиардов клеток (например, примерно 5 миллионов клеток, примерно 25 миллионов клеток, примерно 500 миллионов клеток, примерно 1 миллиард клеток, примерно 5 миллиардов клеток, примерно 20 миллиардов клеток, примерно 30 миллиардов клеток, примерно 40 миллиардов клеток или диапазон, определяемый любыми двумя из вышеперечисленных значений), например примерно от 10 миллионов примерно до 100 миллиардов клеток (например, примерно 20 миллионов клеток, примерно 30 миллионов клеток, примерно 40 миллионов клеток, примерно 60 миллионов клеток, примерно 70 миллион клеток, примерно 80 миллионов клеток, примерно 90 миллионов клеток, примерно 10 миллиардов клеток, примерно 25 миллиардов клеток, примерно 50 миллиардов клеток, примерно 75 миллиардов клеток, примерно 90 миллиардов клеток или диапазон, определенный любыми двумя из вышеперечисленных значений), а в некоторых случаях примерно от 100 миллионов клеток примерно до 50 миллиардов клеток (например, примерно 120 миллионов клеток, примерно 250 миллионов клеток, примерно 350 миллионов клеток, примерно 450 миллионов клеток, примерно 650 миллионов клеток, примерно 800 миллионов клеток, примерно 900 миллионов клеток, примерно 3 миллиардов клеток, примерно 30 миллиардов клеток, примерно 45 миллиард клеток) или любое значение между этими диапазонами и/или на килограмм массы тела. Опять же, дозировки могут варьироваться в зависимости от характеристик конкретного заболевания или расстройства, и/или пациента и/или других методов лечения. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят в виде части комбинированной терапии, как например, одновременно или последовательно, в любом порядке с другим терапевтическим вмешательством, таким как антитело или сконструированная клетка или рецептор или агент, такой как цитотоксический или терапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят совместно с одним или более дополнительными терапевтическими агентами или в связи с другим терапевтическим вмешательством либо одновременно, либо последовательно в любом порядке. В некоторых контекстах клетки вводят совместно с другой терапией, достаточно близкой по времени, так что популяции клеток усиливают действие одного или более дополнительных терапевтических агентов или наоборот. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят перед одним или более дополнительными терапевтическими агентами. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят после одного или более дополнительных терапевтических агентов. В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных агентов включают, например, цитокин, такой как IL-2, для повышения жизнестойкости. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение химиотерапевтического агента.

После введения клеток биологическую активность популяций сконструированных клеток в некоторых вариантах осуществления измеряют, например, любым из ряда известных способов. Параметры для оценки включают специфичное связывание сконструированной или натуральной Т-клетки или другой иммунной клетки с антигеном, in vivo, например, путем визуализации или ex vivo, например, с помощью ИФА или проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления способность сконструированных клеток уничтожать клетки-мишени можно измерить, используя любой подходящий способ, известный в данной области, такой как анализы цитотоксичности, описанные, например, в Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7): 689-702 (2009) и Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). В некоторых вариантах осуществления биологическую активность клеток измеряют путем анализа экспрессии и/или секреции одного или более цитокинов, таких как CD 107a, IFNγ, IL-2 и TNF. В некоторых аспектах биологическую активность измеряют путем оценки клинических исходов, таких как снижение опухолевой массы или нагрузки.

В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки дополнительно модифицируют любым количеством способов, так что их терапевтическая или профилактическая эффективность увеличивается. Например, сконструированный CAR или TCR, экспрессированный популяцией, может быть конъюгирован либо прямо, либо косвенно через линкер с компонентом направленного воздействия. Практика конъюгирования соединений, например CAR или TCR, с компонентами направленного воздействия известна в данной области. См., например, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3:1 1 1 (1995) и патент США 5087616.

V. Определения

Используемые в настоящем описании единственные формы включают множественные обозначения, если контекст явно не диктует иное. Например «один» означает «по меньшей мере один» или «один или более». Понятно, что аспекты и варианты, описанные в настоящем документе, включают «состоящий» и/или «по существу состоящий из» аспектов и вариантов.

Во всем настоящем раскрытии различные аспекты заявленного объекта изобретения представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона приводится лишь для удобства и краткости и не должно толковаться как жесткое ограничение объема заявленного объекта изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретно раскрывающее все возможные субдиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, когда предлагается диапазон значений, понятно, что каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределом этого диапазона и любым другим указанным или промежуточным значением в указанном диапазоне охвачено в заявленном объекте изобретения. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны и также охватываются заявленным объектом изобретения с учетом любого специально исключенного предела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба из включенных пределов, также включены в заявленный объект изобретения. Это применимо независимо от ширины диапазона.

Используемый в настоящем описании термин «примерно» относится к обычному диапазону ошибок для соответствующего значения, хорошо известного специалисту в данной области техники. Ссылка на «примерное» значение или параметра в настоящем описании включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся к самому этому значению или параметру как таковому. Например, описание, относящееся к «примерно X», включает описание «X».

Используемая в настоящем описании композиция относится к любой смеси двух или более продуктов, веществ или соединений, включая клетки. Это может быть раствор, суспензия, жидкость, порошок, паста, водная, неводная или любая их комбинация.

Используемый в настоящем описании термин «обогащение» в отношении одного или более конкретных типов клеток или популяций клеток относится к увеличению количества или процента типа или популяции клеток, например, по сравнению с общим количеством клеток в объеме композиции, или относительно других типов клеток, например, полученных путем положительной селекции на основе маркеров, экспрессируемых популяцией или клеткой, или полученных путем отрицательной селекции на основе маркера, отсутствующего на популяции клеток или клетке, которые должны быть истощены. Этот термин не требует полного удаления других клеток, типа клеток или популяций из композиции и не требует, чтобы обогащенные клетки присутствовали в количестве 100% или даже около 100% в обогащенной композиции.

Используемое в настоящем описании утверждение, что клетка или популяция клеток является «положительной» для конкретного маркера, относится к детектируемому присутствию на или в клетке конкретного маркера, обычно поверхностного маркера. Когда речь идет о поверхностном маркере, этот термин относится к присутствию поверхностной экспрессии, детектируемой проточной цитометрией, например, путем окрашивания антителом, которое специфично связывается с маркером и детектирует указанное антитело, где окрашивание детектируется проточной цитометрией на уровне, по существу превышающем детектированное окрашивание, проводя ту же самую процедуру с контролем с использованием изотипа при других идентичных условиях, и/или на уровне, по существу, аналогичном уровню для клетки, которая, как известно, является положительной для маркера, и/или на уровне существенно выше чем для клетки, которая, как известно, является отрицательной для маркера.

Используемое в настоящем описании утверждение, что клетка или популяция клеток является «отрицательной» для конкретного маркера, относится к отсутствию существенного детектируемого присутствия на клетке или в клетке конкретного маркера, обычно поверхностного маркера. Когда речь идет о поверхностном маркере, этот термин относится к отсутствию поверхностной экспрессии, детектируемой проточной цитометрией, например, путем окрашивания антителом, которое специфично связывается с маркером и детектирует указанное антитело, где окрашивание не детектируется проточной цитометрией на уровне, значительно превышающем детектированное окрашивание, проводя ту же самую процедуру с контролем с использованием изотипа при других идентичных условиях и/или на уровне, по существу, ниже, чем уровень для клетки, которая, как известно, является положительной для маркера, и/или на уровне по существу аналогичном по сравнению с уровнем для клетки, которая, как известно, является отрицательной для маркера.

Используемый в настоящем описании термин «экспрессия» относится к способу получения полипептида на основе кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, такой как ген. Этот способ может включать транскрипцию, посттранскрипционный контроль, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционный контроль, посттрансляционную модификацию или любую их комбинацию.

Используемый в настоящем описании термин пациент включает любой живой организм, такой как люди и другие млекопитающие. Млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, людей и животных, не относящихся к человеку, включая сельскохозяйственных животных, спортивных животных, грызунов и домашних животных.

Используемый в настоящем описании термин «контроль» относится к образцу, который по существу идентичен тестируемому образцу, за исключением того, что он не обрабатывается тестируемым параметром или, если он является образцом плазмы, он может быть взят от здорового добровольца, не имеющего интересующее патологическое состояние. Контроль также может быть внутренним контролем.

Используемый в настоящем описании термин «функционально связанный» относится к ассоциации компонентов, таких как последовательность ДНК, например гетерологичная нуклеиновая кислота) и регуляторная последовательность (последовательности), таким образом, чтобы обеспечить экспрессию гена, когда соответствующие молекулы (например, белки-активаторы транскрипции) связаны с регуляторной последовательностью. Следовательно, это означает, что описанные компоненты находятся в связи, позволяющей им функционировать назначенным образом.

Используемый в настоящем описании термин «процент идентичности последовательности (%)» и «процент идентичности» при использовании в отношении нуклеотидной последовательности (эталонной нуклеотидной последовательности) или аминокислотной последовательности (эталонной аминокислотной последовательности) определяется как процентное содержание нуклеотидных остатков или аминокислотных остатков, соответственно, в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам в эталонной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения пропусков, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процента идентичности последовательностей может быть достигнуто различными способами, которые входят в компетенцию специалиста в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.

Используемый в настоящем описании термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной распространять другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин включает вектор как самовоспроизводящую структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы обозначены в настоящем описании как «экспрессирующие векторы». Среди векторов - вирусные векторы, такие как лентивирусные векторы.

VI. ИЛЛЮСТРАТИВНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Среди предложенных вариантов осуществления представлены:

1. Химерный рецептор, содержащий:

(а) лигандсвязывающий домен; и

(b) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (i) TNF-рецептор ассоциированный фактор 6 (TRAF-6)-индуцирующий домен, который способен индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6 и/или способен индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию; и (ii) активирующий цитоплазматический сигнальный домен.

2. Химерный рецептор варианта осуществления 1, отличающийся тем, что TRAF-6-индуцирующий домен содержит TRAF-6-связывающий домен или домен, способный связываться с молекулой, которая содержит TRAF-6-связывающий домен или которая рекрутирует молекулу, содержащую TRAF-6-связывающий домен.

3. Химерный рецептор варианта осуществления 1, отличающийся тем, что:

TRAF-6-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, содержащую Pro-Xxa-Glu-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 26); и/или

TRAF-6-связывающий домен не связывается специфично с молекулой TRAF, отличной от TRAF-6; и/или

химерный рецептор не содержит связывающего домена, способного специфично связываться с молекулой, которая специфично связывается с любой другой молекулой TRAF, TRAF-1, TRAF-2, TRAF-3 и/или TRAF-5.

4. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-3, отличающийся тем, что TRAF-6-индуцирующий домен представляет собой или содержит TRAF-6-индуцирующий домен молекулы, выбранной из группы, состоящей из членов семейства TNF-R, рецепторов цитокинов и Toll-подобных рецепторов (TLR), или является функциональным фрагментом или вариантом TRAF-6-индуцирующего домена молекулы, выбранной из группы, состоящей из членов семейства TNF-R, рецепторов цитокинов и Toll-подобных рецепторов (TLR).

5. Химерный рецептор варианта осуществления 4, отличающийся тем, что:

молекула не содержит никаких других TRAF-индуцирующих доменов, полученных из молекулы;

молекула не содержит TRAF-1-индуцирующий домен, полученный из молекулы;

молекула не содержит никакого другого TRAF-2-индуцирующего домена, полученного из молекулы;

молекула не содержит никакого другого TRAF-3-индуцирующего домена, полученного из молекулы;

молекула не содержит никакого другого TRAF-4-индуцирующего домена, полученного из молекулы;

молекула не содержит никакого другого TRAF-5-индуцирующего домена, полученного из молекулы;

молекула не содержит домен молекулы, который способен индуцировать активацию или клеточную локализацию другого TRAF или TRAF-1, TRAF-2, TRAF-3 или TRAF-5 и/или

молекула не содержит домен молекулы, который способен индуцировать сигнализацию через другой TRAF и/или TRAF-1, TRAF-2, TRAF-3 или TRAF-5.

6. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-5, отличающийся тем, что:

TRAF-6-индуцирующий домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен молекулы суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей (TNF) или является его функциональным вариантом или его фрагментом; или

TRAF-6-индуцирующий домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен молекулы семейства Toll/ IL-1 или является его функциональным вариантом или его фрагментом.

7. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 4-6, отличающийся тем, что молекула выбрана из CD40, RANK и рецептора 1 интерлейкина-1 (IL1R1).

8. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-7, отличающийся тем, что TRAF-6-индуцирующий домен содержит последовательность аминокислот, выбранных из:

(i) последовательности аминокислот, представленных в SEQ ID NO: 12, 14 или 16;

(ii) функционального варианта, содержащего последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12, 14 или 16;

(iii) функционального варианта, содержащего последовательность аминокислот, которая имеет менее чем 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12 и по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12 или

(iv) функционального фрагмента (i), (ii) или (iii).

9. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 6-8, отличающийся тем, что функциональный вариант или функциональный фрагмент способен индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6 и/или способен индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию и/или содержит TRAF-6-связывающий домен или домен, способный связываться с молекулой, которая содержит TRAF-6-связывающий домен, или который рекрутирует молекулу, содержащую TRAF-6-связывающий домен.

10. Химерный рецептор варианта осуществления 2 или варианта осуществления 9, отличающийся тем, что TRAF-6-индуцирующая часть рекрутирует молекулу, содержащую TRAF-6-связывающий домен, и рекрутированная молекула представляет собой или содержит IRAK и/или TRAF-6-индуцирующую часть, содержит домен TIR, способный рекрутировать IRAK.

11. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-10, отличающийся тем, что TRAF-6-индуцирующий домен не представляет собой или не содержит цитоплазматический сигнальный домен CD40 или OX40 и/или не представляет собой или не содержит полный цитоплазматический домен CD40 или OX40, не представляет собой или не содержит последовательность аминокислот, представленных в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 20, и/или не содержит TRAF-связывающий домен OX40 или CD40, отличный от TRAF-6-связывающего домена.

12. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-11, отличающийся тем, что внутриклеточный сигнальный домен содержит по порядку от его N-конца к C-концу: лигандсвязывающий домен, (TRAF-6)-индуцирующий домен и активирующий цитоплазматический сигнальный домен.

13. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-12, отличающийся тем, что TRAF-6-индуцирующий домен содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1R1 или функциональный вариант его фрагмента, а при связывании лиганда химерный рецептор способен образовывать мультимерный комплекс со вторым химерным рецептором, содержащим вспомогательный сигнальный домен, причем мультимерный комплекс способен индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6 и/или способен индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию.

14. Химерный рецептор варианта осуществления 13, отличающийся тем, что вспомогательный сигнальный домен содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1RAP или его функциональный вариант или его фрагмент, достаточные для образования мультимерного комплекса с первым химерным рецептором.

15. Химерный рецептор варианта осуществления 13 или варианта осуществления 14, отличающийся тем, что мультимерный комплекс представляет собой гетеродимерный комплекс.

16. Химерный рецептор, содержащий:

(а) лигандсвязывающий домен; и

(b) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий:

(i) TRAF-6-индуцирующий домен и вспомогательный сигнальный домен, отличающийся тем, что при связывании лиганда TRAF-6-индуцирующий домен и вспомогательный сигнальный домен способны взаимодействовать, чтобы индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6 и/или способны индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию; и

(ii) активирующий цитоплазматический сигнальный домен.

17. Химерный рецептор варианта осуществления 16, отличающийся тем, что:

TRAF-6-индуцирующий домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1R1 или функциональный вариант его фрагмента; и

вспомогательный сигнальный домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1RAP или функциональный вариант или его фрагмент.

18. Химерный рецептор варианта осуществления 16 или варианта осуществления 17, отличающийся тем, что TRAF-6-индуцирующий домен и вспомогательный сигнальный домен связаны прямо или косвенно, в тандеме.

19. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-18, отличающийся тем, что активирующий цитоплазматический сигнальный домен, который способен индуцировать первичный активирующий сигнал в Т-клетке, представляет собой компонент Т-клеточного рецептора (TCR) и/или содержит мотив активации иммунорецептора на основе тирозина на основе тирозина (ITAM).

20. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-19, отличающийся тем, что активирующий цитоплазматический сигнальный домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен дзета-цепи CD3-дзета (CD3ζ) или его функциональный вариант или сигнальную часть.

21. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-20, отличающийся тем, что лигандсвязывающий домен представляет собой функциональный антигенный рецептор, отличный от TCR-антигенного рецептора, или трансгенный TCR.

22. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-21, который представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR), где лигандсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен.

23. Химерный рецептор варианта осуществления 22, отличающийся тем, что антигенсвязывающий домен представляет собой антитело или фрагмент антитела.

24. Химерный рецептор варианта осуществления 23, отличающийся тем, что антигенсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, который представляет собой одноцепочечный фрагмент.

25. Химерный рецептор варианта осуществления 23 или 24, отличающийся тем, что фрагмент содержит вариабельные области антитела, соединенные гибким линкером иммуноглобулина.

26. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 23-25, отличающийся тем, что фрагмент содержит scFv.

27. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-26, отличающийся тем, что лигандсвязывающий домен специфично связывается с антигеном, который ассоциирован с заболеванием или расстройством.

28. Химерный рецептор варианта осуществления 25, отличающийся тем, что:

заболевание или расстройство представляет собой инфекционное заболевание или патологическое состояние, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание или опухоль или злокачественное новообразование;

лигандсвязывающий домен специфично связывается с опухолевым антигеном; и/или

лигандсвязывающий домен специфично связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA, поверхностного антигена гепатита B, антитела против фолатного рецептора, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, рецептора фетального ацетилхолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-альфа, IL-13R-альфа2, kdr, легкой цепи каппа, Lewis Y, молекулы адгезии L1-клеток, MAGE-A1, мезотелина, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D-лигандов, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкофетального антигена, TAG72, VEGF- R2, карциноэмбрионального антигена (СЕА), простата-специфичного антигена, PSMA, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфринВ2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, Опухоли Вильмса 1 (WT-1) и циклина A1 (CCNA1).

29. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-28, дополнительно содержащий трансмембранный домен, связывающий лигандсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен.

30. Химерный рецептор варианта осуществления 29, отличающийся тем, что трансмембранный домен связан с TRAF-6-индуцируемым доменом, в результате чего TRAF-6-индуцируемый домен находится между трансмембранным доменом и активирующим сигнальным доменом.

31. Химерный рецептор варианта осуществления 29 или варианта осуществления 30, отличающийся тем, что трансмембранный домен содержит трансмембранный домен молекулы, содержащей TRAF-6-индуцируемый домен или его функциональный фрагмент или его вариант.

32. Химерный рецептор варианта осуществления 31, отличающийся тем, что трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен или его функциональный фрагмент или его вариант, выбранный из группы, состоящей из членов семейства TNF-R, рецепторов цитокинов и Toll-подобных рецепторов (TLR).

33. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 29-32, отличающийся тем, что трансмембранный домен и TRAF-6-индуцируемый домен взяты из одной молекулы.

34. Химерный рецептор варианта осуществления 32 или варианта осуществления 33, отличающийся тем, что молекула выбрана из CD40, RANK и рецептора типа 1 интерлейкина-1 (IL1R1).

35. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 32-34, отличающийся тем, что трансмембранный домен содержит последовательность аминокислот, выбранную из:

(i) последовательности аминокислот, представленных в SEQ ID NO: 11, 13 или 15;

(ii) функционального варианта, содержащего последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 11, 13 или 15;

(iii) функционального фрагмента (i) или (ii).

36. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-35, отличающийся тем, что внутриклеточный сигнальный домен дополнительно содержит (iii) костимулирующий сигнальный домен.

37. Химерный рецептор варианта осуществления 36, отличающийся тем, что костимулирующий сигнальный домен содержит цитоплазматический сигнальный домен костимулирующей молекулы Т-клеток или его функциональный вариант или сигнальную часть.

38. Химерный рецептор варианта осуществления 36 или варианта осуществления 37, отличающийся тем, что костимулирующий сигнальный домен содержит домен, индуцирующий PI-3-киназу.

39. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 36-38, отличающийся тем, что костимулирующий сигнальный домен содержит цитоплазматический сигнальный домен CD28, 4-1BB или молекулу ICOS или является функциональным вариантом его сигнальной части.

40. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 36-39, отличающийся тем, что:

костимулирующйй сигнальный домен находится между TRAF-6-индуцирующим доменом и активирующим сигнальным доменом; или

TRAF-6-индуцирующий домен находится между костимулирующим сигнальным доменом и активирующим сигнальным доменом.

41. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 29, 30 и 36-40, отличающийся тем, что трансмембранный домен содержит трансмембранный домен костимулирующей молекулы.

42. Мультимерный химерный рецепторный комплекс, содержащий:

(1) первый химерный рецептор, содержащий: (а) первый лигандсвязывающий домен; и (b) первый внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (i) TRAF-6-индуцирующий домен и (ii) активирующий цитоплазматический сигнальный домен; и

(2) второй химерный рецептор, содержащий: (c) второй лигандсвязывающий домен, причем указанный второй лигандсвязывающий домен способен связываться с тем же лигандом, что и первый лигандсвязывающий домен; и (d) второй внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (iii) вспомогательный сигнальный домен,

где при связывании с лигандом, TRAF-индуцирующий домен и вспомогательный сигнальный домен способны взаимодействовать, чтобы индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6 и/или способны индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию.

43. Мультимерный комплекс варианта осуществления 41, отличающийся тем, что:

TRAF-6-индуцирующий домен содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1R1 или функциональный вариант его фрагмента; и

вспомогательный сигнальный домен содержит цитоплазматический сигнальный домен IL1RAP или его функциональный вариант или его фрагмент.

44. Мультимерный комплекс варианта осуществления 42 или варианта осуществления 43, отличающийся тем, что первый лигандсвязывающий домен и второй лигандсвязывающий домен являются одинаковыми или, по существу, одинаковыми.

45. Мультимерный химерный рецепторный комплекс любого из вариантов осуществления 42-44, отличающийся тем, что второй химерный рецептор дополнительно содержит второй активирующий цитоплазматический сигнальный домен, который, необязательно, является таким же или по существу таким же, как первый активирующий цитоплазматический домен.

46. Мультимерный химерный рецепторный комплекс любого из вариантов осуществления 42-45, отличающийся тем, что активирующий цитоплазматический сигнальный домен, который может быть первым и/или вторым активирующим цитоплазматическим сигнальным доменом, независимо представляет собой компонент Т-клеточного рецептора (TCR) и/или содержит мотив активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM).

47. Мультимерный химерный рецепторный комплекс любого из вариантов осуществления 42-46, отличающийся тем, что активирующий цитоплазматический сигнальный домен, который может быть первым и/или вторым активирующим цитоплазматическим сигнальным доменом, независимо содержит цитоплазматический сигнальный домен дзета-цепи CD3-дзета (CD3ζ) или его сигнальную часть.

48. Мультимерный химерный рецепторный комплекс любого из вариантов осуществления 42-47, отличающийся тем, что первый и/или второй химерный рецептор содержит костимулирующий сигнальный домен.

49. Мультимерный химерный рецепторный комплекс варианта осуществления 48, отличающийся тем, что костимулирующий сигнальный домен, который может быть первым и/или вторым костимулирующим сигнальным доменом, независимо содержит цитоплазматический сигнальный домен костимулирующей молекулы Т-клеток или его сигнальную часть.

50. Мультимерный химерный рецепторный комплекс варианта осуществления 48 или варианта осуществления 49, отличающийся тем, что костимулирующий сигнальный домен, который может быть первым и/или вторым костимулирующим сигнальным доменом, независимо, содержит цитоплазматический сигнальный домен CD28, 4-1BB или ICOS или их сигнальную часть.

51. Мультимерный химерный рецепторный комплекс любого из вариантов осуществления 42-50, отличающийся тем, что первый и/или второй лигандсвязывающий домен является функциональным антигенным рецептором, отличным от TCR, или трансгенным TCR.

52. Мультимерный химерный рецепторный комплекс любого из вариантов осуществления 42-51, отличающийся тем, что первый и/или второй химерный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR), где первый и/или второй лигандсвязывающий домен является антигенсвязывающим доменом.

53. Мультимерный химерный рецепторный комплекс варианта осуществления 52, отличающийся тем, что антигенсвязывающий домен представляет собой антитело или фрагмент антитела.

54. Мультимерный химерный рецепторный комплекс варианта осуществления 53, отличающийся тем, что антигенсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, который является одноцепочечным фрагментом.

55. Мультимерный химерный рецепторный комплекс варианта осуществления 53 или варианта осуществления 54, отличающийся тем, что фрагмент содержит вариабельные области антитела, соединенные гибким линкером иммуноглобулина.

56. Мультимерный химерный рецепторный комплекс любого из вариантов осуществления 53-55, отличающийся тем, что фрагмент содержит scFv.

57. Мультимерный химерный рецепторный комплекс любого из вариантов осуществления 42-56, отличающийся тем, что первый и/или второй химерный рецептор дополнительно содержат трансмембранный домен, связывающий лигандсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен.

58. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-41.

59. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая:

последовательность нуклеотидов, кодирующую первый химерный рецептор, содержащий: (а) первый лигандсвязывающий домен; и (b) первый внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (i) TRAF-6-индуцирующий домен и (ii) активирующий цитоплазматический сигнальный домен; и/или

последовательность нуклеотидов, кодирующую второй химерный рецептор, включающий: (c) второй лигандсвязывающий домен, причем указанный второй лигандсвязывающий способен связываться с тем же лигандом, что и первый лигандсвязывающий домен; и (d) второй внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (iii) вспомогательный сигнальный домен.

60. Молекула нуклеиновой кислоты варианта 59, которая представляет собой одиночный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеотидов, кодирующую первый химерный рецептор, и последовательность нуклеотидов, кодирующую второй химерный рецептор, и, необязательно, дополнительно содержит по меньшей мере один промотор, который функционально связан с контролем экспрессии первого химерного рецептора и/или второго химерного рецептора.

61. Молекула нуклеиновой кислоты варианта осуществления 60, отличающаяся тем, что:

последовательность нуклеотидов, кодирующая первый химерный рецептор, функционально связана с первым промотором, и последовательность нуклеотидов, кодирующая второй химерный рецептор, функционально связана со вторым промотором, причем первый и второй промоторы могут быть одинаковыми или разными; или

первый химерный рецептор и второй химерный рецептор разделены сайтом внутренней посадки рибосомы (IRES), саморасщепляющимся пептидом или пептидом, который вызывает прыжок рибосомы, необязательно полипептид T2A, и первый и второй химерные рецепторы экспрессируются под контролем одного и того же промотора.

62. Молекула нуклеиновой кислоты любого из вариантов осуществления 59-61, отличающаяся тем, что кодированный первый химерный рецептор и/или кодированный второй химерный рецептор представляют собой первый и/или второй химерный рецептор мультимерного комплекса любого из вариантов осуществления 42-57.

63. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты любого из вариантов осуществления 58-62.

64. Вектор варианта осуществления 63, который является вирусным вектором.

65. Вектор варианта осуществления 63 или варианта осуществления 64, который представляет собой ретровирусный вектор, который необязательно является лентивирусным вектором или гаммаретровирусным вектором.

66. Сконструированная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту любого из вариантов осуществления 58-62 или вектор любого из вариантов осуществления 63-65, или экспрессирующая химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-42.

67. Сконструированная клетка, содержащая:

первый химерный рецептор, содержащий: (а) первый лигандсвязывающий домен; и (b) первый внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (i) TRAF-6-индуцирующий домен и (ii) активирующий цитоплазматический сигнальный домен; и/или

второй химерный рецептор, содержащий: (c) второй лигандсвязывающий домен, причем указанный второй лигандсвязывающий домен способен связываться с тем же лигандом, что и первый лигандсвязывающий домен; и (d) второй внутриклеточный сигнальный домен, содержащий (iii) вспомогательный сигнальный домен.

68. Сконструированная клетка варианта осуществления 67, отличающаяся тем, что первый химерный рецептор и/или второй химерный рецептор представляют собой первый и/или второй химерный рецептор мультимерного комплекса любого из вариантов осуществления 42-57.

69. Вектор любого из вариантов осуществления 63-65 или сконструированная клетка любого из вариантов осуществления 66-68, отличающийся тем, что клетка не экспрессирует модифицированную молекулу каспазы или индуцируемую молекулу каспазы, где молекула каспазы необязательно представляет собой модифицированную каспазу-9 или индуцируемую каспазу 9.

70. Сконструированная клетка любого из вариантов осуществления 66-69, которая является Т-клеткой.

71. Сконструированная клетка любого из вариантов осуществления 66-70, которая представляет собой CD8+ Т-клетку.

72. Композиция, содержащая сконструированные клетки любого из вариантов осуществления 66-71 и необязательно фармацевтически приемлемый буфер.

73. Композиция, содержащая:

сконструированную CD8+ клетку, экспрессирующую химерный рецептор любого из вариантов осуществления 1-42 или экспрессирующую первый и/или второй химерный рецептор мультимерного комплекса любого из вариантов осуществления 42-57;

сконструированную CD4+клетку, содержащую другой химерный рецептор, по сравнению с химерным рецептором, экспрессируемым в CD8+ клетке, причем другой химерный рецептор содержит другой костимулирующий сигнальный домен; и

необязательно, фармацевтически приемлемый буфер.

74. Композиция варианта осуществления 73, отличающаяся тем, что единственное различие в химерном рецепторе, экспрессируемом в CD4+ клетке, по сравнению с CD8+клеткой, заключается в другом костимулирующем сигнальном домене.

75. Композиция варианта осуществления 73 или варианта осуществления 74, отличающаяся тем, что другой костимулирующий сигнальный домен не содержит TRAF-6-индуцирующий домен, способный индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6 и/или способный индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию,

76. Композиция любого из вариантов осуществления 73-75, где другой костимулирующий сигнальный домен представляет собой или содержит домен, индуцирующий PI-3-киназу, способный индуцировать активацию или клеточную локализацию PI-3-киназы и/или способный индуцировать сигнализацию PI3-киназы/Akt.

77. Композиция любого из вариантов осуществления 73-76, отличающаяся тем, что другой костимулирующий сигнальный домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен молекулы CD28, 4-1BB или ICOS или является функциональным вариантом его сигнальной части.

78. Композиция любого из вариантов осуществления 73-77, отличающаяся тем, что при стимулировании стимулирующим агентом или агентами in vitro генетически сконструированные клетки в композиции проявляют повышенную способность к пролиферации или наращиванию по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании тем же стимулирующим агента или агентами.

79. Композиция любого из вариантов осуществления 73-78, отличающаяся тем, что при стимулировании в присутствии стимулирующего агента или агентов in vitro генетически сконструированные клетки в композиции демонстрируют повышенное количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании одним и тем же стимулирующим агентом или агентами.

80. Композиция варианта осуществления 79, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD62L+.

81. Композиция варианта осуществления 79 или варианта осуществления 80, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются Т-клетками центральной памяти (Т_СМ), Т-клетками долговременной памяти или стволовыми Т-клетками памяти (T_SCM).

82. Композиция варианта осуществления 80 или варианта осуществления 81, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти дополнительно содержат фенотип, содержащий:

a) CD127+; и/или

b) любой один или более из CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ и CD27+ и любой один или более из t-bet^low, IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+.

83. Композиция любого из вариантов осуществления 79-82, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD8+.

84. Композиция любого из вариантов осуществления 79-83, отличающаяся тем, что количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти, полученных из введенных генетически сконструированных клеток, содержит увеличение или больший процент Т-клеток центральной памяти (T_CM), Т-клеток долговременной памяти или стволовых Т-клеток памяти (T_SCM) по сравнению с эталонной композицией.

85. Композиция любого из вариантов осуществления 73-84, отличающаяся тем, что при стимулировании стимулирующим агентом или агентами in vitro генетически сконструированные клетки в композиции проявляют повышенную жизнестойкость и/или выживаемость по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании тем же стимулирующим агентом или агентами.

86. Композиция любого из вариантов осуществления 78-85, отличающаяся тем, что стимулирующий агент или агенты содержат антиген, антитело против CD3/антитело против CD28 и/или содержат цитокин IL-2, IL-15 и/или IL-7.

87. Композиция любого из вариантов осуществления 78-86, отличающаяся тем, что увеличение наблюдается в течение 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней или 14 дней после начала стимулирования.

88. Способ лечения, включающий введение клетки любого из вариантов осуществления 66-71 или композиции любого из вариантов осуществления 72-87 пациенту, имеющему заболевание или патологическое состояние.

89. Способ варианта осуществления 88, отличающийся тем, что химерный рецептор специфично связывается с лигандом или антигеном, ассоциированным с заболеванием или патологическим состояние.

90. Способ варианта осуществления 88 или варианта осуществления 89, отличающийся тем, что заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование, опухоль, аутоиммунное заболевание или расстройство или инфекционное заболевание.

91. Способ любого из вариантов осуществления 88-90, отличающийся тем, что генетически сконструированные Т-клетки в композиции проявляют увеличенное более продолжительное наращивание и/или жизнестойкость у пациента, чем у пациента, которому вводили такое же или примерно такое же количество дозы эталонной клеточной композиции.

92. Способ любого из вариантов осуществления 88-91, отличающийся тем, что существует увеличение или большее количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти и/или увеличенная или более продолжительная жизнестойкость Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти у пациента, полученных из вводимых генетически сконструированных Т-клеток, по сравнению с количеством или жизнестойкостью Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти у пациента, полученных из эталонной клеточной композиции, вводимой в той же или примерно той же дозировке.

93. Способ варианта осуществления 92, отличающийся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD62L+.

94. Способ варианта осуществления 92 или варианта осуществления 93, отличающийся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются Т-клетками центральной памяти (Т_СМ), Т-клетками долговременной памяти или стволовыми Т-клетками памяти (T_SCM).

95. Способ варианта осуществления 93 или варианта осуществления 94, отличающийся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти дополнительно содержат фенотип, содержащий:

a) CD127+; и/или

b) любой один или более из CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ и CD27+ и любой один или более из t-bet^low, IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+.

96. Способ любого из вариантов осуществления 88-95, отличающийся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD8+.

97. Способ любого из вариантов осуществления 88-96, отличающийся тем, что количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти, полученных из введенных генетически сконструированных клеток, содержит увеличение или больший процент Т-клеток центральной памяти (T_CM), Т-клеток долговременной памяти или стволовых Т-клеток памяти (T_SCM) по сравнению с количеством таких клеток, полученных из эталонной клеточной композиции, вводимой в той же или примерно той же дозе.

98. Способ любого из вариантов осуществления 88-97, отличающийся тем, что существует увеличение или большее количество не терминально дифференцированных T-лимфоцитов у пациента, полученных из введенных генетически сконструированных Т-клеток, по сравнению с количеством не терминально дифференцированных клеток у пациента, полученных из эталонной клеточной композиции, вводимой в таком же или примерно таком же количестве дозы.

99. Способ любого из вариантов осуществления 88-98, отличающийся тем, что генетически сконструированные клетки у пациента, полученные из введенных генетически сконструированных клеток, демонстрируют увеличение активации или пролиферации при повторном стимулировании ex vivo в присутствии стимулирующего агента или агента по сравнению с активацией или пролиферацией генетически сконструированных клеток у пациента, полученных из эталонной клеточной композиции, вводимой в такой же или примерно такой же дозе, при повторном стимулировании ex vivo в присутствии того же самого стимулирующего агента или агентов.

100. Способ варианта осуществления 99, отличающийся тем, что стимулирующий агент или агенты содержат антиген, антитело против CD3/антитело против CD28 или содержит цитокин IL-2, IL-15 и/или IL-7.

101. Способ любого из вариантов осуществления 91-100, отличающийся тем, что увеличение составляет по меньшей мере в 1,2 раза, в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза или в 5 раз.

102. Способ любого из вариантов осуществления 88-101, отличающийся тем, что имеется уменьшенная или пониженная экспрессия маркера истощения в генетически сконструированных клетках у пациента, полученных из введенных генетически сконструированных Т-клеток, по сравнению с экспрессией маркера истощения в генетически сконструированных клетках у пациента, вводимых в таком же или примерно таком же количестве дозы эталонной клеточной композиции.

103. Способ варианта осуществления 102, отличающийся тем, что маркер истощения выбран из CD244, CD160 и PD-1.

104. Способ варианта осуществления 102 или варианта осуществления 103, отличающийся тем, что экспрессия уменьшается или снижается в 1,2 раза, в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 9 раз, в 10 раз или более.

105. Способ любого из вариантов осуществления 88-104, отличающийся тем, что увеличение или уменьшение наблюдается или присутствует в течение месяца, в течение двух месяцев, в течение шести месяцев или в течение одного года после введения клеток.

106. Композиция любого из вариантов осуществления 78-87 или способ любого из вариантов осуществления 91-105, отличающаяся тем, что эталонная клеточная композиция содержит генетически сконструированные клетки, которые являются по существу одинаковыми, за исключением того, что экспрессированный химерный рецептор содержит другую костимулирующую молекулу, которая не содержит TRAF - 6-индуцирующий домен и/или содержит костимулирующий сигнальный, домен, способный индуцировать сигнализацию PI3K/Akt, и/или содержит костимулирующий домен CD28, 4-1BB или ICOS.

107. Химерный рецептор, содержащий:

(а) лигандсвязывающий домен;

(b) трансмембранный домен; и

(c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен, полученный из человеческого CD40.

108. Химерный рецептор, содержащий:

(а) лигандсвязывающий домен;

(b) трансмембранный домен, полученный из человеческого CD28; и

(c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен, полученный из CD40.

109. Химерный рецептор варианта осуществления 108, отличающийся тем, что CD40 представляет собой человеческий CD40.

110. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-109, отличающийся тем, что сигнальный домен, полученный из CD40, содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 12, или функциональный вариант, содержащий последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12.

111. Химерный рецептор, содержащий:

(а) лигандсвязывающий домен;

(b) трансмембранный домен; и

(c) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен, полученный из CD40, представленный в SEQ ID NO: 12.

112. Химерный рецептор варианта осуществления 107 или варианта осуществления 111, отличающийся тем, что трансмембранный домен содержит трансмембранный домен молекулы, содержащей TRAF-6-индуцируемый домен или его функциональный фрагмент или его вариант.

113. Химерный рецептор варианта осуществления 107, варианта осуществления 111 или варианта осуществления 112, отличающийся тем, что трансмембранный домен получен из CD40.

114. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107 и 111-113, отличающийся тем, что трансмембранный домен представляет собой или содержит трансмембранный домен, полученный из CD4, CD28 или CD8.

115. Химерный рецептор варианта осуществления 114, отличающийся тем, что трансмембранный домен представляет собой или содержит трансмембранный домен, полученный из CD28.

116. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107 и 111-115, отличающийся тем, что трансмембранный домен является человеческим или получен из человеческого белка.

117. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 108-110, 115 и 116, отличающийся тем, что трансмембранный домен, полученный из CD28, содержит:

а) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; или

б) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6.

118. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-117, дополнительно содержащий активирующий цитоплазматический сигнальный домен.

119. Химерный рецептор варианта осуществления 118, отличающийся тем, что активирующий цитоплазматический сигнальный домен, способный индуцировать первичный активирующий сигнал в Т-клетке, является компонентом Т-клеточного рецептора (TCR) и/или содержит мотив активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM).

120. Химерный рецептор варианта осуществления 118 или варианта осуществления 119, отличающийся тем, что активирующий цитоплазматический сигнальный домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен дзета-цепи CD3-дзета (CD3ζ) или его функциональный вариант или сигнальную часть.

121. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 118-120, отличающийся тем, что внутриклеточный сигнальный домен содержит по порядку от его N-конца до C-конца: сигнальный домен, полученный из CD40, и активирующий цитоплазматический сигнальный домен.

122. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-117, отличающийся тем, что внутриклеточный сигнальный домен не содержит внутриклеточный сигнальный домен дзета-цепи CD3-дзета (CD3ζ).

123. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-122, отличающийся тем, что внутриклеточный сигнальный домен дополнительно содержит дополнительный костимулирующий сигнальный домен.

124. Химерный рецептор варианта осуществления 123, отличающийся тем, что дополнительный костимулирующий сигнальный домен содержит внутриклеточный сигнальный домен костимулирующей молекулы Т-клеток или его сигнальную часть, отличный от полученного из CD40.

125. Химерный рецептор варианта осуществления 123 или варианта осуществления 124, отличающийся тем, что дополнительный костимулирующий сигнальный домен содержит сигнальный домен, полученный из CD28, 4-1BB или ICOS, или его сигнальную части.

126. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-125, отличающийся тем, что лигандсвязывающий домен является антигенсвязывающим доменом.

127. Химерный рецептор варианта осуществления 126, отличающийся тем, что антигенсвязывающий домен представляет собой антитело или фрагмент антигенсвязывающего антитела.

128. Химерный рецептор варианта осуществления 127, отличающийся тем, что антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, который является одноцепочечным фрагментом.

129. Химерный рецептор варианта осуществления 127 или варианта осуществления 128, отличающийся тем, что антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит вариабельные области антитела, соединенные гибким линкером иммуноглобулина.

130. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 127-129, отличающийся тем, что антигенсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

131. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-130, отличающийся тем, что лигандсвязывающий домен специфично связывается с антигеном, который ассоциирован с заболеванием или расстройством.

132. Химерный рецептор варианта осуществления 131, отличающийся тем, что заболевание или расстройство представляют собой инфекционное заболевание или патологическое состояние, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание или опухоль или злокачественное новообразование.

133. Химерный рецептор варианта осуществления 122, отличающийся тем, что злокачественное новообразование представляет собой солидную опухоль.

134. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-133, отличающийся тем, что лигандсвязывающий домен специфично связывается с опухолевым антигеном.

135. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-122, отличающийся тем, что лигандсвязывающий домен специфично связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из ROR1, антигена созревания В-клеток (BCMA), tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, СЕА и поверхностного антигена гепатита В, антитела против фолатного рецептора, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 или 4, erbB димеров, EGFR vIII, FBP, FCRL5, FCRH5, фетального рецептора ацетилхолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-альфа, IL-13R-альфа2, kdr, легкой цепи каппа, Lewis Y, молекулы адгезии L1-клеток, (L1-CAM), ассоциированного с меланомой антигена (MAGE) - A1, MAGE-A3, MAGE-A6, предпочтительно экспрессируемого антигена меланомы (PRAME), сурвивина, EGP2, EGP40, TAG72, B7-H6, рецептора a2 IL-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, фолатного рецептора-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 интегрина, 8H9, NCAM, VEGF-рецепторов, 5T4, фетального AchR, NKG2D-лигандовы, CD44v6, двойного антигена и антигена, ассоциированного с универсальным маркером, антигена рака яичка, мезотелина, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D-лигандов, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкофетального антигена, ROR1, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбрионального антигена (CEA), простата-специфичного антигена, PSMA, Her2/neu, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфрина B2, CD123, c-Met, GD-2, O-ацетилированного GD2 (OGD2), CE7, Опухоли Вильмса 1 (WT-1), циклина, циклина A2, CCL-1, CD138 и патогенспецифического антигена.

136. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-123, отличающийся тем, что лигандсвязывающий домен специфично связывается с CD19.

137. Химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-136, отличающийся тем, что химерный рецептор дополнительно содержит спейсер, соединяющий лигандсвязывающий домен и трансмембранный домен.

138. Химерный рецептор варианта осуществления 137, отличающийся тем, что спейсер получен из человеческого IgG.

139. Химерный рецептор варианта осуществления 137 или варианта осуществления 138, отличающийся тем, что спейсер содержит аминокислотную последовательность ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 1).

140. Химерный рецептор варианта осуществления 137, отличающийся тем, что спейсер содержит внеклеточную часть из CD28, который необязательно представляет собой человеческий CD28.

141. Химерный рецептор варианта осуществления 140, отличающийся тем, что внеклеточная часть, полученная из CD28, содержит 1-50 аминокислот в длину, 1-40 аминокислот в длину, 1-30 аминокислот в длину, 1-20 аминокислот в длину или 1-10 аминокислот в длину.

142. Химерный рецептор варианта осуществления 140 или варианта осуществления 141, отличающийся тем, что спейсер и трансмембранный домен содержат:

а) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; или

b) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7.

143. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-142.

144. Молекула нуклеиновой кислоты варианта осуществления 143, дополнительно содержащая сигнальную последовательность.

145. Молекула нуклеиновой кислоты варианта осуществления 143 или варианта осуществления 144, отличающаяся тем, что полинуклеотид представляет собой первый полинуклеотидом, и молекула нуклеиновой кислоты содержит второй полинуклеотид, кодирующий второй химерный рецептор.

146. Молекула нуклеиновой кислоты варианта осуществления 141, отличающаяся тем, что первый и второй полинуклеотиды разделены сайтом внутренней посадки рибосомы (IRES) или нуклеотидной последовательностью, кодирующей саморасщепляющийся пептид или пептид, который вызывает прыжок рибосомы, и который необязательно представляет собой T2A или P2A,

147. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту любого из вариантов осуществления 143-146.

148. Вектор варианта осуществления 147, отличающийся тем, что вектор представляет собой экспрессирующий вектор.

149. Вектор варианта осуществления 147 или варианта осуществления 148, отличающийся тем, что вектор представляет собой вирусный вектор.

150. Вектор варианта осуществления 149, отличающийся тем, что вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.

151. Вектор варианта осуществления 149 или варианта осуществления 150, отличающийся тем, что вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор.

152. Вектор варианта осуществления 149 или варианта осуществления 150, отличающийся тем, что вирусный вектор представляет собой гамма-ретровирусный вектор.

153. Сконструированная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту любого из вариантов осуществления 143-146 или вектор любого из вариантов осуществления 147-152 или экспрессирующая химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-144.

154. Сконструированная клетка варианта осуществления 153, которая является Т-клеткой.

155. Сконструированная клетка варианта осуществления 153 или варианта осуществления 154, которая является CD8+ Т-клеткой.

156. Способ получения сконструированной клетки, включающий введение в клетку молекулы нуклеиновой кислоты любого из вариантов осуществления 143-146 или вектора любого из вариантов осуществления 147-152, в результате чего получают сконструированную клетку.

157. Сконструированная клетка, полученная способом варианта осуществления 156.

158. Композиция, содержащая сконструированную клетку любого из вариантов осуществления 153-155 и 157.

159. Композиция, содержащая:

сконструированную клетку варианта осуществления 155 или сконструированную CD8+клетку, экспрессирующую химерный рецептор любого из вариантов осуществления 107-144;

сконструированную CD4+ клетку, содержащую другой химерный рецептор, по сравнению с химерным рецептором, экспрессируемым в CD8+ клетке, причем другой химерный рецептор содержит другой костимулирующий сигнальный домен.

160. Композиция варианта осуществления 159, отличающаяся тем, что соотношение первой сконструированной клетки и второй сконструированной клетки составляет от 1:1 до 2:1, необязательно составляет или примерно составляет 1:1, 1: 2, 2:1.

161. Композиция варианта 159 или варианта 160, отличающаяся тем, что единственное различие в химерном рецепторе, экспрессируемом в CD4+ клетке, по сравнению с CD8+ клеткой, представляет собой другой костимулирующий сигнальный домен.

162. Композиция любого из вариантов осуществления 159-161, отличающаяся тем, что другой костимулирующий сигнальный домен не содержит TRAF-6-индуцирующий домен, способный индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6 и/или способный индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию.

163. Композиция любого из вариантов осуществления 159-162, отличающаяся тем, что другой костимулирующий сигнальный домен представляет собой или содержит домен, индуцирующий PI-3-киназу, способный индуцировать активацию или клеточную локализацию PI-3-киназы и/или способный индуцировать сигнализацию PI3K/Akt.

164. Композиция любого из вариантов осуществления 159-163, отличающаяся тем, что другой костимулирующий сигнальный домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен молекулы CD28, 4-1BB или ICOS или является функциональным вариантом его сигнальной части.

165. Композиция любого из вариантов осуществления 158-164, отличающаяся тем, что при стимулировании стимулирующим агентом или агентами in vitro генетически сконструированные клетки в композиции демонстрируют повышенную способность к пролиферации или наращиванию по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании тем же стимулирующим агентом или агентами.

166. Композиция любого из вариантов осуществления 158-165, отличающаяся тем, что при стимулировании в присутствии стимулирующего агента или агентов in vitro генетически сконструированные клетки в композиции демонстрируют повышенное количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании одним и тем же стимулирующим агентом или агентами.

167. Композиция варианта осуществления 166, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD62L+.

168. Композиция варианта осуществления 166 или варианта осуществления 167, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются Т-клетками центральной памяти (Т_СМ), Т-клетками долговременной памяти или стволовыми Т-клетками памяти (T_SCM).

169 Композиция варианта осуществления 167 или варианта осуществления 168, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти дополнительно содержат фенотип, содержащий:

a) CD127+; и/или

b) любой один или более из CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ и CD27+ и любой один или более из t-bet^low, IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+.

170. Композиция любого из вариантов осуществления 167-169, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD8+.

171. Композиция любого из вариантов осуществления 167-170, отличающаяся тем, что количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти, полученных из введенных генетически сконструированных клеток, содержит увеличение или больший процент Т-клеток центральной памяти (T_CM), Т клеток долговременной памяти или стволовых Т-клеток памяти (T_SCM) по сравнению с эталонной композицией.

172. Композиция любого из вариантов осуществления 158-171, отличающаяся тем, что при стимулировании стимулирующим агентом или агентами in vitro генетически сконструированные клетки в композиции демонстрируют повышенную жизнестойкость и/или выживаемость по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании тем же стимулирующим агентом или агентами.

173. Композиция любого из вариантов осуществления 158-172, отличающаяся тем, что при стимулировании стимулирующим агентом или агентами in vitro генетически сконструированные клетки в композиции продуцируют больше IL-2 по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании одним и тем же стимулирующим агентом или агентами.

174. Композиция любого из вариантов осуществления 158-173, отличающаяся тем, что стимулирующий агент или агенты содержат антиген, специфичный для связывания химерного рецептора, антитела против CD3/CD28 и/или содержат цитокин IL-2, IL-15 и/или IL-7.

175. Композиция любого из вариантов осуществления 158-174, отличающаяся тем, что увеличение наблюдается в течение 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней или 14 дней после начала стимулирования.

176. Композиция любого из вариантов осуществления 158-175, отличающаяся тем, что увеличение наблюдается при соотношении эффектора к мишени, составляющего больше или больше, чем примерно или примерно 3:1, больше или больше, чем примерно или примерно 5:1 или больше или больше, чем примерно или примерно 9:1.

177. Композиция любого из вариантов осуществления 158-176, отличающаяся тем, что в анализе in vitro после множества раундов антигенспецифичного стимулирования Т-клетки из композиции демонстрируют или, как было обнаружено, демонстрируют устойчивый или повышенный уровень фактора, показательного для функции, здоровья или активности Т-клеток по сравнению с эталонной композицией, содержащей популяцию Т-клеток по сравнению с одним раундом стимулирования и/или по сравнению с уровнем в том же анализе при оценке после одного раунда стимулирования и/или нескольких раундов стимулирования, которых меньше, чем множество.

178. Композиция любого из вариантов осуществления 73-87 и 165-177, отличающаяся тем, что:

эталонная клеточная композиция содержит генетически сконструированные клетки, которые являются по существу одинаковыми, за исключением того, что экспрессированный химерный рецептор содержит внутриклеточный сигнальный домен, полученный из другой костимулирующей молекулы, которая не содержит внутриклеточный сигнальный домен CD40; или

генетически сконструированные клетки содержат CD8+ Т-клетки и генетически сконструированные Т-клетки эталонной клеточной композиции, содержащие тот же химерный рецептор, но не содержащие CD8+ Т-клеток или не содержащие CD8+ Т-клеток в том же отношении.

179. Композиция варианта осуществления 178, отличающаяся тем, что эталонная клеточная композиция содержит генетически сконструированные Т-клетки, содержащие внутриклеточную сигнализацию, полученную из другой костимулирующей молекулы, где:

другая костимулирующая молекула представляет собой другую костимулирующую молекулу, содержащую TRAF-6-индуцирующий домен, необязательно, внутриклеточный сигнальный домен, полученный из OX40; или

другая костимулирующая молекула представляет собой полученный из ICOC внутриклеточный сигнальный домен.

180. Композиция любого из вариантов осуществления 175-179, отличающаяся тем, что уровень фактора не уменьшается по сравнению с эталонной популяцией или уровнем в том же анализе при оценке после одного раунда стимулирования и/или нескольких раундов стимулирования, которых меньше, чем множество.

181. Композиция любого из вариантов осуществления 175-180, отличающаяся тем, что множество раундов стимулирования содержит по меньшей мере 3, 4 или 5 раундов и/или проводится в течение периода по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 дней.

182. Способ лечения, включающий введение клетки любого из вариантов осуществления 153-155 и 157 или композиции любого из вариантов осуществления 158-181 пациенту, имеющему заболевание или патологическое состояние.

183. Способ варианта осуществления 182, отличающийся тем, что химерный рецептор специфично связывается с лигандом или антигеном, ассоциированным с заболеванием или патологическим состоянием.

184. Способ варианта осуществления 182 или варианта осуществления 183, отличающийся тем, что заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование, опухоль, аутоиммунное заболевание или расстройство или инфекционное заболевание.

185. Способ любого из вариантов осуществления 182-184, отличающийся тем, что генетически сконструированные Т-клетки или подгруппа генетически сконструированных Т-клеток демонстрируют повышенное или более продолжительное наращивание и/или жизнестойкость у пациента, чем у пациента, которому вводили такое же или примерно такое же количество дозы контрольной клеточной композиции.

186. Способ варианта осуществления 185, отличающийся тем, что генетически сконструированные Т-клетки или подгруппа генетически сконструированных Т-клеток представляют собой CD8+ Т-клетки.

187. Способ варианта осуществления 185 или 186, отличающийся тем, что увеличение или уменьшение наблюдается или присутствует в течение месяца, в течение двух месяцев, в течение шести месяцев или в течение одного года после введения клеток.

188. Способ любого из вариантов осуществления 185-187, отличающийся тем, что эталонная клеточная композиция содержит генетически сконструированные клетки, которые являются по существу одинаковыми, за исключением того, что экспрессированный химерный рецептор содержит другую костимулирующую молекулу, которая не содержит внутриклеточный сигнальный домен, полученный из CD40.

189. Композиция варианта осуществления 188, отличающаяся тем, что другая костимулирующая молекула представляет собой другую костимулирующую молекулу, содержащую TRAF-6-индуцирующий домен, необязательно, внутриклеточный сигнальный домен, полученный из OX40.

190. Композиция любого из вариантов осуществления 158-181 для применения при лечении заболевания или патологического состояния у пациента, имеющего заболевания или патологическое состояние.

191. Применение композиции любого из вариантов осуществления 158-181 для лечения заболевания или патологического состояния у пациента, имеющего заболевание или патологическое состояние.

192. Применение композиции любого из вариантов осуществления 158-181 для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или патологического состояния у пациента, имеющего заболевание или патологическое состояние.

193. Композиция для применения варианта осуществления 190 или применения варианта осуществления 191 или варианта осуществления 192, отличающаяся тем, что лигандсвязывающий рецептор специфично связывается с лигандом или антигеном, ассоциированным с заболеванием или патологическим состоянием.

194. Композиция для применения или применение любого из вариантов осуществления 190-193, отличающиеся тем, что заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование, опухоль, аутоиммунное заболевание или расстройство или инфекционное заболевание.

VII. ПРИМЕРЫ

Следующие примеры включены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Пример 1: Генерация химерных антигенных рецепторов (CAR), содержащих сигнальный эндодомен TRAF-6

Были созданы молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие химерный антигенный рецептор (CAR), несущий, помимо внутриклеточного сигнального домена CD3-дзета, костимулирующий рецепторный компонент, полученный из внутриклеточного сигнального домена либо человеческого CD40 (SEQ ID NO: 12, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 34), человеческого OX40 (SEQ ID NO: 32, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 33), либо человеческого ICOS (SEQ ID NO: 35, кодируется последовательностью, представленной в SEQ IN NO: 36). В частности, CAR, кодируемый каждой генерируемой конструкцией нуклеиновой кислоты, содержал по порядку: scFv антитела против CD19 (SEQ ID NO: 27, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 28); (SEQ ID NO: 1, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2), трансмембранный домен, полученный из человеческого CD28 (SEQ ID NO: 6, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 46), сконструированный внутриклеточный сигнальный домен, полученный из CD40, OX40 или ICOS, указанный выше; и человеческий сигнальный домен, полученный из CD3-дзета (SEQ ID NO: 21, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 41).

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, также содержала сигнальную последовательность, кодирующую сигнальный пептид GMCSFR (SEQ ID NO: 37). Молекула нуклеиновой кислоты также включала укороченную последовательность EGFR (tEGFR) для использования в качестве маркера трансдукции (SEQ ID NO: 31, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 30), отделенную от последовательности CAR последовательностью саморасщепляющегося T2A (SEQ ID NO: 24, кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 40).

Для сравнения были созданы дополнительные CAR, содержащие scFv антитела против CD19, спейсер, полученный из Ig, человеческий трансмембранный домен, полученный из CD28, либо костимулирующий сигнальный домен, полученный из человеческого CD28, либо костимирутивный сигнальный домен, полученный из человеческого 4-1BB, и сигнальный домен, полученный из человеческого CD3-дзета.

Молекулу нуклеиновой кислоты клонировали в лентивирусный вектор, который использовали для трансдукции первичных Т-клеток, выделенных путем обогащения на основе иммуноаффинности из клеток донора-человека.

Пример 2. Анализы функции in vitro с химерными антигенными рецепторами (CAR), содержащими сигнальным эндодомен TRAF-6

Генетически сконструированные клетки, экспрессирующие различные CAR, полученные, как описано выше, оценивали для различных ответов после совместного культивирования с CD19-экспрессирующими клетками. Анализы in vitro для оценки уничтожения клеток-мишеней и продуцирования цитокинов проводили с использованием CD19-трансдуцированных клеток K562.

2A. Цитолитическая активность

CD19-экспрессирующие клетки-мишени (клетки K562, трансдуцированные для экспрессии CD19, K562-CD19) инкубировали с различными сконструированными Т-клетками, как описано выше, при различных соотношениях эффекторных клеток к клеткам-мишеням (E:T) 9:1, 3:1 или 1:1. В качестве контролей использовали инкубацию только в присутствии клеток-мишеней (только мишень) или инкубацию клеток-мишеней с Т-клетками, не экспрессирующими CAR (пустой контроль). На 4-й день совместного культивирования лизис клеток контролировали в режиме реального времени в течение от 0 до примерно 110 часов путем добавления реагента IncuCyte™ флуоресцентной каспазы 3/7 к совместной культуре для детектирования апоптотических клеток. Смерть клеток-мишеней определяли количественно с помощью автоматизированного анализа изображений в течение времени. Определяли площадь под кривой (AUC) флуоресцентного сигнала в течение времени для каждой концентрации. Индекс уничтожения определяли по формуле: 1/AUC.

На ФИГ. 1 представлен индекс уничтожения для каждого тестированного условия. Как показано на ФИГ. 1, сконструированные Т-клетки, экспрессирующие CAR, содержащие костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, ICOS, или OX40, уничтожали CD19-экспрессирующие клетки-мишени. Для некоторых тестируемых CAR уровень уничтожения был на уровне, сопоставимом с Т-клетками, экспрессирующими CAR, содержащий костимулирующий сигнальный домен, полученный из 4-1BB или CD28, хотя большее уничтожение наблюдали для некоторых CAR-экспрессирующих клеток при более высоком соотношении эффектор:клетка-мишень.

2B. Высвобождение цитокинов

Высвобождение цитокинов оценивали для супернатантов с 4-го дня, полученных из описанного выше теста на уничтожение, после инкубации клеток, экспрессирующих CAR, с антиген-экспрессирующими клетками-мишенями K562-CD19 при соотношениях E:T 1:1, 3:1 и 9:1. Конкретно, присутствие TNF-α, IFNγ, GM-CSF и IL-2 в супернатантах культуры оценивали с использованием мультиплексного анализа на основе микросфер Luminex®. Результаты на ФИГ. 2А-D продемонстрировали, что сопоставимые уровни цитокинов TNF-α, IFNγ, и GM-CSF присутствовали в супернатантах, полученных после инкубации клеток-мишеней с каждыми из Т-клеток, экспрессирующих CAR, содержащий внутриклеточный сигнальный домен, полученный из CD40, OX40 или ICOS, по сравнению с клетками, сконструированными с помощью CAR, содержащего внутриклеточные сигнальные домены, полученные из CD28 или 41BB, при всех соотношениях E:T. Как показано на ФИГ. 2D, некоторые различия наблюдались в уровне IL-2 в супернатантах, полученных из совместных культур, инкубированных с Т-клетками, экспрессирующими CAR, несущий костимулирующий сигнальный домен OX40 или ICOS, особенно при самом высоком отношении E: T 9:1.

Дополнительные исследования проводили путем контроля уровня внутриклеточных цитокинов в сконструированных Т-клетках, совместно культивированных с облученными клетками-мишенями K562-CD19 или с родительскими клетками K562, не экспрессирующими антиген CD19, при соотношении E:T 1:1 в течение 4 часов в присутствии ингибитора Гольджи. После стимулирования клетки затем фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали на присутствие TNF, IFN-γ, IL-17A, Гранзима B, IL-13, IL-22, IL-10 или IL-2. Присутствие внутриклеточных цитокинов оценивали с помощью проточной цитометрии в клетках CD4+/CAR+ и в CD8+/CAR+ живых клетках, идентифицированных с помощью первого гейтирования для CD3+ клеток, а затем для клеток CAR+ (идентифицированных с использованием антитела против CAR или антитела против EGFR для детектирования суррогатного маркера EGFRt) перед отдельной оценкой CD8+ и CD4+ подгрупп для внутриклеточных цитокинов, как указано.

Экспрессия цитокинов в CD8+клетках представлена на ФИГ. 3А, CD40; ФИГ. 3B, OX40; ФИГ. 3C, ICOS; ФИГ. 3D 4-1BB, ФИГ. 3E, CD28) и для CD4+ показаны на ФИГ. 4А, CD40; ФИГ. 4B, OX40; ФИГ. 4C, ICOS; ФИГ. 4D, 4-1BB, ФИГ. 4E, CD28. Черным показаны внутриклеточные цитокины в CAR-сконструированных Т-клетках, стимулированных клетками-мишенями K562-CD19, а серым показаны внутриклеточные цитокины в CAR-сконструированных, стимулированных родительскими клетками K562. Цифры в каждом квадрате относятся к CAR-сконструированным клеткам, которые были стимулированы клетками-мишенями K562-CD19, и представляют процент таких CAR+клеток для каждой соответствующей подгруппы CD8+ или CD4+, положительной для указанного цитокина или цитокинов в процентах от общего количества CAR+ клеток подгруппы.

Пример 3: Оценка наращивания после последовательного рестимулирования

Способность клеток наращиваться ex vivo после повторных стимулирований в некоторых аспектах может указывать на способность CAR-T-клеток сохраняться (например, после начальной активации) и/или указывать на функцию in vivo (Zhao et al. (2015) Cancer Cell, 28: 415-28). CAR-T-клетки, полученные, как описано выше, культивировали с облученными клетками-мишенями (K562-CD19) при соотношении эффектора к мишени 1:1. Клетки стимулировали, собирали каждые 3-4 дня и подсчитывали, и рестимулировали с новыми клетками-мишенями, используя те же условия культивирования после сброса количества клеток до начальной плотности посева для каждого раунда. Всего было проведено 4 раунда стимулирования в течение 14-дневного периода культивирования. Для каждого раунда стимулирования определяли количество удвоений.

Как показано на ФИГ. 5, сопоставимый исходный рост анти-CD19 CAR-сконструированных клеток, экспрессирующих CAR, содержащий костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, OX40, ICOS, CD28 или 4-1BB, наблюдали в количестве удвоений популяции. К 11-му дню стимулирования наблюдали продолжение клеточного наращивания анти-CD19 CAR-сконструированных клеток, экспрессирующих CAR, содержащий костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD-и CD28- или 4-1BB.

Пример 4. Противоопухолевая эффективность in vivo и наращивание CAR-сконструированных Т-клеток, несущих сигнальный эндодомен TRAF-6

Мышиная модель ксенотрансплантата диссеминированной опухоли была создана путем инъекции мышей NOD/Scid/gc -/- (NSG) клетками клеточной линии диссеминированной опухоли CD19+ Nalm-6.

В день ноль (0) мышам NSG вводили внутривенно 5×10⁵ клеток Nalm-6, экспрессирующих люциферазу светлячка. На 4-й день мышей сгруппировали в пять групп исследования, каждая из которых состояла из 8 мышей, и вводили им 1×10⁶ CAR-сконструированных Т-клеток, полученных, как описано в Примере 1, следующим образом:1) Группа 1 - CAR-T-клетки, экспрессирующие CAR, несущий внутриклеточный сигнальный домен, полученный из CD40; 2) Группа 2 - CAR-T-клетки, экспрессирующие CAR, несущий внутриклеточный сигнальный домен, полученный из OX40; 3) Группа 3 - CAR-T-клетки, экспрессирующие CAR, несущий внутриклеточный сигнальный домен, полученный из ICOS; 4) Группа 4 - CAR-T-клетки, экспрессирующие CAR, несущий внутриклеточный сигнальный домен, полученный из 4-1BB, или 5) Группа 5 - CAR-T-клетки, экспрессирующие CAR, несущий внутриклеточный сигнальный домен, полученный из CD28. В качестве контролей добавляли две дополнительные группы исследования, в частности группа исследования из 5 мышей, которым не инъецировали никаких клеток (группа исследования только с опухолью), и в группа из 8 мышей, которым инъецировали 1×10⁶ Т-клеток, которые не экспрессировали CAR (группа исследования пустой контроль).

4A. Опухолевый рост и выживание

После обработки, как описано выше, опухолевый рост измеряли во времени с помощью биолюминесцентной визуализации, а среднее значение (импульс/с/см²/ср) измеряли до 28 дней после инъекции клетками CD19+ Nalm-6, экспрессирующими люциферазу светлячка. Как показано на ФИГ. 6A, пять групп исследования мышей, инъецированных CAR-сконструированными клетками, экспрессирующими костимулирующий сигнальный домен, полученный либо из CD40, OX40, CD28, ICOS, либо 4-1BB, показали сопоставимое снижение количества средней светимости во все тестированные моменты времени по сравнению как с группой исследования только опухоли, так и с группой исследования пустого контроля, что указывает на аналогичную противоопухолевую эффективность CAR-сконструированных в этом исследовании.

Мышей в каждой группе исследования также оценивали на выживание до 40 дней после инъекции клетками CD19+ Nalm-6, экспрессирующими люциферазу светлячка. На ФИГ. 6В показан процент выживаемости мышей, которым вводили CAR-сконструированные клетки, экспрессирующие CAR, содержащий ко-стимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, OX40, ICOS, CD28 или 4-1BB. Мыши в каждой тестируемой группе выживали примерно до 35 дней после инъекции опухоли по сравнению с группой исследования только опухоли и группой исследования пустого контроля, которые выживали только до 23 дней и 24 дней после инъекции опухоли, соответственно.

4В. In Vivo наращивание

Кровь, селезенка и костный мозг от мышей, которым вводили CAR-сконструированные клетки, экспрессирующие CAR, содержащий костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, OX40, ICOS, CD28 или 4-1BB, анализировали на присутствие EGFRt+ CAR Т-клеток и/или опухолевых клетки на 7-й день или 28-й день. Иллюстративные результаты по количеству опухолевых клеток в крови, селезенке или костном мозге в день 28 показаны на ФИГ. 7A-C и по количеству циркулирующих CD4+ или CD8+ CAR-T-клеток в костном мозге в день 28 показаны на ФИГ. 7D и ФИГ. 7Е, соответственно.

Как показано на ФИГ. 7А-С, детектировали меньшее количество опухолевых клеток в крови, селезенке или костном мозге у мышей, которым вводили CAR-сконструированные клетки, экспрессирующие CAR, содержащий костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, OX40, ICOS, CD28 или 4-1BB, по сравнению с группой исследования пустого контроля. Как показано на ФИГ. 7D-E, CAR-сконструированные клетки, экспрессирующие CAR, содержащий костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD-CD, CD28 или 4-1BB, демонстрировали большее количество циркулирующих CD4+ и/или CD8+ CAR-T клеток в костном мозге по сравнению с другими CAR-экспрессирующими клетками.

Настоящее изобретение не ограничивается рамками конкретных раскрытых вариантов осуществления, которые предложены, например, для иллюстрации различных аспектов изобретения. Различные модификации описанных композиций и способов станут очевидными из описания и положений настоящего изобретения. Такие вариации могут быть осуществлены на практике, не отходя от истинного объема и сущности раскрытия, и подразумевается, что они попадают в объем настоящего раскрытия.

Последовательности

SEQ ID NO.	ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ	ОПИСАНИЕ
1	ESKYGPPCPPCP	спейсер (IgG4-шарнир) (ак)homo sapiens
2	GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT	спейсер (IgG4-шарнир) (нт) homo sapiens
3	ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK	Шарнир-CH3 спейсер Homo sapiens
4	ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK	Шарнир-CH2-CH3 спейсер Homo sapiens
5	RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH	IgD-шарнир-Fc Homo sapiens
6	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV	CD28 (аминокислоты 153-179 регистрационный No. P10747) Homo sapiens
7	IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV	CD28 (аминокислоты 114-179 регистрационный No. P10747) Homo sapiens
8	RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS	CD28 (аминокислоты 180-220 P10747) Homo sapiens
9	RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS	CD28 (LL на GG) Homo sapiens
10	KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL	4-1BB (аминокислоты 214-255 Q07011.1) Homo sapiens
11	ALVVIPIIFGILFAILLVLVFI	UniProt P25942 аминокислотные остатки 194-215 Трансмембранный домен CD40
12	KKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ	UniProt P25942 аминокислотные остатки 216-277 Цитоплазматический домен CD40 TRAF-6-связывающий домен соответствует аминокислотным остаткам 18-23 SEQID NO: 12 (выделено и подчеркнуто)
113	GLIILLLFASVALVAAIIFGV	UniProt Q9Y6Q6 аминокислотные остатки 213-233 Трансмембранный домен RANK (TNFRSF11A)
14	CYRKKGKALTANLWHWINEACGRLSGDKESSGDSCVSTHTANFGQQGACEGVLLLTLEEKTFPEDMCYPDQGGVCQGTCVGGGPYAQGEDARMLSLVSKTEIEEDSFRQMPTEDEYMDRPSQPTDQLLFLTEPGSKSTPPFSEPLEVGENDSLSQCFTGTQSTVGSESCNCTEPLCRTDWTPMSSENYLQKEVDSGHCPHWAASPSPNWADVCTGCRNPPGEDCEPLVGSPKRGPLPQCAYGMGLPPEEEASRTEARDQPEDGADGRLPSSARAGAGSGSSPGGQSPASGNVTGNSNSTFISSGQVMNFKGDIIVVYVSQTSQEGAAAAAEPMGRPVQEETLARRDSFAGNGPRFPDPCGGPEGLREPEKASRPVQEQGGAKA	UniProt Q9Y6Q6 аминокислотные остатки 234-616 Цитоплазматический домен RANK (TNFRSF11A) TRAF-6-связывающий домен соответствует аминокислотным остаткам 111-116 SEQ ID NO: 14 (выделено и подчеркнуто)
115	HMIGICVTLTVIIVCSVFIY	UniProt P14778 аминокислотные остатки 337-356 Трансмембранный домен рецептора типа 1 интерлейкина-1 (IL1R1)
116	KIFKIDIVLWYRDSCYDFLPIKASDGKTYDAYILYPKTVGEGSTSDCDIFVFKVLPEVLEKQCGYKLFIYGRDDYVGEDIVEVINENVKKSRRLIIILVRETSGFSWLGGSSEEQIAMYNALVQDGIKVVLLELEKIQDYEKMPESIKFIKQKHGAIRWSGDFTQGPQSAKTRFWKNVRYHMPVQRRSPSSKHQLLSPATKEKLQREAHVPLG	UniProt P14778 аминокислотные остатки 357-569 Цитоплазматический домен рецептора типа 1 интерлейкина-1 (IL1R1)
117	VLLVVILIVVYHVYWLEMVLF	UniProt Q9NPH3 аминокислотные остатки 368-388 Трансмембранный домен вспомогательного белка рецептора интерлейкина-1 (IL1RAP)
118	YRAHFGTDETILDGKEYDIYVSYARNAEEEEFVLLTLRGVLENEFGYKLCIFDRDSLPGGIVTDETLSFIQKSRRLLVVLSPNYVLQGTQALLELKAGLENMASRGNINVILVQYKAVKETKVKELKRAKTVLTVIKWKGEKSKYPQGRFWKQLQVAMPVKKSPRRSSSDEQGLSYSSLKNV	UniProt Q9NPH3 аминокислотные остатки 389-570 Цитоплазматический домен вспомогательного белка рецептора интерлейкина-1 (IL1RAP)
119	VAAILGLGLVLGLLGPLAILL	UniProt P43489 аминокислотные остатки 215-235 Трансмембранный домен OX40 Homo sapiens
220	ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI	UniProt P43489 аминокислотные остатки 236-277 Цитоплазматический домен OX40 Homo sapiens
221	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	CD3-дзета Homo sapiens
222	RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	CD3-дзета Homo sapiens
223	RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR	CD3-дзета Homo sapiens
224	LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR	T2A Искусственная
225	MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM	tEGFR Искусственная
226	Pro-Xaa1-Glu-Xaa2-Xaa3-Xaa4	Консенсус TRAF-6 связывающего домена Xaa1, Xaa2, Xaa3=любая аминокислота Xaa4=ароматическая или кислая аминокислота
227	DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS	scFv антитела против CD19 искусственная (ак)
228	GACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTCAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAACACACTGCCCTACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCACCGGCAGCACCTCCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGAGGTGAAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCCAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCCAGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGC	scFv антитела против CD19 искусственная (нт)
229	EGRGSLLTCGDVEENPGP	T2A искусственная (ак)
330	CGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATG	tEGFR искусственная (нт)
331	RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM	tEGFR искусственная (ак)
332	RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI	Цитоплазматический домен OX40 Homo sapiens (ак)
333	CGGAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATC	Цитоплазматический домен OX40 Homo sapiens (нт)
334	AAAAAGGTGGCCAAGAAGCCAACCAATAAGGCCCCCCACCCCAAGCAGGAACCCCAGGAGATCAATTTTCCCGACGATCTTCCTGGCTCCAACACTGCTGCTCCAGTGCAGGAGACTTTACATGGATGCCAACCGGTCACCCAGGAGGATGGCAAAGAGAGTCGCATCTCAGTGCAGGAGAGACAG	Цитоплазматический домен CD40 Homo sapiens (нт)
335	CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL	Цитоплазматический домен ICOS Homo sapiens (ак)
336	TGTTGGCTTACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCTAGACTCACAGATGTGACCCTA	Цитоплазматический домен ICOS Homo sapiens (нт)
337	MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP	GMCSFR альфа-цепь, сигнальная последовательность Homo sapiens UniProt No. P15509 (ак)
338	ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCA	GMCSFR альфа-цепь, сигнальная последовательность Homo sapiens (нт)
339	ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCC	GMCSFR альфа-цепь, сигнальная последовательность Homo sapiens (нт)
440	TCGAGGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGG	T2A искусственная (нт)
441	CGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGG	CD3-дзета Homo sapiens (нт)
442	GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP	P2A
443	ATNFSLLKQAGDVEENPGP	P2A
444	QCTNYALLKLAGDVESNPGP	E2A
445	VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP	F2A
446	TTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGAGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTCACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTG	CD28 трансмембранный домен (нт)

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Juno Therapeutics, Inc

Thompson, Lucas James

Odegard, Valarie

Sather, Blythe

Brahmandam, Archana

<120> ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, СОДЕРЖАЩИЕ TRAF-ИНДУЦИРУЮЩИЕ ДОМЕНЫ И

СВЯЗАННЫЕ С НИМИ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ

<130> 735042002940

<140> Not Yet Assigned

<141> Concurrently Herewith

<150> 62/251,590

<151> 2015-11-05

<160> 46

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 12

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Спейсер (IgG4-шарнир)

<400> 1

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 36

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Спейсер (IgG4-шарнир)

<400> 2

gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36

<210> 3

<211> 119

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> шарнир-CH3 Спейсер

<400> 3

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg

1 5 10 15

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

20 25 30

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

35 40 45

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

50 55 60

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

65 70 75 80

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

85 90 95

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

100 105 110

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

115

<210> 4

<211> 229

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> шарнир-CH2-CH3 Спейсер

<400> 4

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 5

<211> 282

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> IgD-шарнир-Fc

<400> 5

Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala

1 5 10 15

Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys

35 40 45

Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln

65 70 75 80

Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly

85 90 95

Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val

100 105 110

Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly

115 120 125

Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn

130 135 140

Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro

145 150 155 160

Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys

165 170 175

Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser

180 185 190

Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu

195 200 205

Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro

210 215 220

Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser

225 230 235 240

Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr

245 250 255

Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg

260 265 270

Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His

275 280

<210> 6

<211> 27

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD28

<300>

<308> UniProt P10747

<309> 1989-07-01

<400> 6

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 7

<211> 66

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD28

<300>

<308> UniProt P10747

<309> 1989-07-01

<400> 7

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

50 55 60

Trp Val

65

<210> 8

<211> 41

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD28

<300>

<308> UniProt P10747

<309> 1989-07-01

<400> 8

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 9

<211> 41

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD28

<400> 9

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 10

<211> 42

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> 4-1BB

<300>

<308> UniProt Q07011.1

<309> 1995-02-01

<400> 10

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 11

<211> 22

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Трансмембранный домен CD40

<300>

<308> UniProt P25942

<309> 1992-05-01

<400> 11

Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile Leu

1 5 10 15

Leu Val Leu Val Phe Ile

20

<210> 12

<211> 62

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Цитоплазматический домен CD40

<300>

<308> UniProt P25942

<309> 1992-05-01

<400> 12

Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala Pro His Pro Lys Gln

1 5 10 15

Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr

20 25 30

Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln

35 40 45

Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln

50 55 60

<210> 13

<211> 21

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Трансмембранный домен RANK (TNFRSF11A)

<300>

<308> UniProt Q9Y6Q6

<309> 2001-09-26

<400> 13

Gly Leu Ile Ile Leu Leu Leu Phe Ala Ser Val Ala Leu Val Ala Ala

1 5 10 15

Ile Ile Phe Gly Val

20

<210> 14

<211> 383

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Цитоплазматический домен RANK (TNFRSF11A)

<400> 14

Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp His Trp

1 5 10 15

Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg Leu Ser Gly Asp Lys Glu Ser Ser Gly

20 25 30

Asp Ser Cys Val Ser Thr His Thr Ala Asn Phe Gly Gln Gln Gly Ala

35 40 45

Cys Glu Gly Val Leu Leu Leu Thr Leu Glu Glu Lys Thr Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gln Gly Gly Val Cys Gln Gly Thr Cys Val

65 70 75 80

Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gln Gly Glu Asp Ala Arg Met Leu Ser Leu

85 90 95

Val Ser Lys Thr Glu Ile Glu Glu Asp Ser Phe Arg Gln Met Pro Thr

100 105 110

Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg Pro Ser Gln Pro Thr Asp Gln Leu Leu

115 120 125

Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser Lys Ser Thr Pro Pro Phe Ser Glu Pro

130 135 140

Leu Glu Val Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gln Cys Phe Thr Gly Thr

145 150 155 160

Gln Ser Thr Val Gly Ser Glu Ser Cys Asn Cys Thr Glu Pro Leu Cys

165 170 175

Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met Ser Ser Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Glu

180 185 190

Val Asp Ser Gly His Cys Pro His Trp Ala Ala Ser Pro Ser Pro Asn

195 200 205

Trp Ala Asp Val Cys Thr Gly Cys Arg Asn Pro Pro Gly Glu Asp Cys

210 215 220

Glu Pro Leu Val Gly Ser Pro Lys Arg Gly Pro Leu Pro Gln Cys Ala

225 230 235 240

Tyr Gly Met Gly Leu Pro Pro Glu Glu Glu Ala Ser Arg Thr Glu Ala

245 250 255

Arg Asp Gln Pro Glu Asp Gly Ala Asp Gly Arg Leu Pro Ser Ser Ala

260 265 270

Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ser Ser Pro Gly Gly Gln Ser Pro Ala

275 280 285

Ser Gly Asn Val Thr Gly Asn Ser Asn Ser Thr Phe Ile Ser Ser Gly

290 295 300

Gln Val Met Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser Gln

305 310 315 320

Thr Ser Gln Glu Gly Ala Ala Ala Ala Ala Glu Pro Met Gly Arg Pro

325 330 335

Val Gln Glu Glu Thr Leu Ala Arg Arg Asp Ser Phe Ala Gly Asn Gly

340 345 350

Pro Arg Phe Pro Asp Pro Cys Gly Gly Pro Glu Gly Leu Arg Glu Pro

355 360 365

Glu Lys Ala Ser Arg Pro Val Gln Glu Gln Gly Gly Ala Lys Ala

370 375 380

<210> 15

<211> 20

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Трансмембранный домен рецептора типа 1 интерлейкина-1 (IL1R1)

<300>

<308> UniProt P14778

<309> 1990-04-01

<400> 15

His Met Ile Gly Ile Cys Val Thr Leu Thr Val Ile Ile Val Cys Ser

1 5 10 15

Val Phe Ile Tyr

20

<210> 16

<211> 213

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Цитоплазматический домен рецептора типа 1 интерлейкина-1

(IL1R1)

<300>

<308> UniProt P14778

<309> 1990-04-01

<400> 16

Lys Ile Phe Lys Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg Asp Ser Cys Tyr

1 5 10 15

Asp Phe Leu Pro Ile Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Tyr

20 25 30

Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Val Gly Glu Gly Ser Thr Ser Asp Cys Asp

35 40 45

Ile Phe Val Phe Lys Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Lys Gln Cys Gly

50 55 60

Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val Gly Glu Asp Ile

65 70 75 80

Val Glu Val Ile Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg Arg Leu Ile Ile

85 90 95

Ile Leu Val Arg Glu Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu Gly Gly Ser Ser

100 105 110

Glu Glu Gln Ile Ala Met Tyr Asn Ala Leu Val Gln Asp Gly Ile Lys

115 120 125

Val Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gln Asp Tyr Glu Lys Met Pro

130 135 140

Glu Ser Ile Lys Phe Ile Lys Gln Lys His Gly Ala Ile Arg Trp Ser

145 150 155 160

Gly Asp Phe Thr Gln Gly Pro Gln Ser Ala Lys Thr Arg Phe Trp Lys

165 170 175

Asn Val Arg Tyr His Met Pro Val Gln Arg Arg Ser Pro Ser Ser Lys

180 185 190

His Gln Leu Leu Ser Pro Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gln Arg Glu Ala

195 200 205

His Val Pro Leu Gly

210

<210> 17

<211> 21

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Трансмембранный домен вспомогательного белка рецептора

интерлейкина-1 (IL1RAP)

<300>

<308> UniProt Q9NPH3

<309> 2003-08-22

<400> 17

Val Leu Leu Val Val Ile Leu Ile Val Val Tyr His Val Tyr Trp Leu

1 5 10 15

Glu Met Val Leu Phe

20

<210> 18

<211> 182

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Цитоплазматический домен вспомогательного белка рецептора

интерлейкина-1 (IL1RAP)

<300>

<308> UniProt Q9NPH3

<309> 2003-08-22

<400> 18

Tyr Arg Ala His Phe Gly Thr Asp Glu Thr Ile Leu Asp Gly Lys Glu

1 5 10 15

Tyr Asp Ile Tyr Val Ser Tyr Ala Arg Asn Ala Glu Glu Glu Glu Phe

20 25 30

Val Leu Leu Thr Leu Arg Gly Val Leu Glu Asn Glu Phe Gly Tyr Lys

35 40 45

Leu Cys Ile Phe Asp Arg Asp Ser Leu Pro Gly Gly Ile Val Thr Asp

50 55 60

Glu Thr Leu Ser Phe Ile Gln Lys Ser Arg Arg Leu Leu Val Val Leu

65 70 75 80

Ser Pro Asn Tyr Val Leu Gln Gly Thr Gln Ala Leu Leu Glu Leu Lys

85 90 95

Ala Gly Leu Glu Asn Met Ala Ser Arg Gly Asn Ile Asn Val Ile Leu

100 105 110

Val Gln Tyr Lys Ala Val Lys Glu Thr Lys Val Lys Glu Leu Lys Arg

115 120 125

Ala Lys Thr Val Leu Thr Val Ile Lys Trp Lys Gly Glu Lys Ser Lys

130 135 140

Tyr Pro Gln Gly Arg Phe Trp Lys Gln Leu Gln Val Ala Met Pro Val

145 150 155 160

Lys Lys Ser Pro Arg Arg Ser Ser Ser Asp Glu Gln Gly Leu Ser Tyr

165 170 175

Ser Ser Leu Lys Asn Val

180

<210> 19

<211> 21

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Трансмембранный домен OX40

<300>

<308> UniProt P43489

<309> 1995-11-01

<400> 19

Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro

1 5 10 15

Leu Ala Ile Leu Leu

20

<210> 20

<211> 42

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Цитоплазматический домен OX40

<300>

<308> UniProt P43489

<309> 1995-11-01

<400> 20

Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His

1 5 10 15

Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln

20 25 30

Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

35 40

<210> 21

<211> 112

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD3-дзета

<400> 21

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 22

<211> 112

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD3-дзета

<400> 22

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 23

<211> 112

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD3-дзета

<400> 23

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 24

<211> 24

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> T2A

<400> 24

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

20

<210> 25

<211> 357

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> tEGFR

<400> 25

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala

325 330 335

Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly

340 345 350

Ile Gly Leu Phe Met

355

<210> 26

<211> 6

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> консенсус TRAF-6-связывающего домена

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)...(2)

<223> Xaa1 любая аминокислота

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)...(4)

<223> Xaa2 любая аминокислота

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)...(5)

<223> Xaa3 любая аминокислота

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)...(6)

<223> Xaa4 ароматическая или кислая аминокислота

<400> 26

Pro Xaa Glu Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 27

<211> 245

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-CD19 scFv

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 28

<211> 735

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> анти-CD19 scFv

<400> 28

gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60

atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120

gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180

cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240

gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300

ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360

ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420

cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480

tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540

accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600

agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660

gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720

gtgaccgtga gcagc 735

<210> 29

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> T2A

<400> 29

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 30

<211> 1005

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> tEGFR

<400> 30

cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60

acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120

gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180

attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240

aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300

ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360

aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420

acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480

agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540

ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600

gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660

gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720

cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780

acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 840

ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt 900

gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg ccactgggat ggtgggggcc 960

ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct tcatg 1005

<210> 31

<211> 335

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> tEGFR

<400> 31

Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile

20 25 30

Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe

35 40 45

Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr

50 55 60

Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn

65 70 75 80

Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg

85 90 95

Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile

100 105 110

Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val

115 120 125

Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp

130 135 140

Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn

145 150 155 160

Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu

165 170 175

Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser

180 185 190

Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu

195 200 205

Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln

210 215 220

Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly

225 230 235 240

Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro

245 250 255

His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr

260 265 270

Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His

275 280 285

Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro

290 295 300

Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala

305 310 315 320

Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met

325 330 335

<210> 32

<211> 37

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Цитоплазматический домен OX40

<400> 32

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

20 25 30

Thr Leu Ala Lys Ile

35

<210> 33

<211> 111

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Цитоплазматический домен OX40

<400> 33

cggagggacc agaggctgcc ccccgatgcc cacaagcccc ctgggggagg cagtttccgg 60

acccccatcc aagaggagca ggccgacgcc cactccaccc tggccaagat c 111

<210> 34

<211> 186

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Цитоплазматический домен CD40

<400> 34

aaaaaggtgg ccaagaagcc aaccaataag gccccccacc ccaagcagga accccaggag 60

atcaattttc ccgacgatct tcctggctcc aacactgctg ctccagtgca ggagacttta 120

catggatgcc aaccggtcac ccaggaggat ggcaaagaga gtcgcatctc agtgcaggag 180

agacag 186

<210> 35

<211> 38

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Цитоплазматический домен ICOS

<400> 35

Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn

1 5 10 15

Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg

20 25 30

Leu Thr Asp Val Thr Leu

35

<210> 36

<211> 114

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Цитоплазматический домен ICOS

<400> 36

tgttggctta caaaaaagaa gtattcatcc agtgtgcacg accctaacgg tgaatacatg 60

ttcatgagag cagtgaacac agccaaaaaa tctagactca cagatgtgac ccta 114

<210> 37

<211> 22

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> GMCSFR альфа-цепь сигнальная последовательность

<300>

<308> UniProt P15509

<309> 1990-04-01

<400> 37

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 38

<211> 66

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> GMCSFR альфа-цепь сигнальная последовательность

<400> 38

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 39

<211> 66

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> GMCSFR альфа-цепь сигнальная последовательность

<400> 39

atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60

atcccc 66

<210> 40

<211> 71

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> T2A

<400> 40

tcgagggcgg cggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc 60

ccggccctag g 71

<210> 41

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3-дзета

<400> 41

cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaatcagctg 60

tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120

cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180

gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240

aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336

<210> 42

<211> 22

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> P2A

<400> 42

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 43

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> P2A

<400> 43

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 44

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> E2A

<400> 44

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 45

<211> 22

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F2A

<400> 45

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 46

<211> 81

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD28 Трансмембранный домен

<400> 46

ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg 60

gccttcatca tcttttgggt g 81

<---

1. Химерный антигенный рецептор (CAR) для применения в конструировании клеток, экспрессирующих CAR, для адоптивной терапии CD19+ опухолей, содержащий:

(а) антигенсвязывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27;

(b) трансмембранный домен, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6; и

(c) спейсер, соединяющий антигенсвязывающий домен и трансмембранный домен, где спейсер содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; и

(d) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий:

(i) активирующий цитоплазматический сигнальный домен, содержащий цитоплазматический сигнальный домен цепи CD3-дзета (CD3ζ), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, и

(ii) костимулирующий сигнальный домен, полученный из человеческого CD40, содержащий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 12.

2. Химерный антигенный рецептор по п.1, отличающийся тем, что внутриклеточный сигнальный домен содержит от его N-конца до C-конца по порядку: костимулирующий сигнальный домен, полученный из CD40, и активирующий цитоплазматический сигнальный домен.

3. Химерный антигенный рецептор по п. 1 или 2, где:

(a) антигенсвязывающий домен представлен в SEQ ID NO: 27;

(b) трансмембранный домен представлен в SEQ ID NO: 6;

(c) спейсер представлен в SEQ ID NO: 1; и

(d) внутриклеточный сигнальный домен содержит:

(i) цитоплазматический сигнальный домен цепи CD3-дзета (CD3ζ), представленной в SEQ ID NO: 21, и

(ii) костимулирующий сигнальный домен, полученный из человеческого CD40, представленный в SEQ ID NO: 12.

4. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный антигенный рецептор по любому из пп.1-3.

5. Молекула нуклеиновой кислоты по п.4, дополнительно содержащая сигнальную последовательность.

6. Молекула нуклеиновой кислоты по п.4 или 5, отличающаяся тем, что химерный антигенный рецептор кодируется первым полинуклеотидом, и молекула нуклеиновой кислоты содержит второй полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличный от химерного антигенного рецептора, который необязательно является вторым химерным рецептором.

7. Молекула нуклеиновой кислоты по п.6, отличающаяся тем, что первый и второй полинуклеотиды разделены участком внутренней посадки рибосомы (IRES) или нуклеотидной последовательностью, кодирующей саморасщепляющийся пептид или пептид, который вызывает или стимулирует прыжок рибосомы и который необязательно представляет собой T2A или P2A.

8. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.4-7.

9. Вектор по п.8, отличающийся тем, что вектор представляет собой вирусный вектор.

10. Вектор по п.9, отличающийся тем, что вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.

11. Вектор по п.9 или 10, отличающийся тем, что вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор или гаммаретровирусный вектор.

12. Сконструированная клетка для экспрессии химерного антигенного рецептора по любому из пп. 1-3, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 4-7 или вектор по любому из пп. 8-11.

13. Сконструированная клетка по п.12, которая представляет собой Т-клетку.

14. Сконструированная клетка по п.12 или 13, которая представляет собой CD8+ Т-клетку.

15. Способ получения сконструированной клетки для экспрессии химерного антигенного рецептора по любому из пп. 1-3, причем способ включает введение в клетку молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-7 или вектора по любому из пп.8-11, с получением таким образом сконструированной клетки.

16. Композиция для адоптивной терапии CD19+ опухолей, содержащая эффективное количество сконструированной клетки по любому из пп.12-14, экспрессирующей химерный антигенный рецептор для адоптивной терапии CD19+ опухолей по любому из пп. 1-3, где эффективное количество сконструированной клетки содержит от примерно одного миллиона до примерно 100 миллиардов клеток на 1 килограмм массы тела.

17. Композиция для адоптивной терапии CD19+ опухолей, содержащая:

эффективное количество первой сконструированной клетки, представляющей собой сконструированную CD8+ клетку по п.14 или сконструированную CD8+ клетку, экспрессирующую химерный антигенный рецептор по любому из пп.1-3, для адоптивной терапии CD19+ опухолей;

эффективное количество второй сконструированной клетки, представляющей собой сконструированную CD4+ клетку, содержащую другой антигенный рецептор, который отличается от химерного антигенного рецептора, экспрессированного в сконструированной CD8+ клетке, где химерный антигенный рецептор, экспрессированный в сконструированной CD4+ клетке, содержит костимулирующий сигнальный домен, отличный от такового в химерном антигенном рецепторе, экспрессированном в сконструированных CD8+ клетках, где эффективное количество сконструированной клетки содержит от примерно одного миллиона до примерно 100 миллиардов клеток на 1 килограмм массы тела.

18. Композиция по п.17, отличающаяся тем, что соотношение первой сконструированной клетки и второй сконструированной клетки составляет или составляет примерно 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 или 3:1.

19. Композиция по п.17 или 18, отличающаяся тем, что единственное различие или по существу единственное различие в химерном рецепторе, экспрессированном в CD4+ клетке, по сравнению с CD8+ клеткой, или в аминокислотной последовательности и/или кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты указанных рецепторов представляет собой другой костимулирующий сигнальный домен.

20. Композиция по любому из пп.17-19, отличающаяся тем, что другой костимулирующий сигнальный домен не содержит TRAF-6-индуцирующий домен, способный индуцировать активацию или клеточную локализацию TRAF-6, и/или не содержит домен, способный индуцировать TRAF-6-опосредованную сигнализацию.

21. Композиция по любому из пп.17-20, отличающаяся тем, что другой костимулирующий сигнальный домен представляет собой или содержит домен, рекрутинга PI-3-каназы, способный индуцировать активацию или клеточную локализацию PI-3-киназы и/или способный индуцировать или стимулировать индукцию сигнализации PI3K/Akt.

22. Композиция по любому из пп.17-21, отличающаяся тем, что другой костимулирующий сигнальный домен представляет собой или содержит цитоплазматический сигнальный домен молекулы CD28, 4-1BB или ICOS или представляет собой функциональный вариант его сигнальной части.

23. Композиция по любому из пп.16-22, отличающаяся тем, что при стимулировании стимулирующим агентом или агентами in vitro генетически сконструированные клетки в композиции демонстрируют повышенную способность к пролиферации или к наращиванию по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании тем же стимулирующим агентом или агентами.

24. Композиция по любому из пп.16-23, отличающаяся тем, что при стимулировании в присутствии стимулирующего агента или агентов in vitro генетически сконструированные клетки в композиции демонстрируют повышенное количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании тем же стимулирующим агентом или агентами.

25. Композиция по п.24, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD62L+.

26. Композиция по п. 24 или 25, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти представляют собой Т-клетки центральной памяти (Т_СМ), Т-клетки долговременной памяти или стволовые Т-клетки памяти (T_SCM).

27. Композиция по п.25 или 26, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти дополнительно содержат фенотип, содержащий:

a) CD127+ и/или

b) любой один или более из CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ и CD27+ и любой один или более из t-betlow, IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+.

28. Композиция по любому из пп.25-27, отличающаяся тем, что Т-клетки памяти или подгруппа Т-клеток памяти являются CD8+.

29. Композиция по любому из пп.25-28, отличающаяся тем, что количество Т-клеток памяти или подгруппы Т-клеток памяти, полученных из введенных генетически сконструированных клеток, содержит увеличение или больший процент Т-клеток центральной памяти (T_CM), Т-клеток долговременной памяти или стволовых Т-клеток памяти (T_SCM) по сравнению с эталонной композицией.

30. Композиция по любому из пп.16-29, отличающаяся тем, что при стимулировании стимулирующим агентом или агентами in vitro генетически сконструированные клетки в композиции демонстрируют повышенную жизнестойкость и/или выживаемость по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании тем же стимулирующим агентом или агентами.

31. Композиция по любому из пп.16-30, отличающаяся тем, что при стимулировании стимулирующим агентом или агентами in vitro генетически сконструированные клетки в композиции продуцируют больше IL-2 по сравнению с соответствующей эталонной клеточной композицией при стимулировании тем же стимулирующим агентом или агентами.

32. Композиция по любому из пп.16-31, отличающаяся тем, что стимулирующий агент или агенты содержат антиген, специфичный для связывания химерного рецептора, антитела против CD3/CD28 и/или содержат цитокин IL-2, IL-15 и/или IL-7.

33. Композиция по любому из пп.23-32, отличающаяся тем, что увеличение наблюдается в течение 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней или 14 дней после начала стимулирования.

34. Композиция по любому из пп.23-33, отличающаяся тем, что увеличение наблюдается при соотношении эффектора и мишени, составляющем более чем или более чем примерно или примерно 3:1, более чем или более чем примерно или примерно 5:1 или более чем или более чем примерно или примерно 9:1.

35. Композиция по любому из пп.16-34, отличающаяся тем, что в анализе in vitro после множества раундов антигенспецифичного стимулирования Т-клетки из композиции демонстрируют или наблюдается, что демонстрируют устойчивый или повышенный уровень фактора, показательного для функции, здоровья или активности Т-клеток по сравнению с эталонной композицией, содержащей популяцию Т-клеток, по сравнению с одним раундом стимулирования и/или по сравнению с уровнем в том же анализе при оценке после одного раунда стимулирования и/или нескольких раундов стимулирования, где несколько составляет менее чем множество.

36. Композиция по любому из пп.23-35, отличающаяся тем, что эталонная клеточная композиция содержит генетически сконструированные клетки, которые являются по существу такими же, за исключением того, что экспрессированный химерный рецептор содержит другую костимулирующую молекулу, которая не содержит внутриклеточный сигнальный домен, полученный из CD40.

37. Композиция по п.35 или 36, отличающаяся тем, что уровень фактора не уменьшается по сравнению с эталонной популяцией или уровнем в том же анализе при оценке после одного раунда стимулирования и/или нескольких раундов стимулирования, где несколько составляет менее чем множество.

38. Композиция по любому из пп. 35-37, отличающаяся тем, что множество раундов стимулирования включает по меньшей мере 3, 4 или 5 раундов и/или стимулирование проводят в течение периода, составляющего по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 дней.

39. Способ лечения, включающий введение клетки по любому из пп.12-14 или композиции по любому из пп.16-38 пациенту, имеющему заболевание или патологическое состояние, где заболевание или состояние представляет собой СD19+ опухоль.

40. Способ по п.39, отличающийся тем, что генетически сконструированные клетки или подгруппа генетически сконструированных клеток демонстрируют повышенное или более продолжительное наращивание и/или жизнестойкость у пациента, чем у пациента, которому вводят такое же или примерно такое же количество дозы эталонной клеточной композиции.

41. Способ по п.40, отличающийся тем, что генетически сконструированные клетки или подгруппа генетически сконструированных клеток представляют собой CD8+ Т-клетки.

42. Способ по п.40 или 41, отличающийся тем, что повышенное или более продолжительное наращивание и/или жизнестойкость наблюдается или присутствует в течение месяца, в течение двух месяцев, в течение шести месяцев или в течение одного года после введения клеток.

43. Способ по любому из пп.40-42, отличающийся тем, что эталонная клеточная композиция содержит генетически сконструированные клетки, которые по существу такие же, за исключением того, что экспрессированный химерный рецептор содержит другую костимулирующую молекулу, которая не содержит внутриклеточный сигнальный домен, полученный из CD40.

44. Композиция по любому из пп.16-38 для лечения СD19+ опухоли у пациента, имеющего CD19+ опухоль.

45. Применение композиции по любому из пп.16-38 для лечения CD19+ опухоли у пациента, имеющего CD19+ опухоль.

46. Применение композиции по любому из пп.16-38 для изготовления лекарственного средства для лечения CD19+ опухоли у пациента, имеющего CD19+ опухоль.