Способ изготовления микрофлюидных биочипов

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу изготовления микрорельефа на рабочей поверхности оптически прозрачной базовой пластины и соединения базовой и защитной пластин, обеспечивающему массовое производство биочипов и их функционирование совместно с трансдьюсерами флуоресцентного типа в широком спектральном диапазоне, что достигается путем отливки базовой пластины из предварительно облученного электронами мономера ММА, без введения в него каких-либо инициаторов полимеризации и иных добавок, и соединения (склейки) базовой и защитной пластин посредством того же самого облученного электронами мономера ММА. Предлагаемый способ исключает активное воздействие на поверхность материала, которое приводит к изменению свойств поверхности, а также исключает использование различных химических веществ, вводимых в состав полимера. Такой подход позволяет исключить неконтролируемую иммобилизацию (фиксацию) биологических объектов в каналах биочипа и дополнительное фоновое «свечение» материала биочипа в потоках зондирующего излучения при использовании флуоресцентных методов детектирования. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к области изготовления микрофлюидных биочипов. Наиболее простая и распространенная конструкция микрофлюидного биочипа представляет собой две герметично соединенные пластины: на базовой формируются микроканалы, реакторы, клапаны, электроды и другие функциональные элементы, другая пластина является защитной и обычно представляет собой оптически прозрачную стеклянную пластинку. Существует множество способов формирования микрорельефа на рабочей поверхности базовой пластины, которая может быть выполнена из различных материалов. Выбор материала и технологического маршрута формирования микрорельефа и его параметры в значительной степени определяется теми операциями, которые планируется осуществлять на чипе. Следует иметь в виду, что все технологии, связанные с активным воздействием на поверхность материала, такие как, например, лазерная микрообработка, кислотное травление, ионно-реактивное травление и т.п., приводят к изменению исходных свойств поверхности. Предметом заявляемого изобретения является способ изготовления микрорельефа на рабочей поверхности оптически прозрачной базовой пластины и соединения базовой и защитной пластин, обеспечивающий массовое производство биочипов и их совместное функционирование с трансдьюсерами флуоресцентного типа в широком спектральном диапазоне.

В качестве способа-аналога выбран способ изготовления микрофлюидного биочипа [описанный в статье В. Родченкова, И. Шахнович. Микрофлюидные чипы - конструктор для разработчика // Аналитика №3. 2007 (34). Р. 60-69], в котором материалом оптически прозрачной базовой пластины является стекло.

Способ-аналог изготовления микрофлюидного биочипа содержит следующие операции:

1) формируют на рабочей поверхности заготовки стеклянной базовой пластины известными литографическими способами резистивную маску из резиста, стойкого к воздействию плавиковой кислоты (HF);

2) производят формирование каналов (углублений) на рабочей поверхности стеклянной базовой пластины посредством жидкостного травления стекла на определенную глубину плавиковой кислотой (HF) через резистивную маску;

3) производят удаление остатков резистивной маски;

4) производят взаимную фиксацию посредством клея базовой и защитной пластин.

На фиг. 1 схематично проиллюстрирован способ-аналог изготовления микрорельефа на рабочей поверхности стеклянной базовой пластины 1 биочипа, где на первом этапе на рабочей поверхности формируют резистивную маску 2, через которую на втором этапе производят жидкостное травление стекла на определенную глубину плавиковой кислотой.

Данный способ обеспечивает перенос на поверхность стекла топологии резистивной маски и получение рельефа заданной высоты, однако, имеет ряд недостатков, а именно:

- при жидкостном травлении стекла через резистивную маску неизбежно возникает подтравливание под края резиста, что приводит к невертикальности стенок канала и к увеличению ширины канала в стекле по сравнению с шириной канала в резисте (см. Фиг. 1), а следствие этого (при формировании глубоких каналов особенно) является в том числе непроизводительный расход дорогих особочистых реагентов;

- кислотное травление стекла приводит к закреплению на травленной поверхности химических радикалов, изменяющих ее свойства, а это, в свою очередь, ведет к неконтролируемой иммобилизации (фиксации) биологических объектов в каналах биочипа и к дополнительному фоновому «свечению» материала биочипа в потоках зондирующего излучения при использовании флуоресцентных методов детектирования, что затрудняет анализ слабых полезных сигналов, идущих от исследуемых проб;

- поскольку для формирование рельефа базовой пластины используются процессы фотолитографии и жидкостного травления плавиковой кислотой (HF), то это приводит к относительной дороговизне таких чипов.

Следует иметь в виду, что все вышесказанное об иммобилизации и флуоресценции в потоках зондирующего излучения также может относиться и к клею, которым производят фиксацию защитной и базовой пластин между собой и который имеет частичный контакт с анализируемым жидкостным или газожидкостным потоком, протекающим по каналам биочипа.

В качестве способа-прототипа выбран способ изготовления микрофлюидного биочипа [описанный в статье Пельтек С.Е., Горячковская Т.Н., Попик В.М. и др. Микрофлюидные системы в биологии и конструирование геносенсоров // Российские нанотехнологии. 2008. Т. 3, №9/10, С. 136-145], в котором материалом оптически прозрачной базовой пластины является промышленно выпускаемое листовое органическое стекло, состоящее из полиметилметакрилата (ПММА).

Способ-прототип содержит следующие операции:

1) проводят трафаретную рентгеновскую литографию, облучая рентгеновским излучением рабочую поверхность заготовки базовой пластины, выполненной из листового оргстекла, через рентгеношаблон, содержащий топологический рисунок в виде сети микроканалов;

2) производят последующее проявление заготовки базовой пластинки, в результате чего облученные участки полимера растворяются в проявителе на заданную глубину, образуя микрорельеф нужной конфигурации;

3) производят взаимную фиксацию посредством клея базовой и защитной пластин.

На фиг. 2 схематично проиллюстрирован способ-прототип изготовления микрорельефа на рабочей поверхности оргстеклянной базовой пластины 3 биочипа, где на первом этапе (см. фиг. 2а) проводят трафаретную рентгеновскую литографию, экспонируя рентгеновским излучением 4 через рентгеношаблон 5, содержащий топологический рисунок в виде сети микроканалов, рабочую поверхность заготовки базовой пластины 3, а на следующем этапе производят ее проявление, в результате чего облученные участки полимера растворяются в проявителе на заданную глубину, образуя микрорельеф нужной конфигурации (см. фиг. 2б).

Основными недостатками данного способа являются: 1) необходимость проведения экспонирования рентгеновским излучением каждого изготавливаемого чипа, что является сравнительно дорогой операцией и не позволяет на основе данного способа организовать массовое производство; 2) высокая шероховатость поверхности каналов, обусловленная неоднородностью травления полимера и являющаяся причиной существенного ухудшения условий для ламинарного протекания жидкости по каналам; 3) существенный уровень наличия в промышленно выпускаемом оргстекле различных химических добавок, применяемых, как для его полимеризации, так и для придания ему определенных свойств, а также активное химическое воздействие на поверхность материала проявителя (растворителя). Факторы, изложенные в последнем (третьем) пункте, приводят как к неконтролируемой иммобилизации (фиксации) биологических объектов анализируемых проб, так и к дополнительному фоновому «свечению» оргстекла в потоках зондирующего излучения, что затрудняет детектирование слабых полезных сигналов, исходящих от анализируемых проб при применении таких высокочувствительных методов детектирования, как, например, метод лазер-индуцируемой флуоресценции.

Решением вышеуказанных проблем может быть изменение технологии изготовления базовых пластин биочипов, например, путем их механической формовки или отливки из пластических масс, что не приводит к изменению свойств поверхности каналов биочипа.

Известно, что промышленное производство оргстекла различных марок основано на полимеризации мономера ММА путем его перемешивания с различными химическими веществами, включающими как инициаторы полимеризации (например, перекись бензоила), так и другие добавки, существенно улучшающие определенные итоговые свойства производимого продукта, но при этом также значительно влияющие на его оптические характеристики и приводящие к флуоресцентному свечению, например, при УФ-облучении.

Целью предлагаемого способа изготовления микрофлюидных биочипов является исключение вышеуказанных проблем, связанных как с изменением свойств поверхности каналов при их формировании, так и с наличием различных примесей в составе клея, скрепляющего защитную и базовую пластины биочипа, и в составе органического полимера, из которого изготавливается оптически прозрачная базовая пластина, поскольку это приводит к нежелательным последствиям при работе биочипа в сочетании с трансдьюсерами флуоресцентного типа, а именно: к неконтролируемой иммобилизации и фоновой флуоресценции в видимом и УФ-диапазонах.

Предлагаемая новая технология полимеризации оптически прозрачного оргстекла из жидкого промышленно выпускаемого мономера ММА обеспечивает его полимеризацию без внесения в него каких-либо добавок. Суть данной технологии заключается в том, что в специально изготовленную литьевую форму, дном которой является металлический вкладыш литьевой формы (далее по тексту штамп) или деталь с зафиксированным штампом, заливался промышленно выпускаемый мономер ММА, предварительно облученный электронами. Штамп содержит рельеф в виде негативного отображения рельефа изготавливаемой полимерной реплики (т.е. топология выступов поверхности вкладыша соответствуют топологии микроканалов, реакторов и прочих элементов отливаемой реплики). Затем литьевая форма нагревается до температуры полимеризации и выдерживается определенное время, что приводит к полимеризации ММА. Время выдержки подбирается экспериментально и зависит от температуры процесса полимеризации и от экспозиционной дозы, полученной мономером ММА при его облучении электронами, которая в свою очередь также может варьироваться в достаточно широких пределах.

Полученное таким образом оргстекло существенно отличается по своим оптическим свойствам от известных марок непластифицированного оргстекла, например, марок СО-120 или ТОСН и характеризуется существенно большей прозрачностью в видимом и УФ спектральных диапазонах, что экспериментально подтверждено снятием спектров пропускания на спектрофотометре. Эти характеристики оргстекла позволяют использовать изготовленные из него биочипы в сочетании с трансдьюсерами флуоресцентного типа в существенно более широком спектральном диапазоне.

Поскольку коэффициенты линейного теплового расширения для полимеров, как правило, больше примерно на порядок (~10 раз), чем у металлов, то совместное охлаждение полимерной отливки и металлического штампа от температуры полимеризации до комнатной приводит к напряжениям на границах рельефа полимерной реплики, что может выразиться в необратимых изменениях ее рельефа (в сколах, вероятность которых существенно возрастает при увеличении габаритных размеров полимерной реплики), поэтому конструкция литьевой формы должна позволять проводить операцию разделения штампа и полимерной отливки при температуре полимеризации.

Фиксация защитной пластины к базовой производится посредством нанесения на защитную пластину методом центрифугирования тонкого слоя того же жидкого облученного электронами ММА с последующим созданием условий для его полимеризации непосредственно в прижатом состоянии базовой и защитной пластин. Такой способ приклейки исключает ранее указанные недостатки, связанные с наличием в клее нежелательных примесей, взаимодействующих как с анализируемой пробой, так и с излучением накачки трансдьюсера флуоресцентного типа. Для уменьшения потоков отраженного света и улучшения детектирования слабых полезных сигналов, идущих от анализируемых проб, стеклянная защитная пластина может содержать напыленные слои просветляющего покрытия именно в том спектральном диапазоне, на который ориентирована работа флуоресцентного трансдьюсера.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ИСПОЛНЕНИЯ

На фиг. 3 схематично проиллюстрирован предлагаемый способ изготовления рельефа базовой пластины биочипа. Корпус 6 литьевой формы герметично соединяют со штампом 7 (металлическим вкладышем, содержащим негативное отображение рельефа изготавливаемой полимерной реплики), выполняющим функцию дна данной формы. В литьевую форму наливают определенный объем предварительно облученного электронами, ускоренными до энергии Е=25 МэВ (стимулирующая доза составляет примерно D≈50 кГр ≈ 50 кДж/кг), мономера ММА. Литьевая форма прикрывается крышкой 8 с резиновым уплотнителем (не схеме не показан), устанавливается в фиксатор струбцинного типа и герметизируется, путем прижатия винтом. Затем вся эта сборка устанавливается в тепловой шкаф и выдерживается ~15 часов при температуре Т≈85°С, что приводит к полимеризации ММА. Литьевая форма содержит полость, соединенную с входом 9 для подачи сжатого воздуха. По истечении указанного времени, непосредственно в работающем тепловом шкафу производится выкручивание винта, прижимающего крышку, и подается сжатый воздух в полость литьевой формы между корпусом 6 и штампом 7 через вход 9, что приводит к отделению штампа 7 от отлитой из оргстекла базовой пластины 3.

Затем на стеклянную защитную пластину методом центрифугирования наносят слой толщиной ~10 мкм того же жидкого облученного электронами ММА. После чего к защитной пластине со стороны нанесенного слоя прикладывается изготовленная базовая пластина и они обе в прижатом состоянии с небольшим равномерно распределенным прижимающим грузом размещаются в тепловом шкафу на время ~2÷4 часа для полимеризации нанесенного слоя, герметично скрепляющего защитную и базовую пластины. Схема, приведенная на фиг. 4, иллюстрирует этот процесс: защитная стеклянная пластина 10 с нанесенным слоем облученного ММА (на схеме не показан) размещается внизу, базовая пластина 3 равномерно прижимается к защитной посредством прижимного груза 11 массой около 100 г.

1. Способ изготовления микрофлюидного биочипа, включающий в себя процессы формирования микрорельефа на рабочей поверхности оптически прозрачной базовой пластины и герметичного соединения посредством клея базовой и стеклянной защитной пластин, отличающийся тем, что формирование микрорельефа производится путём отливки базовой пластины в литьевой форме, содержащей металлический штамп с негативным изображением требуемого микрорельефа, из предварительно облученного электронами с энергией Е = 2,5 МэВ мономера метилметакрилата до средней дозы облучения в интервале D = 5 ÷ 50 кДж/кг без введения в него каких-либо инициаторов полимеризации и иных добавок, полимеризация которого производится путем выдержки определенной продолжительности при температуре процесса полимеризации, а герметичное соединение базовой и защитной пластин производится путем нанесения слоя толщиной 10 мкм жидкого такого же облученного мономера метилметакрилата, как и используемого для формирования базовой пластины биочипа, на защитную пластину методом центрифугирования, прижатия рабочей поверхности изготовленной базовой пластины к защитной пластине со стороны нанесенного слоя метилметакрилата и выдержки их в прижатом состоянии 2 ÷ 4 часа при температуре процесса полимеризации.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что литьевая форма сконструирована таким образом, что позволяет производить отделение полимерной отливки от штампа непосредственно при температуре процесса полимеризации по его окончании.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на защитную стеклянную пластину предварительно наносят путем напыления слои просветляющего покрытия именно для того спектрального диапазона, на который ориентирована работа трансдьюсера флуоресцентного типа.