Антитело против подокаликсина и tra-родственного белка, способы его получения и применения в качестве противоопухолевого терапевтического средства

Изобретение относится к области биохимии, в частности к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые обладают селективным связыванием с TRA-подокаликсином. Также раскрыто противоопухолевое терапевтическое средство для лечения злокачественного новообразования, связанного с TRA-подокаликсином, содержащее моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Изобретение обладает способностью эффективно лечить заболевания, ассоциированные с TRA-подокаликсином. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке в соответствии с 35 U.S.C. 119(e) испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США № 62/307690 под названием "PODOCALYXIN AND TRA-RELATED ANTIBODY, METHODS FOR PREPARATION AND USES FOR TREATMENT OF AGGRESSIVE AND/OR METASTATIC CANCER", зарегистрированной 14 марта 2016 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к антителу, специфическому в отношении плюрипотентных и эмбриональных стволовых клеток. Настоящее изобретение дополнительно относится к антителу, являющемуся реактивным и имеющим связывающую активность по отношению к эмбриональной форме белка подокаликсина. Настоящее изобретение дополнительно относится к противоопухолевому терапевтическому средству, включающему антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента для регрессирования, снижения или устранения злокачественных клеток.

Предпосылки изобретения

Нормальные эмбриональные стволовые клетки человека являются плюрипотентными стволовыми клетками, дифференцирующимися в двести различных типов клеток, составляющих организм человека. Эмбриональная карцинома представляет собой злокачественные плюрипотентные стволовые клетки человека, происходящие из опухолей половых клеток человека, и известна как злокачественный эквивалент нормальных эмбриональных стволовых клеток. Нормальные эмбриональные стволовые клетки и эмбриональная карцинома экспрессируют антигены, ассоциированные с плюрипотентностью, на поверхности их плазматической мембраны. Известно, что, по меньшей мере, некоторые антигены, ассоциированные с плюрипотентностью, утрачиваются при дифференцировке и не экспрессируются в нормальных клетках и тканях или экспрессируются на низком уровне.

Известно, что многие злокачественные новообразования человека имеют генную сигнатуру эмбриональных стволовых клеток и повторно экспрессируют антигены, ассоциированные с плюрипотентностью, и эмбриональные антигены, не присутствующие на дифференцированных клетках или присутствующие на низком уровне. Согласно теории клеточного перепрограммирования, касающейся происхождения злокачественных новообразований, их причиной является перепрограммирование нормальных клеток и их дедифференцировка в обратном направлении в сторону примитивных эмбрионально-подобных злокачественных клеток со свойствами стволовых клеток. Считают, что эти примитивные эмбрионально-подобные злокачественные стволовые клетки являются источником злокачественных новообразований и движущей силой прогрессирования заболевания и его резистентности, возникающей почти повсеместно при использовании общепринятых способов терапии. Кроме того, считают, что терапевтический таргетинг и устранение этих примитивных эмбрионально-подобных стволовых клеток будут приводить к существенному к эффективному лечению злокачественных опухолей с длительным действием.

Подокаликсин является гликопротеином поверхности клеток, сильно экспрессирующимся на эмбриональных стволовых клетках и плюрипотентных злокачественных стволовых клетках человека. Белок подокаликсин, экспрессирующийся на эмбриональных и плюрипотентных клетках, имеет дополнительные углеводные группы (TRA-1-60 и TRA-1-81, обозначаемые в настоящем описании как TRA), присоединенные к белку подокаликсину. Углеводные группы TRA являются эмбрионально- и плюрипотентно-специфическими и не присутствуют на соматических или дифференцированных клетках. Плюрипотентную и эмбриональную версию подокаликсина называют TRA-подокаликсином. Известно, что эмбриональная и плюрипотентная форма TRA-подокаликсина повторно экспрессируется во многих типах злокачественных новообразований.

Можно получать моноклональные антитела, специфические и реактивные в отношении антигенов, ассоциированных с плюрипотентностью, экспрессирующихся на поверхности злокачественных клеток и нормальных эмбриональных клеток, но не на нормальных дифференцированных клетках организма. Кроме того, можно получать моноклональные антитела, являющиеся реактивными и имеющими специфическую связывающую активность в отношении TRA-подокаликсина. Эти антитела можно использовать в качестве противоопухолевых терапевтических средств в случае злокачественных новообразований, повторно экспрессирующихся эмбриональные антигены и антигены, ассоциированные с плюрипотентностью, такие как TRA-подокаликсин, при дебюте и прогрессировании заболевания.

Целью настоящего изобретения является разработка антитела, специфического в отношении плюрипотентных и эмбриональных стволовых клеток. Кроме того, целью настоящего изобретения является разработка TRA-подокаликсин-специфического антитела. Кроме того, целью настоящего изобретения является разработка терапевтического средства или композиции, включающей антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента. Кроме того, целью настоящего изобретения является введение терапевтического средства или композиции пациенту со злокачественным новообразованием для регрессирования, снижения или устранения злокачественных клеток у пациента.

Сущность изобретения

Моноклональное антитело по настоящему изобретению включает шесть специфических аминокислотных последовательностей, имеющих три определяющие комплементарность области тяжелой цепи и три определяющие комплементарность области легкой цепи.

Моноклональное антитело может являться специфическим и реактивным по отношению к плазматической мембране поверхности эмбриональных стволовых клеток человека и злокачественных плюрипотентных стволовых клеток эмбриональной карциномы. Кроме того, моноклональное антитело может являться специфическим и реактивным по отношению к TRA-подокаликсину.

Моноклональное антитело может иметь специфичность и реактивность в отношении множества злокачественных новообразований человека, выбранных из группы, состоящей из рака ротовой полости, яичников, предстательной железы, молочной железы, поджелудочной железы, толстого кишечника, желудка и пищевода.

В одном из аспектов изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему тяжелую цепь и легкую цепь, при этом определяющие комплементарность области тяжелой цепи 1-3 имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3, соответственно, и определяющие комплементарность области легкой цепи 1-3 имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4-6, соответственно.

Антитело или его фрагмент могут являться рекомбинантным антителом. Рекомбинантное антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела человека, гуманизированного антитела и антитела человека.

В определенных вариантах осуществления фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, диатела, dsFv и пептида, содержащего CDR.

В другом аспекте изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, включающему тяжелую цепь и легкую цепь, при этом определяющие комплементарность области тяжелой цепи 1-3 имеют сходство аминокислотной последовательности по меньшей мере 80% по отношению к аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1-3, соответственно, и определяющие комплементарность области легкой цепи 1-3 имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4-6, соответственно.

Кроме того, определяющие комплементарность области легкой цепи 1-3 могут иметь сходство аминокислотной последовательности по меньшей мере 80% по отношению к аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 4-6, соответственно.

Антитело или его фрагмент могут являться рекомбинантным антителом. Рекомбинантное антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела человека, гуманизированного антитела и антитела человека.

В определенных вариантах осуществления фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, диатела, dsFv и пептида, содержащего CDR.

В другом аспекте настоящее изобретение включает противоопухолевое терапевтическое средство, включающее описанное выше моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент.

Средство может находиться в форме композиции, дополнительно включающей компонент, выбранный из группы, состоящей из фармацевтически приемлемого линкера, нагрузки и их комбинаций. Средство может находиться в форме композиции, дополнительно включающей лекарственное средство для получения конъюгата антитело-лекарственное средство. С помощью средства можно направленно воздействовать, выбирать и устранять эмбриональные стволовые клетки из дифференцированных клеток, происходящих из эмбриональных стволовых клеток. Средство может направленно воздействовать на злокачественные клетки, выбранные из группы, состоящей из злокачественных клеток желудка, поджелудочной железы, пищевода, толстого кишечника, молочной железы и предстательной железы.

Композицию можно вводить пациенту посредством внутривенного введения антитела в его изолированной человеческой химерной форме для индуцирования противоопухолевой антителозависимой клеточной цитотоксичности. Альтернативно, композицию можно вводить пациенту посредством внутривенного введения, где композиция дополнительно включает цитотоксическое лекарственное средство для доставки конкретно в злокачественную клетку.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Аминокислотные последовательности, приведенные в сопутствующем списке последовательностей, представлены с использованием стандартных буквенных сокращений, и список последовательностей включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к антителу, специфическому для плюрипотентных и эмбриональных стволовых клеток. Антитело проявляет противоопухолевую активность. Антитело является нереактивным или слабореактивным по отношению к нормальным клеткам и высокоспецифическим и реактивным по отношению к множеству злокачественных клеток. Антитело можно использовать в качестве противоопухолевого терапевтического средства благодаря его свойствам антителозависимой клеточной цитотоксичности, комплементзависимой цитотоксичности и нахождению в виде конъюгата антитело-лекарственное средство. Антитело, конъюгированное с токсином, например, имеет цитотоксическую активность против злокачественных клеток. Антитело является эффективным против широкого спектра злокачественных новообразований, включая, в качестве неограничивающих примеров, рак ротовой полости, яичников, желудка, поджелудочной железы, пищевода, толстого кишечника, молочной железы и предстательной железы.

Антитело по изобретению является моноклональным и обозначено в настоящем описании как бстронгомаб-9A или CM-918. Моноклональное антитело получают с использованием стандартной гибридомной технологии. Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность вариабельных областей тяжелых и легких цепей моноклонального антитела CM-918 представлены в настоящем описании. Аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей (CDR) определены с использованием VBASE2.

Моноклональное антитело CM-918 включает следующие аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей тяжелой цепи (hcCDR) 1-3:

- hcCDR #1 GFTFSDFY (SEQ ID NO: 1)

- hcCDR #2 SRNKANDYTT (SEQ ID NO: 2)

- hcCDR #3 ARDGWVEAMDY (SEQ ID NO: 3)

Моноклональное антитело CM-918 включает следующие аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей легкой цепи (lcCDR) 1-3:

- lcCDR #1 QSLVHSNGNTY (SEQ ID NO: 4)

- lcCDR #2 KVS (SEQ ID NO: 5)

- lcCDR #3 SQSTHVPWT (SEQ ID NO: 6)

Моноклональное антитело CM-918 может являться рекомбинантным антителом, включающим не принадлежащее человеку антитело и антитело человека. В альтернативных вариантах осуществления рекомбинантное антитело может являться не принадлежащим человеку, полученным из животного антителом (например, мыши или крысы), полученным из человека антителом, химерным антителом человека или гуманизированным антителом. Антитело, предпочтительно, является антителом человека, специфически связывающимся с клетками человека, например, плюрипотентными и эмбриональными стволовыми клетками. Более конкретно, антитело представляет собой полученное из млекопитающего моноклональное антитело, включая антитела, полученные с помощью гибридом. В определенных вариантах осуществления антитело получают из мыши с использованием общепринятой гибридомной технологии. Антитело можно модифицировать с использованием различных молекул, в качестве неограничивающих примеров, таких как полиэтиленгликоль (PEG). Антитело также можно модифицировать с использованием химиотерапевтического средства, радиоактивного химического вещества или т.п., имеющего цитотоксическую активность.

В определенных вариантах осуществления моноклональное антитело CM-918 имеет реактивность и селективно связывается с эпитопом на белке клеточной адгезии подокаликсине (также известном как подокаликсин-подобный белок 1). Подокаликсин является интегральным мембранным белком, который у людей кодируется геном PODXL. Подокаликсин является сильно гликозилированным трансмембранным белком типа-1, экспрессирующимся в некоторых нормальных клетках. Подокаликсин сильно экспрессируется во множестве злокачественных новообразований и является опухолевым маркером, уровень экспрессии которого коррелирует с агрессивностью опухоли при различных злокачественных новообразованиях. В нормальных клетках подокаликсин имеет молекулярную массу приблизительно 160-164 кДа. Подокаликсин также сильно экспрессируется в нормальных эмбриональных стволовых клетках и злокачественных плюрипотентных стволовых клетках эмбриональной карциномы. Подокаликсин является поверхностным клеточным маркером нормальных эмбриональных стволовых клеток. Подокаликсин экспрессируется во всех эмбриональных и плюрипотентных стволовых клетках в варианте, специфическом для эмбриональных или плюрипотентных клеток, имеющем дополнительные посттрансляционные модификации, не присутствующие в неплюрипотентных и неэмбриональных стволовых клетках. Одной из известных специфических для эмбриональных стволовых клеток посттрансляционных модификаций подокаликсина является дополнительное гликозилирование остова белка подокаликсина, известного как TRA-1-60 и TRA-1-81 (в настоящем описании обозначаемого как эпитоп TRA). Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что эпитоп TRA является расширенной тетрасахаридной структурой O-гликана муцинового типа, специфической для плюрипотентных и эмбриональных клеток. Когда эмбриональные стволовые клетки и плюрипотентные злокачественные клетки дифференцируются в соматические клетки, подокаликсин утрачивает эпитоп TRA. TRA не экспрессируется на нормальных соматических и дифференцированных клетках. Кажущаяся молекулярная масса эмбрионального варианта подокаликсина с эпитопами TRA (обозначаемого в настоящем описании как TRA-подокаликсин) составляет приблизительно 200-240 кДа. Известно, что TRA-подокаликсин экспрессируется во множестве типов злокачественных новообразований, включая рак ротовой полости, толстого кишечника, поджелудочной железы, желудка, молочной железы, предстательной железы, головного мозга, яичников и легких.

В определенных вариантах осуществления моноклональное антитело CM-918 является реактивным и селективно связывается с эпитопом TRA, присутствующем на специфическом для эмбриональных и плюрипотентных клетках варианте подокаликсина, TRA-подокаликсине.

В других вариантах осуществления моноклональное антитело CM-918 селективно связывается и имеет реактивность в отношении неизвестного эпитопа на TRA-подокаликсине. В других вариантах осуществления моноклональное антитело CM-918 селективно связывается и имеет реактивность в отношении неизвестного эпитопа, экспрессирующегося на плазматической мембране эмбриональных стволовых клеток и плюрипотентных злокачественных клеток эмбриональной карциномы. В соответствии с настоящим изобретением, следует понимать, что существуют варианты аминокислотной последовательности антитела CM-918, в которых одну, или две, или три аминокислоты в одной или нескольких последовательностях CDR тяжелой цепи (SEQ ID NO: 1-3) заменяют другой аминокислотой. Предпочтительно, эти варианты CM-918 имеют реактивность и селективно связываются с TRA-подокаликсином или имеют реактивность и селективно связываются с плазматической мембраной эмбриональных стволовых клеток.

Варианты аминокислотной последовательности антитела CM-918, в которых одна, или две, или три аминокислоты в одной или нескольких последовательностях CDR легкой цепи (SEQ ID NO: 4-6) заменяют другой аминокислотой, также включены в настоящее изобретение. Предпочтительно, эти варианты CM-918 имеют реактивность и селективно связываются с TRA-подокаликсином или имеют реактивность и селективно связываются с плазматической мембраной эмбриональных стволовых клеток.

В определенных аспектах изобретение относится к антителу, включающему CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, а также CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно. Кроме того, антитело включает CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, а также CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотные последовательности, приведенные SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно. Кроме того, в определенных аспектах настоящее изобретение включает антитело, полученное из антитела, представленного в настоящем описании, и функционально эквивалентное ему благодаря замене, делеции, добавлению и/или инсерции одной или нескольких аминокислот. В определенных аспектах настоящее изобретение включает моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь и легкую цепь, при этом определяющие комплементарность области тяжелой цепи 1-3 имеют сходство аминокислотной последовательности по меньшей мере 80% по отношению к аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1-3, соответственно, и определяющие комплементарность области легкой цепи 1-3 имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4-6, соответственно. В других конкретных аспектах настоящее изобретение включает моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь и легкую цепь, при этом определяющие комплементарность области тяжелой цепи 1-3 имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3, соответственно, и определяющие комплементарность области легкой цепи 1-3 имеют сходство аминокислотной последовательности по меньшей мере 80% по отношению к аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 4-6, соответственно. В других конкретных аспектах настоящее изобретение включает моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь и легкую цепь, при этом определяющие комплементарность области тяжелой цепи 1-3 имеет сходство аминокислотной последовательности по меньшей мере 80% по отношению к аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 1-3, соответственно, и определяющие комплементарность области легкой цепи 1-3 имеют сходство аминокислотной последовательности по меньшей мере 80% по отношению к аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 4-6, соответственно.

Антитело по изобретению не ограничено целыми молекулами антител и могут являться низкомолекулярным антителом или его модифицированной формой при условии, что антитело связывается с поверхностью клетки. Низкомолекулярное антитело включает фрагмент антитела, у которого отсутствует часть целого антитела. Такое частичное отсутствие в молекуле антитело является приемлемым при условии, что полученный фрагмент антитела способе связываться с поверхностью клетки. Предпочтительно, фрагмент антитела содержит (hc)CDR тяжелой цепи, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и (lc)CDR легкой цепи, приведенные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6. Конкретные примеры низкомолекулярного антитела и фрагмента антитела могут включать Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv (одноцепочечный Fv), dsFv, диатело, sc(Fv)₂ или пептид, включающий CDR.

Термин "диатело" относится к бивалентному фрагменту антитела, сконструированному посредством слияния генов. Диатело является димером, содержащим две полипептидных цепи. scFv получают, соединяя области тяжелой и легкой цепи антитела. В scFv области тяжелой и легкой цепи соединяют с помощью линкера, такого как, пептидный линкер. Пептидный линкер, соединяющий вариабельные области, в частности, не ограничен. Например, в качестве линкера можно использовать произвольный одноцепочечный пептид приблизительно из 3-25 остатков. scFv-Fc является низкомолекулярным антителом, содержащим Fc-область, слитую с scFv. Источник scFv, используемого в scFv-Fc, в частности, не ограничен, и, например, можно использовать scFv, полученный из IgM. Кроме того, источник Fc, в частности, не ограничен, и, например, можно использовать Fc, полученный из IgG человека (IgG1 человека и т.д.). sc(Fv)₂ является низкомолекулярным антителом, имеющим одну цепь, содержащую области тяжелой цепи и области легкой цепи, соединенные с помощью линкеров или т.п. sc(Fv)₂ можно получать, например, соединяя scFv с помощью линкера.

Фрагменты антитела можно получать с использованием различных технологий, известных в этой области, в качестве неограничивающих примеров, таких как, ферментативная обработка антитела для получения его фрагментов.

Для лечения клеточно-пролиферативного заболевания, такого как злокачественное новообразование, предпочтительно, чтобы антитело сохраняло свою эффекторную активность. Конкретно, антитело по настоящему изобретению может иметь аффинность связывания для поверхности клетки и эффекторные функции. Эффекторные функции антитела включают антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимую цитотоксичность (CDC). Терапевтическое антитело по настоящему изобретению, в частности, в качестве эффекторных функций может обладать активностью ADCC. Антитело по настоящему изобретению, используемое в терапевтических целях, может являться антителом, обладающим цитотоксической активностью. Примеры цитотоксической активности по настоящему изобретению могут включать ADCC и CDC. В настоящем изобретении, ADCC означает активность повреждения клеток-мишеней посредством связывания клеток, несущих рецепторы Fcγ (иммуноцитов и т.д.), через рецепторы Fcγ с Fc-доменами антител, специфически присоединенных к антигенам поверхности клеток-мишеней. CDC означает цитотоксическую активность, опосредованную системой комплемента.

Антитело можно конъюгировать с цитотоксическим веществом. Неограничивающие примеры подходящих цитотоксических веществ включают химиотерапевтическое средство, токсический пептид, радиоактивное химическое вещество или другую нагрузку, такую как лекарственное средство. Такое модифицированное антитело (далее в настоящем описании обозначаемое как конъюгат антитела) можно получать посредством химической модификации полученного антитела. В определенных вариантах осуществления модифицированное антитело включает фармацевтически приемлемый линкер, нагрузку или их комбинации. Если нагрузка является лекарственным средством, получают конъюгат антитело-лекарственное средство. В этой области известны различные способы модификации антитела, и эти способы пригодны для использования в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента антитело, связывающееся с поверхностями клеток, например, плюрипотентных и эмбриональных стволовых клеток. Фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество антитела. Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество антитела, позволяющее антителу проявлять желаемый терапевтический эффект или профилактический эффект. В варианте осуществления фармацевтическая композиция является ингибитором роста клеток, в частности, противоопухолевым терапевтическим средством. Ингибитор роста клеток и противоопухолевое средство по настоящему изобретению вводят индивидууму, имеющему злокачественное новообразование или, вероятно, имеющему злокачественное новообразование, и может быть эффективным для направленного воздействия, селекции и устранения эмбриональных стволовых клеток из дифференцированных клеток, происходящих из эмбриональных стволовых клеток.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента может содержать конъюгированное с цитотоксическим веществом антитело. Если заболевание, на которое направленно воздействуют с помощью фармацевтической композиции по настоящему изобретению, является злокачественным новообразованием, злокачественное новообразование, на которое направленно воздействуют, в частности, не ограничено и может являться, в частности, раком ротовой полости, раком яичников, раком желудка, раком поджелудочной железы, раком пищевода, раком толстого кишечника, раком молочной железы или раком предстательной железы.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить пациенту перорально или парентерально. Парентеральное введение может быть предпочтительным. Конкретные примеры такого способа введения включают инъекцию, трансназальное, легочное и трансдермальное введение. Примеры инъекционного введения включают внутривенные, внутримышечные, интраперитонеальные и подкожные инъекции, посредством которых фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить системно или местно. Кроме того, способ введения можно выбирать соответствующим образом в соответствии с возрастом или симптомами пациента. Дозу фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно выбирать из диапазона доз, например, от 0,0001 мг до 1000 мг на кг массы тела на введение. Альтернативно, дозу можно выбирать из диапазона, например, от 0,001 до 100000 мг на организм. Однако фармацевтическая композиция по настоящему изобретению не ограничена этими дозами. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно составлять стандартными общепринятыми способами, известными в этой области, и она может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители или добавки. Их примеры включают, в качестве неограничивающих примеров, поверхностно-активные вещества, эксципиенты, красители, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы, буферы, суспендирующие средства, регуляторы тоничности, связывающие средства, разрыхлители, смазочные средства, активаторы текучести и корригирующие вещества. Можно соответствующим образом включать другие общепринято используемые носители. После контакта со злокачественными клетками антитело по настоящему изобретению может повреждать злокачественные клетки или ингибировать их рост. Клетки, с которыми связывается антитело, в частности, не ограничено. В настоящем изобретении клетки, предпочтительно, являются злокачественными клетками.

Специалистам в этой области следует понимать, что можно осуществлять изменения вариантов осуществления, описанных выше, без отклонения от сущности и объема изобретения. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными вариантами осуществления и следующими приведенными примерами, но должно охватывать модификации, входящие в сущность и объем изобретения.

Примеры

Пример 1. Получение моноклонального антитела CM-918

Моноклональное антитело по изобретению, обозначенное в настоящем описании как бстронгомаб или CM-918, получали с использованием стандартной технологии гибридомы мыши. Мышам интраперитонеально инъецировали свежесобранные клетки NCCIT, суспендированные в стерильном PBS. Каждой мыши вводили 10e6 клеток на инъекцию. После четырех инъекций с интервалами в 2 недели сыворотку иммунизированных мышей тестировали с помощью ELISA и вестерн-блоттинга для идентификации мышей с положительными результатами. Затем мыши с наибольшим титром проводили бустерную иммунизацию перед слиянием за 2-7 дней перед сбором B-клеток из селезенки и слиянием с миеломными клетками мыши NS0 или P3X63Ag8.653.

Гибридомы высевали на 96-луночные планшеты (960 лунок на слияние) и выращивали в течение 14 дней с использованием сред для слияния гибридом, состоящих из 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 20% NCTC-109 (Gibco), 1% об./об. пенициллина-стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 0,4% об./об. добавки для слияния и клонирования гибридом (Sigma-Aldrich), 1-кратных ненезаменимых аминокислот (Gibco), 1-кратной добавки HAT (Gibco), 20 мМ HEPES и 1-кратной среды RPMI 1640 (модифицированной) с L-глутамином. Супернатанты гибридом собирали и подвергали скринингу посредством вестерн-блоттинга против лизата NCCIT для идентификации гибридом, генерирующих антитела IgG, связывающиеся с TRA. Положительные клоны выращивали и подвергали по меньшей мере двум раундам субклонирования посредством ограниченных разведений в 96-луночных планшетах для выделения моноклональных гибридом. Планшеты для субклонирования подвергали скринингу посредством ELISA и положительные моноклональные гибридомы выращивали в средах для гибридом, состоящих из 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% NCTC-109 (Gibco), 1% об./об. пенициллина-стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 0,4% об./об. добавки для слияния и клонирования гибридом (Sigma-Aldrich), 1-кратных ненезаменимых аминокислот (Gibco), 1-кратной добавки HT (Gibco), 20 мМ HEPES и 1-кратной среды RPMI 1640 (модифицированной) с L-глутамином.

После подтверждения активности гибридомы с помощью вестерн-блоттинга, моноклональные гибридомы подвергали криоконсервации в средах для гибридом, дополненных 10% DMSO. Антитела CM-918 очищали от супернатантов моноклональных гибридом, культивируемых до истощения в средах для гибридом, содержащих 10% ультранизкого IgGFBS. Супернатанты центрифугировали, а затем пропускали через фильтр 45 мкм для удаления клеток и клеточного детрита. Антитела IgG очищали посредством аффинной хроматографии с использованием колонок HiTrap HP с протеином G от GE LifeSciences. Очищенные mAb обессоливали с использованием колонок Zeba Spin Desalting Columns (ThermoScientific). Вариабельные области тяжелых и легких цепей подвергали секвенированию ДНК и определяли аминокислотные последовательности областей CDR антитела с использованием VBASE2, интегральной базы данных о генах вариабельных областей зародышевой линии из локусов иммуноглобулинов человека и мыши.

Пример 2. Анализ вестерн-блоттинга плюрипотентных клеток с использованием антитела CM-918

При вестерн-блоттинге образцов мембранных белков из плюрипотентных злокачественных клеток эмбриональной карциномы NCCIT (ATCC № CRL2073) и эмбриональных стволовых клеток человека (ESI-017) с использованием антитела CM-918 определяли одну диффузную полосу, соответствующую молекулярной массе 200-240 кДа, в обоих образцах белков, но не определяли реактивность в линиях неплюрипотентных клеток PC3 (ATCC № CRL1435) или A172 (ATCC № CRL1620), не экспрессирующих TRA-подокаликсин. Идентичные результаты блоттинга получали с использованием коммерчески доступного антитела IgM против TRA-1-60 (abcam 16288) при идентичном вестерн-блоттинге. Результаты подтверждали, что антитело CM-918 и антитело против TRA-1-60 связываются со схожим эпитопом. Электрофорез в ПААГ в присутствие SDS и вестерн-блоттинг осуществляли стандартными способами. Образцы мембран клеток в 1% детергенте Chaps (Sigma) в фосфатном буфере анализировали на 8% гелях и переносили на нитроцеллюлозу. Блоты инкубировали с антителом CM-918 или антителом против TRA-1-60 при 1:1000 (концентрация 1 мкг/мл) с последующей инкубацией с вторичными антителами против IGG-HRP или против IGM-HRP при 1-5000 (0,2 мкг/мл) (Millipore) и визуализировали полосы посредством детекции ECL (Amersham Biosciences).

Пример 3. Окрашивание плазматических мембран эмбриональных стволовых клеток и плюрипотентных клеток эмбриональной карциномы с использованием антитела CM-918

Эмбриональные стволовые клетки (ESL-017) и плюрипотентные клетки эмбриональной карциномы NCCIT окрашивали с использованием антитела CM-918, конъюгированного с Alexa 647 (Sigma) (0,5 мкг/мл), и антитела против TRA-1-60 (0,5 мкг/мл) и антитела против IgM-Alexa F488 (Millipore) (0,5 мкг/мл). Флуоресцентная микроскопия с использованием красного канала показала, что антитело CM-918 сильно связывается с плазматической мембраной эмбриональных стволовых клеток и плюрипотентных клеток эмбриональной карциномы, но не с контрольными линиями клеток PC3 (ATCC № CRL1435) или A172 (ATCC № CRL1620), не экспрессирующими TRA-подокаликсин. При наложении флуоресцентных изображений, полученных с использованием красного и зеленого каналов, наблюдали перекрывание идентичного окрашивания с использованием антитела CM-918 и антитела против TRA-1-60, свидетельствующее о том, что антитела связывались с одинаковыми эпитопами на поверхности стволовых клеток.

Пример 4. Иммуногистохимическое (IHC) окрашивание нормальных и злокачественных тканей человека с использованием антитела CM-918

Иммуногистохимическое окрашивание нормальных и злокачественных тканей с использованием CM-918 осуществляли, как описано ниже. Использовали систему оценок от 0 до 3: 0 - отсутствие окрашивания, 1 - фокальное окрашивание (<5%); 2 - умеренное окрашивание (<50%); и 3 - сильное окрашивание (>50%). Окрашенные срезы тканей оценивали патологи. Баллы окрашивания 2 или 3 определяли в следующих злокачественных тканях: рак поджелудочной железы - 22 из 38 образцов; рак предстательной железы - 19 из 41 образца; рак молочной железы - 45 из 145 образцов; рак яичников - 18 из 30 образцов; рак желудка - 8 из 8 образцов; рак толстого кишечника - 15 из 30 образцов; и рак легких - 32 из 66 образцов. Экспрессия в нормальных тканях человека была очень ограниченной, в диапазоне от нулевой экспрессии в почти всех нормальных тканях, включая костный мозг, до минорной фокальной экспрессии в некоторых образцах поджелудочной железы, пищевода и толстого кишечника. Почки имели положительную оценку во всех образцах, при этом приблизительно 1% окрашивания CM-918 наблюдали в трубочках. Единственной нормальной тканью, имевшей оценку 2, являлась паращитовидная железа, в случае которой 2 из 9 образцов имели оценку в 2 балла. Результаты показали, что в случае CM-918 наблюдали окрашивание мембран при множестве различных злокачественных новообразований и очень ограниченное окрашивание нормальных тканей.

Все ткани фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 24 часов, нарезали по 5 мкм и помещали на положительно заряженные предметные стекла. Перед окрашиванием предметные стекла сушили при 60°C в течение ночи. После депарафинизации в ксилоле (Fisher Scientific, кат. № X3P-1GAL) срезы регидратировали с помощью 100% этанола (Eki-Chem, кат. № 4085-1GL), 95% этанола и 70% этанола (Eki-Chem, кат. № 4089-1GL). Затем срезы погружали в 1-кратный Diva Decloaker (Biocare Medical, кат. № DV2004LX) и подвергали тепловой обработке с помощью камеры Decloaking chamber (Biocare Medical, модель: NxGen). Затем срезы блокировали BLOXALL (Vector labs, кат. № SP-6000) и универсального реагента для блокирования/разведения IHC PowerVision (Leica, кат. № BD09-15). Первичное антитело наносили на каждое предметное стекло в концентрации 2 мкг/мл в PBS, оставляя при комнатной температуре на 1 час. После промывки PBS реагент PowerVision Post Blocking (Leica, кат. № DPVO+15Post) наносили на 20 мин при комнатной температуре. Затем предметные стекла инкубировали с поли-HRP IgG против мыши/кролика PowerVision (Leica, кат. № DPVO-15HRP) в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей цветной реакцией с DAB (Vector labs, кат. № SK4105). Предметные стекла докрашивали гематоксилином (Vector labs, кат. № H-3404). Между инкубациями с различными реагентами или антителами предметные стекла промывали PBS. Срезы эмбриональной карциномы включали в окрашивание для обеспечения технической точности определения экспрессии белка-мишени в тканях. Эксперименты с отрицательным контролем проводили в присутствие антител изотипического контроля (Biolegend, кат. № 401401) параллельно во всех анализах.

Пример 5. Кривые доза-эффект в отношении жизнеспособности клеток для конъюгата антитело CM-918-лекарственное средство

Получали конъюгат антитело-лекарственное средство CM-919-vc-MMAE: раствор CM-918 в PBS обрабатывали TCEP при 37°C для восстановления межцепочечных дисульфидных связей. В реакционную смесь добавляли раствор MC-vc-PAB-MMAE (малеимидокапроил-валин-цитрулин-p-аминобензилоксикарбонил-монометил ауристатин E) для соединения остатка малеимида из MC-vc-PAB-MMAE с CM-918. Полученный конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) обессоливали на колонке SephadexG50 для удаления остаточных непрореагировавших токсинов и для замены буфера на PBS (pH 7,2). Соотношение лекарственного средства и антитела (DAR) определяли с помощью соотношения поглощения УФ при 248 и 280 нм. Для определения распределения молекул DAR осуществляли HIC (хроматографию с гидрофобными взаимодействиями) и SEC (эксклюзионную хроматографию).

Осуществляли анализ жизнеспособности клеток с использованием плюрипотентных клеток NCCIT, эмбриональных стволовых клеток (ESL-017) и контрольных клеток PCS, не экспрессирующих TRA-подокаликсин: клетки-мишени высевали на 96-луночные планшеты при плотности от 3×10³ до 1×10⁴ клеток на лунку (90 мкл) и инкубировали клетки в инкубаторе при 5% CO₂ в течение 24 часов. Клетки обрабатывали антителом (10 мкл на лунку) следующим образом: начинали с концентрации 100 нМ и снижали до полулогарифмического разведения, 6 повторений на концентрацию, и последние лунки без антитела использовали в качестве отрицательного контроля. Клетки инкубировали в инкубаторе при 5% CO₂ в течение от 24 часов до 7 дней. Реагент для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, кат. № 7572) перед использованием уравновешивали до комнатной температуры. В каждую лунку наносили 100 мкл реагента CellTiter-Glo® и смешивали содержимое в течение 2 минут на орбитальном шейкере для индуцирования лизиса клеток. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут для стабилизации люминесцентного сигнала. Люминесценцию регистрировали с помощью микроспектрофотометра для чтения планшетов (FiltermaxF5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Результаты анализа жизнеспособности клеток показали, что IC50 гибели клеток при использовании конъюгата антитело-лекарственное средство CM-918-vc-MMAE составляла 2,7 нМ в случае клеток NCCIT, 5,6 нМ в случае эмбриональных стволовых клеток и наблюдали отсутствие эффекта в случае контрольных клеток PC3 при концентрации CM-918-vcMMAE до 100 нМ. Антитело изотипического контроля, идентичным образом конъюгированное с MMAE, не обладало эффектом в случае всех трех линий клеток в концентрации до 100 нМ. Результаты свидетельствовали о том, что конъюгат антитело CM-918-лекарственное средство является очень эффективным в уничтожении плюрипотентных злокачественных клеток эмбриональной карциномы и эмбриональных стволовых клеток человека, но не клеток, не экспрессирующих TRA-подокаликсин.

Пример 6. Мышиная модель ксенотрансплантата плюрипотентных злокачественных клеток NCCIT, обработанная конъюгатом антитело CM-919-лекарственное средство

Пятнадцати безтимусным мышам подкожно инъецировали 2×10⁶ плюрипотентных злокачественных стволовых клеток NCCIT и позволяли опухолям достигнуть размера 200 мм³, после чего мышей разделяли на 3 группы по 5: 5 мышам проводили 4 инъекции физиологического раствора; 5 мышам вводили CM-vc-MMAE в количестве 3 мг/кг, Q4Dx4; еще пяти мышам вводили антитело изотипического контроля-vc-MMAE в количестве 3 мг/кг, Q4Dx4. Результаты свидетельствовали о том, что по истечении 35 дней мыши, которым инъецировали физиологический раствор, и мыши, которым инъецировали изотипический контроль, имели опухоли со средним размером 1000 мм³. В случае мышей, которым вводили конъюгат антитело CM-918-лекарственное средство, 4 из 5 мышей не имели определимых опухолей, и 1 мышь имела опухоль размером приблизительно 25 мм³. В случае антитела изотипического контроля, конъюгированного с MMAE, как с CM-918, наблюдали результаты, схожие с результатами у мышей, которым вводили физиологический раствор, со средним размером опухолей 1000 мм³. Результаты свидетельствовали о том, что конъюгат антитело-лекарственное средство CM-919-vc-MMAE является эффективным в лечении злокачественных опухолей из плюрипотентных стволовых клеток у мышей.

Пример 7. Анализ антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) с использованием антитела CM-918

Анализ ADCC с использованием антитела CM-918 и плюрипотентных злокачественных клеток NCCIT показал цитотоксичность 12-15% и активность ADCC CM-918, при этом контрольные клетки, не экспрессирующие TRA-подокаликсин, имели цитотоксичность 2%. Контрольное антитело IgG имело цитотоксичность 2% в случае клеток NCCIT. Результаты свидетельствовали о том, что антитело CM-918 имеет активность ADCC в отношении плюрипотентных злокачественных клеток, экспрессирующих TRA-подокаликсин.

PBMC выделяли из крови здоровых доноров с использованием градиента фиколла. Клетки-мишени высевали на 96-луночные планшеты в количестве 1×10⁴/лунку и инкубировали со свежевыделенными PBMC в соотношении E:T=25:1 или 50:1 в течение 4 ч. при 37°C. Концентрация тестового антитела и контрольного антитела IgG-Fc являлась фиксированной и составляла 190 нМ. После совместной инкубации измеряли цитотоксичность клеток с использованием анализа LDH. Процент цитотоксичности клетки-мишени вычисляли посредством вычитания фоновых значений поглощения контрольных эффекторных клеток и клеток-мишеней (без антитела) и принятия только клеток-мишеней (спонтанный лизис) за 0% и только лизированных клеток-мишеней (максимальный лизис) за 100%.

Пример 8. Анализ обусловленной комплементом цитотоксичности (CDC) с использованием антитела CM-918

Осуществляли анализ CDC, и он показал, что плюрипотентные злокачественные стволовые клетки NCCIT имели цитотоксичность 18% при 100 нМ антитела CM-918 и цитотоксичность 10% при 10 нМ антитела CM-918. Результаты анализа цитотоксичности CDC клеток NCCIT с использованием 100 нМ контрольного антитела показали цитотоксичность <1%. Результаты свидетельствовали о том, что антитело CM-918 может вызывать активность CDC в отношении плюрипотентных злокачественных стволовых клеток, экспрессирующих TRA-подокаликсин на плазматической мембране на поверхности клетки.

Комплемент человека инкубировали с 10⁴ клеток-мишеней при объемном соотношении 1:4 в 96-луночном формате. Тестовое антитело нагружали в серии полулогарифмических разведений с 10 точками, начиная с 190 нМ. Контрольное антитело IgG-Fc добавляли только в концентрации 190 нМ. Антитела инкубировали совместно с клетками-мишенями и комплементом в течение 4 ч. при 37°C. После совместной инкубации измеряли цитотоксичность клеток с использованием анализа LDH (Roche). Процент цитотоксичности клетки-мишени вычисляли посредством вычитания фоновых значений поглощения контрольного комплемента и клеток-мишеней (без антитела) и принятия только клеток-мишеней (спонтанный лизис) за 0% и только лизированных клеток-мишеней (максимальный лизис) за 100%.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<160> КОЛИЧЕСТВО SEQ ID NOS: 6

<210> SEQ ID NO 1

<211> ДЛИНА: 8

<212> ТИП: БЕЛОК

<213> ОРГАНИЗМ: МЫШЬ

<400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Tyr

1 5

<210> SEQ ID NO 2

<211> ДЛИНА: 10

<212> ТИП: БЕЛОК

<213> ОРГАНИЗМ: МЫШЬ

<400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 2

Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr

1 5 10

<210> SEQ ID NO 3

<211> ДЛИНА: 11

<212> ТИП: БЕЛОК

<213> ОРГАНИЗМ: МЫШЬ

<400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 3

Ala Arg Asp Gly Trp Val Glu Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> SEQ ID NO 4

<211> ДЛИНА: 11

<212> ТИП: БЕЛОК

<213> ОРГАНИЗМ: МЫШЬ

<400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 11

Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> SEQ ID NO 5

<211> ДЛИНА: 3

<212> ТИП: БЕЛОК

<213> ОРГАНИЗМ: МЫШЬ

<400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 3

Lys Val Ser

1

<210> SEQ ID NO 6

<211> ДЛИНА: 9

<212> ТИП: БЕЛОК

<213> ОРГАНИЗМ: МЫШЬ

<400> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ: 9

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr

<110> SCHOPPERLE, WILLIAM MICHAEL

TAN, EDWIN SAAVEDRA

JU, YAWEN

HOLMQVIST, MATS HARALD

TAK, YOUNGBIN

HOLMQVIST, AN MARY

<120> АНТИТЕЛО ПРОТИВ ПОДОКАЛИКСИНА И TRA-РОДСТВЕННОГО БЕЛКА, СПОСОБЫ ЕГО

ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО

СРЕДСТВА

<130> 302977-00042-2

<140> PCT/US17/22109

<141> 2017-03-13

<150> 62/307,690

<151> 2016-03-14

<160> 6

<170> MICROSOFT WORD

<210> 1

<211> 8

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Tyr

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 2

Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 3

Ala Arg Asp Gly Trp Val Glu Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 4

Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 5

Lys Val Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 6

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr

1 5

2

<---

1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые обладают селективным связыванием с TRA-подокаликсином, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, при этом определяющие комплементарность области тяжелой цепи 1-3 имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3, соответственно, и определяющие комплементарность области легкой цепи 1-3 имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4-6, соответственно.

2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где указанное антитело или его фрагмент является рекомбинантным антителом.

3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где рекомбинантное антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела человека, гуманизированного антитела и антитела человека.

4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, диатела, dsFv и пептида, содержащего CDR моноклонального антитела.

5. Противоопухолевое терапевтическое средство для лечения злокачественного новообразования, связанного с TRA-подокаликсином, содержащее моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 в терапевтическом эффективном количестве.

6. Противоопухолевое терапевтическое средство по п.5, где указанное средство находится в форме композиции, дополнительно содержащей компонент, выбранный из группы, состоящей из фармацевтически приемлемого линкера, нагрузки и их комбинаций.

7. Противоопухолевое терапевтическое средство по п.5, где указанное средство находится в форме композиции, дополнительно содержащей лекарственное средство для получения конъюгата антитело-лекарственное средство.

8. Противоопухолевое терапевтическое средство по п.5, где с помощью указанного средства направленно воздействуют, выбирают и устраняют эмбриональные стволовые клетки из дифференцированных клеток, происходящих из эмбриональных стволовых клеток.

9. Противоопухолевое терапевтическое средство по п.5, где указанное средство направленно воздействует на злокачественные клетки, выбранные из группы, состоящей из злокачественных клеток желудка, поджелудочной железы, пищевода, толстого кишечника, молочной железы и предстательной железы.