Вирусные векторы, кодирующие рекомбинантные варианты fix с повышенной экспрессией, для генотерапии гемофилии в

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полинуклеотиду, кодирующему белок фактора IX, и может быть использовано в медицине. Полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17, может быть использован в составе вектора для эффективной генной терапии гемофилии B млекопитающих. 2 н. и 24 з.п. ф-лы, 25 ил., 7 табл., 6 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка испрашивает преимущество предварительной заявки США № 62/509,616, поданной 22 мая 2017 года, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки во всех целях.

ССЫЛКА НА «ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ», ТАБЛИЦУ ИЛИ КОМПЬЮТЕРНУЮ ПРОГРАММУ, ПРИЛОЖЕНИЕ С ПЕРЕЧНЕМ ПРЕДСТАВЛЕНЫ НА КОМПАКТ-ДИСКЕ

[0002] Данное раскрытие включает в себя посредством ссылки представленную в данном документе копию текста Перечня последовательностей, созданную 21 мая 2018 года и озаглавленную 008073_5117_WO_Sequence_Listing.txt, размер которой составляет 73 килобайта.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Свертывание крови происходит по сложному и динамическому биологическому пути взаимозависимых биохимических реакций, называемых каскадом коагуляции. Фактор свертывания крови VIII (FVIII) и фактор IX (FIX) являются ключевыми компонентами в каскаде. Фактор VIII рекрутируется в места кровотечения и образует комплекс Xase с активированным фактором IX и фактором X (FX). Комплекс Xase активирует FX, который в свою очередь активирует превращение протромбина в тромбин, который затем активирует другие компоненты в каскаде коагуляции для создания стабильного сгустка (обзор представлен Saenko et al., Trends Cardiovasc. Med., 9:185-192 (1999); Lenting et al., Blood, 92:3983-3996 (1998)).

[0004] Гемофилия В - это врожденное, связанное с Х-хромосомой нарушение свертывания крови, характеризующееся дефицитом активности фактора IX. Как правило, сниженная активность фактора VIII/ фактора IX ингибирует контур положительной обратной связи в каскаде коагуляции. Это приводит к неполной коагуляции, которая проявляется в виде эпизодов кровотечения с увеличенной продолжительностью, обширных кровоподтеков, спонтанного орального и носового кровотечения, ригидности суставов и хронической боли и, возможно, внутреннего кровотечения и анемии в тяжелых случаях. (Zhang et al., Clinic. Rev. Allerg. Immunol., 37:114-124 (2009)).

[0005] Обычно гемофилию В лечат заместительной терапией с фактором IX, которая заключается в введении белка фактора IX (например, фактора IX, полученного из плазмы или рекомбинантно продуцированного) человеку с гемофилией В. Фактор IX вводят профилактически для предотвращения или уменьшения частоты эпизодов кровотечения, в ответ на острый эпизод кровотечения, и/или периоперационно для контроля над кровотечением во время операции. Тем не менее, есть несколько нежелательных особенностей заместительной терапии фактором IX.

[0006] Во-первых, заместительная терапия фактором IX используется для лечения или контроля гемофилии В, но не лечит лежащий в ее основе дефицит фактора IX. Из-за этого люди с гемофилией B нуждаются в заместительной терапии фактором IX в течение всей своей жизни. Непрерывное лечение является дорогостоящим и требует от человека соблюдения строгого режима, поскольку пропуск даже всего нескольких профилактических доз может иметь серьезные последствия для индивидуумов с тяжелой формой гемофилии B.

[0007] Во-вторых, поскольку обычные продукты фактора IX имеют относительно короткий период полувыведения in vivo, около 24 часов, профилактическая заместительная терапия фактором IX требует введения два или три раза в неделю. Соблюдение подобного режима в течение всей жизни может быть для индивидуума обременительным. Препараты фактора IX пролонгированного действия третьего поколения могут снижать частоту введения, однако профилактическая заместительная терапия фактором FIX этими препаратами по-прежнему требует ежемесячного, еженедельного или более частого применения все время. Например, профилактическое лечение бета-пеголом Nonacog [пегилированный рекомбинантный фактор IX] (Novo Nordisk, ожидается одобрение регулирующих органов США и ЕФ) по-прежнему требует еженедельного введения (Collins P.W., et al., Blood, 124(26):3880-86 (2014)). Более того, долгосрочные эффекты химически модифицированных биопрепаратов (например, пегилированных полипептидов) еще полностью не изучены.

[0008] В-третьих, у до 5% пациентов с тяжелой формой гемофилии В в ответ на заместительную терапию фактором IX вырабатываются антитела, ингибирующие фактор IX, что делает терапию неэффективной (Osooli and Berntorp, J. Intern. Med., 277(1):1-15 (2015)). В отличие от обходной терапии фактором VIII, которая может быть использована для лечения пациентов с гемофилией А, у которых вырабатываются антитела, ингибирующие фактор VIII, обходной терапии фактором IX для лечения гемофилии В не существует.

[0009] В-четвертых, заместительная терапия фактором IX стоит дорого, в диапазоне от 1000 до 3000 долларов США за дозу, в зависимости от веса пациента (доступные онлайн материалы Американской федерации гемофилии (Hemophilia Federation of America)). Таким образом, при дозировке два раза в неделю заместительная терапия фактором IX может стоить до 300 000 долларов в год.

[0010] Генная терапия имеет большие перспективы в отношении лечения гемофилии В, потому что она позволит устранить недостаточную экспрессию функциональной активности фактора IX (например, из-за миссенс- или нонсенс-мутации), являющуюся причиной состояний, а не обеспечит индивидууму одноразовую дозу активности фактора IX. Из-за различий в механизме предоставления фактора IX по сравнению с заместительной терапией фактором IX, однократное введение вектора генной терапии фактором IX может обеспечить индивидууму достаточные уровни фактора IX в течение нескольких лет, если не дольше. Это снижает стоимость лечения и устраняет необходимость постоянного соблюдения пациентом режима лечения.

[0011] Было представлено доказательство концепции генной терапии фактором IX при гемофилии В. См., например, Manno C.S., et al., Nat Med., 12(3):342-47 (2006). Однако остаются вопросы относительно того, могут ли терапевтически эффективные количества фактора IX экспрессироваться в течение достаточных периодов времени. См., например, Giangrande, Semin Thromb Hemost. 42(5):513-17 (2016).

[0012] Было предпринято несколько попыток сконструировать кодон-оптимизированный фактор IX. Например, в WO 2006/036502 описан кодон-оптимизированный вектор AAV генной терапии фактора IX с энхансером ApoE HCR-1 и промотором альфа-1-антитрипсином (AAT). Аналогичным образом, в WO 2014/064277 и WO 2016/146757 раскрыты кодон-оптимизированные векторы AAV генной терапии фактора VIII и фактора IX, которые включают одну или несколько копий специфического для печени регуляторного элемента SERPIN. Наконец, в WO 2016/210170 описаны кодон-оптимизированные векторы AAV генной терапии фактора IX с энхансером ApoE HCR-1 и промотором альфа-1-антитрипсина (AAT).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РАСКРЫТИЯ

[0013] Соответственно, существует потребность в улучшенных конструкциях для генной терапии фактором IX. Например, существует потребность в синтетических кодон-измененных нуклеиновых кислотах, кодирующих фактор IX, которые более эффективно упаковываются и доставляются посредством векторов генной терапии. Также существует потребность в синтетических кодон-измененных нуклеиновых кислотах, которые более эффективно экспрессируют фактор IX. Также существует потребность в кодон-измененных нуклеиновых кислотах, кодирующих полипептиды фактора IX с улучшенными свойствами сворачивания, улучшенной секрецией из экспрессирующих клеток и/или повышенной активностью по сравнению с фактором IX дикого типа. Такие кодирующие фактор IX кодон-измененные нуклеиновые кислоты позволяют улучшить лечение дефицита фактора IX (например, гемофилии В). Указанные выше дефицитные состояния и другие проблемы, связанные с лечением дефицита фактора IX (например, гемофилии В), уменьшаются или устраняются раскрытыми кодон-измененными нуклеиновыми кислотами, кодирующими белки фактора IX.

[0014] В одном аспекте описаны композиции нуклеиновых кислот (например, кодон-измененные полинуклеотиды), кодирующие варианты фактора IX и фактора IX. Композиции нуклеиновых кислот включают полинуклеотиды с высокой идентичностью последовательностей с последовательностями CS02, CS03, CS04, CS05 и CS06, кодирующими фактор IX, в соответствии с описанным в данном документе. Композиции нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, обеспечивают повышенную экспрессию фактора IX относительно кодирующих последовательностей фактора IX дикого типа. Композиции нуклеиновых кислот также позволяют увеличить производство вирионов генной терапии на основе AAV. В некоторых вариантах осуществления композиции нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, имеют пониженное содержание GC и/или включают меньшее количество динуклеотидов CpG по сравнению с последовательностями дикого типа, кодирующими фактор IX.

[0015] В некоторых вариантах осуществления композиция нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотид, кодирующий фактор IX, который имеет нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 95% (например, идентичностью последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) относительно раскрытой последовательности, выбранной из CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), CS03-MP -NA (SEQ ID NO: 14), CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), CS05 -MP-NA (SEQ ID NO: 16), CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9) и CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17).

[0016] В некоторых вариантах осуществления композиция нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотид, кодирующий фактор IX, который имеет нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 95% (например, с идентичностью последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) относительно раскрытой последовательности, кодирующей легкую цепь фактора IX (например, CS02-LC-NA (SEQ ID NO: 42), CS03-LC-NA (SEQ ID NO: 44), CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 46), CS05-LC-NA (SEQ ID NO: 48) или CS06-LC-NA (SEQ ID NO: 50)), и раскрытой последовательности, кодирующей тяжелую цепь фактора IX (например, CS02-HC-NA ( SEQ ID NO: 41), CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43), CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 45), CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 47) или CS06-HC -НА (SEQ ID NO: 49)).

[0017] В некоторых вариантах осуществления композиция нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора IX, имеющий легкую цепь, тяжелую цепь и полипептидный линкер, соединяющий С-конец легкой цепи с N-концом тяжелой цепи (например, пептид активации). Легкая цепь полипептида фактора IX кодируется первой нуклеотидной последовательностью с высокой идентичностью последовательности с одной из CS02-LC-NA (SEQ ID NO: 42), CS03-LC-NA (SEQ ID NO: 44), CS04- LC-NA (SEQ ID NO: 46), CS05-LC-NA (SEQ ID NO: 48) и CS06-LC-NA (SEQ ID NO: 50). Тяжелая цепь полипептида фактора IX кодируется второй нуклеотидной последовательностью с высокой идентичностью последовательности с одной из CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 41), CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43), CS04- HC-NA (SEQ ID NO: 45), CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 47) и CS06-HC-NA (SEQ ID NO: 49). Полипептидный линкер содержит сайт расщепления протеазой (например, два сайта расщепления фактора XIa).

[0018] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов, описанных выше, полипептидный линкер имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью последовательности с пептидом активации фактора IX дикого типа FIX-AP-AA (SEQ ID NO: 56; аминокислоты 192-226 из FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)). В некоторых вариантах осуществления полипептидный линкер кодируется третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей высокую идентичность последовательности с одной из CS02-AP-NA (SEQ ID NO: 57), CS03-AP-NA (SEQ ID NO: 58), CS04- AP-NA (SEQ ID NO: 59), CS05-AP-NA (SEQ ID NO: 60) и CS06-AP-NA (SEQ ID NO: 61).

[0019] В некоторых вариантах осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, описанные в данном документе, кодируют препрополипептид фактора IX, например, в котором кодированный белок фактора IX содержит сигнальный пептид и пропептид. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид, пропептид или и сигнальный пептид и пропептид кодируются кодон-измененной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид, пропептид или и сигнальный пептид и пропептид кодируются последовательностью дикого типа, тогда как часть нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелый одноцепочечный полипептид фактора IX (например, FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10); аминокислоты 47-461 из FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)) являются кодон-измененными.

[0020] В некоторых вариантах осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, описанные в данном документе, кодируют вариантный полипептид фактора IX, например, имеющий одну или несколько аминокислотных замен относительно аминокислотной последовательности фактора IX дикого типа (например, FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2) или FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10)). В некоторых вариантах осуществления вариант фактора IX представляет собой вариант гиперактивного фактора IX с повышенной активностью фактора IX по сравнению с фактором IX дикого типа. В конкретном варианте осуществления кодируемый полипептид фактора IX имеет аминокислотную замену R384L, т. н. вариант «Падуя» (относительно препрополипипептидной последовательности фактора IX FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2), аминокислотную замену R338L относительно зрелой одноцепочечной последовательности фактора IX FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10)).

[0021] В одном аспекте описаны способы лечения гемофилии B. Способы включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, композиции нуклеиновой кислоты (например, кодон-измененной полинуклеотидной конструкции фактора IX), описанной в данном документе (например, полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с кодирующей последовательностью CS02, CS03, CS04, CS05 или CS06 фактора IX). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная конструкция фактора IX представляет собой вектор генной терапии млекопитающих в соответствии с описанным в данном документе. В конкретном варианте осуществления полинуклеотидная конструкция фактора IX представляет собой вектор аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления вектор генной терапии включает в себя одну или несколько копий специфичного для печени регуляторного контрольного элемента (например, от 1 до 3 копий регуляторного контрольного элемента CRM8).

[0022] В одном аспекте описаны способы получения частицы аденоассоциированного вируса (AAV). Способ включает введение композиции нуклеиновой кислоты (например, кодон-измененной полинуклеотидной конструкции фактора IX), описанной в данном документе (например, полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с кодирующей последовательностью фактора IX CS02, CS03, CS04, CS05 или CS06) в клетку-хозяина млекопитающего, в которой полинуклеотид способен к репликации в клетке-хозяине млекопитающего.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0023] На фигуре 1 показаны типичные конструкции для генной терапии фактором IX в соответствии с некоторыми вариантами реализации. Элементы последовательности для самокомплементарных (A, B) и одноцепочечных (C, D) векторов показаны без (A, C) и с (B, D) специфичными для печени цис-регуляторными модулями (CRM8).

[0024] На фиг. 2 показана кодирующая последовательность фактора IX дикого типа (SEQ ID NO: 1) для инвентарного номера CCDS14666.1 («FIX-FL-NA»).

[0025] На фиг. 3 показаны аминокислотные последовательности двух препрополипептидных изоформ фактора IX дикого типа, экспрессируемых у людей. На фиг. 3А показана аминокислотная последовательность дикого типа для первой более длинной изоформы препрополипептида фактора IX (SEQ ID NO: 2), соответствующей номеру доступа UniProt P00740 и номеру доступа NCBI NP_000124.1 («FIX-FL-AA»). На фиг. 3В показана аминокислотная последовательность дикого типа для второй более короткой изоформы препрополипептида фактора IX (SEQ ID NO: 3), соответствующей номеру доступа NCBI NP_001300842.1 («FIX2-FL-AA»).

[0026] На фиг. 4 показана аминокислотная последовательность варианта Падуя (R384L) фактора IX (SEQ ID NO: 4; «FIXp-FL-AA»).

[0027] На фиг. 5 показана кодон-измененная нуклеотидная последовательность CS02 (SEQ ID NO: 5), кодирующая вариант фактора IX с аминокислотной заменой R384L (CS02-FL-NA), в соответствии с некоторыми вариантами реализации.

[0028] На фиг. 6 показана кодон-измененная нуклеотидная последовательность CS03 (SEQ ID NO: 6), кодирующая вариант фактора IX с аминокислотной заменой R384L (CS03-FL-NA), в соответствии с некоторыми вариантами реализации.

[0029] На фиг. 7 показана кодон-измененная нуклеотидная последовательность CS04 (SEQ ID NO: 7), кодирующая вариант фактора IX с аминокислотной заменой R384L (CS04-FL-NA), в соответствии с некоторыми вариантами реализации.

[0030] На фиг. 8 показана кодон-измененная нуклеотидная последовательность CS05 (SEQ ID NO: 8), кодирующая вариант фактора IX с аминокислотной заменой R384L (CS05-FL-NA), в соответствии с некоторыми вариантами реализации.

[0031] На фиг. 9 показана кодон-измененная нуклеотидная последовательность CS06 (SEQ ID NO: 9), кодирующая вариант фактора IX с аминокислотной заменой R384L (CS06-FL-NA), в соответствии с некоторыми вариантами реализации.

[0032] Фиг. 10 иллюстрирует уровни антигена FIX у мышей дикого типа, которым инъецировали геннотерапевтическую конструкцию CS02, имеющую 0, 1, 2 или 3 копии печеночно-специфического цис-регуляторного контрольного элемента CRM8 в дозе 2×10E11 мкг/кг массы тела.

[0033] На фиг. 11 показаны аминокислотные последовательности двух одноцепочечных изоформ белка фактора IX дикого типа (например, с отсутствием сигнала и пропептидов), экспрессированных у людей. На фиг. 11А показана аминокислотная последовательность дикого типа для первой более длинной изоформы препрополипептида фактора IX (SEQ ID NO: 10), соответствующей номеру доступа UniProt P00740 и номеру доступа NCBI NP_000124.1 («FIX-MA-AA»). На фиг. 11В показана аминокислотная последовательность дикого типа для второй более короткой изоформы препрополипептида фактора IX (SEQ ID NO: 11), соответствующей номеру доступа NCBI NP_001300842.1 («FIX2-MA-AA»).

[0034] На фиг. 12 показана одноцепочечная аминокислотная последовательность фактора IX, вариант Падуя (R338L) (SEQ ID NO: 12; «FIXp-MP-AA»).

[0035] На фиг. 13 показана кодон-измененная нуклеотидная последовательность CS02 (SEQ ID NO: 13), кодирующая одноцепочечный вариант фактора IX с аминокислотной заменой R338L (CS02-MP-NA), в соответствии с некоторыми вариантами реализации.

[0036] На фиг. 14 показана кодон-измененная нуклеотидная последовательность CS03 (SEQ ID NO: 14), кодирующая одноцепочечный вариант фактора IX с аминокислотной заменой R338L (CS03-MP-NA), в соответствии с некоторыми вариантами реализации.

[0037] На фиг. 15 показана кодон-измененная нуклеотидная последовательность CS04 (SEQ ID NO: 15), кодирующая одноцепочечный вариант фактора IX с аминокислотной заменой R338L (CS04-MP-NA), в соответствии с некоторыми вариантами реализации.

[0038] На фиг. 16 показана кодон-измененная нуклеотидная последовательность CS05 (SEQ ID NO: 16), кодирующая одноцепочечный вариант фактора IX с аминокислотной заменой R338L (CS05-MP-NA), в соответствии с некоторыми вариантами реализации.

[0039] На фиг. 17 показана кодон-измененная нуклеотидная последовательность CS06 (SEQ ID NO: 17), кодирующая одноцепочечный вариант фактора IX с аминокислотной заменой R338L (CS06-MP-NA), в соответствии с некоторыми вариантами реализации.

[0040] На фиг. 18 показаны последовательности нуклеиновых кислот (NA), кодирующие препропептид (PPP) ряда конструкций, описанных в настоящем документе, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления.

[0041] На фиг. 19 показаны последовательности нуклеиновых кислот (NA), кодирующие сигнальный пептид (SP) для ряда конструкций, описанных в настоящем документе, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления.

[0042] На фиг. 20 показаны последовательности нуклеиновых кислот (NA), кодирующие пропептид (PP) для ряда конструкций, описанных в настоящем документе, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления.

[0043] На фиг. 21 показана аминокислотная последовательность (AA) препропептида FIX (PPP).

[0044] На фиг. 22 показана аминокислотная последовательность (AA) сигнального пептида FIX (SP).

[0045] На фиг. 23 показана аминокислотная последовательность (AA) пропептида FIX (PP).

[0046] На фиг. 24 показана последовательность нуклеиновой кислоты последовательности CRM8 (SEQ ID NO: 39).

[0047] На фиг. 25А и В показана последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ РАСКРЫТИЯ

Введение

[0048] Генная терапия на основе AAV имеет большие перспективы для лечения гемофилии. Что касается гемофилии В, первые клинические данные обнадеживают, так как уровни FIX около 10% могут поддерживаться по меньшей мере у некоторых пациентов в течение более 1 года. Например, в первоначальных исследованиях на людях было показано, что катеризация печеночных артерий конструкций AVV-FIX приводила к временной экспрессии фактора IX in vivo. Kay M. et al., Nat Genet. 24(3):257-61 (2000). Однако трансдукция привела к умеренной активации иммунной системы в отношении капсидных антигенов, полученных из AAV. Manno C.S. et al., Nat Med. 12(3):342-47 (2006) and Mingozzi F. et al., Nat Med. 13(4):419-22 (2007).

[0049] Невирусные векторы могут быть менее иммуногенными, поскольку они основаны на доставке депротеинизированной ДНК или ДНК, связанной с неантигенными носителями (например, инертными полимерами, липидами или наночастицами). Однако показатели клеточной трансфекции невирусных векторов ниже, чем у вирусных векторов доставки. Кроме того, длительной экспрессии из невирусных векторов препятствует присутствие бактериальных последовательностей, используемых для крупномасштабного производства конструкций.

[0050] Тем не менее, эти проблемы не могут быть решены путем простого введения более высоких доз конструкции в ходе генной терапии. Согласно современным знаниям, векторная доза вектора генной терапии на основе AAV не должна превышать 2 × 10¹² мкг/кг массы тела. Это связано с тем, что при таких высоких дозах запускается иммунный ответ Т-клеток, который разрушает трансдуцированные клетки, вследствие чего экспрессия трансгена уменьшается или даже прекращается. Следовательно, необходимы стратегии улучшения экспрессии FIX, чтобы сделать генную терапию FIX жизнеспособным терапевтическим вариантом для пациентов с гемофилией B.

[0051] Таким образом, улучшенные полипептидные конструкции фактора IX, которые поддерживают улучшенную экспрессию и активность фактора IX, улучшат оба терапевтических подхода. Например, способы доставки вируса могут быть улучшены путем уменьшения начальной дозы конструкции, тем самым уменьшая стимуляцию иммунной системы субъекта. Способы, основанные на введении депротеинизированной ДНК, могли бы быть улучшены путем поддержки большей активности фактора IX с меньшим количеством копий терапевтического полинуклеотида.

[0052] Настоящее раскрытие относится к открытию кодон-измененных кодирующих последовательностей варианта фактора IX, которые решают эти и другие проблемы, связанные с генной терапией фактора IX. Например, описанные в данном документе полинуклеотиды обеспечивают заметно улучшенную экспрессию и активность фактора IX у млекопитающего-хозяина. В некоторых вариантах реализации данные преимущества реализуются путем использования кодирующих фактор IX полинуклеотидов с высокой идентичностью последовательности с кодон-измененными конструкциями CS02, CS03, CS04, CS05 и CS06. В некоторых вариантах осуществления такие последовательности включают значительно меньше динуклеотидов CpG по сравнению с конструкциями дикого типа, как более полно описано ниже.

[0053] Преимущественно описанные в данном документе последовательности фактора IX с кодон-измененными конструкциями CS02, CS03, CS04, CS05 и CS06 обеспечивают повышенную экспрессию фактора IX in vivo по сравнению с эквивалентными последовательностями дикого типа. Например, пример 1 показывает, что самокомплементарные векторы AAV, несущие кодирующую последовательность фактора IX (R384L) с кодон-измененными конструкциями CS02, CS03, CS04, CS05 и CS06, обеспечивают повышение фактора IX в 20-40 раз in vivo относительно самокомплементарного вектора AAV, несущего кодирующую последовательность фактора IX дикого типа. Аналогично, наблюдается 2-4-кратное увеличение экспрессия фактора IX относительно таковой у самокомплементарного вектора AAV, несущего кодирующую последовательность фактора IX дикого типа (R384L) (таблица 2).

[0054] Преимущественно, улучшенная активность фактора IX, генерируемая в кодон-измененных последовательностях CS02, CS03, CS04, CS05 и CS06, может быть дополнительно улучшена путем введения одной или нескольких копий специфичного для печени регуляторного элемента против хода транскрипции относительно кодирующей последовательностью фактора IX. Например, как показано в примерах 2 и 3, включение одного или нескольких специфичных для печени регуляторных контрольных элементов CRM8 в самокомплементарный вектор AAV фактора IX дополнительно увеличивало экспрессию фактора IX в 2-3 раза в мышиной модели и 2-13 раз в гепатоцитах человека (таблицы 3 и 4 соответственно). Аналогичным образом, включение одной или нескольких копий специфического для печени регуляторного контрольного элемента CRM8 в одноцепочечный вектор AAV фактора IX повышает активность фактора IX в 2 раза in vivo (мышиная модель; таблица 5) и до 26 раз в гепатоцитах человека (таблица 6).

[0055] Удивительно, но в то время как самокомплементарные векторы AAV, кодирующие кодон-измененный полипептид фактора IX, в котором отсутствуют специфические для печени регуляторные контрольные элементы CRM8, обеспечивали большее увеличение экспрессии фактора IX, чем аналогичные одноцепочечные векторы AAV (сравните 6,2-кратное увеличение активности FIX, обеспечиваемое CS06-CRM.0-scV с 3,9-кратным увеличением активности фактора IX, обеспечиваемого CS06-CRM.0-ssV (SEQ ID NO: 40) в таблице 6), одноцепочечные векторы фактора IX AAV, содержащие несколько копий специфических для печени регуляторных контрольных элементов CRM8, значительно превосходили аналогичные самокомплементарные векторы AAV (сравните 12,8-кратное увеличение активности фактора IX, обеспечиваемого CS02-CRM8.3-scV, по сравнению с CS02-CRM8.0-scV, в таблице 4 с 16.8-кратным увеличением активности фактора IX, обеспечиваемым CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40), по сравнению с CS06-CRM8.0-scV, в таблице 6).

Определения

[0056] В контексте данного документа, следующие термины имеют присвоенные им значения, если не указано иное.

[0057] Используемые в данном документе термины «фактор IX» и «FIX» (где «IX» относится к римским цифрам для обозначения цифры «девять») используются взаимозаменяемо и относятся к любому белку с активностью фактора IX (например, активному FIX, нередко называеммому называемому «FIXa») или предшественнику белка (например, пробелку или препробелку, часто называемым pFIX и ppFIX) с активностью фактора IX, особенно активностью расщепления фактора X в присутствии фактора VIII, например, измеренного с использованием одностадийного анализа свертывания фактора IX, описанного в главе 2.7.11 Европейской фармакопеи 9.0, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки

[0058] Фактор IX транслируется в виде неактивного одноцепочечного полипептида, который включает в себя сигнальный пептид, пропептид, легкую цепь, пептид активации и тяжелую цепь, часто называемого препрополипептидом фактора IX. Препропептид фактора IX подвергается посттрансляционной обработке с образованием активного белка фактора IX (например, FIXa). Эта обработка включает удаление (например, расщеплением) сигнального пептида с последующим удалением (например, расщеплением) пропептида с образованием одноцепочечного зрелого полипептида фактора IX, содержащего легкую цепь фактора IX и тяжелую цепь фактора IX, который по-прежнему неактивен. Зрелый полипептид фактора IX далее расщепляется для удаления пептида активации между легкой цепью фактора IX и тяжелой цепью фактора IX, образуя активный белок фактора IX (например, FIXa). Легкая цепь фактора IX и тяжелая цепь фактора IX остаются связанными посредством дисульфидной связи.

[0059] Например, препробелок человеческого фактора IX дикого типа сначала расщепляется для высвобождения кодированного сигнального пептида (аминокислоты 1-28 FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)), образуя первую одноцепочечную цепь пробелка. Этот одноцепочечный пропептид затем расщепляется для высвобождения пропептида (аминокислоты 29-46 FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)) с образованием второго одноцепочечного пробелка (например, FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10) с обозначением «MP», обозначающим mature protein (зрелый белок)). Второй одноцепочечный пробелок затем дважды расщепляется между легкой цепью FIX и тяжелой цепью FIX фактором XIa для высвобождения пептида активации (аминокислоты 192-226 FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)). Таким образом формируется активный белок фактора IXa, состоящий из отдельных легких и тяжелых цепей, связанных посредством дисульфидной связи. Для получения дополнительной информации о структуре, функции и активации фактора IX см., например, Brandstetter H. et al. P.N.A.S. USA, 92(21):9796-800 (1995), Hopfner KP et al., Structure, 7(8):989-96 (1999), and Gailani D. et al., Thromb Res., 133 Suppl 1:S48-51 (2014), содержание которых включено в данный документ посредством ссылки во всей их полноте для любых целей.

[0060] В соответствии с описанным в данном документе, такой активный белок фактора IXa может включать в себя один или несколько вариантов, причем вариант R338L находит конкретное применение в некоторых вариантах осуществления. Это обозначается как «FIXp-MP-AA» (SEQ ID NO: 12), а последовательность нуклеиновой кислоты именуется в данном документе «FIXp-MP-NA»; «FIXp» означает включение варианта R338L Падуя в конечный белок. Следует отметить, что кодон-оптимизированные последовательности CS02-CS06, представленные в качестве примера в настоящем документе, кодируют белок FIXp, включая вариант R338L. Таким образом, специально включенным в определение FIX является FIXp.

[0061] Используемые в данном документе термины «полипептид фактора IX» и «полипептид FIX» относятся к полипептиду, обладающему активностью сериновой протеазы фактора IX при определенных условиях, например, как измерено с использованием одностадийного анализа свертывания фактора IX, описанного в главе 2.7.11 Европейской фармакопеи 9.0. Полипептиды фактора IX включают одноцепочечные полипептиды-предшественники (в том числе препрополипептиды фактора IX, пропептиды фактора IX и зрелые одноцепочечные полипептиды фактора IX), которые при активации путем посттрансляционной обработки, описанной выше, становятся активным белком фактора IX с активностью сериновой протеазы фактора IX, а также активными белками фактора IX сами по себе. В определение полипептидов фактора IX специально включены полипептиды фактора IX, включая вариант R338L. В типичном варианте осуществления полипептид человеческого фактора IX относится к полипептиду, который включает аминокислотную последовательность с высокой идентичностью последовательности (например, по меньшей мере, 85%, 90%, 95%, 99% или более) к части полипептида человеческого фактора IX дикого типа, который включает легкую и тяжелую цепи, FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10, показанная на фиг. 11A) или к части полипептида человеческого фактора IX, вариант Падуя, который включает легкую и тяжелую цепи, FIXp -MP-AA (SEQ ID NO: 12, показанная на фигуре 12).

[0062] Используемые в данном документе термины «легкая цепь фактора IX» или просто «легкая цепь» относятся к полипептиду в активированном белке фактора IXa, полученному из N-концевой части одноцепочечного полипептида фактора IX, содержащему модуль Gla, EGF-подобные домены 1 и 2 фактора IX. В типичном варианте осуществления аминокислоты 47-191 препрополипептида человеческого фактора IX (FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)) составляют легкую цепь фактора IX. В настоящем описании аминокислотная последовательность легкой цепи фактора IX дикого типа обозначается как FIX-LC-AA (SEQ ID NO: 62).

[0063] Используемый в данном документе термин «тяжелая цепь фактора IX» или просто «тяжелая цепь» относится к полипептиду в активированном белке фактора IXa, полученному из С-концевой части одноцепочечного полипептида фактора IX, содержащему домен пептидазы S1 фактора IX. В одном из примеров варианта осуществления аминокислоты 227-461 препрополипептида человеческого фактора IX (FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)) человека составляют тяжелую цепь фактора IX. В настоящем описании аминокислотная последовательность тяжелой цепи фактора IX дикого типа обозначается как FIX-HC-AA (SEQ ID NO: 63) и FIXp-HC-AA (SEQ ID NO: 64) при включении варианта R338L.

[0064] Обычно легкая и тяжелая цепи фактора IX экспрессируются в виде одной полипептидной цепи, например, вместе с пептидом активации. Однако в некоторых вариантах осуществления легкая цепь фактора IX и тяжелая цепь фактора VIII экспрессируются в виде отдельных полипептидных цепей (например, совместно экспрессируются) и восстанавливаются с образованием белка фактора IX (например, in vivo или in vitro). В целом, для целей настоящего изобретения, даже если две цепи экспрессируются раздельно, они, как правило, находятся на одном и том же векторе экспрессии (например, вирусном геноме), а не на разных векторах экспрессии.

[0065] Используемый в данном документе термин «пептид активации фактора IX» или просто «пептид активации» относится к пептиду, вырезанному из одноцепочечного полипептида фактора IX при активации белка фактора IXa. В типичном варианте осуществления аминокислоты 192-226 препрополипептида фактора IX человека (FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)) составляют пептид активации фактора IX. В настоящем описании аминокислотная последовательность пептида активации фактора IX дикого типа обозначается как FIX-AP-AA (SEQ ID NO: 56).

[0066] Используемый в данном документе термин «сигнальный пептид фактора IX» или просто «сигнальный пептид» относится к пептиду, вырезанному с N-конца препрополипептида фактора IX сигнальной пептидазой. Сигнальный пептид направляет новотранслированный препробелок фактора IX в эндоплазматический ретикулум. В типичном варианте осуществления аминокислоты 1-28 препрополипептида фактора IX человека (FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)) составляют сигнальный пептид фактора IX. В настоящем описании аминокислотная последовательность сигнального пептида фактора IX дикого типа обозначается как FIX-SP-AA (SEQ ID NO: 37). Ряд сигнальных пептидов в соответствии с изобретением показан на фигурах 19 и 22.

[0067] Используемый в данном документе термин «пропептид фактора IX» или просто «пропептид» относится к пептиду, вырезанному фурином с N-конца прополипептида фактора IX (например, после расщепления сигнального пептида). Пропептид включает сайт распознавания γ-карбоксилирования, который рекрутирует карбоксилазу в соседний модуль Gla, тем самым способствуя карбоксилированию глутаминовых остатков. В типичном варианте осуществления аминокислоты 29-46 препрополипептида фактора IX человека (FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)) составляют пропептид фактора IX. В настоящем описании аминокислотная последовательность пропептида фактора IX дикого типа обозначается как FIX-PP-AA (SEQ ID NO: 38).

[0068] Используемый в данном документе термин «препропептид фактора IX» или просто «препропептид» относится к агрегату сигнального пептида фактора IX и прополипептида. В типичном варианте осуществления аминокислоты 1-46 препрополипептида фактора IX человека (FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)) составляют препропептид фактора IX. В настоящем описании аминокислотная последовательность препропептида фактора IX дикого типа обозначается как FIX-PPP-AA (SEQ ID NO: 36) с последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной на фиг. 18, обозначаемой как FIX-PPP-NA (SEQ ID NO: 18) (с соответствующими FIXp-PPP-AA и FIXp-PPP-NA при использовании варианта R338L).

[0069] Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислот фактора IX относится к соответствующей аминокислоте в полноразмерной препрополипептидной последовательности человеческого фактора IX дикого типа (FIX-FL-AA), представленной в виде SEQ ID NO:2 на фигуре 3А. Таким образом, при упоминании аминокислотной замены в полипептиде фактора IX, раскрытом в данном документе, приведенное аминокислотное число относится к аналогичной (например, структурно или функционально эквивалентной) и/или гомологичной (например, эволюционно консервативной в первичной аминокислотной последовательности) аминокислоте в полноразмерной препрополипептидной последовательности фактора IX дикого типа. Например, аминокислотная замена R384L относится к замене R на L в положении 384 полноразмерной препропептидной последовательности человеческого фактора IX дикого типа (FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)), замене R на L в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX дикого типа (FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10), замене R на L в положении 346 полноразмерной последовательность изоформы 2 препропептида человеческого фактора IX дикого типа (FIX2-FL-AA (SEQ ID NO: 3)), замене R на L в положении 300 зрелой последовательности изоформы 2 препрополипептида человеческого фактора IX дикого типа (FIX2-FL-AA (SEQ ID NO: 3)) и замене R на L в положении 158 последовательности тяжелой цепи человеческого фактора IX дикого типа (FIX-HC-AA (SEQ ID NO: 63)). Таким образом, все данные номенклатуры описывают одну и ту же аминокислотную замену «Падуя» в разных конструкциях фактора IX.

[0070] В соответствии с описанным в данном документе, система нумерации аминокислот фактора IX зависит от того, включен ли препропептид фактора IX (например, аминокислоты 1-46 полноразмерной последовательности человеческого фактора IX дикого типа включительно сигнальным пептидом и пропептидом). При включении препропептида нумерация обозначается как pre-pro-peptide inclusive (препропептид включительно) или PPI. Если препропептид не включен, нумерация обозначается как pre-pro-peptide exclusive (препропептид исключен) или PPE. Например, R384L является нумерацией PPI для той же аминокислотной замены, что и R338L в нумерации PPE. Аналогично, аминокислотная нумерация фактора IX также зависит от изоформы фактора IX. Например, R384L является нумерацией изоформы 1 для той же аминокислотной замены, что и R346L в нумерации изоформы 2. Если не указано иное, вся аминокислотная нумерация относится к соответствующей аминокислоте в полноразмерной последовательности изоформы 1 человеческого фактора IX дикого типа (FIX-FL-AA), представленной в виде SEQ ID NO: 2 на фиг. 3А. Эта нумерация идентична для FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4), которая имеет такую же аминокислотную последовательность, кроме мутации R384L «Падуя».

[0071] Неограничивающие примеры полипептидов фактора IX дикого типа включают в себя препрофактор IX человека (например, учетный номер GenBank. NP_000124.1 (FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)) и NP_001300842.1 (FIX2-FL-AA (SEQ ID NO: 3)), соответствующий одноцепочечный фактор IX, в котором отсутствует сигнальный пептид (аминокислоты 1-28 препробелка) и/или пропептид (аминокислоты 29-46 препробелка) и их природные варианты; препрофактор IX свиньи (например, учетный номер UniProt P00741), соответствующий одноцепочечный фактор IX, в котором отсутствует сигнальный пептид, и его природные варианты; препрофактор IX мыши (например, учетный номер UniProt P16294), соответствующий одноцепочечный фактор IX, в котором отсутствует сигнальный пептид, и его природные варианты; крысиный препрофактор IX (например, учетный номер UniProt P16296), соответствующий одноцепочечный фактор IX, в котором отсутствует сигнальный пептид, и его природные варианты; и другие гомологи фактора VIII млекопитающих (например, шимпанзе, человекообразных обезьян, хомяков, морских свинок и т. д.).

[0072] Используемый в данном документе полипептид фактора IX включает природные варианты и искусственные конструкции с активностью расщепления фактором X в присутствии фактора VIII. В соответствии с использованием в настоящем раскрытии, фактор IX охватывает любые природные варианты, альтернативные последовательности, изоформы или мутантные белки, которые сохраняют некоторую базальную активность расщепления фактора IX (например, по меньшей мере 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, или более соответствующей активности дикого типа, в соответствии с результатами проведенного одностадийного анализа свертывания крови в соответствии с главой 2.7.11 Европейской фармакопеи 9.0, которая специально включена в настоящее описание в качестве ссылки из-за указаний в отношении анализа фактора свертывания крови человека IX в главе 2.7.11. Примеры вариаций аминокислот фактора IX (родственных FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)), обнаруженных в популяции людей, включают, без ограничения, I17N, L20S, C28R, C28Y, V30I, R43L, R43Q, R43W, K45N, R46S, R46T, N48I, S49P, L52S, E53A, E54D, E54G, F55C, G58A, G58E, G58R, E66V, E67K, F71S, E73K, E73V, R75Q, E79D, T84R, Y91C, D93G, Q96P, C97S, P101R, C102R, C102R, G106D, G106S, C108S, D110N, I112S, N113K, Y115C, C119F, C119R, E124K, G125E, G125R, G125V, C134Y, I136T, N138H, G139D, G139S, C155F, G160E, Q167H, S169C, C170F, C178R, C178W, R191C, R191H, R226G, R226Q, R226W, V227D, V227F, V228F, V228L, Q241H, Q241K, C252S, C252Y, G253E, G253R, A265T, C268W, A279T, N283D, E291V, R294G, R294Q, V296M, H302R, N306S, I316F, L318R, L321Q, N328K, N328Y, P333H, P333T, T342K, T342M, I344L, G351D, W356C, G357E, G357R, K362E, G363W, A366D, R379G, R379Q, C382Y, L392F, L383I, R384L, K387E, I390F, M394K, F395I, F395L, C396F, C396S, A397P, R404T, C407R, C407S, D410H, S411G, S411I, G412E, G413R, P414T, V419E, F424V, T426P, S430T, W431G, W431R, G432S, E433A, G433K, C435Y, A436V, G442E, G442R, I443T, R449Q, R449W, Y450C, W453R и I454T. Как более подробно обсуждается ниже, эта нумерация относится к человеческому FIX дикого типа. Другие вариации аминокислот, выявленные в популяции людей, известны и могут быть обнаружены, например, с помощью средства просмотра вариаций Национального центра биотехнологической информации (NCBI), учетный номер GCF_000001405.25. Белки фактора VIII также включают полипептиды, содержащие посттрансляционные модификации.

[0073] Особое использование в настоящем раскрытии представляет собой белок FIX, который включает в себя так называемую мутацию «Падуя», замену аргинина на лейцин в положении 338 зрелого одноцепочечного белка фактора IX (R338L), положении 384 препрополипептида фактора IX (R384L). Эта мутация придает гиперфункциональную активность белку FIX. Например, было показано, что белок «Падуя» (например, фактор IX, содержащий мутацию R338L) в 5-10 раз более активен, чем фактор IX дикого типа in vivo. патент США № 6,531,298; Simioni P. et al., N Engl J Med. 361(17): 1671-75 (2009), полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки. Соответственно, в описании раскрыты конструкции аминокислот и нуклеиновых кислот, которые кодируют белок Падуя-FIX, иногда называемый в данном документе FIXp или pFIX.

[0074] Используемые в данном документе термины «полинуклеотид фактора IX» и «полинуклеотид FIX» относятся к полинуклеотиду, кодирующему полипептид фактора IX, обладающий сериновой протеазной активностью фактора IX, в определенных условиях, например, как измерено с помощью одностадийного анализа свертывания фактора IX, описанного в главе 2.7.11 Европейской Фармакопеи 9.0. Полинуклеотиды фактора IX включают полинуклеотиды, кодирующие одноцепочечные полипептиды-предшественники фактора IX, в том числе пре-полипропептиды фактора IX, пропептиды фактора IX и зрелые одноцепочечные полипептиды фактора IX, которые при активации путем посттрансляционной обработки, описанной выше, становится активным белок фактора IX с активностью сериновой протеазы фактора IX. В определение полинуклеотидов фактора IX специально включены полинуклеотиды, кодирующие полипептид фактора IX, который включает вариант R338L. В примерном варианте осуществления полинуклеотид человеческого фактора IX относится к полинуклеотиду, кодирующий полипептид, который включает аминокислотную последовательность с высокой идентичностью последовательности (например, по меньшей мере, 85%, 90%, 95%, 99% или более) к части полипептида человеческого фактора IX дикого типа, который включает легкую и тяжелую цепи, FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10, показанная на фиг. 11A) или к части полипептида человеческого фактора IX, вариант Падуя, который включает легкую и тяжелую цепи, FIXp -MP-AA (SEQ ID NO: 12, показанная на фигуре 12).

[0075] Как описано в настоящем документе, полинуклеотиды фактора IX могут включать регуляторные элементы, такие как промоторы, энхансеры, терминаторы, последовательности полиаденилирования и интроны, а также элементы упаковки вирусов, такие как инвертированные концевые повторы (ITR) и/или другие элементы, которые поддерживают репликацию полинуклеотида в невирусной клетке-хозяине, например, репликоне, поддерживающем размножение полинуклеотида, например в бактериальной, дрожжевой клетке-хозяине или клетке-хозяине млекопитающего.

[0076] Особенно применимыми в настоящем изобретении являются кодон-измененные полинуклеотиды фактора IX. В соответствии с описанным в данном документе, кодон-измененные полинуклеотиды FIX обеспечивают повышенную экспрессию трансгенного фактора IX in vivo по сравнению с уровнем экспрессии фактора IX, обеспечиваемым нативно-кодированной конструкцией фактора IX (например, полинуклеотидом, кодирующим ту же аминокислотную последовательность фактора IX с использованием человеческих кодонов дикого типа). Используемый в данном документе термин «повышенная экспрессия» относится к повышенному уровню белка трансгенного фактора IX в крови животного, которому вводили кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий фактор IX, по сравнению с уровнем трансгенного белка фактора IX в крови животного, которому вводили нативно кодированную конструкцию фактора IX. Повышенная экспрессия белка приводит к увеличению активности фактора IX; таким образом, повышенная экспрессия приводит к повышенной активности.

[0077] В некоторых вариантах осуществления повышенная экспрессия относится к по меньшей мере на 25% большему количеству трансгенного полипептида фактора IX в крови животного, которому вводили кодон-измененный полинуклеотид фактора IX, по сравнению с уровнем трансгенного полипептида фактора IX в крови животного, которому вводили нативно кодированный полинуклеотид фактора IX. В целях настоящего изобретения повышенная экспрессия относится к эффекту, вызванному изменением последовательности кодона, а не гиперактивности, вызванной основной аминокислотной заменой, например мутацией «Падуя». То есть, уровень экспрессии, полученный из кодон-оптимизированной последовательности, кодирующей полинуклеотид фактора IX «Падуя», сравнивают с уровнем экспрессии, полученным при использовании нативно кодированного белка «Падуя». В некоторых вариантах осуществления повышенная экспрессия относится к уровню трансгенного полипептида фактора IX в крови животного, которому вводили кодон-измененный полинуклеотид фактора IX, который по меньшей мере на 50% выше, по меньшей мере на 75% выше, по меньшей мере на 100% выше, по меньшей мере в 3 раза выше, по меньшей мере в 4 раза выше, по меньшей мере в 5 раз выше, по меньшей мере в 6 раз выше, по меньшей мере в 7 раз выше, по меньшей мере в 8 раз выше, по меньшей мере в 9 раз выше, по меньшей мере в 10 раз выше, по меньшей мере в 15 раз выше, по меньшей мере в 20 раз выше, по меньшей мере в 25 раз выше, по меньшей мере в 30 раз выше, по меньшей мере в 40 раз выше, по меньшей мере в 50 раз выше, по меньшей мере в 60 раз выше, по меньшей мере в 70 раз выше, по меньшей мере в 80 раз выше, по меньшей мере в 90 раз выше, по меньшей мере в 100 раз выше, по меньшей мере в 125 раз выше, по меньшей мере в 150 раз выше, по меньшей мере в 175 раз выше, по меньшей мере в 200 раз выше, по меньшей мере в 225 раз выше или по меньшей мере в 250 раз выше по сравнению с уровнем трансгенного полипептида фактора IX в крови животного, которому вводили нативно кодированный полинуклеотид фактора IX. Уровни полипептида фактора IX в крови животного могут быть измерены, например, с помощью анализа ИФА, специфичного для полипептида фактора IX.

[0078] Под «активностью фактора IX» или «активностью сериновой протеазы фактора IX» в данном документе подразумевается способность расщеплять полипептид фактора X в присутствии кофактора фактора VIIIa, например, посредством гидролиза пептидной связи Arg194-Ile195 в факторе IX дикого типа, тем самым активируя фактор X до фактора Ха. Уровни активности могут быть измерены с использованием любой активности фактора IX, известной в данной области; подходящие анализы описаны в данном документе; примерным анализом для определения активности фактора IX является одностадийный анализ свертывания фактора IX, описанный в главе 2.7.11 Европейской фармакопеи 9.0, который используется в приведенных в данном документе примерах. В некоторых вариантах осуществления человеческая плазма, дефицитная в отношении активности FIX, используется в качестве контроля в одностадийном анализе свертывания для определения специфичности фактора IX.

[0079] Поскольку некоторые варианты фактора IX обладают повышенной специфической активностью по сравнению с фактором IX дикого типа in vivo, например, активность сериновой протеазы фактора IX человеческого варианта «Падуи» в 5-10 раз выше активности человеческого фактора IX нативно кодированного типа, в некоторых вариантах осуществления терапевтический потенциал полинуклеотидной композиции фактора IX оценивают по увеличению активности фактора IX в крови животного, которому вводят полинуклеотид фактора IX, например, вместо или в дополнение к повышенной экспрессии фактора IX. В некоторых вариантах осуществления, как используется в настоящем документе, повышенная активность фактора IX относится к большему увеличению активности фактора IX в крови животного, которому вводили кодон-измененный полинуклеотид фактора IX, относительно базовой активности фактора IX в крови животного до введения кодон-измененного полинуклеотида фактора IX по сравнению с увеличением активности фактора IX в крови животного, которому вводили нативно кодированный полинуклеотид фактора IX, относительно базовой активности фактора IX в крови животного до введения нативно кодированного полинуклеотида фактора IX. В некоторых вариантах осуществления повышенная активность фактора IX относится к по меньшей мере на 25% большему увеличению активности фактора IX в крови животного, которому вводили кодон-измененный полинуклеотид фактора IX, относительно базового уровня активности фактора IX в крови животного до введения кодон-измененного полинуклеотида фактора IX по сравнению с увеличением уровня активности фактора IX в крови животного, которому вводили нативно кодированный полинуклеотид фактора IX относительно исходного уровня активности фактора IX у животного до введения нативно кодированного полинуклеотида фактора IX. В некоторых вариантах осуществления повышенная активность фактора IX относится к повышению активности фактора IX в крови животного, которому вводили кодон-измененный полинуклеотид фактора IX, которая по меньшей мере на 50% выше, по меньшей мере на 75% выше, по меньшей мере на 100% выше, по меньшей мере в 3 раза выше, по меньшей мере в 4 раза выше, по меньшей мере в 5 раз выше, по меньшей мере в 6 раз выше, по меньшей мере в 7 раз выше, по меньшей мере в 8 раз выше, по меньшей мере в 9 раз выше, по меньшей мере в 10 раз выше, по меньшей мере в 15 раз выше, по меньшей мере в 20 раз выше, по меньшей мере в 25 раз выше, по меньшей мере в 30 раз выше, по меньшей мере в 40 раз выше, по меньшей мере в 50 раз выше, по меньшей мере в 60 раз выше, по меньшей мере в 70 раз выше, по меньшей мере в 80 раз выше, по меньшей мере в 90 раз выше, по меньшей мере в 100 раз выше, по меньшей мере в 125 раз выше, по меньшей мере в 150 раз выше, по меньшей мере в 175 раз выше, по меньшей мере в 200 раз выше, по меньшей мере в 225 раз выше или по меньшей мере в 250 раз выше относительно исходного уровня активности фактора IX в крови животного до введения кодон-измененного полинуклеотида фактора IX по сравнению с повышением уровня активности фактора IX в крови животного, которому вводили нативно кодированный полинуклеотид фактора IX относительно исходного уровня активности фактора IX у животного до введения нативно кодированного полинуклеотида фактора IX. Активность измеряют с использованием одностадийного анализа свертывания фактора IX, описанного в главе 2.7.11 Европейской фармакопеи 9.0, в соответствии с описанным в данном документе.

[0080] Используемый в данном документе термин «гемофилия» относится к группе болезненных состояний, широко характеризующихся снижением свертываемости крови или коагуляции. Гемофилия может относиться к гемофилии типа А, типа В или типа С, или к совокупности всех трех типов заболеваний. Гемофилия типа А (гемофилия А) вызвана снижением или потерей активности фактора VIII (FVIII) и является наиболее заметным из подтипов гемофилии. Гемофилия типа B (гемофилия B) является результатом потери или снижения свертывающей функции фактора IX (FIX). Гемофилия типа С (гемофилия С) является следствием потери или снижения свертывающей активности фактора XI (FXI). Гемофилия А и В - это Х-связанные заболевания, а гемофилия С является аутосомным заболеванием. Обычные способы лечения гемофилии включают как профилактическое введение, так и введение по требованию факторов свертывания крови, таких как FVIII, FIX, включая Bebulin®-VH и FXI, также FEIBA-VH, десмопрессин, а также инфузии плазмы.

[0081] Используемый в данном документе термин «генная терапия фактором IX» или «генная терапия FIX» включает в себя любой терапевтический подход к обеспечению пациенту нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор IX, для облегчения, уменьшения или предотвращения повторения одного или нескольких симптомов ( например, клинических факторов), связанных с дефицитом фактора IX (например, гемофилия B). Термин включает введение любого соединения, лекарственного средства или процедуры либо схемы, включающее нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу фактора IX, включая любую модифицированную форму фактора IX (например, вариант фактора VIII R384L), для поддержания или улучшения здоровья человека с дефицитом фактора IX (например, гемофилией B). Специалист в данной области поймет, что либо курс генной терапии FIX, либо доза терапевтического агента для генной терапии FIX могут быть изменены, например, на основании результатов, полученных в соответствии с настоящим изобретением.

[0082] Термины «терапевтически эффективное количество или доза» или «терапевтически достаточное количество или доза» или «эффективное или достаточное количество или доза» относятся к дозе, которая вызывает терапевтические эффекты, для которых она вводится. Например, терапевтически эффективное количество лекарственного средства, применимого для лечения гемофилии, может представлять собой количество, которое способно предотвратить или ослабить один или несколько симптомов, связанных с гемофилией.

[0083] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное лечение приводит к снижению частоты и/или тяжести случаев кровотечений у субъекта.

[0084] Используемый в данном документе термин «ген» относится к сегменту молекулы ДНК, кодирующий полипептидную цепь (например, кодирующей области). В некоторых вариантах осуществления ген расположен в непосредственно предшествующих, следующих и/или промежуточных областях кодирующей области, которые участвуют в продуцировании полипептидной цепи (например, регуляторные элементы, такие как промотор, энхансер, последовательность полиаденилирования, 5'нетранслируемый регион, 3'нетранслируемый регион или интрон).

[0085] Используемый в данном документе термин «регуляторные элементы» относится к нуклеотидным последовательностям, таким как промоторы, энхансеры, терминаторы, последовательности полиаденилирования, интроны и т. д., которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке.

[0086] Используемый в данном документе термин «промоторный элемент» относится к нуклеотидной последовательности, которая помогает контролировать экспрессию кодирующей последовательности. Как правило, промоторные элементы расположены на 5'-конце сайта начала трансляции гена. Однако в некоторых вариантах осуществления промоторный элемент может быть расположен внутри интронной последовательности или на 3'-конце кодирующей последовательности. В некоторых вариантах осуществления промотор, применимый для вектора генной терапии, происходит от нативного гена белка-мишени (например, промотора фактора VIII). В некоторых вариантах осуществления промотор, используемый для вектора генной терапии, является специфичным для экспрессии в конкретной клетке или ткани организма-мишени (например, специфический для печени промотор). В еще других вариантах осуществления в векторе генной терапии, описанном в данном документе, используется один из множества хорошо охарактеризованных промоторных элементов. Неограничивающие примеры хорошо охарактеризованных промоторных элементов включают ранний промотор CMV, промотор β-актина и промотор метил CpG-связывающего белка 2 (MeCP2). В некоторых вариантах осуществления промотор является конститутивным промотором, который управляет по существу постоянной экспрессией целевого белка. В других вариантах осуществления промотор представляет собой индуцибельный промотор, который стимулирует экспрессию целевого белка в ответ на конкретный стимул (например, воздействие определенного лечения или агента). Для обзора разработки промоторов для AAV-опосредованной генной терапии см. Gray et al. (Human Gene Therapy 22:1143-53 (2011)), содержание которого прямо включено в качестве ссылки во всей его полноте для всех целей.

[0087] Используемый в данном документе термин «CRM8» относится к цис-действующему регуляторному модулю, полученному из гена SERPINA1 (учетный номер NCBI NM_000295.4), который усиливает экспрессию функционально связанного гена, например последовательности, кодирующей полипептид фактора IX, печень-специфическим образом имеющим высокую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 39. При использовании в данном документе элемент CRM8 относится к одной копии регуляторного элемента, который в некоторых вариантах осуществления включен в одну или несколько копий в полинуклеотиде фактора IX, например, в 1, 2, 3 или более копий. Для получения дополнительной информации об элементах CRM, таких как CRM8, см. Chuah MK et al., Mol Ther., 22 (9): 1605-13 (2014), которая включена в настоящее описание посредством ссылки.

[0088] Используемый в данном документе термин «интрон MVM» относится к последовательности интрона, полученной из мелкого вируса мышей, обладающего высокой идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 53. Для получения дополнительной информации о самом интроне MVM см. Haut and Pintel, J Virol. 72 (3): 1834-43 (1998) и об использовании интрона MVM в векторах генной терапии AAV, см. Wu Z et al., Mol Ther., 16 (2): 280-9 (2008), оба из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

[0089] Используемый в данном документе термин «функционально связанный» относится к взаимосвязи между первой эталонной нуклеотидной последовательностью (например, геном) и второй нуклеотидной последовательностью (например, регуляторным контрольным элементом), которая позволяет второй нуклеотидной последовательности влиять на одно или несколько свойств, связанных с первой эталонной нуклеотидной последовательностью (например, скорость транскрипции). В контексте настоящего раскрытия регуляторный контрольный элемент функционально связан с трансгеном фактора IX, когда регуляторный элемент расположен внутри вектора генной терапии таким образом, что он оказывает влияние (например, промоторный или тканеспецифический эффект) на транскрипцию трансгена фактора IX.

[0090] Используемый в данном документе термин «вектор» относится к любой конструкции нуклеиновой кислоты, используемой для переноса нуклеиновой кислоты фактора IX в клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления вектор включает репликон, который функционирует для репликации конструкции нуклеиновой кислоты. Неограничивающие примеры векторов, полезных для генной терапии, включают плазмиды, фаги, космиды, искусственные хромосомы и вирусы, которые функционируют как автономные единицы репликации in vivo. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор для введения нуклеиновой кислоты фактора IX в клетку-хозяина. Многие модифицированные эукариотические вирусы, используемые для генной терапии, известны в данной области. Например, аденоассоциированные вирусы (AAV) особенно хорошо подходят для использования в генной терапии человека, поскольку люди являются естественным носителем вируса, известно, что нативные вирусы не способствуют каким-либо заболеваниям и вирусы вызывают слабый иммунный ответ.

[0091] Используемый в данном документе термин «вирусный вектор фактора IX» относится к рекомбинантному вирусу, содержащему полинуклеотид фактора IX, кодирующий полипептид фактора IX, который достаточен для экспрессии полипептида фактора IX при введении в подходящее животное-хозяина (например, человека). В определение вирусного вектора фактора IX конкретно включены рекомбинантные вирусы, в которые в геном вируса был встроен кодон-измененный полинуклеотид фактора IX, кодирующий полипептид фактора IX. В определение вирусного вектора фактора IX также специально включены рекомбинантные вирусы, в которых нативный геном вируса заменен полинуклеотидом фактора IX, кодирующий полипептид фактора IX. В определение вирусного вектора фактора IX включены рекомбинантные вирусы, содержащие полинуклеотид фактора IX, кодирующий вариант «Падуя» фактора IX.

[0092] Используемый в данном документе термин «вирусная частица фактора IX» относится к вирусной частице, инкапсулирующей полинуклеотид фактора IX, кодирующий полипептид фактора IX, который специфичен для экспрессии полипептида фактора IX при введении в подходящее животное-хозяина (например, человек). В определение вирусных частиц фактора IX конкретно включены рекомбинантные вирусные частицы, инкапсулирующие геном, в который был встроен кодон-измененный полинуклеотид фактора IX, кодирующий полипептид фактора IX. В определение вирусных частиц фактора IX также специально включены рекомбинантные вирусные частицы, инкапсулирующие полинуклеотид фактора IX, кодирующий полипептид фактора IX, который заменяет нативный геном вируса. В определение вирусных частиц фактора IX включены рекомбинантные вирусные частицы, инкапсулирующие полинуклеотид фактора IX, кодирующий вариант «Падуя» фактора IX

[0093] Под «AAV» или «аденоассоциированным вирусом» в данном описании подразумевается депендопарвовирус из рода вирусов Parvoviridae. Используемый в данном документе термин «AAV» может относиться к вирусу, происходящему из встречающегося в природе генома AAV «дикого типа», в который был вставлен полинуклеотид фактора IX, рекомбинантному вирусу, полученному из рекомбинантного полинуклеотида фактора IX, упакованного в капсид с использованием белков капсида, кодированных встречающимся в природе геном AAV, или рекомбинантным вирусом, полученным из рекомбинантного полинуклеотида фактора IX, упакованного в капсид с использованием капсидных белков, кодируемых неприродным геном кэпа капсида. В определение AAV включены вирусы AAV типа 1 (AAV1), AAV типа 2 (AAV2), AAV типа 3 (AAV3), AAV типа 4 (AAV4), AAV типа 5 (AAV5), AAV типа 6 (AAV6), AAV типа 7 (AAV7), AAV типа 8 (AAV8) и AAV типа 9 (AAV9), инкапсулирующие полинуклеотид фактора IX, и вирусы, образованные одним или несколькими вариантами капсидных белков AAV, инкапсулирующих полинуклеотид фактора IX.

[0094] Под «AAV8», «AAV-8» или «AAV серотипа 8» в данном документе подразумевается вирус, образованный капсидным вирусным белком AAV8, который инкапсулирует полинуклеотид фактора IX.

[0095] Используемый в данном документе термин «CpG» относится к цитозин-гуаниновому динуклеотиду вдоль одной цепи ДНК, где «p» представляет фосфатную связь между ними.

[0096] Используемый в данном документе термин «остров CpG» относится к области внутри полинуклеотида, имеющей статистически повышенную плотность динуклеотидов CpG. При использовании в данном документе область полинуклеотида (например, полинуклеотида, кодирующего кодон-измененный белок фактора IX) представляет собой островок CpG, если при рассмотрении 200 пар оснований: (i) область имеет содержание GC более 50%, и (ii) отношение наблюдаемых динуклеотидов CpG к ожидаемым динуклеотидам CpG составляет по меньшей мере 0,6, как определено соотношением:

≥ 0,6.

Для получения дополнительной информации о способах идентификации островков CpG см. Gardiner-Garden M. et al., J Mol Biol., 196 (2): 261-82 (1987), содержание которого включено в данный документ во всей его полноте для любых целей посредством ссылки.

[0097] Используемый в данном документе термин «нуклеиновая кислота» относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам в одно- или двухцепочечной форме и их комплементам. Термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные каркасные остатки, или звенья, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе; которые имеют сходные связывающие свойства, как и рассматриваемая нуклеиновая кислота и метаболизируются аналогично эталонным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, без ограничений, тиофосфаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-O-метилрибонуклеотиды и пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК). Однако особо применимые варианты осуществления в данном документе для применения в генной терапии у пациентов используют фосфодиэфирные связи.

[0098] Под «композициями нуклеиновых кислот» в данном документе подразумевается любая молекула или состав молекулы, которая включает полинуклеотид фактора IX, кодирующий пептид фактора IX. В определение составов нуклеиновых кислот входят полинуклеотиды фактора IX, водные растворы полинуклеотидов фактора IX, вирусные частицы, инкапсулирующие полинуклеотид фактора IX, и водные составы вирусных частиц, инкапсулирующих полинуклеотид фактора IX. Композиция нуклеиновой кислоты в соответствии с описанным в данном документе включает кодон-измененный ген FIX, кодирующий полипептид FIX.

[0099] Термин «аминокислота» относится к аминокислотам природного и неприродного происхождения, включая аналоги аминокислот и имитаторы аминокислот, которые функционируют подобно аминокислотам природного происхождения. Встречающиеся в природе аминокислоты включают те, которые кодируются генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые позднее модифицируются, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Встречающиеся в природе аминокислоты могут включать, например, D- и L-аминокислоты. В отношении аминокислотных последовательностей среднему специалисту в данной области понятно, что отдельные замены, делеции или добавления к последовательности нуклеиновой кислоты или пептида, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, являются «консервативно модифицированным вариантом», в котором изменение приводит к замещению аминокислоты химически сходной аминокислотой. Таблицы консервативных замен, представляющие функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты являются дополнением и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели по данному раскрытию.

[00100] Консервативные аминокислотные замены, обеспечивающие функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в данной области. В зависимости от функциональности конкретной аминокислоты, например каталитической, структурной или стерически важной аминокислоты, различные группы аминокислот могут рассматриваться как консервативные замены друг друга. Таблица 1 представляет группы аминокислот, которые считаются консервативными заменами на основе заряда и полярности аминокислоты, гидрофобности аминокислоты, поверхностного воздействия/структурной природы аминокислоты и склонности аминокислоты к вторичной структуре.

Таблица 1. Группировки консервативных аминокислотных замен основаны на функциональности остатка в белке.

Важная особенность	Консервативные группы
Заряд/полярность	1. H, R и K 2. D и E 3. C, T, S, G, N, Q и Y 4. A, P, M, L, I, V, F и W
Гидрофобность	1. D, E, N, Q, R и K 2. C, S, T, P, G, H и Y 3. A, M, I, L, V, F и W
Структурное/поверхностное воздействие	1. D, E, N, Q, H, R и K 2. C, S, T, P, A, G, W и Y 3. M, I, L, V и F
Предрасположенность вторичной структуры	1. A, E, Q, H, K, M, L и R 2. C, T, I, V, F, Y и W 3. S, G, P, D и N
Эволюционное сохранение	1. D и E 2. H, K и R 3. N и Q 4. S и T 5. L, I и V 6. F, Y и W 7. A и G 8. M и C

[00101] Термины «идентичный» или процент «идентичности» в контексте двух или более нуклеиновых кислот или пептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (т. е. около 60% идентичности, предпочтительно 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или выше идентичности в определенной области при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения или выделенной области), измеренный с использованием алгоритмов сравнения последовательностей BLAST или BLAST 2.0 с параметрами по умолчанию, описанными ниже, или путем ручного выравнивания и визуального осмотра.

[00102] Как известно в данной области, ряд различных программ может быть использован для идентификации того, имеет ли белок (или нуклеиновая кислота, как обсуждено ниже) идентичность последовательности или сходство с известной последовательностью. Идентичность и/или сходство последовательностей определяют с использованием стандартных методов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, алгоритм идентификации локальной последовательности Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981), алгоритм выравнивания идентичности последовательностей Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970). поиска по методу сходства согласно Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988), компьютеризованные реализации данных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном пакете Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мэдисон, штат Висконсин), программа Best Fit sequence, описанная Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984), предпочтительно с использованием настроек по умолчанию, или путем проверки. Предпочтительно, процентная идентичность вычисляется использованием FastDB на основе следующих параметров: mismatch penalty (штраф за ошибочное спаривание) - 1; gap penalty (штраф за пропуск в последовательности) - 1; gap size penalty (штраф за размер пропуска в последовательности) - 0,33 и joining penalty (штраф за соединение) - 30, «Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,», Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, стр. 127-149 (1988 г.), Alan R. Liss,, с Inc., каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки.

[00103] Примером подходящего алгоритма является PILEUP. Алгоритм PILEUP создает множественное выравнивание последовательностей из группы связанных последовательностей с использованием прогрессивных парных выравниваний. Он также может отображать дерево, показывающее отношения кластеризации, используемые для создания выравнивания. Алгоритм PILEUP использует упрощение метода прогрессивного выравнивания Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987); метод аналогичен описанному Higgins & Sharp CABIOS 5:151-153 (1989), оба включены в качестве ссылки. Применимые параметры PILEUP включают следующие: default gap weight (штраф за делецию по умолчанию) - 3,00, default gap length weight (штраф за продолжение делеции по умолчанию) - 0,10 и weighted end gaps (оцениваемые концевые делеции).

[00104] Другим примером применимого алгоритма является алгоритм BLAST, описанный в: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); и Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787 (1993), оба включены посредством ссылки. Особенно полезной программой BLAST является программа WU-BLAST-2, полученная у Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html]. Программа WU-BLAST-2 использует несколько параметров поиска, большинство из которых имеют настроенные значения по умолчанию. Регулируемые параметры задаются следующими значениями: интервал перекрытия=1, доля перекрытия=0,125, пороговое значение слова (T) = 11. Параметры HSP S и HSP S2 являются динамическими значениями и определяются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных, в которой осуществляется поиск исследуемой последовательности; однако значения могут быть скорректированы для повышения чувствительности.

[00105] Дополнительным полезным алгоритмом является gapped BLAST, как сообщают Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25:3389-3402, включенный в качестве ссылки. Алгоритм Gapped BLAST использует очки замещения BLOSUM-62; параметр threshold T (пороговая длина слова) установлен на 9; two-hit method to trigger ungapped extensions (двухударный способ запуска продолжения без делеции) изменяет значение gap lengths (продолжение делеции) k с cost (ценой) 10+k; Xu установлен на 16, а Xg установлен на 40 для этапа поиска в базе данных и до 67 для выходного каскада алгоритмов. Содержащие разрывы выравнивания запускаются посредством оценки, соответствующей~ 22 битам.

[00106] Процентное значение идентичности аминокислотной последовательности определяется количеством совпадающих идентичных остатков, деленным на общее количество остатков «более длинной» последовательности в выровненной области. «Более длинная» последовательность - это последовательность, имеющая наиболее действительные остатки в выровненной области (пропуски, введенные WU-Blast-2 для максимизации оценки выравнивания, игнорируются). Аналогичным образом, «выраженная в процентах идентичность последовательности нуклеиновой кислоты» (%) в отношении кодирующей последовательности определенных полипептидов определяется как процентное содержание в последовательности-кандидате нуклеотидных остатков, которые идентичны нуклеотидным остаткам в кодирующей последовательности белка клеточного цикла. В предпочитаемом способе используется модуль BLASTN программы WU-BLAST-2, заданный по умолчанию, с интервалом перекрытия и долей перекрытия, установленным на 1 и 0,125 соответственно.

[00107] Выравнивание может включать введение в последовательности гэпов для выравнивания. Кроме того, для последовательностей, которые содержат больше или меньше аминокислот, чем белок, кодируемый последовательностью фактора IX дикого типа на фиг. 3А (SEQ ID NO: 2), следует понимать, что в одном варианте осуществления процент идентичности последовательности будет определен на основе количества идентичных аминокислот или нуклеотидов по отношению к общему количеству аминокислот или нуклеотидов. Таким образом, например, идентичность последовательностей, более коротких, чем показанная на фиг. 3А (SEQ ID NO: 2), как обсуждено ниже, будет определяться с использованием числа нуклеотидов в более короткой последовательности в одном варианте осуществления. В расчетах процентной идентичности различным проявлениям вариации последовательности, таким как вставки, делеции, замены и т. д., относительный вес не присваивается.

[00108] В одном варианте осуществления оцениваются положительно (+1) только идентификаторы, и всем формам изменения последовательности, включая гэпы, присваивается значение «0», что устраняет необходимость в взвешенном масштабе или параметрах, как описано ниже для вычислений подобия последовательности. Процент идентичности последовательности можно рассчитать, например, путем деления числа совпадающих идентичных остатков на общее количество остатков «более короткой» последовательности в выровненной области и умножения на 100. «Более длинная» последовательность - это последовательность, имеющая наиболее действительные остатки в выровненной области.

[00109] Термин «аллельные варианты» относится к полиморфным формам гена в определенном генетическом локусе, а также к кДНК, полученным из транскриптов мРНК генов, и кодируемым ими полипептидам. Термин «предпочтительный кодон млекопитающего» относится к подмножеству кодонов из набора кодонов, кодирующих аминокислоту, которые наиболее часто используются в белках, экспрессируемых в клетках млекопитающих, выбранных из следующего списка: Gly (GGC, GGG); Glu (GAG); Asp (GAC); Val (GTG, GTC); Ala (GCC, GCT); Ser (AGC, TCC); Lys (AAG); Asn (AAC); Met (ATG); Ile (ATC); Thr (ACC); Trp (TGG); Cys (TGC); Tyr (TAT, TAC); Leu (CTG); Phe (TTC); Arg (CGC, AGG, AGA); Gln (CAG); His (CAC); и Pro (CCC).

[00110] Используемый в данном документе термин «кодон-измененный» относится к полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид (например, белок фактора IX), в котором по меньшей мере, один кодон нативного полинуклеотида, кодирующего полипептид, был изменен для улучшения свойства полинуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления улучшенное свойство способствует повышенной транскрипции мРНК, кодирующей полипептид, повышенной стабильности мРНК (например, улучшенному периоду полураспада мРНК), повышенной трансляции полипептида и/или увеличенной упаковке полинуклеотида внутри вектора. Неограничивающие примеры изменений, которые можно использовать для достижения улучшенных свойств, включают в себя изменение использования и/или распределения кодонов у конкретных аминокислот, корректировку глобального и/или локального содержания GC, удаление богатых на AT последовательностей, удаление повторяющихся элементов последовательности, регулирование общего и/или локального содержания динуклеотидов CpG, удаление криптических регуляторных элементов (например, элементов TATA-бокса и CCAAT-боксов), удаление сайтов сплайсинга интрона/экзона, улучшение регуляторных последовательностей (например, введение консенсусной последовательности Козак) и удаление элементов последовательности, способных образовывать вторичную структуру (например, стволовые петли) в транскрибируемой мРНК.

[00111] Как обсуждено в данном документе, существуют различные номенклатуры для ссылки на компоненты раскрытия в данном документе. «Номер CS» (например, «CS02», «CS03», «CS04», «CS05», «CS06» и т. д.) относится к кодон-измененным полинуклеотидам, кодирующим полипептиды FIX и/или кодируемые полипептиды, включая варианты. Например, CS02-FL относится к кодон-измененной полинуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности CS02 полной длины (Full Length) (иногда называемой здесь CS02-FL-AA от Amino Acid (аминокислота) и CS02-FL-НС (SEQ ID NO: 5) от Nucleic Acid (нуклеиновая кислота)), кодируемой полинуклеотидной последовательностью CS02. Аналогично, «CS02-LC» относится либо к кодон-измененной последовательности нуклеиновой кислоты («CS02-LC-NA» (SEQ ID NO: 42)), кодирующей легкую цепь полипептида FIX, либо к аминокислотной последовательности (также иногда упоминаемой в данном документе как «CS02-LC-AA») легкой цепи FIX, кодируемой полинуклеотидной последовательностью CS02. Аналогично, CS02-HC, CS02-HC-AA и CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 41) одинаковы для тяжелой цепи FIX. Специалистам в данной области будет понятно, что для конструкций, таких как CS02, CS03, CS04, CS05, CS06 и т. д., которые являются только кодон-измененными (например, они не содержат дополнительных аминокислотных замен по сравнению с фактором IX, вариантом Падуя) аминокислотные последовательности будут идентичны, так как аминокислотные последовательности не изменяются при оптимизации кодонов. Таким образом, конструкции последовательности раскрытия включают в себя, но не ограничиваются ими, CS02-FL-NA (SEQ ID NO:5), CS02-FL-AA, CS02-LC-NA (SEQ ID NO:42), CS02-LC-AA, CS02-HC-AA, CS02-HC-NA (SEQ ID NO:41), CS03-FL-NA (SEQ ID NO:6), CS03-FL-AA, CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44), CS03-LC-AA, CS03-HC-AA, CS03-HC-NA (SEQ ID NO:43), CS04-FL-NA (SEQ ID NO:7), CS04-FL-AA, CS04-LC-NA (SEQ ID NO:46), CS04-LC-AA, CS04-HC-AA, CS04-HC-NA, CS05-FL-NA (SEQ ID NO:8), CS05-FL-AA, CS05-LC-NA (SEQ ID NO:48), CS05-LC-AA, CS05-HC-AA, CS05-HC-NA (SEQ ID NO:47), CS06-FL-NA (SEQ ID NO:9), CS06-FL-AA, CS06-LC-NA (SEQ ID NO:50), CS06-LC-AA, CS06-HC-AA и CS06-HC-NA (SEQ ID NO:49). Следует отметить, что все конструкции «CS», представленные в данном документе, кодируют или содержат аминокислотную последовательность FIXp, хотя в определение конструкций CS входят те, которые кодируют или содержат аминокислотную последовательность FIX дикого типа человека.

[00112] Используемый в данном документе термин «специфическая для печени экспрессия» относится к предпочтительной или преимущественной экспрессии in vivo определенного гена (например, кодон-измененного трансгенного гена фактора IX) в ткани печени по сравнению с другими тканями. В некоторых вариантах осуществления специфическая для печени экспрессия означает, что по меньшей мере 50% всей экспрессии конкретного гена происходит в тканях печени субъекта. В других вариантах осуществления специфическая для печени экспрессия означает, что по меньшей мере 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% всей экспрессии конкретного гена встречается в тканях печени субъекта. Соответственно, специфический для печени регуляторный элемент представляет собой регуляторный элемент, который стимулирует специфическую для печени экспрессию гена в ткани печени.

[00113] Используемые в данном документе термины «менее чем X» и «менее чем X%» относятся к диапазону от 0 до X, исключая значение X, например, от 0% до X%, исключая X%. Используемые в данном документе термины используются взаимозаменяемо с диапазоном, начинающимся с 0 или 0%, но не включая X или X%.

[00114] Используемые в данном документе термины «не более X» или «не более X%» относятся к диапазону от 0 до X, включая значение X, например, от 0% до X%, включая X%. Используемые в данном документе термины используются взаимозаменяемо с диапазоном, начинающимся с 0 или 0% и включающим Х или Х%.

[00115] Используемые в данном документе термины «более чем X» или «более чем X%» относятся к диапазону от X до верхнего предела, исключая значение X, например, от X% до 100%, исключая X%. Используемые в данном документе термины используются взаимозаменяемо с диапазоном, начинающимся с, но не включающим, X или X% до верхнего предела, который составляет 100% в контексте процента.

[00116] Используемые в данном документе термины «по меньшей мере X» или «по меньшей мере X%» относятся к диапазону от X до верхнего предела, включая значение X, например, от X% до 100%, включая X%. Используемые в данном документе термины используются взаимозаменяемо с диапазоном, начинающимся с и включающим в себя Х или Х% до верхнего предела, который составляет 100% в контексте процента.

[00117] Используемые в данном документе термины «между X и Y», «между X% и Y% »,«от X до Y» и « от X% до Y%» относятся к диапазону от X до Y, включая значения X и Y, например, от X% до Y%, включая X% и Y%. Используемые в данном документе термины используются взаимозаменяемо с диапазоном, начинающимся с Х или Х% и до Y или Y% включительно.

Кодон-измененный полинуклеотид фактора IX

[00118] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к кодон-измененным композициям нуклеиновых кислот, кодирующим фактор IX или вариант фактора IX (при этом FIXp находит применение в конкретных вариантах осуществления). Такие кодон-измененные полинуклеотиды обеспечивают заметно улучшенную экспрессию фактора IX при введении в конструкции генной терапии на основе AAV. Кодон-измененные полинуклеотиды также демонстрируют улучшенную упаковку AAV-вириона по сравнению с традиционными кодон-оптимизированными конструкциями. Как показано в примере 1, заявители достигли этих преимуществ благодаря открытию нескольких кодон-измененных полинуклеотидов (например, CS02-FL-NA, CS03-FL-NA, CS04-FL-NA, CS05-FL-NA и CS06- FL-NA (SEQ ID NO: 5-9 соответственно)), кодирующих полипептиды фактора IXp с гиперактивной аминокислотной заменой R338L (на основе зрелой одноцепочечной полипептидной последовательности фактора IX; R384L на основе препробелковой последовательности фактора IX). Как показано в примерах 2 и 3, включение одного или нескольких специфических для печени регуляторных контрольных элементов (например, CRM8) в векторы генной терапии, кодирующие молекулу фактора IX, еще более увеличивало экспрессию фактора IX и активности фактора IX in vivo и in vitro.

[00119] Фактор IX дикого типа кодируется сигнальным пептидом из 28 аминокислот (FIX-SP-AA (SEQ ID NO: 37)) и пропептидом из 18 аминокислот (FIX-PP-AA (SEQ ID NO: 38)), которые отщепляются от кодируемого полипептида до активации фактора IXa. Специалистам в данной области понятно, что сигнальные пептиды и/или пропептиды могут быть мутированы, заменены сигнальными пептидами и/или пропептидами из других генов или других организмов или полностью удалены, не затрагивая последовательность зрелого оставшегося полипептида. после того как сигнал и пропептид удалены клеточной обработкой.

[00120] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид (например, композиция нуклеиновой кислоты), предоставленный в настоящем документе, имеет нуклеотидную последовательность с высокой идентичностью последовательности с CS02-FL-NA, CS03-FL-NA, CS04-FL-NA, CS05- FL-NA или CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 5-9, соответственно), кодирующими зрелый одноцепочечный полипептид фактора IX, то есть, легкую цепь фактора IX, пептид активации и тяжелую цепь (например, аминокислоты 47-461 полноразмерного полипептида, кодируемого геном фактора IX дикого типа; FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2)).

[00121] Кроме того, как известно в данной области техники, человеческий фактор IX дикого типа имеет пептид активации из 34 аминокислот, расположенный между легкой цепью фактора IX и тяжелой цепью, который вырезается из одноцепочечного полипептида фактора IX при активации белка. Поскольку пептид активации удаляется из активного полипептида фактора IX, сам пептид не является обязательно необходимым для максимальной активности фактора IX. Соответственно, не требуется, чтобы полипептиды фактора IX, кодируемые кодон-измененными полинуклеотидами, раскрытыми в данном документе, имели высокую идентичность последовательности с последовательностью человеческого пептида активации дикого типа (FIX-AP-AA (SEQ ID NO: 56)). Однако кодируемый пептид активации должен быть иссекаемым при активации полипептида фактора IX. Например, в некоторых вариантах осуществления кодируемый пептид активации должен включать сайты расщепления фактора XI на его N- и C-концах, которые распознаются и расщепляются человеческим фактором IX in vivo.

[00122] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид (например, композиция нуклеиновой кислоты), предоставленный в настоящем документе, кодирует одноцепочечный полипептид фактора IX с высокой идентичностью последовательности с последовательностью легкой цепи FIX дикого типа у человека (FIX-LC-AA ( SEQ ID NO: 62)) и последовательности тяжелой цепи FIX дикого типа у человека (FIX-HC-AA (SEQ ID NO: 63)), и дополнительно кодируют полипептидный линкер, соединяющий С-конец легкой цепи с N-концом тяжелой цепи (например, пептида активации) с двумя сайтами расщепления фактора XI.

[00123] В некоторых вариантах осуществления легкая и тяжелая цепи фактора IX, кодируемые кодон-измененным полинуклеотидом, представляют собой легкую и тяжелую цепи фактора IX человека, соответственно, включая тяжелую цепь FIXp. В других вариантах осуществления легкая и тяжелая цепи фактора IX, кодируемые кодон-измененным полинуклеотидом, представляют собой последовательности тяжелой и легкой цепи от другого млекопитающего (например, фактор IX свиньи). В еще других вариантах осуществления легкая и тяжелая цепи фактора IX представляют собой химерные легкие и тяжелые цепи (например, комбинацию последовательности человека и второй млекопитающей). В других вариантах осуществления легкая и тяжелая цепи фактора IX представляют собой гуманизированную версию легкой и тяжелой цепей от другого млекопитающего, например. последовательности легкой и тяжелой цепей от другого млекопитающего, в которых в выбранных положениях замещены человеческие остатки для снижения иммуногенности полученного пептида при введении человеку.

[00124] Содержание GC в человеческих генах варьируется в широких пределах: от менее 25% до более 90%. Однако в целом человеческие гены с более высоким содержанием GC экспрессируются на более высоких уровнях. Например, Kudla et al. (PLoS Biol., 4 (6): 80 (2006)) демонстрируют, что увеличение содержания GC гена увеличивает экспрессию кодируемого полипептида, главным образом за счет увеличения транскрипции и воздействия на более высокий уровень устойчивого состояния транскрипта мРНК. Обычно желаемое содержание GC в кодон-оптимизированной генной конструкции считается равным или превышающим 60%. Например, ген фактора IX в векторе генной терапии scAAV8.FIXR338L был специфически кодон-измененным с использованием программного обеспечения GeneOptimizer (Geneart), чтобы увеличить содержание GC в кодирующей последовательности дикого типа с 41% GC до 61% GC. См. Wu Z. et al., Mol Ther 16:280-89 (2008) и Monahan PE et al., Hum Gene Ther., 26(2):69-81 (2015). Однако нативные геномы AAV имеют содержание GC около 56%.

[00125] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления кодон-измененные полинуклеотиды (например, композиции нуклеиновых кислот), представленные в настоящем документе, имеют содержание CG, которое более точно соответствует содержанию GC в нативных вирионах AAV (например, приблизительно 56% GC), что ниже, чем предпочтительное содержание GC в полинуклеотидах, которые обычно кодон-оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих (например, при 60% GC или выше). Например, CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5) имеет содержание GC около 54%, CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6) имеет содержание GC около 55%, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7) имеет содержание GC около 54,5%, CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8) имеет содержание GC около 56,6% и CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9) имеет содержание GC около 55%. Эти конструкции должны обеспечивать улучшенную упаковку вирионов по сравнению с аналогично кодон-измененными последовательностями с более высоким содержанием GC.

[00126] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX (например, полинуклеотиде, имеющем высокую идентичность последовательности с одной из кодирующих последовательностей фактора IX CS02-CS06), составляет менее 60%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет менее 59%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет менее 58%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет менее 57%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет не более 56%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет не более 55%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет не более 54%.

[00127] В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 53% до 59%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 54% до 59%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 55% до 59%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 56% до 59%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 53% до 58%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 54% до 58%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 55% до 58%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 56% до 58%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 53% до 57%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 54% до 57%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 55% до 57%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 56% до 57%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 53% до 56%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 54% до 56%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 55% до 56%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 53% до 55%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет от 54% до 55%.

[00128] В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 54 ± 0,5%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 54 ± 0,4%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 54 ± 0,3%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 54 ± 0,2%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 54 ± 0,1%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 54%.

[00129] В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 55 ± 0,5%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 55 ± 0,4%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 55 ± 0,3%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 55 ± 0,2%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 55 ± 0,1%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 55%.

[00130] В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 56 ± 0,5%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 56 ± 0,4%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 56 ± 0,3%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 56 ± 0,2%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 56 ± 0,1%. В некоторых вариантах осуществления общее содержание GC в кодон-измененном полинуклеотиде, кодирующем полипептид фактора IX, составляет 56%.

[00131] Предполагается, что эти динуклеотиды CpG (то есть цитозиновый нуклеотид, за которым следует гуаниновый нуклеотид) индуцируют иммунные ответы посредством toll-подобных рецепторов in vivo. Некоторые данные свидетельствуют о том, что векторы AAV с деплецией CpG при определенных обстоятельствах избегают иммунного выявления у мышей (Faust et al., J. Clin. Invest. 2013; 123, 2994-3001). Кодирующая последовательность фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO: 1)) содержит 20 динуклеотидов CpG.

[00132] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления композиции нуклеиновых кислот (например, кодон-измененные полинуклеотиды), представленные в настоящем документе, кодон-изменены с целью уменьшения количества динуклеотидов CpG в кодирующей последовательности фактора IX. Например, CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5) не содержит динуклеотидов CpG, CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6) не содержит динуклеотидов CpG, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7) не содержит CpG-динуклеотидов, CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8) содержит 11 CpG-динуклеотидов, а CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9)содержит 3 CpG-динуклеотида. Эти конструкции должны вызывать более низкие иммуногенные ответы, чем кодирующая последовательность фактора IX дикого типа, и аналогично кодон-измененные последовательности с более высоким числом CpG-динуклеотидов.

[00133] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX (например, полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с одной из кодирующих последовательностей фактора IX CS02-CS06), имеет менее 20 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, имеет менее 15 CpG-динуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, имеет менее 12 CpG-динуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, имеет менее 10 CpG-динуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, имеет менее 5 CpG-динуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, имеет менее 3 CpG-динуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, не содержит динуклеотидов CpG.

[00134] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, имеет более 15 CpG-динуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, имеет не более 12 CpG-динуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, имеет не более 10 CpG-динуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, имеет не более 5 CpG-динуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, имеет не более 3 CpG-динуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, не содержит динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора IX, имеет не более 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 CpG динуклеотидов или не содержит CpG динуклеотидов.

Аминокислотные замены фактора IX

[00135] Для дальнейшего повышения эффективности экспрессии на основе вектора AAV конструкций фактора IX, описанных в настоящем документе, далее в соответствии с некоторыми вариантами осуществления были встроены аминокислотные замены, известные как такие, что улучшают секрецию, увеличивают специфическую активность и/или повышают стабильность фактора IX. В данной области известно несколько потенциальных вариантов фактора IX для повышения уровней активности FIX в плазме. Эти варианты включают аминокислотные замены, которые увеличивают каталитическую активность фактора IX (например, гиперактивные мутанты), увеличивают устойчивость к антитромбину III и/или гепарину, увеличивают период полувыведения из сыворотки и приводят к измененным паттернам посттрансляционной модификации.

[00136] Например, мутация остатка R338 (PPE) может увеличить свертывающую активность фактора IX. Для обзора см. патент США № 6,531,298, содержание которого полностью включено в качестве ссылки для всех целей. Как раскрыто в патенте США № 6,531,298, аминокислотная замена аргинина на лейцин в этом положении увеличивает активность фактора IX. Позднее это было подтверждено in vivo, где мутация R338L (PPE) увеличивала активность фактора IX в 5-10 раз in vivo. Для обзора см. Simioni P. et al., N Engl J Med. 361(17): 1671-75 (2009), полностью включенную в настоящее описание посредством ссылки. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, описанные в данном документе, кодируют полипептид фактора IX с аминокислотной заменой аргинина 384 (PPI); остаток 338 (PPE). В конкретном варианте осуществления аминокислотная замена представляет собой R384L (PPI). В других вариантах осуществления аминокислотная замена проводится в остатке 384 (PPI)/338 (PPE) на остаток, отличный от лейцина. Например, сообщалось, что аминокислотная замена R384A (PPI) обеспечивала в 2-6 раз более высокую активность у мышей. Schuettrumpf J et al., Blood, 105 (6): 2316-23 (2005), содержание которого прямо включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00137] Аналогично, мутация остатков Y305, K311, S365 и Y391 приводит к увеличению активности фактора IX на синтетическом субстрате. В частности, одиночные мутации K311M и K311T приводили к 2,8-кратному и 6,7-кратному увеличению активности на синтетическом субстрате расщепления. Sichler K. et al., J Biol Chem. 278 (6):4121-26 (2003) (с использованием другой нумерации остатков). Кроме того, тройной мутант Y305F/K311T/Y391T приводил к 7000-кратному увеличению активности на синтетическом субстрате. Id. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, описанные в данном документе, кодируют полипептид фактора IX с аминокислотной заменой в одном или нескольких из тирозина 305 (PPI), лизина 311 (PPI) и тирозина 391 (PPI). В конкретном варианте осуществления аминокислотная замена представляет собой K311M (PPI). В конкретном варианте осуществления аминокислотная замена представляет собой K311T (PPI). В другом конкретном варианте осуществления аминокислотная замена представляет собой Y305F/K311T/Y391T (PPI).

[00138] Другие аминокислотные замены, которые обеспечивают улучшенные свойства, известны в данной области и могут быть включены в описанные кодон-измененные полинуклеотиды фактора IX. Например, см. патент США № 8,778,870, содержание которого прямо включено в настоящий документ посредством ссылки во всей его полноте для всех целей.

Кодон-измененные полинуклеотиды, кодирующие белок фактора IX

Кодон-измененные полинуклеотиды CS02

[00139] В одном варианте осуществления композиция нуклеиновой кислоты, представленная в настоящем документе, включает полинуклеотид фактора IX (например, кодон-оптимизированный полинуклеотид), кодирующий одноцепочечный полипептид фактора IX, где полинуклеотид фактора IX включает нуклеотидную последовательность, имеющую высокую идентичность последовательности с CS02-FL-НА (SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющая высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет пониженное содержание GC по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет уменьшенное количество динуклеотидов CpG по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)).

[00140] В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5). В другом варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида представляет собой CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5).

[00141] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC менее 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC менее 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC менее 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC менее 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC менее 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC менее 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC менее 54%.

[00142] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC от 50% до 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC от 50% до 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC от 50% до 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC от 50% до 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC от 50% до 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC от 50% до 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC от 50% до 54%.

[00143] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC 53,8% ±1,0. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC 53,8% ±0,8. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC 53,8% ±0,6. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC 53,8% ±0,5. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC 53,8% ±0,4. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC 53,8% ±0,3. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC 53,8% ±0,2. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC 53,8% ±0,1. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет содержание GC 53,8%.

[00144] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 15 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 12 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 10 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 9 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 8 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 7 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 6 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 5 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 4 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 3 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 2 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет не более 1 динуклеотида CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), не содержит динуклеотидов CpG.

[00145] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например, полипептид, кодируемый полинуклеотидом, имеющим высокую гомологию последовательности с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет высокую идентичность последовательности с последовательностью препробелка FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2) фактора IX дикого типа и/или последовательностью препробелка FIXp-FL-AA варианта Падуя (hFIX (R384L)) (SEQ ID NO: 4). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00146] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2).

[00147] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4).

[00148] В одном варианте осуществления композиция нуклеиновой кислоты, представленная в настоящем документе, включает полинуклеотид фактора IX (например, кодон-измененный полинуклеотид), кодирующий одноцепочечный полипептид фактора IX (например, имеющий активность сериновой протеазы), где полинуклеотид фактора IX включает нуклеотидную последовательность имеющий высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющая высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет пониженное содержание GC по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет уменьшенное количество динуклеотидов CpG по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)).

[00149] В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В другом варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида представляет собой CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13).

[00150] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC менее 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC менее 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC менее 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC менее 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC менее 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC менее 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC менее 54%.

[00151] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC от 50% до 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC от 50% до 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC от 50% до 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC от 50% до 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC от 50% до 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC от 50% до 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC от 50% до 54%.

[00152] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC 53,8% ±1,0. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC 53,8% ±0,8. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC 53,8% ±0,6. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC 53,8% ±0,5. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC 53,8% ±0,4. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC 53,8% ±0,3. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC 53,8% ±0,2. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC 53,8% ±0,1. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет содержание GC 53,8%.

[00153] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 15 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 12 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 10 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 9 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 8 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 7 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 6 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 5 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 4 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 3 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 2 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), имеет не более 1 динуклеотида CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), не содержит динуклеотидов CpG.

[00154] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность последовательности полинуклеотида фактора IX с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13) дополнительно включает сигнальный полинуклеотид фактора IX, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-SP-AA (SEQ ID №: 37). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-SP-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29).

[00155] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность полинуклеотида фактора IX с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13) дополнительно включает пропептидный полинуклеотид фактора IX, кодирующий пропептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-PP- AA (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-PP-NA (SEQ ID №: 31). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-PP-NA (SEQ ID №: 32). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-PP-NA (SEQ ID №: 33). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-PP-NA (SEQ ID №: 34). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-PP-NA (SEQ ID №: 35).

[00156] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность полинуклеотида фактора IX с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13) дополнительно включает в себя препропептидный полинуклеотид фактора IX, кодирующий препропептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-PPP-AA (SEQ ID NO: 36). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-PPP-NA (SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-PPP-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-PPP-NA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-PPP-NA (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-PPP-NA (SEQ ID NO: 23).

[00157] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например полипептид, кодируемый полинуклеотидом, обладающий высокой гомологией последовательности к CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), имеет высокую идентичность последовательности с зрелой последовательностью одноцепочечного полипептида фактора IX дикого типа FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10) и/или зрелой одноцепочечной последовательностью варианта Падуя (hFIX (R384L)) FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления любого сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00158] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10).

[00159] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12).

[00160] В одном варианте осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, представленные в настоящем документе, кодируют одноцепочечный полипептид фактора IX, включающий легкую цепь, тяжелую цепь и полипептидный линкер, соединяющий С-конец легкой цепи с N-концом тяжелой цепи. Легкая цепь полипептида фактора IX кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS02-LC-NA (SEQ ID NO: 42), которая является частью CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), кодирующей легкую цепь фактор IX. Тяжелая цепь полипептида фактора IX кодируется второй нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 41), которая является частью CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5) кодирующей тяжелой цепи фактора IX. Полипептидный линкер включает сайты расщепления фактора XI, которые позволяют созревание in vivo (например, после экспрессии предшественника одноцепочечного полипептида фактора IX).

[00161] В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS02-LC-NA и CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 42 и 41) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 96% идентичность последовательности с CS02-LC-NA и CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 42 и 41) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 97% идентичность последовательности с CS02-LC-NA и CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 42 и 41) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 98% идентичность последовательности с CS02-LC-NA и CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 42 и 41) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99% идентичность последовательности с CS02-LC-NA и CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 42 и 41) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99,5% идентичность последовательности с CS02-LC-NA и CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 42 и 41) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности с CS02-LC-NA и CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 42 и 41) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности представляют собой CS02-LC-NA и CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 42 и 41) соответственно.

[00162] В некоторых вариантах осуществления полипептидный линкер конструкции фактора IX кодируется третьей нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS02-AP-NA (SEQ ID NO: 57), которая является кодон-измененной последовательностью, кодирующей полипептид активации фактора IX дикого типа, например, аминокислоты 192-226 FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность с CS02-AP-NA (SEQ ID NO: 57). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 90% идентичность с CS02-AP-NA (SEQ ID NO: 57). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS02-AP-NA (SEQ ID NO: 57). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS02-AP-NA (SEQ ID NO: 57). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS02-AP-NA (SEQ ID NO: 57). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS02-AP-NA (SEQ ID NO: 57). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS02-AP-NA (SEQ ID NO: 57). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность представляет собой CS02-AP-NA (SEQ ID NO: 57).

[00163] В некоторых вариантах кодированный полипептид фактора IX также включает сигнальный пептид (например, сигнальный пептид фактора IX) и/или пропептид (например, пропептид фактора IX). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид фактора IX дикого типа (FIX-SP-AA (SEQ ID NO: 37)). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид кодируется кодон-измененной полинуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) с CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах воплощения пропептид представляет собой пропептид фактора IX дикого типа (FIX-PP-AA (SEQ ID NO: 38)). В некоторых вариантах осуществления пропептидный пептид кодируется кодон-измененной полинуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) с CS02-PP-NA ( SEQ ID NO: 31).

[00164] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например полипептид, кодируемый полинуклеотидом, обладающий высокой гомологией последовательности к CS02-LC-NA (SEQ ID NO:42) и CS02-HC-NA (SEQ ID NO: 41), имеет высокую идентичность последовательности с зрелой последовательностью одноцепочечного полипептида фактора IX дикого типа FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10) и/или зрелой одноцепочечной последовательностью варианта Падуя (hFIX (R384L)) FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления любого сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00165] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10).

[00166] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12).

[00167] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг.1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает в себя самокомплементарный полинуклеотид структуры A, где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5).

[00168] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг.1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает в себя самокомплементарный полинуклеотид структуры B, где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5).

[00169] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг. 1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид структуры C (например, одноцепочечный полинуклеотид), где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5).

[00170] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг. 1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид структуры D (например, одноцепочечный полинуклеотид), где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5).

Кодон-измененные полинуклеотиды CS03

[00171] В одном варианте осуществления композиция нуклеиновой кислоты, представленная в настоящем документе, включает полинуклеотид фактора IX (например, кодон-измененный полинуклеотид), кодирующий одноцепочечный полипептид фактора IX, где полинуклеотид фактора IX включает нуклеотидную последовательность, имеющую высокую идентичность последовательности CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющая высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет пониженное содержание GC по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет уменьшенное количество динуклеотидов CpG по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)).

[00172] В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6). В другом варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида представляет собой CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6).

[00173] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC менее 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC менее 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC менее 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC менее 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC менее 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC менее 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC менее 54%.

[00174] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC от 50% до 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC от 50% до 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC от 50% до 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC от 50% до 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC от 50% до 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC от 50% до 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC от 50% до 54%.

[00175] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC 53,8% ±1,0. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC 53,8% ±0,8. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC 53,8% ±0,6. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC 53,8% ±0,5. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC 53,8% ±0,4. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC 53,8% ±0,3. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC 53,8% ±0,2. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC 53,8% ±0,1. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет содержание GC 53,8%.

[00176] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 15 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 12 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 10 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 9 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 8 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 7 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 6 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 5 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 4 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 3 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 2 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет не более 1 динуклеотида CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), не содержит динуклеотидов CpG.

[00177] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например, полипептид, кодируемый полинуклеотидом, имеющим высокую гомологию последовательности с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет высокую идентичность последовательности с последовательностью препробелка FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2) фактора IX дикого типа и/или последовательностью препробелка FIXp-FL-AA варианта Падуя (hFIX (R384L)) (SEQ ID NO: 4). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00178] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2).

[00179] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4).

[00180] В одном варианте осуществления композиция нуклеиновой кислоты, представленная в настоящем документе, включает полинуклеотид фактора IX (например, кодон-измененный полинуклеотид), кодирующий одноцепочечный полипептид фактора IX (например, имеющий активность сериновой протеазы), где полинуклеотид фактора IX включает нуклеотидную последовательность имеющий высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющая высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет пониженное содержание GC по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет уменьшенное количество динуклеотидов CpG по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)).

[00181] В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В другом варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида представляет собой CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14).

[00182] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC менее 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC менее 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC менее 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC менее 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC менее 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC менее 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC менее 54%.

[00183] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC от 50% до 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC от 50% до 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC от 50% до 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC от 50% до 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC от 50% до 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC от 50% до 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC от 50% до 54%.

[00184] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC 53,8% ±1,0. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC 53,8% ±0,8. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC 53,8% ±0,6. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC 53,8% ±0,5. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC 53,8% ±0,4. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC 53,8% ±0,3. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC 53,8% ±0,2. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC 53,8% ±0,1. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет содержание GC 53,8%.

[00185] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 15 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 12 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 10 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 9 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 8 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 7 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 6 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 5 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 4 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 3 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 2 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), имеет не более 1 динуклеотида CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), не содержит динуклеотидов CpG.

[00186] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность последовательности полинуклеотида фактора IX с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14) дополнительно включает сигнальный полинуклеотид фактора IX, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-SP-AA (SEQ ID №: 37). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-SP-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29).

[00187] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность полинуклеотида фактора IX с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14) дополнительно включает пропептидный полинуклеотид фактора IX, кодирующий пропептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-PP- AA (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-PP-NA (SEQ ID №: 31). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-PP-NA (SEQ ID №: 32). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-PP-NA (SEQ ID №: 33). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-PP-NA (SEQ ID №: 34). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-PP-NA (SEQ ID №: 35).

[00188] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность полинуклеотида фактора IX с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14) дополнительно включает в себя препропептидный полинуклеотид фактора IX, кодирующий препропептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-PPP-AA (SEQ ID NO: 36). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-PPP-NA (SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-PPP-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-PPP-NA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-PPP-NA (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-PPP-NA (SEQ ID NO: 23).

[00189] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например полипептид, кодируемый полинуклеотидом, обладающий высокой гомологией последовательности к CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), имеет высокую идентичность последовательности с зрелой последовательностью одноцепочечного полипептида фактора IX дикого типа FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10) и/или зрелой одноцепочечной последовательностью варианта Падуя (hFIX (R384L)) FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления любого сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00190] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10).

[00191] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12).

[00192] В одном варианте осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, представленные в настоящем документе, кодируют одноцепочечный полипептид фактора IX, включающий легкую цепь, тяжелую цепь и полипептидный линкер, соединяющий С-конец легкой цепи с N-концом тяжелой цепи. Легкая цепь полипептида фактора IX кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS03-LC-NA (SEQ ID NO: 44), которая является частью CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), кодирующей легкую цепь фактор IX. Тяжелая цепь полипептида фактора IX кодируется второй нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43), которая является частью CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6) кодирующей тяжелой цепи фактора IX. Полипептидный линкер включает сайты расщепления фактора XI, которые позволяют созревание in vivo (например, после экспрессии предшественника одноцепочечного полипептида фактора IX).

[00193] В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS03-LC-NA (SEQ ID NO: 44) и CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43), соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 96% идентичность последовательности с CS03-LC-NA (SEQ ID NO: 44) и CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43), соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 97% идентичность последовательности с CS03-LC-NA (SEQ ID NO: 44) и CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43), соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 98% идентичность последовательности с CS03-LC-NA (SEQ ID NO: 44) и CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43), соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99% идентичность последовательности с CS03-LC-NA (SEQ ID NO: 44) и CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99,5% идентичность последовательности с CS03-LC-NA (SEQ ID NO: 44) и CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43), соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности с CS03-LC-NA (SEQ ID NO: 44) и CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43), соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности представляют собой CS03-LC-NA (SEQ ID NO: 44) и CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43) соответственно.

[00194] В некоторых вариантах осуществления полипептидный линкер конструкции фактора IX кодируется третьей нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS03-AP-NA (SEQ ID NO: 58), которая является кодон-измененной последовательностью, кодирующей полипептид активации фактора IX дикого типа, например, аминокислоты 192-226 FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность с CS03-AP-NA (SEQ ID NO: 58). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 90% идентичность с CS03-AP-NA (SEQ ID NO: 58). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS03-AP-NA (SEQ ID NO: 58). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS03-AP-NA (SEQ ID NO: 58). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS03-AP-NA (SEQ ID NO: 58). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS03-AP-NA (SEQ ID NO: 58). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS03-AP-NA (SEQ ID NO: 58). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность представляет собой CS03-AP-NA (SEQ ID NO: 58).

[00195] В некоторых вариантах кодированный полипептид фактора IX также включает сигнальный пептид (например, сигнальный пептид фактора IX) и/или пропептид (например, пропептид фактора IX). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид фактора IX дикого типа (FIX-SP-AA (SEQ ID NO: 37)). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид кодируется кодон-измененной полинуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) с CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах воплощения пропептид представляет собой пропептид фактора IX дикого типа (FIX-PP-AA (SEQ ID NO: 38)). В некоторых вариантах осуществления пропептидный пептид кодируется кодон-измененной полинуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) с CS03-PP-NA ( SEQ ID NO: 32).

[00196] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например полипептид, кодируемый полинуклеотидом, обладающий высокой гомологией последовательности к CS03-LC-NA (SEQ ID NO:44) и CS03-HC-NA (SEQ ID NO: 43), имеет высокую идентичность последовательности с зрелой последовательностью одноцепочечного полипептида фактора IX дикого типа FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10) и/или зрелой одноцепочечной последовательностью варианта Падуя (hFIX (R384L)) FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления любого сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00197] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10).

[00198] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12).

[00199] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг.1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает в себя самокомплементарный полинуклеотид структуры A, где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6).

[00200] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг.1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает в себя самокомплементарный полинуклеотид структуры B, где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6).

[00201] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг. 1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид структуры C (например, одноцепочечный полинуклеотид), где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6).

[00202] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг. 1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид структуры D (например, одноцепочечный полинуклеотид), где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6).

Кодон-измененные полинуклеотиды CS04

[00203] В одном варианте осуществления композиция нуклеиновой кислоты, представленная в настоящем документе, включает полинуклеотид фактора IX (например, кодон-измененный полинуклеотид), кодирующий одноцепочечный полипептид фактора IX, где полинуклеотид фактора IX включает нуклеотидную последовательность, имеющую высокую идентичность последовательности CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющая высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет пониженное содержание GC по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет уменьшенное количество динуклеотидов CpG по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)).

[00204] В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7). В другом варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида представляет собой CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7).

[00205] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC менее 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC менее 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC менее 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC менее 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC менее 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC менее 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC менее 54%.

[00206] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC от 50% до 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC от 50% до 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC от 50% до 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC от 50% до 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC от 50% до 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC от 50% до 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC от 50% до 54%.

[00207] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC 53,8% ±1,0. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC 53,8% ±0,8. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC 53,8% ±0,6. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC 53,8% ±0,5. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC 53,8% ±0,4. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC 53,8% ±0,3. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC 53,8% ±0,2. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC 53,8% ±0,1. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет содержание GC 53,8%.

[00208] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 15 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 12 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 10 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 9 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 8 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 7 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 6 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 5 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 4 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 3 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 2 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет не более 1 динуклеотида CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), не содержит динуклеотидов CpG.

[00209] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например, полипептид, кодируемый полинуклеотидом, имеющим высокую гомологию последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет высокую идентичность последовательности с последовательностью препробелка FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2) фактора IX дикого типа и/или последовательностью препробелка FIXp-FL-AA варианта Падуя (hFIX (R384L)) (SEQ ID NO: 4). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00210] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2).

[00211] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4).

[00212] В одном варианте осуществления композиция нуклеиновой кислоты, представленная в настоящем документе, включает полинуклеотид фактора IX (например, кодон-измененный полинуклеотид), кодирующий одноцепочечный полипептид фактора IX (например, имеющий активность сериновой протеазы), где полинуклеотид фактора IX включает нуклеотидную последовательность имеющий высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющая высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет пониженное содержание GC по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет уменьшенное количество динуклеотидов CpG по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)).

[00213] В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В другом варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида представляет собой CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15).

[00214] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC менее 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC менее 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC менее 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC менее 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC менее 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC менее 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC менее 54%.

[00215] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC от 50% до 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC от 50% до 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC от 50% до 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC от 50% до 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC от 50% до 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC от 50% до 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC от 50% до 54%.

[00216] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC 53,8% ±1,0. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC 53,8% ±0,8. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC 53,8% ±0,6. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC 53,8% ±0,5. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC 53,8% ±0,4. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC 53,8% ±0,3. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC 53,8% ±0,2. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC 53,8% ±0,1. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет содержание GC 53,8%.

[00217] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 15 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 12 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 10 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 9 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 8 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 7 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 6 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 5 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 4 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 3 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 2 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), имеет не более 1 динуклеотида CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), не содержит динуклеотидов CpG.

[00218] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность последовательности полинуклеотида фактора IX с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15) дополнительно включает сигнальный полинуклеотид фактора IX, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-SP-AA (SEQ ID №: 37). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-SP-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29).

[00219] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность полинуклеотида фактора IX с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15) дополнительно включает пропептидный полинуклеотид фактора IX, кодирующий пропептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-PP- AA (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-PP-NA (SEQ ID №: 31). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-PP-NA (SEQ ID №: 32). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-PP-NA (SEQ ID №: 33). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-PP-NA (SEQ ID №: 34). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-PP-NA (SEQ ID №: 35).

[00220] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность полинуклеотида фактора IX с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15) дополнительно включает в себя препропептидный полинуклеотид фактора IX, кодирующий препропептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-PPP-AA (SEQ ID NO: 36). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-PPP-NA (SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-PPP-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-PPP-NA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-PPP-NA (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-PPP-NA (SEQ ID NO: 23).

[00221] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например полипептид, кодируемый полинуклеотидом, обладающий высокой гомологией последовательности к CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), имеет высокую идентичность последовательности с зрелой последовательностью одноцепочечного полипептида фактора IX дикого типа FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10) и/или зрелой одноцепочечной последовательностью варианта Падуя (hFIX (R384L)) FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления любого сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00222] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10).

[00223] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12).

[00224] В одном варианте осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, представленные в настоящем документе, кодируют одноцепочечный полипептид фактора IX, включающий легкую цепь, тяжелую цепь и полипептидный линкер, соединяющий С-конец легкой цепи с N-концом тяжелой цепи. Легкая цепь полипептида фактора IX кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 46), которая является частью CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), кодирующей легкую цепь фактор IX. Тяжелая цепь полипептида фактора IX кодируется второй нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 45), которая является частью CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7) кодирующей тяжелой цепи фактора IX. Полипептидный линкер включает сайты расщепления фактора XI, которые позволяют созревание in vivo (например, после экспрессии предшественника одноцепочечного полипептида фактора IX).

[00225] В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS04-LC-NA и CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 46 и 45) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 96% идентичность последовательности с CS04-LC-NA и CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 46 и 45) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 97% идентичность последовательности с CS04-LC-NA и CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 46 и 45) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 98% идентичность последовательности с CS04-LC-NA и CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 46 и 45) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99% идентичность последовательности с CS04-LC-NA и CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 46 и 45) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99,5% идентичность последовательности с CS04-LC-NA и CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 46 и 45) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности с CS04-LC-NA и CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 46 и 45) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности представляют собой CS04-LC-NA и CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 46 и 45) соответственно.

[00226] В некоторых вариантах осуществления полипептидный линкер конструкции фактора IX кодируется третьей нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS04-AP-NA (SEQ ID NO: 59), которая является кодон-измененной последовательностью, кодирующей полипептид активации фактора IX дикого типа, например, аминокислоты 192-226 FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность с CS04-AP-NA (SEQ ID NO: 59). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 90% идентичность с CS04-AP-NA (SEQ ID NO: 59). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS04-AP-NA (SEQ ID NO: 59). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS04-AP-NA (SEQ ID NO: 59). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS04-AP-NA (SEQ ID NO: 59). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS04-AP-NA (SEQ ID NO: 59). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS04-AP-NA (SEQ ID NO: 59). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность представляет собой CS04-AP-NA (SEQ ID NO: 59).

[00227] В некоторых вариантах кодированный полипептид фактора IX также включает сигнальный пептид (например, сигнальный пептид фактора IX) и/или пропептид (например, пропептид фактора IX). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид фактора IX дикого типа (FIX-SP-AA (SEQ ID NO: 37)). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид кодируется кодон-измененной полинуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) с CS04-SP-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах воплощения пропептид представляет собой пропептид фактора IX дикого типа (FIX-PP-AA (SEQ ID NO: 38)). В некоторых вариантах осуществления пропептидный пептид кодируется кодон-измененной полинуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) с CS04-PP-NA ( SEQ ID NO: 33).

[00228] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например полипептид, кодируемый полинуклеотидом, обладающий высокой гомологией последовательности к CS04-LC-NA (SEQ ID NO:46) и CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 45), имеет высокую идентичность последовательности с зрелой последовательностью одноцепочечного полипептида фактора IX дикого типа FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10) и/или зрелой одноцепочечной последовательностью варианта Падуя (hFIX (R384L)) FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления любого сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00229] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10).

[00230] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12).

[00231] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг.1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает в себя самокомплементарный полинуклеотид структуры A, где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7).

[00232] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг.1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает в себя самокомплементарный полинуклеотид структуры B, где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7).

[00233] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг. 1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид структуры C (например, одноцепочечный полинуклеотид), где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7).

[00234] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг. 1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид структуры D (например, одноцепочечный полинуклеотид), где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7).

Кодон-измененные полинуклеотиды CS05

[00235] В одном варианте осуществления композиция нуклеиновой кислоты, представленная в настоящем документе, включает полинуклеотид фактора IX (например, кодон-измененный полинуклеотид), кодирующий одноцепочечный полипептид фактора IX, где полинуклеотид фактора IX включает нуклеотидную последовательность, имеющую высокую идентичность последовательности CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющая высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет пониженное содержание GC по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет уменьшенное количество динуклеотидов CpG по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)).

[00236] В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8). В другом варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида представляет собой CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8).

[00237] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC менее 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC менее 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC менее 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC менее 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC менее 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC менее 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC менее 54%.

[00238] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC от 50% до 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC от 50% до 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC от 50% до 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC от 50% до 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC от 50% до 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC от 50% до 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC от 50% до 54%.

[00239] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC 53,8% ±1,0. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC 53,8% ±0,8. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC 53,8% ±0,6. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC 53,8% ±0,5. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC 53,8% ±0,4. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC 53,8% ±0,3. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC 53,8% ±0,2. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC 53,8% ±0,1. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет содержание GC 53,8%.

[00240] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 15 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 12 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 10 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 9 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 8 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 7 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 6 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 5 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 4 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 3 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 2 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет не более 1 динуклеотида CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), не содержит динуклеотидов CpG.

[00241] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например, полипептид, кодируемый полинуклеотидом, имеющим высокую гомологию последовательности с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет высокую идентичность последовательности с последовательностью препробелка FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2) фактора IX дикого типа и/или последовательностью препробелка FIXp-FL-AA варианта Падуя (hFIX (R384L)) (SEQ ID NO: 4). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00242] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2).

[00243] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4).

[00244] В одном варианте осуществления композиция нуклеиновой кислоты, представленная в настоящем документе, включает полинуклеотид фактора IX (например, кодон-измененный полинуклеотид), кодирующий одноцепочечный полипептид фактора IX (например, имеющий активность сериновой протеазы), где полинуклеотид фактора IX включает нуклеотидную последовательность имеющий высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющая высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет пониженное содержание GC по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет уменьшенное количество динуклеотидов CpG по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)).

[00245] В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16). В другом варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида представляет собой CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16).

[00246] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC менее 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC менее 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC менее 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC менее 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC менее 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC менее 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC менее 54%.

[00247] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC от 50% до 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC от 50% до 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC от 50% до 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC от 50% до 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC от 50% до 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC от 50% до 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC от 50% до 54%.

[00248] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC 53,8% ±1,0. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC 53,8% ±0,8. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC 53,8% ±0,6. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC 53,8% ±0,5. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC 53,8% ±0,4. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC 53,8% ±0,3. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC 53,8% ±0,2. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC 53,8% ±0,1. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет содержание GC 53,8%.

[00249] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 15 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 12 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 10 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 9 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 8 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 7 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 6 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 5 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 4 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 3 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 2 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), имеет не более 1 динуклеотида CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16), не содержит динуклеотидов CpG.

[00250] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность последовательности полинуклеотида фактора IX с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16) дополнительно включает сигнальный полинуклеотид фактора IX, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-SP-AA (SEQ ID №: 37). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-SP-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29).

[00251] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность полинуклеотида фактора IX с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16) дополнительно включает пропептидный полинуклеотид фактора IX, кодирующий пропептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-PP- AA (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-PP-NA (SEQ ID №: 31). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-PP-NA (SEQ ID №: 32). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-PP-NA (SEQ ID №: 33). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-PP-NA (SEQ ID №: 34). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-PP-NA (SEQ ID №: 35).

[00252] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность полинуклеотида фактора IX с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16) дополнительно включает в себя препропептидный полинуклеотид фактора IX, кодирующий препропептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-PPP-AA (SEQ ID NO: 36). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-PPP-NA (SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-PPP-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-PPP-NA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-PPP-NA (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-PPP-NA (SEQ ID NO: 23).

[00253] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например полипептид, кодируемый полинуклеотидом, обладающий высокой гомологией последовательности к CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), имеет высокую идентичность последовательности с зрелой последовательностью одноцепочечного полипептида фактора IX дикого типа FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10) и/или зрелой одноцепочечной последовательностью варианта Падуя (hFIX (R384L)) FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления любого сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00254] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10).

[00255] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12).

[00256] В одном варианте осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, представленные в настоящем документе, кодируют одноцепочечный полипептид фактора IX, включающий легкую цепь, тяжелую цепь и полипептидный линкер, соединяющий С-конец легкой цепи с N-концом тяжелой цепи. Легкая цепь полипептида фактора IX кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS05-LC-NA (SEQ ID NO: 48), которая является частью CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8), кодирующей легкую цепь фактор IX. Тяжелая цепь полипептида фактора IX кодируется второй нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 47), которая является частью CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8) кодирующей тяжелой цепи фактора IX. Полипептидный линкер включает сайты расщепления фактора XI, которые позволяют созревание in vivo (например, после экспрессии предшественника одноцепочечного полипептида фактора IX).

[00257] В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS05-LC-NA и CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 48 и 47) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 96% идентичность последовательности с CS05-LC-NA и CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 48 и 47) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 97% идентичность последовательности с CS05-LC-NA и CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 48 и 47) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 98% идентичность последовательности с CS05-LC-NA и CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 48 и 47) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99% идентичность последовательности с CS05-LC-NA и CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 48 и 47) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99,5% идентичность последовательности с CS05-LC-NA и CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 48 и 47) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности с CS05-LC-NA и CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 48 и 47) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности представляют собой CS05-LC-NA и CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 48 и 47) соответственно.

[00258] В некоторых вариантах осуществления полипептидный линкер конструкции фактора IX кодируется третьей нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS05-AP-NA (SEQ ID NO: 60), которая является кодон-измененной последовательностью, кодирующей полипептид активации фактора IX дикого типа, например, аминокислоты 192-226 FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность с CS05-AP-NA (SEQ ID NO: 60). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 90% идентичность с CS05-AP-NA (SEQ ID NO: 60). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS05-AP-NA (SEQ ID NO: 60). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS05-AP-NA (SEQ ID NO: 60). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS05-AP-NA (SEQ ID NO: 60). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS05-AP-NA (SEQ ID NO: 60). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS05-AP-NA (SEQ ID NO: 60). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность представляет собой CS05-AP-NA (SEQ ID NO: 60).

[00259] В некоторых вариантах кодированный полипептид фактора IX также включает сигнальный пептид (например, сигнальный пептид фактора IX) и/или пропептид (например, пропептид фактора IX). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид фактора IX дикого типа (FIX-SP-AA (SEQ ID NO: 37)). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид кодируется кодон-измененной полинуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) с CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах воплощения пропептид представляет собой пропептид фактора IX дикого типа (FIX-PP-AA (SEQ ID NO: 38)). В некоторых вариантах осуществления пропептидный пептид кодируется кодон-измененной полинуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) с CS05-PP-NA ( SEQ ID NO: 34).

[00260] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например полипептид, кодируемый полинуклеотидом, обладающий высокой гомологией последовательности к CS05-LC-NA (SEQ ID NO:48) и CS05-HC-NA (SEQ ID NO: 47), имеет высокую идентичность последовательности с зрелой последовательностью одноцепочечного полипептида фактора IX дикого типа FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10) и/или зрелой одноцепочечной последовательностью варианта Падуя (hFIX (R384L)) FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления любого сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00261] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10).

[00262] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12).

[00263] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг.1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает в себя самокомплементарный полинуклеотид структуры A, где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8).

[00264] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг.1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает в себя самокомплементарный полинуклеотид структуры B, где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8).

[00265] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг. 1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид структуры C (например, одноцепочечный полинуклеотид), где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8).

[00266] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг. 1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид структуры D (например, одноцепочечный полинуклеотид), где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8).

Кодон-измененные полинуклеотиды CS06

[00267] В одном варианте осуществления композиция нуклеиновой кислоты, представленная в настоящем документе, включает полинуклеотид фактора IX (например, кодон-измененный полинуклеотид), кодирующий одноцепочечный полипептид фактора IX, где полинуклеотид фактора IX включает нуклеотидную последовательность, имеющую высокую идентичность последовательности CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющая высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет пониженное содержание GC по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет уменьшенное количество динуклеотидов CpG по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)).

[00268] В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9). В другом варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида представляет собой CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9).

[00269] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC менее 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC менее 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC менее 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC менее 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC менее 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC менее 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC менее 54%.

[00270] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC от 50% до 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC от 50% до 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC от 50% до 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC от 50% до 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC от 50% до 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC от 50% до 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC от 50% до 54%.

[00271] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC 53,8% ±1,0. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC 53,8% ±0,8. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC 53,8% ±0,6. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC 53,8% ±0,5. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC 53,8% ±0,4. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC 53,8% ±0,3. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC 53,8% ±0,2. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC 53,8% ±0,1. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет содержание GC 53,8%.

[00272] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 15 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 12 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 10 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 9 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 8 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 7 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 6 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 5 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 4 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 3 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 2 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет не более 1 динуклеотида CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), не содержит динуклеотидов CpG.

[00273] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например, полипептид, кодируемый полинуклеотидом, имеющим высокую гомологию последовательности с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет высокую идентичность последовательности с последовательностью препробелка FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2) фактора IX дикого типа и/или последовательностью препробелка FIXp-FL-AA варианта Падуя (hFIX (R384L)) (SEQ ID NO: 4). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00274] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2).

[00275] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4).

[00276] В одном варианте осуществления композиция нуклеиновой кислоты, представленная в настоящем документе, включает полинуклеотид фактора IX (например, кодон-измененный полинуклеотид), кодирующий одноцепочечный полипептид фактора IX (например, имеющий активность сериновой протеазы), где полинуклеотид фактора IX включает нуклеотидную последовательность имеющий высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющая высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет пониженное содержание GC по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность полинуклеотида фактора IX, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет уменьшенное количество динуклеотидов CpG по сравнению с кодирующей последовательностью фактора IX дикого типа (FIX-FL-NA (SEQ ID NO:1)).

[00277] В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В конкретном варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В другом варианте осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида представляет собой CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17).

[00278] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC менее 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC менее 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC менее 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC менее 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC менее 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC менее 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC менее 54%.

[00279] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC от 50% до 60%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC от 50% до 59%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC от 50% до 58%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC от 50% до 57%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC от 50% до 56%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC от 50% до 55%. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC от 50% до 54%.

[00280] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC 53,8% ±1,0. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC 53,8% ±0,8. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC 53,8% ±0,6. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC 53,8% ±0,5. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC 53,8% ±0,4. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC 53,8% ±0,3. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC 53,8% ±0,2. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC 53,8% ±0,1. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет содержание GC 53,8%.

[00281] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 15 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 12 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 10 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 9 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 8 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 7 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 6 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 5 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 4 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 3 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 2 динуклеотидов CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), имеет не более 1 динуклеотида CpG. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодон-измененного полинуклеотида, имеющего высокую идентичность последовательности с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17), не содержит динуклеотидов CpG.

[00282] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность последовательности полинуклеотида фактора IX с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17) дополнительно включает сигнальный полинуклеотид фактора IX, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-SP-AA (SEQ ID №: 37). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-SP-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах осуществления сигнальный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29).

[00283] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность полинуклеотида фактора IX с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17) дополнительно включает пропептидный полинуклеотид фактора IX, кодирующий пропептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-PP- AA (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-PP-NA (SEQ ID №: 31). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-PP-NA (SEQ ID №: 32). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-PP-NA (SEQ ID №: 33). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-PP-NA (SEQ ID №: 34). В некоторых вариантах осуществления пропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-PP-NA (SEQ ID №: 35).

[00284] В некоторых вариантах осуществления высокая идентичность полинуклеотида фактора IX с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17) дополнительно включает в себя препропептидный полинуклеотид фактора IX, кодирующий препропептид фактора IX, имеющий аминокислотную последовательность FIX-PPP-AA (SEQ ID NO: 36). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS02-PPP-NA (SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS03-PPP-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS04-PPP-NA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS05-PPP-NA (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах осуществления препропептидный полинуклеотид фактора IX имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична CS06-PPP-NA (SEQ ID NO: 23).

[00285] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например полипептид, кодируемый полинуклеотидом, обладающий высокой гомологией последовательности к CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), имеет высокую идентичность последовательности с зрелой последовательностью одноцепочечного полипептида фактора IX дикого типа FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10) и/или зрелой одноцепочечной последовательностью варианта Падуя (hFIX (R384L)) FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления любого сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00286] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10).

[00287] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12).

[00288] В одном варианте осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, представленные в настоящем документе, кодируют одноцепочечный полипептид фактора IX, включающий легкую цепь, тяжелую цепь и полипептидный линкер, соединяющий С-конец легкой цепи с N-концом тяжелой цепи. Легкая цепь полипептида фактора IX кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS06-LC-NA (SEQ ID NO: 50), которая является частью CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9), кодирующей легкую цепь фактор IX. Тяжелая цепь полипептида фактора IX кодируется второй нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS06-HC-NA (SEQ ID NO: 49), которая является частью CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9) кодирующей тяжелой цепи фактора IX. Полипептидный линкер включает сайты расщепления фактора XI, которые позволяют созревание in vivo (например, после экспрессии предшественника одноцепочечного полипептида фактора IX).

[00289] В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS06-LC-NA и CS06-HC-NA (SEQ ID NO: 50 и 49) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 96% идентичность последовательности с CS06-LC-NA и CS06-HC-NA (SEQ ID NO: 50 и 49) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 97% идентичность последовательности с CS06-LC-NA и CS06-HC-NA (SEQ ID NO: 50 и 49) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 98% идентичность последовательности с CS06-LC-NA и CS06-HC-NA (SEQ ID NO: 50 и 49) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99% идентичность последовательности с CS06-LC-NA и CS06-HC-NA (SEQ ID NO: 50 и 49) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99,5% идентичность последовательности с CS06-LC-NA и CS06-HC-NA (SEQ ID NO: 50 и 49) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности с CS06-LC-NA и CS06-HC-NA (SEQ ID NO: 50 и 49) соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности представляют собой CS06-LC-NA и CS06-HC-NA (SEQ ID NO: 50 и 49) соответственно.

[00290] В некоторых вариантах осуществления полипептидный линкер конструкции фактора IX кодируется третьей нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS06-AP-NA (SEQ ID NO: 61), которая является кодон-измененной последовательностью, кодирующей полипептид активации фактора IX дикого типа, например, аминокислоты 192-226 FIX-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность с CS06-AP-NA (SEQ ID NO: 61). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 90% идентичность с CS06-AP-NA (SEQ ID NO: 61). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичность с CS06-AP-NA (SEQ ID NO: 61). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичность с CS06-AP-NA (SEQ ID NO: 61). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичность с CS06-AP-NA (SEQ ID NO: 61). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичность с CS06-AP-NA (SEQ ID NO: 61). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичность с CS06-AP-NA (SEQ ID NO: 61). В некоторых вариантах осуществления третья нуклеотидная последовательность представляет собой CS06-AP-NA (SEQ ID NO: 61).

[00291] В некоторых вариантах кодированный полипептид фактора IX также включает сигнальный пептид (например, сигнальный пептид фактора IX) и/или пропептид (например, пропептид фактора IX). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид фактора IX дикого типа (FIX-SP-AA (SEQ ID NO: 37)). В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид кодируется кодон-измененной полинуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) с CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах воплощения пропептид представляет собой пропептид фактора IX дикого типа (FIX-PP-AA (SEQ ID NO: 38)). В некоторых вариантах осуществления пропептидный пептид кодируется кодон-измененной полинуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) с CS06-PP-NA ( SEQ ID NO: 35).

[00292] В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид фактора IX, например полипептид, кодируемый полинуклеотидом, обладающий высокой гомологией последовательности к CS06-LC-NA (SEQ ID NO:50) и CS06-HC-NA (SEQ ID NO: 49), имеет высокую идентичность последовательности с зрелой последовательностью одноцепочечного полипептида фактора IX дикого типа FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10) и/или зрелой одноцепочечной последовательностью варианта Падуя (hFIX (R384L)) FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12). Кодируемый полипептид фактора IX должен сохранять способность активироваться в функциональном белке фактора IXa (например, путем удаления любого сигнального пептида и пропептида и путем удаления активирующего полипептида).

[00293] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичности с FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIX-MP-AA (SEQ ID NO: 10).

[00294] В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 85% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида (например, в положении 338 зрелого одноцепочечного полипептида фактора IX FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12)). В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 90% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 95% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 96% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 97% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 98% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,5% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX имеет по меньшей мере 99,9% идентичность с FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12) и включает лейцин в положении 384 препрополипептида. В одном варианте осуществления последовательность кодируемого полипептида фактора IX представляет собой FIXp-MP-AA (SEQ ID NO: 12).

[00295] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг.1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает в себя самокомплементарный полинуклеотид структуры A, где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9).

[00296] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг.1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает в себя самокомплементарный полинуклеотид структуры B, где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9).

[00297] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг. 1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид структуры C (например, одноцепочечный полинуклеотид), где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9).

[00298] В некоторых вариантах осуществления, со ссылкой на фиг. 1, предоставляется композиция нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид структуры D (например, одноцепочечный полинуклеотид), где часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид фактора IX, который имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c одной из FIX-SP-NA (SEQ ID NO: 24), CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26), CS04-SP-NA ( SEQ ID NO: 27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28) и CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид фактора IX (необязательно в комбинации с последовательностью нуклеиновой кислоты сигнального пептида фактора IX, как описано выше), которая имеет идентичность по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и одной из FIX-PP-NA (SEQ ID NO: 30), CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31 ), CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34) и CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В некоторых вариантах осуществления часть кодирующей последовательности FIX полинуклеотида включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую препрополипептид фактора IX, который имеет идентичность по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100% с CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9).

Пропептиды и кодон-измененный сигнал фактора IX

[00299] В одном аспекте изобретение раскрывает кодон-измененные полинуклеотиды, кодирующие сигнальные пептиды фактора IX, пропептиды фактора IX и оба (например, препропептиды фактора IX). Такие кодон-измененные полинуклеотиды улучшают экспрессию фактора IX и могут быть размещены, например, против хода транскрипции относительно полинуклеотида, кодон-измененного или измененного иным образом, кодирующего одноцепочечный полипептид фактора IX (например, легкую цепь фактора IX, пептид активации и тяжелую цепь). Как правило, кодируемые пептиды представляют собой сигнальные пептиды фактора IX дикого типа (например, FIX-SP-AA (SEQ ID NO: 37)), пропептиды (например, FIX-PP-AA (SEQ ID NO: 38) и препропептиды (FIX-PPP-AA (SEQ ID NO: 36)).

[00300] В некоторых вариантах осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, кодирующие сигнальные пептиды, пропептиды и препропептиды фактора IX, имеют последовательность с высокой идентичностью (например, по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) с одной из CS02-SP-NA (SEQ ID NO:25), CS03-SP-NA (SEQ ID NO:26), CS04-SP-NA (SEQ ID NO:27), CS05-SP-NA (SEQ ID NO:28), CS06-SP-NA (SEQ ID NO:29), CS02-PP-NA (SEQ ID NO:31), CS03-PP-NA (SEQ ID NO:32), CS04-PP-NA (SEQ ID NO:33), CS05-PP-NA (SEQ ID NO:34), CS06-PP-NA (SEQ ID NO:35), CS02-PPP-NA (SEQ ID NO:19), CS03-PPP-NA (SEQ ID NO:20), CS04-PPP-NA (SEQ ID NO:21), CS05-PPP-NA (SEQ ID NO:22) и CS06-PPP-NA (SEQ ID NO:23).

Сигнал CS02 и пропептиды

[00301] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS02-SP-NA (SEQ ID NO: 25).

[00302] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий пропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий пропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS02-PP-NA (SEQ ID NO: 31).

[00303] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий препропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS02-PPP-NA (SEQ ID NO: 19). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий препропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS02-PPP-NA (SEQ ID NO: 19).

Сигнал CS03 и пропептиды

[00304] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS03-SP-NA (SEQ ID NO: 26).

[00305] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий пропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий пропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS03-PP-NA (SEQ ID NO: 32).

[00306] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий препропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS03-PPP-NA (SEQ ID NO: 20). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий препропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS03-PPP-NA (SEQ ID NO: 20).

Сигнал CS04 и пропептиды

[00307] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS04-SP-NA (SEQ ID NO: 27). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS04-SP-NA (SEQ ID NO: 27).

[00308] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий пропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий пропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS04-PP-NA (SEQ ID NO: 33).

[00309] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий препропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS04-PPP-NA (SEQ ID NO: 21). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий препропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS04-PPP-NA (SEQ ID NO: 21).

Сигнал CS05 и пропептиды

[00310] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS05-SP-NA (SEQ ID NO: 28).

[00311] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий пропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий пропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS05-PP-NA (SEQ ID NO: 34).

[00312] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий препропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS05-PPP-NA (SEQ ID NO: 22). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий препропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS05-PPP-NA (SEQ ID NO: 22).

Сигнал CS06 и пропептиды

[00313] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS06-SP-NA (SEQ ID NO: 29).

[00314] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий пропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий пропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS06-PP-NA (SEQ ID NO: 35).

[00315] В одном варианте осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий препропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с CS06-PPP-NA (SEQ ID NO: 23). В других вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий препропептид фактора IX, имеет по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с CS06-PPP-NA (SEQ ID NO: 23).

Векторы экспрессии фактора IX

[00316] В некоторых вариантах осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, описанные в данном документе, интегрированы в векторы экспрессии. Как будет понятно специалисту в данной области, многие формы векторов могут быть использованы для осуществления генной терапии фактором IX с использованием кодон-измененных полинуклеотидных последовательностей фактора IX, раскрытых в данном документе. Неограничивающие примеры экспрессирующих векторов включают вирусные векторы (например, векторы, подходящие для генной терапии), плазмидные векторы, векторы бактериофага, космиды, фагемиды, искусственные хромосомы и тому подобное.

[00317] В некоторых вариантах осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, описанные в данном документе, интегрированы в вирусный вектор генной терапии. Неограничивающие примеры вирусных векторов включают: ретровирус, например, вирус мышиного лейкоза Молони (MMLV), вирус мышиной саркомы Харви, вирус опухоли молочной железы мыши и вирус саркомы Рауса; аденовирусы, аденоассоциированные вирусы; вирусы типа SV40; полиомавирусы; вирусы Эпштейна-Барр; вирусы папилломы; вирусы герпеса; вирусы коровьей оспы; и вирусы полиомиелита.

[00318] В естественных условиях фактор IX синтезируется главным образом в печени. Таким образом, гепатоциты были выбраны в качестве подходящих клеток-хозяев для конструкций генной терапии фактором IX. Было показано, что несколько классов вирусных векторов пригодны для целевой доставки конструкции для генной терапии в печень, включая ретровирусные векторы (см., например, Axelrod et al., 1990; Kay et al., 1992; Van den Driessche et al., 1999 и Xu et al., 2003, 2005, раскрытия которых прямо включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте для всех целей), лентивирус (см., например, Ward et al., 2011, Brown et al., 2007 и Matrai et al., 2011, раскрытия которых прямо включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте для всех целей), аденоассоциированный вирус (AAV) (см., например, Herzog et al., 1999, раскрытие которого прямо включено в настоящий документ посредством ссылки во всей его полноте для всех целей), и аденовирусные векторы (см., например, Brown et al., 2004 и Ehrhardt & Kay, 2002, раскрытия которых прямо включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте для всех целей).

[00319] В некоторых вариантах осуществления вектор генной терапии представляет собой ретровирус и, в частности, ретровирус с дефицитом репликации. Протоколы для получения ретровирусов с дефицитом репликации известны в данной области. Для обзора, см. Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) и Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

[00320] В одном варианте осуществления вектор генной терапии представляет собой вектор генной терапии на основе аденоассоциированного вируса (AAV). AAV-системы были описаны ранее и в целом хорошо известны в данной области (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17 (6): 1110-17 (1994); Cotten et al., PNAS). U.S.A., 89(13):6094-98 (1992); Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994); Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992); и Asokan A, et al., Mol. Ther., 20(4): 699-708 (2012), каждый из которых включен сюда посредством ссылки во всей их полноте для всех целей). Подробности, касающиеся генерации и использования векторов rAAV, описаны, например, в патентах США №№ 5,139,941 и 4,797,368, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей. В конкретном варианте осуществления вектор AAV представляет собой вектор AAV-8.

[00321] Примерный вектор доставки AAV для специфической для печени экспрессии фактора IX описан в заявке WO 2009/130208, содержание которой прямо включено в настоящий документ посредством ссылки во всей его полноте для всех целей. Вектор представляет собой одноцепочечный вектор AAV, кодирующий человеческий фактор IX, и включает регуляторные последовательности TTR Serp, управляющие кДНК фактора. Вектор также включает интрон I гена человеческого фактора IX и сигнал полиаденилирования.

[00322] В некоторых вариантах осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, описанные в данном документе, интегрированы в ретровирусный вектор экспрессии. Эти системы были описаны ранее и обычно хорошо известны в данной области (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas и Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). В конкретном варианте осуществления ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор (см., например, Naldini et al., Science, 272 (5259): 263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15 (9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71 (9): 6641-6649, 1997; патент США. №№ 6 013 516 и 5 994 136).

[00323] В некоторых вариантах осуществления кодон-измененные полинуклеотиды, описанные в настоящем документе, можно вводить субъекту невирусным способом. Например, депротеинизированную ДНК можно вводить в клетку путем электропорации, сонопорации, бомбардировки частицами или гидродинамической доставки. ДНК также может быть инкапсулирована или связана с полимерами, например, липосомами, полисомами, полипелезами, дендримерами, и вводиться субъекту в виде комплекса. Аналогичным образом, ДНК может быть связана с неорганическими наночастицами, например частицами золота, кремния, оксида железа или фосфата кальция, или прикреплена к проникающим в клетки пептидам для доставки в клетки in vivo.

[00324] Кодон-измененные полинуклеотиды, кодирующие фактор IX, также могут быть включены в искусственные хромосомы, такие как экспрессия искусственных хромосом (ACE) (см., например, Lindenbaum et al., Nucleic Acids Res., 32 (21):e172 (2004)) и искусственные хромосомы млекопитающих (MAC). Для обзора см., например, Pérez-Luz and Diaz-Nido, J Biomed Biotechnol. 2010: Article ID 642804 (2010).

[00325] Для экспрессии полипептида фактора IX из кодон-измененного полипептида в клеточной культуре можно использовать различные векторы, включая эукариотические и прокариотические векторы экспрессии. В определенных вариантах осуществления для экспрессии полипептида фактора IX в клеточной культуре предполагается использовать плазмидный вектор. Как правило, плазмидные векторы, содержащие репликон и контрольные последовательности, полученные из видов, совместимых с клеткой-хозяином, используются в связи с этими хозяевами. Вектор может нести сайт репликации, а также маркирующие последовательности, которые способны обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Плазмида будет включать кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора IX, функционально связанный с одной или несколькими контрольными последовательностями, например, промотором.

[00326] Неограничивающие примеры векторов для прокариотической экспрессии включают плазмиды, такие как pRSET, pET, pBAD и т. д., где промоторы, используемые в прокариотических векторах экспрессии, включают lac, trc, trp, recA, araBAD и т. д. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (i) векторы, такие как pAO, pPIC, pYES, pMET, с использованием промоторов, таких как AOX1, GAP, GAL1, AUG1 и т. д. для экспрессии в дрожжах; (ii) векторы, такие как pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC и т. д., с использованием промоторов, таких как PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh и т. д., для экспрессии в клетках насекомых и (iii) векторы, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV и т. д., и векторы, полученные из вирусных систем, таких как вирус коровьей оспы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса, ретровирусы и т. д., с использованием промоторов такие как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β актина для экспрессии в клетках млекопитающих.

[00327] В некоторых вариантах осуществления изобретение раскрывает вектор генной терапии AAV, который включает кодон-измененный полинуклеотид фактора IX, как описано в данном документе, последовательности внутреннего концевого повтора (ITR) на 5'- и 3'-концах вектора, один или несколько промоторов и/или последовательностей энхансера, которые функционально связаны с полинуклеотидом фактора IX, и сигнал полиаденилирования, следующий за 3'-концом полинуклеотидной последовательности фактора IX. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько последовательностей промотора и/или энхансера включают одну или несколько копий специфического для печени регуляторного контрольного элемента.

[00328] На фигуре 1 показано несколько примерных архитектур вектора генной терапии фактором IX в соответствии с некоторыми вариантами реализации. На фигуре 1А показан самокомплементарный вектор AAV, имеющий мутированный 5'-ITR, усеченные последовательности энхансера/промотора TTR, вирусную интронную последовательность MVM, кодон-измененную последовательность фактора IX, последовательность полиаденилирования и 3'-ITR. На фигуре 1В показан самокомплементарный вектор AAV, кодирующий полипептид фактора IX, аналогичный приведенному на фигуре 1А, но дополнительно включающий один или несколько (например, один, два, три или более) специфичных для печени регуляторных контрольных элементов. На фигуре 1C показан одноцепочечный вектор, имеющий те же элементы, что и приведенный на фигуре 1A, за исключением того, что 5'-ITR не мутирован, что предотвращает самокомплементарность. На фигуре 1D показан одноцепочечный вектор AAV, кодирующий полипептид фактора IX, аналогичный приведенному на фигуре 1А, но дополнительно включающий один или несколько (например, один, два, три или более) специфичных для печени регуляторных контрольных элементов. Хотя данные иллюстрации приведены для белка фактора IX, который включает аминокислотную замену R384L «Падуя» на фигуре 1, в некоторых вариантах осуществления нуклеотидная конструкция фактора IX имеет общую структуру, как изображено на фигуре 1 (например, структура А, В, С или D) кодирующую белок фактора IX, который не включает аминокислотную замену R384L «Падуя».

[00329] На фигуре 25 показана нуклеотидная последовательность вектора генной терапии фактором IX AAV CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40), которая представляет архитектуру вектора генной терапии, проиллюстрированную на фигуре 1D. Нуклеотиды 1-145 CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40) представляют собой последовательность 5'-ITR AAV2 (SEQ ID NO: 51). За последовательностью 5'-ITR следуют три копии печеночно-специфического регуляторного контрольного элемента CRM8 CRM8 (SEQ ID NO: 39) в нуклеотидах 165-236, 238-309 и 311-382. Следующая последовательность CRM8 представляет собой усеченную последовательность энхансер/промотор TTR (SEQ ID NO: 52) в нуклеотидах 383-712. Затем вектор включает интрон мелкого вируса мышей (MVM) (SEQ ID NO: 53) в нуклеотидах 724-800. Нуклеотиды 814-2199 вектора представляют собой кодирующую последовательность фактора IX (R384L) CS06 с измененным кодоном (CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9)). За полинуклеотидной последовательностью фактора IX следует сигнал полиаденилирования BGH в нуклеотидах 2208-2441 и, наконец, последовательность 3'-ITR AAV2 (SEQ ID NO: 55) в нуклеотидах 2458-2602.

[00330] В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к полинуклеотиду фактора IX, содержащему последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность с нуклеотидами 1-2602 SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к полинуклеотиду фактора IX, содержащему последовательность, имеющую по меньшей мере 99% идентичность с нуклеотидами 1-2602 SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к полинуклеотиду фактора IX, содержащему последовательность, имеющую по меньшей мере 99,5% идентичность с нуклеотидами 1-2602 SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к полинуклеотиду фактора IX, содержащему последовательность нуклеотидов 1-2602 SEQ ID NO: 40.

[00331] Было охарактеризовано несколько серотипов AAV, включая AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 и AAV9. Как правило, любой серотип AAV можно использовать для описанных в данном документе конструкций генной терапии фактором IX. Однако серотипы имеют разные тропизмы, например, они преимущественно поражают разные ткани. В одном варианте осуществления, поскольку фактор IX продуцируется, главным образом, в печени, серотип AAV для раскрытых конструкций генной терапии выбирается на основе тропизма печени, обнаруженного по меньшей мере в серотипах AAV7, AAV8 и AAV9. Соответственно, в одном варианте осуществления конструкция для генной терапии фактором IX представляет собой вектор серотипа AAV7. В другом варианте осуществления конструкция для генной терапии фактором IX представляет собой вектор серотипа AAV8. В еще одном варианте осуществления конструкция для генной терапии фактором IX представляет собой вектор серотипа AAV9.

[00332] Конструкции для генной терапии фактором IX, описанные в данном документе, могут быть одноцепочечными (например, вектор ssAAV, как показано на фиг. 1C и 1D) или самокомплементарными (например, вектор scAAV, как показано на фиг. 1A и 1B). Хотя исследования и теория предполагают, что самокомплементарные векторы AAV должны способствовать лучшей экспрессии трансгена, обходя требование синтеза второй цепи перед трансляцией, были выявлены одноцепочечные векторы AAV, способствующие лучшей экспрессии фактора IX в сравнении с сопоставимыми самокомплементарными векторами, как сообщается в Примере 5.

Промоторы и энхансеры

[00333] Конструкции для генной терапии фактором IX, описанные в данном документе, обычно включают один или несколько промоторных и/или энхансерных элементов, которые управляют экспрессией генов in vivo, например регуляторные элементы. В некоторых вариантах осуществления промоторный или энхансерный элемент стимулирует экспрессию в зависимости от ткани, например, преимущественно в конкретной ткани. Поскольку фактор IX синтезируется главным образом в печени, в некоторых вариантах осуществления векторы генной терапии, описанные в данном документе, включают специфический для печени регуляторный элемент, который по существу ограничивает экспрессию вектора генной терапии до клеток печени.

[00334] Как правило, специфичные для печени регуляторные элементы могут быть получены из любого гена, о котором известно, что он экспрессируется исключительно в печени. В WO 2009/130208 идентифицированы несколько генов, экспрессируемых специфическим для печени образом, включая ингибитор серпинпептидазы, член 1 клады А, также известный как α-антитрипсин (SERPINA1; GeneID 5265), аполипопротеин C-I (APOC1; GeneID 341), аполипопротеин C-IV (APOC4; GeneID 346), аполипопротеин H (APOH; GeneID 350); транстиретин (TTR; GeneID 7276), альбумин (ALB; GeneID 213), альдолаза B (ALDOB; GeneID 229), полипептид 1 подсемейства E семейства 2 цитохрома P450 (CYP2E1; GeneID 1571), альфа-цепь фибриногена (FGA; GeneID 2243), трансферрин (TF; GeneID 7018), белок, связанный с гаптоглобином (HPR; GeneID 3250). В некоторых вариантах осуществления конструкции для генной терапии фактором IX, описанные в данном документе, включают специфический для печени регуляторный элемент, полученный из геномных локусов одного или нескольких из этих белков. Несколько примеров таких элементов описаны в заявке WO 2009/130208, содержание которой прямо включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00335] Одним из примеров специфического для печени регуляторного элемента является ген транстиретина (TTR), обычно называемый «TTRe» или «TTREnh». См. Hsieh JL, et al., Cancer Sci., 100(3):537-45 (2009), содержание которой прямо включено сюда посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. В некоторых вариантах осуществления конструкции для генной терапии фактором IX, описанные в данном документе, включают усеченные элементы энхансера и промотора TTR. Пример этих элементов представлен в нуклеотидах 383-712 CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40), представленных на фиг. 25. В некоторых вариантах осуществления усеченный энхансер и промоторный элемент TTR имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 383-712 CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40). В других вариантах осуществления усеченный энхансер TTR и промоторный элемент имеют по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 100% идентичность последовательности с нуклеотидами 383-712 CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40).

[00336] Другим примером специфичного для печени регуляторного элемента является ген SERPINA1 в соответствии с описанным в публикации РСТ № WO 2016/146757, содержание которой специально включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Примером такого элемента является регуляторный контрольный элемент CRM8 (SEQ ID NO: 39), предоставленный в нуклеотидах 165-236 CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40). В некоторых вариантах осуществления регуляторный контрольный элемент, полученный из SERPINA1, имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с CRM8 (SEQ ID NO: 39). В других вариантах осуществления усеченный регуляторный элемент, полученный из SERPINA1, имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с CRM8 (SEQ ID NO: 39).

[00337] В некоторых вариантах осуществления конструкция для генной терапии фактором IX включает один или несколько регуляторных контрольных элементов, полученных из SERPINA1, примером чего являются конструкции, показанные на фиг. 1B и 1D. В одном варианте осуществления конструкция включает в себя один регуляторный контрольный элемент, полученный из SERPINA1 (например, CRM8). В другом варианте осуществления конструкция включает два регуляторных контрольных элемента, полученных из SERPINA1 (например, CRM8). В другом варианте осуществления конструкция включает три регуляторных контрольных элемента, полученных из SERPINA1 (например, CRM8). В еще других вариантах осуществления конструкция включает 4, 5, 6 или более полученных из SERPINA1 регуляторных контрольных элемента (например, CRM8).

[00338] В одном варианте осуществления конструкция для генной терапии фактором IX включает один или несколько регуляторных контрольных элементов, полученных из SERPINA1 (например, CRM8), и усеченный элемент энхансера и промотора TTR, как проиллюстрировано на фиг. 1B, 1D и 25.

Интроны

[00339] В некоторых вариантах осуществления конструкции для генной терапии фактором IX, описанные в данном документе, включают интрон, например, полученный из вируса интрон, для повышения экспрессии гена фактора IX. Подходящие интроны для экспрессии конструкций для генной терапии известны в данной области. Как правило, интрон расположен в направлении к 5'-концу от последовательности, кодирующей трансген, как показано в конструкциях фактора IX, показанных на фиг. 1 и фиг. 25. Однако в некоторых вариантах осуществления интрон может быть расположен внутри последовательности, кодирующей трансген, например, в природном соединении интрона фактора IX или иным образом, или в направлении к 3'-концу от последовательности, кодирующей трансген. Неограничивающие примеры интронов, которые можно использовать в конструкциях для генной терапии фактором IX, описанных в данном документе, включают интроны, полученные из интронов мелкого вируса мышей (MVM), интронов бета-глобина (betalVS-ll), интронов А фактора IX (FIX), малых Т-интронов обезьяньего вируса 40 (SV40) и бета-актиновых интронов.

[00340] В одном варианте осуществления конструкции для генной терапии фактором IX, описанные в данном документе, включают интрон, полученный из MVM, например, как показано на фиг. 1, и примером которого является интрон MVM (SEQ ID NO: 53) в нуклеотидах 724-800 CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40) на фиг. 25. В некоторых вариантах осуществления интрон, используемый в конструкциях для генной терапии, описанных в данном документе, имеет по меньшей мере 85% идентичности последовательности с MVM (SEQ ID NO: 53). В других вариантах осуществления интрон, используемый в конструкциях для генной терапии, описанных в данном документе, имеет идентичность последовательности по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% с MVM (SEQ ID NO: 53).

Сигналы полиаденилирования

[00341] В некоторых вариантах осуществления конструкции для генной терапии фактором IX, описанные в данном документе, включают сигнал полиаденилирования, например, как показано на фиг. 1. Сигнал полиаденилирования направляет синтез поли-А-хвоста на 3'-конце транскрипта мРНК, полученного из трансгена фактора IX. Соответственно, сигнал полиаденилирования расположен в направлении 3'-конца относительно кодирующей последовательности фактора IX. Неограничивающие примеры сигналов полиаденилирования, которые можно использовать в конструкциях для генной терапии фактором IX, описанных в данном документе, включают в себя сигналы полиаденилирования, полученные из «позднего» гена вируса обезьяньего вируса 40 (SV40), сигнала полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (BGH) и минимального гена кроличьего β-глобина (mRBG).

[00342] В одном варианте осуществления конструкции для генной терапии фактором IX, описанные в данном документе, включают сигнал полиаденилирования, полученный из сигнала полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (BGH), например, как проиллюстрировано на фиг. 1 и примером которого является сигнал BGHpA (SEQ ID NO: 54) в нуклеотидах 2208-2441 CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40) на фигуре 25. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования, используемый в конструкциях для генной терапии, описанных в данном документе, имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с сигналом BGHpA (SEQ ID NO: 54). В других вариантах осуществления сигнал полиаденилирования, используемый в конструкциях для генной терапии, описанных в данном документе, имеет идентичность последовательности по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% с сигналом BGHpA (SEQ ID NO: 54).

Способы

Получение

[00343] Описанные в данном документе кодон-измененные полинуклеотиды и вирусные векторы фактора IX (например, композиции нуклеиновых кислот) получают в соответствии с общепринятыми способами амплификации нуклеиновых кислот и продуцирования векторов. Для крупномасштабного производства рекомбинантных векторов AAV были разработаны две основные платформы. Первая платформа основана на репликации в клетках млекопитающих, а вторая основана на репликации в клетках беспозвоночных. Для обзора см. Kotin R.M., Hum. Mol. Genet., 20 (R1): R2-6 (2011), содержание которого прямо включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00344] Соответственно, настоящее изобретение относится к способам получения частиц аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления способы включают введение кодон-измененной полинуклеотидной конструкции фактора IX, имеющей высокую идентичность нуклеотидной последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100%) с одной из последовательностей CS02, CS03, CS04, CS05 или CS06, в соответствии с описанным в данном документе, в клетку-хозяина, где полинуклеотидная конструкция обладает компетенцией для репликации в клетке-хозяине.

[00345] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина млекопитающего, например клетку HEK, CHO или BHK. В конкретных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку HEK 293. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку беспозвоночного, например, клетку насекомого. В специфическом варианте реализации клетка-хозяин представляет собой клетку SF9.

Составы

[00346] В данном документе представлены композиции для применения при лечении нарушений свертываемости крови. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество кодон-измененного полинуклеотида фактора IX, например, вектора генной терапии AAV, включающего кодон-измененный полинуклеотид, кодирующий фактор IX, в соответствии с описанным в данном документе. Терапевтически эффективные количества кодон-измененного полинуклеотида FIX (например, вектор генной терапии AAV, включающий кодон-измененную последовательность фактора IX) смешивают с подходящим фармацевтическим носителем или носителем для системного, местного или местного введения. Окончательный состав полинуклеотидов с кодон-измененным фактором IX, раскрытых в данном документе, будет в пределах возможностей специалистов в данной области.

Дозировки

[00347] Композиции нуклеиновых кислот по изобретению вводят нуждающимся в этом пациентам. Количество или доза вводимого терапевтического средства для генной терапии зависит от таких факторов, как конкретная кодон-измененная полинуклеотидная конструкция FIX, используемый вектор доставки, тяжесть заболевания и общие характеристики субъекта. Точная доза будет зависеть от цели лечения и устанавливаться специалистом в данной области техники с использованием известных методик (см., например, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 13, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins). Опытный врач может определить конкретную дозировку и режим дозирования для лечения конкретного субъекта.

[00348] В некоторых вариантах осуществления вектор генной терапии (например, частица вектора генной терапии AAV), содержащий кодон-измененный полинуклеотид фактора IX, вводят внутривенно в терапевтически эффективной дозе субъекту, нуждающемуся в этом (например, субъекту с легкой, умеренной, или тяжелой гемофилией B). В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза составляет от примерно 2×10Е11 до 2×10Е14 векторных геномов на килограмм массы тела субъекта. В конкретном варианте осуществления терапевтически эффективная доза составляет от примерно 2×10Е12 до 2×10Е13 векторных геномов на килограмм массы тела субъекта. В некоторых вариантах субъекту вводят примерно 2×10E11, 3×10E11, 4×10E11, 5×10E11, 6×10E11, 7×10E11, 8×10E11, 9×10E11, 1×10E12, 2×10E12, 3×10E12, 4×10E12, 5×10E12, 6×10E12, 7×10E12, 8×10E12, 9×10E12, 1×10E13, 2×10E13, 3×10E13, 4×10E13, 5×10E13, 6×10E13, 7×10E13, 8×10E13, 9×10E13, 1×10E14 или 2×10E14 векторных геномов на килограмм массы тела субъекта.

[00349] Соответственно, раскрытие предоставляет способы лечения дефицита фактора IX (например, гемофилии B). В некоторых вариантах осуществления способы включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, кодон-измененной полинуклеотидной конструкции фактора IX, имеющей высокую идентичность нуклеотидной последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100%) с одной из последовательностей CS02, CS03, CS04, CS05 или CS06, в соответствии с описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид фактора имеет высокую идентичность последовательности с кодон-измененной препрополипептидной кодирующей последовательностью фактора IX, например высокую идентичность последовательности с одной из CS02-FL-NA (SEQ ID NO: 5), CS03-FL-NA (SEQ ID NO: 6), CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 7), CS05-FL-NA (SEQ ID NO: 8) или CS06-FL-NA (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах осуществления кодон-измененный полинуклеотид фактора имеет высокую идентичность последовательности с кодон-измененной зрелой одноцепочечной кодирующей последовательностью фактора IX, например высокую идентичность последовательности с одной из CS02-MP-NA (SEQ ID NO: 13), CS03-MP-NA (SEQ ID NO: 14), CS04-MP-NA (SEQ ID NO: 15), CS05-MP-NA (SEQ ID NO: 16) или CS06-MP-NA (SEQ ID NO: 17).

[00350] В некоторых вариантах осуществления лечение включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, вектора генной терапии, включающего кодон-измененную полинуклеотидную конструкцию фактора IX, имеющую высокую идентичность нуклеотидной последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 99,5%, 99,9% или 100%) с одной из последовательностей CS02, CS03, CS04, CS05 или CS06, в соответствии с описанным в данном документе. В одном варианте осуществления вектор генной терапии представляет собой вектор генной терапии млекопитающих. В конкретном варианте осуществления вектор генной терапии млекопитающих представляет собой вирусный вектор, например, лентивирус, ретровирус, аденовирус или аденоассоциированный вирусный вектор.

[00351] В одном варианте осуществления вектор генной терапии представляет собой частицу аденоассоциированного вируса (AAV), содержащую вирусный вектор, кодирующий кодон-измененную кодирующую последовательность фактора IX. Обычно вирусный вектор включает в себя инвертированные концевые повторы (ITR) на каждом конце, один или несколько регуляторных элементов экспрессии, кодон-измененную кодирующую последовательность фактора IX и сигнальную последовательность поли-А. В конкретном варианте осуществления вектор генной терапии включает специфический для печени регуляторный контрольный элемент (например, одну или несколько копий элемента CRM8).

Получение

[00352] Описанные в данном документе кодон-измененные полинуклеотиды и вирусные векторы фактора IX (например, композиции нуклеиновых кислот) получают в соответствии с общепринятыми способами амплификации нуклеиновых кислот и продуцирования векторов. Для крупномасштабного производства рекомбинантных векторов AAV были разработаны две основные платформы. Первая платформа основана на репликации в клетках млекопитающих, а вторая основана на репликации в клетках беспозвоночных. Для обзора см. Kotin R.M., Hum. Mol. Genet., 20 (R1): R2-6 (2011), содержание которого прямо включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00353] Соответственно, настоящее изобретение относится к способам получения частиц аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления способы включают введение кодон-измененной полинуклеотидной конструкции фактора IX, имеющей высокую идентичность нуклеотидной последовательности (например, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 100%) с одной из последовательностей CS02, CS03, CS04, CS05 или CS06, в соответствии с описанным в данном документе, в клетку-хозяина, где полинуклеотидная конструкция обладает компетенцией для репликации в клетке-хозяине.

[00354] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина млекопитающего, например клетку HEK, CHO или BHK. В конкретных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку HEK 293. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку беспозвоночного, например, клетку насекомого. В специфическом варианте реализации клетка-хозяин представляет собой клетку SF9.

Лечение

[00355] В некоторых вариантах осуществления композиции нуклеиновых кислот (например, кодон-измененные полинуклеотиды), описанные в данном документе, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, в соответствии с известными способами введения. Способы введения векторов генной терапии хорошо известны в данной области. К ним относятся, без ограничения, внутривенное введение, внутримышечная инъекция, интерстициальная инъекция и внутрипеченочное введение (например, через внутрипеченочную артерию или вену). Например, см. Chuah MK et al., Hum Gene Ther., 23(6):557-65 (2012); Chuah MK et al., J Thromb Haemost., 10(8):1566-69 (2012); Chuah MK et al., J Thromb Haemost. 11 Suppl 1:99-110 (2013); VandenDriessche et al., Hum Gene Ther. 23(1):4-6 (2012); High KA, Blood, 120(23):4482-87 (2012); Matrai et al., Mol Ther., 18(3):477-90 (2010); and Matrai et al., Curr Opin Hematol., 17(5):387-92 (2010), каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки для обзора.

Оценка терапевтической эффективности

[00356] Терапевтическую эффективность лечения гемофилии В можно оценить, например, путем измерения зависимого от фактора IX потенциала коагуляции у субъекта подвергающегося лечению. Метрики для оценки потенциала коагуляции включают, без ограничения, анализ in vitro частичного тромбопластинового времени (APPT), анализы хромогенной активности фактора IX, время свертывания крови и уровни антигена фактора IX (например, с использованием ИФА, специфического для фактора IX). Следует отметить, что терапевтическая доза должна приводить не к уровням FIX дикого типа у пациента; а, скорее, к экспрессии, достаточной для уменьшения симптомов значимым или измеримым способом, что и считается терапевтическим для целей изобретения.

[00357] По данным Национального фонда гемофилии, субъект классифицируется как имеющий легкую гемофилию B, когда в его плазме крови содержится от 6 до 49% активности фактора IX относительно показателей нормальной плазмы крови человека. Субъекты с легкой формой гемофилии В обычно испытывают кровотечение только после серьезного ранения, травмы или операции. Во многих случаях легкая гемофилия не диагностируется, пока травма, операция или удаление зуба не приводят к длительному кровотечению. Первый эпизод может не произойти до совершеннолетия. Женщины с легкой гемофилией часто испытывают меноррагию, тяжелые менструальные периоды и могут сталкиваться с кровотечениями после родов.

[00358] По данным Национального фонда гемофилии, субъект классифицируется как имеющий умеренную гемофилию B, когда в его плазме крови содержится от 1 до 5% активности фактора IX относительно показателей нормальной плазмы крови человека. Субъекты с умеренной гемофилией В, как правило, имеют кровотечения после травм. Кровотечения, которые возникают без очевидной причины, называются эпизодами спонтанного кровотечения.

[00359] По данным Национального фонда гемофилии, субъект классифицируется как имеющий тяжелую гемофилию B, когда в его плазме крови содержится менее 1% активности фактора IX относительно показателей нормальной плазмы крови человека. Субъекты с тяжелой гемофилией В испытывают кровотечение после травмы и могут иметь частые эпизоды спонтанного кровотечения, часто в суставах и мышцах.

[00360] В некоторых вариантах осуществления нормальная плазма крови человека определяется как содержащая 1 МЕ активности фактора IX на мл. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления плазма крови субъекта, классифицированного как имеющего легкую гемофилию В, содержит от 0,06 до 0,49 МЕ активности фактора IX на мл. В некоторых вариантах осуществления плазма крови субъекта, классифицированного как имеющего умеренную гемофилию В, содержит от 0,01 до 0,05 МЕ активности фактора IX на мл. В некоторых вариантах осуществления плазма крови субъекта, классифицированного как имеющего тяжелую гемофилию B, содержит от 0,01 до 0,05 МЕ активности фактора IX на мл.

[00361] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления терапия гемофилии В является терапевтически эффективной, когда она повышает средний уровень активности фактора IX в крови/плазме субъекта. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное лечение повышает средний уровень активности фактора IX в крови/плазме субъекта по меньшей мере на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или более. В конкретном варианте осуществления терапевтически эффективная терапия гемофилии увеличивает среднюю активность фактора IX в крови/плазме субъекта по меньшей мере на 5%. В другом конкретном варианте осуществления терапевтически эффективная терапия гемофилии увеличивает среднюю активность фактора IX в крови/плазме субъекта по меньшей мере на 10%. В другом конкретном варианте осуществления терапевтически эффективная терапия гемофилии увеличивает среднюю активность фактора IX в крови/плазме субъекта по меньшей мере на 15%. В другом конкретном варианте осуществления терапевтически эффективная терапия гемофилии увеличивает среднюю активность фактора IX в крови/плазме субъекта по меньшей мере на 20%. В другом конкретном варианте осуществления терапевтически эффективная терапия гемофилии увеличивает среднюю активность фактора IX в крови/плазме субъекта по меньшей мере на 25%. В другом конкретном варианте осуществления терапевтически эффективная терапия гемофилии увеличивает среднюю активность фактора IX в крови/плазме субъекта по меньшей мере на 30%.

[00362] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное лечение повышает средний уровень активности фактора IX в крови субъекта, так что субъект классифицируется как имеющий менее тяжелую форму гемофилии B. Например, в одном варианте осуществления субъект первоначально классифицирован как имеющий тяжелую форму гемофилии B, повторно классифицируется как имеющий умеренную гемофилию B или легкую гемофилию B после прохождения терапевтически эффективного лечения. В другом варианте осуществления субъект, первоначально классифицированный как имеющий умеренную гемофилию B, повторно классифицируется как имеющий легкую гемофилию B после прохождения терапевтически эффективного лечения.

Примеры

Пример 1. Последовательности экспрессии кодон-измененного фактора IX повышают уровни экспрессии FIX

[00363] Для создания конструкций для генной терапии, обеспечивающих улучшенную экспрессию гетерологичного фактора IX in vivo, была сконструирована панель самокомплементарных векторов на основе AAV8, кодирующих полноразмерный препробелок фактора IX с аминокислотной заменой R384L (FIXp-FL-AA SEQ ID NO:4)). Кодирующая последовательность фактора IX каждой конструкции была изменена для улучшения экспрессии у людей в несколько этапов. Каждая кодирующая последовательность фактора IX была модифицирована в соответствии с алгоритмом, разработанным для учета предпочтительных/нежелательных мотивов последовательности и для смещения использования кодонов в сторону предпочтительных человеческих кодонов. На данном первом этапе было использовано несколько алгоритмов, как показано в таблице 2. Промежуточные кодон-измененные последовательности, полученные в результате применения алгоритмов, представленных в таблице 2, затем были дополнительно модифицированы вручную для уменьшения или исключения динуклеотидов CpG, после чего были проведены коррекции конечного содержания GC, коррекции с учетом предпочтительных пар кодонов, коррекции для избежания неблагоприятных пар кодонов и регулировки окончательного использования кодонов. Для получения дополнительной информации об этих соображениях см., например, Fath S. et al., PLoS. One., 6, e17596 (2011); Haas J. et al., Curr. Biol., 6, 315-324 (1996); Tats A., BMC Genomics. 9:463 (2008), Grote A. et al., Nucleic Acids Research, 33(Web Server issue), W526-W531 (2005), Mirsafian H. et al., Scientific World Journal., 639682 (2014) и Pechmann S. et al., Nat Struct Mol Biol. 20(2):237-43 (2013), содержание которых прямо включено в настоящий документ посредством ссылки, во всей своей полноте, для всех целей, особенно в отношении учения о соображениях об изменениях кодонов.

[00364] Каждая сгенерированная кодон-измененная кодирующая последовательность (например, CS02, CS03, CS04, CS05 и CS06, показанная на фиг. 5-9 соответственно) кодируется для идентичного белка FIX(R384L) (FIXp-FL-AA (SEQ ID NO: 4)). Конструкции CS02, CS03 и CS04 не содержат мотивов CpG, тогда как CS05 и CS06 содержат 11 и 3 CpG соответственно.

[00365] Для использования в качестве контролей также были получены векторные конструкции, включающие последовательности, кодирующие FIX дикого типа, с аминокислотными заменами R384L Падуя и без них. Конструкция WH01 кодирует препробелок FIX дикого типа без мутации R384L Падуя и включает 20 CpG-динуклеотидов. Конструкция WH02 кодирует препробелок FIX дикого типа с мутацией R384L Падуя и включает 19 CpG-динуклеотидов.

[00366] Кодирующие последовательности конструкций WH01 и WH02 включают 20 и 19 CpG соответственно. В противоположность, конструкции CS02, CS03 и CS04 не содержат мотивов CpG, тогда как конструкции CS05 и CS06 содержат 11 и 3 CpG соответственно.

[00367] Как показано на фиг. 1А, кодон-измененные кодирующие последовательности фактора IX были вставлены в трансгенную кассету аденоассоциированного вируса («AAV»), содержащую энхансер/промотор мышиного транстиретрина (SEQ ID NO: 52), интрон мелкого вируса мыши ( «MVM»), (SEQ ID NO: 53), кодон-измененную конструкцию FIX, включающую аминокислотную замену R384L «Падуя» (патент США № 6531298; Simione et al., NEJM 361:1671-75 (2009); мутация R384L обычно описывается как мутация R338L, относящаяся к положению аргинина дикого типа в одноцепочечном белке FIX человека, в котором отсутствует сигнал и пропептид), за которым следует элемент поли-A гормона роста крупного рогатого скота (SEQ ID NO: 54). Генная кассета фланкирована инвертированными концевыми повторами AAV2 («ITR») (SEQ ID NO: 51 и 55). Левый повтор ITR включает мутацию в терминальном сайте разрешения конкатемера, приводящую к самокомплементарному (sc) фенотипу векторов. Базовая конструкция вектора подробно описана в Wu et al., Mol. Ther. 16:280-89 (2008) и в публикации РСТ № WO 2014/064277 А1, содержание которой включено сюда в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей.

[00368] Конструкции AAV CS и WH фактора IX вводили мышам, нокаутированным по FIX B6/129P2-F9tm1Dws (описано в Lin et al., Blood, 90:3962-66 (1997), содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки в его целиком, для любых целей). Разведения вектора AAV вводили животным (4-8 животных в группе) через боковую хвостовую вену на основе массы тела отдельных животных (4×10E11 векторных геномов/килограмм (вг/кг) массы тела). Образцы крови собирали через определенные промежутки времени после введения дозы путем ретроорбитальной пункции в соответствии с известными процедурами с использованием стеклянных капилляров. Затем кровь переносили в пробирку, предварительно заполненную антикоагулянтом цитратом натрия, плазму получали стандартными процедурами и замораживали при -20°C.

Определяли экспрессию различных конструкций фактора IX и уровни FIX в плазме на 14 день у мышей, нокаутированных по FIX, использовали для оценки эффективности конструкций после инъекции векторов мышам в хвостовую вену, как показано в таблице 2. К 14 дню уровни экспрессии в модели нокаутированной мыши почти достигли максимальной экспрессии FIX. Как показано в таблице 2, контрольная конструкция WH02 FIX (R384L) экспрессировалась в 1,03 единицах FIX на 14 день после введения 4×10E11 векторных геномов/килограмм (вг/кг) массы тела. Данный уровень экспрессии использовали в качестве базовой линии для определения кратности обогащения кодон-измененных конструкций фактора IX. Как показано в таблице 2, кодон-измененные конструкции CS обеспечивали примерно 2-кратное и 4-кратное повышение экспрессии по сравнению с контрольной конструкцией WH02, кодируемой полинуклеотидной последовательностью дикого типа. В частности, кодон-измененная конструкция CS06 обеспечивала в 4,2 раза большую активность фактора IX, чем контрольная конструкция WH02, и в 21,6 раза большую активность фактора IX, чем контрольная конструкция WH01 (фактор IX дикого типа).

Таблица 2. Экспрессия фактора IX из контрактов с последовательностями кодонов дикого типа (WH01-wtFIX; WH02-FIX (R384L) и кодон-измененными последовательностями (CS02-CS06).

AAV Конструкция	Модификация векторного генома	Количество CpG	День 14, уровни экспрессии [% чел. FIX]	Кратность экспрессии по сравнению с WH01	Кратность экспрессии по сравнению с WH02
WH01	Человеческая последовательность FIX дикого типа (GeneBank NM000133.3) без мутации R338L (Падуя)	20	0,20	1,0	0,19
WH02	Последовательность FIX человека дикого типа с мутацией R338L (Падуя)	19	1,03	5,2	1,0
CS02	Последовательность FIX человека с мутацией R338L; базовый алгоритм Geneart дополнительно оптимизирован для кодонов человеческого сывороточного альбумина.	0	2,12	10,6	2,1
CS03	Последовательность FIX человека с мутацией R338L; базовый алгоритм Geneart далее оптимизирован для наиболее часто используемых человеческих кодонов (Haas et al., 1996. Curr Biol. 6, 315-324).	0	1,98	9,9	1,9
CS04	Последовательность FIX человека с мутацией R338L; базовый алгоритм Geneart далее оптимизирован для использования печеночных кодонов, как описано в Uhlen et al., 2015 Science 347, 6220.	0	2,77	13,9	2,7
CS05	Последовательность FIX человека с мутацией R338L; алгоритм JCAT, модифицированный для уменьшения CpG; (Grote et al., 2005. Nucleic Acids Res 1,33).	11	3,93	19,7	3,8
CS06	Последовательность FIX человека с мутацией R338L; базовый алгоритм Geneart далее оптимизирован для наиболее часто используемых человеческих кодонов (Haas et al., 1996. Curr Biol. 6, 315-324).	3	4,32	21,6	4,2

Пример 2. Специфичные для печени элементы CRM8 усиливают экспрессию FIX у мышей

[00369] Для дальнейшего увеличения экспрессии фактора IX и активности кодон-измененных конструкций, от одной до трех копий специфичного для печени цис-регуляторного контрольного элемента (CRM8 (SEQ ID NO: 39)), как сообщается в Nair et al., Blood 123:3195-99 (2014) были включены в генную кассету с созданием конструкции, изображенной на рисунке 1B. Векторы AAV, содержащие кодон-измененную кодирующую последовательность FIX CS02 с нулем (CS02-CRM8.0-V), одним (CS02-CRM8.1-V), двумя (CS02-CRM8.2-V) или тремя (CS02- CRM8.3-V) контрольными элементами CRM8 вводили мышам дикого типа в хвостовую вену. Затем измеряли уровень человеческого антигена к FIX в плазме мыши с течением времени посредством анализа ИФА, специфического для FIX человека.

[00370] Как показано в таблице 3, использование регуляторных элементов CRM8 увеличивало экспрессию фактора IX in vivo примерно в 2 и 4 раза по сравнению с экспрессией у контрольной конструкции, в которой отсутствует элемент CRM8, через 21 день после заражения. Например, вектор CS02-CRM8.1-V, содержащий один элемент CRM8, обеспечивает двойную экспрессию FIX, как и контрольный вектор CS02-CRM8.0-V. Включение нескольких копий элемента CRM8 привело к дальнейшему улучшению такой экспрессии. Например, векторы, содержащие 2 копии элемента CRM8, обеспечивали трехкратную экспрессию, а векторы, содержащие 3 копии элемента CRM8, обеспечивали 3,4-кратную экспрессию относительно контрольного вектора.

Таблица 3. Уровни экспрессии фактора IX в плазме мышей дикого типа, которым вводили кодон-измененные векторы AAV с 0-3 копиями регуляторного контрольного элемента CRM8.

№	Конструкция AAV	Количество элементов CRM8	FIX (нг/мл) День 4	FIX (нг/мл) День 11	FIX (нг/мл) День 21	Кратное увеличение День 21
1	CS02-CRM8.0-scV	0	65,8	133,4	239,2	1,0
2	CS02-CRM8.1-scV	1	120,7	250,7	442,8	1,9
3	CS02-CRM8.2-scV	2	152,9	417,3	713,8	3,0
4	CS02-CRM8.3-scV	3	130,9	432,6	800,9	3,4

Пример 3. Специфичные для печени элементы CRM8 усиливают экспрессию FIX в клетках печени человека

[00371] Конструкции для генной терапии фактором IX CS02, содержащие 0-3 копии специфического для печени регуляторного контрольного элемента CRM8, как описано в примере 2, дополнительно тестировали посредством анализов биопотентности in vitro, проводимых с использованием клеточной линии печени человека HepG2. Вкратце, клетки HepG2 были инфицированы одним из векторов AAV CS02-CRM8-V, как описано в примере 2, и активность FIX была измерена с помощью хромогенного субстратного анализа через три дня после заражения. В соответствии с результатами, представленными в примере 2, все векторы, содержащие регуляторный контрольный элемент CRM8, обеспечивали более высокую экспрессию FIX, как показано в таблице 4. Поразительно, но эффект от использования нескольких элементов CRM8 в клетках человеческой печени HepG2 был выражен еще более значимо, чем в мышиной модели. Например, векторы, содержащие 2 копии элемента CRM8, обеспечивали 6,7-кратную экспрессию, а векторы, содержащие 3 копии элемента CRM8, обеспечивали 12,8-кратную экспрессию относительно контрольного вектора. Это подтверждает положительные эффекты, которые регуляторный контрольный элемент CRM8 оказывает на экспрессию FIX в таких векторах.

Таблица 4. Уровни экспрессии фактора IX в печеночных клетках HepG2 человека, в которые вводили кодон-измененные векторы AAV с 0-3 копиями регуляторного контрольного элемента CRM8.

Конструкция AAV	Количество элементов CRM8	Активность FIX [Единицы биологической активности]	Кратное увеличение
CS02-CRM8.0-scV	0	0,35	1
CS02-CRM8.1-scV	1	0,82	2,3
CS02-CRM8.2-scV	2	2,36	6,7
CS02-CRM8.3-scV	3	4,48	12,8

Пример 4. Одноцепочечные векторы AAV8 FIX обеспечивают экспрессию in vivo, аналогичную сопоставимым самокомплементарным векторам.

[00372] В некоторых случаях самокомплементарные (sc) векторы AAV экспрессируют трансгенную кассету более эффективно, чем аналогичный одноцепочечный (ss) вектор AAV. Вероятно, это связано с более быстрым образованием двухцепочечных нитей после снятия покрытия самокомплементарного векторного генома в ядре клетки. Для обзора см. McCarty D., Mol. Ther., (16): 1648-56 (2008), содержание которого включено сюда в качестве ссылки во всей своей полноте для всех целей.

[00373] Недавнее исследование подтвердило этот эффект с использованием вектора EGFP. Bell et al., Hum. Gene Ther. Methods, (27):228-37 (2016). Однако исследование также показало, что этот эффект был трансгенным и зависел от дозы. Например, кассета гена орнитинтранскарбамилазы (hOTC) человека в самокомплементарном векторе AAV8 показала лучшую экспрессию при низкой дозе в печени мышей по сравнению с соответствующим одноцепочечным вектором. Однако этот эффект не может быть продемонстрирован при высоких дозах, что позволяет предположить, что эффект, по меньшей мере в изученном не секретируемом гене, был трансгенным и зависел от дозы. Id.

[00374] В целях исследования свойств раскрытых кодон-измененных генных конструкций FIX в контексте одноцепочечного и самокомплементарного дизайна, одноцепочечные конструкции, несущие ген кодон-измененного FIX(R338L) CS06, и два интактных ITR были сконструированы с использованием и регулирующих контрольных элементов CRM8 и без них, как показано на фиг. 1D и 1C, соответственно. Одноцепочечные (ss) векторы были получены в клеточной системе HEK293, и экспрессию фактора IX сравнивали с экспрессией самокомплементарных конструкций, описанных в примерах 1-3.

[00375] Сначала самокомплементарные (sc) и одноцепочечные (ss) конструкции CS06-CRM8.0-V тестировали in vivo после инъекции мышам, нокаутированным по FIX B6/129P2-F9tm1Dws в соответствии с описанием выше. Удивительно, но, как показано в таблице 5, самокомплементарные (sc) и одноцепочечные (ss) векторные конструкции CS06 показали очень сходные уровни активности FIX в плазме, что указывает на то, что сообщаемое преимущество sc-векторов по сравнению с ss-векторами не дает наблюдается в кодон-измененных конструкциях фактора IX, описанных в данном документе. Экспрессия зависит от многих параметров, включая трансгенную конструкцию, стабильность транскрипта, используемые в конструкции промоторы, время и дозу. Как показано в таблице 5, в условиях, выбранных для коррекции кровотечения и получения долговременной экспрессии у мышей FIX ko, соответствующие векторы sc и ss обеспечивали по существу сходные уровни экспрессии.

[00376] Эффекты специфичного для печени регуляторного контрольного элемента CRM8 на экспрессию FIX также исследовали на основании одноцепочечного вектора. Как показано в таблице 5, включение одного элемента CRM8 в одноцепочечный вектор улучшало экспрессию FIX у мышей, нокаутированных по FIX B6/129P2-F9tm1Dws. Включение трех элементов CRM8 дополнительно улучшило экспрессию FIX одноцепочечной конструкции CS06 до уровней, чуть более чем в 2 раза превышающих самокомплементарный контрольный CS06 без элемента CRM8. По сравнению с конструкцией WH02 дикого типа, одноцепочечные векторы CS06 обеспечивали в 7 раз большую экспрессию в сочетании с тремя регуляторными контрольными элементами CRM8.

Таблица 5. Уровни экспрессии фактора IX у мышей, нокаутированных по FIX, которым вводили различные одноцепочечные (ss) и самокомплементарные (sc) векторы AAV с фактором IX.

Конструкция AAV	Количество элементов CRM8	Уровень экспрессии1 (д. 7)	Уровень экспресии (д. 14)	Уровень экспрессии (д. 28)	Кратное увеличение отн. CS06 (д. 7/д. 14/д. 28)	Кратное увеличение отн. WH02 (д. 7/д. 14/д. 28)
CS06-CRM8.0-ssV	0	1,38	2,73	2,99	0,7/0,9/0,9	1,5/2,7 /2,7
CS06-CRM8.1-ssV	1	1,92	3,57	3,47	1,0/1,1/1,0	2,1/3,5/3,2
CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO:40)	3	4,43	6,65	7,78	2,3/2,1/2,2	4,9/6,5/7,1
CS06-CRM8.0-scV	0	1,89	3,17	3,50	1,0/1,0/ 1,0	2,1/3,1/3,2
WH02-CRM8.0-scV	0	0,90	1,03	1,10	0,5/0,3/0,3	1,0
1 Активность FIX в международных единицах (среднее значение на основании результатов 7-8 мышей); д., день;

Пример 5. Одноцепочечные векторы FIX AAV8 обеспечивают лучшую экспрессию FIX в клетках печени человека, чем сопоставимые самокомплементарные векторы.

[00377] Экспрессию фактора IX одноцепочечных векторов CS06, описанных в примере 4, затем исследовали на культуре человеческих клеток HepG2 и сравнили с аналогичными самокомплементарными векторными конструкциями. В соответствии с результатами in vivo, представленными в примере 4, в клетках HepG2 одноцепочечные векторы CS06 без элемента CRM8 обеспечивали экспрессию FIX на несколько более низких уровнях, чем сравнительный самокомплементарный вектор. Однако включение одного элемента CRM8 увеличило экспрессию FIX одноцепочечного вектора CS06 до уровня, в 2,6 раза превышающего экспрессию самокомплементарного вектора CS06, как показано в таблице 6.

[00378] Однако самое удивительное, что включение трех элементов CRM8 в одноцепочечный вектор CS06 увеличило экспрессию FIX до уровня в 16,8 раз большего уровня экспрессии самокомплементарного вектора CS06. Повышенная экспрессия FIX более чем в 100 раз превышала экспрессию FIX контрольного вектора WH02. Таким образом, одноцепочечный вектор CS06, содержащий три элемента CRM8, обеспечивает наивысшие уровни экспрессии в анализах биопотентности как in vivo, так и in vitro.

[00379] Таблица 6. Уровни экспрессии фактора IX одноцепочечных (ss) и самокомплементарных векторов в клетках печени человека.

Конструкция AAV	Количество элементов CRM8	Активность FIX [Единицы биопотентности]	Кратное увеличение отн. CS06-CRM8.0-scV	Кратное увеличение отн. WH02-CRM8.0-scV
CS06-CRM8.0-ssV	0	0,24	0,6	3,9
CS06-CRM8.1-ssV	1	0,95	2,6	15,9
CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40)	3	6,20	16,8	103,3
CS06-CRM8.0-scV	0	0,37	1,0	6,2
WH02-CRM8.0-scV	0	0,06	0,2	1,0

Материалы и способы для примеров 1-5.

[00380] Эксперименты на животных. Для экспериментов на модели с нокаутом FIX использовали мышиный штамм FIX ko B6/129P2-F9tm1Dws (разработанный Lin et al., 1997. Blood 90:3962-6). В мышиной модели дикого типа использовали самцов мышей C57BL6-J Bl6 в возрасте 4-5 недель. Оба штамма были получены от коммерческих заводчиков. Разведения вектора AAV вводили животным (4-8 животных в группе) через боковую хвостовую вену на основе массы тела отдельных животных. Забор крови производился через определенные промежутки времени после введения дозы путем ретроорбитальной пункции в соответствии с известными процедурами с использованием стеклянных капилляров. Затем кровь переносили в пробирку, предварительно заполненную антикоагулянтом цитратом натрия, плазму получали стандартными процедурами и замораживали при -20°C.

[00381] Анализ биопотентности in vitro в клетках HepG2, включая анализ хромогенного субстрата FIX. Анализ биопотентности in vitro препаратов вектора генной терапии проводили на клеточной линии печени человека HepG2 (ATCC HB-8065). Клетки обрабатывали гидроксимочевиной, после чего инфицировали векторами AAV8FIX и инкубировали в течение приблизительно 96 часов. Во время инкубации FIX экспрессировался и высвобождался в супернатант клеток, и FIX-активность определялась путем измерения хромогенной конечной точки (Rossix AB, Sweden). Каждый анализ включает стандартную кривую очищенного векторного материала AAV-FIX с использованием MOI в диапазоне от 700 до 7000. Активность FIX стандарта при MOI 3270 принята в качестве 1 единицы биопотенциала (BPU).

Количественная оценка FIX человека в плазме мыши. Для количественной оценки человеческого FIX в плазме нокаутных мышей были проведены анализы коагуляции FIX с использованием стандартных анализов коагуляции FIX. Для количественной оценки человеческого антигена к FIX в плазме мышей дикого типа использовали коммерчески доступный набор ИФА (ASSERACHROM IX: AG (кат. № 00943 Stago BNL)), который специфически выявляет человеческий FIX.

Пример 6. Улучшенная транскрипционная эффективность за счет включения элементов CRM8.

[00382] Чтобы выяснить, является ли повышение биопотентности CRM8-содержащих векторов результатом повышения транскрипционной эффективности, клеточную линию печени человека (HepG2) и клетки печени мыши (нокаутированных по FIX мышей) трансдуцировали одноцепочечными векторами CS06, содержащими 0, 1 или 3 элемента CRM8. Уровни мРНК и ДНК FIX были определены и представлены как соотношение между нормализованными уровнями мРНК и ДНК FIX.

[00383] В модели in vitro включение одного элемента CRM8 (CS06-CRM8.1-ssV) или трех элементов CRM8 (CS06-CRM8.3-ssV (SEQ ID NO: 40)) привело к 5-кратному и 23-кратному увеличению уровней мРНК человеческого FIX в трансдуцированных клетках печени человека, по сравнению с клетками, трансдуцированными вектором, в котором отсутствует элемент CRM8 (CS06-CRM8.0-ssV) (таблица 6), соответственно. Аналогично, в модели in vivo экспрессия FIX в мышиной печени из векторов, содержащих один или три элемента CRM8, была в 2,0 раза и в 2,8 раза выше, чем экспрессия FIX из вектора, в котором отсутствовал элемент CRM8 (таблица 6), соответственно. Обе модели подтверждают, что элементы CRM8 оказывают положительный эффект, улучшая транскрипционную активность конструкции FIX.

[00384] Таблица 7. Уровни мРНК FIX после трансдукции AAV8-FIX клеточной линии печени человека или печени мыши.

	Клеточная линия печени (HepG2) in vitro	Ткань печени мыши in vitro
Конструкция AAV	Нормализованное соотношение FIX: мРНК/ДНК	Кратное увеличение отн. CS06-CRM8.0-ssV	Нормализованное соотношение FIX: мРНК/ДНК	Кратное увеличение отн. CS06-CRM8.0-ssV
CS06-CRM8.0-ssV	0,025	1	0,38	1
CS06-CRM8.1-ssV	0,14	5,4	0,78	2,0
CS06-CRM8.3-ssV	0,58	23,4	1,09	2,8

Способы для примера 6

[00385] Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени, включая экстракцию РНК и ДНК. Геномную ДНК и общую РНК экстрагировали из замороженной печени (см. эксперименты на животных) или клеток HepG2 (см. анализ биопотентности in vitro в клетках HepG2) с использованием стандартных процедур. Для аналитики экспериментов in vivo была выбрана подгруппа из трех животных на группу лечения, близкая к средней активности FIX соответствующей группы на 14-й день (рассчитано на основе среднего значения ± стандартное отклонение). Синтез кДНК проводили с использованием олиго(dT20)праймера, обратной транскриптазы (RT) SuperScript III и общей РНК, обработанной ДНКазой, в соответствии с руководством (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, Germany; RNeasy mini kit, Qiagen).

[00386] Количество копий трансгенных FIX в образцах как гДНК, так и кДНК определяли с помощью количественной полимеразной цепной реакции на основе флуоресценции в реальном времени (кПЦР), амплифицирующей последовательность экзона 6 FIX длиной 96 п. о. В качестве эндогенного контроля использовали β-актин мыши, который определяли количественно с использованием коммерчески доступного анализа TaqMan. Анализ данных кПЦР проводили с использованием программного обеспечения для конкретного устройства, вычисляя количество копий FIX или β-актина на реакцию на основе параметров линейной регрессии стандартной кривой. Кроме того, результаты были нормализованы к 1 мкг РНК или ДНК, и было рассчитано соотношение мРНК:ДНК.

Понятно, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей и что различные модификации или изменения в их свете будут предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в сущность и сферу применения этой заявки и объема прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патентные и патентные заявки, цитируемые в данном документе, в полном объеме и во всех целях включены посредством ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Baxalta Incorporated

Baxalta GmbH

Horling, Franziska

Lengler, Johannes

Falkner, Falko-Guenther

Rottensteiner, Hanspeter

Scheiflinger, Friedrich

<120> ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ, КОДИРУЮЩИЕ РЕКОМБИНАНТНЫЙ FIX С ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ

ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ ГЕМОФИЛИИ В

<130> 008073-5117-WO

<150> US 62/509 616

<151> 22.05.2017

<160> 64

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 1386

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-FL-NA

<400> 1

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt 120

ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt 180

gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac 240

actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat 300

ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc 360

tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga 420

tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga 480

tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga 540

gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac 600

tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca 660

tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg 720

caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa 780

tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt 840

gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt 900

cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa 960

ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020

tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080

cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140

acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200

gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa 1260

gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa 1320

tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc 1380

acttaa 1386

<210> 2

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-FL-AA

<400> 2

Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr

1. 5 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu

20 25 30

Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn

35 40 45

Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys

50 55 60

Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn

65 70 75 80

Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln

85 90 95

Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile

100 105 110

Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys

115 120 125

Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe

130 135 140

Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe

165 170 175

Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala

180 185 190

Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu

195 200 205

Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe

210 215 220

Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp

225 230 235 240

Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile

245 250 255

Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly

260 265 270

Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu

275 280 285

His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn

290 295 300

Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu

305 310 315 320

Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile

325 330 335

Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr

340 345 350

Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val

355 360 365

Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg

370 375 380

Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His

385 390 395 400

Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val

405 410 415

Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly

420 425 430

Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser

435 440 445

Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

450 455 460

<210> 3

<211> 423

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX2-FL-AA

<400> 3

Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr

1. 5 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu

20 25 30

Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn

35 40 45

Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys

50 55 60

Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn

65 70 75 80

Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Val Thr Cys

85 90 95

Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp

100 105 110

Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn

115 120 125

Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser

130 135 140

Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp

145 150 155 160

Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile

165 170 175

Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly

180 185 190

Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly

195 200 205

Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile

210 215 220

Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val

225 230 235 240

Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg

245 250 255

Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn

260 265 270

Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val

275 280 285

Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr

290 295 300

Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg

305 310 315 320

Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val

325 330 335

Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile

340 345 350

Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser

355 360 365

Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr

370 375 380

Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys

385 390 395 400

Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile

405 410 415

Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

420

<210> 4

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIXp-FL-AA

<400> 4

Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr

1. 5 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu

20 25 30

Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn

35 40 45

Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys

50 55 60

Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn

65 70 75 80

Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln

85 90 95

Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile

100 105 110

Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys

115 120 125

Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe

130 135 140

Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe

165 170 175

Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala

180 185 190

Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu

195 200 205

Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe

210 215 220

Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp

225 230 235 240

Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile

245 250 255

Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly

260 265 270

Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu

275 280 285

His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn

290 295 300

Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu

305 310 315 320

Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile

325 330 335

Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr

340 345 350

Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val

355 360 365

Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu

370 375 380

Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His

385 390 395 400

Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val

405 410 415

Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly

420 425 430

Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser

435 440 445

Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

450 455 460

<210> 5

<211> 1385

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS02-FL-NA

<400> 5

atgcagaggg tgaacatgat catggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtcagcaga gtgcacagtg ttcctggacc atgagaatgc caacaagatc 120

ctgaacaggc ccaagagata caactcaggc aagctggagg agtttgtgca gggcaacctg 180

gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc tttgaggagg ccagagaggt gtttgagaac 240

acagagagga ccacagagtt ctggaagcag tatgtggatg gagaccagtg tgagagcaac 300

ccttgcctga atggaggcag ctgcaaggat gacatcaaca gctatgagtg ctggtgccct 360

tttggctttg agggcaagaa ctgtgagctg gatgtgacct gcaacatcaa gaatggcagg 420

tgtgagcagt tctgcaagaa ctcagctgac aacaaagtgg tgtgtagctg cacagagggc 480

tacagactgg ctgagaacca gaagagctgt gagcctgctg tgcccttccc ctgtggcaga 540

gtgtcagtgt cccagaccag caagctgacc agagctgaga cagtgttccc tgatgtggac 600

tatgtgaata gcacagaggc tgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagtcc 660

ttcaatgact tcaccagagt tgtgggagga gaggatgcca agcctggcca gttcccctgg 720

caggtggtgc tgaatggcaa agtggatgcc ttctgtggag gcagcattgt gaatgagaag 780

tggattgtga cagctgccca ctgtgtggag acaggagtga agatcacagt ggtggctgga 840

gaacacaata ttgaggagac agagcacaca gagcagaaga ggaatgtcat caggattatc 900

ccccaccaca actacaatgc tgccatcaac aagtacaacc atgacattgc cctgctggag 960

ctggatgagc ctctggtgct gaatagctat gtgaccccca tctgcattgc tgacaaggag 1020

tacaccaaca tcttcctgaa gtttggctca ggctatgtgt caggctgggg cagagtgttc 1080

cacaagggca gatcagccct ggtgctgcag tacctgagag tgcccctggt ggacagagcc 1140

acctgcctgt tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200

gagggaggca gagacagctg ccagggagac tcaggaggac cccatgtgac agaagtggag 1260

ggcaccagct tcctgacagg catcatcagc tggggagagg agtgtgccat gaagggcaag 1320

tatggcatct acaccaaagt gagcagatat gtgaactgga tcaaggagaa aaccaagctg 1380

acctg 1385

<210> 6

<211> 1386

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS03-FL-NA

<400> 6

atgcagaggg tgaacatgat catggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgcactgtg ttcctggacc atgagaatgc caacaagatc 120

ctgaacaggc ccaagagata caactctggc aagctggagg agtttgtgca gggcaacctg 180

gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc tttgaggagg ccagggaagt gtttgagaac 240

actgagagga ccactgagtt ctggaagcag tatgtggatg gggaccagtg tgagagcaac 300

ccttgcctga atgggggcag ctgcaaggat gacatcaaca gctatgagtg ctggtgccct 360

tttggctttg agggcaagaa ctgtgagctg gatgtgacct gcaacatcaa gaatggcagg 420

tgtgagcagt tctgcaagaa ctctgctgac aacaaagtgg tgtgtagctg cactgagggc 480

tacagactgg ctgagaacca gaagagctgt gagcctgctg tgcccttccc ctgtggcaga 540

gtgtctgtgt cccagaccag caagctgacc agagctgaga ctgtgttccc tgatgtggac 600

tatgtgaata gcactgaggc tgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagtcc 660

ttcaatgact tcaccagagt ggtggggggg gaggatgcca agcctggcca gttcccctgg 720

caggtggtgc tgaatggcaa agtggatgcc ttctgtgggg gcagcattgt gaatgagaag 780

tggattgtga ctgctgccca ctgtgtggag actggggtga agatcactgt ggtggctggg 840

gaacacaata ttgaggagac tgagcacact gagcagaaga ggaatgtcat caggattatc 900

ccccaccaca actacaatgc tgccatcaac aagtacaacc atgacattgc cctgctggag 960

ctggatgagc ctctggtgct gaatagctat gtgaccccca tctgcattgc tgacaaggag 1020

tacaccaaca tcttcctgaa gtttggctct ggctatgtgt ctggctgggg cagagtgttc 1080

cacaagggca ggtctgccct ggtgctgcag tacctgagag tgcccctggt ggacagagcc 1140

acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200

gaggggggca gagacagctg ccagggggac tctgggggcc cccatgtgac tgaagtggag 1260

ggcaccagct tcctgactgg catcatcagc tggggggagg agtgtgccat gaagggcaag 1320

tatggcatct acaccaaagt gagcaggtat gtgaactgga tcaaggagaa aaccaagctg 1380

acctga 1386

<210> 7

<211> 1386

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS04-FL-NA

<400> 7

atgcagaggg tgaacatgat tatggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgcacagtg ttcctggacc atgagaatgc caacaagatc 120

ctgaacaggc ccaagagata caactctggc aagctggagg agtttgtgca gggcaacctg 180

gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc tttgaggagg ccagggaggt gtttgagaac 240

acagagagga ccacagagtt ctggaagcag tatgtggatg gtgaccagtg tgagagcaac 300

ccttgcctga atggaggcag ctgcaaggat gacatcaaca gctatgagtg ctggtgccct 360

tttggctttg agggcaagaa ctgtgagctg gatgtgacct gcaacatcaa gaatggcagg 420

tgtgagcagt tctgcaagaa ctctgctgac aacaaggtgg tgtgtagctg cacagagggc 480

tacagactgg ctgagaacca gaagagctgt gagcctgctg tgcccttccc ctgtggcaga 540

gtgtctgtgt cccagaccag caagctgacc agagctgaga cagtgttccc tgatgtggac 600

tatgtgaaca gcacagaggc tgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagtcc 660

ttcaatgact tcaccagagt ggtgggagga gaggatgcca agcctggcca gttcccctgg 720

caggtggtgc tgaatggcaa ggtggatgcc ttctgtggag gcagcattgt gaatgagaag 780

tggattgtga cagctgccca ctgtgtggag acaggagtga agatcacagt ggtggctgga 840

gagcacaaca ttgaggagac agagcacaca gagcagaaga ggaatgtgat caggatcatc 900

cctcaccaca actacaatgc tgccatcaac aagtacaacc atgacattgc cctgctggag 960

ctggatgagc ctctggtgct gaacagctat gtgaccccta tctgcattgc tgacaaggag 1020

tacaccaaca tcttcctgaa gtttggctct ggctatgtgt ctggctgggg cagagtgttc 1080

cacaagggca ggtctgccct ggtgctgcag tacctgagag tgcccctggt ggacagagcc 1140

acctgcctgt tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200

gagggaggca gagacagctg ccagggtgac tctggaggac cccatgtgac agaggtggag 1260

ggcaccagct tcctgacagg catcatcagc tggggagagg agtgtgccat gaagggcaag 1320

tatggcatct acaccaaagt gagcagatat gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380

acctga 1386

<210> 8

<211> 1386

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS05-FL-NA

<400> 8

atgcagaggg tgaacatgat tatggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgcactgtg ttcctggacc atgagaatgc caacaagatc 120

ctgaaccgcc ccaagcgcta caactctggc aagctggagg agtttgtgca gggcaacctg 180

gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc tttgaggagg ccagggaggt gtttgagaac 240

actgagcgca ccactgagtt ctggaagcag tatgtggatg gggaccagtg tgagagcaac 300

ccctgcctga atggggggag ctgcaaggat gacatcaaca gctatgagtg ctggtgcccc 360

tttggctttg agggcaagaa ctgtgagctg gatgtgacct gcaacatcaa gaatggccgc 420

tgtgagcagt tctgcaagaa ctctgctgac aacaaggtgg tgtgctcttg cactgagggc 480

taccgcctgg ctgagaacca gaagagctgt gagcctgctg tgcccttccc ctgtggcagg 540

gtgtctgtga gccagaccag caagctgacc agggctgaga ctgtgttccc tgacgtggac 600

tatgtgaaca gcactgaggc tgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660

ttcaatgact tcaccagggt ggtgggagga gaggatgcca agcctggcca gttcccctgg 720

caggtggtgc tgaatggcaa ggtggatgcc ttctgtggag gcagcattgt gaatgagaag 780

tggattgtga ccgctgccca ctgtgtggag actggagtga agatcactgt ggtggctggg 840

gagcacaaca ttgaggagac agagcacaca gagcagaagc gcaatgtgat caggatcatc 900

ccccaccaca actacaatgc tgccatcaac aagtacaacc atgacattgc cctgctggag 960

ctggatgagc ccctggtgct gaacagctac gtgaccccca tctgcattgc agacaaggag 1020

tacaccaaca tcttcctgaa gtttggctct ggctatgtgt ctggctgggg cagggtgttc 1080

cacaagggca ggtctgccct ggtgctgcag tacctgaggg tgcccctggt ggacagggcc 1140

acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc tggcttccat 1200

gagggaggaa gggacagctg ccagggagac tctggaggcc cccatgtgac agaggtggag 1260

ggcaccagct tcctgacagg catcatcagc tggggggagg agtgtgccat gaagggcaag 1320

tatggcatct acaccaaagt gtcccgctat gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380

acctga 1386

<210> 9

<211> 1386

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS06-FL-NA

<400> 9

atgcagaggg tcaacatgat catggctgag tcccctggcc tcatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgcactgtc ttcctggacc atgagaatgc caacaagatc 120

ctcaacaggc ccaagagata caactctggc aaactggagg agtttgtcca gggcaacctg 180

gagagggagt gcatggagga gaagtgctcc tttgaggagg ccagggaggt ctttgagaac 240

actgagcgca ccactgagtt ctggaaacag tatgtggatg gggaccagtg tgagtccaac 300

ccctgcctga atgggggcag ctgcaaggat gacatcaaca gctatgagtg ctggtgcccc 360

tttggctttg agggcaagaa ctgtgagctg gatgtgacct gcaacatcaa gaatggcaga 420

tgtgagcagt tctgcaagaa ctctgctgac aacaaggtgg tgtgctcctg cactgagggc 480

taccgcctgg ctgagaacca gaagagctgt gagcctgctg tgccattccc atgtggcaga 540

gtctctgtga gccagaccag caagctcacc agggctgaga ctgtgttccc tgatgtggac 600

tatgtgaaca gcactgaggc tgaaaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660

ttcaatgact tcaccagagt ggtgggagga gaggatgcca agcctggcca gttcccctgg 720

caagtggtgc tcaatggcaa ggtggatgcc ttctgtgggg gctccattgt gaatgagaag 780

tggattgtca ctgctgccca ctgtgtggag actggggtca agatcactgt ggtggctggg 840

gagcacaaca ttgaggagac tgagcacact gagcagaagc gcaatgtgat caggatcatc 900

ccccaccaca actacaatgc tgccatcaac aagtacaacc atgacattgc cctgctggag 960

ctggatgagc ccctggtcct caacagctat gtgaccccca tctgcattgc tgacaaggag 1020

tacaccaaca tcttcctcaa gtttggctct ggctatgtct ctggctgggg cagagtgttc 1080

cacaaaggca ggtctgccct ggtgctccag tacctgagag tgcccctggt ggacagggcc 1140

acctgcctct tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200

gagggaggaa gagacagctg ccagggggac tctggaggac cccatgtcac tgaggtggag 1260

ggcacctcct tcctcactgg catcatctcc tggggagagg agtgtgccat gaaaggcaaa 1320

tatggcatct acaccaaagt ctccagatat gtcaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380

acctga 1386

<210> 10

<211> 415

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-MP-AA

<400> 10

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1. 5 10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

35 40 45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

50 55 60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65 70 75 80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

85 90 95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

100 105 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

115 120 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

130 135 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145 150 155 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

165 170 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

180 185 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

195 200 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

210 215 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225 230 235 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

245 250 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

260 265 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

275 280 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

290 295 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305 310 315 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

325 330 335

Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

340 345 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

355 360 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

370 375 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385 390 395 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

405 410 415

<210> 11

<211> 377

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX2-MP-AA

<400> 11

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1. 5 10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Val

35 40 45

Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser

50 55 60

Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala

65 70 75 80

Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe Pro Cys Gly Arg

85 90 95

Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe

100 105 110

Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp

115 120 125

Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val

130 135 140

Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val Val Leu

145 150 155 160

Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile Val Asn Glu Lys

165 170 175

Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly Val Lys Ile Thr

180 185 190

Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu His Thr Glu Gln

195 200 205

Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn Tyr Asn Ala Ala

210 215 220

Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Asp Glu Pro

225 230 235 240

Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile Ala Asp Lys Glu

245 250 255

Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser Gly Trp

260 265 270

Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln Tyr Leu

275 280 285

Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe

290 295 300

Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His Glu Gly Gly Arg

305 310 315 320

Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Glu Val Glu

325 330 335

Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Glu Glu Cys Ala

340 345 350

Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Val Asn

355 360 365

Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

370 375

<210> 12

<211> 415

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIXp-MP-AA

<400> 12

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1. 5 10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

35 40 45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

50 55 60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65 70 75 80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

85 90 95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

100 105 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

115 120 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

130 135 140

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

145 150 155 160

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

165 170 175

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

180 185 190

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

195 200 205

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

210 215 220

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

225 230 235 240

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

245 250 255

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

260 265 270

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

275 280 285

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

290 295 300

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

305 310 315 320

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

325 330 335

Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

340 345 350

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

355 360 365

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

370 375 380

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

385 390 395 400

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

405 410 415

<210> 13

<211> 1248

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS02-MP-NA

<400> 13

tacaactcag gcaagctgga ggagtttgtg cagggcaacc tggagaggga gtgcatggag 60

gagaagtgca gctttgagga ggccagagag gtgtttgaga acacagagag gaccacagag 120

ttctggaagc agtatgtgga tggagaccag tgtgagagca acccttgcct gaatggaggc 180

agctgcaagg atgacatcaa cagctatgag tgctggtgcc cttttggctt tgagggcaag 240

aactgtgagc tggatgtgac ctgcaacatc aagaatggca ggtgtgagca gttctgcaag 300

aactcagctg acaacaaagt ggtgtgtagc tgcacagagg gctacagact ggctgagaac 360

cagaagagct gtgagcctgc tgtgcccttc ccctgtggca gagtgtcagt gtcccagacc 420

agcaagctga ccagagctga gacagtgttc cctgatgtgg actatgtgaa tagcacagag 480

gctgagacca tcctggacaa catcacccag agcacccagt ccttcaatga cttcaccaga 540

gttgtgggag gagaggatgc caagcctggc cagttcccct ggcaggtggt gctgaatggc 600

aaagtggatg ccttctgtgg aggcagcatt gtgaatgaga agtggattgt gacagctgcc 660

cactgtgtgg agacaggagt gaagatcaca gtggtggctg gagaacacaa tattgaggag 720

acagagcaca cagagcagaa gaggaatgtc atcaggatta tcccccacca caactacaat 780

gctgccatca acaagtacaa ccatgacatt gccctgctgg agctggatga gcctctggtg 840

ctgaatagct atgtgacccc catctgcatt gctgacaagg agtacaccaa catcttcctg 900

aagtttggct caggctatgt gtcaggctgg ggcagagtgt tccacaaggg cagatcagcc 960

ctggtgctgc agtacctgag agtgcccctg gtggacagag ccacctgcct gttgagcacc 1020

aagttcacca tctacaacaa catgttctgt gctggcttcc atgagggagg cagagacagc 1080

tgccagggag actcaggagg accccatgtg acagaagtgg agggcaccag cttcctgaca 1140

ggcatcatca gctggggaga ggagtgtgcc atgaagggca agtatggcat ctacaccaaa 1200

gtgagcagat atgtgaactg gatcaaggag aaaaccaagc tgacctga 1248

<210> 14

<211> 1248

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS03-MP-NA

<400> 14

tacaactctg gcaagctgga ggagtttgtg cagggcaacc tggagaggga gtgcatggag 60

gagaagtgca gctttgagga ggccagggaa gtgtttgaga acactgagag gaccactgag 120

ttctggaagc agtatgtgga tggggaccag tgtgagagca acccttgcct gaatgggggc 180

agctgcaagg atgacatcaa cagctatgag tgctggtgcc cttttggctt tgagggcaag 240

aactgtgagc tggatgtgac ctgcaacatc aagaatggca ggtgtgagca gttctgcaag 300

aactctgctg acaacaaagt ggtgtgtagc tgcactgagg gctacagact ggctgagaac 360

cagaagagct gtgagcctgc tgtgcccttc ccctgtggca gagtgtctgt gtcccagacc 420

agcaagctga ccagagctga gactgtgttc cctgatgtgg actatgtgaa tagcactgag 480

gctgagacca tcctggacaa catcacccag agcacccagt ccttcaatga cttcaccaga 540

gtggtggggg gggaggatgc caagcctggc cagttcccct ggcaggtggt gctgaatggc 600

aaagtggatg ccttctgtgg gggcagcatt gtgaatgaga agtggattgt gactgctgcc 660

cactgtgtgg agactggggt gaagatcact gtggtggctg gggaacacaa tattgaggag 720

actgagcaca ctgagcagaa gaggaatgtc atcaggatta tcccccacca caactacaat 780

gctgccatca acaagtacaa ccatgacatt gccctgctgg agctggatga gcctctggtg 840

ctgaatagct atgtgacccc catctgcatt gctgacaagg agtacaccaa catcttcctg 900

aagtttggct ctggctatgt gtctggctgg ggcagagtgt tccacaaggg caggtctgcc 960

ctggtgctgc agtacctgag agtgcccctg gtggacagag ccacctgcct gctgagcacc 1020

aagttcacca tctacaacaa catgttctgt gctggcttcc atgagggggg cagagacagc 1080

tgccaggggg actctggggg cccccatgtg actgaagtgg agggcaccag cttcctgact 1140

ggcatcatca gctgggggga ggagtgtgcc atgaagggca agtatggcat ctacaccaaa 1200

gtgagcaggt atgtgaactg gatcaaggag aaaaccaagc tgacctga 1248

<210> 15

<211> 1250

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS04-MP-NA

<400> 15

cstacaactc tggcaagctg gaggagtttg tgcagggcaa cctggagagg gagtgcatgg 60

aggagaagtg cagctttgag gaggccaggg aggtgtttga gaacacagag aggaccacag 120

agttctggaa gcagtatgtg gatggtgacc agtgtgagag caacccttgc ctgaatggag 180

gcagctgcaa ggatgacatc aacagctatg agtgctggtg cccttttggc tttgagggca 240

agaactgtga gctggatgtg acctgcaaca tcaagaatgg caggtgtgag cagttctgca 300

agaactctgc tgacaacaag gtggtgtgta gctgcacaga gggctacaga ctggctgaga 360

accagaagag ctgtgagcct gctgtgccct tcccctgtgg cagagtgtct gtgtcccaga 420

ccagcaagct gaccagagct gagacagtgt tccctgatgt ggactatgtg aacagcacag 480

aggctgagac catcctggac aacatcaccc agagcaccca gtccttcaat gacttcacca 540

gagtggtggg aggagaggat gccaagcctg gccagttccc ctggcaggtg gtgctgaatg 600

gcaaggtgga tgccttctgt ggaggcagca ttgtgaatga gaagtggatt gtgacagctg 660

cccactgtgt ggagacagga gtgaagatca cagtggtggc tggagagcac aacattgagg 720

agacagagca cacagagcag aagaggaatg tgatcaggat catccctcac cacaactaca 780

atgctgccat caacaagtac aaccatgaca ttgccctgct ggagctggat gagcctctgg 840

tgctgaacag ctatgtgacc cctatctgca ttgctgacaa ggagtacacc aacatcttcc 900

tgaagtttgg ctctggctat gtgtctggct ggggcagagt gttccacaag ggcaggtctg 960

ccctggtgct gcagtacctg agagtgcccc tggtggacag agccacctgc ctgttgagca 1020

ccaagttcac catctacaac aacatgttct gtgctggctt ccatgaggga ggcagagaca 1080

gctgccaggg tgactctgga ggaccccatg tgacagaggt ggagggcacc agcttcctga 1140

caggcatcat cagctgggga gaggagtgtg ccatgaaggg caagtatggc atctacacca 1200

aagtgagcag atatgtgaac tggatcaagg agaagaccaa gctgacctga 1250

<210> 16

<211> 1248

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS05-MP-NA

<400> 16

tacaactctg gcaagctgga ggagtttgtg cagggcaacc tggagaggga gtgcatggag 60

gagaagtgca gctttgagga ggccagggag gtgtttgaga acactgagcg caccactgag 120

ttctggaagc agtatgtgga tggggaccag tgtgagagca acccctgcct gaatgggggg 180

agctgcaagg atgacatcaa cagctatgag tgctggtgcc cctttggctt tgagggcaag 240

aactgtgagc tggatgtgac ctgcaacatc aagaatggcc gctgtgagca gttctgcaag 300

aactctgctg acaacaaggt ggtgtgctct tgcactgagg gctaccgcct ggctgagaac 360

cagaagagct gtgagcctgc tgtgcccttc ccctgtggca gggtgtctgt gagccagacc 420

agcaagctga ccagggctga gactgtgttc cctgacgtgg actatgtgaa cagcactgag 480

gctgagacca tcctggacaa catcacccag agcacccaga gcttcaatga cttcaccagg 540

gtggtgggag gagaggatgc caagcctggc cagttcccct ggcaggtggt gctgaatggc 600

aaggtggatg ccttctgtgg aggcagcatt gtgaatgaga agtggattgt gaccgctgcc 660

cactgtgtgg agactggagt gaagatcact gtggtggctg gggagcacaa cattgaggag 720

acagagcaca cagagcagaa gcgcaatgtg atcaggatca tcccccacca caactacaat 780

gctgccatca acaagtacaa ccatgacatt gccctgctgg agctggatga gcccctggtg 840

ctgaacagct acgtgacccc catctgcatt gcagacaagg agtacaccaa catcttcctg 900

aagtttggct ctggctatgt gtctggctgg ggcagggtgt tccacaaggg caggtctgcc 960

ctggtgctgc agtacctgag ggtgcccctg gtggacaggg ccacctgcct gctgagcacc 1020

aagttcacca tctacaacaa catgttctgc gctggcttcc atgagggagg aagggacagc 1080

tgccagggag actctggagg cccccatgtg acagaggtgg agggcaccag cttcctgaca 1140

ggcatcatca gctgggggga ggagtgtgcc atgaagggca agtatggcat ctacaccaaa 1200

gtgtcccgct atgtgaactg gatcaaggag aagaccaagc tgacctga 1248

<210> 17

<211> 1248

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS06-MP-NA

<400> 17

tacaactctg gcaaactgga ggagtttgtc cagggcaacc tggagaggga gtgcatggag 60

gagaagtgct cctttgagga ggccagggag gtctttgaga acactgagcg caccactgag 120

ttctggaaac agtatgtgga tggggaccag tgtgagtcca acccctgcct gaatgggggc 180

agctgcaagg atgacatcaa cagctatgag tgctggtgcc cctttggctt tgagggcaag 240

aactgtgagc tggatgtgac ctgcaacatc aagaatggca gatgtgagca gttctgcaag 300

aactctgctg acaacaaggt ggtgtgctcc tgcactgagg gctaccgcct ggctgagaac 360

cagaagagct gtgagcctgc tgtgccattc ccatgtggca gagtctctgt gagccagacc 420

agcaagctca ccagggctga gactgtgttc cctgatgtgg actatgtgaa cagcactgag 480

gctgaaacca tcctggacaa catcacccag agcacccaga gcttcaatga cttcaccaga 540

gtggtgggag gagaggatgc caagcctggc cagttcccct ggcaagtggt gctcaatggc 600

aaggtggatg ccttctgtgg gggctccatt gtgaatgaga agtggattgt cactgctgcc 660

cactgtgtgg agactggggt caagatcact gtggtggctg gggagcacaa cattgaggag 720

actgagcaca ctgagcagaa gcgcaatgtg atcaggatca tcccccacca caactacaat 780

gctgccatca acaagtacaa ccatgacatt gccctgctgg agctggatga gcccctggtc 840

ctcaacagct atgtgacccc catctgcatt gctgacaagg agtacaccaa catcttcctc 900

aagtttggct ctggctatgt ctctggctgg ggcagagtgt tccacaaagg caggtctgcc 960

ctggtgctcc agtacctgag agtgcccctg gtggacaggg ccacctgcct cttgagcacc 1020

aagttcacca tctacaacaa catgttctgt gctggcttcc atgagggagg aagagacagc 1080

tgccaggggg actctggagg accccatgtc actgaggtgg agggcacctc cttcctcact 1140

ggcatcatct cctggggaga ggagtgtgcc atgaaaggca aatatggcat ctacaccaaa 1200

gtctccagat atgtcaactg gatcaaggag aagaccaagc tgacctga 1248

<210> 18

<211> 138

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-PPP-NA

<400> 18

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60

ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt 120

ctgaatcggc caaagagg 138

<210> 19

<211> 138

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS02-PPP-NA

<400> 19

atgcagaggg tgaacatgat catggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtcagcaga gtgcacagtg ttcctggacc atgagaatgc caacaagatc 120

ctgaacaggc ccaagaga 138

<210> 20

<211> 138

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS03-PPP-NA

<400> 20

atgcagaggg tgaacatgat catggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgcactgtg ttcctggacc atgagaatgc caacaagatc 120

ctgaacaggc ccaagaga 138

<210> 21

<211> 138

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS04-PPP-NA

<400> 21

atgcagaggg tgaacatgat tatggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgcacagtg ttcctggacc atgagaatgc caacaagatc 120

ctgaacaggc ccaagaga 138

<210> 22

<211> 138

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS05-PPP-NA

<400> 22

atgcagaggg tgaacatgat tatggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgcactgtg ttcctggacc atgagaatgc caacaagatc 120

ctgaaccgcc ccaagcgc 138

<210> 23

<211> 138

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS06-PPP-NA

<400> 23

atgcagaggg tcaacatgat catggctgag tcccctggcc tcatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgcactgtc ttcctggacc atgagaatgc caacaagatc 120

ctcaacaggc ccaagaga 138

<210> 24

<211> 84

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-SP-NA

<400> 24

atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60

ggatatctac tcagtgctga atgt 84

<210> 25

<211> 84

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS02-SP-NA

<400> 25

atgcagaggg tgaacatgat catggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtcagcaga gtgc 84

<210> 26

<211> 84

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS03-SP-NA

<400> 26

atgcagaggg tgaacatgat catggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgc 84

<210> 27

<211> 84

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS04-SP-NA

<400> 27

atgcagaggg tgaacatgat tatggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgc 84

<210> 28

<211> 84

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS05-SP-NA

<400> 28

atgcagaggg tgaacatgat tatggctgag agccctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgc 84

<210> 29

<211> 84

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS06--SP-NA

<400> 29

atgcagaggg tcaacatgat catggctgag tcccctggcc tcatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgtctgctga gtgc 84

<210> 30

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-PP-NA

<400> 30

acagtttttc ttgatcatga aaacgccaac aaaattctga atcggccaaa gagg 54

<210> 31

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS02-PP-NA

<400> 31

acagtgttcc tggaccatga gaatgccaac aagatcctga acaggcccaa gaga 54

<210> 32

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS03-PP-NA

<400> 32

actgtgttcc tggaccatga gaatgccaac aagatcctga acaggcccaa gaga 54

<210> 33

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS04-PP-NA

<400> 33

acagtgttcc tggaccatga gaatgccaac aagatcctga acaggcccaa gaga 54

<210> 34

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS05-PP-NA

<400> 34

actgtgttcc tggaccatga gaatgccaac aagatcctga accgccccaa gcgc 54

<210> 35

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS06-PP-NA

<400> 35

actgtcttcc tggaccatga gaatgccaac aagatcctca acaggcccaa gaga 54

<210> 36

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-PPP-AA

<400> 36

Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr

1. 5 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu

20 25 30

Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg

35 40 45

<210> 37

<211> 28

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-SP-AA

<400> 37

Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr

1. 5 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys

20 25

<210> 38

<211> 18

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-PP-AA

<400> 38

Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro

1. 5 10 15

Lys Arg

<210> 39

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CRM8

<400> 39

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc ac 72

<210> 40

<211> 5276

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS06-CRM8.3-ssV

<400> 40

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcctgagtt taaacttcgt cgacggggga ggctgctggt 180

gaatattaac caaggtcacc ccagttatcg gaggagcaaa caggggctaa gtccaccggg 240

ggaggctgct ggtgaatatt aaccaaggtc accccagtta tcggaggagc aaacaggggc 300

taagtccacc gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg 360

agcaaacagg ggctaagtcc accgagggca ctgggaggat gttgagtaag atggaaaact 420

actgatgacc cttgcagaga cagagtatta ggacatgttt gaacaggggc cgggcgatca 480

gcaggtagct ctagaggatc cccgtctgtc tgcacatttc gtagagcgag tgttccgata 540

ctctaatctc cctaggcaag gttcatattt gtgtaggtta cttattctcc ttttgttgac 600

taagtcaata atcagaatca gcaggtttgg agtcagcttg gcagggatca gcagcctggg 660

ttggaaggag ggggtataaa agccccttca ccaggagaag ccgtcacaca gactaggcgc 720

gccctaaggt aagttggcgc cgtttaaggg atggttggtt ggtggggtat taatgtttaa 780

ttaccttttt tacaggcctg aagatctgcc accatgcaga gggtcaacat gatcatggct 840

gagtcccctg gcctcatcac catctgcctg ctgggctacc tgctgtctgc tgagtgcact 900

gtcttcctgg accatgagaa tgccaacaag atcctcaaca ggcccaagag atacaactct 960

ggcaaactgg aggagtttgt ccagggcaac ctggagaggg agtgcatgga ggagaagtgc 1020

tcctttgagg aggccaggga ggtctttgag aacactgagc gcaccactga gttctggaaa 1080

cagtatgtgg atggggacca gtgtgagtcc aacccctgcc tgaatggggg cagctgcaag 1140

gatgacatca acagctatga gtgctggtgc ccctttggct ttgagggcaa gaactgtgag 1200

ctggatgtga cctgcaacat caagaatggc agatgtgagc agttctgcaa gaactctgct 1260

gacaacaagg tggtgtgctc ctgcactgag ggctaccgcc tggctgagaa ccagaagagc 1320

tgtgagcctg ctgtgccatt cccatgtggc agagtctctg tgagccagac cagcaagctc 1380

accagggctg agactgtgtt ccctgatgtg gactatgtga acagcactga ggctgaaacc 1440

atcctggaca acatcaccca gagcacccag agcttcaatg acttcaccag agtggtggga 1500

ggagaggatg ccaagcctgg ccagttcccc tggcaagtgg tgctcaatgg caaggtggat 1560

gccttctgtg ggggctccat tgtgaatgag aagtggattg tcactgctgc ccactgtgtg 1620

gagactgggg tcaagatcac tgtggtggct ggggagcaca acattgagga gactgagcac 1680

actgagcaga agcgcaatgt gatcaggatc atcccccacc acaactacaa tgctgccatc 1740

aacaagtaca accatgacat tgccctgctg gagctggatg agcccctggt cctcaacagc 1800

tatgtgaccc ccatctgcat tgctgacaag gagtacacca acatcttcct caagtttggc 1860

tctggctatg tctctggctg gggcagagtg ttccacaaag gcaggtctgc cctggtgctc 1920

cagtacctga gagtgcccct ggtggacagg gccacctgcc tcttgagcac caagttcacc 1980

atctacaaca acatgttctg tgctggcttc catgagggag gaagagacag ctgccagggg 2040

gactctggag gaccccatgt cactgaggtg gagggcacct ccttcctcac tggcatcatc 2100

tcctggggag aggagtgtgc catgaaaggc aaatatggca tctacaccaa agtctccaga 2160

tatgtcaact ggatcaagga gaagaccaag ctgacctgat gagcatgcct agagctcgct 2220

gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc 2280

cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg 2340

catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca 2400

agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga attaattaag ctcgcgaagg 2460

aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 2520

ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag 2580

cgcgcagaga gggagtggcc aagacgattt aaatgacaag cttggcgtaa tcatggtcat 2640

agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 2700

gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc 2760

gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 2820

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 2880

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 2940

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 3000

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 3060

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 3120

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 3180

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 3240

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 3300

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 3360

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 3420

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa 3480

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 3540

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 3600

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 3660

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 3720

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 3780

aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 3840

tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 3900

gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 3960

atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 4020

tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 4080

ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 4140

ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 4200

tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 4260

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 4320

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 4380

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 4440

gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 4500

taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 4560

cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 4620

agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 4680

gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 4740

ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa 4800

ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg 4860

cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag 4920

cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 4980

gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 5040

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt 5100

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 5160

gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt 5220

cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattcct cgagatttaa atgacg 5276

<210> 41

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS02-HC-NA

<400> 41

gttgtgggag gagaggatgc caagcctggc cagttcccct ggcaggtggt gctgaatggc 60

aaagtggatg ccttctgtgg aggcagcatt gtgaatgaga agtggattgt gacagctgcc 120

cactgtgtgg agacaggagt gaagatcaca gtggtggctg gagaacacaa tattgaggag 180

acagagcaca cagagcagaa gaggaatgtc atcaggatta tcccccacca caactacaat 240

gctgccatca acaagtacaa ccatgacatt gccctgctgg agctggatga gcctctggtg 300

ctgaatagct atgtgacccc catctgcatt gctgacaagg agtacaccaa catcttcctg 360

aagtttggct caggctatgt gtcaggctgg ggcagagtgt tccacaaggg cagatcagcc 420

ctggtgctgc agtacctgag agtgcccctg gtggacagag ccacctgcct gttgagcacc 480

aagttcacca tctacaacaa catgttctgt gctggcttcc atgagggagg cagagacagc 540

tgccagggag actcaggagg accccatgtg acagaagtgg agggcaccag cttcctgaca 600

ggcatcatca gctggggaga ggagtgtgcc atgaagggca agtatggcat ctacaccaaa 660

gtgagcagat atgtgaactg gatcaaggag aaaaccaagc tg 702

<210> 42

<211> 435

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS02-LC-NA

<400> 42

tacaactcag gcaagctgga ggagtttgtg cagggcaacc tggagaggga gtgcatggag 60

gagaagtgca gctttgagga ggccagagag gtgtttgaga acacagagag gaccacagag 120

ttctggaagc agtatgtgga tggagaccag tgtgagagca acccttgcct gaatggaggc 180

agctgcaagg atgacatcaa cagctatgag tgctggtgcc cttttggctt tgagggcaag 240

aactgtgagc tggatgtgac ctgcaacatc aagaatggca ggtgtgagca gttctgcaag 300

aactcagctg acaacaaagt ggtgtgtagc tgcacagagg gctacagact ggctgagaac 360

cagaagagct gtgagcctgc tgtgcccttc ccctgtggca gagtgtcagt gtcccagacc 420

agcaagctga ccaga 435

<210> 43

<211> 705

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS03-HC-NA

<400> 43

gtggtggggg gggaggatgc caagcctggc cagttcccct ggcaggtggt gctgaatggc 60

aaagtggatg ccttctgtgg gggcagcatt gtgaatgaga agtggattgt gactgctgcc 120

cactgtgtgg agactggggt gaagatcact gtggtggctg gggaacacaa tattgaggag 180

actgagcaca ctgagcagaa gaggaatgtc atcaggatta tcccccacca caactacaat 240

gctgccatca acaagtacaa ccatgacatt gccctgctgg agctggatga gcctctggtg 300

ctgaatagct atgtgacccc catctgcatt gctgacaagg agtacaccaa catcttcctg 360

aagtttggct ctggctatgt gtctggctgg ggcagagtgt tccacaaggg caggtctgcc 420

ctggtgctgc agtacctgag agtgcccctg gtggacagag ccacctgcct gctgagcacc 480

aagttcacca tctacaacaa catgttctgt gctggcttcc atgagggggg cagagacagc 540

tgccaggggg actctggggg cccccatgtg actgaagtgg agggcaccag cttcctgact 600

ggcatcatca gctgggggga ggagtgtgcc atgaagggca agtatggcat ctacaccaaa 660

gtgagcaggt atgtgaactg gatcaaggag aaaaccaagc tgacc 705

<210> 44

<211> 435

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS03-LC-NA

<400> 44

tacaactctg gcaagctgga ggagtttgtg cagggcaacc tggagaggga gtgcatggag 60

gagaagtgca gctttgagga ggccagggaa gtgtttgaga acactgagag gaccactgag 120

ttctggaagc agtatgtgga tggggaccag tgtgagagca acccttgcct gaatgggggc 180

agctgcaagg atgacatcaa cagctatgag tgctggtgcc cttttggctt tgagggcaag 240

aactgtgagc tggatgtgac ctgcaacatc aagaatggca ggtgtgagca gttctgcaag 300

aactctgctg acaacaaagt ggtgtgtagc tgcactgagg gctacagact ggctgagaac 360

cagaagagct gtgagcctgc tgtgcccttc ccctgtggca gagtgtctgt gtcccagacc 420

agcaagctga ccaga 435

<210> 45

<211> 705

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS04-HC-NA

<400> 45

gtggtgggag gagaggatgc caagcctggc cagttcccct ggcaggtggt gctgaatggc 60

aaggtggatg ccttctgtgg aggcagcatt gtgaatgaga agtggattgt gacagctgcc 120

cactgtgtgg agacaggagt gaagatcaca gtggtggctg gagagcacaa cattgaggag 180

acagagcaca cagagcagaa gaggaatgtg atcaggatca tccctcacca caactacaat 240

gctgccatca acaagtacaa ccatgacatt gccctgctgg agctggatga gcctctggtg 300

ctgaacagct atgtgacccc tatctgcatt gctgacaagg agtacaccaa catcttcctg 360

aagtttggct ctggctatgt gtctggctgg ggcagagtgt tccacaaggg caggtctgcc 420

ctggtgctgc agtacctgag agtgcccctg gtggacagag ccacctgcct gttgagcacc 480

aagttcacca tctacaacaa catgttctgt gctggcttcc atgagggagg cagagacagc 540

tgccagggtg actctggagg accccatgtg acagaggtgg agggcaccag cttcctgaca 600

ggcatcatca gctggggaga ggagtgtgcc atgaagggca agtatggcat ctacaccaaa 660

gtgagcagat atgtgaactg gatcaaggag aagaccaagc tgacc 705

<210> 46

<211> 435

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS04-LC-NA

<400> 46

tacaactctg gcaagctgga ggagtttgtg cagggcaacc tggagaggga gtgcatggag 60

gagaagtgca gctttgagga ggccagggag gtgtttgaga acacagagag gaccacagag 120

ttctggaagc agtatgtgga tggtgaccag tgtgagagca acccttgcct gaatggaggc 180

agctgcaagg atgacatcaa cagctatgag tgctggtgcc cttttggctt tgagggcaag 240

aactgtgagc tggatgtgac ctgcaacatc aagaatggca ggtgtgagca gttctgcaag 300

aactctgctg acaacaaggt ggtgtgtagc tgcacagagg gctacagact ggctgagaac 360

cagaagagct gtgagcctgc tgtgcccttc ccctgtggca gagtgtctgt gtcccagacc 420

agcaagctga ccaga 435

<210> 47

<211> 705

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS05-HC-NA

<400> 47

gtggtgggag gagaggatgc caagcctggc cagttcccct ggcaggtggt gctgaatggc 60

aaggtggatg ccttctgtgg aggcagcatt gtgaatgaga agtggattgt gaccgctgcc 120

cactgtgtgg agactggagt gaagatcact gtggtggctg gggagcacaa cattgaggag 180

acagagcaca cagagcagaa gcgcaatgtg atcaggatca tcccccacca caactacaat 240

gctgccatca acaagtacaa ccatgacatt gccctgctgg agctggatga gcccctggtg 300

ctgaacagct acgtgacccc catctgcatt gcagacaagg agtacaccaa catcttcctg 360

aagtttggct ctggctatgt gtctggctgg ggcagggtgt tccacaaggg caggtctgcc 420

ctggtgctgc agtacctgag ggtgcccctg gtggacaggg ccacctgcct gctgagcacc 480

aagttcacca tctacaacaa catgttctgc gctggcttcc atgagggagg aagggacagc 540

tgccagggag actctggagg cccccatgtg acagaggtgg agggcaccag cttcctgaca 600

ggcatcatca gctgggggga ggagtgtgcc atgaagggca agtatggcat ctacaccaaa 660

gtgtcccgct atgtgaactg gatcaaggag aagaccaagc tgacc 705

<210> 48

<211> 435

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS05-LC-NA

<400> 48

tacaactctg gcaagctgga ggagtttgtg cagggcaacc tggagaggga gtgcatggag 60

gagaagtgca gctttgagga ggccagggag gtgtttgaga acactgagcg caccactgag 120

ttctggaagc agtatgtgga tggggaccag tgtgagagca acccctgcct gaatgggggg 180

agctgcaagg atgacatcaa cagctatgag tgctggtgcc cctttggctt tgagggcaag 240

aactgtgagc tggatgtgac ctgcaacatc aagaatggcc gctgtgagca gttctgcaag 300

aactctgctg acaacaaggt ggtgtgctct tgcactgagg gctaccgcct ggctgagaac 360

cagaagagct gtgagcctgc tgtgcccttc ccctgtggca gggtgtctgt gagccagacc 420

agcaagctga ccagg 435

<210> 49

<211> 705

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS06-HC-NA

<400> 49

gtggtgggag gagaggatgc caagcctggc cagttcccct ggcaagtggt gctcaatggc 60

aaggtggatg ccttctgtgg gggctccatt gtgaatgaga agtggattgt cactgctgcc 120

cactgtgtgg agactggggt caagatcact gtggtggctg gggagcacaa cattgaggag 180

actgagcaca ctgagcagaa gcgcaatgtg atcaggatca tcccccacca caactacaat 240

gctgccatca acaagtacaa ccatgacatt gccctgctgg agctggatga gcccctggtc 300

ctcaacagct atgtgacccc catctgcatt gctgacaagg agtacaccaa catcttcctc 360

aagtttggct ctggctatgt ctctggctgg ggcagagtgt tccacaaagg caggtctgcc 420

ctggtgctcc agtacctgag agtgcccctg gtggacaggg ccacctgcct cttgagcacc 480

aagttcacca tctacaacaa catgttctgt gctggcttcc atgagggagg aagagacagc 540

tgccaggggg actctggagg accccatgtc actgaggtgg agggcacctc cttcctcact 600

ggcatcatct cctggggaga ggagtgtgcc atgaaaggca aatatggcat ctacaccaaa 660

gtctccagat atgtcaactg gatcaaggag aagaccaagc tgacc 705

<210> 50

<211> 435

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS06-LC-NA

<400> 50

tacaactctg gcaaactgga ggagtttgtc cagggcaacc tggagaggga gtgcatggag 60

gagaagtgct cctttgagga ggccagggag gtctttgaga acactgagcg caccactgag 120

ttctggaaac agtatgtgga tggggaccag tgtgagtcca acccctgcct gaatgggggc 180

agctgcaagg atgacatcaa cagctatgag tgctggtgcc cctttggctt tgagggcaag 240

aactgtgagc tggatgtgac ctgcaacatc aagaatggca gatgtgagca gttctgcaag 300

aactctgctg acaacaaggt ggtgtgctcc tgcactgagg gctaccgcct ggctgagaac 360

cagaagagct gtgagcctgc tgtgccattc ccatgtggca gagtctctgt gagccagacc 420

agcaagctca ccagg 435

<210> 51

<211> 145

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AAV2_5'-ITR

<400> 51

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcct 145

<210> 52

<211> 330

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> усеченный_энхансер/промотор_TTR

<400> 52

cgagggcact gggaggatgt tgagtaagat ggaaaactac tgatgaccct tgcagagaca 60

gagtattagg acatgtttga acaggggccg ggcgatcagc aggtagctct agaggatccc 120

cgtctgtctg cacatttcgt agagcgagtg ttccgatact ctaatctccc taggcaaggt 180

tcatatttgt gtaggttact tattctcctt ttgttgacta agtcaataat cagaatcagc 240

aggtttggag tcagcttggc agggatcagc agcctgggtt ggaaggaggg ggtataaaag 300

ccccttcacc aggagaagcc gtcacacaga 330

<210> 53

<211> 77

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> интрон_MVM

<400> 53

ctaaggtaag ttggcgccgt ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta 60

ccttttttac aggcctg 77

<210> 54

<211> 234

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнал_полиаденилирования_BGH

<400> 54

cctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 60

ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 120

aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 180

gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggaa 234

<210> 55

<211> 145

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AAV2 3'-ITR

<400> 55

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145

<210> 56

<211> 35

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-AP-AA

<400> 56

Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala

1. 5 10 15

Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp

20 25 30

Phe Thr Arg

35

<210> 57

<211> 105

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS02-AP-NA

<400> 57

gctgagacag tgttccctga tgtggactat gtgaatagca cagaggctga gaccatcctg 60

gacaacatca cccagagcac ccagtccttc aatgacttca ccaga 105

<210> 58

<211> 105

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS03-AP-NA

<400> 58

gctgagactg tgttccctga tgtggactat gtgaatagca ctgaggctga gaccatcctg 60

gacaacatca cccagagcac ccagtccttc aatgacttca ccaga 105

<210> 59

<211> 105

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS04-AP-NA

<400> 59

gctgagacag tgttccctga tgtggactat gtgaacagca cagaggctga gaccatcctg 60

gacaacatca cccagagcac ccagtccttc aatgacttca ccaga 105

<210> 60

<211> 105

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS05-AP-NA

<400> 60

gctgagactg tgttccctga cgtggactat gtgaacagca ctgaggctga gaccatcctg 60

gacaacatca cccagagcac ccagagcttc aatgacttca ccagg 105

<210> 61

<211> 105

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CS06-AP-NA

<400> 61

gctgagactg tgttccctga tgtggactat gtgaacagca ctgaggctga aaccatcctg 60

gacaacatca cccagagcac ccagagcttc aatgacttca ccaga 105

<210> 62

<211> 145

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-LC-AA

<400> 62

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1. 5 10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

35 40 45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

50 55 60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65 70 75 80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

85 90 95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

100 105 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

115 120 125

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

130 135 140

Arg

145

<210> 63

<211> 235

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIX-HC-AA

<400> 63

Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val

1. 5 10 15

Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile Val Asn

20 25 30

Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly Val Lys

35 40 45

Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu His Thr

50 55 60

Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Asp

85 90 95

Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile Ala Asp

100 105 110

Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser

115 120 125

Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln

130 135 140

Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr

145 150 155 160

Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His Glu Gly

165 170 175

Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Glu

180 185 190

Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Glu Glu

195 200 205

Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr

210 215 220

Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

225 230 235

<210> 64

<211> 235

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FIXp-HC-AA

<400> 64

Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val

1. 5 10 15

Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile Val Asn

20 25 30

Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly Val Lys

35 40 45

Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu His Thr

50 55 60

Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Asp

85 90 95

Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile Ala Asp

100 105 110

Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser

115 120 125

Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln

130 135 140

Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu Ser Thr

145 150 155 160

Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His Glu Gly

165 170 175

Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Glu

180 185 190

Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Glu Glu

195 200 205

Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr

210 215 220

Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

225 230 235

<---

1. Полинуклеотид, кодирующий белок фактора IX, причем указанный полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17.

2. Полинуклеотид по п. 1, где полинуклеотид имеет не более 10 CpG–динуклеотидов.

3. Полинуклеотид по п. 1, где полинуклеотид имеет не более 3 CpG–динуклеотидов.

4. Полинуклеотид по п. 1, где полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17.

5. Полинуклеотид по п. 1, где полинуклеотид кодирует лейцин в положении аминокислоты, соответствующем остатку 384 полноразмерного полипептида фактора IX дикого типа, имеющего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2.

6. Полинуклеотид по п. 2, где полинуклеотид кодирует лейцин в положении аминокислоты, соответствующем остатку 384 полноразмерного полипептида фактора IX дикого типа, имеющего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2.

7. Полинуклеотид по п. 3, где полинуклеотид кодирует лейцин в положении аминокислоты, соответствующем остатку 384 полноразмерного полипептида фактора IX дикого типа, имеющего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2.

8. Полинуклеотид по любому из пп. 1–7, где белок фактора IX, кодируемый полинуклеотидом, имеет от 1 до 10 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 12.

9. Полинуклеотид по любому из пп. 1–7, где белок фактора IX, кодируемый полинуклеотидом, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

10. Полинуклеотид по любому из пп. 1–7, где полинуклеотид дополнительно содержит препролидерный полинуклеотид, кодирующий препролидерный пептид, причем указанный препролидерный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

11. Полинуклеотид по п. 10, где препролидерный полинуклеотид имеет последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23.

12. Полинуклеотид по любому из пп. 1–7, где полинуклеотид имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9.

13. Полинуклеотид по любому из пп. 1–7, в которой полинуклеотид имеет последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 9.

14. Полинуклеотид по любому из пп. 1–7, дополнительно содержащий специфический для печени промоторный элемент, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок фактора IX.

15. Полинуклеотид по п. 14, где специфический для печени промоторный элемент содержит одну копию промоторного полинуклеотида, причем указанный промоторный полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 39.

16. Полинуклеотид по п. 14, где специфический для печени промоторный элемент содержит три копии промоторного полинуклеотида, причем указанный промоторный полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 39.

17. Полинуклеотид по п. 15, где указанный промоторный полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 39.

18. Полинуклеотид по любому из пп. 1–7, дополнительно содержащий интрон, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок фактора IX.

19. Полинуклеотид по п. 18, где интрон содержит полинуклеотид интрона MVM, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 53.

20. Полинуклеотид по п. 19, где указанный полинуклеотид интрона MVM содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 53.

21. Полинуклеотид по п. 18, где указанный интрон расположен между промоторным элементом и сайтом инициации трансляции нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид фактора IX.

22. Полинуклеотид по п. 1, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 40.

23. Вектор для генной терапии млекопитающих, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 1-22.

24. Вектор для генной терапии млекопитающих по п. 23, где вектор для генной терапии млекопитающих представляет собой вектор аденоассоциированного вируса (AAV).

25. Вектор для генной терапии млекопитающих по п. 24, где указанный вектор аденоассоциированного вируса представляет собой вектор аденоассоциированного вируса серотипа 8 (AAV-8).

26. Вектор для генной терапии млекопитающих по п. 23, где полинуклеотид представляет собой одноцепочечный полинуклеотид, кодирующий белок фактора IX.