Селективное сульфирование производных бензодиазепина

Изобретение относится к новым способам получения конъюгатов связывающий клетки агент-цитотоксический агент, где цитотоксический агент представляет собой иминсодержащий цитотоксический агент, несущий малеимидную группу. В некоторых вариантах осуществления связывающий клетки агент (СКА) ковалентно связан с цитотоксическим агентом посредством сконструированного Cys, такого как сконструированный Cys в домене CH3 тяжелой цепи, в позиции, соответствующей позиции 442 (или C442) согласно нумерации EU/OU в СКА антитела. Способ получения конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент включает стадии: (a) взаимодействие иминного фрагмента в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном следующей формулой: или его фармацевтически приемлемой солью, с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе при рН от 2,9 до 4,0 с образованием модифицированного цитотоксического агента, содержащего модифицированный иминный фрагмент, представленный следующей формулой: или его фармацевтически приемлемой солью; и (b) взаимодействие модифицированного цитотоксического агента со связывающим клетки агентом с образованием конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, где связывающий клетки агент представляет собой антитело или фрагмент антитела; D представляет собой иминсодержащее бензодиазепиновое соединение; и L является линкером, причем D представлен следующей формулой: или его фармацевтически приемлемой солью, где R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂', R₃' и R₄' все представляют собой Н; R₆ представляют собой -ОМе; X₁' и Y₁' оба представляют собой -Н; А и А' представляют собой -О-; L'' и L''' оба представляют собой Н, L' представлен следующей формулой -NR₅-P₁-C(=O)-(CR_aR_b)_s-C(=O)- (В1'); -NR₅-P₁-C(=O)-Cy-(CR_aR_b)_s1'-C(=O)- (В2'); -C(=O)-P₁-NR₅-(CR_aR_b)_s-C(=O)- (С1'), или -C(=O)-P₁-NR₅-Cy-(CR_aR_b)_s1'-C(=O)- (С2'), где каждый из R_a и R_b в каждом случае независимо представляет собой -Н, (C₁-С₃)алкил или заряженный заместитель или ионизируемую группу Q; s представляет собой целое число от 1 до 6; s1' представляет собой 0 или целое число от 1 до 6; Су представляет собой циклический алкил с 5 или 6 кольцевыми атомами углерода, необязательно замещенный галогеном, -ОН, (С₁-С₃)алкилом, (С₁-С₃)алкокси или галоген(С₁-С₃)алкилом; P₁ представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков; G представляет собой -СН- или -N-; R₅ в каждом случае независимо представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода; L представлен следующей структурной формулой: или его фармацевтически приемлемой солью, где s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой; R₂₃ и R₂₄ в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил; m' представляет собой целое число от 0 до 10; и R^h' представляет собой Н или необязательно замещенный алкил. 2 н. и 70 з.п. ф-лы, 5 ил., 7 табл., 8 пр.

 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по дате подачи в соответствии с 35 U.S.C. § 119(e) по предварительной заявке США № 62/425,761, поданной 23 ноября 2016 г.; полное содержание которой, включая все графические материалы, формулы, описание, формулу изобретения и списки последовательностей, включено в настоящий документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Конъюгаты антитело-цитотоксический агент (или «конъюгаты антитело-лекарственный препарат» (ADC, от англ. «antibody-drug conjugate») и конъюгаты связывающий клетки агент-лекарственный препарат являются высокоэффективным классом противораковых агентов с эффективностью при ряде раковых заболеваний. Конъюгаты связывающий клетки агент-лекарственный препарат (такие как ADC) обычно состоят из трех отдельных элементов: связывающий клетки агент (например, антитело); линкер и цитотоксический фрагмент. Цитотоксический фрагмент может быть ковалентно присоединен к лизинам на антителе, что приводит к получению конъюгатов, которые представляют собой гетерогенные смеси ADC, несущих различное количество лекарственных препаратов, прикрепленных в разных положениях на молекуле антитела, в альтернативном варианте цитотоксический фрагмент может быть ковалентно связан с тиоловыми группами цистеина в антителе посредством тиолреактивной группы, такой как малеимидная группа, с образованием сайт-специфических ADC. Реакции конъюгации между антителами и цитотоксическими агентами часто проводят в воде или водном растворе с небольшим количеством органического растворителя, необходимого для солюбилизации цитотоксических агентов.

Бензодиазепиновые соединения, в том числе трициклические бензодиазепины, такие как пирролобензодиазепины (ПБД), и тетрациклические бензодиазепины, такие как индолинобензодиазепины, использовали в качестве цитотоксических агентов в сочетании с антителами для получения ADC, которые проявляют многообещающую противоопухолевую активность. Эти бензодиазепиновые соединения содержат иминные связи, которые могут связываться с малой бороздкой ДНК и препятствовать функции ДНК, что приводит к гибели клеток. Бензодиазепиновые соединения обычно имеют очень низкую растворимость в воде. Чтобы растворить соединения бензодиазепина в реакции конъюгации с антителами, требуется относительно большое количество органического растворителя, который может дестабилизировать антитела.

Следовательно, существует необходимость в разработке новых способов получения конъюгатов связывающего клетки агента и иминсодержащих бензодиазепиновых лекарственных средств.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для улучшения растворимости в воде иминсодержащие бензодиазепиновые соединения могут быть обработаны иминреактивным реагентом, таким как бисульфитная соль или метабисульфитная соль, до реакции конъюгации с антителами с образованием конъюгатов антитело-бензодиазепин. Сульфирование иминной группы может повысить растворимость в воде бензодиазепиновых соединений, что приводит к улучшению условий для реакций конъюгации с СКА, такими как антитела. Кроме того, нуклеофильные добавления между нуклеофилами и α,β-ненасыщенными карбонилами хорошо известны в синтетической органической химии. Нуклеофильное добавление бисульфита к активированному олефину малеимида является одним из таких примеров этой реакции. Следовательно, когда иминсодержащие бензодиазепиновые соединения несут малеимид, реакционноспособную группу для ковалентного связывания с антителами, как малеимидный фрагмент, так и иминный фрагмент, могут реагировать с бисульфитной солью или солью метабисульфита с образованием сульфированного малеимида и/или сульфированного имина. Неожиданно было обнаружено, что взаимодействие иминсодержащего соединения индолинбензодиазепина, содержащего малеимидную группу, с бисульфитной солью или метабисульфитной солью при низком pH может селективно и эффективно влиять на сульфирование иминной группы без значительного сульфирования малеимидной группы, увеличивая тем самым выход реакции для реакции конъюгации между соединением индолинобензодиазепина и антителами. Кроме того, сульфированное соединение индолинбензодиазепина имеет повышенную растворимость в воде, и в результате в реакции конъюгации с антителами требуется значительно меньшее количество органического растворителя (например, ДМА). Присутствие большого количества органического растворителя в реакции конъюгации может дестабилизировать антитела.

Настоящее изобретение обеспечивает новый способ получения конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, содержащего иминсодержащий цитотоксический агент, несущий малеимидную группу, ковалентно связанную со связывающим клетки агентом (СКА). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, включающему стадии:

(а) взаимодействие иминного фрагмента в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соли с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе при рН от 1,9 до 5,0 с образованием модифицированного цитотоксического агента, содержащего модифицированный иминный фрагмент, представленный следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемую соль; и

(б) взаимодействие модифицированного цитотоксического агента со связывающим клетки агентом с образованием конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент,

где D представляет собой иминсодержащее цитотоксическое соединение; и L является линкером.

В некоторых вариантах осуществления D представляет собой иминсодержащее трициклическое или тетрациклическое бензодиазепиновое соединение.

В некоторых вариантах осуществления D представляет собой иминсодержащие трициклические бензодиазепиновые соединения.

В некоторых вариантах осуществления D представляет собой иминсодержащие тетрациклические бензодиазепиновые соединения.

Используемый здесь термин «иминсодержащее трициклическое бензодиазепиновое соединение» относится к соединению, имеющему моноциклическое кольцо, конденсированное с диазепиновой частью бензодиазепинового ядра. Моноциклическое кольцо может содержать один или более дополнительных гетероатомов, таких как кислород, сера или азот, и заместители, такие как моноциклические кольца или полициклические кольца. Типичные трициклические бензодиазепиновые соединения включают, но не ограничиваются ими, пирролобензодиазепины (ПБД), такие как те, которые описаны в WO 2010/043880, WO 2011/130616, WO 2009/016516, WO 2013/177481 и WO 2012/112708.

Используемый здесь термин иминсодержащее тетрациклическое бензодиазепиновое соединение относится к соединению, имеющему бициклическое кольцо, конденсированное с диазепиновой частью бензодиазепинового ядра. Бициклическое кольцо представляет собой конденсированное бициклическое кольцо, необязательно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, таких как кислород, сера или азот. Типичные тетрациклические бензодиазепиновые соединения включают, но не ограничиваются ими, индолинобензодиазепины (IGN), такие как соединения, описанные в WO/2010/091150 и WO 2012/128868.

В некоторых вариантах осуществления D представляет собой индолинобензодиазепин.

В некоторых вариантах осуществления D представляет собой пирролобензодиазепин (ПБД).

Настоящее изобретение также относится к конъюгатам связывающего клетки агента и цитотоксического агента и модифицированным цитотоксическим агентам, полученным способами, описанными в настоящем документе.

Следует понимать, что любые варианты осуществления, описанные в данном документе, включая варианты осуществления, описанные только в соответствии с одним аспектом изобретения, но не в других аспектах, и включающие в себя варианты осуществления, появляющиеся только в примерах, могут быть объединены с любым одним или более другими вариантами осуществления, если явно не указано об их исключении или неприемлемости.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 показана СЭЖХ-хроматограмма (СЭЖХ - СВЕРХЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ) реакционной смеси иминсодержащего цитотоксического агента D1 с бисульфитом натрия при РН 3,3.

На ФИГ. 2 показана СЭЖХ-хроматограмма реакционной смеси иминсодержащего цитотоксического агента D1 с бисульфитом натрия при pH 4,75.

На ФИГ. 3 показана СЭЖХ-хроматограмма реакционной смеси пбд-иминсодержащего цитотоксического агента талирина с бисульфитом натрия.

На ФИГ. 4А и 4В показаны СЭЖХ-хроматограммы реакционной смеси иминсодержащего цитотоксического агента D5 с 2,0 (ФИГ. 4A) или 2.5 (ФИГ. 4B) эквивалентами бисульфита натрия.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Теперь будет сделана подробная ссылка на некоторые варианты осуществления изобретения, примеры которых проиллюстрированы в прилагаемых структурах и формулах. Хотя изобретение будет описано в связи с перечисленными вариантами осуществления, следует понимать, что они не предназначены для ограничения изобретения этими вариантами осуществления. Наоборот, изобретение предназначено для охвата всех альтернативных вариантов, модификаций и эквивалентов, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения, определяемый формулой изобретения. Специалист в данной области техники примет во внимание множество способов и материалов, подобных или эквивалентных тем, которые описаны здесь, которые могут быть использованы при осуществлении настоящего изобретения.

Следует понимать, что любой из вариантов осуществления, описанный в данном документе, в том числе описанный в различных аспектах изобретения и различных частях описания (включая варианты осуществления, описанные только в примерах), может быть объединен с одним или более другими вариантами осуществления изобретения, если явно не указано о их исключении или неприемлимости. Комбинация вариантов осуществления не ограничена этими конкретными комбинациями, заявленными посредством множества зависимых пунктов формулы изобретения.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

«Алкил» или «линейный или разветвленный алкил» в контексте настоящего описания относится к насыщенному линейному или разветвленному одновалентному углеводородному радикалу. В предпочтительных вариантах осуществления алкил с прямой или разветвленной цепью имеет тридцать или менее атомов углерода (например, C₁-C₃₀ для алкильной группы с прямой цепью и C₃-C₃₀ для разветвленного алкила) и более предпочтительно - двадцать или менее атомов углерода. Еще более предпочтительно, алкил с прямой или разветвленной цепью имеет десять или менее атомов углерода (т.е. C₁-C₁₀ для алкильной группы с прямой цепью и C₃-C₁₀ для алкила с разветвленной цепью). В других вариантах осуществления алкил с прямой или разветвленной цепью имеет шесть или менее атомов углерода (т.е. C₁-C₆ для алкильной группы с прямой цепью или C₃-C₆ для алкила с разветвленной цепью). Примеры алкила включают, но не ограничиваются этим, метил, этил, 1-пропил, 2-пропил, 1-бутил, 2-метил-1-пропил, -CH₂CH(CH₃)₂), 2-бутил, 2-метил-2-пропил, 1-пентил, 2-пентил 3-пентил, 2-метил-2-бутил, 3-метил-2-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-1-бутил, 1-гексил), 2-гексил, 3-гексил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 3-метил-3-пентил, 2-метил-3-пентил, 2,3-диметил-2-бутил, 3,3-диметил-2-бутил, 1-гептил, 1-октил и тому подобное. Кроме того, термин «алкил», используемый в описании, примерах и формуле изобретения, предназначен для включения как «незамещенных алкилов», так и «замещенных алкилов», последний из которых относится к алкильным группам, имеющим заместители, замещающие водород на одном или более атомах углерода углеводородного каркаса. Используемый в настоящем документе термин (C_x-C_xx)алкил или C_x-xx алкил означает линейный или разветвленный алкил, имеющий x-xx атомы углерода.

«Алкенил» или «линейный или разветвленный алкенил» относится к одновалентному углеводородному радикалу с линейной или разветвленной цепью из двух-двадцати атомов углерода, по меньшей мере, с одной ненасыщенной связью, то есть углерод-углеродной двойной связью, где алкенильный радикал включает радикалы, имеющие ориентации «цис» и «транс» или, в альтернативном варианте, ориентации «Е» и «Z». Примеры включают, но не ограничиваются этим, этиленил или винил (-CH=CH₂), аллил (-CH₂CH=CH₂) и тому подобное. Предпочтительно алкенил имеет от двух до десяти атомов углерода. Более предпочтительно, алкил имеет от двух до четырех атомов углерода.

«Алкинил» или «линейный или разветвленный алкинил» относится к линейному или разветвленному одновалентному углеводородному радикалу с двумя-двадцатью атомами углерода, по меньшей мере, с одним центром ненасыщенности, т.е. углерод-углеродной тройной связью. Примеры включают, но не ограничиваются этим, этинил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-пентинил, гексинил и тому подобные. Предпочтительно алкинил имеет от двух до десяти атомов углерода. Более предпочтительно, алкинил имеет от двух до четырех атомов углерода.

Термины «циклический алкил» и «циклоалкил» могут использоваться взаимозаменяемо. В контексте данного документа этот термин относится к радикалу насыщенного карбоциклического кольца. В предпочтительных вариантах осуществления циклоалкилы имеют от 3 до 10 атомов углерода в своей кольцевой структуре и более предпочтительно - от 5 до 7 атомов углерода в кольцевой структуре. В некоторых вариантах осуществления два циклических кольца могут иметь два или более общих атомов, например, кольца представляют собой «конденсированные кольца». Подходящие циклоалкилы включают, но не ограничиваются ими, циклогептил, циклогексил, циклопентил, циклобутил и циклопропил. В некоторых вариантах циклоалкил представляет собой моноциклическую группу. В некоторых вариантах циклоалкил представляет собой бициклическую группу. В некоторых вариантах циклоалкил представляет собой трициклическую группу.

Термин «циклоалкил» относится к алкильной группе, описанной выше, которая замещена циклоалкильной группой.

Термин «циклический алкенил» относится к карбоциклическому кольцевому радикалу, имеющему по меньшей мере одну двойную связь в кольцевой структуре.

Термин «циклический алкенил» относится к карбоциклическому кольцевому радикалу, имеющему по меньшей мере одну тройную связь в кольцевой структуре.

Термин «арил», используемый в данном документе, включает замещенные и незамещенные ароматические группы с одним кольцом, в которых каждый атом кольца представляет собой углерод. Предпочтительно кольцо представляет собой 5-7-членное кольцо, более предпочтительно - 6-членное кольцо. Арильная группа включает, но не ограничивается ими, фенил, фенол, анилин и тому подобное. Термины «арил» также включают «полициклильные», «полициклические» и «полицикличные» кольцевые системы, имеющие два или более колец, в которых два или более атомов являются общими для двух соседних колец, например, кольца являются «конденсированными кольцами», где по меньшей мере одно из колец является ароматическим, например, другие циклические кольца могут быть циклоалкилами, циклоалкенилами, циклоалкинилами или ароматическими кольцами. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления полициклы имеют 2-3 кольца. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления полициклические кольцевые системы имеют два циклических кольца, в которых оба кольца являются ароматическими. Каждое из колец полицикла может быть замещенным или незамещенным. В определенных вариантах осуществления каждое кольцо полицикла содержит от 3 до 10 атомов углерода в кольце, предпочтительно - от 5 до 7. Например, арильные группы включают, но не ограничиваются ими, фенил (бензол), толил, антраценил, флуоренил, инденил, азуленил и нафтил, а также бензо-конденсированные карбоциклические фрагменты, такие как 5,6,7,8-тетрагидронафтил, и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления арил представляет собой ароматическую группу с одним кольцом. В некоторых вариантах осуществления арил представляет собой ароматическую группу с двумя кольцами. В некоторых вариантах осуществления арил представляет собой ароматическую группу с тремя кольцами.

Используемые здесь термины «гетероцикл», «гетероциклил» и «гетероциклическое кольцо» относятся к замещенным или незамещенным неароматическим кольцевым структурам 3-18-членных колец, предпочтительно 3-10-членных колец, более предпочтительно от 3- до 7-членных колец, чьи кольцевые структуры включают, по меньшей мере, один гетероатом, предпочтительно от одного до четырех гетероатомов, более предпочтительно - один или два гетероатома. В определенных вариантах осуществления кольцевая структура может иметь два циклических кольца. В некоторых вариантах осуществления два циклических кольца могут иметь два или более общих атомов, например, кольца представляют собой «конденсированные кольца». Гетероциклильные группы включают, например, пиперидин, пиперазин, пирролидин, морфолин, лактоны, лактамы и тому подобное. Гетероциклы описаны в Paquette, Leo A.; “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W. A. Benjamin, New York, 1968), в частности в главах 1, 3, 4, 6, 7 и 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), в частности, в томах 13, 14, 16, 19 и 28; и J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. Примеры гетероциклических колец включают, но не ограничиваются ими, тетрагидрофуран, дигидрофуран, тетрагидротиен, тетрагидропиран, дигидропиран, тетрагидротиопиран, тиоморфолин, тиоксан, гомопиперазин, азетидин, оксетан, тиетан, гомопиперидин, пиперидин, пиперазин, пирролидин, морфолин, оксепан, тиепан, оксазепин, диазепин, тиазепин, 2-пирролин, 3-пирролин, индолин, 2Н-пиран, 4Н-пиран, диоксан, 1,3-диоксолан, пиразолин, дитиан, дитиолан, дигидропиран, дигидротиен, дигидрофуран, пиразолидинилимидазолин, имидазолидин, 3-азабицикло[3.1.0]гексан, 3-азабицикло[4.1.0]гептан и азабицикло[2.2.2]гексан. Спиро-фрагменты также включены в объем этого определения. Примерами гетероциклической группы, в которой атомы кольца замещены оксо (= O) фрагментами, являются пиримидинон и 1,1-диоксотиоморфолин.

Используемый здесь термин «гетероарил» относится к замещенным или незамещенным ароматическим однокольцевым структурам, предпочтительно 5-7-членным кольцам, более предпочтительно - 5-6-членным кольцам, чьи кольцевые структуры включают в себя по меньшей мере один гетероатом (например, O, N или S), предпочтительно от одного до четырех или от одного до трех гетероатомов, более предпочтительно - один или два гетероатома. Когда два или более гетероатомов присутствуют в гетероарильном кольце, они могут быть одинаковыми или разными. Термин «гетероарил» также включает «полициклильные», «полициклические» и «полицикличные» кольцевые системы, имеющие два или более циклических кольца, в которых два или более кольцевых атома являются общими для двух соседних колец, например, кольца являются «конденсированными кольцами», где, по меньшей мере, одно из колец является гетероароматическим, например, другие циклические кольца могут быть циклоалкилами, циклоалкенилами, циклоалкинилами, арилами, гетероароматическими и/или гетероциклическими. В некоторых предпочтительных вариантах полициклические гетероарилы имеют 2-3 кольца. В некоторых вариантах предпочтительные полициклические гетероарилы имеют два циклических кольца, в которых оба кольца являются ароматическими. В определенных вариантах осуществления каждое кольцо полицикла содержит от 3 до 10 атомов в кольце, предпочтительно - от 5 до 7 атомов в кольце. Например, гетероарильные группы включают, но не ограничиваются ими, пиррол, фуран, тиофен, имидазол, оксазол, тиазол, пиразол, пиридин, пиразин, пиридазин, хинолин, пиримидин, индолизин, индол, индазол, бензимидазол, бензотиазол, бензофуран, бензотиофен, циннолин, фталазин, хиназолин, карбазол, феноксазин, хинолин, пурин и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления гетероарил представляет собой ароматическую группу с одним кольцом. В некоторых вариантах осуществления гетероарил представляет собой ароматическую группу с двумя кольцами. В некоторых вариантах осуществления гетероарил представляет собой ароматическую группу с тремя кольцами.

Гетероциклические или гетероарильные группы могут быть связаны углеродом (углерод-связанные) или азотом (азот-связанные), где это возможно. В качестве примера, но не ограничения, углеродно-связанные гетероциклы или гетероарилы связаны в положении 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина, положении 3, 4, 5 или 6 пиридазина, положении 2, 4, 5 или 6 пиримидина, положении 2, 3, 5 или 6 пиразина, положении 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрагидрофурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола, положении 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола, положении 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола или изотиазола, положении 2 или 3 азиридина, положении 2, 3 или 4 азетидина, положении 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 хинолина или положении 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 изохинолина.

В качестве примера, но не ограничения, связанные с азотом гетероциклы или гетероарилы связаны в положении 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина, 1H-индазола, положении 2 изоиндола или изоиндолина, положении 4 морфолина и положении 9 карбазола или O-карболина.

Гетероатомы, присутствующие в гетероариле или гетероциклиле, включают окисленные формы, такие как NO, SO и SO₂.

Термин «гало» или «галоген» относится к фтору (F), хлору (Cl), брому (Br) или йоду (I).

Используемый здесь термин «галогеналкил» относится к алкилу согласно определению в настоящем документе, который замещен одной или более группами галогена согласно определению в данном документе. Галогеналкил может быть моногалогеналкилом, дигалогеналкилом или полигалогеналкилом. Моногалогеналкил может иметь один заместитель фтора, хлора, брома или йода. Дигалогеналкил или полигалогеналкил могут быть замещены двумя или более одинаковыми атомами галогена или комбинацией различных групп галогена. Примеры галогеналкила включают, но не ограничиваются ими, фторметил, дифторметил, трифторметил, хлорметил, дихлорметил, трихлорметил, пентафторэтил, гептафторпропил, дифторхлорметил, дихлорфторметил, дифторэтил, дифторпропил, дихлорэтил и дихлорпропил.

«Алкокси», используемый в настоящем документе, относится к алкил-O-, где алкил определен в данном документе выше. Примеры алкокси включают, но не ограничиваются этим, метокси, этокси, пропокси, 2-пропокси, бутокси, трет-бутокси, пентилокси, гексилокси и тому подобное.

Алкил, галогеналкил, алкокси, алкенил, алкинил, циклический алкил, циклический алкенил, циклический алкинил, карбоциклил, арил, гетероциклил и гетероарил, описанные выше, могут быть необязательно замещены одним или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или больше) заместителями.

Если специально не указано, что они являются «незамещенными», подразумевается, что ссылки на химические фрагменты в данном описании также включают замещенные варианты. Например, ссылка на «алкильную» группу или фрагмент неявно включает как замещенные, так и незамещенные варианты. Примеры заместителей в химических фрагментах включают, но не ограничиваются ими, галоген, гидроксил, карбонил (такой как карбоксил, алкоксикарбонил, формил или ацил), тиокарбонил (такой как тиоэфир, тиоацетат или тиоформиат), алкоксил, алкилтио, ацилокси, фосфорил, фосфат, фосфонат, амино, амидо, амидин, имин, циано, нитро, азидо, сульфгидрил, алкилтио, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, сульфонил, гетероциклил, аралкил или арил или гетероарильный фрагмент.

«Необязательный» или «необязательно» означает, что описанное после этого обстоятельство может возникать или не возникать, поэтому в заявку включаются случаи, когда это обстоятельство возникает, и случаи, когда этого не происходит. Например, фраза «необязательно замещенный» означает, что неводородный заместитель может присутствовать или не присутствовать на данном атоме, и, таким образом, заявка включает структуры, в которых присутствует неводородный заместитель, и структуры, в которых неводородный заместитель не присутствует.

Термин «замещенный» относится к фрагментам, имеющим заместители, замещающие водород на одном или более атомах углерода, азота, кислорода или серы. Понятно, что «замещение» или «замещенный» включает в себя неявное условие, что такое замещение соответствует допустимой валентности замещенного атома и заместителя, и что замещение приводит к стабильному соединению, например, которое не подвергается самопроизвольной трансформации, такой как перегруппировка, циклизация, элиминация и т.д. Используемый здесь термин «замещенный» предполагает включение всех допустимых заместителей органических соединений. В широком аспекте допустимые заместители включают ациклические и циклические, разветвленные и неразветвленные, карбоциклические и гетероциклические, ароматические и неароматические заместители органических соединений. Допустимые заместители могут являться одним или более и одинаковыми или различными для соответствующих органических соединений. Для целей изобретения гетероатомы, такие как азот, могут иметь водородные заместители и/или любые допустимые заместители органических соединений, описанных здесь, которые удовлетворяют валентности гетероатомов. Заместители могут включать любые заместители, описанные в настоящем документе, например, галоген, гидроксил, карбонил (такой как карбоксил, алкоксикарбонил, формил или ацил), тиокарбонил (такой как тиоэфир, тиоацетат или тиоформиат), алкоксил, алкилтио, ацилокси, фосфорил, фосфат, фосфонат, амино, амидо, амидин, имин, циано, нитро, азидо, сульфгидрил, алкилтио, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, сульфонил, гетероциклил, аралкил или ароматический или гетероароматический фрагмент. Для иллюстрации монофторалкил представляет собой алкил, замещенный фторзаместителем, и дифторалкил представляет собой алкил, замещенный двумя фторзаместителями. Следует понимать, что если в заместителе имеется более одного замещения, каждый неводородный заместитель может быть одинаковым или различным (если не указано иное).

Если углерод заместителя описывается как необязательно замещенный одним или более из списка заместителей, один или более атомов водорода на атоме углерода (если они есть) могут быть отдельно и/или вместе заменены независимо выбранным необязательным заместителем. Если азот заместителя описывается как необязательно замещенный одним или более из списка заместителей, один или более атомов водорода в азоте (в той степени, в которой они присутствуют) могут быть заменены независимо выбранным необязательным заместителем. Один примерный заместитель может быть обозначен как -NR'R'', где R' и R'' вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероциклическое кольцо. Гетероциклическое кольцо, образованное из R' и R'' вместе с атомом азота, к которому они присоединены, может быть частично или полностью насыщенным. В некоторых вариантах осуществления гетероциклическое кольцо состоит из 3-7 атомов. В других вариантах осуществления гетероциклическое кольцо выбрано из группы, состоящей из пирролила, имидазолила, пиразолила, триазолила, тетразолила, изоксазолила, пиридила и тиазолила.

В этом описании термины «заместитель», «радикал» и «группа» используются взаимозаменяемо.

Если группа заместителей в совокупности описывается как необязательно замещенная одним или более из списка заместителей, группа может включать: (1) незамещаемые заместители, (2) замещаемые заместители, которые не замещены необязательными заместителями, и/или (3) замещаемые заместители, которые замещены одним или более необязательными заместителями.

Если заместитель описан как необязательно замещенный неводородными заместителями в количестве до определенного числа, этот заместитель может быть (1) незамещенным; или (2) замещенным неводородными заместителями в количестве вплоть до этого определенного числа или вплоть до максимального числа замещаемых положений на заместителе, в зависимости от того, какое из значений меньше. Таким образом, например, если заместитель описан как гетероарил, необязательно замещенный неводородными заместителями в количестве до 3, то любой гетероарил с менее чем 3 замещаемыми положениями будет необязательно замещен только таким количеством неводородных заместителей, сколько замещаемых позиций имеет гетероарил. Такие заместители в неограничивающих примерах могут быть выбраны из линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, арила, гетероарила, гетероциклила, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR¹⁰⁰, NR¹⁰¹R¹⁰², -NO₂, -NR¹⁰¹COR¹⁰², -SR¹⁰⁰, сульфоксида, представленного -SOR¹⁰¹, сульфона, представленного -SO₂R¹⁰¹, сульфоната -SO₃M, сульфата -OSO₃M, сульфонамида, представленного -SO₂NR¹⁰¹R¹⁰², циано азидо, -COR¹⁰¹, -OCOR¹⁰¹, -OCONR¹⁰¹R¹⁰² и полиэтиленгликолевого звена (-OCH₂CH₂)_nR¹⁰¹, где М представляет собой Н или катион (Na⁺ или K⁺); R¹⁰¹, R¹⁰² и R¹⁰³ каждый независимо выбран из Н, линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена (-OCH₂CH₂)_n-R¹⁰⁴, где n представляет собой целое число от 1 до 24, арила с 6-10 атомами углерода, гетероциклического кольца с 3-10 атомами углерода и гетероарила с 5-10 атомами углерода; и R¹⁰⁴ представляет собой Н или линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода, где алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероарил и гетероциклил в группах, представленных R¹⁰⁰, R¹⁰¹, R¹⁰², R¹⁰³ и R¹⁰⁴, необязательно замещены одним или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более) заместителями, независимо выбранными из галогена, -ОН, -CN, -NO₂ и незамещенного линейного или разветвленного алкила, имеющего от 1 до 4 атомов углерода. Предпочтительно заместители для необязательно замещенного алкила, алкенила, алкинила, циклического алкила, циклического алкенила, циклического алкинила, карбоциклила, арила, гетероциклила и гетероарила, описанных выше, включают галоген, -CN, -NR¹⁰²R¹⁰³, -CF₃, -OR¹⁰¹, арил, гетероарил , гетероциклил, -SR¹⁰¹, -SOR¹⁰¹, -SO₂R¹⁰¹ и -SO₃M.

Число атомов углерода в группе может быть указано в данном документе префиксом «C_x-xx» или «C_x-C_xx», где x и xx являются целыми числами. Например, «C_1-4алкил» или «C1-C4 алкил» представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода.

Термины «соединение» или «цитотоксическое соединение», «цитотоксический димер» и «цитотоксическое димерное соединение» используются взаимозаменяемо. Предполагается, что они включают соединения, для которых структура или формула или любое их производное были описаны в настоящем изобретении, или структура или формула, или любое их производное, которые были включены путем ссылки. Термин также включает стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры, сольваты, метаболиты, соли (например, фармацевтически приемлемые соли) и пролекарства и соли пролекарств соединения всех формул, описанных в настоящем изобретении. Термин также включает любые сольваты, гидраты и полиморфы любого из вышеперечисленного. Специфическое перечисление «стереоизомеров», «геометрических изомеров», «таутомеров», «сольватов», «метаболитов», «соли», «пролекарства», «соли пролекарства», «конъюгатов», «соли конъюгатов», «сольвата», «гидрата» или «полиморфа» в определенных аспектах изобретения, описанных в настоящей заявке, не следует интерпретировать как намеренное упущение этих форм в других аспектах изобретения, где термин «соединение» используется без перечисления этих других форм.

Используемый здесь термин «конъюгат» относится к описанному здесь соединению или его производному, которое связано со связывающим клетки агентом.

Термин «связываемый со связывающим клетки агентом» используемый здесь, относится к соединениям, описанным здесь, или их производным, содержащим, по меньшей мере, одну связывающую группу или ее предшественника, подходящим для связывания этих соединений или их производных со связывающим клетки агентом.

Термин «предшественник» данной группы относится к любой группе, которая может привести к образованию этой группы посредством любого из снятия защиты, химической модификации или реакции сочетания.

Термин «хиральный» относится к молекулам, которые обладают свойством несовпадения при наложении зеркального отображения, в то время как термин «ахиральный» относится к молекулам, которые совпадают при наложении зеркального отображения.

Термин «стереоизомер» относится к соединениям, которые имеют одинаковые химическое строение и связность, но разные ориентации атомов в пространстве, которые не могут взаимопревращаться вращением вокруг одинарных связей.

«Диастереомер» относится к стереоизомеру с двумя или более центрами хиральности, молекулы которого не являются зеркальным отображением друг друга. Диастереомеры имеют разные физические свойства, например, точки плавления, точки кипения, спектральные свойства и реакционную способность. Смеси диастереомеров могут разделяться при аналитических процедурах высокого разрешения, таких как кристаллизация, электрофорез и хроматография.

«Энантиомеры» относятся к двум стереоизомерам соединения, которые не являются совпадающими при наложении зеркальными отображениями друг друга.

Используемые здесь стереохимические определения и условные обозначения, как правило, соответствуют S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel, E. and Wilen, S., “Stereochemistry of Organic Compounds,” John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Соединения изобретения могут содержать асимметричные или хиральные центры и, следовательно, существовать в разных стереоизомерных формах. Предполагается, что все стереоизомерные формы соединений изобретения, включая, но не ограничиваясь ими, диастереомеры, энантиомеры и атропоизомеры, а также их смеси, такие как рацемические смеси, составляют часть настоящего изобретения. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, то есть они способны вращать плоскость плоскополяризованного света. При описании оптически активного соединения префиксы D и L или R и S используются для обозначения абсолютной конфигурации молекулы относительно ее хирального центра(ов). Префиксы d и I или (+) и (-) используются для обозначения знака вращения плоскополяризованного света соединением, где (-) или 1 означает, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для заданной химической структуры эти стереоизомеры идентичны, за исключением того, что они являются зеркальными отображениями друг друга. Конкретный стереоизомер также может называться энантиомером, а смесь таких изомеров часто называется энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров в соотношении 50:50 называется рацемической смесью или рацематом, которые могут возникать в тех случаях, когда в химической реакции или процессе не было стереоселективности или стереоспецифичности. Термины «рацемическая смесь» и «рацемат» относятся к эквимолярной смеси двух энантиомерных видов, лишенной оптической активности.

Термин «таутомер» или «таутомерная форма» относится к структурным изомерам с различными энергиями, которые взаимопревращаемы через низкоэнергетический барьер. Например, протонные таутомеры (также известные как прототропные таутомеры) включают взаимопревращения посредством миграции протона, такие как изомеризация кето-енола и имин-енамина. Валентные таутомеры включают взаимопревращения путем реорганизации некоторых связывающих электронов.

Используемый здесь термин «бензодиазепиновое» соединение представляет собой соединение, имеющее структуру бензодиазепинового ядра. Бензодиазепиновое ядро может быть замещенным или незамещенным и/или конденсированным с одной или более кольцевыми структурами. Он также включает соединение, имеющее два бензодиазепиновых ядра, связанных линкером. Функциональность имина (-C=N-) в составе бензодиазепинового ядра может быть снижена.

Используемый здесь термин «пирролобензодиазепиновое» (ПБД) соединение представляет собой соединение, имеющее структуру ядра пирролобензодиазепина. Пирролобензодиазепин может быть замещенным или незамещенным. Он также включает соединение, имеющее два пирролобензодиазепиновых ядра, связанных линкером. Функциональность имина (-C=N-) в составе индолинобензодиазепинового ядра может быть снижена.

В определенных вариантах осуществления соединение пирролобензодиазепина содержит структуру ядра, представленную , которая может быть необязательно замещенной.

В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепиновые соединения содержат структуру ядра, представленную , которая может быть необязательно замещена.

Используемое здесь соединение «индолинобензодиазепин» (IGN) представляет собой соединение, имеющее структуру ядра индолинбензодиазепина. Индолинобензодиазепин может быть замещенным или незамещенным. Он также включает соединение, имеющее два индолинобензодиазепиновых ядра, связанных линкером. Функциональность имина (-C=N-) в составе индолинобензодиазепинового ядра может быть снижена.

В некоторых вариантах осуществления соединение индолинобензодиазепина содержит структуру ядра, представленную , которая может быть необязательно замещена.

В некоторых вариантах осуществления соединение индолинбензодиазепина содержит структуру ядра, представленную , которая может быть дополнительно замещена.

Используемая здесь фраза «фармацевтически приемлемая соль» относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям соединения изобретения. Типичные соли включают, но не ограничиваются ими, сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, йодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, кислый цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат «мезилат», этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, соли памоата (например, 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтаноат)), соли щелочных металлов (например, натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, магния) и соли аммония. Фармацевтически приемлемая соль может включать включение другой молекулы, такой как ацетат-ион, сукцинат-ион или другой противоион. Противоион может быть любым органическим или неорганическим фрагментом, который стабилизирует заряд исходного соединения. Кроме того, фармацевтически приемлемая соль может иметь более одного заряженного атома в своей структуре. В случаях, когда несколько заряженных атомов являются частью фармацевтически приемлемой соли, может присутствовать несколько противоионов. Следовательно, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или более заряженных атомов и/или один или более противоионов.

Если соединение изобретения представляет собой основание, желаемая фармацевтически приемлемая соль может быть получена любым подходящим способом, доступным в данной области, например обработкой свободного основания неорганической кислотой, такой как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, метансульфоновая кислота, фосфорная кислота и тому подобное, или органической кислотой, такой как уксусная кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, миндальная кислота, фумаровая кислота, малоновая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, гликолевая кислота, салициловая кислота, пиранозидиловая кислота, такая как глюкуроновая кислота или галактуроновая кислота, альфа-гидрокси кислота, такая как лимонная кислота или винная кислота, аминокислота, такая как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, ароматическая кислота, такая как бензойная кислота или коричная кислота, сульфоновая кислота, такая как п-толуолсульфоновая кислота или этансульфоновая кислота, или тому подобное.

Если соединение изобретения представляет собой кислоту, желаемую фармацевтически приемлемую соль можно получить любым подходящим способом, например обработкой свободной кислоты неорганическим или органическим основанием, таким как амин (первичный, вторичный или третичный), гидроксидом щелочного металла или гидроксидом щелочноземельного металла или тому подобное. Иллюстративные примеры подходящих солей включают, но не ограничиваются ими, органические соли, полученные из аминокислот, таких как глицин и аргинин, аммиак, первичные, вторичные и третичные амины, и циклические амины, такие как пиперидин, морфолин и пиперазин, и неорганические соли, полученные из натрия, кальция, калия, магния, марганца, железа, меди, цинка, алюминия и лития.

Используемый здесь термин «сольват» означает соединение, которое дополнительно включает стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя, такого как вода, изопропанол, ацетон, этанол, метанол, ДМСО, этилацетат, уксусная кислота и дихлорметан этаноламин, 2-пропанол или тому подобное, связанное нековалентными межмолекулярными силами. Сольваты или гидраты соединений легко получают добавлением к соединению по меньшей мере одного молярного эквивалента гидроксильного растворителя, такого как метанол, этанол, 1-пропанол, 2-пропанол или вода, чтобы привести к сольватации или гидратации иминной части.

Фраза «фармацевтически приемлемый» указывает на то, что вещество или композиция должны быть химически и/или токсикологически совместимыми с другими ингредиентами, составляющими препарат, и/или млекопитающим, которое ими лечат.

Термин «защитная группа» или «защитный фрагмент» относится к заместителю, который обычно используется для блокирования или защиты конкретной функциональности при взаимодействии других функциональных групп в соединении, его производном или его конъюгате. Например, «аминозащитная группа» или «аминозащитный фрагмент» представляет собой заместитель, присоединенный к аминогруппе, который блокирует или защищает аминофункциональность в соединении. Такие группы хорошо известны в данной области (см., например, P. Wuts and T. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 7, J. Wiley & Sons, NJ) и в качестве примера можно привести карбаматы, такие как метил и этилкарбамат, FMOC, замещенные этилкарбаматы, карбаматы, расщепленные 1,6-β-элиминированием (также называемые «саморасщепляющимися»), мочевины, амиды, пептиды, алкильные и арильные производные. Подходящие аминозащитные группы включают ацетил, трифторацетил, трет-бутоксикарбонил (BOC), бензилоксикарбонил (CBZ) и 9-флуоренилметиленоксикарбонил (Fmoc). Информацию относительно общего описания защитных групп и их использования см. в P. G.M. Wuts & T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2007.

Термин «уходящая группа» относится к группе заряженных или незаряженных фрагментов, которые отходят во время замены или смещения. Такие уходящие группы хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, галогены, сложные эфиры, алкокси, гидроксил, тозилаты, трифлаты, мезилаты, нитрилы, азид, карбамат, дисульфиды, тиоэстеры, тиоэфиры и соединения диазония.

Термин «бифункциональный сшивающий агент», «бифункциональный линкер» или «сшивающие агенты» относится к модифицирующим агентам, которые имеют две реакционноспособные группы; одна из которых способна реагировать со связывающим клетки агентом, в то время как другая реагирует с цитотоксическим соединением, связывая вместе две части. Такие бифункциональные сшиватели хорошо известны в данной области (см., например, Isalm and Dent in Bioconjugation chapter 5, p218-363, Groves Dictionaries Inc. New York, 1999). Например, бифункциональные сшивающие агенты, которые обеспечивают связывание посредством тиоэфирной связи, включают N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) для введения малеимидогрупп или с N-сукцинимидил-4-(йодоацетил)-аминобензоатом (SIAB) для введения йодацетильных групп. Другие бифункциональные сшивающие агенты, которые вводят малеимидные группы или галогенацетильные группы в связывающий клетки агент, хорошо известны в данной области (см. Заявки на патент США 2008/0050310, 20050169933, доступные от Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, USA) и включают, но не ограничиваются ими, бис-малеимидополиэтиленгликоль (BMPEO), BM(PEO)₂, BM(PEO)₃, N-(β-малеимидопропилокси)сукцинимидный эфир (BMPS), γ-N-сукцинимидиловый эфир малеиминомасляной кислоты (GMBS), Nε-гидроксисукцинимидный эфир малеимидокапроновой кислоты (EMCS), 5-малеимидовалериановую кислоту NHS, HBVS, N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат), который является «длинноцепочечным» аналогом SMCC (LC-SMCC), м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидного эфира (MBS), гидразид 4-(4-N-малеимидофенил)-бутировой кислоты или соли HCl (MPBH), N-сукцинимидил-3-(бромацетамидо) пропионат(SBAP), N-сукцинимидилийодоацетат (SIA), Nκ-сукцинимидиловый эфир-малеиминидоундекановой кислоты (KMUA), N-сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)-бутират) (SMPB), сукцинимидил-6-(β-малеимидопропионамидо)гексаноат (SMPH), сукцинимидил-(4-винилсульфонил)бензоат (SVSB), дитиобисмалеимидоэтан (DTME), 1,4-бис-малеимидобутан (BMB), 1,4-бисмалеимидил-2,3-дигидроксибутан (BMDB), бис-малеимидогексан (BMH), бис-малеимидоэтан (BMOE), сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидо-метил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), сульфосукцинимидил (4-йод-ацетил)аминобензоат (сульфо-SIAB), м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидный эфир (сульфо-MBS), N-(γ-малеимидобутилокси)сульфосукцинимидный эфир (сульфо-GMBS), N-(ε-малеимидокапроилокси)сульфосукцинимидный эфир (сульфо-EMCS), N-(κ-малеимидоундеканоилокси)сульфосукцинимида эфир (сульфо-KMUS) и сульфосукцинимидил-4-(п-малеимидофенил) бутират (сульфо-SMPB).

Гетеробифункциональные сшивающие агенты представляют собой бифункциональные сшивающие агенты, имеющие две разные реакционноспособные группы. Гетеробифункциональные сшивающие агенты, содержащие как реакционноспособную по аминогруппе N-гидроксисукцинимидную группу (группу NHS), так и реакционноспособную по карбонилу гидразиновую группу, также можно использовать для связывания описанных здесь цитотоксических соединений со связывающим клетки агентом (например, антителом). Примеры таких коммерчески доступных гетеробифункциональных сшивающих агентов включают сукцинимидил 6-гидразиноникотинамид ацетон гидразон (SANH), сукцинимидил 4-гидразидотерефталат гидрохлорид (SHTH) и сукцинимидил гидразиния никотинат гидрохлорид (SHNH). Конъюгаты, несущие кислотолабильную связь, также могут быть получены с использованием гидразинсодержащего производного бензодиазепина настоящего изобретения. Примеры бифункциональных сшивающих агентов, которые можно использовать, включают сукцинимидил-п-формилбензоат (SFB) и сукцинимидил-п-формилфеноксиацетат (SFPA).

Бифункциональные сшивающие агенты, которые обеспечивают связывание связывающего клетки агента с цитотоксическими соединениями посредством дисульфидных связей, известны в данной области и включают N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентаноат (SPP), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)2-сульфобутаноат (сульфо-SPDB) для введения дитиопиридильных групп. Другие бифункциональные сшивающие агенты, которые можно использовать для введения дисульфидных групп, известны в данной области техники и описаны в патентах США 6913748, 6716821 и патентных публикациях США 20090274713 и 20100129314, которые все включены в настоящий документ посредством ссылки. В альтернативном варианте сшивающие агенты, такие как 2-иминотиолан, гомоцистеинтиолактон или S-ацетилсукциновый ангидрид, которые вводят тиольные группы, также могут быть использованы.

«Линкер», «линкерный фрагмент» или «связывающая группа» согласно определению в данном документе относится к фрагменту, который соединяет две группы, такие как связывающий клетки агент и цитотоксическое соединение, вместе. Как правило, линкер является по существу инертным в условиях, в которых две группы, которые он соединяет, связаны. Бифункциональный сшивающий агент может содержать две реакционноспособные группы, по одной на каждом конце линкерного фрагмента, так что одна реакционноспособная группа может сначала реагировать с цитотоксическим соединением с образованием соединения, содержащего линкерный фрагмент, а вторая реакционноспособная группа затем может реагировать со связывающим клетки агентом. В альтернативном варианте один конец бифункционального сшивающего агента можно сначала приводить в реакцию со связывающим клетки агентом, чтобы получить связывающий клетки агент, содержащий линкерный фрагмент и вторую реакционноспособную группу, которая затем может реагировать с цитотоксическим соединением. Связывающий фрагмент может содержать химическую связь, которая обеспечивает высвобождение цитотоксического фрагмента в конкретном участке. Подходящие химические связи хорошо известны в данной области и включают дисульфидные связи, тиоэфирные связи, кислотолабильные связи, фотолабильные связи, пептидазо-лабильные связи и эстеразо-лабильные связи (см., например, патенты США 5208020; 5475092; 6441163; 6716821; 6913748; 7276497; 7276499, 7368565; 7388026 и 7414073). Предпочтительными являются дисульфидные связи, тиоэфирные и пептидазо-лабильные связи. Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают нерасщепляемые линкеры, такие как подробно описанные в публикации США № 20050169933, или заряженные линкеры или гидрофильные линкеры, описанные в US 2009/0274713, US 2010/01293140 и WO 2009/134976, которые все явным образом включены в данный документ посредством ссылки.

Термин «аминокислота» относится к встречающимся в природе аминокислотам или не встречающимся в природе аминокислотам. В некоторых вариантах осуществления аминокислота представлена NH₂-C(R^aa'R^aa)-C(=O)OH, где каждый из R^aa и R^aa' независимо представляет собой Н, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, арил, гетероарил или гетероциклил, или же R^aa и N-концевой атом азота могут вместе образовывать гетероциклическое кольцо (например, как в пролине). Термин «аминокислотный остаток» относится к соответствующему остатку, когда один атом водорода удален из амино- и/или карбокси-конца аминокислоты, например, как -NH-C(R^aa'R^aa)-C(=O)O-.

Термин «пептид» относится к коротким цепям аминокислотных мономеров, связанных пептидными (амидными) связями. В некоторых вариантах осуществления пептиды содержат от 2 до 20 аминокислотных остатков. В других вариантах осуществления пептиды содержат от 2 до 10 аминокислотных остатков. В еще других вариантах осуществления пептиды содержат от 2 до 5 аминокислотных остатков. В контексте данного документа, когда пептид представляет собой часть цитотоксического агента или линкера, описанного в настоящем документе, представленного конкретной последовательностью аминокислот, пептид может быть связан с остальной частью цитотоксического агента или линкера в обоих направлениях. Например, дипептид X₁-X₂ включает X₁-X₂ и X₂-X₁. Точно так же трипептид X₁-X₂-X₃ включает X₁-X₂-X₃ и X₃-X₂-X₁, а тетрапептид X₁-X₂-X₃-X₄ включает X₁-X₂-X₃-X₄ и X₄-X₂-X₃-X₁. X₁, X₂, X₃ и X₄ представляет собой аминокислотный остаток.

Термин «катион» относится к иону с положительным зарядом. Катион может быть одновалентным (например, Na⁺, K⁺ и т.д.), двухвалентным (например, Ca²⁺, Mg²⁺ и т.д.) или многовалентным (например, Al³⁺ и т.д.). Предпочтительно, катион является одновалентным.

Термин «сконструированное с цистеином антитело» включает антитело по меньшей мере с одним цистеином (Cys), который обычно не присутствует в данном остатке легкой цепи или тяжелой цепи антитела. Такой Cys, который также может называться «сконструированным Cys», можно вводить, например, с помощью стандартной рекомбинантной технологии (например, путем замены кодирующей последовательности для не-Cys остатка в остатке-мишени на кодирующую последовательность для Cys). В определенных вариантах осуществления Cys-сконструированное антитело согласно изобретению имеет сконструированный Cys в тяжелой цепи. В определенных вариантах осуществления сконструированный Cys находится в домене СН₃ тяжелой цепи или вблизи него. В определенных вариантах осуществления сконструированный Cys находится в остатке 442 тяжелой цепи (нумерация EU/OU).

В контексте данного документа все аминокислотные остатки антител, описанные в данном документе, пронумерованы в соответствии с EU-индексом, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed., NIH publication No. 91-3242, 1991 (нумерация EU/OU, все содержание включено в данный документ посредством ссылки). Общие изотипы называются G1, G2, G4 и т.д.

Остаток C442 может быть конъюгирован с цитотоксическим лекарственным препаратом/агентом посредством свободной тиольной группы остатка C442, например, путем взаимодействия с тиолреактивным агентом цитотоксического лекарственного препарата (например, малеимидогруппой).

Используемый здесь термин «водный раствор» относится к раствору, где растворителем является вода или смесь воды и одного или более органических растворителей.

Используемый здесь термин «врачевание» или «лечение» включает изменение, уменьшение или остановку симптомов, клинических признаков и лежащей в основе патологии состояния таким образом, чтобы улучшить или стабилизировать состояние субъекта. В контексте данного документа и как хорошо известно в данной области, «лечение» представляет собой подход для получения благоприятных или желательных результатов, включая клинические результаты. Благоприятные или желательные клинические результаты могут включать, но не ограничиваются ими, уменьшение, улучшение или замедление прогрессирования одного или более симптомов или состояний, связанных с состоянием, например, раком, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или смягчение состояния заболевания и ремиссию (частичную или полную), определяемую или не определяемую. «Лечение» также может означать продление выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью, если лечение не проводится. Примерные благоприятные клинические результаты описаны здесь.

СПОСОБЫ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым способам получения конъюгата связывающего клетки агента и цитотоксического агента, содержащего иминсодержащий цитотоксический агент, несущий малеимидную группу, ковалентно связанную со связывающим клетку агентом (СКА).

В некоторых вариантах осуществления способы получения конъюгата связывающего клетки агента с цитотоксическим агентом согласно настоящему изобретению включают стадии:

(а) взаимодействие иминного фрагмента в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соли с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе при рН от 1,9 до 5,0 с образованием модифицированного цитотоксического агента, содержащего модифицированный иминный фрагмент, представленный следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соль; и

(б) взаимодействие модифицированного цитотоксического агента со связывающим клетки агентом с образованием конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент. В некоторых вариантах осуществления бисульфитная соль представляет собой бисульфит натрия или бисульфит калия. Более конкретно, бисульфитная соль представляет собой бисульфит натрия. В еще других вариантах осуществления метабисульфитная соль представляет собой метабисульфит натрия или метабисульфит калия. Более конкретно, метабисульфитная соль представляет собой метабисульфит натрия.

Настоящее изобретение также относится к способу получения модифицированного цитотоксического агента, включающему стадию взаимодействия иминной части в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соли с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе при рН от 1,9 до 5,0 с образованием модифицированного цитотоксического агента, содержащего модифицированный иминный фрагмент, представленный следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления реакцию можно проводить в условиях реакции, описанных в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-ом, 5-ом, 6-ом или 7-ом аспекте ниже.

В 1-ом аспекте для способа настоящего изобретения, описанного выше, реакцию стадии (а) проводят при рН от 1,9 до 5,0. Более конкретно, pH составляет от 2,5 до 4,9, от 1,9 до 4,8, от 2,0 до 4,8, от 2,5 до 4,5, от 2,9 до 4,5, от 2,9 до 4,0, от 2,9 до 3,7, от 3,1 до 3,5 или от 3,2 до 3,4. В другом конкретном варианте осуществления реакцию стадии (а) проводят при pH 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или 5,0. В еще одном конкретном варианте осуществления реакцию стадии (а) проводят при рН 3,3.

В контексте настоящего документа конкретное значение рН означает конкретное значение ±0,05.

В некоторых вариантах осуществления реакцию стадии (а) проводят в присутствии буферного раствора. Любой подходящий буферный раствор, известный в данной области, может быть использован в способах настоящего изобретения. Подходящие буферные растворы включают, например, но не ограничиваются ими, цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер, фосфатный буфер, глицинсодержащий буфер (например, глицин-HCl-буфер), фталатный буфер (например, буферный раствор, содержащий гидрофталат натрия или калия) и их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления буферный раствор представляет собой сукцинатный буфер. В некоторых вариантах осуществления буферный раствор представляет собой фосфатный буфер. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой цитрат-фосфатный буфер. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой цитрат-фосфатный буфер, содержащий лимонную кислоту и Na₂HPO₄. В других вариантах осуществления буфер представляет собой цитрат-фосфатный буфер, содержащий лимонную кислоту и K₂HPO₄. В некоторых вариантах осуществления концентрация буферного раствора, описанного выше, может находиться в диапазоне от 10 до 250 мМ, от 10 до 200 мМ, от 10 до 150 мМ, от 10 до 100 мМ, от 25 до 100 мМ, от 25 до 75 мМ, от 10 до 50 мм или от 20 до 50 мм.

Во 2-ом аспекте стадию реакции (а) проводят в отсутствие буферного раствора (например, буферов, описанных в 1-ом аспекте). В некоторых вариантах осуществления настоящий способ содержит этапы: (а) взаимодействие иминной части в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном формулой (А), или его фармацевтически приемлемой соли с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе с образованием модифицированного цитотоксического агента, содержащего модифицированный иминный фрагмент, представленный следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемую соль, где водный раствор не содержит буфер; и

(б) взаимодействие модифицированного цитотоксического агента со связывающим клетки агентом с образованием конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент. В некоторых вариантах осуществления реакцию стадии (а) проводят в смеси органического растворителя и воды. Более конкретно, реакцию стадии (а) проводят в смеси диметилацетамида (ДМА) и воды. В некоторых вариантах осуществления смесь ДМА и воды содержит менее 60% ДМА по объему. Более конкретно, объемное соотношение ДМА и воды составляет 1:1.

В третьем аспекте для способов, описанных выше или в 1-ом или 2-ом аспекте, используют 0,5-5,0 эквивалентов бисульфитной соли или 0,25 или 2,5 эквивалента метабисульфитной соли на каждый 1 эквивалент иминсодержащего цитотоксического агента в реакции стадии (а). В некоторых вариантах осуществления от 0,5 до 4,5, от 0,5 до 4,0, от 0,5 до 3,5, от 0,5 до 4,0, от 0,5 до 3,5, от 0,5 до 3,0, от 0,5 до 2,5, от 0,8 до 2,0, от 0,9 до 1,8, от 1,0 до 1,7, от 1,1 до 1,6 или от 1,2 до 1,5 эквивалента соли бисульфита или от 0,25 до 2,25, от 0,25 до 2,0, от 0,25 до 1,75, от 0,25 до 2,0, от 0,25 до 1,75, от 0,25 до 1,5, от 0,25 до 1,25, от 0,4 до 1,0, от 0,45 до 0,9, от 0,5 до 0,85, от 0,55 до 0,8 или от 0,6 до 0,75 эквивалента соли метабисульфита используют на каждый 1 эквивалент иминсодержащего цитотоксического агента. В других вариантах осуществления 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8 , 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 4,0, 4,5 или 5,0 эквивалентов соли бисульфита или 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1,0, 1,05, 1,1, 1,15, 1,2, 1,25, 1,3, 1,35, 1,4, 1,45, 1,5, 1,55, 1,6, 1,65, 1,7, 1,75, 2,0, 2,25 или 2,5 эквивалента соли метабисульфита используют на каждый 1 эквивалент иминсодержащего цитотоксического агента. В еще других вариантах осуществления 1,4 эквивалента бисульфитной соли или 0,7 эквивалента метабисульфитной соли используют на каждый 1 эквивалент иминсодержащего цитотоксического агента. В других вариантах осуществления 1,2 эквивалента бисульфитной соли или 0,6 эквивалента метабисульфитной соли используют на каждый 1 эквивалент иминсодержащего цитотоксического агента.

Используемый здесь конкретный эквивалент означает конкретное значение ± 0,05.

В 4-ом аспекте для способов настоящего изобретения реакцию стадии (а) проводят при рН от 2,9 до 3,7 и от 1,0 до 1,8 эквивалента соли бисульфита или от 0,5 до 0,9 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента. В некоторых вариантах осуществления реакцию стадии (а) проводят при рН от 3,1 до 3,5 и от 1,1 до 1,6 эквивалента соли бисульфита или от 0,55 до 0,8 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента. В других вариантах осуществления реакцию стадии (а) проводят при рН от 3,2 до 3,4 и от 1,3 до 1,5 эквивалента соли бисульфита или от 0,65 до 0,75 эквивалента метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента. В других вариантах осуществления реакцию стадии (а) проводят при рН от 3,3 и 1,4 эквивалента соли бисульфита или 0,7 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента. В еще других вариантах осуществления реакцию стадии (а) проводят при рН от 3,3 и 1,4 эквивалента бисульфита натрия приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

В 5-ом аспекте для способов настоящего изобретения, описанных в данном документе или в 1-ом, 2-ом, 3-ем или 4-ом аспекте, реакцию стадии (а) проводят в смеси органического растворителя и воды. Можно использовать любой подходящий органический растворитель. Типичные органические растворители включают, но не ограничиваются ими, спирты (например, метанол, этанол, пропанол и т.д.), диметилформамид (ДМФА), диметилсульфоксид (ДМСО), ацетонитрил, ацетон, метиленхлорид и т.д. В некоторых вариантах осуществления органический растворитель поддается смешиванию с водой. В других вариантах осуществления органический растворитель не поддается смешиванию с водой, т.е. реакцию стадии (а) проводят в двухфазном растворе. В некоторых вариантах осуществления органический растворитель представляет собой диметилацетамид (ДМА). Органический растворитель (например, ДМА) может присутствовать в количестве 1-99%, 1-95%, 10-80%, 20-70%, 30-70%, 1-60%, 5-60% 10-60%, 20-60%, 30-60%, 40-60%, 45-55%, 10-50% или 20-40% по объему от общего объема воды и органического растворителя. В некоторых вариантах осуществления реакцию стадии (а) проводят в смеси ДМА и воды, где объемное соотношение ДМА и воды составляет 1:1.

В 6-ом аспекте для способов настоящего изобретения, описанных в данном документе или в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-ом или 5-ом аспекте, реакцию стадии (а) можно проводить при любой подходящей температуре. В некоторых вариантах осуществления реакцию проводят при температуре от 0°C до 50°C, от 10°C до 50°C, от 10°C до 40°C или от 10°C до 30°C. В других вариантах осуществления реакцию проводят при температуре от 15°C до 30°C, от 20°C до 30°C, от 15°C до 25°C, от 16°C до 24°C, от 17°C до 23°C, от 18°C до 22°C или от 19°C до 21°C. В еще других вариантах осуществления реакцию можно проводить при 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C или 25°C. В некоторых вариантах осуществления реакцию можно проводить от 0°C до 15°C, от 0°C до 10°C, от 1°C до 10°C, от 5°C до 15°C или от 5°C до 10°C.

В 7-ом аспекте для способов настоящего изобретения, описанных в данном документе или в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-ом, 5-ом или 6-ом аспекте, реакцию стадии (а) проводят от 1 минуты до 48 часов, от 5 минут до 36 часов, от 10 минут до 24 часов, от 30 минут до 24 часов, от 30 минут до 20 часов, от 1 часа до 20 часов, от 1 часа до 15 часов, от 1 часа до 10 часов, от 2 часов до 10 часов, от 3 часов до 9 часов, от 3 часов до 8 часов, от 4 часов до 6 часов или от 1 часа до 4 часов. В некоторых вариантах осуществления реакции дают протекать в течение 4-6 часов. В других вариантах осуществления реакции дают протекать в течение 10 минут, 15 минут, 20 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов и т.д. В других вариантах осуществления реакция может протекать в течение 4 часов. В еще других вариантах осуществления реакции дают протекать в течение 2 часов.

В 8-ом аспекте для способов настоящего изобретения, описанных в данном документе или в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-ом, 5-ом, 6-ом или 7-ом аспекте, реакцию стадии (b) проводят при рН от 4 до 9. В некоторых вариантах осуществления реакцию стадии (b) проводят при рН от 4,5 до 8,5, от 5 до 8,5, от 5 до 8, от 5 до 7,5, от 5 до 7, от 5 до 6,5 или от 5,5 до 6,5. В других вариантах осуществления реакцию стадии (b) проводят при рН 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 или 8,0.

В некоторых вариантах осуществления для способов настоящего изобретения, описанных в настоящем документе или в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-ом, 5-ом, 6-ом, 7-ом или 8-ом аспекте, реакцию стадии (b) проводят в водном растворе, содержащем смесь воды и органического растворителя. Может быть использован любой подходящий органический растворитель, описанный выше. Более конкретно, органическим растворителем является ДМА. В некоторых вариантах осуществления водный раствор содержит менее чем 50%, менее чем 40%, менее чем 30%, менее чем 25%, менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 3%, менее чем 2% или менее чем 1% органического растворителя (например, ДМА) по объему.

В некоторых вариантах осуществления для способов настоящего изобретения, описанных здесь или в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-ом, 5-ом, 6-ом, 7-ом или 8-ом аспекте, модифицированный цитотоксический агент не очищают перед реакцией со связывающим клетки агентом на стадии (б). В альтернативном варианте, модифицированный цитотоксический агент очищают перед реакцией со связывающим клетки агентом на стадии (b). Любые подходящие способы, описанные здесь, могут быть использованы для очистки модифицированного цитотоксического агента. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному цитотоксическому агенту, полученному настоящими способами. Выделенный модифицированный цитотоксический агент может храниться в течение некоторого времени до реакции со связывающим клетки агентом. Предпочтительно, выделенный модифицированный цитотоксический агент хранится в условиях, которые будут предотвращать разложение модифицированного цитотоксического агента, например, в виде очищенного твердого вещества или в виде замороженного раствора, или должен храниться при низкой температуре (например, менее чем 10°С или менее чем 5°С).

В некоторых вариантах осуществления для способов настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, или в любом из вариантов осуществления, описанных выше, конъюгат связывающий клетки агент-цитотоксический агент стадии (b) подвергается стадии очистки. В этом отношении конъюгат связывающий клетки агент-цитотоксический агент может быть очищен от других компонентов смеси с использованием фильтрации в тангенциальном потоке (ФТП), неадсорбционной хроматографии, адсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, селективного осаждения или любого другого подходящего процесса очистки, а также их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат связывающий клетки агент-цитотоксический агент очищают с использованием одной стадии очистки (например, ФТП). Предпочтительно, конъюгат очищают и заменяют на соответствующий состав, используя одну стадию очистки (например, ФТП). В других вариантах осуществления изобретения конъюгат связывающий клетки агент-цитотоксический агент очищают с использованием двух последовательных стадий очистки. Например, конъюгат может быть сначала очищен селективным осаждением, адсорбционной фильтрацией, абсорбционной хроматографией или неабсорбционной хроматографией с последующей очисткой с помощью ФТП. Специалист в данной области поймет, что очистка конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент позволяет выделить стабильный конъюгат, содержащий связывающий клетки агент, химически связанный с цитотоксическим агентом.

Для очистки могут использоваться любые подходящие системы ФТП, включая систему типа Pellicon (Millipore, Billerica, Mass.), кассетную систему Sartocon (Sartorius AG, Edgewood, N.Y.) и систему типа Centrasette (Pall Corp., East Hills, N.Y.)

Любая подходящая адсорбционная хроматографическая смола может быть использована для очистки. Предпочтительные адсорбционные хроматографические смолы включают хроматографию на гидроксиапатите, гидрофобную хроматографию с индуцированием заряда (HCIC), хроматографию с гидрофобным взаимодействием (HIC), ионообменную хроматографию, ионообменную хроматографию в смешанном режиме, аффинную хроматографию с использованием иммобилизованных металлов (IMAC), хроматографию с красителем-лигандом, аффинную хроматографию, хроматографию с обращенной фазой и их комбинации. Примеры подходящих гидроксиапатитовых смол включают керамический гидроксиапатит (CHT типа I и типа II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.), гидроксиапатит HA Ultrogel (Pall Corp., East Hills, N.Y.) и керамический фторапатит (CFT типа I и типа II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Примером подходящей смолы HCIC является смола MEP Hypercel (Pall Corp., East Hills, N.Y.). Примеры подходящих смол HIC включают бутилсефарозу, гексилсефарозу, фенилсефарозу и октилсефарозу (все от GE Healthcare, Piscataway, N.J.), а также макропрепараты метиловых и макропрепараты трет-бутиловых смол (Biorad Laboratories, Hercules, Calif.). Примеры подходящих ионообменных смол включают SP-сефарозу, CM-сефарозу и Q-сефарозу (все от GE Healthcare, Piscataway, N.J.) и смолу Unosphere S (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Примеры подходящих ионообменников смешанного режима включают смолу Bakerbond ABx (JT Baker, Phillipsburg N.J.) Примеры подходящих смол IMAC включают хелатообразующую сефарозную смолу (GE Healthcare, Piscataway, N.J.) и смолу Profinity IMAC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Примеры подходящих смол на основе красителей-лигандов включают смолу Blue Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, N.J.) и смолу Affi-gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Примеры подходящих аффинных смол включают протеин А-сефарозную смолу (например, MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, N.J.), когда связывающий клетки агент, представляет собой антитело, и лектиновые аффинные смолы, например, смолу Lentil Lectin Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, N.J.), когда связывающий клетки агент, несет соответствующие сайты связывания лектина. В альтернативном варианте можно использовать антитело, специфичное к связывающему клетки агенту. Такое антитело может быть иммобилизовано, например, на смоле Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, N.J.). Примеры подходящих смол с обращенной фазой включают смолы C4, C8 и C18 (Grace Vydac, Hesperia, Calif.).

Любая подходящая неадсорбционная хроматографическая смола может быть использована для очистки. Примеры подходящих не адсорбционных хроматографических смол включают, но не ограничиваются ими, SEPHADEX™ G-25, G-50, G-100, SEPHACRYL™ смолы (например, S-200 и S-300), SUPERDEX™ смолы (например, SUPERDEX™ 75 и SUPERDEX™ 200), BIO-GEL® смолы (например, P-6, P-10, P-30, P-60 и P-100), и другие, известные специалистам в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления очищенный конъюгат связывающего клетки агента с цитотоксическим агентом готовят в подходящем препаративном буфере. В некоторых вариантах осуществления буфер для состава содержит бисульфитную соль, такую как бисульфит натрия или бисульфит калия. Более конкретно, буфер для состава содержит бисульфит натрия. В некоторых вариантах осуществления буфер для состава содержит от 5 до 200 мкМ, от 10 до 200 мкМ, от 10 до 150 мкМ, от 20 до 100 мкМ, от 30 до 90 мкМ, от 40 до 80 мкМ, от 50 до 70 мкМ, от 40 до 60 мкМ, от 45 до 55 мкМ или от 55- до 65 мкМ бисульфитной соли (например, бисульфита натрия). В других вариантах осуществления буфер для состава содержит 20, 30, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 70, 80, 90 или 100 мкМ бисульфитной соли (например, бисульфита натрия).

В других вариантах осуществления буфер для состава дополнительно содержит трегалозу. Может быть использовано любое подходящее количество трегалозы. В некоторых вариантах осуществления буфер для состава дополнительно содержит от 2 до 15%, от 5 до 10%, от 6 до 10%, от 7 до 9% или от 6 до 8% трегалозы по массе.

В другом варианте осуществления буфер для состава имеет рН от 4 до 6, от 4 до 5 или от 4 до 4,5. В других вариантах осуществления pH буфера для состава составляет 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или 5,0.

В еще других вариантах осуществления буфер для состава содержит 10 мМ сукцината натрия, 50 мкМ бисульфита натрия, 8% дигидрата трелозы и 0,01% полисорбата 20 при рН 4,2.

В некоторых вариантах осуществления для способов настоящего изобретения, описанных здесь, реакция стадии (а) не приводит к существенному сульфированию малеимидной группы. В некоторых вариантах осуществления менее чем 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% малеимидной группы является сульфированной. Процент сульфирования малеимида равен общему количеству малеимид-сульфированного цитотоксического агента (цитотоксический агент, имеющий сульфирование только на малеимиде) и дисульфированного цитотоксического агента (цитотоксический агент, имеющий сульфирование как на малеимидной, так и на иминной составляющих), деленному на исходное количество иминсодержащего цитотоксического агента перед его реакцией с солью бисульфита или солью метабисульфита.

В 9-ом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, представленного следующей формулой:

;

или его фармацевтически приемлемой соли, включающему стадии:

(а) взаимодействие иминного фрагмента в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соли с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе при рН от 3,1 до 3,5 с образованием модифицированного цитотоксического агента, представленного следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой соль; и

(б) взаимодействие модифицированного цитотоксического агента или его фармацевтически приемлемой соли со связывающим клетки агентом Ab с образованием конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, где:

Ab представляет собой антитело против CD123, содержащее тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26; и

w равен 1 или 2.

В некоторых вариантах осуществления способ по 9-му аспекту осуществляют в условиях реакции, описанных в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-ом, 5-ом, 6-ом, 7-ом или 8-ом аспекте, и в любых вариантах осуществления, описанных в них.

В 10-ом аспекте реакцию стадии (а) в способе 9-го аспекта проводят при рН от 3,2 до 3,4. Более конкретно, pH составляет 3,3.

В некоторых вариантах осуществления реакцию стадии (а) проводят в присутствии буферного раствора. Типичные буферные растворы включают, но не ограничиваются ими, цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер или фосфатный буфер. Более конкретно, буфер представляет собой сукцинатный буфер.

В 11-ом аспекте для реакции стадии (а) в способе 9-го аспекта от 1,1 до 1,6 эквивалента соли бисульфита или от 0,55 до 0,8 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента. Остальные условия реакции являются такими, как описаны выше в 10-ом аспекте и любых вариантах осуществления, описанных в нем. В некоторых вариантах осуществления от 1,3 до 1,5 эквивалента соли бисульфита или от 0,65 до 0,75 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента. Более конкретно, 1,4 эквивалента соли бисульфита или 0,7 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

В 12-ом аспекте реакцию стадии (а) в способе 9-го аспекта проводят при рН от 3,2 до 3,4 и от 1,3 до 1,5 эквивалента соли бисульфита натрия приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента. В некоторых вариантах осуществления реакцию проводят при рН 3,3 и 1,4 эквивалента соли бисульфита натрия приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

В некоторых вариантах осуществления реакцию стадии (а) в способе 9-го, 10-го, 11-го или 12-го аспекта проводят в подходящем растворителе или смеси растворителей. В некоторых вариантах осуществления реакцию стадии (а) проводят в водном растворе, содержащем смесь воды и органического растворителя. Может быть использован любой подходящий органический растворитель, описанный выше. Более конкретно, органическим растворителем является ДМА. В некоторых вариантах осуществления водный раствор содержит менее чем 50%, менее чем 40%, менее чем 30%, менее чем 25%, менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 3%, менее чем 2% или менее чем 1% органического растворителя (например, ДМА) по объему.

В некоторых вариантах осуществления реакцию стадии (а) проводят при подходящей температуре, например, при комнатной температуре или при температуре от 15 до 25°С, в течение достаточного периода времени, такого как 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 20 часов, 24 часа, 48 часов и т.д.

В некоторых вариантах осуществления модифицированный цитотоксический агент, полученный в реакции стадии (а), не очищают перед реакцией со связывающим клетки агентом на стадии (б).

В некоторых вариантах осуществления модифицированный цитотоксический агент, полученный в реакции стадии (а), очищают перед реакцией со связывающим клетки агентом на стадии (б). Любые подходящие способы очистки, описанные здесь, могут быть использованы.

В 13-ом аспекте реакцию стадии (b) в способе 9-го аспекта проводят при рН от 5,5 до 6,5; а остальные условия реакции являются такими, как описаны в 9-ом, 10-ом, 11-ом или 12-ом аспекте. В некоторых вариантах осуществления pH составляет 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 или 6,5. В некоторых вариантах осуществления pH составляет 6,0.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат, полученный способами 9-го, 10-го, 11-го, 12-го или 13-го аспекта, очищают подходящим способом, описанным в настоящем документе. В одном варианте осуществления конъюгат очищают фильтрацией в тангенциальном потоке с получением очищенного конъюгата.

В некоторых вариантах осуществления очищенный конъюгат готовят в буфере для состава, содержащем от 40 до 80 мкМ бисульфита натрия, имеющего рН от 4 до 5. В некоторых вариантах осуществления буфер для состава содержит 50 мкМ бисульфита натрия, имеющего рН 4,2. В некоторых вариантах осуществления буфер для состава содержит 10 мМ сукцината натрия, 50 мкМ бисульфита натрия, 8% дигидрата трегалозы и 0,01% полисорбата 20 при рН 4,2.

В некоторых вариантах осуществления для способов настоящего изобретения, описанных в данном документе (например, 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го, 6-го, 7-го или 8-го аспекта и любых вариантов осуществления, описанных в них), связывающий клетки агент не является антителом против CD123.

В некоторых вариантах осуществления для способов настоящего изобретения, описанных в данном документе (например, 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го, 6-го, 7-го или 8-го аспекта и любых вариантов осуществления, описанных в них), связывающий клетки агент, не является антителом против CD123, содержащим тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающий клетки агент-цитотоксический агент, полученный способами настоящего изобретения, описанными в данном документе (например, 1-й, 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й или 8-й аспект и любые варианты осуществления, описанные в них), не является конъюгатом, представленным следующей структурой:

;

или его фармацевтически приемлемой солью, где Ab представляет собой антитело против CD123, содержащее тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26; и

w равен 1 или 2.

ИМИН-СОДЕРЖАЩИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ И КОНЪЮГАТЫ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

В некоторых вариантах осуществления для способов настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, и

конъюгат связывающий клетки агент-цитотоксический агент представлен следующей формулой:

где D^M представляет собой модифицированный цитотоксический агент, содержащий модифицированный иминный фрагмент, представленный следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемую соль; L является линкером; представляет собой связывающий клетки агент, связанный с цитотоксическим агентом посредством тиольной группы; и w является целым числом от 1 до 10.

В некоторых вариантах осуществления СКА представляет собой антитело, и антитело связано с цитотоксическим агентом посредством одной или более тиоловых групп цистеина. В некоторых вариантах осуществления свободная тиольная группа находится на сконструированном остатке Cys в области СН3 тяжелой цепи антитела, в позиции 442 этой тяжелой цепи (или сокращенно С442) по нумерации EU/OU. Более конкретно, остаток цистеина в положении 442 рекомбинантно вводится в антитело.

В других вариантах осуществления w равен 1 или 2. Более конкретно, w равен 2.

Далее описываются определенные варианты осуществления и конкретные варианты осуществления для способов настоящего изобретения, описанных в данном документе (например, способы 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го, 6-го, 7-го или 8-го аспекта, описанных выше, и варианты осуществления, описанные в них).

В 1-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) D представлен следующей структурной формулой:

или их фармацевтически приемлемой солью, где:

один из L', L'' и L''' представлен следующей формулой:

а два других каждый независимо выбраны из -H, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CH₂CH₂O)_n-R^c, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR, -NR'R'', -NO₂, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SO₂R', -SO₃H, -OSO₃H, -SO₂NR'R'', циано, азидо, -COR', -OCOR' и -OCONR'R';

один из Z₁ и Z₂ представляет собой -C(=O)-, а другой представляет собой -NR₅-;

P₁ представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

R_x1 представляет собой необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;

R^e представляет собой -H, линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k представляет собой -H, линейный, разветвленный циклический алкил, имеющий 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущий вторичную амино- (например, -NHR¹⁰¹) или третичную амино- (-NR¹⁰¹R¹⁰²) группу или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, такой как пиперидин или морфолин, где R¹⁰¹ и R¹⁰² каждый независимо представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;

R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из -H, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

R' и R'' каждый независимо выбран из -H, -OH, -OR, -NHR, -NR₂, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CH₂CH₂O)_n-R^c и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из O, S, N и P;

R^c представляет собой -H или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода;

n представляет собой целое число от 1 до 24;

X₁' выбран из -H, аминозащитной группы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

Y₁' выбран из -H, оксогруппы (т.е. Y₁' вместе с атомом углерода, к которому он присоединен, образует -C(=O)-группу), необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного 6-18-членного арила, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и

серы, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂', R₃' и R₄' каждый независимо выбран из группы, состоящей из -H, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CH₂CH₂O)_n-R^c, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR, -NR'R'', -NO₂, -NCO, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SO₂R', -SO₃^-H, -OSO₃H, -SO₂NR'R'', циано, азидо, -COR', -OCOR' и -OCONR'R'';

R₆ представляет собой -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO₂ или галоген;

G представляет собой -CH- или -N-;

А и A' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -O-, оксо(-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR₅ и -CRR'N(R₅)-; и

R₅ в каждом случае независимо представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода.

В более конкретном варианте осуществления D представлен формулой (IGN1') или (IGN1).

В другом более конкретном варианте осуществления для формул (IGN1')-(IGN4') и (IGN1)-(IGN4) один из L', L” и L'” представлен формулой (A') или (D'), а другие представляют собой -Н, линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, галоген, -ОН, (C₁-C₆)алкокси или -NO₂.

В другом более конкретном варианте осуществления для формул (IGN1')-(IGN4') и (IGN1)-(IGN4) L' представлен формулой (A'); а L” и L'” оба представляют собой -H.

В другом более конкретном варианте осуществления для формул (IGN1')-(IGN4') и (IGN1)-(IGN4) L' представлен формулой (D'); а L” и L'” оба представляют собой -H.

В другом более конкретном варианте осуществления для формул (IGN1')-(IGN4') и (IGN1)-(IGN4) R_x1 представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, необязательно замещенный галогеном, -OH, -SO₃H, (C₁-C₃)алкилом, (C₁-C₃)алкокси, галоген(C₁-C₃)алкилом, или заряженный заместитель или ионизируемую группу Q.

Во 2-ом конкретном аспекте для формул (IGN1')-(IGN4') и (IGN1)-(IGN4) L' представлен следующей формулой:

где:

каждый из R_a и R_b в каждом случае независимо представляет собой -H, (C₁-C₃)алкил или заряженный заместитель или ионизируемую группу Q;

s представляет собой целое число от 1 до 6;

s1' представляет собой 0 или целое число от 1 до 6; и

Cy представляет собой циклический алкил с 5 или 6 кольцевыми атомами углерода, необязательно замещенный галогеном, -OH, (C₁-C₃)алкилом, (C₁-C₃)алкокси или галоген(C₁-C₃)алкилом;

а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 1-ом конкретном аспекте или любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в нем.

В более конкретном варианте осуществления R_a и R_b оба представляют собой Н; Cy в формулах (B2') и (C2') представляет собой циклогексан; и R₅ представляет собой H или Me. Более конкретно, s1' равен 0 или 1.

В 3-ем конкретном аспекте для формул (IGN1')-(IGN4') и (IGN1)-(IGN4) P₁ представляет собой пептид, содержащий от 2 до 10 аминокислотных остатков; а остальные переменные являются такими, как описаны в 1-ом или 2-ом конкретном аспекте или любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них.

В конкретных вариантах осуществления P₁ представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.

В других конкретных вариантах осуществления, P₁ представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe и Gln-Ala. Еще конкретнее, P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

В 4-ом конкретном аспекте для формул (IGN1')-(IGN4') и (IGN1)-(IGN4) X₁' выбран из группы, состоящей из -H, -OH, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, и фенила; Y₁' выбран из группы, состоящей из -H, оксогруппы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода; а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 1-ом, 2-ом или 3-ем конкретном аспекте или в любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них. Более конкретно, X₁' представляет собой -H, -OH, (C₁-C₃)алкил, галоген(C₁-C₃)алкил или фенил; и Y₁' представляет собой -H, оксогруппу, (C₁-C₃) алкил или галоген(C₁-C₃)алкил. В другом более конкретном варианте X₁' представляет собой -H, -OH или -Me; и Y₁' представляет собой -H или оксо. Еще конкретнее, X₁' представляет собой -H; и Y₁' представляет собой -H.

В 5-ом конкретном аспекте для формул (IGN1')-(IGN4') и (IGN1)-(IGN4) A и A' являются одинаковыми или разными и представляют собой -O-, -S-, -NR₅- или оксо-(C=O)-; а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 1-ом, 2-ом, 3-ем или 4-ом конкретном аспекте или в любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них. Более конкретно, A и A' являются одинаковыми или разными и представляют собой -O- или -S-. Более конкретно, A и A' представляют собой -O-.

В 6-ом конкретном аспекте для формул (IGN1')-(IGN4') и (IGN1)-(IGN4) R₆ представляет собой -OR , где R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода; а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-ом или 5-ом конкретном аспекте или любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них. Более конкретно, R₆ представляет собой -OMe.

В 7-ом конкретном аспекте для формул (IGN1)-(IGN4) R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂', R₃'и R₄' каждый независимо представляет собой -H, галоген, -NO₂, -OH, (C₁-C₃)алкил, галоген(C₁-C₃)алкил или (C₁-C₃) алкокси; а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-ом, 5-ом или 6-ом конкретном аспекте или любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них. Более конкретно, R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂', R₃' и R₄' представляют собой -H.

В 8-ом конкретном аспекте для формул (IGN1')-(IGN4') и (IGN1)-(IGN4) R, R', R” и R₅ каждый независимо представляют собой -H или (C₁-C₃)алкил; а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 1-ом, 2-ом, 3-ем, 4-ом, 5-ом, 6-ом или 7-ом конкретном аспекте или любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них.

В 9-ом конкретном аспекте для формул (IGN1')-(IGN4') и (IGN1)-(IGN4):

R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂', R₃' и R₄' все представляют собой -H;

R₆ представляет собой -OMe;

X₁' и Y₁' оба представляют собой -H; и

A и A' представляют собой -O-;

а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 1-ом, 2-ом или 3-ем конкретном аспекте или в любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них. Более конкретно, R, R', R” и R₅ каждый независимо представляет собой -Н или ((C₁-C₃)алкил. Более конкретно, R, R', R” и R₅ представляют собой -H.

В 10-м конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) D представлен следующей структурной формулой:

;

;

;

;

;

;

;

или ее фармацевтически приемлемой солью; а остальные переменные описаны для формулы (A) или (B), описанных выше.

В 11-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) -L- представлен следующей структурной формулой:

где:

s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;

R₂₃ и R₂₄ в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил;

m' представляет собой целое число от 0 до 10; и

R^h' представляет собой Н или необязательно замещенный алкил;

а остальные переменные являются такими, как описаны выше для формулы (A) или формулы (B), или с 1-го по 10-ый конкретный аспект, или в любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них.

В конкретном варианте осуществления m' представляет собой целое число от 1 до 6. Более конкретно, m' представляет собой целое число от 1 до 3.

В другом конкретном варианте осуществления R₂₃ и R₂₄ в каждом случае независимо представляют собой H или (C₁-C₃) алкил. Более конкретно, R₂₃ и R₂₄ оба представляют собой H.

В другом конкретном варианте осуществления R^h' представляет собой H или (C₁-C₃) алкил. В частности, R^h' представляет собой H.

В другом конкретном варианте осуществления R₂₃ и R₂₄ оба представляют собой H; m' представляет собой целое число от 1 до 6. Более конкретно, m' представляет собой целое число от 1 до 3.

В 12-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) -L- представлен следующей структурной формулой:

;

где s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой; а остальные переменные являются такими, как описаны выше для формулы (A) или формулы (B), или с 1-го по 10-ый конкретный аспект, или в любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них.

В 13-м конкретном аспекте иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или их фармацевтически приемлемой солью, а модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или их фармацевтически приемлемой солью. Более конкретно, модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или их натриевой или калиевой солью. Еще более конкретно, модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

.

В некоторых вариантах осуществления иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или их фармацевтически приемлемой солью, а модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или их фармацевтически приемлемой солью. Более конкретно, модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или их натриевой или калиевой солью. Еще более конкретно, модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

.

В 14-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) D представлен следующей структурной формулой:

или их фармацевтически приемлемой солью, где:

X' выбран из группы, состоящей из -H, -OH, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, фенила и аминозащитной группы;

Y' выбран из группы, состоящей из -H, оксогруппы, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода;

А и А' выбраны из -О- и -S-;

W' отсутствует или выбран из -O-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)-, -N(C(=O)R^e)-, -S- или -CH₂-S-, -CH₂NR^e-;

R^x отсутствует или выбран из линейного, разветвленного или циклического алкила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода;

R^e представляет собой -H, линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k представляет собой -H, линейный разветвленный циклический алкил, имеющий 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущий вторичную амино- (например, -NHR¹⁰¹) или третичную амино- (-NR¹⁰¹R¹⁰²) группу или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, где R¹⁰¹ и R¹⁰² каждый независимо представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;

n представляет собой целое число от 1 до 24;

G выбран из -CH- или -N-;

R₆ представляет собой -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO₂ или галоген; и

R представляет собой -H, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или группу ПЭГ -(CH₂CH₂O)_n-R^c, где n представляет собой целое число от 1 до 24, и R^c представляет собой линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода;

R' и R' каждый независимо выбран из -H, -OH, -OR, -NRR^g', -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из O, S, N и P, группы ПЭГ -(CH₂CH₂O)_n-R^c, а R^g' представляет собой -Н, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или группу ПЭГ -(CH₂CH₂O)_n-R^c.

В более конкретном варианте осуществления D представлен формулой (IGN5') или (IGN5), выше, или их фармацевтически приемлемой солью.

В другом конкретном варианте осуществления для формул (IGN5')-(IGN8') и (IGN5)-(IGN8):

X' и Y' оба представляют собой -H;

А и А' оба представляют собой -O-;

R₆ представляет собой -OMe;

W' представляет собой -N(R^e)- или -N(R^e)-C(=O)-;

R^e представляет собой -H, линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k представляет собой -H, линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода;

n представляет собой целое число от 2 до 6; и

R^x представляет собой линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода.

В 15-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) D представлен следующей структурной формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где остальные переменные являются такими, как описаны выше для формулы (A) или (B).

В 16-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) -L- представлен следующей структурной формулой:

где:

s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D, а s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;

E представляет собой -(CR₁₀R₁₁)_q-, циклоалкил или циклоалкилалкил;

Z отсутствует, представляет собой -SO₂NR₉-, -NR₉SO₂-, -C(=O)-NR₉-, -NR₉-C(=O)-, -C(=O)-O-, -O-C(=O)-, -C(=O)-NR₉-(CH₂CH₂O)_p-, -NR₉-C(=O)-(CH₂CH₂O)_p-, -(OCH₂CH₂)_p-C(=O)NR₉- или -(OCH₂CH₂)_p-NR₉-C(=O)-;

p представляет собой целое число от 1 до 24;

Q представляет собой Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;

R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂ и R₁₃ в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил; и

q и r в каждом случае независимо представляют собой целые числа от 0 до 10; а остальные переменные являются такими, как описаны выше для формулы (A) или формулы (B), или в 14-ом или 15-ом конкретном аспекте, или в любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них.

В более конкретном варианте осуществления q и r независимо представляют собой целые числа от 1 до 6, более конкретно от 1 до 3.

В другом более конкретном варианте осуществления R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂ и R₁₃ в каждом случае независимо представляют собой H или C_1-3алкил. Более конкретно, R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂ и R₁₃ все представляют собой -H.

В другом более конкретном варианте осуществления p представляет собой целое число от 2 до 14. Более конкретно, p представляет собой целое число от 2 до 8, от 2 до 6 или от 2 до 4.

В более конкретном варианте осуществления E представляет собой -(CR₁₀R₁₁)_q-; а остальные переменные в формуле (L2) являются такими, как описаны выше в 16-ом конкретном аспекте.

В другом более конкретном варианте осуществления Е представляет собой ; а остальные переменные в формуле (L2) являются такими, как описаны выше в 16-ом конкретном аспекте.

В еще одном конкретном варианте осуществления Z представляет собой -C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O)-; а остальные переменные в формуле (L2) являются такими, как описаны выше в 16-ом конкретном аспекте или любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных выше. Более конкретно, R₉ представляет собой H или Me. В альтернативном варианте R₉ представляет собой H.

В еще одном более конкретном варианте осуществления Q представляет собой i) H; ii) -SO₃H, -Z'-SO₃H, -OPO₃H₂, -Z'-OPO₃H₂, -PO₃H₂, -Z'-PO₃H₂, -CO₂H, -Z'-CO₂H, -NR₁₄R₁₅ или -Z'-NR₁₄R₁₅, или его фармацевтически приемлемую соль; или iii) -N⁺R₁₄R₁₅R₁₆X^- или -Z'-N⁺R₁₄R₁₅R₁₆X^-; Z' представляет собой необязательно замещенный алкилен, необязательно замещенный циклоалкилен или необязательно замещенный фенилен; каждый из R₁₄-R₁₆ независимо представляет собой необязательно замещенный алкил; и X^- представляет собой фармацевтически приемлемый анион; а остальные переменные в формуле (L2) являются такими, как описаны выше в 16-ом конкретном варианте осуществления или любых более конкретных вариантах осуществления, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления Z' представляет собой необязательно замещенный алкилен. В еще других вариантах осуществления Z' представляет собой алкилен (например, -CH₂); а каждый из R₁₄-R₁₆ независимо представляет собой C_1-4алкил.

В еще одном конкретном варианте осуществления Q представляет собой H, или -SO₃H, или фармацевтически приемлемый катион (например, натриевую или калиевую соль); а остальные переменные в формуле (L2) являются такими, как описаны выше в 16-ом конкретном аспекте или любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных выше.

В другом более конкретном варианте осуществления для формулы (L2):

каждый из R₁₂ и R₁₃, в каждом случае независимо представляет собой H или (C₁-C₃)алкил;

Q представляет собой H или -SO₃H или его фармацевтически приемлемую соль;

Z представляет собой -C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O)-;

R₉ представляет собой H или (C₁-C₃)алкил;

E представляет собой -(CR₁₀R₁₁)_q-.

R₁₀ и R₁₁, в каждом случае независимо представляют собой Н или (C₁-C₃) алкил; и

q и r представляют собой целые числа от 1 до 5.

В 17-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) -L- представлен любой одной из следующих структурных формул:

или ее фармацевтически приемлемой солью (например, натриевой или калиевой солью), где s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D, а s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;

q и r каждый независимо представляют собой целое число от 1 до 6; а остальные переменные являются такими, как описаны выше для формулы (A) или формулы (B), или в 14-ом или 15-ом конкретном аспекте, или в любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них. Более конкретно, каждый из q и r независимо представляет собой целое число от 1 до 3.

В 18-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) -L- представлен любой одной из следующих структурных формул:

, и

,

или ее фармацевтически приемлемой солью (например, натриевой или калиевой солью), где s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D, а s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;

а остальные переменные являются такими, как описаны выше для формулы (A) или формулы (B), или в 14-ом или 15-ом конкретном аспекте, или в любых конкретных или более конкретных вариантах осуществления, описанных в них.

В 19-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) -L- представлен следующей структурной формулой:

где:

s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;

R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил;

m и n каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10;

R^h представляет собой Н или необязательно замещенный алкил;

P_L представляет собой необязательно замещенный алкилен, -(CH₂-CH₂-O)_j- (где атом кислорода связан с -(C=O)-группой, связанной с P), аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков; и

j представляет собой целое число от 1 до 24; а остальные переменные являются такими, как описаны выше для формулы (A) или формулы (B), или 14-го или 15-го конкретного аспекта, или любых конкретных или более конкретных вариантов осуществления, описанных в них.

В 20-ом конкретном аспекте для формулы (L3), R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ каждый представляет собой H или (C₁-C₃)алкил; m и n каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 6; а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 19-ом конкретном варианте осуществления или любом конкретном или более конкретном варианте осуществления, описанном в нем. Более конкретно, R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ все представляют собой H. Еще более конкретно, R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ все представляют собой H; а m и n каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 3.

В 21-ом конкретном аспекте для формулы (L3) P_L представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 10 аминокислотных остатков; а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 19-ом или 20-ом конкретном аспекте или любом конкретном или более конкретном варианте осуществления, описанном в них. Более конкретно, P_L представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах осуществления каждый аминокислотный остаток представляет собой остаток аминокислоты, независимо выбранной из: встречающейся в природе аминокислоты, синтетической аминокислоты, аналога аминокислоты и миметика аминокислоты, который функционирует аналогично встречающейся в природе аминокислоте.

В других вариантах осуществления каждый аминокислотный остаток представляет собой остаток аминокислоты, независимо выбранной из группы, состоящей из: гистидина, аланина, изолейцина, аргинина, лейцина, аспарагина, лизина, аспарагиновой кислоты, метионина, цистеина, фенилаланина, глутаминовой кислоты, треонина, глутамина, триптофана, глицина, валина, пролина, серина, тирозина, N-метил-гистидина, N-метил-аланина, N-метил-изолейцина, N-метил-аргинина, N-метил-лейцина, N-метил-аспарагина, N-метил-лизина, N-метил-аспарагиновой кислоты, N-метил-метионина, N-метил-цистеина, N-метил-фенилаланина, N-метил-глутаминовой кислоты, N-метил-треонина, N-метил-глутамина, N-метил-триптофана, N-метил-глицина, N-метил-валина, N-метил-пролина, N-метил-серина, N-метил-тирозина, гидроксипролина, γ-карбоксиглутамата, селиноцистеина, O-фосфосерина, гомосерина, норлейцина, метионинсульфоксида, метионин метилсульфония, цитруллина, орнитина, цистеинсульфокислоты, цистеинсульфокислоты, 3-аминоаланина, 3-диметиламиноаланина, 2-амино-4-(диметиламино)бутановой кислоты, 2,4-диаминобутановой кислоты, 2-амино-6-(диметиламино)гексановой кислоты, 2-амино-5-(диметиламины)пентановой кислоты и β-аланина, каждый независимо в качестве L или D изомера. Более конкретно, каждый аминокислотный остаток представляет собой остаток из независимо выбранного глицина или аланина.

В других вариантах осуществления P_L представляет собой пептид, расщепляемый протеазой. Более конкретно, P_L представляет собой пептид, расщепляемый протеазой, экспрессируемой в опухолевой ткани. В альтернативном варианте P_L представляет собой пептид, расщепляемый лизосомальной протеазой.

В еще других вариантах осуществления P_L выбран из группы, состоящей из: Ala-Val, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala., Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe, Gln-Ala, Gly-Gly-Gly, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Val-Cit, Ala-Val-Ala и β-Ala-Gly-Gly-Gly. Более конкретно, P_L представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Val-Ala или β-Ala-Gly-Gly-Gly.

В 22-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) -L- представлен следующей структурной формулой:

,

или ее фармацевтически приемлемой солью, где s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой; а остальные переменные являются такими, как описаны выше для формулы (A) или формулы (B), или в 14-ом или 15-ом конкретном аспекте.

В 23-ем конкретном аспекте иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

; или

,

или их фармацевтически приемлемой солью, а модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или их фармацевтически приемлемой солью.

В более конкретном варианте осуществления модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или их натриевой или калиевой солью. Еще более конкретно, модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

В некоторых вариантах осуществления иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или их фармацевтически приемлемой солью, а модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

; или

,

или их фармацевтически приемлемой солью.

В 24-ом конкретном аспекте конъюгат, который может быть получен способами настоящего изобретения, представлен следующей структурной формулой:

;

;

;

;

;

;

;

;

;

;

;

;

;

;

;

;

;

;

; или

,

или ее фармацевтически приемлемой солью (например, натриевой или калиевой солью).

В одном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) D представляет собой иминсодержащее соединение ПБД.

В 25-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) D представлен следующей формулой:

(ПБД1');

(ПБД1);

(ПБД2');

(ПБД2);

(ПБД3');

(ПБД3);

(ПБД4'); или

(ПБД4),

или их фармацевтически приемлемой солью, где:

W выбран из C=O, C=S, CH₂, BH, SO и SO₂;

X₁' выбран из -H, аминозащитной группы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

Y₁' выбран из -H, оксогруппы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного 6-18-членного арила, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов;

R₆ представляет собой -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO₂ или галоген;

А и A' являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из -O-, оксо (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR₅ и -CRR'N(R₅)-,

R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из -H, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CH₂CH₂O)_n-R^c, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

R' и R'' каждый независимо выбран из -H, -OH, -OR, -NHR, -NR₂, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CH₂CH₂O)_n-R^c и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из O, S, N и P;

R^c представляет собой -H или замещенный или незамещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода, или связующую группу с реакционноспособной группой, связанной с ней;

n представляет собой целое число от 1 до 24;

R₅ в каждом случае независимо представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;

D₀ и D₀' являются одинаковыми или разными и независимо отсутствуют или выбраны из группы, состоящей из необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, аминокислоты, пептида, содержащего от 2 до 6 аминокислот, и полиэтиленгликолевого звена (-OCH₂CH₂)_n-;

L отсутствует, представляет собой линкер, полиэтиленгликолевое звено (-OCH₂CH₂)_n-, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенную фенильную группу, необязательно замещенное 3-18-членное гетероциклическое кольцо или 5-18-членное гетероарильное кольцо, имеющее от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;

R_a, R_a', R_b и R_b' являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из группы, состоящей из -H, галогенида или необязательно замещенного разветвленного, линейного или циклического алкила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода; или R_a и R_a' и/или R_b и R_b' вместе образуют двойную связь, содержащую группу =B и =B' соответственно;

=B и =B' являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из необязательно замещенной разветвленной или линейной алкенильной или карбонильной группы;

Q представляет собой Q₁-Ar-Q₂;

Q' представляет собой Q₁'-Ar'-Q₂';

Q₁ и Q₁' каждый независимо отсутствует, представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил с 1-6 атомами углерода или -CH=CH звено;

Ar и Ar' каждый независимо отсутствует или представляют арильную группу;

Q₂ и Q₂' каждый независимо выбран из -H, линкера, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -R^c'-(OCH₂CH₂)_n-R^c или заместителя, выбранного из галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -R, -OR, -NR'R'', -NO₂, -NCO, -NR'COR'', NR'(C=O)OR'' -SR, сульфоксида, представленного -SOR', сульфона, представленного -SO₂R', сульфоната -SO₃M, сульфата -OSO₃M, сульфонамида, представленного SO₂NR'R'', циано, азидо, -COR', -OCOR' или -OCONR'R''; и

R^c' отсутствует или выбран из линейного или разветвленного алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 5 атомов углерода.

В 26-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) D выбран из одного из следующих:

(ПБД5')

(ПБД5),

(ПБД6'),

(ПБД6),

(ПБД7'),

(ПБД7),

(ПБД8'),

(ПБД8),

(ПБД9'),

(ПБД9),

(ПБД10') и

(ПБД10),

или их фармацевтически приемлемой солью, где:

один из L', L'' и L''' в формуле (ПБД5'), (ПБД6'), (ПБД7'), (ПБД8'), (ПБД5), (ПБД6), (ПБД7) или (ПБД8) представлен следующей формулой:

а два других каждый независимо выбраны из -H, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CH₂CH₂O)_n-R^c, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR, -NR'R'', -NO₂, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SO₂R', -SO₃H, -OSO₃H, -SO₂NR'R'', циано, азидо, -COR', -OCOR' и -OCONR'R';

один из Q₂ и Q₂' в формуле (ПБД9'), (ПБД10'), (ПБД9) или (ПБД10) представлен следующей формулой:

а другой выбран из -H, -R, -OR, -NR'R '', -NO2, -NR '(C = O) OR'', -SR или -NO₂;

один из Z₁ и Z₂ представляет собой -C(=O)-, а другой представляет собой -NR₅-;

P₁ представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

R_x1 представляет собой необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;

R^e представляет собой -H, линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k представляет собой -H, линейный разветвленный циклический алкил, имеющий 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущий вторичную амино- (например, -NHR¹⁰¹) или третичную амино- (-NR¹⁰¹R¹⁰²) группу или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, где R¹⁰¹ и R¹⁰² каждый независимо представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;

R^c представляет собой -H или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода;

R₅ в каждом случае независимо представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода.

R_a'' и R_b'' являются одинаковыми или разными и выбраны из -H и -Me; и

n' выбран из 0, 1, 2 и 3; а остальные переменные такие, как описаны в 25-ом конкретном аспекте.

В 27-ом конкретном аспекте один из L', L” и L”' в формуле (ПБД5'), (ПБД6'), (ПБД7'), (ПБД8'), (ПБД5), (ПБД6), (ПБД7) или (ПБД8) представлен формулой (A') или (D'), а два других представляют собой -H, линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, галоген, -OH, (C₁-C₆)алкокси или -NO₂; или один из Q₂ и Q₂' в формуле (ПБД9'), (ПБД10'), (ПБД9) или (ПБД10) представлен формулой (A'), (D') или (E'); а другой представляет собой -H, линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, галоген, -OH, (C₁-C₆)алкокси или -NO₂; а остальные переменные такие, как описаны в 26-ом конкретном аспекте.

В 28-ом конкретном аспекте L” и L”' оба представляют собой -H; и L' в формуле (ПБД5'), (ПБД6'), (ПБД7'), (ПБД8'), (ПБД5), (ПБД6), (ПБД7) или (ПБД8) представлен следующей формулой:

один из Q₂ и Q₂' в формуле (ПБД9'), (ПБД10'), (ПБД9) или (ПБД10) представлен следующей формулой:

где:

каждый из R_a и R_b в каждом случае независимо представляет собой -H, (C₁-C₃)алкил или заряженный заместитель или ионизируемую группу Q;

s представляет собой целое число от 1 до 6;

s1' представляет собой 0 или целое число от 1 до 6; и

Cy представляет собой циклический алкил с 5 или 6 кольцевыми атомами углерода, необязательно замещенный галогеном, -OH, (C₁-C₃)алкилом, (C₁-C₃)алкокси или галогено(C₁-C₃)алкилом; а остальные переменные такие, как описаны в 27-ом конкретном аспекте. В некоторых вариантах осуществления R_a и R_b оба представляют собой H; Cy в формулах (B2') и (C2') представляет собой циклогексан; R₅ представляет собой H или Me; и s1 'представляет собой 0 или 1.

В 29-ом конкретном аспекте P₁ представляет собой пептид, содержащий от 2 до 10 аминокислотных остатков; а остальные переменные такие, как описаны в 28-ом конкретном аспекте. В некоторых вариантах осуществления P₁ представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления P₁ представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe и Gln-Ala. В некоторых вариантах осуществления P₁ представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

В 30-ом конкретном аспекте для способов, описанных в любом из 25-го, 26-го, 27-го, 28-го или 29-го конкретного аспекта и описанных в них вариантов осуществления, R₆ представляет собой -OMe; X₁' и Y₁' оба представляют собой -H; и A и A' представляют собой -O-.

В 31-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) D представлен следующей структурной формулой:

;

;

;

;

; или

,

или их фармацевтически приемлемой солью.

В 32-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) -L- представлен следующей структурной формулой:

,

или их фармацевтически приемлемой солью, где:

s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;

R₂₃ и R₂₄ в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил;

m' представляет собой целое число от 0 до 10; и

R^h' представляет собой Н или необязательно замещенный алкил; а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 25-ом, 26-ом, 27-ом, 28-ом, 29-ом, 30-ом, 31-ом или 32-ом конкретном аспекте.

В некоторых вариантах осуществления R₂₃ и R₂₄ оба представляют собой Н; и m' представляет собой целое число от 1 до 6.

В некоторых вариантах осуществления R^h' представляет собой H.

В некоторых вариантах осуществления L представлен следующей структурной формулой:

.

В 34-ом конкретном аспекте иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или их фармацевтически приемлемой солью.

В некоторых вариантах осуществления иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью; модифицированный иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью; а конъюгат представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью.

В 35-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) D представлен следующей формулой:

(ПБД11'),

(ПБД11),

(ПБД12'),

(ПБД12),

(ПБД13'),

(ПБД13),

(ПБД14'),

(ПБД14),

(ПБД15'),

(ПБД15),

(ПБД16') и

(ПБД16),

или их фармацевтически приемлемой солью, где:

X₁' выбран из группы, состоящей из -H, -OH, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, фенила и защитной группы амина;

Y₁' выбран из группы, состоящей из -H, оксогруппы, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода;

один из Q₂ и Q₂' в формуле (ПБД15) или (ПБД16) представляет собой -W'-R^x-S-; а другой выбран из -H, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CH₂CH₂O)_n-R^c, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH₂], -OR, -NR'R'', -NO₂, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SO₂R', -SO₃H, -OSO₃H, -SO₂NR'R'', циано, азидо, -COR', -OCOR' и -OCONR'R'';

W' отсутствует или выбран из -O-, -N(R^e)-, -N(R^e)-C(=O)-, -N(C(=O)R^e)-, -S- или -CH₂-S-, -CH₂NR^e-;

R^x отсутствует или выбран из линейного, разветвленного или циклического алкила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода;

R^e представляет собой -H, линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k представляет собой -H, линейный разветвленный циклический алкил, имеющий 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущий вторичную амино- (например, -NHR¹⁰¹) или третичную амино- (-NR¹⁰¹R¹⁰²) группу или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, где R¹⁰¹ и R¹⁰² каждый независимо представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;

n представляет собой целое число от 1 до 24;

R₆ представляет собой -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO₂ или галоген; и

R представляет собой -H, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или группу ПЭГ -(CH₂CH₂O)_n-R^c, где n представляет собой целое число от 1 до 24, и R^c представляет собой линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода;

R' и R” каждый независимо выбран из -H, -OH, -OR, -NRR^g', -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из O, S, N и P, группы ПЭГ -(CH₂CH₂O)_n-R^c, а R^g' представляет собой -Н, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или группу ПЭГ -(CH₂CH₂O)_n-R^c.

В 36-ом конкретном аспекте, для формулы (ПБД11'), (ПБД12'), (ПБД13'), (ПБД14'), (ПБД15'), (ПБД16'), (ПБД11), (ПБД12), (ПБД13), (ПБД14), (ПБД15) или (ПБД16) X₁' и Y₁' оба представляют собой -H;

R₆ представляет собой -OMe;

W' представляет собой -N(R^e)- или -N(R^e)-C(=O)-;

R^e представляет собой -H, линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода или -(CH₂-CH₂-O)_n-R^k, где R^k представляет собой -H, линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода;

n представляет собой целое число от 2 до 6; и

R^x представляет собой линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода; а остальные переменные соответствуют описанным в 35-ом конкретном аспекте.

В 37-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) L представлен следующей структурной формулой:

,

или их фармацевтически приемлемой солью, где:

s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D, а s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;

E представляет собой -(CR₁₀R₁₁)_q-, циклоалкил или циклоалкилалкил;

Z отсутствует, представляет собой -SO₂NR₉-, -NR₉SO₂-, -C(=O)-NR₉-, -NR₉-C(=O)-, -C(=O)-O-, -O-C(=O)-, -C(=O)-NR₉-(CH₂CH₂O)_p-, -NR₉-C(=O)-(CH₂CH₂O)_p-, -(OCH₂CH₂)_p-C(=O)NR₉- или -(OCH₂CH₂)_p-NR₉-C(=O)-;

p представляет собой целое число от 1 до 24;

Q представляет собой Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;

R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂ и R₁₃ в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил; и

q и r в каждом случае независимо представляют собой целые числа от 0 до 10; а остальные переменные такие, как описаны в 35-ом или 36-ом конкретном аспекте.

В некоторых вариантах осуществления E представляет собой -(CR₁₀R₁₁)_q-. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой -C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O)-. В некоторых вариантах осуществления R₉ представляет собой -H. В некоторых вариантах осуществления R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂ и R₁₃ представляют собой Н; а q и r каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 6.

В некоторых вариантах осуществления для -L-, описанного в 37-ом конкретном аспекте:

R₁₂ и R₁₃ в каждом случае независимо представляет собой H или (C₁-C₃)алкил;

Q представляет собой H или -SO₃H или его фармацевтически приемлемую соль

Z представляет собой -C(=O)-NR₉- или -NR₉-C(=O)-;

R₉ представляет собой H или (C₁-C₃)алкил;

E представляет собой -(CR₁₀R₁₁)_q-.

R₁₀ и R₁₁, в каждом случае независимо представляют собой Н или (C₁-C₃) алкил; и

q и r представляют собой целые числа от 1 до 5.

В 38-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) L представлен любой одной из следующих структурных формул:

, и

,

или их фармацевтически приемлемой солью, а остальные переменные являются такими, как описаны в 35-ом или 36-ом конкретном аспекте.

В 39-ом конкретном аспекте для иминсодержащего цитотоксического агента формулы (A) или конъюгата формулы (B) L представлен следующей структурной формулой:

,

или их фармацевтически приемлемой солью, где:

s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;

R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил;

m и n каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10;

R^h представляет собой Н или необязательно замещенный алкил;

P_L представляет собой необязательно замещенный алкилен, -(CH₂-CH₂-O)_j- (где атом кислорода связан с -(C=O)-группой, связанной с P), аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков; и

j представляет собой целое число от 1 до 24; а остальные переменные такие, как описаны в 35-ом или 36-ом конкретном аспекте.

В некоторых вариантах осуществления R₁₉, R₂₀, R₂₁ и R₂₂ каждый представляют собой H; и m и n, каждый независимо представляют собой целое число от 1 до 6.

В некоторых вариантах осуществления P_L представляет собой пептид, содержащий от 2 до 10 аминокислотных остатков. Более конкретно, P_L представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков. Более конкретно, P_L выбран из группы, состоящей из: Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Cit-Val. Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala., Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe, Gln-Ala, Gly-Gly-Gly, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Val-Cit, Ala-Val-Ala и β-Ala-Gly-Gly-Gly.

В некоторых вариантах осуществления L представлен следующей структурной формулой:

,

или их фармацевтически приемлемой солью.

В 40-ом конкретном варианте осуществления для способов, описанных в настоящем документе, иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

(ПБД17');

(ПБД17);

(ПБД18') или

(ПБД18),

или их фармацевтически приемлемой солью, где:

пунктирные линии указывают необязательное наличие двойной связи;

R^3'' представляет собой C_3-12 алкиленовую группу,

каждый X' в каждом случае независимо представляет собой -O-, -S- или -N(H)-;

каждый R² независимо выбран из -H, -OH, -CN, -R^1', -OR^1', -O-SO₂-R^1', -CO₂R^1', -COR^1' или галогена, или оба R², взятые вместе, представляют собой =O, =CH₂, =CH-R^a или =C(R^a)₂;

каждый R^2' независимо выбран из -H, -OH, -CN, -R^1', -OR^1', -O-SO₂-R^1', -CO₂R^1', -COR^1' или галогена;

R^4b представляет собой уходящую группу, выбранную из -OR⁶', -OCOR⁴', -OCOOR⁴', -OCONR^4'R^5', -NR^4'R^5', -NR^4'COR^5', -NR^4'NR^4'R⁵, необязательно замещенного 5- или 6-членного азотсодержащего гетероцикла (например, пиперидина, тетрагидропиррола, пиразола, морфолина), гуанидиния, представленного -NR^4'(C=NH)NR^4'R^5', аминокислоты или пептида, представленного -NR^6'COP', где P' представляет собой аминокислоту или полипептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных звеньев, -SR^6', -SOR^4', -SO₂M, -SO₃M, -OSO₃M, галогена, циано и азидо;

R^L представляет собой линкер, несущий малеимидный фрагмент, который может образовывать ковалентную связь со связывающим клетки агентом (СКА);

R⁶ и R⁹ независимо выбраны из -H, -R^1', -OH, -OR^1', -SH, -SR^1', -NH₂, -NHR^1', -NR^1'R^3', -NO₂, Me₃Sn и галогена; и

R^1' и R^3' каждый независимо выбран из необязательно замещенных C_1-12 алкильных, C_3-20 гетероциклильных или C_5-20арильных групп и необязательно в связи с группой -NR^1'R^3', R^1' и R^3' вместе с азотом атом, к которому они присоединены, образует необязательно замещенное 4-, 5-, 6- или 7-членное гетероциклическое кольцо; или любая пара соседних групп от R⁶ до R⁹ вместе образует группу -O-(CH₂)_p-O-, где p равен 1 или 2;

R^4' и R^5' каждый независимо выбран из -H, -OH, -OR^6', -NHR^6', -NR^6'₂, -COR⁶, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CH₂CH₂O)_n-R^b или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из O, S, N или P;

R^6' в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из -H, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, -(CH₂CH₂O)_n-R^b, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы, и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N или Р;

R^a независимо выбран из -R^1', -CO₂R^1', -COR^1', -CHO, -CO₂H или галогена;

R^b представляет собой -Н или замещенный или незамещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода;

М представляет собой Н или фармацевтически приемлемый катион; и

n является целым числом от 1 до 24.

В 41-ом конкретном аспекте для способов, описанных в настоящем документе, иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

(ПБД19');

(ПБД19);

(ПБД20') или

(ПБД20),

или его фармацевтически приемлемой солью, где R^3'' представляет собой C_3-5 алкилен и остальные переменные соответствуют описанным выше в 40-м конкретном аспекте.

В 42-ом конкретном аспекте для формулы (ПБД17'), (ПБД18'), (ПБД19'), (ПБД20'), (ПБД17), (ПБД18), (ПБД19) или (ПБД20) R^L представляет собой , где L¹ представляет собой расщепляемый линкер, A представляет собой связывающую группу, несущую малеимид, способный связывать L¹ со связывающим клетки агентом, L² представляет собой ковалентную связь или вместе с -OC(=O)- образует саморасщепляющийся линкер; а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 40-ом или 41-ом конкретном аспекте.

В 43-ем конкретном аспекте для R^L, описанного в 42-ом конкретном аспекте, L¹ представляет собой пептид, содержащий от 2 до 10 аминокислотных остатков; а остальные переменные являются такими, как описаны выше в 42-ом конкретном аспекте. Более конкретно, L¹ представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков. Еще более конкретно, L¹ выбран из группы, состоящей из Phe-Lys, Val-Ala, Val-Lys, Ala-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Phe-Arg, Trp-Cit, Lys-Lys, Phe-Ala, Phe-N9-tosyl-Arg, Phe-N9-нитро-Arg, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Gly-Gly-Gly, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:2) и Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:3).

В 44-ом конкретном аспекте для R^L, описанного в 42-ом конкретном аспекте, -C(=O)O- и L² вместе образуют группу:

где звездочка обозначает точку присоединения к позиции N10, волнистая линия обозначает точку присоединения к линкеру L¹, Y' представляет собой -NH-, -O-, -C(=O)NH- или -C(=O)O-, а n равен от 0 до 3; а остальные переменные соответствуют описанному в 42-ом или 43-ем конкретном аспекте.

В 45-ом конкретном аспекте для R^L, описанного в 42-ом конкретном аспекте, -C(=O)O- и L² вместе образуют группу:

,

а остальные переменные соответствуют описанным в 42-ом или 43-ем конкретном аспекте.

В 46-ом конкретном аспекте для R^L, описанного в 42-ом конкретном аспекте, L¹ и L² вместе с -OC(=O)- составляют группу, выбранную из:

,

где звездочка обозначает точку присоединения к позиции N10, а волнистая линия обозначает точку присоединения к оставшейся части линкера L¹ или точку присоединения к A.

В 47-ом конкретном аспекте для R^L, описанного в 42-ом конкретном аспекте, A представлен одним из следующих:

(i) , где звездочка обозначает точку присоединения к L¹, а p равен от 1 до 6; или

(ii) , где звездочка обозначает точку присоединения к L¹, r равен 0 или 1, а s равен от 0 до 30;

а остальные переменные являются такими, как описаны в 42-ом, 43-ем, 44-ом, 45-ом или 46-ом конкретном аспекте.

В некоторых вариантах осуществления p равен от 4 до 6; r равен 1; и s равен от 1 до 10.

В 48-ом конкретном аспекте для способов, описанных в настоящем изобретении, иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, модифицированный иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или ее фармацевтически приемлемой солью, а конъюгат представлен следующей формулой:

где s равен от 2 до 8; w равен 1 или 2; а СКА представляет собой связывающий клетки агент, описанный здесь. В некоторых вариантах осуществления s равен 7.

В некоторых вариантах осуществления для способов, описанных в настоящем изобретении, иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

;

или ее фармацевтически приемлемой солью, модифицированный иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или ее фармацевтически приемлемой солью, а конъюгат представлен следующей формулой:

где s равен от 2 до 8; w равен 1 или 2; а СКА представляет собой связывающий клетки агент, описанный здесь. В некоторых вариантах осуществления s равен 7.

В 49-ом конкретном аспекте для способов, описанных в настоящем изобретении, иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или ее фармацевтически приемлемой солью, модифицированный иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или ее фармацевтически приемлемой солью, а конъюгат представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где s равен от 2 до 8; w равен 1 или 2; а СКА представляет собой связывающий клетки агент, описанный здесь. В некоторых вариантах осуществления s равен 7.

В некоторых вариантах осуществления для способов, описанных в настоящем изобретении, иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или ее фармацевтически приемлемой солью, модифицированный иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

,

или ее фармацевтически приемлемой солью, а конъюгат представлен следующей формулой:

или ее фармацевтически приемлемой солью, где s равен от 2 до 8; w равен 1 или 2; а СКА представляет собой связывающий клетки агент, описанный здесь. В некоторых вариантах осуществления s равен 7.

В некоторых вариантах осуществления заряженный заместитель или ионизируемая группа Q, описанные в любых вышеупомянутых вариантах осуществления, представляют собой i) -SO₃H, -Z'-SO₃H, -OPO₃H₂, -Z'-OPO₃H₂, -PO₃H₂, -Z'-PO₃H₂, -CO₂H, -Z'-CO₂H, -NR₁₁R₁₂ или -Z'-NR₁₁R₁₂, или их фармацевтически приемлемую соль; или ii) -N⁺R₁₄R₁₅R₁₆X^- или -Z'-N⁺R₁₄R₁₅R₁₆X^-; Z' представляет собой необязательно замещенный алкилен, необязательно замещенный циклоалкилен или необязательно замещенный фенилен; каждый от R₁₄ до R₁₆ независимо представляет собой необязательно замещенный алкил; и X^- представляет собой фармацевтически приемлемый анион. Более конкретно, Q представляет собой -SO₃H или его фармацевтически приемлемую соль. Более конкретно, Q представляет собой -SO₃Na.

СВЯЗЫВАЮЩИЕ КЛЕТКИ АГЕНТЫ

В некоторых вариантах осуществления связывающий клетки агент может быть использован в настоящих способах в качестве антитела, имеющего сконструированный остаток цистеина (например, в позиции 442 тяжелой цепи (цепей) согласно нумерации EU/OU). Сконструированный остаток Cys может быть расположен в одной или обеих тяжелых цепях антитела или в одной или обеих легких цепях антитела, или их антигенсвязывающей части, или их комбинации. В некоторых случаях это означает, что остаток Cys находится в позиции 442 тяжелой(ых) цепи(ей) антитела согласно нумерации EU/OU. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой сконструированное антитело, содержащее цистеин, как описано в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления антитело согласно настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, антитело с измененной поверхностью или антитело человека.

В других вариантах осуществления связывающий клетки агент представляет собой антитело, одноцепочечное антитело, фрагмент антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, моноклональное антитело, одноцепочечное моноклональное антитело, фрагмент (или «антигенсвязывающую часть») моноклонального антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, химерное антитело, фрагмент (или «антигенсвязывающую часть») химерного антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, доменное антитело (например, sdAb) или фрагмент доменного антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью.

В еще других вариантах осуществления связывающий клетки агент представляет собой гуманизированное антитело, гуманизированное одноцепочечное антитело или фрагмент (или «антигенсвязывающую часть») гуманизированного антитела. В конкретном варианте осуществления гуманизированное антитело представляет собой huMy9-6 или другое родственное антитело, которое описано в патентах США №№ 7 342 110 и 7 557 189. В другом конкретном варианте осуществления гуманизированное антитело представляет собой антитело против рецептора фолата, описанное в патенте США № 8557966. В еще других вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой антитело против CD123, описанное в заявке США № 15/195401, поданной 28 июня 2016 года, под названием «ANTI-CD123 ANTIBODIES AND CONJUGATES AND DERIVATIVES THEREOF» («АНТИ-CD123 АНТИТЕЛА И КОНЪЮГАТЫ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ»). Содержание всех этих заявок полностью включено в данный документ посредством ссылки.

В еще других вариантах осуществления связывающий клетки агент представляет собой антитело с измененной поверхностью, одноцепочечное антитело с измененной поверхностью, фрагмент (или «антигенсвязывающую часть») антитела или биспецифическое антитело.

В другом аспекте изобретения предложено рекомбинантное антитело, содержащее зрелую процессированную последовательность тяжелой цепи, легкой цепи или ее антигенсвязывающую часть, полученную из тяжелой цепи (НС), легкой цепи (LC) рассматриваемого рекомбинантного антитела или их антигенсвязывающей части, описанных в данном документе.

Например, рекомбинантное антитело может представлять собой или может содержать scFv-Fc, Fcab, mAb2, малое модульное иммунофармацевтическое средство (SMIP), Genmab / унитело или дуотело, минитело, IgGΔCH2, DVD-Ig, протело, интратело или мультиспецифическое антитело.

DuoBody^® представляет собой гетеродимерное биспецифическое модифицированное IgG1-антитело на основе шарнирной области IgG1, которое обычно содержит (i) стабильную шарнирную область, которая содержит последовательность CPPC и не допускает обмен Fab-фрагментами in vivo, и (ii) IgG4-подобный домен CH3, модифицированный таким образом, чтобы содержать остатки F405L и K409R, что обеспечивает возможность обмена Fab-фрагментами in vivo (См. например , WO2008119353 и WO2011131746).

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантное антитело может содержать 1, 2, 3 или 4 зрелые процессированные последовательности тяжелой цепи, легкой цепи или их антигенсвязывающей части, каждая из которых получена либо из тяжелой цепи (HC), легкой цепи (LC) рассматриваемого рекомбинантного антитела или их антигенсвязывающей части, описанных в настоящем документе.

В других вариантах осуществления рекомбинантное антитело может представлять собой гетеродимерное антитело, содержащее первый полипептид тяжелой цепи и второй полипептид тяжелой цепи, причем Fc-область первого полипептида тяжелой цепи и Fc-область второго полипептида тяжелой цепи соприкасаются на поверхности контакта, и поверхность контакта Fc-области второго полипептида тяжелой цепи содержит выпуклость с возможностью расположения в углублении на поверхности контакта Fc-области первого полипептида тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления технология «выступ-во-впадину» для стимулирования специфического спаривания тяжелых цепей в биспецифическом антителе может быть дополнительно улучшена на основе, например, технологии CrossMab Genentech/Roche, например, путем перестановки CH1 и каппа константных областей для дополнительного уменьшения или устранения неправильного спаривания легких цепей.

В альтернативном варианте аналогичные результаты также могут быть достигнуты с использованием гетеродимеров LC, таких как технология на основе платформы гетеродимерных легких цепей IgG1 Zymeworks Azymetric™, которая полностью дополняет множество других биологических подходов, включая обычную легкую цепь, доменное антитело и одноцепочечные форматы, при разработке полностью биспецифических антител.

В некоторых вариантах осуществления Fc-область второго полипептида тяжелой цепи была изменена относительно матрицы/исходного полипептида для кодирования выпуклости, или Fc-область первого полипептида тяжелой цепи была изменена относительно матрицы/исходного полипептида для кодирования углубления, или имеют место оба варианта.

В других вариантах осуществления выпуклость и углубление содержат природный аминокислотный остаток.

В других вариантах осуществления Fc-область второго полипептида тяжелой цепи, содержащая выпуклость, получают путем замены исходного остатка на поверхности контакта матрица/исходный полипептид вносимым остатком, имеющим больший объем боковой цепи, чем исходный остаток.

В еще других вариантах осуществления Fc-область второго полипептида тяжелой цепи, содержащую выпуклость, получают способом, включающим этап, на котором нуклеиновые кислоты, кодирующие исходный остаток из поверхности контакта указанного полипептида, заменяют нуклеиновыми кислотами, кодирующими вносимый остаток, имеющий больший объем боковой цепи, чем исходный.

В некоторых вариантах осуществления антитело включает биспецифические, мультиспецифические и моноспецифические варианты антитела, которые включают антигенсвязывающие области и константный домен тяжелой цепи, причем константный домен тяжелой цепи модифицирован для включения Cys в положении 442 согласно нумерации EU/OU.

В других вариантах осуществления антитело может связываться с лигандом на клетке-мишени, таким как лиганд на клеточной поверхности, включая рецепторы на клеточной поверхности.

Конкретные типичные антигены или лиганды могут включать ренин; гормон роста (например, человеческий гормон роста и бычий гормон роста); фактор, высвобождающий гормон роста; гормон паращитовидной железы; гормон, стимулирующий щитовидную железу; липопротеин; альфа-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; фактор свертывания крови (например, фактор vmc, фактор IX, тканевой фактор и фактор фон Виллебранда); фактор против свертывания крови (например, протеин С); предсердный натрийуретический фактор; поверхностно-активное вещество легкого; активатор плазминогена (например, урокиназа, активатор плазминогена мочи человека или тканевого типа); бомбезин; тромбин; кроветворный фактор роста; фактор некроза опухоли альфа и бета; энкефалиназу; RANTES (т. е. регулятор активации экспрессии и секреции нормальных T-клеток); воспалительный белок-1-альфа макрофаги человека; сывороточный альбумин (человеческий сывороточный альбумин); ингибирующее вещество Мюллера; А-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; микробный белок (бета-лактамаза); ДНКазы; IgE; цитотоксический антиген, ассоциированный с Т-лимфоцитами (например, CTLA-4); ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; рецептор гормонов или факторов роста; белок А или D; ревматоидный фактор; нейротрофический фактор (например, нейротрофический фактор костного происхождения, нейротрофин-3, -4, -5 или -6), фактор роста нервов (например, NGF-β); тромбоцитарный фактор роста; фактор роста фибробластов (например, aFGF и bFGF); рецептор фактора роста фибробластов 2; эпидермальный фактор роста; трансформирующий фактор роста (например, TGF-альфа, TGF-β1, TGFβ2, TGFβ3, TGFβ4 и TGFβ5); инсулиноподобный фактор роста-I и -II; des(1-3)-IGF-I (IGF-I головного мозга); белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста; меланотрансферрин; EpCAM; GD3; FLT3; PSMA; PSCA; MUC1; MUC16; STEAP; CEA; TENB2; рецептор EphA; рецептор EphB; рецептор фолата; FOLR1; мезотелин; крипто; альфа_vбета₆; интегрины; VEGF; VEGFR; EGFR; рецептор трансферрина; IRTA1; IRTA2; IRTA3; IRTA4; IRTA5; CD протеины (например, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80, CD81, CD103, CD105, CD123, CD134, CD137, CD138 и CD152), один или более опухолеассоциированных антигенов или рецепторов клеточной поверхности (см. публикацию США № 2008/0171040 или публикацию США № 2008/0305044, в полном объеме включенные посредством ссылки); эритропоэтин; остеоиндуктивный фактор; иммунотоксин; костный морфогенетический белок; интерферон (например, интерферон-альфа, -бета и -гамма); колониестимулирующий фактор (например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF); интерлейкины (например, от IL-1 до IL-10); супероксиддисмутазу; Т-клеточный рецептор; белок поверхностной мембраны; фактор ускорения распада; вирусный антиген (например, часть оболочки ВИЧ); транспортный белок, хоминг-рецептор; адрессин; регуляторный белок; интегрин (например, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM;) опухолеассоциированный антиген (например, рецепторы HER2, HER3 и HER4); эндоглин; c-Met; c-kit; 1GF1R; PSGR; NGEP; PSMA; PSCA; TMEFF2; LGR5; B7H4; и фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов.

В некоторых вариантах осуществления связывающий клетки агент представляет собой антитело против фолатного рецептора. Более конкретно, антитело против фолатного рецептора представляет собой гуманизированное антитело, которое специфически связывает фолатный рецептор 1 человека, при этом антитело содержит: (а) CDR1 тяжелой цепи, содержащую GYFMN (SEQ ID NO: 4); CDR2 тяжелой цепи, содержащую RIHPYDGDTFYNQXaa₁FXaa₂Xaa₃ (SEQ ID NO: 5); и CDR3 тяжелой цепи, содержащую YDGSRAMDY (SEQ ID NO: 6); и (b) CDR1 легкой цепи, содержащую KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO: 7); CDR2 легкой цепи, содержащую RASNLEA (SEQ ID NO: 8); и CDR3 легкой цепи, содержащую QQSREYPYT (SEQ ID NO: 9); где Xaa₁ выбран из K, Q, H и R; Xaa₂ выбран из Q, H, N и R; и Xaa₃ выбран из G, E, T, S, A и V. Предпочтительно, последовательность CDR2 тяжелой цепи содержит RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 10).

В других вариантах осуществления антитело против фолатного рецептора представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает фолатный рецептор 1 человека, содержащее тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQ KFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLCLSPG (SEQ ID NO: 11).

В других вариантах осуществления антитело против фолатного рецептора представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает фолатный рецептор 1 человека, содержащее легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPD RFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 12); или DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPD RFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13).

В других вариантах осуществления антитело против фолатного рецептора представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает человеческий фолатный рецептор 1, содержащее тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13. Предпочтительно антитело содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 (huMov19).

В других вариантах осуществления антитело против фолатного рецептора представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее сконструированный остаток Cys (например, C442) и вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере на около 90%, 95%, 99% или 100%, идентичный QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQ KFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 14), и вариабельный домен легкой цепи, по меньшей мере на около 90%, 95%, 99% или 100% идентичный DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPD RFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 15); или DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPD RFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 16).

В конкретном варианте осуществления гуманизированное антитело представляет собой huMy9-6 или другое родственное антитело, которое описано в патентах США №№ 7 342 110 и 7 557 189. В другом конкретном варианте осуществления гуманизированное антитело представляет собой антитело против фолатного рецептора (например, huMov19), описанное в патенте США № 8577966. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой антитело против CD37 (например, против CD37-3), описанное в патенте США № 8765917. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой антитело против EGFR, описанное в патенте США № 8790649. В других вариантах осуществления антитело является антителом против EGFR. В некоторых вариантах осуществления антитело против EGFR представляет собой неантагонистическое антитело, включая, например, антитела, описанные в WO2012058592, включенной в настоящий документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления антитело против EGFR представляет собой нефункциональное антитело, например, гуманизированное ML66. Более конкретно, антитело против EGFR представляет собой huML66.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело против CD123, такое как гуманизированное антитело huCD123, описанное в заявке США № 15/195401, поданной 28 июня 2016 г., под названием «ANTI-CD123 ANTIBODIES AND CONJUGATES AND DERIVATIVES THEREOF» («АНТИ-CD123 АНТИТЕЛА И КОНЪЮГАТЫ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ») (полное содержание, включая все последовательности и графические материалы, включено в настоящий документ). В конкретном варианте осуществления антитело против CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: а) по меньшей мере, одну вариабельную область тяжелой цепи или ее фрагмент, содержащую три последовательные определяющие комплементарность области (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, причем CDR1 имеет последовательность SSIMH (SEQ ID NO: 17), CDR2 имеет последовательность YIKPYNDGTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 18) и CDR3 имеет последовательность EGGNDYYDTMDY (SEQ ID NO: 19); и b) по меньшей мере, одну вариабельную область легкой цепи или ее фрагмент, содержащую три последовательные определяющие комплементарность области (CDR) CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно, причем CDR1 имеет последовательность RASQDINSYLS (SEQ ID NO: 20), CDR2 имеет последовательность RVNRLVD (SEQ ID NO: 21) и CDR3 имеет последовательность LQYDAFPYT (SEQ ID NO: 22).

В других конкретных вариантах осуществления антитело против CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит сконструированный остаток Cys (например, C442); вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, по меньшей мере на около 90%, 95%, 99% или 100% идентичный QXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSSIMHWVRQAPGQGLEWIGYIKPYNDGTKYNE KFKGRATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23); и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 90%, 95%, 99% или 100% идентичную DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRVNRLVDGVPSRFSG SGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:24). В определенных вариантах осуществления, Xaa, второй остаток от N-конца SEQ ID NO: 23, представляет собой Phe. В других вариантах Xaa представляет собой Val.

В некоторых вариантах осуществления антитело против CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать: область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSSIMHWVRQAPGQGLEWIGYIKPYNDGTKYNE KFKGRATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLCLSPG (SEQ ID NO:25);

и область легкой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRVNRLVDGVPSRFSG SGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:26).

КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящее изобретение также включает конъюгаты связывающий клетки агент-цитотоксический агент, полученные любыми способами согласно настоящему изобретению, композицию (например, фармацевтическую композицию), содержащую конъюгаты связывающий клетки агент-цитотоксический агент, полученные любыми способами согласно настоящему изобретению, и носитель (фармацевтически приемлемый носитель). Настоящие конъюгаты и композиции применимы для ингибирования аномального клеточного роста или лечения пролиферативного нарушения у млекопитающего (например, человека). Настоящее изобретение включает способ ингибирования аномального клеточного роста или лечения пролиферативного нарушения у млекопитающего (например, человека), включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества конъюгатов, полученных способами настоящего изобретения, описанными выше, или их композиции, отдельно или в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

В некоторых вариантах осуществления пролиферативным нарушением является рак. Рак может включать гематологический рак или солидную опухоль. Более конкретно, рак представляет собой лейкоз (например, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), такой как острый B-лимфобластный лейкоз (B-ОЛЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ)) или лимфому, меланому, рак легких (например, немелкоклеточный рак легких), рак яичников, рак эндометрия, рак брюшины, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак простаты и рак шейки матки.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения, включающим введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества любого из конъюгатов, описанных выше.

Аналогично, в настоящем изобретении предложен способ индукции гибели клеток в выбранных популяциях клеток, включающий приведение в контакт клеток-мишеней или ткани, содержащей клетки-мишени, с эффективным количеством цитотоксического агента, содержащего любой из конъюгатов, описанных выше. Клетки-мишени представляют собой клетки, с которыми может связываться связывающий клетки агент.

При желании вместе с конъюгатом можно вводить другие активные агенты, такие как другие противоопухолевые агенты.

Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители и наполнители хорошо известны и могут быть определены специалистами в данной области в зависимости от клинической ситуации. Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или наполнителей включают: (1) забуференный фосфатом физиологический раствор Дульбекко, рН около 7,4, содержащий или не содержащий от около 1 мг/мл до 25 мг/мл человеческого сывороточного альбумина, (2) 0,9% солевого раствора (0,9% масс./об. NaCl) и (3) 5 % (масс./об.) декстрозы; и может также содержать антиоксидант, такой как триптамин, и стабилизирующий агент, такой как Твин 20.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Приготовление иминсодержащих цитотоксических агентов

Следующие растворители, реагенты, защитные группы, фрагменты и другие обозначения могут упоминаться в сокращенном виде в скобках:

Me	метил	Et	этил	Pr	пропил
i-Pr	изопропил	Bu	бутил	t-Bu	трет-бутил
Ph	фенил	Ac	ацетил	AcOH / HOAc	уксусная кислота
Ala	аланин	водн.	водный	АЦН / CH3CN	ацетонитрил
ДИвода	деионизованная вода	ДХМ / CH2Cl2	дихлорметан	Boc / BOC	трет-бутоксикарбонил
г	грамм	ДМА	N,N-диметилацетамид	ДИЭА или ДИПЭА	N,N-диизопропилэтиламин
ч	час	ДМФ	N,N-диметилформамид	ЭДК	1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид
мин	минуты	EtOAc	этилацетат	ИЭР или ЭР	ионизация электрораспылением
мг	миллиграмм	ЖХ	жидкостная хроматография	ВЭЖХ	высокоэффективная жидкостная хроматография
мл	миллилитров	ммоль	ммоль	ЖХМС	жидкостная хроматография - масс-спектрометрия
мкг	микрограмм	мкмоль	микромоль	МС	масс-спектрометрия
мкл	микролитры	MeOH	метанол	NHS	N-гидроксисукцинамид
нас. или насыщ.	насыщенный	КТ или кт	комнатная температура (температура окружающей среды около 25 °C)	ЯМР	спектроскопия ядерного магнитного резонанса
ТГФ	тетрагидрофуран	ТЭА	триэтиламин (Et3N)	ОФВЭЖХ или ОФ-ВЭЖХ	обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

Синтез N1-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил)-N6-((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-метокси-6-оксо-11,12,12a,13-тетрагидро-6H-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-a]индо-9-ил)окси)метил)-5-((((S)-8-метокси-6-оксо-12a,13-дигидро-6H-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-a]индол-9-ил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)адипамида, соединение D1

Сложный эфир NHS 1а (8,2 мг, 7,6 мкмоль) (полученный в соответствии с процедурами, описанными в US-2016/0082114, включенной в настоящее описание посредством ссылки) и гидрохлорид 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (2,2 мг 0,011 ммоль) растворяли в безводном дихлорметане (305 мкл) при комнатной температуре. Добавляли ДИПЭА (2,66 мкл, 0,015 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 3,5 часов. Реакционную смесь концентрировали и очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ (колонка C18, CH₃CN/H₂O, градиент, от 35% до 55%). Фракции желаемого продукта замораживали и лиофилизировали, получая малеимид, соединение D1 в виде твердого белого порошка (5,3 мг, выход 58%). ЖХМС = 5,11 мин (8 мин метод). МС (m/z): 1100,6 (M + 1)⁺.

B. Синтез N-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил)-11-(3-((((S)-8-метокси-6-оксо-11,12,12a,13-тетрагидро-6H-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-a]индол-9-ил)окси)метил)-5-((((S)-8-метокси-6-оксо-12a,13-дигидро-6H-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-a]индол-9-ил)окси)метил)фенил)-13,13-диметил-2,5,8-триокса-14,15-дитиа-11-азанонадекан-19-амид, соединение D2

К раствору свободного тиола 2a (40 мг, 0,042 ммоль) и NHS 4-(2-пиридилдитио) бутаната (35 мг, чистота 80%, 0,085 ммоль) в безводном дихлорметане (0,5 мл) добавляли безводный диизопропилэтиламин (0,015 мл, 0,085 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь гасили насыщенным хлоридом аммония и разбавляли дихлорметаном. Полученную смесь разделяли в делительной воронке. Органический слой промывали рассолом, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью полупрепаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка C18, CH₃CN/H₂O). Фракции, которые содержали чистый продукт, объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением желаемого эфира NHS, 2b (29,7 мг, выход 60%). ЖХМС = 9,1 мин (15 мин метод). МС (m/z): 1157,3 (M + 1)⁺.

К раствору эфира NHS, 2b (12,3 мг, 0,011 ммоль) и N-(2-аминоэтил) малеимида гидрохлорида (2,0 мг, 0,011 ммоль) в безводном дихлорметане (0,3 мл) добавляли ДИПЭА (0,0022 мл, 0,013 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, затем ее отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью полупрепаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка C18, CH₃CN/H₂O). Фракции, которые содержали чистый продукт, объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением желаемого малеимида, соединение D2 (10 мг, выход 80%). ЖХМС = 8,3 мин (15 мин метод). МС (m/z): 1181,8 (M + 1)⁺.

C. Синтез 1-((2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил)амино)-4-((5-((3-((((S)-8-метокси-6-оксо-11,12,12a,13-тетрагидро-6H-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-a]индол-9-ил)окси)метил)-5-((((S)-8-метокси-6-оксо-12a,13-дигидро-6H-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-a]индол-9-ил)окси)метил)фенил)амино)-2-метил-5-оксопентан-2-ил)дисульфанил)-1-оксобутан-2-сульфоновая кислота, соединение D3

К суспензии свободного тиола 3а (88 мг, 0,105 ммоль) и 1-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-1-оксо-4-(пиридин-2-илдисульфанил)бутан-2-сульфоновой кислоты (64,0 мг, 0,158 ммоль) в безводном дихлорметане (2,10 мл) добавляли ДИПЭА (55,0 мкл, 0,315 ммоль) в атмосфере азота при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение 16 часов и затем добавляли 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион гидрохлорид (55,6 мг, 0,315 ммоль), безводный дихлорметан (1,0 мл) и ДИПЭА (0,055 мл, 0,315 ммоль). Смесь перемешивали в течение дополнительных 5 часов при комнатной температуре, после чего реакционную смесь концентрировали в вакууме. Полученный остаток очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ (C18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержащие желаемый продукт, замораживали и лиофилизировали с получением малеимида, соединения D3 (20 мг, 16% выход), в виде белого твердого вещества. ЖХМС = 4,92 мин (8 мин метод). МС (m/z): 1158,6 (M + 1)⁺.

D. Синтез N-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил)-11-(3-((((S)-8-метокси-6-оксо-11,12,12a,13-тетрагидро-6H-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-a]индол-9-ил)окси)метил)-5-((((S)-8-метокси-6-оксо-12a,13-дигидро-6H-бензо[5,6][1,4]диазепино[1,2-a]индол-9-ил)окси)метил)фенил)-2,5,8-триокса-11-азапентадекан-15-амид, соединение D4

К раствору сложного эфира NHS 4а (5 мг, 4,82 мкмоль) и гидрохлориду 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (1,7 мг, 9,64 мкмоль) в безводном дихлорметане (200 мкл) добавляли ДИПЭА (1,512 мкл, 8,68 мкмоль) в атмосфере азота. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов и затем концентрировали в вакууме. Полученный остаток очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ (C18, CH₃CN/H₂O). Фракции, содержащие желаемый продукт, замораживали и лиофилизировали с получением малеимида, соединение D4 (3,5 мг, выход 68%). ЖХМС = 4,61 мин (15 мин метод). МС (m/z): 1062,8 (M + 1)⁺.

Пример 2. Селективное сульфирование иминсодержащего цитотоксического агента, содержащего малеимидную группу

К смеси 50 мМ сукцината натрия pH 3,3 (116,5 мл) и ДМА (98,5 мл) добавляли D1 (263,6 мг), растворенный в 21,4 мл ДМА. Затем в реакцию вводили 3,4 мл 100 мМ раствора бисульфита натрия (1,4 эквивалента) в воде, содержащей 1 об./об.% ДМА. Гомогенной смеси давали возможность реагировать в течение 2 ч при 25°С, после чего полноту реакции анализировали с помощью СЭЖХ-МС. Реакционная смесь пригодна для конъюгации без дополнительной очистки. Как показано на ФИГ. 1, анализ реакционной смеси методом СЭЖХ-МС показывает 92,5% имин-сульфо D1, 1,9% непрореагировавшего D1, 0,8% малеимид-сульфо D1 и 4,8% дисульфо-D1. Режим определения отрицательных ионов ИЭР-МС [M-H] - рассчитано для имин-сульфо D1 (C₆₀H₆₂N₉O₁₅S^-): 1180,41; найдено: 1180,03.

Пример 3.

Влияние бисульфита натрия на селективное сульфирование

Как указано в таблице 1, к необходимому объему буфера 50 мМ сукцината натрия pH 3,3 добавляли следующие реагенты в следующем порядке: ДМА (38,8 мкл), необходимый объем 20 или 40 мМ водного раствора бисульфита натрия, содержащего 1 об/об % ДМА, и 8,9 мМ D1 в ДМА (11,2 мкл). Полученной реакционной смеси, содержащей 50% ДМА по объему, давали возможность реагировать в течение 20 часов при 25°C. Продукты реакции анализировали с помощью СЭЖХ-МС. Относительное содержание наблюдаемых продуктов дисульфо D1, малеимид-сульфо D1, имин-сульфо D1 и несульфированных продуктов D1 показаны в таблице 1.

Таблица 1

	Буфер на основе сукцината натрия (мкл)	Исходная смесь бисульфита натрия	Продукты реакции, D1 (%)
Реакция	Всего эквивалентов	Концентрация исходной смеси (мМ)	Добавленный объем (мкл)	Дисульфо	Малеимид-сульфо	Имин-сульфо	Несульфированные	Общее количество оставшегося реактивного малеимида
1	46	0,8	20	4	0,6	1,4	35,9	62,1	98,0
2	45	1,0	20	5	1,1	1,4	53,4	44,2	97,6
3	44	1,2	20	6	2,0	1,2	69,6	27,2	96,8
4	43	1,4	20	7	2,6	1,1	79,1	17,2	96,3
5	42	1,6	20	8	5,0	1,1	85,7	8,2	93,9
6	41	1,8	20	9	8,3	1,2	84,6	5,9	90,5
7	45	2,0	40	5	8,7	0,8	88,2	2,3	90,5
8	44	2,4	40	6	13,0	0,9	83,9	2,2	86,1
9	43	2,8	40	7	16,4	1,1	79,8	2,7	82,5
10	42	3,2	40	8	19,8	1,5	75,8	2,9	78,7
11	41	3,6	40	9	22,9	1,8	71,9	3,4	75,3

Пример 4. Влияние рН на селективное сульфирование

Как подробно указано в таблице 2, к 44,0 мкл 50 мМ буфера на основе сукцината натрия с указанным рН добавляли следующие реагенты в следующем порядке: 20 мМ водного раствора бисульфита натрия (6,0 мкл), содержащего 1 об/об % ДМА, ДМА (38,8 мкл) и 8,9 мМ D1 в ДМА (11,2 мкл). Полученной реакционной смеси, содержащей 50% ДМА по объему, давали возможность реагировать в течение 4 часов при 25°C. Продукты реакции анализировали с помощью СЭЖХ-МС. Относительное содержание наблюдаемых продуктов дисульфо, малеимид-сульфо, имин-сульфо и несульфированного D1 показано в таблице 2.

Таблица 2.

	Буфер на основе сукцината натрия рН	Бисульфит натрия (всего эквивалентов)	Продукты реакции, DGN549-C (%)
Реакция	Дисульфо	Малеимид-сульфо	Имин-сульфо	Несульфированные	Общее количество оставшегося реактивного малеимида
1	2,9	1,2	0,7	1,0	68,5	29,8	98,3
2	3,1	1,2	0,8	1,3	65,0	33,0	97,9
3	3,3	1,2	1,1	1,7	66,9	30,3	97,1
4	3,4	1,2	1,3	1,4	66,5	30,7	97,3
5	3,7	1,2	2,3	2,7	65,6	29,4	94,9

Пример 5. Селективное сульфирование с буфером или без

Как подробно указано в таблице 3, к 21,6 мкл ДМА добавляли 22,0 мкл воды или 50 мМ натрий-сукцинатного буфера с указанным pH, 20 мМ водного раствора бисульфита натрия (3,0 мкл), содержащего 1 об/об % ДМА, и 14,5 мМ D1 в ДМА (3,4 мкл). Полученной реакционной смеси, содержащей 50% ДМА по объему, давали возможность реагировать в течение 6 часов при 25°C. Продукты реакции анализировали с помощью СЭЖХ-МС. Относительное содержание наблюдаемых продуктов дисульфо, малеимид-сульфо, имин-сульфо и несульфированного D1 показано в таблице 3.

Таблица 3.

	Буфер на основе сукцината натрия рН	Бисульфит натрия (всего эквивалентов)	Продукты реакции, D1 (%)
Реакция	Дисульфо	Малеимид-сульфо	Имин-сульфо	Несульфированные	Общее количество оставшегося реактивного малеимида
1	3,5	1,2	0,8	0,5	86,9	11,8	98,7
2	4,0	1,2	4,8	2,9	70,0	22,8	92,8
3	только вода	1,2	2,8	1,8	75,8	19,6	95,4

Аналогично, как подробно показано в таблице 4, к 47,6 мкл ДМА добавляли 55,6 мкл воды или 50 мМ буфера на основе сукцината натрия с pH 4,75, 20 мМ водного раствора бисульфита натрия (6,9 мкл), содержащего 1 об/об % ДМА, и 8,4 мМ D1 в ДМА (14,9 мкл). Полученной реакционной смеси, содержащей 50% ДМА по объему, давали возможность реагировать в течение 24 ч при 25°С. Продукты реакции анализировали с помощью СЭЖХ-МС (см. Фиг. 2). Относительное содержание наблюдаемых продуктов дисульфо, малеимид-сульфо, имин-сульфо и несульфированных DGN549-C указано в таблице 4.

Таблица 4.

	Буфер на основе сукцината натрия рН	Бисульфит натрия (всего эквивалентов)	Продукты реакции, D1 (%)
Реакция	Дисульфо	Малеимид-сульфо	Имин-сульфо	Несульфированные	Общее количество оставшегося реактивного малеимида
1	4,75	1,1	9,8	40,7	13,4	36,1	49,5
3	только вода	1,1	1,5	0,9	73,8	23,8	97,6

В другом эксперименте, как подробно описано в таблице 5, к 24,6 мкл ДМА добавляли указанный объем воды, указанный объем 20 мМ водного раствора бисульфита натрия. pH этих растворов был таким, как указано в таблице 5. К этим смесям добавляли 11,2 мМ D1 в ДМА (5,4 мкл). Полученные реакционные смеси, содержащие 50% ДМА по объему, оставляли реагировать в течение 1-2 ч при 25°C. Продукты реакции анализировали с помощью СЭЖХ-МС. Относительное содержание наблюдаемых продуктов дисульфо, малеимид-сульфо, имин-сульфо и несульфированных D1 указано в таблице 5.

Таблица 5

	Вода (мкл)	Исходная смесь бисульфита натрия		Продукты реакции, DGN549-C (%)
Реакция	Всего эквивалентов	Концентрация исходной смеси (мМ)	Добавленный объем (мкл)	Наблюдаемый рН реакции	Дисульфо	Малеимид-сульфо	Имин-сульфо	Несульфированные	Общее количество оставшегося реактивного малеимида
1	21,0	3,0	20	9,0	4,2	6,9	-	90,9	2,2	93,1
2	15,0	5,0	20	15,0	4,2	20,5	-	78,0	1,5	79,5

«-» означает не наблюдается методом СЭЖХ.

Пример 6. Приготовление конъюгатов антитело-цитотоксический агент

Реакционную смесь для сульфирования (240 мл, 3,5 экв.), приготовленную в соответствии с примером 2, затем вводили в 50 мМ раствор фосфата калия с pH 6,0, содержащий 10 г антитела против CD123 с восстановленными сконструированными остатками цистеина C442. При конечной концентрации антитела 2 мг/мл и 15 об/об % ДМА реакции конъюгации давали протекать в течение 18 часов при 25°С. SEC-анализ продукта реакции дает ADC с DAR (соотношение между лекарственным средством и антителом) 1,9 и % HMW (процентное содержание высокомолекулярных частиц) 4,4% по сравнению с 3,7% до конъюгации.

Конъюгаты с двумя другими гуманизированными моноклональными антителами с восстановленными сконструированными остатками цистеина C442 также получали в соответствии с аналогичными процедурами, описанными выше.

Пример 7. Селективное сульфирование иминсодержащих димеров ПБД, содержащих малеимидную группу

К 21,2 мкл 50 мМ буфера сукцината натрия, рН 3,3, добавляли в следующем порядке: 20 мкл ДМА, 3,8 мкл 20 мМ водного раствора бисульфита натрия и 5,0 мкл 10,0 мМ талирина в ДМА. Это соответствует 1,5 эквивалента бисульфита по отношению к талирину. Полученной реакционной смеси, содержащей 50% ДМА по объему, давали возможность реагировать в течение 4 часов при 25°C. Продукты реакции анализировали с помощью СЭЖХ-МС. Относительное содержание наблюдаемых иминдисульфо, общего иминмоносульфо, несульфированного и общего малеимидсульфо продуктов были определены, как указано в таблице 6. ИЭР-МС рассчит. для талирина (C₆₀H₆₅N₈O₁₂⁺) [M+H]⁺ 1089.4716, найдено 1089,4716; рассчит. для имин-моносульфированного талирина (C₆₀H₆₅N₈O₁₅S^-) [M-H]^- 1169.4296, найдено 1169,4345; рассчит. для имин-дисульфонированного талирина (C₆₀H₆₇N₈O₁₈S₂^-) [M-H]^- 1251.4020, найдено 1251,4053. Типичная хроматограмма (поглощение на 330 нм) конечной реакционной смеси показана на Фиг. 3. Структуры идентифицированных продуктов реакции

Таблица 6.

	Буфер на основе сукцината натрия (мкл)	Исходная смесь бисульфита натрия	Продукты реакции, талирин (%)
Реакция	Всего эквивалентов (по сравнению с нагрузкой)	Концентрация исходной смеси (мМ)	Добавленный объем (мкл)	Иминдисульфо	Всего иминдисульфо	Всего видов малеимид-сульфо	Несульфированные	Общее количество оставшегося реактивного малеимида
талирин	21,2	1,5	20	3,8	57,3	39,0	<1	3,7	>99.0

талирин

Имин моносульфоталирин (изомер 1)

Имин моносульфоталирин (изомер 2)

Имин ди-сульфо-талирин

Пример 8. Селективное сульфирование иминсодержащих димеров IGN, содержащих малеимидную группу

Как указано в таблице 7, к необходимому объему 50 мМ буфера на основе сукцината натрия, pH 3,3, добавляли в следующем порядке: ДМА (21,2 мкл), необходимый объем 20 мМ водного раствора бисульфита натрия и 13,2 мМ D5 в ДМА (3,8 мкл). Полученной реакционной смеси, содержащей 50% ДМА по объему, давали возможность реагировать в течение 4 ч при 25°С. Продукты реакции анализировали с помощью СЭЖХ-МС. Относительное содержание наблюдаемых иминдисульфо, иминмоносульфо, несульфированных и общих малеимидсульфированных продуктов определяли, как указано в таблице 7. ИЭР-МС рассчит. для D5 (C₆₀H₆₀N₉O₁₂⁺) [M+H]⁺ 1098,4356, найдено 1098,4351; рассчит. для моносульфированного имином D5 (C₆₀H₆₀N₉O₁₅S^-) [M-H]^- 1178,3935, найдено 1178,4006; рассчит. для диметилсульфонированного имина D5 (C₆₀H₆₂N₉O₁₈S₂^-) [M-H]^- 1260,3660, найдено 1260,3704; рассчит. для иминсульфансилированного малеимидсульфонированного D5 (C₆₀H₆₄N₉O₂₁S₃^-) [M-2H]² z=2670,6653, найдено 670,6693. Типичные хроматограммы (поглощение на 330 нм) конечной реакционной смеси с 2,0 и 2,5 эквивалентами бисульфита показаны на Фиг. 4A и 4B. Структуры идентифицированных продуктов реакции показаны ниже.

Таблица 7

	Буфер на основе сукцината натрия (мкл)	Исходная смесь бисульфита натрия	Продукты реакции, IGN148-mal (%)
Реакция	Всего эквивалентов (по сравнению с нагрузкой)	Концентрация исходной смеси (мМ)	Добавленный объем (мкл)	Иминдисульфо	Иминмоносульфо	Всего видов малеимид-сульфо	Несульфированные	Общее количество оставшегося реактивного малеимида
1	21,2	1,5	20	3,8	41,9	46,9	1,4	9,7	98,6
2	20,0	2,0	20	5,0	76,0	20,3	1,9	1,8	98,1
3	18,7	2,5	20	6,3	83,3	6,7	10,0	-	90,0

D5

Имин моносульфо D5

Имин ди-сульфо D5

Имин ди-сульфо малеимид D5

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ИММУНОДЖЕН, ИНК.

<120> СЕЛЕКТИВНОЕ СУЛЬФИРОВАНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗОДИАЗЕПИНА

<130> 128037-03820

<140> PCT/US2017/062989

<141> 22.11.2017

<150> 62/425,761

<151> 23.11.2016

<160> 27

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 1

Ala Leu Ala Leu

1

<210> 2

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<220>

<221> МОД_ОСТ

<222> (1)..(1)

<223> Beta-Ala

<400> 2

Xaa Leu Ala Leu

1

<210> 3

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 3

Gly Phe Leu Gly

1

<210> 4

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 4

Gly Tyr Phe Met Asn

1 5

<210> 5

<211> 23

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (14)..(14)

<223> Gln, His или Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (18)..(18)

<223> His, Asn или Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (21)..(21)

<223> Glu, Thr, Ser, Ala или Val

<220>

<221> ПРОЧ_ПРИЗНАКИ

<222> (1)..(23)

<223> /примечание="Вариантные остатки, приведенные в последовательности,

не являются предпочтительными по сравнению с приведенными в сносках

для вариантных позиций"

<400> 5

Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Ala Ala

1 5 10 15

Phe Gln Ala Ala Gly Ala Ala

20

<210> 6

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 6

Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 7

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 7

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His

1 5 10 15

<210> 8

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 8

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 9

Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 10

Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид»

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Cys Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 12

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид»

<400> 12

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 13

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид»

<400> 13

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 14

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид»

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид»

<400> 15

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид»

<400> 16

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 17

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 17

Ser Ser Ile Met His

1 5

<210> 18

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 18

Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 19

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 19

Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 20

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 21

Arg Val Asn Arg Leu Val Asp

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<400> 22

Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 23

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид»

<220>

<221> МОД_ОСТ

<222> (2)..(2)

<223> Любая аминокислота

<400> 23

Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид»

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 25

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид»

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Cys Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 26

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид»

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 27

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид»

<220>

<221> МОД_ОСТ

<222> (1)..(1)

<223> Beta-Ala

<400> 27

Xaa Gly Gly Gly

1

<---

1. Способ получения конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, включающий стадии:

(a) взаимодействие иминного фрагмента в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе при рН от 2,9 до 4,0 с образованием модифицированного цитотоксического агента, содержащего модифицированный иминный фрагмент, представленный следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью; и

(b) взаимодействие модифицированного цитотоксического агента со связывающим клетки агентом с образованием конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент,

где связывающий клетки агент представляет собой антитело или фрагмент антитела; D представляет собой иминсодержащее бензодиазепиновое соединение; и L является линкером, причем

D представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂', R₃' и R₄' все представляют собой Н;

R₆ представляют собой -ОМе;

X₁' и Y₁' оба представляют собой -Н;

А и А' представляют собой -О-;

L'' и L''' оба представляют собой Н;

L' представлен следующей формулой:

-NR₅-P₁-C(=O)-(CR_aR_b)_s-C(=O)- (В1');

-NR₅-P₁-C(=O)-Cy-(CR_aR_b)_s1'-C(=O)- (В2');

-C(=O)-P₁-NR₅-(CR_aR_b)_s-C(=O)- (С1'), или

-C(=O)-P₁-NR₅-Cy-(CR_aR_b)_s1'-C(=O)- (С2'),

где:

каждый из R_a и R_b в каждом случае независимо представляет собой -Н, (C₁-С₃)алкил или заряженный заместитель или ионизируемую группу Q;

s представляет собой целое число от 1 до 6;

s1' представляет собой 0 или целое число от 1 до 6;

Су представляет собой циклический алкил с 5 или 6 кольцевыми атомами углерода, необязательно замещенный галогеном, -ОН, (С₁-С₃)алкилом, (С₁-С₃)алкокси или галоген(С₁-С₃)алкилом;

P₁ представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

G представляет собой -СН- или -N-;

R₅ в каждом случае независимо представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;

L представлен следующей структурной формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D;

s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;

R₂₃ и R₂₄ в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил;

m' представляет собой целое число от 0 до 10; и

R^h' представляет собой Н или необязательно замещенный алкил.

2. Способ по п. 1, где реакцию на стадии (а) проводят при рН от 2,9 до 3,7.

3. Способ по п. 1, где реакцию на стадии (а) проводят при рН от 3,1 до 3,5.

4. Способ по п. 1, где реакцию на стадии (а) проводят при рН от 3,2 до 3,4.

5. Способ по п. 1, где реакцию на стадии (а) проводят при рН 3,3.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где реакцию на стадии (а) проводят в присутствии буферного раствора.

7. Способ по п. 6, где буферный раствор представляет собой цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер и фосфатный буфер.

8. Способ по п. 6, где буферный раствор представляет собой сукцинатный буфер.

9. Способ получения конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, включающий стадии:

(a) взаимодействие иминного фрагмента в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе в отсутствие буфера для образования модифицированного цитотоксического агента, содержащего модифицированный иминный фрагмент, представленный следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью; и

(b) взаимодействие модифицированного цитотоксического агента со связывающим клетки агентом с образованием конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент,

где связывающий клетки агент представляет собой антитело или фрагмент антитела; D представляет собой иминсодержащее бензодиазепиновое соединение; и L является линкером, причем

D представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

R₁, R₂, R₃, R₄, R₁', R₂', R₃' и R₄' все представляют собой Н;

R₆ представляют собой -ОМе;

X₁' и Y₁' оба представляют собой -Н;

А и А' представляют собой -О-;

L'' и L''' оба представляют собой -Н;

L' представлен следующей формулой:

-NR₅-P₁-C(=O)-(CR_aR_b)_s-C(=O)- (В1');

-NR₅-P₁-C(=O)-Cy-(CR_aR_b)_s1'-C(=O)- (В2');

-C(=O)-P₁-NR₅-(CR_aR_b)_s-C(=O)- (С1') или

-C(=O)-P₁-NR₅-Cy-(CR_aR_b)_s1'-C(=O)- (С2'),

где:

каждый из R_a и R_b в каждом случае независимо представляет собой -Н, (C₁-С₃)алкил или заряженный заместитель или ионизируемую группу Q;

s представляет собой целое число от 1 до 6;

s1' представляет собой 0 или целое число от 1 до 6; и

Су представляет собой циклический алкил с 5 или 6 кольцевыми атомами углерода, необязательно замещенный галогеном, -ОН, (С₁-С₃)алкилом, (С₁-С₃)алкокси или галоген(С₁-С₃)алкилом;

P₁ представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

G представляет собой -СН- или -N-;

R₅ в каждом случае независимо представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;

L представлен следующей структурной формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, где:

s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D;

s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;

R₂₃ и R₂₄ в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил;

m' представляет собой целое число от 0 до 10; и

R^h' представляет собой Н или необязательно замещенный алкил.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где от 0,5 до 5 эквивалентов соли бисульфита или от 0,25 до 2,5 эквивалентов соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

11. Способ по п. 10, где от 0,8 до 2,0 эквивалентов соли бисульфита или от 0,4 до 1,0 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

12. Способ по п. 10, где от 1,1 до 1,6 эквивалентов соли бисульфита или от 0,55 до 0,8 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

13. Способ по п. 10, где 1,4 эквивалента соли бисульфита или 0,7 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

14. Способ по п. 1, где реакцию стадии (а) проводят при рН от 2,9 до 3,7 и от 1,0 до 1,8 эквивалента соли бисульфита или от 0,5 до 0,9 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

15. Способ по п. 1, где реакцию стадии (а) проводят при рН от 3,1 до 3,5 и от 1,1 до 1,6 эквивалента соли бисульфита или от 0,55 до 0,8 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

16. Способ по п. 1, где реакцию на стадии (а) проводят при рН 3,3 и 1,4 эквивалента бисульфитной соли или 0,7 эквивалента метабисульфитной соли приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

17. Способ по любому из пп. 1-16, где реакцию стадии (а) проводят в смеси органического растворителя и воды.

18. Способ по п. 17, где реакцию стадии (а) проводят в смеси диметилацетамида (ДМА) и воды.

19. Способ по п. 17, где реакцию стадии (а) проводят в смеси ДМА и воды, где объемное соотношение ДМА и воды составляет 1:1.

20. Способ по любому из пп. 1-19, где на стадии (а) иминсодержащий цитотоксический агент приводят в реакцию с бисульфитом натрия.

21. Способ по любому из пп. 1-19, где на стадии (а) иминсодержащий цитотоксический агент приводят в реакцию с метабисульфитом натрия.

22. Способ по любому из пп. 1-21, где модифицированный цитотоксический агент не очищают перед реакцией со связывающим клетки агентом на стадии (b).

23. Способ по любому из пп. 1-21, где реакцию на стадии (b) проводят при рН от 4 до 9.

24. Способ по п. 23, где реакцию на стадии (b) проводят при рН от 5 до 8,5.

25. Способ по п. 23, где реакцию на стадии (b) проводят при рН от 5,5 до 6,5.

26. Способ по любому из пп. 1-25, где конъюгат очищают фильтрацией в тангенциальном потоке с получением очищенного конъюгата.

27. Способ по п. 26, где очищенный конъюгат готовят в буфере для состава, содержащем бисульфитную соль.

28. Способ по п. 27, где буфер для состава содержит от 10 до 200 мкМ бисульфита натрия.

29. Способ по п. 27, где буфер для состава содержит от 40 до 80 мкМ бисульфита натрия.

30. Способ по п. 27, где буфер для состава содержит 50 мкМ бисульфита натрия.

31. Способ по любому из пп. 27-30, где буфер для состава имеет рН от 4 до 5.

32. Способ по п. 31, где буфер для состава имеет рН 4,2.

33. Способ по любому из пп. 1-32, где R_a и R_b оба представляют собой Н; Су в формулах (В2') и (С2') представляет собой циклогексан; и R₅ представляет собой Н или Me.

34. Способ по п. 33, где s1' равен 0 или 1.

35. Способ по любому из пп. 1-34, где заряженный заместитель или ионизируемая группа Q представляют собой i) -SO₃H, -Z'-SO₃H, -ОРО₃Н₂, -Z'-OPO₃H₂, -РО₃Н₂, -Z'-PO₃H₂, -CO₂H, -Z'-CO₂H, -NR₁₁R₁₂ или -Z'-NR₁₁R₁₂ или их фармацевтически приемлемую соль; или ii) -N⁺R₁₄R₁₅R₁₆X^- или -Z'-N⁺R₁₄R₁₅R₁₆X^-; Z' представляет собой необязательно замещенный алкилен, необязательно замещенный циклоалкилен или необязательно замещенный фенилен; каждый из R₁₄-R₁₆ независимо представляет собой необязательно замещенный алкил; а X^- представляет собой фармацевтически приемлемый анион.

36. Способ по п. 35, где Q представляет собой -SO₃H или ее фармацевтически приемлемую соль.

37. Способ по любому из пп. 1-36, где P₁ представляет собой пептид, содержащий от 2 до 10 аминокислотных остатков.

38. Способ по п. 37, где P₁ представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.

39. Способ по п. 38, где P₁ представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-тозил-Arg, Phe-N9-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe и Gin-Ala.

40. Способ по п. 39, где P₁ представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.

41. Способ по любому из пп. 1-40, где R₅ представляет собой -Н или (С₁-С₃)алкил.

42. Способ по любому из пп. 1-32, где D представлен следующей структурной формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью.

43. Способ по любому из пп. 1-42, где R₂₃ и R₂₄ оба представляют собой Н; и m' представляет собой целое число от 1 до 6.

44. Способ по любому из пп. 1-43, где R^h' представляет собой Н.

45. Способ по любому из пп. 1-42, где L представлен следующей структурной формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью.

46. Способ по любому из пп. 1-32, где иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, а модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью.

47. Способ по п. 46, где модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

или их натриевой или калиевой солью.

48. Способ по п. 47, где модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:

49. Способ по любому из пп. 1-48, где связывающий клетки агент представляет собой антитело, имеющее сконструированный остаток цистеина.

50. Способ по п. 49, где сконструированный остаток цистеина находится в позиции 442 согласно нумерации EU/OU одной или обеих тяжелых цепей антитела.

51. Способ по п. 50, где сконструированный остаток цистеина находится в обеих тяжелых цепях.

52. Способ по п. 50, где сконструированный остаток цистеина находится в одной из тяжелых цепей.

53. Способ по любому из пп. 1-52, где антитело представляет собой моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, антитело с измененной поверхностью или антитело человека.

54. Способ по п. 53, где антитело представляет собой антитело против CD123.

55. Способ по п. 54, где антитело против CD123 содержит область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и область легкой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

56. Способ по любому из пп. 1-32, отличающийся тем, что он предназначен для получения конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, представленного следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, при этом способ включает стадии:

(a) взаимодействие иминного фрагмента в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе при рН от 3,1 до 3,5 с образованием модифицированного цитотоксического агента, представленного следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью; и

(b) взаимодействие модифицированного цитотоксического агента или его фармацевтически приемлемой соли со связывающим клетки агентом Ab с образованием конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, где:

Ab представляет собой антитело против CD123, содержащее область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и область легкой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и

w равен 1 или 2.

57. Способ по п. 56, где реакцию на стадии (а) проводят при рН от 3,2 до 3,4.

58. Способ по п. 56, где реакцию на стадии (а) проводят при рН 3,3.

59. Способ по любому из пп. 56-58, где реакцию на стадии (а) проводят в присутствии буферного раствора.

60. Способ по п. 59, где буферный раствор представляет собой цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер или фосфатный буфер.

61. Способ по п. 60, где буфер представляет собой сукцинатный буфер.

62. Способ по любому из пп. 56-61, где от 1,1 до 1,6 эквивалента соли бисульфита или от 0,55 до 0,8 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

63. Способ по п. 62, где от 1,3 до 1,5 эквивалента соли бисульфита или от 0,65 до 0,75 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

64. Способ по п. 62, где 1,4 эквивалента соли бисульфита или 0,7 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

65. Способ по любому из пп. 56-64, где реакцию стадии (а) проводят при рН от 3,2 до 3,4 и от 1,3 до 1,5 эквивалента соли бисульфита натрия приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.

66. Способ по любому из пп. 56-65, где реакцию стадии (а) проводят в смеси диметилацетамида (ДМА) и воды.

67. Способ по любому из пп. 56-66, где реакцию на стадии (а) проводят при комнатной температуре.

68. Способ по любому из пп. 56-67, где модифицированный цитотоксический агент не очищают перед реакцией со связывающим клетки агентом на стадии (b).

69. Способ по любому из пп. 56-68, где реакцию на стадии (b) проводят при рН от 5,5 до 6,5.

70. Способ по любому из пп. 56-69, где конъюгат очищают фильтрацией в тангенциальном потоке с получением очищенного конъюгата.

71. Способ по п. 70, где очищенный конъюгат готовят в буфере для состава, содержащем от 40 до 80 мкМ бисульфита натрия, имеющего рН от 4 до 5.

72. Способ по п. 71, где буфер для состава содержит 50 мкМ бисульфита натрия, имеющего рН 4,2.