Способ получения биоактивного покрытия с бактерицидными свойствами на имплантате
Владельцы патента RU 2774836:
Общество с ограниченной ответственностью "Титанмед" (RU)
Изобретение относится к области медицины и конкретно касается получения биоактивного, антибактериального адгезионно прочного покрытия на имплантате из титана или его сплавов. Способ получения биоактивного покрытия с бактерицидными свойствами на имплантате включает обезжиривание и активацию поверхности имплантата, электрофоретическое осаждение покрытия из раствора электролита, содержащего по крайней мере один антибиотик на полимерном носителе, представляющем собой хондроитин сульфат, и воду, и сушку покрытия. Активацию поверхности имплантата проводят в две стадии, на первой стадии обрабатывают соляной кислотой или смесью соляной и азотной кислот, на второй стадии поверхность имплантата промывают водой и обрабатывают раствором гидроксида натрия, после чего промывают водой до нейтрального значения рН, при этом в раствор электролита дополнительно вводят соединения кальция. Изобретение позволяет получать прочное биоактивное, антибактериальное покрытие с высокой плотностью, адгезией к поверхности титана и его сплавов, обеспечивает длительное выделение антибиотика после установки имплантата и ускоренную минерализацию хрящевой ткани. 2 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 пр.
Изобретение относится к области медицины и конкретно касается получения биоактивного, антибактериального адгезионно прочного покрытия на имплантате из титана или его сплавов, предназначенных для введения в костную ткань с целью устранения костных дефектов.
Центральными проблемами в имплантационной хирургии являются медленная приживаемость имплантата, риск адсорбции на нем бактерий, заселяющих организм, и формирование на поверхности имплантата токсичной биопленки (биообрастание) в послеоперационный период. В этой связи актуальной является задача создания защитной оболочки с антибактериальными свойствами на поверхности имплантата. Ускорить приживаемость возможно, покрыв имплантат пленкой из биоактивного материала, который способствует регенерации костной ткани. В настоящее время с инфекцией борются в основном при помощи антибиотиков, но выявлена неэффективность покрытия имплантатов чистыми антибиотиками без специальных добавок или без матриц. Поскольку, во-первых, антибиотик растворяется в организме за слишком короткое время, а во-вторых, с чистым антибиотиком невозможно изготовить слой, обладающий адгезивностью к имплантату, так как покрытие имеет порошкообразный, сухой, крошащийся и рассыпчатый вид.
Большинство современных имплантатов изготавливаются из титана или его сплавов - он прочен, биоинертен и не подвержен коррозии. Однако титан и его сплавы не обладают биоактивными и антибактериальными свойствами, поэтому актуальной задачей остается создание покрытий, выступающих как органическая составляющая матрикса для костезамещения, а также устраняющих риск адсорбции на имплантатах бактерий организма и формирования на поверхности имплантатов токсичной биопленки, что приводит к повторному хирургическому вмешательству по извлечению и замене имплантата.
Известен способ получения биоактивного покрытия титанового имплантата, вводимого в костную ткань человека (патент РФ №2566060, A61L 27/06, A61L 27/30, A61F 2/28, опубл. 20.10.2015), Покрытие представляет собой многослойное биоактивное покрытие, полученное атомно-слоевым осаждением и состоящее, по меньшей мере, из слоев одного оксида переходного металла, выбранных из группы, включающей слои оксида титана TiO2 с кристаллической анатазной модификацией; слои из оксида циркония ZrO2, слои из оксида гафния HfO2 с поликристаллической структурой с тетрагональной решеткой, из слоев оксида тантала Ta2O5 с аморфной структурой, слоев из оксида ниобия Nb2O5 с аморфной структурой, из слоев многокомпонентного оксида (TiO2)xTa2O5)1-x, где x равен 0,8-0,95, со структурой твердого раствора на основе тетрагональной кристаллической решетки, с контролируемой толщиной покрытия, определяемой числом повторяющихся циклов осаждения соответствующих прекурсоров - химических реагентов в виде жидких органометаллических соединений указанных переходных металлов и воды. Недостатком способа является то, что оксидные покрытия только лишь препятствуют биообрастанию самого имплантата, но не являются носителями лекарственных средств для костной ткани. Кроме того, технология атомно-слоевого осаждения для формирования покрытий может быть обеспечена только для реагентов, которые возможно перевести в газовую фазу, что ограничивает выбор реагентов.
Известен способ нанесения на эндопротез (патент РФ №2592367, A61L 27/54, A61L 29/16, A61L 31/16, опубл. 20.07.2016) покрытия активным соединением, включающим антибиотик из группы гликозидов или комбинации, по меньшей мере, из двух антибиотиков, они могут находиться вместе в одном слое покрытия или могут быть расположены в отдельных слоях один над другим. Покрытие можно наносить на базовый слой из биоустойчивых или биоразлагаемых полимеров. Биоразлагаемый полимер может содержаться в базовом покрытии, в верхнем слое и в дополнительном слое активного агента. Нанесение покрытия представляет собой способы напыления, окунания, нанесения кистью, разбрызгивания, подмешивания, оборачивания лекарственным средством, раскатывания и/или накапывания из пипетки. Недостатком нанесения данного покрытия является недостаточно высокая адгезионная прочность покрытия на поверхности из титана или его сплавов. Любой из предлагаемых способов нанесения не может обеспечить равномерности покрытия, а также требует дополнительной стадии - удаление растворителя.
Ближайшим аналогом изобретения является способ получения биоактивного покрытия с бактерицидными свойствами на имплантате из титана (патент РФ №2719475, A61F 2/02, A61L 27/02, A61L 27/04, A61L 27/06, опубл. 17.04.2020).
Предварительно поверхность имплантата активируют соляной кислотой. Покрытие наносят электрофоретическим осаждением из раствора электролита, содержащего двух- или трехосновную кислоту и одноосновную кислоту, хитозан и, по меньшей мере, один антибиотик из группы аминогликозидов или ионы серебра или наночастицы серебра в воде. Затем покрытие сушат и дополнительно обрабатывают водным раствором этанола. Недостатком способа является сложность и длительность растворения хитозана в воде с использованием комплекса кислот и необходимость доведения раствора до определенного значения рН при получении композиции для электрофоретического нанесения. Также одностадийная активация поверхности кислотой не приводит к образованию необходимых функциональных групп (гидроксильных), формируемых на поверхности из титана и его сплавов, которые обеспечивали бы прочное связывание покрытия с поверхностью имплантата.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является получение более прочного биоактивного, антибактериального покрытия с высокой плотностью, с высокой адгезией к поверхности титана и его сплавов, обеспечивающего постепенное длительное выделение антибиотика после установки имплантата и ускоренную минерализацию образующейся в процессе регенерации хрящевой ткани.
Указанный результат достигается тем, что разработанный способ получения биоактивного покрытия с бактерицидными свойствами на имплантате включает обезжиривание и активацию поверхности имплантата, электрофоретическое осаждение покрытия из раствора электролита, содержащего, по крайней мере, один антибиотик из группы аминогликозидов на полимерном носителе и воду, последующую сушку покрытия.
Новым в способе получения биоактивного покрытия с бактерицидными свойствами на имплантате является то, что в качестве материала имплантата используют титан или его сплавы, в качестве полимера-носителя выбирают хондроитин сульфат, активацию поверхности имплантата проводят в две стадии, на первой стадии обрабатывают соляной кислотой или смесью соляной и азотной кислот, на второй стадии поверхность имплантата промывают водой и обрабатывают раствором гидроксида натрия, после чего промывают водой до нейтрального значения рН, при этом в раствор электролита дополнительно вводят соединения кальция, электрофоретическое осаждение проводят при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| антибиотик | от 0,3 до 0,5 (в пересчете на действующее вещество) |
| хондроитин сульфат | от 2 до 5 |
| соединения кальция | от 2 до 10 |
| вода | до 100, |
электрофоретическое осаждение проводят при температуре от 20 до 30°С в течение 1-5 минут при силе тока от 100 до 150 мА в автоматическом режиме регулирования напряжения, затем покрытие сушат при температуре от 20 до 50°С в течение 6-24 часов.
В первом частном случае реализации способа получения биоактивного покрытия целесообразно дополнительно проводить гидрофобизацию поверхности окунанием имплантата с первичным покрытием в раствор хитозана, или поликапролактона, или полилактида, или их смеси в диоксане при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| хитозан, или поликапролактон, или полилактид, или их смесь | от 1 до 4 |
| диоксан | до 100, |
затем покрытие сушат при температуре от 20 до 50°С в течение 20-120 минут.
Во втором частном случае реализации способа получения биоактивного покрытия целесообразно в раствор для гидрофобизации добавлять антибиотик из групп пенициллинов, цефалоспоринов, тетрациклинов, эритромицинов.
Способ осуществляют следующим образом.
Поверхность имплантата из титана или его сплавов обезжиривают раствором этанола, активируют, обрабатывая последовательно 36 мас. % раствором соляной кислоты, дистиллированной водой, 10 мас. % раствором гидроксида натрия, дистиллированной водой. Благодаря обработке раствором гидроксида натрия, на поверхности имплантата образуются гидроксильные группы, которые удерживают полисахариды, входящие в покрытие, за счет водородных связей. Этим достигается более высокая адгезионная прочность.
Покрытие наносят электрофоретическим осаждением из раствора, содержащего полимер-носитель (хондроитин сульфат) в количестве от 2 до 5 мас. %, антибиотик в количестве от 0,3 до 0,5 мас. % и соединения кальция в количестве от 2 до 10 мас. %.
При меньшем количестве хондроитин сульфата покрытие получается неоднородным, поскольку имеет слишком малую толщину; при большем количестве хондроитин сульфата уменьшается адгезионная прочность получаемых покрытий.
При меньшем количестве антибиотика значительно снижается бактерицидность покрытий; использование большего количества антибиотика нецелесообразно, поскольку его избыток (по отношению к количеству, рассчитанному исходя из количества хондроитин сульфата) не способен связываться с полимером-носителем и переноситься на поверхность имплантата.
При меньшем количестве соединений кальция качество покрытий существенно не улучшается по сравнению с аналогичными покрытиями, полученными из раствора, не содержащего соединения кальция; при большем количестве соединений кальция ухудшается адгезионная прочность покрытий.
Электрофоретическое осаждение проводят при температуре от 20 до 30°С в течение 1-5 минут при силе тока от 100 до 150 мА в автоматическом режиме регулирования напряжения.
При больших температурах ухудшается адгезия покрытий к поверхности титана; при меньших температурах происходит структурирование раствора электролита, что приводит к ухудшению качества покрытий.
При меньшем времени нанесения не происходит полного и равномерного покрытия имплантата; при большем времени нанесения толщина образующегося на поверхности титана слоя полимера значительно увеличивается, он частично отслаивается при извлечении имплантата из раствора электролита.
При меньшем значении силы тока нанесение покрытия из раствора электролита происходит медленнее, что приводит к необходимости увеличения времени нанесения; при большем значении силы тока нанесение происходит слишком интенсивно, при этом увеличивается толщина покрытия, ухудшается его азгезионная прочность.
Покрытие сушат при температуре от 20 до 50°С в течение 6-24 часов в зависимости от геометрических параметров и конструкционных особенностей имплантата.
При меньшей температуре сушка покрытия происходит значительно дольше; при большей температуре возникает риск термического разложения антибиотика.
При меньшем времени сушки возможна механическая деформация покрытия при работе с имплантатом; большее время сушки нецелесообразно, так как не изменяет качества получаемых покрытий.
Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами и фигурами, на которых изображено:
На фиг.1. Адгезионная прочность (0 баллов) под микроскопом покрытия к Примеру 1;
На фиг.2. Адгезионная прочность (0 баллов) под микроскопом покрытия к Примеру 2;
На фиг.3. Адгезионная прочность (0 баллов) под микроскопом покрытия к Примеру 3;
На фиг.4. Антибактериальные свойства покрытия к Примеру 1 на титановой пластине на примере бактерий Staphiloccocus aureus;
На фиг.5. Антибактериальные свойства покрытия к Примеру 2 на титановой пластине на примере бактерий Staphiloccocus aureus;
На фиг.6. Антибактериальные свойства покрытия к Примеру 3 на титановой пластине на примере бактерий Staphiloccocus aureus;
На фиг.7. Таблица 1. Классификация результатов испытания покрытий на адгезионную прочность по ГОСТу 31149-2014 методом решетчатого надреза;
На фиг.8. Таблица 2. Результаты испытаний адгезионной прочности покрытий на титановых изделиях по ГОСТу 31149-2014 методом решетчатого надреза. Адгезионная прочность (0 баллов) под микроскопом покрытий к Примерам 1-3;
На фиг.9. Таблица 3. Результаты антибактериального исследования пленок на основе хондроитина сульфата на титановых изделиях к Примерам 1-3.
На фиг.10. Таблица 4. Результаты измерений электропроводности растворов для электрофоретического нанесения покрытий.
Пример 1
Поверхность имплантата из титана обезжиривают раствором этанола и активируют, обрабатывая последовательно 36 мас. % раствором соляной кислоты, дистиллированной водой, 10 мас. % раствором гидроксида натрия, дистиллированной водой. Готовят 3 мас. % раствор хондроитин сульфата в воде, добавляют гентамицин в количестве 0,32 мас. %. В указанный раствор погружают покрываемое титановое изделие, которое выступает одним из электродов, и наносят покрытие методом электрофореза в течение 1 минуты, другим электродом при этом является медный электрод, сила тока 150 мА в автоматическом режиме регулирования напряжения. Покрытое титановое изделие сушат при комнатной температуре в течение 6-24 часов в зависимости от геометрических параметров и конструкционных особенностей изделия.
Пример 2
Поверхность имплантата из титана обезжиривают раствором этанола и активируют, обрабатывая последовательно смесью 36 мас. % раствора соляной кислоты и 65 масс. % раствора азотной кислоты (при соотношении 1:1 по массе), дистиллированной водой, 10 мас. % раствором гидроксида натрия, дистиллированной водой. Готовят 3 мас. % раствор хондроитин сульфата в воде, добавляют гентамицин в количестве 0,32 мас. %, добавляют хлорид кальция из расчета 10 мас. % от массы сухого хондроитин сульфата. В указанный раствор погружают покрываемое титановое изделие, которое выступает одним из электродов, и наносят покрытие методом электрофореза в течение 1 минуты, другим электродом при этом является медный электрод, сила тока 150 мА в автоматическом режиме регулирования напряжения. Покрытое титановое изделие сушат при комнатной температуре в течение 6-24 часов в зависимости от геометрических параметров и конструкционных особенностей изделия.
Пример 3
Поверхность имплантата из титана обезжиривают раствором этанола и активируют, обрабатывая последовательно 36 мас. % раствором соляной кислоты, дистиллированной водой, 10 мас. % раствором гидроксида натрия, дистиллированной водой. Готовят 3 мас. % раствор хондроитин сульфата в воде, добавляют гентамицин в количестве 0,32 мас. %, добавляют хлорид кальция из расчета 10 мас. % от массы сухого хондроитин сульфата. В указанный раствор погружают покрываемое титановое изделие, которое выступает одним из электродов, и наносят покрытие методом электрофореза в течение 1 минуты, другим электродом при этом является медный электрод, сила тока 150 мА в автоматическом режиме регулирования напряжения. Покрытое титановое изделие сушат при комнатной температуре в течение 6-24 часов в зависимости от геометрических параметров и конструкционных особенностей изделия. Готовят 3 мас. % раствор поликапролактона в диоксане, наносят покрытие методом окунания, сушат при комнатной температуре в течение 20-120 минут в зависимости от геометрических параметров и конструкционных особенностей изделия.
Изучение адгезии
Классификация результатов испытания по ГОСТу 31149-2014 методом решетчатого надреза приведена в Таблице 1 (фиг.7). Результаты испытаний адгезионной прочности полимерных покрытий на титановых изделиях при различных составах композиции приведены в Таблице 2 (фиг.8).
Как видно из Таблицы 2 (фиг.8), согласно фиг.1, 2, 3 во всех случаях выявлена высокая адгезионная прочность покрытий, которая составила 0 баллов.
Изучение антибактериальных свойств
Были исследованы титановые пластины с покрытием на бактерицидность. В качестве тест-культуры использовался штамм бактерии Staphylococcus aureus. Титановые пластины с покрытием помещались на поверхность агаризованной питательной среды (мясо-пептонный агар), инокулированной Staphylococcus aureus. В качестве контроля служили титановые пластины без покрытия. Условия культивирования - в термостате при 37°С. Время экспозиции - 24 часа. Наличие бактерицидных свойств оценивалось по величине ингибирования роста (диметр, мм) бактерий вокруг исследуемых объектов:
d=до 4 мм - образцы небактерицидные
d=5-8 мм - образцы малобактерицидные
d=9-19 мм - образцы бактерицидные
d>19 мм - образцы сильнобактерицидные.
Результаты антибактериального исследования полимерных пленок на титановых пластинах приведены в Таблице 3 (фиг.9).
Анализ полученных результатов показал, что все испытуемые образцы полимерных пленок, нанесенных на имплантаты из титана и его сплавов, обладают сильным бактерицидным действием по отношению к тест-культуре бактерии. Зона ингибирования роста Staphylococcus aureus вокруг испытуемых объектов превышала 19 мм (24-26 мм).
Изучение влияния хлорида кальция (CaCl2) на процесс электрофоретического нанесения
Добавление хлорида кальция (CaCl2) при приготовлении растворов для электрофоретического нанесения приводит к увеличению их электропроводности. Это доказывают измерения электропроводности кондуктометрическим методом.
Измерение значений 1/R (в мСм) проводилось при 23,5°С, при этом сначала было измерено значение 1/R для раствора хлорида калия KCl (0,01М) и вычислена постоянная сосуда (λ=0,23754 см-1).
За счет более высоких показателей электропроводности растворов процесс осаждения из раствора компонентов, образующих покрытие, на поверхность титана происходит более интенсивно. Полученные покрытия более плотные, содержат больше антибиотика.
Добавление соединений кальция в раствор для электрофоретического осаждения имеет особое значение для получении покрытия с бактерицидными свойствами на имплантате из титана и его сплавов, так как данная добавка позволяет добиться многих важных качеств получаемого покрытия, а также благоприятно влияет на процесс заживления перелома, поскольку ионы кальция входят в состав костной ткани, и выступают как органическая составляющая матрикса для костезамещения. Ионы кальция связывают макромолекулы хондроитин сульфата за счет его кислотных групп (сульфогруппы, карбоксильные группы), образуя устойчивые комплексы (Shen Q. et al. Fabrication of chondroitin sulfate calcium complex and its chondrocyte proliferation in vitro // Carbohydrate Polymers. 2021. Vol. 254. P. 117282). Авторами обнаружено, что хлорид кальция способен образовывать комплексы как с хондроитин сульфатом, так и с антибиотиками аминогликозидного ряда, поэтому введение солей кальция в раствор электролита, содержащего хондроитин сульфат, способствует связыванию хондроитин сульфата и аминогликозидов через ионы кальция Са2+. За счет этого связывания происходит перенос аминогликозидов на поверхность имплантата, а также последующее удержание антибиотика. Тот факт, что аминогликозиды находятся на поверхности титана не в свободном виде, а в составе комплекса, обеспечивает постепенное длительное их выделение после установки имплантата.
Помимо этого, присутствие ионов кальция Са2+, предположительно, замедляет биодеградацию покрытия. За счет этого усиливается пролонгированный эффект выделения антибиотика в послеоперационный период.
Соединения кальция, присутствующие на поверхности имплантата за счет разработанного покрытия, способствуют минерализация костной ткани. Они ускоряют переход мягкой костной мозоли, образующейся в месте перелома, в костную ткань, что предотвращает повторное повреждение кости и ускоряет заживление перелома.
Авторами установлено, что для достижения пролонгированного высвобождения антибиотика в послеоперационный период возможна дополнительная гидрофобизация биоактивного покрытия путем обработки его растворами поликапролактона, полилактида или хитозана или их смеси. Это замедляет растворение биоактивного покрытия на основе хондроитин сульфата, обеспечивая более постепенное выделение его активных компонентов при контакте с внутренней средой организма. При этом сохраняются бактерицидные свойства получаемых покрытий. Установлено, что подобная обработка не уменьшает адгезионную прочность покрытий.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать прочные биоактивные покрытия с бактерицидными свойствами на имплантате из титана и его сплавов с высокой адгезией к поверхности титана и его сплавов, обеспечивающие пролонгированное, т.е. длительное действие антибиотика в процессе биодеструкции полимеpa непосредственно в области раны в течение послеоперационного периода, а также ускоренную минерализацию образующейся в процессе регенерации хрящевой ткани.
1. Способ получения биоактивного покрытия с бактерицидными свойствами на имплантате, включающий обезжиривание и активацию поверхности имплантата, электрофоретическое осаждение покрытия из раствора электролита, содержащего по крайней мере один антибиотик из группы аминогликозидов на полимерном носителе и воду, последующую сушку покрытия, отличающийся тем, что в качестве материала имплантата используют титан или его сплавы, в качестве полимерного носителя выбирают хондроитин сульфат, активацию поверхности имплантата проводят в две стадии, на первой стадии обрабатывают соляной кислотой или смесью соляной и азотной кислот, на второй стадии поверхность имплантата промывают водой и обрабатывают раствором гидроксида натрия, после чего промывают водой до нейтрального значения рН, при этом в раствор электролита дополнительно вводят соединения кальция, электрофоретическое осаждение проводят при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| антибиотик | от 0,3 до 0,5 в пересчете на действующее вещество |
| хондроитин сульфат | от 2 до 5 |
| соединения кальция | от 2 до 10 |
| вода | до 100, |
электрофоретическое осаждение проводят при температуре от 20 до 30°С в течение 1-5 мин при силе тока от 100 до 150 мА в автоматическом режиме регулирования напряжения, затем покрытие сушат при температуре от 20 до 50°C в течение 6-24 ч.
2. Способ получения биоактивного покрытия с бактерицидными свойствами на имплантате по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно проводят гидрофобизацию поверхности окунанием имплантата с биоактивным покрытием в раствор хитозана, или поликапролактона, или полилактида, или их смеси в диоксане при следующем соотношении компонентов, мас. %:
| хитозан, или поликапролактон, или полилактид, или их смесь | от 1 до 4 |
| диоксан | до 100, |
затем покрытие сушат при температуре от 20 до 50°С в течение 20-120 мин.
3. Способ получения биоактивного покрытия с бактерицидными свойствами на имплантате по п. 2, отличающийся тем, что в раствор для гидрофобизации добавляют антибиотик из групп пенициллинов, цефалоспоринов, тетрациклинов.
