Способ подавления индуцирующего действия высокомолекулярной гиалуроновой кислоты на стволовые клетки рака молочной железы

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, онкологии и может быть использовано для подавления индуцирующего действия высокомолекулярной гиалуроновой кислоты на стволовые клетки рака молочной железы. Осуществляют 72-часовое воздействие на опухолевые клетки in vitro ДНК-связывающих лигандов – водонерастворимых димерных бисбензимидазолов. Проводят одновременную инкубацию клеток с водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 7 метиленовыми звеньями в составе линкера DB (7) и гиалуроновой кислотой с молекулярным весом от 1 до 3 кДа при температуре +37°С в течение 72 часов. После чего регистрируют снижение количества опухолевых стволовых клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low. Способ обеспечивает возможность снижения количества опухолевых стволовых клеток (ОСК), индуцированных при воздействии высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 10⁶ Да и более, за счет того, что на клетки рака молочной железы in vitro воздействуют с помощью ДНК-связывающих лигандов - водонерастворимых димерных бисбензимидазолов, что приводит к подавлению процесса эпителиально-мезенхимального перехода, приводящего к дедифференцировке опухолевых клеток и пополнению пула ОСК. 3 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, в частности онкологии, и может быть использовано для снижения количества опухолевых стволовых клеток (ОСК), индуцированных под действием высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (10⁶ Да и более), которая является важным компонентом межклеточной среды нормальных и опухолевых тканей.

ОСК, обнаруженные в злокачественных новообразованиях различной локализации и стабильных линиях опухолевых клеток человека и животных, характеризуются более высокой резистентностью к большинству терапевтических воздействий по сравнению с остальными опухолевыми клетками. Несмотря на небольшой размер этой субпопуляции (обычно от 0,1 до 5% от общего числа опухолевых клеток), ОСК играют важную роль в канцерогенезе и определяют эффективность лечения онкологических больных, поскольку способны сохранять жизнеспособность в ходе радио- и химиотерапии, вследствие чего могут являются причиной развития рецидивов и метастазов у части больных после окончания лечения (Krause M., Dubrovska A., Linge A., Baumann M. Cancer stem cells: Radioresistance, prediction of radio-therapy outcome and specific targets for combined treatments// Adv Drug Deliv Rev. 2017. V. 109. P. 63-73; Lytle N.K., Barber A.G., Reya T. Stem cells fate in cancer growth, progression and therapy resistance//Nat Rev Cancer. 2018. V. 18. P. 669-680; Batlle E., Clevers H. Cancer stem cells revisited// Nat Med. 2017. V. 23. P. 1124-1134; Chopra S., Deodhar K., Pai V., Pant S., Rathod N., Goda J.S., Sudhalkar N., Pandey P., Waghmare S., Engineer R. Cancer Stem Cells, CD44, and Outcomes Following Chemoradiation in Locally Advanced Cervical Cancer: Results From a Prospective Study// Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2019. V. 103. P. 161-168). В связи с этим снижение количества ОСК является одной из наиболее актуальных проблем онкологии, решение которой основывается на понимании молекулярных особенностей и сигнальных путей регуляции этих клеток.

Как известно, существенную роль в формировании пула ОСК и регуляции биологических свойств этих клеток играют различные факторы микроокружения, включая один из основных компонентов внеклеточного матрикса - гиалуроновую кислоту (ГК), которая в организме обычно находится в форме полианиона (гиалуронана). ГК относится к семейству глюкозамингликанов, представляет собой линейный полимер, состоящий из остатков D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина, соединенных поочередно β-1,4- и β-1,3-гликозидными связями и может содержать до 25000 таких дисахаридных звеньев в составе одной молекулы. Молекулярный вес ГК сильно варьирует у разных видов животных от 10³ до 10⁷ Да в зависимости от тканевой принадлежности, физиологических условий и патологического состояния. Физиологическая концентрация ГК, например, в дерме составляет 0,5 мг/мл (Хабаров В.Н. К вопросу о концентрации гиалуроновой кислоты в препаратах для биоревитализации// Эстетическая медицина. 2015. Т. 14. № 1. С.3-6).

При раке молочной железы (РМЖ) ГК имеет особое значение, поскольку ОСК этой локализации экспрессируют поверхностный маркер CD44, который является одним из рецепторов ГК, как показано авторами, обнаружившими стволовые клетки РМЖ в 2003 году (Al-Hajj M., Wicha M.S., Benito-Hernandez A., Morrison S.J., Clarke M.F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003. V. 100. No 7. P. 3983-3988). Накапливается все больше данных о важном значении ГК на всех стадиях опухолевого процесса, начиная от его инициации до развития резистентности к противоопухолевой терапии и образования метастазов (Price Z.K., Lokman N.A., Ricciardelli C. Differing Roles of Hyaluronan Molecular Weight on Cancer Cell Behavior and Chemotherapy Resistance// Cancers (Basel). 2018. V.10:482; Karousou E., Misra S., Ghatak S., Dobra K., Götte M., Vigetti D., Passi A., Karamanos N.K., Skandalis S.S. Roles and targeting of the HAS/hyaluronan/CD44 molecular system in cancer// Matrix Biol. 2017. V.59. P. 3-22; Tavianatou A.G., Caon I., Franchi M., Piperigkou Z., Galesso D., Karamanos N.K. Hyaluronan: molecular size-dependent signaling and biological functions in inflammation and cancer// FEBS J. 2019. V. 286. No 15. P.2883-2908; Liu M., Tolg C., Turley E. Dissecting the Dual Nature of Hyaluronan in the Tumor Microenvironment// Front Immunol. 2019. V. 10: 974). В частности, показано, что высокомолекулярная ГК (1-3)х10⁶ Да) способна повышать количество ОСК молочной железы (Замулаева И.А., Абрамова М.Р., Матчук О.Н., Липунов Н.М., Мкртчян Л.С., Крикунова Л.И. Влияние высокомолекулярной гиалуроновой кислоты на размер популяции стволовых клеток рака молочной железы линии MCF-7 //Вопросы Онкологии. 2021. Т. 67. № 2. С. 293-299). Кроме того, в ряде исследований доказано участие экзо- и эндогенной ГК в формировании и поддержании пула ОСК яичников, головы и шеи, глиобластомы и др. с помощью различных молекулярных механизмов, включая индукцию процесса эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), который приводит к дедифференцировке опухолевых клеток и пополнению пула ОСК (Price Z.K., Lokman N.A., Ricciardelli C. Differing Roles of Hyaluronan Molecular Weight on Cancer Cell Behavior and Chemotherapy Resistance// Cancers (Basel). 2018. V.10:482; Vaidyanath A., Mahmud H.B., Khayrani A.C., Oo A.K., Seno A., Asakura A., Kasaiand T., Seno M. Hyaluronic Acid Mediated Enrichment of CD44 Expressing Glioblastoma Stem Cells in U251MG Xenograft Mouse Model// J Stem Cell Res Ther. 2017. V. 7: 384; Shiina M., Bourguignon L.Y. Selective activation of cancer stem cells by size-specific hyaluronan in head and neck cancer. Int J Cell Biol. 2015. V. 2015: 989070).

Таким образом, увеличение пула ОСК под влиянием ГК является доказанным фактом, который делает необходимым поиск способов подавления такого влияния, тем более, что ГК с различным молекулярным весом широко используется в клинической практике в составе композиций и препаратов для регенерации биологических тканей (RU 2614722, RU 2667964, RU 2489176), терапии остеоартроза, повреждения связок и др. патологии суставов (RU 2529803), а также для коррекции эстетических и возрастных изменений кожи (RU 2686738, RU 2585893). С практической точки зрения, важно учитывать стимулирующее действие ГК на популяцию ОСК, которое возможно даже при отсутствии признаков онкологического заболевания, например, у лиц после успешно проведенной противоопухолевой терапии, поскольку именно ОСК могут сохраняться при полной клинической регрессии опухоли и, как предполагают, могут являться источником рецидивирования опухолевого процесса спустя долгие годы после лечения. Кроме того, нельзя исключать влияние как эндо-, так и экзогенной ГК на ОСК в опухолевых микроочагах, не выявляемых клинически, но присутствующих в различных органах и тканях человека в возрастающем при старении количестве (Folkman J., Kalluri R. Cancer without disease// Nature. 2004. V. 427. No 6977. P.787). В других изобретениях описаны композиции на основе ГК, которые предложено использовать для профилактики (RU2341271, RU2612821) и лечения онкологических заболеваний, в том числе путем направленной доставки химиопрепаратов в опухолевые клетки (RU2581972, RU2686679, RU2480201, RU2411958, RU2384331, RU2341271, RU2162327, RU2686679, RU2162327). Недостатком перечисленных способов профилактики и лечения с помощью композиций и препаратов ГК является отсутствие данных об их действии на ОСК.

Известны многочисленные способы снижения количества ОСК. Известен способ на основе использования полиэфирного ионофорного антибиотика салиномицин, который значимо уменьшает количество ОСК различных злокачественных новообразований, включая РМЖ (Lu Y., Mao J., Yu X. Hou Z., Fan S., Wang H., Li J., Kanq L., Liu P., Liu Q., Li L. Salinomycin exerts anticancer effects on human breast carcinoma MCF-7cancer stem cells via modulation of Hedgehog signaling // Chemico-Biological Interactions. 2015. V. 228. P. 100-107). Существует способ, когда использование салиномицина в качестве радиосенсибилизатора приводит к снижению пула ОСК злокачественных новообразований головы и шеи в условиях in vitro (Zhang Y., Zuo Y., Guan Z., Lu W., Xu Z., Zhang H., Yang Y., Yang M., Zhu H., Chen X. Salinomycin radiosensitizes human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2 to radiation//Tumour Biol. 2016. V. 37. Nо 1. P. 305-311; Scherzed A., Hackenberg S., Froelich K., Rak K., Ginzkey C., Hagen R., Schendzielorz P., Kleinsasser N. Effects of salinomycin and CGP37157 on head and neck squamous cell carcinoma cell lines in vitro//Mol Med Rep. 2015. V.12. Nо 3. P. 4455-4461). Возможные механизмы действия салиномицина на ОСК связаны с его способностью ингибировать сигнальные пути SOX2, Hedgehog, CXCR4 и др.

Недостатком салиномицина является его токсичность в отношении клеток нервной системы и других нормальных клеток (Boehmerle W., Endres M. Salinomycin induces calpain and cytochromec-mediated neuronal cell death // Cell Death and Disease. 2011. V. 2. P. 2-10; Jaganmohan R., Jain M.V., Hallbeck A.L., Roberq K., Lotfi K., Los M.J. Glucose starvation-mediated inhibition of salinomycin induced autophagy amplifies cancer cell specific cell death // Oncotarget. 2015. V. 6. No 12. P. 10134-10145).

Известно вещество метформин (1,1 - диметилбигуанид гидрохлорид), которое широко используется в качестве гипогликемического препарата для лечения диабета 2-го типа (Wiernsperger N., Bailey C.J. The antihyperglycaemic effect of metformin: therapeutic and cellular mechanisms // Drugs. 1999. V. 58. No 1. P. 31-39). Доказана его высокая противоопухолевая активность в отношении ОСК молочной железы с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low. При этом на остальные (не стволовые) опухолевые клетки это вещество оказывало менее выраженное действие (Lee H. Park H.J., Oh E. T., Choi B.H., Williams B., Lee C.K., Somq C.W. Response of Breast Cancer Cells and Cancer Stem Cells to Metformin and Hyperthermia Alone or Combined // PLOS ONE. 2014. V. 9. No 2. P. 1-11).

Ключевым механизмом его действия является способность нарушать окислительное фосфорилирование в митохондриях опухолевых клеток, в том числе ОСК. Недостатком метформина является то, что он наиболее эффективен в отношении ОСК только совместно с гипертермией или радиационным воздействием.

Известно вещество куркумин (дифферулоилметан), которое представляет собой полифенол, полученный из азиатской специи куркумы. В многочисленных исследованиях был показан высокий терапевтический потенциал куркумина в качестве средства снижения количества ОСК рака молочной железы (Mukherjee S., Mazumbar M., Manna A., Saha S., Khan P., Bhattacharjee O., Guha D., Adnikary A., Mukhjerjee S., Das T. Curcumin inhibits breast cancer stem cell migration by amplifying the E cadherin/β-cateninnegative feedback loop // Stem Cell Research & Therapy. 2014. No 5. P. 116-134). Куркумин воздействует на ряд сигнальных путей, играющих важную роль в жизнедеятельности ОСК, например, таких как Wnt, Notch-1 и NFκ-B (Gülçür E., Thaqi M., Khaja F., Kuzmis A., Önyüksel H. Curcumin in VIP-targeted sterically stabilized phospholipid nanomicelles: a novel therapeutic approach for breast cancer and breast cancer stem cells // Drug DelivTransl Res. 2013. No 3. P. 1-25). Недостатком этого соединения является его низкая биодоступность, плохая абсорбция и недостаточная стабильность in vivo (Bansal S., Goel M., Aqil F., Vadhanam M., Gupta R. Advanced drug-delivery systems of curcumin for cancer chemoprevention // Cancer Prev. Res. (Phila). 2011. №4. P. 1158-1171; Anand P., Kunnumakkara A., Newman R., Aggarwal B. Bioavailability of Curcumin: Problems and Promises // Molecular Pharmaceutics. 2007. V.4. No 6. P. 807-818).

Известны способы лечения злокачественных новообразований, направленные на снижение количества ОСК с помощью различных механизмов, например, с использованием:

-замещенных пирролопиримидиновых соединений и композиций на их основе (WO/2016/010886, Zhu D., Boylan J., Xu, S., Riggs J., Shi T., Wurmser A., Mikolon D., Deyanat-Yazdi G. Methods of treating a cancer using substituted pyrrolopyrimidine compounds, compositions thereof);

-антител к PTK7 и их конъюгатов с цитотоксическим агентом (WO/2012/112943, Foord O., Dylla S. , Stull R., Bankovich A., Lazetic A.L.L., Bernstein J. Novel modulators and methods of use);

- Wnt-связывающего полипептида, ингибирующего Wnt-сигнальный путь, отдельно или в комбинации с другими противоопухолевыми препаратами (WO2011088123, Satyal S. H., Mitra S.S.K., Garni A.L. Wnt antagonists and methods of treating and testing);

- изменений CD47-сигналинга и индукции дифференцировки ОСК различными средствами (WO/2016/057980, Roberts D.R., Kaur S., Liu C. Methods to eliminate cancer stem cells by targeting CD47).

Известен способ снижения количества ОСК с помощью препарата флубендазол. Это соединение является членом семейства бензимидазолов, имеет типичную бензимидазольную часть, но с добавлением атома фтора в основную структуру, чем и отличается от других бензимидазолов. Флубендазол широко используется как эффективное противогельминтное средство. Недавние исследования показали, что флубендазол подавляет пролиферацию опухолевых клеток, а также снижает количество CD44⁺СD24^-/low клеток РМЖ линии MCF-7 на 25% (Hou Z.-J., Luo X., Zang W., Peng F., Cui B., Wu S.-J., Zheng F.-M., Xu J., Xu L.-Z., Long Z.-J., Wang X.-T., Li G.-H., Wan X.-Y., Yang Y.-L., Liu Q. Flubendazole, FDA-approved antihelmintic, targets breast cancer stem-like cells // Oncotarget. 2015. V.6. No.8. P. 6326-6340).

Недостатком способа снижения количества ОСК с помощью флубендазола является низкая биодоступность из-за высокой липофильности соединения.

Важно отметить, что для всех вышеперечисленных способов отсутствуют данные об их способности блокировать стимулирующее действие высокомолекулярной ГК на пул ОСК, что является существенным недостатком известных способов уменьшения количества ОСК.

Прототипом предлагаемого технического решения является cпособ снижения количества стволовых клеток рака молочной железы (RU 2702910 C1, Чурюкина К.А., Замулаева И.А., Матчук О.Н., Жузе А.Л., Иванов А.А.). Способ основан на применении ДНК-связывающих лигандов - водонерастворимых димерных бисбензимидазолов (dimeric bisbenzimidazoles - DB). Водонерастворимые димерные бисбензимидазолы являются флуоресцентными химическими соединениями из группы бисбензимидазолов, в которых два бисбензимидазольных блока соединены между собой метиленовым линкером - DB(n), где n- число метиленовых звеньев.

Однако в известном способе отсутствуют данные о влиянии DB(n) на размер пула ОСК при воздействии ГК на опухолевые клетки, включая возможность блокирования стимулирующего эффекта высокомолекулярной ГК в отношении ОСК - критически важной популяции клеток злокачественных новообразований.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в снижении количества ОСК, индуцированных при воздействии высокомолекулярной ГК 10⁶ Да и более, путем подавления процесса ЭМП.

Технический результат достигается тем, что так же как в известном способе, на клетки РМЖ in vitro воздействуют с помощью ДНК-связывающих лигандов - водонерастворимых димерных бисбензимидазолов DB(n).

Особенность заявляемого способа заключается в том, что проводят одновременную инкубацию клеток с водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 7 метиленовыми звеньями в составе линкера DB (7) и гиалуроновой кислотой с молекулярным весом от 1 до 3 кДа при температуре +37⁰С в течение 72 часов, после чего регистрируют снижение количества опухолевых стволовых клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low.

Изобретение иллюстрируется подробным описанием, примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 - относительное количество СD44⁺CD24^-/low ОСК линии MCF-7 в контроле, после инкубации клеток с ГК (0,6 мг/мл) или водонерастворимым димерным бисбензимидазолом DB (7) (20 мкМ) или после комбинированного воздействия DB(7) и ГК. Приведены значения р, установленные при сравнении указанных групп по критерию Стьюдента.

Фиг. 2 - абсолютное количество СD44⁺CD24^-/low ОСК линии MCF-7 в контроле, после инкубации клеток с ГК (0,6 мг/мл) или водонерастворимым димерным бисбензимидазолом DB (7) (20 мкМ) или после комбинированного воздействия DB(7) и ГК. Приведены значения р, установленные при сравнении указанных групп по критерию Стьюдента.

Фиг. 3 - интенсивность связывания клеток линии MCF-7 с антителами к виментину в интактном контроле, после одиночного или комбинированного действия DB(7) и ГК. Сплошная горизонтальная линия показывает среднюю интенсивность флуоресценции клеток после обработки контрольными иммуноглобулинами (изотипический контроль неспецифического связывания), пунктирные линии отмечают стандартную ошибку (± SE) средней интенсивности флуоресценции в контроле неспецифического связывания; *p=0,005 при сравнении с интактным контролем, ^p=0,02 при сравнении с контролем неспецифического связывания.

Способ осуществляют следующим образом.

Способ включает несколько этапов.

I этап - одиночное и комбинированное воздействие DB(7) и ГК на клетки РМЖ.

Клетки РМЖ линии MCF-7 человека культивируют в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Biosera, Франция), пенициллин (50 ед/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) и глютамин (292 мг/л), в стандартных условиях при 37°С в СО₂-инкубаторе (Shellab, США). Клетки рассевают в пластиковые флаконы с площадью дна 25см² (Corning, США) по 250 тысяч клеток/флакон в полной питательной среде DMEM. Через 24 ч в часть флаконов добавляют DB(7) в конечной концентрации 20 мкМ, в часть флаконов - высокомолекулярную ГК (10⁶ Да и более) в конечной концентрации 0,6 мг/мл, которая примерно соответствует физиологической норме, в часть флаконов добавляют одновременно DB(7) и ГК в указанных концентрациях и инкубируют в течение 72 ч в стандартных условиях. Таким образом, формируют группы «Контроль», «ГК», «DB(7)», «DB(7)+ГК».

После инкубации с указанными соединениями клетки снимают со дна контрольных и опытных флаконов с помощью смеси версен/трипсин (1:1). С помощью камеры Горяева определяют концентрацию и общее количество клеток в каждом флаконе.

Далее в полученных суспензиях выявляют ОСК (II этап) и оценивают экспрессию виментина на белковом уровне (III этап).

II этап - выявление и количественная оценка CD44⁺СD24^-/low ОСК.

Клетки из каждого флакона разводят в соотношении 1 млн клеток на 100 мкл холодного раствора Хэнкса, в который добавляют моноклональные антитела к CD44, меченные флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) (Becton Dickinson - BD, США), и антитела к CD24, меченные фикоэритрином (ФЭ) (BD, США), из расчета по 20 мкл антител на 1 млн клеток. Для контроля неспецифического связывания используют моноклональные антитела соответствующих изотипов к гемоцианину улитки, конъюгированные с теми же флуорохромами, что и антитела к указанным поверхностным маркерам (BD, США). Пробы инкубируют с антителами в течение 30 минут на льду в темноте, затем отмывают в 0,01M фосфатно-солевом буферном растворе, pH 7,2 (PBS, Панэко, Россия), центрифугируют в течение 5 минут при 200xg и к получившемуся осадку добавляют холодный раствор Хэнкса. Пробы ресуспендируют и немедленно анализируют на стандартном проточном цитофлуориметре, оснащенном лазером с длиной волны 488 нм (например, FACSCalibur, Becton Dickinson, США).

В каждом образце анализируют и собирают в файл данные об интенсивности прямого и бокового светорассеяния, флуоресценции ФИТЦа и ФЭ. В ходе обработки файлов выполняют стандартную процедуру выделения региона неповрежденных клеток и удаления дебриса по показателям светорассеяния. Затем оценивают интенсивность флуоресценции ФИТЦа и ФЭ в выделенном регионе неповрежденных клеток. С учетом контроля неспецифического связывания идентифицируют клетки с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low и определяют их относительное количество (%). Абсолютное количество CD44⁺СD24^-/low клеток вычисляют путем умножения доли этих клеток на общее количество клеток во флаконе, определенное с помощью камеры Горяева.

III этап - оценка экспрессии виментина в клетках РМЖ.

Из каждого флакона отбирают аликвоты по 250 тыс. клеток, фиксируют их в холодном ацетоне и хранят при -20°С. Перед окрашиванием клетки 3-кратно отмывают в PBS c 1% бычьим сывороточным альбумином, после чего инкубируют с моноклональными антителами к виментину, меченными ФЭ (BD, США), в течение 1ч при комнатной температуре в соотношении 5 мкл антител/250 тыс. клеток. Для контроля неспецифического связывания используют моноклональные антитела того же изотипа к гемоцианину улитки, конъюгированные с ФЭ (BD, США). После инкубации клетки отмывают в PBS от несвязавшихся антител и немедленно анализируют с помощью стандартного проточного цитофлуориметра, например, FACSCalibur (BD, США) по показателям интенсивности светорассеяния и флуоресценции ФЭ. Определяют среднюю интенсивность флуоресценции ФЭ в клетках после исключения дебриса по показателям светорассеяния.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Изменение относительного количества CD44⁺СD24^-/low ОСК после одиночного или комбинированного воздействия DB(7) и ГК с молекулярным весом (1-3)х10⁶Да на клетки РМЖ

Клетки РМЖ линии MCF-7 культивировали in vitro в присутствии DB(7) в конечной концентрации 20 мкМ и высокомолекулярной ГК (1-3)х10⁶ Да) в конечной концентрации 0,6 мг/мл в течение 72 ч в стандартных условиях. Далее клетки снимали с подложки и в полученных клеточных суспензиях определяли относительное количество (%) клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low с помощью проточной цитометрии. В результате было подтверждено значительное повышение относительного количества ОСК под влиянием высокомолекулярной ГК по сравнению с контрольным уровнем, а также снижение относительного количества ОСК под влиянием DB(7) по сравнению с контролем, описанное в прототипе (Фиг. 1).

Установлено, что соединение DB(7) в комбинации с ГК статистически значимо снижает относительное количество CD44⁺СD24^-/low ОСК в 12,7 раз по сравнению с одиночным воздействием ГК (р=0,0004), т.е. происходит подавление стимулирующего эффекта ГК в отношении пула ОСК. При комбинированном воздействии отмечается тенденция к снижению относительного количества ОСК по сравнению с таковым в контроле: 0,14±0,02% vs 0,29±0,04% в среднем, соответственно (р=0,108).

Пример 2. Изменение абсолютного количества CD44⁺СD24^-/low ОСК после одиночного или комбинированного воздействия DB(7) и ГК с молекулярным весом (1-3)х10⁶Да на клетки РМЖ

Клетки РМЖ линии MCF-7 культивировали in vitro в присутствии DB(7) в конечной концентрации 20 мкМ и высокомолекулярной ГК (1-3)х10⁶ Да) в конечной концентрации 0,6 мг/мл в течение 72 ч в стандартных условиях. Далее клетки снимали с подложки, определяли их общее количество и рассчитывали абсолютное количество клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low, идентифицированных с помощью проточной цитометрии. В результате было показано значительное повышение абсолютного количества ОСК под влиянием высокомолекулярной ГК по сравнению с интактным контролем (Фиг. 2). Как и в прототипе, зарегистрировано многократное снижение абсолютного количества ОСК под влиянием DB(7) по сравнению с контролем (р=0,002).

Комбинированное использование DB(7) и ГК статистически значимо снижало абсолютное количество CD44⁺СD24^-/low ОСК в 41,3 раза по сравнению с одиночным действием ГК (р=0,0004) и в 8,5 раз по сравнению с интактным контролем (р=0,006). Таким образом, под влиянием DB(7) стимулирующий эффект ГК в отношении пула ОСК нивелировался, и более того, количество ОСК уменьшалось до уровня ниже, чем в контроле.

Пример 3. Белковая экспрессия виментина как маркера ЭМП в клетках линии MCF-7 РМЖ после одиночного или комбинированного воздействия DB(7) и ГК с молекулярным весом (1-3)×10⁶Да

Клетки РМЖ линии MCF-7 культивировали in vitro в присутствии DB(7) в конечной концентрации 20 мкМ и высокомолекулярной ГК (1-3)х10⁶ Да) в конечной концентрации 0,6 мг/мл в течение 72 ч в стандартных условиях. Далее клетки снимали с подложки, фиксировали в ацетоне и окрашивали с помощью флуоресцирующих антител к виментину (одному из основных маркеров ЭМП). С помощью проточной цитометрии оценивали связывание клеток с антителами к виментину в сравнении с контролем неспецифического связывания (контрольными иммуноглобулинами, имеющими тот же изотип и меченными тем же флуорохромом, что антитела к виментину).

Фиг. 3 показывает, что интактные клетки линии MCF-7 в общей массе не экспрессируют виментин, т.к. средняя интенсивность флуоресценции клеток, обработанных антителами к этому белку, не отличалась от таковой после инкубации с контрольными иммуноглобулинами того же изотипа. Однако после инкубации клеток с высокомолекулярной ГК обнаружено специфическое связывание антител к виментину, что свидетельствует об индукции процесса ЭМП, который является важным механизмом дедифференцировки опухолевых клеток, вследствие чего происходит увеличение пула ОСК под влиянием ГК. Обработка клеток с помощью DB(7) полностью блокировала ЭМП, индуцированный ГК. Таким образом, по крайней мере, одним из механизмов снижения количества ОСК при комбинированном действии DB(7) и ГК является подавление ЭМП, зарегистрированное нами по отсутствию экспрессии виментина.

Вместе примеры №1 и №2 показывают высокую эффективность действия DB(7) на популяцию ОСК, индуцируемую высокомолекулярной ГК в клеточной культуре РМЖ. Установлено, что DB (7) многократно уменьшает абсолютное количество CD44⁺СD24^-/low ОСК по сравнению с одиночным действием ГК. При этом DB(7) обладает направленным действием именно на ОСК, снижая их количество в большей степени по сравнению с остальными опухолевыми клетками, как следует из примера 1.

Пример №3 проясняет механизм снижения количества ОСК, которые индуцируются под влиянием ГК, путем подавления процесса ЭМП.

В соответствии с концепцией ОСК, все ключевые характеристики злокачественных новообразований, делающие их смертельно опасными заболеваниями, определяются именно ОСК. Ряд факторов опухолевого микроокружения, включая высокомолекулярную ГК, способны повышать количество ОСК, которые являются более химио- и радиорезистентными, чем остальная масса опухолевых клеток.

Предлагаемый способ подавления индукции ОСК позволит повысить химио-и радиочувствительность опухоли в целом, что в свою очередь будет способствовать повышению эффективности лечения.

Способ подавления индуцирующего действия высокомолекулярной гиалуроновой кислоты на стволовые клетки рака молочной железы, включающий 72-часовое воздействие на опухолевые клетки in vitro ДНК-связывающих лигандов – водонерастворимых димерных бисбензимидазолов, отличающийся тем, что проводят одновременную инкубацию клеток с водонерастворимым димерным бисбензимидазолом с 7 метиленовыми звеньями в составе линкера DB (7) и гиалуроновой кислотой с молекулярным весом от 1 до 3 кДа при температуре +37°С в течение 72 часов, после чего регистрируют снижение количества опухолевых стволовых клеток с иммунофенотипом CD44⁺СD24^-/low .