Основанные на hla способы и композиции и их применение

Изобретение относится к биотехнологии, в частности представлена композиция и способы выделения HLA-пептидов из клетки. В настоящем раскрытии представлена универсальная платформа и способы получения профиля HLA-пептидов, обеспечивающие идентификацию эндогенно презентируемых HLA-пептидов из клеточных линий, экспрессирующих любую возможную конструкцию I или II класса. 18 з.п. ф-лы, 22 ил., 4 табл., 7 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[1] Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/457978, поданной 12 февраля 2017 года, и с предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/461162, поданной 20 февраля 2017 года, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

[2] Главный комплекс гистосовместимости (MHC) представляет собой генный комплекс, кодирующий гены человеческого лейкоцитарного антигена (HLA). Гены HLA экспрессируются в виде белковых гетеродимеров, которые представлены на поверхности клеток человека для циркулирования T-клеток. Гены HLA являются очень полиморфными, что позволяет им точно настраивать адаптивную иммунную систему. Адаптивные иммунные ответы частично зависят от способности T-клеток идентифицировать и уничтожать клетки, которые демонстрируют связанные с заболеванием пептидные антигены, связанные с гетеродимерами человеческого лейкоцитарного антигена (HLA).

[3] У людей эндогенные и экзогенные белки могут быть процессированы в пептиды протеосомой и цитозольными и эндосомальными/лизосомальными протеазами и пептидазами и представлены двумя классами белков клеточной поверхности, кодируемых MHC. Эти белки клеточной поверхности называют человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA I класса и II класса), а группа пептидов, которые их связывают и вызывают иммунные ответы, называются эпитопы HLA. Эпитопы HLA являются ключевым компонентом, который позволяет иммунной системе обнаруживать сигналы опасности, такие как заражение патогенным микроорганизмом и самотрансформация. Циркулирующие CD8+ T-клетки распознают эпитопы MHC I класса (HLA-A, HLA-B и HLA-C), происходящие из эндогенных путей процессинга и представленные почти на всех ядросодержащих клетках. CD4+ T-клетки распознают эпитопы MHC II класса (HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP), представленные на антигенпрезентирующих клетках (APC), таких как дендритные клетки и макрофаги. Презентация пептида HLA II класса активирует T-хелперы, впоследствии способствуя дифференциации B-клеток и выработке антител, а также ответам CTL. Активированные T-хелперы также секретируют цитокины и хемокины, которые активируют и индуцируют дифференциацию других T-клеток.

[4] Гены, кодирующие гетеродимеры HLA, являются очень полиморфными, причем в популяции людей более 12000 вариантов аллелей класса I и 4000 классов II выявлено. От метеринских и отцовский гаплотипов HLA индивидуум может наследовать разные аллели для каждого из локусов HLA класса I и класса II. Молекулы HLA I класса представляют собой гетеродимеры, состоящие из тяжелой α-цепи, кодируемой генами HLA I класса, и β-2-микроглобулина (B2M). Молекулы HLA II класса представляют собой гетеродимеры α- и β-цепей, которые кодируются генами HLA II класса. Из-за комбинаций спаривания α- и β-цепей популяция гетеродимеров HLA является очень сложной. Кроме того, каждый гетеродимер HLA, по оценкам, связывает тысячи пептидов с аллель-специфическими предпочтениями связывания. Фактически, каждый аллель HLA, по оценкам, связывает и презентирует T-клеткам ~1000-10000 уникальных пептидов; ≤0,1% из ~10 миллионов потенциальных 9-мерных пептидов из генов, кодирующих белки человек. Учитывая такое разнообразие в связывании HLA, точное прогнозирование того, может ли пептид связываться с конкретным аллелем HLA, является очень сложной задачей. Меньше известно об аллель-специфических пептид-связывающих характеристиках молекул HLA II класса из-за неоднородности спаривания α и β цепей, сложности данных, ограничивающих способность уверенно назначать связывающие коровую часть эпитопы, и отсутствия градации иммунопреципитации, аллель-специфических антител, необходимых для биохимических анализов с высоким разрешением. Кроме того, проведение анализа пептидных эпитопов, происходящих из данного аллеля HLA, повышает неоднозначность при презентации множественных аллелей HLA на клеточной поверхности.

[5] Понимание предпочтений связывания каждого гетеродимера HLA является ключом к успешному прогнозированию того, какие неоантигены могут вызывать опухоль-специфические T-клеточные ответы. Очевидно, существует потребность в способах идентификации и выделения специфических связанных с HLA пептидов I класса и II класса (например, неоантигенных пептидов). Такое методика и выделенные молекулы полезны, например, для исследования связанных с HLA пептидов, а также для разработки терапевтических средств, включая, но без ограничения, основанные на иммунитете терапевтические средства.

Включение посредством ссылки

[6] Все публикации, патенты и заявки на патент, упомянутые в этом описании, включены в настоящее описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент была конкретно и индивидуально указана для включения в качестве ссылки.

Сущность Изобретения

[7] Описанные в данном документе способы и композиции находят применение в широком диапазоне вариантов применения. Например, описанные в данном документе способы и композиции можно использовать для идентификации иммуногенных антигенных пептидов и можно использовать для разработки лекарственных средств, таких как персонализированные лекарственные препараты.

[8] В настоящем документе представлен способ получения характеристик комплексов HLA-пептиды, включающий: предоставление популяция клеток, причем одна или более клеток популяции клеток содержат полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую аллель меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, при этом последовательность, кодирующая меченный аффинным акцептором HLA, содержит последовательность, кодирующую аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, функционально связанный с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор; экспрессию меченного аффинным акцептором HLA по меньшей мере в одной клетке из одной или более клеток популяции клеток, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды по меньшей мере в одной клетке; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и получение характеристик комплексов HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления кодируемым аллелем меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса является растворимый аллель меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса.

[9] В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя получение характеристик пептида, связанного с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления способ включает выполнение стадий способа для двух или более аллелей HLA I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления два или более аллеля HLA I класса и/или II класса включают в себя по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аллелей HLA I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат внутриклеточный домен. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды не секретируются. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды при экспрессии встраивают в клеточную мембрану. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды представляют собой растворимые комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды представляют собой нерастворимые комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает создание базы данных специфических к аллелям HLA пептидов. В некоторых вариантах осуществления аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является единственный аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса.

[10] В некоторых вариантах осуществления способ включает: предоставление популяции клеток, каждая из которых содержит одну или более клеток, содержащих меченный аффинным акцептором HLA, причем меченный аффинным акцептором HLA содержит другой рекомбинантный полипептид, кодируемый другим аллелем HLA, функционально связанным с аффинным пептидом-акцептором; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и получение характеристик пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения.

[11] В некоторых вариантах осуществления способ включает введение одного или более пептидов в популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одним или более пептидами или экспрессию одного или более пептидов в популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими одна или более пептидов. В некоторых вариантах осуществления одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов, является ДНК. В некоторых вариантах осуществления одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов, является РНК, необязательно при этом РНК является мРНК. В некоторых вариантах осуществления обогащение не включает в себя использование тетрамерного реагента.

[12] В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя определение последовательности пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения, необязательно определение, является ли пептид или его часть модифицированной. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя биохимический анализ, масс-спектрометрический анализ, MS анализ, MS/MS анализ, анализ LC-MS/MS или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя оценку аффинности связывания или стабильности пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя определение, содержит ли пептид или его часть, связанная с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения, одну или более мутаций. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя оценку связей пептидов с молекулами HLA в комплексах меченные аффинным акцептором HLA-пептиды.

[13] В некоторых вариантах осуществления способ включает экспрессию библиотеки пептидов в популяции клеток, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение в контакт с популяцией клеток библиотеки пептидов или библиотеки последовательностей, кодирующих пептиды, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой библиотеку пептидов, связанных с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой библиотеку пептидов, полученных из полипептидного лекарственного средства, такого как биологическое (например, содержащее антитела лекарственное средство).

[14] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак, заражение возбудителем инфекции или аутоиммунную реакцию. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение возбудителя инфекции или его частей в одну или более клеток популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение полипептидного лекарственного средства, такого как биологическое (например, содержащее антитела лекарственное средство) или его частей в одну или более клеток популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одного или более пептидов из комплексов HLA-пептиды, при этом необязательно, чтобы пептиды происходили из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции или полипептидного лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одной или более областей пептидов из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции или полипептидного лекарственного средства.

[15] В некоторых вариантах осуществления способ включает идентификацию пептидов из комплексов HLA-пептиды, полученных из возбудителя инфекции. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток происходит из биологического образца у субъекта с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция первичных клеток. В некоторых вариантах осуществления аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса соответствует субъекту с заболеванием или состоянием.

[16] В некоторых вариантах осуществления пептид из комплекса меченный аффинным акцептором HLA-пептид способен активировать T-клетку у субъекта при презентации антигенпрезентирующей клеткой. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя сравнение комплексов HLA-пептиды из раковых клеток с комплексами HLA-пептиды из нераковых клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя множество популяций клеток, причем каждая популяция клеток экспрессирует другой аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления каждая популяция клеток множества находится в одном и том же или отдельном контейнере.

[17] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение пептидов из комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды перед получением характеристик. В некоторых вариантах осуществления комплекс HLA-пептид выделяют с использованием антитела против HLA. В некоторых случаях комплекс HLA-пептид с аффинной меткой или без нее выделяют с использованием антитела против HLA. В некоторых случаях растворимый HLA (sHLA) с аффинной меткой или без нее выделяют из среды клеточной культуры. В некоторых случаях растворимый HLA (sHLA) с аффинной меткой или без нее выделяют с использованием антитела против HLA. Например, HLA, такой как растворимый HLA (sHLA) с аффинной меткой или без нее, можно выделять с использованием гранулы или колонки, содержащей антитело против HLA. В некоторых вариантах осуществления пептиды выделяют с использованием антител против HLA. В некоторых случаях растворимый HLA (sHLA) с аффинной меткой или без нее выделяют с использованием антител против HLA. В некоторых случаях растворимый HLA (sHLA) с аффинной меткой или без нее выделяют с использованием колонки, содержащей антитело против HLA. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает удаление одной или более аминокислот на конце пептида, связанного с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид.

[18] В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция клеток с низкой экспрессией HLA клеточной поверхности I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток экспрессирует один или более аллелей эндогенного HLA. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса и аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса и нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, кодирует HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F и HLA-G. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, кодирует HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса выбирают из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса содержит α-цепь HLA II класса, β-цепь HLA II класса или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления каждая последовательность кодирует по меньшей мере два разных аллеля HLA I класса и/или II класса.

[19] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей другой аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления один или более из по меньшей мере двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей первый аффинный пептид-акцептор, и один или более из по меньшей мере двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей другой аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления каждый из по меньшей мере двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей другой аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей аффинную метку. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение по меньшей мере второй полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую другой аллель рекомбинантного HLA, функционально связанный с тем же самым или другим аффинным пептидом-акцептором.

[20] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор экспрессируется внеклеточно. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор находится на внеклеточной части аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с N-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внутриклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор экспрессируется внутриклеточно. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с C-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с внутренней последовательностью последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, такой как последовательность с гибкой петлей. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя обогащение интактных клеток, экспрессирующих комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ не включает лизирование клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает лизирование одной или более клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт молекулы связывания аффинного пептида-акцептора с комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем молекула связывания аффинного пептида-акцептора специфически связывается с аффинным пептидом-акцептором.

[21] В некоторых вариантах осуществления аффинный пептид-акцептор содержит последовательность метки, включающей в себя пептид-акцептор биотина (BAP), полигистидиновую метку, полигистидин-глициновую метку, полиаргининовую метку, полиаспартатную метку, полицистеиновую метку, полифенилаланин, метку c-myc, гликопротеиновую D (gD) метку вируса простого герпеса, метку FLAG, эпитопную метку KT3, тубулиновую эпитопную метку, пептидную метку белка 10 гена Т7, стрептавидиновую метку, метку стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метку, Strep-метку II, метку альбумин-связывающего белка (ABP), метку щелочной фосфатазы (AP), метку вируса катаральной лихорадки (B-метку), метку кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метку хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метку холин-связывающего домена (CBD), метку хитин-связывающего домена (CBD), метку целлюлозосвязывающего домена (CBP), метку дигидрофолатредуктазы (DHFR), метку галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансферазу (GST), метку Glu-Glu (EE), метку гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метку пероксидазы хрена (HA), NE-метку, метку HSV, метку кетостероид-изомеразы (KSI), метку KT3, метку LacZ, люциферазную метку, метку NusA, метку домена PDZ, AviTag, кальмодулиновую метку, E-метку, S-метку, SBP-метку, Softag 1, Softag 3, метку TC, VSV-метку, метку Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метку Profinity eXact, метку протеина C, S1-метку, S-метку, метку белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метку зеленого флуоресцентного белка (GFP), метку малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метку тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метку, метку Thioredoxin, Fc-метку, метку CYD, метку HPC, метку TrpE, убиквитиновую метку, эпитопную метку VSV-G, метку V5, сортазную метку, метку, образующую с гранулой ковалентную пептидную связь, или их комбинацию; необязательно при этом аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки.

[22] В некоторых вариантах осуществления молекулой связывания аффинного пептида-акцептора является биотин или антитело, специфическое к аффинному пептиду-акцептору. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение аффинной молекулы в контакт с комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем аффинная молекула специфически связывается с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора.

[23] В некоторых вариантах осуществления аффинная молекула представляет собой молекулу, которая связывается с биотином. Например, аффинная молекула может содержать стрептавидин, NeutrAvidin, включая белковые гомологи из других организмов и их производные.

[24] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления молекулу связывания аффинного пептида-акцептора присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления аффинную молекулу присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления твердой поверхностью является гранула. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора, которая специфически связывается с аффинным пептидом-акцептором.

[25] В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора не имеет специфического взаимодействия с аминокислотной последовательностью кодируемого рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к внеклеточной части аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к N-концевой части аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса.

[26] В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с полинуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления введение в контакт включает в себя трансфекцию или трансдукцию. В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с вектором, содержащим полинуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления вектором является вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления полинуклеиновую кислоту стабильно встраивают в геном популяции клеток.

[27] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая рекомбинантный HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β2 микроглобулин в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA I класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая рекомбинантный HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β-цепь HLA II класса, в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA II класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор.

[28] В некоторых вариантах осуществления второй аффинный пептид-акцептор отличается от первого аффинного пептида-акцептора, и его выбирают из группы, состоящей из пептида-акцептора биотина (BAP), полигистидиновой метки, полигистидин-глициновой метки, полиаргининовой метки, полиаспартатной метки, полицистеиновой метки, полифенилаланина, метки c-myc, гликопротеиновой D (gD) метки вируса простого герпеса, метки FLAG, эпитопной метки KT3, тубулиновой эпитопной метки, пептидной метки белка 10 гена Т7, стрептавидиновой метки, метки стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метки, Strep-метки II, метки альбумин-связывающего белка (ABP), метки щелочной фосфатазы (AP), метки вируса катаральной лихорадки (B-метки), метки кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метки хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метки холин-связывающего домена (CBD), метки хитин-связывающего домена (CBD), метки целлюлозосвязывающего домена (CBP), метки дигидрофолатредуктазы (DHFR), метки галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающего белка (MBP), глутатион-S-трансферазы (GST), метки Glu-Glu (EE), метки гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метки пероксидазы хрена (HA), NE-метки, HSV метки, метки кетостероид-изомеразы (KSI), метки KT3, метки LacZ, люциферазной метки, метки NusA, метки домена PDZ, AviTag, кальмодулиновой метки, E-метки, S-метки, SBP-метки, Softag 1, Softag 3, метки TC, VSV-метки, метки Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метки Profinity eXact, метки протеина C, S1-метки, S-метки, метки белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метки зеленого флуоресцентного белка (GFP), метки малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метки тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метки, метки Thioredoxin, Fc-метки, метки CYD, метки HPC, метки TrpE, убиквитиновой метки, эпитопной метки VSV-G, метки V5 и их комбинаций; необязательно при этом первый или второй аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки.

[29] В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность полинуклеиновой кислоты, кодирующую расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой элемент-участок ухода с рибосомы или участок внутренней посадки рибосомы (IRES). В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы или IRES расщепляется при экспрессии в клетках. В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы выбирают из группы, состоящей из F2A, T2A, P2A и E2A. В некоторых вариантах осуществления элемент IRES выбирают из общих клеточных или вирусных последовательностей IRES.

[30] В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя проведение биохимического анализа или масс-спектрометрии, такой как тандемная масс-спектрометрия. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя получение последовательности пептида, которая соответствует MS/MS спектрам одного или более пептидов, выделенных из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды из базы данных пептидов; при этом одна или более полученных последовательностей идентифицирует последовательность одного или более пептидов. В некоторых вариантах осуществления базой данных пептидов является база данных пептидов без специфичности к ферментам, например, база данных без модификации или база данных с модификацией. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает поиск в базе данных пептидов с использованием стратегии поиска в перевернутой базе данных. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является человеческая клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является мышиная клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия CHO. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия, выбранная из HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO и THP1.

[31] В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более цитокинами, ингибиторами контрольных точек, эпигенетически-активными лекарственными средствами, IFN-γ, средствами, которые изменяют процессинг антигенов (такими как ингибиторы пептидазы, ингибиторы протеосом и ингибиторы TAP) или их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют метаболический путь или состояние обмена веществ клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют клеточный протеом клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют или регулируют клеточную экспрессию или транскрипцию (например, AIRE или CREB-связывающий белок или его модуляторы) клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют или регулируют фактор транскрипции клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют или регулируют клеточную экспрессию или транскрипцию HLA клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют или регулируют клеточную экспрессию или транскрипцию протеома клеток.

[32] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя по меньшей мере 105 клеток, по меньшей мере 106 клеток или по меньшей мере 107 клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция дендритных клеток, макрофагов, раковых клеток или B-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя опухолевые клетки. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток вводят в контакт со средством перед выделением указанных комплексов HLA-пептиды из одной или более клеток. В некоторых вариантах осуществления указанным средством является воспалительный цитокин, химическое средство, вспомогательное средство, терапевтическое средство или радиация.

[33] В некоторых вариантах осуществления аллелем HLA является мутантный аллель HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аллель HLA, представляет собой штрихкодированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления анализ включает в себя секвенирование аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, обнаружение РНК аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, обнаружение белка аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления анализ экспрессии может включать в себя вестерн-блоттинг, сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS), масс-спектрометрию (MS), анализ гибридизации на микрочипах, анализ секвенирования РНК, анализ полимеразной цепной реакции, LAMP-анализ, анализ лигазной цепной реакции, саузерн блоттинг, нозерн блоттинг или иммуноферментный анализ (ELISA).

[34] В некоторых вариантах осуществления способ включает выполнение стадий способа для разных аллелей HLA. В некоторых вариантах осуществления каждый аллель HLA содержит уникальную штрихкодированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления каждая полинуклеиновая кислота, кодирующая другой аллель HLA, содержит уникальную штрихкодированную последовательность.

[35] В настоящем документе представлена база данных последовательностей специфически связывающих аллели HLA пептидов, полученная путем выполнения описанного в настоящем документе способа. В настоящем документе представлена комбинация двух или более баз данных последовательностей специфически связывающих аллели HLA пептидов, полученных путем многократного выполнения описанного в настоящем документе способа, каждый раз с использованием другого аллеля HLA. В настоящем документе представлен способ генерирования алгоритма прогнозирования для идентификации специфически связывающих аллели HLA пептидов, включающий обучение машины с помощью базы данных последовательностей описанных в данном документе пептидов или описанной в настоящем документе комбинации.

[36] В некоторых вариантах осуществления машина объединяет одну или более линейных моделей, методов опорных векторов, деревьев решений и нейронных сетей. В некоторых вариантах осуществления переменная, используемая для обучения машины, включает в себя одну или более переменных, выбранных из группы, состоящей из последовательности пептида, физических свойств аминокислот, физических свойств пептидов, уровня экспрессии исходного белка пептида в клетке, стабильности белка, скорости трансляции белка, сайтов убиквитинирования, скорости разрушения белка, эффективности трансляции из рибосомального профилинга, расщепляемости белка, локализации белка, мотивов белка-хозяина, которые облегчают транспортировку TAP, белок-хозяин подвергают аутофагии, мотивов, которые способствуют остановке рибосомы, и особенностей белков, которые способствуют NMD.

[37] В некоторых вариантах осуществления мотивы, которые способствуют остановке рибосомы, содержат полипролиновые или полилизиновые участки. В некоторых вариантах осуществления особенности белков, которые способствуют NMD, выбирают из группы, состоящей из длинного 3' UTR, стоп-кодона более 50 нуклеиновых кислот перед последним экзон:экзонным сочленением и расщепляемостью пептида.

[38] В настоящем документе представлен способ идентификации специфически связывающих аллели HLA пептидов, включающий проведение анализа последовательности пептида с помощью машины, которую обучили с помощью базы данных последовательностей пептидов, полученных путем выполнения описанного в настоящем документе способа для аллели HLA. В некоторых вариантах осуществления способ включает определение уровня экспрессии исходного белка пептида в клетке; и при этом экспрессия исходного белка является прогностической переменной, используемой машиной. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии определяют путем измерения количества исходного белка или количества РНК, кодирующей указанный исходный белок.

[39] В настоящем документе представлена композиция, содержащая рекомбинантную полинуклеиновую кислоту, содержащую две или более последовательности, каждая из которых кодирует меченный аффинным акцептором HLA, при этом последовательности, кодирующие меченные аффинным акцептором HLA, содержит последовательность, кодирующую другой аллель α-цепи рекомбинантного HLA I класса, последовательность, кодирующую аффинный пептид-акцептор, и необязательно, последовательность, кодирующую β2 микроглобулин; при этом последовательности (a) и (b) и необязательно (c) функционально связаны.

[40] В настоящем документе представлена композиция, содержащая рекомбинантную полинуклеиновую кислоту, содержащую две или более последовательности, каждая из которых содержит последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA, при этом последовательности, кодирующие меченные аффинным акцептором HLA, содержат последовательность, кодирующую аллель α-цепи рекомбинантного HLA II класса, последовательность, кодирующую аффинный пептид-акцептор, и необязательно, последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса; при этом последовательности (a) и (b) и необязательно (c) функционально связаны. В некоторых вариантах осуществления выделяют рекомбинантную полинуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F и HLA-G. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса выбирают из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP.

[41] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинную молекулу-акцептор, функционально связана с N-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей внутриклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с C-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей аллель рекомбинантного HLA посредством линкера.

[42] В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, экспрессируются из одного и того же полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, экспрессируются из разных полинуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор специфически связывается с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, содержат два или более аффинных пептида-акцептора. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, содержат три или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, причем по меньшей мере две из трех или более последовательностей, кодирующих меченный аффинным акцептором HLA, содержат один и тот же аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления два или более аффинных пептида-акцептора являются уникальными для каждой из двух или более последовательностей, кодирующих меченный аффинным акцептором HLA.

[43] В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор выбирают из группы, состоящей из пептида-акцептора биотина (BAP), полигистидиновой метки, полигистидин-глициновой метки, полиаргининовой метки, полиаспартатной метки, полицистеиновой метки, полифенилаланина, метки c-myc, гликопротеиновой D (gD) метки вируса простого герпеса, метки FLAG, эпитопной метки KT3, тубулиновой эпитопной метки, пептидной метки белка 10 гена Т7, стрептавидиновой метки, метки стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метки, Strep-метки II, метки альбумин-связывающего белка (ABP), метки щелочной фосфатазы (AP), метки вируса катаральной лихорадки (B-метки), метки кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метки хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метки холин-связывающего домена (CBD), метки хитин-связывающего домена (CBD), метки целлюлозосвязывающего домена (CBP), метки дигидрофолатредуктазы (DHFR), метки галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающего белка (MBP), глутатион-S-трансферазы (GST), метки Glu-Glu (EE), метки гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метки пероксидазы хрена (HA), NE-метки, HSV метки, метки кетостероид-изомеразы (KSI), метки KT3, метки LacZ, люциферазной метки, метки NusA, метки домена PDZ, AviTag, кальмодулиновой метки, E-метки, S-метки, SBP-метки, Softag 1, Softag 3, метки TC, VSV-метки, метки Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метки Profinity eXact, метки протеина C, S1-метки, S-метки, метки белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метки зеленого флуоресцентного белка (GFP), метки малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метки тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метки, метки Thioredoxin, Fc-метки, метки CYD, метки HPC, метки TrpE, убиквитиновой метки, эпитопной метки VSV-G, метки V5 и их комбинаций; необязательно при этом первый или второй аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки.

[44] В некоторых вариантах осуществления молекулой связывания аффинного пептида-акцептора является биотин или антитело, специфическое к аффинному пептиду-акцептору. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора специфически связывается с аффинной молекулой. В некоторых вариантах осуществления аффинной молекулой является стрептавидин, NeutrAvidin или их производное. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора не имеет специфического взаимодействия с аминокислотной последовательностью рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления для двух или более рекомбинантных полинуклеиновых кислот: последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA, стабильно встраивают в геном клетки. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин или последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления второй аффинный пептид-акцептор содержит метку HA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, или последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей рекомбинантный HLA и аффинный пептид-акцептор, посредством линкера.

[45] В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность полинуклеиновой кислоты, кодирующую расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой элемент-участок ухода с рибосомы или участок внутренней посадки рибосомы (IRES). В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы или IRES расщепляется при экспрессии в клетках. В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы выбирают из группы, состоящей из F2A, T2A, P2A и E2A. В некоторых вариантах осуществления элемент IRES выбирают из общих клеточных или вирусных последовательностей IRES.

[46] В настоящем документе представлена композиция, содержащая две или более выделенные полипептидные молекулы, кодируемые полинуклеиновой кислотой композиции, описанной в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая популяцию клеток, содержащих две или более полипептидные молекулы, кодируемые полинуклеиновой кислотой композиции, описанной в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая популяцию клеток, содержащих композицию, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая популяцию клеток, содержащих одну или более клеток, содержащих композицию, описанную в настоящем документе.

[47] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток экспрессирует один или более аллелей эндогенного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствует один или более аллелей эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствуют аллели эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствует один или более аллелей эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствуют аллели эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствует один или более аллелей эндогенного HLA I класса и один или более аллелей эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция клеток с низкой экспрессией HLA клеточной поверхности I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления составляют композицию с использованием пептидов или полинуклеиновых кислот, кодирующих пептиды, специфические к типу HLA пациента. В настоящем документе представлен способ получения клетки, включающий трансдукцию или трансфекцию двух или более клеток двумя или более полинуклеиновыми кислотами композиции, описанной в настоящем документе.

[48] В настоящем документе представлен пептид, идентифицированный согласно способу, описанному в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему клетки, содержащей пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему клетки, содержащей эффективное количество полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетка презентирует пептид в виде комплекса HLA-пептид. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, описанный в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе.

[49] В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является T-клеточный иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является CD8 T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является CD4 T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является гуморальный иммунный ответ.

[50] В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, описанный в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления заболеванием является рак. В некоторых вариантах осуществления заболеванием является заражение возбудителем инфекции. В некоторых вариантах осуществления возбудителем инфекции является патогенный микроорганизм, необязательно вирус или бактерия, или паразит.

[51] В некоторых вариантах осуществления вирус выбирают из группы, состоящей из: BK вируса (BKV), вирусов Денге (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), цитомегаловируса (CMV), вируса гепатита В (HBV), вируса гепатита С (HCV), вируса Эпштейна-Барра (EBV), аденовируса, вируса иммунодефицита человека (HIV), Т-клеточного лимфотрофического вируса человека (HTLV-1), вируса гриппа, RSV, HPV, бешенства, вируса паротита, краснухи, полиовируса, желтой лихорадки, гепатита A, гепатита B, ротавируса, вируса ветряной оспы, вируса папилломы человека (HPV), оспы, опоясывающего лишая и любой их комбинации.

[52] В некоторых вариантах осуществления бактерию выбирают из группы, состоящей из: видов Klebsiella, Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis и Mycobacterium tuberculosis, тифа, пневмококка, менингококка, haemophilus B, сибирской язвы, столбнячного токсина, менингококка группы B, bcg, холеры и любой их комбинации.

[53] В некоторых вариантах осуществления паразитом является гельминт или простейшие. В некоторых вариантах осуществления паразитирующий организм выбирают из группы, состоящей из: видов Leishmania, видов Plasmodium, Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, видов Schistosoma и любой их комбинации.

[54] В настоящем документе представлен способ обогащения иммуногенных пептидов, включающий: предоставление популяции клеток, содержащей одну или более клеток, экспрессирующих меченный аффинным акцептором HLA, причем меченный аффинным акцептором HLA содержит аффинный пептид-акцептор, функционально связанный с рекомбинантным HLA, кодируемым аллелем рекомбинантного HLA; и обогащение комплексов HLA-пептиды, содержащих меченный аффинным акцептором HLA. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает определение последовательности иммуногенных пептидов, выделенных из комплексов HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя использование LC-MS/MS.

[55] В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, описанный в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества клеток, содержащих пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту клетки, содержащей эффективное количество полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе.

[56] В настоящем документе представлен способ разработки терапевтического средства для субъекта с заболеванием или состоянием, включающий предоставление популяции клеток, полученных у субъекта с заболеванием или состоянием, экспрессию в одной или более клетках популяции клеток аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса путем введения в одну или более клеток полинуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, содержащую: последовательность, кодирующую аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды в одной или более клетках; обогащение и получение характеристик комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и, необязательно, разработку терапевтического средства на основании полученной характеристики.

[57] В настоящем документе представлен способ идентификации по меньшей мере одного специфического для субъекта иммуногенного антигена и получение специфической для субъекта иммуногенной композиции, которая содержит по меньшей мере один специфичный для субъекта иммуногенный антиген, в котором субъект имеет заболевание, а по меньшей мере один специфичный для субъекта иммуногенный антиген является специфическим для субъекта и заболевания субъекта, причем указанный способ включает: предоставление популяции клеток, полученных у субъекта с заболеванием или состоянием, экспрессию в одной или более клетках популяции клеток у субъекта аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса путем введения в одну или более клеток полинуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, содержащую: последовательность, кодирующую аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды в одной или более клетках; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды из одной или более клеток; идентификацию иммуногенного пептида из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, который является специфическим для субъекта и заболевания субъекта; и составление специфической для субъекта иммуногенной композиции на основании одного или более специфичных для субъекта иммуногенных идентифицированных пептидов.

[58] В некоторых вариантах осуществления терапевтическая или специфическая для субъекта иммуногенная композиция содержит пептид из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды или полинуклеотид, кодирующий полипептид из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления терапевтическая или специфическая для субъекта иммуногенная композиция содержит T-клетку, экспрессирующую T-клеточный рецептор (TCR), который специфически связывается с полипептидом из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления специфическая для субъекта иммуногенная композиция содержит химерный рецептор антигена (CAR), T-клетку, экспрессирующую рецептор, который специфически связывается с полипептидом из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды.

[59] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту еще одного терапевтического средства, необязательно, ингибитора иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту вспомогательного средства, необязательно, поли-ICLC.

[60] В некоторых вариантах осуществления заболеванием или расстройством является рак. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или расстройством является аутоиммунное заболевание. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или расстройством является заражение. В некоторых вариантах осуществления заражением является заражение возбудителем инфекции. В некоторых вариантах осуществления возбудителем инфекции является патогенный микроорганизм, вирус, бактерия или паразит.

[61] В некоторых вариантах осуществления вирус выбирают из группы, состоящей из: BK вируса (BKV), вирусов Денге (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), цитомегаловируса (CMV), вируса гепатита В (HBV), вируса гепатита С (HCV), вируса Эпштейна-Барра (EBV), аденовируса, вируса иммунодефицита человека (HIV), Т-клеточного лимфотрофического вируса человека (HTLV-1), вируса гриппа, RSV, HPV, бешенства, вируса паротита, краснухи, полиовируса, желтой лихорадки, гепатита A, гепатита B, ротавируса, вируса ветряной оспы, вируса папилломы человека (HPV), оспы, опоясывающего лишая и любой их комбинации.

[62] В некоторых вариантах осуществления бактерию выбирают из группы, состоящей из: видов Klebsiella, Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis и Mycobacterium tuberculosis, тифа, пневмококка, менингококка, haemophilus B, сибирской язвы, столбнячного токсина, менингококка группы B, bcg, холеры и их комбинации.

[63] В некоторых вариантах осуществления паразитом является гельминт или простейшие. В некоторых вариантах осуществления паразитирующий организм выбирают из группы, состоящей из: видов Leishmania, видов Plasmodium, Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, видов Schistosoma и любой их комбинации.

[64] В настоящем документе представлен способ разработки терапевтического средства для субъекта с заболеванием или состоянием, включающий: предоставление популяции клеток, причем одна или более клеток популяции клеток содержат полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую по меньшей мере два аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, причем последовательность, кодирующая по меньшей мере два меченных аффинным акцептором HLA I класса или II класса, содержит первую рекомбинантную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую первый аллель HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей первый аффинный пептид-акцептор; и вторую рекомбинантную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую второй аллель HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор; экспрессию по меньшей мере двух меченных аффинным акцептором HLA по меньшей мере в одной клетке из одной или более клеток популяции клеток, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды по меньшей мере в одной клетке; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и идентификацию пептида из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и составление иммуногенной композиции на основе одного или более идентифицированных пептидов, причем аллели первого и второго рекомбинантного HLA I класса или II класса совпадают с гаплотипом HLA субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание или состояние.

[65] В некоторых вариантах осуществления первый аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса отличается от аллеля второго рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления первый аффинный пептид-акцептор такой же, как второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик пептида, связанного с первым и/или вторым комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса включают в себя по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аллелей HLA I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат внутриклеточный домен. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды не экскретируют. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды при экспрессии встраивают в клеточную мембрану. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды представляют собой нерастворимые комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды.

[66] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает создание базы данных специфических к аллелям HLA пептидов. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение одного или более экзогенных пептидов в популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одним или более экзогенными пептидами или экспрессию одного или более экзогенных пептидов в популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более экзогенных пептидов.

[67] В некоторых вариантах осуществления одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов, является ДНК. В некоторых вариантах осуществления одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов, является РНК, необязательно при этом РНК является мРНК.

[68] В некоторых вариантах осуществления обогащение не включает в себя использование тетрамерного реагента. В некоторых вариантах осуществления способ включает определение последовательности пептида или его части, связанной с первым и/или вторым комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя биохимический анализ, масс-спектрометрический анализ, MS анализ, MS/MS анализ, анализ LC-MS/MS или их комбинацию.

[69] В некоторых вариантах осуществления способ включает оценку аффинности связывания или стабильности пептида или его части, связанной с первым и/или вторым комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления способ включает определение, содержит ли пептид или его часть, связанная с первым и/или вторым комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения, одну или более мутаций. В некоторых вариантах осуществления способ включает оценку связей пептидов с молекулами HLA в первом и/или втором комплексе меченный аффинным акцептором HLA-пептид.

[70] В некоторых вариантах осуществления способ включает экспрессию библиотеки пептидов в популяции клеток, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение в контакт с популяцией клеток библиотеки пептидов или библиотеки последовательностей, кодирующих пептиды, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой библиотеку пептидов, связанных с заболеванием или состоянием.

[71] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак или заражение возбудителем инфекции. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение возбудителя инфекции или его частей в одну или более клеток популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одного или более пептидов из первого и/или второго комплексов HLA-пептиды, при этом необязательно, чтобы пептиды происходили из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одной или более областей пептидов из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции. В некоторых вариантах осуществления способ включает идентификацию пептидов из первого и/или второго комплексов HLA-пептиды, полученных из возбудителя инфекции.

[72] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток происходит из биологического образца у субъекта с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция первичных клеток. В некоторых вариантах осуществления пептид из первого и/или второго комплекса меченный аффинным акцептором HLA-пептид способен активировать T-клетку у субъекта при презентации антигенпрезентирующей клеткой. В некоторых вариантах осуществления способ включает сравнение комплексов HLA-пептиды из пораженных клеток с комплексами HLA-пептиды из непораженных клеток. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение пептидов из первого и/или второго комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды перед идентификацией. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция клеток с низкой экспрессией HLA клеточной поверхности I класса или II класса.

[73] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток экспрессирует один или более аллелей эндогенного HLA. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток экспрессирует аллели эндогенного HLA, обычно экспрессируемые популяцией клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса и аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса и нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая по меньшей мере два аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, кодирует HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F и HLA-G. В некоторых вариантах осуществления первым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является первый аллель HLA I класса, а вторым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является второй аллель HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая по меньшей мере два аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, кодирует HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса выбирают из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса содержит α-цепь HLA II класса, β-цепь HLA II класса или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления первым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является первый аллель HLA II класса, а вторым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является второй аллель HLA II класса.

[74] В некоторых вариантах осуществления каждая из первой последовательности и второй последовательности функционально связаны. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность и вторая последовательность находятся в разных полинуклеотидных молекулах. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть первого и/или второго аллеля HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй кодируемый аффинный пептид-акцептор экспрессируется внеклеточно. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аффинный пептид-акцептор, функционально связана с N-концом последовательности, кодирующей первый и/или второй аллель HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внутриклеточную часть первого и/или второго аллеля HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления кодируемый первый и/или второй аффинный пептид-акцептор экспрессируется внутриклеточно. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аффинный пептид-акцептор, функционально связана с C-концом последовательности, кодирующей первый и/или второй аллель HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей первый и/или второй аллель HLA I класса или II класса, посредством линкера.

[75] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя обогащение интактных клеток, экспрессирующих первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ не включает лизирование клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает лизирование одной или более клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт молекулы связывания аффинного пептида-акцептора с первым и/или вторым комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем молекула связывания аффинного пептида-акцептора специфически связывается с первым и/или вторым аффинным пептидом-акцептором.

[76] В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй аффинный пептид-акцептор содержит последовательность метки, включающей в себя пептид-акцептор биотина (BAP), полигистидиновую метку, полигистидин-глициновую метку, полиаргининовую метку, полиаспартатную метку, полицистеиновую метку, полифенилаланин, метку c-myc, гликопротеиновую D (gD) метку вируса простого герпеса, метку FLAG, эпитопную метку KT3, тубулиновую эпитопную метку, пептидную метку белка 10 гена Т7, стрептавидиновую метку, метку стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метку, Strep-метку II, метку альбумин-связывающего белка (ABP), метку щелочной фосфатазы (AP), метку вируса катаральной лихорадки (B-метку), метку кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метку хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метку холин-связывающего домена (CBD), метку хитин-связывающего домена (CBD), метку целлюлозосвязывающего домена (CBP), метку дигидрофолатредуктазы (DHFR), метку галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансферазу (GST), метку Glu-Glu (EE), метку гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метку пероксидазы хрена (HA), NE-метку, метку HSV, метку кетостероид-изомеразы (KSI), метку KT3, метку LacZ, люциферазную метку, метку NusA, метку домена PDZ, AviTag, кальмодулиновую метку, E-метку, S-метку, SBP-метку, Softag 1, Softag 3, метку TC, VSV-метку, метку Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метку Profinity eXact, метку протеина C, S1-метку, S-метку, метку белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метку зеленого флуоресцентного белка (GFP), метку малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метку тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метку, метку Thioredoxin, Fc-метку, метку CYD, метку HPC, метку TrpE, убиквитиновую метку, эпитопную метку VSV-G, метку V5 или их комбинацию; необязательно при этом первый и/или второй аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки.

[77] В некоторых вариантах осуществления молекулой связывания аффинного пептида-акцептора является биотин или антитело, специфическое к первому и/или второму аффинному пептиду-акцептору. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение аффинной молекулы в контакт с первым и/или вторым комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем аффинная молекула специфически связывается с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора. В некоторых вариантах осуществления аффинной молекулой является стрептавидин, NeutrAvidin или их производное. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию первого и/или второго комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды.

[78] В некоторых вариантах осуществления молекулу связывания аффинного пептида-акцептора присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления аффинную молекулу присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления твердой поверхностью является гранула.

[79] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию первого и/или второго комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора, которая специфически связывается с первым и/или вторым аффинным пептидом-акцептором. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора не имеет специфического взаимодействия с аминокислотной последовательностью кодируемого первого и/или второго HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к внеклеточной части первого и/или второго аллеля HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к N-концевой части первого и/или второго аллеля HLA I класса или II класса.

[80] В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с полинуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления введение в контакт включает в себя трансфекцию или трансдукцию. В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с вектором, содержащим полинуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления вектором является вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления полинуклеиновую кислоту стабильно встраивают в геном популяции клеток.

[81] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления первым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является α-цепь первого HLA I класса, а вторым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является α-цепь второго HLA I класса.

[82] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β2 микроглобулин в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей первый и/или второй HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей первый и/или второй HLA I класса или II класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей третий аффинный пептид-акцептор.

[83] В некоторых вариантах осуществления третий аффинный пептид-акцептор отличается от первого и/или второго аффинного пептида-акцептора. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA II класса и/или β-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь первого HLA II класса и α-цепь второго HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β-цепь HLA II класса, в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую α-цепь первого HLA II класса и α-цепь второго HLA II класса HLA, связывают с последовательностью, кодирующей β-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую β-цепь первого HLA II класса и β-цепь второго HLA II класса.

[84] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей α-цепь HLA II класса, в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь первого HLA II класса и β-цепь второго HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA II класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса или α-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей третий аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления третий аффинный пептид-акцептор отличается от первого и/или второго аффинного пептида-акцептора.

[85] В некоторых вариантах осуществления третий аффинный пептид-акцептор отличается от первого аффинного пептида-акцептора, и его выбирают из группы, состоящей из пептида-акцептора биотина (BAP), полигистидиновой метки, полигистидин-глициновой метки, полиаргининовой метки, полиаспартатной метки, полицистеиновой метки, полифенилаланина, метки c-myc, гликопротеиновой D (gD) метки вируса простого герпеса, метки FLAG, эпитопной метки KT3, тубулиновой эпитопной метки, пептидной метки белка 10 гена Т7, стрептавидиновой метки, метки стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метки, Strep-метки II, метки альбумин-связывающего белка (ABP), метки щелочной фосфатазы (AP), метки вируса катаральной лихорадки (B-метки), метки кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метки хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метки холин-связывающего домена (CBD), метки хитин-связывающего домена (CBD), метки целлюлозосвязывающего домена (CBP), метки дигидрофолатредуктазы (DHFR), метки галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающего белка (MBP), глутатион-S-трансферазы (GST), метки Glu-Glu (EE), метки гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метки пероксидазы хрена (HA), NE-метки, HSV метки, метки кетостероид-изомеразы (KSI), метки KT3, метки LacZ, люциферазной метки, метки NusA, метки домена PDZ, AviTag, кальмодулиновой метки, E-метки, S-метки, SBP-метки, Softag 1, Softag 3, метки TC, VSV-метки, метки Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метки Profinity eXact, метки протеина C, S1-метки, S-метки, метки белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метки зеленого флуоресцентного белка (GFP), метки малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метки тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метки, метки Thioredoxin, Fc-метки, метки CYD, метки HPC, метки TrpE, убиквитиновой метки, эпитопной метки VSV-G, метки V5 и их комбинаций; необязательно при этом первый или второй аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки.

[86] В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность полинуклеиновой кислоты, кодирующую расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой элемент-участок ухода с рибосомы или участок внутренней посадки рибосомы (IRES). В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы или IRES расщепляется при экспрессии в клетках. В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы выбирают из группы, состоящей из F2A, T2A, P2A и E2A. В некоторых вариантах осуществления элемент IRES выбирают из общих клеточных или вирусных последовательностей IRES.

[87] В некоторых вариантах осуществления способ включает проведение биохимического анализа или масс-спектрометрии, такой как тандемная масс-спектрометрия. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение последовательности пептида, которая соответствует MS/MS спектрам одного или более пептидов, выделенных из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды из базы данных пептидов; при этом одна или более полученных последовательностей идентифицирует последовательность одного или более пептидов.

[88] В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия, выбранная из HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO и THP1. В некоторых вариантах осуществления клеточную линию обрабатывают одним или более цитокинами, ингибиторами контрольных точек, эпигенетически-активными лекарственными средствами, IFN-γ или их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя по меньшей мере 105 клеток, по меньшей мере 106 клеток или по меньшей мере 107 клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция дендритных клеток, макрофагов, раковых клеток или B-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя опухолевые клетки.

[89] В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток вводят в контакт со средством перед выделением первого и/или второго комплексов HLA-пептиды из одной или более клеток. В некоторых вариантах осуществления средством является воспалительный цитокин, химическое средство, вспомогательное средство, терапевтическое средство или радиация.

[90] В некоторых вариантах осуществления первым и/или вторым аллелем HLA является мутантный аллель HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аллель HLA, содержит штрихкодированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии первого и/или второго аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса.

[91] В некоторых вариантах осуществления анализ включает в себя секвенирование первого и/или второго аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, обнаружение РНК, кодирующей РНК первого и/или второго аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, обнаружение белка первого и/или второго аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления первый и второй аллель меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса содержит уникальную штрихкодированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность и вторая последовательность содержат уникальную штрихкодированную последовательность.

Краткое описание чертежей

[92] Признаки настоящего раскрытия подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Более хорошее понимание признаков и преимуществ настоящего раскрытия будет получено посредством ссылки на следующее подробное описание, в котором изложены иллюстративные варианты осуществления, в которых использованы принципы раскрытия, и сопровождающие чертежи, на которых:

[93] на фиг. 1A представлена типичная схема конвейера для универсальной иммуноаффинной очистки и генерирования данных. Молекулы HLA I класса и/или II класса вводят в любую клетку, включая клетку, не экспрессирующую HLA I класса или II класса, чтобы экспрессировать в клетке конкретный аллель (аллели) HLA I класса или II класса. Популяции генетически сконструированных экспрессирующих HLA клеток собирают, лизируют, и их комплексы HLA-пептиды метят (например, биотинилируют) и очищают иммуноаффинным методом (например, с использованием взаимодействия биотин-стрептавидин). Связанные с HLA пептиды, специфические к одному HLA, можно элюировать из их меченых (например, биотинилированных) комплексов и оценивать (например, секвенировать с использованием LC-MS/MS высокого разрешения).

[94] на фиг. 1B представлена схема структур молекул HLA II класса -DP, -DQ и -DR. Молекулы HLA-DR представляют собой гетеродимеры, содержащие константную α-цепь и вариабельную β-цепь. Молекулы HLA-DQ и HLA-DP представляют собой гетеродимеры, содержащие вариабельные α-цепи и вариабельные β-цепи.

[95] на фиг. 2 представлена типичная схема конструкций, разработанных для экспрессии HLA I и II класса в культивируемых клеточных линиях. Конструкции HLA-A*02:01 представляют собой конструкцию HLA I класса, в которой реализованы пептиды-акцепторы биотина (BAP) для биотинилирования и иммуноаффинной очистки. Конструкции HLA-DRB1*11:01 представляют собой конструкцию HLA II класса, в которой реализованы пептиды-акцепторы биотина (BAP) для биотинилирования и иммуноаффинной очистки.

[96] на фиг. 3 представлена схема иллюстративного лентивирусного вектора, который можно использовать для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих конструкции HLA I класса и II класса.

[97] на фиг. 4A представлена типичная схема основанного на трансфекции ввода конструкции HLA I класса или II класса для универсальной IP и секвенирования связанного c HLA пептида посредством LC-MS/MS.

[98] на фиг. 4B представлена типичная схема основанного на трансфекции ввода конструкций HLA I класса или II класса с последующим процессом отбора, например, включения гена устойчивости к антибиотикам. Затем отобранные клетки можно предоставить для универсальной IP и секвенирования связанного c HLA пептида посредством LC-MS/MS.

[99] на фиг. 5 представлена схема универсальной иммуноаффинной очистки для HLA I класса и II класса. Клетки, такие как HEK293T (первичная почка человека), либо трансфицируют, либо трансдуцируют для экспрессии одного аллеля HLA I класса или II класса с аффинной меткой для иммуноаффинной очистки. Меченные HLA экспрессирующие клетки собирают, лизируют, и их комплексы HLA-пептиды биотинилируют и очищают иммуноаффинным методом с использованием взаимодействия биотин-стрептавидин. Связанные с HLA пептиды, специфические к одному HLA, элюируют из их биотинилированных комплексов и анализируют (например, секвенируют с использованием LC-MS/MS высокого разрешения).

[100] на фиг. 6A представлен вестерн-блоттинг (антибиотинилирование), сравнивающий трансфекции с имитацией, GFP и пустой плазмидой с конструкциями HLA-A*02:01 для иммунопреципитации на основе биотинилирования, демонстрирующими экспрессию аллелей HLA I класса в клетках HEK293T.

[101] на фиг. 6B представлен окрашенный гель Понсо, используемый в качестве контроля качества переноса для вестерн-блоттинга.

[102] на фиг. 6C представлено схематичное изображение конструкций HLA I класса, используемых для создания сконструированных клеток HEK293T, изображенных на фиг. 6A и фиг. 6B.

[103] на фиг. 7A представлены изображения вестерн-блоттинга (сверху) и контроля качества переноса (внизу) эксперимента по определению зависимости биотинилирования от времени, демонстрирующие что биотинилирование HLA-BAP с меченными C- и N-концами завершается за 10 минут для клеток, экспрессирующих HLA-BAP как I класса, так и II класса. Результаты показывают оптимизацию трансфекции и биотинилирования аллелей HLA-BAP I класса и II класса, экспрессируемых клетками HEK293T.

[104] на фиг. 7B представлен вестерн-блоттинг против анти-BAP (сверху) и контроля качества переноса (внизу) из клеток, экспрессирующих конструкции HLA I класса и II класса с меченными BAP и N- и C-концами.

[105] на фиг. 7C представлено схематичное изображение конструкций (HLA-A*02:01) I класса и (HLA-DRβ*11:01) II класса, с меченными BAP и N- и C-концами, используемых для оптимизации трансфекции и биотинилирования.

[106] на фиг. 8A представлено изображение вестерн-блоттинга (анти-стрептавидин для метки BAP и анти-HA для метки HA) и контроля качества переноса (Понсо S), показывающее экспрессию биотинилированных конструкций HLA I класса и II класса, используемых для иммунопреципитации HLA в клетках HEK293T. Лизаты анализировали перед добавлением биотина (-Биотин), после добавления биотина (+Ввод Биотина) и после биотинилирования и последующего удаления со стрептавидиновыми гранулами (+Биотин FT). уменьшение сигнала в полосе +Биотин FT демонстрирует, что биотинилированный MHC удален из лизата, и связывание со стрептавидиновыми гранулами.

[107] на фиг. 8B представлено изображение вестерн-блоттинга (анти-стрептавидин для метки BAP и анти-HA для метки HA) и контроля качества переноса (Понсо S), показывающее экспрессию биотинилированных конструкций HLA I класса и II класса, используемых для иммунопреципитации HLA в клетках HeLa (рака шейки матки человека). Лизаты анализировали перед добавлением биотина (-Биотин), после добавления биотина (+Ввод Биотина), и после биотинилирования и последующего удаления со стрептавидиновыми гранулами (+Биотин FT). уменьшение сигнала в полосе +Биотин FT демонстрирует, что биотинилированный MHC удален из лизата, и связывание со стрептавидиновыми гранулами.

[108] на фиг. 8C представлено изображение вестерн-блоттинга (анти-стрептавидин для метки BAP и анти-HA для метки HA) и контроля качества переноса (Понсо S), показывающее экспрессию биотинилированных конструкций HLA I класса и II класса, используемых для иммунопреципитации HLA в клетках A375 (злокачественная меланома человека). Лизаты анализировали перед добавлением биотина (-Биотин), после добавления биотина (+Ввод Биотина) и после биотинилирования и последующего удаления со стрептавидиновыми гранулами (+Биотин FT). уменьшение сигнала в полосе +Биотин FT демонстрирует, что биотинилированный MHC удален из лизата, и связывание со стрептавидиновыми гранулами.

[109] на фиг. 8D представлено изображение вестерн-блоттинга (анти-стрептавидин для метки BAP и анти-HA для метки HA) и контроля качества переноса (Понсо S), показывающее экспрессию биотинилированных конструкций HLA I класса и II класса, используемых для иммунопреципитации HLA в клетках Expi293 (первичная почка человека, генетически сконструированная для культуры высокой плотности и экспрессии белка). Лизаты анализировали перед добавлением биотина (-Биотин), после добавления биотина (+Ввод Биотина), и после биотинилирования и последующего удаления со стрептавидиновыми гранулами (+Биотин FT). уменьшение сигнала в полосе +Биотин FT демонстрирует, что биотинилированный MHC удален из лизата, и связывание со стрептавидиновыми гранулами.

[110] на фиг. 9A представлена гистограмма иллюстративного анализа LC-MS/MS связанных с HLA пептидов, выделенных с использованием конвейера для универсальной иммунопреципитации HLA (универсальной IP). Показано изображение на графике в виде столбцов общего количества уникальных связанных с HLA пептидов, идентифицированных из множества типов клеток (A375; серый, HEK293T; оранжевый, HeLa; синий), которые экспрессируют аффинные меченные конструкции HLA I класса и II класса, используемые в конвейере для универсальной IP.

[111] на фиг. 9B представлен график в виде столбцов, показывающий репрезентативные данные в результате получения профиля пептида моноаллельного HLA I класса посредством LC-MS/MS. Каждый столбец представляет общее количество уникальных связанных с HLA пептидов, идентифицированных в результате экспериментов с моноаллелями I класса с использованием аффинных меченных конструкций HLA.

[112] на фиг. 9C представлен график в виде столбцов, показывающий репрезентативные данные в результате получения профиля пептида моноаллельного HLA II класса посредством LC-MS/MS. Каждый столбец представляет общее количество уникальных связанных с HLA пептидов, идентифицированных в результате экспериментов с моноаллелями II класса с использованием аффинных меченных конструкций HLA.

[113] на фиг. 10A представлена иллюстративная схема характеристик связанных с HLA пептидов I класса и II класса, обнаруженных с использованием конвейера для универсальной IP. Показано иллюстративное изображение лигатуры последовательностей пептидов, связанных с HLA-A*02:01 I класса, и пептидов, связанных с HLA-DRβ*11:01 II класса, выделенных и секвенированных с использованием платформы универсальной IP.

[114] на фиг. 10B представлена гистограмма, показывающая сравнение распределения длины пептидов, связанных c HLA I класса (красный; HLA-A*02:01) и II класса (синий; HLA-DRβ*11:01), причем связанные с HLA пептиды идентифицированы с использованием конвейера для универсальной IP. Распределения длины связанных с HLA пептидов как I класса, так и II класса, идентифицированных с использованием универсальной IP, соответствует ожидаемым тенденциям.

[115] на фиг. 11A представлено схематичное изображение конструкций HLA II класса, которые были сконструированы для экспрессии клетками разных типов для конвейера для универсальной IP.

[116] на фиг. 11B представлено схематичное изображение комплексов HLA II класса, которые могут образовываться при экспрессии конструкции, показанной на фиг. 11A, в клеточных линиях, экспрессирующих субъединицы α-цепи и β-цепи эндогенного HLA II класса. Комплексы HLA II класса образуют путем спаривания α-цепи и β-цепи, каждую из которых метят маркерами разной аффинности.

[117] на фиг. 12A представлено схематичное изображение стратегии серийной универсальной IP, которую можно использовать для деконволюции спаривания α-цепи и β-цепи HLA II класса, изображенных на фиг. 11B и однозначных назначений связывания пептидов конкретным комплексам HLA II класса, и которая демонстрирует подтверждение серийной универсальной IP комплексов HLA II класса, содержащих множество аффинных меток. Клетки, экспрессирующие конструкции HLA II класса с меткой двойной аффинности, лизируют, биотинилируют и инкубируют с гранулами, связанными с антителами против HA. Комплексы HLA II класса с меченными HA субъединицами выделяют, промывают и элюируют с использованием пептида HA (например, YPYDVPDYA). Затем элюат инкубируют с гранулами, связанными либо с NeutrAvidin, либо со стрептавидином, для выделения меченных HA и меченных биотином комплексов HLA II класса. Затем пептиды, связанные с комплексами HLA II класса с двойной меткой, элюируют и секвенируют посредством LC-MS/MS.

[118] на фиг. 12B представлена проверка с помощью вестерн-блоттинга стратегии серийной универсальной IP в HEK293T, экспрессирующих конструкции HLA-DRB*11:01 с двойной меткой. Антитело против HA использовали для процесса серийного обогащения. Показан контроля качества переноса (Понсо S окрашенный гель).

[119] на фиг. 12C представлены результаты иллюстративного эксперимента с отрицательным контролем, когда клетки, экспрессирующие конструкцию HLA-DRB*11:01 HLA II класса с меткой двойной аффинности, лизировали и инкубировали с гранулами, связанными с антителами против HA без биотинилирования. Показаны вестерн-блоттинг и контроль качества переноса (Понсо S окрашенный гель) для демонстрации специфичности конвейера для серийной универсальной IP. Когда из протокола серийной универсальной IP исключали стадию биотинилирования, обогащение не наблюдалось.

[120] на фиг. 13 представлено схематичное изображение обзорных экспериментов по обрезанию HLA II класса, которые обеспечивают идентификацию связывающих коровую часть эпитопов. Молекулы HLA II класса связывают вложенные множества пептидов, обычно с длиной 12-18 аминокислот, которые генерируют из одного и того же исходного белка. Более длинные пептиды висят на N- и C-концевых сторонах молекул HLA II класса, тогда как коровой эпитоп наиболее сильно взаимодействует с бороздкой связывания пептида. Пептиды, связанные с молекулами HLA II класса, обрезают с использованием пептидазы, специфической к N- и C-концевым областям. После обрезания, коровые пептидные эпитопы секвенируют с использованием LC-MS/MS.

[121] на фиг. 14A представлено схематичное изображение подхода к получению профиля моноаллельного пептидома HLA, при котором исполняют биотиновую аффинную метку. В иллюстративном варианте осуществления настоящего раскрытия осуществляют использование пептида-акцептора биотина (BAP), который биотинилируют на лизиновом (K) остатке с помощью фермента BirA. Последовательность пептида BAP содержит лизиновый остаток, который биотинилируют при добавлении фермента BirA, биотина и ATP. Биотинилированный продукт демонстрирует высокую аффинность к стрептавидину/NeutrAvidin. Гранулы стрептавидина/NeutrAvidin можно использовать для обогащения биотинилированной последовательности пептида BAP.

[122] на фиг. 14B представлено схематичное изображение иммуноаффинной очистки на основе биотина генетически сконструированных молекул HLA. Конкретный аллель HLA с последовательностью BAP либо на N-, либо на C-конце белка HLA вводят в клетку, например, путем трансфекции или трансдукции плазмиды. Следует заметить, что плазмида содержит штрихкод ДНК, который позволяет методом ПЦР контролировать клеточную линию для каждого аллеля. длина штрихкода может составлять по меньшей мере 5 пар оснований, по меньшей мере 10 пар оснований, по меньшей мере 15 пар оснований, по меньшей мере 20 пар оснований или более. Клетки, экспрессирующие белки HLA-BAP, лизируют и биотинилируют. Комплексы HLA-BAP-пептид очищают иммуноаффинным методом от смеси лизатов комплекса, которые можно подвергать анализу LC-MS/MS для идентификации пептидов.

[123] на фиг. 15 представлено схематичное изображение иллюстративного применения платформы универсальной IP для проверки и обнаружения эпитопа-мишени. Интересующая клеточная линия сконструирована для экспрессии конструкции аллель-специфического меченного (например, BAP) HLA. Клетки, экспрессирующие меченные (например, BAP) молекулы HLA, генетически сконструированы для экспрессии одного эпитопа или множества эпитопов. Экспрессирующие эпитоп клетки лизируют, и комплексы HLA-BAP-пептид очищают иммуноаффинным методом. Выделенные пептидные антигены можно исследовать с помощью любого подходящего средства, например, секвенировать посредством LC-MS/MS, а фрагменты пептидов, полученные из введенных эпитопов, можно использовать в качестве высокопроизводительного считывания для процессинга и презентации соответствующих аллелям HLA антигенов.

[124] на фиг. 16 представлено схематичное изображение мультиплексирования аллелей HLA в конвейере для универсальной IP. Из одной конструкции HLA можно экспрессировать множество аллелей I класса и II класса. Например, в конструкции I класса может содержаться множество тяжелых цепей, а в конструкции II класса может содержаться множество β- и/или α-цепей. За счет мультиплексирования аллелей HLA в одной конструкции, множество молекул HLA можно доставлять и экспрессировать в интересующей клеточной линии. Мультиплексирование аллелей обеспечивает соответствие типам HLA пациента и считывания персонализированных пептидных антигенов с применением конвейера для универсальной IP и последующего анализа комплексов и/или пептидов, например, считывание LC-MS/MS.

[125] на фиг. 17 представлены схемы многоаллельных и моноаллельных подходов при получении профиля лиганда HLA. В многоаллельном подходе лиганды HLA подвергают совместной иммунопреципитации с гетеродимерами HLA непосредственно из материала или клеточных линий пациентов (сверху). Поскольку эти клетки естественным образом экспрессировали множество аллелей HLA, пептиды, идентифицированные в результате таких многоаллельных подходов, необходимо развернуть для назначения связывания конкретному гетеродимеру HLA, если известны типы HLA. В моноаллельном подходе лиганды HLA подвергают совместной иммунопреципитации с гетеродимерами HLA из клеточных линий, генетически модифицированных для экспрессии только одного аллеля HLA (внизу). Таким образом, пептидам, идентифицированным в результате моноаллельных подходов, не требуется деконволюция для назначения связывания гетеродимеру HLA.

[126] на фиг. 18A представлена схема, показывающая мутантный неоантигенный пептид, презентированный на MHC.

[127] на фиг. 18B представлен схематичный способ разработки персонализированной направленной на неоантиген терапии, которая описана в настоящем документе.

[128] на фиг. 19 представлена схема, показывающая разные экспериментальные подходы получения профиля разных лигандов HLA. Биохимический анализ связывания пептид:MHC (p:MHC) является медленным и с низкой пропускной способностью и не учитывает процессинг. Многоаллельная масс-спектрометрия обладает высокой пропускной способностью и способностью выучить правила процессинга; однако, для назначения пептидов аллелям требуется подстановка in silico. Моноаллельная масс-спектрометрия обеспечивает быстрый, непредвзятый и чистый подход для определения пептидсвязывающих мотивов в различных аллелях MHC. Моноаллельная масс-спектрометрия может быстро и систематически заполнять пробелы охвата аллелей и позволяет использовать преимущества длины аллель-специфических пептидов.

[129] на фиг. 20A представлена таблица иллюстративных связывающих HLA пептидов для аллелей A*01:01, B*51:01, A*29:02 и B*54:01, раскрытых с использованием моноаллельного подхода. Моноаллельный подход раскрывает связывающие HLA пептиды, которые плохо оценивать с помощью NetMHCpan, но которые биохимически подтверждены как сильные связующие элементы.

[130] на фиг. 20B представлена гистограмма, показывающая уровни неправильного назначения в 100 смоделированных деконволюциих. Получили генотип из шести случайных аллелей HLA пациента (по 2 аллеля каждого из HLA-A, HLA-B и HLA-C, взятых с частотой аллелей в США). Для каждого аллеля отобрали образцы 500 пептидов из соответствующего моноаллельного эксперимента и объединили с созданием набора имитированных данных по 3000 многоаллельным пептидам. Каждый пептид назначили аллелю, который дает наилучшее ранговое множество NetMHCpan%, для определения доли пептидов, неправильно назначенных NetMHCpan. Этот процесс повторяли 100 раз.

[131] на фиг. 21 представлена схематичная иллюстрация средства прогнозирования презентации MHC для различных индивидуальных аллелей MHC I класса с использованием данных MS. Обучение и оценку модели проводили на непересекающихся исходных белках. Наблюдаемые при MS пептиды назначают для обучения/тестирования в зависимости от исходного белка. В оценочном подходе используют избыток ловушек 5000:1 к истинным связующим элементам.

[132] на фиг. 22 представлена гистограмма, показывающая значительно улучшенные прогнозы как с точки зрения процессинга, так и аллель-специфического связывания.

Подробное описание

[133] Следующее описание и примеры подробно иллюстрируют варианты осуществления раскрытия. Следует понимать, что это раскрытие не ограничено конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе, и в связи с этим может изменяться. Специалисты в данной области должны понимать, что существует множество вариантов и модификаций этого раскрытия, которые попадают в его объем.

[134] Все термины следует понимать так, как их понял бы специалист в данной области. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимает рядовой специалист в области, к которой относится раскрытие.

[135] Заголовки разделов, используемых в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие предмет описания.

[136] Хотя различные признаки настоящего раскрытия могут быть описаны в контексте одного варианта осуществления, признаки также могут быть предоставлены отдельно или в любой подходящей комбинации. И наоборот, хотя для ясности настоящее раскрытие может быть описано в данном документе в контексте отдельных вариантов осуществления, раскрытие также может быть реализовано в одном варианте осуществления.

[137] Следующие определения дополняют определения в данной области техники и направлены на текущую заявку и не должны относиться к какому-либо связанному или не связанному случаю, например, к любому общедоступному патенту или заявке. Хотя на практике для тестирования настоящего раскрытия можно использовать любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, здесь описаны иллюстративные материалы и способы. Соответственно, используемая в данном документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.

Определения

[138] В этой заявке использование единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. Следует отметить, что, как используется в описании, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если в контексте явно не предписано иное. В данной заявке использование «или» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, использование термина «включающий», а также других форм, таких как «включать», «включает» и «включенный», не является ограничивающим.

[139] Термины «один или более» или «по меньшей мере один», такие как один или более или по меньшей мере один элемент (элементы) группы элементов, понятны сами по себе, посредством дополнительных примеров, среди прочего термин включает в себя ссылку на любой один из указанных элементов или на любые два или более из указанных элементов, такие как, например, любые ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 или ≥7 и т.д. Из указанных элементов и до всех указанных элементов.

[140] Ссылка в описании на «некоторые варианты осуществления», «вариант осуществления», «один вариант осуществления» или «другие варианты осуществления» означает, что признак, структура или характеристика, описанные в связи с вариантами осуществления, включены по меньшей мере в некоторые варианты осуществления, но не обязательно все варианты осуществления настоящего раскрытия.

[141] Как использовано в данном описании и пункте (пунктах) формулы изобретения, слова «содержащий» (и любая форма содержащий, такая как «содержат» и «содержит»), «имеющий» (и любая форма имеющий, такая как «иметь» и «имеет»), «включающий» (и любая форма включающий, например, «включает» и «включать») или «заключающий» (и любая форма заключающий, например, «заключает» и «заключать») являются включающими или открытыми и не исключают дополнительных, не перечисленных элементов или стадий метода. Предполагается, что любой вариант осуществления, обсуждаемый в этом описании, может быть реализован в отношении любого способа или композиции согласно раскрытию и наоборот. Кроме того, композиции согласно раскрытию можно использовать для достижения способов согласно раскрытию.

[142] Термин «примерно» или «приблизительно» в рамках настоящего изобретения, когда он относится к измеряемому значению, такому как параметр, количество, продолжительность времени и тому подобное, подразумевает охват вариантов +/-20% или менее, +/-10% или менее, +/-5% или менее, или +/-1% или менее указанного значения и от него, если такие варианты подходят для использвоания в настоящем раскрытии. Следует понимать, что также конрктно раскрыто само значение, к которому относится модификатор «примерно» или «приблизительно».

[143] Термин «иммунный ответ» включает в себя опосредованные T-клетками и/или опосредованные B-клетками иммунные ответы, на которые влияет модуляция костимуляции T-клеток. Иллюстративные иммунные ответы включают в себя T-клеточные ответы, например, выработку цитокинов, и клеточную цитотоксичность. Кроме того, термин иммунный ответ включает в себя иммунные ответы, на которые косвенно влияет активация T-клеток, например, выработка антител (гуморальные ответы) и активация чувствительных к цитокину клеток, например, макрофагов.

[144] «Рецептор» следует понимать в значении биологическая молекула или группа молекул, способных связывать лиганд. Рецептор может служить для передачи информации в клетке, клеточном образовании или организме. Рецептор содержит по меньшей мере одну рецепторную единицу и может содержать две или более рецепторные единицы, при этом каждая рецепторная единица может состоять из молекулы белка, например, молекулы гликопротеина. Рецептор имеет структуру, которая дополняет структуру лиганда и может образовывать комплекс лиганда в качестве партнера по связыванию. После связывания с лигандом на поверхности клетки конформоционные изменения рецептора могут передавать сигнальную информацию. Согласно настоящему раскрытию рецептор может относиться к белкам MHC I и II классов, способным образовывать с лигандом комплекс рецептор/лиганд, например, к пептиду или фрагменту пептида подходящей длины.

[145] «Штрихкодированной» последовательностью может быть последовательность нуклеиновой кислоты, которая может кодировать элемент информации о последовательности, такой как идентичность последовательности, к которой прикреплен штрихкод, или идентичность образца, из которого получена последовательность.

[146] Под «лигандом» подразумевают молекулу, которая способна образовывать комплекс с рецептором. Согласно настоящему раскрытию лиганд следует понимать в значении, например, пептида или фрагмента пептида, который имеет подходящую длину и подходящие мотивы связывания в своей аминокислотной последовательности, чтобы пептид или фрагмент пептида был способен образовывать комплекс с белками MHC I класса или MHC II класса.

[147] «Антигеном» является молекула, способная стимулировать иммунный ответ, которую могут продуцировать раковые клетки или возбудители инфекции или аутоиммунное заболевание. Антигены, распознаваемые T-клетками, будь то хелперные T-лимфоциты (T-хелперные (TH) клетки) или цитотоксические T-лимфоциты (CTL), распознаются не как интактные белки, но скорее как небольшие пептиды, которые связываются с белками MHC I класса или II класса на поверхности клеток. В ходе естественного иммунного ответа антигены, которые распознаются в связи с молекулами MHC II класса на антигенпрезентирующих клетках (APC), извлекаются снаружи клетки, интернализируются и процессируются в небольшие пептиды, которые связываются с молекулами MHC II класса. APC также могут кросс-презентировать пептидные антигены путем процессинга экзогенных антигенов и презентации процессированных антигенов на молекулах MHC I класса. Антигены, которые вызывают белки, которые распознаются в связи с молекулами MHC I класса, обычно представляют собой белки, которые продуцируются в клетках, и эти антигены процессируются и связываются с молекулами MHC I класса. Теперь понятно, что пептиды, которые связываются с данными молекулами MHC I класса или II класса, характеризуют, как имеющие общий связывающий мотив, и были определены связывающие мотивы для большого количества разных молекул MHC I класса и II. Также можно синтезировать синтетические пептиды, которые соответствуют аминокислотной последовательности данного антигена и которые содержат связывающий мотив для данной молекулы MHC I класса или II. Затем эти пептиды можно добавлять к соответствующим APC, и APC можно использовать для стимулирования T-хелперных клеток или CTL ответа либо in vitro, либо in vivo. Все связывающие мотивы, способы синтеза пептидов, и способы стимулирования T-хелперной клетки или CTL ответа известны и легко доступны рядовому специалисту в данной области.

[148] Термин «пептид» в настоящем описании используется взаимозаменяемо с «мутантный пептид» и «неоантигенный пептид». Аналогично, термин «полипептид» в настоящем описании используется взаимозаменяемо с «мутантный полипептид» и «неоантигенный полипептид». Под «неоантиген» или «неоэпитоп» подразумевают класс опухолевых антигенов или опухолевых эпитопов, которые возникают в результате опухоль-специфических мутаций в экспрессируемом белке. В настоящее раскрытие дополнительно включены пептиды, которые содержат опухольспецифические мутации, пептиды, которые содержат известные опухольспецифические мутации, и мутантные полипептиды или их фрагменты, идентифицированные способом настоящего раскрытия. Эти пептиды и полипептиды в данном документе упоминаются, как «неоантигенные пептиды» или «неоантигенные полипептиды». Полипептиды или пептиды могут иметь различную длину, либо в их нейтральных (незаряженных) формах, либо в формах, которые представляют собой соли, и либо не содержат модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи, фосфорилирование или любая посттрансляционная модификация, либо содержат эти модификации, при условии, что модификация не нарушает биологическую активность полипептидов, которые описаны в данном документе. В некоторых вариантах осуществления неоантигенные пептиды согласно настоящему раскрытию могут иметь: для MHC I класса длину 22 остатка или менее, например, от приблизительно 8 до приблизительно 22 остатков, от приблизительно 8 до приблизительно 15 остатков или 9 или 10 остатков; для MHC II класса длину 40 остатков или менее, например, длину от приблизительно 8 до приблизительно 40 остатков, длину от приблизительно 8 до приблизительно 24 остатков, от приблизительно 12 до приблизительно 19 остатков или от приблизительно 14 до приблизительно 18 остатков. В некоторых вариантах осуществления неоантигенный пептид или неоантигенный полипептид содержит неоэпитоп.

[149] Термин «эпитоп» включает в себя любую белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом, пептидом антитела и/или антителоподобной молекулой (включая, но без ограничения T-клеточный рецептор) согласно определению в настоящем документе. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда.

[150] Под «T-клеточным эпитопом» подразумевают последовательность пептида, которую могут связывать молекулы MHC I или II класса в форме пептидпрезентирующей молекулы MHC или комплекса MHC, а затем в этой форме распознавать и связывать цитотоксические T-лимфоциты или T-хелперные клетки, соответственно.

[151] Термин «антитело» в рамках настоящего изобретения включает в себя IgG (включая IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4), IgA (включая IgAl и IgA2), IgD, IgE или IgM, и IgY, и подразумевает охват целых антител, включая одноцепочечные целые антитела и их антигенсвязывающие (Fab) фрагменты. Антигенсвязывающие фрагменты антител включают в себя, но без ограничения, Fab, Fab' и F(ab')2, Fd (состоящий из VH и CH1), одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), одноцепочечные антитела, дисульфидсвязанный вариабельный фрагмент (dsFv) и фрагменты, содержащие либо VL, либо VH домен. Антитела могут быть любого животного происхождения. Антигенсвязывающие фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела, могут содержать вариабельную область (области), отдельно или в комбинации со всеми или частью следующего: шарнирной областью, доменами CH1, CH2 и CH3. Также включены любые комбинации вариабельной области (областей) и шарнирной области, доменов CH1, CH2 и CH3. Антитела могут быть моноклональными, поликлональными, химерными, гуманизированными, и человеческими моноклональными и поликлональными антителами, которые, например, специфически связывают связанный c HLA полипептид или комплекс HLA-пептид. Специалисту в данной области должно быть понятно, что множество иммуноаффинных методов подходят для обогащения растворимых белков, таких как растворимые комплексы HLA-пептиды или мембраносвязанные HLA-ассоциированные полипептиды, например, которые были протеолитически отщеплены от мембраны. Они включают в себя методы, в которых (1) одно или более антител, способных специфически связываться с растворимым белком, иммобилизуют на неподвижном или подвижном субстрате (например, пластмассовых лунках или смоле, латексных или парамагнитных гранулах), и (2) раствор, содержащий растворимый белок из биологического образца, пропускают по покрытому антителами субстрату, обеспечивая связывание растворимого белка с антителами. Субстрат с антителами и связанный растворимый белок выделяют из раствора, и необязательно антитела и растворимый белок диссоциируют, например, путем изменения pH и/или ионной силы и/или ионного состава раствора с антителами. Альтернативно, можно использовать методы иммунопреципитации, в которых антитело и растворимый белок объединены и могут образовывать макромолекулярные агрегаты. Макромолекулярные агрегаты можно выделять из раствора методами исключения по размеру или путем центрифугирования.

[152] Термин «иммуноаффинная очистка (IP)» (или иммуносорбционная очистка или иммунопреципитация) представляет процесс, хорошо известный в данной области и широко используемый для выделения из образца требуемого антигена. В общем, процесс включает введение образца, содержащего требуемый антиген, в контакт с аффинной матрицей, содержащейе антитело к антигену, ковалентно соединенное с твердой фазой. Антиген в образце становится связанным с аффинной матрицей через иммунохимическую связь. Затем аффинную матрицу промывают для удаления любых несвязанных компонентов. Антиген извлекают из аффинной матрицы за счет изменения химического состава раствора в контакте с аффинной матрицей. Иммуноаффинную очистку можно проводить в колонке, содержащей аффинную матрицу, и в этом случае раствором является элюент. Альтернативно иммуноаффинная очистка представлять собой периодический процесс, и в этом случае аффинная матрица сохраняется в виде суспензии в растворе. Важной стадией процесса является удаление антигена из матрицы. Обычно это достигается путем увеличения ионной силы раствора в контакте с аффинной матрицей, например, путем добавления неорганической соли. Изменение рН также может быть эффективным для диссоциации иммунохимической связи между антигеном и аффинной матрицей.

[153] Под «средством» подразумевается любое низкомолекулярное химическое соединение, антитело, молекула нуклеиновой кислоты или полипептид, или их фрагменты.

[154] Под «заменой» или «изменением» подразумевается увеличение или уменьшение. Изменение может быть всего на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30% или на 40%, 50%, 60%, или даже на 70%, 75%, 80%, 90% или 100%.

[155] Под «биологическим образцом» подразумевается любая ткань, клетка, текучая среда или другой материал, полученный из организма. В рамках настоящего изобретения термин «образец» включает в себя биологический образец, такой как любая ткань, клетка, текучая среда или другой материал, полученный из организма. Под «специфическим связыванием» подразумевают соединение (например, пептид), которое распознает и связывает молекулу (например, полипептид), но которое по существу не распознает и связывает другие молекулы в образце, например, биологическом образце.

[156] Под «реагентом захвата» подразумевается реагент, который специфически связывает молекулу (например, молекулу нуклеиновой кислоты или полипептид) для отбора или выделения молекулы (например, молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида).

[157] В рамках настоящего изобретения термины «определение», «оценка», «анализ», «измерение», «обнаружение» и их грамматические эквиваленты относятся как к количественным, так и к качественным определениям, и в связи с этим термин «определение» используется в данном документе взаимозаменяемо с «анализом», «измерением» и тому подобное. Когда подразумевается количественное определение, используется фраза «определение количества» аналита и тому подобное. Если подразумевается качественное и/или количественное определение, используется фраза «определение уровня» аналита или «обнаружение» аналита.

[158] Под «фрагментом» подразумевается часть белка или нуклеиновой кислоты, которая по существу идентична эталонному белку или нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах осуществления эта часть сохраняет, по меньшей мере, 50%, 75% или 80%, или 90%, 95%, или даже 99% биологической активности описанных в настоящем документе эталонного белка или нуклеиновой кислоты.

[159] Термины «выделенный», «очищенный», «биологически чистый» и их грамматические эквиваленты относятся к материалу, который в той или иной степени не содержит компонентов, которые обычно сопровождают его, когда он находится в своем естественном состоянии. «выделить» означает степень отделения от исходного источника или окружения. «Очистить» означает степень разделения, более высокую, чем выделение. «Очищенный» или «биологически чистый» белок в достаточной степени не содержит других веществ, так что любые примеси не оказывают существенного влияния на биологические свойства белка и не вызывают других неблагоприятных последствий. То есть нуклеиновая кислота или пептид согласно настоящему изобретению являются очищенными, если они по существу не содержат клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды при получении методами рекомбинантной ДНК, или химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. Чистоту и однородность обычно определяют с использованием методов аналитической химии, например, электрофореза в полиакриламидном геле или жидкостной хроматографии высокого разрешения. Термин «очищенный» может означать, что нуклеиновая кислота или белок дают по существу одну полосу в электрофоретическом геле. Для белка, который может быть подвергнут модификациям, например, фосфорилированию или гликозилированию, различные модификации могут давать разные выделенные белки, которые можно очищать отдельно.

[160] Под «выделенным» полипептидом (например, пептидом из комплекса HLA-пептид) или полипептидным комплексом (например, комплексом HLA-пептид) подразумевается полипептид или полипептидный комплекс согласно настоящему изобретению, который был отделен от компонентов, которые сопровождают его в естественном состоянии. Как правило, полипептид или полипептидный комплекс выделяют, когда он составляет по меньшей мере 60% по массе, не содержит белков и существующих в природе органических молекул, с которыми он естественным образом связан. Препарат может составлять по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 99% по массе полипептидного или полипептидного комплекса согласно настоящему изобретению. Выделенный полипептид или полипептидный комплекс согласно настоящему изобретению может быть получен, например, путем экстракции из природного источника, путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей такой полипептид или один или более компонентов полипептидного комплекса, или путем химического синтеза полипептид или один или более компонентов полипептидного комплекса. Чистоту можно измерить с помощью любого подходящего метода, например, с помощью колоночной хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле или анализа HPLC.

[161] Термин «векторы» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать или опосредовать экспрессию гетерологичной нуклеиновой кислоты. Плазмида представляет собой разновидность рода, охватываемого термином «вектор». Вектор обычно относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей источник репликации и другие фрагменты, необходимые для репликации и/или содержания в клетке-хозяине. Векторы, способные направлять экспрессию генов и/или последовательностей нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны, обозначаются в данном документе как «векторы экспрессии». Как правило, используемые векторы экспрессии часто имеют форму «плазмид», которые относятся к кольцевым двухцепочечным молекулам ДНК, которые в своей векторной форме не связаны с хромосомой и обычно содержат фрагменты для стабильной или кратковременной экспрессии, или к кодируемой ДНК. Другие векторы экспрессии, которые можно использовать в способах, описанных в настоящем документе, включают, но без ограничения, плазмиды, эписомы, бактериальные искусственные хромосомы, дрожжевые искусственные хромосомы, бактериофаги или вирусные векторы, и такие векторы могут встраиваться в геном хозяина или автономно реплицироваться в клетке. Вектор может быть ДНК или РНК вектором. Также можно использовать другие формы векторов экспрессии, известные специалистам в данной области, которые выполняют эквивалентные функции, например, самореплицирующиеся внехромосомные векторы или векторы, способные встраиваться в геном хозяина. Иллюстративными векторами являются векторы, способные к автономной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они связаны.

[162] Под «молекулярным профилем» подразумевается характеристика экспрессии или уровня экспрессии двух или более маркеров (например, полипептидов или полинуклеотидов).

[163] Термины «спейсер» или «линкер», используемые в отношении слитого белка, относятся к пептиду, который присоединяется к белкам, содержащим слитый белок. Как правило, спейсер не обладает специфической биологической активностью, кроме присоединения или сохранения некоторого минимального расстояния или других пространственных связей между белками или последовательностями РНК. Однако в некоторых вариантах осуществления составляющие аминокислоты спейсера могут быть выбраны так, чтобы влиять на некоторые свойства молекулы, такие как свертывание, суммарный заряд или гидрофобность молекулы. Подходящие линкеры для использования в варианте осуществления настоящего изобретения хорошо известны специалистам в данной области и включают, но без ограничения, углеродные линкеры с прямой или разветвленной цепью, гетероциклические углеродные линкеры или пептидные линкеры. Линкер используется для разделения двух антигенных пептидов на расстояние, достаточное для обеспечения в некоторых вариантах осуществления правильного складывания каждого антигенного пептида. Иллюстративные пептидные линкерные последовательности принимают гибкую расширенную конформацию и не проявляют склонности к развитию упорядоченной вторичной структуры. Типичные аминокислоты в гибких белковых областях включают Gly, Asn и Ser. Можно ожидать, что практически любая перестановка аминокислотных последовательностей, содержащих Gly, Asn и Ser, удовлетворяет вышеуказанным критериям для линкерной последовательности. Другие почти нейтральные аминокислоты, такие как Thr и Ala, также могут быть использованы в линкерной последовательности. Другие аминокислотные последовательности, которые можно использовать в качестве линкеров, описаны у Maratea et al. (1985), Gene 40: 39-46; Murphy et al. (1986) Proc. Nat'l. Акад. Sci. USA 83: 8258-62; в патенте США № 4935233; и патенте США № 4751180.

[164] Термин «новообразование» относится к любому заболеванию, которое вызвано или приводит к непропорционально высоким уровням деления клеток, непропорционально низким уровням апоптоза или и тому и другому. Глиобластома является одним из неограничивающих примеров неоплазии или рака. Термины «рак» или «опухоль» или «гиперпролиферативное расстройство» относятся к наличию клеток, обладающих характеристиками, типичными для раковых клеток, такими как неконтролируемая пролиферация, бессмертие, метастатический потенциал, быстрый рост и скорость пролиферации, а также некоторые характерные морфологические признаки. Раковые клетки часто находятся в форме опухоли, но такие клетки могут существовать отдельно у животного или могут представлять собой неопухолевую раковую клетку, такую как лейкозная клетка. Рак включает в себя, но без ограничения, В-клеточный рак, например множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезни тяжелых цепей, такие как, например, болезнь альфа-цепи, болезнь гамма-цепи и болезнь мю-цепи, доброкачественная моноклональная гаммопатия и иммуноцитарный амилоидоз, меланомы, рак молочной железы, рак легкого, рак бронха, колоректальный рак, рак простаты (например, метастатический, гормонорефрактерный рак простаты), рак поджелудочной железы, рак желудка, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак мозга или центральной нервной системы, рак периферической нервной системы, рак пищевода, рак шейки матки, рак матки или эндометрия, рак полости рта или глотки, рак печени, рак почки, рак яичка, рак желчных путей, рак тонкой кишки или аппендикса, рак слюнной железы, рак щитовидной железы, рак надпочечника, остеосаркому, хондросаркому, рак гематологических тканей и тому подобное. Другие не ограничивающие примеры видов рака, применимого к методам, охватываемых настоящим изобретением, включают человеческие саркомы и карциномы, например, фибросаркому, злокачественную миксому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, плоскоклеточный рак, базально-клеточный рак, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярную аденокарциному, цистаденокарциному, медуллярный рак, бронхогенный рак, почечноклеточный рак, гепатому, карциному желчного протока, рак печени, хориокарциному, семиному, эмбриональный рак, опухоль Вильмса, рак шейки матки, рак костей, опухоль головного мозга, рак яичек, рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, акустическую неврому, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому, ретинобластому; лейкемии, например, острый лимфоцитарный лейкоз и острый миелоцитарный лейкоз (миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный и эритролейкемический); хроническую лейкемию (хроническую миелоцитарную (гранулоцитарную) лейкемию и хроническую лимфоцитарную лейкемию); и истинную полицитемию, лимфому (болезнь Ходжкина и неходжкинскую болезнь), множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема и болезнь тяжелых цепей. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой эпителиальный рак, такой как, но без ограничения, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки, гинекологический рак, рак почки, рак гортани, рак легкого, рак полости рта, рак головы и шеи, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак простаты или рак кожи. В других вариантах осуществления рак представляет собой рак молочной железы, рак простаты, рак легкого или рак толстой кишки. В других вариантах осуществления эпителиальный рак представляет собой немелкоклеточный рак легкого, непапиллярный почечно-клеточный рак, рак шейки матки, рак яичника (например, серозный рак яичника) или рак молочной железы. Рак эпителия может быть охарактеризован различными другими способами, включая, но без ограничения, серозный, эндометриоидный, слизистый, светлоклеточный, Бреннера или недифференцированный. В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие используется при лечении, диагностике и/или прогнозе лимфомы или ее подтипов, включая, но без ограничения, лимфому из мантийных клеток. Лимфопролиферативные заболевания также считаются пролиферативными заболеваниями.

[165] Термин «вакцина» следует понимать в значении композиция для создания иммунитета для профилактики и/или лечения заболеваний (например, новообразования/опухоли/возбудителей инфекций/аутоиммунных заболеваний). Соответственно, вакцины представляют собой лекарственные средства, которые содержат антигены и предназначены для использования у людей или животных для создания специфических протекторных и защитных веществ путем вакцинации. «Вакцинная композиция» может содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель. Аспекты настоящего раскрытия относятся к использованию технологии при получении вакцины на основе антигена. В этих вариантах осуществления вакцина предназначена для обозначения одного или более специфических для заболевания антигенных пептидов (или соответствующих кодирующих их нуклеиновых кислот). В некоторых вариантах осуществления антигенная вакцина содержит по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30 или более антигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления вакцина на основе антигена содержит 2-100, 2-75, 2-50, 2-25, 2-20, 2-19, 2-18, 2-17, 2-16, 2-15, 2-14, 2-13, 2-12, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 3-100, 3-75, 3-50, 3-25, 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 4-100, 4-75, 4-50, 4-25, 4-20, 4-19, 4-18, 4-17, 4-16, 4-15, 4-14, 4-13, 4-12, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 5-100, 5-75, 5-50, 5-25, 5-20, 5-19, 5-18, 5-17, 5-16, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-10, 5-9, 5-8 или 5-7 антигенных пептидов. В некоторых вариантах антигенная вакцина содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 антигенных пептидов. В некоторых случаях антигенные пептиды являются неоантигенными пептидами. В некоторых случаях антигенные пептиды содержат один или более неоэпитопов.

[166] Термин «фармацевтически приемлемый» относится к одобренному или заслуживающему одобрения регулирующим органом Федерального правительства или правительства штата или указанному в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения на животных, включая людей. «Фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель» относится к наполнителю, носителю или разбавителю, который можно вводить субъекту вместе со средством и который не разрушает его фармакологическую активность и является нетоксичным при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества средства. «Фармацевтически приемлемая соль» объединенных специфических для заболеваний антигенов, которые перечислены в данном документе, может представлять собой кислотную или основную соль, которая обычно считается в данной области техники подходящей для использования в контакте с тканями людей или животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения. Такие соли включают соли минеральных и органических кислот основных остатков, таких как амины, а также щелочные или органические соли кислотных остатков, таких как карбоновые кислоты. Конкретные фармацевтические соли включают, но без ограничения, соли таких кислот, как соляная, фосфорная, бромистоводородная, яблочная, гликолевая, фумаровая, серная, сульфаминовая, сульфаниловая, муравьиная, толуолсульфоновая, метансульфоновая, бензолсульфоновая, этандисульфоновая, 2-гидроксиэтилсульфоновая, азотная, бензойная, 2-ацетоксибензойная, лимонная, винная, молочная, стеариновая, салициловая, глутаминовая, аскорбиновая, памоевая, янтарная, фумаровая, малеиновая, пропионовая, гидроксималеиновая, иодистоводородная, фенилуксусная, алкановая, такая как уксусная, HOOC-(CH2)n-COOH, где n равно 0-4, и тому подобное. Аналогично, фармацевтически приемлемые катионы включают, но без ограничения, натрий, калий, кальций, алюминий, литий и аммоний. Рядовым специалистам в данной области из этого раскрытия и знаний в данной области будет понятно, что дополнительные фармацевтически приемлемые соли для объединенных специфических для заболеваний антигенов, представленных в настоящем документе, включают соли, которые перечислены в Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985). В общем, фармацевтически приемлемая соль кислоты или основания может быть синтезирована из исходного соединения, которое содержит основной или кислотный фрагмент, любым обычным химическим способом. Вкратце, такие соли можно получать за счет реакции форм этих соединений в виде свободной кислоты или основания со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в подходящем растворителе.

[167] Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые в способах согласно изобретению, включают в себя любую молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид согласно изобретению или его фрагмент. Такие молекулы нуклеиновой кислоты не обязательно должны быть на 100% идентичны с последовательностью эндогенной нуклеиновой кислоты, но обычно будут демонстрировать существенную идентичность. Полинуклеотиды, имеющие существенную идентичность с эндогенной последовательностью, обычно способны гибридизоваться по меньшей мере с одной цепью двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. Под «гибридизацией» подразумевается пара для образования двухцепочечной молекулы между комплементарными полинуклеотидными последовательностями или их частями в различных условиях жесткости. (См., Например, Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507). Например, жесткая концентрация соли может обычно составлять менее примерно 750 мМ NaCl и 75 мМ тринатрийцитрата, менее примерно 500 мМ NaCl и 50 мМ тринатрийцитрата или менее примерно 250 мМ NaCl и 25 мМ тринатрийцитрата. Гибридизация с низкой жесткостью может быть получена в отсутствие органического растворителя, например формамида, тогда как гибридизация с высокой жесткостью может быть получена в присутствии по меньшей мере примерно 35% формамида или по меньшей мере примерно 50% формамида. Жесткие температурные условия обычно могут включать температуры по меньшей мере приблизительно 30°С, по меньшей мере приблизительно 37°С или по меньшей мере приблизительно 42°С. Различные дополнительные параметры, такие как время гибридизации, концентрация детергента, например додецилсульфата натрия (SDS) и включение или исключение носителя ДНК, хорошо известны специалистам в данной области. Различные уровни жесткости достигаются путем объединения этих различных условий по мере необходимости. В иллюстративном варианте осуществления гибридизация может происходить при 30°C в 750 мМ NaCl, 75 мМ тринатрийцитрате и 1% SDS. В другом иллюстративном варианте осуществления гибридизация может происходить при 37°C в 500 мМ NaCl, 50 мМ тринатрийцитрате, 1% SDS, 35% формамиде и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося (ssDNA). В другом иллюстративном варианте осуществления гибридизация может происходить при 42°С в 250 мМ NaCl, 25 мМ тринатрийцитрате, 1% SDS, 50% формамида и 200 мкг/мл sSDNA. Полезные изменения этих условий будут очевидны для специалистов в данной области техники. Для большинства применений стадии промывки, следующие за гибридизацией, также могут различаться по жесткости. Условия жесткости при промывке могут определяться концентрацией соли и температурой. Как указано выше, жесткость промывки можно увеличить, уменьшив концентрацию соли или увеличив температуру. Например, жесткая концентрация соли на стадиях промывки может составлять менее чем приблизительно 30 мМ NaCl и 3 мМ тринатрийцитрата или менее чем приблизительно 15 мМ NaCl и 1,5 мМ тринатрийцитрата. Жесткие температурные условия для стадий промывки могут включать температуру по меньшей мере приблизительно 25°C, по меньшей мере приблизительно 42°C или по меньшей мере приблизительно 68°C. В иллюстративных вариантах осуществления стадии промывки могут происходить при 25°C в 30 мМ NaCl, 3 мМ тринатрийцитрате и 0,1% SDS. В других иллюстративных вариантах осуществления стадии промывки могут происходить при 42°C в 15 мМ NaCl, 1,5 мМ тринатрийцитрате и 0,1% SDS. В другом иллюстративном варианте осуществления стадии промывки могут происходить при 68°C в 15 мМ NaCl, 1,5 мМ тринатрийцитрате и 0,1% SDS. Дополнительные изменения этих условий будут очевидны для специалистов в данной области техники. Методы гибридизации хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны, например, у Benton и Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein и Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72: 3961, 1975); Ausubel et. al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger и Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); и Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

[168] Под «по существу идентичной» подразумевается молекула полипептида или нуклеиновой кислоты, проявляющая по меньшей мере 50% идентичность с эталонной аминокислотной последовательностью (например, любой одной из аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем документе) или последовательностью нуклеиновой кислоты (например, любой из последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе). Такая последовательность может быть по меньшей мере на 60%, 80% или 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или даже на 99% или более на уровне аминокислот или нуклеиновой кислоты идентичной используемой для сравнения последовательности. Идентичность последовательности обычно измеряют с помощью программного обеспечения для анализа последовательности (например, пакета программного обеспечения для анализа последовательности, представленного Genetics Computer Group, Центр биотехнологии Университета Висконсина, 1710 University Avenue, Madison, Wis., 53705, программ BLAST, BESTFIT, GAP или PILEUP/PRETTYBOX). Такое программное обеспечение сопоставляет идентичные или сходные последовательности, присваивая степени гомологии различным заменам, делециям и/или другим модификациям. Консервативные замены обычно включают замены в следующих группах: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глютамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. В иллюстративном подходе к определению степени идентичности можно использовать программу BLAST с оценкой вероятности между e-3 и e-m°, указывающей тесно связанную последовательность. Под «ссылкой» подразумевается стандарт сравнения.

[169] Термин «субъект» или «пациент» относится к животному, которое является объектом лечения, наблюдения или эксперимента. Только в качестве примера, субъект включает, но без ограничения, млекопитающее, включая, без ограничения, человека или млекопитающего, не являющегося человеком, такого как примат, не являющийся человеком, мышь, бык, лошадь, собака, овца или кошачьи.

[170] Термины «лечить», «получающий лечение», «при лечении», «лечение» и тому подобное предназначены для обозначения снижения, предотвращения или ослабления расстройства и/или связанных с ним симптомов (например, новообразования или опухоли или возбудителя инфекции или аутоиммунного заболевания). «Лечение» может относиться к проведению терапии субъекта после начала или предполагаемого начала заболевания (например, рака или инфекции от возбудителя инфекции или аутоиммунного заболевания). «Лечение» включает в себя понятия «облегчения», которое относится к уменьшению частоты возникновения или рецидива или тяжести любых симптомов или других неблагоприятных эффектов, связанных с заболеванием, и/или побочных эффектов, связанных с терапией. Термин «лечение» также включает в себя понятие «ведение», которое относится к снижению тяжести заболевания или расстройства у пациента, например, продлению жизни или продлению выживаемости пациента с заболеванием или задержке его рецидива, например, к удлинению периода ремиссии у пациента, который страдает от заболевания. Понятно, что, хотя это и не исключается, лечение расстройства или состояния не требует полного устранения расстройства, состояния или связанных с ним симптомов.

[171] Термины «предотвращать», «предотвращая», «предотвращение» и их грамматические эквиваленты, используемые в данном документе, означают предотвращение или задержку появления симптомов, связанных с заболеванием или состоянием, у субъекта, у которого не было таких симптомов во время начала введение средства или соединения.

[172] Термин «терапевтический эффект» относится к некоторой степени ослабления одного или более симптомов расстройства (например, новообразования, опухоли или инфекции от возбудителя инфекции или аутоиммунного заболевания) или связанной с ним патологии. «Терапевтически эффективное количество» в контексте настоящего описания относится к количеству средства, которое эффективно при введении одной или более доз в клетку или субъекту для продления выживаемости пациента с таким расстройством, уменьшения одного или более признаков или симптомов расстройства, профилактики или отсрочки и тому подобное, помимо ожидаемого в отсутствие такого лечения. «Терапевтически эффективное количество» предназначено для определения количества, необходимого для достижения терапевтического эффекта. Врач или ветеринар, имеющий обычный опыт в данной области, может легко определить и назначить «терапевтически эффективное количество» (например, ED50) требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начинать дозы соединений согласно настоящему изобретению, применяемых в фармацевтической композиции, с уровней ниже, чем требуется для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку до тех пор, пока не будет достигнут желаемый эффект. Болезнь, состояние и расстройство используются здесь взаимозаменяемо.

[173] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аллель HLA, дополнительно содержит пептидную метку, аффинную метку, эпитопную метку или аффинную акцепторную метку, которые можно использовать для очистки иммуноаффинным методом HLA-белка. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что термины «пептидная метка», «аффинная метка», «эпитопная метка» или «аффинная акцепторная метка» используются здесь взаимозаменяемо. Используемый здесь термин «аффинная акцепторная метка» относится к аминокислотной последовательности, которая позволяет легко обнаружить или очистить меченый белок, например, аффинной очисткой. Аффинную акцепторную метку обычно (но не обязательно) размещают на N- или С-конце аллеля HLA или рядом с ним. Различные пептидные метки хорошо известны в данной области. Неограничивающие примеры включают в себя полигистидиновую метку (например, 4-15 последовательных остатков His, например, 8 последовательных остатков His); полигистидин-глициновую метку; метку HA (например, Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159, 1988); метку c-myc (например, Evans et al., Mol. Cell. Biol., 5: 3610, 1985); метку гликопротеина D (gD) вируса простого герпеса (например, Paborsky et al., Protein Engineering, 3: 547, 1990); метку FLAG (например, Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204, 1988; патенты США №№ 4703004 и 4851341); эпитопную метку KT3 (например, Martine et al., Science, 255: 192, 1992); тубулиновую эпитопную метку (например, Skinner, Biol. Chem., 266: 15173, 1991); пептидную метку белка 10 гена Т7 (например, Lutz-Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393, 1990); стрептавидиновую метку (StrepTag™ или StrepTagII™); см., например, Schmidt et al., J. Mol. Biol., 255 (5): 753-766, 1996 или патент США № 5506121; также имеется в продаже от Sigma-Genosys); или эпитопную метку VSV-G, полученную из вирусного гликопротеина везикулярного стоматита; или метку V5, полученную из небольшого эпитопа (Pk), обнаруженного на белках P и V парамиксовируса обезьяньего вируса 5 (SV5). В некоторых вариантах осуществления аффинная метка-акцептор представляет собой «эпитопную метку», которая представляет собой тип пептидной метки, которая добавляет узнаваемый эпитоп (сайт связывания антитела) в белок HLA для обеспечения связывания соответствующего антитела, что обеспечивает идентификацию или аффинную очистку меченого белка. Неограничивающим примером метки эпитопа является белок A или белок G, который связывается с IgG. В некоторых вариантах осуществления матрица из смолы для хроматографии в быстропроточной IgG сефарозе 6 ковалентно связана с человеческим IgG. Эта смола обеспечивает высокие скорости прохождения для быстрой и удобной очистки белка, меченного белком А. В данном документе предусмотрено множество других меток, известных рядовым специалистам в данной области, которые они могут рассмотреть. Можно использовать любую пептидную метку при условии, что она способна экспрессироваться как элемент комплекса меченный аффинным акцептором HLA-пептид.

[174] В рамках настоящего изобретения термин «аффинная молекула» относится к молекуле или лиганду, который связывается с химической специфичностью с аффинным пептидом-акцептором. Химическая специфичность - это способность сайта связывания белка связывать специфические лиганды. Чем меньше лигандов может связать белок, тем больше его специфичность. Специфичность описывает силу связывания между данным белком и лигандом. Эта связь может быть описана константой диссоциации (KD), которая характеризует баланс между связанными и несвязанными состояниями для системы белок-лиганд.

[175] Термин «комплекс меченный аффинным акцептором HLA-пептид» относится к комплексу, содержащему пептид, связанный с HLA I класса или II класса, или его часть, специфически связанную с одноаллельным рекомбинантным HLA I класса или II класса, причем пептид, представляет собой аффинный пептид-акцептор.

[176] Термины «специфическое связывание» или «специфически связанный» при использовании в отношении взаимодействия аффинной молекулы и аффинной акцепторной метки или эпитопа и пептида HLA означает, что взаимодействие зависит от наличия на белке конкретной структуры (то есть антигенной детерминанты или эпитопа); другими словами, аффинная молекула распознает и связывается со структурой специфического аффинного пептида-акцептора, а не с белками в целом.

[177] В рамках настоящего изобретения термин «аффинность» относится показателю силы связывания между двумя элементами пары связывания, например, «аффинной акцепторной меткой» и «аффинной молекулой» и связывающим HLA пептидом и HLA I или II класса. KD является константой диссоциации и имеет единицы молярности. Константа аффинности является обратной величиной константы диссоциации. Константу аффинности иногда используют как общий термин для описания этого химического понятия. Это прямая мера энергии связи. Аффинность можно определить экспериментально, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием коммерчески доступных элементов Biacore SPR. Аффинность также может быть выражена как ингибирующая концентрация 50 (IC50), т.е. Концентрация, при которой вытесняется 50% пептида. Аналогично, ln (IC50) относится к натуральному логарифму IC50. Кoff относится к константе скорости диссоциации, например, для диссоциации аффинной молекулы из комплекса меченный аффинным акцептором HLA-пептид.

[178] В некоторых вариантах осуществления комплекс меченный аффинным акцептором HLA-пептид содержит пептид-акцептор биотина (BAP), и его очищают иммуноаффинным методом из сложных клеточных смесей с использованием гранул стрептавидина/NeutrAvidin. Связывание биотин-авидин/стрептавидин является самым сильным нековалентным взаимодействием, известным в природе. Это свойство используется в качестве биологического инструмента для широкого спектра применений, таких как иммуноаффинная очистка белка, к которому ковалентно присоединен биотин. В иллюстративном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аллель HLA, внедряет пептид-акцептор биотина (BAP) в качестве аффинной акцепторной метки для иммуноаффинной очистки. BAP можно специфически биотинилировать in vivo или in vitro по одному остатку лизина в метке (например, патенты США № 5723584; 5874239 и 5932433; патент США № GB2370039). BAP обычно имеет длину 15 аминокислот и содержит один лизин в качестве остатка-акцептора биотина. В некоторых вариантах осуществления BAP расположен на или рядом с N- или C-концом пептида одноаллельного HLA. В некоторых вариантах осуществления BAP расположен между доменом тяжелой цепи и доменом β2 микроглобулина пептида HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления BAP расположен между доменом β-цепи и доменом α-цепи пептида HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления BAP помещают в области петли между доменами α1, α2 и α3 тяжелой цепи HLA класса I или между доменами α1 и α2 и β1 и β2 α-цепи и β-цепи, соответственно, HLA II класса. Иллюстративные конструкции, разработанные для экспрессии HLA I и II класса, с использованием BAP для биотинилирования и иммунопрификации, описаны на фиг. 2.

[179] В рамках настоящего изобретения термин «биотин» относится к самому соединению биотина и его аналогам, производным и вариантам. Таким образом, термин «биотин» включает в себя биотин (цис-гексагидро-2-оксо-1Н-тиено [3,4]имидазол-4-пентановую кислоту) и любые его производные и аналоги, включая биотиноподобные соединения. Такие соединения включают, например, биотин-eN-лизин, гидразид биоцитина, амино или сульфгидрильные производные 2-иминобиотина и биотинил-E-аминокапроновой кислоты-N-гидроксисукцинимидного эфира, сульфосукцинимидиминобиотин, 3-(N-малеимидопропионил)биоцитин, дестиобиотин и тому подобное. Термин «биотин» также включает в себя варианты биотина, которые могут специфически связываться с одним или более из фрагментов ризавидина, авидина, стрептавидина, тамавидина или других авидиноподобных пептидов.

Подходы получения профиля лиганда HLA

[180] Биохимический анализ связывания пептид-MHC для обнаружения HLA-эпитоп был основой для NetMHC, аллель-специфического средства прогнозирования с использованием искусственных нейронных сетей; однако, медленный биохимический анализ связывания p:MHC является методом с низкой пропускной способностью (фиг. 19). Эндогенно процессированные и презентированные лиганды HLA, профилированные из клеточных линий и материалов, полученных от пациентов, обычно являются многоаллельными, что означает, что данные LC-MS/MS, полученные из этих образцов, содержат смешанную популяцию лигандов, которые могут связываться с одним из множества одновременно экспрессируемых аллелей HLA, как показано на фиг. 17 и фиг. 19. Мультиаллельные наборы данных требуют деконволюции, чтобы определить, какие пептиды связываются с различными гетеродимерами HLA, презентированными индивидуумом. Таким образом, лиганды из мультиаллельных наборов данных должны быть отнесены к их соответствующим гетеродимерам HLA с использованием (1) средств прогнозирования связывания, обученных с ранее существовавшими данными, или (2) алгоритмов деконволюции, которые используют перекрывание аллелей HLA, представленных в больших наборах данных лигандов. Важно отметить, что уверенно можно разворачивать только наборы данных LC-MS/MS с доступной информацией о типизации HLA. Фактически, почти 40% лигандов, процессированных естественным путем, связанных с комплексами HLA I класса, о которых сообщалось в многоаллельных исследованиях в базе данных иммунных эпитопов (IEDB), не имеют специфичных для аллелей HLA назначений, либо из-за отсутствия информации о типировании HLA, либо из-за неспособности деконволюции, что затрудняет использование этого подмножества данных для аллель-специфического прогнозирования эпитопа. Кроме того, трудно идентифицировать пептиды, связанные с редкими гетеродимерами HLA I класса и многими гетеродимерами HLA II класса, потому что для деконволюции недостаточно аннотированных данных. Многоаллельный подход генерирования данных также ограничивает обнаружение новых мотивов связывания, поскольку разворачивание опирается на уже существующие знания. Хотя существуют предостережения относительно использования мультиаллельных наборов данных для аллель-специфических прогнозирований эпитопов, они чрезвычайно важны для определения моделей презентации лигандов, которые требуют коэкспрессии нескольких аллелей, и для проверки правильности алгоритмов прогнозирования эпитопов.

[181] Ортогональный подход генерирования мультиаллельных данных и последующей деконволюции заключается в создании моноаллельных наборов данных, из которых идентифицируют популяции пептидов, презентированных одним аллелем HLA (фиг. 17 и фиг. 19). Один из способов получения моноаллельных данных использует клеточные линии, которые имеют недостаточную экспрессию HLA. Эти клетки могут быть трансфицированы или трансдуцированы одиночными аллелями HLA, поэтому с помощью LC-MS/MS можно получить профиль лигандов для генерирования аллель-специфических библиотек лигандов. Также для получения моноаллельных данных из клеточных сред с помощью LC-MS/MS можно выделить и получить профиль пептидов, связанных с растворимыми молекулами HLA (sHLA). Основным преимуществом моноаллельных наборов данных является то, что они не требуют деконволюции и позволяют уверенно назначать пептиду аллели HLA без предварительных данных. Моноаллельные подходы также быстро предоставляют данные для аллелей HLA, которые ранее не были охарактеризованы - задача, которую могут выполнять мультиаллельные данные, только если в больших наборах данных имеется достаточное перекрытие. Кроме того, с использованием моноаллельных систем можно легко обнаруживать новые пептидсвязывающие мотивы, так как для уверенного назначения связывания HLA не требуется никаких предварительных знаний. Моноаллельные данные можно использовать даже для назначения лигандов из мультиаллельных наборов данных, когда методы деконволюции не позволяют этого сделать.

[182] Ограничивающим фактором доступного в настоящее время моноаллельного подхода является то, что он требует клеточной линии с дефицитом HLA. Ключевой инновационной особенностью настоящего изобретения является то, что для создания моноаллельных данных клеточная линия с дефицитом HLA не требуется. Аффинно-меченные конструкции, представленные в настоящем документе, можно поместить в любую клеточную линию, представляющую комплексы эндогенный HLA-пептид, для выделения представляющего интерес аллеля с использованием аффинные метки. Другое преимущество настоящего раскрытия состоит в том, что одни и те же реагенты можно использовать для любого аллеля I класса или II класса в библиотеке при условии, что он имеет одинаковую аффинную метку, что делает раскрытый в настоящее время способ масштабируемым (автоматизированным). В некоторых вариантах осуществления способ включает экспрессию библиотеки пептидов в популяции клеток, тем самым формируя библиотеку комплексов меченных акцептором акцептора HLA-пептид. В некоторых вариантах осуществления способ включает в себя контактирование с популяцией клеток библиотеки пептидов или библиотеки последовательностей, кодирующих пептиды, тем самым формируя библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления библиотека включает в себя библиотеку пептидов, связанных с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток происходит из биологического образца от субъекта с заболеванием или состоянием.

[183] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение пептидов из комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды перед получением характеристик. В некоторых вариантах осуществления пептиды выделяют с использованием антител против HLA. В некоторых случаях растворимый HLA (sHLA) с аффинными метками выделяют с использованием антител против HLA. В некоторых случаях растворимый HLA (sHLA) с аффинными метками выделяют с использованием колонки, содержащей антитело против HLA.

Способы и Композиции

[184] В настоящем документе представлен способ получения характеристик комплексов HLA-пептиды, включающий: предоставление популяции клеток, причем одна или более клеток популяции клеток содержат полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую аллель меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, при этом последовательность, кодирующая меченный аффинным акцептором HLA, содержит последовательность, кодирующую аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор; экспрессию меченного аффинным акцептором HLA по меньшей мере в одной клетке из одной или более клеток популяции клеток, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды по меньшей мере в одной клетке; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и получение характеристик комплексов HLA-пептиды.

[185] В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя получение характеристик пептида из комплекса меченный аффинным акцептором HLA-пептид. В некоторых вариантах осуществления способ включает выполнение стадий способа для разных аллелей HLA I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления способ включает использование более чем одного аллеля HLA I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток получают у субъекта (например, имеющего заболевание пациента). В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток являются отрицательные клеточные линии I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает создание базы данных специфических к аллелям HLA пептидов.

[186] В настоящем документе представлен способ создания базы данных специфических к аллелям HLA пептидов, включающий: предоставление первой и второй популяции клеток, каждая из которых содержит одну или более клеток, содержащих меченный аффинным акцептором HLA, причем последовательность меченного аффинным акцептором HLA содержит другой рекомбинантный полипептид, кодируемый другим аллелем HLA, функционально связанным с аффинным пептидом-акцептором; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; получение характеристик пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения; и создание базы данных специфических к аллелям HLA пептидов.

[187] В некоторых вариантах осуществления обогащение не включает в себя использование тетрамерного реагента.

[188] В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя определение последовательности пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя определение, является ли пептид или его часть модифицированной (например, посттрансляционная модификация). В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя биохимический анализ. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя масс-спектрометрический анализ. В некоторых вариантах осуществления масс-спектрометрией является MS анализ, анализ MS/MS, анализ LC-MS/MS или их комбинация. В некоторых вариантах осуществления MS анализ используется для определения массы интактного пептида. Например, определение может включать в себя определение массы интактного пептида (например, MS анализ). В некоторых вариантах осуществления MS/MS анализ используется для определения массы фрагментов пептида. Например, определение может включать в себя определение массы фрагментов пептида, которые можно использовать для определения аминокислотной последовательность пептида или его части (например, MS/MS анализ). В некоторых вариантах осуществления массу фрагментов пептида используют для определения последовательности аминокислот в пептиде. В некоторых вариантах осуществления анализ LC-MS/MS используют для разделения смесей пептидов комплексов. Например, определение может включать в себя разделение смесей пептидов комплексов, например, с помощью жидкостной хроматографии, и определение массы интактного пептида, массы фрагментов пептида или их комбинацию (например, анализ LC-MS/MS). Это данные можно использовать, например, для секвенирования пептидов.

[189] В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя оценку аффинности связывания или стабильности пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя определение, содержит ли пептид или его часть, связанная с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения, одну или более мутаций. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя определение, является ли пептид или его часть модифицированной (например, посттрансляционная модификация). В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя оценку связей пептидов комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды с аллелями HLA.

[190] В некоторых вариантах осуществления способ включает экспрессию библиотеки пептидов в популяции клеток, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение в контакт с популяцией клеток библиотеки пептидов или библиотеки последовательностей, кодирующих пептиды, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой библиотеку пептидов, связанных с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток происходит из биологического образца у субъекта с заболеванием или состоянием.

[191] В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция первичных клеток.

[192] В некоторых вариантах осуществления аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса соответствует субъекту с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления антигенпрезентирующая клетка, содержащая пептид или его мутант, связанный с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид, обладает реактивностью к T-клетке, экспрессирующей T-клеточный рецептор у субъекта. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя сравнение комплексов HLA-пептиды из раковых клеток с комплексами HLA-пептиды из нераковых клеток.

[193] В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса и нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления нокаут аллеля HLA I класса или II класса включает в себя устранение функции аллеля HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления нокаут аллеля HLA I класса или II класса достигается через редактирование гена. В некоторых вариантах осуществления редактирование гена выполняют путем введения нуждающемуся в этом индивидууму нуклеазы, при этом нуклеаза выделяет подлежащий нокауту аллель HLA I класса или аллель II класса. В некоторых вариантах осуществления нуклеазой является белок, связанный с CRISPR (например, белки Cas, например, Cas9), цинк-пальцевая нуклеаза (ZFN), эффекторная нуклеаза, подобная активаторам транскрипции (TALEN) или мегануклеаза. В некоторых вариантах осуществления редактирование гена достигается путем введения нуждающемуся в этом индивидууму системы CRISPR-Cas9. В некоторых вариантах осуществления используют любую подходящую нуклеазу, которая вызывает разрыв или двухцепочечный разрыв в требуемом сайте узнавания. В некоторых вариантах осуществления используют природную или нативную нуклеазу. В некоторых вариантах осуществления используют модифицированную или сконструированную нуклеазу.

[194] В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток происходит нокдаун одного или более аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток происходит нокдаун одного или более аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток происходит нокдаун всех аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток происходит нокдаун всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток происходит нокдаун всех аллелей HLA I класса и нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления нокдаун аллеля HLA I класса или II класса включает в себя уменьшение экспрессии аллеля HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления нокдаун аллеля HLA I класса или аллеля II класса достигается путем введения нуждающемуся в этом индивидууму терапевтически эффективного количества небольшой двухцепочечной интерферирующей РНК (siRNA), микроРНК (miRNA), короткой шпилечной РНК (shRNA), причем siRNA, miRNA, shRNA выделяют аллель HLA класса I или аллель класса II для нокдауна. В некоторых вариантах осуществления экспрессия аллеля HLA класса I или класса II снижается приблизительно на 99%, приблизительно 95%, приблизительно 90%, приблизительно 85%, приблизительно 80%, приблизительно 75%, приблизительно 70%, приблизительно 65%, приблизительно 60%, приблизительно 55%, приблизительно 50%, приблизительно 45%, приблизительно 40%, приблизительно 35%, приблизительно 30%, приблизительно 25% или приблизительно 20% по сравнению с отсутствием нокдауна аллеля HLA I класса или аллель II класса.

[195] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя клетки, которые были обогащены или отсортированы для экспрессии на клеточной поверхности аллеля HLA I класса, аллеля HLA II класса или их комбинации, например, с помощью сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS). В некоторых вариантах осуществления сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS) используют для сортировки популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS) используют для сортировки популяции клеток для экспрессии на клеточной поверхности аллеля HLA I класса, аллеля HLA II класса или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления FACS используют для обогащения или сортировки клеток с низкой экспрессией HLA клеточной поверхности I класса или II класса.

[196] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя множество популяций клеток, каждая из которых экспрессирует другой аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления каждая популяция клеток множества находится в отдельном контейнере.

[197] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение пептидов из комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды перед получением характеристик. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает обрезание конца пептида, связанного с комплексами HLA-пептиды (фиг. 13).

[198] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток экспрессирует один или более аллелей эндогенного HLA. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса и аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, кодирует HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, кодирует HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса относится к неклассической группе класса-I-b. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-E, HLA-F и HLA-G. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса относится к неклассической группе класса-I-b, выбранной из группы, состоящей из HLA-E, HLA-F и HLA-G. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса содержит α-цепь HLA II класса, β-цепь HLA II класса или их комбинацию.

[199] В некоторых вариантах осуществления каждая последовательность, кодирующая другой аллель HLA I класса и/или II класса, функционально связана с последовательностью, кодирующей другой аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, который кодирует внеклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор экспрессируется внеклеточно. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с N-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, который кодирует внутриклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор экспрессируется внутриклеточно. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с C-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса.

[200] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, посредством линкера.

[201] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя обогащение интактных клеток, экспрессирующих комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды.

[202] В некоторых вариантах осуществления способ не включает лизирование одной или более клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает лизирование одной или более клеток перед обогащением.

[203] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт молекулы связывания аффинного пептида-акцептора с комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем молекула связывания аффинного пептида-акцептора специфически связывается с аффинным пептидом-акцептором. В некоторых вариантах осуществления аффинный пептид-акцептор может включать в себя пептид-акцептор биотина (BAP), полигистидиновую метку, полигистидин-глициновую метку, полиаргининовую метку, полиаспартатную метку, полицистеиновую метку, полифенилаланин, метку c-myc, гликопротеиновую D (gD) метку вируса простого герпеса, метку FLAG, эпитопную метку KT3, тубулиновую эпитопную метку, пептидную метку белка 10 гена Т7, стрептавидиновую метку, метку стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метку, Strep-метку II, метку альбумин-связывающего белка (ABP), метку щелочной фосфатазы (AP), метку вируса катаральной лихорадки (B-метка), метку кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метку хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метку холин-связывающего домена (CBD), метку хитин-связывающего домена (CBD), метку целлюлозосвязывающего домена (CBP), метку дигидрофолатредуктазы (DHFR), метку галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансферазу (GST), метку Glu-Glu (EE), метку гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метку пероксидазы хрена (HA), NE-метку, метку HSV, метку кетостероид-изомеразы (KSI), метку KT3, метку LacZ, люциферазную метку, метку NusA, метку домена PDZ, AviTag, кальмодулиновую метку, E-метку, S-метку, SBP-метку, Softag 1, Softag 3, метку TC, VSV-метку, метку Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метку Profinity eXact, метку протеина C, S1-метку, S-метку, метку белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метку зеленого флуоресцентного белка (GFP), метку малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метку тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метку, метку Thioredoxin, Fc-метку, метку CYD, метку HPC, метку TrpE, убиквитиновую метку, эпитопную метку VSV-G, метку V5 или их комбинацию; необязательно при этом аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки. В некоторых вариантах осуществления молекулой связывания аффинного пептида-акцептора является биотин или антитело, специфическое к аффинному пептиду-акцептору.

[204] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение аффинной молекулы в контакт с комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем аффинная молекула специфически связывается с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора. В некоторых вариантах осуществления аффинной молекулой является стрептавидин, NeutrAvidin или их производное. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления молекулу связывания аффинного пептида-акцептора присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления аффинную молекулу присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления твердой поверхностью является гранула.

[205] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора, которая специфически связывается с аффинным пептидом-акцептором. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора не имеет специфического взаимодействия с аминокислотной последовательностью кодируемого рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к внеклеточной части комплексов HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к N-концевой части комплексов HLA-пептиды.

[206] В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с полинуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA. В некоторых вариантах осуществления введение в контакт включает в себя трансфекцию или трансдукцию. В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с вектором или плазмидой, содержащей полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA. В некоторых вариантах осуществления вектором является вирусный вектор.

[207] Для определения HLA, экспрессируемого в клетке (например, сконструированной клеточной линии), можно использовать любой подходящий биохимический анализ. Иллюстративные способы определения идентичности аллеля HLA, экспрессируемого в клетке (например, сконструированной клеточной линии), включают в себя вестерн-блоттинг, например, для определения класса аллеля HLA (I класса или II класса), анализ последовательности, например, секвенирование отдельных аллелей (например, с использованием разных праймеров для идентификации разных аллелей похожей последовательности). В некоторых вариантах осуществления полинуклеиновая кислота, кодирующая аллель HLA, содержит штрихкодированную последовательность. штрихкодированную последовательность можно использовать для идентификации аллеля HLA, экспрессируемого в клетке. В некоторых вариантах осуществления штрихкодированная последовательность является уникальной для одного HLA. В некоторых вариантах осуществления штрихкодированная последовательность является уникальной для одного аллеля HLA I класса или II класса.

[208] В некоторых вариантах осуществления полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA, стабильно встраивают в геном популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая рекомбинантный HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β2 микроглобулин в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA I класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор.

[209] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая рекомбинантный HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β-цепь HLA II класса, в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA II класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор.

[210] В некоторых вариантах осуществления второй аффинный пептид-акцептор отличается от первого аффинного пептида-акцептора и может включать в себя пептид-акцептор биотина (BAP), полигистидиновую метку, полигистидин-глициновую метку, полиаргининовую метку, полиаспартатную метку, полицистеиновую метку, полифенилаланин, метку c-myc, гликопротеиновую D (gD) метку вируса простого герпеса, метку FLAG, эпитопную метку KT3, тубулиновую эпитопную метку, пептидную метку белка 10 гена Т7, стрептавидиновую метку, метку стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метку, Strep-метку II, метку альбумин-связывающего белка (ABP), метку щелочной фосфатазы (AP), метку вируса катаральной лихорадки (B-метку), метку кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метку хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метку холин-связывающего домена (CBD), метку хитин-связывающего домена (CBD), метку целлюлозосвязывающего домена (CBP), метку дигидрофолатредуктазы (DHFR), метку галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансферазу (GST), метку Glu-Glu (EE), метку гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метку пероксидазы хрена (HA), NE-метку, метку HSV, метку кетостероид-изомеразы (KSI), метку KT3, метку LacZ, люциферазную метку, метку NusA, метку домена PDZ, AviTag, кальмодулиновую метку, E-метку, S-метку, SBP-метку, Softag 1, Softag 3, метку TC, VSV-метку, метку Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метку Profinity eXact, метку протеина C, S1-метку, S-метку, метку белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метку зеленого флуоресцентного белка (GFP), метку малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метку тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метку, метку Thioredoxin, Fc-метку, метку CYD, метку HPC, метку TrpE, убиквитиновую метку, эпитопную метку VSV-G, метку V5 или их комбинацию.

[211] В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность полинуклеиновой кислоты, кодирующую расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой элемент-участок ухода с рибосомы или участок внутренней посадки рибосомы (IRES). В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы или IRES расщепляется при экспрессии в клетках. В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы выбирают из группы, состоящей из F2A, T2A, P2A и E2A. В некоторых вариантах осуществления элемент IRES выбирают из общих клеточных или вирусных последовательностей IRES.

[212] В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя проведение масс-спектрометрии, такой как тандемная масс-спектрометрия. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя получение последовательности пептида, которая соответствует MS/MS спектрам одного или более пептидов, выделенных из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды из базы данных пептидов; при этом одна или более полученных последовательностей идентифицирует последовательность одного или более пептидов.

[213] В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия, которую выбирают из HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO и THP1. В некоторых вариантах осуществления клеточную линию обрабатывают одним или более цитокинами, ингибиторами контрольных точек, эпигенетически-активными лекарственными средствами, IFN-γ, средством, которое изменяет процессинг антигенов (например, ингибиторами пептидазы, ингибитором протеосомы, ингибитором TAP и т.д.) или их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления базой данных пептидов является база данных пептидов без специфичности к ферментам, например, база данных без модификации или база данных с модификацией (например, фосфорилированием или цистеинилированием). В некоторых вариантах осуществления базой данных пептидов является база данных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления базой данных полипептидов является база данных белков. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает поиск в базе данных пептидов с использованием стратегии поиска в перевернутой базе данных. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает поиск в базе данных белков с использованием стратегии поиска в перевернутой базе данных. В некоторых вариантах осуществления выполняют поиск de novo, например, для обнаружения новых пептидов, которые не содержатся в базе данных нормальных пептидов или белков.

[214] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя по меньшей мере 105 клеток, по меньшей мере 106 клеток или по меньшей мере 107 клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция дендритных клеток, макрофагов, раковых клеток или B-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя опухолевые клетки или клетки, инфицированные возбудителем инфекции или его частью.

[215] В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток вводят в контакт со средством перед выделением указанных комплексов HLA-пептиды из одной или более клеток. В некоторых вариантах осуществления указанным средством является воспалительный цитокин, химическое средство, вспомогательное средство, терапевтическое средство или радиация.

[216] В некоторых вариантах осуществления аллелем HLA является мутантный аллель HLA.

[217] В некоторых вариантах осуществления способ включает выполнение стадий способа для разных аллелей HLA.

[218] В настоящем документе представлена база данных последовательностей специфически связывающих аллели HLA пептидов, полученных путем выполнения способов, описанных в настоящем документе. В настоящем документе представлена комбинация двух или более баз данных последовательностей специфически связывающих аллели HLA пептидов, полученных путем многократного выполнения способов, описанных в данном документе, каждый раз с использованием другого аллеля HLA. В настоящем документе представлен способ генерирования алгоритма прогнозирования для идентификации специфически связывающих аллели HLA пептидов, включающий обучение машины с помощью базы данных последовательностей пептидов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления машина объединяет одну или более линейных моделей, методов опорных векторов, деревьев решений и нейронных сетей.

[219] Генерирование алгоритма прогнозирования путем обучения машины является хорошо известным методом. Самым важным при обучении машины является качество базы данных, используемой для обучения. Обычно, машина объединяет одну или более линейных моделей, методов опорных векторов, деревьев решений и/или нейронных сетей.

[220] В некоторых вариантах осуществления переменная, используемая для обучения машины или алгоритма, включает в себя одну или более переменных, выбранных из группы, состоящей из последовательности пептида, физических свойств аминокислот, физических свойств пептидов, уровня экспрессии исходного белка пептида в клетке, стабильности белка, скорости трансляции белка, сайтов убиквитинирования, скорости разрушения белка, эффективности трансляции из рибосомального профилинга, расщепляемости белка, локализации белка, мотивов белка-хозяина, которые облегчают транспортировку TAP, белок-хозяин подвергают аутофагии, мотивов, которые способствуют остановке рибосомы, (например, полипролиновых или полилизиновых участков), особенностей белков, которые способствуют NMD, (например, длинного 3' UTR, стоп-кодона >50 н. Перед последним экзон:экзонным сочленением и расщепляемости пептида).

[221] В настоящем документе представлен способ идентификации специфически связывающих аллели HLA пептидов, включающий проведение анализа последовательности пептида с помощью машины, которую обучили с помощью базы данных последовательностей пептидов, полученных путем выполнения описанного в настоящем документе способа для аллелей HLA. В некоторых вариантах осуществления способ включает определение уровня экспрессии исходного белка пептида в клетке; и при этом экспрессия исходного белка является прогностической переменной, используемой машиной. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии определяют путем измерения количества исходного белка или количества РНК, кодирующей указанный исходный белок.

[222] В настоящем документе представлена композиция, содержащая первую и вторую рекомбинантную полинуклеиновую кислоту, каждая из которых содержит последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA, при этом последовательность, кодирующая меченный аффинным акцептором HLA, содержит (a) последовательность, кодирующую другой рекомбинантный аллель α-цепи HLA I класса, (b) последовательность, кодирующую аффинный пептид-акцептор, и необязательно, (c) последовательность, кодирующую β2 микроглобулин; при этом последовательности (a) и (b) и необязательно (c) функционально связаны.

[223] В настоящем документе представлена композиция, содержащая первую и вторую рекомбинантную полинуклеиновую кислоту, каждая из которых содержит последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA, при этом последовательность, кодирующая меченный аффинным акцептором HLA, содержит (a) последовательность, кодирующую рекомбинантный аллель α-цепи HLA II класса, (b) последовательность, кодирующую аффинный пептид-акцептор, и необязательно, (c) последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса; при этом последовательности (a) и (b) и необязательно (c) функционально связаны.

[224] В некоторых вариантах осуществления выделяют первую и вторую рекомбинантные полинуклеиновые кислоты.

[225] В некоторых вариантах осуществления последовательность кодирует аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса относится к неклассической группе класса-I-b. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-E, HLA-F и HLA-G. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса относится к неклассической группе класса-I-b, выбранной из группы, состоящей из HLA-E, HLA-F и HLA-G.

[226] В некоторых вариантах осуществления как для первой, так и для второй рекомбинантных полинуклеиновых кислот: последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью из последовательности, кодирующей другой аллель рекомбинантного HLA, которая кодирует внеклеточную часть другого аллеля рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления как для первой, так и для второй рекомбинантных полинуклеиновых кислот: последовательность, кодирующая аффинную молекулу-акцептор, функционально связана с N-концом последовательности, кодирующей другой аллель рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления как для первой, так и для второй рекомбинантных полинуклеиновых кислот: последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью из последовательности, кодирующей другой аллель рекомбинантного HLA, которая кодирует внутриклеточную часть другого аллеля рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления как для первой, так и для второй рекомбинантных полинуклеиновых кислот: последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с C-концом последовательности, кодирующей другой аллель рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления как для первой, так и для второй рекомбинантных полинуклеиновых кислот: последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей другой аллель рекомбинантного HLA, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор специфически связывается с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора. В некоторых вариантах осуществления аффинный пептид-акцептор первой и второй рекомбинантных полинуклеиновых кислот отличается.

[227] В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор может включать в себя пептид-акцептор биотина (BAP), полигистидиновую метку, полигистидин-глициновую метку, полиаргининовую метку, полиаспартатную метку, полицистеиновую метку, полифенилаланин, метку c-myc, гликопротеиновую D (gD) метку вируса простого герпеса, метку FLAG, эпитопную метку KT3, тубулиновую эпитопную метку, пептидную метку белка 10 гена Т7, стрептавидиновую метку, метку стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метку, Strep-метку II, метку альбумин-связывающего белка (ABP), метку щелочной фосфатазы (AP), метку вируса катаральной лихорадки (B-метка), метку кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метку хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метку холин-связывающего домена (CBD), метку хитин-связывающего домена (CBD), метку целлюлозосвязывающего домена (CBP), метку дигидрофолатредуктазы (DHFR), метку галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансферазу (GST), метку Glu-Glu (EE), метку гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метку пероксидазы хрена (HA), NE-метку, метку HSV, метку кетостероид-изомеразы (KSI), метку KT3, метку LacZ, люциферазную метку, метку NusA, метку домена PDZ, AviTag, кальмодулиновую метку, E-метку, S-метку, SBP-метку, Softag 1, Softag 3, метку TC, VSV-метку, метку Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метку Profinity eXact, метку протеина C, S1-метку, S-метку, метку белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метку зеленого флуоресцентного белка (GFP), метку малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метку тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метку, метку Thioredoxin, Fc-метку, метку CYD, метку HPC, метку TrpE, убиквитиновую метку, эпитопную метку VSV-G, метку V5 или их комбинацию; необязательно при этом аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки. В некоторых вариантах осуществления молекулой связывания аффинного пептида-акцептора является биотин или антитело, специфическое к аффинному пептиду-акцептору. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора специфически связывается с аффинной молекулой. В некоторых вариантах осуществления аффинной молекулой является стрептавидин, NeutrAvidin или их производное. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора не имеет специфического взаимодействия с аминокислотной последовательностью кодируемого рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления как для первой, так и для второй рекомбинантных полинуклеиновых кислот: последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA, стабильно встраивают в геном клетки. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, или последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор.

[228] В некоторых вариантах осуществления второй аффинный пептид-акцептор содержит метку HA. В некоторых вариантах осуществления второй аффинный пептид-акцептор может включать в себя пептид-акцептор биотина (BAP), полигистидиновую метку, полигистидин-глициновую метку, полиаргининовую метку, полиаспартатную метку, полицистеиновую метку, полифенилаланин, метку c-myc, гликопротеиновую D (gD) метку вируса простого герпеса, метку FLAG, эпитопную метку KT3, тубулиновую эпитопную метку, пептидную метку белка 10 гена Т7, стрептавидиновую метку, метку стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метку, Strep-метку II, метку альбумин-связывающего белка (ABP), метку щелочной фосфатазы (AP), метку вируса катаральной лихорадки (B-метка), метку кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метку хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метку холин-связывающего домена (CBD), метку хитин-связывающего домена (CBD), метку целлюлозосвязывающего домена (CBP), метку дигидрофолатредуктазы (DHFR), метку галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансферазу (GST), метку Glu-Glu (EE), метку гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метку пероксидазы хрена (HA), NE-метку, метку HSV, метку кетостероид-изомеразы (KSI), метку KT3, метку LacZ, люциферазную метку, метку NusA, метку домена PDZ, AviTag, кальмодулиновую метку, E-метку, S-метку, SBP-метку, Softag 1, Softag 3, метку TC, VSV-метку, метку Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метку Profinity eXact, метку протеина C, S1-метку, S-метку, метку белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метку зеленого флуоресцентного белка (GFP), метку малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метку тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метку, метку Thioredoxin, Fc-метку, метку CYD, метку HPC, метку TrpE, убиквитиновую метку, эпитопную метку VSV-G, метку V5 или их комбинацию; необязательно при этом второй аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки.

[229] В некоторых вариантах осуществления как для первой, так и для второй рекомбинантных полинуклеиновых кислот: последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, или последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей разные рекомбинантный HLA и аффинный пептид-акцептор посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность полинуклеиновой кислоты, кодирующую расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой элемент-участок ухода с рибосомы или участок внутренней посадки рибосомы (IRES). В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы или IRES расщепляется при экспрессии в клетках. В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы выбирают из группы, состоящей из F2A, T2A, P2A и E2A. В некоторых вариантах осуществления элемент IRES выбирают из общих клеточных или вирусных последовательностей IRES.

[230] В настоящем документе представлена композиция, содержащая первую и вторую выделенные полипептидные молекулы, кодируемые первой и второй полинуклеиновыми кислотами, соответственно, композиции, описанной в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая первую и вторую клетки, содержащие первую и вторую полипептидную молекулы, кодируемые первой и второй полинуклеиновыми кислотами, соответственно, композиции, описанной в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая первую и вторую клетки, содержащие первую и вторую полинуклеиновые кислоты, соответственно, композиции, описанной в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая первый и второй популяция клеток, содержащих одну или более клеток, содержащих первый и второй полинуклеиновые кислоты, соответственно композиции, описанной в настоящем документе.

[231] В некоторых вариантах осуществления первая и вторая популяции клеток экспрессируют один или более аллелей эндогенного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют первую и вторую популяцию клеток, у которых отсутствует один или более аллелей эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют первую и вторую популяцию клеток, у которых отсутствуют аллели эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют первую и вторую популяцию клеток, у которых отсутствует один или более аллелей эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют первую и вторую популяцию клеток, у которых отсутствуют аллели эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют первую и вторую популяцию клеток, у которых отсутствуют аллели эндогенного HLA I класса и аллели эндогенного HLA II класса.

[232] В настоящем документе представлен способ получения клетки, включающий трансдукцию или трансфекцию первой и второй клетки первой и второй полинуклеиновыми кислотами, соответственно, композиции, описанной в настоящем документе.

[233] В настоящем документе представлен пептид, идентифицированный согласно способу, описанному в настоящем документе.

[234] В настоящем документе представлен способ обогащения иммуногенных пептидов, включающий: предоставление популяции клеток, содержащей одну или более клеток, экспрессирующих меченный аффинным акцептором HLA, причем меченный аффинным акцептором HLA содержит аффинный пептид-акцептор, функционально связанный с рекомбинантным HLA, кодируемым аллелем рекомбинантного HLA; и обогащение комплексов HLA-пептиды, содержащих меченный аффинным акцептором HLA. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает определение последовательности иммуногенных пептидов, выделенных из комплексов HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя использование LC-MS/MS.

Система Человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)

[235] Иммунную систему можно разделить на две функциональные подсистемы: врожденную и адаптивную иммунную систему. Врожденная иммунная система является первой линией защиты от инфекций, и большинство потенциальных патогенов быстро нейтрализуются этой системой, прежде чем они могут вызвать, например, заметное заражение. Адаптивная иммунная система реагирует на молекулярные структуры вторгающегося организма, называемые антигенами. В отличие от врожденной иммунной системы, адаптивная иммунная система очень специфична для патогена. Адаптивный иммунитет также может обеспечивать длительную защиту; например, тот, кто выздоравливает от кори, теперь защищен от кори на протяжении всей жизни. Существует два типа адаптивных иммунных реакций, которые включают гуморальную иммунную реакцию и опосредованную клетками иммунную реакцию. При гуморальной иммунной реакции антитела, выделяемые В-клетками в текучие среды организма, связываются с антигенами, происходящими из патогенов, что приводит к элиминации патогена с помощью различных механизмов, например, опосредованного комплементом лизиса. В опосредованной клетками иммунной реакции активируются Т-клетки, способные разрушать другие клетки. Например, если в клетке присутствуют белки, связанные с заболеванием, они протеолитически фрагментируются на пептиды внутри клетки. Затем специфические клеточные белки сами присоединяются к антигену или образованному таким образом пептиду и транспортируют их на поверхность клетки, где их презентируют механизмам молекулярной защиты в Т-клетках организма. Цитотоксические Т-клетки распознают эти антигены и убивают клетки, которые содержат антигены.

[236] Термин «главный комплекс гистосовместимости (MHC)», «молекулы MHC» или «белки MHC» относится к белкам, способным связывать пептиды, образующиеся в результате протеолитического расщепления белковых антигенов, и представляющим потенциальные T-клеточные эпитопы, транспортируя их к поверхности клетки и презентируя их там специфическим клеткам, например, в цитотоксических Т-лимфоцитах или Т-хелперных клетках. MHC человека также называют комплексом HLA. Таким образом, термин «система человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)», «молекулы HLA» или «белки HLA» относится к генному комплексу, кодирующему белки MHC у людей. Термин МНС обозначается как комплекс «Н-2» у мышей. Рядовым специалистам в данной области должно быть понятно, что термины «главный комплекс гистосовместимости (MHC)», «молекулы MHC», «белки MHC» и «система человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)», «молекулы HLA», «белки HLA» используются в настоящем документе взаимозаменяемо.

[237] Белки HLA подразделяют на два типа, называемые HLA I класса и HLA II класса. Структуры белков HLA двух классов очень похожи; однако, они имеют очень разные функции. Белки HLA I класса присутствуют на поверхности почти все клеток организма, включая большинство опухолевых клеток. Белки HLA I класса загружают антигены, которые обычно происходят из эндогенных белков или из патогенных микроорганизмов, присутствующих внутри клеток, а затем презентируют наивным или цитотоксическим T-лимфоцитам (CTL). Белки HLA II класса презентируют на антигенпрезентирующих клетках (APC), включая, но без ограничения дендритные клетки, B-клетки и макрофаги. В основном они презентируют пептиды, которые процессируют из внешних источников антигенов, то есть за пределами клеток, T-хелперам. Большинство пептидов, связываемых белками HLA I класса, происходят из цитоплазматических белков, продуцируемых в здоровых клетках-хозяевах самого организма, и обычно не стимулируют иммунную реакцию.

[238] молекулы HLA I класса состоят из тяжелой цепи и легкой цепи и способны связывать пептид из приблизительно 7-13 аминокислот (например, приблизительно 8-11 аминокислот или 9 или 10 аминокислот), если это пептид имеет подходящие мотивы связывания, и презентировать его цитотоксическим Т-лимфоцитам. Пептиды, связанные молекулами HLA I класса, происходят из эндогенного белкового антигена. Тяжелая цепь молекул HLA I класса может представлять собой мономер HLA-A, HLA-B или HLA-C, а легкая цепь представляет собой β-2-микроглобулин. HLA I класса встречается в виде α-цепи, состоящей из трех доменов - α1, α2 и α3. Эту цепь часто называют тяжелая цепь I класса, а в данном документе называют альфа-цепь I класса. α1 основана на единице молекулы β2 микроглобулина не HLA (кодируется в хромосоме 15 человека). Домен α3 является трансмембранным, закрепляющим молекулу HLA класса I на клеточной мембране. Презентируемый пептид удерживается дном пептидсвязывающей бороздки в центральной области гетеродимера α1/α2 (молекулы, состоящей из двух неидентичных субъединиц). HLA-A, HLA-B или HLA-C I класса являются высоко полиморфными. HLA класса Ib проявляет ограниченный полиморфизм, профили экспрессии и презентируемые антигены. Эту группу подразделяют на группу, кодируемую в локусах HLA, например, HLA-E, HLA-F, HLA-G, а также группы, не являющиеся, например, стрессовыми лигандами, такими как ULBPs, Rae1 и H60. Антиген/лиганд для многих из этих молекул остается неизвестным, но они могут взаимодействовать с каждой из CD8+ T-клеток, NKT-клеток и NK-клеток.

[239] В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытие используют неклассический аллель HLA-E I класса. HLA-E - это одна из неклассических молекул I класса, распознаваемых клетками-природными киллерами (NK) и CD8+ T-клетками. HLA-E экспрессируется почти во всех тканях, включая клетки легких, печени, кожи и плаценты. Экспрессию HLA-E также обнаруживают в солидных опухолях (например, остеосаркоме и меланоме). HLA-E связывается с TCR, экспрессируемым на CD8+ T-клетках, что приводит к активации T-клеток. Также известно, что HLA-E связывает рецептор CD94/NKG2, экспрессируемый на NK-клетках и CD8+ T-клетках. CD94 может соединяться с несколькими различными изоформами NKG2 с образованием рецепторов с потенциалом либо ингибировать (NKG2A, NKG2B), либо способствовать (NKG2C) клеточной активации. HLA-E может связываться с пептидом, полученным из аминокислотных остатков 3-11 лидерных последовательностей большинства молекул HLA-A, -B, -C и -G, но не может связывать свой собственный лидерный пептид. Также было показано, что HLA-E презентирует пептиды, полученные из эндогенных белков, сходных с аллелями HLA-A, -B и -C. В физиологических условиях взаимодействие CD94/NKG2A с HLA-E, нагруженным пептидами из лидерных последовательностей HLA I класса, обычно индуцирует ингибирующие сигналы. Цитомегаловирус (ЦМВ) использует механизм ухода от иммунного надзора NK-клеток посредством экспрессии гликопротеина UL40, имитирующего лидерную последовательность HLA-A. Однако также сообщается, что CD8+ T-клетки могут распознавать HLA-E, нагруженный пептидом UL40, полученным из штамма CMV Toledo, и учавствовать в защите от CMV. В ряде исследований выявлено несколько важных функций HLA-E при инфекционных заболеваниях и раке.

[240] Пептидные антигены сами прикрепляются к молекулам HLA I класса путем конкурентного аффинного связывания внутри эндоплазматического ретикулума, перед их презентацией на поверхности клетки. В данном случае аффинность отдельного пептидного антигена напрямую связана с его аминокислотной последовательностью и наличием специфических мотивов связывания в определенных положениях внутри аминокислотной последовательности. Если известна последовательность такого пептида, то можно манипулировать иммунной системой против пораженных клеток, используя, например, пептидные вакцины.

[241] молекулы HLA II класса имеют две цепи, α и β, каждая из которых имеет два домена - α1 и α2 и β1 и β2 - каждая цепь имеет трансмембранный домен, α2 и β2, соответственно, прикрепляющий молекулу HLA II класса к клеточной мембране. Пептидсвязывающая бороздка образована из гетеродимера α1 и β1. Пептид, связанный молекулами HLA II класса, обычно происходит из внеклеточного участка экзогенного белкового антигена. α-цепь и β-цепь находятся в мономерах HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP (фиг. 1B). Молекулы HLA II класса имеют шесть изотипов. Классические молекулы презентируют пептиды CD4+ лимфоцитам. Неклассические молекулы, дополнительные, с внутриклеточными функциями, находятся не на клеточных мембранах, а на внутренних мембранах в лизосомах, обычно загружая антигенные пептиды на классические молекулы HLA II класса.

[242] В HLA II класса, фагоциты, такие как макрофаги и незрелые дендритные клетки, забирают объекты путем фагоцитоза в фагосомы - хотя В-клетки демонстрируют более общий эндоцитоз в эндосомы - которые сливаются с лизосомами, кислотные ферменты которых расщепляют поглощенный белок на множество различных пептидов. Аутофагия является еще одним источником пептидов HLA II класса. За счет физико-химической динамики в молекулярном взаимодействии с вариантами HLA II класса, переносимыми хозяином, кодируемыми в геноме хозяина, определенный пептид проявляет иммунодоминантность и загружается в молекулы HLA II класса. Они перемещаются и выходят на поверхность клетки. Наиболее изученными генами HLA подкласса II являются: HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA и HLA-DRB1.

[243] Презентация пептидов молекулами HLA II класса CD4+ T-хелперам необходима для иммунного ответа на чужеродные антигены (Roche and Furuta, 2015). После активации CD4+ T-клетки стимулируют дифференцировку B-клеток и выработку антител, а также ответы CD8+ T-клеток (CTL). CD4+ T-клетки также секретируют цитокины и хемокины, которые активируют и индуцируют дифференцировку других иммунных клеток. Молекулы HLA II класса представляют собой гетеродимеры α и β цепей, которые взаимодействуют с образованием пептидсвязывающей бороздки, которая является более открытой, чем пептидсвязывающие бороздки I класса (Unanue et al., 2016). Считается, что пептиды, связанные с молекулами HLA II класса, имеют ядро, связывающее 9 аминокислот, с фланкирующими остатками на N- или C-концевой стороне, выступающими из бороздки (Jardetzky et al., 1996; Stern et al., 1994). Эти пептиды обычно имеют длину 12-16 аминокислот и часто содержат 3-4 якорных остатка в положениях P1, P4, P6/7 и P9 регистра связывания (Rossjohn et al., 2015).

[244] Аллели HLA экспрессируются в кодоминантной форме, что означает, что аллели (варианты), унаследованные от обоих родителей, экспрессируются одинаково. Например, каждый человек несет 2 аллеля каждого из 3 генов I класса (HLA-A, HLA-B и HLA-C) и, следовательно, может экспрессировать шесть различных типов HLA II класса. В локусе HLA II класса каждый человек наследует пару генов HLA-DP (DPA1 и DPB1, которые кодируют α и β цепи), пару генов HLA-DQ (DQA1 и DQB1, для α и β цепей), один ген HLA-DRα (DRA1) и один или более генов HLA-DRβ (DRB1 и DRB3, -4 или -5). Это означает, что один гетерозиготный индивидуум может наследовать шесть или восемь функционирующих аллелей HLA II класса, по три или более от каждого родителя. Таким образом, гены HLA очень полиморфны; у разных людей внутри популяции существует много разных аллелей. Гены, кодирующие белки HLA, имеют множество возможных вариаций, позволяющих иммунной системе каждого человека реагировать на широкий круг чужеродных захватчиков. Некоторые гены HLA имеют сотни идентифицированных версий (аллелей), каждому из которых присваивается определенный номер. В некоторых вариантах осуществления аллели HLA I класса представляют собой HLA-A*02:01, HLA-B*14:02, HLA-A*23:01, HLA-E*01:01 (неклассический). В некоторых вариантах осуществления аллели HLA II класса представляют собой HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02, HLA-DRB 11:01, HLA-DRB*15:01 и HLA-DRB*07:01.

[245] Специфические для субъекта аллели HLA или генотип HLA субъекта можно определить любым способом, известным в данной области. В иллюстративных вариантах осуществления генотипы HLA определяют любым способом, описанным в международной заявке на патент № PCT/US2014/068746, опубликованной 11 июня 2015 г. Как W02015085147. Вкратце, способы включают определение типов полиморфных генов, которое может включать в себя создание выравнивания считываний, извлеченных из набора данных секвенирования, в набор эталонных генов, содержащий варианты аллелей полиморфного гена, определение первой апостериорной вероятности или оценки, полученной по апостериорной вероятности, для каждого варианта аллеля в выравнивании, идентификацию варианта аллеля с максимальной первой апостериорной вероятностью или оценкой, полученной по апостериорной вероятности, в качестве первого варианта аллеля, идентификацию одного или более перекрывающихся считываний, которые выровнены с первым вариантом аллеля и одним или более другими вариантами аллеля, определение второй апостериорной вероятности или оценки, полученной по апостериорной вероятности, для одного или более других вариантов аллелей с использованием весового коэффициента, идентификацию второго варианта аллеля путем выбора варианта аллеля с максимальной второй апостериорной вероятностью или оценкой, полученной по апостериорной вероятности, причем первый и второй варианты аллелей определяют тип гена для полиморфного гена, и обеспечение вывода первого и второго варианта аллеля.

[246] Как описано в настоящем документе, имеется большое количество доказательств как у животных, так и у людей, что мутантные эпитопы эффективны в индукции иммунного ответа и что случаи спонтанной регрессии опухоли или долгосрочной выживаемости коррелируют с ответами CD8+ T-клеток на мутантные эпитопы. (Buckwalter и Srivastava PK. «It is the antigen(s), stupid” and other lessons from over a decade of vaccitherapy of human cancer. Seminars in immunology 20:296-300 (2008); Karanikas et al., Высокая частота цитолитических Т-лимфоцитов, направленных против специфического для опухоли мутантного антигена, обнаруживаемого тетрамерами HLA в крови пациента с карциномой легкого с длительным выживанием. Cancer Res. 61: 3718-3724 (2001); Lennerz et al. В ответе аутологичных Т-клеток на меланому человека преобладают мутантные неоантигены (Proc Natl Acad Sci US A.102: 16013 (2005)), и это «иммуноредактирование» можно проследить по изменениям экспрессии доминантных мутантных антигенов у мышей и человека (Matsushita et al., Анализ ракового экзома раскрывает Т-клеточно-зависимый механизм иммуноредактирования рака. Nature 482: 400 (2012); DuPage et al. В основе иммуноредактирования рака лежит экспрессия опухолеспецифических антигенов. Nature 482: 405 (2012); и Sampson et al. Иммунологический уход после продолжительной выживаемости без прогрессирования с помощью пептидной вакцинации III варианта рецептора эпидермального фактора роста у пациентов с недавно диагностированной глиобластомой J Clin Oncol. 28: 4722-4729 (2010)).

[247] Технология секвенирования показала, что каждая опухоль содержит множество специфичных для пациента мутаций, которые изменяют содержание белка, кодирующего ген. Такие мутации создают измененные белки, начиная от единичных аминокислотных изменений (вызванных ошибочными мутациями) до добавления длинных областей новой аминокислотной последовательности из-за сдвигов рамки, считывания терминирующих кодонов или трансляции областей интронов (новые мутации открытой рамки считывания); neoORF). Эти мутантные белки являются значимыми мишенями для иммунного ответа хозяина на опухоль, так как, в отличие от нативных белков, они не подвержены иммуносупрессорному эффекту самостоятельной толерантности. Следовательно, более вероятно, что мутантные белки будут иммуногенными, а также более специфическими для опухолевых клеток по сравнению с нормальными клетками пациента.

[248] Термин «T-клетка» включает в себя CD4+ T-клетки и CD8+ T-клетки. Термин T-клетка также включает в себя как T-клетки T-хелперы 1 типа, так и T-клетки T-хелперы 2 типа. T-клетки в рамках настоящего изобретения обычно классифицируют по функции и антигенам клеточной поверхности (антигенам кластера дифференцировки или CD), которые также облегчают связывание T-клеточного рецептора с антигеном, на два больших класса: T-хелперные (TH) клетки и цитотоксические T-лимфоциты (CTL).

[249] Зрелые Т-хелперы экспрессируют поверхностный белок CD4 и обозначаются как CD4+ Т-клетки. После развития Т-клеток зрелые наивные Т-клетки покидают тимус и начинают распространяться по всему организму, включая лимфатические узлы. Наивные Т-клетки - это те Т-клетки, которые никогда не подвергались воздействию антигена, на который они запрограммированы реагировать. Как и все Т-клетки, они экспрессируют комплекс Т-клеточный рецептор-CD3. Т-клеточный рецептор (TCR) состоит из константных и вариабельных областей. Вариабельная область определяет, на какой антиген может реагировать Т-клетка. CD4+ T-клетки имеют TCR с аффинностью к MHC II класса, а CD4 участвует в определении аффинности MHC во время созревания в тимусе. Белки МНС II класса обычно обнаруживают только на поверхности специализированных антигенпрезентирующих клеток (АРС). Специализированные антигенпрезентирующие клетки (АРС) - это, прежде всего, дендритные клетки, макрофаги и В-клетки, хотя дендритные клетки являются единственной группой клеток, которая экспрессирует МНС II класса постоянно (все время). Некоторые АРС также связывают нативные (или непроцессированные) антигены с их поверхностью, например, фолликулярные дендритные клетки, но непроцессированные антигены не взаимодействуют с Т-клетками и не участвуют в их активации. Пептидные антигены, которые связываются с белками MHC I класса, обычно короче, чем пептидные антигены, которые связываются с белками MHC II класса.

[250] Цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), также известные как цитотоксические Т-клетки, цитолитические Т-клетки, CD+Т-клетки или киллерные Т-клетки, относятся к лимфоцитам, которые вызывают апоптоз в клетках-мишенях. CTL образуют антигенспецифические конъюгаты с клетками-мишенями посредством взаимодействия TCR с процессированным антигеном (Ag) на поверхности клеток-мишеней, что приводит к апоптозу клетки-мишени. Апоптотические тела устраняются макрофагами. Термин «ответ CTL» используется для обозначения первичного иммунного ответа, опосредованного клетками CTL. Цитотоксические Т-лимфоциты имеют на поверхности как Т-клеточные рецепторы (TCR), так и молекулы CD8. Т-клеточные рецепторы способны распознавать и связывать пептиды, образованные в комплексе с молекулами HLA I класса. Каждый цитотоксический Т-лимфоцит экспрессирует уникальный Т-клеточный рецептор, который способен связывать специфические комплексы МНС/пептид. Большинство цитотоксических Т-клеток экспрессируют Т-клеточные рецепторы (TCR), которые могут распознавать специфический антиген. Для того чтобы TCR связывался с молекулой МНС I класса, первый должен сопровождаться гликопротеином под названием CD8, который связывается с константной частью молекулы МНС I класса. Следовательно, эти Т-клетки называются CD8+ Т-клетками. Аффинность между CD8 и молекулой МНС удерживает Т-клетку и клетку-мишень в тесном контакте во время антигенспецифической активации. CD8+ T-клетки распознаются как T-клетки после их активации, и их обычно классифицируют как имеющие заранее определенную цитотоксическую роль в иммунной системе. Однако CD8+ T-клетки также обладают способностью вырабатывать некоторые цитокины.

[251] «Т-клеточные рецепторы (TCR)» представляют собой рецепторы клеточной поверхности, которые участвуют в активации Т-клеток в ответ на презентацию антигена. TCR обычно состоит из двух цепей, альфа и бета, которые при сборке образуют гетеродимер и связываются с субъединицами, трансдуцирующими CD3, с образованием комплекса рецептор-Т-клетка, присутствующего на поверхности клетки. Каждая альфа- и бета-цепь TCR состоит из иммуноглобулиноподобной N-концевой вариабельной (V) и константной (C) области, гидрофобного трансмембранного домена и короткой цитоплазматической области. Что касается молекул иммуноглобулина, вариабельные области альфа- и бета-цепей генерируют путем рекомбинации V(D)J, создавая большое разнообразие антигенных специфичностей в популяции Т-клеток. Однако, в отличие от иммуноглобулинов, которые распознают интактный антиген, Т-клетки активируются процессированными фрагментами пептидов в ассоциации с молекулой МНС, вводя дополнительное измерение для распознавания антигена Т-клетками, известное как рестрикция МНС. Распознавание MHC-различий между донором и реципиентом через Т-клеточный рецептор приводит к пролиферации Т-клеток и потенциальному развитию GVHD. Было показано, что нормальная поверхностная экспрессия TCR зависит от скоординированного синтеза и сборки всех семи компонентов комплекса (Ashwell и Klusner 1990). Инактивация TCRα или TCRβ может приводить к элиминированию TCR с поверхности T-клеток, предотвращая распознавание аллоантигена и, следовательно, GVHD. Однако нарушение TCR обычно приводит к элиминированию сигнального компонента CD3 и изменяет средства дальнейшей экспансии T-клеток.

[252] Термин «пептидом HLA» относится к пулу пептидов, который специфически взаимодействует с конкретным классом HLA и может включать тысячи различных последовательностей. Пептидомы HLA включают разнообразные пептиды, полученные как из нормальных, так и аномальных белков, экспрессируемых в клетках. Таким образом, пептидомы HLA можно изучать для идентификации специфических для рака пептидов, для разработки противоопухолевого иммунотерапевтического средства и в качестве источника информации о схемах синтеза и деградации белка в раковых клетках. В некоторых вариантах осуществления пептидом HLA представляет собой пул растворимых молекул HLA (sHLA). В некоторых вариантах осуществления пептидом HLA представляет собой пул мембранной HLA (mHLA).

[253] Термин «антигенпрезентирующая клетка» или «АРС» включает профессиональные антигенпрезентирующие клетки (например, В-лимфоциты, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, клетки Лангерганса), а также другие антигенпрезентирующие клетки (например, кератиноциты, эндотелиальные клетки, астроциты, фибробласты, олигодендроциты, эпителиальные клетки тимуса, эпителиальные клетки щитовидной железы, глиальные клетки (головного мозга), бета-клетки поджелудочной железы и эндотелиальные клетки сосудов). «Антигенпрезентирующая клетка» или «АРС» представляет собой клетку, которая экспрессирует молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС) и может демонстрировать чужеродный антиген, образующий комплекс с МНС, на своей поверхности.

Конвейер для универсальной IP: Платформа для Универсальной Идентификации Комплексов Моноаллельные HLA-пептиды

[254] Адаптивные иммунные ответы частично зависят от способности цитотоксических CD8+ T-клеток идентифицировать и уничтожать клетки, которые демонстрируют связанные с заболеванием антигены, связанные с молекулами I класса человеческого лейкоцитарного антигена (HLA). Белки HLA I класса (HLA-A, B и C) экспрессируются на поверхности почти всех ядросодержащих клеток в организме человека и необходимы для презентации коротких пептидов для обнаружения рецепторами CD8+ T-клеток. Связанные с HLA пептиды возникают из эндогенных или чужеродных белков, которые расщепляются протеасомой и ER-пептидазами до загрузки и демонстрации белками HLA I класса. Гены HLA являются наиболее полиморфными генами в человеческой популяции, и на сегодняшний день выявлено более 10000 вариантов аллелей HLA I класса (Robinson et al., 2015). Предполагается, что каждый аллель HLA связывает и презентирует Т-клеткам ~ 1000-10000 уникальных пептидов; ≤0,1% из ~ 10 миллионов потенциальных 9-мерных пептидов из генов, кодирующих белки человека (Bassani-Sternberg et al., 2015; Hunt et al., 1992; Rammensee et al., 1995, 1999; Rock et al .; Vita et al. ., 2015; Walz et al., 2015).

[255] В отличие от I класса, белки HLA II класса (HLA-DR, DQ и DP) в ответ на воспалительные сигналы экспрессируются только на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC) и клеток эпителиальных, сосудистых и соединительных тканей. Презентация молекулами HLA II класса пептидов, чаще всего происходящих из экзогенных белков, CD4+ Т-клеткам необходима для иммунного ответа на чужеродные антигены (Roche and Furuta, 2015). После активации CD4+ T-клетки стимулируют дифференцировку B-клеток и выработку антител, а также ответы CD8+ T-клеток. CD4+ T-клетки также секретируют цитокины и хемокины, которые активируют и индуцируют дифференцировку других иммунных клеток. Молекулы HLA II класса представляют собой гетеродимеры α и β цепей, которые взаимодействуют с образованием пептидсвязывающей бороздки, которая является более открытой, чем пептидсвязывающие бороздки I класса (Unanue et al., 2016). Считается, что пептиды, связанные с молекулами HLA II класса, имеют ядро, связывающее 9 аминокислот, с фланкирующими остатками на N- или C-концевой стороне, выступающими из бороздки (Jardetzky et al., 1996; Stern et al., 1994). Эти пептиды обычно имеют длину 12-16 аминокислот и часто содержат 3-4 якорных остатка в положениях P1, P4, P6/7 и P9 регистра связывания (Rossjohn et al., 2015). Меньше известно об аллель-специфических пептидсвязывающих характеристиках молекул HLA II класса из-за неоднородности спаривания α- и β-цепей, сложности данных, ограничивающих способность уверенно назначать эпитопы связывания с ядром, и отсутствия степени иммунопреципитации, аллельспецифичных антител, необходимых для биохимического анализа с высоким разрешением.

[256] Правила связывания пептидов были тщательно изучены для подмножества аллелей HLA (Vita et al., 2015) и закодированы в современных алгоритмах на основе нейронных сетей, которые прогнозируют связывание (Hoof et al., 2009; Lundegaard et al., 2008). Однако некоторые факторы ограничивают способность прогнозировать пептиды, презентированные на аллелях HLA. Во-первых, происхождение данных о пептидах, на которых обучаются эти алгоритмы, разнообразно, от скрининга библиотеки пептидов до деградации Эдмана и основанного на масс-спектрометрии секвенирования эндогенно обработанных и презентированных пептидов (Boen et al., 2000; Rammensee et al., 1995 , 1999; Vita et al., 2015). Масс-спектрометрическая идентификация пептидов составляет около 30% от общей идентификации в IEDB. Масс-спектрометрия стала желательным методом секвенирования пептидов, связанных с HLA, благодаря новаторской работе Дональда Ф. Ханта и его коллег (Cobbold et al., 2013; Hunt et al., 1992; Meadows et al., 1997; Mohammed et al. , 2008; Zarling et al., 2000, 2006), а также усовершенствованиям инструментальных средств, продемонстрированные многими группами за последние два десятилетия (Bassani-Sternberg et al., 2015; Caron et al., 2015; Mommen et al., 2014). Во-вторых, многие существующие алгоритмы прогнозирования были направлены на прогнозирование связывания, но могут не полностью учитывать эндогенные процессы, которые генерируют и транспортируют пептиды для связывания (Larsen et al., 2007). В-третьих, количество связывающих пептидов для многих аллелей HLA слишком мало, чтобы разработать надежное средство прогнозирования. Однако до настоящего времени созданию высококачественных наборов ресурсных данных препятствовали неэффективные протоколы, которые требуют чрезмерно большого количества входного клеточного материала, а также отсутствие инструментов поиска в базе данных для секвенирования пептидов HLA (Caron et al., 2015; Hoof et al. al., 2009; Lundegaard et al., 2008; Vita et al., 2015).

[257] В данном документе раскрыта уникальная стратегия биохимического обогащения комплексов пептид-HLA I и II класса из живых клеток и клеточного лизата. Молекулы HLA, содержащие N-концевую или С-концевую последовательность метки (например, BAP или HA), можно пометить на клеточной поверхности или в клеточном лизате. Например, молекулы HLA, содержащие N-концевую или С-концевую последовательность пептида-акцептора биотина (BAP), можно ферментативно пометить биотином на клеточной поверхности или в клеточном лизате. Например, молекулы HLA, содержащие N-концевую или С-концевую последовательность HA, можно обогащать смесями клеточными комплексов с использованием HA-специфического антитела. В иллюстративном варианте осуществления меченные биотином комплексы HLA-пептиды обогащают из клеточных смесей комплексов с использованием гранул стрептавидина/NeutrAvidin, и обогащенные комплексы HLA-пептиды анализируют, или получают их характеристики. В иллюстративном варианте осуществления меченные HA комплексы HLA-пептиды обогащают из клеточных смесей комплексов с использованием HA-специфического антитела, и обогащенные комплексы HLA-пептиды анализируют, или получают их характеристики. Например, связанные пептиды можно элюировать и секвенировать с помощью LC-MS/MS. Важно отметить, что раскрытые в настоящее время способы обеспечивают платформу для универсального анализа и получения характеристик комплексов HLA-пептиды. Например, раскрытые в настоящее время способы обеспечивают платформу для универсальной идентификации эндогенно представленных пептидов из клеточной линии, экспрессирующей все возможные конструкции I или II класса.

[258] В данном документе раскрыты отдельные линии клеток, экспрессирующих аллели HLA I класса и II класса, позволяющие однозначно назначить пептид:аллель (Shimizu and DeMars, 1989; Shimizu et al., 1986). Это усовершенствование современных методов обнаружения HLA-связанных пептидов, так как большинство исследований на основе MS включают элюцию и секвенирование грязной смеси лигандов, связанных с несколькими молекулами HLA-A, B и C, что требует прогнозирования аффинности и иногда деконволюции для назначения аллелей (Bassani-Sternberg и Gfeller, 2016). Исследования с растворимыми клеточными линиями, трансфицированными HLA, позволили получить пептидсвязывающие эпитопы для одного аллеля HLA, но наиболее полные эксперименты на сегодняшний день выявили только <200 уникальных пептидов и потребовали на несколько порядков больше исходного клеточного материала (Hawkins et al. 2008). За счет устранения неопределенности в отношении назначения пептид:HLA, раскрытые в настоящее время способы облегчают более глубокую и более точную оценку лигандомов HLA-пептиды и правил, связанных с процессингом и презентацией пептидного антигена с использованием меньшего количества клеточного материала, чем предыдущие попытки.

[259] Способы и композиции, описанные в данном документе, включают, например, химически меченную вариабельную β-цепь (биотинилирование) для дифференциации между гетеродимерами HLA II класса, презентируемыми клетками, которые позволяют улучшить картирование эпитопов. В способах, описанных в настоящем документе, можно использовать конструкции HLA I класса и II класса, которые содержат метку, такую как последовательность пептида-акцептора биотина (BAP), на N- или C-конце. N- и C-концевое аффинное мечение позволяет проводить селективную иммуноаффинную очистку аллелей HLA из клеток, экспрессирующих эндогенный HLA. N-концевое аффинное мечение позволяет проводить селективную иммуноаффинную очистку аллелей HLA комплексов, презентированных на клеточной поверхности. Например, после трансфекции или трансдукции N-концевое биотинилирование позволяет дифференцировать комплексы HLA, презентированные на клеточной поверхности, от всех комплексов HLA-пептиды в клеточных лизатах. Например, биотинилирование комплексов HLA-пептиды на интактных клеточных поверхностях (без лизиса) позволяет использовать методы объективного масс-спектрометрического (МС) секвенирования эндогенно процессированных и презентированных пептидов. Раскрытые здесь способы обогащения, такие как способы обогащения с помощью иммунопреципитации, позволяют проводить высокопроизводительный анализ образцов клеток.

[260] В настоящем документе представлен способ получения характеристик комплексов HLA-пептиды, включающий: предоставление популяции клеток, причем одна или более клеток популяции клеток содержат полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую аллель меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, при этом последовательность, кодирующая меченный аффинным акцептором HLA, содержит последовательность, кодирующую аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор; экспрессию меченного аффинным акцептором HLA по меньшей мере в одной клетке из одной или более клеток популяции клеток, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды по меньшей мере в одной клетке; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и получение характеристик комплексов HLA-пептиды.

[261] В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя получение характеристик пептида, связанного с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения.

[262] В некоторых вариантах осуществления способ включает выполнение стадий способа для двух или более аллелей HLA I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления два или более аллеля HLA I класса и/или II класса включают в себя по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аллелей HLA I класса и/или II класса.

[263] В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат внутриклеточный домен. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды не экскретируют. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды при экспрессии встраивают в клеточную мембрану. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды представляют собой нерастворимые комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды.

[264] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает создание базы данных специфических к аллелям HLA пептидов.

[265] В некоторых вариантах осуществления аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является единственный аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса.

[266] В некоторых вариантах осуществления способ включает: предоставление популяции клеток, каждая из которых содержит одну или более клеток, содержащих меченный аффинным акцептором HLA, причем меченный аффинным акцептором HLA содержит другой рекомбинантный полипептид, кодируемый другим аллелем HLA, функционально связанным с аффинным пептидом-акцептором; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и получение характеристик пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения.

[267] В некоторых вариантах осуществления способ включает введение одного или более пептидов в популяцию клеток.

[268] В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одним или более пептидами или экспрессию одного или более пептидов в популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов. В некоторых вариантах осуществления одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов, является ДНК. В некоторых вариантах осуществления одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов, является РНК, необязательно при этом РНК является мРНК.

[269] В некоторых вариантах осуществления обогащение не включает в себя использование тетрамерного реагента.

[270] В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя определение последовательности пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения, необязательно определение, является ли пептид или его часть модифицированной. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя биохимический анализ, масс-спектрометрический анализ, MS анализ, MS/MS анализ, анализ LC-MS/MS или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя оценку аффинности связывания или стабильности пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя определение, содержит ли пептид или его часть, связанная с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения, одну или более мутаций. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя оценку связей пептидов с молекулами HLA в комплексах меченные аффинным акцептором HLA-пептиды.

[271] В некоторых вариантах осуществления способ включает экспрессию библиотеки пептидов в популяции клеток, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение в контакт с популяцией клеток библиотеки пептидов или библиотеки последовательностей, кодирующих пептиды, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой библиотеку пептидов, связанных с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак, заражение возбудителем инфекции или аутоиммунную реакцию. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение возбудителя инфекции или его частей в одну или более клеток популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одного или более пептидов из комплексов HLA-пептиды, при этом необязательно, чтобы пептиды происходили из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одной или более областей пептидов из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции. В некоторых вариантах осуществления способ включает идентификацию пептидов из комплексов HLA-пептиды, полученных из возбудителя инфекции.

[272] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток происходит из биологического образца у субъекта с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция первичных клеток. В некоторых вариантах осуществления аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса соответствует субъекту с заболеванием или состоянием.

[273] В некоторых вариантах осуществления способ включает скрининг гиперчувствительности к лекарственным средствам (например, биопрепаратам). В некоторых вариантах осуществления способ включает оценку презентации T-клеткам введенного биопрепарата (например, белка, пептида или содержащего антитела лекарственного средства), фрагмента введенных биопрепаратов или фрагмента процессированного биопрепарата. Эти эпитопы могут вызывать неблагоприятное воздействие на субъекта, и, таким образом, следует отслеживать насколько процессируются введенные биологические препараты у субъекта. Например, лекарство против ВИЧ (например, абакавир) может связываться с молекулами HLA и изменять пептидсвязывающие мотивы для некоторых аллелей HLA (например, HLA-B5701).

[274] В некоторых вариантах осуществления пептид из комплекса меченный аффинным акцептором HLA-пептид способен активировать T-клетку у субъекта при презентации антигенпрезентирующей клеткой. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя сравнение комплексов HLA-пептиды из раковых клеток с комплексами HLA-пептиды из нераковых клеток.

[275] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя множество популяций клеток, причем каждая популяция клеток экспрессирует другой аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления каждая популяция клеток множества находится в одном и том же или отдельном контейнере.

[276] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение пептидов из комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды перед получением характеристик. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает удаление одной или более аминокислот на конце пептида, связанного с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид.

[277] В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция клеток с низкой экспрессией HLA клеточной поверхности I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток экспрессирует один или более аллелей эндогенного HLA. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса и аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA I класса.

[278] В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса и нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, кодирует HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F и HLA-G. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, кодирует HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса выбирают из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса содержит α-цепь HLA II класса, β-цепь HLA II класса или их комбинацию.

[279] В некоторых вариантах осуществления каждая последовательность кодирует по меньшей мере два разных аллеля HLA I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей другой аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор.

[280] В некоторых вариантах осуществления способ включает введение по меньшей мере второй полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую другой аллель рекомбинантного HLA, функционально связанный с тем же самым или другим аффинным пептидом-акцептором.

[281] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса.

[282] В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор экспрессируется внеклеточно. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с N-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внутриклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор экспрессируется внутриклеточно. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с C-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, посредством линкера.

[283] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя обогащение интактных клеток, экспрессирующих комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ не включает лизирование клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает лизирование одной или более клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт молекулы связывания аффинного пептида-акцептора с комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем молекула связывания аффинного пептида-акцептора специфически связывается с аффинным пептидом-акцептором.

[284] В некоторых вариантах осуществления аффинный пептид-акцептор содержит последовательность метки, включающей в себя пептид-акцептор биотина (BAP), полигистидиновую метку, полигистидин-глициновую метку, полиаргининовую метку, полиаспартатную метку, полицистеиновую метку, полифенилаланин, метку c-myc, гликопротеиновую D (gD) метку вируса простого герпеса, метку FLAG, эпитопную метку KT3, тубулиновую эпитопную метку, пептидную метку белка 10 гена Т7, стрептавидиновую метку, метку стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метку, Strep-метку II, метку альбумин-связывающего белка (ABP), метку щелочной фосфатазы (AP), метку вируса катаральной лихорадки (B-метку), метку кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метку хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метку холин-связывающего домена (CBD), метку хитин-связывающего домена (CBD), метку целлюлозосвязывающего домена (CBP), метку дигидрофолатредуктазы (DHFR), метку галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансферазу (GST), метку Glu-Glu (EE), метку гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метку пероксидазы хрена (HA), NE-метку, метку HSV, метку кетостероид-изомеразы (KSI), метку KT3, метку LacZ, люциферазную метку, метку NusA, метку домена PDZ, AviTag, кальмодулиновую метку, E-метку, S-метку, SBP-метку, Softag 1, Softag 3, метку TC, VSV-метку, метку Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метку Profinity eXact, метку протеина C, S1-метку, S-метку, метку белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метку зеленого флуоресцентного белка (GFP), метку малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метку тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метку, метку Thioredoxin, Fc-метку, метку CYD, метку HPC, метку TrpE, убиквитиновую метку, эпитопную метку VSV-G, метку V5 или их комбинацию; необязательно при этом аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки. В некоторых вариантах осуществления молекулой связывания аффинного пептида-акцептора является биотин или антитело, специфическое к аффинному пептиду-акцептору. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение аффинной молекулы в контакт с комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем аффинная молекула специфически связывается с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора. В некоторых вариантах осуществления аффинной молекулой является стрептавидин, NeutrAvidin или их производное. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления молекулу связывания аффинного пептида-акцептора присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления аффинную молекулу присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления твердой поверхностью является гранула. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора, которая специфически связывается с аффинным пептидом-акцептором. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора не имеет специфического взаимодействия с аминокислотной последовательностью кодируемого рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к внеклеточной части аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к N-концевой части аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса.

[285] В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с полинуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления введение в контакт включает в себя трансфекцию или трансдукцию. В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с вектором, содержащим полинуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления вектором является вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления полинуклеиновую кислоту стабильно встраивают в геном популяции клеток.

[286] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая рекомбинантный HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β2 микроглобулин в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA I класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая рекомбинантный HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β-цепь HLA II класса, в одной или более клетках В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA II класса, посредством линкера.

[287] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления второй аффинный пептид-акцептор отличается от первого аффинного пептида-акцептора, и его выбирают из группы, состоящей из пептида-акцептора биотина (BAP), полигистидиновой метки, полигистидин-глициновой метки, полиаргининовой метки, полиаспартатной метки, полицистеиновой метки, полифенилаланина, метки c-myc, гликопротеиновой D (gD) метки вируса простого герпеса, метки FLAG, эпитопной метки KT3, тубулиновой эпитопной метки, пептидной метки белка 10 гена Т7, стрептавидиновой метки, метки стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метки, Strep-метки II, метки альбумин-связывающего белка (ABP), метки щелочной фосфатазы (AP), метки вируса катаральной лихорадки (B-метки), метки кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метки хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метки холин-связывающего домена (CBD), метки хитин-связывающего домена (CBD), метки целлюлозосвязывающего домена (CBP), метки дигидрофолатредуктазы (DHFR), метки галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающего белка (MBP), глутатион-S-трансферазы (GST), метки Glu-Glu (EE), метки гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метки пероксидазы хрена (HA), NE-метки, HSV метки, метки кетостероид-изомеразы (KSI), метки KT3, метки LacZ, люциферазной метки, метки NusA, метки домена PDZ, AviTag, кальмодулиновой метки, E-метки, S-метки, SBP-метки, Softag 1, Softag 3, метки TC, VSV-метки, метки Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метки Profinity eXact, метки протеина C, S1-метки, S-метки, метки белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метки зеленого флуоресцентного белка (GFP), метки малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метки тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метки, метки Thioredoxin, Fc-метки, метки CYD, метки HPC, метки TrpE, убиквитиновой метки, эпитопной метки VSV-G, метки V5 и их комбинаций; необязательно при этом первый или второй аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки.

[288] В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность полинуклеиновой кислоты, кодирующую расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой элемент-участок ухода с рибосомы или участок внутренней посадки рибосомы (IRES). В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы или IRES расщепляется при экспрессии в клетках. В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы выбирают из группы, состоящей из F2A, T2A, P2A и E2A. В некоторых вариантах осуществления элемент IRES выбирают из общих клеточных или вирусных последовательностей IRES.

[289] В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя проведение биохимического анализа или масс-спектрометрии, такой как тандемная масс-спектрометрия. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя получение последовательности пептида, которая соответствует MS/MS спектрам одного или более пептидов, выделенных из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды из базы данных пептидов; при этом одна или более полученных последовательностей идентифицирует последовательность одного или более пептидов.

[290] В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия, выбранная из HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO и THP1. В некоторых вариантах осуществления клеточную линию обрабатывают одним или более цитокинами, ингибиторами контрольных точек, эпигенетически-активными лекарственными средствами, IFN-γ, средствами, которые изменяют процессинг антигенов (такими как ингибиторы пептидазы, ингибиторы протеосом и ингибиторы TAP) или их комбинацией.

[291] В некоторых вариантах осуществления базой данных пептидов является база данных пептидов без специфичности к ферментам, например, база данных без модификации или база данных с модификацией. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает поиск в базе данных пептидов с использованием стратегии поиска в перевернутой базе данных.

[292] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя по меньшей мере 105 клеток, по меньшей мере 106 клеток или по меньшей мере 107 клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция дендритных клеток, макрофагов, раковых клеток или B-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя опухолевые клетки. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток вводят в контакт со средством перед выделением указанных комплексов HLA-пептиды из одной или более клеток. В некоторых вариантах осуществления указанным средством является воспалительный цитокин, химическое средство, вспомогательное средство, терапевтическое средство или радиация.

[293] В некоторых вариантах осуществления аллелем HLA является мутантный аллель HLA.

[294] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аллель HLA, представляет собой штрихкодированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления анализ включает в себя секвенирование аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, обнаружение РНК аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, обнаружение белка аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса или их комбинацию.

[295] В некоторых вариантах осуществления способ включает выполнение стадий способа для разных аллелей HLA. В некоторых вариантах осуществления каждый аллель HLA содержит уникальную штрихкодированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления каждая полинуклеиновая кислота, кодирующая другой аллель HLA, содержит уникальную штрихкодированную последовательность.

[296] В настоящем документе представлена база данных последовательностей специфически связывающих аллели HLA пептидов, полученных путем выполнения описанного в настоящем документе способа. В настоящем документе представлена комбинация двух или более баз данных последовательностей специфически связывающих аллели HLA пептидов, полученных путем многократного выполнения описанного в настоящем документе способа, каждый раз с использованием другого аллеля HLA. В настоящем документе представлен способ генерирования алгоритма прогнозирования для идентификации специфически связывающих аллели HLA пептидов, включающий обучение машины с помощью базы данных последовательностей описанных в данном документе пептидов или описанной в настоящем документе комбинации. В некоторых вариантах осуществления машина объединяет одну или более линейных моделей, методов опорных векторов, деревьев решений и нейронных сетей. В некоторых вариантах осуществления переменная, используемая для обучения машины, включает в себя одну или более переменных, выбранных из группы, состоящей из последовательности пептида, физических свойств аминокислот, физических свойств пептидов, уровня экспрессии исходного белка пептида в клетке, стабильности белка, скорости трансляции белка, сайтов убиквитинирования, скорости разрушения белка, эффективности трансляции из рибосомального профилинга, расщепляемости белка, локализации белка, мотивов белка-хозяина, которые облегчают транспортировку TAP, белок-хозяин подвергают аутофагии, мотивов, которые способствуют остановке рибосомы, и особенностей белков, которые способствуют NMD. В некоторых вариантах осуществления мотивы, которые способствуют остановке рибосомы, содержат полипролиновые или полилизиновые участки. В некоторых вариантах осуществления особенности белков, которые способствуют NMD, выбирают из группы, состоящей из длинного 3' UTR, стоп-кодона более 50 нуклеотидов перед последним экзон:экзонным сочленением и расщепляемости пептида. В настоящем документе представлен способ идентификации специфически связывающих аллели HLA пептидов, включающий проведение анализа последовательности пептида с помощью машины, которую обучили с помощью базы данных последовательностей пептидов, полученных путем выполнения описанного в настоящем документе способа для аллелей HLA. В некоторых вариантах осуществления способ включает определение уровня экспрессии исходного белка пептида в клетке; и при этом экспрессия исходного белка является прогностической переменной, используемой машиной. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии определяют путем измерения количества исходного белка или количества РНК, кодирующей указанный исходный белок.

[297] В настоящем документе представлена композиция, содержащая рекомбинантную полинуклеиновую кислоту, содержащую две или более последовательности, каждая из которых кодирует меченный аффинным акцептором HLA, при этом последовательности, кодирующие меченные аффинным акцептором HLA, содержат (a) последовательность, кодирующую другой рекомбинантный аллель α-цепи HLA I класса, (b) последовательность, кодирующую аффинный пептид-акцептор, и необязательно, (c) последовательность, кодирующую β2 микроглобулин; при этом последовательности (a) и (b) и необязательно (c) функционально связаны.

[298] В настоящем документе представлена композиция, содержащая рекомбинантную полинуклеиновую кислоту, содержащую две или более последовательности, каждая из которых содержит последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA, при этом последовательности, кодирующие меченные аффинным акцептором HLA, содержат (a) последовательность, кодирующую рекомбинантный аллель α-цепи HLA II класса, (b) последовательность, кодирующую аффинный пептид-акцептор, и необязательно, (c) последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса; при этом последовательности (a) и (b) и необязательно (c) функционально связаны. В некоторых вариантах осуществления выделяют рекомбинантную полинуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F и HLA-G. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса выбирают из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP.

[299] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинную молекулу-акцептор, функционально связана с N-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей внутриклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с C-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA.

[300] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей аллель рекомбинантного HLA посредством линкера.

[301] В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, экспрессируются из одного и того же полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, экспрессируются из разных полинуклеотидов.

[302] В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор специфически связывается с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора.

[303] В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, содержат два или более аффинных пептида-акцептора. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, содержат три или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, причем по меньшей мере две из трех или более последовательностей, кодирующих меченный аффинным акцептором HLA, содержат один и тот же аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления два или более аффинных пептида-акцептора являются уникальными для каждой из двух или более последовательностей, кодирующих меченный аффинным акцептором HLA. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор выбирают из группы, состоящей из пептида-акцептора биотина (BAP), полигистидиновой метки, полигистидин-глициновой метки, полиаргининовой метки, полиаспартатной метки, полицистеиновой метки, полифенилаланина, метки c-myc, гликопротеиновой D (gD) метки вируса простого герпеса, метки FLAG, эпитопной метки KT3, тубулиновой эпитопной метки, пептидной метки белка 10 гена Т7, стрептавидиновой метки, метки стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метки, Strep-метки II, метки альбумин-связывающего белка (ABP), метки щелочной фосфатазы (AP), метки вируса катаральной лихорадки (B-метки), метки кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метки хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метки холин-связывающего домена (CBD), метки хитин-связывающего домена (CBD), метки целлюлозосвязывающего домена (CBP), метки дигидрофолатредуктазы (DHFR), метки галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающего белка (MBP), глутатион-S-трансферазы (GST), метки Glu-Glu (EE), метки гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метки пероксидазы хрена (HA), NE-метки, HSV метки, метки кетостероид-изомеразы (KSI), метки KT3, метки LacZ, люциферазной метки, метки NusA, метки домена PDZ, AviTag, кальмодулиновой метки, E-метки, S-метки, SBP-метки, Softag 1, Softag 3, метки TC, VSV-метки, метки Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метки Profinity eXact, метки протеина C, S1-метки, S-метки, метки белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метки зеленого флуоресцентного белка (GFP), метки малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метки тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метки, метки Thioredoxin, Fc-метки, метки CYD, метки HPC, метки TrpE, убиквитиновой метки, эпитопной метки VSV-G, метки V5 и их комбинаций; необязательно при этом первый или второй аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки. В некоторых вариантах осуществления молекулой связывания аффинного пептида-акцептора является биотин или антитело, специфическое к аффинному пептиду-акцептору. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора специфически связывается с аффинной молекулой. В некоторых вариантах осуществления аффинной молекулой является стрептавидин, NeutrAvidin или их производное. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора не имеет специфического взаимодействия с аминокислотной последовательностью рекомбинантного HLA I класса или II класса.

[304] В некоторых вариантах осуществления для двух или более рекомбинантных полинуклеиновых кислот: последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA, стабильно встраивают в геном клетки.

[305] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, или последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления второй аффинный пептид-акцептор содержит метку HA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, или последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей рекомбинантный HLA и аффинный пептид-акцептор, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность полинуклеиновой кислоты, кодирующую расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой элемент-участок ухода с рибосомы или участок внутренней посадки рибосомы (IRES). В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы или IRES расщепляется при экспрессии в клетках. В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы выбирают из группы, состоящей из F2A, T2A, P2A и E2A. В некоторых вариантах осуществления элемент IRES выбирают из общих клеточных или вирусных последовательностей IRES.

[306] В настоящем документе представлена композиция, содержащая две или более выделенные полипептидные молекулы, кодируемые полинуклеиновой кислотой композиции, описанной в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая популяцию клеток, содержащих две или более полипептидные молекулы, кодируемые полинуклеиновой кислотой композиции, описанной в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая популяцию клеток, содержащих композицию, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая популяцию клеток, содержащих одну или более клеток, содержащих композицию, описанную в настоящем документе.

[307] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток экспрессирует один или более аллелей эндогенного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствует один или более аллелей эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствуют аллели эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствует один или более аллелей эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствуют аллели эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствует один или более аллелей эндогенного HLA I класса и один или более аллелей эндогенного HLA II класса.

В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция клеток с низкой экспрессией HLA клеточной поверхности I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления составляют композицию с использованием пептидов или полинуклеиновых кислот, кодирующих пептиды, специфические к типу HLA пациента.

[308] В настоящем документе представлен способ получения клетки, включающий трансдукцию или трансфекцию двух или более клеток двумя или более полинуклеиновыми кислотами композиции, описанной в настоящем документе. В настоящем документе представлен пептид, идентифицированный согласно способу, описанному в настоящем документе.

[309] В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему клетки, содержащей пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему клетки, содержащей эффективное количество полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетка презентирует пептид в виде комплекса HLA-пептид. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, описанный в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе.

[310] В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является T-клеточный иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является CD8 T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является CD4 T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является гуморальный иммунный ответ.

[311] В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, описанный в данном документе. В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе.

[312] В некоторых вариантах осуществления заболеванием является рак. В некоторых вариантах осуществления заболеванием является заражение возбудителем инфекции. В некоторых вариантах осуществления возбудителем инфекции является патогенный микроорганизм, необязательно вирус или бактерия или паразит. В некоторых вариантах осуществления вирус выбирают из группы, состоящей из: BK вируса (BKV), вирусов Денге (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), цитомегаловируса (CMV), вируса гепатита В (HBV), вируса гепатита С (HCV), вируса Эпштейна-Барра (EBV), аденовируса, вируса иммунодефицита человека (HIV), Т-клеточного лимфотрофического вируса человека (HTLV-1), вируса гриппа, RSV, HPV, бешенства, вируса паротита, краснухи, полиовируса, желтой лихорадки, гепатита A, гепатита B, ротавируса, вируса ветряной оспы, вируса папилломы человека (HPV), оспы, опоясывающего лишая и любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления бактерию выбирают из группы, состоящей из: видов Klebsiella, Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis и Mycobacterium tuberculosis, тифа, пневмококка, менингококка, haemophilus B, сибирской язвы, столбнячного токсина, менингококка группы B, bcg, холеры и любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления паразитом является гельминт или простейшие. В некоторых вариантах осуществления паразитирующий организм выбирают из группы, состоящей из: видов Leishmania, видов Plasmodium, Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, видов Schistosoma и любой их комбинации.

[313] В настоящем документе представлен способ обогащения иммуногенных пептидов, включающий: предоставление популяции клеток, содержащей одну или более клеток, экспрессирующих меченный аффинным акцептором HLA, причем меченный аффинным акцептором HLA содержит аффинный пептид-акцептор, функционально связанный с рекомбинантным HLA, кодируемым аллелем рекомбинантного HLA; и обогащение комплексов HLA-пептиды, содержащих меченный аффинным акцептором HLA. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает определение последовательности иммуногенных пептидов, выделенных из комплексов HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя использование LC-MS/MS.

[314] В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, описанный в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества клеток, содержащих пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту клетки, содержащей эффективное количество полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе.

Обогащение комплексов HLA-пептиды

[315] Гены, кодирующие гликопротеины HLA класса I и класса II, являются одними из самых полиморфных кодирующих последовательностей в геноме человека. Однако для каждой из тяжелых цепей HLA I класса и α- и β-цепей HLA II класса существуют относительно постоянные или неизменные области, на которые могут быть нацелены антитела, чтобы селективно захватывать любую тяжелую цепь HLA I класса или α- или β-цепь HLA II класса. Однако, поскольку α- или β-цепи обычно связаны друг с другом in vivo, иммуноаффинная очистка α-цепи интактного растворимого HLA может совместно осаждать β-цепь и наоборот. Антитела против HLA II класса с целью обогащения для HLA-ассоциированных полипептидов могут распознавать консервативные эпитопы, представленные в α- или β-цепи.

[316] Способ обогащение с использованием специфических к аллелям HLA антител или с использованием не специфических к HLA реагентов хорошо известен в данной области. Например, полипептиды HLA-C обычно экспрессируются индивидуумами на более низких уровнях, чем HLA-A и HLA-B. Соответственно, для того, чтобы улучшить обнаружение HLA-C с использованием антител, может быть предпочтительно обеспечить в дополнение к другим способам очистки специфическую иммуноаффинную очистку HLA-C с использованием специфических к HLA-C антител. Коммерчески доступны многочисленные примеры моноклональных или поликлональных антител, которые специфически связываются с отдельными цепями HLA.

[317] В настоящем документе представлен конвейер для универсальной иммуноаффинной очистки (IP) для обогащение одного или более комплексов одноаллельные HLA-полипептиды. Иллюстрацией такого способа обогащение связанного c HLA полипептида является способ, который включает стадию иммуноаффинной очистки. Конвейер для универсальной IP содержит конструкции для универсальной IP, состоящие из конструкции ДНК, кодирующей аффинные меченные аллели HLA I класса или II класса, которые экспрессируются из вектора экспрессии посредством клеточной трансфекции или трансдукции. Неограничивающим примером вектора экспрессии является лентивирусный вектор.

[318] Клетки, трансфицированные или трансдуцированные с помощью конструкций универсальной IP, либо размножали, либо отбирали, а затем размножали перед анализом последовательностей LC-MS/MS. Подходящие клеточные популяции для трансфекции или трансдукции включают, например, клеточные линии с дефицитом по I классу, в которых экспрессируется один аллель HLA I класса, клеточные линии с дефицитом по II классу, в которых экспрессируется одна пара аллелей HLA II класса, или клеточные линии с дефицитом по I классу и II классу, в которых экспрессируются один HLA I класса и/или одна пара аллелей II класса. В качестве иллюстративного варианта осуществления B-клеточной линиой с дефицитом по I классу является B721.221. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки представляют собой A375 или HEK293T, HeLa или expi293. Однако специалисту в данной области ясно, что можно получать другие клеточные популяции, которые имеют дефицит по I классу и/или II классу. В данной области известны способы получения клеток с дефицитом по I классу и/или по II классу, а также клеточных линий с дефицитом по I классу и/или по II классу, а иллюстративный способ удаления/инактивации эндогенных генов I класса или II класса включает опосредованное CRISPR-Cas9 редактирование генома, например, в клетках THP-1. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток представляют собой профессиональные антигенпрезентирующие клетки, такие как макрофаги, В-клетки и дендритные клетки. Клетки могут быть B-клетками или дендритными клетками. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой опухолевые клетки или клетки из опухолевой клеточной линии. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки представляют собой клетки, выделенные у пациента. В некоторых вариантах осуществления клетки содержат возбудитель инфекции или его часть.

[319] В некоторых вариантах осуществления конструкции для универсальной IP содержат конструкции HLA I класса или II класса, содержащие аффинную акцепторную метку и аффинную молекулу. В некоторых вариантах осуществления конструкции для универсальной IP содержат по меньшей мере одну специфически связывающую аффинную акцепторную метку и аффинную молекулу. В некоторых вариантах осуществления аффинной акцепторной меткой является полигистидиновая метка, полигистидин-глициновая метка, полиаргининовая метка, полиаспартатная метка, полицистеиновая метка, полифенилаланин, метка c-myc, гликопротеиновая D (gD) метка вируса простого герпеса, метка FLAG, эпитопная метка KT3, тубулиновая эпитопная метка, пептидная метка белка 10 гена Т7, стрептавидиновая метка, метка стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метка, Strep-метка II, метка альбумин-связывающего белка (ABP), метка щелочной фосфатазы (AP), метка вируса катаральной лихорадки (B-метка), метка кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метка хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метка холин-связывающего домена (CBD), метка хитин-связывающего домена (CBD), метка целлюлозосвязывающего домена (CBP), метка дигидрофолатредуктазы (DHFR), метка галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансфераза (GST), метка Glu-Glu (EE), метка гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метка пероксидазы хрена (HA), NE-метка, метка HSV, метка кетостероид-изомеразы (KSI), метка KT3, метка LacZ, люциферазная метка, метка NusA, метка домена PDZ, AviTag, кальмодулиновая метка, E-метка, S-метка, SBP-метка, Softag 1, Softag 3, метка TC, VSV-метка, метка Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метка Profinity eXact, метка протеина C, S1-метка, S-метка, метка белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метка зеленого флуоресцентного белка (GFP), метка малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метка тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метка, метка Thioredoxin, Fc-метка, метка CYD, метка HPC, метка TrpE, убиквитиновая метка, эпитопная метка VSV-G, полученная из вирусного гликопротеина везикулярного стоматита, или метка V5, полученная из небольшого эпитопа (Pk), обнаруженного на белках P и V парамиксовируса обезьяньего вируса 5 (SV5). В некоторых вариантах осуществления аффинная акцепторная метка может содержать множество повторов последовательности метки (например, 3x полигистидиновых метки, 3x метки FLAG). В некоторых вариантах осуществления аффинная акцепторная метка может содержать множество повторов последовательности метки (например, 3x полигистидиновых метки, 3x метки FLAG). Аффинной акцепторной меткой является «эпитопная метка», которая представляет собой тип пептидной метки, которая добавляет узнаваемый эпитоп (сайт связывания антитела) к белку HLA для обеспечения связывания соответствующего антитела, что обеспечивает идентификацию или аффинную очистку меченого белка. Неограничивающим примером эпитопной метки является белок A или белок G, который связывается с IgG. В некоторых вариантах осуществления аффинные акцепторные метки содержат последовательность пептида-акцептора биотина (BAP) или пептида гемагглютинина вируса гриппа (HA). Рядовому специалисту в данной области техники известны, и он может рассмотреть многочисленные другие фрагменты меток, которые предусмотрены в данном документе. Можно использовать любую пептидную метку при условии, что она способна экспрессироваться как элемент комплекса меченный аффинным акцептором HLA-пептид.

[320] Аффинные метки можно помещать либо на N-конце, либо на C-конце аллеля HLA. Последовательность расщепления, такую как F2A или участок внутренней посадки рибосомы (IRES), можно помещать между α-цепью и β2-микроглобулином (I класса) или между α-цепью и β-цепью (II класса). В некоторых вариантах осуществления единственным аллелем HLA I класса является HLA-A*02:01, HLA-A*23:01 и HLA-B*14:02, или HLA-E*01:01, а аллелем HLA II класса является HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 и HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01 или HLA-DRB*07:01. В некоторых вариантах осуществления последовательностью расщепления является последовательность T2A, P2A, E2A или F2A. Например, последовательностью расщепления может быть E G R G S L L T C G D V E E N P G P (T2A), T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (P2A), Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (E2A) или V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (F2A).

[321] В некоторых вариантах осуществления иммуноаффинная очистка комплексов HLA-пептиды основана на биотине. В некоторых вариантах осуществления иммуноаффинная очистка комплексов HLA-пептиды основана на стрептавидине или NeutrAvidin. В некоторых вариантах осуществления комплексы HLA-пептиды также можно обогащать из биологического образца с помощью методов хроматографии, такой как HPLC. В некоторых вариантах осуществления для обогащения комплексов HLA-пептиды можно использовать истощение сывороточных белков с избыточным содержанием. В некоторых вариантах осуществления способы удаления избыточных сывороточных белков включают красители-лиганды (для альбумина), белок A и G (для γ-глобулинов) или специфические антитела, которые связывают с высокой аффинностью и избирательно истощают эти виды из образца (Govorukhina, Reijmers et al. 2006). Такие стратегии будут увеличивать количество последовательностей пептидов, полученных из HLA, идентифицированных в одном масс-спектрометрическом анализе.

[322] Степень обогащения, требуемая для оптимизации анализа конкретных последовательностей HLA из биологического образца, будет зависеть от начальной концентрации последовательности HLA в биологическом образце, а также от концентрации и природы других не относящихся к HLA белков в образце.

[323] Для обогащения комплексов HLA-пептиды в биологическом образце можно использовать классические методы очистки белков, отдельно или в комбинации с предоставленными в настоящем документе методами конвейера для универсальной IP. Классические методы разделения (очистки) белка основаны на: различиях в размерах (ультрафильтрация, гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография); разности зарядов (pi) (анионо-катионообменная хроматография или хроматография гидрофобного взаимодействия); и комбинации различий в размерах и зарядах (1D или 2D электрофорез). Варианты иммуноаффинной очистки включают использование моноклональных или поликлональных антител, которые специфически связывают белки HLA. Другие варианты аффинной очистки белка включают использование белков, которые, как известно, связывают HLA, к ним относятся; CD8, который связывается с α3-доменом всех белков HLA I класса; CD4, который связывается со всеми белками HLA II класса; аутологичные Т-клеточные рецепторы; и антигенные пептиды, которые связывают HLA с высокой аффинностью (для прогнозирования характеристик связывания пептида/HLA можно использовать алгоритмы компьютерного моделирования). Любой из этих вариантов белка с высокой аффинностью HLA может быть иммобилизован на нерастворимом твердом носителе для получения аффинной матрицы, которую можно использовать для захвата HLA из жидкого биологического образца. Подходящие условия элюирования будут приводить к концентрации и очистке (выделению) содержимого HLA в образце.

[324] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя обогащение интактных клеток, экспрессирующих комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ не включает лизирование клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает лизирование одной или более клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт молекулы связывания аффинного пептида-акцептора с комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем молекула связывания аффинного пептида-акцептора специфически связывается с аффинным пептидом-акцептором. В некоторых случаях обогащение не включает в себя использование тетрамерного реагента.

Специфических для Болезни Антигены

[325] В некоторых вариантах осуществления размер по меньшей мере одной молекулы антигенного пептида может включать, но без ограничения, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39, приблизительно 40, приблизительно 41, приблизительно 42, приблизительно 43, приблизительно 44, приблизительно 45, приблизительно 46, приблизительно 47, приблизительно 48, приблизительно 49, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120 или более аминокислотных остатков и любой производный диапазон.

[326] В некоторых вариантах осуществления молекулы антигенного пептида равны или менее чем 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления молекулы антигенного пептида равны от приблизительно 20 до приблизительно 30 аминокислотам. Более длинный пептид можно сконструировать несколькими способами. Например, когда связывающие HLA области спрогнозированы или известны, более длинный пептид может состоять либо из: отдельных связывающих пептидов протяженностью 0-10 аминокислот в направлении N- и C-конца каждого соответствующего генного продукта. Более длинный пептид также может состоять из конкатенации некоторых или всех связывающих пептидов с удлиненными последовательностями для каждого. В другом случае, когда секвенирование обнаруживает длинную (> 10 остатков) последовательность эпитопа, присутствующую в пораженной ткани (например, из-за сдвига рамки, считывания или включения интрона, что приводит к новой пептидной последовательности), более длинный пептид может состоять из целого ряда новых специфических для заболевания аминокислот. В обоих случаях использование более длинного пептида требует эндогенного процессинга профессиональными антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки, и может привести к более эффективной презентации антигена и индукции Т-клеточных ответов. В некоторых вариантах удлиненную последовательность изменяют, чтобы улучшить биохимические свойства полипептида (такие свойства, как растворимость или стабильность) или повысить вероятность эффективного протеасомного процессинга пептида.

[327] Антигенные пептиды и полипептиды могут связывать белок HLA. В некоторых вариантах осуществления антигенные пептиды могут связывать белок HLA с большей аффинностью, чем соответствующий пептид нативного/дикого типа. Антигенный пептид может иметь IC50 приблизительно менее чем 1000 нм, приблизительно менее чем 500 нм, приблизительно менее чем 250 нм, приблизительно менее чем 200 нм, приблизительно менее чем 150 нм, приблизительно менее чем 100 нм или приблизительно менее чем 50 нм. В некоторых вариантах осуществления антигенные пептиды не индуцируют аутоиммунный ответ и/или вызывают иммунологическую толерантность при введении субъекту.

[328] В настоящем раскрытии также предоставлены композиции, содержащие множество антигенных пептидов. Ссылка на антигенные пептиды включает в себя любой подходящий способ доставки, который может привести к введению пептида в клетку субъекта (например, нуклеиновую кислоту). В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере 3 или более антигенных пептида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 или 50 различных пептидов. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере 20 различных пептидов. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит не более 20 различных пептидов. Согласно настоящему раскрытию из одного и того же полипептида можно получить 2 или более различных пептида. Например, если антигенная мутация кодирует полипептид, из полипептида можно получить два или более антигенных пептида. В одном варианте осуществления два или более антигенных пептида, полученных из полипептида, могут содержать матрицу блоков, которая охватывает полипептид (например, антигенные пептиды могут содержать серию перекрывающихся антигенных пептидов, которая охватывает часть полипептида или весь). Антигенные пептиды можно получить из любого белка, кодирующего ген. Антигенные пептиды можно получить из мутаций рака человека или из возбудителя инфекции или аутоиммунного заболевания.

[329] Антигенные пептиды, полипептиды и аналоги можно дополнительно модифицировать, чтобы они содержали дополнительные химические фрагменты, которые обычно не являются частью белка. Эти производные фрагменты могут улучшить растворимость, период биологического полураспада, абсорбцию белка или аффинность связывания. фрагменты могут также уменьшить или устранить любые необходимые побочные эффекты белков и тому подобное. Обзор этих фрагментов можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000). Например, антигенные пептиды и полипептиды, имеющие требуемую активность, при необходимости можно модифицировать для обеспечения определенных необходимых свойств, например, улучшенных фармакологических характеристик, в то же время увеличивая или по меньшей мере сохраняя практически всю биологическую активность немодифицированного пептида для связывания требуемой молекулы МНС и активации соответствующей Т-клетки. Например, антигенный пептид и полипептиды можно подвергать различным изменениям, таким как замены, либо консервативные, либо неконсервативные, при этом такие изменения могут обеспечивать определенные преимущества при их использовании, такие как улучшенное связывание МНС. Такие консервативные замены могут включать замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, который биологически и/или химически сходен, например, один гидрофобный остаток на другой или один полярный остаток на другой. Результат единичных аминокислотных замен также можно исследовать с использованием D-аминокислот. Такие модификации можно проделать с использованием хорошо известных процедур синтеза пептидов, которые описаны, например, в Merrifield, Science 232: 341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979); и Stewart & Young, Solid Phase Peptide Синтез, (Rockford, III., Pierce), 2d Ed. (1984).

[330] Антигенный пептид также можно модифицировать путем увеличения или уменьшения аминокислотной последовательности соединения, например, путем добавления или удаления аминокислот. Антигенные пептиды, полипептиды или аналоги также можно модифицировать путем изменения порядка или состава определенных остатков. Специалист в данной области поймет, что некоторые аминокислотные остатки, необходимые для биологической активности, например, остатки в критических контактных сайтах или консервативные остатки, обычно нельзя изменять без неблагоприятного воздействия на биологическую активность. Некритические аминокислоты не обязательно ограничивать аминокислотами, встречающимися в природе в белках, таких как L-a-аминокислоты или их D-изомеры, но они также могут включать неприродные аминокислоты, такие как β-γ-δ-аминокислоты, а также многие производные L-a-аминокислот.

[331] Антигенный пептид можно оптимизировать с использованием ряда пептидов с единичными аминокислотными заменами для определения влияния электростатического заряда, гидрофобности и т. д. При связывание МНС. Например, можно сделать серию положительно заряженных (например, Lys или Arg) или отрицательно заряженных (например, Glu) аминокислотных замен по длине пептида, обнаруживая различные профили чувствительности к различным молекулам МНС и Т-клеточным рецепторам. Кроме того, можно использовать множественные замены с использованием небольших относительно нейтральных фрагментов, таких как Ala, Gly, Pro или аналогичные остатки. Замены могут быть гомоолигомерами или гетероолигомерами. Количество и типы остатков, которые замещают или добавляют, зависят от необходимого расстояния между основными точками контакта и определенными требуемыми функциональными характеристиками (например, гидрофобность по сравнению с гидрофильностью). С помощью таких замен можно также повысить аффинность связывания с молекулой МНС или Т-клеточным рецептором по сравнению с аффинностью родительского пептида. В любом случае в таких заменах должны использоваться аминокислотные остатки или другие молекулярные фрагменты, выбранные во избежание, например, стерических и зарядовых помех, которые могут нарушить связывание. Аминокислотные замены обычно состоят из отдельных остатков. для получения конечного пептида можно объединить замены, делеции, вставки или любую их комбинацию.

[332] Антигенный пептид можно модифицировать для обеспечения желаемых свойств. Например, способность пептидов индуцировать активность ЦТЛ можно улучшить путем связывания с последовательностью, которая содержит по меньшей мере один эпитоп, способный индуцировать ответ Т-хелперных клеток. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты иммуногенные пептиды/Т-хелперы связывают молекулой спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер содержит относительно небольшие нейтральные молекулы, такие как аминокислоты или миметики аминокислот, которые в физиологических условиях по существу не заряжены. Спейсеры можно выбрать, например, из Ala, Gly или других нейтральных спейсеров неполярных аминокислот или нейтральных полярных аминокислот. Понятно, что необязательно присутствующий спейсер не обязательно должен состоять из одних и тех же остатков и, таким образом, может представлять собой гетеро- или гомоолигомер. Антигенный пептид может быть связан с Т-хелперным пептидом либо напрямую, либо через спейсер на амино- или карбокси-конце пептида. Аминоконец либо антигенного пептида, либо Т-хелперного пептида может быть ацилирован. Иллюстративные Т-хелперные пептиды включают столбнячный анатоксин 830-843, грипп 307-319, малярию, окраспорозоит 382-398 и 378-389.

Моноаллельные Клеточные линии HLA

[333] Моноаллельная клеточная линия, экспрессирующая либо один аллель HLA I класса, одну пару аллелей HLA II класса, либо один аллель HLA I класса и одну пару аллелей HLA II класса, может быть получена путем трансдукции или трансфекции подходящей популяции клеток с помощью полинуклеиновой кислоты, например вектора, кодирующего один аллель HLA. Подходящие популяции клеток включают, например, клеточные линии с дефицитом I класса, в которых экспрессируется один аллель HLA I класса, клеточные линии с дефицитом II класса, в которых экспрессируется одна пара аллелей класса II HLA, или клеточные линии с дефицитом I класса и II класса, в которых экспрессируются один HLA I класса и/или одна пара аллелей II класса. В качестве иллюстративного варианта осуществления B-клеточной линией с дефицитом I класса является B721.221. Однако специалисту в данной области ясно, что можно получать другие популяции клеток, которые имеют дефицит I класса и/или II класса. Иллюстративный способ удаления/инактивации эндогенных генов I класса или II класса включает опосредованное CRISPR-Cas9 редактирование генома, например, в клетках THP-1. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток представляют собой профессиональные антигенпрезентирующие клетки, такие как макрофаги, В-клетки и дендритные клетки. Клетки могут быть B-клетками или дендритными клетками. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой опухолевые клетки или клетки опухолевой клеточной линии. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки представляют собой клетки, выделенные у пациента. В некоторых вариантах осуществления клетки содержат возбудитель инфекции или его часть. В некоторых вариантах популяция клетоксодержит по меньшей мере 107 клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток дополнительно модифицируют, например, путем увеличения или уменьшения экспрессии и/или активности по меньшей мере одного гена. В некоторых вариантах ген кодирует элемент иммунопротеасомы. Известно, что иммунопротеасома участвует в процессинге пептидов, связывающих HLA I класса, и содержит субъединицы LMP2 (β1i), MECL-1 (β2i) и LMP7 (β5i). Иммунопротеасому также можно индуцировать с помощью интерферона-гамма. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления популяцию клеток можно вводить в контакт с одним или более цитокинами, факторами роста или другими белками. Клетки можно стимулировать воспалительными цитокинами, такими как интерферон-гамма, IL-10, IL-6 и/или TNF-α. Популяцию клеток также можно подвергать воздействию различных условий окружающей среды, таких как стресс (тепловой стресс, недостаток кислорода, недостаток глюкозы, повреждающие ДНК средства и т. д.). В некоторых вариантах осуществления клетки вводят в контакт с одним или более химиотерапевтическими препаратами, радиацией, таргетной терапией, иммунотерапией. Поэтому способы, раскрытые в данном документе, можно использовать для изучения влияния различных генов или условий на процессинг и презентацию пептида HLA. В некоторых вариантах осуществления используемые условия выбираются так, чтобы они соответствовали состоянию пациента, для которого нужно идентифицировать популяция пептидов HLA.

[334] Один HLA-аллель согласно настоящему изобретению можно кодировать и экспрессировать с использованием вирусной системы (например, аденовирусной системы, вектора аденоассоциированного вируса (AAV), поксвируса или лентивируса). Плазмиды, которые можно использовать для доставки аденоассоциированных вирусов, аденовирусов и лентивирусов, были описаны ранее (см., например, патенты США №№ 6955808 и 6943019 и заявку на патент США № 20080254008, включенные в настоящее описание в качестве ссылки). Среди векторов, которые можно использовать в практике настоящего раскрытия, интеграция в геном клетки-хозяина возможна с помощью способов переноса гена ретровируса, что часто приводит к длительной экспрессии встроенного трансгена. В иллюстративном варианте осуществления ретровирус представляет собой лентивирус. Кроме того, во многих различных типах клеток и тканей-мишеней наблюдалась высокая эффективность трансдукции. Тропизм ретровируса можно изменить путем включения чужеродных белков оболочки, расширяя потенциальную целевую популяцию клеток-мишеней. Ретровирус также можно сконструировать для обеспечения условной экспрессии вставленного трансгена, так чтобы лентивирус заражал только определенные типы клеток. Специфические для типа клеток промоторы можно использовать для нацеленной экспрессии в конкретных типах клеток. Лентивирусные векторы являются ретровирусными векторами (и, следовательно, в практике настоящего изобретения можно использовать как лентивирусные, так и ретровирусные векторы). Кроме того, лентивирусные векторы способны трансдуцировать или инфицировать непролиферирующие клетки и обычно продуцируют высокие вирусные титры. Иллюстративный лентивирусный вектор, который можно использовать для создания стабильных клеточных линий, трансдуцированных для экспрессии HLA I класса и II класса, показан на фиг. 3.

[335] Выбор ретровирусной системы переноса гена может зависеть от ткани-мишени. Ретровирусные векторы состоят из длинных концевых повторов цис-действия с упаковочной способностью до 6-10 т.п.н. чужеродной последовательности. Минимальные цис-действующие LTR достаточны для репликации и упаковки векторов, которые затем используют для интеграции желаемой нуклеиновой кислоты в клетку-мишень для обеспечения постоянной экспрессии. Широко используемые ретровирусные векторы, которые можно использовать в практике настоящего раскрытия, включают векторы, основанные на вирусе мышиного лейкоза (MuLV), вирусе лейкемии гиббонов (GaLV), вирусе иммунодефицита обезьян (SIV), вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ) и их комбинациях. Их (см., например, Buchscher et al., (1992) J. Virol. 66:2731-2739; Johann et al., (1992) J. Virol. 66:1635-1640; Sommnerfelt et al., (1990) Virol. 176:58-59; Wilson et al., (1998) J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., (1991) J. Virol. 65:2220-2224; PCT/US94/05700). Кроме того, в практике настоящего изобретения полезен минимальный неприматный лентивирусный вектор, такой как лентивирусный вектор, основанный на вирусе инфекционной анемии у лошадей (EIAV) (см., например, Balagaan, (2006) J Gene Med; 8:275-285, опубликовано в сети 21 ноября 2005 г. В Wiley InterScience DOI:10.1002/jgm.845). Векторы могут иметь цитомегаловирусный (CMV) промотор, управляющий экспрессией гена-мишени. Соответственно, настоящее раскрытие предусматривает среди вектора (векторов), используемых в практике настоящего раскрытия: вирусные векторы, включая ретровирусные векторы и лентивирусные векторы.

[336] В популяции клеток можно экспрессировать любой аллель HLA. В иллюстративном варианте осуществления аллелем HLA является аллель HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления аллелем HLA I класса является аллель HLA-A или аллель HLA-B. В некоторых вариантах осуществления аллелем HLA является аллель HLA II класса. Последовательности аллелей HLA I класса и II класса можно найти в базе данных IPD-IMGT/HLA. Иллюстративные аллели HLA содержат, но без ограничения, HLA-A*02:01, HLA-B*14:02, HLA-A*23:01, HLA-E*01:01, HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02, HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01, и HLA-DRB*07:01.

[337] В некоторых вариантах осуществления аллель HLA выбирают так, чтобы он соответствовал интересующему генотипу. В некоторых вариантах осуществления аллель HLA представляет собой мутантный аллель HLA, которым может быть не встречающийся в природе аллель или встречающийся в природе аллель больного пациента. Способы, раскрытые в данном документе, имеют дополнительное преимущество в идентификации HLA-связывающих пептидов для аллелей HLA, связанных с различными нарушениями, а также аллелей, которые присутствуют с низкой частотой. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления аллель HLA способа присутствует с частотой менее 1% в популяции, например, в европеиоидной популяции.

[338] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аллель HLA, дополнительно содержит аффинную акцепторную метку, которую можно использовать для иммуноаффинной очистки HLA-белка. Подходящие метки хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления аффинной акцепторной меткой является полигистидиновая метка, полигистидин-глициновая метка, полиаргининовая метка, полиаспартатная метка, полицистеиновая метка, полифенилаланин, метка c-myc, гликопротеиновая D (gD) метка вируса простого герпеса, метка FLAG, эпитопная метка KT3, тубулиновая эпитопная метка, пептидная метка белка 10 гена Т7, стрептавидиновая метка, метка стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метка, Strep-метка II, метка альбумин-связывающего белка (ABP), метка щелочной фосфатазы (AP), метка вируса катаральной лихорадки (B-метка), метка кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метка хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метка холин-связывающего домена (CBD), метка хитин-связывающего домена (CBD), метка целлюлозосвязывающего домена (CBP), метка дигидрофолатредуктазы (DHFR), метка галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансфераза (GST), метка Glu-Glu (EE), метка гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метка пероксидазы хрена (HA), NE-метка, метка HSV, метка кетостероид-изомеразы (KSI), метка KT3, метка LacZ, люциферазная метка, метка NusA, метка домена PDZ, AviTag, кальмодулиновая метка, E-метка, S-метка, SBP-метка, Softag 1, Softag 3, метка TC, VSV-метка, метка Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метка Profinity eXact, метка протеина C, S1-метка, S-метка, метка белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метка зеленого флуоресцентного белка (GFP), метка малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метка тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метка, метка Thioredoxin, Fc-метка, метка CYD, метка HPC, метка TrpE, убиквитиновая метка, эпитопная метка VSV-G, полученная из вирусного гликопротеина везикулярного стоматита, или метка V5, полученная из небольшого эпитопа (Pk), обнаруженного на белках P и V парамиксовируса обезьяньего вируса 5 (SV5). В некоторых вариантах осуществления аффинной акцепторной меткой является «эпитопная метка», которая относится к типу пептидной метки, которая добавляет узнаваемый эпитоп (сайт связывания антитела) в белок HLA для обеспечения связывания соответствующего антитела, что обеспечивает идентификацию или аффинную очистку меченого белка. Неограничивающим примером эпитопной метки является белок A или белок G, которые связывается с IgG. В некоторых вариантах осуществления аффинные акцепторные метки содержат последовательность пептида-акцептора биотина (BAP) или пептида гемагглютинина вируса гриппа (HA). Рядовому специалисту в данной области техники известны, и он может рассмотреть многочисленные другие фрагменты меток, которые предусмотрены в данном документе. Можно использовать любую пептидную метку при условии, что она способна экспрессироваться как элемент комплекса меченный аффинным акцептором HLA-пептид.

[339] Способы, предоставленные в данном документе, включают выделение комплексов HLA-пептиды из клеток, трансфицированных или трансдуцированных с помощью конструкций HLA универсальной IP. В некоторых вариантах осуществления комплексы можно выделять с использованием стандартных методов иммунопреципитации, известных в данной области, с коммерчески доступными антителами. Сперва клетки можно лизировать. Комплексы HLA I класса-пептиды можно выделять с использованием специфических к HLA I класса антител, таких как антитело W6/32, тогда как комплексы HLA II класса-пептиды можно выделять с использованием специфических к HLA II класса антител, таких как моноклональное антитело M5/114,15.2. В некоторых вариантах осуществления один (или пару) аллелей HLA экспрессируют в виде белка слияния с пептидной меткой, и комплексы HLA-пептиды выделяют с использованием молекул связывания, которые распознают пептидные метки.

[340] Способы дополнительно включают выделение пептидов из указанных комплексов HLA-пептиды и секвенирование пептидов. Пептиды выделяют из комплекса любым способом, известным специалисту в данной области, таким как кислотная элюция. Несмотря на то, что можно использовать любой способ секвенирования, в некоторых вариантах осуществления использованы способы с использованием масс-спектрометрии, например, жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS или LC-MS/MS, или альтернативно HPLC-MS или HPLC-MS/MS). Эти способы секвенирования хорошо известны специалисту и рассмотрены в Medzihradszky KF и Chalkley RJ. Масса Spectrom Rev. 2015 Jan-Feb;34(1):43-63.

[341] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток экспрессирует один или более аллелей эндогенного HLA. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA II класса или сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса и аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя клетки, которые были обогащенные или отсортированы, например, с помощью сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS). В некоторых вариантах осуществления для сортировки популяции клеток используют сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток предварительно сортируют с помощью FACS для экспрессии на клеточной поверхности HLA либо I класса, либо II класса, или HLA как I класса, так и II класса. Например, FACS можно использовать для сортировки популяции клеток для экспрессии на клеточной поверхности аллеля HLA I класса, аллеля HLA II класса или их комбинации.

Библиотеки Конструкций Меченного аффинным акцептором HLA

[342] Термин «библиотека» в рамках настоящего изобретения относится к совокупности молекул нуклеиновой кислоты (кольцевых или линейных). В одном варианте осуществления библиотека может содержать множество (т.е. две или более) молекул нуклеиновой кислоты, которые могут быть из общего исходного организма, органа, ткани или клетки. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет все или часть или значительную часть содержимого нуклеиновых кислот в организме («геномной» библиотеки) или набор молекул нуклеиновой кислоты, представляющих все или часть или значительную часть молекул экспрессированной нуклеиновой кислоты (библиотека кДНК или полученных из нее сегментов) в клетке, ткани, органе или организме. Библиотека также может содержать случайные последовательности, полученные путем синтеза de novo, мутагенеза одной или более последовательностей и тому подобное. Такие библиотеки могут содержаться в одном или более векторах. Библиотека конструкций меченных акцепторным акцептором HLA в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность ДНК, кодирующую элементы аллеля HLA, аффинный пептид-акцептор или линкер. Подходящие молекулярно-биологические методы можно найти в Sambrook et al. (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Было описано несколько способов облегчения клонирования сегментов нуклеиновой кислоты, например, в следующих ссылках: Ferguson, J., et al., Gene 16: 191 (1981) и Hashimoto-Gotoh, T., et al., Gene 41: 125 (1986). Другие термины в рамках настоящего изобретения, используемые в областях технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот и молекулярной и клеточной биологии, будут в целом понятны специалисту в данной области техники.

[343] Различные элементы или домены рекомбинантного аллеля HLA можно расположить в любом порядке между N-терминальным и C-терминальным концами аллеля рекомбинантного HLA. Элемент или домен, который находится ближе к N-концу рекомбинантного полипептида, кодируемого аллелем рекомбинантного HLA, чем к другому элементу или домену, называется «N-концом» другого элемента или домена. Подобным образом, элемент или домен, который находится ближе к С-концу рекомбинантного полипептида, кодируемого аллелем рекомбинантного HLA, чем другой элемент или домен, называется «C-концом» другого элемента или домена. Если прямо не указано иное, различные элементы или домены рекомбинантного полипептида, кодируемого аллелем рекомбинантного HLA, необязательно должны быть смежными (то есть без одного или более промежуточных элементов или доменов). В некоторых вариантах осуществления различные элементы или домены рекомбинантного полипептида, кодируемого аллелем рекомбинантного HLA, могут быть смежными.

[344] Рекомбинантный полипептид, кодируемый аллелем рекомбинантного HLA, может содержать один или более необязательных элементов, например, один или более линкеров, пептидные метки (например, эпитопные метки) или сайт (сайты) узнавания протеазы. В некоторых вариантах осуществления пептидной меткой является аффинный пептид-акцептор. линкер имеет относительно короткий ряд аминокислот, который разделяет другие элементы или домены рекомбинантного белка. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину от 1 до 100 аминокислот; например, длину 5-75, 10-60, 15-50, 15-40 или 1-50 аминокислот.

[345] Способы экспрессии белков в гетерологичных системах экспрессии хорошо известны в данной области. Как правило, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую весь или часть представляющего интерес белка (такого как меченный аффинным акцептором пептид рекомбинантного HLA I класса или II класса), получают с использованием способов, таких как описаны в настоящем документе. Кодирующую белок последовательность нуклеиновой кислоты клонируют в вектор экспрессии, который подходит для конкретной интересующей клетки-хозяина с использованием стандартных процедур рекомбинантной ДНК. Векторы экспрессии включают (среди прочих элементов) регуляторные последовательности (например, промоторы), которые могут быть функционально связаны с требуемой молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, чтобы вызвать экспрессию такой молекулы нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Вместе регуляторные последовательности и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, представляют собой «кассету экспрессии». Векторы экспрессии также могут включать в себя источник репликации, маркерные гены, которые обеспечивают фенотипический отбор в трансформированных клетках, один или более других промоторов и полилинкерную область, содержащую несколько сайтов рестрикции для вставки гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот.

[346] Векторы экспрессии, используемые для экспрессии гетерологичного белка (белков) во множестве клеток-хозяев, хорошо известны в данной области, и некоторые конкретные примеры представлены в данном документе. Клетка-хозяин трансфицируется вектором экспрессии (или инфицируется вирусом, содержащим) вектор экспрессии с использованием любого метода, подходящего для конкретной клетки-хозяина. Такие способы трансфекции также хорошо известны в данной области, и в настоящем документе описаны неограничивающие примеры способов. Трансфицированная или трансдуцированная клетка-хозяин способна экспрессировать белок, кодируемый соответствующей последовательностью нуклеиновой кислоты в кассете экспрессии.

[347] В некоторых вариантах осуществления конструкции HLA I класса или II класса содержат аффинную акцепторную метку и аффинную молекулу на N-конце или C-конце. В некоторых вариантах осуществления конструкции HLA I класса или II класса содержат по меньшей мере одну специфически связывающую аффинную акцепторную метку и аффинную молекулу. В некоторых вариантах осуществления аффинной акцепторной меткой является полигистидиновая метка, полигистидин-глициновая метка, полиаргининовая метка, полиаспартатная метка, полицистеиновая метка, полифенилаланин, метка c-myc, гликопротеиновая D (gD) метка вируса простого герпеса, метка FLAG, эпитопная метка KT3, тубулиновая эпитопная метка, пептидная метка белка 10 гена Т7, стрептавидиновая метка, метка стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метка, Strep-метка II, метка альбумин-связывающего белка (ABP), метка щелочной фосфатазы (AP), метка вируса катаральной лихорадки (B-метка), метка кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метка хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метка холин-связывающего домена (CBD), метка хитин-связывающего домена (CBD), метка целлюлозосвязывающего домена (CBP), метка дигидрофолатредуктазы (DHFR), метка галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансфераза (GST), метка Glu-Glu (EE), метка гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метка пероксидазы хрена (HA), NE-метка, метка HSV, метка кетостероид-изомеразы (KSI), метка KT3, метка LacZ, люциферазная метка, метка NusA, метка домена PDZ, AviTag, кальмодулиновая метка, E-метка, S-метка, SBP-метка, Softag 1, Softag 3, метка TC, VSV-метка, метка Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метка Profinity eXact, метка протеина C, S1-метка, S-метка, метка белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метка зеленого флуоресцентного белка (GFP), метка малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метка тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метка, метка Thioredoxin, Fc-метка, метка CYD, метка HPC, метка TrpE, убиквитиновая метка, эпитопная метка VSV-G, полученная из вирусного гликопротеина везикулярного стоматита, или метка V5, полученная из небольшого эпитопа (Pk), обнаруженного на белках P и V парамиксовируса обезьяньего вируса 5 (SV5). В некоторых вариантах осуществления аффинная акцепторная метка может содержать множество повторов последовательности метки (например, 3x полигистидиновых метки, 3x метки FLAG). В некоторых вариантах осуществления аффинная акцепторная метка может содержать множество повторов последовательности метки (например, 3x полигистидиновых метки, 3x метки FLAG). В некоторых вариантах осуществления аффинной акцепторной меткой является «эпитопная метка», которая относится к типу пептидной метки, которая добавляет узнаваемый эпитоп (сайт связывания антитела) в белок HLA для обеспечения связывания соответствующего антитела, что обеспечивает идентификацию или аффинную очистку меченого белка. Неограничивающим примером эпитопной метки является белок A или белок G, которые связывается с IgG.

[348] В некоторых вариантах осуществления аффинные акцепторные метки содержат последовательность пептида-акцептора биотина (BAP) или пептида гемагглютинина вируса гриппа (HA). Рядовому специалисту в данной области техники известны, и он может рассмотреть многочисленные другие фрагменты меток, которые предусмотрены в данном документе. Можно использовать любую пептидную метку при условии, что она способна экспрессироваться как элемент комплекса меченный аффинным акцептором HLA-пептид.

[349] Аффинные метки можно помещать либо на N-конце, либо на C-конце аллеля HLA. В некоторых вариантах осуществления аффинную метку помещали на C-конце аллеля HLA, чтобы обеспечить локализацию HLA-пептид на клеточной поверхности vs. ER. В некоторых вариантах осуществления аффинная метка помещали на N-конце аллеля HLA, чтобы обеспечить выделения одной HLA из клеточных линий, экспрессирующих множество аллелей эндогенного HLA. В еще одном варианте осуществления аффинную метку добавляют к различным β-цепям для иммуноаффинной очистки конкретных гетеродимеров HLA II класса.

[350] В некоторых вариантах осуществления последовательность расщепления, такую как F2A или участок внутренней посадки рибосомы (IRES), можно помещать между α-цепью и β2-микроглобулином (I класса) или между α-цепью и β-цепью (II класса). В некоторых вариантах осуществления единственным аллелем HLA I класса является HLA-A*02:01, HLA-A*23:01 и HLA-B*14:02 или HLA-E*01:01, а аллелем HLA II класса является HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 и HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01 или HLA-DRB*07:01.

[351] Неограничивающих иллюстративные конструкции меченного аффинным акцептором HLA изображены на фиг.2, ФИГ. 6C и ФИГ. 7C.

Терапевтическое Способы

[352] описана персонализированная иммунотерапия с использованием опухоль-специфических пептидов (Ott et al. Hematol. Oncol. Clin. N. Am. 28 (2014) 559-569). Для эффективного выбора того, какие конкретные пептиды использовать в качестве иммуногена, требуется способность прогнозирования, какие опухоль-специфические пептиды будут эффективно связываться с аллелями HLA, присутствующими у пациента. Одним из критических барьеров на пути развития лечебной и опухоль-специфической иммунотерапии является идентификация и отбор высокоспецифичных и рестриктированных опухолевых антигенов, чтобы избежать аутоиммунитета. Опухолевые неоантигены, которые возникают в результате генетического изменения (например, инверсий, транслокаций, делеций, миссенс-мутаций, мутаций сайтов сплайсинга и т. д.) в злокачественных клетках, представляют собой наиболее специфичный для опухолей класс антигенов. Неоантигены редко использовались в противораковых вакцинах или иммуногенных композициях из-за технических трудностей в их идентификации, выборе оптимизированных антигенов и получении неоантигенов для использования в вакцинах или иммуногенных композициях. Эти проблемы могут быть решены путем: выявления мутаций в новообразованиях/опухолях, которые присутствуют на уровне ДНК в опухоли, но отсутствуют в соответствующих образцах зародышевой линии у высокой доли субъектов, имеющих рак; анализа идентифицированных мутаций с помощью одного или более алгоритмов прогнозирования связывания пептид-МНС для создания множества Т-клеточных эпитопов неоантигена, которые экспрессируются в новообразовании/опухоли и которые связываются с высокой долей аллелей HLA пациента; и синтеза множеста неоантигенных пептидов, выбранных из наборов всех неоантигенных пептидов и предполагаемых связывающих пептидов, для применения в противораковой вакцине или иммуногенной композиции, подходящей для лечения высокой доли субъектов, страдающих раком (фиг. 18A и фиг. 18B).

[353] Например, транслирование информации о секвенировании пептидов в терапевтическую вакцину может включать в себя прогнозирование мутантных пептидов, которые могут связываться с молекулами HLA у большой части индивидуумов. Для эффективного выбора, какие конкретные мутации использовать в качестве иммуногена, требуется способность прогнозирования, какие мутантные пептиды будут эффективно связываться с аллелями HLA у большой части пациентов. В последнее время подходы к обучению на основе нейронной сети с подтвержденными связывающими и несвязывающими пептидами повысили точность алгоритмов прогнозирования для основных аллелей HLA-A и -B. Однако, даже с использованием продвинутых алгоритмов на основе нейронной сети для кодирования правил связывания пептида и HLA, некоторые факторы ограничивают способность прогнозировать пептиды, представленные на аллелях HLA.

[354] Например, транслирование информации о секвенировании пептидов в терапевтическую вакцину может включать в себя составление лекарственного средства в виде мультиэпитопной вакцины из длинных пептидов. Таргетирование как можно большего числа мутантных эпитопов, насколько это практически возможно, использует огромные возможности иммунной системы, предотвращает возможность ускользания от иммунологического надзора за счет понижающего модулирования иммунного направленного генного продукта и компенсирует известную неточность подходов к прогнозированию эпитопов. Синтетические пептиды обеспечивают полезные средства для эффективного получения множества иммуногенов и быстрого преобразования идентификации мутантных эпитопов в эффективную вакцину. Пептиды можно легко синтезировать химически и легко очищать с использованием реагентов, не содержащих загрязняющих бактериальных или животных веществ. Небольшой размер позволяет четко сфокусироваться на мутантной области белка, а также уменьшает нерелевантную антигенную конкуренцию со стороны других компонентов (немутантных белковых или вирусных векторных антигенов).

[355] Например, транслирование информации о секвенировании пептидов в терапевтическую вакцину может включать в себя комбинацию с сильным вакцинным вспомогательным средством. Эффективные вакцины могут требовать сильного вспомогательного средства для инициирования иммунного ответа. Например, поли-ICLC, агонист TLR3 и РНК-геликазных доменов MDA5 и RIG3, продемонстрировал несколько необходимых свойств вакцинного вспомогательного средства. Эти свойства включают в себя индукцию локальной и системной активации иммунных клеток in vivo, продуцирование стимулирующих хемокинов и цитокинов и стимуляцию презентации антигена DC. Кроме того, поли-ICLC может индуцировать длительные CD4+ и CD8+ ответы у людей. Важно отметить, что поразительное сходство в повышающей регуляции путей транскрипционной и сигнальной трансдукции было обнаружено у субъектов, вакцинированных поли-ICLC, и у добровольцев, которые получили высокоэффективную, репликационно-компетентную вакцину против желтой лихорадки. Кроме того, > 90% пациентов с карциномой яичника, иммунизированных поли-ICLC в комбинации с пептидной вакциной NYESO-1 (в дополнение к Montanide), показали индукцию CD4+ и CD8+ T-клеток, а также ответы антител на пептид в недавней 1 фазе исследования. В то же время на сегодняшний день поли-ICLC тщательно протестирована в более чем 25 клинических испытаниях и продемонстрировала относительно благоприятный профиль токсичности.

[356] В некоторых вариантах осуществления иммуногенные пептиды можно идентифицировать из клеток субъекта с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные пептиды могут быть специфическими для субъекта с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные пептиды могут связываться с HLA, который соответствует гаплотипу HLA субъекта с заболеванием или состоянием.

[357] В некоторых вариантах осуществления библиотеку пептидов можно экспрессировать в клетках. В некоторых вариантах осуществления клетки содержат пептиды, которые необходимо идентифицировать или охарактеризовать. В некоторых вариантах осуществления пептидами, которые необходимо идентифицировать или охарактеризовать, являются эндогенные пептиды. В некоторых вариантах осуществления пептидами являются экзогенные пептиды. Например, пептиды, которые необходимо идентифицировать или охарактеризовать, можно экспрессировать из множества последовательностей, кодирующих библиотеку пептидов.

[358] До раскрытия настоящего описания в большинстве исследований LC-MS/MS пептидома HLA использовали клетки, экспрессирующие несколько молекул HLA, что требует назначения пептидов 1 из 6 аллелей I класса с использованием ранее существующих биоинформационных средств прогнозирования или «деконволюции» (Bassani-Sternberg and Gfeller, 2016). Таким образом, нельзя с уверенностью сообщать о пептидах, которые близко не соответствуют известным мотивам, в качестве связующих элементов для данного аллеля HLA.

[359] В данном документе предоставлены способы прогнозирования пептидов, таких как мутантные пептиды, которые могут связываться с молекулами HLA индивидуумов. В некоторых вариантах осуществления в заявке предоставлены способы идентификации из данного набора содержащих антигены пептидов наиболее подходящих пептидов для получения иммуногенной композиции для субъекта, причем указанный способ включает выбор из данного набора пептидов множества пептидов, способных связывать белок HLA субъекта, причем указанную способность связывать белок HLA определяют путем анализа последовательности пептидов с помощью машины, которая была обучена по базам данных пептидных последовательностей, соответствующих специфическим связывающим HLA пептидам для каждого из аллелей HLA указанного субъекта. В данном документе представлены способы идентификации из данного набора антиген-содержащих пептидов наиболее подходящих пептидов для получения иммуногенной композиции для субъекта, причем указанный способ включает выбор из данного набора пептидов множества пептидов, определенных как способные связывать белок HLA субъекта, при этом способность связываться с белком HLA определяют путем анализа последовательности пептидов на машине, которая была обучена с использованием базы данных пептидных последовательностей, полученной с помощью способов, описанных в данном документе выше. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в настоящем раскрытии предоставлены способы идентификации множества специфичных для субъекта пептидов для получения специфической для субъекта иммуногенной композиции, когда у субъекта имеется опухоль, а специфические для субъекта пептиды являются специфическими для субъекта и опухоли субъекта, причем указанный способ включает: секвенирование образца опухоли субъекта и неопухолевого образца субъекта; определение на основе секвенирования нуклеиновой кислоты: немолчащих мутаций, присутствующих в геноме раковых клеток субъекта, но не в нормальной ткани субъекта, и генотипа HLA субъекта; и отбор из идентифицированных немолчащих мутаций множества специфичных для субъекта пептидов, каждый из которых имеет различный опухолевый эпитоп, который представляет собой эпитоп, специфичный для опухоли субъекта, и каждый из которых идентифицирован как способный связывать белок HLA субъекта, что определяют путем анализа последовательности пептидов, полученных из немолчащих мутаций в описанных в настоящем документе способах прогнозирования связывания HLA.

[360] В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе раскрыт способ получения характеристик комплексов HLA-пептиды, специфичных для индивидуума.

[361] В некоторых вариантах осуществления способ получения характеристик комплексов HLA-пептиды, специфичных для индивидуума, используется для разработки иммунотерапевтического средства для нуждающегося в этом индивидуума, такого как субъект с состоянием или заболеванием.

[362] В настоящем документе представлен способ обеспечения противоопухолевого иммунитета у млекопитающего, включающий введение млекопитающему полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, идентифицированный согласно описанному способу. В настоящем документе представлен способ обеспечения противоопухолевого иммунитета у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества пептида с последовательностью пептида, идентифицированной согласно описанному в настоящем документе способу. В настоящем документе представлен способ обеспечения противоопухолевого иммунитета у млекопитающего, включающий введение млекопитающему клетки, содержащей пептид, содержащий последовательность пептида, идентифицированную согласно описанному в настоящем документе способу. В настоящем документе представлен способ обеспечения противоопухолевого иммунитета у млекопитающего, включающий введение млекопитающему клетки, содержащей полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, идентифицированную согласно описанному в настоящем документе способу. В некоторых вариантах осуществления клетка презентирует пептид в виде комплекса HLA-пептид.

[363] В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, идентифицированный согласно описанному в настоящем документе способу. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, идентифицированную согласно описанному в настоящем документе способу. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту клетки, содержащей пептид, содержащий последовательность пептида, идентифицированную согласно описанному в настоящем документе способу. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту клетки, содержащей полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, идентифицированную согласно описанному в настоящем документе способу. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или расстройством является рак. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора иммунных контрольных точек.

[364] В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе раскрыты способы разработки иммунотерапевтического средства для нуждающегося в этом индивидуума путем получения характеристик комплексов HLA-пептиды, включающие: a) предоставление популяции клеток, полученных у нуждающегося в этом индивидуума, причем одна или более клеток популяции клеток содержат полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую аллель меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, при этом последовательность, кодирующая меченный аффинным акцептором HLA, содержит: i) последовательность, кодирующую аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, функционально связанную с ii) последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор; b) экспрессию меченного аффинным акцептором HLA по меньшей мере в одной клетке из одной или более клеток популяции клеток, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды по меньшей мере в одной клетке; c) обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; получение характеристик комплексов HLA-пептиды, специфичных для нуждающегося в этом индивидуума; и d) разработку иммунотерапевтического средства на основе комплекса HLA-пептид, специфического для нуждающегося в этом индивидуума; при этом индивидуум имеет заболевание или состояние.

[365] В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтическим средством является полинуклеотидное или пептидное терапевтическое средство.

[366] В некоторых вариантах осуществления способ включает введение одного или более пептидов в популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение популяции клеток в контакт с одним или более пептидами или экспрессию одного или более пептидов в популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов.

[367] В некоторых вариантах осуществления способ включает введение одного или более специфического для пациента HLA. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение всех специфичных для пациента HLA. В некоторых вариантах осуществления специфические для пациента HLA можно вводить в виде одного аллеля. В некоторых вариантах осуществления можно вводить множество специфичных для пациента HLA. В некоторых вариантах осуществления способ включает разработку иммунотерапевтического средства на основе пептидов, идентифицированных в связи со специфическими для пациентов HLA. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток получают у нуждающегося в этом индивидуума.

[368] В некоторых вариантах осуществления способ включает экспрессию библиотеки пептидов в популяции клеток, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение в контакт с популяцией клеток библиотеки пептидов или библиотеки последовательностей, кодирующих пептиды, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой библиотеку пептидов, связанных с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак или заражение возбудителем инфекции или аутоиммунное заболевание. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение возбудителя инфекции или его частей в одну или более клеток популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одного или более пептидов из комплексов HLA-пептиды, специфичных для нуждающегося в этом индивидуума, при этом необязательно, чтобы пептиды происходили из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции или аутоиммунного заболевания. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одной или более областей пептидов из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции или аутоиммунного заболевания. В некоторых вариантах осуществления способ включает идентификацию пептидов из комплексов HLA-пептиды, полученных из возбудителя инфекции или аутоиммунного заболевания.

[369] В некоторых вариантах осуществления возбудителем инфекции является патогенный микроорганизм. В некоторых вариантах осуществления патогенным микроорганизмом является вирус, бактерия или паразит.

[370] В некоторых вариантах осуществления вирус выбирают из группы, состоящей из: BK вируса (BKV), вирусов Денге (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), цитомегаловируса (CMV), вируса гепатита В (HBV), вируса гепатита С (HCV), вируса Эпштейна-Барра (EBV), аденовируса, вируса иммунодефицита человека (HIV), Т-клеточного лимфотрофического вируса человека (HTLV-1), вируса гриппа, RSV, HPV, бешенства, вируса паротита, краснухи, полиовируса, желтой лихорадки, гепатита A, гепатита B, ротавируса, вируса ветряной оспы, вируса папилломы человека (HPV), оспы, опоясывающего лишая и их комбинаций.

[371] В некоторых вариантах осуществления бактерию выбирают из группы, состоящей из: видов Klebsiella, Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis и Mycobacterium tuberculosis. В некоторых вариантах осуществления бактерию выбирают из группы, состоящей из: тифа, пневмококка, менингококка, haemophilus B, сибирской язвы, столбнячного токсина, менингококка группы B, bcg, холеры и их комбинаций.

[372] В некоторых вариантах осуществления паразитом является гельминт или простейшие. В некоторых вариантах осуществления паразитирующий организм выбирают из группы, состоящей из: видов Leishmania (например, L. major, L. infantum, L. braziliensis, L. donovani, L. chagasi, L. mexicana), видов Plasmodium (например, P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae), Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus и видов Schistosoma (S. mansoni, S. haematobium, S. japonicum).

[373] В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтическим средством является сконструированный рецептор. В некоторых вариантах осуществления сконструированным рецептором является химерный рецептор антигена (CAR), T-клеточный рецептор (TCR) или B-клеточный рецептор (BCR), адаптивная T-клеточная терапия (ACT) или их производное. В других аспектах сконструированным рецептором является химерный рецептор антигена (CAR). В некоторых аспектах CAR является CAR первого поколения. В других аспектах CAR является CAR второго поколения. В других аспектах CAR является CAR третьего поколения.

[374] В некоторых аспектах CAR содержит внеклеточную часть, трансмембранную часть и внутриклеточную часть. В некоторых аспектах внутриклеточная часть содержит по меньшей мере один T-клеточный костимулирующий домен. В некоторых аспектах T-клеточный костимулирующий домен выбирают из группы, состоящей из CD27, CD28, TNFRS9 (4-1BB), TNFRSF4 (OX40), TNFRSF8 (CD30), CD40LG (CD40L), ICOS, ITGB2 (LFA-1), CD2, CD7, KLRC2 (NKG2C), TNFRS18 (GITR), TNFRSF14 (HVEM) или любой их комбинации.

[375] В некоторых аспектах сконструированный рецептор связывает мишень. В некоторых аспектах связывание специфично к пептиду, идентифицированному в способе получения характеристик комплексов HLA-пептиды, специфичных для индивидуума, страдающего от заболевания или состояния.

[376] В некоторых аспектах иммунотерапевтическим средством является клетка, которая подробно описана в настоящем документе. В некоторых аспектах иммунотерапевтическим средством является клетка, содержащая рецептор, который специфически связывает пептид, идентифицированный в способе получения характеристик комплексов HLA-пептиды, специфичных для индивидуума, страдающего от заболевания или состояния. В некоторых аспектах иммунотерапевтическим средством является клетка, используемая в комбинации с пептидами/нуклеиновыми кислотами согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления клеткой является клетка пациента. В некоторых вариантах осуществления клеткой является T-клетка. В некоторых вариантах осуществления клеткой является инфильтрующий опухоль лимфоцит.

[377] В некоторых аспектах субъекта с состоянием или заболеванием лечат на основе набора T-клеточных рецепторов субъекта. В некоторых вариантах осуществления антигенную вакцину выбирают на основе набора T-клеточных рецепторов субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъекта лечат T-клетками, экспрессирующими TCR, специфические к антигену или пептиду, идентифицированному с использованием способов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъекта лечат антигеном или пептидом, идентифицированным с использованием способов, описанных в данном документе, специфическим к TCR, например, специфическим к TCR субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъекта лечат антигеном или пептидом, идентифицированным с использованием способов, описанных в данном документе, специфическим к T-клеткам, экспрессирующим TCR, например, специфическим к TCR субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъекта лечат антигеном или пептидом, идентифицированным с использованием способов, описанных в данном документе, специфическим к TCR, специфическим для субъекта.

[378] В некоторых вариантах осуществления иммуногенную антигенную композицию или вакцину выбирают на основе TCR, идентифицированных у субъекта. В одном варианте осуществления идентификацию набора T-клеток и тестирование в функциональных анализах используют для определения иммуногенной композиции или вакцины для введения субъекту с состоянием или заболеванием. В некоторых вариантах осуществления иммуногенной композицией является антигенная вакцина. В некоторых вариантах осуществления антигенная вакцина содержит специфические для субъекта антигенные пептиды. В некоторых вариантах осуществления антигенные пептиды для включения в антигенную вакцину выбирают на основе количественного определения специфичных для субъекта TCR, которые связываются с антигенами. В некоторых вариантах осуществления антигенные пептиды выбирают на основе аффинности связывания пептида с TCR. В некоторых вариантах осуществления выбирают на основе комбинации как величины, так и аффинности связывания. Например, TCR, который в функциональном анализе сильно связывается с антигеном, но который незначительно представлен в наборе TCR, может быть хорошим кандидатом на антигенную вакцину, поскольку преимущественно будут амплифицироваться T-клетки, экспрессирующие TCR.

[379] В некоторых вариантах осуществления антигены выбирают для введения субъекту на основе связывания с TCR. В некоторых вариантах осуществления можно размножать T-клетки, такие как T-клетки у субъекта с заболеванием или состоянием. Размноженные T-клетки, которые экспрессируют TCR, специфические к иммуногенному антигенному пептиду, идентифицированному с использованием способа, описанного в настоящем документе, можно вводить назад субъекту. В некоторых вариантах осуществления подходящие клетки, например, PBMC, трансдуцируют или трансфицируют полинуклеотидами для экспрессии TCR, специфических к иммуногенному антигенному пептиду, идентифицированному с использованием способа, описанного в данном документе, и вводят субъекту. T-клетки, экспрессирующие TCR, специфические к иммуногенному антигенному пептиду, идентифицированному с использованием способа, описанного в данном документе, можно размножать и вводить назад субъекту. В некоторых вариантах осуществления можно размножать и вводить субъекту T-клетки, которые экспрессируют TCR, специфические к иммуногенному антигенному пептиду, идентифицированному с использованием способа, описанного в данном документе, которые приводят к цитолитической активности при инкубировании с аутологичной пораженной тканью. В некоторых вариантах осуществления можно размножать и вводить субъекту T-клетки, используемые в функциональных анализах, что приводит к связыванию с иммуногенным антигенным пептидом, идентифицированным с использованием способа, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления можно экспрессировать в T-клетках и вводить субъекту TCR, которые, как было определено, связываются со специфическими для субъекта иммуногенными антигенными пептидами, идентифицированными с использованием способа, описанного в данном документе.

[380] Способы, описанные в данном документе, могут включать адоптивный перенос клеток иммунной системы, таких как T-клетки, специфические для выбранных антигенов, таких как антигены, связанные с опухолью или патогенным микроорганизмом. Различные стратегии можно использовать для генетической модификации T-клеток за счет изменения специфичности T-клеточного рецептора (TCR), например, путем введения новых α и β цепей TCR со специфичностью к иммуногенному антигенному пептиду, идентифицированному с использованием способа, описанного в данном документе (см., например, патент США № 8697854; публикации патентов PCT: WO2003020763, WO2004033685, WO2004044004, WO2005114215, WO2006000830, WO2008038002, WO2008039818, WO2004074322, WO2005113595, WO2006125962, WO2013166321, WO2013039889, WO2014018863, WO2014083173; патент США № 8088379).

[381] Химерные рецепторы антигена (CAR) можно использовать для создания иммуночувствительных клеток, таких как T-клетки, специфические для выбранных мишеней, таких как иммуногенные антигенные пептиды, идентифицированные с использованием способа, описанного в настоящем документе, с большим множеством химерных конструкций рецептора (см., например, патенты США №№ 5843728; 5851828; 5912170; 6004811; 6284240; 6392013; 6410014; 6753162; 8211422; и публикацию PCT W09215322). Альтернативные конструкции CAR можно охарактеризовать, как относящиеся к последующим поколениям. CAR первого поколения обычно состоят из одноцепочечного вариабельного фрагмента антитела, специфического к антигену, например, содержащего VL, связанную с VH конкретного антитела, связанного гибким линкером, например, шарнирным доменом CD8a и трансмембранным доменом CD8a, с трансмембранным и внутриклеточным сигнальными доменами либо CD3ζ, либо FcRy, либо scFv-FcRy (см., например, патент США № 7741465; патент США № 5912172; патент США № 5906936). CAR второго поколения содержат внутриклеточные домены одной или более костимулирующих молекул, таких как CD28, OX40 (CD134) или 4-1BB (CD137) внутри эндодомена, например, scFv-CD28/OX40/4-lBB-CD3 (см., например, патенты США №№ 8911993; 8916381; 8975071; 9101584; 9102760; 9102761). CAR третьего поколения содержат комбинацию костимулирующих эндодоменов, таких как CD3C-цепь, CD97, GDI la-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CDS, OX40, 4-1BB, или сигнальных доменов CD28, например, scFv-CD28-4-lBB-CD3C или scFv-CD28-OX40-CD3Q (см., например, патент США № 8906682; патент США № 8399645; патент США № 5686281; PCT публикация № WO2014134165; PCT публикация № WO2012079000). В некоторых вариантах осуществления костимуляцию можно координировать посредством экспрессии CAR в антиген-специфических T-клетках, выбираемых таким образом, чтобы активировать и размножать их, например, после взаимодействия с антигеном на профессиональных антигенпрезентирующих клетках при костимуляции. На иммуночувствительных клетках можно обеспечить дополнительные сконструированные рецепторы, например, для улучшения нацеливания атаки T-клеток и/или минимизации побочных эффектов.

[382] Для трансформации иммуночувствительных клеток-мишеней можно использовать альтернативные методы, такие как слияние протопластов, липофекция, трансфекция или электропорация. Можно использовать большое множество векторов, таких как ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, плазмиды или транспозоны, такие как транспозон «спящая красавица» (см. Патенты США №№ 6489458; 7148203; 7160682; 7985739; 8227432), для введения CAR, например, с использованием антиген-специфических CAR второго поколения, передающих сигналы через CD3ζ или CD28 или CD137. Вирусные векторы, например, могут включать в себя векторы на основе HIV, SV40, EBV, HSV или BPV

[383] Клетки, которые нацелены на трансформацию, могут, например, включать в себя T-клетки, клетки Natural Killer (NK), цитотоксические T-лимфоциты (CTL), регуляторные T-клетки, человеческие эмбриональные стволовые клетки, инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) или плюрипотентную стволовую клетку, из которой можно дифференцировать лимфоидные клетки. Т-клетки, экспрессирующие требуемый CAR, например, можно отобрать путем совместного культивирования с γ-облученными активирующими и размножающимися клетками (APC), которые совместно экспрессируют раковый антиген и костимулирующие молекулы. T-клетки со сконструированными CAR можно размножать, например, путем совместного культивирования на APC в присутствии растворимых факторов, таких как IL-2 и IL-21. Это размножение, например, можно проводить так, чтобы обеспечить CAR Т-клетки памяти (которые, например, анализируют с помощью неферментативной цифровой матрицы и/или проточной цитометрии с несколькими панелями). Таким образом, можно обеспечить CAR Т-клетки, которые обладают специфической цитотоксической активностью в отношении антиген-несущих опухолей (необязательно в сочетании с продуцированием требуемых хемокинов, таких как интерферон-γ). CAR Т-клетки такого типа можно использовать, например, в животных моделях, например, для угрозы опухолевым ксенотрансплантатам.

[384] Такие подходы, как изложенно выше, можно адаптировать для обеспечения способов лечения и/или увеличения выживаемости субъекта, имеющего заболевание, такое как новообразование или заражение патогенным микроорганизмом, например, путем введения эффективного количества иммуночувствительных клеток, содержащих распознающий антиген рецептор, который связывает выбранный антиген, причем связывание активирует иммуночувствительную клетку, таким образом с лечением или предотвращением заболевания (такого как новообразование, заражение патогенным микроорганизмом, аутоиммунное расстройство или аллогенная реакция трансплантата). Применение CAR Т-клеточной терапии может, например, включать введение от 106 до 109 клеток/кг, с курсом лимфодеплеции, например, с циклофосфамидом, или без него.

[385] Для защиты от возможных побочных реакций сконструированные иммуночувствительные клетки можно снабдить трансгенным предохранительным выключателем в форме трансгена, который делает клетки уязвимыми для воздействия специфического сигнала. Например, таким образом можно использовать ген вирусной тимидинкиназы (TK) простого герпеса, например, путем введения в аллогенные Т-лимфоциты, используемые в качестве донорских инфузий лимфоцитов после трансплантации стволовых клеток. В таких клетках введение нуклеозидного пролекарства, такого как ганцикловир или ацикловир, вызывает гибель клеток. Альтернативные конструкции безопасного выключателя включают индуцибельную каспазу 9, например, запускаемую введением низкомолекулярного димеризатора, который объединяет две нефункциональные молекулы icasp9 для образования активного фермента. Описан широкий спектр альтернативных подходов к осуществлению контроля клеточной пролиферации (см., например, патентную публикацию США № 20130071414; патентную публикацию РСТ WO2011146862; патентную публикацию РСТ WO2014011987; публикацию патентной заявки РСТ WO2013040371). В дальнейшем уточнении адоптивной терапии редактирование генома можно использовать для адаптации иммуночувствительных клеток к альтернативному исполнению, например, для предоставления Т-клеток с отредактированными CAR.

[386] Методы клеточной терапии также могут включать активацию и размножение Т-клеток ex-vivo. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки можно активировать перед введением их нуждающемуся в этом субъекту. Примеры такого типа лечения включают использование клеток инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) (см. Патент США № 5126132), цитотоксические Т-клетки (см. Патент США № 6255573 и патент США № 5846827), размноженных клеток опухоли дренирующего лимфатического узла (см. Патент США № 6251385) и различные другие препараты лимфоцитов (см. Патент США № 6194207; патент США № 5443983; патент США № 6040177; патент США № 5766920).

[387] Активированная ex vivo популяция Т-клеток может находиться в состоянии, которое максимально регулирует иммунный ответ на рак, инфекционные заболевания или другие болезненные состояния, например аутоиммунное заболевание. Для активации в Т-клетки можно доставить по меньшей мере два сигнала. Первый сигнал обычно доставляется через T-клеточный рецептор (TCR) на поверхности T-клетки. Первый сигнал TCR обычно запускается при взаимодействии TCR с пептидными антигенами, экспрессируемыми в сочетании с комплексом MHC на поверхности антигенпрезентирующей клетки (APC). Второй сигнал обычно доставляется через костимулирующие рецепторы на поверхности Т-клеток. Костимулирующие рецепторы, как правило, запускаются соответствующими лигандами или цитокинами, экспрессируемыми на поверхности АРС.

[388] Предполагается, что Т-клетки, специфические к иммуногенным антигенным пептидам, идентифицированным с использованием способа, описанного в настоящем документе, можно получать и использованы в способах лечения или профилактики заболевания. В этом отношении настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики заболевания или состояния у субъекта, включающему введение субъекту клеточной популяции, содержащей клетки, специфические к иммуногенным антигенным пептидам, идентифицированным с использованием способа, описанного в настоящем документе, в количестве, эффективном для лечения или профилактики болезни у субъекта. В некоторых вариантах осуществления способ лечения или профилактики заболевания у субъекта включает введение субъекту клеточной популяции, обогащенной Т-клетками, реагирующими на заболевание, в количестве, эффективном для лечения или предотвращения рака у млекопитающего. Клетками могут быть клетки, которые являются аллогенными или аутологичными для субъекта.

[389] В настоящем раскрытии дополнительно предоставлен способ вызова специфического к болезни иммунного ответа у субъекта, вакцинации против заболевания, лечения и/или облегчения симптома заболевания у субъекта путем введения субъекту антигенного пептида или вакцины.

[390] Пептид или композицию согласно изобретению можно вводить в количестве, достаточном для вызова ответа CTL. Антигенную пептидную или вакцинную композицию можно вводить отдельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами. Иллюстративные терапевтические средства включают, но без ограничения, химиотерапевтическое или биотерапевтическое средство, облучение или иммунотерапию. Может быть назначено любое подходящее терапевтическое лечение для конкретного заболевания. Примеры химиотерапевтических и биотерапевтических средств включают, но без ограничения, альдеслейкин, альтретамин, амифостин, аспарагиназу, блеомицин, капецитабин, карбоплатин, кармустин, кладрибин, цизаприд, цисплатин, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин (DTIC), дактиномицин, доцетаксел, доксорубицин, дронабинол, эпоэтин альфа, этопозид, филграстим, флударабин, фторурацил, гемцитабин, гранисетрон, гидроксимочевина, идарубицин, ифосфамид, интерферон альфа, иринотекан, лансопразол, левамизол, лейкоровин, мегестрол, месна, метотрексат, метоклопрамид, митомицин, митотан, митоксантрон, омепразол, ондансетрон, паклитаксел (Таксол®), пилокарпин, прохлороперазин, ритуксимаб, тамоксифен, таксол, топотекан гидрохлорид, трастузумаб, винбластин, винкристин и винорелбин тартрат. Кроме того, субъекту можно дополнительно вводить антииммуносупрессивное или иммуностимулирующее средство. Например, субъекту можно дополнительно вводить антитело против CTLA или анти-PD-1 или анти-PD-L1.

[391] Специалист в данной области можем определить количество каждого пептида, включаемого в композицию вакцины, и схему введения. Например, пептид или его вариант может быть получен для внутривенной (i.v.) инъекции, подкожной (s.c.) инъекции, внутрикожной (i.d.) инъекции, внутрибрюшинной (i.p.) инъекции, внутримышечной (i.m.) инъекции. Иллюстративные способы инъекции пептидов включают s.c, i.d. i.p. i.m. И i.v. Иллюстративные способы инъекции ДНК включают i.d. i.m. s.c, i.p. И i.v. Специалистам в данной области известны другие способы введения вакцинной композиции.

[392] Фармацевтическую композицию можно составить таким образом, чтобы выбор, число и/или количество пептидов, присутствующих в композиции, было/были специфическими для болезнени и/или пациента. Например, точный отбор пептидов можно направлять с помощью профилей экспрессии родительских белков в данной ткани, чтобы избежать побочных эффектов. Выбор может зависеть от конкретного типа заболевания, состояния заболевания, более ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и гаплотипа HLA пациента. Кроме того, вакцина согласно настоящему раскрытию может содержать индивидуализированные компоненты в соответствии с личными потребностями конкретного пациента. Примеры включают варьирование количества пептидов в соответствии с экспрессией родственного антигена у конкретного пациента, нежелательные побочные эффекты, вызванные личной аллергией, или другие виды лечения и корректировки для вторичного лечения после первого раунда или схемы лечения.

Получение Специфических к болезням Антигенов

[393] Настоящее раскрытие по меньшей мере частично основано на способности презентировать иммунной системе пациента один или более специфических для заболевания антигенов. Из этого раскрытия и из знаний в данной области специалист в данной области поймет, что существует множество способов получения таких специфических для заболевания антигенов. Как правило, такие специфические для заболевания антигены можно получать либо in vitro, либо in vivo. Специфические для заболевания антигены можно получать in vitro в виде пептидов или полипептидов, которые затем можно включить в состав вакцины или иммуногенной композиции и вводить субъекту. Как описано в настоящем документе более подробно, такое получение in vitro может происходить различными способами, известными специалисту в данной области, такими как, например, синтез пептида или экспрессия пептида/полипептида из молекулы ДНК или РНК в любой из различных бактериальных, эукариотических или вирусных рекомбинантных систем экспрессии с последующей очисткой экспрессированного пептида/полипептида. Альтернативно, специфические для заболевания антигены можно получать in vivo путем введения молекул (например, ДНК, РНК, вирусных систем экспрессии и тому подобное), которые кодируют специфические для заболевания антигены у субъекта, после чего экспрессируют кодируемые специфические для заболевания антигены. Также в данном документе дополнительно описаны способы получения антигенов in vitro и in vivo, поскольку они относятся к фармацевтическим композициям и способам доставки при терапии.

[394] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие включает модифицированные антигенные пептиды. Модификация может включать ковалентную химическую модификацию, которая не изменяет первичную аминокислотную последовательность самого антигенного пептида. Модификации могут создавать пептиды с требуемыми свойствами, например, продлевание периода полувыведения in vivo, увеличение стабильности, уменьшение клиренса, изменение иммуногенности или аллергенности, обеспечение появления специфических антител, нацеливание на клетки, поглощение антигена, процессинг антигена, аффинность МНС, стабильность МНС или презентация антигена. Изменения антигенного пептида, которые можно осуществлять, включают, но без ограничения, конъюгирование с белком-носителем, конъюгирование с лигандом, конъюгирование с антителом, пегилирование, полисиалилирование, присоединение ГЭК, рекомбинантные миметики ПЭГ, слияние с Fc, слияние альбумина, присоединение наночастиц, инкапсуляцию наночастиц, слияние с холестерином, слияние с железом, ацилирование, амидирование, гликозилирование, окисление боковой цепи, фосфорилирование, биотинилирование, добавление поверхностно-активного вещества, добавление миметиков аминокислот или добавление неприродных аминокислот.

[395] Проблемы, связанные с коротким периодом полураспада в плазме или восприимчивостью к деградации протеаз, можно преодолеть с помощью различных модификаций, включая конъюгирование или связывание полипептидной последовательности с любым из множества небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем (PEG), полипропиленом, гликолем или полиоксиалкиленами (см., например, обычно через связывающий фрагмент, ковалентно связанный как с белком, так и с непротеиновым полимером, например, PEG). Было показано, что такие конъюгированные с PEG биомолекулы обладают клинически полезными свойствами, включая лучшую физическую и термическую стабильность, защиту от подверженности к ферментативному расщеплению, повышенную растворимость, более длительный период полувыведения из кровотока in vivo и уменьшенный клиренс, сниженную иммуногенность и антигенность и пониженную токсичность.

[396] PEG, подходящие для конъюгирования с полипептидной последовательностью, обычно растворимы в воде при комнатной температуре и имеют общую формулу R(O-CH2-CH2)nO-R, где R представляет собой водород или защитную группу, такую как алкильная или алканольная группа, и где n представляет собой целое число от 1 до 1000. Когда R представляет собой защитную группу, он обычно имеет от 1 до 8 атомов углерода. PEG, конъюгированный с полипептидной последовательностью, может быть линейным или разветвленным. В настоящем раскрытии рассмотрены разветвленные производные PEG, «звездчатые PEG» и многоплечие PEG.

[397] В настоящем раскрытии также рассмотрены композиции конъюгатов, в которых PEG имеют разные значения n и, таким образом, множество разных PEG присутствует в определенных соотношениях. Например, некоторые композиции содержат смесь конъюгатов, где n=1, 2, 3 и 4. В некоторых композициях процент конъюгатов, где n=l, составляет 18-25%, процент конъюгатов, где n=2, составляет 50-66%, процент конъюгатов, где n=3, составляет 12-16%, а процент конъюгатов, где n=4, составляет до 5%. Такие композиции можно получить с помощью условий реакции и способов очистки, известных в данной области. Например, катионообменную хроматографию можно использовать для разделения конъюгатов, и затем идентифицировать фракцию, которая содержит конъюгат, имеющий, например, необходимое количество присоединенных PEG, очищенных от последовательностей немодифицированного белка и от конъюгатов, имеющих другое количество присоединенных PEG.

[398] PEG можно связать с полипептидом согласно настоящему изобретению через концевую реактивную группу («спейсер»). Спейсер представляет собой, например, концевую реактивную группу, которая опосредует связь между свободными амино или карбоксильными группами одной или более полипептидных последовательностей и полиэтиленгликолем. PEG, имеющий спейсер, который можно связать со свободной аминогруппой, содержит N-гидроксисукцинилимид-полиэтиленгликоль, который можно получить путем активации эфира янтарной кислоты и полиэтиленгликоля с N-гидроксисукцинилимидом. Другим активированным полиэтиленгликолем, который можно связать со свободной аминогруппой, является 2,4-бис (О-метоксиполиэтиленгликоль)-6-хлор-s-триазин, который можно получить путем взаимодействия монометилового эфира полиэтиленгликоля с хлоридом циануровой кислоты. Активированный полиэтиленгликоль, который связан со свободной карбоксильной группой, содержит полиоксиэтилендиамин.

[399] Конъюгирование одной или более полипептидных последовательностей согласно настоящему изобретению с PEG, имеющим спейсер, можно проводить различными обычными способами. Например, реакцию конъюгации можно проводить в растворе при рН от 5 до 10, при температуре от 4°С до комнатной температуры, в течение от 30 минут до 20 часов, используя молярное отношение реагента к белку от 4:1 до 30:1. Условия реакции можно выбрать так, чтобы направить реакцию на получение преимущественно необходимой степени замещения. Как правило, низкая температура, низкий pH (например, pH=5) и короткое время реакции имеют тенденцию уменьшать количество присоединяемых PEG, тогда как высокая температура, pH от нейтрального до высокого (например, pH>7) и более длительное время реакции имеют тенденцию увеличить количество прикрепленных PEG. Для прекращения реакции можно использовать различные способы, известные в данной области. В некоторых вариантах осуществления реакцию прекращают путем подкисления реакционной смеси и замораживания, например, при -20°С.

[400] Настоящее раскрытие также предусматривает использование миметиков PEG. Были разработаны рекомбинантные миметики PEG, которые сохраняют свойства PEG (например, увеличенный период полувыведения из сыворотки), в то же время сохраняя некоторые дополнительные полезные свойства. Например, простые полипептидные цепи (содержащие, например, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser и Thr), способные образовывать расширенную конформацию, подобную PEG, можно получить рекомбинантно уже слитыми с интересующим пептидным или белковым лекарственным средством (например, технология XTEN компании Amunix; Mountain View, CA). Это устраняет необходимость в дополнительном этапе конъюгации в процессе получения. Кроме того, признанные методы молекулярной биологии позволяют контролировать состав боковых цепей полипептидных цепей, что позволяет оптимизировать иммуногенность и получаемые свойства.

[401] Гликозилирование может влиять на физические свойства белков, а также может играть важную роль в стабильности, секреции и внутриклеточной локализации белков. Правильное гликозилирование может быть важным для биологической активности. Фактически, некоторые гены из эукариотических организмов, когда они экспрессируются в бактериях (например, E.coli), в которых отсутствуют клеточные процессы для гликозилирования белков, дают белки, которые извлекают с небольшой активностью или которые вообще не имеют активности из-за отсутствия гликозилирования. Добавление сайтов гликозилирования можно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности. Изменение полипептида можно осуществлять, например, путем добавления или замены одним или более остатками серина или треонина (для сайтов O-связанного гликозилирования) или остатков аспарагина (для сайтов N-связанного гликозилирования). Структура N-связанных и O-связанных олигосахаридов и остатков сахара, обнаруженных в каждом типе, может быть различной. Одним типом сахара, который обычно встречается и там и там, является N-ацетилнейраминовая кислота (далее упоминаемая как сиаловая кислота). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком как N-связанных, так и O-связанных олигосахаридов и благодаря своему отрицательному заряду может придавать гликопротеину кислотные свойства. Варианты осуществления настоящего изобретения включают в себя создание и использование вариантов N-гликозилирования.

[402] Полипептидные последовательности согласно настоящему изобретению необязательно можно изменять посредством изменений на уровне ДНК, в частности, путем мутации ДНК, кодирующей полипептид, на предварительно выбранных основаниях, так что образуются кодоны, которые будут транслироваться в требуемые аминокислоты. Другим способом увеличения количества углеводных фрагментов в полипептиде является химическое или ферментативное связывание гликозидов с полипептидом. Удаление углеводов можно выполнять химически или ферментативно, или путем замены кодонов, кодирующих аминокислотные остатки, которые гликозилируют. Методы химического дегликозилирования известны, и ферментативное расщепление углеводных остатков на полипептидах можно получать путем использования различных эндо- и экзогликозидаз.

[403] Дополнительные подходящие компоненты и молекулы для конъюгации включают в себя, например, молекулы для нацеливания на лимфатическую систему тироглобулин; альбумины, такие как человеческий сывороточный альбумин (HAS); столбнячный анатоксин; дифтерийный анатоксин; полиаминокислоты, такие как поли (D-лизин: D-глутаминовая кислота); полипептиды VP6 ротавирусов; гемагглютинин вируса гриппа, нуклеопротеин вируса гриппа; гемоцианин лимфы улитки (KLH); и основной белок и поверхностный антиген вируса гепатита В; или любую комбинацию вышеизложенного.

[404] Слияния альбумина с одним или более полипептидами согласно настоящему изобретению, например, можно достигнуть путем генетических манипуляций, так чтобы соединить ДНК, кодирующую HSA или его фрагмент, с ДНК, кодирующей одну или более полипептидных последовательностей. После этого подходящего хозяина можно трансформировать или трансфицировать слитыми нуклеотидными последовательностями в форме, например, подходящей плазмиды, чтобы экспрессировать слитый полипептид. Экспрессию можно осуществить in vitro, например, из прокариотических или эукариотических клеток или in vivo, например, из трансгенного организма. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессию слитого белка проводят в клеточных линиях млекопитающих, например в клеточных линиях СНО. Трансформацию широко используют в данном документе для обозначения генетического изменения клетки в результате прямого захвата, включения и экспрессии экзогенного генетического материала (экзогенной ДНК) из его окружения и захвата через клеточную мембрану (мембраны). Трансформация происходит естественным образом у некоторых видов бактерий, но ее также можно провести искусственным путем в других клетках. Кроме того, сам альбумин можно модифицировать, чтобы продлить его период полувыведения из крови. Слияние модифицированного альбумина с одним или более полипептидами можно получить методами генетической манипуляции, описанными выше, или с помощью химической конъюгации; получающаяся в результате слитая молекула имеет период полувыведения, который превышает время слияния с немодифицированным альбумином. (См. WO2011/051489). Несколько стратегий связывания альбумина было разработано в качестве альтернативы прямого слияния, включая связывание альбумина через цепь конъюгированных жирных кислот (ацилирование). Поскольку сывороточный альбумин является транспортным белком для жирных кислот, эти природные лиганды с альбумин-связывающей активностью были использованы для продления полувыведения терапевтических средств с малыми белками. Например, инсулин детемир (LEVEMIR), одобренный препарат для лечения диабета, содержит миристильную цепь, конъюгированную с генетически модифицированным инсулином, что приводит к аналогу инсулина длительного действия.

[405] Другим типом модификации является конъюгирование (например, связывание) одного или более дополнительных компонентов или молекул на N- и/или C-конце полипептидной последовательности, таких как другой белок (например, белок, имеющий аминокислотную последовательность, гетерологичную по отношению к белку субъекта) или молекула-носитель. Таким образом, примерная полипептидная последовательность может быть предоставлена в виде конъюгата с другим компонентом или молекулой.

[406] Модификация конъюгата может привести к полипептидной последовательности, которая сохраняет активность с дополнительной или комплементарной функцией или активность второй молекулы. Например, полипептидную последовательность можно конъюгировать с молекулой, например, для облегчения растворимости, хранения или срока годности in vivo или стабильности, снижения иммуногенности, замедленного или контролируемого высвобождения in vivo и т. д. Другие функции или действия включают конъюгат, который снижает токсичность по отношению к неконъюгированной полипептидной последовательности, конъюгат, нацеленный на тип клетки или органа более эффективно, чем неконъюгированная полипептидная последовательность, или лекарственное средство для дополнительного противодействия причинам или последствиям, связанным с нарушением или заболеванием, как изложено в настоящем документе (например, диабетом).

[407] Полипептид также может быть конъюгирован с большими медленно метаболизируемыми макромолекулами, такими как белки; полисахариды, такие как сефароза, агароза, целлюлоза, целлюлозные шарики; полимерные аминокислоты, такие как полиглутаминовая кислота, полилизин; аминокислотные сополимеры; инактивированные вирусные частицы; инактивированные бактериальные токсины, такие как анатоксин из молекул дифтерии, столбняка, холеры, лейкотоксинов; инактивированные бактерии; и дендритные клетки.

[408] Дополнительные компоненты и молекулы, кандидаты для конъюгации, включают те, которые подходят для выделения или очистки. Конкретные неограничивающие примеры включают связывающие молекулы, такие как биотин (пара специфического связывания биотин-авидин), антитело, рецептор, лиганд, лектин или молекулы, которые содержат твердую подложку, включая, например, пластиковые или полистирольные гранулы, пластины или шарики, магнитные шарики, тест-полоски и мембраны. Для разделения конъюгатов по разнице зарядов можно использовать такие методы очистки, как катионообменная хроматография, которая эффективно разделяет конъюгаты с разными молекулярными массами. Содержание фракций, полученных катионообменной хроматографией, можно идентифицировать по молекулярной массе с использованием общепринятых методов, например, масс-спектроскопии, SDS-PAGE или других известных способов разделения молекулярных образований по молекулярной массе.

[409] В некоторых вариантах осуществления амино- или карбоксильный конец полипептидной последовательности согласно настоящему изобретению можно слить с Fc-областью иммуноглобулина (например, Fc человека) с образованием слитого конъюгата (или слитой молекулы). Было показано, что слитые Fc-конъюгаты увеличивают системный период полувыведения биофармацевтических препаратов, и, таким образом, биофармацевтический продукт может требовать менее частого введения.

[410] Fc связывается с неонатальным рецептором Fc (FcRn) в эндотелиальных клетках, которые выстилают кровеносные сосуды, и после связывания слитая молекула Fc защищена от распада и повторно выделяется в кровоток, дольше сохраняя молекулу в кровотоке. Считается, что это связывание Fc является механизмом, посредством которого эндогенный IgG сохраняет свой длительный период полувыведения из плазмы. Более современная технология Fc-слияния связывает одну копию биофармацевтического средства с Fc-областью антитела для оптимизации фармакокинетических и фармакодинамических свойств биофармацевтического средства по сравнению с традиционными слитыми Fc-конъюгатами.

[411] Настоящее раскрытие предусматривает использование других известных в настоящее время или разработанных в будущем модификаций полипептидов для улучшения одного или более свойств. Один из таких способов продления периода полувыведения из кровотока, повышения стабильности, уменьшения клиренса или изменения иммуногенности или аллергенности полипептида согласно настоящему изобретению включает модификацию полипептидных последовательностей путем гезилирования, в котором используются производные гидроксиэтилкрахмала, связанные с другими молекулами, для того, чтобы изменить характеристики молекулы. Различные аспекты гезилирования описаны, например, в патентных заявках США №№ 2007/0134197 и 2006/0258607.

Синтез Пептидов/Полипептидов In Vitro

[412] Белки или пептиды могут быть получены любым способом, известным специалистам в данной области, включая экспрессию белков, полипептидов или пептидов с помощью стандартных молекулярно-биологических методов, выделения белков или пептидов из природных источников, трансляции in vitro или химического синтеза белков или пептидов.

[413] Пептиды можно легко синтезировать химически с использованием реагентов, которые не содержат загрязняющих бактериальных или животных веществ (Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc.85:2149-54, 1963). В некоторых вариантах осуществления антигенные пептиды получают путем (1) параллельного твердофазного синтеза на многоканальных приборах с использованием однородных условий синтеза и расщепления; (2) очистки на колонке RP-HPLC с отгонкой из колонки; и повторной промывки, но не замены, между пептидами; с последующим (3) анализом с ограниченным набором наиболее информативных анализов. Относительно набора пептидов для отдельного пациента можно определить область «Надлежащей производственной практики» (GMP), что требует проведения процедур смены набора только между синтезами пептидов для разных пациентов.

[414] Альтернативно, нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую антигенный пептид согласно настоящему изобретению, можно использовать для получения антигенного пептида in vitro. Полинуклеотидом может быть, например, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, одно- и/или двухцепочечные или нативные или стабилизированные формы полинуклеотидов, такие как, например, полинуклеотиды с фосфоротиатным остовом или их комбинации, и они могут содержать интроны, если они кодируют пептид. В одном варианте осуществления для получения пептида используют трансляцию in vitro. Существует множество иллюстративных систем, которые может использовать специалист в данной области (например, набор Retic Lysate IVT, Life Technologies, Waltham, MA). Также можно получить вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид. В данной области хорошо известны векторы экспрессии для различных типов клеток, которые можно выбрать без чрезмерных экспериментов. Как правило, ДНК вставляют в вектор экспрессии, такой как плазмида, в правильной ориентации и правильной рамке считывания для экспрессии. При необходимости ДНК может быть связана с соответствующими нуклеотидными последовательностями регуляторного контроля транскрипции и трансляции, распознаваемыми нужным хозяином (например, бактериями), хотя такие контроли обычно доступны в векторе экспрессии. Затем вектор вводят в бактерии-хозяева для клонирования с использованием стандартных методов (см., например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

[415] Также предполагаются векторы экспрессии, содержащие выделенные полинуклеотиды, а также клетки-хозяева, содержащие векторы экспрессии. Антигенные пептиды могут быть предоставлены в форме молекул РНК или кДНК, кодирующих нужные антигенные пептиды. Один или более антигенных пептидов согласно изобретению может кодировать один вектор экспрессии.

[416] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для специфического для заболевания антигенного пептида, слитого в одной и той же рамке считывания с полинуклеотидом, который способствует, например, экспрессии и/или секреции полипептида из клетки-хозяина (например, лидерную последовательность, которая функционирует как секреторная последовательность для контроля транспорта полипептида из клетки). Полипептид, имеющий лидерную последовательность, представляет собой препротеин и может иметь лидерную последовательность, расщепляемую клеткой-хозяином с образованием зрелой формы полипептида.

[417] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для специфического для заболевания антигенного пептида, слитого в одной и той же рамке считывания с маркерной последовательностью, которая позволяет, например, очищать кодированный полипептид, который затем может быть включен в персонализированную вакцину против болезни или иммуногенную композицию. Например, маркерная последовательность может представлять собой гексагистидиновую метку, поставляемую вектором pQE-9, для обеспечения очистки зрелого полипептида, слитого с маркером, в случае бактериального хозяина, или маркерная последовательность может представлять собой гемагглютининовую (HA) метку, полученную из белка гемагглютинина гриппа, когда используется хозяин млекопитающего (например, клетки COS-7). Дополнительные метки включают, но без ограничения, кальмодулиновые метки, метки FLAG, метки Myc, метки S, метки SBP, метки Softag 1, Softag 3, метку V5, метки Xpress, метки Isopeptag, SpyTag, метки белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), GST-метки, метки флуоресцентного белка (например, метки зеленого флуоресцентного белка), метки мальтозосвязывающего белка, метки Nus, Strep-метку, метку Thioredoxin, метку TC, метку Ty и тому подобное.

[418] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для одного или более специфических для заболевания антигенных пептидов, слитых в одной и той же рамке считывания, для создания единой конкатамеризованной антигенной пептидной конструкции, способной создавать множество антигенных пептидов.

[419] В некоторых вариантах осуществления могут быть предоставлены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную, по меньшей мере на 65% идентичную, по меньшей мере на 70% идентичную, по меньшей мере на 75% идентичную, по меньшей мере на 80% идентичную, по меньшей мере на 85% идентичную, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или по меньшей мере на 96%, 97%, 98% или 99% идентичную полинуклеотиду, кодирующему специфический для заболевания антигенный пептид согласно настоящему изобретению.

[420] Выделенные специфические для заболевания антигенные пептиды, описанные здесь, могут быть получены in vitro (например, в лаборатории) любым подходящим способом, известным в данной области. Такие способы варьируют от методов прямого синтеза белка до конструирования последовательности ДНК, кодирующей выделенные полипептидные последовательности, и экспрессии этих последовательностей в подходящем трансформированном хозяине. В некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК конструируют с использованием рекомбинантной технологии путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей интересующий белок дикого типа. Необязательно, последовательность может быть мутагенизирована с помощью сайт-специфического мутагенеза для получения ее функциональных аналогов. См., например Zoeller et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) и патент США. № 4588585.

[421] В некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК, кодирующая представляющий интерес полипептид, может быть сконструирована с помощью химического синтеза с использованием синтезатора олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды могут быть сконструированы на основе аминокислотной последовательности нужного полипептида и выбора тех кодонов, которые являются предпочтительными в клетке-хозяине, в которой продуцируется интересующий рекомбинантный полипептид. Для синтеза изолированной полинуклеотидной последовательности, кодирующей интересующий изолированный полипептид можно применять стандартные методы. Например, для конструирования обратно транслированного гена можно использовать полную аминокислотную последовательность. Кроме того, можно синтезировать олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретный выделенный полипептид. Например, несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части желаемого полипептида, могут быть синтезированы и затем лигированы. Отдельные олигонуклеотиды обычно содержат 5’ или 3’ концы для комплементарной сборки.

[422] После сборки (например, путем синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другого метода) полинуклеотидные последовательности, кодирующие конкретный выделенный представляющий интерес полипептид, встраивают в вектор экспрессии и необязательно функционально связывают с последовательностью контроля экспрессии, подходящей для экспрессии белка у нужного хозяина. Правильная сборка может быть подтверждена секвенированием нуклеотидов, рестрикционным картированием и экспрессией биологически активного полипептида в подходящем хозяине. Как хорошо известно в данной области, для получения высоких уровней экспрессии трансфицированного гена в хозяине ген может быть функционально связан с последовательностями контроля транскрипционной и трансляционной экспрессии, которые являются функциональными в выбранном хозяине экспрессии.

[423] Для амплификации и экспрессии ДНК, кодирующей специфичные для заболевания антигенные пептиды, можно использовать рекомбинантные векторы экспрессии. Рекомбинантные векторы экспрессии представляют собой реплицируемые ДНК-конструкции, которые имеют синтетические или полученные из кДНК фрагменты ДНК, кодирующие специфический для заболевания антигенный пептид или биоэквивалентный аналог, функционально связанный с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами, полученными из генов млекопитающих, микробов, вирусов или насекомых. Транскрипционная единица обычно содержит комплекс (1) генетического элемента или элементов, играющих регулирующую роль в экспрессии генов, например, транскрипционных промоторов или энхансеров, (2) структурной или кодирующей последовательности, которая транскрибируется в mRNA и транслируется в белок, и (3) соответствующие последовательности инициации и терминации транскрипции и трансляции, как подробно описано в данном документе. Такие регуляторные элементы могут содержать операторную последовательность для управления транскрипцией. Дополнительно может быть включена способность к репликации в хозяине, обычно придаваемая источником репликации, и селекционный ген для облегчения распознавания трансформантов. Области ДНК функционально связаны, когда они имеют функциональное отношение друг к другу. Например, ДНК для сигнального пептида (секреторного лидера) функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в качестве предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он управляет транскрипцией последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы обеспечить трансляцию. Обычно функционально связанный означает смежный, а в случае секреторных лидеров означает смежный и в рамке считывания. Структурные элементы, предназначенные для использования в дрожжевых системах экспрессии, включают лидерную последовательность, обеспечивающую внеклеточную секрецию транслированного белка клеткой-хозяином. Альтернативно, когда рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может содержать N-концевой остаток метионина. Этот остаток может быть необязательно впоследствии отщеплен от экспрессированного рекомбинантного белка для получения конечного продукта.

[424] Подходящие векторы экспрессии для эукариотических хозяев, особенно млекопитающих или людей, включают в себя, например, векторы, содержащие последовательности управления экспрессии из SV40, вируса бычьей папилломы, аденовируса и цитомегаловируса. Подходящие векторы экспрессии для бактериальных хозяев включают в себя известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из Escherichia coli, включая pCR 1, pBR322, pMB9 и их производные, плазмиды с более широким спектром хозяев, такие как M13 и нитевидные фаги с одноцепочечной ДНК.

[425] Подходящие клетки-хозяева для экспрессии полипептида включают в себя прокариоты, дрожжи, клетки насекомых или высших эукариот под управлением соответствующих промоторов. Прокариоты включают грамотрицательные или грамположительные организмы, например, E.coli или бациллы. Клетки высших эукариот включают установленные линии клеток, происходящих от млекопитающих. Могут также использоваться бесклеточные системы перевода. Подходящие векторы клонирования и экспрессии для использования с клетками-хозяевами бактерий, грибов, дрожжей и млекопитающих хорошо известны в данной области (см. Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985).

[426] Для экспрессии рекомбинантного белка также преимущественно используют различные системы культивирования клеток млекопитающих или насекомых. Экспрессию рекомбинантных белков можно выполнять в клетках млекопитающих, потому что такие белки, как правило, правильно свернуты, соответствующим образом модифицированы и полностью функциональны. Примеры подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих включают в себя линии COS-7 клеток почек обезьян, описанные Gluzman (Cell 23: 175, 1981), и другие линии клеток, способные экспрессировать соответствующий вектор, включая, например, L-клетки, C127, 3T3, линии клеток яичника китайского хомячка (СНО), 293, HeLa и BHK. Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать нетранскрибированные элементы, такие как источник репликации, подходящий промотор и энхансер, связанный с экспрессируемым геном, и другие 5 'или 3' фланкирующие нетранскрибированные последовательности и 5 'или 3' нетранслируемые последовательности, такие как необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга и последовательности терминации транскрипции. Бакуловирусные системы для получения гетерологичных белков в клетках насекомых рассмотрены Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

[427] Белки, продуцируемые трансформированным хозяином, можно очищать любым подходящим способом. Такие стандартные методы включают хроматографию (например, ионообменную, аффинную и калибровочную хроматографию на колонках и т.п.), центрифугирование, дифференциальную растворимость или любую другую стандартную методику очистки белка. Аффинные метки, такие как гексагистидин, мальтозосвязывающий домен, последовательность оболочки вируса гриппа, глутатион-S-трансфераза и тому подобное, могут быть присоединены к белку для обеспечения легкой очистки путем пропускания через соответствующую аффинную колонку. Выделенные белки также могут быть физически охарактеризованы с использованием таких методов, как протеолиз, ядерный магнитный резонанс и рентгеновская кристаллография. Например, супернатанты из систем, которые секретируют рекомбинантный белок в культуральную среду, могут быть сначала сконцентрированы с использованием коммерчески доступного фильтра концентрации белка, например, ультрафильтрационной установки Amicon или Millipore Pellicon. После стадии концентрирования концентрат может быть нанесен на подходящую матрицу очистки. Альтернативно, можно использовать анионообменную смолу, например, матрицу или субстрат, имеющий боковые диэтиламиноэтильные (DEAE) группы. Матрицы могут быть акриламидом, агарозой, декстраном, целлюлозой или другими типами, обычно используемыми при очистке белка. В качестве альтернативы можно использовать стадию катионного обмена. Подходящие катионообменники содержат различные нерастворимые матрицы, содержащие сульфопропильные или карбоксиметильные группы. Наконец, для дополнительной очистки белка-Fc раковых стволовых клеток можно использовать одну или более стадий высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC), использующих гидрофобную среду RP-HPLC, например силикагель, имеющий боковые метильные или другие алифатические группы. Сочинение. Некоторые или все вышеупомянутые стадии очистки в различных комбинациях также можно использовать для получения гомогенного рекомбинантного белка.

[428] Рекомбинантный белок, продуцируемый в бактериальной культуре, может быть выделен, например, путем первоначальной экстракции из клеточных гранул с последующей одной или более стадиями концентрирования, высаливания, водного ионного обмена или эксклюзионной хроматографии. Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) может быть использована для конечных стадий очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессии рекомбинантного белка, могут быть разрушены любым удобным способом, включая циклы замораживания-оттаивания, обработку ультразвуком, механическое разрушение или использование средств, лизирующих клетки.

Синтез Пептидов/Полипептидов In Vivo

[429] В настоящем раскрытии также предусмотрено использование молекул нуклеиновых кислот в качестве носителей для доставки антигенных пептидов/полипептидов нуждающемуся в этом субъекту in vivo, в форме, например, ДНК/РНК-вакцин (см., например, WO2012/159643 и WO2012/159754, полностью включенных в настоящее описание в качестве ссылки).

[430] В некоторых вариантах осуществления антигены можно вводить нуждающемуся в этом пациенту с использованием плазмиды. Это плазмиды, которые обычно состоят из сильного вирусного промотора, чтобы управлять in vivo транскрипцией и трансляцией интересующего гена (или комплементарной ДНК) (Mor, et al., (1995). The Journal of Immunology 155 (4): 2039-2046). Для улучшения стабильности мРНК и, следовательно, для увеличения экспрессии белка иногда можно включить интрон А (Leitner, et al. (1997). The Journal of Immunology 159 (12): 6112-6119). Плазмиды также включают сильный сигнал терминации полиаденилирования/транскрипции, такой как бычий гормон роста или последовательности полиаденилирования бета-глобулина кролика (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Robinson et al. , (2000) Adv. Virus Res. Advances in Virus Research 55: 1-74; Böhmet al., (1996). Journal of Immunological Methods 193 (1): 29-40.). Для экспрессии более одного иммуногена или для экспрессии иммуногена и иммуностимулирующего белка иногда конструируют мультицистронные векторы (Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).

[431] Плазмиды можно вводить в ткани животных различными способами. Двумя наиболее популярными подходами являются инъекция ДНК в физиологическом растворе с использованием стандартной иглы для подкожных инъекций и доставка с помощью генной пушки. Схематическое описание конструкции плазмиды ДНК-вакцины и ее последующей доставки этими двумя способами хозяину проиллюстрировано в Scientific American (Weiner et al., (1999) Scientific American 281 (1): 34-41). Инъекцию в физиологическом растворе обычно проводят внутримышечно (IM) в скелетных мышцах или внутрикожно (ID), с доставкой ДНК во внеклеточные пространства. Этому может помочь электропорация путем временного повреждения мышечных волокон миотоксинами, такими как бупивакаин; или с помощью гипертонических растворов физиологического раствора или сахарозы (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410). На иммунные реакции при этом методе доставки могут влиять многие факторы, включая тип иглы, выравнивание иглы, скорость инъекции, объем инъекции, тип мышцы и возраст, пол и физиологическое состояние инъецируемого животного (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410).

[432] Доставка с помощью генной пушки, другой широко используемый метод доставки, баллистически ускоряет плазмидную ДНК (pDNA), которая адсорбируется на микрочастицах золота или вольфрама, в клетки-мишени, используя сжатый гелий в качестве ускорителя (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).

[433] Альтернативные способы доставки могут включать аэрозольную инстилляцию голой ДНК на поверхности слизистой оболочки, такой как слизистая оболочка носа и легких, (Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88) и местное введение пДНК в слизистую оболочку глаза и влагалища (Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88). Поверхностная доставка через слизистую оболочку также достигается с использованием препаратов катионных липосом-ДНК, биоразлагаемых микросфер, аттенуированных векторов Shigella или Listeria для перорального введения в слизистую оболочку кишечника и рекомбинантных аденовирусных векторов. ДНК или РНК также могут быть доставлены в клетки после легкого механического разрушения клеточной мембраны, делая клетки временно проницаемыми. Такое легкое механическое разрушение мембраны может быть достигнуто путем осторожного проталкивания клеток через маленькую апертуру (Ex vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells, Sharei et al, PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0118803 April 13, 2015).

[434] В некоторых вариантах осуществления специфическая для заболевания вакцина или иммуногенная композиция может содержать отдельные ДНК-плазмиды, кодирующие, например, один или более антигенных пептидов/полипептидов, как определено в соответствии с настоящим изобретением. Как обсуждается в настоящем документе, точный выбор экспрессирующих векторов может зависеть от пептида/полипептидов, которые должны быть экспрессированы, и находится в пределах компетенции рядового специалиста. Ожидаемая стойкость конструкций ДНК (например, в эписомальной, не реплицирующейся, неинтегрированной форме в мышечных клетках), как ожидается, обеспечит увеличенную продолжительность защиты.

[435] Один или более антигенных пептидов согласно настоящему изобретению можно кодировать и экспрессировать in vivo с использованием системы на основе вируса (например, аденовирусной системы, вектора аденоассоциированного вируса (AAV), поксвируса или лентивируса). В одном варианте осуществления вакцина против болезни или иммуногенная композиция для применения у нуждающегося в этом пациента-человека может содержать вектор на основе вируса, такого как, например, аденовирус (см., например, Baden et al. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 26 HIV-1 Env vaccine (IPCAVD 001). J Infect Dis.2013 Jan 15;207(2):240-7, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки). Плазмиды, которые можно использовать для доставки аденоассоциированных вирусов, аденовирусов и лентивирусов, были описаны ранее (см., например, патенты США №№ 6955808 и 6943019 и заявку на патент США № 20080254008, включенные в настоящее описание в качестве ссылки).

[436] Пептиды и полипептиды согласно изобретению также могут быть экспрессированы вектором, например молекулой нуклеиновой кислоты, как обсуждается в данном документе, например, РНК или ДНК плазмидой, вирусным вектором, таким как поксвирус, например, ортопоксвирус, авипоксвирус или аденовирус, AAV или лентивирус. Этот подход включает использование вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, которые кодируют пептид согласно настоящему изобретению. При введении остро или хронически инфицированному хозяину или неинфицированному хозяину вектор экспрессирует иммуногенный пептид и тем самым вызывает ответ CTL хозяина.

[437] Среди векторов, которые могут быть использованы в практике раскрытия, интеграция в геном клетки-хозяина возможна с помощью способов переноса гена ретровируса, что часто приводит к длительной экспрессии встроенного трансгена. В некоторых вариантах осуществления ретровирус представляет собой лентивирус. Кроме того, высокая эффективность трансдукции наблюдалась во многих различных типах клеток и тканей-мишеней. Тропизм ретровируса может быть изменен путем включения чужеродных белков оболочки, расширяя потенциальную целевую популяцию клеток-мишеней. Ретровирус также может быть сконструирован для обеспечения условной экспрессии вставленного трансгена, так что лентивирус заражает только определенные типы клеток. Специфичные для типа клеток промоторы могут быть использованы для нацеливания экспрессии в конкретных типах клеток. Лентивирусные векторы являются ретровирусными векторами (и, следовательно, как лентивирусные, так и ретровирусные векторы могут использоваться в практике раскрытия). Кроме того, лентивирусные векторы способны трансдуцировать или инфицировать неделящиеся клетки и обычно продуцируют высокие вирусные титры. Поэтому выбор ретровирусной системы переноса генов может зависеть от ткани-мишени. Ретровирусные векторы состоят из длинных концевых повторов цис-действия с упаковочной способностью до 6-10 т.п.н. чужеродной последовательности. Минимальные цис-действующие LTR достаточны для репликации и упаковки векторов, которые затем используют для интеграции нужной нуклеиновой кислоты в клетку-мишень для обеспечения постоянной экспрессии. Широко используемые ретровирусные векторы, которые можно использовать в практике раскрытия, включают векторы, которые основаны на вирусе мышиного лейкоза (MuLV), вирусе лейкемии гиббонов (GaLV), вирусе иммунодефицита обезъян (SIV), вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ) и их комбинациях (см., например, Buchscher et al., (1992) J. Virol. 66: 2731-2739; Johann et al., (1992) J. Virol. 66: 1635-1640; Sommnerfelt et al., (1990) Virol. .176: 58-59; Wilson et al., (1998) J. Virol.63: 2374-2378; Miller et al. (1991) J. Virol.65: 2220-2224; PCT/US94/05700).

[438] Также полезным в практике раскрытия изобретения является минимальный неприматный лентивирусный вектор, такой как лентивирусный вектор на основе вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV) (см., например, Balagaan, (2006) J Gene Med; 8: 275-285, опубликовано в сети 21 ноября 2005 г. В Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Векторы могут иметь цитомегаловирусный (CMV) промотор, управляющий экспрессией гена-мишени. Соответственно, данное раскрытие относится к вектору (векторам), полезным для практики раскрытия: вирусным векторам, включая ретровирусные векторы и лентивирусные векторы.

[439] Лентивирусные векторы были описаны в качестве лечения болезни Паркинсона, см., например, патентные публикации США № 20120295960 и патенты США №№ 7303910 и 7351585. Лентивирусные векторы также были раскрыты для доставки в головной мозг, см., например, Патентные публикации США №№ US20110293571; US20040013648, US20070025970, US20090111106 и патент США № US7259015. В другом варианте осуществления лентивирусные векторы используют для доставки векторов в головной мозг тех, кого лечат от заболевания. Что касается лентивирусных векторных систем, полезных в практике раскрытия, упоминаются патенты США №№ 6428953, 6165782, 6013516, 5994136, 6312682 и 7198784 и цитируемые в них документы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения доставка осуществляется через лентивирус. Zou et al. С помощью интратекального катетера вводили около 10 мкл рекомбинантного лентивируса, имеющего титр 1×109 трансдуцирующих единиц, (TU)/мл. Эти виды дозировок могут быть адаптированы или экстраполированы для использования ретровирусного или лентивирусного вектора в настоящем раскрытии. Для трансдукции в таких тканях, как головной мозг, необходимо использовать очень небольшие объемы, поэтому вирусный препарат концентрируют с помощью ультрацентрифугирования. Можно использовать другие способы концентрирования, такие как ультрафильтрация или связывание и элюция из матрицы. В других вариантах осуществления количество вводимого лентивируса может составлять 1×105 или около 1×105 бляшкообразующих единиц, (PFU), 5×105 или около 5×105 PFU, 1×106 или около 1×106 PFU, 5×106 или около 5×106 PFU, 1×107 или около 1×107 PFU, 5×107 или около 5×107 или около 5×107 или около 5×107 PFU, 1×108 или около 1×108 PFU, 5×108 или около 5×108 PFU, 1×109 или около 1×109 PFU, 5×109 или около 5×109 PFU, 1×1010 или около 1×1010 PFU или 5×1010 или около 5×1010 PFU в качестве единой общей дозы на среднего человека весом 75 кг, или его можно откорректировать по массе и размеру и видам субъекта. Специалист в данной области может определить подходящую дозировку. Подходящие дозы для вируса можно определить опытным путем.

[440] Также полезным в практике раскрытия является аденовирусный вектор. Одним из преимуществ является способность рекомбинантных аденовирусов эффективно переносить и экспрессировать рекомбинантные гены в различных клетках и тканях млекопитающих in vitro и in vivo, что приводит к высокой экспрессии переносимых нуклеиновых кислот. Кроме того, способность продуктивно заражать покоящиеся клетки расширяет возможности использования рекомбинантных аденовирусных векторов. Кроме того, высокие уровни экспрессии гарантируют, что продукты нуклеиновых кислот будут экспрессироваться до уровней, достаточных для генерирования иммунного ответа (см., например, патент США № 7029848, включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Что касается аденовирусных векторов, полезных в практике раскрытия, следует упомянуть патент США № 6955808. Используемый вектор аденовируса может быть выбран из группы, состоящей из векторов Ad5, Ad35, Ad11, C6 и C7. Была опубликована последовательность генома аденовируса 5 ("Ad5"). (Chroboczek, J., Bieber, F. И Jacrot, B. (1992). The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2, Virology 186, 280-285; содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки). Векторы Ad35 описаны в патентах США №№ 6974695, 6913922 и 6869794. Векторы Ad11 описаны в патенте США № 6913922. Векторы аденовируса C6 описаны в патентах США №№ 6780407; 6537594; 6309647; 6265189; 6156567; 6090393; 5942235 и 5833975. Векторы C7 описаны в патенте США № 6277558. Также можно использовать аденовирусные векторы с дефектной или удаленной E1, с дефектной или удаленной E3 или с дефектной или удаленной E4. Некоторые аденовирусы, имеющие мутации в области E1, имеют улучшенный запас безопасности, поскольку мутанты аденовируса с дефектом E1 дефектны по репликации в непермиссивных клетках или по крайней мере сильно ослаблены. Аденовирусы, имеющие мутации в области E3, могут иметь усиленную иммуногенность, нарушая механизм, посредством которого аденовирус подавляет молекулы МНС I класса. Аденовирусы, имеющие мутации E4, могут иметь пониженную иммуногенность аденовирусного вектора из-за подавления поздней экспрессии генов. Такие векторы могут быть особенно полезны, когда нужна повторная вакцинация с использованием того же самого вектора. Аденовирусные векторы с удаленной или мутантной Е1, Е3, Е4, Е1 и Е3, а также Е1 и Е4, можно использовать в соответствии с настоящим раскрытием. Кроме того, в соответствии с настоящим раскрытием также можно использовать «выпотрошенные» аденовирусные векторы, в которых удалены все вирусные гены. Такие векторы нуждаются в вирусе-помощнике для репликации и требуют специальной клеточной линии 293 человека, экспрессирующей как E1a, так и Cre, - условие, которое не существует в естественной среде. Такие «выпотрошенные» векторы являются неиммуногенными, и, следовательно, векторы могут быть инокулированы несколько раз для повторной вакцинации. «Выпотрошенные» аденовирусные векторы можно использовать для введения гетерологичных вставок/генов, таких как трансгены согласно настоящему изобретению, и можно использовать даже для совместной доставки большого количества гетерологичных вставок/генов. В некоторых вариантах осуществления доставка осуществляется через аденовирус, который может быть в однократной бустерной дозе. В некоторых вариантах осуществления аденовирус доставляют в виде многократных доз. С точки зрения доставки in vivo, AAV имеет преимущество перед другими вирусными векторами из-за низкой токсичности и низкой вероятности вызова инсерционного мутагенеза, потому что он не интегрируется в геном хозяина. AAV имеет ограничение по упаковке 4,5 или 4,75 КБ. Конструкции размером более 4,5 или 4,75 КБ приводят к значительному снижению выработки вируса. Существует много промоторов, которые можно использовать для управления экспрессией молекул нуклеиновых кислот. AAV ITR может служить в качестве промотора и является предпочтительным для устранения необходимости в дополнительном элементе промотора. Для повсеместной экспрессии можно использовать следующие промоторы: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, тяжелые или легкие ферритиновые цепи и т. д. Для экспрессии в головном мозге можно использовать следующие промоторы: SynapsinI для всех нейронов, CaMKIIalpha для возбуждающих нейронов, GAD67 или GAD65 или VGAT для ГАМК-эргических нейронов и т. д. Промоторы, используемые для управления синтезом РНК, могут включать: промоторы Pol III, такие как U6 или H1. Использование промотора Pol II и интронных кассет можно задействовать для экспрессии направляющей РНК (gRNA). Что касается векторов AAV, полезных в практике раскрытия, следует упомянуть патенты США №№ 5658785, 7115391, 7172893, 6953690, 6936466, 6924128, 6893865, 6793926, 6537540, 6475769 и 6258595 и цитируемые в них документы. Что касается AAV, AAV может быть AAV1, AAV2, AAV5 или любой их комбинацией. Можно выбрать AAV в отношении целевых клеток; например, для нацеливания на клетки головного мозга или нейроны можно выбрать серотипы AAV 1, 2, 5 или гибридный капсид AAV1, AAV2, AAV5 или любую их комбинацию; а для нацеливания на ткань сердца можно выбрать AAV4. AAV8 полезен для доставки в печень. В некоторых вариантах осуществления доставку осуществляют через AAV. Дозировку можно скорректировать, чтобы сбалансировать терапевтическую пользу против побочных эффектов.

[441] В некоторых вариантах осуществления эффективной активации клеточного иммунного ответа для вакцины против болезни или иммуногенной композиции можно достичь путем экспрессии соответствующих антигенов в вакцине или иммуногенной композиции в непатогенном микроорганизме. Хорошо известными примерами таких микроорганизмов являются Mycobacterium bovis BCG, Salmonella и Pseudomona (см. Патент США № 6991797, полностью включенный в настоящее описание в качестве ссылки).

[442] В некоторых вариантах осуществления вирус оспы используется в вакцине против болезни или иммуногенной композиции. К нему относятся ортопоксвирус, авипоксвирус, осповакцина, MVA, NYVAC, канарипокс, ALVAC, оспа канареек, TROVAC и т. д. (см., например, Verardi et al., Hum Vaccin Immunother. 2012 Jul; 8 (7): 961-70; и Moss, Vaccine. 2013; 31 (39): 4220-4222). Поксвирусные векторы экспрессии были описаны в 1982 году и быстро стали широко использоваться для разработки вакцин, а также для исследований во многих областях. Преимущества векторов включают простую конструкцию, возможность размещения большого количества чужеродной ДНК и высокий уровень экспрессии. Информацию, касающуюся поксвирусов, которых можно использовать в практике раскрытия, таких как поксвирусы подсемейства Chordopoxvirinae (поксвирусы позвоночных), например, ортопоксвирусы и авипоксвирусы, например, вирус коровьей оспы (например, штамм Wyeth, штамм WR (например, ATCC® VR-1354), штамм Copenhagen, NYVAC, NYVAC.1, NYVAC.2, MVA, MVA-BN), вирус оспы канареек (например, штамм Wheatley C93, ALVAC), вирус оспы птиц (например, штамм FP9, штамм Webster, TROVAC), оспы горлиц, оспы голубей, оспы перепелов и оспы енотов, среди прочего, их синтетические или не существующие в природе рекомбинанты, их применение и способы получения и использования таких рекомбинантов можно найти в научной и патентной литературе.

[443] В некоторых вариантах осуществления в вакцине против болезни или иммуногенной композиции для экспрессии антигена используют вирус коровьей оспы. (Rolph et al., Recombinant viruses as vaccines and immunological tools. Curr Opin Immunol 9:517-524, 1997). Рекомбинантный вирус коровьей оспы способен реплицироваться в цитоплазме инфицированной клетки-хозяина, и поэтому представляющий интерес полипептид может индуцировать иммунный ответ. Кроме того, поксвирусы широко используются в качестве векторов вакцин или иммуногенных композиций из-за их способности нацеливаться на закодированные антигены для процессирования пути главного комплекса гистосовместимости I класса путем непосредственного заражения иммунных клеток, в частности антигенпрезентирующих клеток, но также и благодаря их способности иметь адъювантные свойства.

[444] В некоторых вариантах осуществления ALVAC используется в качестве вектора в вакцине против болезни или иммуногенной композиции. ALVAC - это вирус оспы канареек, который можно модифицировать для экспрессии чужеродных трансгенов, и он использовался в качестве метода вакцинации против прокариотических и эукариотических антигенов (Horig H, Lee DS, Conkright W, et al. Phase I clinical trial of a recombinant canarypoxvirus (ALVAC) vaccine expressing human carcinoembryonic antigen and the B7.1 co-stimulatory molecule. Cancer Immunol Immunother 2000;49:504-14; von Mehren M, Arlen P, Tsang KY, et al. Пилотное исследование рекомбинантной авипоксиновой вакцины с двумя генами, содержащей как карциноэмбриональный антиген (CEA), так и трансгены B7.1 у пациентов с рецидивирующими CEA-экспрессирующими аденокарциномами. Clin Cancer Res 2000;6:2219-28; Musey L, Ding Y, Elizaga M, et al. Вакцинация против ВИЧ-1, вводимая внутримышечно, может индуцировать как системный, так и мукозный Т-клеточный иммунитет у людей, не инфицированных ВИЧ-1. J Immunol 2003;171:1094-101; Paoletti E. Applications of pox virus vectors to vaccination: an update. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93:11349-53; патент США № 7255862). В I фазе клинического испытания вирус ALVAC, экспрессирующий опухолевый антиген CEA, продемонстрировал превосходный профиль безопасности и привел к увеличению CEA-специфических Т-клеточных ответов у выбранных пациентов; объективные клинические ответы, однако, не наблюдались (Marshall JL, Hawkins MJ, Tsang KY, et al. Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen. J Clin Oncol 1999; 17:332-7).

[445] В некоторых вариантах осуществления модифицированный вирус Vaccinia Ankara (MVA) можно использовать в качестве вирусного вектора для антигенной вакцины или иммуногенной композиции. MVA является членом семейства ортопоксвирусов, и было получено около 570 серийных пассажей на фибробластах куриных эмбрионов штамма Ankara вируса осповакцины (CVA) (для обзора см. Mayr, A., et al., Infection 3, 6-14, 1975). В результате этих пассажей полученный MVA-вирус содержит на 31 килобазу меньше геномной информации по сравнению с CVA и сильно рестриктирован клетками-хозяевами (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991). MVA отличается чрезвычайным ослаблением, а именно сниженной вирулентностью или инфекционной способностью, но все же обладает превосходной иммуногенностью. При тестировании в различных моделях животных было доказано, что MVA является авирулентным, даже у лиц с подавленной иммунной системой. Кроме того, MVA-BN®-HER2 является потенциальной иммунотерапией, разработанной для лечения HER-2-позитивного рака молочной железы, и в настоящее время проходит клинические испытания. (Mandl et al., Cancer Immunol Immunother. Jan 2012; 61(1): 19-29). Описаны способы получения и использования рекомбинантного MVA (например, см. Патенты США №№ 8309098 и 5185146, полностью включенные в настоящий документ).

[446] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные вирусные частицы вакцинной или иммуногенной композиции вводят нуждающимся в этом пациентам.

[447] В настоящем документе представлен способ разработки терапевтического средства для субъекта с заболеванием или состоянием, включающий предоставление популяции клеток, полученных у субъекта с заболеванием или состоянием, экспрессию в одной или более клетках популяции клеток аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса путем введения в одну или более клеток полинуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, содержащую: последовательность, кодирующую аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды в одной или более клетках; обогащение и получение характеристик комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и, необязательно разработку терапевтического средства на основе полученной характеристики.

[448] В настоящем документе представлен способ идентификации по меньшей мере одного специфического для субъекта иммуногенного антигена и получение специфической для субъекта иммуногенной композиции, которая содержит по меньшей мере один специфичный для субъекта иммуногенный антиген, причем субъект имеет заболевание, а по меньшей мере один специфичный для субъекта иммуногенный антиген является специфическим для субъекта и заболевания субъекта, причем указанный способ включает: предоставление популяции клеток, полученных у субъекта с заболеванием или состоянием, экспрессию в одной или более клетках популяции клеток у субъекта аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса путем введения в одну или более клеток полинуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, содержащую: последовательность, кодирующую аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды в одной или более клетках; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды из одной или более клеток; идентификацию иммуногенного пептида из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, который является специфическим для субъекта и заболевания субъекта; и составление специфической для субъекта иммуногенной композиции на основании одного или более специфичных для субъекта иммуногенных идентифицированных пептидов.

[449] В некоторых вариантах осуществления терапевтическая или специфическая для субъекта иммуногенная композиция содержит пептид из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды или полинуклеотид, кодирующий полипептид из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды.

[450] В некоторых вариантах осуществления терапевтическая или специфическая для субъекта иммуногенная композиция содержит T-клетку, экспрессирующую T-клеточный рецептор (TCR), который специфически связывается с полипептидом из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления специфическая для субъекта иммуногенная композиция содержит химерный рецептор антигена (CAR), T-клетку, экспрессирующую рецептор, который специфически связывается с полипептидом из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту еще одного терапевтического средства, необязательно, ингибитора иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту вспомогательного средства, необязательно, поли-ICLC.

[451] В некоторых вариантах осуществления заболеванием или расстройством является рак. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или расстройством является аутоиммунное заболевание. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или расстройством является заражение. В некоторых вариантах осуществления заражением является заражение возбудителем инфекции. В некоторых вариантах осуществления возбудителем инфекции является патогенный микроорганизм, вирус, бактерия или паразит. В некоторых вариантах осуществления вирус выбирают из группы, состоящей из: BK вируса (BKV), вирусов Денге (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), цитомегаловируса (CMV), вируса гепатита В (HBV), вируса гепатита С (HCV), вируса Эпштейна-Барра (EBV), аденовируса, вируса иммунодефицита человека (HIV), Т-клеточного лимфотрофического вируса человека (HTLV-1), вируса гриппа, RSV, HPV, бешенства, вируса паротита, краснухи, полиовируса, желтой лихорадки, гепатита A, гепатита B, ротавируса, вируса ветряной оспы, вируса папилломы человека (HPV), оспы, опоясывающего лишая и любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления бактерию выбирают из группы, состоящей из: видов Klebsiella, Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis и Mycobacterium tuberculosis, тифа, пневмококка, менингококка, haemophilus B, сибирской язвы, столбнячного токсина, менингококка группы B, bcg, холеры и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления паразитом является гельминт или простейшие. В некоторых вариантах осуществления паразитирующий организм выбирают из группы, состоящей из: видов Leishmania, видов Plasmodium, Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, видов Schistosoma и любой их комбинации.

[452] В настоящем документе представлен способ разработки терапевтического средства для субъекта с заболеванием или состоянием, включающий: предоставление популяции клеток, причем одна или более клеток популяции клеток содержат полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую по меньшей мере два аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, причем последовательность, кодирующая по меньшей мере два меченных аффинным акцептором HLA I класса или II класса, содержит первую рекомбинантную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую первый аллель HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей первый аффинный пептид-акцептор; и вторую рекомбинантную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую второй аллель HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор; экспрессию по меньшей мере двух меченных аффинным акцептором HLA по меньшей мере в одной клетке из одной или более клеток популяции клеток, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды по меньшей мере в одной клетке; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и идентификацию пептида из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и составление иммуногенной композиции на основе одного или более идентифицированных пептидов, причем аллели первого и второго рекомбинантного HLA I класса или II класса совпадают с гаплотипом HLA субъекта.

[453] В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание или состояние. В некоторых вариантах осуществления первый аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса отличается от аллеля второго рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления первый аффинный пептид-акцептор такой же, как второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик пептида, связанного с первым и/или вторым комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса включают в себя по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аллелей HLA I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат внутриклеточный домен. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды не экскретируют. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды при экспрессии встраивают в клеточную мембрану. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды представляют собой нерастворимые комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает создание базы данных специфических к аллелям HLA пептидов. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение одного или более экзогенных пептидов в популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одним или более экзогенными пептидами или экспрессию одного или более экзогенных пептидов в популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более экзогенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов, является ДНК. В некоторых вариантах осуществления одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов, является РНК, необязательно при этом РНК является мРНК. В некоторых вариантах осуществления обогащение не включает в себя использование тетрамерного реагента. В некоторых вариантах осуществления способ включает определение последовательности пептида или его части, связанной с первым и/или вторым комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя биохимический анализ, масс-спектрометрический анализ, MS анализ, MS/MS анализ, анализ LC-MS/MS или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления способ включает оценку аффинности связывания или стабильности пептида или его части, связанной с первым и/или вторым комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения.

[454] В некоторых вариантах осуществления способ включает определение, содержит ли пептид или его часть, связанная с первым и/или вторым комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения, одну или более мутаций. В некоторых вариантах осуществления способ включает оценку связей пептидов с молекулами HLA в первом и/или втором комплексе меченный аффинным акцептором HLA-пептид.

[455] В некоторых вариантах осуществления способ включает экспрессию библиотеки пептидов в популяции клеток, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение в контакт с популяцией клеток библиотеки пептидов или библиотеки последовательностей, кодирующих пептиды, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой библиотеку пептидов, связанных с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак или заражение возбудителем инфекции.

[456] В некоторых вариантах осуществления способ включает введение возбудителя инфекции или его частей в одну или более клеток популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одного или более пептидов из первого и/или второго комплексов HLA-пептиды, при этом необязательно, чтобы пептиды происходили из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одной или более областей пептидов из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции. В некоторых вариантах осуществления способ включает идентификацию пептидов из первого и/или второго комплексов HLA-пептиды, полученных из возбудителя инфекции.

[457] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток происходит из биологического образца у субъекта с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция первичных клеток.

[458] В некоторых вариантах осуществления пептид из первого и/или второго комплекса меченный аффинным акцептором HLA-пептид способен активировать T-клетку у субъекта при презентации антигенпрезентирующей клеткой. В некоторых вариантах осуществления способ включает сравнение комплексов HLA-пептиды из пораженных клеток с комплексами HLA-пептиды из непораженной клетки.

[459] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение пептидов из первого и/или второго комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды перед идентификацией.

[460] В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция клеток с низкой экспрессией HLA клеточной поверхности I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток экспрессирует один или более аллелей эндогенного HLA. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса и аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса.

[461] В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса и нокаут всех аллелей HLA II класса.

[462] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая по меньшей мере два аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, кодирует HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F и HLA-G. В некоторых вариантах осуществления первым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является первый аллель HLA I класса, а вторым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является второй аллель HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая по меньшей мере два аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, кодирует HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса выбирают из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса содержит α-цепь HLA II класса, β-цепь HLA II класса или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления первым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является первый аллель HLA II класса, а вторым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является второй аллель HLA II класса.

[463] В некоторых вариантах осуществления каждая из первой последовательности и второй последовательности функционально связаны. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность и вторая последовательность находятся в разных полинуклеотидных молекулах.

[464] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть первого и/или второго аллеля HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй кодируемый аффинный пептид-акцептор экспрессируется внеклеточно. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аффинный пептид-акцептор, функционально связана с N-концом последовательности, кодирующей первый и/или второй аллель HLA I класса или II класса.

[465] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внутриклеточную часть первого и/или второго аллеля HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления кодируемый первый и/или второй аффинный пептид-акцептор экспрессируется внутриклеточно. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аффинный пептид-акцептор, функционально связана с C-концом последовательности, кодирующей первый и/или второй аллель HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей первый и/или второй аллель HLA I класса или II класса, посредством линкера.

[466] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя обогащение интактных клеток, экспрессирующих первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ не включает лизирование клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает лизирование одной или более клеток перед обогащением.

[467] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт молекулы связывания аффинного пептида-акцептора с первым и/или вторым комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем молекула связывания аффинного пептида-акцептора специфически связывается с первым и/или вторым аффинным пептидом-акцептором. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй аффинный пептид-акцептор содержит последовательность метки, включающей в себя пептид-акцептор биотина (BAP), полигистидиновую метку, полигистидин-глициновую метку, полиаргининовую метку, полиаспартатную метку, полицистеиновую метку, полифенилаланин, метку c-myc, гликопротеиновую D (gD) метку вируса простого герпеса, метку FLAG, эпитопную метку KT3, тубулиновую эпитопную метку, пептидную метку белка 10 гена Т7, стрептавидиновую метку, метку стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метку, Strep-метку II, метку альбумин-связывающего белка (ABP), метку щелочной фосфатазы (AP), метку вируса катаральной лихорадки (B-метку), метку кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метку хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метку холин-связывающего домена (CBD), метку хитин-связывающего домена (CBD), метку целлюлозосвязывающего домена (CBP), метку дигидрофолатредуктазы (DHFR), метку галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансферазу (GST), метку Glu-Glu (EE), метку гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метку пероксидазы хрена (HA), NE-метку, метку HSV, метку кетостероид-изомеразы (KSI), метку KT3, метку LacZ, люциферазную метку, метку NusA, метку домена PDZ, AviTag, кальмодулиновую метку, E-метку, S-метку, SBP-метку, Softag 1, Softag 3, метку TC, VSV-метку, метку Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метку Profinity eXact, метку протеина C, S1-метку, S-метку, метку белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метку зеленого флуоресцентного белка (GFP), метку малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метку тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метку, метку Thioredoxin, Fc-метку, метку CYD, метку HPC, метку TrpE, убиквитиновую метку, эпитопную метку VSV-G, метку V5 или их комбинацию; необязательно при этом первый и/или второй аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки. В некоторых вариантах осуществления молекулой связывания аффинного пептида-акцептора является биотин или антитело, специфическое к первому и/или второму аффинному пептиду-акцептору.

[468] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение аффинной молекулы в контакт с первым и/или вторым комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем аффинная молекула специфически связывается с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора. В некоторых вариантах осуществления аффинной молекулой является стрептавидин, NeutrAvidin или их производное. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию первого и/или второго комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления молекулу связывания аффинного пептида-акцептора присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления аффинную молекулу присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления твердой поверхностью является гранула.

[469] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию первого и/или второго комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора, которая специфически связывается с первым и/или вторым аффинным пептидом-акцептором. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора не имеет специфического взаимодействия с аминокислотной последовательностью кодируемого первого и/или второго HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к внеклеточной части первого и/или второго аллеля HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к N-концевой части первого и/или второго аллеля HLA I класса или II класса.

[470] В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с полинуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления введение в контакт включает в себя трансфекцию или трансдукцию. В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с вектором, содержащим полинуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления вектором является вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления полинуклеиновую кислоту стабильно встраивают в геном популяции клеток.

[471] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления первым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является α-цепь первого HLA I класса, а вторым аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является α-цепь второго HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β2 микроглобулин в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей первый и/или второй HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей первый и/или второй HLA I класса или II класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей третий аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления третий аффинный пептид-акцептор отличается от первого и/или второго аффинного пептида-акцептора.

[472] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA II класса и/или β-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь первого HLA II класса и α-цепь второго HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β-цепь HLA II класса, в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую α-цепь первого HLA II класса и α-цепь второго HLA II класса HLA, связывают с последовательностью, кодирующей β-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую β-цепь первого HLA II класса и β-цепь второго HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей α-цепь HLA II класса, в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь первого HLA II класса и β-цепь второго HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA II класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса или α-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей третий аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления третий аффинный пептид-акцептор отличается от первого и/или второго аффинного пептида-акцептора.

[473] В некоторых вариантах осуществления третий аффинный пептид-акцептор отличается от первого аффинного пептида-акцептора, и его выбирают из группы, состоящей из пептида-акцептора биотина (BAP), полигистидиновой метки, полигистидин-глициновой метки, полиаргининовой метки, полиаспартатной метки, полицистеиновой метки, полифенилаланина, метки c-myc, гликопротеиновой D (gD) метки вируса простого герпеса, метки FLAG, эпитопной метки KT3, тубулиновой эпитопной метки, пептидной метки белка 10 гена Т7, стрептавидиновой метки, метки стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метки, Strep-метки II, метки альбумин-связывающего белка (ABP), метки щелочной фосфатазы (AP), метки вируса катаральной лихорадки (B-метки), метки кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метки хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метки холин-связывающего домена (CBD), метки хитин-связывающего домена (CBD), метки целлюлозосвязывающего домена (CBP), метки дигидрофолатредуктазы (DHFR), метки галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающего белка (MBP), глутатион-S-трансферазы (GST), метки Glu-Glu (EE), метки гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метки пероксидазы хрена (HA), NE-метки, HSV метки, метки кетостероид-изомеразы (KSI), метки KT3, метки LacZ, люциферазной метки, метки NusA, метки домена PDZ, AviTag, кальмодулиновой метки, E-метки, S-метки, SBP-метки, Softag 1, Softag 3, метки TC, VSV-метки, метки Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метки Profinity eXact, метки протеина C, S1-метки, S-метки, метки белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метки зеленого флуоресцентного белка (GFP), метки малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метки тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метки, метки Thioredoxin, Fc-метки, метки CYD, метки HPC, метки TrpE, убиквитиновой метки, эпитопной метки VSV-G, метки V5 и их комбинаций; необязательно при этом первый или второй аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки.

[474] В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность полинуклеиновой кислоты, кодирующую расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой элемент-участок ухода с рибосомы или участок внутренней посадки рибосомы (IRES). В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы или IRES расщепляется при экспрессии в клетках. В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы выбирают из группы, состоящей из F2A, T2A, P2A и E2A. В некоторых вариантах осуществления элемент IRES выбирают из общих клеточных или вирусных последовательностей IRES.

[475] В некоторых вариантах осуществления способ включает проведение биохимического анализа или масс-спектрометрии, такой как тандемная масс-спектрометрия.

[476] В некоторых вариантах осуществления способ включает получение последовательности пептида, которая соответствует MS/MS спектрам одного или более пептидов, выделенных из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды из базы данных пептидов; при этом одна или более полученных последовательностей идентифицирует последовательность одного или более пептидов.

[477] В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия, выбранная из HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO и THP1.

[478] В некоторых вариантах осуществления клеточную линию обрабатывают одним или более цитокинами, ингибиторами контрольных точек, эпигенетически-активными лекарственными средствами, IFN-γ или их комбинацией.

[479] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя по меньшей мере 105 клеток, по меньшей мере 106 клеток или по меньшей мере 107 клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция дендритных клеток, макрофагов, раковых клеток или B-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя опухолевые клетки.

[480] В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток вводят в контакт со средством перед выделением первого и/или второго комплексов HLA-пептиды из одной или более клеток. В некоторых вариантах осуществления средством является воспалительный цитокин, химическое средство, вспомогательное средство, терапевтическое средство или радиация.

[481] В некоторых вариантах осуществления первым и/или вторым аллелем HLA является мутантный аллель HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая первый и/или второй аллель HLA, содержит штрихкодированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии первого и/или второго аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления анализ включает в себя секвенирование первого и/или второго аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, обнаружение РНК, кодирующей РНК первого и/или второго аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, обнаружение белка первого и/или второго аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления первый и второй аллель меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса содержит уникальную штрихкодированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность и вторая последовательность содержат уникальную штрихкодированную последовательность.

ПРИМЕРЫ

[482] Предоставленные ниже примеры предназначены только для иллюстративных целей, а не для ограничения объема предоставленной в настоящем документе формулы изобретения.

ПРИМЕР 1. Конвейер для универсальной IP: Платформа для Универсальной Идентификации Одноаллельных Комплексов HLA-пептид

[483] Конструкции для универсальной иммуноаффинной очистки (IP), раскрытые в данном документе, состоят из конструкции ДНК, кодирующей аффинные меченные аллели HLA I класса или I I класса, которые экспрессируются из вектора экспрессии млекопитающих посредством клеточной трансфекции или трансдукции (фиг. 1A и ФИГ. 1B). Неограничивающие иллюстративные конструкции HLA I класса и II класса показаны на фиг. 2. Неограничивающие иллюстративные аффинные метки содержат последовательность пептида-акцептора биотина (BAP) или пептида гемагглютинина вируса гриппа (HA). Аффинные метки можно помещать либо на N-конце, либо на C-конце аллеля HLA. Последовательность расщепления, такую как F2A, показанную на фиг. 2, или участок внутренней посадки рибосомы (IRES) можно помещать между α-цепью и β2-микроглобулином (I класса) или между α-цепью и β-цепью (II класса). Неограничивающие иллюстративный векторы содержат лентивирусный вектор, как показано на фиг. 3. Гены устойчивости к антителам, например, устойчивости к пуромицину (Puro), включены в конструкции для обеспечения возможности отбора после трансфекции или трансдукции. Клетки, трансфицированные или трансдуцированные конструкциями универсальной IP, либо размножают (фиг. 4A), либо отбирают, а затем размножают (фиг. 4B) до анализа LC-MS/MS. Схемы платформы для универсальной иммуноочистки HLA класса I и класса показаны на фиг. 5.

ПРИМЕР 2. Клеточная культура и Иммуноаффинная очистка и Секвенирование HLA-Пептида

[484] Моноаллельные клетки HLA получали путем трансдукции клеток B721.221, A375, JEG-3, K562, Jurkat или HEK293T, HeLa или expi293 ретровирусным вектором, кодирующим один аллель HLA I класса (например, HLA-A*02:01, HLA-A*23:01 и HLA-B*14:02 или HLA-E*01:01) или аллель HLA II класса (например, HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 и HLA-DRB*11:01, или HLA-DRB*15:01 или HLA-DRB*07:01), как описано ранее (Reche et al., 2006). Типы HLA I или II класса клеточных линий подтверждали с помощью стандартного молекулярного типирования. Клетки культивировали и проводили иммуноаффинную очистку HLA-пептида.

[485] Подтверждение концепции трансдукции аллелей HLA I класса (фиг. 6C) в клетки HEK293T показано на фиг. 6A-6C. Провели имитирующие, GFP и пустые плазмидные трансдукции с использованием конструкций HLA-A*02:01 для универсальной иммуноочистки на основе биотинилирования, и биотинилирование подтвердили с помощью вестерн-блоттинга (фиг.6А). В качестве контроля загрузки для вестерн-блоттинга использовали Понсо окрашенный гель (фиг.6B). Оптимизация трансфекции и биотинилирования аллелей HLA-BAP I класса и II класса (фиг. 7C), экспрессируемых клетками HEK293T, показана на фиг. 7А-7С. Эксперимент биотинилирования с течением времени показал, что биотинилирование HLA-BAP, меченного на С- и N-концах, было завершено через 10 минут для клеток, экспрессирующих HLA-BAP I класса и II класса (фиг. 7A и фиг. 7B).

[486] Раскрытый в настоящем документе конвейер универсальной IP тестировали в нескольких типах ячеек (фиг. 8A-8D). Конструкции универсальной IP для HLA I класса и II класса трансфицировали в HEK293T (эмбриональная почка человека) (фигура 8A), HeLa (рак шейки матки человека) (фигура 8B), A375 (злокачественная меланома человека) (фигура 8C) и клетки Expi293 (первичная почка человека, генетически сконструированная для культивирования высокой плотности и экспрессии белка) (фиг.8D). Вестерн-блоттинг проводили с использованием анти-стрептавидина для метки BAP и анти-HA для метки HA, а в качестве контроля загрузки для вестерн-блоттинга использовали Понсо окрашенный гель. Вестерн-блоттинг подтвердил экспрессию конструкций I класса и II класса во всех протестированных типах клеток (фиг.8A-8D).

[487] Далее описаны материалы и способы, используемые в этом Примере.

Универсальная IP аллелей HLA I класса и II класса (Биотин)

[488] Клетки трансфицировали или трансдуцировали для экспрессии конструкций универсальной IP, следуя стандартным методам. После трансдукции клетки ресуспендировали в среде и переносили в 50 мл пробирки falcon. Пробирки вращали при 1500 об/мин в течение 5 минут, и среду удаляли. Затем клетки ресуспендировали в 1,5 мл холодного PBS и переносили в 1,5 мл пробирку Эппендорфа. Затем пробирки центрифугировали (550×g при 4°C) в течение 5 минут. PBS удаляли, а клетки затем ресуспендировали в 1,2 мл лизисного буфера. Клетки ресуспендировали в буфере с последующим добавлением бензоназы. Пробирки инкубировали на льду с периодическим перемешиванием. После 15 минут инкубации на льду пробирки центрифугировали (15000×g при 4°C) в течение 20 минут. Супернатанты (500 мкл) переносили в другую пробирку объемом 1,5 мл (предварительно промытую) для биотинилирования. Биотинилирование клеточных лизатов получали путем добавления в каждый образец биотина, АТФ и BirA. Затем образец инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и затем помещали на лед до иммунопреципитации.

[489] Иммунопреципитацию с гранулами NeutrAvidin или стрептавидина проводили путем добавления предварительно промытой суспензии стрептавидина или агарозной смолы NeutrAvidin к биотинилированному лизату. Образец затем помещали в пробирку и инкубировали в течение 30 минут при 4°С. После 30-минутной инкубации гранулы осаждали центрифугированием (1500×g, 1 мин, 4°C), и супернатант удаляли и выбрасывали. Затем гранулы ресуспендировали в 1 мл промывочного буфера. Затем гранулы осаждали центрифугированием (1500×g, 1 мин, 4°C), а промывочный буфер удаляли и выбрасывали. Этот этап повторяли, чтобы получить всего четыре промывки в промывочном буфере. Осажденные гранулы ресуспендировали в 1 мл Трис-буфера, осаждали центрифугированием (1500×g, 1 мин, 4°C), а Трис-буфер удаляли. Этот шаг повторяли, чтобы получить в общей сложности четыре промывки в трис-буфере. Заключительную промывку проводили в воде класса MS путем ресуспендирования гранул в 1 мл воды класса Mass Spec и центрифугирования (1500×g, 1 мин, 4°C) для осаждения гранул. Супернатант удаляли, а шарики либо хранили при -80°С, либо сразу подвергали элюции и обессоливанию HLA-пептидов.

Серийная Универсальная IP Аллелей HLA II класса (меченного HA и Биотином)

[490] Клетки трансфицировали или трансдуцировали для экспрессии конструкций универсальной IP в соответствии со стандартными протоколами. После трансдукции клетки ресуспендировали в среде и переносили в 50 мл пробирки falcon. Пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут, а среду удаляли. Затем клетки ресуспендировали в 1,5 мл холодного PBS и переносили в 1,5 мл пробирку Эппендорфа. Затем пробирки центрифугировали (550×g при 4°C) в течение 5 минут. PBS удаляли, а клетки затем ресуспендировали в 1,2 мл лизисного буфера. Клетки ресуспендировали в буфере с последующим добавлением бензоназы. Пробирки инкубировали на льду с периодическим перемешиванием. После 15 минут инкубации на льду пробирки центрифугировали (15000×g при 4°C) в течение 20 минут. Супернатанты переносили в другую 1,5 мл пробирку (предварительно промытую) для биотинилирования. Биотинилирования клеточных лизатов достигали путем добавления в каждый образец биотина, АТФ и BirA. Затем образец инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем помещали на лед до иммунопреципитации.

[491] Иммунопреципитацию меченых HA аллелей II класса осуществляли путем добавления предварительно промытой агарозной смолы белка G, которая была предварительно связана с антителом против HA. Затем образец инкубировали в течение 60 минут при 4°C на вертушке для пробирок. После 60-минутной инкубации гранулы осаждали с помощью центрифугирования (1500×g, 1 мин, 4°C), и супернатант удаляли и выбрасывали. Гранулы промывали два раза буфером для лизиса и ресуспендировали в буфере для лизиса, содержащем свободный HA пептид, и инкубировали в течение 15 минут при 4°C в вертушке для пробирок. Затем гранулы осаждали с помощью центрифугирования (1500×g, 1 мин, 4°C), и супернатант переносили в 1,5 мл пробирку Эппендорфа, содержащую 200 мкл предварительно промытых агарозных гранул NeutrAvidin или стрептавидина. Образец затем помещали в пробирку и инкубировали в течение 30 минут при 4°C. После 30-минутной инкубации гранулы осаждали с помощью центрифугирования (1500×g, 1 мин, 4°C), и супернатант удаляли и выбрасывали. Затем гранулы ресуспендировали в 1 мл промывочного буфера. Затем гранулы осаждали с помощью центрифугирования (1500×g, 1 мин, 4°C), и промывочный буфер удаляли и выбрасывали. Этот этап повторяли, чтобы получить всего четыре промывки в промывочном буфере. Осажденные гранулы ресуспендировали в 1 мл трис-буфера, осаждали с помощью центрифугирования (1500×g, 1 мин, 4°C), и промывочный буфер удаляли. Этот шаг повторяли, чтобы получить в общей сложности четыре промывки в Трис-буфере. Заключительную промывку проводили в воде сорта MS путем ресуспендирования гранул в 1 мл воды сорта Mass Spec и центрифугирования (1500×g, 1 мин, 4°C) для осаждения гранул. Супернатант удаляли, и гранулы хранили либо при -80°C, либо немедленно подвергали элюции и обессоливанию HLA-пептидов.

Элюция и Обессоливание HLA-Пептидов

[492] Пептиды элюировали из комплексов HLA и обессоливали на встроенных в Empore C18 StageTips (3M, 2315) (Rappsilber et al., 2007). Загрузку, промывки и элюцию образцов выполняли на настольной центрифуге с максимальной скоростью 1500-3000 х g. StageTips уравновешивали двумя промывками метанола, двумя промывками ацетонитрила/муравьиной кислоты и двумя промывками муравьиной кислоты. В пробирке высушенные гранулы в результате IP HLA-ассоциированных пептидов оттаивали при 4°C, восстанавливали в смеси ACN/муравьиная кислота и загружали на StageTips. Гранулы промывали муравьиной кислотой, и пептиды дополнительно элюировали, используя два цикла 5-минутных инкубаций в 10% уксусной кислоте. Объединенные объемы промывки и элюции объединяли и загружали в StageTips. Пробирки, содержащие IP гранулы, снова промывали муравьиной кислотой, и этот объем также загружали в StageTips. Пептиды дважды промывали на StageTips или обессоливающих картриджах с муравьиной кислотой. Пептиды элюировали, используя ступенчатый градиент смесей ACN и муравьиной кислоты. Для завершения элюции стадии объединяли и высушивали.

ПРИМЕР 3. Секвенирование Пептидов, Связанных с HLA I класса и II класса посредством LC-MS/MS

[493] Во всех анализах нано-LC-ESI-MS/MS использовали одни и те же условия разделения ЖХ, которые описаны ниже. Образцы разделяли хроматографически с использованием Proxeon Easy Nano LC 1000 (Thermo Scientific, San Jose, CA), снабженного капилляром с внутренним диаметром PicoFrit 75 мкм с излучателем 10 мкм, и упаковывали под давлением до ~ 20 см с гранулами C18 Reprosil (размер частиц 1,9 мкм, размер пор 200 Å Dr. Maisch GmBH) и во время разделения нагревали до 50°C.

[494] Образцы загружали в CAN, и смесь муравьиной кислоты и пептиды элюировали с линейным градиентом 7-30% буфера B (0,1% FA или 0,5% AcOH и 80% или 90% ACN) в течение 82 минут, 30-90% буфера B в течение 6 минут, а затем выдерживали в 90% буфере B в течение 15 минут при 200 нЛ/мин (буфер A, 0,1% FA и 3% ACN), чтобы получить ширину пика ~ 13 (FA) секунд. Во время сбора в зависимости от данных элюированные пептиды вводили в масс-спектрометр Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Scientific), оснащенный источником наноэлектрораспыления при напряжении 2,2 кВ. Полное сканирование MS получали с разрешением 30000 от 300 до 1800 м/з. За каждым полным сканированием следовали 10 лучших сканирований MS2 в зависимости от данных с разрешением 15000 с шириной изоляции 0,7 м/z.

[495] На фиг. 9А показано Количество общих уникальных HLA-ассоциированных пептидов, идентифицированных из множества типов клеток, экспрессирующих аффинно-меченные конструкции HLA I класса и II класса, использованных в конвейере универсальной IP. На фиг. 9В показано количество уникальных пептидов в результате профилирования моноаллельных пептидов HLA I класса. На фиг. 9С показано количество уникальных пептидов в результате профилирования моноаллельных пептидов HLA II класса. Анализ LC-MS/MS HLA-ассоциированных пептидов выявил характеристики HLA-ассоциированных пептидов I класса и II класса (фиг. 10A и 10B). На фиг. 10A показаны представления лигатур последовательностей выделенных и секвенированных пептидов, ассоциированных с HLA-A*02:01 I класса, и пептидов, ассоциированных с HLA-DRβ*11:01 II класса. Сравнение распределения длин пептидов, ассоциированных с HLA-A*02:01 I класса (красный) и HLA-DRβ*11:01, ассоциированных с пептидами класса II (синий), показало, что HLA-ассоциированные пептиды I класса и II класса следовали ожидаемые тенденции (фиг. 10B).

[496] 70 аллелей HLA I класса и 47 аллелей HLA II класса оценили для моноаллельного подхода, который описан в настоящем документе. Было получено 70 уникальных аллелей HLA I класса с аффинными метками (табл. 1А) и 47 уникальных аллелей HLA II класса с аффинными метками (табл. 2А). В Таблице 1В показаны подробности 96 уникальных экспериментов с использованием 70 уникальных аллелей HLA I класса (в некоторых случаях один и тот же аллель помещали в несколько клеточных линий). В Таблице 2В показаны подробности 54 уникальных экспериментов, выполненных с использованием 47 уникальных аллелей HLA II класса (в некоторых случаях один и тот же аллель помещали в несколько клеточных линий).

Таблица 1A. 70 Уникальные аллели HLA I класса

# Уникальные Аллели I класса # Уникальные Аллели I класса
1 A*0201 36 B*3802
2 A*0202 37 B*3901
3 A*0203 38 B*3906
4 A*0206 39 B*4001
5 A*0207 40 B*4002
6 A*1101 41 B*4006
7 A*2301 42 B*4101
8 A*2501 43 B*4201
9 A*2601 44 B*4501
10 A*3001 45 B*4601
11 A*3002 46 B*4801
12 A*3101 47 B*4901
13 A*3201 48 B*5001
14 A*3301 49 B*5201
15 A*3303 50 B*5301
16 A*3402 51 B*5401
17 A*3601 52 B*5501
18 A*6801 53 B*5703
19 A*7401 54 B*5801
20 B*0702 55 B*5802
21 B*0801 56 B*8101
22 B*1302 57 C*0102
23 B*1401 58 C*0202
24 B*1402 59 C*0303
25 B*1501 60 C*0401
26 B*1502 61 C*0602
27 B*1503 62 C*0701
28 B*1509 63 C*0702
29 B*1510 64 C*0704
30 B*1801 65 C*1203
31 B*270502 66 C*1701
32 B*3502 67 C*1801
33 B*3503 68 F*0101
34 B*3701 69 G*0101
35 B*3801 70 E*0101

Таблица 1B. Библиотеки и Клеточные линии для аллелей HLA I класса

# Уникальные Эксперименты
# Волна библиотеки Аллель I класса Клеточная линия # Волна библиотеки Аллель I класса Клеточная линия
1 W1 A0201 Hek293 49 W2 B4101 expi293
2 W1 A0201 HeLa 50 W2 B4201 expi293
3 W1 A0201 A375 51 W2 B4501 expi293
4 W1 A0201 expi293 52 W2 B4601 expi293
5 W1 A1101 expi293 53 W2 B4801 expi293
6 W1 A1101 HeLa 54 W2 B4901 expi293
7 W1 A2301 Hek293 55 W2 B5001 expi293
8 W1 A2301 A375 56 W2 B5201 expi293
9 W1 A2301 expi293 57 W2 B5301 expi293
10 W1 A2601 A375 58 W2 B5501 expi293
11 W1 A2601 HeLa 59 W2 B5501 A375
12 W1 A2601 expi293 60 W2 B5703 expi293
13 W1 A3201 A375 61 W2 B5801 expi293
14 W1 A3201 HeLa 62 W2 B5801 A375
15 W1 A3201 expi293 63 W2 B5802 expi293
16 W1 A3601 expi293 64 W2 B8101 expi293
17 W1 B0702 expi293 65 W2 C0401 expi293
18 W1 B0702 HeLa 66 W2 C0401 A375
19 W1 B0801 expi293 67 W2 C0602 expi293
20 W1 B0801 HeLa 68 W2 C0602 A375
21 W1 B0801 A375 69 W2 C0701 expi293
22 W1 B1402 Hek293 70 W2 C0701 A375
23 W1 B1402 A375 71 W2 C0702 expi293
24 W1 B1402 expi293 72 W2 C0702 A375
25 W1 B1402 HeLa 73 W3 A3301 expi293
26 W1 B1501 expi293 74 W3 A0206 expi293
27 W1 B1509 HeLa 75 W3 A0202 expi293
28 W1 B1509 expi293 76 W3 A3402 expi293
29 W1 B1801 HeLa 77 W3 A0207 expi293
30 W1 B1801 expi293 78 W3 A0203 expi293
31 W1 B270502 HeLa 79 W3 B3502 expi293
32 W1 B270502 expi293 80 W3 B1401 expi293
33 W1 B4001 HeLa 81 W3 B3906 expi293
34 W1 B4001 expi293 82 W3 B1510 expi293
35 W2 A2501 expi293 83 W3 B4006 expi293
36 W2 A3001 expi293 84 W3 B1502 expi293
37 W2 A3002 expi293 85 W3 B3802 expi293
38 W2 A3101 expi293 86 W3 B5401 expi293
39 W2 A3303 expi293 87 W3 C0303 expi293
40 W2 A6801 expi293 88 W3 C0202 expi293
41 W2 A7401 expi293 89 W3 C1203 expi293
42 W2 B1302 expi293 90 W3 C0102 expi293
43 W2 B1503 expi293 91 W3 C1701 expi293
44 W2 B3503 expi293 92 W3 C0704 expi293
45 W2 B3701 expi293 93 W3 C1801 expi293
46 W2 B3801 expi293 94 W2 E0101 expi293
47 W2 B3901 expi293 95 W3 F0101 expi293
48 W2 B4002 expi293 96 W3 G0101 expi293

Таблица 2A. 47 Уникальные HLA Аллели II класса

# Уникальные Аллели II класса # Уникальные Аллели II класса
1 DPB1*0101 25 DRB1*0901
2 DPB1*0101 DPA*01:03 26 DRB1*1001
3 DPB1*0201 DPA*01:03 27 DRB1*1101
4 DPB1*0401 DPA*01:03 28 DRB1*1102
5 DPB1*0402 DPA*01:03 29 DRB1*1104
6 DQ2*B0201*A0501 30 DRB1*1201
7 DQ2*B0202*A0201 31 DRB1*1202
8 DQ6*B0602*A0102 32 DRB1*1301
9 DQ6*B1*0602 33 DRB1*1302
10 DRB1*0101 34 DRB1*1303
11 DRB1*0102 35 DRB1*1401
12 DRB1*0301 36 DRB1*1501
13 DRB1*0302 37 DRB1*1502
14 DRB1*0401 38 DRB1*1503
15 DRB1*0402 39 DRB1*1601
16 DRB1*0403 40 DRB3*0101
17 DRB1*0404 41 DRB3*0202
18 DRB1*0405 42 DRB3*0301
19 DRB1*0407 43 DRB4*0103
20 DRB1*0701 44 DRB5*0101
21 DRB1*0801 45 HLA DM no аффинной метка
22 DRB1*0802 46 HLA-DM с аффинной метка
23 DRB1*0803 47 HLA-DO
24 DRB1*0804

Таблица 2B. Библиотеки и Клеточные линии для HLA Аллели II класса

# Уникальные Эксперименты
# Волна библиотеки II класса Аллель Клеточная линия # Волна библиотеки II класса Аллель Клеточная линия
1 W1 DRB1_0101 Hek293 28 W2 DRB1_1303 expi293
2 W1 DRB1_0101 expi293 29 W2 DRB1_1401 expi293
3 W1 DRB1_0102 Hek293 30 W2 DRB1_1502 expi293
4 W1 DRB1_0102 expi293 31 W2 DRB1_1503 expi293
5 W1 DRB1_0701 Hek293 32 W2 DRB1_1601 expi293
6 W1 DRB1_0701 expi293 33 W2 DRB4_0103 expi293
7 W1 DRB1_1101 Hek293 34 W2 DPB1_0101 expi293
8 W1 DRB1_1101 HeLa 35 W2 DPB1_0201 expi293
9 W1 DRB1_1101 A375 36 W2 DPB1_0401 expi293
10 W1 DRB1_1101 expi293 37 W2 DPB1_0402 expi293
11 W1 DRB1_1501 Hek293 38 W2 DQ2_B0201_A0501 expi293
12 W1 DRB1_1501 expi293 39 W2 DQ2_B0202_A0201 expi293
13 W2 DRB1_0301 expi293 40 W2 DQ6_B0602_A0102 expi293
14 W2 DRB1_0302 expi293 41 W2 HLA DM no tag expi293
15 W2 DRB1_0401 expi293 42 W3 DRB1*0402 expi293
16 W2 DRB1_0404 expi293 43 W3 DRB1*0403 expi293
17 W2 DRB1_0405 expi293 44 W3 DRB1*1102 expi293
18 W2 DRB1_0407 expi293 45 W3 DRB1*1202 expi293
19 W2 DRB1_0801 expi293 46 W3 DRB1*0803 expi293
20 W2 DRB1_0802 expi293 47 W3 DRB3*0101 expi293
21 W2 DRB1_0804 expi293 48 W3 DRB3*0202 expi293
22 W2 DRB1_0901 expi293 49 W3 DRB5*0101 expi293
23 W2 DRB1_1001 expi293 50 W3 DRB3*0301 expi293
24 W2 DRB1_1104 expi293 51 W3 HLA-DO expi293
25 W2 DRB1_1201 expi293 52 W3 DPB1 0101 expi293
26 W2 DRB1_1301 expi293 53 W3 DQ6 B1 0602 expi293
27 W2 DRB1_1302 expi293 54 W3 HLA-DM меченых expi293

ПРИМЕР 4. Тандемная Универсальная IP комплексов HLA II класса с Множеством Аффинных меток

[497] Комплексы HLA II класса образовали путем спаривания α-цепи и β-цепи, каждая из которых может быть мечена иной аффинной меткой. Серийная IP с использованием обеих аффинных меток обеспечивает деконволюцию спаривания α-цепи и β-цепь и однозначные назначения связывания пептидов с комплексами HLA II класса. На фиг. 11A показано схематичное изображение конструкций HLA II класса, сконструированных для экспрессии клетками разных типов для конвейера для универсальной IP. На фиг. 11B показаны схематичные изображения возможных комплексов HLA II класса, которые могут образовываться при экспрессии конструкций ФИГ. 11A в клеточных линиях, экспрессирующих субъединицы α-цепи и β-цепи эндогенного HLA II класса.

[498] На фиг. 12A изображены схемы стратегии последовательной универсальной IP, которую можно использовать для деконволюции спаривания α-цепи и β-цепи и однозначных назначений связывания пептидов с конкретными комплексами HLA II класса. Клетки, экспрессирующие конструкции HLA II класса с меткой двойной аффинности, лизировали, биотинилировали и инкубировали с гранулами, связанными с антителами против HA. Комплексы HLA II класса с меченными HA субъединицами выделяли, промывали и элюировали с использованием пептида HA (YPYDVPDYA). Затем для выделения меченных HA и меченных биотином комплексов HLA II класса элюат инкубировали с гранулами, связанными либо с NeutrAvidin, либо со стрептавидином. Затем пептиды, связанные с комплексами HLA II класса с двойной меткой, элюировали и секвенировали посредством LC-MS/MS. Вестерн-блоттинг и контроль качества переноса (окрашенный Понсо S гель) показали специфичность конвейера для серийной универсальной IP. Вестерн-блоттинг подтвердил стратегию серийной универсальной IP в HEK293T, экспрессирующей конструкции HLA-DRB*11:01 с двойной меткой (фиг. 12B). Для процесса серийного обогащения использовали антитело против HA. Окрашенный Понсо S гель использовали в качестве вестерн-блоттинг контроля качества переноса. На фиг. 12C показан вестерн-блоттинг эксперимента с отрицательным контролем, где клетки, экспрессирующие конструкцию HLA-DRB*11:01 HLA II класса с меткой двойной аффинности лизировали и инкубировали с гранулами, связанными с антителами против HA без биотинилирования. Как показано на фиг. 12C, обогащение не наблюдалось, когда из протокола серийной универсальной IP исключали стадию биотинилирования.

ПРИМЕР 5. Подход Получения профиля Моноаллельного HLA-пептидома, при котором используют Биотиновую аффинную метку.

[499] На ФИГ. 14A и ФИГ. 14B показано схематичное изображение подхода к получению профиля моноаллельного пептидома HLA, при котором используют биотиновую аффинную метку. В иллюстративном варианте осуществления настоящего раскрытия осуществляют использование пептида-акцептора биотина (BAP), который биотинилируют на лизиновом (K) остатке с помощью фермента BirA. Последовательность пептида BAP содержит лизиновый остаток, который биотинилируют при добавлении фермента BirA, биотина и ATP. Биотинилированный продукт демонстрирует высокую аффинность к стрептавидину/NeutrAvidin. Гранулы стрептавидина/NeutrAvidin можно использовать для обогащения биотинилированной последовательности пептида BAP.

ПРИМЕР 6. Платформа Обнаружения Эпитопа-мишеня

[500] В интересующую клеточную линию (например, 2HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO или THP1) или первичные клетки (например, клетки у субъекта с заболеванием или состоянием) можно трансфицировать/трансдуцировать конструкцию HLA I или II класса, содержащую метку (например, последовательность BAP) на N- или C-конец с отбором для обогащения экспрессирующих HLA клеток или без него (фиг. 15). Затем в клетки можно трансфицировать или трансдуцировать вторую плазмиду, которая содержит фрагмент эпитопа или цепь эпитопов, которые можно экспрессировать и презентировать на молекуле с меченным меткой HLA. Альтернативно, и плазмиду с аллелем HLA и плазмиду с эпитопом можно совместно доставлять в клетки с последующим размножением и/или отбором. Затем эти сконструированные клетки лизируют, биотинилируют, а молекулу HLA обогащают из лизата (например, с использованием стрептавидиновых гранул). Пептиды элюируют из молекулы HLA и анализируют, например, посредством LC-MS/MS. Это способ позволяет проанализировать, как разные аллели процессируют и презентируют эпитопы. Этот способ также можно использовать для улучшения доставки и разработки эпитопов.

ПРИМЕР 7. Мультиплексирование аллелей

[501] Конструкцию ДНК можно сконструировать для экспрессии множества тяжелых цепей I класса или множества < или ® цепей II класса, которые содержат одну или более меток (фиг. 16). Каждую конструкцию HLA можно экспрессировать из одной и той же генной конструкции, которая содержит последовательность ухода с рибосомы (F2A, T2A, P2A и т.д.) или элемент IRES. В нужную клеточную линию можно трансдуцировать или трансфицировать эту плазмиду для вызова экспрессии множества аллелей HLA, которые метят и впоследствии обогащают. Альтернативно, в клеточную линию можно трансдуцировать или трансфицировать множество плазмид, каждая из которых содержит один аллель HLA. Затем пептиды, связанные с аллелями HLA, можно анализировать, например, посредством LC-MS/MS. Эта платформа обеспечивает образование клеточных линий с множеством аллелей. Ее можно использовать, например, для совпадения с типом HLA пациента. Это позволяет получать профили эпитопов пептидов для разных комбинаций аллелей.

ПРИМЕР 8. Улучшенное Прогнозирование Процессинга и Специфического Связывания Аллелей

[502] NetMHC - это аллель-специфический метод, который обучает отдельное устройство прогнозирования по набору данных для каждого аллеля, а NetMHCpan - это паналлельный метод, входными данными которого являются кодирования векторов как пептида, так и подпоследовательности конкретной молекулы MHC. Общепринятое мнение состоит в том, что NetMHC работает лучше на аллелях с множеством анализируемых лигандов, тогда как NetMHCpan работает лучше для менее хорошо охарактеризованных аллелей. Однако было показано, что NetMHCpan не является точным, когда в обучающие наборы не были включены соответствующие данные.

[503] Моноаллельный подход, который описан в данном документе (фиг. 21), выявил связывающие HLA пептиды, которые были плохо оценены NetMHCpan, но биохимически подтверждены как сильные связующие элементы. На фиг. 20А показаны иллюстративные связывающие HLA пептиды для аллелей A*01:01, B*51:01, A*29:02, и B*54:01, раскрытые с использованием описанного в настоящее время моноаллельного подхода. На фиг. 20B показана частота неправильного назначения в 100 смоделированных деконволюциях. Был сгенерирован случайный генотип HLA пациента с шестью аллелями (по 2 аллеля каждого из HLA-A, HLA-B и HLA-C, взятых с частотой аллелей в США). Для каждого аллеля были отобраны 500 пептидов из соответствующего моноаллельного эксперимента и объединены, чтобы создать набор многоаллельных данных по имитированным 3000 пептидам. Каждый пептид был назначен для аллеля, который дает наилучший показатель ранга NetMHCpan% для определения процента пептидов, неправильно назначенных NetMHCpan. Этот процесс был повторен 100 раз. Как показано на фиг. 22, прогнозирование как процессинга, так и аллель-специфического связывания было значительно улучшено.

Параграфы раскрытия

[504] В настоящем документе представлен способ получения характеристик комплексов HLA-пептиды, включающий: предоставление популяции клеток, причем одна или более клеток популяции клеток содержат полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую аллель меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, при этом последовательность, кодирующая меченный аффинным акцептором HLA, содержит последовательность, кодирующую аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор; экспрессию меченного аффинным акцептором HLA по меньшей мере в одной клетке из одной или более клеток популяции клеток, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды по меньшей мере в одной клетке; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и получение характеристик комплексов HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления кодируемым аллелем меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса является растворимый аллель меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса.

[505] В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя получение характеристик пептида, связанного с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления способ включает выполнение стадий способа для двух или более аллелей HLA I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления два или более аллеля HLA I класса и/или II класса включают в себя по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аллелей HLA I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат внутриклеточный домен. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды не секретируются. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды при экспрессии встраивают в клеточную мембрану. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды представляют собой растворимые комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды представляют собой нерастворимые комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает создание базы данных специфических к аллелям HLA пептидов. В некоторых вариантах осуществления аллелем рекомбинантного HLA I класса или II класса является единственный аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса.

[506] В некоторых вариантах осуществления способ включает: предоставление популяции клеток, каждая из которых содержит одну или более клеток, содержащих меченный аффинным акцептором HLA, причем меченный аффинным акцептором HLA содержит другой рекомбинантный полипептид, кодируемый другим аллелем HLA, функционально связанным с аффинным пептидом-акцептором; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и получение характеристик пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения.

[507] В некоторых вариантах осуществления способ включает введение одного или более пептидов в популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одним или более пептидами или экспрессию одного или более пептидов в популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов. В некоторых вариантах осуществления одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов, является ДНК. В некоторых вариантах осуществления одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими один или более пептидов, является РНК, необязательно при этом РНК является мРНК. В некоторых вариантах осуществления обогащение не включает в себя использование тетрамерного реагента.

[508] В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя определение последовательности пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения, необязательно определение, является ли пептид или его часть модифицированной. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя биохимический анализ, масс-спектрометрический анализ, MS анализ, MS/MS анализ, анализ LC-MS/MS или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя оценку аффинности связывания или стабильности пептида или его части, связанной с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя определение, содержит ли пептид или его часть, связанная с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид в результате обогащения, одну или более мутаций. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя оценку связей пептидов с молекулами HLA в комплексах меченные аффинным акцептором HLA-пептиды.

[509] В некоторых вариантах осуществления способ включает экспрессию библиотеки пептидов в популяции клеток, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение в контакт с популяцией клеток библиотеки пептидов или библиотеки последовательностей, кодирующих пептиды, образуя тем самым библиотеку комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой библиотеку пептидов, связанных с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления библиотека представляет собой библиотеку пептидов, полученных из полипептидного лекарственного средства, такого как биологическое (например, содержащее антитела лекарственное средство).

[510] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак, заражение возбудителем инфекции или аутоиммунную реакцию. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение возбудителя инфекции или его частей в одну или более клеток популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение полипептидного лекарственного средства, такого как биологическое (например, содержащее антитела лекарственное средство) или его частей в одну или более клеток популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одного или более пептидов из комплексов HLA-пептиды, при этом необязательно, чтобы пептиды происходили из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции или полипептидного лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик одной или более областей пептидов из одного или более белков-мишеней возбудителя инфекции или полипептидного лекарственного средства.

[511] В некоторых вариантах осуществления способ включает идентификацию пептидов из комплексов HLA-пептиды, полученных из возбудителя инфекции. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток происходит из биологического образца у субъекта с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция первичных клеток. В некоторых вариантах осуществления аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса соответствует субъекту с заболеванием или состоянием.

[512] В некоторых вариантах осуществления пептид из комплекса меченный аффинным акцептором HLA-пептид способен активировать T-клетку у субъекта при презентации антигенпрезентирующей клеткой. В некоторых вариантах осуществления получение характеристик включает в себя сравнение комплексов HLA-пептиды из раковых клеток с комплексами HLA-пептиды из нераковых клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя множество популяций клеток, причем каждая популяция клеток экспрессирует другой аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления каждая популяция клеток множества находится в одном и том же или отдельном контейнере.

[513] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение пептидов из комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды перед получением характеристик. В некоторых вариантах осуществления комплекс HLA-пептид выделяют с использованием антител против HLA. В некоторых случаях комплекс HLA-пептид с аффинной меткой или без нее выделяют с использованием антител против HLA. В некоторых случаях растворимый HLA (sHLA) с аффинной меткой или без нее выделяют из среды клеточной культуры. В некоторых случаях растворимый HLA (sHLA) с аффинной меткой или без нее выделяют с использованием антител против HLA. Например, HLA, такой как растворимый HLA (sHLA) с аффинной меткой или без нее, можно выделять с использованием гранулы или колонки, содержащей антитело против HLA. В некоторых вариантах осуществления пептиды выделяют с использованием антител против HLA. В некоторых случаях растворимый HLA (sHLA) с аффинной меткой или без нее выделяют с использованием антител против HLA. В некоторых случаях растворимый HLA (sHLA) с аффинной меткой или без нее выделяют с использованием колонки, содержащей антитело против HLA. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает удаление одной или более аминокислот на конце пептида, связанного с комплексом меченный аффинным акцептором HLA-пептид.

[514] В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция клеток с низкой экспрессией HLA клеточной поверхности I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток экспрессирует один или более аллелей эндогенного HLA. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими одним или более аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является сконструированная популяция клеток с отсутствующими аллелями эндогенного HLA I класса и аллелями эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут одного или более аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления в популяции клеток имеется нокаут всех аллелей HLA I класса и нокаут всех аллелей HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, кодирует HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F и HLA-G. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, кодирует HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса выбирают из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса содержит α-цепь HLA II класса, β-цепь HLA II класса или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления каждая последовательность кодирует по меньшей мере два разных аллеля HLA I класса и/или II класса.

[515] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей другой аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления один или более из по меньшей мере двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей первый аффинный пептид-акцептор, и один или более из по меньшей мере двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей другой аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления каждый из по меньшей мере двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей другой аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере каждый из двух разных аллелей HLA I класса и/или II класса функционально связан с последовательностью, кодирующей аффинную метку. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение по меньшей мере второй полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую другой аллель рекомбинантного HLA, функционально связанный с тем же самым или другим аффинным пептидом-акцептором.

[516] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор экспрессируется внеклеточно. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор находится на внеклеточной части аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с N-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внутриклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор экспрессируется внутриклеточно. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с C-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с внутренней последовательностью последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, такой как последовательность с гибкой петлей. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя обогащение интактных клеток, экспрессирующих комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления способ не включает лизирование клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает лизирование одной или более клеток перед обогащением. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт молекулы связывания аффинного пептида-акцептора с комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем молекула связывания аффинного пептида-акцептора специфически связывается с аффинным пептидом-акцептором.

[517] В некоторых вариантах осуществления аффинный пептид-акцептор содержит последовательность метки, включающей в себя пептид-акцептор биотина (BAP), полигистидиновую метку, полигистидин-глициновую метку, полиаргининовую метку, полиаспартатную метку, полицистеиновую метку, полифенилаланин, метку c-myc, гликопротеиновую D (gD) метку вируса простого герпеса, метку FLAG, эпитопную метку KT3, тубулиновую эпитопную метку, пептидную метку белка 10 гена Т7, стрептавидиновую метку, метку стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метку, Strep-метку II, метку альбумин-связывающего белка (ABP), метку щелочной фосфатазы (AP), метку вируса катаральной лихорадки (B-метку), метку кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метку хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метку холин-связывающего домена (CBD), метку хитин-связывающего домена (CBD), метку целлюлозосвязывающего домена (CBP), метку дигидрофолатредуктазы (DHFR), метку галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающий белок (MBP), глутатион-S-трансферазу (GST), метку Glu-Glu (EE), метку гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метку пероксидазы хрена (HA), NE-метку, метку HSV, метку кетостероид-изомеразы (KSI), метку KT3, метку LacZ, люциферазную метку, метку NusA, метку домена PDZ, AviTag, кальмодулиновую метку, E-метку, S-метку, SBP-метку, Softag 1, Softag 3, метку TC, VSV-метку, метку Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метку Profinity eXact, метку протеина C, S1-метку, S-метку, метку белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метку зеленого флуоресцентного белка (GFP), метку малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метку тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метку, метку Thioredoxin, Fc-метку, метку CYD, метку HPC, метку TrpE, убиквитиновую метку, эпитопную метку VSV-G, метку V5, сортазную метку, метку, образующую с гранулой ковалентную пептидную связь, или их комбинацию; необязательно при этом аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки.

[518] В некоторых вариантах осуществления молекулой связывания аффинного пептида-акцептора является биотин или антитело, специфическое к аффинному пептиду-акцептору. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение аффинной молекулы в контакт с комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, причем аффинная молекула специфически связывается с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора.

[519] В некоторых вариантах осуществления аффинная молекула представляет собой молекулу, которая связывается с биотином. Например, аффинная молекула может содержать стрептавидин, NeutrAvidin, включая белковые гомологи из других организмов и их производные.

[520] В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления молекулу связывания аффинного пептида-акцептора присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления аффинную молекулу присоединяют к твердой поверхности. В некоторых вариантах осуществления твердой поверхностью является гранула. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя иммунопреципитацию комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора, которая специфически связывается с аффинным пептидом-акцептором.

[521] В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора не имеет специфического взаимодействия с аминокислотной последовательностью кодируемого рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к внеклеточной части аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления обогащение включает в себя введение в контакт аффинной молекулы, специфической к N-концевой части аллеля рекомбинантного HLA I класса или II класса.

[522] В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с полинуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления введение в контакт включает в себя трансфекцию или трансдукцию. В некоторых вариантах осуществления предоставление включает в себя введение популяции клеток в контакт с вектором, содержащим полинуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления вектором является вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления полинуклеиновую кислоту стабильно встраивают в геном популяции клеток.

[523] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая рекомбинантный HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β2 микроглобулин в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA I класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая рекомбинантный HLA I класса или II класса, содержит последовательность, кодирующую α-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает экспрессию последовательности, кодирующей β-цепь HLA II класса, в одной или более клетках. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей α-цепь HLA II класса, посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор.

[524] В некоторых вариантах осуществления второй аффинный пептид-акцептор отличается от первого аффинного пептида-акцептора, и его выбирают из группы, состоящей из пептида-акцептора биотина (BAP), полигистидиновой метки, полигистидин-глициновой метки, полиаргининовой метки, полиаспартатной метки, полицистеиновой метки, полифенилаланина, метки c-myc, гликопротеиновой D (gD) метки вируса простого герпеса, метки FLAG, эпитопной метки KT3, тубулиновой эпитопной метки, пептидной метки белка 10 гена Т7, стрептавидиновой метки, метки стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метки, Strep-метки II, метки альбумин-связывающего белка (ABP), метки щелочной фосфатазы (AP), метки вируса катаральной лихорадки (B-метки), метки кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метки хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метки холин-связывающего домена (CBD), метки хитин-связывающего домена (CBD), метки целлюлозосвязывающего домена (CBP), метки дигидрофолатредуктазы (DHFR), метки галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающего белка (MBP), глутатион-S-трансферазы (GST), метки Glu-Glu (EE), метки гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метки пероксидазы хрена (HA), NE-метки, HSV метки, метки кетостероид-изомеразы (KSI), метки KT3, метки LacZ, люциферазной метки, метки NusA, метки домена PDZ, AviTag, кальмодулиновой метки, E-метки, S-метки, SBP-метки, Softag 1, Softag 3, метки TC, VSV-метки, метки Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метки Profinity eXact, метки протеина C, S1-метки, S-метки, метки белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метки зеленого флуоресцентного белка (GFP), метки малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метки тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метки, метки Thioredoxin, Fc-метки, метки CYD, метки HPC, метки TrpE, убиквитиновой метки, эпитопной метки VSV-G, метки V5 и их комбинаций; необязательно при этом первый или второй аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки.

[525] В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность полинуклеиновой кислоты, кодирующую расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой элемент-участок ухода с рибосомы или участок внутренней посадки рибосомы (IRES). В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы или IRES расщепляется при экспрессии в клетках. В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы выбирают из группы, состоящей из F2A, T2A, P2A и E2A. В некоторых вариантах осуществления элемент IRES выбирают из общих клеточных или вирусных последовательностей IRES.

[526] В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя проведение биохимического анализа или масс-спектрометрии, такой как тандемная масс-спектрометрия. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя получение последовательности пептида, которая соответствует MS/MS спектрам одного или более пептидов, выделенных из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды из базы данных пептидов; при этом одна или более полученных последовательностей идентифицирует последовательность одного или более пептидов. В некоторых вариантах осуществления базой данных пептидов является база данных пептидов без специфичности к ферментам, например, база данных без модификации или база данных с модификацией. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает поиск в базе данных пептидов с использованием стратегии поиска в перевернутой базе данных.

[527] В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является человеческая клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является мышиная клеточная линия. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия CHO. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является клеточная линия, выбранная из HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, и THP1. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более цитокинами, ингибиторами контрольных точек, эпигенетически-активными лекарственными средствами, IFN-γ, средствами, которые изменяют процессинг антигенов (такими как ингибиторы пептидазы, ингибиторы протеосом и ингибиторы TAP) или их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют метаболический путь или состояние обмена веществ клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют клеточный протеом клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют или регулируют клеточную экспрессию или транскрипцию (например, AIRE или CREB-связывающий белок или его модуляторы) клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют или регулируют фактор транскрипции клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют или регулируют клеточную экспрессию или транскрипцию HLA клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обрабатывают одним или более реагентами, которые модулируют или регулируют клеточную экспрессию или транскрипцию протеома клеток.

[528] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя по меньшей мере 105 клеток, по меньшей мере 106 клеток или по меньшей мере 107 клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция дендритных клеток, макрофагов, раковых клеток или B-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток включает в себя опухолевые клетки. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток вводят в контакт со средством перед выделением указанных комплексов HLA-пептиды из одной или более клеток. В некоторых вариантах осуществления указанным средством является воспалительный цитокин, химическое средство, вспомогательное средство, терапевтическое средство или радиация.

[529] В некоторых вариантах осуществления аллелем HLA является мутантный аллель HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аллель HLA, представляет собой штрихкодированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ экспрессии аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления анализ включает в себя секвенирование аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, обнаружение РНК аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, обнаружение белка аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления анализ экспрессии может включать в себя вестерн-блоттинг, сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS), масс-спектрометрию (MS), анализ гибридизации на микрочипах, анализ секвенирования РНК, анализ полимеразной цепной реакции, LAMP-анализ, анализ лигазной цепной реакции, саузерн блоттинг, нозерн блоттинг или иммуноферментный анализ (ELISA).

[530] В некоторых вариантах осуществления способ включает выполнение стадий способа для разных аллелей HLA. В некоторых вариантах осуществления каждый аллель HLA содержит уникальную штрихкодированную последовательность. В некоторых вариантах осуществления каждая полинуклеиновая кислота, кодирующая другой аллель HLA, содержит уникальную штрихкодированную последовательность.

[531] В настоящем документе представлена база данных последовательностей специфически связывающих аллели HLA пептидов, полученных путем выполнения описанного в настоящем документе способа. В настоящем документе представлена комбинация двух или более баз данных последовательностей специфически связывающих аллели HLA пептидов, полученных путем многократного выполнения описанного в настоящем документе способа, каждый раз с использованием другого аллеля HLA. В настоящем документе представлен способ генерирования алгоритма прогнозирования для идентификации специфически связывающих аллели HLA пептидов, включающий обучение машины с помощью базы данных последовательностей описанных в данном документе пептидов или описанной в настоящем документе комбинации.

[532] В некоторых вариантах осуществления машина объединяет одну или более линейных моделей, методов опорных векторов, деревьев решений и нейронных сетей. В некоторых вариантах осуществления переменная, используемая для обучения машины, включает в себя одну или более переменных, выбранных из группы, состоящей из последовательности пептида, физических свойств аминокислот, физических свойств пептидов, уровня экспрессии исходного белка пептида в клетке, стабильности белка, скорости трансляции белка, сайтов убиквитинирования, скорости разрушения белка, эффективности трансляции из рибосомального профилинга, расщепляемости белка, локализации белка, мотивов белка-хозяина, которые облегчают транспортировку TAP, белок-хозяин подвергают аутофагии, мотивов, которые способствуют остановке рибосомы, и особенностей белков, которые способствуют NMD.

[533] В некоторых вариантах осуществления мотивы, которые способствуют остановке рибосомы, содержат полипролиновые или полилизиновые участки. В некоторых вариантах осуществления особенности белков, которые способствуют NMD, выбирают из группы, состоящей из длинного 3' UTR, стоп-кодона более 50 нуклеотидов перед последним экзон:экзонным сочленением и расщепляемости пептида.

[534] В настоящем документе представлен способ идентификации специфически связывающих аллели HLA пептидов, включающий проведение анализа последовательности пептида с помощью машины, которую обучили с помощью базы данных последовательностей пептидов, полученных путем выполнения описанного в настоящем документе способа для аллелей HLA. В некоторых вариантах осуществления способ включает определение уровня экспрессии исходного белка пептида в клетке; и при этом экспрессия исходного белка является прогностической переменной, используемой машиной. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии определяют путем измерения количества исходного белка или количества РНК, кодирующей указанный исходный белок.

[535] В настоящем документе представлена композиция, содержащая рекомбинантную полинуклеиновую кислоту, содержащую две или более последовательности, каждая из которых кодирует меченный аффинным акцептором HLA, при этом последовательности, кодирующие меченные аффинным акцептором HLA, содержат последовательность, кодирующую другой рекомбинантный аллель α-цепи HLA I класса, последовательность, кодирующую аффинный пептид-акцептор, и необязательно, последовательность, кодирующую β2 микроглобулин; при этом последовательности (a) и (b) и необязательно (c) функционально связаны.

[536] В настоящем документе представлена композиция, содержащая рекомбинантную полинуклеиновую кислоту, содержащую две или более последовательности, каждая из которых содержит последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA, при этом последовательности, кодирующие меченные аффинным акцептором HLA, содержат последовательность, кодирующую рекомбинантный аллель α-цепи HLA II класса, последовательность, кодирующую аффинный пептид-акцептор, и необязательно, последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса; при этом последовательности (a) и (b) и необязательно (c) функционально связаны. В некоторых вариантах осуществления выделяют рекомбинантную полинуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления HLA I класса выбирают из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F и HLA-G. В некоторых вариантах осуществления HLA II класса выбирают из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP.

[537] В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, которая кодирует внеклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинную молекулу-акцептор, функционально связана с N-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей внутриклеточную часть аллеля рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с C-концом последовательности, кодирующей аллель рекомбинантного HLA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая аффинный пептид-акцептор, функционально связана с последовательностью, кодирующей аллель рекомбинантного HLA посредством линкера.

[538] В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, экспрессируются из одного и того же полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, экспрессируются из разных полинуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор специфически связывается с молекулой связывания аффинного пептида-акцептора. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, содержат два или более аффинных пептида-акцептора. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, содержат три или более последовательности, кодирующие меченный аффинным акцептором HLA, причем по меньшей мере две из трех или более последовательностей, кодирующих меченный аффинным акцептором HLA, содержат один и тот же аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления два или более аффинных пептида-акцептора являются уникальными для каждой из двух или более последовательностей, кодирующих меченный аффинным акцептором HLA.

[539] В некоторых вариантах осуществления кодируемый аффинный пептид-акцептор выбирают из группы, состоящей из пептида-акцептора биотина (BAP), полигистидиновой метки, полигистидин-глициновой метки, полиаргининовой метки, полиаспартатной метки, полицистеиновой метки, полифенилаланина, метки c-myc, гликопротеиновой D (gD) метки вируса простого герпеса, метки FLAG, эпитопной метки KT3, тубулиновой эпитопной метки, пептидной метки белка 10 гена Т7, стрептавидиновой метки, метки стрептавидин-связывающего пептида (SPB), Strep-метки, Strep-метки II, метки альбумин-связывающего белка (ABP), метки щелочной фосфатазы (AP), метки вируса катаральной лихорадки (B-метки), метки кальмодулин-связывающего пептида (CBP), метки хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), метки холин-связывающего домена (CBD), метки хитин-связывающего домена (CBD), метки целлюлозосвязывающего домена (CBP), метки дигидрофолатредуктазы (DHFR), метки галактозосвязывающего белка (GBP), мальтозосвязывающего белка (MBP), глутатион-S-трансферазы (GST), метки Glu-Glu (EE), метки гемагглютинина вируса гриппа человека (HA), метки пероксидазы хрена (HA), NE-метки, HSV метки, метки кетостероид-изомеразы (KSI), метки KT3, метки LacZ, люциферазной метки, метки NusA, метки домена PDZ, AviTag, кальмодулиновой метки, E-метки, S-метки, SBP-метки, Softag 1, Softag 3, метки TC, VSV-метки, метки Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, метки Profinity eXact, метки протеина C, S1-метки, S-метки, метки белка-носителя карбоксибиотина (BCCP), метки зеленого флуоресцентного белка (GFP), метки малого убиквитин-подобного модификатора (SUMO), метки тандемной аффинной очистки (TAP), HaloTag, Nus-метки, метки Thioredoxin, Fc-метки, метки CYD, метки HPC, метки TrpE, убиквитиновой метки, эпитопной метки VSV-G, метки V5 и их комбинаций; необязательно при этом первый или второй аффинный пептид-акцептор содержит два или более повтора последовательности метки.

[540] В некоторых вариантах осуществления молекулой связывания аффинного пептида-акцептора является биотин или антитело, специфическое к аффинному пептиду-акцептору. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора специфически связывается с аффинной молекулой. В некоторых вариантах осуществления аффинной молекулой является стрептавидин, NeutrAvidin или их производное. В некоторых вариантах осуществления молекула связывания аффинного пептида-акцептора не имеет специфического взаимодействия с аминокислотной последовательностью рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления для двух или более рекомбинантных полинуклеиновых кислот: последовательность, кодирующую меченный аффинным акцептором HLA, стабильно встраивают в геном клетки. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, или последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления второй аффинный пептид-акцептор содержит метку HA. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую β2 микроглобулин, или последовательность, кодирующую β-цепь HLA II класса, связывают с последовательностью, кодирующей рекомбинантный HLA и аффинный пептид-акцептор, посредством линкера.

[541] В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность полинуклеиновой кислоты, кодирующую расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер представляет собой элемент-участок ухода с рибосомы или участок внутренней посадки рибосомы (IRES). В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы или IRES расщепляется при экспрессии в клетках. В некоторых вариантах осуществления участок ухода с рибосомы выбирают из группы, состоящей из F2A, T2A, P2A и E2A. В некоторых вариантах осуществления элемент IRES выбирают из общих клеточных или вирусных последовательностей IRES.

[542] В настоящем документе представлена композиция, содержащая две или более выделенные полипептидные молекулы, кодируемые полинуклеиновой кислотой композиции, описанной в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая популяцию клеток, содержащих две или более полипептидные молекулы, кодируемые полинуклеиновой кислотой композиции, описанной в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая популяцию клеток, содержащих композицию, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлена композиция, содержащая популяцию клеток, содержащих одну или более клеток, содержащих композицию, описанную в настоящем документе.

[543] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток экспрессирует один или более аллелей эндогенного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствует один или более аллелей эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствуют аллели эндогенного HLA I класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствует один или более аллелей эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствуют аллели эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления конструируют популяцию клеток, у которых отсутствует один или более аллелей эндогенного HLA I класса и один или более аллелей эндогенного HLA II класса. В некоторых вариантах осуществления популяцией клеток является популяция клеток с низкой экспрессией HLA клеточной поверхности I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления составляют композицию с использованием пептидов или полинуклеиновых кислот, кодирующих пептиды, специфические к типу HLA пациента. В настоящем документе представлен способ получения клетки, включающий трансдукцию или трансфекцию двух или более клеток двумя или более полинуклеиновыми кислотами композиции, описанной в настоящем документе.

[544] В настоящем документе представлен пептид, идентифицированный согласно описанному в настоящем документе способу. В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему клетки, содержащей пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова противоопухолевого ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему клетки, содержащей эффективное количество полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетка презентирует пептид в виде комплекса HLA-пептид. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, описанный в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ вызова иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе.

[545] В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является T-клеточный иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является CD8 T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является CD4 T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунным ответом является гуморальный иммунный ответ.

[546] В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, описанный в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток, содержащих полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления заболеванием является рак. В некоторых вариантах осуществления заболеванием является заражение возбудителем инфекции. В некоторых вариантах осуществления возбудителем инфекции является патогенный микроорганизм, необязательно вирус или бактерия или паразит.

[547] В некоторых вариантах осуществления вирус выбирают из группы, состоящей из: BK вируса (BKV), вирусов Денге (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), цитомегаловируса (CMV), вируса гепатита В (HBV), вируса гепатита С (HCV), вируса Эпштейна-Барра (EBV), аденовируса, вируса иммунодефицита человека (HIV), Т-клеточного лимфотрофического вируса человека (HTLV-1), вируса гриппа, RSV, HPV, бешенства, вируса паротита, краснухи, полиовируса, желтой лихорадки, гепатита A, гепатита B, ротавируса, вируса ветряной оспы, вируса папилломы человека (HPV), оспы, опоясывающего лишая и любой их комбинации.

[548] В некоторых вариантах осуществления бактерию выбирают из группы, состоящей из: видов Klebsiella, Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis и Mycobacterium tuberculosis, тифа, пневмококка, менингококка, haemophilus B, сибирской язвы, столбнячного токсина, менингококка группы B, bcg, холеры и любой их комбинации.

[549] В некоторых вариантах осуществления паразитом является гельминт или простейшие. В некоторых вариантах осуществления паразитирующий организм выбирают из группы, состоящей из: видов Leishmania, видов Plasmodium, Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, видов Schistosoma и любой их комбинации.

[550] В настоящем документе представлен способ обогащения иммуногенных пептидов, включающий: предоставление популяции клеток, содержащей одну или более клеток, экспрессирующих меченный аффинным акцептором HLA, причем меченный аффинным акцептором HLA содержит аффинный пептид-акцептор, функционально связанный с рекомбинантным HLA, кодируемым аллелем рекомбинантного HLA; и обогащение комплексов HLA-пептиды, содержащих меченный аффинным акцептором HLA. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает определение последовательности иммуногенных пептидов, выделенных из комплексов HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления определение включает в себя использование LC-MS/MS.

[551] В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, описанный в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества пептида, содержащего последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества клеток, содержащих пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе. В настоящем документе представлен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту клетки, содержащей эффективное количество полинуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид, содержащий последовательность пептида, описанную в настоящем документе.

[552] В настоящем документе представлен способ разработки терапевтического средства для субъекта с заболеванием или состоянием, включающий предоставление популяции клеток, полученных у субъекта с заболеванием или состоянием, экспрессию в одной или более клетках популяции клеток аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса путем введения в одну или более клеток полинуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, содержащую: последовательность, кодирующую аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды в одной или более клетках; обогащение и получение характеристик комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и, необязательно, разработку терапевтического средства на основании полученной характеристики.

[553] В настоящем документе представлен способ идентификации по меньшей мере одного специфического для субъекта иммуногенного антигена и получение специфической для субъекта иммуногенной композиции, которая содержит по меньшей мере один специфичный для субъекта иммуногенный антиген, в котором субъект имеет заболевание, а по меньшей мере один специфичный для субъекта иммуногенный антиген является специфическим для субъекта и заболевания субъекта, причем указанный способ включает: предоставление популяции клеток, полученных у субъекта с заболеванием или состоянием, экспрессию в одной или более клетках популяции клеток у субъекта аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса путем введения в одну или более клеток полинуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, содержащую: последовательность, кодирующую аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей аффинный пептид-акцептор, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды в одной или более клетках; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды из одной или более клеток; идентификацию иммуногенного пептида из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды, который является специфическим для субъекта и заболевания субъекта; и составление специфической для субъекта иммуногенной композиции на основании одного или более специфичных для субъекта иммуногенных идентифицированных пептидов.

[554] В некоторых вариантах осуществления терапевтическая или специфическая для субъекта иммуногенная композиция содержит пептид из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды или полинуклеотид, кодирующий полипептид из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления терапевтическая или специфическая для субъекта иммуногенная композиция содержит T-клетку, экспрессирующую T-клеточный рецептор (TCR), который специфически связывается с полипептидом из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды. В некоторых вариантах осуществления специфическая для субъекта иммуногенная композиция содержит химерный рецептор антигена (CAR), T-клетку, экспрессирующую рецептор, который специфически связывается с полипептидом из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды.

[555] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту еще одного терапевтического средства, необязательно, ингибитора иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту вспомогательного средства, необязательно, поли-ICLC.

[556] В некоторых вариантах осуществления заболеванием или расстройством является рак. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или расстройством является аутоиммунное заболевание. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или расстройством является заражение. В некоторых вариантах осуществления заражением является заражение возбудителем инфекции. В некоторых вариантах осуществления возбудителем инфекции является патогенный микроорганизм, вирус, бактерия или паразит.

[557] В некоторых вариантах осуществления вирус выбирают из группы, состоящей из: BK вируса (BKV), вирусов Денге (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), цитомегаловируса (CMV), вируса гепатита В (HBV), вируса гепатита С (HCV), вируса Эпштейна-Барра (EBV), аденовируса, вируса иммунодефицита человека (HIV), Т-клеточного лимфотрофического вируса человека (HTLV-1), вируса гриппа, RSV, HPV, бешенства, вируса паротита, краснухи, полиовируса, желтой лихорадки, гепатита A, гепатита B, ротавируса, вируса ветряной оспы, вируса папилломы человека (HPV), оспы, опоясывающего лишая и любой их комбинации.

[558] В некоторых вариантах осуществления бактерию выбирают из группы, состоящей из: видов Klebsiella, Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis и Mycobacterium tuberculosis, тифа, пневмококка, менингококка, haemophilus B, сибирской язвы, столбнячного токсина, менингококка группы B, bcg, холеры и их комбинации.

[559] В некоторых вариантах осуществления паразитом является гельминт или простейшие. В некоторых вариантах осуществления паразитирующий организм выбирают из группы, состоящей из: видов Leishmania, видов Plasmodium, Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, видов Schistosoma и любой их комбинации.

[560] В настоящем документе представлен способ разработки терапевтического средства для субъекта с заболеванием или состоянием, включающий: предоставление популяции клеток, причем одна или более клеток популяции клеток содержат полинуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую по меньшей мере два аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса, причем последовательность, кодирующая по меньшей мере два меченных аффинным акцептором HLA I класса или II класса, содержит первую рекомбинантную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую первый аллель HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей первый аффинный пептид-акцептор; и вторую рекомбинантную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую второй аллель HLA I класса или II класса, функционально связанную с последовательностью, кодирующей второй аффинный пептид-акцептор; экспрессию по меньшей мере двух меченных аффинным акцептором HLA по меньшей мере в одной клетке из одной или более клеток популяции клеток, образуя тем самым комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды по меньшей мере в одной клетке; обогащение комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и идентификацию пептида из обогащенных комплексов меченные аффинным акцептором HLA-пептиды; и составление иммуногенной композиции на основе одного или более идентифицированных пептидов, причем аллели первого и второго рекомбинантного HLA I класса или II класса совпадают с гаплотипом HLA субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание или состояние.

[561] В некоторых вариантах осуществления первый аллель рекомбинантного HLA I класса или II класса отличается от аллеля второго рекомбинантного HLA I класса или II класса. В некоторых вариантах осуществления первый аффинный пептид-акцептор такой же, как второй аффинный пептид-акцептор. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение характеристик пептида, связанного с первым и/или вторым комплексами меченные аффинным акцептором HLA-пептиды в результате обогащения. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два аллеля меченного аффинным акцептором HLA I класса или II класса включают в себя по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аллелей HLA I класса и/или II класса. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды содержат внутриклеточный домен. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды не экскретируют. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды при экспрессии встраивают в клеточную мембрану. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды представляют собой нерастворимые комплексы меченные аффинным акцептором HLA-пептиды.

[562] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает создание базы данных специфических к аллелям HLA пептидов. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение одного или более экзогенных пептидов в популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяции клеток в контакт с одним или более экзогенными пептидами или экспрессию одного или более экзогенных пептидов в популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления введение включает в себя введение популяц