Повышение иммуногенности конъюгатов полисахарид streptococcus pneumoniae-белок

Группа изобретений относится к иммуногенным композициям для профилактики инвазивного заболевания, вызванного S. pneumoniae. Предложенные композиции состоят по существу или состоят из полисахарида S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F, каждый из которых конъюгирован с CRM197. При этом реакцию конъюгации для S. pneumoniae серотипов 6А, 6В, 7F, 18С, 19А, 19F и 23F осуществляют в апротонном растворителе, где апротонный растворитель представляет собой DMSO, а реакцию конъюгации S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F осуществляют в водном растворителе. Предложенные иммуногенные композиции обладают повышенной иммуногенностью. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 6 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим по меньшей мере один полисахарид Streptococcus pneumoniae, конъюгированный с CRM₁₉₇ посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе, таком как диметилсульфоксид (DMSO). Изобретение также относится к способам повышения иммуногенности иммуногенных композиций, содержащих один или более конъюгатов полисахарид-белок, в которых один или более полисахаридов из бактериальных капсул S. pneumoniae конъюгируют с белком-носителем посредством восстановительного аминирования, осуществленного в апротонном растворителе, таком как DMSO.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Streptococcus pneumoniae является грамположительной бактерией и наиболее распространенной причиной инвазивных бактериальных заболеваний (таких как пневмония, бактериемия, менингит и отит среднего уха) у новорожденных и детей младшего возраста. Пневмококк инкапсулирован в химически связанный полисахарид, придающий серологическую специфичность. Существует более 90 известных серотипов пневмококков, и капсула является основной детерминантой вирулентности пневмококков, т.к. капсула не только защищает внутреннюю поверхность бактерий от комплемента, но и сама по себе мало иммуногенна. Полисахариды являются T-независимыми антигенами и не могут процессироваться или презентироваться на молекулах MHC для взаимодействия с T-клетками. Однако они могут стимулировать иммунную систему посредством альтернативного механизма, включающего перекрестное сшивание поверхностных рецепторов на B-клетках.

У детей возрастом менее 2 лет не развивается иммунный ответ на большинство полисахаридных вакцин, таким образом, необходимо делать полисахариды иммуногенными посредством химической конъюгации с белковым носителем. Соединение полисахарида, T-независимого антигена, с белком, T-зависимым антигеном, придает полисахариду свойства T-зависимого антигена, включая переключение изотипа, созревание аффинности и индукцию памяти.

Существует множество реакций конъюгаций, используемых для ковалентного соединения полисахаридов с белками. Три из чаще используемых способов включают: 1) восстановительное аминирование, где альдегидная или кетоновая группа на одном компоненте реакционной смеси реагирует с аминогруппой или гидразидной группой на другом компоненте, и образующуюся двойную связь C=N затем восстанавливают до одинарной связи C-N с помощью восстановителя; 2) конъюгацию посредством цианилирования, где полисахарид активируют с помощью цианоген бромида (CNBr) или тетрафторобората 1-циано-4-(диметиламино)пиридиния (CDAP) для встраивания цианатной группы в гидроксильную группу, образующей ковалентную связь с аминогруппой или гидразидной группой после добавления белкового компонента; и 3) карбодиимидную реакцию, где карбодиимид активирует карбоксильную группу на одном компоненте реакционной смеси для конъюгации, и активированная карбонильная группа реагирует с аминогруппой или гидразидной группой на другом компоненте. Эти реакции также часто используют для активации компонентов конъюгата перед реакцией конъюгации.

Для конъюгации полисахаридов S. pneumoniae используют восстановительное аминирование. См., например, патент США № 8192746, публикацию заявки на патент США № 20170021006 и публикации международных патентных заявок №№ WO2011/110381 и WO2015/110941. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление антигена и (2) восстановление антигена и белка-носителя для получения конъюгата. Стадию восстановления можно осуществлять в водном растворителе или апротонном растворителе, таком как DMSO. См., например, публикацию международной заявки на патент № WO2016/113644.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим полисахариды одного или более из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F и 38 S. pneumoniae, конъюгированные с белком-носителем, где реакцию конъюгации, посредством которой полисахарид конъюгируют с белком-носителем, осуществляют в апротонном растворителе. В одном из вариантов осуществления в случае композиций, содержащих идентичные серотипы, один или более серотипов, полученных в апротонном растворителе, имеют повышенную иммуногенность по сравнению с теми же одним или более серотипами, полученными в водных условиях.

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим конъюгаты полисахарид-белок, полученные из одного или более серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F и 38 S. pneumoniae, конъюгированных с белком-носителем, где конъюгаты полисахарид-белок получают способом, включающим стадию конъюгации полисахарида с белком-носителем в апротонном растворителе.

Изобретение также относится к способам конъюгации полисахарида серотипа 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F или 38 S. pneumoniae с белком-носителем, включающим стадию конъюгации полисахарида с белком-носителем в апротонном растворителе.

Изобретение также относится к способам лечения индивидуума с использованием иммуногенной композиции, содержащей один или более полисахаридов серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F или 38 S. pneumoniae, конъюгированных с белком-носителем, где полисахарид конъюгируют с белком-носителем в апротонном растворителе.

В некоторых вариантах осуществления полисахариды одного или более серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 11A, 12F и 14 S. pneumoniae конъюгируют с белком-носителем в апротонном растворителе. В некоторых вариантах осуществления полисахариды одного или более серотипов 2, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 15A, 15C, 16F, 17F, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F и 38 S. pneumoniae конъюгируют с белком-носителем в апротонном растворителе.

В некоторых вариантах осуществления полисахариды из одного или более серотипов 3 и 18C S. pneumoniae конъюгируют с белком-носителем в апротонном растворителе. В одном из аспектов этого варианта осуществления полисахариды серотипа S. pneumoniae 3 конъюгируют с белком-носителем в апротонном растворителе. В одном из аспектов этого варианта осуществления полисахариды серотипа 18C S. pneumoniae конъюгируют с белком-носителем в апротонном растворителе.

В некоторых вариантах осуществления реакцией конъюгации, используемой для конъюгации полисахарида с белком-носителем, является восстановительное аминирование.

В некоторых вариантах осуществления апротонным растворителем является DMSO.

В некоторых вариантах осуществления белком-носителем является CRM₁₉₇.

В некоторых вариантах осуществления конъюгаты, полученные в DMSO, имеют значение потерь лизина более 5,0. В одном из аспектов конъюгаты, полученные в DMSO, имеют значение потерь лизина от 7,0 до 18,0, включительно.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция дополнительно содержит полисахариды одного или более серотипов 6A, 6B, 7F, 10A, 15B, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F S. pneumoniae, конъюгированных с белком-носителем, где реакцию конъюгации, посредством которой полисахарид конъюгируют с белком-носителем, осуществляют в апротонном растворителе. В некоторых аспектах этого варианта изобретения реакцией конъюгации является восстановительное аминирование. В некоторых аспектах апротонным растворителем является DMSO. В некоторых аспектах белком-носителем является CRM₁₉₇. В одном из аспектов иммуногенная композиция содержит полисахарид серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F S. pneumoniae, конъюгированный с белком-носителем, где реакцию конъюгации, посредством которой полисахарид серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F или 23F S. pneumoniae конъюгируют с белком-носителем, осуществляют в апротонном растворителе. В некоторых аспектах полисахарид получают из серотипов 18C, 19A, 19F или 23F S. pneumoniae.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции по изобретению дополнительно содержат полисахариды одного или более серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F и 38 S. pneumoniae, конъюгированные с белком-носителем, где реакцию конъюгации, посредством которой полисахарид серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F или 38 S. pneumoniae конъюгируют с белком-носителем, осуществляют в водном растворителе. В одном из аспектов 35-100% серотипов в иммуногенной композиции получают посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO, а остальные конъюгаты полисахарид-белок получают в водных условиях.

В одном конкретном варианте осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, состоящей, по существу, из полисахаридов серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F S. pneumoniae, конъюгированных с полисахаридом CRM₁₉₇, где реакцию конъюгации серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F S. pneumoniae осуществляют в условиях DMSO, а реакцию конъюгации серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F S. pneumoniae осуществляют в водном растворителе, необязательно, дополнительно содержащем приблизительно 0,2% масс./об. PS-20.

Настоящее изобретение также относится к способам индукции защитного иммунного ответа у человека, включающим введение любой из иммуногенных композиций по изобретению. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет возраст 50 лет или более и/или является иммунокомпрометированным. В некоторых вариантах осуществления возраст индивидуума составляет 2 года или менее. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является иммунокомпрометированным.

Настоящее изобретение также относится к способам достижения повышенного иммунного ответа на вакцину с конъюгатом пневмококковый полисахарид (PnPs)-белок, включающим введение животному иммуногенной композиции, содержащей конъюгаты полисахарид-белок, содержащие капсульные полисахариды S. pneumoniae из первого набора из двух или более пневмококковых серотипов, конъюгированных с одним или более белками-носителями, где два или более конъюгатов полисахарид-белок из первого набора получают посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO. В одном из вариантов осуществления указанный иммунный ответ является повышенным относительно контрольного животного, которому вводят иммуногенную композицию, где один или более из двух или более конъюгатов полисахарид-белок из первого набора получают посредством восстановительного аминирования в водных условиях. В одном из вариантов осуществления контрольным животным является мышь. В другом варианте осуществления контрольным животным является человек. В некоторых вариантах осуществления в способах используют вакцину с конъюгатом пневмококковый полисахарид-белок, содержащую дополнительные конъюгаты полисахарид-белок, содержащие капсульные полисахариды S. pneumoniae из второго набора пневмококковых серотипов, конъюгированных с одним или более белками-носителями, полученные посредством восстановительного аминирования в водных условиях, где серотипы из второго набора отличаются от серотипов из первого набора.

В некоторых вариантах осуществления в способах используют вакцину с конъюгатом пневмококковый полисахарид-белок, где пневмококковые серотипы выбраны из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 33F, 34, 35A, 35B, 35F и 38.

В некоторых вариантах осуществления в способах используют вакцину с конъюгатом пневмококковый полисахарид-белок, где конъюгаты полисахарид-белок серотипа 3 или 18C получают посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO.

В некоторых вариантах осуществления в способах используют вакцину с конъюгатом пневмококковый полисахарид-белок, где конъюгаты полисахарид-белок из первого набора пневмококковых серотипов выбраны из серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F.

В некоторых вариантах осуществления в способах используют вакцину с конъюгатом пневмококковый полисахарид-белок, где конъюгаты полисахарид-белок из первого набора пневмококковых серотипов содержат серотипы 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F, полученные посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO, а конъюгаты полисахарид-белок из второго набора серотипов получают в водных условиях.

В одном конкретном варианте осуществления в способах используют вакцину с конъюгатом пневмококковый полисахарид-белок, где конъюгаты полисахарид-белок серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F получают посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO, а конъюгаты полисахарид-белок серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F получают в водных условиях.

В некоторых вариантах осуществления в способах используют вакцину с конъюгатом пневмококковый полисахарид-белок, где конъюгаты полисахарид-белок 35-100% серотипов получают посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO, а остальные конъюгаты полисахарид-белок получают в водных условиях. В одном из аспектов конъюгаты полисахарид-белок 45-80% серотипов получают посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO, а остальные конъюгаты полисахарид-белок получают в водных условиях. В другом аспекте конъюгаты полисахарид-белок 75-100% серотипов получают посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO, а остальные конъюгаты полисахарид-белок получают в водных условиях.

В некоторых вариантах осуществления в способах используют вакцину с конъюгатом пневмококковый полисахарид-белок, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из комплекса белков наружной мембраны (OMPC) Neisseria meningitidis, столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, белка D и CRM₁₉₇. В одном из аспектов белком-носителем является CRM₁₉₇.

В некоторых вариантах осуществления в способах используют вакцину с конъюгатом пневмококковый полисахарид-белок, где конъюгаты, полученные посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO, имеют более высокую долю образованных гликопептидных связей, что измеряют по значению потерь лизина в белке более 5,0. В одном из аспектов этого варианта осуществления конъюгаты, полученные посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO, имеют значение потерь лизина от 7,0 до 18, включительно. В другом аспекте конъюгаты, полученные посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO, имеют значение потерь лизина более 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5 или 10,0.

В другом конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу достижения повышенного иммунного ответа на вакцину с конъюгатом пневмококковый полисахарид (PnPs)-белок, состоящую, по существу, из полисахаридов серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F S. pneumoniae, конъюгированных с полисахаридом CRM₁₉₇, где способ включает введение человеку иммуногенной композиции, содержащей конъюгаты полисахарид-белок из первого набора и второго набора пневмококковых серотипов, где первый набор серотипов состоит из 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F, и его получают посредством восстановительного аминирования в условиях DMSO, а второй набор серотипов состоит из 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F, и его получают в водных условиях.

В некоторых вариантах осуществления повышенный иммунный ответ у животных, вакцинированных с помощью иммуногенных композиций, полученных способам по изобретению, измеряют по среднему геометрическому титру IgG или опсонофагоцитирующего антитела в сыворотке. В одном из аспектов повышенный иммунный ответ на пневмококковый серотип повышен на 10% или более по сравнению с ответом на конъюгат полисахарид-белок того же пневмококкового серотипа, полученный в водных условиях. В одном из вариантов осуществления животным является мышь. В другом варианте осуществления животным является человек.

В некоторых вариантах осуществления способы используют в отношении человека возрастом 50 лет или более. В некоторых вариантах осуществления способы используют в отношении человека возрастом 2 года или менее. В некоторых вариантах осуществления способы используют в отношении человека, являющегося иммунокомпрометированным.

Изобретение также относится к способам получения конъюгата пневмококковый полисахарид-белок посредством восстановительного аминирования, включающим:

a) реакцию полисахарида Streptococcus pneumoniae, выбранного из серотипов 3, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F, с количеством окислителя (например, периодата) с получением активированного полисахарида, имеющего уровень активации от 0,05 до 0,22;

b) реакцию активированного полисахарида с белком-носителем в апротонном растворителе, необязательно, в присутствии восстановителя, для получения конъюгата полисахарид-белок;

где конъюгат имеет значение потерь лизина от 7,0 до 18,0, включительно.

В некоторых вариантах осуществления уровень активации составляет от 0,09 до 0,22.

В некоторых вариантах осуществления окислителем является периодат.

В некоторых вариантах осуществления уровень активации измеряют посредством дериватизации альдегидов на полисахариде с использованием тиосемикарбазида.

В некоторых вариантах осуществления восстановитель является цианоборогидридной солью, такой как цианоборогидрид натрия.

В некоторых вариантах осуществления белок-носитель выбран из группы, состоящей из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина и CRM₁₉₇. В одном из вариантов осуществления белком-носителем является CRM₁₉₇.

Настоящее изобретение также относится к количественному способу определения уровня альдегидов (т.е. уровня активации периодатом) в активированном полисахариде, включающему стадии:

a) дериватизации активированного полисахарида для получения дериватизированного полисахарида посредством реакции с дериватизирующим средством, проводимой до ее завершения (т.е. выхода реакции на плато);

b) выделения дериватизированного полисахарида посредством высокоэффективной эксклюзионной хроматографии (для удаления непрорегировавшего дериватизирующего средства и компонентов матрицы);

c) количественного анализа поглощения УФ дериватизированным полисахаридом.

Дериватизирующее средство можно выбирать из группы, состоящей из тиосемикарбазида, структурных аналогов тиосемикарбазида, гидразидов, гидразина, семикарбазида, структурных аналогов семикарбазида, аминооксисоединений или ароматических аминов.

В одном из вариантов осуществления количественный анализ на стадии c) осуществляют посредством сравнения со стандартом производного. В одном из вариантов осуществления количественный анализ на стадии c) осуществляют посредством измерения относительно заранее определенного коэффициента экстинкции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Степень конъюгации в разных лизиновых участках CRM₁₉₇, определяемая посредством триптического пептидного картирования. Конъюгаты полисахарид серотипа 19A-CRM₁₉₇, полученные посредством восстановительного аминирования в водном растворе или DMSO, расщепляли трипсином и анализировали посредством LC-UV-MS. Строили график потери пептидного сигнала по сравнению с контрольными образцами CRM₁₉₇ относительно участков конъюгации.

Фигура 2. Результаты электрохемилюминисцентного анализа (ECL) иммуногенности в группах в исследовании на мышах, в котором сравнивали конъюгаты полисахарид серотипа 3-CRM₁₉₇, полученные посредством восстановительного аминирования в водном растворе или DMSO. Конъюгаты составлены с адъювантом фосфатом алюминия (APA). Показаны результаты до вакцинации (Pre) и после введения дозы 3 (PD3). Также показаны результаты для контроля только с APA.

Фигура 3. Результаты анализа опсофагоцитарной активности (OPA) после введения дозы 3 в группах в исследовании на мышах, в котором сравнивали конъюгаты полисахарид серотипа 3-CRM₁₉₇, полученные посредством восстановительного аминирования в водном растворе или DMSO. Также показаны результаты OPA до вакцинации (до иммунизации) и для контроля только с APA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим конъюгаты пневмококковый полисахарид-белок, где конъюгаты по меньшей мере одного пневмококкового серотипа получают посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе, таком как DMSO. Настоящее изобретение частично основано на открытии того, что использование DMSO в качестве растворителя во время восстановительного аминирования конъюгатов полисахарид-белок приводит к неожиданно превосходной стабильности и повышенной иммуногенности для этих серотипов относительно тех же конъюгатов, полученных в водных условиях. Настоящее изобретение относится к преимуществам растворителя DMSO в повышении ковалентных связей полисахарида с белком посредством прямого расхода остатков лизина на поверхности белка-носителя. Для большинства тестируемых серотипов "потерь лизина", обеспечивающих хорошую иммуногенность (≥7,0), можно достигать при более низком уровне активации полисахарида (от 0,05 до 0,22) при конъюгации в апротонном растворителе, чем в водном буфере. Повышенное ковалентное связывание обладает непосредственным преимуществом повышения стабильности конъюгата полисахарид-белок и повышения иммунного ответа на эти конкретные полисахаридные антигены, конъюгированные в DMSO.

Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что, один из возможных механизмов повышения иммуногенности, наблюдаемого при использовании гликоконъюгатов, полученных в DMSO, включает повышение количества связей между углеводом (капсульным полисахаридом) и остатками лизина на поверхности белка-носителя, что будет приводить к получению дополнительных точек присоединения между белком и полисахаридом для придания стабильности и противодействия химической деполимеризации или распаду связи пептид-углевод. См., например, Hsieh, Characterization of Saccharide-CRM₁₉₇ Conjugate Vaccines in Brown F, Corbel M, Griffiths E (eds): Physico-Chemical Procedures for the Characterization of Vaccines. Dev. Biol. Basel, Karger, 2000, vol 103, pp. 93-104. Дополнительным преимуществом повышения связей полисахарид-белок, образующихся при конъюгации в растворителе DMSO, могут быть дополнительные возможности успешной презентации конъюгата пептид-углевод T-клеткам. Следует понимать, что в результате генетической изменчивости в популяции людей, приводящей к разным свойствам и чувствительности нагрузки или связывания с конкретными пептидными последовательностями, конъюгированными с углеводными антигенами, дополнительные точки присоединения на белке-носителе будут повышать шансы успешной презентации антигена на поверхности APC, что делает возможным T-зависимый ответ на, в ином случае, T-независимый антиген. Другой возможный механизм повышения наблюдаемой иммуногенности посредством конъюгации в растворителе DMSO может быть связан с денатурацией CRM₁₉₇ в органическом растворителе, что приводит к экспонированию дополнительных лизинов для связывания с полисахаридом, повышая шансы презентации гликопептида на поверхности APC для T-зависимого ответа на разные пептидные эпитопы. См. Avci et al., 2011, Nature Medicine 17: 1602-1610.

Другим преимуществом конъюгации в органическом растворителе, посредством которой получают денатурированный CRM₁₉₇ в конъюгатах, может являться сниженная иммунная интерференция антител против нативных эпитопов CRM₁₉₇. Дополнительным преимуществом повышения связей полисахарид-белок, образующихся при конъюгации в растворителе DMSO, может являться образование конъюгатов полисахарид-белок большего размера, что приводит к повышению иммуногенности. Считают, что композиции по изобретению обеспечивают значительные преимущества в отношении индукции ответов у человека.

Как показано в примере 5, конъюгат полисахарид-белок, полученный из серотипа 3 S. pneumoniae посредством восстановительного аминирования в DMSO, проявляет повышенную иммуногенность (по сравнению с тем же конъюгатом, полученным посредством восстановительного аминирования в воде) в модели на мышах, что измеряют по опсофагоцитирующей активности (OPA). Кроме того, как показано в примере 6, 15-валентная вакцина на основе пневмококкового конъюгата, содержащая семь серотипов, полученных посредством восстановительного аминирования в DMSO (остальные восемь получены в водном растворителе), имеет тенденцию к лучшей иммуногенности у людей (при этом превосходство 4 серотипов является статистически значимым) для всех семи серотипов, полученных в DMSO, по сравнению с соответствующей 15-валентной PCV, в котором все 15 серотипов получали в водном растворителе.

Как показано в примере 4, при построении графика снижения пептидного сигнала для положений лизина на белке CRM₁₉₇ в конъюгатах серотипа 19A относительно возможных участков конъюгации (по сравнению с контрольным CRM197) обнаружили дополнительные участки конъюгации, находящиеся в ранее идентифицированных распространенных пептидных эпитопах T-клеток человека (См. Raju et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25:3207-3214, находящихся в пептиде 411-430 и пептиде 431-450 последовательности CRM₁₉₇). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям, содержащим один или более конъюгатов полисахарид-CRM₁₉₇, где по меньшей мере один из конъюгатов полисахарид-CRM₁₉₇ получают в апротонном растворителе, и где конъюгат, полученный в апротонном растворителе, демонстрирует более высокую доступность остатков лизина в аминокислотах 411-430 или 431-450 CRM₁₉₇ по сравнению с тем же конъюгатом, полученным в водном растворителе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям, содержащим один или более конъюгатов полисахарид-CRM₁₉₇, где по меньшей мере один из конъюгатов полисахарид-CRM₁₉₇ получают в апротонном растворителе, и где один или более остатков лизина в аминокислотах 411-430 или 431-450 CRM₁₉₇ в конъюгате, полученном в апротонном растворителе, конъюгированы более чем на 10%. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам повышения доступности остатков лизина в CRM₁₉₇, в частности, в аминокислотах 411-430 или 431-450 CRM₁₉₇, включающим конъюгацию полисахарида с CRM₁₉₇ в апротонном растворителе. В некоторых аспектах этого варианта изобретения один или более остатков лизина в аминокислотах 411-430 или 431-450 CRM₁₉₇ в конъюгате, полученном в апротонном растворителе, конъюгированы более чем на 10%. В этих вариантах осуществления полисахарид можно получать из любого организма, подходящего для получения иммуногенной композиции. В некоторых аспектах полисахарид получают из N. meningitidis или S. pneumoniae. Полисахарид можно получать из любого серотипа этих организмов.

В рамках изобретения термины "водный растворитель" или "водные условия" при использовании в отношении конъюгации, такой как восстановительное аминирование, относятся к использованию воды в качестве растворителя для реакции конъюгации. Вода может содержать буферы и другие компоненты, за исключением органического растворителя.

В рамках изобретения термин "апротонный растворитель" при использовании в отношении конъюгации, такой как восстановительное аминирование, относится к использованию полярного апротонного растворителя или комбинации полярных апротонных растворителей в качестве растворителя для реакции конъюгации. Неограничивающие примеры полярных апротонных растворителей включают диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF) и гексаметилфосфамид (HMPA). Апротонный растворитель может содержать некоторое количество воды, например, до 1%, 2%, 5%, 10% или 20%.

В рамках изобретения термины "растворитель DMSO" и "условия DMSO" используют взаимозаменяемо.

В рамках изобретения термин "содержит" при использовании в отношении иммуногенной композиции по изобретению относится к включению любых других компонентов (подлежат ограничению фразой "состоящий из" в случае смеси антигенов), таких как адъюванты и эксципиенты. Термин "состоящий из" при использовании в отношении мультивалентной смеси конъюгатов полисахарид-белок относится к смеси, содержащей конкретные конъюгаты полисахарид S. pneumoniae-белок, но не другие конъюгаты полисахарид S. pneumoniae-белок другого серотипа.

В рамках изобретения термин "потери лизина" относится к расходу лизина при конъюгации, и ее определяют по разнице между средним измеренным количеством лизина в конъюгате и ожидаемым количеством лизина в исходном белке. В примере 4 описывают один из способов определения "потери лизина".

В рамках изобретения термин "полисахарид" предназначен для включения любого антигенного сахаридного элемента (или антигенной единицы), общеупотребительного в области иммунологических и бактериальных вакцин, включая, в качестве неограничивающих примеров, "сахарид", "олигосахарид", "полисахарид", "липосахарид", "липоолигосахарид (LOS)", "липополисахарид (LPS)", "гликозилат", "гликоконъюгат" и т.п.

Что касается процентных долей серотипов в иммуногенной композиции, полученной в апротонном растворителе (например, DMSO), если остальные конъюгаты полисахарид-белок получены в водных условиях, процентные доли просто относятся к количеству серотипов, полученных в апротонном растворителе, разделенному на общее количество серотипов в композиции.

В рамках изобретения все диапазоны, например, pH, температура и концентрации, должны быть инклюзивными. Например, диапазон pH от 5,0 до 9,0 предназначен для включения pH 5,0 и pH 9,0. Аналогично, диапазон температур от 4 до 25°C предназначен для включения внешних пределов диапазона, т.е. 4°C и 25°C.

Полисахарид

Капсульные полисахариды S. pneumoniae, которые можно получать способами по изобретению, т.е. посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе, включают, в качестве неограничивающих примеров, серотипы: 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F и 38. Полисахариды можно использовать в форме олигосахаридов. Их удобно получать посредством фрагментации очищенного полисахарида (например, посредством гидролиза), после которого, как правило, будут осуществлять очистку фрагментов желаемого размера.

В некоторых вариантах осуществления один или более из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F и 38 получают посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе. В некоторых аспектах пневмококковые полисахариды одного или более из серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 11A, 12F и 14 получают посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе. В некоторых аспектах пневмококковые полисахариды одного или более из серотипов 2, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 15A, 15C, 16F, 17F, 19F, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F и 38 получают посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе. В некоторых аспектах пневмококковые полисахариды из одного или обоих из серотипов 3 или 18C конъюгируют с белком-носителем посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе. Полисахариды других серотипов в мультивалентной композиции можно конъюгировать посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе или в водном растворителе. Полисахариды других серотипов в мультивалентной композиции также можно конъюгировать с использованием других химических веществ, которые могут находиться в апротонном растворителе или в водном растворителе.

Капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae можно получать стандартными способами, известными специалистам в этой области. Например, полисахариды можно выделять из бактерий и измельчать до некоторой степени известными способами (см., например, европейские патенты №№ EP497524 и EP497525), предпочтительно, посредством микрофлюидизации, осуществляемой с использованием гомогенизатора, или химического гидролиза. В одном из вариантов осуществления каждый серотип пневмококкового полисахарида выращивают в соевой среде. Затем отдельные полисахариды очищают с помощью стандартных стадий, включающих центрифугирование, осаждение и ультрафильтрацию. См., например, публикацию заявки на патент США № 2008/0286838 и патент США № 5847112. Можно измельчать полисахариды для снижения вязкости образцов полисахаридов и/или улучшения фильтруемости конъюгированных продуктов с использованием таких способов, как механическое или химическое измельчение. Химический гидролиз можно осуществлять с использованием уксусной кислоты. Механическое измельчение можно осуществлять с использованием фрагментации посредством гомогенизации высокого давления.

В некоторых вариантах осуществления очищенные полисахариды перед конъюгацией имеют молекулярную массу от 5 кДа до 4000 кДа. Молекулярную массу можно вычислять посредством эксклюзионной хроматографии (SEC) в комбинации с детектором многоуглового светорассеяния (MALS) и рефрактометрическим детектором (RI). В других таких вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 10 кДа до 4000 кДа, от 50 кДа до 4000 кДа, от 50 кДа до 3000 кДа, от 50 кДа до 2000 кДа, от 50 кДа до 1500 кДа, от 50 кДа до 1000 кДа, от 50 кДа до 750 кДа, от 50 кДа до 500 кДа, от 100 кДа до 4000 кДа, от 100 кДа до 3000 кДа, от 100 кДа до 2000 кДа, от 100 кДа до 1500 кДа, от 100 кДа до 1000 кДа, от 100 кДа до 750 кДа, от 100 кДа до 500 кДа, от 100 до 400 кДа, от 200 кДа до 4,000 кДа, от 200 кДа до 3000 кДа, от 200 кДа до 2000 кДа, от 200 кДа до 1500 кДа, от 200 кДа до 1000 кДа или от 200 кДа до 500 кДа.

Очищенные полисахариды можно химически активировать, чтобы сделать сахариды способными реагировать с белком-носителем. Очищенные полисахариды можно соединять с линкером. После активации или соединения с линкером каждый капсульный полисахарид отдельно конъюгируют с белком-носителем для получения гликоконъюгата. Конъюгаты полисахаридов можно получать известными способами присоединения.

Полисахарид можно соединять с линкером для получения промежуточного продукта полисахарид-линкер, в котором свободный конец линкера представляет собой сложноэфирную группу. Таким образом, линкер является линкером, в котором по меньшей мере один конец представляет собой сложноэфирную группу. Другой конец выбирают таким образом, чтобы он мог реагировать с полисахаридом с образованием промежуточного продукта полисахарид-линкер.

Полисахарид можно соединять с линкером с использованием первичной аминогруппы в полисахариде. В этом случае линкер, как правило, содержит сложноэфирную группу на обоих концах. Это позволяет осуществлять присоединение посредством реакции одной из сложноэфирных групп с первичной аминогруппой в полисахариде посредством нуклеофильного замещения ацила. Реакция приводит к получению промежуточного продукта полисахарид-линкер, в котором полисахарид соединен с линкером амидной связью. Таким образом, линкер является бифункциональным линкером, предоставляющим первую сложноэфирную группу для реакции с первичной аминогруппой в полисахариде и вторую сложноэфирную группу для реакции с первичной аминогруппой в молекуле носителя. Типичным линкером является N-гидроксисукцинимидный эфир адипиновой кислоты (SIDEA).

Присоединение также можно осуществлять не напрямую, т.е. с помощью дополнительного линкера, используемого для дериватизации полисахарида перед соединением с линкером.

Полисахарид соединяют с дополнительным линкером с использованием карбонильной группы на восстанавливающем конце полисахарида. Это присоединение включает две стадии: (a1) реакцию карбонильной группы с дополнительным линкером и (a2) реакцию свободного конца дополнительного линкера с линкером. В этих вариантах осуществления дополнительный линкер, как правило, содержит первичную аминогруппу на обоих концах, что, таким образом, позволяет осуществлять стадию (a1) посредством реакции первичных аминогрупп с карбонильной группой в полисахариде посредством восстановительного аминирования. Используют первичную аминогруппу, которая может реагировать с карбонильной группой в полисахариде. Для этого подходят гидразидные группы или гидроксиламиногруппы. Как правило, на обоих концах дополнительного линкера находится одна и та же первичная аминогруппа. Реакция приводит к получению промежуточного продукта полисахарид-дополнительный линкер, в котором полисахарид соединяют с дополнительным линкером с помощью связи C-N.

Полисахарид можно соединять с дополнительным линкером с использованием другой группы в полисахариде, в частности, карбоксильной группы. Это присоединение включает две стадии: (a1) реакцию группы с дополнительным линкером и (a2) реакцию свободного конца дополнительного линкера с линкером. В этом случае дополнительный линкер, как правило, содержит первичную аминогруппу на обоих концах, что, таким образом, позволяет осуществлять стадию (a1) посредством реакции одной из первичных аминогрупп с карбоксильной группой в полисахариде посредством активации EDAC. Используют первичную аминогруппу, которая может реагировать с EDAC-активированной карбоксильной группой в полисахариде. Для этого подходит гидразидная группа. Как правило, на обоих концах дополнительного линкера находится одна и та же первичная аминогруппа. Реакция приводит к получению промежуточного продукта полисахарид-дополнительный линкер, в котором полисахарид соединен с дополнительным линкером амидной связью.

В одном из вариантов осуществления химической активации полисахаридов и последующей конъюгации с белком-носителем посредством восстановительного аминирования можно достигать способами, описанными в патентах США №№ 4365170, 4673574 и 4902506, публикациях патентных заявок США №№ 2006/0228380, 2007/184072, 2007/0231340 и 2007/0184071 и публикациях международных патентных заявок №№ WO2006/110381, WO2008/079653 и WO2008/143709. Химический способ может вызывать активацию пневмококкового полисахарида посредством реакции с любым окислителем, окисляющим гидроксильную группу до альдегида, таким как периодат (включая периодат натрия, периодат калия или иодную кислоту). Реакция приводит к случайному окислительному расщеплению вицинальных гидроксильных групп углеводов с образованием реакционноспособных альдегидных групп.

В одном из вариантов осуществления полисахарид реагирует с от 0,01 до 10,0, от 0,05 до 5,0, от 0,1 до 1,0, от 0,5 до 1,0, от 0,7 до 0,8, от 0,05 до 0,5, от 0,1 до 0,3 молярными эквивалентами окислителя. В варианте осуществления полисахарид реагирует с приблизительно 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 молярными эквивалентами окислителя. Как правило, предпочтительно использовать меньшие количества периодата для активации, например, от 0,1 до 0,3 мг-экв., для достижения ограниченной активации полисахарида (например, от 0,05 до 0,22 или от 0,09 до 0,22 моль альдегида/моль повторяющейся субъединицы полисахарида). В рамках изобретения термин "уровень активации" относится к молям альдегида/моль повторяющейся субъединицы полисахарида. Меньшая активация полисахарида приводит к получению полисахарида, более похожего на нативный полисахарид, т.е. меньшее количество гидроксильные группы превращается в альдегиды.

В другом варианте осуществления продолжительность реакции окисления составляет от 1 до 50 часов, от 10 до 30 часов, от 15 до 20 часов, от 15 до 17 часов или приблизительно 16 часов.

В другом варианте осуществления температуру реакции окисления поддерживают на уровне от 15°C до 45°C, от 15°C до 30°C, от 20°C до 25°C. В другом варианте осуществления температуру реакции поддерживают на уровне приблизительно 23°C.

Присоединение к белку-носителю осуществляют посредством восстановительного аминирования с помощью прямого аминирования с использованием лизильных групп белка. Например, конъюгацию осуществляют посредством реакции смеси активированного полисахарида и белка-носителя с восстановителем, таким как цианоборогидрид натрия, в присутствии никеля. Реакцию конъюгации можно осуществлять в водном растворе или в присутствии диметилсульфоксида (DMSO). См., например, публикации патентных заявок США №№ 2015/0231270 и 2011/0195086 и европейский патент № EP0471177 B1. Затем непрореагировавшие альдегиды блокируют посредством добавления сильного восстановителя, такого как борогидрид натрия.

Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида для получения реакционноспособных альдегидов и (2) восстановления имина (шиффова основания), образующегося между активированным полисахаридом и белком-носителем, для получения стабильной связи в конъюгате с амином. Перед окислением полисахарид, необязательно, измельчают. Можно использовать механические способы (например, гомогенизацию) или химический гидролиз. Химический гидролиз можно осуществлять с использованием уксусной кислоты. Стадия окисления может включать реакцию с периодатом. В рамках изобретения термин "периодат" включает периодат и иодную кислоту; термин также включает метапериодат (IO₄^-), ортопериодат (IO₆^-) и различные периодатные соли (например, периодат натрия и периодат калия). В варианте осуществления капсульный полисахарид окисляют в присутствии метапериодата, предпочтительно, в присутствии периодата натрия (NaIO₄). В другом варианте осуществления капсульный полисахарид окисляют в присутствии ортопериодата, предпочтительно, в присутствии иодной кислоты.

В варианте осуществления окислитель является стабильным соединением с нитроксильным или нитроксидным радикалом, таким как пиперидин-N-окси- или пирролидин-N-оксисоединения, в присутствии окислителя для селективного окисления первичных гидроксилов (как описано в WO 2014/097099). В указанной реакции конкретным окислителем является соль N-оксоаммония в катализаторном цикле. В одном из аспектов указанное стабильное соединение с нитроксильным или нитроксидным радикалом представляет собой пиперидин-N-окси- или пирролидин-N-оксисоединения. В одном из аспектов указанное стабильное соединение с нитроксильным или нитроксидным радикалом несет остаток TEMPO (2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилоксигруппу) или PROXYL (2,2,5,5-тетраметил-1-пирролидинилоксигруппу). В одном из аспектов указанное стабильное соединение с нитроксильным радикалом представляет собой TEMPO или его производное. В одном из аспектов указанный окислитель представляет собой молекулу, несущую остаток N-галогена. В одном из аспектов указанный окислитель выбран из группы, состоящей из N-хлорсукцинимида, N-бромсукцинимида, N-иодсукцинимида, дихлоризоциануровой кислоты, 1,3,5-трихлор-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона, дибромизоциануровой кислоты, 1,3,5-трибром-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона, дииодизоциануровой кислоты и 1,3,5-трииод-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона.

В некоторых аспектах окислитель представляет собой свободный 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидиниокси-радикал (TEMPO), и в качестве соокислителя используют N-хлорсукцинимид (NCS) (как описано в публикации международной заявки на патент № WO2014/097099). Таким образом, в одном из аспектов гликоконъюгаты S. pneumoniae получают способом, включающим стадии: a) реакции сахарида с 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилоксигруппой (TEMPO) и N-хлорсукцинимидом (NCS) в водном растворителе для получения активированного сахарида и b) реакцию активированного сахарида с белком-носителем, содержащим одну или более аминогрупп (указанный способ далее обозначают как "TEMPO/NCS-восстановительное аминирование").

Необязательно, реакцию окисления гасят посредством добавления гасителя. Гаситель можно выбирать из вицинальных диолов, 1,2-аминоспиртов, аминокислот, глутатиона, сульфита, бисульфатов, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфористой кислоты, глицерина, этиленгликоля, пропан-1,2-диола, бутан-1,2-диола или бутан-2,3-диола, аскорбиновой кислоты.

Второй стадией способа конъюгации является восстановление иминовой (шиффово основание) связи между активированным полисахаридом и белком-носителем для получения стабильной связи в конъюгате (так называемое восстановительное аминирование) с использованием восстановителя. Подходящие восстановители включают цианоборогидриды (такие как цианоборогидрид натрия или борогидрид натрия). В одном из вариантов осуществления восстановителем является цианоборогидрид натрия.

В некоторых вариантах осуществления способов по изобретению реакцию восстановительного аминирования осуществляют в апротонном растворителе (или смеси апротонных растворителей). В варианте осуществления реакцию восстановления осуществляют в растворителе DMSO или DMF (диметилформамиде). Растворитель DMSO или DMF можно использовать для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, если они лиофилизированы. В одном из вариантов осуществления апротонным растворителем является DMSO.

В конце реакции восстановления могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы в конъюгатах, которые можно блокировать с использованием подходящего блокирующего средства. В одном из вариантов осуществления этим блокирующим средством является борогидрид натрия (NaBH₄). Подходящие альтернативы включают триацетоксиборогидрид натрия или борогидрид натрия или цинка в присутствии кислоты Брэнстеда или кислоты Льюиса, аминобораны, такие как пиридин-боран, 2-пиколин-боран, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, t-BuMe'PrN-BH₃, бензиламин-BH₃, 5-этил-2-метилпиридин-боран (PEMB) или борогидридная ионообменная смола. После конъюгации (реакции восстановления и, необязательно, блокирования) гликоконъюгаты можно очищать (обогащать в отношении количества конъюгата полисахарид-белок) различными способами, известными специалисту в этой области. Эти способы включают диализ, способы концентрирования/диафильтрации, тангенциальную фильтрацию, осаждение/элюцию, хроматографию на колонках (ионообменную хроматографию, мультимодальную ионообменную хроматографию, DEAE или хроматографию гидрофобных взаимодействий) и глубинную фильтрацию. В варианте осуществления гликоконъюгаты очищают посредством диафильтрации, или ионообменной хроматографии, или эксклюзионной хроматографии.

Гликоконъюгаты, полученные посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе, как правило, используют в мультивалентных вакцинах с пневмококковым конъюгатом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в случае мультивалентных композиций, в которых не все серотипы получают в апротонном растворителе, реакцию восстановления остальных серотипов осуществляют в водном растворителе (например, выбранном из PBS (фосфатно-солевого буфера), MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты), HEPES, (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), бис-трис, ADA (N-(2-ацетамидо)иминодиуксусной кислоты), PIPES (пиперазин-N,N′-bis(2-этансульфоновой кислоты)), MOPSO (3-морфолино-2-гидроксипропансульфоновой кислоты), BES (N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты), DIPSO (3-бис(2-гидроксиэтил)амино-2-гидроксипропан-1-сульфоновой кислоты), MOBS (4-(N-морфолино)бутансульфоновой кислоты), HEPPSO (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N-(2-гидроксипропансульфоновой кислоты)), POPSO (пиперазин-1,4-бис(2-гидрокси-3-пропансульфоновой кислоты)), TEA (триэтаноламина), EPPS (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-пропансульфоновой кислоты), бицина или HEPB при pH от 6,0 до 8,5, от 7,0 до 8,0, или от 7,0 до 7,5).

В некоторых вариантах осуществления гликоконъюгаты по настоящему изобретению содержат полисахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 10000 кДа. В других таких вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 25 кДа до 5000 кДа. В других таких вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В других таких вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В других таких вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа. В других таких вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 200 кДа до 600 кДа. В дополнительных таких вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 1000 кДа, от 100 кДа до 900 кДа, от 100 кДа до 800 кДа, от 100 кДа до 700 кДа, от 100 кДа до 600 кДа, от 100 кДа до 500 кДа, от 100 кДа до 400 кДа, от 100 кДа до 300 кДа, от 150 кДа до 1000 кДа, от 150 кДа до 900 кДа, от 150 кДа до 800 кДа, от 150 кДа до 700 кДа, от 150 кДа до 600 кДа, от 150 кДа до 500 кДа, от 150 кДа до 400 кДа, от 150 кДа до 300 кДа, от 200 кДа до 1000 кДа, от 200 кДа до 900 кДа, от 200 кДа до 800 кДа, от 200 кДа до 700 кДа, от 200 кДа до 600 кДа, от 200 кДа до 500 кДа, от 200 кДа до 400 кДа, от 200 кДа до 300 кДа, от 250 кДа до 1000 кДа, от 250 кДа до 900 кДа, от 250 кДа до 800 кДа, от 250 кДа до 700 кДа, от 250 кДа до 600 кДа, от 250 кДа до 500 кДа, от 250 кДа до 400 кДа, от 250 кДа до 350 кДа, от 300 кДа до 1000 кДа, от 300 кДа до 900 кДа, от 300 кДа до 800 кДа, от 300 кДа до 700 кДа, от 300 кДа до 600 кДа, от 300 кДа до 500 кДа, от 300 кДа до 400 кДа, от 400 кДа до 1000 кДа, от 400 кДа до 900 кДа, от 400 кДа до 800 кДа, от 400 кДа до 700 кДа, от 400 кДа до 600 кДа, от 500 кДа до 600 кДа.

В некоторых вариантах осуществления гликоконъюгаты по настоящему изобретению имеют молекулярную массу от 1000 кДа до 10000 кДа. В других таких вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 7000 кДа. В других таких вариантах осуществления полисахарид имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 6000 кДа.

В некоторых вариантах осуществления реакцию конъюгации осуществляют посредством восстановительного аминирования, где никель используют для большей эффективности реакции конъюгации и для облегчения удаления свободного цианида. Известно, что переходные металлы образуют стабильные комплексы с цианидом и улучшают восстановительное метилирование аминогрупп белка и формальдегида при использовании цианоборогидрида натрия (S Gidley et al., Biochem J. 1982, 203: 331-334; Jentoft et al. Anal Biochem. 1980, 106: 186-190). Благодаря комплексированию остаточного ингибиторного цианида, добавление никеля повышает расход белка при конъюгации и приводит к образованию более крупных, потенциально более иммуногенных конъюгатов.

Различия в исходных уровнях цианида в партиях реагента цианоборогидрида натрия также приводят к нестабильным показателям конъюгации, что приводит к непостоянным характеристикам продукта, таким как размер конъюгата и соотношение полисахарида и CRM₁₉₇ в конъюгате. Добавление никеля снижало непостоянство конъюгации благодаря комплексированию цианида, устраняя различия в партиях цианоборогидрида натрия.

Подходящие альтернативные химические реакцию включают активацию сахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Таким образом, активированный сахарид можно соединять с аминогруппой на белке-носителе напрямую или с помощью спейсерной (линкерной) группы. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин для получения тиолированного полисахарида, который можно соединять с носителем с помощью тиоэфирной связи, получаемой после реакции с малеимид-активированным белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием иодацетимида [например, этилиодацетимида HCl] или N-сукцинимидилбромацетата или SIAB, или SIA, или SBAP). Например, цианатный сложный эфир (необязательно, полученный с помощью CDAP) соединяют с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH) и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с использованием реакции с карбодиимидом (например, EDAC или EDC) через карбоксильную группу на белке-носителе. Такие конъюгаты описывают в публикациях международных патентных заявок №№ WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/29094; и Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245-256.

В других подходящих способах используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, p-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S--NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который можно получать с помощью реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (См. Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18) с последующей реакцией с белком для получения карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательное присоединение/снятие защитных групп для первичной гидроксильной группы, реакцию первичной гидроксильной группы с CDI с получением CDI-карбаматного промежуточного продукта и соединения CDI-карбаматного промежуточного продукта с аминогруппой на белке.

После конъюгации капсульного полисахарида с белком-носителем конъюгаты полисахарид-белок очищают (обогащают в отношении количества конъюгата полисахарид-белок) одним или более из различных способов. Примеры этих способов хорошо известны специалистам в этой области и включают способы концентрирования/диафильтрации, ультрафильтрацию, осаждение/элюцию, хроматографию на колонках и глубинную фильтрацию. См., например, патент США № 6146902.

Гликоконъюгаты по изобретению также можно характеризовать по количеству остатков лизина в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), конъюгированных с сахаридом, которое можно охарактеризовать как диапазон конъюгированных лизинов (степень конъюгации). Признаки модификации лизина в белке-носителе по причине ковалентного соединения с полисахаридами можно определять посредством анализа аминокислот общепринятыми способами, известными специалистам в этой области. Конъюгация приводит к снижению количества восстановленных остатков лизина по сравнению с исходным материалом белка-носителя, используемого для получения материалов конъюгатов. В варианте осуществления степень конъюгации гликоконъюгата по изобретению составляет от 2 до 18, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 18, от 5 до 13, от 7 до 18, от 7 до 13, от 8 до 18, от 8 до 13, от 10 до 18 или от 10 до 13. В варианте осуществления степень конъюгации гликоконъюгата по изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15. В варианте осуществления степень конъюгации гликоконъюгата по изобретению составляет от 7 до 18. В некоторых таких вариантах осуществления белком-носителем является CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты по изобретению также можно охарактеризовывать по соотношению (масс./масс.) сахарида и белка-носителя. В некоторых вариантах осуществления соотношение полисахарида и белка-носителя в гликоконъюгате (масс./масс.) составляет от 0,5 до 3,0 (например, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9 или приблизительно 3,0). В других вариантах осуществления соотношение сахарида и белка-носителя (масс./масс.) составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,8 до 1,2, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5 или от 1,0 до 2,0. В дополнительных вариантах осуществления соотношение сахарида и белка-носителя (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,2. В варианте осуществления соотношение капсульного полисахарида и белка-носителя в конъюгате составляет от 0,9 до 1,1. В некоторых таких вариантах осуществления белком-носителем является CRM₁₉₇. Гликоконъюгаты и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать свободный сахарид, не конъюгированный ковалентно с белком-носителем, но все равно присутствующий в композиции гликоконъюгата. Свободный сахарид может быть нековалентно связан (т.е. нековалентно связан, адсорбирован или захвачен) с гликоконъюгатом.

В варианте осуществления гликоконъюгат содержит менее приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или 15% свободного полисахарида относительно общего количества полисахарида. В варианте осуществления гликоконъюгат содержит менее приблизительно 25% свободного полисахарида относительно общего количества полисахарида. В варианте осуществления гликоконъюгат содержит менее приблизительно 20% свободного полисахарида относительно общего количества полисахарида. В варианте осуществления гликоконъюгат содержит менее приблизительно 15% свободного полисахарида относительно общего количества полисахарида.

Мультивалентные вакцины с конъюгатом полисахарид-белок

Мультивалентные пневмококковые иммуногенные композиции могут содержать капсульные полисахариды серотипа S. pneumoniae, выбранного из по меньшей мере одного из 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F и 38, конъюгированные с одним или более белками-носителями, где полисахарид по меньшей мере одного серотипа получают посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе, таком как DMSO. Настоящее изобретение включает мультивалентные пневмококковые иммуногенные композиции, содержащие полисахариды по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 серотипов. Предпочтительно, сахариды конкретного серотипа не конъюгированы с несколькими белками-носителями.

В некоторых вариантах осуществления полисахариды по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 серотипов получают посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе, таком как DMSO.

В некоторых вариантах осуществления один или более из серотипов 3, 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F или 23F получают посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе. В некоторых аспектах этого варианта изобретения один или оба из серотипов 3 или 18C получают посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% серотипов в мультивалентной композиции получают в апротонном растворителе. Остальные серотипы получают с использованием альтернативной реакции и/или в водном растворителе.

В некоторых вариантах осуществления один или более из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 9V, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35A, 35B, 35F и 38 получают посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе. В некоторых аспектах один или более из серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 11A, 12F и 14 получают посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе. В некоторых аспектах один или более из серотипов 2, 6C, 6D, 7B, 7C, 8, 9N, 15A, 15C, 16F, 17F, 19F, 20, 21, 22A, 23A, 23B, 24F, 27, 28A, 31, 34, 35B, 35F и 38 получают посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе.

В одном из вариантов осуществления мультивалентная композиция состоит из полисахаридов серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F, полученных посредством восстановительного аминирования в апротонном растворителе, таком как DMSO, и полисахаридов серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F, полученных посредством восстановительного аминирования в водном растворителе.

После очистки отдельных гликоконъюгатов, их смешивают для составления иммуногенной композиции по настоящему изобретению. Эти пневмококковые конъюгаты получают отдельными способами и составляют совместно в стандартной лекарственной форме.

Белок-носитель

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения CRM₁₉₇ используют в качестве белка-носителя. CRM₁₉₇ является нетоксичным вариантом (т.е. анатоксином) дифтерийного токсина. В одном из вариантов осуществления его выделяют из культур Corynebacterium diphtheria штамма C7 (β197), выращенных в среде на основе казаминовых кислот и дрожжевого экстракта. В другом варианте осуществления CRM₁₉₇ получают рекомбинантно способами, описанными в патенте США № 5614382. Как правило, CRM₁₉₇ очищают с помощью комбинации ультрафильтрации, осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления CRM₁₉₇ получают в Pseudomonas fluorescens с использованием технологии Pfenex Expression Technology™ (Pfenex Inc., San Diego, CA).

Другие подходящие белки-носители включают дополнительные инактивированные бактериальные токсины, такие как DT (дифтерийный анатоксин) или фрагмент B DT (DTFB), TT (столбнячный анатоксин) или фрагмент C TT, коклюшный анатоксин, холерный анатоксин (например, как описано, в публикации международной заявки на патент № WO 2004/083251), E. coli LT, E. coli ST и экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa. Также можно использовать бактериальные белки наружной мембраны, такие как комплекс белков наружной мембраны c (OMPC), порины, трансферрин-связывающие белки, пневмококковый поверхностный белок A (PspA; см. публикацию международной заявки на патент № WO 02/091998), пневмококковый белок адгезин (PsaA), пептидаза C5a стрептококков группы A или группы B или белок D Haemophilus influenzae, пневмококковый пневмолизин (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13), включая ply, детоксифицированный каким-либо образом, например dPLY-GMBS (см. публикацию международной заявки на патент № WO 04/081515) или dPLY-формол, PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE и продукты слияния белков Pht, например, продукты слияния PhtDE, продукты слияния PhtBE (см. публикации международных патентных заявок №№ WO 01/98334 и WO 03/54007). В качестве белков-носителей также можно использовать другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин морского блюдца (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или очищенный белковый дериват туберкулина (PPD), PorB (из N. meningitidis), PD (белок D Haemophilus influenzae; см., например, европейский патент № EP0594610 B) или их иммунологические функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (см. европейские патенты №№ EP0378881 и EP0427347), белки теплового шока (см. публикации международных патентных заявок №№ WO 93/17712 и WO 94/03208), белки коклюшной палочки (см. публикацию международной заявки на патент № WO 98/58668 и европейский патент № EP0471177), цитокины, лимфокины, факторы роста или гормоны (см. публикацию международной заявки на патент № WO 91/01146), искусственные белки, содержащие множество эпитопов CD4+ T-клеток человека их различных антигенов, полученных из патогенов (см. Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824), такие как белок N19 (см. Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884-7), белки захвата железа (см. публикацию международной заявки на патент № WO 01/72337), токсин A или B C. difficile (см. публикацию международной заявки на патент № WO 00/61761) и флагеллин (см. Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9).

В качестве второго белка-носителя можно использовать других мутантов DT, таких как CRM₁₇₆, CRM₂₂₈, CRM₄₅ (Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM₉, CRM₄₅, CRM₁₀₂, CRM₁₀₃ и CRM₁₀₇ и другие мутанты, описанные в Nicholls and Youle, Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; варианты с делецией или мутацией Glu-148 в Asp, Gln или Ser и/или Ala 158 в Gly и другими мутациями, описанными в патенте США № 4709017 или патенте США № 4950740; варианты с мутацией по меньшей мере одного или более из остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и другими мутациями, описанными в патенте США № 5917017 или патенте США № 6455673; или фрагмент, описанный в патенте США № 5843711. Такие мутанты DT также можно использовать для получения вариантов DTFB, содержащих фрагмент B, содержащий области эпитопов.

При использовании мультивалентных вакцин можно использовать второй носитель для одного или более из антигенов в мультивалентной вакцине. Второй белок-носитель, предпочтительно, является нетоксичным и нереактогенным белком, который можно получать в достаточном количестве и с достаточной чистотой. Второй белок-носитель также конъюгируют или соединяют с антигеном, например, полисахаридом S. pneumoniae, для повышения иммуногенности антигена. Белки-носители должны подходить для стандартных способов конъюгации. В одном из вариантов осуществления каждый капсульный полисахарид, неконъюгированный с первым белком-носителем, конъюгируют с тем же вторым белком-носителем (например, каждую молекулу капсульного полисахарида конъюгируют с одним белком-носителем). В другом варианте осуществления капсульные полисахариды, неконъюгированные с первым белком-носителем, конъюгируют с двумя или более белками-носителями (каждую молекулу капсульного полисахарида конъюгируют с одним белком-носителем). В таких вариантах осуществления каждый капсульный полисахарид одного серотипа, как правило, конъюгируют с одним белком-носителем.

Фармацевтические/вакцинные композиции

Настоящее изобретение дополнительно относится к композициям, включая фармацевтические, иммуногенные и вакцинные композиции, содержащим, по существу состоящим или, альтернативно, состоящим из любых комбинаций серотипов полисахаридов, описанных выше, вместе с фармацевтически приемлемым носителем и адъювантом.

Составление конъюгатов полисахарид-белок по настоящему изобретению можно осуществлять способами, известными в этой области. Например, для получения композиции отдельные пневмококковые конъюгаты можно составлять с физиологически приемлемым носителем. Неограничивающие примеры таких носителей включают воду, забуференный физиологический раствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и растворы декстрозы.

В варианте осуществления вакцинную композицию составляют в L-гистидиновом буфере с хлоридом натрия.

В рамках изобретения "адъювант" является веществом, используемым для повышения иммуногенности иммуногенной композиции по изобретению. Иммунологический адъювант может повышать иммунный ответ на антиген, являющийся слабоиммуногенным при введении в отдельности, например, неиндуцирующим или индуцирующим низкие титры антител или клеточно-опосредованный иммунный ответ, повышать титры антител против антигена и/или позволять снижать дозу антигена, являющуюся эффективной для достижения иммунного ответа у индивидуума. Таким образом, адъюванты зачастую вводят для усиления иммунного ответа, и они хорошо известны специалистам в этой области. Подходящие адъюванты для повышения эффективности композиции включают, в качестве неограничивающих примеров:

(1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.д.;

(2) составы эмульсий "масло-в-воде" (с другими конкретными иммуностимулирующими средствами, такими как мурамилпептиды (определенные ниже) или компоненты бактериальной клеточной стенки, или без них), такие как, например, (a) MF59 (публикация международной заявки на патент № WO 90/14837), содержащий 5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85 (необязательно, содержащий различные количества MTP-PE), составленный в субмикронных частицах с использованием микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, содержащий 10% сквалена, 0,4% Tween 80, 5% блок-сополимер плюроник L121 и thr-MDP, микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию или перемешанный на вортексе для получения эмульсии с более крупными частицами, (c) адъювантная система Ribi™ (RAS) (Corixa, Hamilton, MT), содержащая 2% сквалена, 0,2% Tween 80 и один или более компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, состоящей из 3-O-деацилированного монофосфорил-липида A (MPL™), описанного в патенте США № 4912094, димиколята трегалозы (TDM) и цитоскелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно - MPL+CWS (Detox™); и (d) монтанид ISA;

(3) можно использовать сапониновые адъюванты, такие как Quil A или STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (см., например, патент США № 5057540) или частицы, полученные из них, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы, полученные посредством комбинирования холестерина, сапонина, фосфолипида и амфипатических белков) и Iscomatrix^® (имеющий, по существу, ту же структуру, что и ISCOM, но без белка);

(4) бактериальные липополисахариды, синтетические аналоги липида A, такие как соединения аминоалкилглюкозамин-фосфата (AGP) или их производные или аналоги, доступные в Corixa и описанные в патенте США № 6113918; одним таким AGP является 2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]этил-2-дезокси-4-O-фосфоно-3-O-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3--тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид, также известный как 529 (ранее известный как RC529), составленный в водной форме или стабильной эмульсии;

(5) синтетические полинуклеотиды, такие как олигонуклеотиды, содержащие CpG-мотивы (патент США № 6207646);

(6) цитокины, такие как интерлейкины (например, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18 и т.д.), интерфероны (например, интерферон гамма), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-КСФ), фактор некроза опухоли (ФНО), костимуляторные молекулы B7-1 и B7-2 и т.д.; и

(7) компонент комплемента, такой как тример компонента комплемента C3d.

В другом варианте осуществления адъювант представляет собой смесь 2, 3 или более из указанных выше адъювантов, например, SBAS2 (эмульсию "масло-в-воде", также содержащую 3-деацилированный момнофосфорил-липид A и QS21).

Мурамилпептиды включают, в качестве неограничивающих примеров, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (MTP-PE) и т.д.

В некоторых вариантах осуществления адъювант является солью алюминия. Адъювант на основе соли алюминия может являться осажденной квасцами вакциной или адсорбированной на квасцах вакциной. Адъюванты на основе соли алюминия хорошо известны в этой области и описаны, например, в Harlow, E. and D. Lane (1988; Антитела: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) и Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493). Соль алюминия включает, в качестве неограничивающих примеров, гидроксид алюминия, гидрат оксида алюминия, тригидрат оксида алюминия (ATH), гидрат алюминия, тригидрат алюминия, Alhydrogel, Superfos, Amphogel, гидроксид алюминия (III), гидроксифосфат-сульфат алюминия, адъювант на основе фосфата алюминия (APA), аморфный оксид алюминия, тригидрат оксида алюминия или тригидроксид алюминия.

APA представляет собой водную суспензию гидроксифосфата алюминия. APA производят посредством смешивания хлорида алюминия и фосфата натрия в объемном соотношении 1:1 для осаждения гидроксифосфата алюминия. После смешивания измельчают с помощью смесителя с высоким усилием сдвига для получения монодисперсного распределения размера частиц. Затем продукт подвергают диафильтрации против физиологического раствора и стерилизуют паром.

В некоторых вариантах осуществления коммерчески доступный Al(OH)₃ (например, Alhydrogel или Superfos Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY) используют для адсорбции белков в соотношении 50-200 г белка/мг гидроксида алюминия. В другом варианте осуществления адсорбция белка зависит от pI (изоэлектрической точки) белка и pH среды. Белок с более низкой pI адсорбируется к положительно заряженному иону алюминия сильнее, чем белок с более высокой pI. Соли алюминия могу образовывать депо для антигена, медленно высвобождающегося в течение 2-3 недель, вовлечены в неспецифическую активацию макрофагов и активацию комплемента и/или стимулируют механизм врожденного иммунитета (возможно, посредством стимуляции образования мочевой кислоты). См., например, Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23.

Моновалентные крупные водные конъюгаты, как правило, смешивают и разбавляют до целевой концентрации 8 мкг/мл для всех серотипов, кроме 6B, который будут разводить до целевой концентрации 16 мкг/мл. После разведения партию будут стерилизовать фильтрацией и асептически добавлять равный объем адъюванта фосфата алюминия до целевой конечной концентрации алюминия 250 мкг/мл. Составленной партией с адъювантом будут наполнять одноразовые флаконы в количестве 0,5 мл/дозу.

В некоторых вариантах осуществления адъювантом является CpG-содержащая нуклеотидная последовательность, например, CpG-содержащий олигонуклеотид, в частности, CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (CpG ODN). В другом варианте осуществления адъювантом является ODN 1826, который можно приобретать в Coley Pharmaceutical Group.

"CpG-содержащий нуклеотид", "CpG-содержащий олигонуклеотид", "CpG-олигонуклеотид" и схожие термины относятся к молекуле 6-50 нуклеотидов в длину, содержащей неметилированный остаток CpG. См., например, Wang et al., 2003, Vaccine 21:4297. В другом варианте осуществления подразумевают любое другое принятое в этой области определение терминов. CpG-содержащие олигонуклеотиды включают модифицированные олигонуклеотиды, в которых используют любые синтетические межнуклеозидные связи, модифицированные основания и/или модифицированный сахар.

Способы использования CpG-олигонуклеотидов хорошо известны в этой области и описаны, например, в Sur et al., 1999, J Immunol. 162:6284-93; Verthelyi, 2006, Metods Mol Med. 127:139-58; и Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110.

Введение/дозировка

Композиции и составы по настоящему изобретению можно использовать для профилактики или лечения человека, подверженного инфекциям, например, пневмококковой инфекции, посредством введения вакцины системным или чрезслизистым путем. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу индукции иммунного ответа на конъюгат капсульного полисахарида S. pneumoniae, включающему введение человеку иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вакцинации человека против пневмококковой инфекции, включающему стадию введения человеку иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по настоящему изобретению.

Оптимальные количества компонентов для конкретной вакцины можно определять с помощью стандартных исследований, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у индивидуумов. Например, в другом варианте осуществления дозу для вакцинации человека определяют посредством экстраполяции данных исследований на животных на данные для людей. В другом варианте осуществления дозу определяют эмпирически. Авторы настоящего изобретения показали, что вакцина является иммуногенной, с помощью данных для новорожденных макак-резусов.

Термин "эффективное количество" композиции по изобретению относится к дозе, необходимой для того, чтобы вызвать образование антител, значительно снижающих вероятность или степень инфективности микроорганизма, например, S. pneumoniae, при последующей стимуляции антигеном.

Способы по изобретению можно использовать для профилактики и/или уменьшения первичных клинических синдромов, вызванных микроорганизмами, например, S. pneumoniae, включая инвазивные инфекции (менингит, пневмонию и бактериемию) и неинвазивные инфекции (острый отит среднего уха и синусит).

Введение композиций по изобретению может включать один или более из: инъекции внутримышечным, интраперитонеальным, внутрикожным или подкожным путями или чрезслизистого введения в ротовую полость/пищеварительный, респираторный или мочеполовой тракты. В одном из вариантов осуществления для лечения пневмонии или отита среднего уха используют интраназальное введение (т.к. можно осуществлять более эффективную профилактику назофарингеального носительства пневмококков, таким образом, ослабляя инфекцию на самой ранней стадии).

Количество конъюгата в каждой дозе вакцины выбирают как количество, вызывающее иммунопротективный ответ без значительных неблагоприятных эффектов. Такое количество может варьироваться в зависимости от серотипа пневмококка. В основном, в случае конъюгатов на основе полисахаридов каждая доза будет содержать от 0,1 до 100 мкг каждого полисахарида, в частности, от 0,1 до 10 мкг и более конкретно - от 1 до 5 мкг. Например, каждая доза может содержать 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 или 750 нг или 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мкг.

Оптимальные количества компонентов для конкретной вакцины можно определять с помощью стандартных исследований, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у индивидуумов. Например, в другом варианте осуществления дозу для вакцинации человека определяют посредством экстраполяции данных исследований на животных на данные для людей. В другом варианте осуществления дозу определяют эмпирически.

В одном из вариантов осуществления доза соли алюминия составляет 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 или 700 мкг или 1, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 мг или более. В еще одном варианте осуществления дозу соли алюминия, описанную выше, определяют на мкг рекомбинантного белка.

В любом из способов по настоящему изобретению и в одном из вариантов осуществления индивидуум является человеком. В некоторых вариантах осуществления человек является новорожденным (возрастом менее 1 года), ребенком ясельного возраста (приблизительно от 12 до 24 месяцев) или ребенком младшего возраста (приблизительно от 2 до 5 лет). В других вариантах осуществления человек является пожилым индивидуумом (например, возрастом >50 лет или >65 лет). Композиции по настоящему изобретению также подходят для использования в отношении детей большего возраста, подростков и взрослых (например, возрастом от 18 до 45 лет или от 18 до 65 лет).

В одном из вариантов осуществления способов по настоящему изобретению композицию по настоящему изобретению вводят в виде одной вакцинации. В другом варианте осуществления вакцину вводят два, три или четыре или более раз с достаточными временными интервалами. Например, композицию можно вводить с интервалами 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев или любой их комбинации. Схема иммунизации может соответствовать схемам, предназначенным для пневмококковых вакцин. Например, общепринятая схема для новорожденных и детей ясельного возраста против инвазивного заболевания, вызванного S. pneumoniae, представляет собой введение в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев. Таким образом, в варианте осуществления композицию вводят в виде последовательности 4 доз в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

Композиции по настоящему изобретению также могут включать один или более белков S. pneumoniae. Примеры белков S. pneumoniae, подходящих для включения в композиции, включают белки, определенные в публикациях международных патентных заявок №№ WO 02/083855 и WO 02/053761.

Составы

Композиции по изобретению можно вводить индивидууму одним или более способами, известными специалисту в этой области, такими как парентеральный, чрезкожный, трансдермальный, внутримышечный, внутривенный, внутрикожный, интраназальный, подкожный, интраперитонеальный путь, и составлять соответствующим образом.

В одном из вариантов осуществления композиции по настоящему изобретению вводят посредством эпидермальной инъекции жидкого препарата, внутримышечной инъекции, внутривенной, внутриартериальной, подкожной инъекции или инъекции в слизистые оболочки дыхательных путей. Жидкие составы для инъекции включают растворы и т.п.

Композицию по изобретению можно составлять в одноразовых флаконах, многоразовых флаконах или предварительно наполненных шприцах.

В другом варианте осуществления композиции по настоящему изобретению вводят перорально и, таким образом, составляют в форме, подходящей для перорального введения, т.е. в виде твердого или жидкого препарата. Твердые пероральные составы включают таблетки, капсулы, пилюли, гранулы, пеллеты и т.п. Жидкие пероральные составы включают растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, масла и т.п.

Фармацевтически приемлемые носители для жидких составов являются водными или неводными растворами, суспензиями, эмульсиями или маслами. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и забуференные среды. Примерами масел являются масла животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, оливковое масло, подсолнечное масло, рыбий жир, жир других морских животных или липид из молока или яиц.

Фармацевтическая композиция может являться изотонической, гипотонической или гипертонической. Однако, зачастую предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция для инфузии или инъекции являлась, по существу, изотонической при ее введении. Таким образом, в случае хранения фармацевтическая композиция, предпочтительно, может являться изотонической или гипертонической. Если фармацевтическая композиция является гипертонической при хранении, ее можно разбавлять перед введением так, чтобы она стала изотоническим раствором.

Изотоническое средство может являться ионным изотоническим средством, таким как соль, или неионным изотоническим средством, таким как углевод. Неограничивающие примеры ионных изотонических средств включают NaCl, CaCl₂, KCl и MgCl₂. Неограничивающие примеры неионных изотонических средств включают маннит, сорбит и глицерин.

Также предпочтительно, по меньшей мере одна фармацевтически приемлемая добавка является буфером. Для некоторых целей, например, если фармацевтическая композиция предназначена для инфузии или инъекции, зачастую желательно, чтобы композиция содержала буфер, с помощью которого можно забуферивать раствор до pH в диапазоне от 4 до 10, таком как от 5 до 9, например, от 6 до 8.

Буфер, например, можно выбирать из группы, состоящей из Трис, ацетатного, глутаматного, лактатного, малеатного, тартратного, фосфатного, цитратного, карбонатного, глицинатного, гистидинового, глицинового, сукцинатного и триэтаноламинового буфера.

Кроме того, буфер, например, можно выбирать из USP-совместимых буферов для парентерального использования, в частности, если фармацевтический состав предназначен для парентерального использования. Например, буфер можно выбирать из группы, состоящей из моноосновных кислот, таких как уксусная, бензойная, глюконовая, глицериновая и молочная кислоты; двухосновных кислот, таких как аконитовая, адипиновая, аскорбиновая, угольная, глутаминовая, яблочная, янтарная и винная кислоты, многоосновных кислот, таких как лимонная и фосфорная кислоты; и оснований, таких как аммиак, диэтаноламин, глицин, триэтаноламин и Трис.

Парентеральные носители (для подкожной, внутривенной, внутриартериальной или внутримышечной инъекции) включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера и жирные масла. Внутривенные носители включают жидкости и добавки питательных веществ, добавки электролитов, такие как добавки на основе декстрозы Рингера, и т.п. Примерами являются стерильные жидкости, такие как вода и масла с добавлением поверхностно-активного вещества и других фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ или без них. В основном, предпочтительными жидкими носителями, в частности, для инъецируемых раствором, являются вода, физиологический раствор, водный раствор декстрозы и растворы родственных сахаров, гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, полисорбат 80 (PS-80), полисорбат 20 (PS-20) и полоксамер 188 (P188). Примерами масел являются масла животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, оливковое масло, подсолнечное масло, рыбий жир, жир других морских животных или липид из молока или яиц.

Составы по изобретению также могут содержать поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активные вещества включают, в качестве неограничивающих примеров: поверхностно-активные вещества на основе сложных эфиров полиоксиэтилена и сорбитана (как правило, обозначаемые как Tween), в частности, PS-20 и PS-80; сополимеры этиленоксида (EO), пропиленоксида (PO) и/или бутиленоксида (BO), продаваемые под торговым названием DOWFAX™, такие как линейные блок-сополимеры EO/PO; октоксинолы, число повторяющихся этоксигрупп (окси-1,2-этандиил) в которых может варьироваться, при этом октоксинол-9 (Triton X-100, или t-октилфеноксиполиэтоксиэтанол) представляет особенный интерес; (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); нонилфенолэтоксилаты, такие как серия Tergitol™ NP; простые эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот, полученные из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как поверхностно-активные вещества Brij), такие как монолауриловый простой эфир триэтиленгликоля (Brij 30); и сложные эфиры сорбитана (известные как SPAN), такие как сорбитантриолеат (Span 85) и сорбитанмонолаурат. Предпочтительным поверхностно-активным веществом для включения в эмульсию является PS-80.

Можно использовать смеси поверхностно-активных веществ, например, смеси PS-80/Span 85. Также для этого подходит комбинация сложного эфира полиоксиэтилена и сорбитана, такого как полиоксиэтилен сорбитан моноолеат (PS-80), и октоксинола, такого как t-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Triton X-100). Другая комбинация, которую можно использовать, содержит сложный эфир полиоксиэтилена и сорбитана laureth-9 plus и/или октоксинол.

Предпочтительные количества поверхностно-активных веществ (% по массе) составляют: сложные эфиры полиоксиэтилена и сорбитана (такие как PS-80) - от 0,01 до 1%, в частности, приблизительно 0,1%; октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (такие как Triton X-100 или другие детергенты серии Triton) - от 0,001 до 0,1%, в частности, от 0,005 до 0,02%; простые эфиры полиоксиэтилена (такие как laureth-9) - от 0,1 до 20%, предпочтительно - от 0,1 до 10% и, в частности, от 0,1 до 1% или приблизительно 0,5%.

В некоторых вариантах осуществления композиция состоит, по существу, из гистидина (20 мМ), физиологического раствора (150 мМ) и 0,02% PS-20 или 0,04% PS-80 при pH 5,8 с 250 мкг/мл APA (адъюванта фосфата алюминия). Количество PS-20 может находиться в диапазоне от 0,005% до 0,1% (масс./об.), при этом наличие PS-20 или PS-80 в составе позволяет контролировать агрегацию при имитации производства и транспортировке с использованием первичной упаковки. Способ состоит из комбинирования смеси до 24 серотипов в гистидине, физиологическом растворе и PS-20 или PS-80, а затем комбинирования этого смешанного материала с APA и физиологическим раствором с антимикробными консервантами или без них.

Для различных лекарственных продуктов и лекарственных веществ может потребоваться оптимизация выбора поверхностно-активного вещества. В случае мультивалентных вакцин, содержащих 15 или более серотипов, предпочтительными являются PS-20 и P188. Выбор химической реакции, используемой для получения конъюгата, также может играть важную роль в стабилизации состава. В частности, обнаружено, что если реакции конъюгации, используемые для получения различных конъюгатов полисахарид-белок в мультивалентной композиции, включают использование водного растворителя и растворителя DMSO, конкретные системы поверхностно-активных веществ приводят к значительным различиям в стабильности. Наблюдали улучшенную стабильность конъюгатов полисахарид-белок при использовании полисорбата 20 в отдельности или полоксамера 188 в сочетании с полиолом.

Конкретный механизм защиты конкретным детергентом биотерапевтического средства непонятен, и его нельзя спрогнозировать априори. Возможные механизмы стабилизации включают предпочтительную гидратацию, предпочтительное исключение, конкуренцию на поверхности раздела воздух/жидкость между биотерапевтическим средством и поверхностью, поверхностное натяжение и/или прямое связывание детергента с биотерапевтическим средством для маскирования гидрофобных участков, служащих в качестве затравки для агрегации.

В композициях по изобретению также можно использовать полоксамер. Полоксамер является неионным триблок-сополимером, состоящим из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена (поли(пропиленоксида)), фланкированной двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксида)). Полоксамеры также известны под торговым названием Плюроник^®. Т.к. длину полимерных блоков можно адаптировать, существует множество различных полоксамеров, обладающих немного отличающимися свойствами. Т.к. общим термином является термин "полоксамер", эти сополимеры общепринято обозначают буквой "P" (от "полоксамер") и тремя цифрами, первые две цифры, умноженные на 100, означают приблизительную молекулярную массу полиоксипропиленовго ядра, а последняя цифра, умноженная на 10, означает процент содержания полиоксиэтилена (например, P407=Полоксамер с молекулярной массой полиоксипропилена 4000 г/моль и содержанием полиоксиэтилена 70%). В случае торгового названия Плюроник^®, кодировка этих сополимеров начинается с буквы, определяющей его физическую форму при комнатной температуре (L=жидкость, P=паста, F=крошка (твердый)), за которой следуют две или три цифры. Первая цифра (две цифры в трехцифровом формате) в числовом обозначении, умноженная на 300, означает приблизительную молекулярную массу гидрофобного вещества; и последняя цифра, умноженная на 10, означает процент содержания полиоксиэтилена (например, L61=Плюроник^® с молекулярной массой полиоксипропилена 1800 г/моль и содержанием полиоксиэтилена 10%). См. патент США № 3740421.

Примеры полоксамеров, имеющих общую формулу:

HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_aH,

где блоки a и b имеют следующие значения:

Плюроник®	Полоксамер	a	b	Молекулярная масса
L31		2	16	1100 (средняя)
L35				1900 (средняя)
L44NF	124	12	20	2090-2360
L64				2900 (средняя)
L81				2800 (средняя)
L121				4400 (средняя)
P123		20	70	5750 (средняя)
F68NF	188	80	27	7680-9510
F87NF	237	64	37	6840-8830
F108NF	338	141	44	12700-17400
F127NF	407	101	56	9840-14600

В рамках изобретения единицами молекулярной массы являются дальтоны (Да) или г/моль.

Предпочтительно, полоксамер, как правило, имеет молекулярную массу в диапазоне от 1100 до 17400 Да, от 7500 до 15000 Да или от 7500 до 10000 Да. Полоксамер можно выбирать из полоксамера 188 или полоксамера 407. Конечная концентрация полоксамера в составах составляет от 0,001% до 5% масс./об. или от 0,025% до 1% масс./об. В некоторых аспектах полиол является пропиленгликолем, и его конечная концентрация составляет от 1% до 20% масс./об. В некоторых аспектах полиол является полиэтиленгликолем 400, и его конечная концентрация составляет от 1% до 20% масс./об.

Подходящими полиолами для составов по изобретению являются полимерные полиолы, в частности полиэфирные диолы, включая, в качестве неограничивающих примеров, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль, монометиловые простые эфиры полиэтиленгликоля. Доступен пропиленгликоль с диапазоном молекулярных масс мономера от ~425 до ~2700. Также доступны полиэтиленгликоль и монометиловый простой эфир полиэтиленгликоля с диапазоном молекулярных масс от ~200 до ~35000, включая, в качестве неограничивающих примеров PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000, PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 и PEG MME 4000. Предпочтительным полиэтиленгликолем является полиэтиленгликоль 400. Конечная концентрация полиола в составах по изобретению может составлять от 1% до 20% масс./об. или 6% до 20% масс./об.

Состав также содержит pH-забуференный физиологический раствор. Буфер, например, можно выбирать из группы, состоящей из Трис, ацетатного, глутаматного, лактатного, малеатного, тартратного, фосфатного, цитратного, карбонатного, глицинатного, гистидинового, глицинового, сукцинатного буфера, буфера HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты), MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты) и триэтаноламинового буфера. С помощью буфера можно забуферивать раствор до pH в диапазоне от 4 до 10, от 5,2 до 7,5 или от 5,8 до 7,0. В определенном аспекте изобретения буфер выбран из группы, состоящей из фосфата, сукцината, гистидина, MES, MOPS, HEPES, ацетата или цитрата. Кроме того, буфер, например, можно выбирать из USP-совместимых буферов для парентерального использования, в частности, если фармацевтический состав предназначен для парентерального использования. Концентрации буфера будут находиться в диапазоне от 1 мМ до 50 мМ или от 5 мМ до 50 мМ. В некоторых аспектах буфер представляет собой гистидин в конечной концентрации от 5 мМ до 50 мМ или сукцинат в конечной концентрации от 1 мМ до 10 мМ. В некоторых аспектах гистидин находится в конечной концентрации 20 мМ ± 2 мМ.

Хотя предпочтительным является физиологический раствор (т.е. раствор, содержащий NaCl), другие соли, подходящие для состава, включают, в качестве неограничивающих примеров, CaCl₂, KCl, MgCl₂ и их комбинации. Вместо соли можно использовать неионные изотонические средства, включая, в качестве неограничивающих примеров, сахарозу, трегалозу, маннит, сорбит и глицерин. Подходящие диапазоны концентраций соли включают, в качестве неограничивающих примеров, от 25 мМ до 500 мМ или от 40 мМ до 170 мМ. В одном из аспектов физиологический раствор представляет собой раствор NaCl, необязательно, находящегося в концентрации от 20 мМ до 170 мМ.

В варианте осуществления составы содержат L-гистидиновый буфер с хлоридом натрия.

В некоторых вариантах осуществления составов, представленных в настоящем описании, конъюгаты полисахарид-белок содержат один или более пневмококковых полисахаридов, конъюгированных с белком-носителем. Белок-носитель можно выбирать из CRM₁₉₇, фрагмента B дифтерийного токсина (DTFB), DTFBC8, дифтерийного анатоксина (DT), столбнячного анатоксина (TT), фрагмента C TT, коклюшного анатоксина, холерного анатоксина, LT E. coli, ST E. coli, экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa и их комбинаций. В одном из аспектов все из конъюгатов полисахарид-белок получают с использованием водной химической реакции. В другом аспекте один или более из конъюгатов полисахарид-белок получают с использованием растворителя DMSO. Например, конъюгат полисахарид-белок состав может являться 15-валентным составом пневмококкового конъюгата (15vPnC), где конъюгаты полисахарид-белок серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F получают с использованием растворителя DMSO, а конъюгаты полисахарид-белок серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F получают с использованием водного растворителя.

В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят в системе с контролируемым высвобождением. Например, средство можно вводить с использованием внутривенной инфузии, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. В другом варианте осуществления используют полимерные материалы, например, в микросферах или имплантате.

Композиции по настоящему изобретению также могут включать один или более белков S. pneumoniae. Примеры белков S. pneumoniae, подходящих для включения, включают белки, определенные в публикациях международных патентных заявок №№ WO 02/083855 и WO 02/053761.

Хотя различные варианты осуществления изобретения описаны со ссылкой на сопутствующее описание и чертежи, следует понимать, что изобретение не ограничено этими конкретными вариантами осуществления, и что специалист в этой области может осуществлять различные изменения и модификации изобретения без отклонения от его объема или сущности, определенных в формуле изобретения.

Следующие примеры представлены в иллюстративных целях, а не для ограничения изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Получение капсульных полисахаридов S. Pneumoniae

Способы культивирования пневмококков хорошо известны в этой области. См., например, Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. Способы получения пневмококковых капсульных полисахаридов также хорошо известны в этой области. См., например, европейский патент № EP0497524. Изоляты подтипов пневмококков доступны в American Type Culture Collection (Manassas, VA). Бактерии идентифицируют как инкапсулированные, неподвижные, грамположительные, ланцетовидные диплококки, являющиеся альфа-гемолитическими на кровяном агаре. Подтипы можно дифференцировать с помощью реакции набухания капсулы с использованием специфических антисывороток. См., например, патент США № 5847112.

Банки клеток, представляющие каждый из имеющихся серотипов S. pneumococcus, получали из Merck Culture Collection (Rahway, NJ) в замороженных флаконах. Размороженную посевную культуру переносили в посевной ферментер, содержащей предварительно стерилизованные среды для выращивания, подходящие для S. pneumoniae. Культуру выращивали в посевном ферментере с контролем температуры и pH. Весь объем посевного ферментера переносили в производственный ферментер, содержащий предварительно стерилизованные среды для выращивания. Производственная ферментация являлась конечной стадией выращивания клеток. Контролировали температуру, pH и скорость перемешивания.

Ферментацию прекращали посредством добавления инактивирующего средства. После инактивации партию переносили в резервуар для инактивации, где ее держат при контролируемой температуре и скорости перемешивания. Клеточный детрит удаляли с использованием комбинации центрифугирования и фильтрации. Партию подвергали ультрафильтрации и диафильтрации. Затем партию подвергали фракционированию с помощью растворителя, посредством которого удаляют примеси и выделения полисахарида.

ПРИМЕР 2: Конъюгация серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F с CRM₁₉₇ посредством восстановительного аминирования в водном растворе

Различные серотипы полисахаридов отдельно конъюгировали с очищенным белком-носителем CRM₁₉₇ с использованием общей технологической схемы. Полисахарид растворяли, измельчали, химически активировали и подвергали замене буфера посредством ультрафильтрации. Затем очищенный CRM₁₉₇ конъюгировали с активированным полисахаридом с использованием NiCl₂ (2 мМ) в реакционной смеси и полученный конъюгат очищали посредством ультрафильтрации перед конечной фильтрации с помощью фильтра 0,2 мкм. Некоторые технологические параметры на каждой стадии, такие как pH, температура, концентрация и время, контролировали так, чтобы поддерживать серотип-специфические значения, определенные в разделе ниже.

Измельчение и окисление полисахарида

Порошок очищенного пневмококкового капсульного полисахарида растворяли в воде и все серотипы, за исключением серотипа 19A, фильтровали с помощью фильтра 0,45 мкм. Все серотипы, за исключением серотипа 19A, гомогенизировали для уменьшения молекулярной массы полисахарида. Серотип 19A не измельчали по причине его относительно небольшого исходного размера. Давление гомогенизации и количество пропусканий через гомогенизатор контролировали на уровне серотип-специфических целевых значений (150-1000 бар; 4-7 пропусканий) для достижения серотип-специфической молекулярной массы. Измельченный полисахарид фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм, а затем концентрировали и подвергали диафильтрации против воды с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 10 кДа.

Затем раствор полисахарида доводят до серотип-специфических температуры (4-22°C) и pH (4-5) с помощью буфера ацетата натрия для минимизации уменьшения размера полисахарида по причине активации. Для всех серотипов (за исключением серотипа 4) активацию полисахарида инициировали посредством добавления раствора 100 мМ метапериодата натрия. Количество добавляемого метапериодата натрия являлось серотип-специфическим и находилось в диапазоне приблизительно от 0,1 до 0,5 моль метапериодата натрия на моль повторяющейся единицы полисахарида. Серотип-специфический заряд метапериодата натрия предназначен для достижения целевого уровня активации полисахарида (молей альдегида на моль повторяющейся единицы полисахарида). В случае серотипа 4 перед добавлением метапериодата натрия партию инкубировали при температуре приблизительно 50°C и pH 4,1 для частичной декетализации полисахарида.

В случае всех серотипов, за исключением серотипов 5 и 7F, активированный продукт подвергали диафильтрации против 10 мМ фосфата калия, pH 6,4, с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 10 кДа. Серотипы 5 и 7F подвергали диафильтрации против 10 мМ ацетата натрия. Ультрафильтрацию всех серотипов осуществляли при 2-8°C.

Конъюгация полисахарида с CRM₁₉₇

Раствор окисленного полисахарида смешивали с водой и 1,5 M фосфатом калия, pH 6,0 или pH 7,0, в зависимости от серотипа. Выбранный pH буфера предназначен для улучшения стабильности активированного полисахарида во время реакция конъюгации. Очищенный CRM₁₉₇, полученный посредством экспрессии в Pseudomonas fluorescens, как описано ранее (WO 2012/173876 A1), фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм и объединяли с забуференным раствором полисахарида при массовом соотношении полисахарида и CRM₁₉₇ в диапазоне от 0,4 до 1,0 масс./масс. в зависимости от серотипа. Массовое соотношение выбирали так, чтобы контролировать соотношение полисахарида и CRM₁₉₇ в получаемом конъюгате. Концентрации полисахарида и фосфата являлись серотип-специфическими и находились в диапазоне от 3,6 до 10,0 г/л и от 100 до 150 мМ, соответственно, в зависимости от серотипа. Серотип-специфическкую концентрацию полисахарида выбирали так, чтобы контролировать размер получаемого конъюгата. Затем раствор фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм. Добавляли хлорид никеля до концентрации приблизительно 2 мМ с использованием 100 мМ раствора хлорида никеля. Добавляли цианоборогидрид натрия (2 моля на моль повторяющейся единицы полисахарида). Конъюгацию осуществляли в течение серотип-специфического периода времени (от 72 до 120 часов) для максимизации расхода полисахарида и белка.

Восстановление борогидридом натрия

После реакции конъюгации партию разбавляли до концентрации полисахарида приблизительно 3,5 г/л, охлаждали до 2-8°C и фильтровали с помощью фильтра 1,2 мкм. Все серотипы (за исключением серотипа 5) подвергали диафильтрации против 100 мМ фосфата калия, pH 7,0, при 2-8°C с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 100 кДа. Затем партию, выделенную в ретентате, разбавляли до приблизительно 2,0 г полисахарида/л и корректировали pH посредством добавления 1,2 M бикарбоната натрия, pH 9,4. Добавляли борогидрид натрия (1 моль на моль повторяющейся единицы полисахарида). Позднее добавляли 1,5 M фосфата калия, pH 6,0. Серотип 5 подвергали диафильтрации против 300 мМ фосфата калия с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 100 кДа.

Конечная фильтрация и хранение продукта

Затем партию концентрировали и подвергали диафильтрации против 10 мМ L-гистидина в 150 мМ хлориде натрия, pH 7,0, при 4°C с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 300 кДа. Партию ретентата фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм.

Конъюгат серотипа 19F инкубировали в течение приблизительно 7 дней при 22°C, подвергали диафильтрации против 10 мМ L-гистидина в 150 мМ хлориде натрия, pH 7,0, при 4°C с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 100 кДа, и фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм.

Партию доводили до концентрации полисахарида 1,0 г/л с использованием дополнительного 10 мМ L-гистидина в 150 мМ хлориде натрия, pH 7,0. Партию разделяли на аликвоты и замораживали при ≤-60°C.

ПРИМЕР 3: Способы конъюгации серотипов 3, 4, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F с CRM₁₉₇ посредством восстановительного аминирования в диметилсульфоксиде

Различные серотипы полисахаридов 3, 4, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F раздельно конъюгировали с очищенным белком-носителем CRM₁₉₇ с использованием общей технологической схемы. Полисахарид растворяли, доводили его размер до целевой молекулярной массы, химически активировали и подвергали замене буфера посредством ультрафильтрации. Активированный полисахарид и очищенный CRM₁₉₇ раздельно лиофилизировали и перерастворяли в диметилсульфоксиде (DMSO). Затем растворы перерастворенных полисахарида и CRM₁₉₇ объединяли и конъюгировали, как описано ниже. Получаемый конъюгат очищали посредством ультрафильтрации перед конечной фильтрацией с помощью фильтра 0,2 мкм. Некоторые технологические параметры на каждой стадии, такие как pH, температура, концентрация и время, контролировали так, чтобы поддерживать серотип-специфические значения, определенные в разделе ниже.

Измельчение и окисление полисахарида

Порошок очищенного пневмококкового капсульного полисахарида растворяли в воде и все серотипы, за исключением серотипа 19A, фильтровали с помощью фильтра 0,45 мкм. Все серотипы, за исключением серотипов 18C и 19A, гомогенизировали для уменьшения молекулярной массы полисахарида. Давление гомогенизации и количество пропусканий через гомогенизатор контролировали на уровне серотип-специфических целевых значений (150-1000 бар; 4-7 пропусканий). Серотип 18C измельчали посредством кислотного гидролиза при ≥90°C.

Измельченный полисахарид фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм, а затем концентрировали и подвергали диафильтрации против воды с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 10 кДа. Для серотипа 18C использовали мембрану NMWCO с отсечкой 5 кДа.

Затем раствор полисахарида доводили до серотип-специфических температуры (4-22°C) и pH (4-5) с использованием буфера ацетата натрия для минимизации измельчения полисахарида по причине активации. Для всех серотипов (за исключением серотипа 4) активацию полисахарида инициировали посредством добавления раствора 100 мМ метапериодата натрия. Количество добавляемого метапериодата натрия являлось серотип-специфическим и находилось в диапазоне от приблизительно от 0,1 до 0,5 молей метапериодата натрия на моль повторяющейся единицы полисахарида. Серотип-специфический заряд метапериодата натрия предназначен для достижения целевого уровня активации полисахарида (молей альдегида на моль повторяющейся единицы полисахарида). В случае серотипа 4 перед добавлением метапериодата натрия партию инкубировали при температуре приблизительно 50°C и pH 4,1 для частичной декетализации полисахарида.

Активированный продукт подвергали диафильтрации против 10 мМ фосфата калия, pH 6,4 с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 10 кДа, затем подвергали диафильтрации или диализу против воды с использованием мембраны NMWCO с отсечкой 10 кДа. Для серотипа 18C использовали мембрану NMWCO с отсечкой 5 кДа. Ультрафильтрацию или диализ всех серотипов осуществляли при 2-8°C.

Конъюгация полисахарида с CRM₁₉₇

Очищенный CRM₁₉₇, полученный посредством экспрессии в Pseudomonas fluorescens, как описано ранее (WO 2012/173876 A1), подвергали диафильтрации против 2-5 мМ фосфатного буфера, pH 7,0, с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 5 кДа и фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм.

В случае всех серотипов, за исключением серотипа 3, окисленные полисахариды составляли при концентрации 6 мг полисахарида/мл и 5% масс./об. сахарозы (50 мг сахарозы/мл) в воде. В случае серотипа 3, окисленный полисахарид составляли при концентрации 2 мг полисахарида/мл и 10% масс./об. сахарозы (100 мг сахарозы/мл) в воде. Раствор белка составляли при концентрации 6 мг белка/мл с использованием 1% масс./об. сахарозы (10 мг сахарозы/мл) в фосфатном буфере.

Составленные растворы полисахарида и CRM₁₉₇ раздельно лиофилизировали. Лиофилизированные материалы полисахарида и CRM₁₉₇ перерастворяли в DMSO и объединяли с использованием Т-образной мешалки. Добавляли цианоборогидрид натрия (1 моль на моль повторяющейся единицы полисахарида) и осуществляли конъюгацию в течение серотип-специфического периода времени (от 1 до 48 часов) для достижения целевого размера конъюгата.

Восстановлением борогидрида натрия

После реакции конъюгации добавляли борогидрид натрия (2 моля на моль повторяющейся единицы полисахарида). Партию разбавляли 150 мМ хлоридом натрия с приблизительно 0,025% (масс./об.) полисорбата 20 или без него при температуре приблизительно 4°C. Затем добавляли буфер фосфата калия для нейтрализации pH. В случае серотипов 3, 6A, 6B, 7F, 9V, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F партию концентрировали и подвергали диафильтрации при температуре приблизительно 4°C против 150 мМ хлорида натрия с 25 мМ фосфатом калия, pH 7, или без него с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 30 кДа.

Конечная фильтрация и хранение продукта

Серотипы 3, 6A, 6B, 7F, 9V, 18C, 19A, 22F, 23F и 33F концентрировали и подвергали диафильтрации против 10 мМ гистидина в 150 мМ хлориде натрия, pH 7,0, с 0,015% (масс./об.) полисорбата 20 или без него при температуре 4°C с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 300 кДа. Партию ретентата фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм.

Серотип 19F инкубировали в течение приблизительно 5 дней, подвергали диафильтрации против 10 мМ гистидина в 150 мМ хлориде натрия, pH 7,0, при температуре приблизительно 4°C с использованием мембраны для тангенциальной фильтрации NMWCO с отсечкой 300 кДа и фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм.

Серотипы 3, 6A, 6B, 7F, 9V, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F разбавляли дополнительным 10 мМ гистидином в 150 мМ хлориде натрия, pH 7,0, разделяли на аликвоты и замораживали при ≤-60°C.

Серотипы 4 и 14 подвергали диализу против 150 мМ хлорида натрия при температуре приблизительно 4°C с использованием мембраны NMWCO с отсечкой 300 кДа, фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм, разделяли на аликвоты и замораживали при ≤-60°C.

ПРИМЕР 4: Анализ конъюгатов

Анализ молекулярной массы и концентрации конъюгатов с использованием анализа HPSEC/UV/MALS/RI

Образцы конъюгата инъецировали и разделяли посредством высокоэффективной эксклюзионной хроматографии (HPSEC). Детекцию осуществляли с использованием детектора ультрафиолета (UV), детектора многоуглового светорассеяния (MALS) и рефрактометрического детектора (RI), расположенных последовательно. Концентрацию белка вычисляли из поглощения УФ при 280 нм с использованием коэффициента экстинкции. Концентрацию полисахарида получали посредством деконволюции сигнала RI (в который вносят вклад и белок, и полисахарид) с использованием коэффициентов dn/dc, представляющих собой изменение коэффициента преломления раствора с изменением концентрации растворенного вещества, приведенного в мл/г. Среднюю молекулярную массу образцов вычисляли с помощью программного обеспечения Astra (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) с использованием измеренной концентрации и информации о светорассеянии по всему пику образца.

Анализ степени активации полисахарида

Конъюгацию осуществляют посредством восстановительного аминирования между активированными альдегидами и, главным образом, остатками лизина на белке-носителе. Уровень активации, выраженный в молях альдегида на моли повторяющейся единицы полисахарида, важен для контроля реакций конъюгации. Анализ для измерения степени активации описан в публикации заявки на патент США № 2017/0021006.

Разрабатывали собственный анализ для измерения степени активации на основе реакции альдегидных групп (образованных при окислении полисахарида периодатом) с тиосемикарбазидом (доступным в коммерческих источниках).

Количественный анализ можно осуществлять с помощью ЯМР (ядерного магнитного резонанса), или посредством сравнения дериватизированного полисахарида с подходящими стандартами, и/или с использованием коэффициентов экстинкции производного. Коэффициенты экстинкции для этого анализа используют аналогично использованию в способе HPSEC/UV/MALS/RI.

Как правило, анализ можно осуществлять в следующих условиях реакции:

Время: 0,5-35 ч. (это время является серотип-специфическим, но реакцию осуществляют до завершения, т.е. достижения плато временной зависимости)

Температура: 15-37°C, предпочтительно - приблизительно 21-27°C

Концентрация TSC: 1-5 мг/Мл

pH реакции: pH 3-5,5, предпочтительно - 4,0

В примере 4 полисахарид дериватизировали с использованием от 1,25 до 2,5 мг/мл тиосемикарбазида (TSC) при pH 4,0 для встраивания хромофора (при дериватизации активированного полисахарида серотипов 1, 5 и 9V используют 1,25 мг/мл TSC). Реакции дериватизации позволяли происходить до достижения плато. Точное время варьировалось в зависимости от скорости реакции для каждого серотипа. Затем TSC-Ps отделяли от TSC и других низкомолекулярных компонентов посредством высокоэффективной эксклюзионной хроматографии. Сигнал определяли по поглощению УФ при 266 нм. Вычисляли уровень активированного альдегида относительно инъекций моно-TSC на стандартной кривой или напрямую с использованием заранее определенных коэффициентов экстинкции. Моно-TSC является синтезированным тиосемикарбазонным производным моносахарида. Затем уровень альдегидов преобразовывали в моли альдегида на моль повторяющейся единицы (Ald/RU) с использованием концентрации полисахарида, измеряемой посредством анализа HPSEC/UV/MALS/RI.

Схожую дериватизацию можно осуществлять с использованием структурных аналогов тиосемикарбазида, гидразидов, гидразина, семикарбазида, структурных аналогов семикарбазида, аминооксисоединений или ароматических аминов при условии, что производные проявляют значительное поглощение УФ. Поглощение УФ может происходить за счет хромофора, присоединенного к дериватизирующим средствам, или хромофора, образовавшегося в результате альдегидной дериватизации, как в случае тиосемикарбазида.

Определение расхода лизина в конъюгированном белке как мера количества ковалентных соединений между полисахаридом и белком-носителем

Для измерения степени конъюгации в образцах конъюгатов использовали анализ аминокислот Waters AccQ-Tag (AAA). Образцы гидролизовали с использованием кислотного гидролиза в газовой фазе с помощью рабочей станции Eldex для разрушения белков-носителей до аминокислот-компонентов. Свободные аминокислоты дериватизировали с использованием 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидил-карбамата (AQC). Затем дериватизированные образцы анализировали с использованием UPLC с детекцией УФ на колонке C18. Среднюю концентрацию белка получали с использованием характерных аминокислот, помимо лизина. Расход лизина во время конъюгации (т.е. потерю лизина) определяли по разнице между средним измеренным количеством лизина в конъюгате и ожидаемым количеством лизина в исходном белке.

Свойства конъюгатов, полученных посредством восстановительного аминирования в водном растворе и DMSO

Результаты анализов активации полисахарида и расхода лизина (т.е. потерь лизина) для конъюгатов, полученных способами, описанными в примерах 2 и 3, приведены в таблице 1. Существует четкое различие в том, что конъюгаты, полученные в DMSO (пример 3), имеют более высокий расход лизина с более низкой активацией полисахарида, чем конъюгаты, полученные в водном растворе (пример 2). Это позволяет предполагать, что получение конъюгатов в растворе DMSO, позволяет полисахариду присоединяться к большему количеству участков конъюгации на белке-носителе с меньшей активацией или разрушением до нативных структур полисахарида. В результате конъюгаты, в среднем, содержат больше гликопептида на повторяющуюся единицу полисахарида по причине более высокого перекрестного сшивания в конъюгатах, полученных в растворе в DMSO, чем в водном растворе. Полагают, что гликопептид является антигенным доменом, вызывающим иммунный ответ. Таким образом, ожидают, что конъюгаты, полученные в DMSO, будут более иммуногенными, чем конъюгаты, полученные в водном растворе.

Среднюю молекулярную массу (Mw) конъюгатов в таблице 1 измеряли посредством анализа HPSEC UV-MALS-RI. Конъюгаты, полученные посредством восстановительного аминирования в водном растворе, имели молекулярную массу в диапазоне от 990 до 3410 кДа. Конъюгаты, полученные в DMSO, как правило, являлись более крупными, имея размеры в диапазоне от 1300 до 5822 кДа.

Таблица 1: Потери лизина для конъюгатов пневмококковых серотипов 3, 4, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F и CRM₁₉₇, полученных посредством восстановительного аминирования в водном растворе или DMSO.

Конъюгат	№ партии конъюгата	Реакция конъюгации в водном растворе или DMSO	Полисахарид активация (моль альдегида/моль повторяющейся единицы)	Потери лизина (моль/моль белка)
Серотип 3-CRM197	1	Водный раствор	0,10	3,1
	2		0,10	2,5
	3	0,10	3,1
	4	DMSO	0,092	16,3
5	0,053	9,6
Серотип 4-CRM197	1	Водный раствор	0,43	2,7
2	DMSO	0,25	3,0
Серотип 6A-CRM197	1	Водный раствор	0,19	4,5
2	DMSO	0,11	9,1
Серотип 6B-CRM197	1	Водный раствор	0,18	4,6
2	DMSO	0,11	9,6
Серотип 7F-CRM197	1	Водный раствор	0,26	2,0
2	DMSO	0,22	10,6
Серотип 9V-CRM197	1	Водный раствор	0,30	4,7
2	DMSO	0,15	7,9
Серотип 14-CRM197	1	Водный раствор	0,22	6,4
2	DMSO	0,22	12,7
Серотип 18C-CRM197	1	Водный раствор	0,12	3,5
2	DMSO	0,11	9,2
Серотип 19A-CRM197	1	Водный раствор	0,38	4,9
2	DMSO	0,14	9,5
Серотип 19F-CRM197	1	Водный раствор	0,13	2,7
2	DMSO	0,15	9,6
Серотип 22F-CRM197	1	Водный раствор	0,12	1,7
	2	DMSO	0,15	7,2
3	0,15	7,0
Серотип 23F-CRM197	1	Водный раствор	0,39	3,2
2	DMSO	0,19	10,8
Серотип 33F-CRM197	1	Водный раствор	0,23	4,5
2	DMSO	0,14	7,0

Количественный анализ степени конъюгации в различных участках на CRM₁₉₇

Полисахарид можно конъюгировать с аминогруппой на N-конце белка-носителя или любыми из боковых цепей 39 остатков лизина в CRM₁₉₇. Аминокислотная последовательность CRM₁₉₇ приведена в таблице 2, где лизины (сокращенно обозначенные как K) подчеркнуты и выделены полужирным шрифтом. Для локализации и количественного анализа степени конъюгации полисахарида в различных участках на белке CRM₁₉₇ использовали способ пептидного картирования LC/UV/MS. Типичные образцы конъюгатов (полученные в DMSO или водном растворе) расщепляли в двух параллелях с использованием трипсина, получая триптические пептиды. Затем смеси разделяли на обращенно-фазовой колонке C₁₈ и анализировали с помощью УФ и масс-спектрометра. Образец белка CRM₁₉₇ (неконъюгированного с полисахаридом) также обрабатывали в трех параллелях одновременно с контролем. Т.к. трипсин расщепляет белок на C-концевой стороне остатков лизина и аргинина, конъюгация по остатку лизина делает этот участок устойчивым к действию протеазы. Степень конъюгации в конкретном участке определяли посредством вычисления снижения интенсивности пика триптического пептида по сравнению с контрольным CRM₁₉₇. В зависимости от участков расщепления и последовательностей, снижение сигнала конкретного пептида может являться результатом неправильного расщепления лизинов в предшествующем пептиде, или неправильного расщепления лизина на конце пептида, или конъюгации в середине последовательности пептида.

Строили график относительных процентных долей снижения сигнала пептида для конъюгатов серотипа 19A по сравнению с контрольным CRM₁₉₇ относительно возможных участков конъюгации, представленный на фигуре 1. Положения лизина, указанные по оси x, нумеровали с учетом их порядка в последовательности белка CRM₁₉₇, и они представляют собой возможные участки конъюгации анализируемых пептидов. Например, обозначение "33" означает, что снижение сигнала пептида являлось результатом конъюгации на 33-ем лизине, а обозначение "6, 7" означает, что снижение сигнала пептида являлось результатом конъюгации на 6-ом, или 7-ом, или обоих лизинах. Данные, представленные на фигуре 1, позволяют предполагать, что не только степень конъюгации в каждом участке, как правило, является более высокой в случае конъюгатов, полученных в DMSO, по сравнению с водным раствором, но и было больше участков конъюгации при конъюгации в DMSO. Эти дополнительные участки конъюгации включают 29-ый, 30-ый, 31-ый и 32-ой лизины, являвшиеся единственными лизинами, локализованными в ранее идентифицированных общих пептидных T-клеточных эпитопах человека (см. Raju et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25:3207-3214, локализующихся в пептиде 411-430 и пептиде 431-450 последовательности CRM₁₉₇). Схожие результаты наблюдали и в случае других тестируемых серотипов.

Таблица 2: Аминокислотная последовательность CRM₁₉₇

Аминокислоты

Аминокислотная последовательность

1-535

GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS (SEQ ID NO: 1)

ПРИМЕР 5: Исследования иммуногенности на мышах, в которых сравнивали конъюгаты полисахарид серотипа 3-CRM₁₉₇, полученные в водном растворе и DMSO

Все эксперименты на животных осуществляли в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве по содержанию и использованию лабораторных животных National Institutes of Health. Протокол был одобрен Комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных (IACUC), MRL, West Point, PA.

Самок мышей CD1 возрастом восемь недель содержали в клетках-микроизоляторах (n=10/клетку) в виварии MRL, West Point, PA. Пища и вода были доступны без ограничений. Мышей (n=10/группу) внутримышечно (IM) иммунизировали конъюгатами ST3-CRM₁₉₇ (0,4 мкг полисахарида ST3), составленными с адъювантом фосфатом алюминия (APA), как описано в таблице 3. Животным отрицательного контроля вводили только APA. Иммунизацию осуществляли в дни 0, 14 и 28. Кровь собирали в пробирки для отделения сыворотки (BD, Franklin Lakes, NJ) через хвостовую вену в дни 6 и 34.

Таблица 3: Группы исследования на мышах, в котором сравнивали конъюгаты полисахарида серотипа 3-CRM₁₉₇, полученные в водном растворе и растворе DMSO.

№ группы	Группа	Описание конъюгата	Описание состава
1	APA	Контроль без использования конъюгата	250 мкг/мл APA, 20 мМ L-гистидин, pH 5,8, и 150 мМ NaCl с 0,2% масс./об. PS-20
2	ST3-CRM197(водный раствор)/APA	Моновалентный конъюгат ST3-CRM197 (партия №1 в таблице 1), полученный посредством восстановительного аминирования в водном растворе, как описано в примере 2	0,4 мкг ST3-CRM197, 250 мкг/мл APA, 20 мМ L-гистидин, pH 5,8, и 150 мМ NaCl с 0,2% масс./об. PS-20
3	ST3-CRM197(DMSO)/APA	Моновалентный конъюгат ST3-CRM197 (партия №4 в таблице 1), полученный посредством восстановительного аминирования в DMSO, как описано в примере 3	0,4 мкг ST3-CRM197, 250 мкг/мл APA, 20 мМ L-гистидин, pH 5,8, и 150 мМ NaCl с 0,2% масс./об. PS-20

Электрохемилюминесцентные анализы (ECL) иммуногенности

Гуморальные ответы мышей измеряли в мультиплексных электрохемилюминесцентных анализах в 96-луночном формате, как описано ранее, с небольшими модификациями. См. Marchese et al., 2009, Clin Vaccine Immunol 16(3):387-96; Skinner et al., 2011, Vaccine 29(48):8870-6; и Caro-Aguilar et al., 2017 Vaccine 35(6):865-72. В кратком изложении, после инкубации тестовых сывороток в течение 1 часа на планшетах Meso-Scale Discovery (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) и промывки в каждую лунку добавляли 25 мкл 2 мкг/мл меченого Sulfo-tag (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) IgG козы против мыши. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре со встряхиванием, а затем обрабатывали, как описано ранее, и анализировали с помощью MESO Sector S600.

Титр ECL вычисляли как величину, обратную линейно интерполированному разведению, соответствующему пороговому значению (средний геометрический сигнал ECL пневмококкового полисахарида в заранее определенных объединенных сыворотках мышей положительного контроля). Интерполяцию осуществляли посредством логарифмического масштабирования ECL и разведения. Затем получали титр посредством обратного преобразования линейно интерполированного разведения. Титры экстраполировали для образцов, выпадающих из исследуемого диапазона от 100 до 1562500, посредством линейной экстраполяции (при двойном логарифмическом масштабировании) с использованием отрезка, отсекаемого на оси, и углового коэффициента для последних 3 точек данных ECL на кривой выборки, расположенных полностью выше пороговой линии, или с использованием отрезка, отсекаемого на оси, и углового коэффициента для первых 2 точек данных ECL на кривой выборки, расположенных полностью ниже пороговой линии. Затем получали титр посредством обратного преобразования линейно экстраполированного разведения.

Опсонофагоцитарный анализ цитолиза (OPA)

Опсонофагоцитарный анализ цитолиза (OPA) пневмококкового серотипа 3 осуществляли, как описано ранее, с небольшими модификациями (Caro-Aguilar et al., 2017 Vaccine 35(6):865-72; и Burton et al., 2006, Clin Vaccine Immunol 13(9):1004-9). После инкубации сывороток бактерии, комплемент, клетки HL-60, 10 мкл смеси для опсонофагоцитарной реакции переносили в отдельную лунку на 96-луночном фильтровальном планшете Millipore, содержащую 200 мкл/лунку стерильной воды. Планшет подвергали вакуумной фильтрации и добавляли 100 мкл бульона Тодда-Хьюитта (THYE, Teknova). Среду фильтровали и влажный планшет помещали в запаянный пластиковый пакет на ночь при 27°C. Затем фильтры из планшета окрашивали 100 мкл/лунку 0,1% раствора кумасси синего (Bio-Rad, Hercules, CA). Краситель фильтровали через планшет, колонии обесцвечивали раствором для обесцвечивания кумасси (Bio-Rad) и снова подвергали вакуумной фильтрации до высушивания. Окрашенные бактериальные колонии подсчитывали с помощью ридера CTL Immunospot (Shaker Heights, OH). Титр OPK определяли как величину, обратную разведению сыворотки с по меньшей мере 50%-ным цитолизом по сравнению со средним ростом в лунках с контрольным комплементом (контроле без сыворотки), и вычисляли его посредством линейной интерполяции между последовательными разведениями, сигналы которых охватывали 50%-ный цитолиз.

Результаты, полученные перед иммунизацией и после введения дозы 3, приведены на фигуре 2 и в таблице 4 для анализа иммуногенности ECL и на фигуре 3 для OPA. Оба конъюгата, полученные способами с использованием водного раствора и DMSO, являются иммуногенными и обеспечивают функциональный цитолиз бактерий. Примечательно, что конъюгат, полученный способом с использованием раствора DMSO, обеспечивал и более высокую иммуногенность в анализе ECL, и более сильные ответы в анализе OPA, чем конъюгат, полученный с использованием водного раствора. Различия иммуногенности в анализе ECL являются статистически значимыми. Соотношение GMT в группе 3 и группе 2 составляет 3,41 (с нижним и верхним пределами 95%-ного доверительного интервала 1,26 и 9,26).

Таблица 4: Результаты анализа иммуногенности ECL после введения дозы 3 в группах исследования на мышах, в котором сравнивали конъюгаты полисахарида серотипа 3-CRM₁₉₇, полученные в водном растворе и растворе DMSO.

№ группы	Группа	Средний геометрический титр, GMT	Нижний предел 95%-ного доверительного интервала	Верхний предел 95%-ного доверительного интервала
1	APA	368	227	596
2	ST3-CRM197(водный раствор)/APA	355,207	187,905	671,466
3	ST3-CRM197(DMSO)/APA	1211654	719,297	2041028

ПРИМЕР 6: Исследования иммуногенности на взрослых людях, в которых сравнивали конъюгаты пневмококковый полисахарид-белок, полученные посредством восстановительного аминирования в водном растворе и DMSO

В этом примере описаны иммуногенность и безопасность двух 15-валентных пневмококковых конъюгатных вакцин (PCV15) в исследовании на здоровых, наивных в отношении пневмококковой вакцины взрослых людях возрастом 50 лет или более.

Дизайн испытания

Осуществляли рандомизированное, многоцентровое, двойное слепое испытание для сравнения безопасности, переносимости и иммуногенности однократной дозы 2 разных составов PCV15 (PCV15-A и PCV15-B) и Prevnar 13™ (пневмококковой 13-валентной конъюгатной вакцины [дифтерийный белок CRM₁₉₇], Wyeth Pharmaceuticals Inc., дочерняя компания Pfizer Inc., Philadelphia, PA, USA) на здоровых (должно быть задокументировано, что любое сопутствующее хроническое заболевание находится в стабильном состоянии) взрослых индивидуумах возрастом 50 лет или более, проводимое в соответствии с правилами Надлежащей клинической практики.

В исследование включали всего 690 здоровых, наивных в отношении пневмококковой вакцины индивидуумов возрастом 50 лет или более и случайным образом распределяли их в три разные группы вакцинации: Prevnar 13™, PCV15-A и PCV15-B в соотношении 1:1:1. Рандомизацию стратифицировали по возрасту при включении в исследование (от 50 до 64 лет, от 65 до 74 лет и ≥75 лет).

PCV15 содержала дозу 2 мкг/0,5 мл каждого из следующих серотипов пневмококкового полисахарида, конъюгированного с CRM₁₉₇ (1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 33F), дозу 4 мкг/0,5 мл пневмококкового полисахарида серотипа 6B, конъюгированного с CRM₁₉₇, дозу 125 мкг/0,5 мл адъюванта фосфата алюминия, 20 мМ L-гистидина, 150 мМ хлорида натрия, pH 5,8. PCV15-A составляли с 0,2% масс./об. P188. PCV15-B составляли с 0,1% масс./об. PS-20.

В случае PCV15-A все пятнадцать серотипов полисахарида (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F) конъюгировали с CRM₁₉₇ посредством восстановительного аминирования в водном растворе, как описано в примере 2. Свойства некоторых из этих конъюгатов (материалы партии №1 конъюгата) приведены в таблице 1.

В случае PCV15-B серотипы 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F конъюгировали с CRM₁₉₇ посредством восстановительного аминирования в DMSO, как описано в примере 3. Свойства этих конъюгатов (материалы партии №2 конъюгата) приведены в таблице 1. Конъюгаты остальных серотипов (1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F) представляют собой те же конъюгаты, которые использовали в PCV15-A.

Оба состава PCV15, как правило, имели профили безопасности, сравнимые с Prevnar 13™, с учетом общей оценки безопасности (данные не представлены). Серотип-специфические GMC IgG и GMT в анализе OPA измеряли в день 30 (результаты OPA не включены).

Результаты

Средние геометрические концентрации (GMC) IgG и доверительные интервалы (CI) приведены в таблице 6. Конъюгаты серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F в PCV15-A и PCV15-B получали разными способами конъюгации, как описано выше. В соответствии с результатами, приведенными в таблице 4, ответы при оценке иммуногенности для каждого из серотипов, представленных в таблице 6, улучшались, если серотипы полисахаридов конъюгировали с CRM₁₉₇ в DMSO. GMC для серотипов 18C, 19A, 19F и 23F в PCV15-B были значимо выше, чем для PCV15-A (двусторонний уровень значимости 0,05). Эти данные убедительно свидетельствуют о преимуществе конъюгации в DMSO для улучшения иммуногенности. Это открытие, которое ранее не было продемонстрировано ни для пневмококковых, ни для других конъюгатных вакцин.

Таблица 6: Гуморальные IgG-ответы на составы PCV15-A и PCV15-B серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F. Конъюгаты этих серотипов получали посредством восстановительного аминирования в водном растворе (PCV15-A) или восстановительного аминирования в DMSO (PCV15-B).

Серотипы	PCV15-A (N=231), GMC† (день 30)	PCV15-B (N=231), GMC† (день 30)	Приблизительное соотношение GMC† [PCV15-B/PCV15-A]
n	Приблизительный ответ	n	Приблизительный ответ	(95% CI)†
6A	217	3,74	217	4,93	1,32 (0,96, 1,81)
6B	217	3,69	217	4,95	1,34 (0,98, 1,85)
7F	217	4,09	217	4,53	1,11 (0,86, 1,43)
18C	217	6,61	217	10,99	1,66 (1,27, 2,18)
19A	217	8,77	217	13,83	1,58 (1,23, 2,02)
19F	217	4,11	217	6,80	1,66 (1,26, 2,17)
23F	217	3,92	217	5,53	1,41 (1,04, 1,91)

†Приблизительные GMC, соотношение GMC и 95% CI получали с помощью модели cLDA

N=Количество рандомизированных и вакцинированных индивидуумов

n=Количество индивидуумов с результатами серологического анализа после вакцинации, проведенного в день 30, включенных в анализ

GMC=Средняя геометрическая концентрация

CI=Доверительный интервал

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ХЭ, Цзянь

МАКНЕЙР, Джон, Е.

СМИТ, Уилльям, Дж.

УИНТЕРС, Майкл, А.

ДЖОЙС, Джозеф, Дж.

АБЕЙГУНАВАРДАНА, Читрананда

МУСЕЙ, Луви

ПУДЖАР, Хари

СКИННЕР, Джули, М.

ВЕН, Эмили

МакХЬЮ, Патрик

УИЛЛЬЯМС, Джон Майкл

ЛАНКАСТЕР, Кэтрин

<120> ПОВЫШЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ КОНЪЮГАТОВ ПОЛИСАХАРИД STREPTOCOCCUS

PNEUMONIAE-БЕЛОК

<130> 24424

<150> 62/555,444

<151> 2017-09-07

<150> 62/463,216

<151> 2017-02-24

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 535

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CRM197 детоксифицированный вариант дифтерийного токсина)

<400> 1

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1. 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val

195 200 205

Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly

210 215 220

Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu

225 230 235 240

Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu

245 250 255

His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val

260 265 270

Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val

275 280 285

Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu

290 295 300

Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala

305 310 315 320

Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser

325 330 335

Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp

340 345 350

Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe

355 360 365

Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His

370 375 380

Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr

385 390 395 400

Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His

405 410 415

Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val

420 425 430

Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr

435 440 445

His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile

450 455 460

Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly

465 470 475 480

Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser

485 490 495

Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu

500 505 510

Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser

515 520 525

Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

530 535

<---

1. Иммуногенная композиция для профилактики инвазивного заболевания, вызванного S. pneumoniae, состоящая по существу из полисахарида S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F, каждый из которых конъюгирован с CRM₁₉₇; где реакцию конъюгации для S. pneumoniae серотипов 6А, 6В, 7F, 18С, 19А, 19F и 23F осуществляют в апротонном растворителе, где апротонный растворитель представляет собой DMSO; и реакцию конъюгации S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F осуществляют в водном растворителе.

2. Иммуногенная композиция по п.1, дополнительно содержащая приблизительно 0,2% масс./об. полисорбата 20.

3. Иммуногенная композиция для профилактики инвазивного заболевания, вызванного S. pneumoniae, состоящая из полисахарида S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F, каждый из которых конъюгирован с CRM₁₉₇; где реакцию конъюгации для S. pneumoniae серотипов 6А, 6В, 7F, 18С, 19А, 19F и 23F осуществляют в апротонном растворителе, где апротонный растворитель представляет собой DMSO; и реакцию конъюгации S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F осуществляют в водном растворителе.

4. Иммуногенная композиция по п.3, дополнительно содержащая приблизительно 0,2% масс./об. полисорбата 20.