Способы модулирования cart-клеток

Изобретение относится к способу экспансии модифицированных способами инженерии клеток, который включает одно или оба из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии индивидууму, имеющему опухоль или злокачественную опухоль. Указанному индивидууму ранее проводилось введение модифицированных способами генной инженерии клеток для лечения указанных опухоли или злокачественной опухоли за 12 месяцев или менее перед одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии. Модифицированные способами инженерии клетки содержат T-клетки и указанные модифицированные способами инженерии клетки экспрессируют рекомбинантный рецептор. Предложенный способ приводит к увеличению экспансии и в некоторых случаях к более устойчивому и длительному ответу модифицированных способами инженерии клеток после проведения разрушения и/или лечения. 51 з.п. ф-лы, 9 ил., 10 табл., 6 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[1] Настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 62/429740, поданной 3 декабря 2016 года, под названием "METHODS FOR MODULATION OF GENETICALLY ENGINEERED CELLS", предварительной заявке США № 62/444784, поданной 10 января 2017 года, под названием "METHODS FOR MODULATION OF GENETICALLY ENGINEERED CELLS", предварительной заявке США № 62/492950, поданной 1 мая 2017 года, под названием "METHODS FOR MODULATION OF GENETICALLY ENGINEERED CELLS", предварительной заявке США № 62/514777, поданной 2 июня 2017 года, под названием "METHODS FOR MODULATION OF GENETICALLY ENGINEERED CELLS", предварительной заявке США № 62/515512, поданной 5 июня 2017 года, под названием "METHODS FOR MODULATION OF GENETICALLY ENGINEERED CELLS", предварительной заявке США № 62/549391, поданной 23 августа 2017 года, под названием "METHODS FOR MODULATION OF GENETICALLY ENGINEERED CELLS" и предварительной заявке США № 62/580414, поданной 1 ноября 2017 года, под названием "METHODS FOR MODULATION OF GENETICALLY ENGINEERED CELLS", содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Включение списка последовательностей в качестве ссылки

[2] Настоящая заявка подается вместе со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей предоставлен в качестве файла под названием 735042009140SeqList.txt, созданного 29 ноября 2017 года, который имеет размер 34,855 килобайт. Информация списка последовательностей в электронном формате включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Область изобретения

[3] Настоящее изобретение относится в некоторых аспектах к способу модулирования in vivo, к клеткам, в которые встроен способами инженерии рекомбинантный рецептор, такой как T-клеточный рецептор (TCR) или химерный рецептор антигена (CAR). В некоторых вариантах осуществления способы включают разрушение области у индивидуума, в которой присутствуют или вероятно будут присутствовать клетки и/или очага повреждения, такого как опухоль и/или обеспечение лечения, которое включает одно или несколько из физической или механической манипуляции над очагом или его частью, облучения или введения иммуномодулирующего средства. В некоторых вариантах осуществления разрушение и/или лечение изменяет среду очага повреждения, например, микроокружение опухоли. В некоторых вариантах осуществления разрушение и/или лечение представляет собой биопсию. В некоторых аспектах, предусматриваемые способы приводят к увеличению экспансии, и, в некоторых случаях к более устойчивому и длительному ответу модифицированных способами инженерии клеток после проведения разрушения и/или лечения.

Уровень техники

[4] Для иммунотерапии доступны различные стратегии, например, способы адоптивной клеточной терапии, вовлекающие введение T-клеток, таких как клетки с встроенными посредством генной инженерии рецепторами антигенов, такими как CAR. В некоторых аспектах доступные способы могут не быть полностью удовлетворительными. Существует потребность в дополнительных стратегиях адоптивной клеточной терапии, например, в стратегиях повышения выживаемости, активности и/или пролиферации введенных клеток и ответов, и в стратегиях модулирования клеток. Предусматриваются способы, которые удовлетворяют такие потребности.

Сущность изобретения

[5] В рамках настоящего изобретения предусматривается способ экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток, включающий вмешательство в область у индивидуума, в которой модифицированные клетки присутствуют, или вероятно будут присутствовать, или присутствовали или вероятно присутствовали, и/или обеспечения лечения, которое включает одно или несколько из физического или механического манипулирования над очагом или его частью, облучения или введения иммуномодулирующего средства, где указанному индивидууму ранее проводили введение модифицированных способами генной инженерии клеток для лечения заболевания или состояния, где способ приводит к экспансии модифицированных способами инженерии клеток у индивидуума в области, и/или в ткани, или в органе, или в жидкости индивидуума и/или к увеличению количества модифицированных способами инженерии клеток в этой области, ткани, или органе, или жидкости. В определенных вариантах осуществления область представляет собой или содержит очаг повреждения или его часть. В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения представляет собой опухоль. В определенных вариантах осуществления опухоль представляет собой первичную или вторичную опухоль. В конкретных вариантах осуществления область представляет собой или содержит ткань костного мозга. В определенных вариантах осуществления область представляет собой или содержит очаг повреждения или его часть.

[6] В некоторых из любых таких вариантов осуществления в момент времени или непосредственно перед моментом времени вмешательства и/или лечения, у индивидуума произошел рецидив после ремиссии в ответ на введение модифицированных способами генной инженерии клеток. В некоторых из любых таких вариантов осуществления в момент времени или непосредственно перед моментом времени вмешательства и/или лечения индивидуум находится в фазе ремиссии; количество модифицированных способами инженерии клеток, поддающихся обнаружению в крови, снижается или не поддается обнаружению; количество модифицированных способами инженерии клеток, поддающееся обнаружению в жидкости, или ткани, или образце, необязательно в крови, от индивидуума снижается по сравнению с предшествующим моментом времени после введения модифицированных способами инженерии клеток; и/или количество модифицированных способами инженерии клеток, поддающихся обнаружению в жидкости, или ткани, или образце, необязательно в крови, от индивидуума, снижается в или более чем в 1,5 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раз, 10 раз или более по сравнению с пиковым или максимальным количеством модифицированных способами инженерии клеток, поддающимся обнаружению или обнаруженным в крови индивидуума после начала введения модифицированных способами инженерии клеток и/или по сравнению с уровнем в момент времени в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, или 14 или 28 суток после введения клеток.

[7] В некоторых из любых таких вариантов осуществления вмешательство и/или лечение проводят через, приблизительно через, или более чем, или более чем приблизительно через 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 1 год или более после начала введения модифицированных способами генной инженерии клеток или после последней дозы модифицированных способами генной инженерии клеток. В некоторых из любых таких вариантов осуществления вмешательство и/или лечение включает одно или несколько из введения иммуномодулирующего средства, лучевой терапии или физического или механического манипулирования над областью или очагом повреждения.

[8] В некоторых из любых таких вариантов осуществления вмешательство и/или лечение включает введение иммуномодулирующего средства. В конкретных вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой или содержит ингибирующую иммунитет молекулу, представляет собой или содержит молекулу иммунной точки контроля или представитель каскада иммунной точки контроля и/или представляет собой или содержит модулятор молекулы или каскада иммунной точки контроля. В определенных вариантах осуществления молекула иммунной точки контроля или каскад представляет собой или содержит PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM3, VISTA, рецептор аденозина, CD73, CD39, рецептор аденозина 2A (A2AR), или аденозин или каскад, вовлекающий любой из вышеуказанных. В определенных вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой талидомид или представляет собой производное или аналог талидомида. В конкретных вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой леналидомид или помалидомид, авадомид, стереоизомер леналидомида, помалидомида, авадомида, или их фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф. В определенных вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой леналидомид, стереоизомер леналидомида или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф.

[9] В некоторых из любых таких вариантов осуществления после рецидива и перед вмешательством и/или лечением, индивидууму не вводят экзогенное или рекомбинантное средство для лечения заболевания или состояния или для модулирования активности модифицированных способами инженерии клеток. В некоторых из любых таких вариантов осуществления вмешательство и/или лечение включает лучевую терапию. В некоторых из любых таких вариантов осуществления вмешательство и/или лечение включает физическое или механическое манипулирование над областью или очагом повреждения, и необязательно включает исследование с помощью зонда, прокалывание или проникновение в область или очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления физическое или механическое манипулирование включает биопсию. В конкретных вариантах осуществления биопсию проводят с помощью иглы или троакара. В определенных вариантах осуществления биопсия включает инцизионную биопсию.

[10] В некоторых из любых таких вариантов осуществления способы приводят к экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток или увеличению количества модифицированных способами генной инженерии клеток по сравнению с моментом времени непосредственно перед вмешательством и/или лечением. В конкретных вариантах осуществления экспансия клеток происходит в пределах или приблизительно в пределах 24 часов, 48 часов, 96 часов, 7 суток, 14 суток или 28 суток после вмешательства и/или лечения. В определенных вариантах осуществления экспансия обеспечивает более чем или приблизительно более чем в 1,5 раза, в 2,0 раза, в 5,0 раз, в 10 раз, в 100 раз, в 200 раз или более больше модифицированных способам инженерии клеток, поддающихся обнаружению в крови, по сравнению с моментом времени непосредственно перед вмешательством и/или лечением; или экспансия обеспечивает более чем или приблизительно более чем в 1,5 раза, в 2,0 раза, в 5,0 раз, в 10 раз, в 100 раз, в 200 раз или более больше модифицированных способами инженерии клеток, поддающихся обнаружению в крови, по сравнению с предшествующими пиковыми уровнями модифицированных способами инженерии клеток в крови перед вмешательством и/или лечением. В конкретных вариантах осуществления количество модифицированных способами инженерии клеток, поддающихся обнаружению в крови в некоторый момент времени после вмешательства и/или лечения: возрастает (например, возрастает в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз или более) по сравнению с количеством модифицированных способами инженерии клеток в предшествующий момент времени перед вмешательством и/или лечением; более чем в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз или более превышает пиковое или максимальное количество модифицированных способами инженерии клеток, поддающееся обнаружению в крови индивидуума до вмешательства и/или лечения; более чем или приблизительно более чем на 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% или 0,1% модифицированных способами инженерии клеток поддается обнаружению в крови в момент времени после обнаружения пика максимального уровня таких клеток в крови.

[11] В некоторых из любых таких вариантов осуществления модифицированные способами инженерии клетки экспрессируют рекомбинантный рецептор, который специфически связывается с антигеном, ассоциированным с заболеванием или нарушением, или экспрессируемым в клетках окружения или очага повреждения. В некоторых из любых таких вариантов осуществления заболевание или состояние представляет собой опухоль или злокачественную опухоль. В некоторых из любых таких вариантов осуществления заболевание или состояние представляет собой лейкоз или лимфому. В некоторых из любых таких вариантов осуществления заболевание или состояние представляет собой неходжкинскую лимфому (NHL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL). В некоторых из любых таких вариантов осуществления рекомбинантный рецептор представляет собой T-клеточный рецептор или функциональный не T-клеточный рецептор. В некоторых из любых таких вариантов осуществления рекомбинантный рецептор представляет собой химерный рецептор антигена (CAR).

[12] В некоторых вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, который специфически связывается с антигеном, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий ITAM. В определенных вариантах осуществления антиген представляет собой CD19. В конкретных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен включает внутриклеточный домен цепи CD3-зета (CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит костимулирующую сигнальную область. В определенных вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен включает сигнальный домен CD28 или 4-1BB. В конкретных вариантах осуществления модифицированные способами инженерии клетки представляют собой CD4+ или CD8+ T-клетки. В некоторых из любых таких вариантов осуществления модифицированные способами инженерии клетки являются аутологичными для индивидуума.

[13] В некоторых из любых таких вариантов осуществления модифицированные способами инженерии клетки являются аллогенными для индивидуума. В некоторых из любых таких вариантов осуществления модифицированные способами инженерии клетки вводят в количестве приблизительно от 0,25×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от 0,5×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 3×10⁶ клеток/кг, приблизительно от 0,75×10⁶ клеток/кг до 2,5×10⁶ клеток/кг или приблизительно от 1×10⁶ клеток/кг до 2×10⁶ клеток/кг, в каждом случае включительно. В некоторых из любых таких вариантов осуществления модифицированные способами инженерии клетки вводят в одной фармацевтической композиции, содержащей клетки. В некоторых из любых таких вариантов осуществления модифицированные способами инженерии вводят в разделенной дозе, где клетки дозы вводят в множестве композиций, в совокупности содержащей клетки дозы, на протяжении периода, составляющего не более трех суток.

[14] В рамках настоящего изобретения предусматриваются способы лечения, включающие проведение режима лечения у индивидуума, где индивидууму ранее вводили модифицированные способами генной инженерии клетки для лечения заболевания или состояния, где способ приводит к экспансии модифицированных способами инженерии клеток у индивидуума, в области и/или в ткани или органе, или жидкости индивидуума, и/или к увеличению количества модифицированных способами инженерии клеток в области, ткани, или органе, или жидкости.

[15] В определенных вариантах осуществления режим лечение включает вмешательство в область у индивидуума, в которой присутствуют, или предположительно присутствуют, или присутствовали, или вероятно будут присутствовать модифицированные клетки, и/или включает одно или нескольких физических или механических манипулирований над очагом повреждения или его частью, лучевую терапию или введение иммуномодулирующего средства. В конкретных вариантах осуществления режим лечения и/или способ не включает последующее введение модифицированных способами генной инженерии клеток или модифицированных способами генной инженерии клеток, и/или экспансию достигают без такого последующего введения. В некоторых вариантах осуществления режим лечения вводят в субтерапевтической дозе и/или он обеспечивает его терапевтический эффект посредством экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток. В определенных вариантах осуществления у индивидуума возник рецидив после ответа на и/или он не отвечал на предшествующее введение модифицированных способами генной инженерии клеток. В некоторых вариантах осуществления индивидуум отвечал на модифицированные способами генной инженерии клетки, а затем перестал отвечать и/или у него возник рецидив.

Краткое описание чертежей

[16] На фиг.1A представлено количество CD3⁺/CAR⁺ T-клеток в периферической крови, измеренное в определенные моменты времени после инфузии, для индивидуумов, сгруппированных по наилучшему общему ответу.

[17] На фиг.1B-1D представлены уровни CD3⁺/CAR⁺ T-клеток, CD4⁺/CAR⁺ T-клеток и CD8⁺/CAR⁺ T-клеток в периферической крови, определенные через определенные временные интервалы после инфузии, для индивидуумов, которые достигли ответа, сгруппированных по длительному ответу через 3 месяца.

[18] На фиг.2A представлено количество CD3+/CAR+, CD4+/CAR+, CD8+/CAR+ T-клеток в периферической крови индивидуума с химиорефрактерной трансформированной DLBCL, определенное в определенные моменты времени. На фиг.2B представлено аксиальное изображение PET-CT до лечения, демонстрирующее внутричерепную аномалию в правой средней черепной ямке и выраженную аномалию в подкожных тканях правой задней слуховой области. На фиг.2C представлено изображение PET-CT после лечения, на котором представлено разрешение аномалии, представленной на фиг.2B, после лечения CAR+ T-клетками против CD19. На фиг.2D представлено изображение MRI головного мозга до лечения (T₁-взвешенное изображение высокого разрешения с использованием контрастного материала; аксиальная проекция), демонстрирующее однородное объемное образование повышенной плотности в правой средней черепной ямке. На фиг.2E представлено изображение MRI после лечения, демонстрирующее практически полное устранение объемного образования повышенной плотности. На фиг.2F представлено аксиальное изображение PET-CT при рецидиве, демонстрирующее повторное появление опухоли в правой задней слуховой области, ассоциированное с интенсивным поглощением ¹⁸F-фтордезоксиглюкозы (стрелка). На фиг.2G представлено изображение PET-CT, демонстрирующее разрешение опухоли задней слуховой области после инцизионной биопсии и повторной экспансии CAR+ T-клеток.

[19] На фиг.3 представлен процент индивидуумов, у которых возникли лабораторные аномалии и возникшие во время лечения неблагоприятные явления (TEAE), которые возникли у ≥20% индивидуумов. *: Одно AE 5 степени, представляющее собой полиорганную недостаточность, не связанную с исследуемым лечением и являющееся результатом прогрессирования лимфомы; †: одно AE 5 степени, представляющее собой диффузное альвеолярное повреждение, оцененное исследователем как связанное с флударабином, циклофосфамидом и терапией CAR T-клетками, возникшее на 23 сутки у индивидуума, который отказался от искусственной вентиляции при прогрессирующей дыхательной недостаточности с нейтропенией, вызванной факторами роста и антибиотиками широкого действия и противогрибковыми средствами.

[20] На фиг.4 представлена кривая Каплана-Мейера, изображающая наблюдаемое время до начала CRS и нейротоксичности.

[21] На фиг. 5A и фиг. 5B представлены показатели ответа среди подгрупп индивидуумов, подвергнутых лечению.

[22] На фиг. 6A и фиг. 6B представлена длительность ответа (CR/PR, CR или PR) и общая выживаемость в полной и основной когортах индивидуумов.

[23] На фиг.7A представлена фармакокинетика CAR⁺ T-клеток в периферической крови в различные моменты времени после лечения дозами на различных уровнях.

[24] На фиг.7B представлена фармакокинетика CAR⁺ T-клеток в периферической крови в различные моменты времени после лечения между отвечающими и не отвечающими индивидуумами.

[25] На фиг.7C представлена фармакокинетика CAR⁺ T-клеток в периферической крови в различные моменты времени после лечения у индивидуумов, у которых развилась или не развилась какая-либо нейротоксичность.

[26] На фиг.8 представлены уровни анализируемых соединений, измеренные в сыворотке индивидуумов до введения CAR+ T-клеток и корреляция с развитием нейротоксичности.

[27] На фиг.9 представлен график, на который нанесено время без прогрессирования (месяцы) и на котором указан общий ответ и длительность ответа, и индивидуальные клинические исходы, наблюдаемые с течением времени у отдельных индивидуумов в полной группе и основной когортах индивидуумов с NHL, которых лечили клеточной терапией против CD19, включающей CAR-T-клетки, экспрессирующие CD4+ и CD8+. ^a: Пациенты достигали BOR через 1 месяц за исключением случаев, когда указано иное; ^b:Полное устранение вовлечения ЦНС в лимфому, наблюдаемое у 2 пациентов; ^c: у одного пациента произошла повторная экспансия после биопсии при прогрессировании заболевания.

Подробное описание

I. Модулирование модифицированных способами генной инженерии клеток в адоптивной клеточной терапии

[28] В рамках настоящего изобретения предусматриваются способы модулирования модифицированных способами генной инженерии клеток in vivo, такие как облегчение, усиление или увеличение экспансии, пролиферации и/или активации модифицированных способами генной инженерии клеток, вводимых индивидууму. В некоторых вариантах осуществления после введения модифицированных способами генной инженерии клеток, таких как клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор (например, CAR+ T-клетки) индивидууму, предусматриваемые способы вовлекают вмешательство, такое как манипулирование, в область у индивидуума, такую как ткань, орган, масса или область очага повреждения индивидуума, или ее регион или часть, в которой модифицированные способами инженерии клетки присутствуют или вероятно будут присутствовать, и/или проведение лечения, которое включает одно или несколько из физического или механического манипулирования над очагом повреждения или его частью, лучевую терапию или введение иммуномодулирующего средства. В некоторых вариантах осуществления известно или предполагается, что область (например, ткань, орган, масса или области очага повреждения индивидуума, или их регион или часть) содержит антигенэкспрессирующие клетки, распознаваемые модифицированными способами генной инженерии клетками. В частности, относительно других областей или регионов у индивидуума, область-мишень представляет собой область, о которой известно или предполагается, что она имеет более высокую или увеличенную концентрацию или количество антигена или количество антигенспецифических клеток относительно или по сравнению с другими областями у индивидуума.

[29] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство изменяет окружение области, например, изменяет окружение очага повреждения, например, микроокружение опухоли. В некоторых случаях изменение является таким, чтобы прямо или непрямо модулировать активность модифицированных способами инженерии T-клеток. В некоторых аспектах, изменение является достаточным для обеспечения реактивации, экспансии и/или пролиферации in vivo ранее введенных модифицированных способами генной инженерии клеток, таких как экспрессирующие рекомбинантный рецептор клетки (например, CAR+ T-клетки).

[30] Способы терапии на основе T-клеток, такие как адоптивная терапия T-клетками (включая терапию, вовлекающую введение клеток, экспрессирующих химерные рецепторы, специфичные к представляющему интерес заболеванию или нарушению, такие как химерные рецепторы антигенов (CAR) и/или другие рекомбинантные рецепторы антигенов, а также другие адоптивные способы терапия иммунными клетками и адоптивные способы терапии T-клетками) могут быть эффективными при лечении злокачественной опухоли и других заболеваний и нарушений. В определенных контекстах доступные подходы к адоптивной клеточной терапии не всегда могут быть полностью удовлетворительными. В некоторых контекстах оптимальная эффективность может зависеть от способности введенных клеток распознавать и связываться с мишенью, например, антигеном-мишенью, транспортироваться, локализоваться и успешно входить в соответствующие области у индивидуума, опухоли и их окружение. В некоторых контекстах оптимальная эффективность может зависеть от способности введенных клеток к активации, экспансии, для проявления различных эффекторных функций, включая цитотоксическое уничтожение и секрецию различных факторов, таких как цитокинов, персистировать, в том числе длительно, дифференцироваться, переходить или вовлекаться в перепрограммирование в определенные фенотипические состояния (такие как длительная память, менее дифференцированное состояние и эффекторное состояние), чтобы избежать или снизить иммунодепрессивные состояния в локальном микроокружении заболевания, для обеспечения эффективных и стойких вторичных ответов после устранения и повторного воздействия лиганда-мишени или антигена-мишени, и избегания или уменьшения истощения, анергии, периферической толерантности, терминальной дифференцировки и/или дифференцировки в супрессивное состояние.

[31] В некоторых аспектах эффективность иммунотерапии, например, T-клеточной терапии, может ограничиваться иммуносупрессивной активностью или факторами, присутствующими в локальном микроокружении заболевания или нарушения, например, TME. В некоторых аспектах TME содержит или продуцирует факторы или условия, которые могут подавлять активность, функцию, пролиферацию, выживаемость и/или персистенцию T-клеток, введенных для T-клеточной терапии.

[32] В некоторых вариантах осуществления экспозиция и персистенция модифицированных способами инженерии клеток снижается или уменьшается после введения индивидууму. Тем не менее, наблюдения указывают на то, что в некоторых случаях увеличенная экспозиция у индивидуума введенных клеток, экспрессирующих рекомбинантные рецепторы (например, увеличенное количество клеток или длительность с течением времени) может увеличить эффективность и улучшить терапевтические исходы адоптивной клеточной терапии. Предварительный анализ, проведенный после введения различных нацеленных на CD19 экспрессирующих CAR T-клеток индивидуумам с различными экспрессирующими CD19 злокачественными опухолями во множестве клинических испытаний продемонстрировал корреляцию между большей и/или более длительной экспозицией CAR-экспрессирующих клеток и исходами лечения. Такие исходы включали выживаемость и ремиссию пациента, даже у индивидуумов с тяжелой или значительной опухолевой нагрузкой. В некоторых аспектах профиль безопасности, наблюдаемый с помощью предусматриваемых способов, может уменьшить риск нежелательных проблем безопасности, связанных с комбинированной терапией, вовлекающей композицию терапевтических T-клеток, описанную в настоящем описании, и другую терапию для лечения заболевания или состояния, например, иммуномодулирующее средство, такой как антагонист точки контроля.

[33] В рамках настоящего изобретения было обнаружено, что вмешательство в очаг повреждения и/или обеспечение лечения, которое включает одно или несколько из физического или механического манипулирования над очагом повреждения или его частью, лучевой терапии или введения иммуномодулирующего средства у индивидуума, которому вводят модифицированные способами инженерии T-клетки, может приводить к значительной экспансии клеток у индивидуума даже после рецидива у индивидуума. В рамках настоящего изобретения предусматриваются способы вмешательства, такие как манипулирование, в область у индивидуума, в которой клетки присутствуют или вероятно будут присутствовать, и/или обеспечение лечения, которое включает одно или несколько из физического или механического манипулирования над очагом повреждения или его частью, лучевой терапии или введения иммуномодулирующего средства. В некоторых вариантах осуществления область представляет собой очаг повреждения, такой как опухоль или злокачественная опухоль. В некоторых вариантах осуществления вмешательство и/или лечение можно проводить посредством механического или физического изменения в очаге повреждения или вблизи очага повреждения, например, в опухоли или вблизи опухоли, или в микроокружении или вблизи микроокружения, которое ассоциировано с очагом повреждения, например, микроокружения опухоли (TME). В некоторых вариантах осуществления вмешательство и/или лечение может быть осуществлено посредством введения введение фармакологического средства или терапевтического средства, такого как иммуномодулирующее средство или другое средство, способное модулировать активность T-клеток, или клетки или клеток, ассоциированных с очагом повреждения или микроокружением очага повреждения. В некоторых случаях фармакологическое средство представляет собой терапевтическое средство, нацеленное на область очага повреждения или специфически связывающееся с клеткой очага повреждения, например, с клеткой микроокружения опухоли. В некоторых вариантах осуществления вмешательство и/или лечение, такое как механическое вмешательство или введение фармакологического средства, такого как иммуномодулирующее средство, проводят более чем или приблизительно более чем через одну неделю, два месяца, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, 1 год, 2 года или более после начала введения T-клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, например CAR+ T-клеток.

[34] В некоторых вариантах осуществления в момент времени или непосредственно перед моментом времени вмешательства и/или лечения, такого как введение фармакологического средства или терапевтического средства, у индивидуума возник рецидив после ремиссии после лечения.

A. Очаги повреждения

[35] В аспектах предусматриваемых способов область у индивидуума, в которой модифицированные способами инженерии клетки присутствуют, или вероятно будут присутствовать, или присутствовали, или вероятно присутствовали представляет собой очаг повреждения или часть очага повреждения. В некоторых аспектах очаг повреждения представляет собой очаг повреждения, о котором известно или предполагается, что он содержит экспрессирующие антиген клетки, распознаваемые клетками, экспрессирующими рекомбинантный рецептор. Предусматриваемые способы проводят для вмешательства в очаг повреждения и/или для лечения индивидуума для модулирования модифицированных способами инженерии клеток in vivo.

[36] В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения включает любой область органа или ткани, которая повреждена в результате травмы или заболевания. В определенных вариантах осуществления очаг повреждения представляет собой любую область органа или ткани, которая претерпела и/или претерпевает аномальное изменение структуры вследствие травмы или заболевания. В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения является ограниченным и четко определенным. В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения является не злокачественным. В конкретных вариантах осуществления очаг повреждения является неопухолевым. В определенных вариантах осуществления очаг повреждения является злокачественным или предположительно является злокачественным. В конкретных вариантах осуществления очаг повреждения представляет собой опухоль.

[37] В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения представляет собой очаг повреждения, находящийся в органе или ткани. В определенных вариантах осуществления очаг повреждение находится в соединительной ткани, мышечной ткани, нервной ткани или эпителиальной ткани. В определенных вариантах осуществления очаг повреждение находится в сердце, сосудах, слюнных железах, пищеводе, желудке, печени, желчном пузыре, поджелудочной железе, кишечнике, тостом кишечнике, прямой кишке, гипоталамусе, гипофизе, эпифизе, щитовидной железе, паращитовидной железе, надпочечнике, почке, мочеточнике, мочевом пузыре, мочеиспускательном канале, лимфатической системе, коже, мышей, головном мозге, спинном мозге, нервах, яичниках, матке, семенниках, предстательной железе, глотке, гортани, трахее, бронхах, легких, диафрагме, кости, хряще, связках или сухожилиях.

[38] В определенных вариантах осуществления очаг повреждения выбран из: очага повреждения в мягкой ткани, например, очага повреждения, повреждения Мореля-Лавалле, повреждения Банкарта, повреждения Пертеса, повреждения Стенера или повреждения SLAP; очага повреждения кости, например, неоссифицирующей фибромы, очага повреждения ALPSA или очага повреждения Хилла-Сакса; очага повреждения кожи, например, меланоцитарного невуса, сегментарного очага повреждения, или узелка Ослера; бленноррагической кератодермии, папулезного дерматоза чернокожих, лейкемида, очага повреждения Джейнвея, саркомы Капоши, меланодермии или хронического рубцового кератоза; желудочно-кишечного очага повреждения, например, очага повреждения Дьелафуа или очага повреждения Кэмерона; эндодермлаьного очага повреждения, например, меланоцитарного очага повреждения полости рта, эндодермальной внутриэпителиальной неоплазии; другого очага повреждения, такого как очаг Гона, доброкачественный лимфоэпителиальный очаг, очаг рассеянного склероза, тропическая язва или герпетический панариций.

[39] В определенных вариантах осуществления очаг повреждения представляет собой опухоль или новообразование. В определенных вариантах осуществления опухоль является доброкачественной. В конкретных вариантах осуществления опухоль является предзлокачественной или злокачественной или предположительно является злокачественной или предзлокачественной. В определенных вариантах осуществления опухоль представляет собой первичную опухоль, т.е. опухоль находится в анатомической области, в которой очаг первоначально развился или появился. В некоторых вариантах осуществления опухоль представляет собой вторичную опухоль, например, злокачественную опухоль, происходящую из клетки в первичной опухоли, расположенной в другой области организма.

[40] В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения ассоциирован с или вызван, или предположительно ассоциирован с или вызван злокачественной опухолью или пролиферативным заболеванием, которое представляет собой B-клеточную злокачественную опухоль или гематологическую злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль или пролиферативное заболевание представляет собой лимфобластный лейкоз (ALL), неходжскинскую лимфому (NHL) или хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL). В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой CLL. В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения ассоциирован с или вызван, или предположительно ассоциирован с или вызван миеломой, лимфомой или лейкозом. В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения ассоциирован с или вызван, или предположительно ассоциирован с или вызван неходжкинской лимфомой (NHL), острым лимфобластным лейкозом (ALL), хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL), диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой (DLBCL), острым миелоидным лейкозом (AML) или миеломой, например, множественной миеломой (MM). В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения ассоциирован с или вызван, или предположительно ассоциирован с или вызван MM или DBCBL.

[41] В конкретных вариантах осуществления очаг повреждения ассоциирован с или вызван, или предположительно ассоциирован с или вызван не гематологической злокачественной опухолью, например, очаг повреждения представляет собой солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения ассоциирован с или вызван, или предположительно ассоциирован с или вызван раком мочевого пузыря, легкого, головного мозга, меланомой (например, мелкоклеточной рак легкого, меланома), молочной железы, шейки матки, яичника, ободочной и прямой кишки, поджелудочной железы, эндометрия, пищевода, почки, печени, предстательной железы, кожи, щитовидной железы тела матки. В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения ассоциирован с или вызван раком поджелудочной железы, раком мочевого пузыря, раком ободочной и прямой кишки, раком молочной железы, раком предстательной железы, раком почки, печеночноклеточным раком, раком легкого, раком яичника, раком шейки матки, раком поджелудочной железы, раком прямой кишки, раком щитовидной железы, раком тела матки, раком желудка, раком пищевода, раком головы и шеи, меланомой, нейроэндокринными злокачественными опухолями, злокачественными опухолями ЦНС, опухолями головного мозга, раком кости или саркомой мягких тканей.

[42] В конкретных вариантах осуществления очаг повреждения представляет собой опухоль, которая содержит или предположительно содержит по меньшей мере одну злокачественную клетку. В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения представляет собой опухоль, которая содержит или предположительно содержит злокачественную клетку, происходящую из связанной со СПИД злокачественной опухоли, рака молочной железы, злокачественной опухоли пищеварительного/желудочно-кишечного тракта, рака анального канала, рака аппендикса, рака желчных протоков, рака толстого кишечника, рака ободочной и прямой кишки, рака пищевода, рака желчного пузыря, опухоли из островковых клеток, нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака прямой кишки, рака тонкого кишечника, рака желудка (гастрального), рака эндокринной системы, карциномы надпочечников, рака паращитовидной железы, феохромацитомы, опухоли гипофиза, рака щитовидной железы, злокачественной опухоли глаза, внутриглазной меланомы, ретинобластомы, рака мочевого пузыря, рака почки (почечно-клеточный), рака полового члена, рака предстательной железы, переходно-клеточного рака почечной лоханки и мочеточника, рака яичка, рака мочеиспускательного канала, опухоли Вильмса или другой опухоли почки детского возраста, герминомы, злокачественной опухоли центральной нервной системы, внечерепной герминомы, внегонадной герминомы, герминомы яичника, гинекологической злокачественной опухоли, рака шейки матки, рака эндометрия, гестационной трофобластической опухоли, эпителиальной злокачетсвенной опухоли яичника, саркомы матки, рака влагалища, рака вульвы, рака головы и шеи, гипофарингеального рака, рака гортани, рака губы и полости рта, метастазирующего плоскоклеточного рака шеи, рака носоглотки, рака ротоглотки, рака околоносовых пазух и носовой полости, фарингеального рака, рака слюнных желез, рака горла, скелетно-мышечного рака, рака кости, саркомы Юинга, желудочно-кишечных стромальных опухолей (GIST), остеосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы кости, рабдомиосаркомы, саркомы мягких тканей, саркому матки, неврологической злокачественной опухоли, опухоли головного мозга, астроцитомы, глиомы ствола головного мозга, атипичной тератоидной/рабдоидной опухоли центральной нервной системы, эмбриональных опухолей центральной нервной системы, герминомы центральной нервной системы, краниофарингиомы, эпендимомы, медуллобластомы, опухоли спинного мозга, супратенториальных примитивных нейроэктодермальных опухолей и пинеобластомы, нейробластомы, рака дыхательных путей, торакального рака, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, злокачественной мезотелиомы, тимомы, тимической карциномы, рака кожи, саркомы Капоши, меланомы или карциномы из клеток Меркеля.

B. Лечение и/или вмешательство в очаг повреждения

[43] В рамках настоящего изобретения предусматриваются способы обеспечения лечения и/или вмешательства в очаг повреждения, например опухоль, для модулирования модифицированных способами генной инженерии клеток in vivo, например, облегчения, усиления или увеличения экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток, вводимых индивидууму. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство включает механическое вмешательство, например, биопсию, лечение и/или вмешательство посредством облучения, например, облучения внешним пучком, и/или фармакологического вмешательства, например, лечения иммуномодулирующим средством.

[44] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждение представляет собой любое манипулирование, процедуру или лечение, которые изменяют модифицированные способами инженерии T-клетки, такие как экспрессирующие рекомбинантный рецептор T-клетки, например CAR+ T-клетки, прямо или непрямо, например, путем изменения микроокружения, ассоциированного с очагом повреждения. В некоторых вариантах осуществления манипулирование, процедура или лечения представляют собой механическое вмешательство, например, биопсию. В конкретных вариантах осуществления манипулирование, процедура или лечение представляют собой введение фармакологического средства индивидууму с очагом повреждения. В конкретных вариантах осуществления манипулирование, процедура или лечение представляют собой применение радиационного излучения к очагу повреждения. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство, по меньшей мере первоначально или немедленно уменьшает количество клеток в очаге повреждения.

[45] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения включает вмешательство в область у индивидуума, в которой модифицированные способами инженерии клетки, например, клетки, экспрессирующие CAR, присутствуют или вероятно будут присутствовать. В некоторых вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения включает вмешательство в области, где модифицированные способами инженерии клетки присутствовали когда-либо, или в области, где модифицированные способами генной инженерии клетки вероятно присутствовали.

[46] В конкретных вариантах осуществления очаг повреждения подвергают лечению и/или вмешательству для модулирования модифицированных способами генной инженерии клеток in vivo, где лечение и/или вмешательство представляет собой или приводит к изменению очага повреждения или микроокружения, которое ассоциировано с очагом повреждения, например, с микроокружением опухоли (TME). В некоторых вариантах осуществления изменение может включать модификацию, изменение, перестановку или преобразование по меньшей мере одного компонента микроокружения. В определенных вариантах осуществления изменение относится к модификации, изменению, перестановке или преобразованию очага повреждения или микроокружения по сравнению с очагом повреждения или микроокружением до проведения лечения и/или вмешательства. В конкретных вариантах осуществления изменение относится к модификации, изменению, перестановке или преобразованию очага повреждения или микроокружения по сравнению со сходным очагом повреждения, например, очагом повреждения того же типа, например, типа опухоли, или микроокружением того же типа опухоли, в случае которых не проводили лечение и/или вмешательство. В определенных вариантах осуществления сходный очаг повреждения находится у другого индивидуума. В конкретных вариантах осуществления сходный очаг повреждения находится у того же индивидуума, что и очаг повреждения, подвергнутый лечению и/или вмешательству.

[47] В некоторых вариантах осуществления компоненты микроокружения включают клетки, находящиеся в пределах или окружающие очаг повреждения, например, злокачественные клетки, незлокачественные клетки и молекулы, например, сигнальные молекулы, которые секретируются, высвобождаются и/или экспрессируются клетками в микроокружении. Не относящиеся к очагу повреждения клетки могут включать клетки, которые не являются клетками очага повреждения, а находятся на периферии или в очаге повреждения. Не относящиеся к очагу повреждения клетки могут включать, но не ограничиваться ими, иммунные клетки, фибробласты, адипоциты, сосудисто-эндотелиальные клетки, перициты и лимфатические эндотелиальные клетки. Сигнальные молекулы могут включать, но не ограничиваться ими, цитокины, хемокины, факторы роста и воспалительные и ремоделирующие матрикс ферменты.

[48] В конкретных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство представляет собой манипуляцию, процедуру или лечение, которые уменьшают, по меньшей мере первоначально или в течение периода времени, количество клеток или количество клеток по меньшей мере одного типа, в микроокружении очага повреждения. В определенных вариантах осуществления очаг повреждения представляет собой опухоль и манипулирование, процедура или лечение снижают количество опухолевых клеток в очаге повреждения. В конкретных вариантах осуществления очаг повреждение является злокачественным и манипулирование, процедура или лечение уменьшает количество злокачественных клеток в очаге повреждения. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство представляет собой манипулирование, процедуру или лечение, которые уменьшают количество не относящихся к очагу повреждения клеток, которые находятся в микроокружении очага повреждения. Не относящиеся к очагу повреждения клетки, находящиеся в микроокружении очага повреждения, включают, но не ограничиваются ими, иммунные клетки, фибробласты, адипоциты и сосудисто-эндотелиальные клетки, перициты и/или лимфатические эндотелиальные клетки, которые находится в микроокружении. В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство представляет собой манипулирование, процедуру или лечение, которые приводят к увеличению количества иммунных клеток, фибробластов, адипоцитов и сосудисто-эндотелиальных клеток, перицитов и/или лимфатических эндотелиальных клеток в микроокружении опухоли.

[49] В конкретных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство представляет собой манипулирование, процедуру или лечение, которые удаляют или уничтожают клетки очага повреждения, по меньшей мере первоначально или на некоторый период времени. В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения представляет собой опухоль и манипулирование, процедура или лечение уничтожает или устраняет клетки из очага повреждения, по меньшей мере первоначально или на некоторый период времени. В конкретных вариантах осуществления очаг повреждения является злокачественным и манипулирование, процедура или лечение уничтожает или устраняет клетки из очага повреждения. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство уничтожает или устраняет по меньшей мере приблизительно 0,001%, по меньшей мере приблизительно 0,01%, по меньшей мере приблизительно 0,1%, по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99%, или по меньшей мере приблизительно 99,9% клеток в очаге повреждения.

[50] В конкретных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство представляет собой манипулирование, процедуру или лечение, которые приводят к изменению количества одного или нескольких типов иммунных клеток в микроокружении очага повреждения. Типы иммунных клеток, которые находятся в микроокружении, могут включать, но не ограничиваться ими, T-лимфоциты, B-лимфоциты, натуральные киллеры (NK-клетки), натуральные киллерные T-клетки (NKT-клетки), макрофаги, например, ассоциированные с опухолью макрофаги, миелоидные супрессорные клетки (MDSC), дендритные клетки и нейтрофилы, например, ассоциированные с опухолью нейтрофилы (TAN). В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство представляет собой манипулирование, процедуру или лечение, которые увеличивают количество CD8⁺ клеток, цитотоксических CD8⁺ T-клеток памяти (CD8⁺CD45RO⁺), CD4⁺ T-хелперов 1 (T_H1), CD4⁺ T-хелперов 2 (T_H2), натуральных киллеров (NK), натуральных киллерных T-клеток (NKT) и/или γδ T-лимфоцитов в микроокружении очага повреждения. В конкретных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство представляет собой манипулирование, процедуру или лечение, которые уменьшают количество TH2-клеток, CD4⁺ T-хелперов 17 (T_H17), иммуносупрессивных регуляторных T-клеток (Treg), регуляторных B-клеток (Breg), клеток B10 и/или ассоциированных с опухолью макрофагов (TAM) в микроокружении очага повреждения.

[51] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство представляет собой манипуляцию, процедуру или вмешательство, которые увеличивают количество одной или нескольких сигнальных молекул, которые присутствуют в очаге повреждения и/или микроокружении очага повреждения. В некоторых вариантах осуществления сигнальные молекулы могут включать, но не ограничиваться ими, цитокины, хемокины, факторы роста и воспалительные и ремоделирующие матрикс ферменты. В определенных вариантах осуществления манипулирование, процедура или лечение увеличивают количество интерлейкина-2 (IL-2), интерлейкина-17A (IL-17A), интерлейкина-17F (IL-17F), интерлейкина-21 (IL-21), интерлейкина-22 (IL-22), и/или интерферона гамма (IFN-γ). В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство представляет собой манипуляцию, процедуру или лечение, которые увеличивают количество сигнальной молекулы, которая присутствует в очаге повреждения и/или в микроокружении очага повреждения по меньшей мере приблизительно на 1%, по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно в 1 раз, по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, по меньшей мере приблизительно в 2 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,5 раза, по меньшей мере приблизительно в 3 раза, по меньшей мере приблизительно в 4 раза, по меньшей мере приблизительно в 5 раз, по меньшей мере приблизительно в 6 раз, по меньшей мере приблизительно в 7 раз, по меньшей мере приблизительно в 8 раз, по меньшей мере приблизительно в 9 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 20 раз, по меньшей мере приблизительно в 30 раз, по меньшей мере приблизительно в 40 раз, по меньшей мере приблизительно в 50 раз, по меньшей мере приблизительно в 100 раз, по меньшей мере приблизительно в 200 раз, по меньшей мере приблизительно в 500 раз, или по меньшей мере приблизительно в 1000 раз.

[52] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство представляет собой манипулирование, процедуру или лечение, которые увеличивают количество одной или нескольких сигнальных молекул, которые присутствуют в очаге повреждения и/или микроокружении очага повреждения. В определенных вариантах осуществления манипулирование, процедура или лечение снижают количество интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-5 (IL-5), интерлейкина-10 (IL-10), интерлейкина-13 (IL-13), интерлейкина-17A (IL-17A), интерлейкина-17F (IL-17F), интерлейкина-21 (IL-21), интерлейкина-22 (IL-22), трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF), эндотелина-1, эндотелина-2, эндотелина-3, эндотелиального активирующего моноциты полипептида II (EMAP2, также известный как AIMP1), фактора роста гепатоцитов (HGF), фибробластного фактора роста (FGF), инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1), инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2), TGF-β, хемокина с C-X-C мотивом 12 (CXCL12), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), матриксной металлопротеиназы (MMP) и/или катепсинов, например, катепсина L. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство представляет собой манипуляцию, процедуру или лечение, которые уменьшают количество сигнальной молекулы в очаге повреждения и/или в микроокружении очага повреждения по меньшей мере приблизительно на 1%, по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 98%, по меньшей мере приблизительно на 99%, по меньшей мере приблизительно на 99,9% или приблизительно на 100%.

1. Механическое вмешательство

[53] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство вовлекает физическое или механическое манипулирование над областью, такой как очаг повреждения, например, путем исследования с помощью зонда, прокалывания и/или проникновения в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство проводят посредством биопсии области, такой как биопсия очага повреждения (например, опухоли). В некоторых вариантах осуществления биопсию проводят с помощью иглы. В некоторых вариантах осуществления биопсия представляет собой инцизионную биопсию.

[54] В некоторых вариантах осуществления проводят физическое или механическое вмешательство в очаг повреждения с помощью процедуры биопсии для модулирования модифицированных способами генной инженерии клеток in vivo, например, для облегчения, усиления или увеличения экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток, введенных индивидууму. В некоторых вариантах осуществления процедура биопсии представляет собой тонкоигольную аспирацию, в которой используют длинную тонкую иглу, которую можно вводить в очаг повреждения, и шприц для отбора клеток и/или жидкости из очага повреждения. В конкретных вариантах осуществления биопсия представляет собой толстоигольную биопсию, в которой более крупную иглу с режущим наконечником используют для извлечения столбика ткани из очага повреждения. В конкретных вариантах осуществления биопсия представляет собой вакуумную биопсию, в которой используют всасывающее устройство для увеличения количества жидкости и/или клеток, которые извлекают через иглу. В определенных вариантах осуществления биопсия представляет собой биопсию под контролем изображения, в которой очаг визуализируют с помощью способов визуализации, включая, но не ограничиваясь ими, рентген, ультразвук, CT-сканирование или MRI-сканирование, для облегчения визуализации медицинским специалистом, например, врачом, очага повреждения и направления устройства для проведения биопсии, например иглы, в опухоль.

[55] В конкретных вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят с помощью одного или нескольких устройств для проведения биопсии (например, иглы) для модулирования модифицированных способами генной инженерии клеток in vitro. В некоторых вариантах осуществления устройство для проведения биопсии представляет собой иглу для коровой биопсии. В определенных вариантах осуществления устройство для биопсии представляет собой иглу, которую можно использовать для тонкоигольной аспирации. В определенных вариантах осуществления устройство для биопсии представляет собой троакар.

[56] В конкретных вариантах осуществления устройство для биопсии представляет собой иглу для коровой биопсии. В некоторых вариантах осуществления игла для коровой биопсии имеет калибр 10, калибр 11, калибр 12, калибр 13, калибр 14, калибр 15, калибр 16, калибр 17, калибр 18, калибр 19, калибр 20, калибр 21, калибр 22, калибр 23, калибр 24, калибр 25 или калибр 26. В определенных вариантах осуществления игла для коровой биопсии имеет калибр между 10 и 30, между 10 и 24, или между 14 и 20. В определенных вариантах осуществления игла имеет длину приблизительно 10 см, приблизительно 11 см, приблизительно 12 см, приблизительно 13 см, приблизительно 14 см, приблизительно 15 см, приблизительно 16 см, приблизительно 17 см, приблизительно 18 см, приблизительно 19 см, приблизительно 20 см, приблизительно 21 см, приблизительно 22 см, приблизительно 23 см, приблизительно 24 см, приблизительно 25 см, приблизительно 26 см, приблизительно 27 см, приблизительно 28 см, приблизительно 29 см, приблизительно 30 см, приблизительно 31 см или приблизительно 32 см. В некоторых вариантах осуществления игла для коровой биопсии имеет длину от приблизительно 5 см до приблизительно 30 см, от приблизительно 10 см до приблизительно 25 см, или от приблизительно 10 см до приблизительно 20 см. В определенных вариантах осуществления игла для коровой биопсии имеет калибра между 14 и 20 и имеет длину приблизительно от 10 см до 20 см. В конкретных вариантах осуществления игла для коровой биопсии является одноразовой. В определенных вариантах осуществления игла для коровой биопсии является многоразовой.

[57] В некоторых вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят посредством тонкоигольной аспирации. В конкретных вариантах осуществления игла представляет собой тонкую иглу. В некоторых вариантах осуществления игла, которую можно использовать для тонкоигольной аспирации, имеет калибр 20, калибр 21, калибр 22, калибр 23, калибр 24, калибр 25, калибр 26, калибр 27, калибр 28, калибр 29, калибр 30, калибр 31 или калибр 32. В определенных вариантах осуществления игла имеет калибр между 20 и 30, между 22 и 28, между 20 и 26, или между приблизительно 24 и приблизительно 28. В определенных вариантах осуществления иглу можно использовать для тонкоигольной аспирации и она имеет длину приблизительно 1 см, приблизительно 2 см, приблизительно 3 см, приблизительно 4 см, приблизительно 5 см, приблизительно 6 см, приблизительно 7 см, приблизительно 8 см, приблизительно 9 см, приблизительно 10 см, приблизительно 12 см, приблизительно 14 см, приблизительно 16 см, приблизительно 18 см или приблизительно 20 см. В некоторых вариантах осуществления иглу можно использовать для тонкоигольной аспирации, и она имеет размер от приблизительно 1 см до приблизительно 10 см, от приблизительно 5 см до приблизительно 10 см или от приблизительно 1 см до приблизительно 5 см. В определенных вариантах осуществления иглу можно использовать для тонкоигольной аспирации, и она имеет калибр между 22 и 28 и длину от 1 см до 10 см.

[58] В некоторых вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят с использованием троакара или с помощью троакара для модулирования модифицированных способами генной инженерии клеток in vivo. Троакары часто используют для лапароскопических хирургических способов, например, для получения или обеспечения доступа в полость тела, например, брюшную полость. Общепринятый троакар может включать, например, обтуратор, острый троакар, канюлю и защитную перегородку для защиты органов после проникновения троакара в брюшную полость. Защитная перегородка обычно конструируется в качестве механического устройство, которое является пружинным и активируется, когда наконечник троакара вставляют в канюлю. Наконечник троакара защищен защитной перегородкой. Троакар проходит через слои стенки брюшной полости, защитную перегородку оттягивается, обнажая острый наконечник троакара. Когда устройство, наконец, проходит через последний слой ткани брюшной полости и непосредственно перед вхождением в открытое пространство брюшной полости, защитная перегородка двигается вперед, чтобы вновь закрыть наконечник троакара.

[59] Примеры троакаров включают троакары с лезвиями, которые включают наконечник с лезвием, и тупые троакары. Тип наконечника троакара с лезвием, который используют наиболее часто, имеет трехстороннюю пирамидальную конструкцию, которая облегчает вхождение в ткань посредством трех острых краев, которые могут разрезать ткань, например, ткань стенки брюшной полости. Троакары с лезвиями также включают троакары с гибридными наконечниками. Гибридные наконечники имеют направляющие линейные лезвия меньшего размера для внесения разрезов, которые затем расширяются тупым компонентом троакара. Тупые троакары сконструированы для вхождения в полость без наконечника с лезвием. Тупые троакары включают радиально расширяющиеся троакары, которые сконструированы для вхождения в ткань после внесения небольшого разреза с помощью другого инструмента, например, скальпеля. В некоторых вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят посредством или с помощью троакара с лезвием. В определенных вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят с помощью или посредством тупого троакара.

[60] В некоторых вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят с помощью троакара, который имеет диаметр по меньшей мере или приблизительно 1 мм, приблизительно 2 мм, приблизительно 3 мм, приблизительно 4 мм, приблизительно 5 мм, приблизительно 6 мм, приблизительно 7 мм, приблизительно 8 мм, приблизительно 9 мм, приблизительно 10 мм, приблизительно 11 мм, приблизительно 12 мм, приблизительно 13 мм, приблизительно 14 мм, приблизительно 15 мм, приблизительно 16 мм, приблизительно 17 мм, приблизительно 18 мм, приблизительно 19 мм, или приблизительно 20 мм. В определенных вариантах осуществления троакар имеет диаметр от приблизительно 1 мм до приблизительно 20 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 15 мм, от приблизительно 5 мм до приблизительно 15 мм, от приблизительно 10 мм до приблизительно 15 мм, или от приблизительно 5 мм до приблизительно 12 мм. В определенных вариантах осуществления троакар имеет диаметр от приблизительно 5 мм до приблизительно 12 мм.

[61] В определенных вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят посредством пункционной биопсии для модулирования модифицированных способом инженерии клеток in vivo. В некоторых вариантах осуществления пункционную биопсию проводят с помощью дискообразного лезвия, которое может вращаться вниз ткани для сбора цилиндрического столбчатого образца ткани, например, образца кожи. В определенных вариантах осуществления игла для пункционной терапии имеет диаметр по меньшей мере или приблизительно 0,1 мм, приблизительно 0,5 мм, приблизительно 1 мм, приблизительно 2 мм, приблизительно 3 мм, приблизительно 4 мм, приблизительно 5 мм, приблизительно 6 мм, приблизительно 7 мм, приблизительно 8 мм, приблизительно 9 мм, приблизительно 10 мм, приблизительно 11 мм, приблизительно 12 мм, приблизительно 13 мм, приблизительно 14 мм, приблизительно 15 мм, приблизительно 16 мм, приблизительно 17 мм, приблизительно 18 мм, приблизительно 19 мм, или приблизительно 20 мм. В определенных вариантах осуществления игла для пункционной терапии имеет диаметр от приблизительно 1 мм до приблизительно 8 мм.

[62] В некоторых вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят посредством эксцизионной биопсии. В определенных вариантах осуществления эксцизионная биопсия включает удаление всего или большей части очага повреждения. В конкретных вариантах осуществления эксцизионная биопсия включает удаление по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99%, по меньшей мере приблизительно 99,5%, по меньшей мере приблизительно 99,9%, или приблизительно 100% очага повреждения.

[63] В конкретных вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят с помощью инцизионной биопсии. В определенных вариантах осуществления инцизионная биопсия включает извлечение по меньшей мере части очага повреждения. В определенных вариантах осуществления инцизионная биопсия включает извлечение по меньшей мере приблизительно 0,01%, по меньшей мере приблизительно 0,1%, по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, или по меньшей мере приблизительно 95% очага повреждения. В конкретных вариантах осуществления инцизионная биопсия включает извлечение менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 5%, менее чем приблизительно 1%, менее чем приблизительно 0,5% или менее чем приблизительно 0,1% очага повреждения.

[64] В некоторых вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят путем прокалывания, пронизывания, разрезания, разрывания, рассечения, открытия, прорезания, сбривания и/или срезания очага повреждения с помощью хирургического инструмента, например, троакара, ножа или иглы. В конкретных вариантах осуществления прокалывание, пронизывание, разрезание, разрывание, рассечение, открытие, прорезание, сбривание и/или срезание очага повреждения приводит к травмированию очага повреждения. Например, в некоторых вариантах осуществления повреждение включает укол, прокол, срез, прорез или разрыв. В некоторых вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения приводит к травмированию очага повреждения, которое включает укол, прокол, срез, прорез или разрыв, размер которого составляет менее чем или приблизительно 0,001 мм, приблизительно 0,01 мм, приблизительно 0,1 мм, приблизительно 0,2 мм, приблизительно 0,3 мм, приблизительно 0,4 мм, приблизительно 0,5 мм, приблизительно 0,6 мм, приблизительно 0,7 мм, приблизительно 0,8 мм, приблизительно 0,9 мм, приблизительно 1 мм, приблизительно 1,1 мм, приблизительно 1,2 мм, приблизительно 1,3 мм, приблизительно 1,4 мм, приблизительно 1,5 мм, приблизительно 1,6 мм, приблизительно 1,7 мм, приблизительно 1,8 мм, приблизительно 1,9 мм, приблизительно 2 мм, приблизительно 2,5 мм, приблизительно 3 мм, приблизительно 4 мм, приблизительно 5 мм, приблизительно 6 мм, приблизительно 7 мм, приблизительно 8 мм, приблизительно 9 мм, приблизительно 1 см, приблизительно 2 см, приблизительно 3 см, приблизительно 4 см, приблизительно 5 см, приблизительно 6 см, приблизительно 7 см, приблизительно 8 см, приблизительно 9 см или приблизительно 10 см. В некоторых вариантах осуществления укол, прокол, срез, прорез или разрыв превышает или равен приблизительно 10 см. В определенных вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят путем прокалывания, пронизывания, разрезания, разрывания, рассечения, открытия, прорезания, сбривания и/или срезания очага повреждения с помощью хирургического инструмента, что приводит к уколу, проколу, срезу, прорезу или разрыву очага повреждения, которые составляют от приблизительно 0,001 мм до приблизительно 0,1 мм, от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 1 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 1 см, или от приблизительно 1 см до приблизительно 10 см.

[65] В некоторых вариантах осуществления механическое вмешательство проводят путем изменения температуры очага повреждения, например, посредством термотерапии. В конкретных вариантах осуществления механическое вмешательство проводят с помощью криоаблации. В определенных вариантах осуществления механическое вмешательство представляет собой гипертермическую терапию.

[66] В определенных вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждение осуществляют с помощью криоаблации. Криоаблация вовлекает замораживание неопластической массы, которое приводит к отложению внутриклеточных и внеклеточных кристаллов льда; разрушению клеточных мембран, белков и органелл; и индукции гиперосмотической среды, тем самым вызывая гибель клеток. Способы и устройства, пригодные для криоаблации, описаны в Murphy et al, Sent. Urol. Oncol. 79:133-140 (2001) и патентах США № 6383181, 6383180, 5993444, 5654279, 5437673 и 5147355.

[67] В конкретных вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения проводят с помощью гипертермической терапии. Гипертермическая терапия обычно вовлекает повышение температуры неопластической массы до диапазона от приблизительно 42°C до приблизительно 44°C. Температура очага повреждения может быть дополнительно повышена выше этого диапазона; однако такие температуры могут увеличивать повреждение окружающей здоровой ткани, не вызывая увеличенной клеточной смерти в очаге повреждения, подвергаемом лечению. Опухоль можно нагревать в гипертермической терапии любыми способами, известными специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления очаг повреждения можно нагревать посредством микроволнового излучения, высокоинтенсивного фокусированного ультразвукового излучения, ферромагнитных термозатравок, локализованных полей тока, инфракрасного излучения, влажной или сухой радиочастотной албации, лазерной фотокоагуляции, лазерной интерстициальной термической терапии и электрокаустики. Микроволны и радиоволны можно генерировать посредством волноводных аппликаторов, роговидного, спирального аппликаторов, аппликаторов с токовым слоем и компактных аппликаторов.

[68] Другие способы, устройства и композиции для повышения температуры очага повреждения, например, опухоли, рассмотрены в Wust et al, Lancet Oncol. 3:487-97 (2002), и описаны в патентах США № 6470217, 6379347, 6165440, 6163726, 6099554, 6009351, 5776175, 5707401, 5658234, 5620479, 5549639 и 5523058.

2. Лечение и/или вмешательство посредством облучения

[69] В определенных вариантах осуществления очаг повреждения подвергают лечению и/или вмешательству посредством облучения или лучевой терапии, для модулирования модифицированных способами генной инженерии клеток in vivo. В определенных вариантах осуществления в лучевой терапии используется высокоэнергетическая радиация для уменьшения размера очага повреждения, например, опухоли, и она уничтожает клетки в очаге повреждения, например, злокачественные клетки. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят с помощью ионизирующей радиации, т.е. радиации, включающей частицы или фотоны, имеющие достаточную энергию, и она может обеспечивать достаточную энергию посредством ядерных взаимодействия для обеспечения ионизации (приобретения или потери электронов). В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждение осуществляют путем воздействия на очаг повреждения рентгеновских лучей, гамма-лучей, заряженных частиц, например электронов, или любого другого типа радиации, который можно использовать для лечения злокачественной опухоли.

[70] Лучевая терапия может включать любые источники терапевтической радиации, используемые для лечения злокачественной опухоли и/или родственного заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, ионизирующую лучевую терапию, брахитерапию, терапию близкофокусным радиоактивным излучением, системную терапию радиоизотопом, лучевую терапию с открытым источником, радионуклидную терапию, лучевую терапию внешним пучком, радиационную хирургическую операцию, лучевую терапию заряженными частицами, нейтронную лучевую терапию, терапию рентгеновскими лучами, терапию гамма-лучами и кобальтовую терапию.

[71] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят посредством терапии внешним пучком (EBT), при которой к области организма индивидуума, которая содержит очаг повреждения, применяют внешний источник ионизирующего излучения. В некоторых вариантах осуществления EBT включает ортовольтажные (т.е. поверхностные) лучи радиационного излучения для лечения и/или вмешательство в очаг повреждения, находящийся на коже. В определенных вариантах осуществления EBT включает мегавольтажные, например глубокие, лучи радиационного излучения, которые используют для лечения внутренних очагов повреждения, например, очагов повреждения в мочевом пузыре, кишечнике, предстательной железе, легком или головном мозге. В конкретных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения посредством EBT включает доставку рентгеновских лучей, гамма-лучей, электронных пучков, протонных пучков или пучков ионизированных ядер в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят посредством EBT, которую проводят с помощью линейного ускорителя, коллиматора, кобальтового устройства, устройства для поверхностной лучевой терапии (SRT), ортовольтажного рентгеноского устройства.

[72] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят с помощью внутренней лучевой терапии, т.е. брахитерапии. В определенных вариантах осуществления брахитерапия включает применение источников радиации в или вблизи области очага повреждения. В конкретных вариантах осуществления брахитерапия включает внутритканевое облучение, где источник радиации содержится в мелких гранулах, зернах, проводах, трубках и/или контейнерах и помещается непосредственно в или вблизи очага повреждения. В определенных вариантах осуществления брахитерапия включает внутриполостную радиацию, где контейнер радиоактивного материала помещают в полость тела, например, грудную полость или толстый кишечник. В некоторых вариантах осуществления ультразвуковое исследование, рентгеновское исследование и/или CT-сканирование используют для облегчения размещения радиоактивного источника.

[73] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят с помощью перманентной брахитерапии, которая включает помещение небольших контейнеров, например, контейнеров размером приблизительно с зерно риса, в очаг повреждение. В некоторых вариантах осуществления контейнеры испускают радиационное излучение в течение периода времени, составляющего несколько недель или месяцев, и они остаются на месте после прекращения радиационного излучения.

[74] В конкретных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят с помощью временной брахитерапии, которая включает помещение цилиндров, полых игл, трубок (катетеров) и/или заполненных жидкостью баллонов в область, подвергаемую лечению, которые затем извлекают после лечения. В некоторых вариантах осуществления радиоактивные материалы помещают в эти контейнеры на короткий период времени, а затем извлекают. В некоторых вариантах осуществления временная брахитерапия может представлять собой брахитерапию с высокой мощностью дозы (HDR), где источник радиации устанавливают на несколько минут за раз в или вблизи очага повреждения, а затем извлекают. Этот процесс можно повторять два раза в сутки в течение вплоть до недели или один раз в неделю в течение нескольких недель. В некоторых вариантах осуществления временная брахитерапия представляет собой брахитерапию с низкой мощностью дозы (LDR), где источник радиации остается на месте в течение вплоть до 7 суток перед извлечением.

[75] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят посредством системной лучевой терапии. В некоторых вариантах осуществления системная лучевая терапия включает введение радиоактивных веществ, таких как радиоактивный йод, который проходят через кровь, уничтожая клетки в очаге повреждения. Репрезентативные радиоизотопы, которые можно вводить в радионуклидной терапии, включают, но не ограничиваются ими, фосфор-32, иттрий-90, диспрозий-165, индий-111, стронций-89, самарий-153, рений-186, йод-131, йод-125, лютеций-177 и висмут-213. В то время как все эти радиоизотопы могут быть связаны с биомолекулой, обеспечивающей специфичность нацеливания, йод-131, индий-111, фосфор-32, самарий-153 и рений-186 можно вводить системно без такой конъюгации. Специалист в данной области может выбирать конкретную биомолекулу для применения для нацеливания на конкретное новообразование для радионуклидной терапии на основе молекул клеточной поверхности, присутствующих на этом новообразовании. В некоторых вариантах осуществления радиоактивную частицу конъюгируют с моноклональным антителом, или его активным фрагментом или вариантом, которые связываются с клеткой очага повреждения. Примеры радиофармацевтических лекарственных средств включают, но не ограничиваются ими, ибритутомаба тиуксетан, моноклональное антитело против CD20, конъюгированное либо с иттрием-90, либо с индием-111; и тозитумомаб, моноклональное антитело против CD20, которое конъюгировано с йодом-131.

3. Фармакологическое лечение и/или вмешательство

[76] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят для модулирования модифицированных способами генной инженерии клеток in vivo, например, для облегчения, усиления или увеличения экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток, вводимых индивидууму, посредством введения средства индивидууму. В конкретных вариантах осуществления средство представляет собой фармацевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой иммуномодулирующее средство. В конкретных вариантах осуществления средство представляет собой химиотерапевтическое средство.

[77] В некоторых вариантах осуществления средство, такое как иммуномодулирующее средство, способно ингибировать или блокировать функцию молекулы или каскад передачи сигнала, вовлекающий указанную молекулу. В некоторых вариантах осуществления молекула экспрессируется на иммунных клетках или является частью иммунного синапса, например, экспрессируется на T-клетке или антиген представляющей клетке, или другой клетке, ассоциированной с иммунным ответом. В некоторых таких аспектах молекула представляет собой ингибирующую иммунитет молекула или молекулу иммунной точки контроля. В некоторых вариантах осуществления молекула или каскад иммунной точки контроля представляет собой PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM3, VISTA, рецептор аденозина 2A (A2AR), или аденозин, или каскад, вовлекающий любой из вышеуказанных.

[78] В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой или содержит антитело, которое может представлять собой фрагмент антитела, одноцепочечное антитело, мультиспецифическое антитело, или иммуноконъюгат. В некоторых вариантах осуществления антитело специфически связывается с молекулой иммунной точки контроля, или ее лигандом или рецептором. В некоторых вариантах осуществления антитело способно блокировать или нарушать взаимодействие между молекулой иммунной точки контроля и ее лигандом или рецептором.

[79] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят для модулирования модифицированных способами генной инженерии клеток in vivo путем введения иммуномодулирующего средства индивидууму. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство блокирует, ингибирует или противодействует компоненту каскада иммунной точки контроля. Иммунная система имеет множество ингибиторных путей, которые вовлечены в поддержание толерантности к "своему" и в модулирование иммунных ответов. Опухоли могут использовать определенные каскады иммунной точки контроля в качестве основного механизма иммунной резистентности, в частности, против T-клеток, которые являются специфичными к опухолевым антигенам, например, модифицированных способами инженерии клеток, таких как CAR-экспрессирующие клетки (Pardoll (2012) Nature Reviews Cancer 12:252-264). Поскольку многие такие иммунные точки контроля инициируются взаимодействиями лиганд-рецептор, их можно без труда блокировать антителами против лигандов и/или их рецепторами. В противоположность большинству средств против злокачественной опухоли, ингибиторы точки контроля не обязательно нацелены непосредственно на опухолевые клетки, а скорее нацелены на рецепторы лимфоцитов или их лиганды, для усиления эндогенной противоопухолевой активности иммунной системы.

[80] В конкретных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения индивидууму ингибитора иммунной точки контроля. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунной точки контроля представляет собой молекулу, которая полностью или частично уменьшает, ингибирует, препятствует или модулирует один или несколько белком точки контроля. В некоторых вариантах осуществления белок точки контроля представляет собой любой белок, который регулирует активацию или функцию T-клеток и/или ответственен за костимулирующее или ингибиторное взаимодействие с T-клеточным ответом. Белки иммунной точки контроля регулируют и поддерживают толерантность к "своему" и длительность и амплитуду физиологического иммунного ответа. Ингибиторы иммунной точки контроля включают любое средство, которое блокирует, ингибирует или уменьшает активность или функцию ингибиторных каскадов иммунной системы. Такие ингибиторы могут включать низкомолекулярные ингибиторы, или могут включать антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают и блокируют или ингибируют рецепторы иммунной точки контроля, лиганды и/или взаимодействие рецептор-лиганд. В некоторых вариантах осуществления модулирование, усиление и/или стимуляция конкретных рецепторов могут преодолеть компоненты каскада иммунной точки контроля. Иллюстративные молекулы иммунной точки контроля, на которые можно осуществлять нацеливание для блокирования, ингибирования, модулирования, усиления и/или стимуляции, включают, но не ограничиваются ими, PD-1 (CD279), PD-L1 (CD274, B7-H1), PDL2 (CD273, B7-DC), CTLA-4, LAG-3 (CD223), TIM-3, 4-1BB (CD137), 4-1BBL (CD137L), GITR (TNFRSF18, AITR), CD40, OX40 (CD134, TNFRSF4), CXCR2, ассоциированные с опухолью антигены (TAA), B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4 (принадлежит семейству молекул CD2 и экспрессируется на всех NK-клетках, T-клетках γδ и CD8+ T-клетках памяти (αβ)), CD160 (также обозначаемый как BY55), CGEN-15049, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAL9, аденозин и рецептор трансформирующего фактора роста (TGFR; например, TGFR-бета). Ингибиторы иммунной точки контроля включают антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, или другие связывающие белки, которые связывают и блокируют, или ингибируют и/или усиливают, или стимулируют одну или несколько из любых из вышеуказанных молекул.

[81] Иллюстративные ингибиторы иммунной точки контроля включают тремелимумаб (антитело, блокирующее CTLA-4, также известное как тицилимумаб, CP-675,206), антитело против OX40, моноклональное антитело против PD-L1 (антитело против B7-H1; MEDI4736, также называемый дурвалумабом), MK-3475 (блокатор PD-1), ниволумаб (антитело против PD-1), CT-011 (антитело против PD-1), моноклональное антитело BY55, AMP224 (антитело против PD-L1), BMS-936559 (антитело против PD-L1), MPLDL3280A (антитело против PD-L1), MSB0010718C (антитело против PD-L1) и ипилимумаб (антитело против CTLA-4, также известное как Yervoy®, MDX-010 и MDX-101). Иллюстративные иммуномодулирующие антитела включают, но не ограничиваются ими, даклизумаб (Зенапакс), Бевацизумаб (AVASTIN ®), Базиликсимаб, Ипилимумаб, Ниволумаб, пембролизумаб, MPDL3280A, Пидилизумаб (CT-011), MK-3475, BMS-936559, MPDL3280A (Атезолизумаб), тремелимумаб, IMP321, BMS-986016, LAG525, урелумаб, PF-05082566, TRX518, MK-4166, дацетузумаб (SGN-40), лукатумумаб (HCD122), SEA-CD40, CP-870, CP-893, MEDI6469, MEDI6383, MOXR0916, AMP-224, MSB0010718C (Авелумаб), MEDI4736 (дурвалумаб), PDR001, rHIgM12B7, Улокуплумаб, BKT140, Варлилумаб (CDX-1127), ARGX-110, MGA271, лирилумаб (BMS-986015, IPH2101), IPH2201, ARGX-115, Эмактузумаб, CC-90002 и MNRP1685A, или их антигенсвязывающий фрагмент. Другие иллюстративные иммуномодуляторы включают, например, афутузумаб (доступный от ROCHE®); пегфилграстим (NEULASTA®); леналидомид (CC-5013, REVLIMID®); талидомид (THALOMID®), актимид (CC4047); и IRX-2 (смесь цитокинов человека, включая интерлейкин 1, интерлейкин 2, и интерферон-гамма, CAS 951209-71-5, доступная от IRX Therapeutics).

[82] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения индивидууму иммуномодулирующего средства, которое связывает и/или ингибирует белок запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1). PD-1 представляет собой белок иммунной точки контроля, который экспрессируется в B-клетках, NK-клетках и T-клетках (Shinohara et al., 1995, Genomics 23:704-6; Blank et al., 2007, Cancer Immunol Immunother 56:739-45; Finger et al., 1997, Gene 197:177-87; Pardoll (2012) Nature Reviews Cancer 12:252-264). Основная роль PD-1 состоит в ограничении активности T-клеток в периферических тканях в ходе воспаления в ответ на инфекцию, а также ограничение аутоиммунитета. Экспрессия PD-1 индуцируется в активированных T-клетках и связывание PD-1 с одним из его эндогенных лигандов ингибирует активацию T-клеток путем ингибирования стимулирующих киназ. PD-1 также ингибирует "стоп-сигнал" TCR. PD-1 на высоком уровне экспрессируется на клетках Treg и может увеличивать их пролиферацию в присутствии лиганда (Pardoll (2012) Nature Reviews Cancer 12:252-264). Антитела против PD 1 используют для лечения меланомы, немелкоклеточного рака легкого, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, рака ободочной и прямой кишки, рака головы и шеи, трижды отрицательного рака молочной железы, лейкоз, лимфомы и почечно-клеточного рака (Topalian et al., 2012, N Engl J Med 366:2443-54; Lipson et al., 2013, Clin Cancer Res 19:462-8; Berger et al., 2008, Clin Cancer Res 14:3044-51; Gildener-Leapman et al., 2013, Oral Oncol 49:1089-96; Menzies & Long, 2013, Ther Adv Med Oncol 5:278-85). В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения антитела против PD-1 или его антигенсвязывающего фрагмента индивидууму. Иллюстративные антитела против PD-1 включают ниволумаб (Opdivo от BMS), пембролизумаб (Keytruda от Merck), пидилизумаб (CT-011 от Cure Tech), ламбролизумаб (MK-3475 от Merck) и AMP-224 (Merck), ниволумаб (также обозначаемый как Opdivo, BMS-936558 или MDX1106; Bristol-Myers Squibb), которое представляет собой полностью человеческое моноклональное IgG4-антитело, которое специфически блокирует PD-1. Ниволумаб (clone 5C4) и другие моноклональные антитела человека, которые специфически связываются с PD-1, описаны в US 8008449 и WO2006/121168. Пидилизумаб (CT-011; Cure Tech) представляет собой гуманизированное моноклональное IgG1k-антитело, которое связывается с PD-1. Пидилизумаб и другие гуманизированные моноклональные антитела против PD-1 описаны в WO2009/101611. Пембролизумаб (ранее известный как ламбролизумаб и также называемый Keytruda, MK03475; Merck) представляет собой гуманзированное моноклональное IgG4-антитело, которое связывается с PD-1. Пембролизумаб и другие гуманизированные антитела против PD-1 описаны в US 8354509 и WO2009/114335. Другие антитела против PD-1 включают AMP 514 (Amplimmune), среди прочих, например, антитела против PD-1, описанные в US 8609089, US 2010028330, US 20120114649 и/или US 20150210769. AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; например, описанный в WO2010/027827 и WO2011/066342), представляет собой растворимый рецептор в виде слитой конструкции PD-L2 и Fc, который блокирует взаимодействие между PD-1 и B7-H1.

[83] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения индивидууму иммуномодулирующего средства, которое связывает или ингибирует PD-L1 (также известный как CD274 и B7-H1) и/или PD-L2 (также известный как CD273 и B7-DC). PD-L1 и PD-L2 являются лигандами PD-1, присутствующими на активированных T-клетках, B-клетках, миелоидных клетках, макрофагах и некоторых типах опухолевых клеток. Противоопухолевая терапия фокусируется на антителах против PD-L1. Комплекс PD-1 и PD-L1 ингибирует пролиферацию CD8⁺ T-клеток и уменьшает иммунный ответ (Topalian et al., 2012, N Engl J Med 366:2443-54; Brahmer et al., 2012, N Eng J Med 366:2455-65). Антитела против PD-L1 используют для лечения немелкоклеточного рака легкого, меланомы, рака ободочной и прямой кишки, почечно-клеточного рака, рака поджелудочной железы, рака желудка, рак яичника, рака молочной железы и гематологических злокачественных опухолей (Brahmer et al., 2012, N Eng J Med 366:2455-65; Ott et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5300-9; Radvanyi et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5541; Menzies & Long, 2013, Ther Adv Med Oncol 5:278-85; Berger et al., 2008, Clin Cancer Res 14:13044-51). В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения индивидууму антитела против PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента. Иллюстративные антитела против PD-L1 включают MDX-1105 (Medarex), MEDI4736 (дурвалумаб, Medimmune), MPDL3280A (Genentech), BMS-935559 (Bristol-Myers Squibb) и MSB0010718C.

[84] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой антитело против PD-L1. Иллюстративным антителом против PD-L1 является MEDI4736 (дурвалумаб, Medimmune), который представляет собой моноклональное антитело человека, которое связывается с PD-L1 и ингибирует взаимодействие лиганда с PD-1 (см. патент США № 8779108). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой MDPL3280A (Genentech/Roche), который представляет собой моноклональное IgG1-антитело человека с оптимизированной Fc-областью, которое связывается с PD-L1. MDPL3280A и другие моноклональные антитела человека к PD-L1 описаны в патенте США № 7943743 и публикации США № 20120039906. Другие связывающиеся с PD-L1 молекулы включают YW243.55.S70 (см. WO2010/077634), MDX-1105 (также называемый BMS-936559, и, например, связывающиеся с PD-L1 молекулы, описанные в WO2007/005874), LY3300054 (см. US2017/0058033), атезолизумаб (см. патент США № 8217149) и авелумаб (патент США № 9624298).

[85] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения ингибитора цитотоксического ассоциированного с T-лимфоцитами антигена (CTLA-4), также известного как CD152. CTLA-4 представляет собой соингибиторную молекулу, которая выполняет функцию регулирования активации T-клеток. CTLA-4 является представителем суперсемейства иммуноглобулинов, который экспрессируется исключительно на T-клетках. CTLA-4 ингибирует активацию T-клеток и, согласно сообщениям, ингибирует активность хелперных T-клеток и усиливает иммуносупрессивную активность регуляторных T-клеток. Хотя точный механизм действия CTLA-4 остается неисследованным, было предположено, что он ингибирует активацию T-клеток путем вытеснения CD28 из связывания с CD80 и CD86, а также активной доставки ингибиторных сигналов T-клетке (Pardoll (2012) Nature Reviews Cancer 12:252-264). Антитела против CTLA-4 используют в клинических испытаниях для лечения меланомы, рака предстательной железы, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого (Robert & Ghiringhelli, 2009, Oncologist 14:848-61; Ott et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5300; Weber, 2007, Oncologist 12:864-72; Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89). Характерным признаком антитела против CTLA-4 является кинетика противоопухолевого эффекта с периодом задержки вплоть до 6 месяцев после первоначального лечения, требуемого для физиологического ответа. В некоторых случаях опухоли могут в действительности увеличиваться в размере после начала лечения перед тем, как наблюдают уменьшение (Pardoll (2012) Nature Reviews Cancer 12:252-264). В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения индивидууму антитела против CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента. Иллюстративные антитела против CTLA-4 включают ипилимумаб (Bristol-Myers Squibb) и тремелимумаб (Pfizer). Ипилимумаб недавно был одобрен FDA для лечения метастазирующей меланомы (Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89).

[86] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения иммуномодулирующего средства, которое связывает и/или ингибирует ген активации лимфоцитов-3 (LAG-3), также известный как CD223. LAG-3 представляет собой белок иммунной точки контроля, который ассоциирован с ингибированием активности лимфоцитов и в некоторых случаях индукцией анергии лимфоцитов. LAG-3 экспрессируется на различных клетках иммунной системы, включая B-клетки, NK-клетки и дендритные клетки. LAG-3 является природным лигандом для рецептора MHC класса II, который на значительном уровне экспрессируется на инфильтрирующих меланому T-клетках, включая клетки, обладающие мощной иммуносупрессивной активностью. В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения индивидууму антитела против LAG-3 или его антигенсвязывающего фрагмента. Иллюстративные антитела против LAG-3 включают BMS-986016 (Bristol-Myers Squib), который представляет собой моноклональное антитело, которое нацелено на LAG-3. IMP701 (Immutep) представляет собой антитело-антагонист LAG-3 и IMP731 (Immutep и GlaxoSmithKline) представляет собой истощающее LAG-3 антитело. Другие ингибиторы LAG-3 включают IMP321 (Immutep), который представляет собой рекомбинантный слитый белок растворимой части LAG-3, и Ig, который связывается с молекулами MHC класса II и активирует антигенпредставляющие клетки (APC). Другие антитела описаны, например, в WO2010/019570 и US 2015/0259420.

[87] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения иммуномодулирующего средства, которое связывает и/или ингибирует T-клеточный иммуноглобулин и домен муцина 3 (TIM-3). Было показано, что TIM-3, первоначально идентифицированный на активированных Th1-клетках, является ингибитором иммунного ответа. Блокада TIM-3 стимулирует опосредуемый T-клетками противоопухолевый иммунитет и обладает противоопухолевой активностью в ряде моделей опухоли на мышах. Комбинации блокады TIM-3 с другими иммунотерапевтическими средствами, такими как TSR-042, антитела против CD137 и другие, могут быть аддитивными или синергичными в отношении увеличения противоопухолевых эффектов. Экспрессия TIM-3 ассоциирована с рядом различных типов опухолей, включая меланому, NSCLC и рак почке, и, коме того, было показано, что экспрессия внутриопухолевого TIM-3 коррелирует с плохим прогнозом ряда типов опухолей, включая NSCLC, рак шейки матки и рак желудка. Блокада TIM-3 также представляет интерес с точки зрения стимуляции увеличенного иммунитета к ряду хронических вирусных заболеваний. Было показано, что TIM-3 взаимодействует рядом лигандом, включая галектин-9, фосфатидилсерин и HMGB1, хотя в настоящее время неясно, какие из них связаны, если какие-либо связаны, с регуляцией противоопухолевых ответов. В некоторых вариантах осуществления антитела, фрагменты антител, низкомолекулярные соединения или ингибиторы пептидов, которые нацелены на TIM-3, могут связываться с IgV-доменом TIM-3, ингибируя взаимодействия с его лигандами. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, или пептида, которые связывают и/или ингибируют TIM-3. Иллюстративные антитела и пептиды, которые ингибируют TIM-3, описаны в US 2015/0218274, WO2013/006490 и US 2010/0247521. Другие антитела против TIM-3 включают гуманизированные версии RMT3-23 (Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551) и клон 8B.2C12 (Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541). Биспецифические антитела, которые ингибируют TIM-3 и PD-1, описаны в US 2013/0156774.

[88] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения индивидууму ингибитора CEACAM (например, ингибитора CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5). В определенных вариантах осуществления ингибитор CEACAM представляет собой антитело против CEACAM или его антигенсвязывающий фрагмент или вариант. Иллюстративные антитела против CEACAM-1 описаны в WO 2010/125571, WO 2013/082366 WO 2014/059251 и WO 2014/022332, например, моноклональное антитело 34B1, 26H7 и 5F4; или их рекомбинантную форму, как описано, например, в US 2004/0047858, US 7132255 и WO 99/052552. В некоторых вариантах осуществления антитело против CEACAM связывается с CEACAM-5, как описано, например, в Zheng et al. PLoS One. (2011) 6(6): e21146), или перекрестно реагирует с CEACAM-1 и CEACAM-5, как описано, например, в WO 2013/054331 и US 2014/0271618.

[89] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения иммуномодулирующего средства, которое связывает и/или ингибирует 4-1BB, также известный как CD137. 4-1BB представляет собой трансмембранный гликопротеин, принадлежащий надсемейству TNFR. Рецепторы 4-1BB находятся на активированных T-клетках и B-клетках, и моноцитах. В некоторых вариантах осуществления антитело против 4-1BB или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. Иллюстративное антитело против 4-1BB представляет собой урелумаб (BMS-663513), которое обладает потенциальной иммуностимулирующей и антинеопластической активностью.

[90] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения иммуномодулирующего средства, которое является структурным или функциональным аналогом, или производным талидомида и/или ингибитором убиквитинлигазы E3. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство связывается с цереблоном (CRBN). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство связывается с комплексом CRBN-убиквитинлигаза E3. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство связывается с CRBN и комплексом CRBN-убиквитинлигаза E3. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство активирует экспрессию белка или гена CRBN. В некоторых аспектах CRBN является субстратным адаптером для убиквитинлигазы E3 CRL4^CRBN, и модулирует специфичность этого фермента. В некоторых вариантах осуществления связывание с CRB или комплексом CRBN-убиквитинлигаза E3 ингибирует активность убиквитинлигазы E3. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство индуцирует убиквитинилирование KZF1 (Ikaros) и IKZF3 (Aiolos) и/или индуцирует деградацию IKZF1 (Ikaros) и IKZF3 (Aiolos). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство индуцирует убиквитинилирование казеинкиназы 1A1 (CK1α) убиквитинлигазой E3 CRL4^CRBN. В некоторых вариантах осуществления убиквитинилирование CK1α приводит к деградации CK1α.

[91] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой ингибитор фактора транскрипции Ikaros (IKZF1). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство усиливает убиквитинилирование Ikaros. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство усиливает деградацию Ikaros. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство подавляет экспрессию белка или гена Ikaros. В некоторых вариантах осуществления введение иммуномодулирующего средства вызывает снижение уровней белка Ikaros.

[92] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой ингибитор фактора транскрипции Aiolos (IKZF3). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство усиливает убиквитинилирование Aiolos. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство усиливает деградацию Aiolos. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство подавляет экспрессию белка или гена Aiolos. В некоторых вариантах осуществления введение иммуномодулирующего средства вызывает снижение уровней белка Aiolos.

[93] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой ингибитор факторов транскрипции как Ikaros (IKZF1), так и Aiolos (IKZF3). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство повышает убиквитинилирование как Ikaros, так и Aiolos. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство усиливает деградацию как Ikaros, так и Aiolos. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство усиливает убиквитинилирование и деградацию как Ikaros, так и Aiolos. В некоторых вариантах осуществления введение иммуномодулирующего средства вызывает снижение уровней как белка Aiolos, так и белка Ikaros.

[94] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой селективное ингибирующее цитокины лекарственное средство (SelCID). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство ингибирует активность фосфодиэстеразы-4 (PDE4). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство подавляет ферментативную активность фосфатаз CDC25. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство изменяет внутриклеточный транспорт фосфатаз CDC25.

[95] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой талидомид (2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1H-изоиндол-1,3(2H)-дион), или аналог или производное талидомида. В определенных вариантах осуществления производное талидомида включает структурные варианты талидомида, которые обладают сходной биологической активностью. Иллюстративные производные талидомида включают, но не ограничиваются ими, леналидомид (REVLIMMUNOMODULATORY COMPOUND^TM; Celgene Corporation), помалидомид (также известный как ACTIMMUNOMODULATORY COMPOUND^TM или POMALYST^TM (Celgene Corporation)), CC-1088, CDC-501 и CDC- 801, и соединения, описанные в патентах США № 5712291; 7320991; и 8716315; заявке США № 2016/0313300; и публикациях PCT № WO 2002/068414 и WO 2008/154252.

[96] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой 1-оксо- и 1,3 диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины, замещенные аминогруппой в бензокольце, как описано в патенте США № 5635517 который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

[97] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой соединение следующей формулы:

где один из X и Y представляет собой -C(O)-, а другой из X и Y представляет собой -C(O)- или -CH₂-, и R⁵ представляет собой водород или низший алкил, или их фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления X представляет собой -C(O)- и Y представляет собой -CH₂-. В некоторых вариантах осуществления как X, так и Y представляют собой -C(O)-. В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой водород. В других вариантах осуществления R⁵ представляет собой метил.

[98] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее соединение представляет собой соединение, которое принадлежит к классу замещенных 2-(2, 6-диоксопиперидин-3-ил)фталиммуномодулирующих соединений и замещенных 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолов, таких как соединения, описанные в патентах США № 6281230; 6316471; 6335349 и 6476052, и международной патентной заявке № PCT/US97/13375 (международная публикация № WO 98/03502), каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки.

[99] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой соединение следующей формулы:

где

один из X и Y представляет собой -C(O)-, а другой из X и Y представляет собой -C(O)- или -CH₂-;

(1) каждый из R¹, R², R³ и R⁴ независимо представляет собой галоген, алкил из 1-4 атомов углерода, или алкокси из 1-4 атомов углерода, или

(2) один из R¹, R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -NHR^a, остальные из R¹, R², R³ и R⁴ представляют собой водород, где R^a представляет собой водород или алкил из 1-8 атомов углерода;

R⁵ представляет собой водород или алкил из 1-8 атомов углерода, бензил или галоген;

при условии, что R⁵ отличен от водорода, если X и Y представляют собой -C(O)-, и (i) каждый из R¹, R², R³ и R⁴ представляет собой фтор; или (ii) один из R¹, R², R³ и R⁴ представляет собой амино;

или их его фармацевтически приемлемую соль.

[100] В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующее средство представляет собой соединение, которое принадлежит к классу изоиндол-иммуномодулирующих соединений, описанных в патенте США № 7091353, публикации патента США № 2003/0045552 и международной заявке № PCT/USOI/50401 (международная публикация № WO02/059106), каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки. Например, в некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующее средство представляет собой [2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил]-амид; трет-бутиловый эфир (2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил)-карбаминовой кислоты; 4-(аминометил)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-изоиндолин-1,3-дион; N-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил)ацетамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил)-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}циклопропилкарбоксамид; 2-хлор-N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}ацетамид; N-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)-3-пиридилкарбоксамид; 3-{1-оксо-4-(бензиламино)изоиндолин-2-ил}пиперидин-2,6-дион; 2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-4-(бензиламино)изоиндолин-1,3-дион; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}пропанамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}-3-пиридилкарбоксамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}гептанамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}-2-фурилкарбоксамид; {N-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)карбамоил}метилацетат; N-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)пентанамид; N-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)-2-тиенилкарбоксамид; N-{[2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил]метил}(бутиламино)карбоксамид; N-{[2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил]метил}(октиламино)карбоксамид; или N-{[2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил]метил}(бензиламино)карбоксамид.

[101] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой соединение, которое относится к классу изоиндол-иммуномодулирующих соединений, описанных в публикациях патентных заявок США № 2002/0045643, международной публикации № WO 98/54170 и патенте США № 6395754, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой тетра-замещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолины, описанные в патенте США № 5798368, который включен в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой 1-оксо- и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины, описанные в патенте США № 6403613, который включен в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой 1-оксо- или 1,3-диоксоизоиндолин, замещенный в положении 4 или 5 кольца индолина, как описано в патенте США № 6380239 и патенте США № 7244759, оба из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок.

[102] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой 2-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-4-карбамоилмасляная кислота или 4-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-4-карбамоилмасляная кислота. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующие соединение представляет собой 4-карбамоил-4-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}-масляная кислота, 4-карбамоил-2-{4-[(фуран-2-илметил)-амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}-масляная кислота, 2-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}-4-фенилкарбамоилмасляная кислота или 2-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}-пентандиовую кислоту.

[103] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой изоиндолин-1-он или изоиндолин-1,3-дион, замещенный во 2 положении 2,6-диоксо-3-гидроксипиперидин-5-илом, как описано в патенте США № 6458810, который включен в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее соединение представляет собой 3-(5-амино-2-метил-4-оксо-4H-хиназолин-3-ил)-пиперидин-2,6-дион, или его энантиомер или смесь энантиомеров; или фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее соединение представляет собой 3-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]-пиперидин-2,6-дион.

[104] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство является таким, как описано в Oshima, K. et al., Nihon Rinsho., 72(6):1130-5 (2014); Millrine, D. et al., Trends Mol Med., 23(4):348-364 (2017); и Collins, et al., Biochem J., 474(7):1127-1147 (2017).

[105] В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой леналидомид, помалидомид, авадомид, стереоизомер леналидомида, помалидомида, авадомида или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующие соединение представляет собой леналидомид, стереоизомер леналидомида или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее соединение представляет собой леналидомид или ((RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион).

[106] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения индивидууму производного талидомида леналидомида ((RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион). Леналидомид одобрен FDA для лечения множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, ассоциированного с делецией 5q и позднее рецидивирующей/рефрактерной лимфомы из клеток мантийной зоны (MCL). Леналидомид обычно представляет собой синтетический производное талидомида и, как понимают в настоящее время, имеет множество иммуномодулирующих эффектов, в том числе усиление образования иммунных синапсов между T-клетками и антигенпредставляющими клетками (APC). Например, в некоторых случаях леналидомид модулирует T-клеточные ответы и приводит к увеличению продукции интерлейкина (IL)-2 в CD4⁺ и CD8⁺ T-клетках, индуцирует сдвиг ответов T-хелперов (Th) с Th2 на Th1, ингибирует экспансию регуляторной подгруппы T-клеток (Treg) и улучшает функционирование иммунологических синапсов при фолликулярной лимфоме и хроническом лимфоцитарном лейкозе (CLL) (Otahal et al., Oncoimmunology (2016) 5(4):e1115940). Леналидомид также обладает прямой туморицидной активностью у пациентов с множественной миеломой (MM) и прямо и непрямо модулирует выживаемость опухолевых клеток CLL путем влияния на поддерживающие клетки, такие как клетки, подобные клеткам-нянькам, находящимся в микроокружении лимфоидных тканей. Леналидомид также может усиливать пролиферацию T-клеток и продукцию интерферона-γ в ответ на активацию T-клеток посредством связывания CD3 или опосредуемой дендритными клетками активации. Кроме того, полагают, что леналидомид уменьшает пролиферацию провоспалительных цитокинов, включая TNF-a, IL-1, IL-6 и IL-12, и усиливает антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) посредством увеличенной активации NK-клеток. Леналидомид также может индуцировать экспрессию злокачественными B-клетками более высоких уровней иммуностимулирующих молекул, таких как CD80, CD86, HLA-DR, CD95 и CD40 (Fecteau et al., Blood (2014) 124(10):1637-1644). Цереблон, убиквитинлигаза E3, был идентифицирован в качестве первичной мишени для индуцируемого талидомидом тератогенеза (Ito et al., T., (2010) Science 327: 1345-1350). Леналидомид также нацелен на цереблон, и было показано, что это приводит к уменьшению экспрессии c-Myc и IRF4 при одновременном увеличении также экспрессии p21, которая приводит к остановке клеточного цикла в фазе G1 (Lopez-Girona et al., (2012) Leukemia 26: 2326-2335).

[107] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения средства, которое модулирует уровни аденозина и/или модулирует активность или количество компонента каскада аденозина. Аденозин может функционировать в качестве иммуномодулирующего средства в организме. Например, аденозин и некоторые аналоги аденозина, которые неселективно активируют подтипы рецепторов аденозина, уменьшают продукцию нейтрофилами воспалительных окислительных продуктов (Cronstein et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 451:291, 1985; Roberts et al., Biochem. J., 227:669, 1985; Schrier et al., J. Immunol. 137:3284, 1986; Cronstein et al., Clinical Immunol. Immunopath. 42:76, 1987). В некоторых случаях концентрация уровни внеклеточного аденозина или аналогов аденозина могут возрастать в определенной среде, например, микроокружении опухоли (TME). В некоторых случаях передача сигнала аденозина или аналога аденозина зависит от гипоксии или факторов, вовлеченных в гипоксию или ее регуляцию, например, индуцируемый гипоксией фактор (HIF). В некоторых вариантах осуществления увеличение передачи сигнала аденозина может приводить к увеличению внутриклеточного уровня cAMP и cAMP-зависимой протеинкиназы, что приводит к ингибированию продукции провоспалительных цитокинов и может приводить к синтезу иммуносупрессивных молекул и развитию Treg (Sitkovsky et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(7):598-605). В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство может снизить или обратить вспять иммуносупрессивные эффекты аденозина, аналогов аденозина и/или передачи сигнала аденозина. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство может снизить или обратить вспять запускаемую гипоксией иммуносупрессию A2-аденозинергических T-клеток. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство выбирают из антагонистов рецепторов аденозина, внеклеточных аденозин-деградирующих средств, ингибиторов образования аденозина эктоферментами CD39/CD73, и ингибиторов передачи сигнала гипоксия-HIF-1α. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой антагонист или агонист рецептора аденозина.

[108] В конкретных вариантах осуществления средство, которое ингибирует или снижает уровень внеклеточного аденозина вводят индивидууму для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления средство, которое ингибирует активность и/или количество рецептора аденозина, вводят индивидууму для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. Конкретные варианты осуществления предусматривают, что ингибирование или снижение уровня внеклеточного аденозина или рецептора аденозина посредством ингибитора внеклеточного аденозина (такого как средство, которое препятствует образованию, деградирует, инактивирует и/или снижает уровень внутриклеточного аденозин), и/или ингибитора рецептора аденозина (такого как антагонист рецептора аденозина) может усилить иммунный ответ, такой как ответ макрофагов, нейтрофилов, гранулоцитов, дендритных клеток, опосредуемый T- и/или B-клетками ответ. Кроме того, ингибиторы опосредуемого Gs-белком зависимого от cAMP внутриклеточного каскада и ингибиторы запускаемых рецептором аденозина опосредуемых Gi-белком внутриклеточных каскадов также могут повышать острое и хроническое воспаление.

[109] В некоторых вариантах осуществления антагонист рецептора аденозина вводят индивидууму для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В конкретных вариантах осуществления антагонист рецептора аденозина вводят индивидууму для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления антагонист рецептора аденозина представляет собой антагонист A2a, A2b и/или A3. Рецепторы A2a, A2b и A3 могут подавлять или снижать иммунный ответ, таким образом, являясь антагонистами иммуносупрессивным рецепторам аденозина, которые могут облегчать, усиливать или повышать иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления средство, которое ингибирует продукцию внеклеточного аденозина и/или ингибирует запускаемую аденозином передачу сигнала через рецепторы аденозина, вводят индивидууму для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ на очаг повреждения, воспаление ткани в очаге повреждения и направленное разрушение ткани в очаге повреждения могут быть усилены путем ингибирования или уменьшения локальной гипоксии ткани, вызывающей продукцию аденозина; путем деградации (или инактивации) накопленного внеклеточного аденозина; путем предупреждения или уменьшения экспрессии рецепторов аденозина на иммунных клетках; и/или путем ингибирования передачи сигнала лигандами аденозина через рецепторы аденозина.

[110] В конкретных вариантах осуществления антагонист рецептора аденозина вводят индивидууму для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления антагонист представляет собой низкомолекулярный антагонист рецептора аденозина, такой как антагонист рецептора A2a, A2b или A3. В некоторых вариантах осуществления антагонист представляет собой пептид или пептидомиметик, который связывает рецептор аденозина A2a, A3b и/или A3, но не запускает каскад зависимой от G_i-белка внутриклеточной передачи сигнала. Примеры таких антагонистов описаны в патентах США № 5565566; 5545627, 5981524; 5861405; 6066642; 6326390; 5670501; 6117998; 6232297; 5786360; 5424297; 6313131, 5504090 и 6322771.

[111] В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят антагонист рецептора A2 (A2R) для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. Иллюстративные антагонисты A2R включают, но не ограничиваются ими, KW6002 (истрадефилин), SCH58261, кофеин, параксантин, 3,7-диметил-1-пропаргилксантин (DMPX), 8-(м-хлорстирил)кофеин (CSC), MSX-2, MSX-3, MSX-4, CGS-15943, ZM-241385, SCH-442416, преладенант, випаденант (BII014), V2006, ST-1535, SYN-115, PSB-1115, ZM241365, FSPTP и ингибиторную нуклеиновую кислоту, нацеленную на экспрессию A2R, например, миРНК или кшРНК, или любые антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые нацелены на A2R. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антагонист A2R, описанный, например, в Ohta et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2006) 103:13132-13137; Jin et al., Cancer Res. (2010) 70(6):2245-2255; Leone et al., Computational and Structural Biotechnology Journal (2015) 13:265-272; Beavis et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2013) 110:14711-14716; и Pinna, A., Expert Opin Investig Drug (2009) 18:1619-1631; Sitkovsky et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(7):598-605; US 8080554; US 8716301; US 20140056922; WO2008/147482; US 8883500; US 20140377240; WO02/055083; US 7141575; US 7405219; US 8883500; US 8450329 и US 8987279).

[112] В конкретных вариантах осуществления антагонист рецептора аденозина, который представляет собой антисмысловую молекулу, ингибиторную молекулу нуклеиновой кислоты (например, малую ингибиторную РНК (миРНК)) или каталитическую молекулу нуклеиновой кислоты (например, рибозим), которая специфически связывает мРНК, кодирующую рецептор аденозина, вводят индивидууму для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления антисмысловая молекула, ингибиторная молекула нуклеиновой кислоты или каталитическая молекула нуклеиновой кислоты связывает нуклеиновые кислоты, кодирующие A2a, A2b или A3. В некоторых вариантах осуществления антисмысловая молекула, ингибиторная молекула нуклеиновой кислоты или каталитическая нуклеиновая кислота нацелена на биохимические каскады ниже рецептора аденозина. Например, антисмысловая молекула или каталитическая нуклеиновая кислота может ингибировать фермент, вовлеченный в внутриклеточный каскад, зависимый от G_s-белка или от G_i-белка. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство включает доминантно-негативную мутантную форму рецептора аденозина, такого как A2a, A2b или A3.

[113] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения средства, которое ингибирует внеклеточный аденозин у индивидуума. Средства, которые ингибируют внеклеточный аденозин, включают средства, которые делают внеклеточный аденозин нефункциональным (например, делают внеклеточный аденозин неспособным связывать и/или активировать рецептор аденозина), такие как вещество, которое модифицирует структуру внеклеточного аденозина. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой фермент, генерирующий внеклеточный аденозин или деградирующий аденозин, его модифицированную форму или модулятор. Например, в некоторых вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой фермент (например, аденозиндезаминазу) или другую каталитическую молекулу, которая селективно связывает и разрушает аденозин, тем самым устраняя или снижая способность эндогенно образовавшегося аденозина передавать сигнал через рецепторы аденозина и прекращать воспаление.

[114] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения аденозиндезаминазы (ADA) или ее модифицированной формы, например, рекомбинантной ADA и/или модифицированной полиэтиленгликолем ADA (ADA-ПЭГ), индивидууму. Аденозиндезаминаза может ингибировать локальное накопление в ткани внеклеточного аденозина. ADA-PEG используют для лечения пациентов с ADA SCID (Hershfield (1995) Hum Mutat. 5:107). В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят средство, которое ингибирует внеклеточный аденозин, которое включает средства, которые препятствуют или уменьшают образование внеклеточного аденозина, и/или препятствуют или уменьшают накопление внеклеточного аденозина, тем самым устраняя или существенно уменьшая иммуносупрессивные эффекты аденозина. В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят средство, которое специфически ингибирует ферменты и белки, которые вовлечены в регуляцию синтеза и/или секреции провоспалительных молекул, включая модуляторы ядерных факторов транскрипции. Подавление экспрессии рецептора аденозина или зависимого от G_s-белка или G_i-белка внутриклеточного каскада, или зависимого от cAMP внутриклеточного каскада может приводить к увеличению/усилению иммунного ответа.

[115] В некоторых вариантах осуществления средство, на которое нацелены эктоферменты, которые генерируют или продуцируют внеклеточный аденозин, вводят индивидууму для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления средство нацелено на эктоферменты CD39 и CD73, которые функционируют тандемно, генерируя внеклеточный аденозин. CD39 (также называемый эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролазой) конвертирует внеклеточный ATP (или ADP) в 5'AMP. Затем CD73 (также называемый 5'-нуклеотидазой) конвертирует 5'AΜΡ в аденозин. Активность CD39 является обратимой в результате действия NDP-киназы и аденилаткиназы, в то время как активность CD73 является необратимой. CD39 и CD73 экспрессируются на стромальных клетках опухоли, включая эндотелиальные клетки и Treg, а также на многих злокачественных клетках. Например, экспрессия CD39 и CD73 на эндотелиальных клетках возрастает в гипоксических условиях микроокружения опухоли. Гипоксия опухоли может быть результатом недостаточного кровоснабжения и нарушения организации сосудов опухоли, которые ухудшают доставку кислорода (Carroll and Ashcroft (2005), Expert. Rev. Mol. Med. 7(6):1-16). Гипоксия также ингибирует аденилаткиназу (AK), которая конвертирует аденозин в AMP, что приводит к очень высокой внеклеточной концентрации аденозина. Таким образом, в ответ на гипоксию, которая является состоянием, которое часто возникает в микроокружении опухоли (TME), в или вокруг солидных опухолей, высвобождается аденозин. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой одно или несколько из антитела против CD39 или его антигенсвязывающего фрагмента, антитела против CD73 или его антигенсвязывающего фрагмента, например, MEDI9447 или TY/23, α-β-метилен-аденозиндифосфата (ADP), ARL 67156, POM-3, IPH52 (см., например, Allard et al. Clin Cancer Res (2013) 19(20):5626-5635; Hausler et al., Am J Transl Res (2014) 6(2):129-139; Zhang, B., Cancer Res. (2010) 70(16):6407-6411).

[116] В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтическое средство (иногда называемое цитотоксическим средством) вводят индивидууму для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В определенных вариантах осуществления очаг повреждения представляет собой опухоль. В конкретных вариантах осуществления очаг повреждения является злокачественным. В конкретных вариантах осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой любое средство, известное специалистам в данной области тем, что оно является эффективным для лечения, предупреждения или смягчения гиперпролиферативных нарушений, таких как злокачественная опухоль. Химиотерапевтические средства включают, но не ограничиваются ими, низкомолекулярные соединения, синтетические лекарственные средства, пептиды, полипептиды, белки, нуклеиновые кислоты (например, полинуклеотиды ДНК и РНК, включая, но не ограничиваясь ими, антисмысловые нуклеотидные последовательности, тройные спирали и нуклеотидные последовательности, кодирующие биологически активные белки, полипептиды или пептиды), антитела, синтетические или природные неорганические молекулы, миметикии синтетические или природные органические молекулы. В конкретных вариантах осуществления химиотерапевтические лекарственные средства включат алкилирующие средства, антрациклины, средства, разрушающие цитоскелет (таксаны), эпотилоны, ингибиторы деацетилазы гистонов, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы топоизомеразы II, ингибиторы киназы, нуклеотидные аналоги и аналогов предшественников, пептидные антибиотики, средства на основе платины и алкалоиды барвинка и их производные.

[117] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения химиотерапевтического средства для модулирования модифицированных способами генной инженерии клеток in vivo. Химиотерапевтические средства могут включать, но не ограничиваться ими, абареликс, альдеслейкин, алемтузумаб, алитретиноин, аллопуринол, алтретамин, амифостин, анастрозол, триоксид мышьяка, аспарагиназу, БЦЖ живую, бевацелизумаб, бексаротен, блеомицин, бортезомиб, бусульфан, калустерон, камптотецин, капецитабин, карбоплатин, кармустин, целекоксиб, цетуксимаб, хлорамбуцил, цинакальцет, цисплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, дарбэпоэтин альфа, даунорубицин, денилейкин дифтитокс, дексразоксан, доцетаксел, доксорубицин, дромостанолон, раствор B Элиотта, эпирубицин, эпоэтин альфа, эстрамустин, этопозид, экземестан, филграстим, флоксуридин, флударабин, фторурацил, фулвестрант, гемцитабин, гемтузумаб озагомицин, гефитиниб, гозерелин, гидроксимочевину, ибритутомаб тиуксетан, идарубицин, ифосфамид, иматиниб, интерферон альфа-2a, интерферон альфа-2b, иринотекан, лектрозол, лейковорин, левамизол, ломустин, меклорэтамин, магестрол, мелфалан, меркаптопурин, месну, метотрексат, метоксален, метилпреднизолон, митомицин C, митотан, митоксантрон, нандролон, нофетумомаб, облимерсен, опрелвекин, оксалиплатин, паклитаксел, памидронат, пегадемазу, пегаспаргазу, пегфилграстим, пеметрексед, пентостатин, пипоброман, пликамицин, полифепросан, порфимер, прокарбазин, хинакрин, расбуриказу, ритуксимаб, сарграмостим, стрептозоцин, тальк, тамоксифен, тарцеву, темозоломид, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепа, топотекан, торемифен, тозитумомаб, трастузумаб, третиноин, урацил мустард, валрубицин, винбластин, винкристин, винорелбин и золедронат.

C. Реэкспансия модифицированных способами генной инженерии клеток

[118] В некоторых вариантах осуществления предусматриваемые способы обеспечивают реэкспансию модифицированных способами инженерии клеток у индивидуума, которая в некоторых случаях может значительно превышать первоначальный максимальный уровень экспансии до лечения и/или вмешательства. В некоторых вариантах осуществления предусматриваемые способы модулируют экспансию и/или персистенцию модифицированных способами инженерии T-клеток в моменты времени, когда максимальные уровни модифицированных способами инженерии снижаются или не поддаются обнаружению. В некоторых вариантах осуществления модифицированная способами генной инженерии клетка, индуцированная для реэкспансии, демонстрирует лучшую эффективность у индивидуума, которому ее вводят.

[119] Способы мониторинга или обнаружения CAR+ T-клеток известны, и иллюстративные способы описаны в разделе IV.C. В некоторых вариантах осуществления после введения индивидууму можно выявлять или количественно определять степень или выраженность экспансии введенных клеток. Например, в некоторых аспектах, количественную ПЦР (кПЦР) используют для оценки количества клеток, экспрессирующих химерный рецептор (например, CAR-экспрессирующие клетки) в крови, или сыворотке, или органе, или ткани (например, пораженной заболеванием области) индивидуума. В некоторых аспектах экспансию, в том числе количества модифицированных способами инженерии клеток, количественно определяют в качестве копий ДНК или плазмиды, кодирующей рецептор, например, CAR, на микрограмм ДНК, или в качестве количества экспрессирующих рецептор, например, экспрессирующих CAR, клеток на микролитр образца, например, крови или сыворотки, или на общее количество мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), или лейкоцитов, или T клеток, на микролитр образца. В некоторых вариантах осуществления можно проводить проточно-цитометрический анализ, выявляющий клетки, экспрессирующие рецептор, обычно с использованием антител, специфичных к рецепторам. Клеточные способы анализа также можно использовать для обнаружения количества или процента функциональных клеток, таких как клетки, способные связывать, и/или нейтрализовывать, и/или индуцировать ответы, например, цитотоксические ответы, против клеток, связанных с заболеванием или состоянием, или экспрессирующих антиген, распознаваемый рецептором. В любых из таких вариантах осуществления степень или уровень экспрессии другого маркера, ассоциированного с рекомбинантным рецептором (например, CAR-экспрессирующие клетки), можно использовать для отличения введенных клеток от эндогенных клеток у индивидуума.

[120] В некоторых вариантах осуществления вмешательство в очаг повреждения в соответствии с предусматриваемыми способами обеспечивает активацию, реэкспансию и/или увеличенную экспозицию клеток у индивидуума, например, T-клеток, введенных для T-клеточной терапии, например, путем обеспечения их экспансии и/или персистенции с течением времени. В некоторых вариантах осуществления T-клеточная терапия демонстрирует увеличенную или пролонгированную экспансию и/или персистенцию у индивидуума, или в среднем у множества индивидуумов, которых лечат таким образом, по сравнению со способом, в котором T-клеточную терапию проводят у индивидуума(ов) в отсутствии вмешательства в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления предусматриваемые способы, вовлекающие вмешательство в очаг повреждения in vivo, могут увеличивать максимальную, общую экспозицию и/или длительность экспозиции клеток, например T-клеток, введенных для T-клеточной терапии, у индивидуума, или в среднем у множества индивидуумов, которых лечат таким образом, по сравнению с введение T-клеток отдельно в отсутствии вмешательства в очаг повреждения. Такое увеличение может составлять, или приблизительно составлять, или составлять по меньшей мере приблизительно 1,2 раза, 1,5 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раз, 6,0 раз, 7,0 раз, 8,0 раз, 9,0 раз, 10,0 раз, 20,0 раз, 30,0 раз, 40,0 раз, 50,0 раз или более.

[121] В некоторых вариантах осуществления увеличенная экспозиция введенных клеток у индивидуума (например, увеличенное количество клеток или длительность экспозиции), обеспечиваема предусматриваемыми способами, повышает эффективность и терапевтические исходы иммунотерапии, например, T-клеточной терапии. В некоторых аспектах, способы являются преимущественными в том, что более высокая степень экспозиции и/или более длительная экспозиция клеток, экспрессирующих рекомбинантные рецепторы, например, CAR-экспрессирующих клеток, улучшает исходы лечения по сравнению с другими способами. Такие исходы могут включать выживаемость и ремиссию пациентов, даже у индивидуумов с тяжелой опухолевой нагрузкой. В некоторых аспектах увеличенная или длительная экспансия и/или персистенция дозы клеток у индивидуума или в среднем у множества индивидуумов, которых лечат таким образом, которая достигается после лечения и/или вмешательства в очаг повреждения, ассоциирована с пользой в отношении связанных с опухолью исходов у индивидуума(ов). В некоторых вариантах осуществления связанный с опухолью исход включает уменьшение опухолевой нагрузки или уменьшение бластов в костном мозге индивидуума(ов). В некоторых вариантах осуществления опухолевая нагрузка уменьшается на или по меньшей мере на или приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 процентов после проведения способа. В некоторых вариантах осуществления нагрузка заболеванием, размер опухоли, объем опухоли, масса опухолевая и/или опухолевая нагрузка или опухолевая масса уменьшаются после введения дозы клеток по меньшей мере на или приблизительно на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с индивидуумом или в среднем с множеством индивидуумов, которых лечат способом, который не вовлекает вмешательство в очаг повреждения.

[122] В некоторых вариантах осуществления предусматриваемые способы эффективно лечат индивидуума, несмотря на то, что индивидуум стал резистентным к другой терапии и/или имеет рецидив после введения модифицированных способами инженерии клеток, таких как клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, например CAR+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления критерии, оцениваемые для эффективного лечения, включают общую частоту ответа (ORR), полный ответ (CR), длительность ответа (DOR), выживаемость без прогрессирования (PFS) и/или общую выживаемость (OS). В некоторых вариантах осуществления способы и применения обеспечивают или достигают более длительных ответов у индивидуума или в среднем у множества индивидуумов, которых лечат таким образом, по сравнению со способом, который не вовлекает вмешательство в очаг повреждения. В конкретных вариантах осуществления любого из предусматриваемых способов ответ, например ORR или CR, длится в течение более 3 месяцев, более 6 месяцев, более 12 месяцев, более 18 месяцев, более 24 месяцев, более 30 месяцев, более 36 месяцев или более после вмешательства в очаг повреждения и/или введения фармакологического или терапевтического средства в соответствии с предусматриваемыми способами.

II. Клеточная терапия и модифицированные способами инженерии клетки

[123] Предусматриваемые терапевтические способы вовлекают введение клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, и их композиций индивидуумам, например, пациентам. В некоторых вариантах осуществления клетки содержат или модифицированы для того, чтобы они содержали модифицированный способами инженерии рецептор, например, модифицированный способами инженерии рецептор антигена, такой как химерный рецептор антигена (CAR), или T-клеточный рецептор (TCR). Клетки включают популяции таких клеток, композиции, содержащие такие клетки и/или обогащенные такими клетками, например, в которых клетки определенного типа, такие как T-клетки или CD8⁺ или CD4⁺ клетки подвергнуты увеличению в количестве или селекции. К композициям относятся фармацевтические композиции и составы для введения, такие как композиции и составы для адоптивной клеточной терапии.

[124] В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или нескольких нуклеиновых кислот, введенных способами генной инженерии, и, тем самым, экспрессируют рекомбинантные или модифицированные способами генной инженерии продукты таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления перенос генов проводят сначала путем стимуляции клеток, например, комбинирования их со стимулом, который индуцирует ответ, такой как пролиферация, выживаемость и/или активация, например, как определяют по экспрессии цитокина или маркера активации с последующей трансдукцией активированных клеток и увеличения в количестве в культуре до количеств, достаточных для клинических применений.

[125] Различные способы введения модифицированных способами генной инженерии компонентов, например, рецепторов антигенов, например CAR, хорошо известны и могут использоваться совместно с предусматриваемыми способами и композициями. Иллюстративные способы включают способы переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы, в том числе посредством вирусного, например, ретровирусного или лентивирусного переноса, трансдукции, транспозонов и электропорации.

A. Рекомбинантные рецепторы

[126] Клетки обычно экспрессируют рекомбинантные рецепторы, такие как рецепторы антигенов, включающие функциональные рецепторы антигена, не являющегося TCR, например, химерные рецепторы антигена (CAR), и другие антигенсвязывающие рецепторы, такие как трансгенные T-клеточные рецепторы (TCR). Также к рецепторам относятся другие химерные рецепторы, такие как химерные рецепторы аутоантител (CAAR).

1. Химерные рецепторы антигена (CAR)

[127] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор включает химерный рецептор антигена (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR является специфическим для конкретного антигена (или маркера, или лиганда), такого как антиген, экспрессируемый на поверхности конкретного типа клеток. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления он представляет собой углевод или другую молекулу. В некоторых вариантах осуществления антиген селективно экспрессируется или сверхэкспрессируется на клетках, связанных с заболеванием или состоянием, например, опухолевых или патогенных клетках, по сравнению с нормальными или не являющимися мишенями клетками или тканями. В других вариантах осуществления антиген экспрессируется на нормальных клетках и/или экспрессируется на модифицированных способами инженерии клетках.

[128] В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как химерный рецептор, содержит внутриклеточную сигнальную область, которая включает цитоплазматический сигнальный домен (также взаимозаменяемо называемый внутриклеточным сигнальным доменом), такой как цитоплазматическая (внутриклеточная) область, способная индуцировать сигнал первичной активации в T-клетках, например, цитоплазматический сигнальный домен компонента T-клеточного рецептора (TCR) (например, цитоплазматический сигнальный домен зета-цепи CD3 (CD3ζ) или его функциональный вариант или сигнальная часть) и/или который содержит иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM).

[129] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор дополнительно содержит внеклеточный связывающий домен, который специфически связывается с антигеном (или лигандом). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор представляет собой CAR, который содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, который специфически связывается с антигеном. В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд), представляет собой белок, экспрессируемый на поверхности клеток. В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой TCR-подобный CAR и антиген представляет собой процессированный пептидный антиген, такой как пептидный антиген внеклеточного белка, который, подобно TCR, распознается на клеточной поверхности в контексте молекулы основного комплекса гистосовместимости (MHC).

[130] Иллюстративные рецепторы антигенов, включая CAR, и способы конструирования и введения таких рецепторов в клетки, включают рецепторы антигенов, описанные, например, в публикациях международных патентных заявок номер WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, публикациях патентных заявок США номер US2002131960, US2013287748, US20130149337, патентах США № 6451995, 7446190, 8252592, 8339645, 8398282, 7446179, 6410319, 7070995, 7265209, 7354762, 7446191, 8324353 и 8479118, и патентной заявке Европы номер EP2537416, и/или рецепторы антигенов, описанные Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. В некоторых аспектах рецепторы антигенов включают CAR, как описано в патенте США № 7446190, и рецепторы антигенов, описанные в публикации международной патентной заявки № WO/2014055668 A1. Примеры CAR включают CAR, как описано в любой из вышеупомянутых публикаций, таких как WO2014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США № 7446190, патент США № 8389282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; и Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177). Также см. WO2014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США № 7446190, и патент США № 8389282. Химерные рецепторы, такие как CAR, обычно включают внеклеточный антигенсвязывающий домен, такой как часть молекулы антитела, обычно вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область (VL) легкой цепи антитела, например, scFv-фрагмент антитела.

[131] В некоторых вариантах осуществления антиген, на который нацелен рецептор, представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления он представляет собой углевод или другую молекулу. В некоторых вариантах осуществления антиген селективно экспрессируется или сверхэкспрессируется на клетках, связанных с заболеванием или состоянием, например, на опухолевых или патогенных клетках, по сравнению с нормальными или не являющимися мишенью клетками или тканями. В других вариантах осуществления антиген экспрессируется на нормальных клетках и/или экспрессируется на модифицированных способами инженерии клетках.

[132] В некоторых вариантах осуществления конструируют CAR, обладающий специфичностью к конкретному антигену (или маркеру или лиганду), такому как антиген, экспрессирующийся в конкретном типе клеток, подлежащем нацеливанию посредством адоптивной терапии, например, маркер злокачественной опухоли и/или антиген, предназначенный для индукции торможения ответа, такой как антиген, экспрессирующийся на нормальном или не связанным с заболеванием типе клеток. Таким образом, CAR, как правило, включает в его внеклеточной части одну или несколько антигенсвязывающих молекул, таких как один или несколько антигенсвязывающих фрагментов, доменов или частей, или один или несколько вариабельных доменов антител, и/или молекулы антител. В некоторых вариантах осуществления CAR включает антигенсвязывающую часть или части молекулы антитела, такие как одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), происходящий из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального антитела (mAb).

[133] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть экспрессируется на клетках в качестве части рекомбинантного рецептора, такого как рецептор антигена. Среди рецепторов антигенов представлены функциональные не являющиеся TCR рецепторы антигенов, такие как химерные рецепторы антигенов (CAR). Как правило, CAR, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который демонстрирует TCR-подобную специфичность, направленную против комплексов пептид-MHC, также может обозначаться как TCR-подобный CAR. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенсвязывающий домен, специфичный к комплексу MHC-пептид TCR-подобного CAR, связан с одним или несколькими компонентам внутриклеточной передачи сигнала, в некоторых аспектах через линкеры и/или трансмембранный домен(ы). В некоторых вариантах осуществления такие молекулы, как правило, имитируют или приблизительно соответствуют сигналу через природный рецептор антигенов, такой как TCR, и, необязательно, сигналу через такой рецептор в комбинации с костимулирующим рецептором.

[134] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как химерный рецептор (например, CAR), включает лиганд-связывающий домен, который связывается, например, специфически связывается, с антигеном (или лигандом). Среди антигенов, на которые нацелены химерные рецепторы, представлены антигены, экспрессирующиеся в контексте заболевания, состояния или типа клеток, подлежащих нацеливанию посредством адоптивной клеточной терапии. Среди заболеваний и состояний представлены пролиферативные, неопластические и злокачественные заболевания и нарушения, включая рак и опухоли, включая гематологические злокачественные опухоли, злокачественные опухоли иммунной системы, такие как лимфомы, лейкозы и/или миеломы, такие как B, T и миелоидные лейкозы, лимфомы и множественные миеломы.

[135] В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления он представляет собой углевод или другую молекулу. В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) селективно экспрессируется или сверхэкспрессируется на клетках, связанных с заболеванием или состоянием, например, на опухолевых или патогенных клетках, по сравнению с нормальными или не являющимися мишенями клетками или тканями.

[136] В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv), которые специфически распознают антиген, такой как интактный антиген, экспрессирующийся на поверхности клетки.

[137] В некоторых вариантах осуществления антигены, на которые нацелены рецепторы, представляют собой или включают орфанный рецептор тирозинкиназы ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелин, CEA и поверхностный антиген гепатита B, рецептор фолатов, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 или 4, FBP, фетальный рецептор ацетилхолина, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-альфа, IL-13R-альфа2, kdr, легкую цепь каппа, антиген Льюиса Y, L1-клеточную молекулу адгезии, MAGE-A1, мезотелин, MUC1, MUC16, PSCA, лиганды NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкоэмбриональный антиген, ROR1, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбриональный антиген (CEA), простатспецифический антиген, PSMA, Her2/neu, рецептор эстрогена, рецептор прогестерона, эфрин B2, CD123, c-Met, GD-2, и MAGE A3, CE7, антиген опухоли Вильмса 1 (WT-1), циклин, такой как циклин A1 (CCNA1), сопряженный с G-белком рецептор 5D (GPCR5D) и/или биотинилированные молекулы, и/или молекулы, экспрессируемые ВИЧ, HCV, HBV или другими патогенами.

[138] В определенных вариантах осуществления модифицированная способами инженерии клетка экспрессирует рекомбинантный рецептор и/или CAR, который связывается с антигеном. В конкретных вариантах осуществления антиген представляет собой интегрин αvβ6 (интегрин avb6), антиген созревания B-клеток (BCMA), B7-H3, B7-H6, карбоангидразу 9 (CA9, также известная как CAIX или G250), антиген злокачественной опухоли-яичка, антиген злокачественной опухоли/яичка 1B (CTAG, также известный как NY-ESO-1 и LAGE-2), карциноэмбриональный антиген (CEA), циклин, циклин A2, лиганд 1 хемокина с C-C мотивом (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, белок эпидермального фактора роста (EGFR), укороченный белок эпидермального фактора роста (tEGFR), мутант рецептора эпидермального фактора роста типа III (EGFR vIII), эпителиальный гликопротеин 2 (EPG-2), эпителиальный гликопротеин 40 (EPG-40), эфрин B2, рецептор эфрина A2 (EPHa2), рецептор эстрогена, Fc-рецептор подобного белка 5 (FCRL5; также известный как гомолог 5 Fc-рецептора или FCRH5), фетальный рецептор ацетилхолина (фетальный AchR), фолат-связывающий белок (FBP), рецептор фолатов альфа, фетальный рецептор ацетилхолина, ганглиозид GD2, O-ацетилированный GD2 (OGD2), ганглиозид GD3, гликопротеин 100 (gp100), Her2/neu (рецепторная тирозинкиназа erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), димеры erbB, высокомолекулярный ассоциированный с меланомой антиген человека (HMW-MAA), поверхностный антиген гепатита B, лейкоцитарный антиген A1 человека (HLA-A1), лейкоцитарный антиген A2 человека (HLA-A2), рецептор IL-22 альфа(IL-22Ra), рецептор IL-13 альфа 2 (IL-13Ra2), рецептор домена киназной вставки (kdr), легкую цепь каппа, молекулу клеточной адгезии L1 (L1-CAM), эпитоп CE7 L1-CAM, представитель A семейства 8 белков с лейцин-богатыми повторами (LRRC8A), антиген Льюиса Y, ассоциированный с меланомой антиген (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, мезотелин, c-Met, цитомегаловирус мышей (CMV), муцин 1 (MUC1), MUC16, лиганды представителя D группы 2 натуральных киллеров (NKG2D), мелан A (MART-1), молекулу адгезии нервных клеток (NCAM), онкофетальный антиген, предпочтительно экспрессирующийся антиген меланомы (PRAME), рецептор прогестерона, простатспецифический антиген, антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA), простатспецифический мембранный антиген (PSMA), подобный рецепторной тирозинкиназе орфанный рецептор 1 (ROR1), сурвивин, гликопротеин трофобластов (TPBG, также известный как 5T4), ассоциированный с опухолью гликопротеин 72 (TAG72), рецептор сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGFR), рецептор 2 сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGFR2), антиген опухоли Вильмса 1 (WT-1), сопряженный с G-белком рецептор 5D (GPCR5D), патоген-специфический антиген или антиген, ассоциированный с универсальной меткой, и/или биотинилированные молекулы, и/или молекулы, экспрессируемые ВИЧ, HCV, HBV или другими патогенами. Антигены, на которые нацелены рецепторы, в некоторых вариантах осуществления включают антигены, ассоциированные с B-клеточной злокачественной опухолью, такие как любой из ряда известных B-клеточных маркеров. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой или включает CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig-каппа, Ig-лямбда, CD79a, CD79b или CD30.

[139] В некоторых вариантах осуществления CAR связывает специфический для патогена или экспрессируемый патогеном антиген. В некоторых вариантах осуществления CAR является специфическим для вирусных антигенов (таких как ВИЧ, HCV, HBV, и т.д.), бактериальных антигенов и/или паразитических антигенов.

[140] В некоторых вариантах осуществления CAR содержит TCR-подобное антитело, такое как антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv), которые специфически распознают внутриклеточный антиген, такой как ассоциированный с опухолью антиген, презентируемый на поверхности в качестве комплекса MHC-пептид. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть, которая распознает комплекс MHC-пептид, может экспрессироваться на клетках в качестве части рекомбинантного рецептора, такого как рецептор антигена. Среди рецепторов антигенов представлены функциональные не являющиеся TCR рецепторы антигенов, такие как химерные рецепторы антигена (CAR). Как правило, CAR, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который демонстрирует TCR-подобную специфичность, направленную против комплексов пептид-MHC, также может обозначаться как TCR-подобный CAR.

[141] Указание на "Основной комплекс гистосовместимости" (MHC) относится к белку, главным образом, гликопротеину, который содержит полиморфный пептид-связывающий центр или связывающую бороздку, которая в некоторых случаях может образовывать комплекс с пептидными антигенами полипептидов, включая пептидные антигены, процессируемые клеточным аппаратом. В некоторых случаях молекулы MHC могут экспонироваться или экспрессироваться на клеточной поверхности, в том числе в качестве комплекса с пептидом, т.е. комплекса MHC-пептид, для презентации антигена в конформации, распознаваемой рецептором антигена на T-клетках, таким как TCR или TCR-подобное антитело. Как правило, молекулы MHC класса I представляют собой гетеродимеры, имеющие проходящую через мембрану α-цепь, в некоторых случаях с тремя α-доменами, и нековалентно связанный β2-микроглобулин. Как правило, молекулы MHC класса II состоят из двух трансмембранных гликопротеинов, α и β, оба из которых, как правило, проходят через мембрану. Молекула MHC может включать эффективную часть MHC, которая содержит антигенсвязывающий центр или центры для связывания пептида и последовательностей, необходимых для распознавания соответствующим рецептором антигена. В некоторых вариантах осуществления молекулы MHC класса I доставляют пептиды, образующиеся в цитозоле, на клеточную поверхность, где комплекс MHC-пептид распознается T-клетками, в основном CD8⁺ T-клетками, но в некоторых случаях CD4+ T-клетками. В некоторых вариантах осуществления молекулы MHC класса II доставляют пептиды, образующиеся в везикулярной системе, на клеточную поверхность, где они обычно распознаются CD4⁺ T-клетками. В основном, молекулы MHC кодируются группой связанных локусов, которые в совокупности называются H-2 у мыши и лейкоцитарным антигеном человека (HLA) у человека. Таким образом, обычно MHC человека также может упоминаться как лейкоцитарный антиген человека (HLA).

[142] Термины "комплекс MHC-пептид" или "комплекс пептид-MHC", или их варианты, относятся к комплексу или ассоциации пептидного антигена и молекулы MHC, обычно, путем нековалентных взаимодействий пептида связывающей бороздке или щели молекулы MHC. В некоторых вариантах осуществления комплекс MHC-пептид презентируется или экспонируется на поверхности клеток. В некоторых вариантах осуществления комплекс MHC-пептид может специфически распознаваться рецептором антигена, таким как TCR, TCR-подобный CAR или его антигенсвязывающие части.

[143] В некоторых вариантах осуществления пептид, такой как пептидный антиген или эпитоп, полипептида может ассоциировать с молекулой MHC, например, для распознавания рецептором антигена. Как правило, пептид происходил или основан на фрагменте более длинной биологической молекулы, такой как полипептид или белок. В некоторых вариантах осуществления пептид обычно имеет длину от приблизительно 8 до приблизительно 24 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептид имеет длину от или от приблизительно 9 до 22 аминокислот для распознавания в комплексе с MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления пептид имеет длину от или от приблизительно 8 до 13 аминокислот для распознавания в комплексе с MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления при распознавании пептида в контексте молекулы MHC, таком как комплекс MHC-пептид, рецептор антигена, такой как TCR или TCR-подобный CAR, генерирует или запускает сигнал активации на T-клетках, который индуцирует T-клеточный ответ, такой как пролиферация T-клеток, продукция цитокинов, ответ цитотоксических T-клеток или другой ответ.

[144] В некоторых вариантах осуществления TCR-подобное антитело или антигенсвязывающая часть известны или могут быть получены известными способами (см., например, опубликованные заявки США № US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; и международную публикацию PCT № WO 03/068201).

[145] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающую часть, которые специфически связываются с комплексом MHC-пептид, можно получать путем иммунизации хозяина эффективным количеством иммуногена, содержащего конкретный комплекс MHC-пептид. В некоторых случаях пептид комплекса MHC-пептид представляет собой эпитоп антигена, способного связываться с MHC, такого как опухолевый антиген, например, универсальный опухолевый антиген, антиген миеломы или другой антиген, как описано ниже. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество иммуногена затем вводят хозяину для индукции иммунного ответа, где иммуноген сохраняет его трехмерную форму в течение периода времени, достаточного для индукции иммунного ответа против трехмерной конфигурации пептида в связывающей бороздке молекулы MHC. Затем сыворотку, полученную от хозяина, анализируют для определения того, продуцируются ли требуемые антитела, которые распознают трехмерную конфигурацию пептида в связывающей бороздке молекулы MHC. В некоторых вариантах осуществления продуцированные антитела можно оценивать для подтверждения того, что антитело может отличать комплекс MHC-пептид от молекулы MHC отдельно, представляющего интерес пептида отдельно и комплекса MHC и постороннего пептида. Затем требуемые антитела можно выделять.

[146] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающую часть, которая специфически связывается с комплексом MHC-пептид, можно получать с использованием способов дисплея на библиотеках, таких как фаговые библиотеки антител. В некоторых вариантах осуществления можно получать, например, библиотеки фагового дисплея мутантного Fab, scFv или других форм антител, в которых представители библиотеки являются мутантными по одному или нескольким остаткам CDR или нескольких CDR. См., например, опубликованную заявку США № US20020150914, US2014/0294841; и Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332.

[147] Термин "антитело" в рамках настоящего изобретения используют в наиболее широком значении, и он включает поликлональные и моноклональные антитела, включая интактные антитела и функциональные (антигенсвязывающие) фрагменты антител, включая антигенсвязывающие (Fab) фрагменты, F(ab')₂-фрагменты, Fab'-фрагменты, Fv-фрагменты, рекомбинантные IgG (rIgG)-фрагменты, вариабельные области тяжелой цепи (V_H), способные специфически связывать антиген, одноцепочечные фрагменты антител, включая одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), и фрагменты в виде однодоменных антител (например, sdAb, sdFv, наноантитело). Термин охватывает модифицированные способами генной инженерии и/или иным образом модифицированные формы иммуноглобулинов, такие как интраантитела, пептиантитела, химерные антитела, полностью человеческие антитела, гуманизированные антитела и гетероконъюгированные антитела, полиспецифические, например, биспецифические антитела, диантитела, триантитела и тетраантитела, тандемные ди-scFv, тандемные три-scFv. Если нет иных указаний, термин "антитело" следует понимать как охватывающее функциональные фрагменты антител. Также термин охватывает интактные или полноразмерные антитела, включая антитела любого класса или подкласса, включая IgG и его подклассы, IgM, IgE, IgA и IgD.

[148] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие белки, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты специфически распознают антиген полноразмерного антитела. В некоторых вариантах осуществления тяжелые и легкие цепи антитела могут быть полноразмерными или могут представлять собой антигенсвязывающую часть (Fab, F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv)). В других вариантах осуществления константную область тяжелой цепи антитела выбирают, например, из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE, в частности, выбирают из, например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, более конкретно, IgG1 (например, IgG1 человека). В другом варианте осуществления константную область легкой цепи антитела выбирают, например, из каппа или лямбда, в частности, каппа.

[149] К предусматриваемым антителам относятся фрагменты антител. "Фрагмент антитела" относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диантитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В конкретных вариантах осуществления антитела представляют собой одноцепочечные фрагменты антител, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, такие как scFv.

[150] Термин "вариабельная область" или "вариабельный домен" относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который вовлечен в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (V_H и V_L, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативных каркасных области (FR) и три CDR (см., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). Одного домена V_H или V_L может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. Более того, антитела, которые связывают конкретный антиген, можно выделять с использованием домена V_H или V_L из антитела, которое связывает антиген, для скрининга библиотеки комплементарных доменов V_L или V_H, соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

[151] Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В определенных вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело человека. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит домен тяжелой цепи антитела, который специфически связывает антиген, такой как маркер злокачественной опухоли или антиген клеточной поверхности клетки или заболевания, подлежащих нацеливанию, таких как опухолевая клетка или злокачественная клетка, такой как любой из описанных в настоящем описании или известных антигенов-мишеней.

[152] Фрагменты антител можно получать различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продукцию рекомбинантными клетками-хозяевами. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой фрагменты, полученные рекомбинантными способами, такие как фрагменты, содержащие расположение элементов, которое не встречается в природе, такие как фрагменты, в которых две или более областей или цепей антитела соединены синтетическими линкерами, например, пептидными линкерами, и/или которые не могут быть получены расщеплением ферментом встречающегося в природе интактного антитела. В некоторых аспектах, фрагменты антител представляют собой scFv.

[153] "Гуманизированное" антитело представляет собой антитело, в котором все или по существу все аминокислотные остатки CDR происходят из не являющихся человеческими CDR и все или по существу все аминокислотные остатки FR происходят из FR человека. Гуманизированное антитело необязательно может включать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящую из антитела человека. "Гуманизированная форма" не являющегося человеческим антитела относится к варианту не являющегося человеческим антитела, который претерпел гуманизацию, как правило, для уменьшения иммуногенности у человека, при сохранении специфичности и аффинности исходного не являющегося человеческим антитела. В некоторых вариантах осуществления некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками из не являющегося человеческим антитела (например, антитело, из которого происходят остатки CDR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

[154] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления химерный рецептор антигена, в том числе TCR-подобные CAR, включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент включает scFv. В некоторых аспектах химерный рецептор антигена включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент, и внутриклеточную сигнальную область. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен представляет собой или содержит первичный сигнальный домен, сигнальный домен, который способен индуцировать первичную активацию сигнала в T-клетке, сигнальный домен компонента T-клеточного рецептора (TCR), и/или сигнальный домен, содержащий иммунорецепторный активирующий мотив на основе тирозина (ITAM).

[155] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как CAR, включающий антительную часть рекомбинантного рецептора, например CAR, дополнительно включает по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, такую как шарнирная область, например, шарнирная область IgG4, и/или C_H1/C_L и/или Fc-область. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как CAR, включая чего антительную часть, дополнительно включает спейсер, который может представлять собой или может включать по меньшей мере часть константной области или варианта иммуноглобулина, или его вариант или модифицированную версию, такую как шарнирная область, например, шарнирная область IgG4, и/или C_H1/C_L и/или Fc-область. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор дополнительно содержит спейсер и/или шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть представляет собой IgG человека, такой как IgG4 или IgG1. В некоторых аспектах часть константной области служит в качестве спейсерной области между распознающим антиген компонентом, например scFv, и трансмембранным доменом. Спейсер может иметь длину, которая обеспечивает увеличенную способность клетки к ответу после связывания антигена по сравнению с отсутствием спейсера. Иллюстративные спейсеры, например, шарнирные области, включают спейсеры, описанные в публикации международной патентной заявки номер WO2014031687. В некоторых примерах спейсер имеет длину ровно или приблизительно 12 аминокислот или не более 12 аминокислот. Иллюстративные спейсеры включают спейсеры, имеющие по меньшей мере приблизительно от 10 до 229 аминокислот, приблизительно от 10 до 200 аминокислот, приблизительно от 10 до 175 аминокислот, приблизительно от 10 до 150 аминокислот, приблизительно от 10 до 125 аминокислот, приблизительно от 10 до 100 аминокислот, приблизительно от 10 до 75 аминокислот, приблизительно от 10 до 50 аминокислот, приблизительно от 10 до 40 аминокислот, приблизительно от 10 до 30 аминокислот, приблизительно от 10 до 20 аминокислот, или приблизительно от 10 до 15 аминокислот, и включая любое целое число между конечными величинами любого из перечисленных диапазонов. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область имеет приблизительно 12 аминокислот или менее, приблизительно 119 аминокислот или менее, или приблизительно 229 аминокислот или менее. Иллюстративные спейсеры включают шарнирную область IgG4 отдельно, шарнирную область IgG4, связанную с доменами C_H2 и C_H3, или шарнирную область IgG4, связанную с доменом C_H3. Иллюстративные спейсеры включают, но не ограничиваются ими, спейсеры, описанные в Hudecek et al., (2013), Clin. Cancer Res., 19:3153, публикации международной патентной заявки номер WO2014031687, патенте США № 8822647 или опубликованной заявке № US2014/0271635.

[156] В некоторых вариантах осуществления константная область или часть представляет собой IgG человека, такой как IgG4 или IgG1. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность ESKYGPPCPPCP (указанную в SEQ ID NO: 1), и кодируется последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть происходят из IgD. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 4 или 5. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26-34. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 26-34.

[157] Антигенраспознающий домен обычно связан с одним или несколькими внутриклеточными сигнальными компонентами, такими как сигнальные компоненты, которые имитируют активацию через рецепторный комплекс для антигена, такой как комплекс TCR, в случае CAR, и/или передает сигнал через другой рецептор клеточной поверхности. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий компонент (например, антитело) связан с одним или несколькими трансмембранными или внутриклеточными сигнальными доменами или областями. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен слит с внеклеточным доменом. В одном варианте осуществления используют трансмембранный домен, который в природе ассоциирован с одним из доменов в рецепторе, например CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен выбирают или модифицируют посредством аминокислотной замены, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или отличающихся поверхностных мембранных белков, чтобы минимизировать взаимодействия с другими членами рецепторного комплекса.

[158] В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен происходит либо из природного, либо из синтетического источника. Когда источник является природным, в некоторых аспектах домен происходит из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные области включают области, происходящие из (т.е. содержат по меньшей мере трансмембранную область(и) из) альфа, бета или зета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Альтернативно в некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен является синтетическим. В некоторых аспектах синтетический трансмембранный домен содержит преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых аспектах, триплет фенилаланина, триптофана и валина находится на каждом конце синтетиеского трансмембранного домена. В некоторых вариантах осуществления связывание осуществляется посредством линкеров, спейсеров и/или трансмембранного домена(ов).

[159] Среди внутриклеточных сигнальных доменов или областей представлены те, которые имитируют или приблизительно соответствуют сигналу через природный рецептор антигена, сигналу через такой рецептор в комбинации с костимулирующим рецептором и/или сигналу через костимулирующий рецептор отдельно. В некоторых вариантах осуществления присутствует короткий олиго- или полипептидный линкер, например, линкер длиной от 2 до 10 аминокислот, такой как линкер, содержащий остатки глицина и серина, например, дублет глицин-серин, и он образует связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом или областью CAR.

[160] Рецептор, например CAR, обычно включает по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный компонент или компоненты. В некоторых вариантах осуществления рецептор включает внутриклеточный компонент комплекса TCR, такой как цепь CD3 TCR, которая опосредует активацию T-клеток и цитотоксичность, например, зета-цепь CD3. Таким образом, в некоторых аспектах антигенсвязывающая часть связана с одним или несколькими передающими сигнал модулями клеток. В некоторых вариантах осуществления передающие сигнал модули клеток включают трансмембранный домен CD3, внутриклеточные сигнальные домены CD3 и/или другие трансмембранные домены CD. В некоторых вариантах осуществления рецептор, например CAR, дополнительно включает часть одной или нескольких дополнительных молекул, такую как Fc-рецептор γ, CD8, CD4, CD25 или CD16. Например, в некоторых аспектах CAR или другой химерный рецептор включает химерную молекулу между CD3-зета (CD3-ζ) или Fc-рецептором γ и CD8, CD4, CD25 или CD16.

[161] В некоторых вариантах осуществления при связывании CAR или другого химерного рецептора цитоплазматический домен или внутриклеточные сигнальные домены или области рецептора активируют по меньшей мере одну из нормальных эффекторных функций или ответов иммунных клеток, например, T-клеток, модифицированных для экспрессии CAR. Например, в некоторых контекстах CAR индуцирует функцию T-клеток, такую как цитолитическая активность или T-хелперная активность, такая как секреция цитокинов или других факторов. В некоторых вариантах осуществления вместо интактной иммуностимулирующей цепи используют укороченную часть внутриклеточного сигнального домена или области рецепторного компонента антигена или костимулирующей молекулы, например, если она передает сигнал эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен, или домены, или области включают цитоплазматические последовательности T-клеточного рецептора (TCR) и в некоторых аспектах также последовательности корецепторов, которые в естественных условиях действуют совместно с такими рецепторами, инициируя передачу сигнала после связывания рецептора антигена, и/или любое производное или вариант таких молекул, и/или любую синтетическую последовательность, которая обладает той же функциональной способностью.

[162] В контексте природного TCR, полная активация обычно требует не только передачи сигнала через TCR, но также костимулирующего сигнала. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления для обеспечения полной активации также в CAR включен компонент для генерирования вторичного или костимулирующего сигнала. В других вариантах осуществления CAR не включает компонент для генерирования костимулирующего сигнала. В некоторых аспектах дополнительный CAR экспрессируется в той же клетке и обеспечивает компонент для вторичного или костимулирующего сигнала.

[163] Активация T-клеток в некоторых аспектах описывается как опосредуемая двумя классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: последовательностями, которые инициируют антигензависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и последовательностями, которые действуют антигеннезависимым образом для обеспечения вторичного или костимулирующего сигнала (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). В некоторых аспектах CAR включает один или оба из таких сигнальных компонентов.

[164] В некоторых аспектах CAR включает первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, которая регулирует первичную активацию комплекса TCR. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны в качестве иммунорецепторных активирующих мотивов на основе тирозина, или ITAM. Примеры ITAM, содержащих первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, включают ITAM, происходящие из TCR-зета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD8, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматическая сигнальная молекула(ы) в CAR содержит(содержат) цитоплазматический сигнальный домен или область, их часть, или последовательность, происходящую из CD3-зета.

[165] В некоторых вариантах осуществления CAR включает сигнальный домен или область, и/или трансмембранную часть костимулирующего рецептора, такого как CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 и ICOS. В некоторых аспектах тот же CAR включает как активирующие, так и костимулирующие компоненты.

[166] В некоторых вариантах осуществления активирующий домен включен в один CAR, в то время как костимулирующий компонент предоставляется другим CAR, распознающим другой антиген. В некоторых вариантах осуществления CAR включают активирующие или стимулирующие CAR и костимулирующие CAR, оба из которых экспрессируются на одной клетке (см. WO2014/055668). В некоторых аспектах клетки включают один или несколько стимулирующих или активирующих CAR и/или костимулирующих CAR. В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно включают ингибиторные CAR (iCAR, см. Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (декабрь 2013 года), такие как CAR, распознающие антиген, отличный от антигена, ассоциированного с и/или специфического для заболевания или состояния, причем активирующий сигнал, доставляемый через нацеленный на заболевание CAR, уменьшается или ингибируется посредством связывания ингибиторного CAR с его лигандом, например, для уменьшения неспецифических эффектов.

[167] В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит трансмембранный и сигнальный домен CD28, связанный с внутриклеточным доменом CD3 (например, CD3-зета). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит химерные костимулирующие домены CD28 и CD137 (4-1BB, TNFRSF9), связанные с внутриклеточным доменом CD3-зета.

[168] В некоторых вариантах осуществления CAR охватывает один или несколько, например, два или более, костимулирующих доменов и домен активации, например, первичный домен активации, в цитоплазматической части. Иллюстративные CAR включают внутриклеточные компоненты CD3-зета, CD28 и 4-1BB.

[169] В некоторых вариантах осуществления CAR или другой рецептор антигена, кроме того, включает маркер, такой как маркер клеточной поверхности, который можно использовать для подтверждения трансдукции или модификации способами инженерии клетки для экспрессии рецептора, такого как укороченная версия рецептора клеточной поверхности, такого как EGFR (tEGFR). В некоторых аспектах маркер включает весь или часть (например, укороченную форму) CD34, NGFR или рецептора эпидермального фактора роста (например, tEGFR). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая маркер, функционально связана с полинуклеотидом, кодирующим линкерную последовательность, такую как расщепляемая линкерная последовательность, например T2A. Например, маркер и необязательно линкерная последовательность могут быть любыми, как описано в публикации международной патентной заявки № WO2014031687. Например, маркер может представлять собой укороченный EGFR (tEGFR), который необязательно связан с линкерной последовательностью, такой как расщепляемая линкерная последовательность T2A. Иллюстративный полипептид для укороченного EGFR (например, tEGFR) содержит последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 7 или 16, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 7 или 16. Иллюстративная линкерная последовательность T2A содержит последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 6 или 17, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью с SEQ ID NO: 6 или 17.

[170] В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой молекулу, например, белок клеточной поверхности, которая естественным образом не встречается на T-клетках или естественным образом не встречается на поверхности T-клеток, или их часть. В некоторых вариантах осуществления молекула представляет собой не собственную молекулу, например, не собственный белок, т.е. белок, который не распознается как "собственный" иммунной системой хозяина, которому клетки вводят посредством адоптивного переноса.

[171] В некоторых вариантах осуществления маркер не выполняет терапевтическую функцию и/или не дает эффекта, отличного от эффекта, используемого для генной инженерии, например, для селекции клеток, успешно модифицированных. В других вариантах осуществления маркер может представлять собой терапевтическую молекулу или молекулу, проявляющую иной желаемый эффект, такую как лиганд для клетки, встречающейся in vivo, такой как костимулирующая молекула или молекула иммунной точки контроля, для усиления и/или торможения ответов клеток при адоптивном переносе и встрече с лигандом.

[172] В некоторых случаях CAR упоминаются как CAR первого, второго и/или третьего поколения. В некоторых аспектах, CAR первого поколения представляет собой CAR, который только обеспечивает индуцируемый CD3-целью сигнал при связывании антигена; в некоторых аспектах CAR второго поколения представляет собой CAR, который обеспечивает такой сигнал и костимулирующий сигнал, такой как CAR, который включает внутриклеточный сигнальный домен из костимулирующего рецептора, такого как CD28 или CD137; в некоторых аспектах CAR третьего поколения представляет собой CAR, который включает множество костимулирующих доменов различных костимулирующих рецепторов.

[173] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор антигена включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент антитела. В некоторых аспектах химерный рецептор антигена включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент, и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент включает scFv, и внутриклеточный домен содержит ITAM. В некоторых аспектах внутриклеточный сигнальный домен включает сигнальный домен зета-цепи CD3 (CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор антигена включает трансмембранный домен, связывающий внеклеточный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых аспектах трансмембранный домен содержит трансмембранную часть CD28. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор антигена содержит внутриклеточный домен костимулирующей молекулы для T-клеток. Внеклеточный домен и трансмембранный домен могут быть связаны прямо или непрямо. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен и трансмембранный домен связаны спейсером, таким как любой спейсер, описанный в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления рецептор содержит внеклеточную часть молекулы, из которой происходит трансмембранный домен, такую как внеклеточная часть CD28. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор антигена содержит внутриклеточный домен, происходящий из костимулирующей молекулы для T-клеток, или его функциональный вариант, например, между трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых аспектах костимулирующая молекула для T-клеток представляет собой CD28 или 41BB.

[174] В некоторых вариантах осуществления scFv происходит из FMC63. FMC63 представляет собой моноклональное IgG1-антитело мыши, индуцированное против клеток Nalm-1 и -16, экспрессирующих CD19 человека (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). Антитело FMC63 содержит CDRH1 и H2, указанные в SEQ ID NO: 38 и 39, соответственно, и CDRH3, указанную в SEQ ID NO: 40 или 54, и CDRL1, указанную в SEQ ID NO: 35, и CDR L2, указанную в SEQ ID NO: 36 или 55, и CDR L3, указанную в SEQ ID NO: 37 или 56. Антитело FMC63 содержит вариабельную область тяжелой цепи (V_H), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и вариабельную область легкой цепи (V_L) содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления svFv содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1, указанную в SEQ ID NO: 35, CDRL2, указанную в SEQ ID NO: 36 или 55, и CDRL3, указанную в SEQ ID NO: 37 или 56, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRH1, указанную в SEQ ID NO:38, CDRH2, указанную в SEQ ID NO:39, и CDRH3, указанную в SEQ ID NO:40 или 54. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит вариабельную область тяжелой цепи FMC63, указанную в SEQ ID NO:41, и вариабельную область легкой цепи FMC63, указанную в SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи соединены линкером. В некоторых вариантах осуществления линкер является таким, как указано в SEQ ID NO:24. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VH, линкер и VL в данном порядке. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VL линкер и VH в данном порядке. В некоторых вариантах осуществления svFc кодируется последовательностью нуклеотидов, указанной в SEQ ID NO:25, или последовательностью, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:25. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO:43, или последовательность, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 43.

[175] В некоторых вариантах осуществления scFv происходит из SJ25C1. SJ25C1 представляет собой моноклональное IgG1-антитело мыши, индуцированное против клеток Nalm-1 и -16, экспрессирующих CD19 человека (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). Антитело SJ25C1 содержит CDRH1, H2 и H3, указанные в SEQ ID NO: 47-49, соответственно, и последовательности CDRL1, L2 и L3, указанные в SEQ ID NO: 44-46, соответственно. Антитело SJ25C1 содержит вариабельную область тяжелой цепи (V_H), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и вариабельную область легкой цепи (V_L), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления svFv содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1, указанную в SEQ ID NO: 44, CDRL2, указанную в SEQ ID NO: 45, и CDRL3, указанную в SEQ ID NO:46, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRH1, указанную в SEQ ID NO: 47, CDRH2, указанную в SEQ ID NO: 48, и CDRH3, указанную в SEQ ID NO:49. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит вариабельную область тяжелой цепи SJ25C1, указанную в SEQ ID NO:50, и вариабельную область легкой цепи SJ25C1, указанную в SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи соединены линкером. В некоторых вариантах осуществления линкер является таким, как указано в SEQ ID NO:52. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VH, линкер и VL в данном порядке. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VL, линкер и VH в данном порядке. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO:53, или последовательность, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:53.

[176] Например, в некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например, фрагмент антитела, трансмембранный домен, который представляет собой или содержит трансмембранную часть CD28 или ее функциональный вариант, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальную часть CD28 или ее функциональный вариант, и сигнальную часть CD3-зета или ее функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например, фрагмент антитела, трансмембранный домен, который представляет собой или содержит трансмембранную часть CD28 или ее функциональный вариант, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальную часть 4-1BB или ее функциональный вариант, и сигнальную часть CD3-зета или ее функциональный вариант. В некоторых таких вариантах осуществления рецептор дополнительно включает спейсер, содержащий часть молекулы Ig, такой как молекула Ig человека, такая как шарнирная область Ig, например, шарнирная область IgG4, такой как спейсер только из шарнирной области.

[177] В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен рекомбинантного рецептора, например CAR, представляет собой или включает трансмембранный домен CD28 человека (например, номер доступа № P01747.1) или его вариант, такой как трансмембранный домен, который содержит последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 8, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 8; в некоторых вариантах осуществления содержащая трансмембранный домен часть рекомбинантного рецептора содержит последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 9, или последовательность аминокислот, обладающую по меньшей мере ровно или приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательностью с ней, или такую как трансмембранный домен CD28 человека из 27 аминокислот.

[178] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор антигена содержит внутриклеточный домен костимулирующей молекулы для T-клеток. В некоторых аспектах костимулирующая молекула для T-клеток представляет собой CD28 или 4-1BB.

[179] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или область, область или компонент(ы) рекомбинантного рецептора, например CAR, содержит внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен или область CD28 человека или его функциональный вариант или часть, такой как домен или область с заменой LL на GG в положениях 186-187 нативного белка CD28. Например, в некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или область может содержать последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 10 или 11, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10 или 11. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен или область содержит внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен или область 4-1BB (например, № доступа Q07011.1) или его функциональный вариант или часть, такие как последовательность аминокислот, указанная в SEQ ID NO: 12, или последовательность аминокислот, обладающая по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 12, или такие как цитоплазматический домен 4-1BB человека из 42 аминокислот.

[180] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или область рекомбинантного рецептора, например CAR, содержит цепь зета CD3 человека, необязательно ее стимулирующий сигнальный домен или область или их функциональный вариант, такой как цитоплазматический домен или область изоформы 3 CD3ζ человека из 112 а.к. (номер доступа № P20963.2) или сигнальный домен или область CD3-зета, как описано в патенте США № 7446190 или патенте США № 8911993. Например, в некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или область содержит последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 13, 14 или 15, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 13, 14 или 15.

[181] В некоторых аспектах спейсер содержит только шарнирную область IgG, такую как только шарнирная область IgG4 или IgG1, например, спейсер только с шарнирной областью, указанный в SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления спейсер представляет собой или содержит шарнирную область Ig, например, происходящую из IgG4 шарнирную область, необязательно связанную с доменами C_H2 и/или C_H3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнирную область Ig, например, шарнирную область IgG4, связанную с доменами C_H2 и C_H3, как указано в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнирную область Ig, например, шарнирную область IgG4, связанную только с доменом C_H3, например, как указано в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой или содержит глицин-серин-богатую последовательность или другой гибкий линкер, такой как известные гибкие линкеры.

[182] Например, в некоторых вариантах осуществления CAR включает антитело, такое как фрагмент антитела, включая scFv, спейсер, такой как спейсер, содержащий часть молекулы иммуноглобулина, такую как шарнирная область и/или одна или несколько константных областей молекулы тяжелой цепи, такой как спейсер, содержащий шарнирную область Ig, трансмембранный домен, содержащий все или часть происходящего из CD28 трансмембранного домена, происходящий из CD28 внутриклеточный сигнальный домен и сигнальный домен CD3-зета. В некоторых вариантах осуществления CAR включает антитело или фрагмент, такой как scFv, спейсер, такой как любой из спейсеров, содержащих шарнирную область Ig, происходящий из CD28 трансмембранный домен, происходящий из 4-1BB внутриклеточный сигнальный домен и происходящий из CD3-зета сигнальный домен.

[183] В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие конструкции CAR, дополнительно включают последовательность, кодирующую элемент рибосомального пропускания T2A и/или последовательность tEGFR, например, ниже последовательности, кодирующей CAR. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодирует элемент рибосомального пропускания T2A, указанный в SEQ ID NO: 6 или 17, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6 или 17. В некоторых вариантах осуществления также можно получать T-клетки, экспрессирующие рецептор антигена (например, CAR), для экспрессии укороченного EGFR (EGFRt) в качестве неиммуногенного селективного эпитопа (например, путем внесения конструкции, кодирующей CAR и EGFRt, разделенные рибосомальным переключателем T2A, для экспрессии двух белков с одной конструкции), который затем можно использовать в качестве маркера для обнаружения таких клеток (см., например, патент США № 8802374). В некоторых вариантах осуществления последовательность кодирует последовательность tEGFR, указанную в SEQ ID NO: 7 или 16, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 7 или 16.

[184] Рекомбинантные рецепторы, такие как CAR, экспрессируемые клетками, введенными индивидууму, обычно распознают или специфически связывают молекулу, которая экспрессируется в, ассоциирована с и/или является специфической для заболевания или состояния, которые подвергают лечению, или связанными с ними клетками. При специфическом связывании с молекулой, например, антигеном, рецептор обычно доставляет иммуностимулирующий сигнал, такой как передаваемый через ITAM сигнал, в клетку, тем самым стимулируя иммунный ответ, нацеленный на заболевание или состояния. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки экспрессируют CAR, который специфически связывается с антигеном, экспрессируемым клеткой или тканью, пораженной заболеванием или состоянием или связанной с заболеванием или состоянием.

2. T-клеточные рецепторы (TCR)

[185] В некоторых вариантах осуществления предусматриваются модифицированные способами инженерии клетки, такие как T-клетки, которые экспрессируют T-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающую часть, которые распознают пептидный эпитоп или T-клеточный эпитоп полипептида-мишени, такого как антиген опухоли, вирусный или аутоиммунный белок.

[186] В некоторых вариантах осуществления "T-клеточный рецептор" или "TCR" представляет собой молекулу, которая содержит вариабельные цепи α и β (также известные как TCRα и TCRβ, соответственно) или вариабельные цепи γ и δ (также известные как TCRα и TCRβ, соответственно), или их антигенсвязывающую часть, и которая способна специфически связываться с пептидом, связанным с молекулой MHC. В некоторых вариантах осуществления TCR имеет форму αβ. Как правило, TCR, которые существуют в формах αβ и γδ, являются структурно сходными, однако T-клетки, экспрессирующие их, могут иметь различные анатомические положения или функции. TCR может находиться на поверхности клетки или может быть в растворимой форме. Как правило, TCR находится на поверхности T-клеток (или T-лимфоцитов), где он обычно ответственен за распознавание антигенов, связанных с молекулами основного комплекса гистосовместимости (MHC).

[187] Если нет иных указаний, термин "TCR" следует интерпретировать как охватывающий полные TCR, а также их антигенсвязывающие части или антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой интактный или полноразмерный TCR, включая TCR в форме αβ или в форме γδ. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой антигенсвязывающую часть, которая является меньшей, чем полноразмерный TCR, но которая связывается со специфическим пептидом, связанным с молекулой MHC, т.е. связывается с комплексом MHC-пептид. В некоторых случаях антигенсвязывающая часть или фрагмент TCR может содержать только часть структурных доменов полноразмерного или интактного TCR, но, тем не менее, способна связывать эпитоп пептида, такой как комплекс MHC-пептид, с которым связывается полный TCR. В некоторых случаях антигенсвязывающая часть содержит вариабельные домены TCR, такие как вариабельная цепь α и вариабельная цепь β TCR, достаточные для образования связывающего участка для связывания со специфическим комплексом MHC-пептид. Как правило, вариабельные цепи TCR содержат определяющие комплементарность области, вовлеченные в распознавание пептида, MHC и/или комплекса MHC-пептид.

[188] В некоторых вариантах осуществления вариабельные домены TCR содержат гипервариабельные петли или определяющие комплементарность области (CDR), которые обычно вносят основной вклад в распознавание антигена и способность к связыванию и его специфичность. В некоторых вариантах осуществления CDR TCR или их комбинация формирует весь или по существу весь антигенсвязывающий центр данной молекулы TCR. Различные CDR в вариабельной области цепи TCR обычно разделены каркасными областями (FR), которые обычно демонстрируют меньшую вариабельность среди молекул TCR по сравнению с CDR (см., например, Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; также см. Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). В некоторых вариантах осуществления CDR3 представляет собой основной CDR, ответственный за связывание антигена или специфичность к нему, или является наиболее важным среди трех CDR на данной вариабельной области TCR для распознавания антигена и/или для взаимодействия с процессированной пептидной частью комплекса пептид-MHC. В некоторых контекстах CDR1 альфа-цепи может взаимодействовать с N-концевой частью определенных антигенных пептидов. В некоторых контекстах CDR1 бета-цепи может взаимодействовать с C-концевой частью пептида. В некоторых контекстах CDR2 вносит наибольший вклад или является основным CDR, ответственным за взаимодействие с или распознавание MHC-частью комплекса MHC-пептид. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область β-цепи может содержать дополнительную гипервариабельную область (CDR4 или HVR4), которая обычно вовлечена в связывание суперантигена и не вовлечена в распознавание антигена (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).

[189] В некоторых вариантах осуществления TCR также может содержать константный домен, трансмембранный домен и/или короткую цитоплазматическую хвостовую часть (см., например, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). В некоторых аспектах каждая цепь TCR может обладать N-концевым вариабельным доменом иммуноглобулина, одним константным доменом иммуноглобулина, трансмембранной областью и короткой цитоплазматической хвостовой частью на C-конце. В некоторых вариантах осуществления TCR ассоциирован с инвариантными белками комплекса CD3, вовлеченного в опосредование передачи сигнала.

[190] В некоторых вариантах осуществления TCR-цепь содержит один или несколько константных доменов. Например, внеклеточная часть данной цепи TCR (например, α-цепи или β-цепи) может содержать два иммуноглобулин-подобных домена, таких как вариабельный домен (например, Vα или Vβ; как правило, аминокислоты с 1 по 116 на основе нумерации по Kabat, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.) и константный домен (например, константный домен α-цепи или Cα, обычно положения с 117 по 259 цепи на основе нумерации Kabat, или константный домен β-цепи или Cβ, обычно положения с 117 по 295 цепи на основе Kabat) рядом с клеточной мембраной. Например, в некоторых случаях внеклеточная часть TCR, образованная двумя цепями, содержит два наиболее близких к мембране константных домена и два наиболее отдаленных от мембраны вариабельных домена, каждый из которых содержит CDR. Константный домен TCR может содержать короткие соединяющие последовательности, в которых остаток цистеина образует дисульфидную связь, тем самым связывая две цепи TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR может иметь дополнительный остаток цистеина в каждой из цепей α и β, так что TCR содержит две дисульфидных связи в константных доменах.

[191] В некоторых вариантах осуществления цепи TCR содержат трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен является положительно заряженным. В некоторых случаях цепь TCR содержит цитоплазматическую хвостовую часть. В некоторых случаях структура позволяет TCR ассоциировать с другими молекулами, такими как CD3, и их субъединицами. Например, TCR, содержащий константные домены с трансмембранной областью, может заякоривать белок на клеточной мембране и связываться с инвариантными субъединицами аппарата или комплекса передачи сигнала CD3. Внутриклеточные хвостовые части сигнальных субъединиц CD3 (например, цепи CD3γ, CD3δ, CD3ε и CD3ζ) содержат один или несколько иммунорецепторных активирующих мотивов на основе тирозина или ITAM, которые вовлечены в способность комплекса TCR передавать сигнал.

[192] В некоторых вариантах осуществления TCR может представлять собой гетеродимер двух цепей α и β (или необязательно γ и δ), или он может представлять собой одноцепочечную конструкцию TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой гетеродимер, содержащий две отдельных цепи (цепи α и β или цепи γ и δ), которые связаны, например, дисульфидной связью или дисульфидными связями.

[193] В некоторых вариантах осуществления TCR можно получать из известной последовательности(ей) TCR, такой как последовательности цепей Vα,β, полная кодирующая последовательность которых по существу легко доступна. Способы получения полноразмерных последовательностей TCR, включая последовательности V-цепи, из клеточных источников хорошо известны. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие TCR, можно получать из различных источников, например, путем амплификации с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) кодирующих TCR нуклеиновых кислот, находящихся в данной клетке или клетках или выделенных из данной клетки или клеток, или синтез общедоступных последовательностей ДНК TCR.

[194] В некоторых вариантах осуществления TCR получают из биологического источника, например, из T-клетки (например, цитотоксическая T-клетка), T-клеточной гибридомы или другого общедоступного источника. В некоторых вариантах осуществления T-клетки можно получать из клеток, выделенных in vivo. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой TCR, подвернутый селекции в тимусе. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой TCR рестриктированный по неоэпитопам. В некоторых вариантах осуществления T-клетки могут представлять собой культивируемую T-клеточную гибридому или клон. В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающую часть можно получать способами синтеза, зная последовательность TCR.

[195] В некоторых вариантах осуществления TCR получают из TCR, идентифицированного или отобранного в результате скрининга библиотеки TCR-кандидатов против полипептида-антигена, являющегося мишенью, или его T-клеточного эпитопа, являющегося мишенью. Библиотеки TCR можно получать путем амплификации репертуара Vα и Vβ из выделенных T-клеток от индивидуума, включая клетки, присутствующие в PBMC, селезенке или другом лимфоидном органе. В некоторых случаях T-клетки можно увеличивать в количестве из инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL). В некоторых вариантах осуществления можно получать библиотеки TCR из CD4+ или CD8+ клеток. В некоторых вариантах осуществления TCR можно амплифицировать из источника T-клеток нормального здорового индивидуума, т.е. библиотек нормального TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR можно амплифицировать из источника T-клеток индивидуума, страдающего заболеванием, т.е. библиотек связанного с заболеванием TCR. В некоторых вариантах осуществления используют вырожденные праймеры для амплификации репертуара генов Vα и Vβ, например, посредством ОТ-ПЦР, в образцах, таких как T-клетки, полученные от человека. В некоторых вариантах осуществления библиотеки scTv можно собирать из библиотек наивных Vα и Vβ, в которых амплифицированные продукты клонированы или собраны так, чтобы они были разделены линкером. В зависимости от индивидуума и источника клеток, библиотеки могут быть специфическими в отношении HLA-аллеля. Альтернативно в некоторых вариантах осуществления библиотеки TCR можно получать путем мутагенеза или диверсификации исходной или каркасной молекулы TCR. В некоторых аспектах TCR подвергают направленной эволюции, например, посредством мутагенеза, например, цепи α или β. В некоторых аспектах, изменяют конкретные остатки в CDR TCR. В некоторых вариантах осуществления выбранные TCR можно модифицировать посредством созревания аффинности. В некоторых вариантах осуществления можно выбирать антигенспецифические T-клетки, например, посредством скрининга для оценки активности CTL против пептида. В некоторых аспектах, TCR, например, присутствующие на антигенспецифических T-клетках, можно отбирать, например, по активности связывания, например, специфической аффинности или авидности в отношении антигена.

[196] В некоторых вариантах осуществления модифицированные способами генной инженерии рецепторы антигенов включают рекомбинантные T-клеточные рецепторы (TCR) и/или TCR, клонированные из встречающихся в природе T-клеток. В некоторых вариантах осуществления идентифицируют клон высокоаффинных T-клеток для выделенного антигена-мишени (например, антигена злокачественной опухоли) от пациента, и вводят в клетки. В некоторых вариантах осуществления клон TCR для антигена-мишени получают у трансгенных мышей, которым встроены способами инженерии гены иммунной системы человека (например, система лейкоцитарного антигена человека, или HLA). См., например, опухолевые антигены (см., например, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 и Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808). В некоторых вариантах осуществления для выделения TCR против антигена-мишени используют фаговый дисплей (см., например, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395 и Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354).

[197] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающая часть представляет собой TCR или его антигенсвязывающую часть, которые являются модифицированными или сконструированными способами инженерии. В некоторых вариантах осуществления для получения TCR с измененными свойствами, например, с более высокой аффинностью в отношении специфического комплекса MHC-пептид, используют способы направленных изменений. В некоторых вариантах осуществления направленные изменения осуществляются способами дисплея, включая, но не ограничиваясь ими, дрожжевой дисплей (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), фаговый дисплей (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) или T-клеточный дисплей (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). В некоторых вариантах осуществления подходя дисплея вовлекают конструирование или модификацию известного, исходного или эталонного TCR. Например, в некоторых случаях TCR дикого типа можно использовать в качестве матрицы для получения мутантных TCR, в которых один или несколько остатков CDR являются мутантными, и отбирают мутанты с желаемым измененным свойством, таким как более высокая аффинность в отношении требуемого антигена-мишени.

[198] В некоторых вариантах осуществления пептиды полипептида-мишени для применения для продуцирования или получения представляющего интерес TCR известны и могут быть без труда идентифицированы специалистом в данной области. В некоторых вариантах осуществления пептиды, пригодные для применения для получения TCR или антигенсвязывающих частей, можно определять, исходя из присутствия рестриктированного по HLA мотива в представляющем интерес полипептиде-мишени, такой как полипептид-мишень, описанный ниже. В некоторых вариантах осуществления пептиды идентифицируют с использованием компьютерных прогнозирующих моделей, известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления для прогнозирования участков связывания MHC класса I такие модели включают, но не ограничиваются ими, ProPred1 (Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237, и SYFPEITHI (см. Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007). В некоторых вариантах осуществления рестриктированный по MHC эпитоп представляет собой HLA-A0201, который экспрессируется у приблизительно 39-46% всех европиоидов и, таким образом, является подходящим для выбора антигеном MHC для применения для получения TCR или другой молекулы, связывающей MHC-пептид.

[199] HLA-A0201-связывающие мотивы и участки расщепления для протеасом и иммунных протеасом с использованием компьютерных прогнозирующих моделей известны специалистам в данной области. Для прогнозирования участков связывания MHC класса I такие модели включают, но не ограничиваются ими, ProPred1 (более подробно описанная в Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001), и SYFPEITHI (см. Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007).

[200] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающая часть могут представлять собой рекомбинантно продуцируемый природный белок или его мутантную форму, у которых одно или нескольких свойств, таких как характеристика связывания, изменены. В некоторых вариантах осуществления TCR может происходить из одного из различных видов животных, таких как человек, мышь, крыса или другое млекопитающее. TCR может находиться с связанной с клеткой или растворимой форме. В некоторых вариантах осуществления для целей предусматриваемых способов TCR находится в связанной с клеткой форме, экспрессируемой на поверхности клетки.

[201] В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой полноразмерный TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой антигенсвязывающую часть. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой димерный TCR (dTCR). В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой одноцепочечный TCR (sc-TCR). В некоторых вариантах осуществления dTCR или scTCR имеют структуры, как описано в WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186.

[202] В некоторых вариантах осуществления TCR содержит последовательность, соответствующую трансмембранной последовательности. В некоторых вариантах осуществления TCR не содержит последовательность, соответствующую цитоплазматическим последовательностям. В некоторых вариантах осуществления TCR способен образовывать комплекс TCR с CD3. В некоторых вариантах осуществления любой из TCR, включая dTCR или scTCR, может быть связан с сигнальными доменами, которые обеспечивают активный TCR на поверхности T-клетки. В некоторых вариантах осуществления TCR экспрессируется на поверхности клеток.

[203] В некоторых вариантах осуществления dTCR содержит первый полипептид, где последовательность, соответствующая вариабельной области α-цепи TCR, слита с N-концом последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константной области α-цепи TCR, и второй полипептид, где последовательность, соответствующая последовательности вариабельной области β-цепи TCR, слита с N-концом последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константной области β-цепи TCR, причем первый и второй полипептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах осуществления связь может соответствовать нативной межцепочечной дисульфидной связи, присутствующей в нативных димерных αβ TCR. В некоторых вариантах осуществления межцепочечные дисульфидные связи не присутствуют в нативном TCR. Например, в некоторых вариантах осуществления один или несколько остатков цистеина могут быть включены во внеклеточные последовательности константных областей пары полипептидов dTCR. В некоторых случаях может быть желательной как нативная, так и ненативная дисульфидная связь. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит трансмембранную последовательность для заякоривания на мембране.

[204] В некоторых вариантах осуществления dTCR содержит α-цепь TCR, содержащую вариабельный α-домен, константный α-домен и первый мотив димеризации, связанный с C-концом константного α-домена, и β-цепь TCR, содержащую вариабельный β-домен, константный β-домен и первый мотив димеризации, связанный с C-концом константного β-домена, где первый и второй мотивы димеризации легко взаимодействуют с образованием ковалентной связи между аминокислотой в первом мотиве димеризации и аминокислотой во втором мотиве димеризации, связывающем α-цепь TCR и β-цепь TCR вместе.

[205] В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой scTCR. Как правило, scTCR можно получать с использованием способов, известных специалистам в данной области, см., например, Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wülfing, C. and Plückthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); международные опубликованные PCT № WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; и Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит введенную ненативную дисульфидную межцепоченую связь для облегчения ассоциации цепей TCR (см., например, международную опубликованную PCT № WO 03/020763). В некоторых вариантах осуществления scTCR представляет собой связанный дисульфидной связью укороченный TCR, в котором гетерогенные лейциновые молнии, слитые с их C-концами, облегчают ассоциацию цепей (см., например, международную опубликованную PCT № WO99/60120). В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит вариабельный домен TCRα, ковалентно связанный с вариабельным доменом TCRβ через пептидный линкер (см., например, международную опубликованную PCT № WO99/18129).

[206] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит первый сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей вариабельной области α-цепи TCR, второй сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности вариабельной области β-цепи TCR, слитой с N-концом аминокислотной последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константного домена β-цепи TCR, и линкерную последовательность, связывающую C-конец первого сегмента с N-концом второго сегмента.

[207] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит первый сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области α-цепи, слитой с N-концом внеклеточной последовательности константного домена α-цепи, и второй сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области β-цепи, слитой с N-концом внеклеточной константной и трансмембранной последовательности β-цепи, и, необязательно, линкерную последовательность, связывающую C-конец первого сегмента с N-концом второго сегмента.

[208] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит первый сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области β-цепи TCR, слитой с N-концом последовательности внеклеточного константного домена β-цепи, и второй сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области α-цепи, слитой с N-концом внеклеточной константной и трансмембранной последовательности α-цепи, и необязательно линкерную последовательность, связывающую C-конец первого сегмента с N-концом второго сегмента.

[209] В некоторых вариантах осуществления линкер scTCR, который связывает первый и второй сегменты TCR, может представлять собой любой линкер, способный образовывать единую полипептидную цепь при сохранении специфичности связывания TCR. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность может иметь формулу, например, -P-AA-P-, где P представляет собой пролин и AA представляет собой аминокислотную последовательность, где аминокислоты представляют собой глицин и серин. В некоторых вариантах осуществления первый и второй сегменты образуют пару, так что их последовательности вариабельной области ориентированы для такого связывания. Таким образом, в некоторых случаях линкер имеет достаточную длину для того, чтобы он охватывал расстояние между C-концом первого сегмента и N-концом второго сегмента, или наоборот, но не был слишком длинным, чтобы не произошло блокирование или уменьшение связывания scTCR с лигандом-мишенью. В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать от или от приблизительно 10 до 45 аминокислот, например, от 10 до 30 аминокислот или от 26 до 41 аминокислотного остатка, например 29, 30, 31 или 32 аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет формулу -PGGG-(SGGGG)₅-P-, где P представляет собой пролин, G представляет собой глицин и S представляет собой серин (SEQ ID NO: 22). В некоторых вариантах осуществления линкер имеет последовательность GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO: 23).

[210] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит ковалентную дисульфидную связь, связывающую остаток области иммуноглобулина константного домена α-цепи с остатком области иммуноглобулина константного домена β-цепи. В некоторых вариантах осуществления межцепочечная дисульфидная связь в нативном TCR отсутствует. Например, в некоторых вариантах осуществления один или несколько остатков цистеина могут быть включены во внеклеточные последовательности константной области первого и второго сегментов полипептида scTCR. В некоторых случаях может быть желательной как нативная, так и ненативная дисульфидная связь.

[211] В некоторых вариантах осуществления dTCR или scTCR, содержащего встроенные межцепочечные дисульфидные связи, нативные дисульфидные связи не присутствуют. В некоторых вариантах осуществления один или несколько нативных остатков цистеина, образующих нативные межцепочечные дисульфидные связи, заменены другим остатком, например, серином или аланином. В некоторых вариантах осуществления встроенная дисульфидная связь может быть образована путем мутации являющихся цистеином остатков на первом и втором сегментах на цистеин. Иллюстративные ненативные дисульфидные связи TCR описаны в опубликованной международной PCT № WO2006/000830.

[212] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент обладают аффинностью с равновесной константой связывания в отношении антигена мишени, составляющей от или приблизительно от 10-5 до 10-12 M, включая все индивидуальные величины и диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой комплекс MHC-пептид или лиганд.

[213] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или нуклеиновые кислоты, кодирующие TCR, такие как α- и β-цепи, можно амплифицировать способом ПЦР, клонированием или другим подходящим способом и клонировать в подходящий экспрессирующий вектор или векторы. Экспрессирующий вектор может представлять собой любой подходящий рекомбинантный экспрессирующий вектор, и его можно использовать для трансформации или трансфекции какого-либо подходящего хозяина. Подходящие векторы включают векторы, сконструированные для увеличения в количестве и экспансии, или для экспрессии, или для обеих целей, такие как плазмиды и вирусы.

[214] В некоторых вариантах осуществления вектор может представлять собой вектор серии pUC (Fermentas Life Sciences), серии pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.), серии pET (Novagen, Madison, Wis.), серии pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Швеция) или серии pEX (Clontech, Palo Alto, Calif.). В некоторых случаях также можно использовать векторы на основе бактериофагов, такие как λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4 и λNM1149. В некоторых вариантах осуществления можно использовать экспрессирующие векторы растений, и они включают pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 и pBIN19 (Clontech). В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие векторы животных включают pEUK-Cl, pMAM и pMAMneo (Clontech). В некоторых вариантах осуществления используют вирусный вектор, такой как ретровирусный вектор.

[215] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные экспрессирующие векторы можно получать с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах осуществления векторы могут содержать регуляторные последовательности, такие как кодоны инициации и терминации транскрипции и трансляции, которые являются специфическими в отношении типа хозяина (например, бактерии, грибы, растений или животные), которому вводят вектор, в зависимости от ситуации и учитывая, является ли вектор вектором на основе ДНК или РНК. В некоторых вариантах осуществления вектор может содержать ненативный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей TCR или антигенсвязывающую часть (или другую молекулу, связывающую MHC-пептид). В некоторых вариантах осуществления промотор может представлять собой невирусный промотор или вирусный промотор, такой как промотор цитомегаловируса (CMV), промотор SV40, промотор RSV и промотор, находящийся в длинном концевом повторе вируса стволовых клеток мыши. Также предусматриваются другие промоторы, известные квалифицированному специалисту.

[216] В некоторых вариантах осуществления после получения клона T-клеток, цепи альфа и бета TCR выделяют и клонируют в вектор, экспрессирующий ген. В некоторых вариантах осуществления гены цепей альфа и бета TCR связаны через пептид рибосомального пропускания пикорнавируса 2A, так что обе цепи коэкспрессируются. В некоторых вариантах осуществления генный перенос TCR осуществляют через ретровирусные или лентивирусные векторы, или через транспозоны (см., например, Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; и Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683.

[217] В некоторых вариантах осуществления для получения вектора, кодирующего TCR, цепи α и β амплифицируют способом ПЦР с тотальной кДНК, выделенной из клона T-клеток, экспрессирующего представляющий интерес TCR, и клонируют в экспрессирующий вектор. В некоторых вариантах осуществления цепи α и β клонируют в тот же вектор. В некоторых вариантах осуществления цепи α и β клонируют в различные векторы. В некоторых вариантах осуществления полученные цепи α и β встраивают в ретровирусный, например, лентивирусный вектор.

3. Химерные рецепторы аутоантител (CAAR)

[218] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор представляет собой химерный рецептор аутоантител (CAAR). В некоторых вариантах осуществления CAAR является специфичным к аутоантителу. В некоторых вариантах осуществления клетку, экспрессирующую CAAR, такую как T-клетка, модифицированная для экспрессии CAAR, можно использовать для специфического связывания и уничтожения клеток, экспрессирующих аутоантитела, но не нормальных клеток, экспрессирующих антитела. В некоторых вариантах осуществления экспрессующие CAAR клетки можно использовать для лечения аутоиммунного заболевания, ассоциированного с экспрессией собственных антигенов, таких как аутоиммунные заболевания. В некоторых вариантах осуществления CAAR-экспрессирующие клетки могут быть нацелены на B-клетки, которые в конечном итоге продуцируют аутоантитела и экспонируют аутоантитела на их клеточных поверхностях, маркируют эти B-клетки в качестве специфических для заболевания мишеней для терапевтического вмешательства. В некоторых вариантах осуществления CAAR-экспрессирующие клетки можно использовать для эффектиного нацеливания и уничтожения патогенных B-клеток при аутоиммунных заболеваниях путем нацеливания на вызывающие заболевание B-клетки с использованием антигенспецифического химерного рецептора аутоантител. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор представляет собой CAAR, такой как любой CAAR, описанный в публикации патентной заявки США № US 2017/0051035.

[219] В некоторых вариантах осуществления CAAR содержит связывающий домен аутоантител, трансмембранный домен и внутриклеточную сигнальную область. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен представляет собой или содержит первичный сигнальный домен, сигнальный домен, который способен индуцировать первичный сигнал активации в T-клетке, компонент сигнального домена T-клеточного рецептора (TCR), и/или сигнальный домен, содержащий иммунорецепторный активирующий мотив на основе тирозина (ITAM). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит вторичную или костимулирующую сигнальную область (вторичные внутриклеточные сигнальные области).

[220] В некоторых вариантах осуществления связывающий домен аутоантитела содержит аутоантиген или его фрагмент. Выбор аутоантигена может зависеть от типа аутоантитела, на которое осуществляют нацеливание. Например, аутоантиген может быть выбран, поскольку он распознает аутоантитело на клетке-мишени, такой как B-клетка, ассоциированной с конкретным болезненным состоянием, например, аутоиммунным заболеванием, таким как опосредуемое аутоантителами аутоиммунное заболевание. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание включает пемфигус обыкновенный (PV). Иллюстративные аутоантигены включают десмоглеин 1 (Dsg1) и Dsg3.

4. Множественное нацеливание

[221] В некоторых вариантах осуществления клетки и способы включают стратегии множественного нацеливания, такие как экспрессия двух или более модифицированных способами генной инженерии рецепторов на клетке, которые распознают один и тот же или различные антигены и, как правило, включают различные компоненты внутриклеточной передачи сигнала. Такие стратегии множественного нацеливания описаны, например, в публикации международной патентной заявки № WO 2014055668 A1 (в которой описаны комбинации активирующих и костимулирующих CAR, например, нацеливание на два различных антигена, присутствующих по отдельности на нецелевых, например, нормальных клетках, но присутствуют вместе только на клетках, связанных с заболеванием или состоянием, подвергаемым лечению) и Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (декабрь 2013) (где описаны клетки, экспрессирующие активирующий и ингибиторный CAR, такие как клетки, в которых активирующий CAR связывается с одним антигеном, экспрессируемым как на нормальных или не связанных с заболеванием клетках, так и на клетках, связанных с заболеванием или состоянием, подвергаемым лечению, и ингибиторный CAR связывается с другим антигеном, экспрессируемым только на нормальных клетках или клетках, на которые нежелательно воздействовать).

[222] Например, в некоторых вариантах осуществления клетки включают рецептор, экспрессирующий первый модифицированный способами инженерии рецептор антигена (например, CAR или TCR), который способен индуцировать активирующий сигнал в клетке, как правило, при специфическом связывании с антигеном, распознаваемым первым рецептором, например, с первым антигеном. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно включает второй модифицированный способами генной инженерии рецептор антигена (например, CAR или TCR), например, химерный костимулирующий рецептор, который способен индуцировать косимулирующий сигнал в иммунной клетке, обычно при специфическом связывании со вторым антигеном, распознаваемым вторым рецептором. В некоторых вариантах осуществления первый антиген и второй антиген являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления первый антиген и второй антиген различаются.

[223] В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй модифицированный способами инженерии рецептор антигена (например, CAR или TCR) способен индуцировать активирующий сигнал в клетке. В некоторых вариантах осуществления рецептор включает компонент внутриклеточной передачи сигнала, содержащий ITAM или ITAM-подобные мотивы. В некоторых вариантах осуществления активация, индуцируемая первым рецептором, вовлекает передачу сигнала или изменение экспрессии белка в клетке, которые приводят к инициации иммунного ответа, такой как фосфорилирование ITAM и/или инициация опосредуемого ITAM каскада передачи сигнала, образование иммунологического синапса и/или кластеризация молекул вблизи связываемого рецептора (например, CD4 или CD8, и т.д.), активация одного или нескольких факторов транскрипции, таких как NF-κB и/или AP-1, и/или индукция экспрессии генов факторов, таких как цитокины, пролиферация и/или выживание.

[224] В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй рецептор включает внутриклеточные сигнальные домены или области костимулирующих рецепторов, таких как CD28, CD137 (41BB), OX40 и/или ICOS. В некоторых вариантах осуществления первый и второй рецепторы включают внутриклеточные сигнальные домены костимулирующего рецептора, которые различаются. В одном варианте осуществления первый рецептор содержит костимулирующую сигнальную область CD28 и второй рецептор содержит костимулирующую сигнальную область 4-1BB, или наоборот.

[225] В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй рецептор включает как внутриклеточный сигнальный домен, содержащий ITAM или ITAM-подобные мотивы, и внутриклеточный сигнальный домен костимулирующего рецептора.

[226] В некоторых вариантах осуществления первый рецептор содержит внутриклеточный сигнальный домен, содержащий ITAM или ITAM-подобные мотивы, и второй рецептор содержит внутриклеточный сигнальный домен костимулирующего рецептора. Костимулирующий сигнал в комбинации с активирующим сигналом, индуцированным в одной клетке, представляет собой сигнал, который приводит к иммунному ответу, такому как устойчивый и длительный иммунный ответ, такой как увеличенная экспрессия генов, секреция цитокинов и других факторов, и опосредуемые T-клетками эффекторные функции, такие как уничтожение клеток.

[227] В некоторых вариантах осуществления ни связывание только первого рецептора, ни связывание только второго рецептора не индуцирует устойчивый иммунный ответ. В некоторых аспектах, если связывается только один рецептор, клетка становится толерантной или не отвечающей на антиген, или ингибируется, и/или не индуцируется к пролиферации или секреции факторов или выполнению эффекторных функций. Однако в некоторых таких вариантах осуществления, когда связывается несколько рецепторов, например, когда встречается клетка, экспрессирующая первый и второй антигены, достигается желаемый ответ, такой как полная иммунная активация или стимуляция, на что указывает, например, секреция одного или нескольких цитокинов, пролиферация, персистенция и/или выполнение иммунной эффекторной функции, такой как цитотоксическое уничтожение клетки-мишени.

[228] В некоторых вариантах осуществления два рецептора индуцируют, соответственно, активирующий и ингибиторный сигнал в клетке, так что связывание одного из рецепторов с его антигеном активирует клетку или индуцирует ответ, однако связывание второго ингибиторного рецептора с его антигеном индуцирует сигнал, который подавляет или тормозит этот ответ. Примерами являются комбинации активирующих CAR и ингибиторных CAR, или iCAR. Можно использовать такую стратегию, например, в которой активирующий CAR связывает антиген, экспрессирующийся при заболевании или состоянии, но который также экспрессируется на нормальных клетках, и ингибиторный рецептор связывается с отдельным антигеном, который экспрессируется на нормальных клетках, но не на клетках, связанных с заболеванием или состоянием.

[229] В некоторых вариантах осуществления стратегию множественного нацеливания используют в случае, когда антиген, ассоциированный с конкретным заболеванием или состоянием, экспрессируется на не связанной с заболеванием клетке и/или экспрессируется на самой модифицированной способами инженерии клетке, либо временно (например, при стимуляции в ассоциации с генной инженерией), либо постоянно. В таких случаях, вследствие необходимости связывания двух отдельных и обладающих индивидуальной специфичностью рецепторов антигенов, может повышаться специфичность, селективность и/или эффективность.

[230] В некоторых вариантах осуществления множество антигенов, например, первый и второй антигены, экспрессируются на клетке, в ткани или при заболевании или состоянии, на которые осуществляют нацеливание, например, на злокачественной клетке. В некоторых аспектах, клетка, ткань, заболевание или состояние представляет собой множественную миелому или клетку множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления один или несколько антигенов, как правило, также экспрессируются на клетке, на которую нежелательно нацеливание посредством клеточной терапии, такой как нормальная или не связанная с заболеванием клетка или ткань, и/или сами модифицированные способами инженерии клетки. В таких вариантах осуществления, вследствие необходимости связывания множества рецепторов для достижения ответа клетки, может быть достигнута специфичность и/или эффективность.

C. Клетки и получение клеток для модификации способами генной инженерии

[231] Среди клеток, экспрессирующих рецепторы и вводимых предусматриваемыми способами, представлены модифицированные способами инженерии клетки. Модификация способами генной инженерии обычно вовлекает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный или сконструированный компонент, в композицию, содержащую клетки, например, посредством ретровирусной трансдукции, трансфекции или трансформации.

[232] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, т.е. обычно не присутствуют в клетке или образце, полученном из такой клетки, например, нуклеиновые кислоты, полученные из другого организма или клетки, которые, например, обычно не присутствуют в клетке, подвергаемой модификации способами инженерии, и/или организме, из которого такая клетка происходит. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются не встречающимися в природе, такими как нуклеиновая кислота, не встречающаяся в природе, включая нуклеиновую кислоту, содержащую химерные комбинации нуклеиновых кислот, кодирующие различные домены множества различных типов клеток.

[233] Клетки, как правило, представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, и, как правило, они представляют собой клетки человека. В некоторых вариантах осуществления клетки происходят из крови, костного мозга, лимфы или лимфоидных органов, и представляют собой клетки иммунной системы, такие как клетки врожденного или адаптивного иммунитета, например, миелоидные или лимфоидные клетки, включая лимфоциты, главным образом, T-клетки и/или NK-клетки. Другие иллюстративные клетки включают стволовые клетки, такие как мультипотентные и плюрипотентные стволовые клетки, в том числе индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Клетки, как правило, представляют собой первичные клетки, такие как клетки, выделенные непосредственно от индивидуума и/или выделенные от индивидуума и замороженные. В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или несколько подгрупп T-клеток или других типов клеток, таких как целые популяции T-клеток, CD4+ клетки, CD8+ клетки, и их субпопуляции, такие как субпопуляции, определяемые функцией, состоянием активации, зрелостью, потенциалом к дифференцировке, экспансией, рециркуляцией, локализацией и/или способностью к персистенции, специфичностью к антигену, типом рецептора антигена, присутствием в конкретном органе или компартменте, профилем секреции маркеров или цитокинов, и/или степенью дифференцировки. Что касается индивидуума, подвергаемого лечению, клетки могут быть аллогенными и/или аутологичными. Способы включают стандартные способы. В некоторых аспектах, например, в случае стандартных технологий, клетки являются плюрипотентными и/или мультипотентными, такими как стволовые клетки, такие как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). В некоторых вариантах осуществления способы включают выделение клеток от индивидуума, подготовку, переработку, культивирование и/или модификацию их способами инженерии, и обратное введение их тому же индивидууму, до или после криоконсервации.

[234] Среди подтипов и субпопуляций T-клеток и/или CD4+ и/или CD8+ T-клеток представлены наивные T (T_N) клетки, эффекторные T-клетки (T_EFF), T-клетки памяти и их подтипы, такие как стволовые T-клетки памяти (T_SCM), центральные T-клетки памяти (T_CM), эффекторные T-клетки памяти (T_EM) или терминально дифференцированные эффекторные T-клетки памяти, инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL), незрелые T-клетки, зрелые T-клетки, хелперные T-клетки, цитотоксические T-клетки, ассоциированные со слизистой оболочкой инвариантные T-клетки (MAIT), встречающиеся в природе и адаптивные регуляторные T(Treg)-клетки, хелперные T-клетки, такие как клетки TH1, клетки TH2, клетки TH3, клетки TH17, клетки TH9, клетки TH22, фолликулярные хелперные T-клетки, альфа/бета T-клетки и дельта/гамма T-клетки.

[235] В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой натуральные киллеры (NK). В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой моноциты или гранулоциты, например, миелоидные клетки, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы и/или базофилы.

[236] В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или несколько нуклеиновых кислот, введенных способами генной инженерии, и, тем самым, экспрессируют рекомбинантные или модифицированные способами генной инженерии продукты, такие как нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, т.е. обычно не присутствуют в клетке или образце, полученном из клетки, как например, нуклеиновые кислоты, полученные из другого организма или клетки, которые, например, обычно не встречаются в клетке, подвергаемой модификации способами инженерии, и/или организме, из которого такая клетка происходит. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не являются встречающимися в природе, как например, нуклеиновая кислота, не встречающаяся в природе, включая нуклеиновую кислоту, содержащую химерные комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих различные домены из нескольких различных типов клеток.

[237] В некоторых вариантах осуществления получение модифицированных способами инженерии включает одну или несколько стадий культивирования и/или получения. Клетки для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей трансгенный рецептор, такой как CAR, можно выделять из образца, такого как биологический образец, например, образец, полученный от или происходящий из индивидуума. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, клетку которого выделяют, представляет собой индивидуума, имеющего заболевание или состояние, или индивидуума, который нуждается в клеточной терапии или которому клеточную терапию будут проводить. В некоторых вариантах осуществления индивидуумом является человек, нуждающийся в конкретном терапевтическом вмешательстве, таком как адоптивная клеточная терапия, для которой клетки выделяют, процессируют и/или модифицируют способами инженерии.

[238] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой первичные клетки, например, первичные клетки человека. Образцы включают образцы ткани, жидкости и другие образцы, которые берут непосредственно от индивидуума, а также образцы, полученные в результате одной или нескольких стадий обработки, таких как разделение, центрифугирование, модификация способами генной инженерии (например, трансдукция вирусным вектором), промывание и/или инкубация. Биологический образец может представлять собой образец, полученный непосредственно из биологического источника, или образец, который обрабатывают. Биологические образцы включают, но не ограничиваются ими, жидкости организма, такие как кровь, плазма, сыворотка, цереброспинальная жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы органов и тканей, в том числе обработанные образцы, происходящие из них.

[239] В некоторых аспектах образец, из которого происходят или выделяют клетки, представляет собой кровь или происходящий из крови образец, или представляет собой или происходит из продукта афереза или лейкафереза. Иллюстративные образцы включают цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), лейкоциты, клетки костного мозга, тимуса, биоптат ткани, клетки опухоли, лейкоза, лимфомы, лимфатического узла, ассоциированной с кишечником лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой лимфоидной ткани, селезенки, других лимфоидных тканей, печени, легкого, желудка, кишечника, толстого кишечника, почки, поджелудочной железы, молочной железы, кости, предстательной железы, шейки матки, яичек, яичников, миндалевидной железы или другого органа, и/или клетки, происходящие из них. Образцы включают, в контексте клеточной терапии, например, адоптивной клеточной терапии, образцы из аутологичных и аллогенных источников.

[240] В некоторых вариантах осуществления клетки происходят из клеточных линий, например, линий T-клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки получают из ксеногенного источника, например, из мыши, крысы, не являющегося человеком примата и свиньи.

[241] В некоторых вариантах осуществления выделение клеток включает одну или несколько стадий препаративного и/или не аффинного разделения клеток. В некоторых примерах клетки промывают, центрифугируют и/или инкубируют в присутствии одного или нескольких реагентов, например, для удаления нежелательных компонентов, обогащения желательными компонентами, лизиса или удаления клеток, чувствительных к конкретным реагентам. В некоторых примерах клетки разделяют на основе одного или нескольких свойств, таких как плотность, способность к прикреплению, размер, чувствительность и/или резистентность к конкретным компонентам.

[242] В некоторых примерах клетки из циркулирующей крови индивидуума получают, например, посредством афереза или лейкафереза. В некоторых аспектах образцы содержат лимфоциты, в том числе T-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты, эритроциты и/или тромбоциты, и в некоторых аспектах они содержат клетки, отличные от эритроцитов и тромбоцитов.

[243] В некоторых вариантах осуществления клетки крови, полученные от индивидуума, промывают, например, для удаления фракции плазмы и для помещения клеток в подходящий буфер или среду для последующих стадий обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают фосфатно-солевым буфером (PBS). В некоторых вариантах осуществления в промывочном растворе отсутствует кальций и/или магний, и/или многие или все двухвалентные катионы. В некоторых аспектах стадию промывания проводят в полуавтоматической "проточной" центрифуге (например, устройство для обработки клеток Cobe 2991, Baxter) в соответствии с инструкциями изготовителя. В некоторых аспектах стадию промывания проводят посредством проточной фильтрации вдоль потока (TFF) в соответствии с инструкциями изготовителя. В некоторых вариантах осуществления после промывания клетки суспендируют в различных биосовместимых буферах, например, таких как свободный от Ca++/Mg++ PBS. В определенных вариантах осуществления компоненты образца крови удаляют и клетки прямо ресуспендируют в культуральной среде.

[244] В некоторых вариантах осуществления способы включают способы разделения по плотности, такие как получение лейкоцитов из периферической крови посредством лизиса эритроцитов и центрифугирования в градиенте Percoll или Ficoll.

[245] В некоторых вариантах осуществления способы выделения включают разделение различных типов клеток на основе экспрессии или присутствия в клетке одной или нескольких определенных молекул, таких как поверхностные маркеры, например, поверхностные белки, внутриклеточные маркеры или нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления можно использовать любой известный способ разделения на основе таких маркеров. В некоторых вариантах осуществления разделение представляет собой аффинное или иммуноаффинное разделение. Например, в некоторых аспектах выделение включает разделение клеток и популяций клеток на основе экспрессии или уровня экспрессии клетками одного или нескольких маркеров, как правило, маркеров клеточной поверхности, например, посредством инкубации с антителом или партнером по связыванию, которые специфически связываются с такими маркерами, после которого обычно следуют стадии промывания и отделения клеток, связавших антитело или партнер по связыванию, от клеток, которые не связались с антителом или партнером по связыванию.

[246] Такие стадии разделения могут быть основаны на положительной селекции, при которой клетки, связавшие реагенты, сохраняются для дальнейшего применения, и/или отрицательной селекции, при которой сохраняются клетки, не связавшиеся с антителом или партнером по связыванию. В некоторых примерах обе фракции сохраняют для дальнейшего применения. В некоторых аспектах негативная селекция может быть полезной, в частности, когда отсутствует доступное антитело, которое специфически идентифицирует тип клеток в гетерогенной популяции, так что разделение лучше всего проводить на основе маркеров, экспрессируемых клетками, отличными от требуемой популяции.

[247] Разделение не должно приводить к 100% обогащению или устранению конкретной клеточной популяции или клеток, экспрессирующих конкретный маркер. Например, положительная селекция или увеличение в количестве клеток конкретного типа, таких как клетки, экспрессирующие маркер, относится к увеличению количества или процента таких клеток, но не должна приводить к полному отсутствию клеток, экспрессирующих маркер. Аналогично, негативная селекция, удаление или истощение клеток конкретного типа, таких как клетки, экспрессирующие маркер, относится к уменьшению количества или процента таких клеток, но оно не должна приводить к полному устранению таких клеток.

[248] В некоторых примерах проводят несколько раундов разделения, где подвергнутую позитивной или негативной селекции фракцию подвергают другой стадии разделения, такой как последующая позитивная или негативная селекция. В некоторых примерах одна стадия разделения может истощать клетки, экспрессирующие несколько маркеров одновременно, например, посредством инкубации клеток с несколькими антителами или партнерами по связыванию, каждый из которых является специфичным к маркеру, на который нацелена отрицательная селекция. Аналогично, несколько типов клеток можно одновременно подвергать позитивной селекции посредством инкубации с несколькими антителами или партнерами по связыванию, экспрессируемыми на различных типах клеток.

[249] Например, в некоторых аспектах способами позитивной или негативной селекции выделяют определенные субпопуляции T-клеток, такие как клетки, положительные или экспрессирующие высокие уровни одного или нескольких поверхностных маркеров, например, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, и/или CD45RO+ T-клетки.

[250] Например, CD3+, CD28+ T-клетки можно подвергать позитивной селекции с использованием конъюгированных с антителом против CD3/антителом против CD28 магнитных гранул (например, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).

[251] В некоторых вариантах осуществления выделение поводят посредством увеличения в количестве конкретной популяции клеток путем позитивной селекции или истощения конкретной популяции клеток путем негативной селекции. В некоторых вариантах осуществления позитивную или негативную селекцию проводят путем инкубации клеток с одним или несколькими антителами или другими связывающими соединениями, которые специфически связываются с одним или несколькими поверхностными маркерами, экспрессируемыми (маркер+) или экспрессируемыми на относительно более высоком уровне (маркер^{высокий}) на клетках, подвергнутых позитивной или негативной селекции, соответственно.

[252] В некоторых вариантах осуществления T-клетки выделяют из образца PBMC посредством негативной селекции по маркерам, экспрессируемым на не T-клетках, таких как B-клетки, моноциты или другие лейкоциты, такие как CD14. В некоторых аспектах стадию CD4+ или CD8+ селекции используют для разделения CD4+ хелперных и CD8+ цитотоксических T-клеток. Такие популяции CD4+ и CD8+ можно далее сортировать на субпопуляции посредством позитивной или негативной селекции маркеров, экспрессируемых или экспрессируемых на относительно более высоком уровне на одной или нескольких наивных субпопуляциях T-клеток, субпопуляциях T-клеток памяти и/или субпопуляциях эффекторных T-клеток.

[253] В некоторых вариантах осуществления среди CD8+ клеток далее увеличивают содержание или истощают наивные клетки, центральные клетки памяти, эффекторные клетки памяти и/или центральные стволовые клетки памяти, например, путем позитивной или негативной селекции на основе поверхностных антигенов, ассоциированных с соответствующей субпопуляцией. В некоторых вариантах осуществления увеличение содержания центральных T-клеток (T_CM) памяти проводят для повышения эффективности, например, для повышения долговременной выживаемости, экспансии и/или приживления после введения, которые в некоторых аспектах являются особенно устойчивыми в таких субпопуляциях. См. Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. В некоторых вариантах осуществления комбинирование обогащенных по TCM CD8+ T-клеток и CD4+-клеток далее повышает эффективность.

[254] В некоторых вариантах осуществления T-клетки памяти присутствуют как в CD62L+, так и в CD62L- подгруппах CD8+ лимфоцитов периферической крови человека. В PBMC можно увеличивать содержание или истощать CD62L-CD8+ и/или CD62L+CD8+ фракции, например, с использованием антител против CD8 и против CD62L.

[255] В некоторых вариантах осуществления увеличение содержания центральных T-клеток памяти (T_CM) основано на положительной или высокой поверхностной экспрессии CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD127; в некоторых аспектах оно основано на негативной селекции клеток, экспрессирующих или экспрессирующих на высокому уровне CD45RA и/или гранзим B. В некоторых аспектах выделение CD8+ популяции, обогащенной клетками TCM, проводят путем истощения клеток, экспрессирующих CD4, CD14, CD45RA, и позитивной селекции или увеличения содержания клеток, экспрессирующих CD62L. В одном аспекте увеличение содержания центральных T-клеток памяти (TCM) проводят, начиная с негативной фракции клеток, подвергнутой селекции на основе экспрессии CD4, которые подвергают негативной селекции на основе экспрессии CD14 и CD45RA, и позитивной селекции на основе CD62L. Такую селекцию в некоторых аспектах проводят одновременно и в других аспектах ее проводят последовательно, в любом порядке. В некоторых аспектах ту же стадию селекции на основе экспрессии CD4, которую используют для получения популяции или субпопуляции CD8+ клеток, также используют для получения популяции или субпопуляции CD4+ клеток, так что как положительные, так и отрицательные фракции при разделении на основе CD4 сохраняются и используются для последующих стадий способов, необязательно после одной или нескольких дополнительных стадий позитивной или негативной селекции.

[256] В конкретном примере образец PBMC или другой образец лейкоцитов подвергают селекции CD4+ клеток, где сохраняют как негативные, так и позитивные фракции. Негативную фракцию затем подвергают негативной селекции на основе экспрессии CD14 и CD45RA или CD19, и позитивной селекции на основе маркера, характерного для центральных T-клеток памяти, такого как CD62L или CCR7, где позитивную и негативную селекцию проводят в любом порядке.

[257] CD4+ T-хелперные клетки сортируют на наивные клетки, центральные клетки памяти и эффекторные клетки посредством идентификации популяций клеток, которые имеют антигены клеточной поверхности. CD4+ лимфоциты можно получать стандартными способами. В некоторых вариантах осуществления наивные CD4+ T-лимфоциты представляют собой CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления центральные CD4+ клетки памяти являются CD62L+ и CD45RO+. В некоторых вариантах осуществления эффекторные CD4+ клетки представляют собой CD62L- и CD45RO-.

[258] В одном примере для увеличения содержания CD4+ клеток посредством негативной селекции коктейль моноклональных антител, как правило, включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах осуществления антитело или партнер по связыванию связывают с твердой подложкой или матрицей, такой как магнитные гранулы или парамагнитные гранулы, чтобы обеспечить разделение клеток для позитивной и/или негативной селекции. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки и популяции клеток разделяют или выделяют с использованием способов иммуномагнитного (или аффинномагнитного) разделения (рассмотренных в Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks и U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).

[259] В некоторых аспектах образец или композицию клеток, подлежащие разделению, инкубируют с небольшим, намагничивающимся или магниточувствительный материал, такой как магниточувствительные частицы или микрочастицы, такие как парамагнитные гранулы (например, такие как гранулы Dynalbeads или MACS). Магниточувствительный материал, например, частицы, обычно прямо или непрямо связан с партнером по связыванию, например, антителом, который специфически связывается с молекулой, например, поверхностным маркером, присутствующем на клетке, клетках или популяции клеток, которые желательно разделить, например, которые намереваются подвергнуть негативной или позитивной селекции.

[260] В некоторых вариантах осуществления магнитная частица или гранула содержит магниточувствительный материал, связанный с определенным связывающим партнером, таким как антитело или другой связывающий партнер. Существует множество магниточувствительных материалов, используемых в способах разделения. Подходящие магнитные частицы включают частицы, описанные в Molday, патент США № 4452773, и описании патента Европы EP 452342 B, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок. Другими примерами являются коллоидные распределенные по размеру частицы, такие как частицы, описанные в патенте США № 4795698, Owen, и патенте США № 5200084, Liberti et al.

[261] или партнеры по связыванию, или молекулы, такие как вторичные антитела или другие реагенты, которые специфически связываются с такими антителами или партнерами по связыванию, которые связаны с магнитной частицей или гранулой, специфически связываются с молекулами клеточной поверхности, если они присутствуют на клетках в образце.

[262] В некоторых аспектах образец помещают в магнитное поле и клетки, с которыми связаны магниточувствительные или намагничиваемые частицы, связываются с магнитом и отделяются от немеченых клеток. Для позитивной селекции клетки, связавшиеся с магнитом, сохраняют; для негативной селекции сохраняют клетки, которые не связались (немеченые клетки). В некоторых аспектах, комбинацию позитивной и негативной селекции проводят в ходе той же стадии селекции, где позитивные и негативные фракции сохраняют и далее обрабатывают или подвергают другим стадиям разделения.

[263] В определенных вариантах осуществления магниточувствительнче частицы покрывают первичными антителами или другими партнерами по связыванию, вторичными антителами, лектинами, ферментами или стрептавидином. В определенных вариантах осуществления магнитные частицы связывают с клетками посредством покрытия первичными антителами, специфичными к одному или нескольким маркерам. В определенных вариантах осуществления клетки, а не гранулы, метят первичным антителом или партнером по связыванию, а затем добавляют магнитные частицы, покрытые специфическим для типа клеток вторичным антителом или другим партнером по связыванию (например, стрептавидин). В определенных вариантах осуществления покрытые стрептавидином магнитные частицы используют совместно с биотинилированными первичными или вторичными антителами.

[264] В некоторых вариантах осуществления магниточувствительные частицы оставляют связанными с клетками, которые затем инкубируют, культивируют и/или модифицируют способами инженерии; в некоторых аспектах частицы оставляют связанными с клетками для введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления намагничивающиеся или магниточувствительные частицы извлекают из клеток. Способы извлечения намагничиваемых частиц из клеток известны, и они включают, например, использование конкурирующих немеченых антител, и намагничивающихся частиц или антител, конъюгированных с расщепляемыми линкерами. В некоторых вариантах осуществления намагничивающиеся частицы являются биодеградируемыми.

[265] В некоторых вариантах осуществления селекцию на основе аффинности проводят посредством магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Системы магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS) способны к селекции с высокой чистотой клеток, с которыми связаны намагниченные частицы. В определенных вариантах осуществления MACS действует в режиме, в котором не являющиеся мишенью и являющиеся мишенью типы клеток последовательно элюируются после применения внешнего магнитного поля. Иными словами, клетки, связанные с магнитными частицами, удерживаются на месте, в то время как несвязанные типы клеток элюируются. Затем после завершения этой первой стадии элюирования типы клеток, которые были захвачены в магнитное поле и элюирование которых предотвращалось, освобождают таким образом, чтобы их можно было элюировать и извлечь. В определенных вариантах осуществления не являющиеся мишенью клетки метят и устраняют из гетерогенной популяции клеток.

[266] В определенных вариантах осуществления выделение или разделение проводят с использованием системы, устройства или аппарата, которые осуществляют одну или несколько из стадий выделения, подготовки клеток, разделения, процессинга, инкубации, культивирования и/или составления. В некоторых аспектах используют систему для проведения каждой из этих стадий в закрытой или стерильной среде, например, для минимизации ошибки, обработки пользователем и/или контаминации. В одном примере система представляет собой систему, как описано в публикации международной патентной заявки номер WO2009/072003 или публикации заявки на патент США номер US 20110003380 A1.

[267] В некоторых вариантах осуществления система или устройство проводят одну или несколько, например, все из стадий выделения, обработки, модификации и составления в объединенной или автономной системе, и/или автоматическим или программируемым образом. В некоторых аспектах система или устройство включает компьютер и/или компьютерную программу, соединенные с системой или устройством, которые позволяют пользователю программировать, контролировать, оценивать результат и/или корректировать различные аспекты стадий обработки, выделения, модификации способами инженерии и составления.

[268] В некоторых аспектах разделение и/или другие стадии проводят с использованием системы CliniMACS (Miltenyi Biotec), например, для автоматического разделения клеток в клиническом масштабе в закрытой и стерильной системе. Компоненты могут включать интегрированный микрокомпьютер, элемент магнитного разделения, перистальтический насос и различные запорные клапаны. В некоторых аспектах интегрированный компьютер контролирует все компоненты устройства и управляет системой для выполнения повторяющихся процедур в стандартизированной последовательности. В некоторых аспектах элемент магнитного разделения включает подвижный постоянный магнит и подставку для колонки для селекции. Перистальтический насос контролирует скорость потока через комплект трубок и, вместе с запорным клапаном обеспечивает контролируемый поток буфера через систему и непрерывное суспендирование клеток.

[269] В некоторых аспектах система CliniMACS использует намагничиваемые частицы, с которыми связано антитело, которые предоставляются в стерильном не пирогенном растворе. В некоторых вариантах осуществления после мечения клеток магнитными частицами клетки промывают для удаления избытка частиц. Затем к комплекту трубок подсоединяют мешок для получения клеток, который в свою очередь соединяют с мешком, содержащим буфер и мешком для сбора клеток. Комплект трубок состоит из заранее собранных стерильных трубок, в том числе трубки предколонки и колонки для разделения, и они предназначены только для однократного применения. После начала программы разделения, система автоматически подает образец клеток в колонку для разделения. Меченые клетки удерживаются в колонке, в то время как немеченые клетки удаляют посредством серии стадий промывания. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для применения в способах, описанных в настоящем описании, являются немечеными и не удерживаются в колонке. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для применения в способах, описанных в настоящем описании, являются мечеными и остаются в колонке. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для применения в способах, описанных в настоящем описании, элюируются из колонки после устранения магнитного поля и собираются в мешок для сбора клеток.

[270] В определенных вариантах осуществления разделение и/или другие стадии проводят с использованием системы CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). В некоторых аспектах система CliniMACS Prodigy оборудована элементом переработки клеток, который позволяет автоматическое промывание и фракционирование клеток посредством центрифугирования. Система CliniMACS Prodigy также может включать встроенную камеру и программное обеспечение для распознавания изображений, которое определяет оптимальный конечный этап фракционирования клеток путем различения макроскопических слоев продукта исходных клеток. Например, периферическую кровь автоматически разделяют на слои эритроцитов, лейкоцитов и плазмацитов. Система CliniMACS Prodigy также может включать встроенную камеру для культивирования клеток, которая выполняет протоколы культивирования клеток, например, такие как дифференцировка и экспансия клеток, нагрузка антигеном и длительное культивирование клеток. Входные отверстия могут позволить стерильное удаление и восполнение среды, и мониторинг клеток можно проводить с использованием встроенного микроскопа. См., например, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, и Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

[271] В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем описании, собирают и обогащают (или истощают) проточной цитометрией, при которой клетки, окрашенные на несколько маркеров клеточной поверхности, перемещаются в потоке жидкости. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем описании, собирают и обогащают (или истощают) сортировкой в препаративном масштабе (FACS). В определенных вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем описании, собирают и обогащают (или истощают) с использованием чипов микроэлектромеханических систем (MEMS) в комбинации с системной детекции на основе FACS (см., например, публикацию международной патентной заявки номер WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; и Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376). В обоих случаях клетки можно метить несколькими маркерами, что позволяет выделение определенных подгрупп T-клеток с высокой чистотой.

[272] В некоторых вариантах осуществления антитела или партнеры по связыванию метят одним или несколькими поддающимися обнаружению маркерами для облегчения разделения для позитивной и/или негативной селекции. Например, разделение может быть основано на связывании с флуоресцентно меченными антителами. В некоторых примерах разделение клеток на основе связывания антител или других партнеров по связыванию, специфичных к одному или нескольким маркерам клеточной поверхности, проводят в потоке жидкости, например, посредством активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS), в том числе в препаративном масштабе (FACS), и/или на чипах микроэлектромеханических систем (MEMS), например, в комбинации с системой проточно-цитометрической детекции. Такие способы позволяют позитивную и негативную селекцию на основе множества маркеров одновременно.

[273] В некоторых вариантах осуществления способы получения включают стадии замораживания, например, криоконсервации, клеток либо до, либо после выделения, инкубации и/или модификации способами инженерии. В некоторых вариантах осуществления стадия замораживания и последующего размораживания устраняет гранулоциты и в некоторой степени моноциты из популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки суспендируют в растворе для замораживания, например, после стадии промывания для плазмы и тромбоцитов. В некоторых аспектах можно использовать любые из множества известных растворов для замораживания и параметров. Один пример вовлекает использование PBS, содержащего 20% DMSO и 8% сывороточный альбумин человека (HSA), или другую подходящую среду для замораживания клеток. Затем ее разбавляют 1:1 средой до конечной концентрации DMSO и HSA 10% и 4%, соответственно. Затем клетки обычно замораживают до -80°C со скоростью 1° в минуту и хранят в паровой фазе емкости для хранения с жидким азотом.

[274] В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют и/или культивируют до или совместно с модификацией способами генной инженерии. Стадии инкубации могут включать культивирование, обработку, стимуляцию, активацию и/или увеличение в количестве. Инкубацию и/или модификацию способами инженерии можно проводить в емкости для культивирования, такой как элемент, камера, лунка, колонка, пробирка, комплект трубок, клапан, емкость, чашка для культивирования, мешок или другой контейнер для культивирования или обработки клеток. В некоторых вариантах осуществления композиции или клетки инкубируют в присутствии стимулирующих условий или стимулирующего средства. Такие условия включают условия, предназначенные для индукции пролиферации, экспансии, активации и/или выживаемости клеток в популяции, для имитации воздействия антигена и/или для подготовки клеток для модификации способами генной инженерии, например, для введения рекомбинантного рецептора антигена.

[275] Условия могут включать одно или несколько из конкретной среды, температуры, содержания кислорода, содержания диоксида углерода, времени, средств, например, питательных веществ, аминокислот, антибиотиков, ионов и/или стимулирующих факторов, таких как цитокины, хемокины, антигены, партнеры по связыванию, слитые белки, рекомбинантный растворимые рецепторы и любые другие средства, предназначенные для активации клеток.

[276] В некоторых вариантах осуществления условия стимуляции или средства включают одно или несколько средств, например, лиганд, которые способны активировать внутриклеточный сигнальный домен комплекса TCR. В некоторых аспектах средство включает или инициирует каскад внутриклеточной передачи сигнала TCR/CD3 в T-клетке. Такие средства могут включать антитела, такие как антитела, специфичные к TCR, например, антитела против CD3. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают одно или несколько средств, например лиганд, которые способны стимулировать костимулирующий рецептор, например, антитело против CD28. В некоторых вариантах осуществления такие средства и/или лиганды могут быть связаны с твердой подложкой, такой как гранулы, и/или одним или несколькими цитокинами. Необязательно, способ экспансии может дополнительно включать стадию добавления антитела против CD3 и/или против CD28 в культуральную среду (например, в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5 нг/мл). В некоторых вариантах осуществления стимулирующие средства включают IL-2, IL-15 и/или IL-7. В некоторых аспектах концентрация IL-2 составляет по меньшей мере приблизительно 10 единиц/мл.

[277] В некоторых аспектах инкубацию проводят в соответствии со способами, такими как способы, описанные в патенте США № 6040177 to Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82 и/или Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

[278] В некоторых вариантах осуществления T-клетки увеличивают в количестве путем добавления в композицию для инициации культуры фидерных клеток, таких как не делящиеся мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) (например, так чтобы конечная популяция клеток содержала по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20 или 40 или более фидерных клеток PBMC на каждый T-лимфоцит в первоначальной популяции, подлежащей увеличению в количестве); и инкубации культуры (например, в течение периода времени, достаточного для увеличения количества T-клеток). В некоторых аспектах не делящиеся фидерные клетки могут включать облученные гамма-излучением фидерные клетки PBMC. В некоторых вариантах осуществления PBMC облучают гамма-лучами в диапазоне приблизительно от 3000 до 3600 рад для предотвращения деления клеток. В некоторых аспектах фидерные клетки добавляют в культуральную среду перед добавлением популяций T-клеток.

[279] В некоторых вариантах осуществления условия стимуляции включают температуру, пригодную для выращивания T-лимфоцитов человека, например, по меньшей мере приблизительно 25 градусов Цельсия, как правило, по меньшей мере приблизительно 30 градусов Цельсия, и обычно ровно или приблизительно 37 градусов Цельсия. Необязательно, инкубация может дополнительно включать добавление не делящихся трансформированных EBV лимфобластоидных клеток (LCL) в качестве фидерных клеток. LCL можно облучать гамма-лучами в диапазоне приблизительно от 6000 до 10000 рад. В некоторых аспектах фидерные клетки LCL предоставляют в любом подходящем количестве, таком как соотношение фидерных клеток LCL и исходных T-лимфоцитов, составляющее по меньшей мере приблизительно 10:1.

[280] В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки, такие как антигенспецифические CD4+ и/или CD8+ T-клетки, получают путем стимуляции наивных или антигенспецифических T-лимфоцитов антигеном. Например, линии или клоны антигенспецифических T-клеток к антигенам цитомегаловируса можно получать путем получения T-клеток от инфицированных индивидуумов и стимуляции клеток in vitro тем же антигеном.

B. Векторы и способы генной инженерии

[281] Различные способы введения модифицированных способами генной инженерии компонентов, например, рекомбинантных рецепторов, например, CAR или TCR, хорошо известны и могут использоваться в предусматриваемых способах и композициях. Иллюстративные способы включают способы переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы, в том числе вирусный, например, ретровирусный или лентивирусный, трансдукцию, транспозоны и электропорацию.

[282] В некоторых вариантах осуществления клетки трансфицируют рекомбинантными нуклеиновыми кислотами с использованием рекомбинантных инфекционных вирусных частиц, например, таких как векторы, происходящие из вируса обезьян 40 (SV40), аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки с использованием рекомбинантных лентивирусных векторов или ретровирусных векторов, таких как гамма-ретровирусные векторы (см., например, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10,1038/gt.2014,25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Cамино et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557.

[283] В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор последовательность длинного концевого повтора (LTR), например, ретровирусного вектора, происходящего из вируса лейкоза мышей Молони (MoMLV), вируса миелопролиферативной саркомы (MPSV), вируса эмбриональных стволовых клеток мышей (MESV), вируса стволовых клеток мышей (MSCV), вируса некроза селезенки (SFFV) или аденоассоциированного вируса (AAV). Большинство ретровирусных векторов происходят из ретровирусов мыши. В некоторых вариантах осуществления ретровирусы включают ретровирусы, происходящие из любого источника клеток птиц или млекопитающих. Ретровирусы, как правило, являются амфотерными, что означает, что они способны инфицировать клетки-хозяева нескольких видов, в том числе человека. В одном варианте осуществления ген, подлежащий экспрессии, заменяет ретровирусные последовательности gag, pol и/или env. Описан ряд иллюстративных ретровирусных систем (например, патенты США № 5219740; 6207453; 5219740; Miller и Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; и Boris-Lawrie и Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

[284] Способы лентивирусной трансдукции известны. Иллюстративные способы описаны, например, в Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Способы Mol Biol. 506: 97-114; и Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.

[285] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки посредством электропорации (см., например, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 и Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437)). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки посредством транспозиции (см., например, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; и Huang et al. (2009) Способы Mol Biol 506: 115-126)). Другие способы введения и экспрессии генетического материала в иммунных клетках включают трансфекцию с фосфатом кальция (например, как описано в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), слияние протопластов, опосредуемую катионными липосомами трансфекцию; облегченную частицами вольфрама бомбардировку микрочастиц (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и копреципитацию ДНК с фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

[286] Другие подходы и векторы для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантные продукты, представляют собой векторы и подходы, описанные, например, в публикации международной патентной заявки № WO2014055668 и патенте США № 7446190.

[287] В некоторых вариантах осуществления клетки, например, T-клетки, можно трансфицировать либо в процессе, либо после экспансии, например, T-клеточным рецептором (TCR) или химерным рецептором антигена (CAR). Эту трансфекцию для введения гена желаемого рецептора можно проводить, например, с помощью любого подходящего ретровирусного вектора. Затем популяцию модифицированных способами генной инженерии клеток можно освобождать от первоначального стимула (стимул CD3/CD28, например), а затем стимулировать вторым типом стимула, например, через введенный de novo рецептор). Этот второй тип стимула может включать антигенный стимул в форме молекулы пептид/MHC, собственного (связывающего) лиганда введенного способами генной инженерии рецептора (например, природный лиганд CAR) или любого лиганда (такого как антитело), который прямо связывается с каркасом нового рецептора (например, посредством распознавания константных областей в рецепторе). См., например, Cheadle et al, "Chimeric Antigen Receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 или Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347).

[288] В некоторых случаях можно использовать вектор, который не требует активации клеток, например, T-клеток. В некоторых таких случаях клетку можно подвергать селекции и/или трансдуцировать перед активацией. Таким образом, клетки можно модифицировать способами инженерии до или после культивирования клеток и в некоторых случаях в то же время или в процессе по меньшей мере части культивирования.

[289] В некоторых аспектах, клетки, кроме того, модифицируют способами инженерии для обеспечения экспрессии цитокинов или других факторов. Среди дополнительных нуклеиновых кислот, например, генов, подлежащих введению, представлены гены, которые повышают эффективность терапии, например, путем обеспечения жизнеспособности и/или функции перенесенных клеток; гены, предоставляющие генетический маркер для селекции и/или оценки клеток, например, для оценки выживаемости или локализации in vivo; гены, повышающие безопасность, например, делая клетку чувствительной к отрицательной селекции in vivo, как описано Lupton S. D. et al., Mol. и Cell Biol., 11:6 (1991); и Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); также см. публикации PCT/US91/08442 и PCT/US94/05601, Lupton et al., в которых описано применение бифункциональных селективных слитых генов, образованных путем слияния доминантного положительного селективного маркера с негативным селективным маркером. См., например, Riddell et al., патент США № 6040177, колонки 14-17.

[290] В некоторых контекстах сверхэкспрессия стимулирующего фактора (например, лимфокина или цитокина) может быть токсичной для индивидуума. Таким образом, в некоторых контекстах модифицированные способами инженерии клетки включают сегменты генов, которые делают клетки чувствительными к негативной селекции in vivo, например, при введении в адоптивной иммунотерапии. Например, в некоторых аспектах клетки модифицируют способами инженерии так, чтобы их можно было удалить посредством изменения условий in vivo у индивидуума, которому их вводят. Поддающийся негативной селекции фенотип может быть результатом инсерции гена, который сообщает чувствительность введенному средству, например, соединению. Поддающиеся негативной селекции гены включают ген тимидинкиназы вируса простого герпеса типа I (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell 2:223, 1977), который сообщает чувствительность к ганцикловиру; ген клеточной гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), ген клеточной аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT), ген бактериальной цитозиндезаминазы (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).

[291] В некоторых вариантах осуществления один промотор может контролировать экспрессию РНК, которая содержит в одной рамке считывания (ORF) два или три гена (например, кодирующих молекулу, вовлеченную в модулирование метаболического каскада и кодирующую рекомбинантный рецептор), разделенных последовательностями, кодирующими саморасщепляющийся пептид (например, последовательности 2A) или участок распознавания протеазой (например, фурин). Таким образом, ORF кодирует один полипептид, который либо в процессе (в случае 2A), либо после трансляции процессируется в индивидуальные белки. В некоторых случаях пептид, такой как T2A, может вызывать пропуск рибосомой (рибосомальное пропускание) синтеза пептидной связи на C-конце элемента 2A, что приводит к разделению между концом последовательности 2A и нижеследующим пептидом (см., например, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) и deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). Многие элементы 2A известны. Примеры последовательностей 2A, которые можно использовать в способах и нуклеиновых кислотах, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, последовательности 2A из вируса ящура (F2A, например, SEQ ID NO: 21), вируса A ринита лошадей (E2A, например, SEQ ID NO: 20), вируса Thosea asigna (T2A, например, SEQ ID NO: 6 или 17), и тесховируса 1 свиней (P2A, например, SEQ ID NO: 18 или 19), как описано в публикации патента США № 20070116690.

III. Композиции и составы

[292] В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия предоставляется в качестве композиции или состава, такой как фармацевтическая композиция или состав. Такие композиции можно использовать в соответствии с предусматриваемыми способами, например, для предупреждения или лечения заболеваний, состояний и нарушений, или в способах детекции, диагностики или прогнозирования.

[293] Термин "фармацевтический состав" относится к препарату, который имеет такую форму, чтобы обеспечить эффективность биологической активности активного ингредиента, содержащегося в нем, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для индивидуума, которому намереваются вводить состав.

[294] "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается ими, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

[295] В некоторых вариантах осуществления средство T-клеточной терапии, такое как модифицированные способами инженерии T-клетки (например, CAR T-клетки), составляют с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых аспектах выбор носителя частично определяется конкретной клеткой и/или способом введения. Таким образом, существует множество подходящих составов. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. В некоторых аспектах используют смесь двух или более консервантов. Консервант или их смесь обычно присутствуют в количестве от приблизительно 0,0001% до приблизительно 2% по массе всей композиции. Носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Фармацевтически приемлемые носители обычно являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, и они включают, но не ограничиваются ими: буферы, такие как фосфатный, цитратный и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметэтония; хлорид бензалкония; хлорид бензэтония; фенол, бутил или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (менее чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ).

[296] В некоторых аспектах в композиции включены буферные вещества. Подходящие буферные вещества включают, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. В некоторых аспектах используют смесь двух или более буферных веществ. Буферные вещества и их смеси обычно присутствуют в количестве от приблизительно 0,001% до приблизительно 4% по массе от всей композиции. Способы получения подлежащих введению фармацевтических композиций известны. Иллюстративные способы более подробно описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).

[297] Составы могут включать водные растворы. Состав или композиция также может содержать более одного активного ингредиента, пригодного для конкретного показания, заболевания или состояния, которое предупреждают или лечат в помощью клеток, включая один или несколько активных ингредиентов, активность которых дополняет клетки и/или соответствующие виды активности не оказывают неблагоприятного влияния друг на друга. Предпочтительно такие активные ингредиенты присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для намеченной цели. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает другие фармацевтически активные вещества или лекарственные средства, такие как химиотерапевтические средства, например, аспарагиназа, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и т.д.

[298] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит клетки в количествах, эффективных для лечения или предупреждения заболевания или состояния, таких как терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество. В некоторых вариантах осуществления мониторинг терапевтической или профилактической эффективности проводят путем периодической оценки подвергаемых лечению индивидуумов. Для многократных введений на протяжении нескольких суток или более, в зависимости от состояния, лечение повторяют до тех пор, пока не произойдет желаемое подавление симптомов заболевания. Однако могут быть пригодными другие режимы дозирования, и они могут быть определены. Требуемую дозировку можно доставлять посредством однократного болюсного введения композиции, посредством многократных болюсных введений композиции, или посредством непрерывной инфузии композиции.

[299] Клетки можно вводить с использованием стандартных способов введения, составов и/или устройств. Предусматриваются составы и устройства, такие как шприцы и флаконы, для хранения и введения композиций. Что касается клеток, введение может быть аутологичным или гетерологичным. Например, иммунореактивные клетки или предшественники можно получать от одного индивидуума и вводить тому же индивидууму или другому совместимому индивидууму. Иммунореактивные клетки периферической крови или их потомки (например, происходящие in vivo, ex vivo или in vitro) можно вводить посредством локализованной инъекции, в том числе введения через катетер, системной инъекции, локализованной инъекции, внутривенной инъекции или парентерального введения. При введении терапевтической композиции (например, фармацевтической композиции, содержащей модифицированную способами инженерии иммунореактивную клетку), ее обычно составляют в единичной дозированной инъекционной форме (раствор, суспензия, эмульсия).

[300] Составы включают составы для перорального, внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, легочного, трансдермального, внутримышечного, интраназального, буккального, сублингвального введения или введения с помощью суппозиториев. В некоторых вариантах осуществления средство или популяции клеток вводят парентерально. Термин "парентеральный", как используют в рамках изобретения, включат внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное и внутрибрюшинное введение. В некоторых вариантах осуществления средство или популяции клеток вводят индивидууму с использованием периферической системной доставки посредством внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции.

[301] В некоторых вариантах осуществления композиции предоставляют в качестве стерильных жидких препаратов, например, изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий, дисперсий или вязких композиций, которые в некоторых аспектах могут быть забуферены для определенного значения pH. Жидкие препараты обычно легче получить, чем гели, другие вязкие композиции и твердые композиции. Кроме того, жидкие композиции в некоторой степени удобнее вводить, особенно посредством инъекции. Вязкие композиции, с другой стороны, можно составлять в пределах подходящего диапазона вязкости для обеспечения более длительных периодов контакта с определенными тканями. Жидкие или вязкие композиции могут включать носители, которые могут представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и подходящие их смеси.

[302] Стерильные инъекционные растворы можно получать путем включения клеток в растворитель, например, в смеси с подходящим носителем, разбавителем или эксципиентом, таким как стерильная вода, физиологический солевой раствор, глюкоза, декстроза и т.п. Композиции также могут быть лиофилизированными. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие вещества, диспергирующие вещества или эмульгаторы (например, метилцеллюлоза), pH-буферные средства, гелеобразующие средства или повышающие вязкость добавки, консерванты, вкусовые добавки, красители и т.п., в зависимости от желаемого пути введения и препарата. Для получения подходящих препаратов в некоторых аспектах можно руководствоваться стандартными справочниками.

[303] Можно добавлять различные добавки, которые повышают стабильность и стерильность композиций, включая противомикробные консерванты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и буферы. Предупреждение действия микроорганизмов можно обеспечивать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Длительного всасывания инъекционной фармацевтической формы можно достигать с использованием средств для замедленного всасывания, например, моностеарата алюминия и желатина.

[304] Составы для применения для введения in vivo обычно являются стерильными. Стерильности можно без труда достигать, например, посредством фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны.

[305] Для предупреждения или лечения заболевания подходящая дозировка может зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа средства или средств, типа клеток или рекомбинантных рецепторов, тяжести и течения заболевания, введения средства или клеток для профилактических или терапевтических целей, предшествующей терапии, клинического анамнеза индивидуума и ответа на средство или клетки, и мнения лечащего врача. В некоторых вариантах осуществления композиции предпочтительно вводят индивидууму один раз или на протяжении серии введений.

IV. Лечение и способы

[306] В некоторых вариантах осуществления предусматриваемые способы ассоциированы с проведением клеточной терапии, например, для лечения заболеваний или состояний, включая различные опухоли. Способы вовлекают введение модифицированных способами генной инженерии клеток, экспрессирующих рекомбинантные рецепторы, предназначенные для распознавания и/или специфического связывания с молекулами, ассоциированными с заболеванием или состоянием, и приводят к ответу, такому как иммунный ответ, против таких молекул при связывании с такими молекулами. Рецепторы могут включать химерные рецепторы, например, химерные рецепторы антигена (CAR), и другие трансгенные рецепторы антигена, в том числе трансгенные T-клеточные рецепторы (TCR), в том числе любые рецепторы, описанные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления после предусматриваемых способов следует реэкспансия рекомбинантных иммунных клеток in vivo у индивидуума, например, путем вмешательства в область у индивидуума, в которой модифицированные способами инженерии клетки присутствуют, или вероятно будут присутствовать, или присутствовали, или вероятно присутствовали. В некоторых вариантах осуществления область может представлять собой область, содержащую экспрессирующие антиген клетки, распознаваемые модифицированными способами инженерии клетками, такую как очаг повреждения, например опухоль, или микроокружение очага повреждения, например, микроокружение опухоли.

[307] В некоторых вариантах осуществления дозу клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, вводят индивидууму для лечения или предупреждения заболеваний, состояний и нарушений, в том числе злокачественных опухолей. В некоторых вариантах осуществления клетки, популяции и композиции вводят индивидууму или пациенту, имеющему конкретное заболевание или состояние, подлежащее лечению, например, посредством адоптивной клеточной терапии, такой как адоптивная терапия T-клетками. В некоторых вариантах осуществления клетки и композиции, такие как сконструированные способами инженерии композиции и готовые к употреблению композиции после инкубации и/или других стадий переработки вводят индивидууму, такому как индивидуум, имеющий заболевание или состояние, или имеющий риск его развития. В некоторых аспектах, способы, таким образом, осуществляют лечение, например, смягчение, одного или нескольких симптомов заболевания или состояния, например, путем уменьшения опухолевой нагрузки при злокачественной опухоли, экспрессирующей антиген, распознаваемый модифицированной способами инженерии T-клеткой.

[308] Способы введения введение клеток для адоптивной клеточной терапии известны и могут быть использованы совместно с предусматриваемыми способами и композициями. Например, способы адоптивной T-клеточной терапии описаны, например, в публикации патентной заявки США № 2003/0170238, Gruenberg et al; патенте США № 4690915, выданном Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). См., например, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.

[309] Заболевание или состояние, которое лечат, может представлять собой любое заболевание или состояние, при котором экспрессия антигена ассоциирована и/или вовлечена в этиологию заболевания, состояния или нарушения, например, вызывает, усиливает или иным образом вовлечена в такое заболевание, состояние или нарушение. Иллюстративные заболевания и состояния могут включать заболевания или состояния, ассоциированные со злокачественным новообразованием или трансформацией клеток (например, злокачественной опухолью), аутоиммунным или воспалительным заболеванием, или инфекционном заболеванием, например, вызываемым бактериальным, вирусным или другим патогеном. Иллюстративные антигены, которые включают антигены, ассоциированные с различными заболеваниями и состояниями, которые можно лечить, описаны выше. В конкретных вариантах осуществления химерный рецептор антигена или трансгенный TCR специфически связывается с антигеном, ассоциированным с заболеванием или состоянием.

[310] Заболевания, состояния и нарушения включают опухоли, в том числе солидные опухоли, гематологические злокачественные опухоли и меланомы, и включая локализованные и метастазирующие опухоли, инфекционные заболевания, такие как инфекция вирусом или другим патогеном, например, ВИЧ, HCV, HBV, CMV, и паразитарные заболевания, и аутоиммунные и воспалительные заболевания. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой опухоль, рак, злокачественную опухоль, новообразование или другое пролиферативное заболевание или нарушение. Такие заболевания включают, но не ограничиваются ими, лейкоз, лимфому, например, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый лимфобластный лейкоз (ALL), неходжскинскую лимфому, острый миелоидный лейкоз, множественную миелому, рефрактерную фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, вялотекущую B-клеточную лимфому, B-клеточные злокачественные опухоли, рак толстого кишечника, легкого, печени, молочной железы, предстательной железы, яичника, кожи, меланому, рак кости, и рак головного мозга, рак яичника, эпителиальные злокачественные опухоли, почечноклеточный рак, аденокарциному поджелудочной железы, лимфому Ходжкина, карциному шейки матки, рак ободочной и прямой кишки, глиобластому, нейробластому, саркому Юинга, медуллобластому, остеосаркому, синовиальную саркому и/или мезотелиому. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет острый лимфобластный лейкоз (ALL). В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет неходжскинскую лимфому.

[311] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой инфекционное заболевание или состояние, такое как, но не ограничиваясь ими, вирусные, ретровирусные, бактериальные и протозойные инфекции, иммунодефицит, инфекции цитомегаловирусом (CMV), вирусом Эпштейна-Барр (EBV), аденовирусом, полиомавирусом BK. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой аутоиммунное или воспалительное заболевание или состояние, такое как артрит, например, ревматоидный артрит (RA), диабет типа I, системная красная волчанка (SLE), воспалительное заболевание кишечника, псориаз, склеродермия, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, болезнь Грэйвса, болезнь Крона, рассеянный склероз, астма, и/или заболевание или состояние, ассоциированное с трансплантацией.

[312] В некоторых вариантах осуществления антиген, ассоциированный с заболеванием или нарушением, представляет собой или включает антиген, выбранный из интегрина αvβ6 (интегрин avb6), антигена созревания B-клеток (BCMA), B7-H3, B7-H6, карбоангидразы 9 (CA9, также известная как CAIX или G250), антигена злокачественной опухоли-яичка, антигена злокачественной опухоли/яичка 1B (CTAG, также известный как NY-ESO-1 и LAGE-2), карциноэмбрионального антигена (CEA), циклина, циклина A2, лиганда 1 хемокина с C-C мотивом (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, белка эпидермального фактора роста (EGFR), укороченного белка эпидермального фактора роста (tEGFR), мутанта рецептора эпидермального фактора роста типа III (EGFR vIII), эпителиального гликопротеина 2 (EPG-2), эпителиального гликопротеина 40 (EPG-40), эфрина B2, рецептора эфрина A2 (EPHa2), рецептора эстрогена, Fc-рецептор подобного белка 5 (FCRL5; также известный как гомолог 5 Fc-рецептора или FCRH5), фетального рецептора ацетилхолина (фетальный AchR), фолат-связывающего белка (FBP), рецептора фолатов альфа, фетального рецептора ацетилхолина, ганглиозида GD2, O-ацетилированного GD2 (OGD2), ганглиозида GD3, гликопротеина 100 (gp100), сопряженного с G-белком рецептора 5D (GPCR5D), Her2/neu (рецепторная тирозинкиназа erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), димеров erbB, высокомолекулярного ассоциированного с меланомой антигена человека (HMW-MAA), поверхностного антигена гепатита B, лейкоцитарного антигена A1 человека (HLA-A1), лейкоцитарного антигена A2 человека (HLA-A2), рецептора IL-22 альфа(IL-22Ra), рецептора IL-13 альфа 2 (IL-13Ra2), рецептора домена киназной вставки (kdr), легкой цепи каппа, молекулы клеточной адгезии L1 (L1-CAM), эпитопа CE7 L1-CAM, представителя A семейства 8 белков с лейцин-богатыми повторами (LRRC8A), антигена Льюиса Y, ассоциированного с меланомой антигена (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, мезотелина, c-Met, цитомегаловируса мышей (CMV), муцина 1 (MUC1), MUC16, лигандов представителя D группы 2 натуральных киллеров (NKG2D), мелана A (MART-1), молекулы адгезии нервных клеток (NCAM), онкофетального антигена, предпочтительно экспрессирующегося антигена меланомы (PRAME), рецептора прогестерона, простатспецифического антигена, антигена стволовых клеток предстательной железы (PSCA), простатспецифического мембранного антигена (PSMA), подобного рецепторной тирозинкиназе орфанного рецептора 1 (ROR1), сурвивина, гликопротеина трофобластов (TPBG, также известный как 5T4), ассоциированного с опухолью гликопротеина 72 (TAG72), рецептора сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGFR), рецептора 2 сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGFR2), антигена опухоли Вильмса 1 (WT-1), патоген-специфического антигена или антигена, ассоциированного с универсальной меткой, и/или биотинилированных молекул, и/или молекул, экспрессируемых ВИЧ, HCV, HBV или другими патогенами. Антигены, на которые нацелены рецепторы, в некоторых вариантах осуществления включают антигены, ассоциированные с B-клеточной злокачественной опухолью, такие как любой из ряда известных B-клеточных маркеров. В некоторых вариантах осуществления антиген, на который нацелен рецептор, представляет собой или включает CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig-каппа, Ig-лямбда, CD79a, CD79b или CD30. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой или включает патоген-специфический антиген или экспрессируемый патогеном антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой вирусный антиген (такой как вирусный антиген из ВИЧ, HCV, HBV и т.д.), бактериальные антигены и/или паразитические антигены.

[313] В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную терапию T-клетками, проводят посредством аутологичного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают от индивидуума, которому будут проводить клеточную терапию, или из образца, полученного от такого индивидуума. Таким образом, в некоторых аспектах клетки получают от индивидуума, например, пациента, нуждающегося в лечении, и после выделения и обработки клетки вводят тому же индивидууму.

[314] В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную терапию T-клетками, проводят посредством аллогенного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают от индивидуума, отличного от индивидуума, которому намереваются проводить или в конечном итоге проводят клеточную терапию, например, от первого индивидуума. В таких вариантах осуществления клетки затем вводят другому индивидууму, например, второму индивидууму, того же вида. В некоторых вариантах осуществления первый и второй индивидуумы являются генетически идентичными. В некоторых вариантах осуществления первый и второй индивидуумы являются генетически сходными. В некоторых вариантах осуществления у второго индивидуума экспрессируется тот же класс или надтип HLA, что и у первого индивидуума.

[315] Клетки можно вводить любым подходящим путем, например, посредством болюсной инфузии, инъекции, например, внутривенных или подкожных инъекций, внутриглазной инъекции, окологлазной инъекции, субретинальной инъекции, инъекции внутрь стекловидного тела, транссептальной инъекции, субсклеральной инъекции, интрахориоидальной инъекции, внутрикамерной инъекции, инъекции под конъюнктиву, субконъюнктивальной инъекции, инъекции в субтеноново пространство, ретробульбарной инъекции, околобульбарной инъекции или задней околосклеральной доставки. В некоторых вариантах осуществления их вводят парентеральным, внутрилегочным и интраназальным путем, и, если желательно для местного лечения, посредством внутриочагового введения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. В некоторых вариантах осуществления данную возу вводят посредством однократного болюсного введения клеток. В некоторых вариантах осуществления ее вводят посредством множества болюсных введений клеток, например, на протяжении периода, составляющего не более 3 суток, или посредством непрерывной инфузии клеток.

[316] Для предупреждения или лечения заболевания подходящая дозировка может зависеть от типа заболевания, подвергаемого лечению, типа клеток или рекомбинантных рецепторов, тяжести и течения заболевания, введения клеток в профилактических или терапевтических целях, предшествующей терапии, клинического анамнеза индивидуума и ответа на клетки, и мнения лечащего врача. В некоторых вариантах осуществления композиции и клетки могут быть введены индивидууму один раз или на протяжении серии введений.

[317] В некоторых вариантах осуществления клетки вводят в качестве части комбинированного лечения, например, одновременно или последовательно в любом порядке с другим терапевтическим вмешательством, таким как антитело, или модифицированная способами инженерии клетка, или рецептор, или средство, такое как цитотоксическое или терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами или совместно с другим терапевтическим вмешательством, либо одновременно, либо последовательно в любом порядке. В некоторых контекстах клетки вводят совместно с другой терапией достаточно близко по времени, чтобы клеточные популяции усиливали эффект одного или нескольких дополнительных терапевтических средств, или наоборот. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят до одного или нескольких дополнительных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят после одного или нескольких дополнительных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления одно или несколько дополнительных средств включают цитокин, такой как IL-2, например, для увеличения персистенции. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение химиотерапевтического средства. В некоторых случаях такое химиотерапевтическое средство не является тем же средство, которое используют в предусматриваемых способах вмешательства в очаг повреждения.

[318] В некоторых вариантах осуществления способы включают введение химиотерапевтического средства, например, кондиционного химиотерапевтического средства, например, для уменьшения опухолевой нагрузки перед введением.

[319] В некоторых аспектах предварительная подготовка индивидуумов вызывающими иммунодеплецию (например, лимфодеплецию) способами терапии может улучшить эффекты адоптивной клеточной терапии (ACT).

[320] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способы включают введение прекондиционного средства, такого как вызывающее лимфодеплецию или химиотерапевтическое средство, такое как циклофосфамид, флударабин или их комбинации, индивидууму перед началом клеточной терапии. Например, индивидууму можно вводить прекондиционное средство за по меньшей мере 2 суток, например, по меньшей мере за 3, 4, 5, 6 или 7 суток до начала клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят прекондиционное средство не более чем за 7 суток, например, не более чем за 6, 5, 4, 3 или 2 суток до начала клеточной терапии.

[321] В некоторых вариантах осуществления индивидууму предварительно вводят циклофосфамид в дозе от или приблизительно от 20 мг/кг до 100 мг/кг, например от или приблизительно от 40 мг/кг до 80 мг/кг. В некоторых аспектах индивидууму предварительно вводят ровно или приблизительно 60 мг/кг циклофосфамида. В некоторых вариантах осуществления циклофосфамид можно вводить в виде однократной дозы или можно вводить в виде множества доз, например, каждые сутки, раз в двое суток или раз в трое суток. В некоторых вариантах осуществления циклофосфамид вводят один раз в сутки на протяжении одних или двух суток.

[322] В некоторых вариантах осуществления, когда вызывающее лимфодеплецию средство включает флударабин, индивидууму вводят флударабин в дозе от или приблизительно от 1 мг/м² до 100 мг/м², например, от или приблизительно от 10 мг/м² до 75 мг/м², от 15 мг/м² до 50 мг/м², от 20 мг/м² до 30 мг/м², или от 24 мг/м² до 26 мг/м². В некоторых случаях индивидууму вводят 25 мг/м² флударабина. В некоторых вариантах осуществления флударабин можно вводить в виде однократной дозы или можно вводить в виде множества доз, например, каждые сутки, раз в двое суток или раз в трое суток. В некоторых вариантах осуществления флударабин вводят каждые сутки, например, в течение 1-5 суток, например, в течение 3-5 суток.

[323] В некоторых вариантах осуществления вызывающее лимфодеплецию средство включает комбинацию средств, такую как комбинация циклофосфамида и флударабина. Таким образом, комбинация средств может включать циклофосфамид в любой дозе или по любой схеме введения, таких как доза и схема введения, описанные выше, и флударабин в любой дозе и по любой схеме введения, таких как доза и схема введения, описанные выше. Например, в некоторых аспектах, индивидууму вводят 60 мг/кг (~2 г/м²) циклофосфамида и от 3 до 5 доз флударабина, 25 мг/м², перед первой или последующей дозой.

[324] После введения клеток биологическую активность модифицированных способами инженерии популяций клеток в некоторых вариантах осуществления определяют, например, любым из ряда известных способов. Параметры для оценки включают специфическое связывание модифицированных способами инженерии или природных T-клеток или других иммунных клеток с антигеном in vivo, например, посредством визуализации, или ex vivo, например, посредством ELISA или проточной цитометрии. В определенных вариантах осуществления способность модифицированных способами инженерии клеток разрушать клетки-мишени можно определять с использованием любого подходящего способа, известного в данной области, такого как способы анализа цитотоксичности, описанные, например, в Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), и Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). В определенных вариантах осуществления биологическую активность клеток определяют посредством анализа экспрессии и/или секреции одного или нескольких цитокинов, таких как CD107a, IFNγ, IL-2 и TNF. В некоторых аспектах биологическую активность определяют путем оценки клинического исхода, такого как снижение опухолевой массы или нагрузки.

[325] В определенных вариантах осуществления модифицированные способами инженерии клетки далее модифицируют любым количеством способов, чтобы увеличить их терапевтическую или профилактическую эффективность. Например, модифицированные способами инженерии CAR или TCR, экспрессируемый популяцией, можно конъюгировать либо прямо, либо непрямо через линкер с нацеливающей частью. Способы конъюгации соединений, например, CAR или TCR, с нацеливающими частями известны в данной области. См., например, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995), и патент США 5087616.

A. Дозирование

[326] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит клетки в количествах, эффективных для лечения или предупреждения заболевания или состояния, таких как терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество. В некоторых вариантах осуществления композиция включает клетки в количестве, эффективном для уменьшения нагрузки заболеванием или состоянием.

[327] В контексте адоптивной клеточной терапии введение данной "дозы" охватывает введение данного количества или числа клеток в качестве одной композиции и/или одного непрерывного введения, например, в качестве однократной инъекции или непрерывной инфузии, и также охватывает введение данного количества или числа клеток в качестве разделенной дозы, предоставленной в виде множества индивидуальных композиций или инфузий, на протяжении определенного периода времени, которое составляет не более 3 суток. Таким образом, в некоторых контекстах доза представляет собой однократное или непрерывное введение определенного количества клеток, осуществляемое или начинающееся в один момент времени. Однако в некоторых контекстах дозу вводят в виде множества инъекций или инфузий на протяжении периода, составляющего не более трех суток, например, один раз в сутки на протяжении трех суток или на протяжении двух суток, посредством множества инфузий на протяжении одних суток.

[328] Таким образом, в некоторых аспектах клетки дозы вводят в одной фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления клетки дозы вводят в множестве композиций, в совокупности содержащих клетки первой дозы.

[329] Термин "разделенная доза" относится к дозе, которая разделена так, что ее вводят на протяжении более чем одних суток. Этот тип дозирования охватывается способами по настоящему изобретению и считается однократной дозой.

[330] Таким образом в некоторых аспектах дозу можно вводить в виде разделенной дозы. Например, в некоторых вариантах осуществления дозу можно вводить индивидууму на протяжении 2 суток или на протяжении 3 суток. Иллюстративные способы разделенного дозирования включают введение 25% дозы в первый день и введение остальных 75% дозы на второй день. В других вариантах осуществления 33% первой дозы могут быть введены в первый день, и остальные 67% могут быть введены на второй день. В некоторых аспектах 10% дозы вводят в первый день, 30% дозы вводят на второй день и 60% дозы вводят на третий день. В некоторых вариантах осуществления разделенная доза не распределена более чем на 3 суток.

[331] В некоторых вариантах осуществления клетки дозы можно вводить посредством введения множества композиций или растворов, например, первого и второго, необязательно более, каждый из которых содержит некоторое количество клеток дозы. В некоторых аспектах, множество композиций, каждая из которых содержит отличающуюся популяцию и/или подтипы клеток, вводят отдельно или независимо, необязательно в течение определенного периода времени. Например, популяции или подтипы клеток могут включать CD8⁺ и CD4⁺ T-клетки, соответственно, и/или CD8+- и CD4+-обогащенные популяции, соответственно, например, CD4+ и/или CD8+ T-клетки, которые в каждом случае индивидуально включают клетки, модифицированные способами генной инженерии для экспрессии рекомбинантного рецептора. В некоторых вариантах осуществления введение дозы включает введение первой композиции, содержащей дозу CD8+ T-клеток или дозу CD4+ T-клеток, и введение второй композиции, содержащей другую дозу CD4+ T-клеток и CD8+ T-клеток.

[332] В некоторых вариантах осуществления введение композиции или дозы, например, введение множества композиций клеток, вовлекает введение композиций клеток по отдельности. В некоторых аспектах отдельное введение проводят одновременно или последовательно в любом порядке. В некоторых вариантах осуществления доза включает первую композицию и вторую композицию, и первую композицию и вторую композицию вводят с интервалом от 0 до 12 часов, от 0 до 6 часов или от 0 до 2 часов. В некоторых вариантах осуществления начало введение первой композиции и начало введение второй композиции проводят с интервалом не более 2 часов, не более 1 часа, или не более 30 минут, не более 15 минут, не более 10 минут или не более 5 минут. В некоторых вариантах осуществления начало и/или завершение введения первой композиции и завершение и/или начало введения второй композиции проводят в пределах не более 2 часов, не более 1 часа, или не более 30 минут, не более 15 минут, не более 10 минут или не более 5 минут.

[333] В некоторых композициях первая композиция, например, первая композиция дозы, содержит CD4+ T-клетки. В некоторых композициях, первая композиция, например, первая композиция дозы, содержит CD8+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления первую композицию вводят до второй композиции.

[334] В некоторых вариантах осуществления доза или композиция клеток включает определенное или заданное соотношение CD4+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, и CD8+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, и/или CD4+ клеток и CD8+ клеток, которое необязательно составляет приблизительно 1:1 или от приблизительно 1:3 до приблизительно 3:1, как например, приблизительно 1:1. В некоторых аспектах введение композиции или дозы с заданным или желаемым соотношением различных популяций клеток (таким как соотношение CD4+:CD8+ или соотношение CAR+CD4+:CAR+CD8+, например, 1:1) вовлекает введение композиции клеток, содержащей одну из популяций, а затем введение отдельной композиции клеток, содержащей другую из популяций, где введение происходит в или приблизительно в заданном или желаемом соотношении.

[335] В некоторых вариантах осуществления индивидууму можно вводить одну или несколько последующих или повторных доз клеток. В некоторых вариантах осуществления последующую или повторную дозу вводят более чем или более чем приблизительно через 7 суток, 14 суток, 21 сутки, 28 суток или 35 суток после начала введения первой дозы клеток. Последующая или повторная доза клеток может быть большей, приблизительно такой же или меньшей, чем первая доза. В некоторых вариантах осуществления проведение T-клеточной терапии, такое как введение первой и/или второй дозы, может повторяться.

[336] В некоторых вариантах осуществления дозу клеток вводят индивидуумам в соответствии с предусматриваемыми способами. В некоторых вариантах осуществления размер или время введения доз определяют в зависимости от конкретного заболевания или состояния у индивидуума. Специалист в данной области способен эмпирически определить размер или время введения доз конкретного заболевания. Дозировки могут варьироваться в зависимости от признаков конкретного заболевания или нарушения, и/или пациента, и/или других способов лечения.

[337] В определенных вариантах осуществления клетки или отдельные популяции подтипов клеток вводят индивидууму в диапазоне от приблизительно 0,1 миллиона до приблизительно 100 миллиардов клеток и/или это количество клеток на килограмм массы тела индивидуума, как например, от 0,1 миллиона до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 25 миллионов клеток, приблизительно 500 миллионов клеток, приблизительно 1 миллиард клеток, приблизительно 5 миллиардов клеток, приблизительно 20 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 40 миллиардов клеток, или диапазон, определяемый любыми двумя из вышеуказанных величин), от 1 миллиона до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 25 миллионов клеток, приблизительно 500 миллионов клеток, приблизительно 1 миллиард клеток, приблизительно 5 миллиардов клеток, приблизительно 20 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 40 миллиардов клеток, или диапазон, определяемый любыми двумя из вышеуказанных величин), например, от приблизительно 10 миллион до приблизительно 100 миллиардов клеток (например, приблизительно 20 миллионов клеток, приблизительно 30 миллионов клеток, приблизительно 40 миллионов клеток, приблизительно 60 миллионов клеток, приблизительно 70 миллионов клеток, приблизительно 80 миллионов клеток, приблизительно 90 миллионов клеток, приблизительно 10 миллиардов клеток, приблизительно 25 миллиардов клеток, приблизительно 50 миллиардов клеток, приблизительно 75 миллиардов клеток, приблизительно 90 миллиардов клеток, или диапазон, определяемый любыми двумя из вышеуказанных величин), и в некоторых случаях от приблизительно 100 миллионов клеток до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 120 миллионов клеток, приблизительно 250 миллионов клеток, приблизительно 350 миллионов клеток, приблизительно 450 миллионов клеток, приблизительно 650 миллионов клеток, приблизительно 800 миллионов клеток, приблизительно 900 миллионов клеток, приблизительно 3 миллиарда клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 45 миллиардов клеток) или any любую величину между этими диапазонами и/или на килограмм массы тела индивидуума. Дозировка может варьироваться в зависимости от признаков, характерных для заболевания или нарушения, и/или пациента и/или других способов лечения. В некоторых вариантах осуществления такие величины относятся к количествам клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор; в других вариантах осуществления они относятся к количеству T-клеток, или PBMC, или всех вводимых клеток.

[338] В некоторых вариантах осуществления, например, когда индивидуумом является человек, доза включает менее чем приблизительно 5×10⁸ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR), T-клеток или мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), например, в диапазоне приблизительно от 1×10⁶ до 5×10⁸ таких клеток, таком как 2×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸ или 5×10⁸ всех таких клеток или в диапазоне между любыми двумя из вышеуказанных величин.

[339] В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток от или от приблизительно 1×10⁵ до 5×10⁸ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех -клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), от или от приблизительно 5×10⁵ до 1×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) или от или от приблизительно 1×10⁶ до 1×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), в каждом случае включительно. В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы клеток, содержащей количество клеток, составляющее по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1×10⁵ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), как например, по меньшей мере или по меньшей мере 1×10⁶, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1×10⁷, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1×10⁸ таких клеток. В некоторых вариантах осуществления это количество относится к общему количеству CD3+ или CD8+ клеток, в некоторых случаях также клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR+). В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток от или от приблизительно 1×10⁵ до 5×10⁸ CD3+ или CD8+ всех T-клеток или CD3+ или CD8+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, от или от приблизительно 5×10⁵ до 1×10⁷ CD3+ или CD8+ всех T-клеток или CD3+ или CD8+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, или от или от приблизительно 1×10⁶ до 1×10⁷ CD3+ или CD8+ всех T-клеток или CD3+ или CD8+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, в каждом случае включительно. В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток, составляющее от или от приблизительно 1×10⁵ до 5×10⁸ всех CD3+/CAR+ или CD8+/CAR+ клеток, от или от приблизительно 5×10⁵ до 1×10⁷ всех CD3+/CAR+ или CD8+/CAR+ клеток, или от или от приблизительно 1×10⁶ до 1×10⁷ всех CD3+/CAR+ или CD8+/CAR+ клеток, в каждом случае включительно.

[340] В некоторых вариантах осуществления T-клетки дозы включают CD4+ T-клетки, CD8+ T-клетки или CD4+ и CD8+ T-клетки.

[341] В некоторых вариантах осуществления, например, когда индивидуум является человеком, CD8+ T-клетки дозы, включая дозу, включающую CD4+ и CD8+ T-клетки, включают приблизительно от 1×10⁶ до 5×10⁸ всех CD8+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR), например, в диапазоне приблизительно от 5×10⁶ до 1×10⁸ таких клеток, таком как 1×10⁷, 2,5×10⁷, 5×10⁷, 7,5×10⁷, 1×10⁸ или 5×10⁸ всех таких клеток, или диапазон между любыми из двух вышеуказанных величин. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят множество доз, и каждая из доз или общая доза могут находиться в пределах любых из вышеуказанных величин. В некоторых вариантах осуществления доза клеток включает введение от или от приблизительно 1×10⁷ до 0,75×10⁸ всех экспрессирующих рекомбинантный рецептор CD8+ T-клеток, от 1×10⁷ до 2,5×10⁷ всех экспрессирующих рекомбинантный рецептор CD8+ T-клеток, от или от приблизительно 1×10⁷ до 0,75×10⁸ всех экспрессирующих рекомбинантный рецептор CD8+ T-клеток, в каждом случае включительно. В некоторых вариантах осуществления доза клеток включает введение ровно или приблизительно 1×10⁷, 2,5×10⁷, 5×10⁷ 7,5×10⁷, 1×10⁸ или 5×10⁸ всех экспрессирующих рекомбинантный рецептор CD8+ T-клеток.

[342] В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток от или от приблизительно 1×10⁵ до 5×10⁸ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех -клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), от или от приблизительно 5×10⁵ до 1×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) или от или от приблизительно 1×10⁶ до 1×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), в каждом случае включительно. В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы клеток, содержащей количество клеток, составляющее по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1×10⁵ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), как например, по меньшей мере или по меньшей мере 1×10⁶, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1×10⁷, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1×10⁸ таких клеток. В некоторых вариантах осуществления это количество относится к общему количеству CD3+ или CD8+ клеток, в некоторых случаях также клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR+). В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток от или от приблизительно 1×10⁵ до 5×10⁸ CD3+ или CD8+ всех T-клеток или CD3+ или CD8+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, от или от приблизительно 5×10⁵ до 1×10⁷ CD3+ или CD8+ всех T-клеток или CD3+ или CD8+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, или от или от приблизительно 1×10⁶ до 1×10⁷ CD3+ или CD8+ всех T-клеток или CD3+ или CD8+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, в каждом случае включительно. В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток, составляющее от или от приблизительно 1×10⁵ до 5×10⁸ всех CD3+/CAR+ или CD8+/CAR+ клеток, от или от приблизительно 5×10⁵ до 1×10⁷ всех CD3+/CAR+ или CD8+/CAR+ клеток, или от или от приблизительно 1×10⁶ до 1×10⁷ всех CD3+/CAR+ или CD8+/CAR+ клеток, в каждом случае включительно.

[343] В определенных вариантах осуществления клетки или отдельные популяции подтипов клеток вводят индивидууму в диапазоне от приблизительно 0,1 миллиона до приблизительно 100 миллиардов клеток и/или это количество клеток на килограмм массы тела индивидуума, например, от 0,1 миллиона до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 25 миллионов клеток, приблизительно 500 миллионов клеток, приблизительно 1 миллиард клеток, приблизительно 5 миллиардов клеток, приблизительно 20 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 40 миллиардов клеток, или диапазон, определяемый любыми двумя из вышеуказанных величин), от 1 миллиона до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 25 миллионов клеток, приблизительно 500 миллионов клеток, приблизительно 1 миллиард клеток, приблизительно 5 миллиардов клеток, приблизительно 20 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 40 миллиардов клеток, или диапазон, определяемый любыми двумя из вышеуказанных величин), например, от приблизительно 10 миллионов до приблизительно 100 миллиардов клеток (например, приблизительно 20 миллионов клеток, приблизительно 30 миллионов клеток, приблизительно 40 миллионов клеток, приблизительно 60 миллионов клеток, приблизительно 70 миллионов клеток, приблизительно 80 миллионов клеток, приблизительно 90 миллионов клеток, приблизительно 10 миллиардов клеток, приблизительно 25 миллиардов клеток, приблизительно 50 миллиардов клеток, приблизительно 75 миллиардов клеток, приблизительно 90 миллиардов клеток, или диапазон, определяемый любыми двумя из вышеуказанных величин), и в некоторых случаях от приблизительно 100 миллионов клеток до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 120 миллионов клеток, приблизительно 250 миллионов клеток, приблизительно 350 миллионов клеток, приблизительно 450 миллионов клеток, приблизительно 650 миллионов клеток, приблизительно 800 миллионов клеток, приблизительно 900 миллионов клеток, приблизительно 3 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 45 миллиардов клеток) или любую величину между этими диапазонами и/или на килограмм массы тела индивидуума. Дозировки могут варьироваться в зависимости от признаков, характерных для заболевания или нарушения, и/или пациента и/или других способов лечения. В некоторых вариантах осуществления такие величины относятся к количествам экспрессирующих рекомбинантный рецептор клеток; в других вариантах осуществления они относятся к количеству T-клеток, или PBMC, или всех введенных клеток.

[344] В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, включающей количество клеток, которое составляет по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или составляет или составляет приблизительно 0,1×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума, 0,2×10⁶ клеток/кг, 0,3×10⁶ клеток/кг, 0,4×10⁶ клеток/кг, 0,5×10⁶ клеток/кг, 1×10⁶ клеток /кг, 2,0×10⁶ клеток/кг, 3×10⁶ клеток/кг или 5×10⁶ клеток/кг.

[345] В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток, которое составляет от или приблизительно от 0,1×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 1,0×10⁷ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг до 3×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг до 2×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг до 1×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг до 3×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг до 2×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 2,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 2,0×10⁶ клеток/кг до 3×10⁶ клеток/кг, или от или приблизительно от 3,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, в каждом случае включительно.

[346] В некоторых вариантах осуществления доза клеток содержит от или приблизительно от 2×10⁵ клеток/кг до или до приблизительно 2×10⁶ клеток/кг, как например, от или приблизительно от 4×10⁵ клеток/кг до или до приблизительно 1×10⁶ клеток/кг или от или приблизительно от 6×10⁵ клеток/кг до или до приблизительно 8×10⁵ клеток/кг. В некоторых вариантах осуществления доза клеток содержит не более 2×10⁵ клеток (например, антигенэкспрессирующих клеток, таких как CAR-экспрессирующие клетки) на килограмм массы тела индивидуума (клеток/кг), например, не более чем или приблизительно 3×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 4×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 5×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 6×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 7×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 8×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 9×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 1×10⁶ клеток/кг, или не более чем или приблизительно 2×10⁶ клеток/кг. В некоторых вариантах осуществления доза клеток содержит по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или ровно или приблизительно 2×10⁵ клеток (например, антигенэкспрессирующих клеток, таких как CAR-экспрессирующие клетки) на килограмм массы тела индивидуума (клеток/кг), например, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или ровно, или приблизительно 3×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или ровно, или приблизительно 4×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или ровно, или приблизительно 5×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или ровно, или приблизительно 6×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или ровно, или приблизительно 7×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или ровно, или приблизительно 8×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или ровно, или приблизительно 9×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или ровно, или приблизительно 1×10⁶ клеток/кг, или по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или ровно, или приблизительно 2×10⁶ клеток/кг.

[347] В некоторых вариантах осуществления клетки вводят в требуемой дозировке, которая в некоторых аспектах включает требуемую дозу или количество клеток или типа(ов) клеток, и/или требуемое соотношение типов клеток. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления дозировка клеток основана на общем количестве клеток (или количество на кг массы тела) и требуемом соотношении индивидуальных популяций или подтипов, таком как соотношение CD4+ и CD8+. В некоторых вариантах осуществления дозировка клеток основана на требуемом общем количестве (или количестве на кг массы тела) клеток в отдельных популяциях или отдельных типах клеток. В некоторых вариантах осуществления дозировка основана на комбинации таких признаков, таких как требуемое количество всех клеток, требуемое соотношение и требуемое общее количество клеток в отдельных популяциях.

[348] В некоторых вариантах осуществления популяции или подтипы клеток, такие как CD8⁺ и CD4⁺ T-клетки, вводят на уровне или в пределах допустимого различия требуемой дозы всех клеток, такой как требуемая доза T-клеток. В некоторых аспектах требуемая доза представляет собой требуемое количество клеток или требуемое количество клеток на единицу массы тела индивидуума, которому клетки вводят, например, количество клеток/кг. В некоторых аспектах требуемая доза находится на уровне или выше минимального количества клеток или минимального количества клеток на единицу массы тела. В некоторых аспектах, седи всех клеток, введенных в требуемой дозе, индивидуальные популяции или подтипы присутствуют на уровни или близко к конечному соотношению (такому как соотношение CD4⁺ и CD8⁺), например, в пределах определенного допустимого различия или ошибки такого соотношения.

[349] В некоторых вариантах осуществления клетки вводят на уровне или в пределах допустимого различия для требуемой дозы одной или нескольких отдельных популяций или подтипов клеток, такой как требуемой CD4+ клеток и/или требуемая доза CD8+ клеток. В некоторых аспектах требуемая клеток представляет собой требуемое количество клеток подтипа или популяции или требуемое количество таких клеток на единицу массы тела индивидуума, которому клетки вводят, например, количество клеток/кг. В некоторых аспектах требуемая доза находится на уровне или выше минимального количества клеток популяции или подтипа или минимального количества популяции или подтипа на единицу массы тела.

[350] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления дозировка основана на требуемой фиксированной дозе всех клеток и требуемом соотношении и/или основана на требуемой фиксированной дозе одного или нескольких, например каждого, из отдельных подтипов или субпопуляций. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления дозировка основана на требуемой фиксированной или минимальной дозе T-клеток и требуемом соотношении CD4⁺ и CD8⁺ клеток, и/или основана на требуемой фиксированной или минимальной дозе CD4⁺ и/или CD8⁺ клеток.

[351] В некоторых вариантах осуществления клетки вводят на уровне или в пределах допустимого диапазона требуемого конечного соотношения множества популяций или подтипов клеток, таких как CD4+ и CD8+ клетки или подтипы. В некоторых аспектах требуемое соотношение может представлять собой определенное соотношение, или оно может представлять собой диапазон соотношений. например, в некоторых вариантах осуществления требуемое соотношение (например, соотношение CD4⁺ и CD8⁺ клеток) составляет от или приблизительно от 5:1 до или до приблизительно 5:1 (или более чем приблизительно 1:5 и менее чем приблизительно 5:1), или от или приблизительно от 1:3 до или приблизительно до 3:1 (или более чем приблизительно 1:3 и менее чем приблизительно 3:1), например, от или приблизительно от 2:1 до или до приблизительно 1:5 (или более чем приблизительно 1:5 и менее чем приблизительно 2:1, например, ровно или приблизительно 5:1, 4,5:1, 4:1, 3,5:1, 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,9:1, 1,8:1, 1,7:1, 1,6:1, 1,5:1, 1,4:1, 1,3:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4, 1:1,5, 1:1,6, 1:1,7, 1:1,8, 1:1,9: 1:2, 1:2,5, 1:3, 1:3,5, 1:4, 1:4,5 или 1:5. В некоторых аспектах, допустимое различие находится в пределах приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 3%, приблизительно 4% приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50% от требуемого соотношения, включая любую величину между этими диапазонами.

[352] В конкретных вариантах осуществления количества и/или концентрации клеток относятся к количеству экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR) клеток. В других вариантах осуществления количества и/или концентрации клеток относятся к количеству или концентрации всех вводимых клеток, T-клеток или мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC).

[353] В некоторых аспектах величину дозы определяют, исходя из одного или нескольких критериев, таких как ответ индивидуума на предшествующее лечение, например химиотерапию, нагрузка заболеванием у индивидуума, такая как опухолевая нагрузка, объем, размер или степень, выраженность или тип метастазов, стадия и/или вероятность или встречаемость у индивидуума токсических исходов, например, CRS, синдрома активации макрофагов, синдрома лизиса опухоли, нейротоксичности и/или иммунного ответа хозяина против вводимых клеток и/или рекомбинантных рецепторов.

B. Вмешательство и/или лечение

[352] Совместно с введением дозы модифицированных способами генной инженерии клеток, таких как клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, например CAR+ T-клетки, можно использовать любой способ вмешательства в область, например, очаг повреждения, в которой клетки присутствуют, или вероятно будут присутствовать, и/или обеспечения лечения, который включает одно или несколько из физического или механического манипулирования над очагом повреждения или его частью, лучевой терапии или введения иммуномодулирующего средства, такой как способы, описанные в разделе B. В некоторых вариантах осуществления вмешательство и/или лечение проводят после введения модифицированных способами генной инженерии клеток. В некоторых вариантах осуществления вмешательство и/или лечение проводят через более чем или более чем приблизительно 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 1 год, 2 года или более после введения модифицированных способами инженерии клеток (например, CAR-T-клеток).

[353] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство проводят после того возникновения у индивидуума частичного ответа (PR) на модифицированные способами инженерии клетки, и/или после отсутствия у индивидуума ответа на модифицированные способами инженерии клетки в течение определенного периода времени, например 14-28 суток, для улучшения исхода в виде ответа. В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство проводят после возникновения у индивидуума частичного ответа. В определенных вариантах осуществления вмешательство проводят через более чем или более чем приблизительно 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 1 год, 2 года или более после возникновения у индивидуума PR. В определенных вариантах осуществления вмешательство проводят через более чем или более чем приблизительно 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 1 год, 2 года или более после возникновения у индивидуума PR. В некоторых вариантах осуществления в результате предусматриваемых способов наблюдают полный ответ (CR) на лечение. В некоторых вариантах осуществления индивидуум ранее не достигал ремиссии, такой как CR, на предшествующую терапию или на модифицированные способами генной инженерии клетки, такие как клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, например CAR+ T-клетки.

[354] В некоторых вариантах осуществления в момент времени или непосредственно перед моментом времени лечения и/или вмешательства у индивидуума возник рецидив после ремиссии в ответ на введение модифицированных способами генной инженерии клеток. В некоторых вариантах осуществления рецидив возникает после (например, в пределах 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 1 года или более) после полного ответа (CR) или PR на введение модифицированных способами генной инженерии клеток, таких как клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, например CAR+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство проводят в пределах или приблизительно в пределах 12 часов, 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток или одной недели после рецидива или после обнаружения или наблюдения рецидива. В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство проводят в пределах или приблизительно в пределах 12 часов, 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток или одной недели после определения или предположения у индивидуума рецидива.

[355] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство проводят в момент времени, когда количество модифицированных способами инженерии клеток, обнаруживаемое в крови индивидуума, уменьшается по сравнению с предшествующим моментом времени после введения индивидууму модифицированных клеток. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство проводят в момент времени, когда количество клеток T-клеточной терапии, обнаруживаемое в крови является менее чем или менее чем приблизительно в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 50 раз или в 100 раз или меньше пикового или максимального количества клеток T-клеточной терапии, обнаруживаемого в крови индивидуума после начала проведения T-клеточной терапии; и/или в момент времени после обнаружения пикового или максимального уровня клеток T-клеточной терапии в крови индивидуума количество клеток T-клеточной терапии, поддающееся обнаружению в крови индивидуума составляет менее 10%, менее 5%, менее 1% или менее 0,1% от всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) в крови индивидуума. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство проводят в момент времени, когда количество клеток T-клеточной терапии, обнаруживаемое в крови, составляет или приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 99,9% меньше пикового или максимального количества клеток T-клеточной терапии, обнаруживаемого в крови индивидуума после начала проведения T-клеточной терапии.

[356] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство проводят в момент времени, когда присутствует (i) менее чем или приблизительно 10 модифицированных клеток на микролитр, (ii) менее чем или менее чем приблизительно 20%, 30%, 40% или 50% от общего количества мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs), (iii) менее чем или менее чем приблизительно 1×10⁵ модифицированных клеток; или (iv) менее чем или менее чем приблизительно 5000 копий ДНК, кодирующей рекомбинантный рецептор, на микрограмм ДНК.

[357] В некоторых вариантах осуществления вмешательство и/или лечение проводят в качестве части режима лечения, вовлекающего однократное введение, процедуру или манипуляцию. В конкретных вариантах осуществления вмешательство и/или лечение проводят в качестве части режима лечения, вовлекающего более одного введения, процедуры или манипуляции. В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство проводят в соответствии с режимом лечения, вовлекающим множество введений на протяжении периода лечения, составляющего приблизительно час, приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 1 сутки, приблизительно 2 суток, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно 6 суток, приблизительно 7 суток, приблизительно 8 суток, приблизительно 9 суток, приблизительно 10 суток, приблизительно 11 суток, приблизительно 12 суток, приблизительно 13 суток, приблизительно 14 суток, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, приблизительно 4 недели, приблизительно 5 недель, приблизительно 6 недель, приблизительно 7 недель, приблизительно 8 недель, приблизительно 9 недель, приблизительно 10 недель, приблизительно 11 недель, приблизительно 12 недель, приблизительно 1 месяц, приблизительно 2 месяца, приблизительно 3 месяца, приблизительно 4 месяца, приблизительно 5 месяцев или приблизительно 6 месяцев. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство проводят посредством многократных введений на протяжении периода лечения, составляющего от приблизительно 1 минуты до приблизительно 1 часа, от 1 часа до 12 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 24 часов, от приблизительно 1 суток до приблизительно 2 суток, от приблизительно 1 суток до приблизительно 5 суток, от приблизительно 1 суток до приблизительно 7 суток, от приблизительно 1 недели до приблизительно 4 недель, от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В некоторых вариантах осуществления множественное введение проводят каждый час, каждые сутки, раз в двое суток, раз в трое суток, раз в четверо суток, раз в пять суток, раз в шесть суток, раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, семь раз в неделю, восемь раз в неделю, девять раз в неделю, десять раз в неделю, одиннадцать раз в неделю, двенадцать раз в неделю, тринадцать раз в неделю, четырнадцать раз в неделю, один раз в месяц, два раза в месяц, три раза в месяц, четыре раза в месяц, пять раз в месяц, шесть раз в месяц, семь раз в месяц, восемь раз в месяц, девять раз в месяц, десять раз в месяц, одиннадцать раз в месяц, двенадцать раз в месяц, тринадцать раз в месяц, четырнадцать раз в месяц, раз в два месяца или раз в три месяца на протяжении периода лечения.

[358] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в область (например, ткань, орган, массу или очаг повреждения у индивидуума или их регион или часть) проводят посредством режима лечения, вовлекающего многократное введение (или процедуры или манипуляции) в ходе курса лечения. Курс лечения представляет собой курс лечения, который повторяют на регулярной основе. В некоторых вариантах осуществления курс лечения может включать несколько дней лечения, за которыми следуют несколько дней покоя (т.е. выходные от лекарственного средства). Например, лечение можно проводить каждые сутки на протяжении трех недель, после которых следует неделя без лечения, в курсе лечения из 28 суток, или лечение можно проводить пять раз в неделю в течение первых трех недель, за которыми следует неделя без лечения. В конкретных вариантах осуществления лечение проводят для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения на протяжении одного или нескольких курсов лечения. Курс лечения может составлять по меньшей мере двое, по меньшей мере трое, по меньшей мере четверо, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере 14, по меньшей мере 21, по меньшей мере 28, по меньшей мере 48, или по меньшей мере 96 суток или более. В одном варианте осуществления курс лечения составляет 28 суток. В различных вариантах осуществления курс лечения определяет медицинский специалист на основе состояния и потребностей индивидуума. В некоторых вариантах осуществления лечение проводят посредством курса лечения, составляющего по меньшей мере одни сутки, по меньшей мере двое суток, по меньшей мере трое суток, по меньшей мере четверо суток, по меньшей мере пять суток, по меньшей мере шесть суток, по меньшей мере семь суток, по меньшей мере восемь суток, по меньшей мере девять суток, по меньшей мере десять суток, по меньшей мере одиннадцать суток, по меньшей мере двенадцать суток, по меньшей мере 13 суток, по меньшей мере 14 суток, по меньшей мере 21 сутки или все 28 суток курса лечения из 28 суток.

[359] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в область (например, ткань, орган, массу или очаг повреждения у индивидуума или их регион или часть) проводят посредством механического лечения и/или вмешательства, например, биопсии. В определенных вариантах осуществления механическое лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят посредством однократного введения, процедуры или манипуляции. В конкретных вариантах осуществления механическое лечение и/или вмешательство включает более одного введения, процедуры или манипуляции, например, биопсии. В некоторых вариантах осуществления у индивидуума проводят лечение и/или вмешательство более чем в один очаг повреждения.

[360] В конкретных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в область (например, ткань, орган, массу или очаг повреждения у индивидуума или их регион или часть) проводят посредством термотерапии, например, криотерапии или гипертермической терапии. Термотерапию можно проводить в соответствии с любой схемой, дозой или способом, которые, как известно специалисту в данной области, являются эффективными для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят посредством однократного проведения термотерапии. В конкретных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят посредством более чем однократного проведения термотерапии. В определенных вариантах осуществления термотерапия может представлять собой криоаблацию. В некоторых вариантах осуществления термотерапия может представлять собой гипертермическую терапию. В некоторых вариантах осуществления термотерапия представляет собой терапию, которая повышает температуру опухоли выше, чем гипертермическая терапия.

[361] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем облучения и/или лучевой терапии. Дозирование основано на международной единице, известной как Грей (Гр, также выражаемая как сГр, где 100 сГр=1 Гр) и доза, доставляемая в ходе одного сеанса лечения, известна как фракция. Например, типичная схема дозирования для поверхностной лучевой терапии (SRT) может представлять собой общую дозу 4500 сГр (45 Гр), доставляемую дозами по 300 сГр на протяжении всего 15 фракций. Радиационное лечение можно проводить на протяжении нескольких недель, причем фракции можно давать в определенные дни, например, с понедельника по пятницу. Также в клинической практике используют схемы чередования, которые включают 2-3 фракции в неделю (т.е. по схеме: понедельник, среда, пятница). Дозировку для пациента определяет квалифицированный клиницист, в том числе с помощью квалифицированного технического специалиста, например, физика, являющегося специалистам в области радиации, и она основана на размере очага повреждения, возрасте и состоянии здоровья индивидуума.

[362] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в область (например, ткань, орган, массу или очаг повреждения у индивидуума или их регион или часть) проводят одного или нескольких лечений с помощью радиации. В конкретных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят с помощью более чем одного лечения или дозы радиации, и общая доза составляет приблизительно 5 Гр, приблизительно 10 Гр, приблизительно 15 Гр, приблизительно 20 Гр, приблизительно 25 Гр, приблизительно 30 Гр, приблизительно 35 Гр, приблизительно 40 Гр, приблизительно 41 Гр, приблизительно 42 Гр, приблизительно 43 Гр, приблизительно 44 Гр, приблизительно 45 Гр, приблизительно 46 Гр, приблизительно 47 Гр, приблизительно 48 Гр, 49 Гр, приблизительно 50 Гр, приблизительно 51 Гр, приблизительно 52 Гр, приблизительно 53 Гр, приблизительно 54 Гр, приблизительно 55 Гр, приблизительно 56 Гр, приблизительно 57 Гр, приблизительно 58 Гр, приблизительно 59 Гр, приблизительно 60 Гр, приблизительно 61 Гр, приблизительно 62 Гр, приблизительно 63 Гр, приблизительно 64 Гр, приблизительно 65 Гр, приблизительно 70 Гр, приблизительно 80 Гр, приблизительно 90 Гр, или приблизительно 100 Гр. В некоторых вариантах осуществления общая доза составляет от приблизительно 0,01 Гр до приблизительно 1 Гр, от приблизительно 1 Гр до приблизительно 30 Гр, от приблизительно 1 Гр до приблизительно 15 Гр, от приблизительно 15 Гр до приблизительно 30 Гр, от приблизительно 30 Гр до приблизительно 90 Гр, от приблизительно 30 Гр до приблизительно 45 Гр, от приблизительно 40 Гр до приблизительно 70 Гр, или от приблизительно 45 Гр до приблизительно 60 Гр.

[363] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят посредством двух или более фракционных лечений с помощью радиации. В определенных вариантах осуществления фракционная доза составляет приблизительно 100 сГр, приблизительно 200 сГр, приблизительно 300 сГр, приблизительно 400 сГр, приблизительно 500 сГр, приблизительно 600 сГр, приблизительно 700 сГр, приблизительно 800 сГр, приблизительно 900 сГр, приблизительно 1 Гр, приблизительно 2 Гр, приблизительно 3 Гр, приблизительно 4 Гр или приблизительно 5 Гр. В конкретных вариантах осуществления фракционная доза составляет от приблизительно 10 сГр до приблизительно 100 сГр, от приблизительно 100 сГр до приблизительно 500 сГр, от приблизительно 500 сГр до приблизительно 1 Гр, или от приблизительно 1 Гр до приблизительно 5 Гр.

[364] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят посредством однократного лечения радиацией. В определенных вариантах осуществления однократная доза составляет приблизительно 100 сГр, приблизительно 200 сГр, приблизительно 300 сГр, приблизительно 400 сГр, приблизительно 500 сГр, приблизительно 600 сГр, приблизительно 700 сГр, приблизительно 800 сГр, приблизительно 900 сГр, приблизительно 1 Гр, приблизительно 2 Гр, приблизительно 3 Гр, приблизительно 4 Гр или приблизительно 5 Гр. В конкретных вариантах осуществления однократная доза составляет от приблизительно 10 сГр до приблизительно 100 сГр, от приблизительно 100 сГр до приблизительно 500 сГр, от приблизительно 500 сГр до приблизительно 1 Гр, или от приблизительно 1 Гр до приблизительно 5 Гр.

[365] В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят посредством лучевой терапии внешним пучком (EBT). Для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения EBT можно проводить в соответствии с любой схемой, дозой или способом, о которых специалисту в данной области известно, что они являются эффективными для лечения или смягчения, но не ограничиваясь этим, гиперпролиферативного нарушения. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем проведения EBT в дозе, которая является меньшей, чем доза, которую специалист в данной области считает эффективной для лечения или смягчения гиперпролиферативного нарушения. Как правило, лучевая терапия внешним пучком включает облучение определенного объема внутри индивидуума высокоэнергетическим пучком, тем самым вызывая клеточную смерть в этом объеме. В некоторых вариантах осуществления облученный объем содержит очаг повреждения, подлежащий лечению и/или вмешательству, и предпочтительно содержит настолько мало здоровой и/или непораженной ткани, насколько это возможно. В определенных вариантах осуществления облученный объем содержит в основном или только очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления способы введения, и устройства и композиции, пригодные для лучевой терапии внешним пучком, могут быть найдены в патентах США № 6449336, 6398710, 6393096, 6335961, 6307914, 6256591, 6245005, 6038283, 6001054, 5802136, 5596619 и 5528652.

[366] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят посредством брахитерапии. В конкретных вариантах осуществления брахитерапию можно проводить в соответствии с любой схемой, дозой или способом, о которых специалисту в данной области известно, что они являются эффективными для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения для лечения или смягчения гиперпролиферативного нарушения. В определенных вариантах осуществления брахитерапию можно проводить в соответствии с схемой, дозой или способом, ко которых специалисту в данной области известно, что они являются меньшими, чем те, что являются эффективными для лечения или смягчения гиперпролиферативного нарушения. Как правило, брахитерапия включает помещение радиоактивных источников в организм индивидуума, подлежащего лечению от злокачественной опухоли, например, внутрь самой опухоли, так что опухоль подвергается максимальной экспозиции от радиоактивного источника, и минимизацию экспозиции здоровой ткани. Репрезентативные радиоизотопы, которые можно вводить при брахитерапии, включают, но не ограничиваются ими, фосфор 32, кобальт 60, палладий 103, рутений 106, йод 125, цезий 137, индий 192, ксенон 133, радий 226, калифорний 252 или золото 198. Способы введении, и устройства, и композиции, пригодные для брахитерапии, описаны в Mazeron et al, Sem. Rad. One. 12:95-108 (2002), Kovacs J. Contemp. Brachytherapy. 6(4):404-416 (2015) и патентах США № 6319189, 6179766, 6168777, 6149889 и 5611767.

[367] В некоторых вариантах осуществления для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения проводят одно или несколько лечений, например, введений фармацевтического средства, такого как терапевтическое средство. В определенных вариантах осуществления лечение включает введение дозы фармацевтического средства, такого как любое из описанных средств, например, иммуномодулирующего средства или соединения. В конкретных вариантах осуществления фармацевтическое средство вводят один раз для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство вводят более одного раза для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство вводят в дозе, находящейся в диапазоне от приблизительно 0,0001 до приблизительно 100 мг/кг массы тела, таком как от приблизительно 0,0005 до приблизительно 50 мг/кг массы тела, таком как от приблизительно 0,001 до приблизительно 10 мг/кг массы тела, например, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 мг/кг массы тела. В конкретных вариантах осуществления фармацевтическое средство вводят индивидууму в дозе от приблизительно 0,001 мг до приблизительно 100 мг, от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 50 мг, от приблизительно 0,01 мг до приблизительно 1 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 20 мг, или от приблизительно 5 мг до приблизительно 15 мг. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство вводят системным путем. В определенных вариантах осуществления средство вводят локально в очаг повреждения. В конкретных вариантах осуществления фармацевтическое средство вводят перорально, местным путем, сублингвально, внутривенно, подкожно, энтерально, парентерально, посредством ингаляции и/или посредством инъекции.

[368] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтические средства можно вводить в дозе или дозах, которые считаются специалистами в данной области эффективными для лечения гиперпролиферативного нарушения. В определенных вариантах осуществления химиотерапевтические средства можно вводить в дозах, которые являются более низкими, чем используемые в данной области дозы, которые считаются эффективными для лечения гиперпролиферативного нарушения. В некоторых вариантах осуществления для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения вводят однократную дозу химиотерапевтического средства. В определенных вариантах осуществления индивидууму вводят более одной дозы химиотерапевтического средства на протяжении периода лечения, например, одного или нескольких курсов лечения, для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В конкретных вариантах осуществления количество лечений или введений химиотерапевтического средства представляет собой количество, которое считается специалистами в данной области эффективным для лечения гиперпролиферативного нарушения. В некоторых вариантах осуществления количество введений является меньшим, чем количество, которое считается специалистами в данной области эффективным для лечения гиперпролиферативного нарушения.

[369] В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой иммуномодулирующее средство, например, ингибитор точки контроля. В определенных вариантах осуществления иммуномодулирующие средства можно вводить в дозе или дозах, которые специалистами в данной области считаются эффективными для лечения гиперпролиферативного нарушения. В определенных вариантах осуществления иммуномодулирующие средства можно вводить в дозах, которые являются более низкими, чем используемые в данной области дозы, которые считаются эффективными для лечения гиперпролиферативного нарушения. В определенных вариантах осуществления для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения вводят однократную дозу иммуномодулирующего средства. В некоторых вариантах осуществления более одной дозы иммуномодулирующего средства вводят индивидууму на протяжении периода лечения, например, одного или нескольких курсов, для лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В конкретных вариантах осуществления количество лечений или введений иммуномодулирующего средства представляет собой количество, которое специалистами в данной области считается эффективным для лечения гиперпролиферативного нарушения. В некоторых вариантах осуществления количество введений является меньшим, чем количество, которое специалистами в данной области считается эффективным для лечения гиперпролиферативного нарушения.

[370] В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой леналидомид или производное талидомида. В конкретных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой леналидомид. В некоторых вариантах осуществления леналидомид или производное талидомида вводят в дозировке от приблизительно 1 мг до приблизительно 20 мг, например, от приблизительно 1 мг до приблизительно 10 мг, от приблизительно 2,5 мг до приблизительно 7,5 мг, от приблизительно 5 мг до приблизительно 15 мг, such as приблизительно 5 мг, 10 мг, 15 мг или 20 мг. В некоторых вариантах осуществления леналидомид вводят в дозе приблизительно от 10 мкг/кг до 5 мг/кг, например, от приблизительно 100 мкг/кг до приблизительно 2 мг/кг, от приблизительно 200 мкг/кг до приблизительно 1 мг/кг, от приблизительно 400 мкг/кг до приблизительно 600 мкг/кг, например, приблизительно 500 мкг/кг. В конкретных вариантах осуществления доза леналидомид составляет или приблизительно составляет 10 мг. В определенных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения индивидууму однократной дозы леналидомида. В конкретных вариантах осуществления лечение и/или вмешательство в очаг повреждения проводят путем введения индивидууму многократных доз леналидомида. В конкретных вариантах осуществления многократные дозы леналидомида вводят на протяжении одного или нескольких курсов лечения. В некоторых вариантах осуществления курсы лечения включают выходной от лекарственного средства. В определенных вариантах осуществления леналидомид вводят один раз в сутки на протяжении 14 суток в ходе курса лечения из 21 суток. В определенных вариантах осуществления леналидомид вводят один раз в сутки на протяжении 21 суток в ходе курса лечения из 28 суток.

[371] В некоторых вариантах осуществления лечение и/или вмешательство повторяют один или несколько раз, например, путем обеспечения одного или нескольких последующих лечений и/или вмешательств после предшествующего или предыдущего лечения и/или вмешательства. В некоторых вариантах осуществления последующее или повторное лечение и/или вмешательство проводят после экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток у индивидуума или после выявления экспансии после предшествующего лечения и/или вмешательства и до предшествующего лечения и/или вмешательства. В некоторых случаях последующее лечение и/или вмешательство проводят в момент времени непосредственно или непосредственно перед последующим лечением и/или вмешательством, когда индивидуум находится в фазе ремиссии. В некоторых примерах последующее лечение и/или вмешательство проводят в момент времени непосредственно или непосредственно перед моментом времени, когда количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых в крови, снижается или не поддается обнаружению. В некоторых случаях последующее лечение и/или вмешательство проводят в момент времени непосредственно или непосредственно перед последующим лечением и/или вмешательством, когда количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых в жидкости, или ткани, или образце, необязательно в крови индивидуума является сниженным по сравнению с предшествующим моментом времени после начала предшествующего лечения и/или вмешательства. В некоторых случаях последующее лечение и/или вмешательство проводят в момент времени непосредственно или непосредственно перед последующим лечением и/или вмешательством, когда количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых в жидкости, или ткани, или образце, необязательно в или более чем в 1,5 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раз, 10 раз или более превышает пиковое или максимальное количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых или обнаруженных в крови индивидуума после начала предшествующего лечения и/или вмешательства, и/или по сравнению с уровнем в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, или 14 или 28 суток после начала предшествующего лечения и/или вмешательства.

[372] В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение последующего лечения и/или вмешательства необязательно после рецидива у индивидуума после ответа в результате предшествующего лечения и/или вмешательства и/или не достижения полного ответа после предшествующего лечения и/или вмешательства. В некоторых случаях индивидуум отвечал на модифицированные способами генной инженерии клетки после предшествующего лечения и/или вмешательства(вмешательств), а затем прекратил отвечать и/или имел рецидив перед последующим лечением и/или вмешательством. В некоторых аспектах модифицированные способами генной инженерии подверглись экспансии у индивидуума или, было обнаружено, что они подверглись экспансии, после предшествующего лечения и/или вмешательства(вмешательств) и перед последующим лечением и/или вмешательством.

C. Мониторинг экспансии клеток

[373] В некоторых вариантах осуществления способ включает оценку экспозиции, персистенции и пролиферации T-клеток, например, T-клеток, введенных для терапии на основе T-клеток. В некоторых вариантах осуществления экспозицию, или длительную экспансию, и/или длительность нахождения клеток, и/или изменения клеточных фенотипов или функциональной активности клеток, например, клеток, введенных для иммунотерапии, например, терапии T-клетками, в способах, описанных в настоящем описании, можно определять путем оценки характеристик T-клеток in vitro или ex vivo. В некоторых вариантах осуществления такие способы анализа можно использовать для определения или подтверждения функции T-клеток, используемых для иммунотерапии, например, терапии T-клетками, до или после проведения клеточной терапии, описанной в настоящем описании.

[374] В некоторых вариантах осуществления выявляют присутствие и/или количество клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR-экспрессирующих клеток, введенных для терапии на основе T-клеток) у индивидуума после введения T-клеток и до, в ходе и/или после проведения терапии. В конкретных вариантах осуществления определяют присутствие и/или количество клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор у индивидуума, после введения T-клеток и до, в ходе и/или после вмешательства. В некоторых аспектах персистенцию или количество клеток, например, для мониторинга персистенции, количественно определяют в качестве копий ДНК или плазмиды, кодирующей рецептор, например CAR, на микрограмм ДНК, или в качестве количества экспрессирующих рецептор, например, экспрессирующих CAR, клеток на микролитр образца, например, крови или сыворотки, или на общее количество мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) или лейкоцитов или T-клеток на микролитр образца. В некоторых случаях детекцию или мониторинг присутствия модифицированных способами инженерии клеток, например, клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, можно проводить в других биологических образцах, таких как образца органа или ткани (например, образец из области заболевания, например, образец опухоли) индивидуума.

[375] В некоторых аспектах для оценки количества клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR-экспрессирующие клетки, вводимые для терапии на основе T-клеток) оценивают в образце крови, или сыворотки, или органа, или ткани (например, образец из области заболевания, например, образец опухоли) индивидуума. В некоторых случаях способы оценки присутствия или количества клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, могут включать взятие периферической крови (или другого биологического образца) от индивидуумов, которым вводили модифицированные клетки, и определение количества или соотношения модифицированных клеток в периферической крови или биологическом образце. Подходы для селекции и/или выделения клеток могут включать использование антител, специфичных к химерному рецептору антигена (CAR) (например, Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 2013 Mar; 5(177): 177ra38), белок L (Zheng et al., J. Transl. Med. 2012 Feb; 10:29), эпитопные метки, такие как последовательности Strep-меток, которые включают непосредственно в определенные участки в CAR, после чего реагенты для связывания Strep-метки используют для прямой оценки CAR (Liu et al. (2016) Nature Biotechnology, 34:430; публикация международной патентной заявки № WO2015095895) и моноклональные антитела, которые специфически связываются с полипептидом CAR (см. публикацию международной патентной заявки № WO2014190273). В некоторых случаях гены внешних маркеров можно использовать совместно со способами терапии модифицированными клетками, чтобы позволить обнаружение или селекцию клеток, и в некоторых клетках также обеспечить самоубийство клеток. В некоторых случаях укороченный рецептор эпидермального фактора роста (EGFRt) можно совместно экспрессировать с представляющим интерес трансгеном (CAR или TCR) в трансдуцированных клетках (см., например, патент США № 8802374). EGFRt может содержать эпитоп, распознаваемый антителом цетуксимабом (Erbitux®) или другим терапевтическим антителом против EGFR или связывающей молекулой, которые можно использовать для идентификации или селекции клеток, модифицированных посредством конструкции EGFRt и другого рекомбинантного рецептора, такого как химерный рецептор антигена (CAR), и/или для элиминации или отделения клеток, экспрессирующих рецептор. См. патент США № 8802374 и Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434).

[376] В некоторых вариантах осуществления клетки обнаруживают у индивидуума через или по меньшей мере через 4, 14, 15, 27 или 28 суток после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток. В некоторых аспектах клетки обнаруживают через или по меньшей мере через 2, 4, или 6 недель после, или 3, 6, или 12, 18, или 24, или 30 или 36 месяцев, или 1, 2, 3, 4, 5 или более лет после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток. В определенных вариантах осуществления клетки обнаруживают у индивидуума через или по меньшей мере через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 суток после вмешательство в область у индивидуума, такую как область ткани, органа, массы или очага повреждения индивидуума или их регион или часть. В некоторых вариантах осуществления клетки обнаруживают через или по меньшей мере через 2, 4 или 6 недель после или через 3, 6, или 12, 18, или 24, или 30 или 36 месяцев, или 1, 2, 3, 4, 5 или более лет после лечения и/или вмешательства в область у индивидуума, такую как область ткани, органа, массы или очага повреждения индивидуума или их регион или часть.

[377] В некоторых вариантах осуществления присутствие и/или количество клеток выявляют после некоторого периода времени после лечения или вмешательства в область у индивидуума, такую как область ткани, органа, массы или очага повреждения индивидуума, или их регион или часть посредством более чем одного введения, процедуры или манипуляции на протяжении периода времени, и определяют период времени после начала первого введения, процедуры или манипуляции. В конкретных вариантах осуществления присутствие и/или количество клеток выявляют после некоторого периода времени после лечения и/или вмешательства в область у индивидуума, такую как область ткани, органа, массы или очага повреждения у индивидуума, или их регион или часть, посредством более чем одного введения, процедуры или манипуляции на протяжении периода времени, и определяют период времени от конца последнего введения, процедуры и манипуляции.

[378] Экспозиция, например, количество клеток, например T-клеток, введенных для T-клеточной терапии, указывающие на экспансию и/или персистенцию, может быть указана в значениях максимальных количеств клеток, которые воздействуют на индивидуума, длительности обнаружения клеток на поддающемся обнаружению уровне или клеток выше определенного количества или процента, площади под кривой для количества или концентрации клеток с течением времени, и/или их комбинации и их признаков. Такие исходы можно оценивать с использованием известных способов, таких как кПЦР для обнаружения количества копий нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, по сравнению с общим количеством нуклеиновой кислоты или ДНК в конкретном образце, например, образце крови, сыворотки, плазмы или ткани, таком как образец крови, и/или анализ с использованием проточной цитометрии, обнаруживающий клетки, экспрессирующие рецептор, обычно с использованием антител, специфичных к рецепторам. Также для определения количества или процента функциональных клеток, таких как клетки, способные связываться с, и/или нейтрализовать, и/или индуцировать ответы, например, цитотоксические ответы, против клеток, связанных с заболеванием или состоянием, или экспрессирующих антиген, распознаваемый рецептором, можно использовать клеточные способы анализа.

[379] В некоторых аспектах увеличенная экспозиция индивидуума клеткам включает увеличенную экспансию клеток. В некоторых вариантах осуществления экспансия экспрессирующих рецептор клеток, например, CAR-экспрессирующих клеток, происходит у индивидуума после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток. В конкретных вариантах осуществления вмешательство в область (например, области ткани, органа, массы или очага повреждения у индивидуума, или их регион или часть) приводит к увеличению экспозиции экспрессирующих рецептор клеток, например, CAR-экспрессирующих клеток, например, к увеличению экспансии клеток у индивидуума по сравнению с экспансией клеток непосредственно перед вмешательством или по сравнению с пиковой экспансией клеток у индивидуума перед вмешательством в область (например, область ткани, органа, массы или очага повреждения у индивидуума, или их регион или часть).

[380] В некоторых отношениях выживаемость без прогрессирования (PFS) описывают как период времени в ходе и после лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, когда индивидуум живет с заболеванием, но ухудшение не происходит. В некоторых аспектах объективный ответ (OR) описывают как поддающийся измерению ответ. В некоторых аспектах объективный показатель ответа (ORR) описывают как доля пациентов, которые достигли CR или PR. В некоторых аспектах общую выживаемость (OS) описывают как период времени либо от даты постановки диагноза, либо от начала лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, когда индивидуумы, у которых диагностировано заболевание, все еще живы. В некоторых аспектах, бессобытийную выживаемость (EFS) описывают как период времени после окончания лечения злокачественной опухоли, когда индивидуум остается свободным от определенных осложнений или событий, которые лечение должно было предупредить или замедлить. Эти события могут включать возвращение злокачественной опухоли или появление определенных симптомов, таких как боль в кости в результате злокачественной опухоли, которая распространилась в кость, или смерть.

[380] В некоторых аспектах способ, например, вмешательство в область (например, области ткани, органа, массы или очага повреждения у индивидуума, или их регион или часть), приводит к высокой пролиферации in vivo введенных клеток, например, при определении проточной цитометрией. В некоторых аспектах выявляют высокие максимальные соотношения клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления при пиковом или максимальном уровне или концентрации после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, в крови или пораженной заболеванием области индивидуума или их лейкоцитарной фракции, например, фракции PBMC или фракции T-клеток, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, или по меньшей мере приблизительно 90% клеток экспрессируют рекомбинантный рецептор, например, CAR.

[381] В некоторых вариантах осуществления способ, например, вмешательство в область (например, области ткани, органа, массы или очага повреждения у индивидуума, или их регион или часть), приводит к максимальной концентрации в крови или сыворотке, или другой жидкости организма, или органе, или ткани индивидуума, составляющей по меньшей мере 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000 или 15000 копий нуклеиновой кислоты, кодирующей рецептор, например CAR, на микрограмм ДНК, или по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 или 0,9 экспрессирующих рецептор, например, CAR-экспрессирующих клеток, на общее количество мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), общее количество мононуклеарных клеток, общее количество T-клеток или общее количество микролитров крови или сыворотки, или другой жидкости организма, или органа, или ткани индивидуума. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие рецептор, выявляют в качестве по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50 или 60% от PBMC в крови индивидуума, и/или на таком уровне в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36, 48 или 52 недель после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, или в течение 1, 2, 3, 4 или 5, или более лет после такого введения.

[382] В некоторых аспектах, способ приводит к увеличению копий нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, например, CAR, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 20 раз, на микрограмм ДНК, например, в образце сыворотки, плазмы, крови или ткани, например, образце опухоли, индивидуума.

[383] В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие рецептор, обнаруживаются в образце сыворотки, плазмы, крови или ткани, например, образце опухоли, индивидуума, например, определенным способом, таким как кПЦР или способ обнаружения на основе проточной цитометрии, по меньшей мере через 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 или более суток после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, по меньшей мере через или приблизительно через 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 или более недель после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, экспрессирующие рецептор, обнаруживаются в образце сыворотки, плазмы, крови или ткани, например, образце опухоли, индивидуума по меньшей мере через 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 или более суток после лечения и/или вмешательства в область (например, области ткани, органа, массы или очага повреждения у индивидуума, или их регион или часть), по меньшей мере через или приблизительно через 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 или более недель после лечения и/или вмешательства в очаг повреждения.

[384] В некоторых аспектах, по меньшей мере приблизительно 1×10², по меньшей мере приблизительно 1×10³, по меньшей мере приблизительно 1×10⁴, по меньшей мере приблизительно 1×10⁵, или по меньшей мере приблизительно 1×10⁶ или по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ или по меньшей мере приблизительно 1×10⁷ или по меньшей мере приблизительно 5×10⁷ или по меньшей мере приблизительно 1×10⁸ экспрессирующих рекомбинантный рецептор клеток, например, CAR-экспрессирующих клеток, и/или по меньшей мере 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, или 500, или 1000 экспрессирующих рецептор клеток на микролитр, например, по меньшей мере 10 на микролитр, обнаруживается или присутствует у индивидуума или в его жидкости, плазме, сыворотке, ткани или отделе, например, в его периферической крови, пораженной заболеванием области, например, очаге повреждения опухоли. В некоторых вариантах осуществления такое количество или концентрация клеток обнаруживаются у индивидуума в течение по меньшей мере приблизительно 20 суток, по меньшей мере приблизительно 40 суток, или по меньшей мере приблизительно 60 суток, или по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев, или по меньшей мере 2 или 3 лет после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток. В определенных вариантах осуществления такое количество или концентрация клеток поддаются обнаружению у индивидуума в течение по меньшей мере приблизительно 20 суток, по меньшей мере приблизительно 40 суток или по меньшей мере приблизительно 60 суток, или по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев, или по меньшей мере 2 или 3 лет, после лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. Такие количества клеток могут быть такими, как обнаруживают с использованием способов на основе проточной цитометрии или количественной ПЦР, и экстраполируют к общим количествам клеток с использованием известных способов. См., например, Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177), Park et al, Molecular Therapy 15(4):825-833 (2007), Savoldo et al., JCI 121(5):1822-1826 (2011), Davila et al., (2013) PLoS ONE 8(4):e61338, Davila et al., Oncoimmunology 1(9):1577-1583 (2012), Lamers, Blood 2011 117:72-82, Jensen et al., Biol Blood Marrow Transplant 2010 September; 16(9): 1245-1256, Brentjens et al., Blood 2011 118(18):4817-4828.

[385] В некоторых аспектах количество копий нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, например, количество копий вектора, на 100 клеток, например, в периферической крови или костном мозге, или другом отделе, как определяют посредством иммуногистохимии, ПЦР и/или проточной цитометрии, составляет по меньшей мере 0,01, по меньшей мере 0,1, по меньшей мере 1 или по меньшей мере 10, через приблизительно 1 неделю, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, приблизительно 4 недели, приблизительно 5 недель или по меньшей мере приблизительно 6 недель, или по меньшей мере приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11 или 12 месяцев, или по меньшей мере 2 или 3 года после введения клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток. В некоторых вариантах осуществления количество копий вектор, экспрессирующего рецептор, например CAR, на микрограмм геномной ДНК составляет по меньшей мере 100, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 5000, или по меньшей мере 10000, или по меньшей мере 15000, или по меньшей мере 20000 в момент времени, составляющий приблизительно 1 неделю, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, или по меньшей мере приблизительно через 4 недели после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, или по меньшей мере через 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или по меньшей мере 2 или 3 года после такого введения.

[386] В определенных вариантах осуществления количество копий нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, например, количество копий вектора, на 100 клеток, например, в периферической крови или костном мозге, или другом отделе, как определяют посредством иммуногистохимии, ПЦР и/или проточной цитометрии, составляет по меньшей мере 0,01, по меньшей мере 0,1, по меньшей мере 1 или по меньшей мере 10, через приблизительно 1 неделю, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, приблизительно 4 недели, приблизительно 5 недель или по меньшей мере приблизительно 6 недель, или по меньшей мере приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11 или 12 месяцев, или по меньшей мере 2 или 3 года после лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления количество копий вектор, экспрессирующего рецептор, например CAR, на микрограмм геномной ДНК составляет по меньшей мере 100, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 5000, или по меньшей мере 10000, или по меньшей мере 15000, или по меньшей мере 20000 в момент времени, составляющий приблизительно 1 неделю, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, или по меньшей мере приблизительно через 4 недели после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, или по меньшей мере через 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или по меньшей мере 2 или 3 года после лечения и/или вмешательства в очаг повреждения.

[387] В некоторых аспектах рецептор, например CAR, экспрессируемый клетками, выявляется количественной ПЦР (кПЦР) или проточной цитометрией у индивидуума, в плазме, сыворотке, крови, ткани и/или пораженной заболеванием области, например, области опухоли, в момент времени, который составляет по меньшей мере приблизительно 3 месяца, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 12 месяцев, по меньшей мере приблизительно 1 год, по меньшей мере приблизительно 2 года, по меньшей мере приблизительно 3 года или более 3 лет после введения клеток, например, после начала введения T-клеток. В конкретных вариантах осуществления рецептор, экспрессируемый клетками, поддается обнаружению у индивидуума, в плазме, сыворотке, крови, ткани и/или пораженной заболеванием области, например, в очаге повреждения или области опухоли, в момент времени, который составляет по меньшей мере приблизительно 3 месяца, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 12 месяцев, по меньшей мере приблизительно 1 год, по меньшей мере приблизительно 2 года, по меньшей мере приблизительно 3 года, или более 3 лет, после лечения и/или вмешательства в очаг повреждения. В некоторых вариантах осуществления измеряют площадь под кривой (AUC) концентрации экспрессирующих рецептор (например, CAR) клеток в жидкости, плазме, сыворотке, крови, ткани, органе и/или пораженной заболеванием области, например, области опухоли, индивидуума с течением времени после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток.

D. Ответ, эффективность и выживаемость

[388] В некоторых вариантах осуществления введение эффективно осуществляет лечение индивидуума, несмотря на то, что индивидуум стал резистентным к другой терапии и/или имел рецидив после введения модифицированных способами генной инженерии клеток, таких как клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, например CAR+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 50% индивидуумов, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 60% индивидуумов, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 70% индивидуумов, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 80% индивидуумов или по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 90% индивидуумов, которых лечат способом, достигают полной ремиссии (CR) и/или достигают объективного ответа (OR).

[389] В некоторых вариантах осуществления индивидуумы, которых лечат в соответствии с предусматриваемым способом, например, вовлекающим вмешательство в область или очаг повреждения после введения модифицированных способами генной инженерии клеток, достигают более длительного ответа или достигают более длительного ответа в среднем в популяции индивидуумов, которых лечат таким образом, по сравнению со способами, вовлекающими введение модифицированных способами генной инженерии клеток, таких как клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, но не вовлекающих лечение и/или вмешательство в область или очаг повреждения, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления показатель длительности ответа (DOR) включает время от документации ответа опухоли до прогрессирования заболевания. В некоторых вариантах осуществления параметр для оценки ответа может включать длительный ответ, например, ответ, который сохраняется после периода времени от начала терапии или после лечения и/или вмешательства в область или очаг повреждения после начала введения модифицированных способами генной инженерии клеток. В некоторых вариантах осуществления на длительный ответ указывает показатель ответа приблизительно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 или 24 месяца после начала терапии или после лечения и/или вмешательства в область или очаг повреждения после начала введения модифицированных способами генной инженерии клеток. В некоторых вариантах осуществления ответ длится в течение более 3 месяцев, более 6 месяцев, более 12 месяцев, более 18 месяцев, более 24 месяцев, более 30 месяцев, более 36 месяцев или более. В некоторых конкретных вариантах осуществления индивидуумы, которых лечат способом, достигают длительного ответа после того, как у индивидуума ранее возник рецидив после ремиссии в ответ на введение модифицированных способами генной инженерии клеток.

[390] В некоторых аспектах показатели ответа у индивидуумов, таких как индивидуумы с хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL), основаны на критериях ответа International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia (IWCLL) (Hallek, et al., Blood 2008, Jun 15; 111(12): 5446-5456). В некоторых аспектах эти критерии описывают следующим образом: полная ремиссия (CR), которая в некоторых аспектах требует отсутствия клональных лимфоцитов в периферической крови при определении посредством иммунофенотипирования, отсутствие лимфаденопатии, отсутствие гепатомегалии или спленомегалии, отсутствие системных симптомов и удовлетворительная лейкоцитарная формула; полная ремиссия с неполным восстановлением костного мозга (CRi), которую в некоторых аспектах описывают как CR выше, но без нормальной лейкоцитарной формулы; частичная ремиссия (PR), которую в некоторых аспектах описывают как ≥ 50% уменьшение количества лимфоцитов, ≥ 50% уменьшение лимфаденопатии или ≥ 50% уменьшение размера печение или селезенки вместе с улучшением периферической формулы крови; прогрессирующее заболевание (PD), которое в некоторых аспектах описывают как ≥ 50% увеличение количества лимфоцитов до > 5×10⁹/л, ≥ 50% увеличение лимфаденопатии, ≥ 50% увеличение размера печени или селезенки, трансформацию Рихтера или новые цитопении вследствие CLL; и стабильное заболевание, которое в некоторых аспектах описывают как отсутствие соответствия критериям CR, CRi, PR или PD.

[391] В некоторых вариантах осуществления индивидуумы демонстрируют CR или OR если в течение 1 месяца после введения дозы клеток, лимфатические узлы у индивидуума имеют размер менее или приблизительно 20 мм, менее или приблизительно 10 мм или менее или приблизительно 10 мм. В конкретных вариантах осуществления индивидуумы демонстрируют CR или OR если в течение 1 месяца после лечения и/или вмешательства в очаг повреждения, лимфатические узлы у индивидуума имеют размер менее или приблизительно 20 мм, менее или приблизительно 10 мм или менее или приблизительно 10 мм.

[392] В некоторых вариантах осуществления индексный клон CLL не обнаруживается в костном мозге индивидуума (или в костном мозге более 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более индивидуумов, которых лечат способами). В некоторых вариантах осуществления индексный клон CLL оценивают посредством глубокого секвенирования IgH. В некоторых вариантах осуществления индексный клон не обнаруживается в момент времени, который составляет, или приблизительно составляет, или по меньшей мере составляет или приблизительно составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 или 24 месяца после введения клеток.

[393] В некоторых аспектах, для оценки ответа используются любые клинические, гематологические и/или молекулярные способы. В некоторых отношениях ответ оценивают с использованием критериев Лугано (Cheson et al., (2014) JCO 32(27):3059-3067; Johnson et al., (2015) Radiology 2:323-338; Cheson, B.D. (2015) Chin Clin Oncol 4(1):5). В некоторых аспектах для оценки ответа используется любой из клинических, гематологических и/или молекулярных способов. В некоторых аспектах ответ, оцениваемый с использованием критериев Лугано, вовлекает использование позитронная эмиссионной томографии (PET)-компьютерной томографии (CT) и/или CT в зависимости от ситуации. Оценка посредством PET-CT может дополнительно включать использование фтордезоксиглюкоза (FDG) для FDG-авидных лимфом. В некоторых аспектах, когда PET-CT используют для оценки ответа в FDG-авидной гистологии, можно использовать 5-бальную шкалу. В некоторых отношениях 5-бальная шкала включает следующие критерии: 1, отсутствие захвата выше фонового уровня; 2, захват ≤ средостения; 3, захват > средостения, но ≤ печени; 4, захват умеренно > печени; 5, захват значительно выше печени и/или новых очагов; X, новые области захвата, мало вероятно связанные с лимфомой.

[394] В некоторых аспектах полный ответ, как описывают с использованием критериев Лугано, вовлекает полный метаболический ответ и полный радиологический ответ в различных поддающихся измерению областях. В некоторых аспектах эти области включают лимфатические узлы и внелимфатические области, где CR описывают как показатель 1, 2 или 3 с или без остаточной массы по 5-бальной шкале, когда используют PET-CT. В некоторых аспектах в кольце Вальдейера или внеузловых областях с высоким физиологическим захватом или в случае активации в селезенке или костном мозге (например, посредством химиотерапии или миелоидных колониестимулирующих факторов), захват может превышать нормальный захват в средостении и/или печени. В этом случае полный метаболический ответ может быть установлен, если захват в областях первоначального вовлечения не превышает захват в нормальной окружающей ткани, даже если ткани имеет высокий физиологический захват. В некоторых аспектах ответ оценивают в лимфатических узлах с использованием CT, где CR описывают как отсутствие внелимфатических областей заболевания и размер заданных узлов /масса узлов должны снижаться до ≤ 1,5 см в наибольшем поперечном диаметре очага повреждения (LDi). Следующие области оценки включают костный мозг, где оценка на основе PET-CT должна указывать на отсутствие признаков FDG-авидного заболевания в костном мозге, и оценка на основе CT должна указывать на нормальную морфологию, которая, если не определяется, должна быть IHC-негативной. Следующие области могут включать оценку увеличения органа, который должен вернуться к норме. В некоторых аспектах, оценивают не измеренные очаги и новые очаги, которые в случае CR должны отсутствовать (Cheson et al., (2014) JCO 32(27):3059-3067; Johnson et al., (2015) Radiology 2:323-338; Cheson, B.D. (2015) Chin Clin Oncol 4(1):5).

[395] В некоторых аспектах частичный ответ (PR), как описывают с использованием критерием Лугано, вовлекает частичный метаболический и/или радиологический ответ в различных поддающихся измерению областях. В некоторых аспектах эти области включают лимфатические узлы и внелимфатические области, где PR описывают как показатель 4 или 5 со сниженным захватом по сравнению с исходным уровнем и остаточной массой(ами) любого размера, когда используют PET-CT. При промежуточной оценке такие данные могут указывать на ответ на заболевание. В конце лечения такие данные могут указывать на остаточное заболевание. В некоторых аспектах ответ оценивают в лимфатических узлах с использованием CT, где PR описывают как ≥50% SPD для вплоть до 6 поддающихся измерению узлов и внеузловых областей. Если очаг повреждения является слишком малым, чтобы его можно было измерить с помощью CT, ему присваивают размер 5 мм×5 мм в качестве величины по умолчанию; если очаг более не является видимым, величина составляет 0 мм×0 мм; для узла >5 мм×5 мм, но меньше нормы, для вычисления используют фактические показатели. Другие области оценки включают костный мозг, где оценка на основе PET-CT должна указывать на остаточный захват, превышающий захват в нормальном костном мозге, но сниженный по сравнению с исходным уровнем (допустим диффузный захват, согласующийся с реактивными изменениями в результате химиотерапии). В некоторых аспектах, если существуют персистирующие очаговые изменения в костном мозге в контексте ответа узлов, следует учитывать дальнейшую оценку посредством MRI или биопсии, или промежуточного сканирования. В некоторых аспектах, дополнительные области могут включать оценку увеличения органа, где селезенка должна уменьшаться на >50% от длины, превышающей норму. В некоторых аспектах, оценивают неизмеренные очаги и новые очаги, которые в случае PR должны отсутствовать /быть нормальными, регрессировать или не увеличиться. Отсутствие ответа/стабильное заболевание (SD) или прогрессирующее заболевание (PD) также можно определять с использованием оценки на основе PET-CT и/или CT (Cheson et al., (2014) JCO 32(27):3059-3067; Johnson et al., (2015) Radiology 2:323-338; Cheson, B.D. (2015) Chin Clin Oncol 4(1):5).

[396] В некоторых отношениях выживаемость без прогрессирования (PFS) описывают как период времени в ходе и после лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, когда индивидуум живет с заболеванием, но ухудшение не происходит. В некоторых аспектах объективный ответ (OR) описывают как поддающийся измерению ответ. В некоторых аспектах объективный показатель ответа (ORR) описывают как доля пациентов, которые достигли CR или PR. В некоторых аспектах общую выживаемость (OS) описывают как период времени либо от даты постановки диагноза, либо от начала лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, когда индивидуумы, у которых диагностировано заболевание, все еще живы. В некоторых аспектах, бессобытийную выживаемость (EFS) описывают как период времени после окончания лечения злокачественной опухоли, когда индивидуум остается свободным от определенных осложнений или событий, которые лечение должно было предупредить или замедлить. Эти события могут включать возвращение злокачественной опухоли или появление определенных симптомов, таких как боль в кости в результате злокачественной опухоли, которая распространилась в кость, или смерть.

[397] В некоторых аспектах для определения объективного ответа опухоли используют критерии RECIST, в некоторых аспектах в солидных опухолях (Eisenhauer et al., European Journal of Cancer 45 (2009) 228-247). В некоторых аспектах критерии RECIST используют для определения объективного ответа на опухоль для заданных очагов. В некоторых отношениях полный ответ, как определяют с использованием критериев RECIST, описывают как исчезновение всех заданных очагов и каких-либо патологических лимфатических узлов (как заданных, так и незаданных), и он должен представлять собой уменьшение по короткой оси до <10 мм. В других аспектах частичный ответ, как определяют с использованием критериев RECIST, описывают как по меньшей мере 30% уменьшение суммы диаметров заданных очагов, принимая в качестве величины для сравнения исходную сумму диаметров. В других аспектах, прогрессирующее заболевание (PD) описывают как по меньшей мере a 20% увеличение суммы диаметров очагов-мишеней, принимая в качестве величины для сравнения наименьшую сумму в исследовании (это включает исходную сумму, если она является наименьшей в исследовании). В дополнение к относительному увеличению на 20%, сумма также должна демонстрировать абсолютное увеличение по меньшей мере на 5 мм (в некоторых аспектах появление одного или нескольких новых очагов также считается прогрессированием). В других аспектах стабильное заболевание (SD) описывают как ни достаточное уменьшение для определения как PR, ни достаточное увеличение для определения как PD, принимая в качестве величины для сравнения наименьшую сумму диаметров в исследовании.

[398] В некоторых аспектах введение или лечение в соответствии с предусматриваемыми способами, как правило, снижает или препятствует экспансии или нагрузке заболеванием или состоянием у индивидуума. Например, когда заболевание или состояние представляет собой опухоль, способы обычно уменьшают размер опухоли, объем, метастазы, процент бластов в костном мозге или поддающуюся молекулярному обнаружению злокачественную опухоль, и/или улучшают прогноз, или выживаемость, или другой симптом, ассоциированный с опухолевой нагрузкой.

[399] Нагрузка заболеванием может охватывать общее количество пораженных заболеванием клеток у индивидуума или в органе, ткани или жидкости организма индивидуума, таких как орган или ткань опухоли или из другой области, например, которая может указывать на метастаз. Например, опухолевые клетки можно выявлять и/или количественно определять в крови или костном мозге в контексте определенных гематологических злокачественных опухолей. В некоторых вариантах осуществления нагрузка заболеванием может включать массу опухоль, количество и выраженность метастазов и/или процент бластных клеток, присутствующих в костном мозге.

[400] В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет лейкоз. Степень нагрузки заболеванием можно определять путем оценки остаточного лейкоза в крови или костном мозге.

[401] В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет морфологическое заболевание, если в костном мозге присутствует более чем или равно 5% бластов, например, при определении световой микроскопией, например, более чем или равно 10% бластов в костном мозге, более чем или равно 20% бластов в костном мозге, более чем или равно 30% бластов в костном мозге, более чем или равно 40% бластов в костном мозге, или более чем или равно 50% бластов в костном мозге. В некоторых вариантах осуществления индивидуум демонстрирует полную или клиническую ремиссию, если количество бластов в костном мозге составляет менее 5%.

[402] В некоторых вариантах осуществления у индивидуума может определяться полная ремиссия, однако присутствует небольшая доля морфологически неопределимых (способами световой микроскопии) остаточных лейкозных клеток. Индивидуума называют имеющим минимальную резидуальную болезнь (MRD), если у индивидуума выявляется менее 5% бластов в костном мозге и определяется молекулярно обнаружимая злокачественная опухоль. В некоторых вариантах осуществления молекулярно обнаружимую злокачественную опухоль можно оценивать с использованием любого из множества молекулярных способов, которые позволяют чувствительное обнаружение малого количества клеток. В некоторых аспектах такие способы включают анализ с использованием ПЦР, который может определять уникальные реарранжировки генов Ig/T-клеточного рецептора или слитые транскрипты, образующиеся в результате транслокаций хромосом. В некоторых вариантах осуществления можно использовать проточную цитометрию для идентификации злокачественных клеток на основе лейкоз-специфических иммунофенотипов. В некоторых вариантах осуществления молекулярное обнаружение злокачественной опухоли может обнаруживать уже 1 лейкозную или бластную клетку на 100000 нормальных клеток или 1 лейкозную клетку на 10000 нормальных клеток. В некоторых вариантах осуществления в индивидуума выявляется MRD, которая является молекулярно обнаружимой, если обнаруживается по меньшей мере или более 1 лейкозной клетки на 100000 клеток, например, посредством ПЦР или проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления нагрузка заболеванием у индивидуума является молекулярно необнаружимой или MRD^-, так что в некоторых случаях невозможно обнаружить лейкозные клетки у индивидуума с использованием ПЦР или способов проточной цитометрии.

[403] В некоторых аспектах заболевание или состояние персистирует после введения первой дозы и/или введения первой дозы является недостаточным для устранения заболевания или состояния у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления ответ на лечения, такой как разрешение заболевания и/или ремиссия, наблюдают в соответствии с предусматриваемыми способами после вмешательства в область или очаг повреждения, как описано.

[404] В некоторых вариантах осуществления способ уменьшает нагрузку заболеванием или состоянием, например, количество опухолевых клеток, размер опухоли, выживаемость пациента или бессобитийную выживаемость, в большей степени и/или в течение более длительного периода времени по сравнению с уменьшением, которое наблюдалось бы в случае сравнимого способа с использованием альтернативного режима дозирования, такого как способ, в котором индивидууму вводят одно или несколько альтернативных терапевтических средств, и/или способ, в котором индивидууму не проводят лечение и/или вмешательство в область у индивидуума, в которой модифицированные способом инженерии клетки присутствуют, или вероятно будут присутствовать, или присутствовали, или вероятно присутствовали, в соответствии с предусматриваемыми способами. В некоторых вариантах осуществления проводят обнаружение, оценку или количественное определение нагрузки заболеванием или состоянием у индивидуума. В некоторых аспектах обнаружение нагрузки заболеванием можно проводить путем обнаружения общего количества пораженных заболеванием или ассоциированных с заболеванием клеток, например, опухолевых клеток, у индивидуума, или в органе, ткани или жидкости организма индивидуума, такой как кровь или сыворотка. В некоторых аспектах, оценивают выживаемость индивидуума, выживаемость в течение определенного периода времени, степень выживаемости, присутствие или длительность бессобытийной или бессимптомной выживаемости, или свободной от рецидива выживаемости. В некоторых вариантах осуществления оценивают любой симптом заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления определяют количественный показатель нагрузки заболеванием или состоянием.

[405] В некоторых вариантах осуществления с помощью способов улучшают показатель бессобытийной выживаемости или показатель общей выживаемости у индивидуума, по сравнению с другими способами, например способами, в которых индивидууму вводят одно или несколько альтернативных терапевтических средств, и/или способами, в которых индивидууму не проводят лечение и/или вмешательство в область индивидуума, в которой модифицированные клетки присутствуют, или вероятно будут присутствовать, или присутствовали, или вероятно присутствовали в соответствии с предусматриваемыми способами. Например, в некоторых вариантах осуществления показатель или вероятность бессобытийной выживаемости для индивидуумов, которых лечат способами, через 6 месяцев после введения дозы, составляет более чем приблизительно 40%, более чем приблизительно 50%, более чем приблизительно 60%, более чем приблизительно 70%, более чем приблизительно 80%, более чем приблизительно 90%, или более чем приблизительно 95%. В некоторых аспектах показатель общей выживаемости составляет более чем приблизительно 40%, более чем приблизительно 50%, более чем приблизительно 60%, более чем приблизительно 70%, более чем приблизительно 80%, более чем приблизительно 90%, или более чем приблизительно 95%. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, которого лечат способами, имеет бессобытийную выживаемость, свободную от рецидива выживаемость или выживаемость в течение по меньшей мере 6 месяцев или по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет. В некоторых вариантах осуществления время до прогрессирования увеличивается, например, до времени до прогрессирования более чем или приблизительно 6 месяцев, или по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет.

[406] В некоторых вариантах осуществления после лечения способом вероятность рецидива уменьшается по сравнению с другими способами, например, способами, в которых индивидууму вводят одно или несколько альтернативных терапевтических средств, и/или со способами, в которых индивидууму не проводят лечение и/или вмешательство в область у индивидуума, в которой модифицированные способами инженерии клетки присутствуют, или вероятно будут присутствовать, или присутствовали, или вероятно присутствовали, в соответствии с предусматриваемыми способами. Например, в некоторых вариантах осуществления вероятность рецидива через 6 месяцев после первой дозы составляет менее чем приблизительно 80%, менее чем приблизительно 70%, менее чем приблизительно 60%, менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20% или менее чем приблизительно 10%.

V. Определения

[407] Если не определено иначе, все термины данной области, обозначения и другие технические и научные термины или терминология, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой относится заявленное изобретение. В некоторых случаях термины с широко известным значением определены в настоящем описании для ясности и/или простоты отсылки, и включение таких определений в настоящее описание не следует обязательно истолковывать как существенное отличие от того, что хорошо известно в данной области.

[408] Как используют в рамках изобретения, "индивидуумом" является млекопитающее, такое как человек или другое животное и, как правило, им является человек. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, например, пациент, которому вводят иммуномодулирующие полипептиды, модифицированные способами инженерии клетки или композиции, представляет собой млекопитающее, как правило, примата, такого как человек. В некоторых вариантах осуществления приматом является мартышка или человекообразная обезьяна. Индивидуумом может быть мужчина или женщина, и он может иметь любой подходящий возраст, в том числе, младенческий, детский, подростковый, взрослый и пожилой. В некоторых вариантах осуществления индивидуумом является не являющееся приматом млекопитающее, такое как грызун.

[409] Как используют в рамках изобретения, "лечение" (и его грамматические варианты, такие как "лечить" или "лечащий"), относится к полному или частичному смягчению или уменьшению заболевания, или состояния, или нарушения, или симптома, или неблагоприятного эффекта или исхода, или фенотипа, ассоциированного с ним. Желаемые эффекты лечения включают, но не ограничиваются ими, предупреждение возникновения или рецидива заболевания, смягчение симптомов, уменьшение каких-либо прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предупреждение метастазов, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, смягчение или облегчение болезненного состояния, и ремиссию или улучшение прогноза. Термины не подразумевают полное излечение от заболевания или полное устранение какого-либо симптома или эффекта(ов) в отношении всех симптомов или исходов.

[410] Как используют в рамках изобретения, "замедление развития заболевания" означает отсрочивание, препятствование, замедление, торможение, стабилизацию, подавление и/или задерживание развития заболевания (такого как злокачественная опухоль). Это отсрочивание может иметь различную длительность в зависимости от анамнеза заболевания и/или подвергаемого лечению индивидуума. Как очевидно специалисту в данной области, достаточное или значительное отсрочивание может, в сущности, охватывать предупреждение, так что у индивидуума не развивается заболевание. Например, может отсрочиваться поздняя стадия злокачественной опухоли, такая как развитие метастазов.

[411] "Предупреждение", как используют в рамках изобретения, включает обеспечение профилактики в отношении возникновения или рецидива заболевания у индивидуума, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого заболевание еще не диагностировано. В некоторых вариантах осуществления предусматриваемые и композиции используют для замедления развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

[412] Как используют в рамках изобретения, "подавлять" функцию или активность означает снижать функцию или активность по сравнению с в остальном теми же условиями за исключением представляющего интерес состояния или параметра или альтернативно по сравнению с другим состоянием. Например, клетки, которые подавляют рост опухоли, снижают скорость роста опухоли по сравнению со скоростью роста опухоли в отсутствии клеток.

[413] "Эффективное количество" средства, например, фармацевтического состава, клеток или композиции в контексте введения относится к количеству, эффективному, в дозировках/количествах и на протяжении периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата, такого как терапевтический или профилактический результат.

[414] "Терапевтически эффективное количество" средства, например, фармацевтического состава или модифицированных способами инженерии клеток, относится к количеству, эффективному, в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического результата, например, для лечения заболевания, состояния или нарушения, и/или фармакокинетического или фармакодинамического эффекта лечения. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и масса тела индивидуума, вводимые иммуномодулирующие полипептиды или модифицированные способами инженерии клетки. В некоторых вариантах осуществления предусматриваемые способы вовлекают введение иммуномодулирующих полипептидов, модифицированных способами инженерии клеток или композиций в эффективных количествах, например, терапевтически эффективных количествах.

[415] "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному, в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, но не обязательно, поскольку профилактическую дозу используют у индивидуума до или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество является меньшим, чем терапевтически эффективное количество.

[416] Термин "фармацевтический состав" относится к препарату, который имеет такую форму, которая обеспечивает эффективность биологической активности активного ингредиента, содержащегося в нем, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для индивидуума, которому вводят состав.

[417] "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается ими, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

[418] Как используют в рамках изобретения, указание на то, что положения нуклеотидов или аминокислот "соответствуют" положениям нуклеотидов или аминокислот в описанной последовательности, такой как указана в списке последовательностей, относится к положениям нуклеотидов или аминокислот, идентифицированным при выравнивании с описанной последовательностью для максимизации идентичности с использованием стандартного алгоритма выравнивания, такого как алгоритм GAP. Посредством выравнивания последовательностей специалист в данной области может идентифицировать соответствующие остатки, например, с использованием консервативных и идентичных аминокислотных остатков в качестве ориентиров. Как правило, для идентификации соответствующих положений последовательности аминокислот выравнивают так, чтобы достигалось наибольшее совпадение (см., например: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).

[419] Термин "вектор", как используют в рамках изобретения, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к увеличению в количестве другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Термин включает вектор в качестве самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, встраивающийся в геном клетки-хозяина, в которую его вводят. Определенные векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называют в настоящем описании "экспрессирующими векторами". К векторам относятся вирусные векторы, такие как ретровирусные, например, гамма-ретровирусные и лентивирусные векторы.

[420] Термины "клетка-хозяин", "линия клеток-хозяев" и "культура клеток-хозяев" используют взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые вводят экзогенную нуклеиновую кислоту, включая потомков таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты" и "трансформированные клетки", которые включают первичные трансформированные клетки и их потомство, независимо от количества пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным исходной клетке в отношении содержания нуклеиновых кислот, а может содержать мутации. Этот термин включает мутантные потомки, которые имеют ту же функцию или биологическую активность при скрининге или селекции, что и первоначально трансформированная клетка.

[421] Как используют в рамках изобретения, указание на то, что клетка или популяция клеток является "положительной" по конкретному маркеру, относится к поддающемуся обнаружению присутствию на или в клетке конкретного маркера, как правило, маркера клеточной поверхности. При указании на маркер клеточной поверхности, термин относится к наличию поверхностной экспрессии, выявляемой посредством проточной цитометрии, например, посредством окрашивания антителом, которое специфически связывается с маркером, и обнаружения такого антитела, где окрашивание поддается обнаружению посредством проточной цитометрии на уровне, существенно превышающем окрашивание, выявляемое при выполнении той же методики с контролем того же изотипа в условиях, в остальном идентичных, и/или на уровне, по существу сходном с уровнем для клетки, о которой известно, что она является положительной в отношении маркера, и/или на уровне, существенно превышающем уровень для клетки, о которой известно, что она является отрицательной в отношении маркера.

[422] Как используют в рамках изобретения, указание на то, что клетка или популяция клеток является "отрицательной" в отношении конкретного маркера, к отсутствию существенного поддающегося обнаружению присутствия на или в клетке конкретного маркера, как правило, маркера поверхности. При указании на маркер клеточной поверхности, термин относится к отсутствию поверхностной экспрессии, выявляемой посредством проточной цитометрии, например, посредством окрашивания антителом, которое специфически связывается с маркером, и обнаружения указанного антитела, где окрашивание не выявляется посредством проточной цитометрии на уровне, существенно превышающем окрашивание, выявляемое при выполнении той же методики с контролем того же изотипа в условиях, в остальном идентичных, и/или на уровне, существенно более низком, чем уровень для клетки, о которой известно, что она является положительной по маркеру, и/или на уровне, по существу сходном с уровнем для клетки, о которой известно, что она является отрицательной по маркеру.

[423] Как используют в рамках изобретения, "процентная идентичность (%) аминокислотных последовательностей" и "процентная идентичность", когда их используют в отношении аминокислотной последовательности (эталонная полипептидная последовательность), определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате (например, рассматриваемом антителе или фрагменте), которые являются идентичными с аминокислотными остатками в эталонной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, при необходимости, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, и не рассматривая какие-либо консервативные замены в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процентной идентичности аминокислотных последовательностей может быть достигнуто различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, в том числе какие-либо алгоритмы, необходимые для обеспечения максимального выравнивания на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей.

[424] Как используют в рамках изобретения, форма единственного числа включает множественное число упоминаемых объектов, если контекст явно не указывает на иное. Например, форма единственного числа означает "по меньшей мере один" или "один или несколько". Понятно, что аспекты и варианты, описанные в настоящем описании, включают "состоящий" и/или "по существу состоящий из" аспектов и вариантов.

[425] На протяжении настоящего описания различные аспекты заявленного изобретения представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона предоставлено только для удобства и краткости, и его не следует истолковывать как строгое ограничение объема заявленного изобретения. Таким образом, описание диапазона следует понимать как конкретное описание всех возможных поддиапазонов, а также отдельных числовых величин в этом диапазоне. Например, когда предоставлен диапазон величин, понятно, что каждая входящая в него величина между верхней и нижней границами этого диапазона и любая другая указанная или входящая в этот указанный диапазон величина охватывается заявленным изобретением. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, и также охватываются заявленным изобретением за исключением какого-либо конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Когда указанный диапазон включает один или оба из пределов, заявленное изобретение также включает любой или оба из этих включенных пределов. Это применимо независимо от ширины диапазона.

[426] Термин "приблизительно", как используют в рамках изобретения, относится к обычному диапазону погрешности для соответствующей величины, хорошо известному специалисту в данной области техники. Указание "приблизительно" величины или параметра в настоящем описании включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся к самой этой величине или параметру. Например, описание с упоминанием "приблизительно X" включает описание "X".

[427] Как используют в рамках изобретения, композиция относится к любой смеси двух или более продуктов, веществ или соединений, включая клетки. Она может представлять собой раствор, суспензию, жидкость, порошок, пасту, водную композицию, неводную композицию или любую их комбинацию.

[428] Все публикации, в том числе патентные документы, научные статьи и базы данных, упоминаемые в настоящей заявке, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме для любых целей в той степени, как если бы каждая индивидуальная публикация была индивидуально включена в качестве ссылки. Если определение, указанное в настоящем описании, противоречит или иным образом не соответствует определению, указанному в патентах, заявках, опубликованных заявках и других публикациях, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки, определение, приведенное в настоящем описании, имеет преимущество над определением, которое включено в настоящее описание в качестве ссылки.

[429] Заголовки разделов, используемые в настоящем описании, приведены только для организационных целей и их не следует истолковывать как ограничивающие описанное изобретение.

IX. ИЛЛЮСТРАТИВНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[430] К вариантам осуществления, предусматриваемым в рамках настоящего изобретения, относятся:

1. Способ экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток, включающий вмешательство в область у индивидуума, в которой модифицированные клетки присутствуют, или вероятно будут присутствовать, или присутствовали или вероятно присутствовали, причем указанному индивидууму ранее проводили введение модифицированных способами генной инженерии клеток для лечения заболевания или состояния, где способ приводит к экспансии модифицированных способами инженерии клеток у индивидуума в области, и/или в ткани, или в органе, или в жидкости индивидуума, и/или к увеличению количества модифицированных способами инженерии клеток в этой области, ткани, или органе, или жидкости.

2. Способ согласно варианту осуществления 1, где способ не включает последующее введение модифицированных способами генной инженерии клеток, и/или экспансии достигают без такого последующего введения модифицированных способами генной инженерии клеток.

3. Способ лечения, включающий проведение режима лечения у индивидуума, где индивидууму ранее вводили модифицированные способами генной инженерии клетки для лечения заболевания или состояния, где способ приводит к экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток у индивидуума, в области, и/или в ткани, или органе, или жидкости индивидуума, и/или к увеличению количества модифицированных способами генной инженерии клеток в этой области, ткани, или органе, или жидкости.

4. Способ согласно варианту осуществления 4, где режим лечения включает вмешательство в область у индивидуума, в которой модифицированные способами инженерии клетки присутствуют, или предположительно присутствуют, или присутствовали, или вероятно присутствовали.

5. Способ согласно варианту осуществления 3 или 4, где режим лечения и/или способ не включает последующее введение модифицированных способами генной инженерии клеток или модифицированных способами генной инженерии клеток, и/или экспансии достигают без такого последующего введения.

6. Способ по любому из вариантов осуществления 3-5, где режим лечения проводят в субтерапевтической дозе, и/или он обеспечивает его терапевтический эффект посредством экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток.

7. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1, 2 и 4-6, где область представляет собой или содержит очаг повреждения или его часть.

8. Способ согласно варианту осуществления 7, где очаг повреждения представляет собой опухоль.

9. Способ согласно варианту осуществления 8, где опухоль представляет собой первичную или вторичную опухоль.

10. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1, 2 и 4-6, где область представляет собой или содержит ткань костного мозга.

11. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1, 2 и 4-10, где в момент или непосредственно перед моментом времени вмешательства индивидуум имеет рецидив после ответа, необязательно после ремиссии, и/или он не отвечал на введение модифицированных способами генной инженерии клеток.

12. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-11, где индивидуум имел рецидив после ответа и/или не отвечал на предшествующее введение модифицированных способами генной инженерии клеток.

13. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-12, где индивидуум отвечал на модифицированные способами генной инженерии клетки, а затем прекратил отвечать, и/или у него возник рецидив перед вмешательством.

14. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-13, где предварительно происходила экспансия модифицированных способами генной инженерии клеток у индивидуума или обнаружилось, что произошла их экспансия, перед вмешательством.

15. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-14, где в момент или непосредственно перед моментом вмешательства:

индивидуум находится на стадии ремиссии;

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, поддающихся обнаружению в крови, уменьшается или не поддается обнаружению;

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых в жидкости, или ткани, или образце, необязательно, в крови, индивидуума уменьшается по сравнению с предшествующим моментом времени после введения модифицированных способами генной инженерии клеток; и/или

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых в жидкости, или ткани, или образце, необязательно в крови, индивидуума, уменьшается на или более чем в 1,5 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раз, 10 раз или более по сравнению с пиковым или максимальным количеством модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых или обнаруженных в крови индивидуума после начала введения модифицированных способами генной инженерии клеток и/или по сравнению с уровнем в момент времени в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, или 14, или 28 суток после введения модифицированных способами генной инженерии клеток.

16. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-15, где вмешательство проводят через, приблизительно через, или более чем через, или более чем через приблизительно 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 1 год или более после начала введения модифицированных способами генной инженерии клеток или после последней дозы модифицированных способами генной инженерии клеток.

17. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-16, где вмешательство прямо или непрямо модулирует активность или функцию модифицированных способами инженерии T-клеток in vivo у индивидуума.

18. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-17, где вмешательство включает одно или несколько из введения иммуномодулирующего средства, радиации или физического или механического манипулирования над областью или очагом повреждения.

19. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-18, где вмешательство включает введение иммуномодулирующего средства.

20. Способ согласно варианту осуществления 19, где иммуномодулирующее средство представляет собой или содержит ингибирующую иммунитет молекулу, представляет собой или содержит молекулу иммунной точки контроля или представитель каскада иммунной точки контроля, и/или представляет собой или содержит модулятор молекулы или каскада иммунной точки контроля.

21. Способ согласно варианту осуществления 20, где молекула или каскад иммунной точки контроля представляет собой или включает PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM3, VISTA, рецептор аденозина, CD73, CD39, рецептор аденозина 2A (A2AR), или аденозин или каскад, вовлекающий любой из вышеуказанных.

22. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-20, где иммуномодулирующее средство представляет собой BY55, MSB0010718C, ипилимумаб, даклизумаб, бевацизумаб, базиликсимаб, ипилимумаб, ниволумаб, пембролизумаб, MPDL3280A, пидилизумаб, MK-3475, BMS-936559, атезолизумаб, тремелимумаб, IMP321, BMS-986016, LAG525, урелумаб, PF-05082566, TRX518, MK-4166, дацетузумаб, лукатумумаб, SEA-CD40, CP-870, CP-893, MEDI6469, MEDI6383, MOXR0916, AMP-224, авелумаб, MEDI4736, PDR001, rHIgM12B7, улокуплумаб, BKT140, варлилумаб, ARGX-110, MGA271, лирилумаб, IPH2201, ARGX-115, эмактузумаб, CC-90002 и MNRP1685A, или их антигенсвязывающий фрагмент.

23. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-22, где иммуномодулирующее средство представляет собой антитело против PD-L1.

24. Способ согласно варианту осуществления 1-23, где антитело против PD-L1 представляет собой MEDI14736, MDPL3280A, BMS-936559, LY3300054, атезолизумаб или авелумаб, или представляет собой их антигенсвязывающий фрагмент.

25. Способ согласно варианту осуществления 19, где иммуномодулирующее средство представляет собой талидомид, или представляет собой производное или аналог талидомида.

26. Способ согласно варианту осуществления 19 или 25, где иммуномодулирующее средство представляет собой леналидомид или помалидомид, авадомид, стереоизомер леналидомида, помалидомида, авадомида или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф.

27. Способ согласно любому из вариантов осуществления 19, 25 и 26, где иммуномодулирующее средство представляет собой леналидомид, стереоизомер леналидомида или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф.

28. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-27, где после рецидива и перед вмешательством индивидууму не вводили экзогенное или рекомбинантное средство для лечения заболевания или состояния, или для модулирования активности модифицированных способами генной инженерии клеток.

29. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-19 и 28, где вмешательство включает лучевую терапию.

30. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-19 и 28, где вмешательство включает физическое или механическое манипулирование над областью или очагом, необязательно включает исследование с помощью зонда, прокалывание или проникновение в область или очаг повреждения.

31. Способ согласно варианту осуществления 30, где физическое или механическое манипулирование включает биопсию.

32. Способ согласно варианту осуществления 31, где биопсию проводят с помощью иглы или троакара.

33. Способ согласно варианту осуществления 31 или варианту осуществления 32, где биопсия включает инцизионную биопсию.

34. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-34, где способ приводит к экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток или увеличению количества модифицированных способами генной инженерии клеток по сравнению с моментом времени непосредственно перед вмешательством.

35. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-34, где экспансия модифицированных способами генной инженерии клеток происходит в пределах или приблизительно в пределах 24 часов, 48 часов, 96 часов, 7 суток, 14 суток или 28 суток после вмешательства.

36. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-35, где:

экспансия обеспечивает более чем или приблизительно более чем в 1,5 раза, в 2,0 раза, в 5,0 раз, в 10 раз, в 100 раз, в 200 раз или более больше модифицированных способам инженерии клеток, поддающихся обнаружению в крови, по сравнению с моментом времени непосредственно перед вмешательством; или

экспансия обеспечивает более чем или приблизительно более чем в 1,5 раза, в 2,0 раза, в 5,0 раз, в 10 раз, в 100 раз, в 200 раз или более больше модифицированных способами инженерии клеток, поддающихся обнаружению в крови, по сравнению с предшествующими пиковыми уровнями модифицированных способами инженерии клеток в крови перед вмешательством.

37. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-36, где количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемое в крови в момент времени после вмешательства:

возрастает (например, возрастает в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз или более) по сравнению с количеством модифицированных способами инженерии клеток в предшествующий момент времени перед вмешательством;

более чем в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз или более превышает пиковое или максимальное количество модифицированных способами инженерии клеток, поддающееся обнаружению в крови индивидуума до вмешательства;

более чем или приблизительно более чем на 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% или 0,1% модифицированных способами инженерии клеток поддается обнаружению в крови в момент времени после обнаружения пика максимального уровня таких клеток в крови.

38. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-37, где модифицированные способами инженерии клетки экспрессируют рекомбинантный рецептор, который специфически связывается с антигеном, ассоциированным с заболеванием или нарушением, или экспрессируемым в клетках окружения или очага повреждения.

39. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-38, где заболевание или состояние представляет собой опухоль или злокачественную опухоль.

40. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-39, где заболевание или состояние представляет собой лейкоз или лимфому.

41. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-40, где заболевание или состояние представляет собой неходжкинскую лимфому (NHL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL).

42. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-41, где рекомбинантный рецептор представляет собой T-клеточный рецептор или функциональный не T-клеточный рецептор.

43. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-42, где рекомбинантный рецептор представляет собой химерный рецептор антигена (CAR).

44. Способ согласно варианту осуществления 43, где CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, который специфически связывается с антигеном, и внеклеточный сигнальный доменом, содержащий ITAM.

45. Способ согласно любому из вариантов осуществления 38-44, где антиген представляет собой CD19.

46. Способ согласно варианту осуществления 44 или вариант осуществления 45, где внутриклеточный сигнальный домен содержит внутриклеточный домен цепи CD3-зета (CD3ζ).

47. Способ согласно любому из вариантов осуществления 43-46, где CAR дополнительно содержит костимулирующую сигнальную область.

48. Способ согласно варианту осуществления 35, где костимулирующий сигнальный домен включает сигнальный домен CD28 или 4-1BB.

49. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-48, где модифицированные способами инженерии клетки представляют собой CD4+ или CD8+ T-клетки.

50. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-49, где терапия T-клетками включает первичные клетки, полученные от индивидуума.

51. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-49, где модифицированные способами инженерии клетки являются аутологичными для индивидуума.

52. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-49, где модифицированные способам инженерии клетки являются аллогенными для индивидуума.

53. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-52, где индивидуумом является человек.

54. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-53, где доза модифицированных способами генной инженерии клеток, которую вводили ранее, составляет от или от приблизительно 1×10⁵ до 1×10⁸ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), от или от приблизительно 5×10⁵ до 1×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) или от или от приблизительно 1×10⁶ до 1×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), в каждом случае включительно.

55. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-54, где доза модифицированных способами генной инженерии клеток, которую вводили ранее, составляет не более чем 1×10⁸ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), не более чем 1×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), не более чем 0,5×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), не более чем 1×10⁶ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), не более чем 0,5×10⁶ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC).

56. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-53, где доза модифицированных способами генной инженерии клеток, которую вводили ранее, составляет от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от 0,5×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 3×10⁶ клеток/кг, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/кг до 2,5×10⁶ клеток/кг или от приблизительно 1×10⁶ клеток/кг до 2×10⁶ клеток/кг, в каждом случае включительно.

57. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-56, где дозу модифицированных способами генной инженерии клеток вводят в одной фармацевтической композиции, содержащей клетки, или в качестве нескольких композиций вместе, содержащих клетки.

58. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-57, где вводимые модифицированные способами инженерии клетки представляют собой разделенную дозу, где клетки дозы вводят в нескольких композициях, в совокупности содержащих клетки дозы, на протяжении периода времени, составляющего не более трех суток.

59. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-58, где способ включает обеспечение последующего вмешательства, необязательно после рецидива у индивидуума после ответа после предшествующего вмешательства, и/или он не достиг полного ответа после предшествующего вмешательства.

60. Способ согласно любому из вариантов осуществления 59, где индивидуум ответил на модифицированные способами генной инженерии клетки после предшествующего вмешательства, а затем прекратил отвечать и/или имел рецидив перед последующим вмешательством.

61. Способ согласно варианту осуществления 59 или варианту осуществления 60, где произошла экспансия модифицированных способами генной инженерии клеток у индивидуума или обнаружено, что произошла экспансия, после предшествующего вмешательства или перед последующим вмешательством.

62. Способ согласно любому из вариантов осуществления 59-61, где в момент или непосредственно перед моментом времени последующего вмешательства:

индивидуум находится в фазе ремиссии;

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемое в крови, уменьшается или не поддается обнаружению;

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемое в жидкости, или ткани, или образце, необязательно в крови, индивидуума уменьшается по сравнению с предшествующим моментом времени после начала предшествующего вмешательства; и/или

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемое в жидкости, или ткани, или образце, необязательно в крови, от индивидуума уменьшается в или более чем в 1,5 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раз, 10 раз или более по сравнению с пиковым или максимальным количеством модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых или обнаруженных в крови индивидуума после начала предшествующего вмешательства и/или по сравнению с уровнем в момент времени в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, или 14 или 28 суток после начала предшествующего вмешательства.

63. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-62, где модифицированные способами генной инженерии клетки демонстрируют увеличенную или пролонгированную экспансию и/или персистенцию у индивидуума по сравнению со способом, в котором модифицированные способами генной инженерии клетки вводят индивидууму в отсутствии вмешательства.

64. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-63, где способ уменьшает опухолевую нагрузку в большей степени и/или в течение более длительного периода времени по сравнению со снижением, которое наблюдалось бы в случае сравнимого способа, в котором модифицированные способами генной инженерии клетки вводят индивидууму в отсутствии вмешательства, и/или в котором терапевтический режим проводят или вмешательство осуществляют в отсутствии модифицированных способами генной инженерии клеток, необязательно с той же дозе или по той же схеме дозирования.

VII. Примеры

[431] Следующие примеры включены только для иллюстраций и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Пример 1: Введение клеток, экспрессирующих CAR против CD19, индивидуумам

[432] Двадцати восьми индивидуумам с рецидивирующей или рефрактерной (R/R) неходжкинской лимфомой (NHL) вводили аутологичные T-клетки, экспрессирующие химерный рецептор антигена (CAR) против CD19. Демографические данные индивидуума и исходные характеристики указаны в таблице 1. CAR содержал scFv против CD19, происходящий из антитела мыши, происходящий из иммуноглобулина спейсер, трансмембранный домен, происходящий из CD28, костимулирующую область, происходящую из 4-1BB, и внутриклеточный сигнальный домен CD3-зета. Для получения аутологичных CAR-экспрессирующих T-клеток, T-клетки выделяли посредством обогащения на основе иммуноаффинности из образцов, полученных посредством лейкафереза отдельных индивидуумов, активировали и трансдуцировали вирусным вектором, кодирующим CAR против CD19, с последующим увеличением количества). Клетки в основном вводили индивидуумам в заданном соотношении CAR⁺ CD4⁺ T-клеток и CAR⁺ CD8⁺ T-клеток приблизительно 1:1.

Таблица 1. Демографические данные и исходные характеристики
Характеристика	N=28
Срединный возраст, годы (диапазон)	63 (37-79)
≥ 70 лет, n (%)	6 (21)
Мужчина/Женщина, n (%)	19/9 (68/32)
Подтип B-NHL, n (%)
DLBCL, NOS	15 (54)
Трансформированный DLBCL	10 (36)
Фолликулярный, степени 3B	1 (4)
MCL	2 (7)
Статус заболевания, n (%)
Рефрактерное*	24 (86)
Химиорефрактерное†	23 (82)
Исходный показатель ECOG, n (%)
0	14 (50)
1	10 (36)
2	4 (14)
Предшествующие линии терапии
Медиана (диапазон)	4 (1-8)
≥ 5, n (%)	7 (25)
Предшествующая трансплантация гематологических стволовых клеток, n (%)
Какие-либо HSCT	16 (57)
Аллогенные	4 (14)
Аутологичные	13 (46)
*<CR на последнюю терапию †SD или PD на последний включающий химиотерапию режим или рецидив <12 месяцев после аутологичной SCT

[433] Перед введением CAR-экспрессирующих T-клеток, (d=0), индивидуумов лечили 30 мг/м² флударабина каждые сутки в течение 3 суток и 300 мг/м² циклофосфамида каждые сутки в течение 3 суток. Композиции криоконсервированных клеток размораживали перед внутривенным введением. Терапевтическую дозу T-клеток вводили в качестве определенной клеточной композиции путем введения составленной популяции CD4+ CAR+ клеток и составленной CD8+ CAR+ популяции, вводимых в заданном соотношении приблизительно 1:1. На d=0 начинали лечение индивидуумов по схеме с однократной дозой или двумя дозами, на одном из двух уровней доз (уровень дозы 1 (DL-1) или уровень дозы 2 (DL-2), посредством внутривенной инфузии. Каждая вводимая доза включала 5×10⁷ (DL-1) или 1×10⁸ (DL-2) CAR-экспрессирующих T-клеток (заданное соотношение CD4+:CD8+ 1:1). Результаты этого примера относятся к результатам, которые наблюдались вплоть до и в конкретный момент времени продолжающегося исследования, в конкретной группе(ах) индивидуумов.

[434] Присутствие или отсутствие различных связанных с лечением неблагоприятных явлений оценивали у индивидуумов, которых лечили схемами с различными дозами терапии CAR-T-клеток (таблица 2). Как показано в таблице 3, не наблюдалось тяжелого синдрома высвобождения цитокинов (sCRS) (степени 3-5); синдром высвобождения цитокинов (CRS) наблюдался у 36% (10/28) индивидуумов. Нейротоксичность степени 3-4 наблюдалась у 14% (4/28) индивидуумов и 18% (5/28) индивидуумов имели нейротоксичность какой-либо степени. Одного индивидуума лечили тоцилизумабом и четырем пациентам вводили дексаметазон в случае CRS или нейротоксичности степени 2 с ранним началом. Шести индивидуумам вводили профилактические противоэпилептические средства.

Таблица 2. Связанные с лечением неблагоприятные явления
	DL1-S N=22	DL1-D N=3	DL2-S N=3	Всего N=28
Любые TEAE	21 (96)	3 (100)	3 (100)	27 (96)
Любые TEAE степени 3-5*	16 (73)	3 (100)	0	19 (68)
Любые связанные TEAE	14 (64)	2 (67)	1 (33)	17 (61)
Любые связанные TEAE степени 3-5*	4 (18)	1 (33)	0	5 (18)
Любые степени TEAE, сообщенные для ≥15% пациентов, предпочтительный термин, n (%)
Усталость	7 (32)	2 (67)	2 (67)	11 (39)
Синдром высвобождения цитокинов	8 (36)	2 (67)	0	10 (36)
Снижение аппетита	6 (27)	1 (33)	1 (33)	8 (29)
Запор	5 (23)	1 (33)	1 (33)	7 (25)
Рвота	5 (23)	1 (33)	1 (33)	7 (25)
Диарея	5 (23)	1 (33)	0	6 (21)
Головокружение	6 (27)	0	0	6 (21)
Головная боль	4 (18)	1 (33)	0	5 (18)
Гипертензия	4 (18)	1 (33)	0	5 (18)
Тошнота	3 (14)	1 (33)	1 (33)	5 (18)
Периферический отек	5 (23)	0	0	5 (18)
Лабораторные аномалии
Анемия	16 (73)	1 (33)	1 (33)	18 (64)
Нейтропения	22 (100)	3 (100)	2 (67)	27 (96)
Тромбоцитопения	13 (59)	3 (100)	2 (67)	18 (64)
*1 дыхательная недостаточность степени 5, оцененная как возможно связанная с терапией CAR-T-клетками, у пациента с MCL, у которого произошло прогрессирование и которому начали проводить следующую терапию

Таблица 3. Связанные с лечением неблагоприятные явления, представляющие особый интерес
Предпочтительный термин, n (%)	DL1-S N=22	DL1-D N=3	DL2-S N=3	Всего N=28
Синдром высвобождения цитокинов (CRS), любой	8 (36)	2 (67)	0	10 (36)
Степени 3-4	0	0	0	0
Нейротоксичность, любая*	4 (18)	1 (33)	0	5 (18)
Степени 3-4	3 (14)	1 (33)	0	4 (14)
*Включает: энцефалопатию, спутанность сознания, снижение уровня сознания, летаргию или судороги

[435] Индивидуумов в группе оценивали в отношении наилучшего общего ответа, наблюдаемого в течение некоторого периода вплоть до конкретного момента времени в ходе терапии после последней инфузии однократной дозы CAR+ T-клеток в соответствии с DL1. Результаты общих ответов представлены в таблице 4. Из 20 индивидуумов, которым вводили однократную дозу DL1 в группе диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (DLBCL) наблюдали общий показатель ответа (ORR) 80% (16/20) и 60% (12/20) индивидуумов продемонстрировали признаки полной ремиссии (CR). 20% (4/20) индивидуумов продемонстрировали признаки частичного ответа (PR) и 20% (4/20) индивидуумов продемонстрировали признаки прогрессирующего заболевания (PD). Среди индивидуумов, являющихся химиорефрактерными (имеющих стабильное или прогрессирующее заболевание после последнего режима, включающего химиотерапию, или рецидив менее чем через 12 месяцев после аутологичной SCT) перед введением CAR+ T-клеток, общий показатель ответа составил 83% (10 ORR, 7 CR, 3 PR, 2 PD, n=12). Среди индивидуумов, являющихся рефрактерными (имеющих менее чем полную ремиссию после последнего лечения, но считающихся химиорефрактерными), общий показатель ответа составил 77% (13 ORR, 9 CR, 4 PR, 4 PD, n=17).

Таблица 4. Общий ответ
	Когорта DLBCL, схема с однократной дозой DL1
	Все (n=20)	Рефрактерные* (n=17)	Химиорефрактерные† (n=12)
ORR, n (%) [95% CI]	16 (80) [56, 94]	13 (77) [50, 93]	10 (83) [52, 98]
CR, n (%) [95% CI]	12 (60) [36, 81]	9 (53) [28, 77]	7 (58) [28, 85]
PR	4 (20)	4 (24)	3 (25)
PD	4 (20)	4 (24)	2 (17)
*<CR на последнюю терапию †SD или PD на последний режим, включающий химиотерапию, или рецидив <12 месяцев после аутологичной SCT

[436] Из трех индивидуумов с DLBCL, которых в момент оценки лечили двумя дозами DL-1, два имели частичный ответ (PR) и 1 имел прогрессирующее заболевание (PD). Среди 2 DLBCL индивидуумов, которых в момент оценки лечили однократной дозой в соответствии с DL-2, у обоих индивидуумов наблюдали достижение CR. В группе MCL, в которой на момент оценки лечили всего двух индивидуумов посредством однократной дозы в соответствии с DL-1, наблюдали 1 PR и 1 PD. Проводили лечение двух индивидуумов с DLBCL типа "double-hit", трех индивидуумов с DLBCL типа "triple-hit", и четырех индивидуумов с DLBCL типа "double-expressor", и все они достигли ответа (7 CR, 2 PR).

[437] Количество CAR⁺ T-клеток в периферической крови определяли в определенные моменты времени после лечения путем инкубации клеток с реагентом, специфичным к трансгену. Количество CD3⁺/CAR⁺ T-клеток в периферической крови, определенное в определенные моменты времени после инфузии, представлено для индивидуумов, сгруппированных по наилучшему общему ответу на фиг.1A. У отвечающих индивидуумов (CR/PR) наблюдалось более высокое максимальное содержание CD3⁺/CAR⁺ T-клеток, чем у индивидуумов с PD. На фиг.1B-1D представлены уровни CD3⁺/CAR⁺ T-клеток, CD4⁺/CAR⁺ T-клеток и CD8⁺/CAR⁺ T-клеток (количество клеток/мкл крови; среднее значение ± SEM) у индивидуумов, которые достигли ответа, сгруппированных по длительности ответа, либо по длительному ответу (CR/PR), либо по PD через 3 месяца.

[438] Определяли C_max (количество CAR⁺ клеток/мкл крови) и площадь под кривой (AUC) для отвечающих индивидуумов (CR/PR) и для индивидуумов с PD, и они представлены в таблице 5. Результаты согласовывались с заключением, что длительные ответы коррелировали с более высокими уровнями CD3⁺/CAR⁺ T-клеток в крови с течением времени и при максимальной экспансии.

Таблица 5. Более высокие Cmax и AUC0-28 у пациентов с CR/PR против PD
	CD3	CD4	CD8
CR/PR (n=16)	PD (n=4)	CR/PR (n=16)	PD (n=4)	CR/PR (n=16)	PD (n=4)
Cmax (CAR+ клетки/мкл крови)
Среднее значение (SD)	612 (1919)	2 (1)	220 (754)	1 (0,6)	426 (1314)	0,5 (0,5)
Медиана (Min, Max)	33 (1, 7726)	1 (1, 3)	8 (1, 3040)	1 (0, 2)	4 (0, 5238)	0,3 (0, 1)
Q1, Q3	7, 123	0,7, 2	2, 46	0,6, 2	0,8, 104	0,1, 0,9
AUC0-28
Среднее значение (SD)	5883 (18821)	16 (13)	2369 (8388)	10 (7)	3873 (11963)	6 (6)
Медиана (Min, Max)	196 (11, 75773)	14 (4, 31)	47 (7, 33740)	9 (3, 17)	23 (1, 47834)	4 (1, 14)
Q1, Q3	52, 781	5, 26	16, 261	4, 16	4, 761	1, 10

AUC_0-28=количества на микролитр для указанной популяции CAR+ клеток между 0 и 28 сутками

Пример 2: Реэкспансия клеток, экспрессирующих CAR против CD19

[438] Для одного индивидуума с хемиорефрактерной трансформированной DLBCL (подтип из герминативного центра с реарранжировкой BCL2 и множеством копий MYC и BCL6), которым вводили CAR+ T-клетки в соответствии со схемой DL-1, как описано в примере 1, количество CD3+/CAR+, CD4+/CAR+, CD8+/CAR+ T-клеток в периферической крови, определенное через определенные периоды времени, представлено на фиг.2A. Индивидуума ранее лечили, и он был рефрактерным к, пяти терапиям предшествующих линий, включая этопозид со скорректированной дозой, доксорубицин и циклофосфамид с винкристином и преднизон плюс ритуксимаб (DA-EPOCH-R) и трансплнтацию аллогенных стволовых клеток промежуточной интенсивности от неродственного донора с совпадением по HLA 8/8. После трансплантации аллогенных стволовых клеток и перед введением CAR+ T-клеток индивидуум продемонстрировал 100% донорский химеризм во всех ростах крови, прекратил иммуносупрессивную терапию и не имел реакции "трансплантат против хозяина" (GVHD). Перед введением CAR+ T-клеток имел околоушную массу и очаг повреждения в правой височной доле головного мозга, наблюдаемые с помощью позитронно-эмиссионной томографии и компьютерной томографии (PET-CT) (фиг.2B) и подтвержденные магнитно-резонансной томографией (MRI) (фиг.2D).

[439] После проведения лечения CAR-T-клетками против CD19 индивидуум достиг CR через 28 суток после инфузии, как показано посредством PET-CT (фиг.2C) и MRI головного мозга (фиг.2E) без наблюдаемых признаков нейротоксичности или CRS. Через три месяца после инфузии CAR-T-клеток у этого индивидуума был обнаружен рецидив околоушной массы (фиг.2F), и ему была проведена инцизионная биопсия. Как показано на фиг.2A, после биопсии видимая опухоль прошла без дальнейшей терапии. Фармакокинетический анализ продемонстрировал выраженную реэкспансию CAR-T-клеток в периферической крови (до уровня выше первоначальной наблюдаемой экспансии, причем пиковые уровни наблюдались приблизительно через 113 суток после инфузии), что совпало с регрессией опухоли. Затем индивидуум достигнул второго CR, что было подтверждено посредством PET-CT для рестадирования через один месяц после биопсии (фиг.2G) и оставался в состоянии CR через 6 месяцев после инфузии CAR-T-клеток. Дальнейшая оценка индивидуума продемонстрировала, что ответ ЦНС был длительным и индивидуум оставался в состоянии CR через 12 месяцев.

[440] Результаты согласуются с заключением, что реэкспансия и активация CAR+T-клеток может инициироваться in vivo после уменьшения или утраты функциональных или активных CAR+ T-клеток и/или рецидива после противоопухолевого ответа на терапию CAR-T-клетками. Кроме того, после поздней реэкспансии in vivo после первоначальной инфузии CAR+ T-клеток CAR+ T-клетки способны вновь демонстрировать противоопухолевую активность. Этот результат подтверждает, что реэкспансия и активация CAR+ T-клеток может запускаться in vivo и что способы реактивации CAR+ T-клеток могут далее усиливать их эффективность.

Пример 3: Введение клеток, экспрессирующих CAR против CD19, индивидуумам с рецидивирующей и рефрактерной неходжскинской лимфомой (NHL)

A. Индивидуумы и лечение

[441] Терапевтические композиции CAR+ T-клеток, содержащие аутологичные T-клетки, экспрессирующие химерный рецептор антигена (CAR), специфичный к CD19, вводили индивидуумам с B-клеточными злокачественными опухолями.

Пример 3.A.1

[442] В примере 3.A.1 описаны результаты оценки в конкретный момент времени (3.A.1) в продолжающемся клиническом испытании проведения такой терапии у пациентов с В-клеточными злокачественными опухолями. В частности исследовали когорту (полная когорта)(на данный момент времени из пятидесяти пяти (55) взрослых человек с рецидивирующей или рефрактерной (R/R) агрессивной неходжскинской лимфомой (NHL), включая диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL), de novo или трансформированную из вялотекущей лимфомы (NOS), первичную медиастинальную крупноклеточную B-клеточную лимфому (PMBCL) и фолликулярную лимфому степени 3b (FLG3B) после неуспеха 2 линий терапии). Среди индивидуумов были индивидуумы с показателями Восточной кооперативной онкологической группы (ECOG) от 0 до 2 (срединное наблюдение 3,2 месяца). Полная когорта не включала индивидуумов с лимфомой из клеток мантийной зоны (MCL). Индивидуумы не исключались на основе предшествующей трансплантации аллогенных стволовых клеток (SCT), вторичного вовлечения центральной нервной системы (ЦНС) и показателя ECOG 2, и отсутствовало минимальное требуемое абсолютное количество лимфоцитов (ALC) для афереза.

[443] Исходы оценивали по отдельности для основной подгруппы из полной когорты (индивидуумы полной когорты за исключением индивидуумов с плохими показателями эффективности (ECOG 2), DLBCL, трансформированной из лимфом маргинальной зоны (MZL), и/или хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL, Рихтера) (основная когорта)). В момент времени, оцениваемый в примере 3.A.1, исходы для 44 индивидуумов в основной когорте оценивали по отдельности.

[444] Демографические данные и исходные характеристики индивидуумов полной и основной когорт, оцененные в момент времени в соответствии с примером 3.A.1, представлены в таблице 6.

Таблица 6. Демографические и исходные характеристики
Характеристика	Полная N=55	Основная N=44
Срединный возраст, годы (диапазон)	61 (29-82)	61 (29-82)
≥ 65 лет, n (%)	22 (40)	17 (39)
Мужчина/женщина, n (%)	38/17 (69/31)	28/16 (64/36)
Количество месяцев после постановки диагноза, медиана (диапазон)	17 (3-259)	20 (8-259)
Подтип B-NHL, n (%)
DLBCL, NOS	40 (73)	35 (80)
Трансформированная DLBCL	14 (26)	8 (18)
Фолликулярная, степени 3B	1 (2)	1 (2)
Молекулярный подтип, n (%)
Подтип "Double/triple hit"	15 (27)	12 (27)
Подтип "Double expressor"	6 (11)	4 (9)
Характеристики пациентов, n (%)
Химиорефрактерные†	42 (76)	34 (77)
ECOG 0-1	48 (87)	44 (100)
ECOG 2	7 (13)	0
Предшествующие линии терапии, медиана (диапазон)	3 (1-11)	3 (1-8)
< 5 линий терапии	44 (80)	37 (84)
Какая-либо HSCT	27 (49)	22 (50)
Аллогенная	4 (7)	3 (7)
Аутологичная	24 (44)	20 (45)
*SD или PD на последний режим, включающий химиотерапию, или рецидив <12 месяцев после аутологичной SCT

[445] Введенные терапевтические композиции T-клеток получали способом, включающим иммуноаффинное обогащение CD4+ и CD8+ клеток из полученных лейкаферезом образцов от отдельных индивидуумов, подвергаемых лечению. Выделенные CD4+ и CD8+ T-клетки активировали и трансдуцировали вирусным вектором, кодирующим CAR против CD19, с последующей экспансией и криоконсервацией модифицированных популяций клеток. CAR содержал scFv против CD19, происходящий из антитела мыши, происходящий из иммуноглобулина спейсер, трансмембранный домен, происходящий из CD28, костимулирующую область, происходящую из 4-1BB, и внутриклеточный сигнальный домен CD3-зета.

[446] Криоконсервированные композиции клеток размораживали перед внутривенным введением. Дозу терапевтических T-клеток вводили в качестве клеточной композиции с определенным составом путем введения составленной популяции CD4+ CAR+ клеток и составленной популяции CD8+ CAR+ клеток, вводимых в заданном соотношении приблизительно 1:1. Индивидуумам вводили однократную или двойную дозу CAR-экспрессирующих T-клеток (каждая отдельная доза посредством отдельных инфузий CD4+ CAR-экспрессирующих T-клеток и CD8+ CAR-экспрессирующих T-клеток, соответственно) следующим образом: однократная доза в соответствии с уровнем дозы 1 (DL-1), содержащая 5×10⁷ всех CAR-экспрессирующих T-клеток (n=30 для индивидуумов, которых оценивали в соответствии с примером 3.A.1), двойная доза в соответствии с DL1, где каждую дозу вводили с интервалом приблизительно четырнадцать (14) суток (n=6 для индивидуумов, которых оценивали в соответствии с примером 3.A.1, в том числе один индивидуум, которому случайно были введены две дозы в соответствии DL2 по схеме с двумя дозами, вследствие ошибки дозирования), или однократная доза в соответствии с уровнем дозы 2 (DL-2), содержащая 1×10⁸ (DL-2) всех CAR-экспрессирующих T-клеток (n=18 для индивидуумов, которых оценивали в соответствии с примером 3.A.1). Начиная за трое (3) суток до инфузии CAR+ T-клеток индивидуумам проводили химиотерапию с лимфодеплецией посредством флударабина (flu, 30 мг/м²) и циклофосфамида (Cy, 300 мг/м²).

Пример 3.A.2

[447] Для примера 3.A.2 проводили анализ результатов в последующий момент времени в клиническом испытании, описанном в этом примере 3 выше. В момент времени этого анализа лечили 74 пациентов (51 мужчин, 23 женщин). Индивидуумы включали шестьдесят девять (69) индивидуумов в полной когорте DLBCL (включая 67 DLBCL NOS (45 de novo, 14 случаев трансформированной из FL, 8 случаев трансформированной из CLL или MZL), 1 FL степени 3B, 1 PMBCL); и 5 индивидуумов в когорте MCL. Среди индивидуумов в полной когорте (DLBCL) срединный возраст составлял 61 год (диапазон 26, 82), срединное количество предшествующих терапий составляло 3 (диапазон 1, 12), 46 (67%) были химиорефрактерными, у 32 (46%) проводилась какая-либо предшествующая трансплантацию и по меньшей мере 16 (23%) пациентов имели лимфому типа "double/triple hit". Сорок девять (49) индивидуумов в основной когорте оценивали в этот момент времени в соответствии с 3.A.2.

B. Безопасность

[448] Оценивали наличие или отсутствие возникших после начала лечения нежелательных явлений (TEAE) при терапии CAR-T-клетками. Индивидуумов также оценивали и подвергали мониторингу в отношении нейротоксичности (неврологические осложнения, включающие симптомы спутанности сознания, афазии, энцефалопатии, миоклонических судорог, спазмы, летаргию и/или измененное психическое состояние), оцениваемой по шкале 1-5, в соответствии со шкалой National Cancer Institute-Common Toxicity Criteria (CTCAE), версия 4.03 (NCI-CTCAE v4,03). См. Common Terminology for Adverse Events (CTCAE) Version 4, U.S. Department of Health и Human Services, Published: May 28, 2009 (v4,03: June 14, 2010); и Guido Cavaletti & Paola Marmiroli Nature Reviews Neurology 6, 657-666 (December 2010). Также синдром высвобождения цитокинов (CRS) определяли и подвергали мониторингу в отношении степени тяжести. См. Lee et al, Blood. 2014;124(2):188-95.

Пример 3.B.1

[449] В примере 3.B.1 описаны результаты на основе момента времени анализа в соответствии с примером 3.A.1.

[450] На фиг.3 представлен процент таких индивидуумов, у которых наблюдалось наличие лабораторных аномалий и TEAE, которые возникали у ≥20% индивидуумов. В дополнение к TEAE, представленным на фиг.3, следующие явления наблюдались у ≥5% пациентов степени 3-4: снижение количества лейкоцитов (13,6%), энцефалопатия (12%), гипертензия (7%). Наблюдаемая степень токсичности была сопоставимой между уровнями доз 1 и 2.

[451] У 84% индивидуумов из полной когорты в анализе в соответствии с 3.B.1 не наблюдался тяжелый (степени 3 или выше) синдром высвобождения цитокинов (CRS) и тяжелая нейротоксичность. Кроме того, было обнаружено, что у 60% индивидуумов полной когорты не развился никакой CRS или нейротоксичность. Не наблюдали различий во встречаемости CRS, нейротоксичности (NT), sCRS или тяжелой нейротоксичности (sNT) между уровнями доз. В таблице 7 обобщенно представлена частота неблагоприятных явлений в виде синдрома высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичности у пациентов через 28 суток после введения по меньшей мере одной дозы CAR-T-клеток. Как показано в таблице 7, не наблюдалось sCRS (степени 3-4) ни у одного из индивидуумов, которым вводили однократную дозу DL2 или двойную дозу DL1. Тяжелую нейротоксичность или тяжелый CRS (степень 3-4) наблюдали у 16% (9/55) индивидуумов полной когорты и у 18% (8/44) индивидуумов в основной подгруппе. 11% (n=6) индивидуумов получали тоцилизумаб, 24% (n=13) индивидуумов получали дексаметазон. Среди индивидуумов ECOG2 полной когорты, наблюдаемые показатели CRS и нейротоксичности составляли 71% и 29%, соответственно.

Таблица 7. Оценка наличия или отсутствия неблагоприятных явлений в виде CRS и нейротоксичности для примера 3.B.1
	ПОЛНАЯ	ОСНОВНАЯ
Все уровни дозы	DL1S	DL2S	DL1D†
Безопасность, N	55	30	19	6	44
sCRS или sNT, n (%)	9 (16)	6 (20)	2 (11)	1 (17)	8 (18)
CRS или NT, n (%)	22 (40)	12 (40)	7 (37)	3 (50)	15 (34)
CRS
Степень 1-2, n (%)	18 (33)	10 (33)	5 (26)	3 (50)	12 (27)
Степень 3-4, n (%)	1 (2)	1 (3)	0	0	1 (2)
Нейротоксичность
Степень 1-2, n (%)	3 (6)	1 (3)	2 (11)	0	2 (5)
Степень 3-4, n (%)	9 (16)	6 (20)	2 (11)	1 (17)	8 (18)
† включает одного пациента, которого лечили по схеме из 2 доз в соответствии с DL2 вследствие ошибки дозирования

[452] На фиг.4 представлена кривая Каплана-Мейера, на которой изображено наблюдаемое время до возникновения CRS и/или нейротоксичности для примера 3.B.1. Как показано, наблюдаемое срединное время до возникновения CRS и до возникновения нейротоксичности составляло 5 и 11 суток, соответственно, причем только у 11% пациентов начало CRS происходило менее чем через 72 часа после начала проведения клеточной терапии. Срединное время до разрешения CRS и нейротоксичности до степени 1 или лучше составляло 5 и 7 суток, соответственно. Срединное время до полного разрешения CRS и нейротоксичности составляло 5 и 11 суток, соответственно. Результаты согласовывались с заключением, что показатель раннего возникновения какого-либо CRS или нейротоксичности у индивидуумов был низким.

Пример 3.B.2

[453] В примере 3.B.2 описана оценка в момент времени в соответствии с примером 3.B.2. Вплоть до этого момента времени данные о неблагоприятных явлениях (AE) собирали от лимфодеплеции (LD) до 90 суток после введения CAR-экспрессирующих T-клеток. Во второй момент времени 69 индивидуумов в когорте DLBCL (полная когорта) оценивали в отношении безопасности: 38, которым вводили однократную дозу согласно DL1, 25, которым вводили однократную дозу в соответствии DL2, и 6, которым вводили двойную дозу в соответствии с DL1. Наиболее частые TEAE, отличные от CRS или NT, включали нейтропению (41%, 28/69), усталость (30%, 21/69), тромбоцитопению (30%, 21/69) и анемию (26%, 18/69). Наблюдали одно TEAE 5 степени, которое представляло собой диффузное альвеолярное повреждение.

[454] В полной когорте не наблюдали острой инфузионной токсичности и наблюдали, что большинство индивидуумов, 64% (44/69), не имели CRS или NT, что указывает на то, что может быть возможной амбулаторная доставка CAR-экспрессирующих T-клеток. Уровни ассоциированной с CAR T-клетками токсичности, в том числе CRS и NT, не различались между уровнями доз. Наблюдалось, что профиль безопасности был сходным среди когорт и уровней доз. Среди 25 индивидуумов в полной когорте (36%), которые имели CRS или NT любой степени, 21 (30%) имел CRS и 14 (20%) имели NT. Ни один из индивидуумов не имел CRS степени 3 и только один (1%, 1/69) имел CRS степени 4, и ему потребовался уход в отделении интенсивной терапии; другие 29% (20/69) имели CRS степени 1-2. Из 20% индивидуумов с NT, 6% (4/69) имели степень 1-2 и 14% (10/69) имели степень 3-4; 2 (3%) имели судороги. Не наблюдалось CRS степени 5 или NT степени 5. Не наблюдалось случаев отека головного мозга. Все случаи CRS и NT разрешились за исключением одного случая тремора степени 1, который продолжался на момент анализа. Срединное время до возникновения первого CRS и NT составляло 5 суток (диапазон 2, 12) и 10 суток (диапазон 5, 23), соответственно. За первые 72 часа после инфузии у индивидуумов не наблюдалась NT, и только у 10% (7/69) наблюдался CRS (во всех случаях степени 1); NT предшествовал CRS у >70% индивидуумов. В целом, тринадцати (13) индивидуумам (19%) потребовалось вмешательство по поводу CRS или NT посредством антицитокиновой терапии (тоцилизумаб отдельно 1 (1%), дексаметазон отдельно 6 (9%), или оба 6 (9%)) и только одному потребовалась какая-либо поддержка с помощью сосудосуживающего средства. Срединные дозы тоцилизумаба и дексаметазон составляли 1 и 6, соответственно. Срединная длительность CRS и NT составляла 5 суток и 11 суток, соответственно. Анализ основной когорте (n=49) также продемонстрировал сходные частоты CRS и NT.

[455] В этой оценке наблюдалась низкая встречаемость и позднее возникновение CRS и/или NT при обоих уровнях доз, что подтверждает осуществимость амбулаторной инфузии, например, с посещением больницы при первых признаках лихорадки или при лихорадке, длящейся дольше чем определенный период времени. Не наблюдалось CRS степени 5 или NT степени 5, и все случае тяжелого CRS и тяжелой NT разрешались. Кроме того, приблизительно 2 из 3 пациентов не имели CRS или NT, что подтверждает, что клетки можно вводить амбулаторно. В момент оценки в соответствии с 3.B.2, четырех индивидуумов лечили в амбулаторных условиях. Кроме того, не наблюдалось значительных отличий в токсичности у индивидуумов, которым проводили введение в соответствии с DL1 или DL2, что указывает на достижение более высоких показателей ответа без увеличения риска токсичности или проблем с безопасностью.

C. Исходы в виде ответа после лечения

[456] Проводили мониторинг индивидуумов в отношении ответа, в том числе путем оценки опухолевой нагрузки через 1, 3, 6, 7, 12, 18 и 24 месяца после введения CAR+ T-клеток.

Пример 3.C.1

[457] Показатели ответа приведены в таблице 8. Высокие показатели длительного ответа наблюдались этой когорте индивидуумов, которая включала индивидуумов с неудачным предшествующим лечением, или с плохим прогнозом, и/или с рецидивирующим или рефрактерным заболеванием. Для индивидуумов среди всех доз в основной (n=44) когорте наблюдаемый общий показатель ответа (ORR) составил 86% и наблюдаемый показатель полного ответа (CR) составил 59%. Через три месяца для основной когорты общий показатель ответа (ORR) составил 66%; уровень CR через три месяца составил 50% в основной когорте. В основной когорте ORR через 3 месяца составил 58% (11/19) при уровне дозы 1 и 78% при уровне дозы 2; показатель CR через 3 месяца составил 42% (8/19) для уровня дозы 1 и 56% (5/9) для уровня дозы 2, что согласуется с предполагаемым эффектом ответа на дозу в отношении исхода лечения. Кроме того, результаты согласовывались с взаимосвязью между дозой и длительностью ответа.

Таблица 8. Ответ
	Полная	Основная
Все уровни дозы	DL1S	DL2S	DL1Dc	Все уровни дозы	DL1S	DL2S	DL1Dc
Наилучший общий ответ, Na	54	30	18	6	44	25	15	4
ORR, % (95% CI)	76 (62, 87)	80 (61, 92)	72 (47, 90)	67 (23, 96)	86 (73, 95)	84 (64, 95)	87 (60, 98)	100 (40, 100)
CR,% (95% CI)	52 (38, 66)	53 (34, 72)	50 (26, 74)	50 (12, 88)	59 (43, 74)	56 (35, 76)	60 (32, 84)	75 (19, 99)
≥ 3 месяцев, f/u, nb	41	24	11	6	32	19	9	4
ORR через 3 месяца,% (95% CI)	51 (35, 67)	46 (26, 67)	64 (31, 89)	50 (12, 88)	66 (47, 81)	58 (34, 80)	78 (40, 97)	75 (19, 99)
CR через 3 месяца, % (95% CI)	39 (24, 56)	33 (16, 55)	46 (17, 77)	50 (12, 88)	50 (32, 68)	42 (20, 67)	56 (21, 86)	75 (19, 99)
DL1S: схема DL1 с 1 дозой; DL2S: схема DL2 с 1 дозой; DL1D: схема DL1 с 2 дозами; a Включены пациенты с явлениями PD, смертью или результатам снимка для рестадирования через 28 суток. Не включены подвергнутые лечению пациенты <28 суток до получения снимка. b В знаменателе указано количество пациентов, которым проводили терапию CAR T-клетками ≥3 месяцев до даты получения данных снимка с оценкой эффективности через 3 месяца или до оценки PD или смерти. c Включен один пациент, которого лечили по схеме 2 дозы DL2 вследствие ошибки дозирования

[459] Общие показатели ответа среди различных подгрупп индивидуумов в полной и основной когорте представлены на фиг.5A и 5B, соответственно. В подгруппах DLBCL низкого риска показатели ответа были в основном высокими. ORR более 50% наблюдали через 3 месяца у пациентов с молекулярным подтипом "double/triple hit", которые имели первичную рефрактерную или химиорефрактерную DLBCL или которые никогда ранее не достигали CR. Полное разрешение вовлечения ЦНС в лимфому наблюдалось у 2 пациентов.

[460] Среди индивидуумов, которых лечили за шесть месяцев или более до конкретного момента времени, из десяти (10) пациентов, которые имели ответ через три месяца, у 9 (90%) ответ сохранялся через шесть месяцев. В момент времени оценки 97% индивидуумов в основной подгруппе, которые отвечали, были живы и при наблюдении со срединным временем наблюдения 3,2 месяца.

[461] Результаты для длительности ответа и общей выживаемости (сгруппированные по наилучшему общему ответу (не отвечающие, CR/PR, CR и/или PR)) представлены для полной и основной когорт индивидуумов на фиг.6A и 6B, соответственно. Как показано, длительная выживаемость наблюдалась у отвечающих с увеличением длительности ответа у субъектов с CR. Все пациенты, имевшие ответ через три месяца, оставались живыми в момент времени оценки, хотя 5/6 индивидуумов с низким статусом эффективности (ECOG 2) умерли.

Пример 3.C.2

[462] В примере 3.C.2 описаны результаты на основе момента времени анализа в соответствии с 3.A.2 и 3.B.2.

[463] Вплоть до момента времени в соответствии с примером 3.C.2, 68 индивидуумов в полной когорте DLBCL оценивали в отношении ответа. Показатели общего или объективного ответа (OR), показатели объективного ответа через 3 месяца и 6 месяцев составляли 75% (51/68), 49% (27/55) и 40% (14/35), соответственно. Показатель полного ответа (CR), показатель CR через 3 месяца и показатель CR через 6 месяцев составляли 56% (38/68), 40% (22/55) и 37% (13/35), соответственно. Тенденцию в отношении увеличенного показателя ответа через 3 месяца наблюдали у индивидуумов, которых лечили в соответствии с DL2 по сравнению с DL1: 63% (12/19; 95% CI 38, 84) против 40% (12/30; 95% CI 23, 59) для ORR, с p=0,148, и 58% (11/19; 95% CI 34, 80) против 27% (8/30; 95% CI: 12, 46) для CR, с p=0,0385. Среди 16 индивидуумов с лимфомой типа "double/triple hit" ORR составил 81% и показатель CR через 3 месяца составил 60%.

[464] В основной когорте (n=49 для момента времени в соответствии с примером 1.C.2), показатели OR, OR через 3 месяца и OR через 6 месяцев составили 84% (41/49), 65% (26/40) и 57% (13/23), соответственно. Показатель CR, показатель CR через 3 месяца и показатель CR через 6 месяцев составили 61% (30/49), 53% (21/40) и 52% (12/23), соответственно. При более высоких дозах наблюдали сходную тенденцию в отношении улучшенного длительного ORR и CR через 3 месяца. В частности, для пациентов в основной когорте, в которой проводили введение в соответствии с DL2, ORR через 3 месяца составил 80% (12/15; 95% CI 52, 96) и CR через 3 месяца составил 73% (11/15; 95% CI 45, 92), по сравнению с показателями ORR и CR через 3 месяца 52% (11/21; 95% CI 30, 74) и 33% (7/21; 95% CI 15, 57) у индивидуумов в основной когорте, которым вводили DL1, с p=0,159 и p=0,0409, соответственно. Среди индивидуумов в основной когорте, которым проводили введение в соответствии с DL2 и с наблюдением в течение 3 месяцев (n=15), ORR через 3 месяца составил 80% и CR через 3 месяца составил 73%.

[465] Срединный DOR в полной когорте и основной когорте в этот момент времени в соответствии с 1.C.2 составил 5,0 и 9,2 месяцев, соответственно; срединная длительность CR составила 9,2 месяца в полной когорте. Эта срединная длительность CR не была достигнута в основной когорте. Срединная общая выживаемость (OS) составила 13,7 месяца в полной когорте и не была достигнута в основной когорте. OS через 6 месяцев составила 75% в полной когорте со срединным значением наблюдения 5,8 месяца. OS через 6 месяцев составила 88% в основной когорте со срединным значением наблюдения 5,6 месяца.

D. Оценка CAR⁺ T-клеток в крови

[466] Исходя из данных для момента времени, описанного в примерах 3.A.1, 3.B.1 и 3.C.1, проводили фармакокинетический анализ для оценки количеств CAR⁺ T-клеток в периферической крови в различные моменты времени после лечения. Анализировали результаты для пятидесяти пяти (55) индивидуумов, оцененных в момент времени в соответствии с примером 3.A.1 в когорте DLBCL и четырех (4) индивидуумов (оцененных в этот же момент времени) при лимфоме из клеток мантийной зоны (MCL), описанных в примере 4 ниже. Определение показателей фармакокинетики (PK) проводили с использованием валидированной проточной цитометрии для обнаружения маркера, экспрессируемого в конструкции CAR, и количественного анализа на основе ПЦР для обнаружения встраивания конструкции CAR. Аплазию B-клеток оценивали посредством проточной цитометрии с использованием антител против CD19. Как показано на фиг.7A, CD4+ и CD8+ CAR-экспрессирующие клетки, при определении по количеству клеток/мкл крови (срединное значение ± квартили), нанесенному на график в логарифмическом масштабе, обнаруживались в ходе оценки при обоих уровнях вводимой дозы. Индивидуумы, которым проводили введение в соответствии с DL2 относительно DL1, имели более высокую срединную C_max и срединную AUC_0-28 для подгрупп CD3⁺/CAR⁺, CD4⁺/CAR⁺ и CD8⁺/CAR⁺ T-клеток в периферической крови (AUC_0-28: для DL2 против DL1 составила 1836 против 461, 350 против 182 и 1628 против 114, для CD3⁺, CD4⁺, и CD8⁺, соответственно; p < 0,05 для CD8⁺; C_max: для DL2 против DL1 составила 99,8 против 27,9, 15,1 против 5,2, и 73,1 против 5,5 клеток/мкл, соответственно). Срединное время до максимальной экспансии CD3⁺ CAR⁺ T-клеток составило 15 суток (диапазон 8-29), и оно не различалось между уровнями дозы. CD4⁺ и CD8⁺ CAR-экспрессирующие T-клетки обосновывались в костном мозге на относительно сходных уровнях.

[467] Увеличенная срединная площадь под кривой (AUC) (количества клеток CD8+ CAR+ в крови с течением времени) наблюдалась для индивидуумов, которым вводили более высокий уровень дозы по сравнению с более низким уровнем дозы без наблюдаемого повышения токсичности. Более высокая максимальная экспозиция CD8⁺/CAR⁺ T-клеток наблюдалась у отвечающих (CR/PR), чем у не отвечающих (PD); присутствие клеток во время оценки, включая 3 и 6 месяцев, наблюдалось даже у индивидуумов, у которых заболевание прогрессировало (фиг.7B). Срединная C_max и срединная AUC_0-28 для CD8⁺ CAR⁺ T-клеток были более высокими у отвечающих индивидуумов и у индивидуумов с длительным ответом через 3 месяца (медиана CD8⁺ C_max=20,8 против 5,5; медиана CD8⁺ AUC_0-28=235 против 55 в группе CR/PR через 3 месяца против PD через 3 месяца). Среди индивидуумов, которых оценивали в отношении персистенции CAR T-клеток, 90% и 93% из 29 индивидуумов имели поддающиеся обнаружению CD8⁺ и CD4⁺ CAR⁺ T-клетки, соответственно, через 3 месяца; 63% и 58% из 19 индивидуумов имели поддающиеся обнаружению CD8⁺ и CD4⁺ CAR⁺ T-клетки, соответственно, через 6 месяцев. Через 3 и 6 месяцев не наблюдалось статистически значимых различий в персистенции CAR⁺ T-клеток между индивидуумами с длительным ответом или рецидивом. CAR⁺ T-клетки поддавались обнаружению в момент рецидива у 89% и 11 индивидуумов с PK, даже несмотря на то, что аплазия B-клеток (<1 клетки/мкл) была продемонстрирована практически у всех индивидуумов, 97% (34/35), через 3 месяца, и у 100% (24/24) через 6 месяцев.

[468] Не было выявлено ассоциации более высокой C_max и AUC_0-28 в случае DL2 по сравнению DL1 с увеличенной частоты CRS или NT. Для какой-либо NT или для CRS степени > 2, срединная AUC для CD4⁺/CAR⁺ и CD8⁺/CAR⁺ T-клеток была в 5-10 раз и в 3-5 раз более высокой, соответственно, чем срединная AUC для DL2. Была выявлена ассоциация более высокой нагрузки заболеванием и исходных уровней воспалительных цитокинов с более высокими максимальными уровнями CAR⁺ T-клеток, более высокими максимальными уровнями цитокинов и более высокой частотой встречаемости CRS и NT. Результаты согласовывались с заключением, что более высокая Cmax и срединная AUC0-28 в случае DL2 не увеличивали частоту CRS или NT.

[469] Результаты согласовывались с заключением, что лечение приводило к длительной экспозиции и персистенции модифицированных способами инженерии клеток даже у индивидуумов с плохим ответом. В некоторых вариантах осуществления используют комбинированные подходы, такие как введение модулятора иммунной точки контроля или другого модулирующего средства, например, после рецидива или прогрессирования заболевания, в момент времени, когда модифицированные клетки присутствуют у индивидуума, например, при определении по уровням клеток в периферической крови. В некоторых аспектах клетки, присутствующие в течение длительного периода, вновь подвергаются экспансии или активируются, и/или демонстрируют противоопухолевую функцию после введения другого средства или проведения другого способа лечения. Как правило, более высокие срединные количества CD4+ и CD8+ CAR+ T-клеток наблюдали с течением времени в крови индивидуумов, у которых развилась (фиг.7C). Результаты показали, что CAR⁺ T-клетки демонстрировали экспансию и персистенцию, длительность ответа через 3 месяцев, который был более высоким при более высоких уровнях дозы, без увеличения токсичности. Было выявлено, что результаты согласуются с предположением, что высокие максимальные уровни CAR⁺ T-клеток и цитокинов в крови могут быть ассоциированы с NT и CRS, и на могут влиять исходные уровни факторов у индивидуума. Было обнаружено, что CAR⁺ T-клетки присутствовали во время рецидива, что указывает на то, что подходы комбинирования и повторного лечения могут обеспечивать определенные преимущества.

D. Анализируемые молекулы крови и нейротоксичность, CRS и ответ

[470] Различные анализируемые молекулы в крови до лечения, в том числе цитокины, количественно определяли в сыворотке индивидуумов (индивидуумов, которых оценивали в момент времени в соответствии с примером 3.A.1) перед введением CAR+ T-клеток. Количественное определение цитокинов проводили с использованием мультиплексного анализа цитокинов. Потенциальную корреляцию с риском развития нейротоксичности оценивали с использованием статистического анализа на основе однофакторных непараметрических критериев.

[471] На фиг.8 представлены срединные уровни оцененных анализируемых молекул в единицах (LDH, Е/л; ферритин, нг/мл; CRP, мг/л; цитокины, пг/мл) у индивидуумов, у которых не развилась нейротоксичность, против индивидуумов, у которых развилась нейротоксичность после терапии CAR+ T-клетками. Было выявлено, что уровни определенных анализируемых молекул в крови, включая LDH, ферритин, CRP, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, IFN- α2, MCP-1 и MIP-1β, ассоциированы с уровнем риска развития нейротоксичности (значения p Уилкоксона <0,05, с поправкой на множественность сравнений). В частности, результаты соответствовали заключению, что уровни LDH до лечения, которые в некоторых вариантах осуществления заменяют нагрузку заболеванием, могут быть пригодными для оценки риска потенциальной нейротоксичности и/или адаптированного к риску дозированию или коррекции лечения определенных индивидуумов. Кроме того, опухолевая нагрузка, измеренная до введения композиции CAR-T-клеток, коррелировала (значения p Спирмана <0,05) с риском развития нейротоксичности. В некоторых аспектах уровни LDH можно оценивать отдельно и/или в комбинации с другим параметром до лечения, таким как другой показатель или индикатор опухолевой нагрузки, такой как волюметрический показатель опухоли, такой как сумма произведений размеров (SPD) или другие волюметрические показатели нагрузки заболеванием на основе CT или MRI. В некоторых аспектах оценивают один или несколько параметров, указывающих на нагрузку заболеванием, и в некоторых контекстах они могут указывать на присутствие, отсутствие или степень риска развития нейротоксичности после терапии T-клетками. В некоторых аспектах один или несколько параметров включают LDH и/или волюметрический показатель опухоли.

[472] В дополнительных анализах пятьдесят пять (55) индивидуумов в когорте DLBCL в момент времени в соответствии с примером 3.A.1, и четыре (4) индивидуума с лимфомой из клеток мантийной зоны (MCL), описанных в примере 4, были включены в анализ для оценки корреляции с безопасности. У 59 индивидуумов, которых оценивали в отношении безопасности, CRS наблюдался у 32% (30% степени 1-2, 0% степени 3, 2% степени 4); NT наблюдался у 20% (5% степени 1-2, 10% степени 3, 5% степени 4). Уровень дозы не коррелировал с CRS или NT (p=0,565 и p=1,00, соответственно). Факторы индивидуума, которые коррелируют с какой-либо степенью CRS и NT, представляли собой худший показатель общего состояния (например, статус ECOG 2) (p=0,03) и более высокая нагрузка заболеванием (p <0,05) при определении по сумме произведений диаметров (SPD) на основе результатов визуализации. Наблюдалось, что клинические лабораторные параметры до инфузии CAR+ T-клеток и показатели цитокинов до инфузии CAR+ T-клеток, ассоциированные с появлением NT какой-либо степени, включали более высокий сывороточный уровень LDH, ферритин и CRP, и более высокий уровень в плазме IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, IFN-α2, MCP-1 и MIP-1β (p<0,05 для каждого). Более высокие уровни в плазме до инфузии CAR+ T-клеток IL-8, IL-10 и CXCL10 также были ассоциированы с NT степени 3-4 (p<0,05 для каждого).

[473] Из 54 индивидуумов в когорте DLBCL, которых оценивали в отношении ответа, более высокие показатели ECOG и DLBCL, трансформированная из CLL или MZL, коррелировали с более низким длительным ответом через 3 месяца (p=0,02 для обоих из них). Параметры до инфузии CAR+ T-клеток, ассоциированные с наилучшим ORR, включали более низкие уровни ферритина, LDH, CXCL10, G-CSF и IL-10, и параметры, ассоциированные с длительным ответом через 3 месяца, включали более низкие уровни ферритина, CRP, LDH, CXCL10, IL-8, IL-10, IL-15, MCP-1, MIP-1β, TNF-α и более высокий уровень гемоглобина и альбумина до инфузии CAR+ T-клеток (p<0,05 для каждого).

[474] В некоторых случаях образец для афереза и композицию CAR+ T-клеток для введения оценивали и сопоставляли с клиническими исходами. Результаты показали, что подгруппы T-клеток памяти и функциональность T-клеток могут коррелировать с определенными клиническими исходами.

[475] Результаты показали, что определенные исходные характеристики пациентов, включая воспалительный статус и высокую опухолевую нагрузку перед лечением, могут быть пригодным для идентификации пациентов, имеющих риск увеличенной токсичности после введение CAR-экспрессирующих T-клеток. Было обнаружено, что низкая опухолевая нагрузка и низкий воспалительный статус ассоциированы с улучшенным профилем токсичности и большей длительностью ответа. Результаты подтверждают, что лечение индивидуумов раньше в ходе терапии и/или оценкаа панели клинических и лабораторных биомаркеров риска, определяющие потенциальное более раннее вмешательство у индивидуумов, может снижать риск токсичности и увеличивать длительность ответа.

[476] На фиг.9 представлен график, на который нанесено время без прогрессирования (месяцы) для отдельных индивидуумов в полной или основной когортах. Каждый столбик соответствует одному пациенту. Затемнение указывает на наилучший общий ответ (в каждом случае, если нет иных указаний, достигнутый через 1 месяц); текстура указывает на дозу (сплошная=уровень дозы 1, однократная доза; заштрихованная накрест, уровень дозы 2, однократная доза; вертикально заштрихованная=уровень дозы 1, две дозы). Горизонтальные стрелки указывают на продолжающийся ответ. Некоторые индивидуумы первоначально были оценены (например, через 1 месяц) как имеющие стабильное заболевание (SD) или частичный ответ (PR), и позднее было обнаружено, что они достигли PR (например, переход SD в PR) или CR. В таких случаях затенение столбика отдельного пациента, как указано, указывает на наилучший общий ответ, и точки (то же соответствие затенения достигнутому ответу) вдоль столбика каждого отдельного индивидуума указывают на то, когда каждый SD, PR и/или CR произошел у индивидуума. Полное разрешение вовлечения ЦНС в лимфому наблюдалось у двух пациентов. Было обнаружено, что CAR+ клетки у одного индивидуума увеличились в количестве согласно биопсии после рецидива.

Пример 4: Введение клеток, экспрессирующих CAR против CD19, индивидуума с лимфомой из клеток мантийной зоны (MCL)

[477] Терапевтические композиции CAR+ T-клеток, содержащие аутологичные T-клетки, экспрессирующие химерный рецептор антигена (CAR), специфичный к CD19, полученный, как описано в примере 1, вводили четырем (4) человекам с лимфомой из клеток мантийной зоны (MCL), у которых оказалась неуспешной терапия 1 линии. Криоконсервированные композиции клеток размораживали перед внутривенным введением. Терапевтическую композицию T-клеток вводили в качестве клеточного продукта с определенным составом с введением составленных CD4+ и CD8+ популяций модифицированных способами инженерии CAR+ T-клеток, происходящих из того же индивидуума, в заданном соотношении приблизительно 1:1. Индивидуумам вводили дозу CAR-экспрессирующих T-клеток (в качестве разделенной дозы CD4+ и CD8+ CAR-экспрессирующих T-клеток) в однократной дозе, соответствующей уровню дозы 1 (DL1), содержащей 5×10⁷ CAR-экспрессирующих T-клеток. Начиная за (3) суток до инфузии CAR+ T-клеток, индивидуумам проводили химиотерапию с лимфодеплецией посредством флурабина (flu, 30 мг/м²) и циклофосфамида (Cy, 300 мг/м²).

[478] Проводили мониторинг индивидуумов в отношении ответа и токсичности, как описано в примере 1. Не наблюдали CRS или нейротоксичности ни у одного из индивидуумов. Среди 4 индивидуумов, которым проводили лечение, два (2) индивидуума достигли PR (не длительный) и два (2) пациента имели прогрессирующее заболевание.

Пример 5: Оценка биомаркеров в биоптатах опухоли от индивидуумов с рецидивирующей и рефрактерной неходжскинской лимфомой (NHL) до и после введения клеток, экспрессирующих CAR против CD19

[479] Экспрессию нескольких биомаркеров оценивали в биоптатах опухоли, полученных от индивидуумов до и/или после введения CAR-экспрессирующих клеток.

A. Биоптаты опухоли

[480] Биоптаты опухоли получали от отдельных индивидуумов с рецидивирующей или рефрактерной (R/R) диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой (DLBCL) или лимфомой из клеток мантийной зоны (MCL), которым проводили лечение терапевтическими композициями CAR⁺ T-клеток, содержащими аутологичные T-клетки, экспрессирующие химерный рецептор антигена (CAR), специфичный к CD19, описанные выше в примерах 3 и 4 выше, исходя из момента времени оценки в соответствии с примером 3.A.2. Биоптаты опухоли получали перед введением CAR⁺ T-клеток (до лечения) и через 7-20 суток после введения (после лечения). В этом примере описаны результаты для оценки в момент времени в соответствии с примером 3.A.2 в продолжающемся исследовании. Исследовали результаты для 43 биоптатов (26 до лечения; 17 после лечения и 15 подобранных пар) всего от 28 индивидуумов (25 DLBCL и 3 MCL).

B. Оценка биомаркеров, исходов ответа и безопасности

[481] Инфильтрацию CAR⁺ T-клеток в биоптат опухоли количественно определяли с использованием зондов для гибридизации in situ (ISH), специфичных к мРНК, кодирующей CAR против CD19. CAR⁺ T-клетки, не CAR T-клетки и B-клетки подсчитывали с использованием мультиплексных иммунофлуоресцентных (IF) способов анализа, обнаруживающих суррогатный маркер клеточной поверхности для CAR-экспрессирующих клеток, CD4, CD8, CD19, CD20, CD73, FOXP3, CD163, IDO и PD-L1. Биоптаты опухоли окраливали гематоксилином и эозином (H&E) и оценивали для определения качества ткани и идентификации опухоли. Иммунофлуоресцентные изображения анализировали с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Потенциальную корреляцию с исходами в виде ответа оценивали с использованием статистического анализа на основе однофакторных t-критериев, и значений p были 2-сторонними без внесения поправки на множественность.

[482] Индивидуумов оценивали в отношении исходов в виде ответа и безопасности, в том числе путем оценки опухолевой нагрузки в различные моменты времени после введения CAR⁺ T-клеток, в том числе через 3 месяца после введения, и определения того, имел ли индивидуум прогрессирующее заболевание (PD), стабильное заболевание (SD), частичный ответ (PR) или полный ответ (CR). Оцениваемые исходы в виде безопасности включали нейротоксичность (неврологические осложнения, включающие симптомы спутанности сознания, афазии, энцефалопатии, миоклонических судорог, конвульсий, летаргии и/или измененного психического состояния), оцененную по шкале 1-5, в соответствии со шкалой National Cancer Institute-Common Toxicity Criteria (CTCAE), версия 4.03 (NCI-CTCAE v4,03).

C. Результаты

[483] Выявленный объективный показатель ответа (ORR; включая CR и PR) составил 71% (20/28) у индивидуумов, для которых оценивали биоптаты. CRS степени 1, 2 наблюдали у 36% (10/28; степень 1, 2) индивидуумов, для которых оценивали биоптаты, и NT степени 2-4 наблюдали у 18% (5/28) индивидуумов, для которых оценивали биоптаты.

[484] Было выявлено, что биоптаты опухоли до лечения имеют различный клеточный состав: опухолевые клетки (медиана: 77%; диапазон 5-96%), CD4⁺ клетки (0,90%; 0,02-15%) и CD8⁺ клетки (1,5%; 0-23%). Результаты показали, что индивидуумы с CR или PR через 3 месяца после введения CAR+ T-клеток имели более высокий процент эндогенных CD4⁺ клеток в опухолях до лечения по сравнению с индивидуумами с PD (CR, PR, медиана: 7,9%; PD, медиана: 0,38%; p < 0,0001). Проценты CD8⁺ клеток в опухолях до лечения на различались между группами ответа через 3 месяца (CR, PR, медиана: 1,9%; PD, медиана: 0,47%; p=0,6496).

[485] В биоптатах после лечения наблюдалась инфильтрация опухоли CAR+ T-клетками, и они составляли вплоть до 22% клеток в биоптате. Было выявлено, что уровень инфильтрации опухоли в образцах после лечения (от 7 до 20 суток после введения) является более высоким у индивидуумов, которые затем достигли CR (медиана: 3,9%) или PR (медиана: 1,1%) по сравнению с индивидуумами, которые затем достигли наилучшего общего ответа (BOR) в виде SD или PD (медиана: 0,51%). Хоты было выявлено, что как CD4⁺, так и CD8⁺ CAR T-клетки инфильтрировали область опухоли в момент времени после лечения (от 7 до 20 суток после введения), индивидуумы, которые затем достигли CR, имели более высокое соотношение CD8⁺ CAR⁺ T-клеток и CD4⁺ CAR⁺ T-клеток в этот момент времени после лечения по сравнению с индивидуумами, которые затем достигли BOR в виде SD или PD (медиана CR: 0,83; SD, медиана PD: 0,14; p=0,0097).

[486] Сравнение результатов для подобранных биоптатов до и после лечения от отдельных индивидуумов показало тенденцию в отношении достижения в конечном итоге BOR в виде CR или PR в случае большего увеличения после лечения количества CD8⁺ клеток (CAR⁺ T и не CAR T) в опухолях по сравнению с индивидуумами, которые достигли BOR в виде SD или PD (CR, PR, срединное изменение: +5,3%; SD, PD, срединное изменение: +0,06%; p=0,1225).

[487] Экспрессия иммуносупрессивных факторов, включая CD73, FOXP3, CD163, IDO и PD-L1, варьировалась среди индивидуумов до лечения (CD73 (медиана: 1,5%; диапазон 0-42%), FOXP3 (0,10%; 0-1,5%), IDO (0,06%; 0-11%), CD163 (1,2%; 0-24%) и PD-L1 (0,16%; 0-56%)) и после лечения (CD73 (1,6%; 0-53%), FOXP3 (0,09%; 0-4,3%), IDO (0,28%; 0-15%), CD163 (3,6%; 0-22%) и PD-L1 (3,3%; 0-65%)). Наблюдалось, что увеличение CD8⁺ клеток после лечения в подобранных биоптатах ассоциировано с увеличением после лечения экспрессии IDO (R²=0,64) и PD-L1 (R²=0,61). Этот результат согласуется с заключением, что инфильтрация CD8+ CAR+ клеток в оцениваемый момент времени может указывать на потенциальную вероятность достижения степени ответа или длительности ответа, и что присутствие и/или активность таких клеток могут приводить к активации факторов TME.

D. Заключение

[488] Было выявлено, что длительность ответа через 3 месяца после введения CAR+ T-клеток ассоциирована с более высокими уровнями CD4⁺ клеток в опухолях до лечения. В опухолевых клетках после лечения наблюдалась инфильтрация CAR+ T-клеток, как CD4⁺, так и CD8⁺, в опухоль и соседнюю ткань. ORR был ассоциирован с увеличением уровня CAR+ T-клеток в биоптате опухоли. Увеличение уровней CD8⁺ клеток в биоптате опухоли после лечения по сравнению с уровнями CD8⁺ в биоптате опухоли до лечения было ассоциировано с увеличением экспрессии IDO и PD-L1. В некоторых вариантах осуществления способы терапии, нацеленные на эти каскады, такие как способы терапии, проводимые в момент введения или после введения CAR-T-клеток, могут улучшать один или несколько терапевтических исходов или их длительность после введения CAR+ T-клеток.

Пример 6: Оценка персистенции у индивидуумов с рецидивирующей и рефрактерной неходжскинской лимфомой (NHL) после введения экспрессирующих клеток с CAR против CD19

[489] Персистенцию и экспансию оценивали у пациентов в момент времени после момента времени оценки в клиническом испытании, описанном в примере 3 выше.

A. Индивидуумы, ответ и безопасность

[490] Анализ в момент времени, представленный в этом примере, основан на оценке всего 91 индивидуума в полной когорте DLBCL (88 (34 из основной когорты), оцененных в отношении ответа, и 91, оцененный в отношении безопасности), которым вводили клетки, экспрессирующие CAR против CD19. Как показано в таблице 9. Объективный показатель ответа (ORR) составил 74%, включая 52% индивидуумов, которые продемонстрировали полный ответ (CR). Встречаемость синдрома высвобождения цитокинов (CRS) какой-либо степени составила 35% с 1% тяжелого CRS; и встречаемость нейротоксичности (NT) какой-либо степени составила 19% с 1% тяжелой NT.

Таблица 9. Ответ и безопасность после введения CAR+ клеток
	Полная	Основная
Все уровни доз	Все уровни дозa	DL1S	DL2S
Наилучший общий ответ (BOR), nb	88	65	34	27
ORR,% (95% CI)	74 (63,83)	80(68, 89)	77 (59,89)	82 (62, 94)
CR,% (95% CI)	52 (41,63)	55(43, 68)	47 (30, 65)	63 (42, 81)
Безопасность, nc	91	67	34	29
Какой-либо CRS,% (95% CI)	35 (25, 46)	36 (24, 48)	41 (25, 59)	24 (10, 44)
sCRS(степень 3-4),% (95% CI)	1 (0, 6)	1 (0, 8)	38 (0, 15)	0
Какая-либо NTx,% (95% CI)	19 (11,28)	21 (12, 33)	24 (11, 41)	17 (6, 36)
sNTx (степень 3-4),% (95% CI)	12 (6, 21)	15 (7, 26)	21 (9, 38)	7 (1, 23)

a Четыре пациента, которых лечили в соответствии с DL1D (уровень дозы 1, схема с двумя дозами) со сходными исходами.

b Включает пациентов со случаем PD, смерти или результатами рестадирования через 28 суток. У одного пациента не было доступных результатов рестадирования.

c Включает всех индивидуумов, которым вводили по меньшей мере одну дозу соответствующего продукта CAR-экспрессирующих клеток за 28 суток до получения данных, или которые умерли.

D. Персистенция

[491] Персистенцию CAR-экспрессирующих клеток и аплазию CD19+ B-клеток (низкие количества или отсутствие CD19+ B-клеток) оценивали в различные моменты времени у поддающихся оценке индивидуумов с DLBCL, которым вводили CAR+ T-клетки, на основе уровней поддающихся обнаружению CD3⁺, CD4⁺ или CD8⁺ CAR-экспрессирующих клеток и уровней CD19⁺ B-клеток, выявленных в крови, соответственно. Результаты представлены в таблице 10. Среди индивидуумов, оцененных при прогрессировании (n=37), наблюдали медиану 0,17 CD4+ CAR-экспрессирующих клеток/мкл (диапазон, 0-65,5 клеток/мкл) и медиану CD8+ CAR+ 0,15 клеток/мкл (диапазон, 0-131,8 клеток/мкл) при прогрессировании. Среди индивидуумов, оцененных при рецидиве (прогрессирование после достижения CR/PR) (n=12), наблюдали медиану 0,17 клеток/мкл (диапазон, 0-35,1 клеток/мкл) CD4+ CAR-экспрессирующих клеток и медиану 0,20 клеток/мкл (диапазон, 0-131,8 клеток/мкл) CD8+ CAR-экспрессирующих клеток пре рецидиве. Длительную персистенцию CAR-экспрессирующих клеток наблюдали у 75% подвергаемых оценке индивидуумов с DLBCL через 12 месяцев. Длительную персистенцию аплазии B-клеток также наблюдали у 75% индивидуумов через 12 месяцев, независимо от статуса рецидива. Результаты согласуются с заключением, что клетки, экспрессирующие CAR против CD19, демонстрировали длительную персистенцию у большинства индивидуумов, и демонстрируют потенциал к продолжающемуся контролю заболевания на низком уровне даже у пациентов с рецидивом.

[492] Среди индивидуумов с рецидивом 91,7% (11/12) имели поддающиеся обнаружению CAR-экспрессирующие клетки в крови в момент рецидива. Этот результат согласуется с заключением, что комбинированную терапию или другое вмешательство в некоторых вариантах осуществления можно использовать для усиления и/или повышения эффективности CAR-экспрессирующих клеток, таких как клетки, которые могут истощаться.

Таблица 10. Длительная персистенция CAR+ клеток и аплазия CD19
	3 месяца	6 месяцев	9 месяцев	12 месяцев	При прогрес-сировании	При рецидиве
Персистенция CAR T-клеток у поддающихся оценке пациентов, n	50	30	18	12	37	12
CD3+,%	100	80,0	77,8	75,0	91,9	91,7
CD4+,%	88,0	63,3	50,0	41,7	83,8	83,3
CD8+,%	90,0	70,0	55,6	50,0	83,8	75,0
CD19+ B-клеточная аплазия (< 1 клетка/мкл),%	96,0	93,3	77,8	75,0	97,3	100

[493] Объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными описанными вариантами осуществления, которые предоставлены, например, для иллюстрации различных аспектов изобретения. Различные модификации описанных композиций и способов, станут очевидными, исходя из описания и идей, описанных в настоящем описании. Такие варианты можно применять на практике без отклонения объема и сущности изобретения, и подразумевается, что они входят в объем настоящего изобретения.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

SEQ ID NO	ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ	ОПИСАНИЕ
1	ESKYGPPCPPCP	Спейсер (шарнирная область IgG4) (а.к.) Homo sapiens
2	GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT	Спейсер (шарнирная область IgG4) (нуклеотидная) homo sapiens
3	ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK	Спейсер шарнирная область-CH3 Homo sapiens
4	ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK	Спейсер шарнирная область-CH2-CH3 Homo sapiens
5	RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH	IgD-шарнирная область-Fc Homo sapiens
6	LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR	T2A, искусственная
7	MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM	tEGFR, искусственная
8	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV	CD28 (аминокислоты 153-179 последовательности с номером доступа № P10747) Homo sapiens
9	IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV	CD28 (аминокислоты 114-179 последовательности с номером доступа № P10747) Homo sapiens
10	RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS	CD28 (аминокислоты 180-220 P10747) Homo sapiens
11	RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS	CD28 (от LL до GG) Homo sapiens
12	KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL	4-1BB (аминокислоты 214-255 Q07011.1) Homo sapiens
13	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	CD3-зета Homo sapiens
14	RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	CD3-зета Homo sapiens
15	RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	CD3-зета Homo sapiens
16	RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM	tEGFR, искусственная
17	EGRGSLLTCGDVEENPGP	T2A, искусственная
18	GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP	P2A
19	ATNFSLLKQAGDVEENPGP	P2A
20	QCTNYALLKLAGDVESNPGP	E2A
21	VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP	F2A
22	PGGG-(SGGGG)5-P- где P представляет собой пролин, G представляет собой глицин и S представляет собой серин	Линкер
23	GSADDAKKDAAKKDGKS	Линкер
24	GSTSGSGKPGSGEGSTKG	Линкер
25	gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagc gtgaccgtgagcagc	Последовательность, кодирующая scFv
26	X1PPX2P X1 представляет собой глицин, цистеин или аргинин X2 представляет собой цистеин или треонин	Шарнирная область
27	Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro	Шарнирная область
28	Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro	Шарнирная область
29	ELKTPLGDTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP	Шарнирная область
30	Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro	Шарнирная область
31	Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro	Шарнирная область
32	Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro	Шарнирная область
33	Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro	Шарнирная область
34	Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro	Шарнирная область
35	RASQDISKYLN	CDR L1 FMC63
36	SRLHSGV	CDR L2 FMC63
37	GNTLPYTFG	CDR L3 FMC63
38	DYGVS	CDR H1 FMC63
39	VIWGSETTYYNSALKS	CDR H2 FMC63
40	YAMDYWG	CDR H3 FMC63
41	EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS	VH FMC63
42	DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT	VL FMC63
43	DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS	scFv FMC63
44	KASQNVGTNVA	CDR L1 SJ25C1
45	SATYRNS	CDR L2 SJ25C1
46	QQYNRYPYT	CDR L3 SJ25C1
47	SYWMN	CDR H1 SJ25C1
48	QIYPGDGDTNYNGKFKG	CDR H2 SJ25C1
49	KTISSVVDFYFDY	CDR H3 SJ25C1
50	EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSS	VH SJ25C1
51	DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR	VL SJ25C1
52	GGGGSGGGGSGGGGS	Линкер
53	EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR	scFv SJ25C1
54	HYYYGGSYAMDY	CDR H3 FMC63
55	HTSRLHS	CDR L2 FMC63
56	QQGNTLPYT	CDR L3 FMC63

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> JUNO THERAPEUTICS, INC.

ALBERTSON, Tina

<120> СПОСОБЫ МОДУЛИРОВАНИЯ CART-КЛЕТОК

<130> 735042009140

<140> Еще не присвоен

<141> К настоящему прилагается

<150> 62/580,414

<151> 2017-11-01

<150> 62/549,391

<151> 2017-08-23

<150> 62/515,512

<151> 2017-06-05

<150> 62/514,777

<151> 2017-06-02

<150> 62/492,950

<151> 2017-05-01

<150> 62/444,784

<151> 2017-01-10

<150> 62/429,740

<151> 2016-12-03

<160> 56

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Спейсер (шарнирная область IgG4)

<400> 1

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 36

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Спейсер (шарнирная область IgG4)

<400> 2

gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36

<210> 3

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Спейсер шарнирная область-CH3

<400> 3

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg

1 5 10 15

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

20 25 30

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

35 40 45

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

50 55 60

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

65 70 75 80

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

85 90 95

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

100 105 110

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

115

<210> 4

<211> 229

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Спейсер шарнирная область CH2-CH3

<400> 4

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 5

<211> 282

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> шарнирная область IgD-Fc

<400> 5

Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala

1 5 10 15

Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys

35 40 45

Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln

65 70 75 80

Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly

85 90 95

Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val

100 105 110

Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly

115 120 125

Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn

130 135 140

Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro

145 150 155 160

Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys

165 170 175

Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser

180 185 190

Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu

195 200 205

Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro

210 215 220

Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser

225 230 235 240

Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr

245 250 255

Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg

260 265 270

Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His

275 280

<210> 6

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> T2A

<400> 6

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

20

<210> 7

<211> 357

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> tEGFR

<400> 7

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala

325 330 335

Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly

340 345 350

Ile Gly Leu Phe Met

355

<210> 8

<211> 27

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD28

<300>

<308> UniProt P10747

<309> 1989-07-01

<400> 8

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 9

<211> 66

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD28

<300>

<308> UniProt P10747

<309> 1989-07-01

<400> 9

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

50 55 60

Trp Val

65

<210> 10

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD28

<300>

<308> UniProt P10747

<309> 1989-07-01

<400> 10

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 11

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD28

<400> 11

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 12

<211> 42

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> 4-1BB

<300>

<308> UniProt Q07011.1

<309> 1995-02-01

<400> 12

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 13

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD3-зета

<400> 13

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 14

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD3-зета

<400> 14

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 15

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<223> CD3-зета

<400> 15

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 335

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> tEGFR

<400> 16

Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile

20 25 30

Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe

35 40 45

Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr

50 55 60

Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn

65 70 75 80

Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg

85 90 95

Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile

100 105 110

Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val

115 120 125

Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp

130 135 140

Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn

145 150 155 160

Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu

165 170 175

Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser

180 185 190

Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu

195 200 205

Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln

210 215 220

Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly

225 230 235 240

Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro

245 250 255

His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr

260 265 270

Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His

275 280 285

Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro

290 295 300

Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala

305 310 315 320

Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met

325 330 335

<210> 17

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> T2A

<400> 17

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 18

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> P2A

<400> 18

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 19

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> P2A

<400> 19

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 20

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> E2A

<400> 20

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 21

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F2A

<400> 21

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 22

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<220>

<221> ПОВТОР

<222> (5)...(9)

<223> SGGGG повторен 5 раз

<400> 22

Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro

1 5 10

<210> 23

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 23

Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 24

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 24

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 25

<211> 735

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> scFv

<400> 25

gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60

atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120

gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180

cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240

gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300

ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360

ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420

cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480

tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540

accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600

agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660

gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720

gtgaccgtga gcagc 735

<210> 26

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирная область

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)...(1)

<223> Xaa1 представляет собой глицин, цистеин или аргинин

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)...(4)

<223> Xaa4 представляет собой цистеин или треонин

<400> 26

Xaa Pro Pro Xaa Pro

1 5

<210> 27

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирная область

<400> 27

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 28

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирная область

<400> 28

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 29

<211> 61

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирная область

<400> 29

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro

1 5 10 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

20 25 30

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro

35 40 45

Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

50 55 60

<210> 30

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирная область

<400> 30

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 31

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирная область

<400> 31

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 32

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирная область

<400> 32

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 33

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирная область

<400> 33

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 34

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирная область

<400> 34

Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR L1 FMC63

<400> 35

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 36

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR L2 FMC63

<400> 36

Ser Arg Leu His Ser Gly Val

1 5

<210> 37

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR L3 FMC63

<400> 37

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly

1 5

<210> 38

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR H1 FMC63

<400> 38

Asp Tyr Gly Val Ser

1 5

<210> 39

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR H2 FMC63

<400> 39

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 40

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR H3 FMC63

<400> 40

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

1 5

<210> 41

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH FMC63

<400> 41

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL FMC63

<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 43

<211> 245

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> scFv FMC63

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 44

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR L1 SJ25C1

<400> 44

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala

1 5 10

<210> 45

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR L2 SJ25C1

<400> 45

Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR L3 SJ25C1

<400> 46

Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 47

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR H1 SJ25C1

<400> 47

Ser Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 48

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR H2 SJ25C1

<400> 48

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 49

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR H3 SJ25C1

<400> 49

Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 50

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH SJ25C1

<400> 50

Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 51

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL SJ25C1

<400> 51

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 52

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 52

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 53

<211> 245

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> scFv SJ25C1

<400> 53

Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser

130 135 140

Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys

145 150 155 160

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn

180 185 190

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe

210 215 220

Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys Arg

245

<210> 54

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR H3 FMC63

<400> 54

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 55

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR L2 FMC63

<400> 55

His Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR L3 FMC63

<400> 56

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<---

1. Способ экспансии модифицированных способами инженерии клеток, включающий одно или оба из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии индивидууму, имеющему опухоль или злокачественную опухоль, причем указанному индивидууму ранее проводилось введение модифицированных способами генной инженерии клеток для лечения указанных опухоли или злокачественной опухоли за 12 месяцев или менее перед одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии, где указанные модифицированные способами инженерии клетки содержат T-клетки и указанные модифицированные способами инженерии клетки экспрессируют рекомбинантный рецептор.

2. Способ по п.1, где способ не включает последующее введение модифицированных способами генной инженерии клеток и/или экспансии достигают без последующего введения модифицированных способами генной инженерии клеток.

3. Способ по п.1 или 2, где в очаге повреждения или его части модифицированные способами инженерии клетки присутствуют, или вероятно будут присутствовать, или присутствовали, или вероятно присутствовали.

4. Способ по любому из пп.1-3, где очаг повреждения представляет собой опухоль.

5. Способ по п.4, где опухоль представляет собой первичную или вторичную опухоль.

6. Способ по любому из пп.1-5, где очаг повреждения представляет собой или содержит ткань костного мозга.

7. Способ по любому из пп.1, 2 и 4-6, где в момент или непосредственно перед моментом времени одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии у индивидуума возник рецидив после ответа на модифицированные способами генной инженерии клетки, необязательно после ремиссии, и/или он не отвечал на введение модифицированных способами генной инженерии клеток.

8. Способ по любому из пп.1-7, где у индивидуума возник рецидив после ответа и/или он не отвечал на предшествующее введение модифицированных способами генной инженерии клеток.

9. Способ по любому из пп.1-7, где индивидуум отвечал на модифицированные способами генной инженерии клетки, а затем прекратил отвечать и/или у него возник рецидив перед одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии.

10. Способ по любому из пп.1-9, где предварительно происходила экспансия модифицированных способами генной инженерии клеток у индивидуума или обнаружилось, что произошла их экспансия перед одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии.

11. Способ по любому из пп.1-10, где в момент или непосредственно перед моментом одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии:

индивидуум находится на стадии ремиссии;

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, поддающихся обнаружению в крови, уменьшается или не поддается обнаружению;

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых в жидкости, или ткани, или образце, необязательно в крови, индивидуума, уменьшается по сравнению с предшествующим моментом времени после введения модифицированных способами генной инженерии клеток; и/или

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых в жидкости, или ткани, или образце, необязательно в крови, индивидуума, уменьшается на или более чем в 1,5 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раз, 10 раз или более по сравнению с пиковым или максимальным количеством модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых или обнаруженных в крови индивидуума после начала введения модифицированных способами генной инженерии клеток и/или по сравнению с уровнем в момент времени в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, или 14, или 28 суток после введения модифицированных способами генной инженерии клеток.

12. Способ по любому из пп.1-11, где одно или оба из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии проводят через или более чем через 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 1 год или более после начала введения модифицированных способами генной инженерии клеток или после последней дозы модифицированных способами генной инженерии клеток.

13. Способ по любому из пп.1-12, где одно или оба из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии прямо или непрямо модулируют активность или функцию модифицированных способами инженерии T-клеток in vivo у индивидуума.

14. Способ по любому из пп.1-13, где указанный ингибитор иммунной точки контроля ингибирует или блокирует молекулу или каскад иммунной точки контроля, которые представляют собой или включают PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM3, VISTA, рецептор аденозина, CD73, CD39, рецептор аденозина 2A (A2AR) или аденозин.

15. Способ по любому из пп.1-14, где указанный ингибитор иммунной точки контроля выбран из группы, состоящей из BY55, даклизумаба, бевацизумаба, базиликсимаба, ипилимумаба, ниволумаба, пембролизумаба, MPDL3280A, пидилизумаба, MK-3475, BMS-936559, атезолизумаба, тремелимумаба, IMP321, BMS-986016, LAG525, урелумаба, PF-05082566, TRX518, MK-4166, дацетузумаба, лукатумумаба, SEA-CD40, CP-870, CP-893, MEDI6469, MEDI6383, MOXR0916, AMP-224, авелумаба, MEDI4736, PDR001, rHIgM12B7, улокуплумаба, BKT140, варлилумаба, ARGX-110, MGA271, лирилумаба, IPH2201, ARGX-115, эмактузумаба, CC-90002 и MNRP1685A или их антигенсвязывающего фрагмента.

16. Способ по любому из пп.1-15, где указанный ингибитор иммунной точки контроля представляет собой антитело против PD-L1.

17. Способ по п.16, где антитело против PD-L1 представляет собой MEDI14736, MDPL3280A, BMS-936559, LY3300054, атезолизумаб или авелумаб или представляет собой их антигенсвязывающий фрагмент.

18. Способ по любому из пп.8-17, где после рецидива и перед одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии индивидууму не вводили экзогенное или рекомбинантное средство для лечения заболевания или состояния или для модулирования активности модифицированных способами генной инженерии клеток.

19. Способ по любому из пп.1-18, где биопсию проводят с помощью иглы или троакара.

20. Способ по любому из пп.1-19, где биопсия включает инцизионную биопсию.

21. Способ по любому из пп.1-20, в котором способ приводит к экспансии модифицированных способами генной инженерии клеток или увеличению количества модифицированных способами генной инженерии клеток по сравнению с моментом времени непосредственно перед одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии.

22. Способ по любому из пп.1-21, где экспансия модифицированных способами генной инженерии клеток происходит в пределах 24 часов, 48 часов, 96 часов, 7 суток, 14 суток или 28 суток после одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии.

23. Способ по любому из пп.1-22, где:

экспансия обеспечивает более чем в 1,5 раза, 2,0 раза, 5,0 раз, 10 раз, 100 раз, 200 раз или более больше модифицированных способами инженерии клеток, поддающихся обнаружению в крови, по сравнению с моментом времени непосредственно перед одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии; или

экспансия обеспечивает более чем в 1,5 раза, 2,0 раза, 5,0 раз, 10 раз, 100 раз, 200 раз или более больше модифицированных способами инженерии клеток, поддающихся обнаружению в крови, по сравнению с предшествующими пиковыми уровнями модифицированных способами инженерии клеток в крови перед одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии.

24. Способ по любому из пп.1-23, где количество модифицированных способами генной инженерии клеток, поддающихся обнаружению в крови в момент времени после одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии:

возрастает, необязательно возрастает в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз или более, по сравнению с количеством модифицированных способами инженерии клеток в предшествующий момент времени перед одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии;

более чем в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз или более превышает пиковое или максимальное количество модифицированных способами инженерии клеток, поддающееся обнаружению в крови индивидуума до одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии;

более чем на 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% или 0,1% модифицированных способами инженерии клеток поддается обнаружению в крови в момент времени после обнаружения пика максимального уровня таких клеток в крови.

25. Способ по любому из пп.1-24, где рекомбинантный рецептор специфически связывается с антигеном, ассоциированным с опухолью или злокачественной опухолью или экспрессируемым в клетках очага повреждения или его части.

26. Способ по п.25, где антиген выбран из 5T4, 8H9, интегрина avb6, B7-H6, антигена созревания B-клеток (BCMA), CA9, антигена злокачественной опухоли-яичка, карбоангидразы 9 (CAIX), CCL-1, CD19, CD20, CD22, CEA, поверхностного антигена гепатита B, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, карциноэмбрионального антигена (CEA), CE7, циклина, циклина A2, c-Met, двойного антигена, EGFR, эпителиального гликопротеина 2 (EPG-2), эпителиального гликопротеина 40 (EPG-40), EPHa2, эфрина B2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, димеров erbB, EGFR vIII, рецептора эстрогена, Fetal AchR, рецептора фолатов альфа, фолат-связывающего белка (FBP), FCRL5, FCRH5, фетального рецептора ацетилхолина, G250/CAIX, GD2, GD3, gp100, Her2/neu (рецепторная тирозинкиназа erbB2), HMW-MAA, IL-22R-альфа, рецептора IL-13 альфа 2 (IL-13Ra2), рецептора домена киназной вставки (kdr), легкой цепи каппа, антигена Льюиса Y, молекулы адгезии L1-клеток (L1-CAM), меланома-ассоциированного антигена (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MART-1, мезотелина, CMV мыши, муцина 1 (MUC1), MUC16, NCAM, NKG2D, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, O-ацетилированного GD2 (OGD2), онкоэмбрионального антигена, предпочтительно экспрессируемого антигена меланомы (PRAME), PSCA, рецептора прогестерона, сурвивина, ROR1, TAG72, tEGFR, рецепторов VEGF, VEGF-R2, антигена опухоли Вильмса 1 (WT-1), патоген-специфического антигена.

27. Способ по любому из пп.1-26, где опухоль или злокачественная опухоль представляет собой лейкоз или лимфому.

28. Способ по любому из пп.1-27, где опухоль или злокачественная опухоль представляет собой B-клеточную злокачественную опухоль.

29. Способ по любому из пп.1-28, где опухоль или злокачественная опухоль представляет собой лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфобластный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (CML), неходжкинскую лимфому (NHL) или диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL) или подтип любого из вышеуказанных.

30. Способ по любому из пп.1-29, где рекомбинантный рецептор представляет собой T-клеточный рецептор или функциональный не T-клеточный рецептор.

31. Способ по любому из пп.1-30, где рекомбинантный рецептор представляет собой химерный рецептор антигена (CAR).

32. Способ по п.31, где CAR содержит внеклеточный антиген-распознающий домен, который специфически связывается с антигеном, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий ITAM.

33. Способ по любому из пп.25-32, где антиген представляет собой CD19.

34. Способ по п.32 или 33, где внутриклеточный сигнальный домен включает внутриклеточный домен цепи CD3-зета (CD3ζ).

35. Способ по любому из пп.31-34, где CAR дополнительно содержит костимулирующую сигнальную область.

36. Способ по п.35, где костимулирующий сигнальный домен включает сигнальный домен CD28 или 4-1BB.

37. Способ по любому из пп.1-36, где T-клетки представляют собой CD4+ или CD8+ T-клетки.

38. Способ по любому из пп.1-37, где клетки, используемые для терапии модифицированными способами инженерии T-клетками, включают первичные клетки, полученные от индивидуума.

39. Способ по любому из пп.1-38, где клетки модифицированных способами генной инженерии клеток являются аутологичными для индивидуума.

40. Способ по любому из пп.1-38, где клетки модифицированных способами генной инженерии клеток являются аллогенными для индивидуума.

41. Способ по любому из пп.1-40, где индивидуумом является человек.

42. Способ по любому из пп.1-41, где доза модифицированных способами генной инженерии клеток, которую ранее вводили, включает дозу от 1×10⁵ до 5×10⁸ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), от 1×10⁵ до 1×10⁸ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), от 5×10⁵ до 1×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) или от 1×10⁶ до 1×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), в каждом случае включительно.

43. Способ по любому из пп.1-42, где доза модифицированных способами генной инженерии клеток, которую вводили ранее, составляет не более 5×10⁸ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), не более 1×10⁸ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), не более 1×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), не более 0,5×10⁷ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), не более 1×10⁶ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), не более 0,5×10⁶ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, всех T-клеток или всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC).

44. Способ по любому из пп.1-43, где доза модифицированных способами генной инженерии клеток, которую вводили ранее, включает дозу от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от 0,5×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 3×10⁶ клеток/кг, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/кг до 2,5×10⁶ клеток/кг или от приблизительно 1×10⁶ клеток/кг до 2×10⁶ клеток/кг, в каждом случае включительно.

45. Способ по любому из пп.1-44, где дозу модифицированных способами генной инженерии клеток вводят в одной фармацевтической композиции, содержащей клетки, или в качестве нескольких композиций вместе, содержащих клетки.

46. Способ по любому из пп.1-45, где вводимые модифицированные способами инженерии клетки представляют собой разделенную дозу, где клетки дозы вводят в нескольких композициях, в совокупности содержащих клетки дозы, на протяжении периода времени, составляющего не более трех суток.

47. Способ по любому из пп.1-46, где способ включает обеспечение последующих одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии, необязательно где последующие одно или оба из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии осуществляются после рецидива у индивидуума после ответа после предшествующих одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии и/или после того, как он не достиг полного ответа после предшествующих одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии.

48. Способ по п.47, где индивидуум отвечал на модифицированные способами генной инженерии клетки после предшествующих одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии, а затем прекратил отвечать и/или имел рецидив перед последующими одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии.

49. Способ по п.47 или 48, где произошла экспансия модифицированных способами генной инженерии клеток у индивидуума или обнаружено, что произошла экспансия, после предшествующих одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии или перед последующими одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии.

50. Способ по любому из пп.47-49, где в момент или непосредственно перед последующими одним или обоими из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии:

индивидуум находится в фазе ремиссии;

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемое в крови, уменьшается или не поддается обнаружению;

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемое в жидкости, или ткани, или образце, необязательно в крови, индивидуума, уменьшается по сравнению с предшествующим моментом времени после начала предшествующих одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии; и/или

количество модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемое в жидкости, или ткани, или образце, необязательно в крови, от индивидуума, уменьшается в или более чем в 1,5 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раз, 10 раз или более по сравнению с пиковым или максимальным количеством модифицированных способами генной инженерии клеток, обнаруживаемых или обнаруженных в крови индивидуума после начала предшествующих одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии и/или по сравнению с уровнем в момент времени в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, или 14, или 28 суток после начала предшествующих одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии.

51. Способ по любому из пп.1-50, где модифицированные способами генной инженерии клетки демонстрируют увеличенную или пролонгированную экспансию и/или персистенцию у индивидуума по сравнению со способом, в котором модифицированные способами генной инженерии клетки вводят индивидууму в отсутствие одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии.

52. Способ по любому из пп.1-51, где способ уменьшает опухолевую нагрузку в большей степени и/или в течение более длительного периода времени по сравнению со снижением, которое наблюдалось бы в случае сравнимого способа, в котором модифицированные способами генной инженерии клетки вводят индивидууму в отсутствие одного или обоих из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии и/или в котором одно или оба из введения ингибитора иммунной точки контроля и биопсии проводят в отсутствие модифицированных способами генной инженерии клеток, необязательно с той же дозой или по той же схеме дозирования.