Способ преимплантационного генетического тестирования миодистрофии дюшенна-беккера

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ диагностики моногенного заболевания миодистрофия Дюшенна-Беккера в условиях преимплантационного генетического тестирования (ПГТ). Для этого проводят диагностику патогенного варианта NC_000023.10:g.32466632_32466633del (NM_004006.2:c.3727_3728delCT, NP_000100.3:p.Leu1243AsnfsX10) в гене DMD. В рамках способа были показаны высокая специфичность и эффективность, а также универсальность в отношении биообразцов различного типа: единичные клетки, продукт полногеномной амплификации, тотальной ДНК, выделенной из разных тканей. 1 пр.

 

Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.

Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования миодистрофии Дюшенна-Беккера. Миодистрофия Дюшенна-Беккера - это наследственная Х-сцепленная мышечная дистрофия, приемущественно затрагивающее мальчиков. Различают две формы данного заболевания: тяжелая, быстропрогрессирующая миодистрофия Дюшенна, и более легкая миодистрофия Беккера. Миодистрофия Дюшенна-Беккера встречается с частотой 2,3 на 100,000 населения, при этом среди новорожденных мальчиков частота встречаемости данного заболевания достигает 19.8 на 100,000. Это заболевание приводит к нарастающей мышечной атрофии и слабости, начинающихся с проксимальных мышц и затем вовлекающих дистальные мышцы нижних и верхних конечностей. Заболевание манифестирует в раннем возрасте, вызывая отставание двигательного развития ребенка, лишает его способности бегать и прыгать, а к подростковому подверженные миодистрофии Дюшенна дети зачастую не могут передвигаться без инвалидного кресла. Помимо скелетных мышц, в процесс могут вовлекаться гладкие мышцы и сердце, что может приводить к сердечной недостаточности. При Х-сцепленном рецессивном типе наследования заболевания вероятность рождения ребенка с этим заболеванием в семье составляет 50% для мальчиков.

К заболеванию миодистрофия дюшенна-беккера могут приводить патогенные генетические варианты в гене DMD, располагающемся на хромосоме X. [Okubo, М. et al. J Hum Genet 61, 483-489 (2016)] Этот ген кодирует белок дистрофин, который, в составе дистрофин-ассоциированного гликопротеинового комплекса, соединяет волокна актина с внеклеточным матриксом. Он обеспечивает прочность и эластичность мышц, поглощает избыточную нагрузку на них.

ПГТ миодистрофии Дюшенна-Беккера проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 году Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association; for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленным патогенными вариантом, обуславливающим этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении), эмбрионы без патогенного варианта и, следовательно, без риска развития заболевания.

Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.

Наиболее близким техническим решением является проведение ПГТ миодистрофии Дюшенна-Беккера предложенное Zi Ren и коллегами [Zi Ren et al, 2009] для детекции дупликации экзонов 3-11 в гене DMD в одном случае, и делеции экзонов 47-50 гена DMD во втором приведенном случае, с применением косвенной диагностики с помощью анализа наследования аллелей полиморфных маркеров, сцепленных с патогенным вариантом, а так же маркера AMEL (амелогенин), специфичного для половых хромосом для определения пола эмбрионов. В своем методе Zi Ren и коллеги использовали 10 полиморфных маркеров для установления сцепления с патогенным вариантом, а затем использовали только информативные маркеры (в количестве 3-5) для диагностики эмбрионов. При этом лишь во втором описанном случае 2 маркера приходились на область мутации. Важным преимуществом предлагаемого нами подхода является использование большего количества маркеров (всего 20 маркеров в тест-системе), в сочетании с проведением прямой диагностики мутации. Такой подход позволяет с большей уверенностью выявить случаи рекомбинации, выпадения аллелей и за счет этого повысить достоверность результата ПГТ-М. Так же для более точного определения пола в нашей тест-системе используется не только AMEL, но и маркер SRY (Sex-determining Region Y) специфичный для Y-хромосомы.

Представленный нами метод ПГТ миодистрофии Дюшенна-Беккера решает задачу разработки более точного способа преимплантационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.

Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенного варианта (номер нуклеотида в референсной последовательности геномной ДНК обозначен префиксом NC, номер нуклеотида в референсной последовательности кодирующего транскрипта обозначен префиксом NM): NC_000023.10:g.32466632_32466633del (NM_004006,2:c.3727_3728delCT, NP_000100.3:p.Leu1243AsnfsX10) в гене DMD с двойной системой детекции -прямой и косвенной. (Так как вызываемая этим вариантом утрата функции кодируемого белка представляет собой известный механизм патогенеза миодистрофии Дюшенна-Беккера, не встречается у здоровых людей - он был расценен как патогенный). Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетического варианта NC_000023.10:g.32466632_32466633del (NM_004006.2:c.3727_3728delCT, NP_000100.3:p.Leu1243AsnfsX10) типа делеция (отсутствие нескольких нуклеотидов, англ. Deletion del) были подобраны праймеры, которые позволяют произвести детекцию мутации по разнице длин фрагментов с помощью капиллярного электрофореза. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией, т.е. наследуемых вместе с ней. Для этого на расстоянии не более 3 мБ (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена DMD в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики. STR представляют собой повторы 2х и более нуклеотидов расположенные друг за другом (например пара аденин-цитозин (АЦ), повторяющаяся несколько раз подряд: АЦАЦАЦАЦ) и в большом количестве присутствуют в геноме человека. Количество повторов в каждом из них может варьироваться от индивидуума к индивидууму, а также может быть разным у одного и того же человека на 2х гомологичных хромосомах. Гетерозиготность выше 0,70 означает, что высока вероятность того, что у одного и того же человека количество повторов нуклеотидов в данном STR на одной хромосоме будет отличаться от количества повторов в этом же STR на гомологичной хромосоме, другими словами, аллели данного маркера у этого человека будут отличаться между собой по длине. При амплификации фрагмента, содержащего такой маркер, будут получены ампликоны двух разных длин. Проанализировав количество повторов в нескольких маркерах, окружающих патогенный вариант, и изучив то, как они наследуются в тестируемой семье, можно установить сцепление между аллелями маркеров и патогенным вариантом. Диагностическая ценность исследования количества повторов в данных маркерах у эмбрионов состоит в том, что по тому, какой аллель каждого из маркеров был унаследован эмбрионом, можно судить о том, унаследовал ли эмбрион ген DMD, несущий патогенный вариант, или же он унаследовал ген DMD с другой, гомологичной хромосомы, не содержащий патогенный вариант. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПЦР в 2 раунда, позволяющей повысить точность и эффективность амплификации. В тест-систему были включены 20 STR локусов для гена DMD: DXS28.6, DXS28.7, DXS30.1, DXS8039, DXS985, DXS30.8, DXS30.91, DXS30.92, DXS31.2, DXS1214, DXS1036, DXS1067, DXS33.3, DXS34.0, DXS34.2, DXS538, DXS34.3, DXS34.7, DXS35.2, DXYS154,. Праймеры для амплификации находятся на X хромосоме в районе координат 28304199-35869165 (в соответствии с hg19). Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешними праймерами для первого раунда ПЦР не должна превышать 500 п.н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренних праймеров для второго раунда ПЦР от 120 до 350 п.н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига не отличается более, чем на 1°С.

Подготовительный этап ПГТ На подготовительном этапе проводится проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт WGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mM, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда ПЦР) с концентрацией 10 mM каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton X-100, 1 мкг Proteinase K), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсии эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.

В рамках гнездовой и полугнездовой ПЦР амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами.

Полугнездовая ПЦР

Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п.н. Для второго этапа были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1×PCR Buffer with Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 mM каждого деоксинуклеотида, 0.15 μМ каждого праймера, 2,5 U/μl of HsTaq DNA-polymerase (Евроген, Россия), 6% of DMSO и 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-ого этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.

В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1×PCR буфер с Mg2+(Евроген, Россия), 0.5×RediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher ScientifiCi USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μM каждого праймера, 1U/μl ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μl ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи).

Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативные (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона). Детекция патогенного варианта NC_000023.10:g.32466632_32466633del (NM_004006.2:c.3727_3728delCT, NP_000100.3:p.Leu1243AsnfsX10) проводилась с помощью праймеров для амплификации:

Внешние праймеры: \

5'-ATTTCCCATTCAGCCTAGTG-3' (Fout)

5'-ССАСАААТССАТАССТССАТ-3' (Rout)

Внутренние праймеры:

5'-AAGCGAAAGTGAAACTCCTTAC-3' (rin) в паре с Fout

Пример 1

Пациенты А

В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой родился ребенок с заболеванием миодистрофия Дюшенна-Беккера с гемизиготным вариантом NC_000023.10:g.32466632_32466633del (NM_004006.2:c. 3727_3728delCT, NP_000100.3:p.Leu1243AsnfsX10) в гене DMD. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания миодистрофия Дюшенна-Беккера в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.

Гаплотипирование семьи

На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) членов семьи для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Было проанализировано 20 STR локусов. Из них 10 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры и на маркеры половых хромосом - AMEL+SRY. Полученные результаты по информативным маркерам (аллели, указанные с одной стороны от символа «/», для разных маркеров располагаются на одной хромосоме, то есть составляют группу сцепления): партнер: AMEL+SRY - XY, DXS28.6 -236, DXS30.1 - 184, DXS8039 -224, DXS30.8 - 160, DXS31.2 - 167, DXS1036 - 197, DXS1067 - 326, DMD c.3727_3728delCT - N, DXS34.0 - 276, DXS34.3 - 345; пациентка: AMEL+SRY - XX, DXS28.6 - 238/232, DXS30.1 - 177/186, DXS8039 - 216/214, DXS30.8 - 176/174, DXS31.2 - 167/161, DXS1036 - 200/196, DXS1067 - 322/314, DMD c.3727_3728delCT - del/N, DXS34.0 - 264/272, DXS34.3 - 350/343; ребенок с заболеванием: AMEL+SRY - XY, DXS28.6 - 232, DXS30.1 - 177, DXS8039 - 216, DXS30.8 - 176, DXS31.2 - 167, DXS1036 - 200, DXS1067 - 322, DMD c.3727_3728delCT - del, DXS34.0 - 264, DXS34.3 - 350.

В результате гаплотипирования был сделан вывод, что у пациентки с патогенным вариантом были связаны следующие аллели STR-маркеров: DXS28.6 - 232, DXS30.1 - 177, DXS8039 - 216, DXS30.8 - 176, DXS31.2 - 167, DXS1036 - 200, DXS1067 - 322, DXS34.0 - 264, DXS34.3 - 350.

Преимплантационное генетическое тестирование

В цикле ЭКО было получено 5 эмбрионов, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1xPBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амплификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).

Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции патогенного варианта и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. На 2 этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты: эмбрион1: AMEL+SRY - XY, DXS28.6 - 238DXS30.1 -177, DXS8039 - 216 DXS30.8 -176, DXS31.2 - 167 DXS1036 - 200, DXS1067 - 322DMD c.3727_3728delCT - del, DXS34.0 - 264 DXS34.3 - 350; эмбрион2: AMEL+SRY - X, DXS28.6 - 236/232, DXS30.1 - 184/186, DXS8039 - 224/ADO, DXS30.8 - 160/174. DXS31.2 - 167/161. DXS1036 - 197/196, DXS1067 - 326/314, DMD c.3727_3728delCT - N, DXS34.0 - 276/272, DXS34.3 - ADO/343; эмбрион3: AMEL+SRY - X, DXS28.6 - 236/238, DXS30.1 - 184/177, DXS8039 - 224/216, DXS30.8 - 160/176, DXS31.2 - 167, DXS1036 - 197/200, DXS1067 - 326/322, DMD c.3727_3728delCT - N/del, DXS34.0 - 276/264, DXS34.3 - 345/350; эмбрион4: AMEL+SRY - X, DXS28.6 - 236/232, DXS30.1 -184/186, DXS8039 - 224/214, DXS30.8 - 160/174, DXS31.2 - 167/ADO, DXS1036 -ADO/196, DXS1067- 326/314, DMD c.3727_3728delCT - N/del, DXS34.0 - 276/264, DXS34.3 - 345/350, эмбрион 5: AMEL+SRY - X, DXS28.6 - 236/232, DXS30.1 - 184/186, DXS8039 - 224/214, DXS30.8 - 160/174, DXS31.2 - 167/ADO, DXS1036 - 197/196, DXS1067 - 326/314, DMD c.3727_3728delCT - N, DXS34.0 - 276/272, DXS34.3 - ADO/343;

По результатам прямой и косвенной диагностики 4 эмбриона не унаследовали заболевание (эмбрион 2,3,4,5), при этом эмбрионы 3 и 4 оказались носителями патогенного варианта в гене DMD. У 1 эмбриона выявлен гаплотип, соответствующий унаследованному заболеванию (эмбрион 1).

Перечень последовательностей праймеров:

DXS28.6

SEQ ID NO 1: 5’-GTAAGAGGGTTAGCCTGGCA-3’ (Fout);

SEQ ID NO 2: 5’-CTGATCATTGGGGTTGAGTG-3’ (Rout);

SEQ ID NO : 3 5’-TCTGAGATGGGTATTAGAGGATGA-3’ (Rin),

DXS28.7

SEQ ID NO 4: 5’-TGACCTACCAGAGGAGAAGTAGG-3’ (Fout);

SEQ ID NO 5: 5’-AGACTTCCAGAATAGCAACAGTCT-3’ (Rout)

SEQ ID NO 6: 5’-CTATGGAATAATGGAAGGAACCTA-3’ (Fin);

SEQ ID NO 7: 5’-TCAGAGTTGTAAAGAATTTCACAGG-3’ (Rin),

DXS30.1

SEQ ID NO 8 5’-CAGACCACATCCAATTCCTTAAT-3’ (Fout);

SEQ ID NO 9 5’-AAGAGAATCCAGCAGTGAATGTT-3’ (Rout);

SEQ ID NO 10 5’-CTGATAAAACCGGAGACACTCAT-3’ (Rin),

DXS8039

SEQ ID NO 11 5’-TGAAACTGACAAACCTCTAGCC-3’

(Fout); SEQ ID NO 12 5’-AGAATGAGTTAGGAGTTAGGAGGTATTC-3’

(Rout); SEQ ID NO 13 5’-GCTTATTCATATTTTGTGGGCA-3’ (Rin),

DXS985

SEQ ID NO 14 5’-GATGACAACCAAAGATATCCCC-3’ (Fout);

SEQ ID NO 15 5’-ATCTCCTGCTTCTCAGCTTCTAA-3’ (Rout)

SEQ ID NO 16 5’-GGAAAGATAGCAGAATAGGCACA-3’ (Fin),

DXS30.8

SEQ ID NO 17: 5’-CCAATCTGTGGTTCTCAATGG-3’ (Fout);

SEQ ID NO 18: 5’-AGAGCTGGTGATGTGTGATGTAA-3’ (Rout)

SEQ ID NO 19: 5’-TACAATGCACAAGGCCGA-3’ (Fin),

DXS30.91

SEQ ID NO 20: 5’-GCTATGTAGCAAGTCCAGGCT-3’ (Fout);

SEQ ID NO 21: 5’-CATGCCATGGAGGTGTGTA-3’ (Rout);

SEQ ID NO 22: 5’-CACATTGTTAAGTGACACATGACTG-3’ (Rin),

DXS30.92

SEQ ID NO 23 5’-CCTCAGATATCCTGACTTGGTC-3’ (Fout);

SEQ ID NO 24 5’-CCCAGTTTGTCACTTATCTTTATG-3’ (Rout)

SEQ ID NO 25 5’-GGCATAGAACATGGTGGG-3’ (Fin),

DXS31.2

SEQ ID NO 26 5’-CCTTGGGCTCTGGATTACC-3’ (Fout);

SEQ ID NO 27 5’-CTCATGGGCTCGCTGTC-3’ (Rout)

SEQ ID NO 28 5’-CACGTAAGTTGACCCAAGCA-3’ (Fin),

DXS1214

SEQ ID NO 29: 5’-GGTGTACACGGTCTTGTAACATT-3’ (Fout);

SEQ ID NO 30: 5’-TGGTCATGCAGCGGAC-3’ (Rout);

SEQ ID NO : 31 5’-CAACGTATACCCATTTTGCTTT-3’ (Rin),

DXS1036

SEQ ID NO 32: 5’-AATCCATTTCAATCTCCACTGT-3’ (Fout);

SEQ ID NO 33: 5’-CAAATTGCCTTCAAACACTTC-3’ (Rout);

SEQ ID NO 34: 5’-TCTATCACAGGTTTATTGGCAAC-3’ (Rin),

DXS1067

SEQ ID NO 35 5’-AACCACCTCAGAGACTAAGGGTAT-3’ (Fout);

SEQ ID NO 36 5’-CAAAGCTGTGGTTTGCAATAGT-3’ (Rout)

SEQ ID NO 37 5’-CAATCACCTTATGCCAGAACC-3’ (Fin);

SEQ ID NO 38 5’-CCATTCTGGTGTGCCAAAC-3’ (Rin),

DXS33.3

SEQ IDNO 39: 5’-AACAGACAGCTGGTTTCATAGTTAC-3’ (Fout);

SEQ ID NO 40: 5’-ATATGCTAATCACCGAAGACTTTTT-3’ (Rout);
SEQ ID NO : 41 5’-TATGGACTCAACTTATCTTTCAGGTT-3’ (Rin),

DXS34.0

SEQ ID NO 42: 5’-ATCTACACATGCAACTCTTATGGAT-3’ (Fout);

SEQ ID NO 43: 5’-ATCGCAAGAAAAGAGTGCTTC-3’ (Rout);

SEQ ID NO 44: 5’-TACAAGAAGCAAGAAGTCTGGATG-3’ (Rin),

DXS34.2

SEQ ID NO 45 5’-TGGCTGTTAGTGGCTCCA-3’ (Fout);

SEQ ID NO 46 5’-GTGGACCAGAGTCAGGTTTCT-3’ (Rout)

SEQ ID NO 47 5’-ACTGCTGCTGGGATGTCA-3’ (Fin),

DXS538

SEQ ID NO 48 5’-CTTGGTTCCCCTGTATTCTCTAG-3’ (Fout);

SEQ ID NO 49 5’-GGGACCTAGTCAAGCTCGTATT-3’ (Rout);

SEQ ID NO 50 5’-AGCTAGGCACCTTGTCCTTATT-3’ (Rin),

DXS34.3

SEQ ID NO 51 5’-ATGTAAGGGATTCTAGCGGC-3’ (Fout);

SEQ ID NO 52 5’-AGTCTCTGTAGGACAGTATTCCAACA-3’ (Rout)

SEQ ID NO 53 5’-AGAAGTAGAGATGAACAAATCACCA-3’ (Fin),

DXS34.7

SEQ ID NO 54: 5’-ACTGTGGCATCTCTCCCATAA-3’ (Fout);

SEQ ID NO 55: 5’-TGTTAACTTGGAACAAGCATTAGAG-3’ (Rout)

SEQ ID NO 56: 5’-TCCAGGAAGGCTAAGTTCTATACC-3’ (Fin),

DXS35.2

SEQ ID NO 57: 5’-ATACTGTGCTGTTATCGGTTGAA-3’(Fout);

SEQ ID NO 58: 5’-GTGAGGACCCAGAATACCTGA-3’ (Rout)

SEQ ID NO 59: 5’-AGTGACTGTGGGGTTTATCCA-3’ (Fin);

SEQ ID NO 60: 5’-CAGTAGCCAGTTCATAAAGATGATT-3’ (Rin),

DXYS154

SEQ ID NO 61 5’-GCAAAGATGCCCACTCTCAC-3’ (Fout);

SEQ ID NO 62 5’-ATTACAGGCACCCACCATCA-3’ (Rout);

SEQ ID NO 63 5’-(FAM)-GGCCTGAATTCATTTATTATTCTAATAG-3’ (Rin)

Способ преимплантационного генетического тестирования миодистрофии Дюшенна-Беккера, предусматривающий выявление наследования патогенного варианта NC_000023.10:g.32466632_32466633del, NM_004006.2:c.3727_3728delCT, NP_000100.3:p.Leu1243AsnfsX10 в гене DMD, связанное с двойной системой детекции - прямой и косвенной, при этом прямую детекцию проводят с помощью праймеров для амплификации:

Внешние праймеры:

5’-ATTTCCCATTCAGCCTAGTG-3’ (Fout)

5’-CCACAAATCCATACCTCCAT-3’ (Rout)

Внутренние праймеры:

5'-AAGCGAAAGTGAAACTCCTTAC-3’ (rin) в паре с Fout, а косвенная включает внешние и внутренние праймеры с последовательностями, представленными в SEQ ID №1-63, при этом используют праймеры, направленные на те STR аллели, которые разные на всех хромосомах родителей, где внешние праймеры обозначены как Fout - прямой праймер и Rout - обратный праймер, а внутренние праймеры как Fin - прямой праймер и Rin - обратный праймер, при этом тестирование подразумевает проведение в два этапа полугнездовой ПЦР: на первом этапе проводят мультиплексную ПЦР с внешними праймерами, на втором этапе проводят индивидуальную ПЦР каждого фрагмента с внутренними праймерами, для анализа наследования молекулярно-генетических полиморфных маркеров типа STR, сцепленных с патогенным вариантом, а также метод ПЦР-ПДРФ для определения патогенного варианта.