Композиции и способы лечения ассоциированного с cep290 заболевания

Изобретение относится к биотехнологии. Описано применение аденоассоциированного вируса 5 (AAV5) вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую Cas9, первую гидовую RNA (гРНК) и вторую гРНК. Причем каждая гРНК нацелена на ген CEP290, в концентрации от 1×10¹¹ вирусных геномов (вг)/мл до 9×10¹³ вг/мл для лечения ассоциированного с CEP290 заболевания. Также описано применение вектора AAV5, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую Cas9, первую гРНК и вторую гРНК, причем каждая из первой и второй гРНК содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-8, или последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную указанным последовательностям, причем (a) применение включает приведение в контакт одного или более рекомбинантных вирусных векторов с сетчаткой субъекта, и причем (b) первая гРНК способна образовывать первый рибонуклеопротеиновый комплекс с Cas9, и (c) первый рибонуклеопротеиновый комплекс способен расщеплять первую последовательность клеточной нуклеиновой кислоты, ассоциированную с наследственной дистрофией сетчатки, тем самым изменяя первую последовательность клеточной нуклеиновой кислоты, и (d) второй рибонуклеопротеиновый комплекс способен расщеплять вторую последовательность клеточной нуклеиновой кислоты, ассоциированную с наследственной дистрофией сетчатки, тем самым изменяя вторую последовательность нуклеиновой кислоты, в концентрации от 1×10¹¹ вг/мл до 9×10¹³ вг/мл, для изменения последовательности клеточной нуклеиновой кислоты, ассоциированной с наследственной дистрофией сетчатки. Кроме того, представлено применение вектора AAV5, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую Cas9, первую гРНК и вторую гРНК, причем первая гРНК содержит нацеливающий домен, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, и вторая гРНК содержит нацеливающий домен, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4-6, в концентрации от 1×10¹¹ вг/мл до 9×10¹³ вг/мл для изменения клетки сетчатки субъекта. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения дистрофии сетчатки. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 9 ил., 12 табл., 5 пр.

 

Ссылка на родственные заявки

[1] Согласно настоящей заявке испрашивается преимущество в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/370202, поданной 2 августа 2016 года; предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/400526, поданной 27 сентября 2016 года; предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/443568, поданной 6 января 2017 года; предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/503800, поданной 9 мая 2017 года; и предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/535193, поданной 20 июля 2017 года; содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Перечень последовательностей

[2] Настоящее раскрытие включает в себя перечень последовательностей, который подан в формате ASCII посредством EFS-Web и тем самым полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Копия ASCII, созданная 2 августа 2017 года, имеет название SequenceListing.txt и размер, составляющий 47,4 КВ.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

[3] Настоящее раскрытие относится к связанным с CRISPR/CAS способам и компонентам для редактирования целевой последовательности нуклеиновой кислоты и их применениям в отношении ассоциированного с CEP290 заболевания.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

[4] CEP290 представляет собой белок массой 290 кДа, кодируемый геном, составляющим 90 т.п.н. в длину, который, как полагают, участвует в нормальном функционировании глаза и почки. В клетках белок CEP290 связывается с центросомой и белками клеточного каркаса и участвует в различных клеточных процессах, включая в себя деление клеток, реакцию на повреждение ДНК и цилиогенез. Мутации CEP290 наблюдаются при некоторых заболеваниях, включая в себя синдром Сениора-Локена, синдром Меккеля-Грубера, синдром Барде-Бидля, синдром Жубера и врожденный амавроз Лебера 10 типа (LCA10).

[5] LCA10 представляет собой наследственное дегенеративное заболевание сетчатки, характеризующееся тяжелым нарушением зрения или слепотой при рождении. Заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу и вызвано мутацией C.2991+1655A> G (мутация "IVS26") в гене CEP290. IVS26 представляет собой мутацию с потерей функции, при которой в интроне 26 гена CEP290 образуется скрытый сайт донора сплайсинга, что приводит к преждевременно процессированным транскриптам иРНК CEP290, которые включают в себя аберрантный экзон 128 п.н. Считается, что последующая потеря функции CEP290 нарушает функцию сенсорных ресничек в фоторецепторных клетках, что приводит к заболеванию.

[6] В настоящее время отсутствуют одобренные виды лечения LCA10. Стратегии генной терапии для лечения ассоциированного с CEP290 заболевания усложняются размером белка и сложностью упаковки больших последовательностей в используемые в настоящее время векторы для генной терапии, и для этого заболевания не были одобрены виды терапии с использованием малых молекул. Для решения проблемы отсутствия вариантов лечения для LCA10 авторы настоящего изобретения разработали стратегию для исправления мутации IVS26 в клетках с использованием редактирования генома CRISPR/Cas9 и показали делецию мутации в до 60% клеток HEK293 in vitro. См. международную патентную публикацию № WO 2015/138510 Maeder с соавт. ("Maeder"), которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

[7] Авторы настоящего изобретения устраняют ключевую неудовлетворенную потребность в настоящей области техники путем получения новых и эффективных средств доставки систем редактирования генома в пораженные ткани субъектов, страдающих от ассоциированных с CEP290 заболеваний и других наследственных дистрофий сетчатки. Настоящее раскрытие относится к нуклеиновым кислотам и векторам для эффективной трансдукции систем редактирования генома в клетки сетчатки и клетки в других тканях, а также способам применения указанных векторов для лечения субъектов. Указанные нуклеиновые кислоты, векторы и способы представляют собой важный шаг вперед в разработке способов лечения заболеваний, ассоциированных с CEP290.

[8] Согласно одному аспекту настоящее раскрытие относится к способу лечения или изменения клетки у субъекта (например, субъекта-человека или субъекта-животного), который предусматривает введение субъекту нуклеиновой кислоты, кодирующей Cas9 и первую и вторую гидовые РНК (гРНК), нацеленные на ген CEP290 субъекта. Согласно определенным вариантам осуществления первая и вторая гРНК нацелены на одну или несколько целевых последовательностей, которые охватывают или находятся в непосредственной близости к целевому положению CEP290. Первая гРНК может включать в себя нацеливающий домен, выбранный из SEQ ID NO: 1-3 (что соответствует последовательностям РНК в SEQ ID NO: 26-28, соответственно), при этом нацеливающий домен второй гРНК можно выбрать из SEQ ID NO: 4-6 (что соответствует последовательностям РНК в SEQ ID NO: 29-31, соответственно). Cas9, который может представлять собой модифицированный Cas9 (например, Cas9, сконструированный для изменения специфичности PAM, улучшения точности или для изменения или улучшения другого структурного или функционального аспекта Cas9), может включать в себя один или несколько сигналов ядерной локализации (NLS) и/или сигнал полиаденилирования. Определенные варианты осуществления характеризуются Cas9, которые включают в себя как C-концевой, так и N-концевой NLS. Согласно определенным вариантам осуществления Cas9 кодируется SEQ ID NO:10, и его экспрессия необязательно управляется одним из следующего: промотор CMV, EFS или hGRK1, как представлено в SEQ ID NO: 13-15, соответственно. Нуклеиновая кислота также включает в себя в различных случаях первую и вторую последовательности инвертированного концевого повтора (ITR).

[9] Продолжая настоящий аспект раскрытия, нуклеиновую кислоту, содержащую любые или все признаки, описанные выше, можно вводить субъекту в виде аденоассоциированного вирусного (AAV) вектора, такого как вектор AAV5. Вектор можно доставить к сетчатке субъекта (например, путем субретинальной инъекции). Различные варианты осуществления способа можно использовать при лечении субъектов-людей. Например, способы можно использовать для лечения субъектов, страдающих от заболевания, ассоциированного с CEP290, такого как LCA10, для восстановления функции CEP290 у субъекта, нуждающегося в этом, и/или для изменения клетки у субъекта, такой как клетка сетчатки и/или фоторецепторная клетка.

[10] Согласно другому аспекту, настоящее раскрытие относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей Cas9, первую гРНК с нацеливающим доменом, выбранным из SEQ ID NO: 1-3 (что соответствует последовательностям РНК в SEQ ID NO: 26-28, соответственно), и вторую гРНК с нацеливающим доменом, выбранным из SEQ ID NO: 4-6 (что соответствует последовательностям РНК в SEQ ID NO: 29-31, соответственно). Нуклеиновая кислота согласно различным вариантам осуществления может включать в себя любой или все признаки, описанные выше (например, NLS и/или сигнал полиаденилирования; промотор CMV, EFS или hGRK1; и/или ITR). Нуклеиновая кислота может представлять собой часть вектора AAV, причем вектор можно использовать в медицине, например, для лечения ассоциированного с CEP290 заболевания, такого как LCA10, и/или можно использовать для редактирования конкретных клеток, включая в себя клетки сетчатки, например, фоторецепторные клетки сетчатки. Нуклеиновую кислоту также можно использовать для получения лекарственного средства.

[11] Согласно еще одному аспекту настоящее раскрытие относится к способу лечения субъекта, который предусматривает стадию приведения в контакт сетчатки субъекта с одной или несколькими рекомбинантными вирусными векторами (например, векторами AAV), которые кодируют Cas9 и первую и вторую гРНК. Первая и вторая гРНК способны образовывать первый и второй рибонуклеопротеиновые комплексы с Cas9, и первый и второй комплексы в свою очередь способны расщеплять первую и вторую целевые последовательности, соответственно, с обеих сторон целевого положения CEP290, в соответствии с тем, как этот термин определен ниже. Это расщепление приводит к изменению последовательности нуклеиновой кислоты целевого положения CEP290. Согласно некоторым вариантам осуществления стадия приведения в контакт сетчатки с одним или несколькими рекомбинантными вирусными векторами предусматривает введение в сетчатку субъекта с помощью субретинальной инъекции композиции, содержащей один или несколько рекомбинантных вирусных векторов. Изменение последовательности нуклеиновой кислоты целевого положения CEP290 может включать в себя образование индела, делецию части или всего целевого положения CEP290 и/или инверсию нуклеотидной последовательности в целевом положении CEP290. Согласно определенным вариантам осуществления субъект представляет собой примата.

[12] Системы редактирования генома, композиции и способы согласно настоящему раскрытию могут поддерживать высокие уровни продуктивного редактирования в клетках сетчатки, например, в фоторецепторных клетках. Согласно определенным вариантам осуществления 10%, 15%, 20% или 25% клеток сетчатки в образцах, модифицированных в соответствии со способами согласно настоящему раскрытию (например, в образцах сетчатки, которые привели в контакт с системой редактирования генома согласно настоящему раскрытию), содержат продуктивное изменение аллеля гена CEP290. Продуктивное изменение может включать в себя, различным образом, делецию и/или инверсию последовательности, содержащей мутацию IVS26, или другую модификацию, которая приводит к увеличению экспрессии функционального белка CEP290 в клетке. Согласно определенным вариантам осуществления 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или больше чем 50% фоторецепторных клеток в образцах сетчатки, модифицированных в соответствии со способами согласно настоящему раскрытию (например, в образцах сетчатки, которые привели в контакт с системой редактирования генома согласно настоящему раскрытию), содержат продуктивное изменение аллеля гена CEP290.

[13] Согласно другому аспекту настоящее раскрытие относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей Cas9 и первую и вторую гРНК, нацеленные на ген CEP290 субъекта для применения в терапии, например, в лечении ассоциированного с CEP290 заболевания. Согласно некоторым вариантам осуществления ассоциированное с CEP290 заболевание может представлять собой LCA10 и согласно другим вариантам осуществления его можно выбрать из группы, состоящей из следующего: синдром Сениора-Локена, синдром Меккеля-Грубера, синдром Барде-Бидля и синдром Жубера. Нацеливающие домены первой и второй гРНК могут содержать последовательности согласно SEQ ID NO: 1-3 и NO: 4-6, соответственно, и согласно определенным вариантам осуществления нацеливающие домены первой и второй гРНК содержат SEQ ID NO: 1 и 4. Согласно другим вариантам осуществления нацеливающие домены первой и второй гРНК содержат последовательности согласно SEQ ID NO: 1 и 5, SEQ ID NO: 1 и 6, SEQ ID NO: 2 и 4, SEQ ID NO 3 и 4 или SEQ ID NO: 3 и 5. Согласно другим вариантам осуществления первый и второй нацеливающие домены содержат последовательности согласно SEQ ID NO: 2 и 5, SEQ ID NO: 2 и 6 или SEQ ID NO: 3 и 6. гРНК согласно этому аспекту настоящего раскрытия могут являться мономолекулярными и могут содержать последовательности РНК согласно SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8. Альтернативно гРНК могут представлять собой двухкомпонентные модульные гРНК согласно любой последовательности, где компонент crРНК содержит часть SEQ ID NO: 7 или 8, которая является подчеркнутой, и компонент tracrРНК содержит часть, которая подчеркнута дважды.

[14] Продолжая этот аспект настоящего раскрытия Cas9, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно определенным вариантам осуществления представляет собой Cas9, Staphylococcus aureus, который может кодироваться последовательностью, содержащей SEQ ID NO:10 или характеризующейся по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательностей по отношению к ней. Cas9, кодируемый нуклеиновой кислотой, может содержать аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO:11 или может характеризоваться по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательностей по отношению к ней. Cas9 можно модифицировать в некоторых случаях, например, чтобы он включал в себя один или несколько сигналов ядерной локализации (NLS) (например, C-концевой и N-концевой NLS) и/или сигнал полиаденилирования. Экспрессия Cas9 может управляться промоторной последовательностью, такой как промоторная последовательность, содержащая SEQ ID NO:13, промоторная последовательность, содержащая SEQ ID NO:14, или промоторная последовательность, содержащая SEQ ID NO:15.

[15] Продолжая этот аспект настоящего раскрытия промоторная последовательность для управления экспрессией Cas9 согласно определенным вариантам осуществления содержит последовательность промотора GRK1 человека. Согласно другим вариантам осуществления промотор содержит последовательность промотора цитомегаловируса (CMV) или промотора EFS. Например, согласно различным вариантам осуществления нуклеиновая кислота может содержать: a) промотор CMV для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 5 (или отличаются не больше чем на 3 нуклеотида от указанного), или b) CMV промотор для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 6, или c) промотор CMV для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 4, или d) промотор CMV для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 4, или e) промотор CMV для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 5, или f) промотор EFS для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 5, или g) промотор EFS для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 6, или h) промотор EFS для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 4, или i) промотор EFS для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 4, или j) промотор EFS для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 5, или k) промотор hGRK1 для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 5, или g) промотор hGRK1 для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 6, или h) промотор hGRK1 для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 4, или i) промотор hGRK1 для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 4, или j) промотор hGRK1 для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 5. Согласно другим вариантам осуществления нуклеиновая кислота содержит промотор CMV и нацеливающие последовательности гидовой РНК согласно SEQ ID NO: 1 и 4. Согласно другим вариантам осуществления нуклеиновая кислота содержит промотор hGRK и нацеливающие последовательности гидовой РНК согласно SEQ ID NO: 2 и 5, или она содержит промотор CMV и нацеливающие последовательности гидовой РНК согласно SEQ ID NO: 2 и 5, или промотор hGRK и нацеливающие последовательности гидовой РНК согласно SEQ ID NO: 2 и 6, или она содержит промотор CMV и нацеливающие последовательности гидовой РНК согласно SEQ ID NO: 3 и 6, или промотор hGRK и нацеливающие последовательности гидовой РНК согласно SEQ ID NO: 3 и 6, или она содержит промотор CMV и нацеливающие последовательности гидовой РНК согласно SEQ ID NO: 2 и 5. И согласно дополнительным вариантам осуществления промотор представляет собой hGRK или CMV, при этом нацеливающие домены первой и второй гРНК содержат последовательности согласно SEQ ID NO: 1 и 5, SEQ ID NO: 1 и 6, SEQ ID NO: 2 и 4, SEQ ID NO 3 и 4 или SEQ ID NO: 3 и 5.

[16] Согласно другому аспекту настоящее раскрытие относится к аденоассоциированным вирусным (AAV) векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, описанные выше. Векторы AAV, содержащие вышеупомянутые нуклеиновые кислоты, можно вводить в различные ткани субъекта, хотя согласно определенным вариантам осуществления векторы AAV вводят в сетчатку субъекта и/или вводят с помощью субретинальной инъекции. Вектор AAV может содержать капсид AAV5.

[17] Дополнительный аспект настоящего раскрытия относится к нуклеиновой кислоте, описанной выше, для доставки посредством вектора AAV, также описанного выше. Согласно некоторым вариантам осуществления нуклеиновая кислота включает в себя первую и вторую последовательности инвертированного концевого повтора (ITR), первую гидовую РНК, содержащую последовательность нацеливающего домена, выбранную из SEQ ID NO: 1-3, вторую гидовую РНК, содержащую последовательность нацеливающего домена, выбранную из SEQ ID NO: 4-6, и промотор для управления экспрессией Cas9, содержащий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13-15. Согласно определенным вариантам осуществления нуклеиновая кислота включает в себя первый и второй ITR и первую и вторую гидовые РНК, содержащие последовательность гидовой РНК, выбранную из SEQ ID NO: 7 и 8 (например, как первая, так и вторая гидовые РНК содержат последовательность согласно SEQ ID NO:8). Нуклеиновую кислоту можно использовать в лечении субъектов-людей и/или в получении лекарственного средства.

[18] Нуклеиновые кислоты и векторы согласно указанным аспектам настоящего раскрытия можно использовать в медицине, например, в лечении заболевания. Согласно некоторым вариантам осуществления их используют в лечении ассоциированного с CEP290 заболевания, в лечении LCA10 или в лечении одного или нескольких из следующего: синдром Сениора-Локена, синдром Меккеля-Грубера, синдром Барде-Бидля и/или синдром Жубера. Векторы и нуклеиновые кислоты согласно настоящему раскрытию можно вводить в сетчатку субъекта, например, с помощью субретинальной инъекции.

[19] Настоящее раскрытие также относится к рекомбинантным вирусным векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, описанные выше, и к применению таких вирусных векторов в лечении заболевания. Согласно некоторым вариантам осуществления один или несколько вирусных векторов кодируют Cas9, первую гРНК и вторую гРНК для применения в способе изменения нуклеотидной последовательности целевого положения CEP290, причем (a) первая и вторая гРНК способны образовывать первый и второй рибонуклеопротеиновые комплексы с Cas9, и (b) первый и второй рибонуклеопротеиновые комплексы способны расщеплять первую и вторую последовательности клеточной нуклеиновой кислоты на первой и второй сторонах целевого положения CEP290, тем самым изменяя нуклеотидную последовательность целевого положения CEP290. При применении один или несколько рекомбинантных вирусных векторов приводят в контакт с сетчаткой субъекта, например, с помощью субретинальной инъекции.

[20] Другой аспект согласно настоящему раскрытию относится к векторам AAV, геномам векторов AAV и/или нуклеиновым кислотам, которые можно перенести с помощью векторов AAV, которые кодируют одну или несколько гидовых РНК, каждая из которых содержит последовательность, выбранную из одной из SEQ ID NO: 7 или 8 или характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к ней (что соответствует последовательностям РНК в SEQ ID NO: 32 и 33, соответственно), последовательность, кодирующую Cas9, и промоторную последовательность, функционально связанную с кодирующей Cas9 последовательностью, причем промоторная последовательность содержит последовательность, выбранную из одной из SEQ ID NO: 13-15 или характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к ней. Кодирующая Cas9 последовательность может содержать последовательность согласно SEQ ID NO: 10 или может характеризоваться по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к ней. Альтернативно или дополнительно кодирующая Cas9 последовательность может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 11 или характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к ней. Согласно определенным вариантам осуществления вектор AAV, геном вектора или нуклеиновая кислота дополнительно содержит одно или несколько из следующего: левая и правая последовательности ITR, необязательно выбранные из SEQ ID NO: 16 и 17, соответственно, или характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к ним; и одна или несколько последовательностей промотора U6, функционально связанных с одной или несколькими последовательностями гидовой РНК. Последовательности промотора U6 могут содержать или характеризоваться по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к SEQ ID NO:9.

[21] Подразумевается, что этот перечень является примерным и иллюстративным, а не всеобъемлющим и ограничивающим. Дополнительные аспекты и варианты осуществления могут быть изложены или могут являться очевидными из остальной части настоящего раскрытия и формулы изобретения.

Описание графических материалов

[22] Прилагаемые графические материалы иллюстрируют определенные аспекты и варианты осуществления настоящего раскрытия. Изображения на графических материалах предназначены для предоставления иллюстративных и схематичных, а не исчерпывающих примеров определенных аспектов и вариантов осуществления настоящего раскрытия. Графические материалы не предназначены для ограничения или привязки к какой-либо конкретной теории или модели и не обязательно выполнены в масштабе. Не ограничивая вышесказанное, нуклеиновые кислоты и полипептиды могут быть изображены в виде линейных последовательностей или в виде схематических двух- или трехмерных структур; указанные изображения предназначены для иллюстрации, а не для ограничения или привязки к какой-либо конкретной модели или теории относительно их структуры.

[23] На фигурах 1 A-C показаны схематические изображения иллюстративного вирусного генома AAV в соответствии с определенными вариантами осуществления согласно настоящему раскрытию. На фиг. 1A показан геном AAV для применения в изменении целевого положения CEP290, который кодирует, среди прочего, две гидовые РНК, характеризующиеся специфическими нацеливающими доменами, выбранными из SEQ ID NO: 1-3 и 4-6, и Cas9 S. aureus. На фиг. 1B показан геном AAV, который можно использовать для разнообразных применений, включая в себя без ограничения изменение целевого положения CEP290, кодирующий две гидовые РНК, содержащие последовательности согласно SEQ ID NO: 7 и/или 8, и Cas9 S. aureus. На фиг. 1C показан геном AAV, кодирующий одну или две гидовые РНК, каждая из которых управляется промотором U6, и Cas9 S. aureus. На фигуре N может представлять собой 1 или 2.

[24] На фиг. 2 проиллюстрирована стратегия редактирования генома, осуществленная согласно определенным вариантам осуществления настоящего раскрытия.

[25] На фиг. 3 схематически изображена гРНК, используемая согласно определенным вариантам осуществления настоящего раскрытия.

[26] На фиг. 4A показана микрофотография эксплантата сетчатки мыши на матрице-подложке; ткань сетчатки указана стрелкой. На фиг. 4B показана флуоресцентная микрофотография гистологического среза эксплантата сетчатки мыши, иллюстрирующая трансдукцию клеток с использованием AAV в нескольких слоях сетчатки с помощью репортера GFP. На фиг. 4C показана микрофотография гистологического среза ткани сетчатки примата, обработанной несущей средой. На фиг. 4D показана микрофотография гистологического среза ткани сетчатки примата, обработанной с помощью вектора AAV5, кодирующего Cas9 S. aureus, функционально связанный со специфическим для фоторецептора промотором hGRK1. Темное окрашивание во внешнем ядерном слое (ONL) указывает на то, что клетки были успешно трансдуцированы с помощью AAV и экспрессировали Cas9.

[27] На фиг. 5A и фиг. 5B показана экспрессия иРНК Cas9 и гРНК, соответственно, нормализованная к экспрессии иРНК GAPDH. UT обозначает не обработанные; GRK1-Cas относится к вектору, в котором экспрессия Cas9 управляется специфическим в отношении фоторецептора промотором hGRK1; dCMV-Cas и EFS-Cas аналогично относятся к векторам, в которых экспрессия Cas9 управляется промотором dCMV или промотора EFS. Условия, при которых гРНК включены в вектор, обозначены столбцом с надписью "с гРНК". Светлые и темные столбцы изображают отдельные экспериментальные повторности.

[28] На фиг. 6 обобщенно представлены редакционные изменения, наблюдаемые в эксплантатах сетчатки мыши через 7 дней после трансдукции с помощью AAV5-mCEPgRNA-Cas9. Редакционные изменения объединены в одну из трех категорий: отсутствие редактирования, индел на одном из двух гидовых сайтов и делеция последовательности между гидовыми сайтами. На каждой гистограмме изображены наблюдаемые редакционные изменения в процентах от прочтений последовательности от отдельных эксплантатов, трансдуцированных с помощью векторов AAV, в которых Cas9 управлялся приведенным в перечне промотором (hGRK1, CMV или EFS).

[29] На фиг. 7 обобщенно представлены редакционные изменения, наблюдаемые в гене CEP290 в полученных с помощью пункционной биопсии образцах сетчатки, полученных от яванских макак, получивших лечение с помощью векторов AAV, кодирующих системы редактирования генома согласно настоящему раскрытию.

[30] На фиг. 8A изображен репортерный конструкт, который использовали для оценки эффекта определенных результатов редактирования, включая в себя инверсии и делеции, на дефект сплайсинга IVS26. На фиг. 8B показаны относительные уровни экспрессии репортера GFP в условиях WT, IVS26, делеции и инверсии, нормализованные к экспрессии mCherry.

[31] На фиг. 9 обобщенно представлены продуктивные редакционные изменения CEP290, наблюдаемые в эксплантатах сетчатки человека через 14 или 28 дней после трансдукции векторами AAV, в которых Cas9 управлялся приведенным в перечне промотором (hGRK1 или CMV).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Определения и сокращения

[32] Если не указано иное, каждый из следующих терминов имеет значение, изложенное в настоящем разделе.

[33] Имя существительное в единственном числе означает по меньшей мере одно из указанного имени существительного и его используют взаимозаменяемо с терминами "по меньшей мере один" и "один или несколько". Например, фраза "модуль" означает по меньшей мере один модуль или один или несколько модулей.

[34] Союзы "или" и "и/или" используют взаимозаменяемо.

[35] "Домен" используют для описания сегмента белка или нуклеиновой кислоты. Если не указано иное, домен не обязательно должен характеризоваться каким-либо конкретным функциональным свойством.

[36] "Индел" представляет собой вставку и/или делецию в последовательности нуклеиновой кислоты. Индел может быть продуктом репарации двухцепочечного разрыва ДНК, такого как двухцепочечный разрыв, образованный системой редактирования генома согласно настоящему раскрытию. Индел чаще всего формируется, когда разрыв репарируется с помощью "допускающего ошибки" пути восстановления, такого как путь NHEJ, описанный ниже. Инделы, как правило, оценивают с помощью секвенирования (чаще всего с помощью способов "нового поколения" или "секвенирования путем синтеза", хотя секвенирование Сэнгера все еще можно использовать) и количественно определяют по относительной частоте числовых изменений (например, ±1, ±2 или более оснований) на представляющем интерес сайте среди всех прочтений секвенирования. Образцы ДНК для секвенирования можно получить различными способами, известными в настоящей области техники, и могут включать в себя амплификацию сайтов, представляющих интерес, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или захвата концов ДНК, генерируемых двухцепочечными разрывами, как в процессе GUIDEseq, описанного в Tsai 2016 (включено в настоящее описание посредством ссылки). Другие способы получения образцов известны в настоящей области техники. Инделы также можно оценивать другими способами, включая в себя способы гибридизации in situ, такие как система FiberComb™, производимая Genomic Vision (Bagneux, France), и другие способы, известные в настоящей области техники.

[37] "Целевое положение CEP290" и "целевой сайт CEP290" используют взаимозаменяемо в настоящем документе для обозначения нуклеотида или нуклеотидов в пределах или в непосредственной близости от гена CEP290, которые подвергают нацеленному воздействию для изменения с использованием способов, описанных в настоящем документе. Согласно определенным вариантам осуществления мутация на одном или нескольких указанных нуклеотидах ассоциирована с заболеванием, ассоциированным с CEP290. Термины "целевое положение CEP290" и "целевой сайт CEP290" также используют в настоящем документе для обозначения указанных мутаций. Например, мутация IVS26 представляет собой один неограничивающий вариант осуществления целевого положения/целевого сайта CEP290.

[38] Используемый в настоящем документе термин "негомологичное соединение концов" или "NHEJ" относится к опосредованной лигированием репарации и/или не опосредованной матрицей репарации, включая в себя каноническое NHEJ (cNHEJ), альтернативное NHEJ (altNHEJ), опосредованное микрогомологией соединение концов (MMEJ) и зависимое от синтеза опосредованное микрогомологией соединение концов (SD-MMEJ).

[39] "Замещение" или "замещенный", используемые в настоящем документе со ссылкой на модификацию молекулы, не требует ограничения процесса, а просто указывает, что присутствует замещающая частица.

[40] "Субъект" означает человека, мышь или не являющегося человеком примата. Субъект-человек может быть любого возраста (например, новорожденный, ребенок, молодой человек или взрослый) и может страдать от заболевания или может нуждаться в изменении гена.

[41] Используемые в настоящем документе термины "лечить", "осуществление лечения" и "лечение" означают лечение заболевания у субъекта (например, субъекта-человека), включая в себя одно или несколько из следующего: ингибирование заболевания, т.е. прекращение или предотвращение его развития или прогрессирования; облегчение заболевания, т.е. регрессирование болезненного состояния; облегчение одного или нескольких симптомов заболевания; и излечение заболевания.

[42] Используемые в настоящем документе термины "предотвращать", "предотвращение" и "профилактика" означает профилактику заболевания у субъекта, например, у человека, включая в себя (a) недопущение или препятствование заболеванию; (b) воздействие на предрасположенность к заболеванию; (c) предотвращение или отсрочка появления по меньшей мере одного симптома заболевания.

[43] Термины "полинуклеотид", "нуклеотидная последовательность", "нуклеиновая кислота", "молекула нуклеиновой кислоты", "последовательность нуклеиновой кислоты" и "олигонуклеотид" относятся к последовательности нуклеотидных оснований (также называемых "нуклеотиды") в ДНК и РНК и означают любую цепь из двух или больше нуклеотидов. Полинуклеотиды могут представлять собой химерные смеси или производные или их модифицированные версии, одноцепочечные или двухцепочечные. Олигонуклеотид можно модифицировать в фрагменте основания, фрагменте сахара или фосфатном остове, например, для улучшения стабильности молекулы, ее параметров гибридизации и т.д. Нуклеотидная последовательность, как правило, несет генетическую информацию, включая в себя информацию, используемую клеточным механизмом для создания белков и ферментов. Указанные термины включают в себя двухцепочечную или одноцепочечную геномную ДНК, РНК, любой синтетический и генетически измененный полинуклеотид, а также смысловые и антисмысловые полинуклеотиды. Термины также включают в себя нуклеиновые кислоты, содержащие модифицированные основания.

[44] Обычное обозначение согласно IUPAC используют в нуклеотидных последовательностях, представленных в настоящем документе, как показано в приведенной ниже таблице 1 (см. также Cornish-Bowden 1985, включенную в настоящий документ посредством ссылки). Однако следует отметить, что "T" обозначает "тимин или урацил", поскольку данная последовательность (такая как последовательность гРНК) может кодироваться либо ДНК, либо РНК.

Таблица 1. Обозначение нуклеиновых кислот согласно IUPAC

Символ	Основание
A	Аденин
T	Тимин
G	Гуанин
C	Цитозин
U	Урацил
K	G или T/U
M	A или C
R	A или G
Y	C или T/U
S	C или G
W	A или T/U
B	C, G или T/U
V	A, C или G
H	A, C или T/U
D	A, G или T/U
N	A, C, G или T/U

[45] Термины "белок", "пептид" и "полипептид" используют взаимозаменяемо для обозначения последовательной цепи аминокислот, связанных друг с другом посредством пептидных связей. Термины включают в себя отдельные белки, группы или комплексы белков, которые ассоциированы вместе, а также фрагменты, варианты, производные и аналоги таких белков. Пептидные последовательности представлены с использованием общепринятых обозначений, начиная с амино- или N-конца слева и заканчивая карбоксильным или С-концом справа. Можно использовать стандартные однобуквенные или трехбуквенные сокращения.

Обзор

[46] Согласно определенным аспектам настоящее раскрытие относится к векторам AAV, кодирующим системы редактирования генома CRISPR/Cas9, и применению таких векторов для лечения ассоциированного CEP290 с заболевание. Иллюстративные геномы векторов AAV схематически представлены на фиг. 1A - 1C, на которых проиллюстрированы определенные фиксированные и вариабельные элементы указанных векторов: инвертированные концевые повторы (ITR), одна или две последовательности гРНК и промоторные последовательности для управления их экспрессией, кодирующая Cas9 последовательность и другой промотор для управления ее экспрессией. Каждый из указанных элементов обсуждается подробно ниже.

[47] Обращаясь вначале к парам гРНК, используемым в нуклеиновых кислотах или векторах AAV согласно настоящему раскрытию, можно использовать одну из трех "левых" гидовых последовательностей или гидовых последовательностей "против хода транскрипции" для разрезания против хода транскрипции (между экзоном 26 и мутацией IVS26), и одну из трех "правых" гидовых последовательностей или гидовых последовательностей "по ходу транскрипции" используют для разрезания по ходу транскрипции (между мутацией IVS26 и экзоном 27). Последовательности нацеливающих доменов указанных гидовых последовательностей представлены в таблице 2 ниже.

Таблица 2. Последовательности нацеливающих доменов гРНК против хода транскрипции (левые) и по ходу транскрипции (правые)

Гидовые последовательности против хода транскрипции (левые)
Нацеливающий домен	ДНК	РНК
CEP290-323	GTTCTGTCCTCAGTAAAAGGTA (SEQ ID NO: 1)	GUUCUGUCCUCAGUAAAAGGUA (SEQ ID NO: 26)
CEP290-490	GAATAGTTTGTTCTGGGTAC (SEQ ID NO: 2)	GAAUAGUUUGUUCUGGGUAC (SEQ ID NO: 27)
CEP290-492	GAGAAAGGGATGGGCACTTA (SEQ ID NO: 3)	GAGAAAGGGAUGGGCACUUA (SEQ ID NO: 28)
Гидовые последовательности по ходу транскрипции (правые)
Нацеливающий домен	ДНК	РНК
CEP290-64	GTCAAAAGCTACCGGTTACCTG (SEQ ID NO: 4)	GUCAAAAGCUACCGGUUACCUG (SEQ ID NO: 29)
CEP290-496	GATGCAGAACTAGTGTAGAC (SEQ ID NO: 5)	GAUGCAGAACUAGUGUAGAC (SEQ ID NO: 30)
CEP290-504	GAGTATCTCCTGTTTGGCA (SEQ ID NO: 6)	GAGUAUCUCCUGUUUGGCA (SEQ ID NO: 31)

[48] Левую и правую гидовые последовательности можно использовать в любой комбинации, хотя определенные комбинации могут являться более подходящими для определенных применений. В таблице 3 приведены несколько пар гидовых последовательностей против хода транскрипции + по ходу транскрипции, используемых согласно вариантам осуществления настоящего раскрытия. Следует отметить, несмотря на использование "левые" и "правые" в качестве номенклатуры для гРНК, что любую гидовую последовательность в паре, против хода транскрипции или по ходу транскрипции, можно разместить в любом из положений кодирующей последовательности гРНК, показанных на фиг. 1.

Таблица 3. Пары гидовых последовательностей против хода транскрипции (левые) + по ходу транскрипции (правые)

	По ходу транскрипции
4	5	6
Против хода транскрипции	1	1 + 4	1 + 5	1 + 6
	2	2 + 4	2 + 5	2 + 6
3	3 + 4	3 + 5	3 + 6

[49] Согласно некоторым вариантам осуществления гРНК, используемые согласно настоящему раскрытию, происходят из гРНК S. aureus и могут являться мономолекулярными или модульными, как описано ниже. Иллюстративная мономолекулярная гРНК S. aureus показана на фиг. 3, а иллюстративные последовательности ДНК и РНК, соответствующие мономолекулярным гРНК S. aureus, показаны ниже:

ДНК: [N]_16-24GTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT (SEQ ID NO: 7) и

РНК: [N]_16-24GUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUUU (SEQ ID NO: 32).

ДНК: [N]_16-24GTTATAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTATAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT (SEQ ID NO: 8) и

РНК: [N]_16-24GUUAUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAUAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUUU (SEQ ID NO: 33).

Следует отметить, что, хотя на фигуре изображен нацеливающий домен из 20 нуклеотидов, нацеливающий домен может иметь любую подходящую длину. гРНК, используемые в различных вариантах осуществления настоящего раскрытия, предпочтительно включают в себя нацеливающие домены длиной от 16 до 24 (включительно) оснований на их 5' концах и необязательно включают в себя 3' терминирующую последовательность U6, как проиллюстрировано.

[50] гРНК на фиг. 3 изображена в виде мономолекулярной, но в некоторых случаях можно использовать модульные гидовые последовательности. В иллюстративных мономолекулярных последовательностях гРНК, представленных выше, 5' часть, соответствующая crРНК (подчеркнута), соединены с помощью линкера GAAA с 3' частью, соответствующей tracrРНК (подчеркнута дважды). Специалистам в настоящей области техники будет понятно, что можно использовать двухкомпонентные модульные гРНК, которые соответствуют подчеркнутым и дважды подчеркнутым участкам.

[51] Любую из представленных выше гРНК можно использовать с любой из нацеливающих последовательностей 1-6, и две гРНК в паре необязательно включают в себя одну и ту же каркасную последовательность. Кроме того, специалистам в настоящей области техники будет понятно, что иллюстративные конструкции гРНК, приведенные в настоящем документе, можно модифицировать различными способами, которые описаны ниже или известны в настоящей области техники; включение таких модификаций находится в пределах объема настоящего раскрытия.

[52] Экспрессия каждой из гРНК в векторе AAV управляется парой промоторов U6, таких как промотор U6 человека. Иллюстративная последовательность промотора U6, изложенная в Maeder, представлена ниже:

AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC (SEQ ID NO: 9).

[53] Обращаясь далее к Cas9, согласно некоторым вариантам осуществления белок Cas9 представляет собой S. aureus Cas9. Согласно дополнительным вариантам осуществления настоящего раскрытия последовательность Cas9 S. aureus модифицируют для включения в нее двух последовательностей ядерной локализации (NLS) на C- и N-концах белка Cas9 и минисигнал полиаденилирования (или последовательность поли-А). Иллюстративные последовательности Cas9 S. aureus (как нуклеотидные и пептидные) показаны ниже:

Таблица 4. Последовательности saCas9

Кодон-оптимизи-рованный нуклеотид Cas9 S. aureus (SEQ ID NO: 10)

ATGAAAAGGAACTACATTCTGGGGCTGGACATCGGGATTACAAGCGTGGGGTATGGGATTATTGACTATGAAACAAGGGACGTGATCGACGCAGGCGTCAGACTGTTCAAGGAGGCCAACGTGGAAAACAATGAGGGACGGAGAAGCAAGAGGGGAGCCAGGCGCCTGAAACGACGGAGAAGGCACAGAATCCAGAGGGTGAAGAAACTGCTGTTCGATTACAACCTGCTGACCGACCATTCTGAGCTGAGTGGAATTAATCCTTATGAAGCCAGGGTGAAAGGCCTGAGTCAGAAGCTGTCAGAGGAAGAGTTTTCCGCAGCTCTGCTGCACCTGGCTAAGCGCCGAGGAGTGCATAACGTCAATGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCTACAAAGGAACAGATCTCACGCAATAGCAAAGCTCTGGAAGAGAAGTATGTCGCAGAGCTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGATGGCGAGGTGAGAGGGTCAATTAATAGGTTCAAGACAAGCGACTACGTCAAAGAAGCCAAGCAGCTGCTGAAAGTGCAGAAGGCTTACCACCAGCTGGATCAGAGCTTCATCGATACTTATATCGACCTGCTGGAGACTCGGAGAACCTACTATGAGGGACCAGGAGAAGGGAGCCCCTTCGGATGGAAAGACATCAAGGAATGGTACGAGATGCTGATGGGACATTGCACCTATTTTCCAGAAGAGCTGAGAAGCGTCAAGTACGCTTATAACGCAGATCTGTACAACGCCCTGAATGACCTGAACAACCTGGTCATCACCAGGGATGAAAACGAGAAACTGGAATACTATGAGAAGTTCCAGATCATCGAAAACGTGTTTAAGCAGAAGAAAAAGCCTACACTGAAACAGATTGCTAAGGAGATCCTGGTCAACGAAGAGGACATCAAGGGCTACCGGGTGACAAGCACTGGAAAACCAGAGTTCACCAATCTGAAAGTGTATCACGATATTAAGGACATCACAGCACGGAAAGAAATCATTGAGAACGCCGAACTGCTGGATCAGATTGCTAAGATCCTGACTATCTACCAGAGCTCCGAGGACATCCAGGAAGAGCTGACTAACCTGAACAGCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAACAGATTAGTAATCTGAAGGGGTACACCGGAACACACAACCTGTCCCTGAAAGCTATCAATCTGATTCTGGATGAGCTGTGGCATACAAACGACAATCAGATTGCAATCTTTAACCGGCTGAAGCTGGTCCCAAAAAAGGTGGACCTGAGTCAGCAGAAAGAGATCCCAACCACACTGGTGGACGATTTCATTCTGTCACCCGTGGTCAAGCGGAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAATGATATCATTATCGAGCTGGCTAGGGAGAAGAACAGCAAGGACGCACAGAAGATGATCAATGAGATGCAGAAACGAAACCGGCAGACCAATGAACGCATTGAAGAGATTATCCGAACTACCGGGAAAGAGAACGCAAAGTACCTGATTGAAAAAATCAAGCTGCACGATATGCAGGAGGGAAAGTGTCTGTATTCTCTGGAGGCCATCCCCCTGGAGGACCTGCTGAACAATCCATTCAACTACGAGGTCGATCATATTATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAATTCCTTTAACAACAAGGTGCTGGTCAAGCAGGAAGAGAACTCTAAAAAGGGCAATAGGACTCCTTTCCAGTACCTGTCTAGTTCAGATTCCAAGATCTCTTACGAAACCTTTAAAAAGCACATTCTGAATCTGGCCAAAGGAAAGGGCCGCATCAGCAAGACCAAAAAGGAGTACCTGCTGGAAGAGCGGGACATCAACAGATTCTCCGTCCAGAAGGATTTTATTAACCGGAATCTGGTGGACACAAGATACGCTACTCGCGGCCTGATGAATCTGCTGCGATCCTATTTCCGGGTGAACAATCTGGATGTGAAAGTCAAGTCCATCAACGGCGGGTTCACATCTTTTCTGAGGCGCAAATGGAAGTTTAAAAAGGAGCGCAACAAAGGGTACAAGCACCATGCCGAAGATGCTCTGATTATCGCAAATGCCGACTTCATCTTTAAGGAGTGGAAAAAGCTGGACAAAGCCAAGAAAGTGATGGAGAACCAGATGTTCGAAGAGAAGCAGGCCGAATCTATGCCCGAAATCGAGACAGAACAGGAGTACAAGGAGATTTTCATCACTCCTCACCAGATCAAGCATATCAAGGATTTCAAGGACTACAAGTACTCTCACCGGGTGGATAAAAAGCCCAACAGAGAGCTGATCAATGACACCCTGTATAGTACAAGAAAAGACGATAAGGGGAATACCCTGATTGTGAACAATCTGAACGGACTGTACGACAAAGATAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAAAGTCCCGAGAAGCTGCTGATGTACCACCATGATCCTCAGACATATCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAGCAGTACGGCGACGAGAAGAACCCACTGTATAAGTACTATGAAGAGACTGGGAACTACCTGACCAAGTATAGCAAAAAGGATAATGGCCCCGTGATCAAGAAGATCAAGTACTATGGGAACAAGCTGAATGCCCATCTGGACATCACAGACGATTACCCTAACAGTCGCAACAAGGTGGTCAAGCTGTCACTGAAGCCATACAGATTCGATGTCTATCTGGACAACGGCGTGTATAAATTTGTGACTGTCAAGAATCTGGATGTCATCAAAAAGGAGAACTACTATGAAGTGAATAGCAAGTGCTACGAAGAGGCTAAAAAGCTGAAAAAGATTAGCAACCAGGCAGAGTTCATCGCCTCCTTTTACAACAACGACCTGATTAAGATCAATGGCGAACTGTATAGGGTCATCGGGGTGAACAATGATCTGCTGAACCGCATTGAAGTGAATATGATTGACATCACTTACCGAGAGTATCTGGAAAACATGAATGATAAGCGCCCCCCTCGAATTATCAAAACAATTGCCTCTAAGACTCAGAGTATCAAAAAGTACTCAACCGACATTCTGGGAAACCTGTATGAGGTGAAGAGCAAAAAGCACCCTCAGATTATCAAAAAGGGC

Белок Cas9 S. aureus (SEQ ID NO: 11)

MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG

Указанные последовательности являются иллюстративными по природе и не предназначены для ограничения. Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что модификации указанных последовательностей могут быть возможны или желательны в определенных применениях; такие модификации описаны ниже или известны в настоящей области техники и находятся в объеме настоящего раскрытия.

[54] Специалистам в настоящей области техники также будет понятно, что сигналы полиаденилирования широко применимы и известны в настоящей области техники, и что любой подходящий сигнал полиаденилирования можно использовать согласно вариантам осуществления настоящего раскрытия. Один иллюстративный сигнал полиаденилирования представлен ниже: TAGCAATAAAGGATCGTTTATTTTCATTGGAAGCGTGTGTTGGTTTTTTGATCAGGCGCG (SEQ ID NO: 12).

[55] Экспрессия Cas9 в определенных векторах согласно настоящему раскрытию управляется одним из трех промоторов: промотор цитомегаловируса (CMV), фактора элонгации-1 (EFS) или киназы 1 рецепторов, связанных с G-белком человека (hGRK1), который специфически экспрессируется в фоторецепторных клетках сетчатки. Нуклеотидные последовательности для каждого из этих промоторов представлены в таблице 5. Модификации этих последовательностей могут являться возможными или желательными в определенных применениях, и такие модификации находятся в пределах объема настоящего раскрытия.

Таблица 5. Последовательности промотора Cas9

CMV (SEQ ID NO: 13)	CATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATCCGC
EFS (SEQ ID NO: 14)	TCGAGTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTGTCGTGACCGCGG
hGRK1 (SEQ ID NO: 15)	GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTCGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGC

[56] Геномы AAV согласно настоящему раскрытию, как правило, включают в себя инвертированные концевые повторы (ITR), происходящие из серотипа AAV2. Иллюстративные левый и правый ITR представлены в таблице 6. Тем не менее, следует отметить, что в настоящей области техники используют многочисленные модифицированные версии ITR AAV2, и последовательности ITR, показанные ниже, являются иллюстративными и не предусмотрены для ограничения. Модификации указанных последовательностей известны в настоящей области техники или будут очевидны специалистам в настоящей области техники и, таким образом, включены в объем настоящего раскрытия.

Таблица 6. Последовательности ITR AAV2

Левый ITR AAV2 (SEQ ID NO: 16)	TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
Правый ITR AAV2 (SEQ ID NO: 17)	AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA

[57] Как проиллюстрировано на фиг. 1, пары гРНК и промотор Cas9 являются вариабельными и их можно выбрать из перечней, представленных выше. Для ясности настоящее раскрытие предусматривает нуклеиновые кислоты и/или векторы AAV, содержащие любую комбинацию указанных элементов, хотя определенные комбинации могут являться предпочтительными для определенных применений. Соответственно, согласно различным вариантам осуществления настоящего раскрытия нуклеиновая кислота или вектор AAV кодирует промотор CMV для Cas9 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 4; промотор CMV и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 5; промотор CMV и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 6; промотор CMV и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 4; промотор CMV и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 5; промотор CMV и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 6; промотор CMV и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 4; промотор CMV и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 5; промотор CMV и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 6; промотор EFS и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 4; промотор EFS и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 5; промотор EFS и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 6; промотор EFS и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 4; промотор EFS и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 5; промотор EFS и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 6; промотор EFS и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 4; промотор EFS и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 5; промотор EFS и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 6; промотор hGRK1 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 4; промотор hGRK1 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 5; промотор hGRK1 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 1 и 6; промотор hGRK1 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 4; промотор hGRK1 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 5; промотор hGRK1 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 2 и 6; промотор hGRK1 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 4; промотор hGRK1 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 5; или промотор hGRK1 и гРНК, содержащие нацеливающие домены согласно SEQ ID NO: 3 и 6.

[58] Согласно различным вариантам осуществления нуклеиновая кислота или вектор AAV кодирует следующее: левая и правая последовательности ITR AAV2, первый промотор U6 для управления экспрессией первой гидовой РНК, характеризующейся последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 7 и 8 (что соответствует последовательностям РНК в SEQ ID NO: 32, и 33, соответственно) и/или содержащей последовательность нацеливающего домена согласно одной из SEQ ID NO: 1-3 (что соответствует последовательностям РНК в SEQ ID NO: 26-28, соответственно), второй промотор U6 для управления экспрессией второй гидовой РНК, содержащей последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7 и 8 и/или содержащей последовательность нацеливающего домена согласно одной из SEQ ID NO: 4-6 (что соответствует последовательностям РНК в SEQ ID NO: 29-31, соответственно), и промотор CMV для управления экспрессией Cas9 S. aureus, кодируемого SEQ ID NO:10; или левая и правая последовательности ITR AAV2, первый промотор U6 для управления экспрессией первой гидовой РНК, характеризующейся последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 7 и 8 и/или содержащей последовательность нацеливающего домена согласно одной из SEQ ID NO: 1-3, второй промотор U6 для управления экспрессией второй гидовой РНК, содержащей последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7 и 8 и/или содержащей последовательность нацеливающего домена согласно одной из SEQ ID NO: 4-6, и промотор hGRK для управления экспрессией Cas9S. aureus, кодируемого SEQ ID NO: 10; или левая и правая последовательности ITR AAV2, первый промотор U6 для управления экспрессией первой гидовой РНК, характеризующейся последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 7 и 8 и/или содержащей последовательность нацеливающего домена согласно одной из SEQ ID NO: 1-3, второй промотор U6 для управления экспрессией второй гидовой РНК, содержащей последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7 и 8 и/или содержащей последовательность нацеливающего домена согласно одной из SEQ ID NO: 4-6, и промотор EFS для управления экспрессией Cas9S. aureus, кодируемого SEQ ID NO:10.

[59] Согласно некоторым вариантам осуществления нуклеиновая кислота или вектор AAV характеризуется по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью последовательности по отношению к одной из нуклеиновых кислот или векторов AAV, приведенных выше.

[60] Следует отметить, что указанные последовательности, описанные выше, являются иллюстративными, и их можно модифицировать способами, которые не нарушают принципы работы элементов, которые они кодируют. Такие модификации, некоторые из которых обсуждаются ниже, находятся в пределах объема настоящего раскрытия. Не ограничивая вышесказанное, специалистам в настоящей области техники будет понятно, что последовательности ДНК, РНК или белковые последовательности элементов согласно настоящему раскрытию можно изменять способами, которые не нарушают их функцию, и что множество сходных последовательностей, которые являются по существу сходными (например, больше чем 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сходства последовательностей или в случае коротких последовательностей, таких как нацеливающие домены гРНК, последовательности, которые отличаются не больше чем на 1, 2 или 3 нуклеотида) можно использовать в различных системах, способах и векторах AAV, описанных в настоящем документе. Такие модифицированные последовательности находятся в пределах объема настоящего раскрытия.

[61] Описанные выше геномы AAV можно упаковать в капсиды AAV (например, капсиды AAV5), причем эти капсиды можно включить в композиции (такие как фармацевтические композиции) и/или ввести субъектам. Иллюстративная фармацевтическая композиция, содержащая капсид AAV согласно настоящему раскрытию, может включать в себя фармацевтически приемлемый носитель, такой как сбалансированный солевой раствор (BSS) и один или несколько поверхностно-активных веществ (например, Tween 20) и/или термочувствительный или обратимо-термочувствительный полимер (например, плюроник). Другие элементы фармацевтического состава, известные в настоящей области техники, также могут являться подходящими для применения в композициях, описанных в настоящем документе.

[62] Композиции, содержащие векторы AAV согласно настоящему раскрытию, можно вводить субъектам с помощью любого подходящего способа, включая в себя без ограничения инъекцию, например, субретинальную инъекцию. Концентрацию вектора AAV в композиции выбирают для обеспечения, среди прочего, того, чтобы достаточная доза AAV была введена на сетчатку субъекта с учетом мертвого объема внутри инъекционного аппарата и относительно ограниченного объема, который можно безопасно вводить в сетчатку. Подходящие дозы могут включать в себя, например, 1×10¹¹ вирусных геномов (вг)/мл, 2×10¹¹ вирусных геномов (вг)/мл, 3×10¹¹ вирусных геномов (вг)/мл, 4×10¹¹ вирусных геномов (вг)/мл, 5×10¹¹ вирусных геномов (вг)/мл, 6×10¹¹ вирусных геномов (вг)/мл, 7×10¹¹ вирусных геномов (вг)/мл, 8×10¹¹ вирусных геномов (вг)/мл, 9×10¹¹ вирусных геномов (вг)/мл, 1×10¹² вг/мл, 2×10¹² вирусных геномов (вг)/мл, 3×10¹² вирусных геномов (вг)/мл, 4×10¹² вирусных геномов (вг)/мл, 5×10¹² вирусных геномов (вг)/мл, 6×10¹² вирусных геномов (вг)/мл, 7×10¹² вирусных геномов (вг)/мл, 8×10¹² вирусных геномов (вг)/мл, 9×10¹² вирусных геномов (вг)/мл, 1×10¹³ вг/мл, 2×10¹³ вирусных геномов (вг)/мл, 3×10¹³ вирусных геномов (вг)/мл, 4×10¹³ вирусных геномов (вг)/мл, 5×10¹³ вирусных геномов (вг)/мл, 6×10¹³ вирусных геномов (вг)/мл, 7×10¹³ вирусных геномов (вг)/мл, 8×10¹³ вирусных геномов (вг)/мл или 9×10¹³ вирусных геномов (вг)/мл. Любой подходящий объем композиции можно доставить в субретинальное пространство. В некоторых случаях объем выбран для образования пузырька в субретинальном пространстве, например, 1 мкл, 10 мкл, 50 мкл, 100 мкл, 150 мкл, 200 мкл, 250 мкл, 300 мкл и т.д.

[63] Любую область сетчатки можно подвергнуть нацеленному воздействию, хотя центральная ямка (фовеа) (которая находится приблизительно на 1 градус от центра глаза) может являться предпочтительной в определенных случаях из-за ее роли в остроте центрального зрения и относительно высокой концентрации фоторецепторов-колбочек относительно периферических областей сетчатки. Альтернативно или дополнительно, инъекции можно направить на парафовеальные области (находящиеся приблизительно от 2 до 10 градусов от центра), которые характеризуются присутствием всех трех типов фоторецепторных клеток сетчатки. Кроме того, инъекции в парафовеальную область можно произвести под сравнительно острыми углами с использованием путей хода иглы, которые пересекают среднюю линию сетчатки. Например, пути инъекции могут проходить от носовой части поверхности склеры около лимба через витреальную камеру и в парафовеальную сетчатку на височной стороне, от височной части поверхности склеры до парафовеальной сетчатки на носовой стороне от части склеры, расположенной выше роговицы к нижнему парафовеальному положению и/или от нижней части склеры к верхнему парафовеальному положению. Использование относительно малых углов инъекции относительно поверхности сетчатки может благоприятно снизить или ограничить возможность распространения вектора из пузырька в стекловидное тело и, следовательно, уменьшить потерю вектора во время доставки. В других случаях нацеленному воздействию можно подвергать макулу (включая в себя центральную ямку), а в других случаях нацеленному воздействию можно подвергать дополнительные области сетчатки глаза, или они могут получать избыточные дозы.

[64] Для целей доклинической разработки системы, композиции, нуклеотиды и векторы согласно настоящему раскрытию можно оценить ex vivo с использованием системы эксплантата сетчатки или in vivo с использованием модели на животных, такой как мышь, кролик, свинья, примат, не являющийся человеком и т.д. Эксплантаты сетчатки необязательно содержат на подложке, а векторы AAV можно доставлять путем инъекции в пространство между слоем фоторецепторов и матрицей подложки для имитации субретинальной инъекции. Ткань для эксплантации сетчатки можно получить от субъектов-людей или животных, например, мышей.

[65] Эксплантаты являются особенно применимыми для изучения экспрессии гРНК и/или Cas9 после вирусной трансдукции и для изучения редактирования генома через сравнительно короткие промежутки времени. Указанные модели также обеспечивают более высокую производительность, чем это возможно на моделях с использованием животных, и могут являться прогностическими в отношении экспрессии и редактирования генома на моделях на животных и субъектах. Модели на небольших (мышь, крыса) и больших животных (таких как кролик, свинья, примат, не являющийся человеком) можно использовать для фармакологических и/или токсикологических исследований и для тестирования систем, нуклеотидов, векторов и композиций согласно настоящему раскрытию в условиях и в объемах, которые приблизительно соответствуют тем, которые будут использовать в клинике. Поскольку модельные системы выбраны для повторения соответствующих аспектов анатомии и/или физиологии человека, данные, полученные в этих системах, как правило (хотя и не обязательно) будут предсказывать поведение векторов AAV и композиций согласно настоящему раскрытию у субъектов-людей и животных.

[66] Наряду с тем, что вышеупомянутые иллюстративные варианты осуществления относятся к гидовым РНК, нуклеиновым кислотам и векторам AAV, нацеленным на ген CEP290, специалистам в настоящей области техники будет понятно, что нуклеиновые кислоты и векторы согласно настоящему раскрытию можно использовать в редактировании других генных мишеней и лечении других заболеваний, таких как наследственные ретинопатии, которые можно лечить путем редактирования генов, отличных от CEP290. На фиг. 1B и 1C проиллюстрированы два иллюстративных вектора AAV, которые можно использовать для трансдукции клеток сетчатки, включая в себя без ограничения фоторецепторные клетки сетчатки, такие как фоторецепторы-палочки и/или фоторецепторы-колбочки, и/или другие типы клеток сетчатки. Геном AAV на фиг. 1B содержит две гидовые РНК согласно SEQ ID NO: 7 и/или 8, и промоторную последовательность согласно одной из SEQ ID NO: 13-15, которая управляет экспрессией Cas9 S. aureus, содержащий один или два сигнала ядерной локализации и необязательно сигнал полиаденилирования. Вектор может дополнительно включать в себя ITR, такие как ITR AAV2, или другие последовательности, которые можно выбрать для конкретного применения, в котором будут использовать вектор. Как показано на фиг. 1C, другие векторы в пределах объема настоящего раскрытия могут включать в себя только 1 гидовую РНК. Таким образом, согласно конкретным вариантам осуществления геном AAV согласно настоящему раскрытию может кодировать промотор CMV для Cas9 и одну гидовую РНК, характеризующуюся последовательностью, содержащей или характеризующейся по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7 и 8; промотор CMV для Cas9 и две гидовые РНК, каждая из которых характеризуется последовательностью, содержащей или характеризующейся по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7 и 8; промотор hGRK для Cas9 и одну гидовую РНК, характеризующуюся последовательностью, содержащей или характеризующейся по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7 и 8; промотор hGRK для Cas9 и две гидовые РНК, каждая из которых характеризуется последовательностью, содержащей или характеризующейся по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7 и 8; промотор EFS для Cas9 и одну гидовую РНК, характеризующуюся последовательностью, содержащей или характеризующейся по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7 и 8; промотор EFS для Cas9 и две гидовые РНК, каждая из которых характеризуется последовательностью, содержащей или характеризующейся по меньшей мере 90% идентичности последовательностей по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7 и 8.

Системы редактирования генома

[67] Термин "система редактирования генома" относится к любой системе, характеризующейся направляемой РНК активностью редактирования ДНК. Системы редактирования генома согласно настоящему раскрытию включают в себя по меньшей мере два компонента, адаптированных из встречающихся в природе систем CRISPR: гРНК и РНК-направляемая нуклеаза. Указанные два компонента образуют комплекс, который способен ассоциироваться с конкретной последовательностью нуклеиновой кислоты в клетке и редактировать ДНК в этой последовательности нуклеиновой кислоты или вокруг нее, например, осуществляя один или несколько одноцепочечных разрывов (SSB или ник), двухцепочечный разрыв (DSB) и/или замену основания.

[68] Встречающиеся в природе системы CRISPR эволюционно организованы в два класса и пять типов (Makarova 2011, включенная в настоящий документ посредством ссылки), и хотя системы редактирования генома согласно настоящему раскрытию могут адаптировать компоненты любого типа или класса встречающейся в природе системы CRISPR, варианты осуществления представленные в настоящем документе, в основном адаптированы из систем CRISPR класса 2 и типа II или V. Системы класса 2, которые включают в себя типы II и V, характеризуются относительно большими, мультидоменными РНК-направляемыми нуклеазными белками (например, Cas9 или Cpf1), которые образуют рибонуклеопротеиновые комплексы (RNP) с гРНК. гРНК, которые более подробно обсуждаются ниже, могут включать в себя одиночные crРНК в случае Cpf1 или дуплексные crРНК и tracrРНК в случае Cas9. Комплексы RNP, в свою очередь, ассоциируются (т.е. нацеленно воздействуют) и расщепляют специфические локусы, комплементарные направляющей последовательности (или спейсеру) crРНК. Системы редактирования генома согласно настоящему раскрытию аналогично нацеленно воздействуют и редактируют последовательности клеточной ДНК, но значительно отличаются от систем CRISPR, встречающихся в природе. Например, мономолекулярные гРНК, описанные в настоящем документе, не встречаются в природе, и как гРНК, так и РНК-направляемые нуклеазы согласно настоящему раскрытию могут включать в себя любое количество не встречающихся в природе модификаций.

[69] Системы редактирования генома можно осуществить различными путями, и различные варианты реализации могут являться подходящими для любого конкретного применения. Например, согласно определенным вариантам осуществления система редактирования генома осуществлена в виде комплекса белок/РНК (рибонуклеопротеин или RNP), который может быть включен в фармацевтическую композицию, которая необязательно включает в себя фармацевтически приемлемый носитель и/или инкапсулирующее средство, такое как липидная или полимерная микро- или наночастица, мицелла, липосома и т.д. Согласно другим вариантам осуществления система редактирования генома осуществлена в виде одной или нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих описанные выше компоненты РНК-направляемой нуклеазы и гРНК, (необязательно с одним или несколькими дополнительными компонентами); согласно другим вариантам осуществления система редактирования генома осуществлена в виде одного или нескольких векторов, содержащих такие нуклеиновые кислоты, например, вирусного вектора, такого как AAV; и согласно другим вариантам осуществления система редактирования генома осуществлена в виде комбинации любого из указанного выше. Дополнительные или модифицированные осуществления, которые работают в соответствии с принципами, изложенными в настоящем документе, будут очевидны специалисту в настоящей области техники и находятся в пределах объема настоящего раскрытия.

[70] Следует отметить, что системы редактирования генома согласно настоящему изобретению можно нацелить на одну конкретную нуклеотидную последовательность или можно нацелить - и они способны к параллельному редактированию - двух или более конкретных нуклеотидных последовательностей посредством использования двух или больше гРНК. Использование двух или более гРНК, нацеленных на разные сайты, называется в настоящем раскрытии "мультиплексирование" и его можно использовать для нацеливания на несколько несвязанных целевых последовательностей, представляющих интерес, или для формирования множества SSB и/или DSB в пределах одного целевого домена, и, в некоторых случаях, для создания конкретных изменений в таком целевом домене. Например, как настоящее раскрытие, так и Maeder описывают систему редактирования генома для исправления точечной мутации (C.2991 + 1655A> G) в гене CEP290 человека, которая приводит к созданию скрытого сайта сплайсинга, который, в свою очередь, уменьшает или устраняет функцию гена. Система редактирования генома согласно Maeder использует две гРНК, нацеленные на последовательности с обеих сторон от точечной мутации (т.е. фланкируя), и формирует DSB, которые фланкируют мутацию. Это, в свою очередь, способствует делеции интрона, включая в себя мутацию, тем самым устраняя скрытый сайт сплайсинга и восстанавливая нормальную функцию гена.

[71] В качестве другого примера, в международной патентной публикации №WO2016/073990, Cotta-Ramusino с соавт. («Cotta-Ramusino»), включенной в настоящий документ посредством ссылки, описана система редактирования генома, которая использует две гРНК в комбинации с никазой Cas9 (Cas9, которая образует одноцепочечный ник, такая как D10A S. pyogenes), конфигурацию, называемую "система двусторонней никазы". Система двусторонней никазы согласно Cotta-Ramusino сконфигурирована для создания двух ников на противоположных цепях представляющей интерес последовательности, которые смещены на один или несколько нуклеотидов, и эти ники объединяются, чтобы создать двойной разрыв цепи со свисающим концом (5' в случае Cotta-Ramusino, хотя возможны и 3' свисающие концы). Свисающий конец, в свою очередь, может при некоторых обстоятельствах способствовать событиям репарации, направляемой гомологией. И, в качестве еще одного примера, в международной патентной публикации № WO 2015/070083, Zhang с соавт., включенной в настоящее описание посредством ссылки, описана гРНК, нацеленная на нуклеотидную последовательность, кодирующую Cas9 (называемая "управляющей" гРНК), которая может быть включена в систему редактирования генома, содержащую одну или несколько дополнительных гРНК для обеспечения транзиентной экспрессии Cas9, который в противном случае мог бы быть конститутивно экспрессирован, например, в некоторых трансдуцированных вирусом клетках. Подразумевается, что указанные применения мультиплексирования являются иллюстративными, а не ограничивающими, и специалисту в настоящей области техники будет понятно, что другие применения мультиплексирования, как правило, являются совместимыми с системами редактирования генома, описанными в настоящем документе.

[72] Системы редактирования генома в некоторых случаях могут образовывать двухцепочечные разрывы, которые репарируются с помощью механизмов двухцепочечных разрывов клеточной ДНК, таких как негомологичное соединение концов (NHEJ) или направляемая гомологией репарация (HDR). Указанные механизмы описаны в литературе (см., например, Davis 2014 (с описанием Alt-HDR), Frit 2014 (с описанием Alt-NHEJ) и Iyama 2013 (с описанием канонических путей HDR и NHEJ в целом), все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки).

[73] В тех случаях, когда системы редактирования генома работают путем формирования DSB, такие системы необязательно включают в себя один или несколько компонентов, которые способствуют или облегчают конкретный режим репарации двухцепочечного разрыва или конкретный результат репарации. Например, Cotta-Ramusino также описывает системы редактирования генома, в которых добавляют одноцепочечную олигонуклеотидную "донорную матрицу"; донорная матрица встраивается в целевую область клеточной ДНК, которая расщепляется системой редактирования генома, и может привести к изменению целевой последовательности.

[74] В других случаях системы редактирования генома модифицируют целевую последовательность или модифицируют экспрессию гена в целевой последовательности или рядом с ней, не вызывая одно- или двухцепочечных разрывов. Например, система редактирования генома может включать в себя белок слияния РНК-направляемой нуклеазы/цитидиндеаминазы и работать путем создания целевых замен С на А. Подходящие слияния нуклеазы/деаминазы описаны в Komor 2016, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Альтернативно система редактирования генома может использовать инактивированную расщеплением (т.е. "мертвую") нуклеазу, такую как мертвая Cas9, и может функционировать путем образования стабильных комплексов на одной или нескольких целевых областях клеточной ДНК, тем самым препятствуя осуществлению функций, в которых участвует(ют) целевая(ые) область(и), таких как транскрипция иРНК и ремоделирование хроматина.

Гидовая РНК (гРНК)

[75] Термин гидовая РНК и гРНК относятся к любой нуклеиновой кислоте, которая способствует специфической ассоциации (или "нацеливанию") РНК-направляемой нуклеазы, такой как Cas9 или Cpf1, с целевой последовательностью, такой как геномная или эписомная последовательность в клетке. гРНК могут являться мономолекулярными (содержащие одну молекулу РНК и альтернативно называемые химерными) или модульными (содержащие больше чем одну и, как правило, две отдельные молекулы РНК, такие как crРНК и tracrРНК, которые, как правило, ассоциированы друг с другом, например, путем дуплексирования). гРНК и их части-компоненты описаны в литературе (см., например, Briner 2014, которая включена в настоящий документ посредством ссылки; см. также Cotta-Ramusino).

[76] У бактерий и архей системы CRISPR типа II, как правило, содержат РНК-направляемый нуклеазный белок, такой как Cas9, РНК CRISPR (crРНК), которая включает в себя 5' область, которая комплементарна чужеродной последовательности, и транс-активирующую crРНК (tracrРНК), которая включает в себя 5' область, которая комплементарна и образует дуплекс с 3' областью crРНК. Без ограничения какой-либо теорией полагают, что этот дуплекс облегчает образование и необходим для активности комплекса Cas9/гРНК. Поскольку системы CRISPR типа II были адаптированы для применения в редактировании генов, было обнаружено, что crРНК и tracrРНК можно объединить в одну мономолекулярную или химерную гРНК, например, с помощью четырехнуклеотидного (например, GAAA) "тетралупа" или "линкерной" последовательности, соединяющей комплементарные области crРНК (на 3' конце) и tracrРНК (на 5' конце) (Mali 2013; Jiang 2013; Jinek 2012; все включены в настоящий документ посредством ссылки).

[77] гРНК, будь то мономолекулярные или модульные, включают в себя нацеливающий домен, который полностью или частично комплементарен целевому домену в целевой последовательности, например, последовательности ДНК в геноме клетки, где требуется редактирование. Согласно определенным вариантам осуществления эта целевая последовательность охватывает или находится в непосредственной близости от целевого положения CEP290. Нацеливающие домены упоминаются в литературе под различными названиями, включая в себя без ограничения "направляющие последовательности" (Hsu 2013, включенная в настоящий документ посредством ссылки), "области комплементарности" (Cotta-Ramusino), "спейсеры" (Briner 2014) и, в общем, как "crРНК" (Jiang 2013). Независимо от названий, которые им дают, нацеливающие домены, как правило, характеризуются длиной, составляющей 10-30 нуклеотидов, предпочтительно 16-24 нуклеотидов (например, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотида в длину) и находятся на 5' конце или рядом с ним в случае гРНК Cas9, и на 3' конце или рядом с ним в случае гРНК Cpf1.

[78] В дополнение к нацеливающим доменам гРНК обычно (но не обязательно, как обсуждается ниже) включают в себя множество доменов, которые влияют на образование или активность комплексов гРНК/Cas9. Например, как упомянуто выше, дуплексная структура, образованная первым и вторичным доменами комплементарности гРНК (также называемая дуплекс повтор: антиповтор), взаимодействует с распознающим (REC) выступом Cas9 и может опосредовать образование комплексов Cas9/гРНК (Nishimasu 2014; Nishimasu 2015; оба включены в настоящий документ посредством ссылки). Следует отметить, что первый и/или второй домены комплементарности могут содержать один или несколько участков поли-А, которые могут распознаваться РНК-полимеразами как сигнал терминации. Следовательно, последовательность первого и второго доменов комплементарности необязательно модифицируют для удаления этих участков и обеспечения полной транскрипции гРНК in vitro, например, путем использования замен A-G, как описано в Briner 2014, или замен A-U. Эти и другие аналогичные модификации первого и второго доменов комплементарности находятся в пределах объема настоящего раскрытия.

[79] Наряду с первым и вторым доменами комплементарности, гРНК Cas9, как правило, включают в себя две или более дополнительных дуплексных областей, которые необходимы для нуклеазной активности in vivo, но не являются обязательными in vitro (Nishimasu 2015). Первая "петля-на-стебле" вблизи 3' части второго домена комплементарности называется по-разному: "проксимальный домен" (Cotta-Ramusino), "петля-на-стебле 1" (Nishimasu 2014; Nishimasu 2015) и "связующее звено" (Briner 2014). Одна или несколько дополнительных структур "петля-на-стебле", как правило, присутствуют вблизи 3' конца гРНК, причем их количество варьируется в зависимости от вида: гРНК S. pyogenes, как правило, включают в себя две 3' "петли-на-стебле" (всего четыре структуры "петля-на-стебле", включая в себя дуплекс повтор: антиповтор), при этом S. aureus и другие виды содержат только одну (всего три). Описание консервативных структур "петля-на-стебле" (и структур гРНК в целом), упорядоченное по видам, приведено в Briner 2014

[80] Специалистам в настоящей области техники будет понятно, что гРНК можно модифицировать с помощью ряда способов, некоторые из которых описаны ниже, и эти модификации находятся в пределах объема настоящего раскрытия. Для экономии представления в настоящем раскрытии гРНК могут быть представлены посредством ссылки исключительно на их последовательности нацеливающих доменов.

Модификации гРНК

[81] Активность, стабильность или другие характеристики гРНК можно изменить путем встраивания в них химических модификаций и/или модификаций последовательностей. В качестве одного примера, транзиентно экспрессируемые или доставляемые нуклеиновые кислоты можно подвергать разложению, например, клеточными нуклеазами. Соответственно, гРНК, описанные в настоящем документе, могут содержать один или несколько модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов, которые вводят стабильность по отношению к нуклеазам. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, также полагают, что определенные модифицированные гРНК, описанные в настоящем документе, могут проявлять пониженный врожденный иммунный ответ при введении в популяцию клеток, в частности клеток согласно настоящему изобретению. Как отмечалось выше, термин "врожденный иммунный ответ" включает в себя клеточный ответ на экзогенные нуклеиновые кислоты, включая в себя одноцепочечные нуклеиновые кислоты, как правило, вирусного или бактериального происхождения, который предусматривает индукцию экспрессии цитокинов и высвобождение, в частности интерферонов, и гибель клеток.

[82] Одной из распространенных 3'-концевых модификаций является добавление участка поли-А, содержащего один или несколько (и, как правило, 5-200) остатков аденина (А). Участок поли-А может содержаться в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гРНК, или его можно добавить к гРНК во время химического синтеза или после транскрипции in vitro с использованием полиаденозинполимеразы (например, полиаденозинполимеразы E. coli). In vivo участки поли-А можно добавить к последовательностям, транскрибируемым из ДНК-векторов, посредством использования сигналов полиаденилирования. Примеры таких сигналов приведены в Maeder.

РНК-направляемые нуклеазы

[83] РНК-направляемые нуклеазы согласно настоящему раскрытию включают в себя без ограничения встречающиеся в природе нуклеазы класса 2 CRISPR, такие как Cas9 и Cpf1, а также другие нуклеазы, происходящие или полученные из них. С функциональной точки зрения РНК-направляемые нуклеазы определяют как те нуклеазы, которые: (а) взаимодействуют (например, образуют комплекс) с гРНК; и (b) вместе с гРНК связываются и необязательно расщепляют или модифицируют целевую область ДНК, которая включает в себя (i) последовательность, комплементарную нацеливающему домену гРНК, и, необязательно, (ii) дополнительную последовательность, которая называется "прилегающий к протоспейсеру мотив", или "PAM", который более подробно описан ниже. Как проиллюстрировано в следующих примерах РНК-направляемые нуклеазы можно определить в широком смысле их специфичностью по отношению к РАМ и активностью расщепления, даже если могут существовать различия между отдельными РНК-направляемыми нуклеазами, которые обладают одинаковой специфичностью по отношению к РАМ или активностью расщепления. Специалистам в настоящей области техники будет понятно, что некоторые аспекты настоящего раскрытия относятся к системам, способам и композициям, которые можно осуществить с использованием любой подходящей РНК-направляемой нуклеазы, характеризующейся определенной специфичностью по отношению к PAM и/или активностью расщепления. По этой причине, если не указано иное, термин "РНК-направляемая нуклеаза" следует понимать как общий термин, и он не ограничен каким-либо конкретным типом (например, Cas9 в отличие от Cpf1), видами (например, S. pyogenes в отличие от S. aureus) или вариацией (например, полноразмерная в отличие от усеченной или расщепленной; встречающаяся в природе специфичность по отношению к PAM в отличие от сконструированной специфичности по отношению к PAM).

[84] Обращаясь к последовательности PAM, эта структура получила свое название от своего последовательностного отношения к "протоспейсерной" последовательности, которая комплементарна нацеливающим доменам гРНК (или "спейсерам"). Вместе с последовательностями протоспейсера последовательности PAM определяют целевые области или последовательности для специфических комбинаций РНК-направляемой нуклеазы/гРНК.

[85] Различные РНК-направляемые нуклеазы могут требовать различных последовательностных отношений между PAM и протоспейсерами. Как правило, Cas9 распознают последовательности PAM, которые находятся 5' по отношению к протоспейсеру, как представлено относительно верхней или комплементарной цепи.

[86] В дополнение к распознаванию специфических последовательностных ориентаций PAM и протоспейсеров, РНК-направляемые нуклеазы, как правило, распознают специфические последовательности PAM. Cas9 S. aureus, например, распознает последовательность PAM NNGRRT, где последовательности N находятся непосредственно 3' от области, распознаваемой нацеливающим доменом гРНК. Cas9 S. pyogenes распознает последовательности NGG PAM. Следует также отметить, что сконструированные РНК-направляемые нуклеазы могут характеризоваться специфичностями по отношению к PAM, которые отличаются от специфичностей по отношению к PAM аналогичных нуклеаз (таких как встречающийся в природе вариант, из которого происходит РНК-направляемая нуклеаза, или встречающийся в природе вариант, характеризующийся наибольшей гомологией аминокислотной последовательности по отношению к сконструированной РНК-направляемой нуклеазы). Модифицированные Cas9, которые распознают альтернативные последовательности PAM, описаны ниже.

[87] РНК-направляемые нуклеазы также характеризуются своей активностью расщепления ДНК: встречающиеся в природе РНК-направляемые нуклеазы, как правило, образуют DSB в целевых нуклеиновых кислотах, но получили сконструированные варианты, которые создают только SSB (обсуждено выше; см. также Ran 2013, включены посредством ссылки в настоящий документ), или которые не отрезают вообще.

Cas9

[88] Кристаллические структуры были определены для Cas9 S. pyogenes (Jinek 2014) и для Cas9 S. aureus в комплексе с мономолекулярной гРНК и целевой ДНК (Nishimasu 2014; Anders 2014; и Nishimasu 2015).

[89] Встречающийся в природе белок Cas9 содержит два выступа: выступ распознавания (REC) и выступ нуклеазы (NUC); каждый из которых содержит определенные структурные и/или функциональные домены. Выступ REC содержит богатый аргинином домен мостиковой спирали (BH) и, по меньшей мере, один домен REC (например, домен REC1 и, необязательно, домен REC2). Выступ REC не характеризуется структурным сходством с другими известными белками, что указывает на то, что это уникальный функциональный домен. Без ограничения какой-либо теорией мутационный анализ предлагает конкретные функциональные роли для доменов BH и REC: домен BH, по-видимому, играет роль в распознавании гРНК: ДНК, а домен REC, как полагают, взаимодействует с дуплексом повтор: антиповтор гРНК и опосредует образование комплекса Cas9/гРНК.

[90] Выступ NUC содержит домен RuvC, домен HNH и домен, взаимодействующий с PAM (PI). Домен RuvC характеризуется структурным сходством с представителями суперсемейства ретровирусной интегразы и расщепляет некомплементарную (т.е. нижнюю) цепь целевой нуклеиновой кислоты. Он может быть сформирован из двух или более мотивов расщепления RuvC (таких как RuvC I, RuvCII и RuvCIII в S. pyogenes и S. aureus). Между тем, домен HNH структурно сходен с мотивами эндонуклеазы HNH и расщепляет комплементарную (т.е. верхнюю) цепь целевой нуклеиновой кислоты. Домен PI вносит вклад в специфичность по отношению к PAM

Модификации РНК-направляемых нуклеаз

[91] Описанные выше РНК-направляемые нуклеазы обладают активностями и свойствами, которые являются применимыми в различных применениях, но специалисту в настоящей области техники понятно, что РНК-направляемые нуклеазы также можно модифицировать в определенных случаях для изменения активности расщепления, специфичности по отношению к PAM или других структурных или функциональных особенностей.

[92] Обращаясь вначале к модификациям, которые изменяют активность расщепления, мутации, которые снижают или устраняют активность доменов в выступе NUC, были описаны выше. Иллюстративные мутации, которые можно осуществить в доменах RuvC, в домене HNH Cas9 или в домене Nuc Cpf1, описаны Ran и Yamano, а также Cotta-Ramusino. Как правило, мутации, которые уменьшают или устраняют активность в одном из двух нуклеазных доменов, приводят к получению РНК-направляемых нуклеаз с активностью никазы, но следует отметить, что тип активности никазы варьируется в зависимости от того, какой домен инактивирован. В качестве одного примера инактивация домена RuvC в Cas9 приведет к появлению никазы, которая расщепляет комплементарную цепь, в то время как инактивация домена HNH Cas9 приводит к появлению никазы, которая расщепляет некомплементарную цепь.

[93] Модификации специфичности к PAM относительно встречающихся в природе эталонных молекул Cas9 описаны как для S. pyogenes (Kleinstiver 2015a), так и для S. aureus (Kleinstiver 2015b). Кроме того, описаны модификации, улучшающие нацеливающую точность Cas9 (Kleinstiver 2016). Каждая из этих ссылок включена в настоящий документ посредством ссылки.

[94] РНК-направляемые нуклеазы разделили на две или больше частей (см., например, Zetsche 2015; Fine 2015; обе включены в настоящий документ посредством ссылки).

[95] РНК-направляемые нуклеазы в некоторых случаях являются оптимизированными по размеру или усеченными, например, посредством одной или нескольких делеций, которые уменьшают размер нуклеазы, сохраняя при этом ассоциацию с гРНК, распознавание мишени и PAM и активности расщепления. Согласно определенным вариантам осуществления РНК-направляемые нуклеазы ковалентно или нековалентно связаны с другим полипептидом, нуклеотидом или другой структурой, необязательно, с помощью линкера. РНК-направляемые нуклеазы также необязательно включают в себя метку, такую как сигнал ядерной локализации, для облегчения перемещения РНК-направляемого нуклеазного белка в ядро.

[96] Предполагается, что вышеприведенный перечень модификаций является иллюстративным по своей природе, и специалисту в настоящей области техники будет понятно, что другие модификации могут быть возможны или желательны в определенных применениях. Поэтому для краткости определенные системы, способы и композиции согласно настоящему раскрытию проиллюстрированы со ссылкой на конкретные РНК-направляемые нуклеазы, но следует понимать, что используемые РНК-направляемые нуклеазы можно модифицировать способами, которые не изменяют приведенные в качестве принципы действия. Такие модификации находятся в пределах объема настоящего раскрытия.

ПРИМЕРЫ

[97] Следующие примеры являются иллюстративными и не предназначены для какого-либо ограничения объема или содержания изобретения.

Пример 1. AAV-трансдукция систем редактирования генома в эксплантатах сетчатки мыши

[98] Для оценки способности описанных выше векторов AAV трансдуцировать системы редактирования генома CRISPR/Cas9 в клетки сетчатки in situ разработали систему эксплантата ex vivo. На фиг. 4A показано репрезентативное изображение эксплантированной сетчатки мыши на матрице-подложке, на котором ткань указана серой стрелкой. Эксплантаты собирали на 7-й или 10-й день и получали гистологические образцы, образцы ДНК, РНК и/или белка. На фиг. 4B показана репрезентативная флуоресцентная микрофотография эксплантата сетчатки, обработанного вектором AAV, несущим репортер GFP, демонстрируя успешную трансдукцию полезной нагрузки AAV в клетках в нескольких слоях сетчатки.

[99] Образцы иРНК, взятые из эксплантатов сетчатки, дополнительно демонстрируют, что системы редактирования генома согласно настоящему раскрытию эффективно трансдуцированы этими векторами AAV: на фиг. 5А и фиг. 5B показана экспрессия иРНК Cas9 и гРНК, соответственно, нормализованная к экспрессии GAPDH. Как и ожидалось, необработанные образцы не экспрессировали Cas9 или гРНК, и гРНК не обнаружили в образцах, которые не были трансдуцированы последовательностями, кодирующими гРНК. Экспрессию Cas9 наблюдали в трех конструктах AAV, в которых экспрессия Cas9 управлялась промоторами hGRK1, CMV или EFS. Данные наблюдений в отношении иРНК Cas9 и гРНК в образцах, трансдуцированных векторами, в которых экспрессия Cas9 управляется промотором hGRK1, специфическим для фоторецепторных клеток сетчатки, указывает на то, что эти векторы могут трансдуцировать системы редактирования генома в фоторецепторных клетках in situ.

[100] Образцы ДНК из эксплантатов сетчатки, обработанных векторами AAV, секвенировали и идентифицировали виды инделов. Векторы AAV, используемые в системе эксплантатов мыши, включали в себя гидовые последовательности с нацеливающими доменами, специфическими в отношении гена CEP290 мыши, но нацеленные на ту же область интрона 26, что и гидовые последовательности человека, представленные выше; помимо конкретных используемых гидовых последовательностей, используемые векторы AAV являлись такими же, как те, что описаны выше. В таблице 7 показана последовательность мыши дикого типа (WT) с выделенными курсивом левой и правой гидовыми последовательностями и тремя репрезентативными инделами +1, -4 и -246, выровненными с последовательностью WT. В таблице три периода (. . .) представляют собой сокращение прочтения последовательности для простоты представления, в то время как штрихи (-) представляют пробелы выравнивания, а подчеркнутые нуклеотиды представляют собой вставки. Поскольку секвенирование ДНК эксплантатов, обработанных векторами AAV с использованием специфического для фоторецептора промотора hGRK1, выявило образование индела, эти данные демонстрируют редактирование генома целевого сайта CEP290 в фоторецепторах сетчатки.

Таблица 7. Репрезентативные инделы в эксплантатах сетчатки мыши

WT	CCCTCAAACACATGTCTCACGCAGCTTAGACATTCT...CAGAACTCGGTCAG-CATGCTACAGATAGCTTATCT (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19)
+1	CCCTCAAACACATGTCTCACGCAGCTTAGACATTCT...CAGAACTCGGTCAGGCATGCTACAGATAGCTTATCT (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 34)
-4	CCCTCAAACACATGTCTCACGCAGCTTAGACATTCT...CAGAACTCGG-----CATGCTACAGATAGCTTATCT (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 35)
-246	CCCTCAAAG---------------------------...---------------CATGCTACAGATAGCTTATCT (SEQ ID NO: 36) (SEQ ID NO: 37)

[101] На фиг. 6 обобщено представлены расчетные значения частоты конкретных событий редактирования в отдельных эксплантатах мыши, трансдуцированных с помощью векторов AAV согласно настоящему раскрытию. В образцах, трансдуцированных векторами AAV, в которых экспрессия Cas9 управлялась промотором hGRK1, стабильно наблюдали делеции последовательностей между гРНК (гидовые сайты), как и инделы на одном из двух гидовых сайтов. Инделы на одном из двух гидовых сайтов также наблюдали в эксплантатах, трансдуцированных векторами CMV и EFS.

[102] Взятые вместе, указанные результаты демонстрируют трансдукцию систем редактирования генома CRISPR/Cas9 в клетки, включая в себя фоторецепторные клетки, в интактной сетчатке мыши и редактирование (включая в себя делецию) целевого сайта CEP290 в фоторецепторах сетчатки in situ.

Пример 2. AAV-трансдукция систем редактирования генома в сетчатке примата in vivo

[103] Для оценки способности векторов AAV, описанных выше, трансдуцировать системы редактирования генома CRISPR/Cas9 в клетки сетчатки in vivo разработали процедуру субретинальной инъекции приматов. Макаки Cynomolgus получали двусторонние субретинальные инъекции вектора AAV5, кодирующего Cas9 S. aureus, функционально связанный с промоторной последовательностью EFS, CMV или hGRK, и гРНК C1 и C2, нацеленные на интронную область гена CEP290 яванского макака и содержащие нацеливающие последовательности, показанные в таблице 8. Инъекции AAV вводили в дозах, составляющих 4×10¹⁰ (низкая доза) или 4×10¹¹ (высокая доза) вирусных геномов (вг). Экспериментальные условия обобщенно приведены в таблице 9.

Таблица 8. Последовательности нацеливающих доменов гРНК яванского макака

гРНК	Последовательность нацеливающего домена (ДНК)	Последовательность нацеливающего домена (РНК)
C1	GGCCGGCTAATTTAGTAGAGA (SEQ ID NO: 20)	GGCCGGCUAAUUUAGUAGAGA (SEQ ID NO: 38)
C2	GTTATGAAGAATAATACAAA (SEQ ID NO: 21)	GUUAUGAAGAAUAAUACAAA (SEQ ID NO: 39)

Таблица 9. Условия лечения яванского макака

Группа	Вектор	Доза (вг/глаз)
CMV-низкая доза	CEPgRNA-dCMV-Cas9	4×1010
CMV-высокая доза	CEPgRNA-dCMV-Cas9	4×1011
EFS-низкая доза	CEPgRNA-EFS-Cas9	4×1010
EFS-высокая доза	CEPgRNA-EFS-Cas9	4×1011
GRK-низкая доза	CEPgRNA-GRK1-Cas9	4×1010
GRK-высокая доза	CEPgRNA-GRK1-Cas9	4×1011
Несущая среда	GRK1-GFP/несущая среда	4×1011

[104] Из сетчатки, обработанной AAV и несущей средой, через 6 и 13 недель после инъекции получали 6- или 8-мм пункционные биоптаты ткани сетчатки и собирали геномную ДНК. Секвенирование проводили с использованием авторской методики (Uni-Directional Targeted Sequencing, или UDiTaS), описанной в принадлежащей этому же правообладателю, находящейся одновременно на рассмотрении патентного ведомства предварительной заявке на выдачу патента США №62/443212, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Данные из двух реакций секвенирования UDiTaS с отдельными праймерами против хода транскрипции или по ходу транскрипции, объединяли, предполагая полное перекрывания инделов в двух разных сайтах разрезания гРНК и усредняя скорости инверсий и делеций, наблюдаемые в двух реакциях секвенирования.

[105] Гистологический анализ продемонстрировал успешную трансдукцию фоторецепторных клеток приматов с использованием систем редактирования генома, как описано в настоящем документе. На фиг. 4C изображено окрашивание антител Cas9 в пункционном биоптате ткани, обработанной несущей средой - контроле из сетчатки примата, тогда как на фиг. 4D показана экспрессия Cas9 в пункционном биоптате из сетчатки примата, обработанной вектором AAV5, кодирующим Cas9 S. aureus, функционально связанный с промоторной последовательностью hGRK. На фигурах показано, что внешний ядерный слой (ONL) в пункционном биоптате, обработанном вектором AAV5, содержит белок Cas9, в то время как ONL из контрольного пункционного биоптата, обработанного контролем - несущей средой, не содержит его. Это свидетельствует об успешной трансдукции клеток в этом слое. Отсутствовала обнаруживаемая экспрессия Cas9 в клетках за пределами ONL. Поскольку промотор hGRK является специфическим для фоторецепторов, эти данные указывают на то, что системы и способы согласно настоящему раскрытию приводят к экспрессии Cas9 в фоторецепторных клетках сетчатки у приматов.

[106] На фиг. 7 показана частота, с которой наблюдали определенные редакционные изменения (инделы, вставки, делеции и инверсии) при каждом условии. Как при условии «CMV-высокая доза», так и при условии «GRK-высокая доза» частота событий редактирования достигала или превышала 40% прочтений во временные точки через 13 недель. Значения частоты конкретных редакционных изменений, наблюдаемых при каждом экспериментальном условии в каждый момент времени, перечислены в таблице 10 ниже. 13-недельные временные точки для условия с высокой дозой EFS не были получены.

Таблица 10. Значения частоты редактирования, наблюдаемые при условиях лечения яванских макак через 6 и 13 недель

	Общее редактирование	Инверсии	Делеции	Вставки	Инделы
EFS-низкая доза	6 недель	2,4%	0,6%	0,4%	0,3%	1,1%
13 недель	3,8%	1,2%	0,6%	0,0%	2,0%
EFS-высокая доза	6 недель	10,2%	1,4%	1,3%	2,3%	5,3%
13 недель	-	-	-	-	-
CMV-низкая доза	6 недель	1,1%	0,5%	0,0%	0,1%	0,5%
13 недель	13,4%	3,7%	2,1%	0,9%	6,6%
CMV-высокая доза	6 недель	8,0%	0,7%	0,7%	2,1%	4,4%
13 недель	44,5%	5,1%	3,7%	11,2%	24,5%
GRK-низкая доза	6 недель	5,0%	0,9%	0,7%	0,7%	2,7%
13 недель	1,6%	0,0%	0,0%	0,3%	1,3%
GRK-высокая доза	6 недель	16,6%	2,5%	2,5%	3,5%	8,1%
13 недель	38,0%	7,0%	8,5%	5,9%	16,7%

[107] Следует отметить, что промотор hGRK1 является специфическим для фоторецепторов и что система редактирования генома, кодируемая вектором AAV5, будет функционировать только в фоторецепторных клетках. Поэтому разумно сделать вывод, что процентные отношения прочтений, полученных из пункционных биптатов тканей, которые включают в себя другие типы клеток сетчатки, ниже, чем процентные отношения, которые наблюдались бы только в фоторецепторных клетках. Вместе эти данные демонстрируют трансдукцию системы CRISPR/Cas9 в сетчатку приматов путем субретинальной инъекции AAV in vivo и получение целевых изменений в последовательности гена CEP290 в фоторецепторных клетках приматов in vivo.

Пример 3. Исправление дефекта сплайсинга IVS26 с помощью инверсий и делеций

[108] Чтобы убедиться, что делеции и инверсии интронной области, включая в себя мутацию IVS26, исправляют дефект сплайсинга, наблюдаемый при ассоциированном с CEP290 заболевании, разработали репортерный анализ с использованием четырех репортерных конструктов, характеризующихся общей структурой, изображенной на фиг. 8А: pAD26_SplitGFP+WildType_CEP290_Kan (SEQ ID NO:22); pAD27_SplitGFP+Mutant_CEP290_Kan (SEQ ID NO:23); pAD28_SplitGFP+Mutant_CEP290_Inverted_Kan (SEQ ID NO:24) и pAD29_SplitGFP+DeletionCEP290_Kan (SEQ ID NO:25). Указанные конструкты трансфицировали в клетки U2OS в концентрациях, показанных на фиг. 8В, и экспрессию GFP и mCherry количественно определяли для каждого условия по трем параллельным биоанализам. Каждый из четырех репортерных конструктов включал в себя последовательность, кодирующую репортерный ген «расщепленного» зеленого флуоресцентного белка (GFP), включающий в себя 2217 п.н. интронную последовательность CEP 290 человека, соответствующую (а) дикому типу (WT), (b) мутации IVS26, (с) делеции интронной последовательности между двумя целевыми сайтами CEP290 человека, включая в себя мутацию IVS26 и скрытый экзон, наблюдаемый в иРНК от субъектов с ассоциированным с CEP290 заболеванием, как результат применения системы редактирования генома согласно настоящему раскрытию, или (d) инверсию интронной последовательности между двумя целевыми сайтами CEP290 человека, включая в себя мутацию IVS26 и скрытый экзон, как следствие применения системы редактирования генома согласно настоящему раскрытию. Конструкт сконструирован так, что для экспрессии GFP необходим правильный сплайсинг. Таким образом, присутствие скрытого сайта акцептора сплайсинга в состоянии IVS26, но не в состоянии WT, приведет к нарушению транскриптов GFP, кодирующих нефункциональные белки GFP; модификации на целевых сайтах CEP290, которые приводят к удалению или изменению мутации IVS26, что восстановит экспрессию функционального белка GFP. Как показано на фиг. 8B, функциональный белок GFP экспрессируется на высоком исходном уровне в клетках, обработанных конструктом WT, экспрессия снижается в состоянии IVS26 и возвращается к исходному уровню WT в состоянии делеции и инверсии. Эти данные указывают на то, что аберрантный сплайсинг иРНК, вызванный мутацией IVS26, устраняется либо делецией, либо инверсией интронной последовательности, содержащей эту мутацию.

Пример 4. AAV5-трансдукция систем редактирования генома в эксплантатах сетчатки человека

[109] Чтобы дополнительно установить, что системы редактирования генома согласно настоящему раскрытию поддерживали редактирование целевого гена в клетках сетчатки человека, например, полностью зрелых фоторецепторах человека in situ, разработали систему эксплантата сетчатки человека ex vivo. Отбирали очищенные векторы AAV5, которые кодировали Cas9 S. aureus, функционально связанный с промоторной последовательностью hGRK1 или CMV, и первую и вторую гРНК, содержащие нацеливающие последовательности согласно SEQ ID NO: 1 и 4, соответственно, и каркасные последовательности согласно SEQ ID NO:8. Как обсуждалось выше, указанные гидовые последовательности нацелены на интронную область гена CEP290 на противоположных сторонах от мутации IVS26 A> G (таблица 2). Глаза человека от донора - трупа получали в течение приблизительно 5 часов после вскрытия и 3 мм пункционные биоптаты иммобилизировали на субстрате для культивирования, как описано выше. Эксплантаты сетчатки обрабатывали векторами AAV либо в низкой дозе, составляющей 1×10¹¹ вг, либо в высокой дозе, составляющей 5×10¹¹ вг. Экспериментальные условия обобщенно приведены в таблице 11.

Таблица 11. Условия лечения человека

Группа	Вектор	Доза (вг/пункционный биоптат)
CMV-низкая доза	CEPgRNA-dCMV-Cas9	1×1011
CMV-высокая доза	CEPgRNA-dCMV-Cas9	5×1011
GRK-низкая доза	CEPgRNA-GRK1-Cas9	1×1011
GRK-высокая доза	CEPgRNA-GRK1-Cas9	5×1011
Несущая среда	GRK1-GFP/несущая среда	5×1011

[110] Образцы ДНК из эксплантатов сетчатки человека, обработанных векторами AAV, секвенировали через 14 или 28 дней после трансдукции, и идентифицировали инверсии и делеции. На фиг. 9 обобщенно представлено продуктивное редактирование, наблюдаемое в эксплантатах сетчатки человека через 14 и 28 дней после трансдукции различными векторами AAV. Продуктивное редактирование определяли как общие редакционные изменения (равные сумме значений частоты инверсий и делеций), способных исправить LCA10-ассоциированную мутацию сплайсинга в гене CEP290 (фиг. 9). Наиболее продуктивное редактирование наблюдали на уровне 16,4% через 28 дней для условия высокой дозы GRK. Эти данные демонстрируют трансдукцию системы CRISPR/Cas9 в сетчатку человека путем субретинальной инъекции AAV и создание целевых изменений в последовательности гена CEP290 в фоторецепторных клетках человека in situ.

Пример 5. AAV5-трансдукция систем редактирования генома у живых трансгенных мышей с нокингом IVS26

[111] Чтобы дополнительно установить, что системы редактирования генома согласно настоящему раскрытию поддерживали редактирование целевого гена целевого положения CEP290 человека в зрелых фоторецепторах in vivo, использовали модель мыши IVS26 12 KI. В этой модели человеческий экзон 26 CEP290, интрон 26 с мутацией IVS26 (13 c.2991 + 1655A> G) и экзон 27 вставлены в ген CEP290 мыши посредством гомологичной рекомбинации. Векторы AAV5, кодирующие (i) Cas9 S. aureus, функционально связанный со специфической для фоторецептора промоторной последовательностью hGRK1, и (ii) первую и вторую гРНК, содержащие нацеливающие последовательности согласно SEQ ID NO: 1 и 4, соответственно, и характеризующиеся каркасными последовательностями гРНК согласно SEQ ID NO: 8, использовали, как описано в примере 4. Векторы вводили субретинально (по направлению к височной стороне сетчатки около зрительного нерва) в оба глаза каждого животного в дозах, составляющих 1×10¹¹ вг/мл, 1×10¹² вг/мл или 1×10¹³ вг/мл; группу несущей среды (содержащей BSS с 0,014% Tween 20) также использовали в исследовании в качестве контроля. Субретинальные инъекции проводили у анестезированных мышей в соответствии с рекомендациями по уходу за животными NIH. Для каждой инъекции иглу с тупым концом (33 калибра, 0,5 дюйма; компания Hamilton) на 5 мл шприце Гамильтона вводили через разрез склеры позади хрусталика и продвигали центрально к височной сетчатке до ощущения сопротивления. Принимали меры, чтобы избежать повреждения хрусталика при продвижении канюли. Объем, составляющий 1 мкл состава AAV или контроля - несущей среды, содержащий 0,2 мг/мл флуоресцеина, вводили в субретинальное пространство с образованием пузырька; флуоресцеин использовали для визуализации пузырька и подтверждения успешной инъекции. Животных умерщвляли через 6 и 12 недель и выделяли геномную ДНК и РНК сетчатки для определения эффективности редактирования генов (с помощью UDiTaS) и уровней Cas9/гРНК (с помощью ОТ-ПЦР), соответственно.

[112] Экспериментальные условия обобщенно представлены в таблице 12 вместе с указанием частоты вставки и делеции из отдельных сетчаток, что измеряли с помощью UDiTaS.

Таблица 12. Частота инверсий и делеций в сетчатках мышей с нокингом IVS26

Доза	1×1012 вг	1×1013 вг
Временная точка	6 недель	12 недель	6 недель	12 недель
Инверсии	4,68%	3,91%	2,06%	1,88%
Делеции	6,29%	5,27%	7,79%	4,13%

[113] Указанные данные дополнительно демонстрируют успешную трансдукцию фоторецепторных клеток сетчатки и изменение целевого положения LCA10 с использованием векторов и систем редактирования генома согласно настоящему раскрытию.

Включение посредством ссылки

[114] Все ссылки, упомянутые в настоящем документе, полностью включены в него посредством ссылки, как если бы было указано, что каждая отдельная ссылка была специально и индивидуально включена в настоящий документ посредством ссылки.

Эквиваленты

[115] Специалисты в настоящей области техники распознают или смогут установить, используя не больше чем обычные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охватываются приведенной ниже формулой изобретения.

Источники информации

Anders et al. Nature 513(7519):569-573 (2014)

Briner et al. Mol Cell 56(2):333-339 (2014)

Cornish-Bowden Nucleic Acids Res 13(9):3021-3030 (1985)

Davis & Maizels Proc Natl Acad Sci USA 111(10):E924-E932 (2014)

Fine et al. Sci Rep 5:10777 (2015)

Frit et al. DNA Repair (Amst.) 17:81-97 (2014)

Hsu et al. Nat Biotechnol 31(9):827–832 (2013)

Iyama & Wilson DNA Repair (Amst.) 12(8):620-636 (2013)

Jiang et al. Nat Biotechnol 31(3):233-239 (2013)

Jinek et al. Science 337(6096):816-821 (2012)

Jinek et al. Science 343(6176):1247997 (2014)

Kleinstiver et al. Nature 523(7561):481-485 (2015a)

Kleinstiver et al. Nat Biotechnol 33(12):1293-1298 (2015b)

Kleinstiver et al. Nature 529(7587):490-495 (2016)

Komor et al. Nature 533(7603):420-424 (2016)

Makarova et al. Nat Rev Microbiol 9(6):467-477 (2011)

Mali et al. Science 339(6121):823-826 (2013)

Nishimasu et al. Cell 156(5):935-949 (2014)

Nishimasu et al. Cell 162(5):1113-1126 (2015)

Ran et al. Cell 154(6):1380-1389 (2013)

Tsai et al. Nat Biotechnol 34(5):483 (2016)

Zetsche et al. Nat Biotechnol 33(2):139-142 (2015)

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЭДИТАС МЕДИСИН, ИНК.

Maeder, Morgan L.

Mepani, Rina J.

Stefanidakis, Michael

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОГО С CEP290 ЗАБОЛЕВАНИЯ

<130> 118945.8012.WO00 (EM087PCT)

<150> US 62/370,202

<151> 2016-08-02

<150> US 62/400,526

<151> 2016-09-27

<150> US 62/443,568

<151> 2017-01-06

<150> US 62/503,800

<151> 2017-05-09

<150> US 62/535,193

<151> 2017-07-20

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Targeting domain

<400> 1

gttctgtcct cagtaaaagg ta 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Targeting domain

<400> 2

gaatagtttg ttctgggtac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Targeting domain

<400> 3

gagaaaggga tgggcactta 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<---

1. Применение аденоассоциированного вируса 5 (AAV5) вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую Cas9, первую гидовую RNA (гРНК) и вторую гРНК, причем каждая гРНК нацелена на ген CEP290, в концентрации от 1x1011 вирусных геномов (вг)/мл до 9x1013 вг/мл для лечения ассоциированного с CEP290 заболевания.

2. Применение вектора AAV5 по п. 1, где концентрация выбрана из группы, состоящей из 1×10¹¹ вг/мл, 2×10¹¹ вг/мл, 3×10¹¹ вг/мл, 4×10¹¹ вг/мл, 5×10¹¹ вг/мл, 6×10¹¹ вг/мл, 7×10¹¹ вг/мл, 8×10¹¹ вг/мл, 9×10¹¹ вг/мл, 1×10¹² вг/мл, 2×10¹² вг/мл, 3×10¹² вг/мл, 4×10¹² вг/мл, 5×10¹² вг/мл, 6×10¹² вг/мл, 7×10¹² вг/мл, 8×10¹² вг/мл, 9×10¹² вг/мл, 1×10¹³ вг/мл, 2×10¹³ вг/мл, 3×10¹³ вг/мл, 4×10¹³ вг/мл, 5×10¹³ вг/мл, 6×10¹³ вг/мл, 7×10¹³ вг/мл, 8×10¹³ вг/мл или 9×10¹³ вг/мл.

3. Применение вектора AAV5 по п. 1 или 2, где вектор вводится в субретинальное пространство сетчатки.

4. Применение вектора AAV5 по любому из пп. 1-3, где ассоциированное с CEP290 заболевание представляет собой врожденный амавроз Лебера 10 типа (LCA-10).

5. Применение вектора AAV5 по любому из пп. 1-4, где первая гРНК способна расщеплять первую последовательность клеточной нуклеиновой кислоты гена CEP290 и вторая гРНК способна расщеплять вторую последовательность клеточной нуклеиновой кислоты гена CEP29, причем первая последовательность клеточной нуклеиновой кислоты отличается от второй последовательности нуклеиновой кислоты клетки.

6. Применение вектора AAV5 по любому из пп. 1-5, где первая гРНК содержит нацеливающий домен, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, и вторая гРНК содержит нацеливающий домен, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4-6.

7. Применение вектора AAV5, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую Cas9, первую гРНК и вторую гРНК, причем первая гРНК содержит нацеливающий домен, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, и вторая гРНК содержит нацеливающий домен, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4-6, в концентрации от 1x1011 вг/мл до 9x1013 вг/мл для изменения клетки сетчатки субъекта.

8. Применение вектора AAV5 по п. 7, где концентрация выбрана из группы, состоящей из 1×10¹¹ вг/мл, 2×10¹¹ вг/мл, 3×10¹¹ вг/мл, 4×10¹¹ вг/мл, 5×10¹¹ вг/мл, 6×10¹¹ вг/мл, 7×10¹¹ вг/мл, 8×10¹¹ вг/мл, 9×10¹¹ вг/мл, 1×10¹² вг/мл, 2×10¹² вг/мл, 3×10¹² вг/мл, 4×10¹² вг/мл, 5×10¹² вг/мл, 6×10¹² вг/мл, 7×10¹² вг/мл, 8×10¹² вг/мл, 9×10¹² вг/мл, 1×10¹³ вг/мл, 2×10¹³ вг/мл, 3×10¹³ вг/мл, 4×10¹³ вг/мл, 5×10¹³ вг/мл, 6×10¹³ вг/мл, 7×10¹³ вг/мл, 8×10¹³ вг/мл или 9×10¹³ вг/мл.

9. Применение вектора AAV5 по любому из пп. 7, 8, где субъект имеет заболевание сетчатки.

10. Применение вектора AAV5, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую Cas9, первую гРНК и вторую гРНК, причем каждая из первой и второй гРНК содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-8, или последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную указанным последовательностям, причем (a) применение включает приведение в контакт одного или более рекомбинантных вирусных векторов с сетчаткой субъекта, и причем (b) первая гРНК способна образовывать первый рибонуклеопротеиновый комплекс с Cas9, и (c) первый рибонуклеопротеиновый комплекс способен расщеплять первую последовательность клеточной нуклеиновой кислоты, ассоциированную с наследственной дистрофией сетчатки, тем самым изменяя первую последовательность клеточной нуклеиновой кислоты, и (d) второй рибонуклеопротеиновый комплекс способен расщеплять вторую последовательность клеточной нуклеиновой кислоты, ассоциированную с наследственной дистрофией сетчатки, тем самым изменяя вторую последовательность нуклеиновой кислоты, в концентрации от 1x1011 вг/мл до 9x1013 вг/мл, для изменения последовательности клеточной нуклеиновой кислоты, ассоциированной с наследственной дистрофией сетчатки.

11. Применение вектора AAV5 по п. 10, в котором концентрация выбрана из группы, состоящей из 1×10¹¹ вг/мл, 2×10¹¹ вг/мл, 3×10¹¹ вг/мл, 4×10¹¹ вг/мл, 5×10¹¹ вг/мл, 6×10¹¹ вг/мл, 7×10¹¹ вг/мл, 8×10¹¹ вг/мл, 9×10¹¹ вг/мл, 1×10¹² вг/мл, 2×10¹² вг/мл, 3×10¹² вг/мл, 4×10¹² вг/мл, 5×10¹² вг/мл, 6×10¹² вг/мл, 7×10¹² вг/мл, 8×10¹² вг/мл, 9×10¹² вг/мл, 1×10¹³ вг/мл, 2×10¹³ вг/мл, 3×10¹³ вг/мл, 4×10¹³ вг/мл, 5×10¹³ вг/мл, 6×10¹³ вг/мл, 7×10¹³ вг/мл, 8×10¹³ вг/мл или 9×10¹³ вг/мл.

12. Применение вектора AAV5 по п. 10 или 11, где вектор вводится в субретинальное пространство сетчатки.

13. Применение вектора AAV5 по любому из пп. 10-12, где субъект имеет врожденный амавроз Лебера 10 типа (LCA-10).

14. Применение вектора AAV5 по любому из пп. 10-13, где первая последовательность клеточной нуклеиновой кислоты отличается от второй последовательности клеточной нуклеиновой кислоты.

15. Применение вектора AAV5 по любому из пп. 10-14, где первая гРНК содержит нацеливающий домен, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, и вторая гРНК содержит нацеливающий домен, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4-6.

16. Применение вектора AAV5 по любому из пп. 1-15, причем вектор AAV5 находится в объеме, выбранном из группы, состоящей из по меньшей мере 10 микролитров, по меньшей мере 50 микролитров, по меньшей мере 100 микролитров, по меньшей мере 150 микролитров, по меньшей мере 200 микролитров, по меньшей мере 250 микролитров и по меньшей мере 300 микролитров.

17. Применение вектора AAV5 по п. 16, причем объем составляет по меньшей мере 10 микролитров.

18. Применение вектора AAV5 по п. 16, причем объем составляет по меньшей мере 50 микролитров.

19. Применение вектора AAV5 по п. 16, причем объем составляет по меньшей мере 100 микролитров.

20. Применение вектора AAV5 по п. 16, причем объем составляет по меньшей мере 150 микролитров.

21. Применение вектора AAV5 по п. 16, причем объем составляет по меньшей мере 200 микролитров.

22. Применение вектора AAV5 по п. 16, причем объем составляет по меньшей мере 250 микролитров.

23. Применение вектора AAV5 по п. 16, причем объем составляет по меньшей мере 300 микролитров.