Способы иммунотерапии и композиции, включающие модуляторы метаболического пути триптофана

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к онкологии, и предназначена для лечения злокачественного новообразования. Для лечения злокачественного новообразования осуществляют введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние, представляющие собой злокачественное новообразование, а также введение индивидууму терапевтически эффективного количества ингибитора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина после начала введения T-клеточного терапевтического средства. Использование группы изобретений позволяет повысить эффективность лечения злокачественного новообразования за счет предотвращения состояний триптофанового голодания в терапевтических Т-клетках. 2 н. и 40 з.п. ф-лы, 21 ил., 1 табл., 16 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[1] По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной патентной заявки США № 62/407776, зарегистрированной 13 октября 2016 года, названной "IMMUNOTHERAPY METHODS AND COMPOSITIONS INVOLVING TRYPTOPHAN METABOLIC PATHWAY MODULATORS", и предварительной патентной заявки США № 62/514767, зарегистрированной 2 июня 2017 года, названной "IMMUNOTHERAPY METHODS AND COMPOSITIONS INVOLVING TRYPTOPHAN METABOLIC PATHWAY MODULATORS", содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Включение списка последовательностей в качестве ссылки

[2] Настоящая заявка зарегистрирована вместе со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей подан в виде файла, названного 735042007540SeqList.txt, созданного 12 октября 2017 года, размер которого составляет 136 килобайт. Информация в электронном формате списка последовательностей включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Область техники

[3] Настоящее изобретение в некоторых аспектах относится к способам, композициям и применению, включающим иммунотерапевтические средства, такие как адоптивная клеточная терапия, например, T-клеточная терапия, и модуляторы пути, вовлеченного в метаболизм триптофана, такого как альтернативный метаболический путь триптофана и/или его компонент или метаболит. В некоторых вариантах осуществления модуляторы включают модуляторы пути кинуренина, включая модуляторы одной или более реакций или компонентов, способствующих метаболизму триптофана через путь кинуренина, и/или их метаболитов. Способы, композиции и применение по настоящему изобретению включают способы, композиции и применение для способов комбинированного лечения, включающих введение или применение одного или более таких модуляторов (например, ингибитора фермента в таких путях) в комбинации с другим средством, таким как иммунотерапевтическое средство, такое как терапевтическое антитело, например, мультиспецифическое (например, привлекающее T-клетки) антитело, и/или клеточная терапия, например, с использованием T-клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR). Кроме того, композиции и применение по настоящему изобретению включают одно или более таких иммунотерапевтических средств, таких как сконструированные клетки, обработанные, измененные или сконструированные с использованием одного или более таких модуляторов или так, чтобы они включали один или более таких модуляторов. Кроме того, сконструированные клетки включают клетки, в которых экспрессию, активность или функцию молекулы, такой как белок, вовлеченной в иммуносупрессорную активность клеток в ответ на метаболизм триптофана, такой как катаболизм триптофана, модифицируют, изменяют, нарушают или влияют на нее. Изобретение также относится к способам производства сконструированных клеток, клеткам, композициям, способам введения индивидуумам, нуклеиновым кислотам, промышленным изделиям и наборам для применения в способах. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям, включающим иммунотерапевтическое средство, такое как сконструированные клетки, модулятор кинуренина и/или триптофана и инструкции по их введению. В некоторых аспектах признаки способов и клеток обеспечивают повышенную или улучшенную активность, функцию, персистирование, экспансию и/или пролиферацию клеток для адоптивной клеточной терапии или эндогенных иммунных клеток, рекрутируемых с помощью иммунотерапевтических средств.

Предпосылки изобретения

[4] Доступны различные стратегии иммунотерапии, например, введение сконструированных T-клеток для адоптивной терапии. Например, доступны стратегии конструирования T-клеток, экспрессирующих генетически сконструированные антигенные рецепторы, такие как CAR, и введения индивидуумам композиций, содержащих такие клетки. Необходимы улучшенные стратегии клеточной терапии. Например, в некоторых случаях желательными являются стратегии с улучшением одного или более аспектов клеток или исходов после введения, например, улучшение персистирования, активности и/или пролиферации клеток после введения индивидуумам. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам, клеткам, композициям, наборам и системам, удовлетворяющим такие потребности.

Сущность изобретения

[5] Изобретение относится к способам повышения или модуляции пролиферации и/или активности иммунных клеток при иммунотерапии, такой как T-клеточная терапия (например, CAR-экспрессирующими T-клетками) или терапия с привлечением T-клеток. В некоторых вариантах осуществления способы, как правило, включают проведение комбинированного лечения с использованием иммунотерапии, такой как T-клеточная терапия (например, CAR-экспрессирующими T-клетками) или терапия с привлечением T-клеток, и модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[6] Изобретение относится к способам лечения, включающим: (a) введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние; и (b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина начинают более чем за 1 день до начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[7] Изобретение относится к способам лечения, включающим введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние, где индивидууму ранее вводили терапевтически эффективное количество модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, начиная более чем за 1 день до начала T-клеточной терапии.

[8] В некоторых вариантах осуществления любого из способов, представленных в настоящем описании, введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина начинают в момент времени в пределах или в пределах приблизительно 2 дней, 3 дней, 6 дней, 12 дней, 15 дней, 30 дней, 60 дней или 90 дней или более до начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает продолжение введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина с началом или после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина после введения клеточного терапевтического средства.

[9] Изобретение относится к способам лечения, включающим: (a) введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние; и (b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина после начала введения T-клеточного терапевтического средства. Изобретение также относится к способам лечения, включающим введение индивидууму, имеющему злокачественное новообразование, терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где индивидууму ранее вводили T-клеточное терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов или 48 часов после начала T-клеточной терапии.

[10] В некоторых вариантах осуществления до начала введения композиции, содержащей T-клетки, индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

[11] Изобретение относится к способам лечения, включающим: (a) введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние; и (b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где до начала введения композиции, содержащей T-клетки, индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

[12] Изобретение относится к способам лечения, включающим: введение индивидууму, имеющему заболевание или состояние, терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где индивидууму вводили T-клеточное терапевтическое средство, где до начала введения композиции, содержащей T-клетки, индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

[13] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние является злокачественным новообразованием.

[14] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят до, во время и/или после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимого на стадии (b), начинают в момент времени в пределах или в пределах приблизительно 2 дней, 3 дней, 6 дней, 12 дней, 15 дней, 30 дней, 60 дней или 90 дней или более до начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[15] В некоторых вариантах осуществления способы также включают введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимого на стадии (b), после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[16] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда: наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства; во время до снижения количества клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; до того, как T-клетки начнут проявлять признаки длительного триптофанового голодания, истощения, снижения эффекторной функции, экспрессии ингибиторных рецепторов и/или утраты пролиферативной способности; до того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства станет детектируемым в крови индивидуума, и/или уровень интерферона-гамма (ИФНγ) повысится в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

[17] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней после начала T-клеточной терапии.

[18] В некоторых вариантах осуществления любого из способов, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда: наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства; количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится более или более чем приблизительно в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз или 100 раз или более по сравнению с пиковым или максимальным количеством клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума после начала введения T-клеточного терапевтического средства; и/или после того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства становится детектируемым в крови индивидуума, количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, составит менее 10%, менее 5%, менее 1% или менее 0,1% от всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) в крови индивидуума; уровень ИФН-гамма повышается в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим. В некоторых вариантах осуществления биологический образец является образцом сыворотки, или плазмы, или опухоли или является опухолью.

[19] В некоторых вариантах осуществления любого из способов, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает образование, концентрацию, доступность, метаболизм и/или эффект фермента и/или метаболита пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает катаболизм триптофана или предотвращает или снижает синтез или накопление метаболита триптофана. В некоторых вариантах осуществления метаболит триптофана выбран из кинуренина, 3-гидроксикинуренина и 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является низкомолекулярным соединением, пептидом, белком, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты.

[20] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является антагонистом фермента кинурениназы.

[21] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), ингибитором IDO2 и ингибитором триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO/TDO двойного действия. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1).

[22] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO1, и модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина IDO1 вводят, когда наблюдают повышение экспрессии или активности IDO1 в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[23] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

[24] В некоторых вариантах осуществления любого из способов, представленных в настоящем описании, злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по IDO1, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1; и/или злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по TDO, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии TDO. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по IDO1, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1.

[25] В некоторых вариантах осуществления любого из способов, представленных в настоящем описании, злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства; и/или злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по TDO до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии TDO до начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[26] Изобретение относится к способам лечения, включающим (a) введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние, где злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназе 1 (IDO1) или триптофан-2,3-диоксигеназе (TDO) до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1, или TDO-положительной опухоли до начала введения T-клеточного терапевтического средства; и; и (b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, являющегося ингибитором IDO1.

[27] Изобретение также относится к способам лечения, включающим введение индивидууму, имеющему злокачественное новообразование, терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, являющегося ингибитором IDO1, где индивидууму вводили T-клеточное терапевтическое средство, где злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназе 1 (IDO1) или триптофан-2,3-диоксигеназе (TDO) до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1, или TDO-положительной опухоли до начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[28] Изобретение также относится к способам лечения, включающим введение индивидууму, имеющему злокачественное новообразование, T-клеточного терапевтического средства, где, индивидууму вводили терапевтически эффективное количество модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, являющегося ингибитором IDO1, где злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназе 1 (IDO1) или триптофан-2,3-диоксигеназе (TDO) до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1, или TDO-положительной опухоли до начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[29] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние является злокачественным новообразованием.

[30] В некоторых вариантах осуществления любого из способов, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят до, во время и/или после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[31] В некоторых вариантах осуществления до начала введения композиции, содержащей T-клетки, индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

[32] В некоторых вариантах осуществления способ также включает введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимого на стадии (b), после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[33] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда: наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства; до того, как количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; до того, как T-клетки начнут проявлять признаки длительного триптофанового голодания, истощения, снижения эффекторной функции, экспрессии ингибиторных рецепторов и/или утраты пролиферативной способности; до того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства станет детектируемым в крови индивидуума; и/или уровень интерферона-гамма (ИФНγ) повысится в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

[34] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней после начала T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов или 48 часов после начала T-клеточной терапии.

[35] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно от 0 до 96 часов, от 0 до 72 часов, от 0 до 48 часов, от 0 до 24 часов, от 0 до 12 часов или 0 до 6 часов или 0 до 2 часов до начала T-клеточной терапии; или модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят не более чем за 96 часов, 72 часа, 48 часов, 24 часа, 12 часов, 6 часов, 2 часа или 1 час до начала T-клеточной терапии.

[36] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из 1-метил-D-триптофана (1-MT) (индоксимода), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (INCB024360, эпакадостата), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанола (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или их комбинации.

[37] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (INCB024360, эпакадостатом). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 1-метил-D-триптофаном (1-MT) (индоксимодом). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

[38] Изобретение относится к способам лечения, включающим: (a) введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние; и (b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина представляет собой или содержит 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамид (INCB024360, эпакадостат).

[39] Изобретение также относится к способам лечения, включающим введение индивидууму, имеющему злокачественное новообразование, терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина представляет собой или содержит 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамид (INCB024360, эпакадостат), где индивидууму вводили T-клеточное терапевтическое средство.

[40] Изобретение также относится к способам лечения, включающим введение индивидууму, имеющему злокачественное новообразование, T-клеточного терапевтического средства, где индивидууму вводили терапевтически эффективное количество модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина представляет собой или содержит 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамид (INCB024360, эпакадостат).

[41] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние является злокачественным новообразованием.

[42] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, после введения индивидууму T-клеточное терапевтическое средство вызывает повышение уровня ИФН-гамма у индивидуума в локальном окружении опухоли или в образце сыворотки или плазмы индивидуума по сравнению с уровнем ИФН-гамма у индивидуума до начала T-клеточной терапии.

[43] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, T-клеточная терапия представляет собой или включает терапию инфильтрирующими опухоль лимфоцитами (TIL) или T-клеточную терапию, включающую генетически сконструированные клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом. В некоторых вариантах осуществления T-клеточная терапия представляет собой или включает генетически сконструированные клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом.

[44] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, генетически сконструированная клетка также включает модификацию, влияющую на экспрессию, наличие или активность белка, или другого фактора, или молекулы, ассоциированной с одной или более активностями, исходами или эффектами, и/или нуклеиновой кислоты, кодирующей такой белок или фактор. В некоторых аспектах активности, исходы или эффекты могут включать активности, исходы или эффекты, ассоциированные, вовлеченные в восприятие или стимулируемые недостаточностью триптофана или триптофановым голоданием. В некоторых аспектах активности, исходы или эффекты могут включать активности, исходы или эффекты, ассоциированные, вовлеченные в восприятие или стимулируемые повышенными количествами или концентрациями кинуренина или одного или более метаболитов пути кинуренина, и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией, и/или сниженными соотношениями триптофана/кинуренина в клетке или окружении. В некоторых вариантах осуществления белок или фактор представляет собой или включает белок, вовлеченный в восприятие или ассоциированный с триптофановым голоданием и/или кинуренин-опосредованными иммуносупрессорными эффектами, такими как эффекты, которые могут ограничивать функцию T-клеток, например, в опухолевом окружении. Такие эффекты могут включать ингибирование или ослабление активности или функции T-клеток и/или стимуляцию функции, уровней или активности Treg. В некоторых вариантах осуществления белок или фактор вовлечен в IDO-индуцированные иммуносупрессорные эффекты в клетке и/или соседних клетках.

[45] Изобретение относится к способам лечения, включающим введение генетически сконструированных T-клеток индивидууму, имеющему заболевание или состояние, где генетически сконструированная T-клетка содержит (i) рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, и (ii) модификацию экспрессии белка, вовлеченного или ассоциированного с восприятием триптофанового голодания и/или кинуренин-опосредованными иммуносупрессорными эффектами, и/или белка, ассоциированного с IDO-опосредованными иммуносупрессорными эффектами в клетке.

[46] Изобретение также относится к способам лечения, включающим введение генетически сконструированных T-клеток индивидууму, имеющему заболевание или состояние, где генетически сконструированная T-клетка содержит (i) рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, и (ii) рекомбинантный, сконструированный и/или эктопически экспрессируемый транспортер аминокислот или его цепь или функциональную и/или каталитически активную часть или вариант. В некоторых вариантах осуществления способы также включают (b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[47] Изобретение относится к способам лечения, включающим: (a) введение генетически сконструированных T-клеток индивидууму, имеющему заболевание или состояние, где генетически сконструированная T-клетка содержит (i) рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, и (ii) модификацию экспрессии белка, вовлеченного или ассоциированного с восприятием триптофанового голодания и/или кинуренин-опосредованными иммуносупрессорными эффектами, и/или белка, ассоциированного с IDO-опосредованными иммуносупрессорными эффектами в клетке; и (b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[48] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние является злокачественным новообразованием.

[49] В некоторых вариантах осуществления индивидуума выбирают по наличию опухоли, положительной по экспрессии транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), тяжелой цепи CD98 (4F2hc; CD98hc; SLC3A2) и/или протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4), или по наличию клеток в микроокружении опухоли, положительных по экспрессии LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4.

[50] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает образование, концентрацию, доступность, метаболизм и/или эффект фермента и/или метаболита пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает катаболизм триптофана или предотвращает или снижает синтез или накопление метаболита триптофана. В некоторых вариантах осуществления метаболит триптофана выбран из кинуренина, 3-гидроксикинуренина и 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA).

[51] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является низкомолекулярным соединением, пептидом, белком, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты.

[52] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является антагонистом фермента кинурениназы.

[53] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), ингибитором IDO2 и ингибитором триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO/TDO двойного действия.

[54] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1). В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из 1-метил-D-триптофана (1-MT) (индоксимода), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (INCB024360, эпакадостата), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил} амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанола (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или их комбинации.

[55] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (INCB024360, эпакадостатом). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 1-метил-D-триптофаном (1-MT) (индоксимодом). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

[56] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[57] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, молекула, белок или фактор, ассоциированные с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированные с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированные с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, являются mTOR или протеинкиназой C тета (PKC-Θ).

[58] В некоторых вариантах осуществления до начала введения композиции, содержащей T-клетки, индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

[59] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят до, во время и/или после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления, включающих введение, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[60] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда: наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства; до того, как количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; до того, как T-клетки начнут проявлять признаки длительного триптофанового голодания, истощения, снижения эффекторной функции, экспрессии ингибиторных рецепторов и/или утраты пролиферативной способности; до того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства станет детектируемым в крови индивидуума, и/или уровень интерферона-гамма (ИФНγ) повысится в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

[61] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней после начала T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов или 48 часов после начала T-клеточной терапии.

[62] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно от 0 до 96 часов, от 0 до 72 часов, от 0 до 48 часов, от 0 до 24 часов, от 0 до 12 часов или 0 до 6 часов или 0 до 2 часов до начала T-клеточной терапии; или модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят не более чем за 96 часов, 72 часа, 48 часов, 24 часа, 12 часов, 6 часов, 2 часов или 1 часа до начала T-клеточной терапии.

[63] В некоторых вариантах осуществления модификация включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования и/или эктопическую экспрессию молекулы или ее функциональной и/или каталитически активной цепи, части или варианта. В некоторых вариантах осуществления молекула является mTOR или протеинкиназой C тета (PKC-Θ).

[64] В некоторых вариантах осуществления молекула является транспортером аминокислот или его цепью или функциональной и/или каталитически активной частью или вариантом. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является транспортером триптофана. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь выбраны из одного или более из rBAT (SLC3A1), тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), транспортера аминокислот Asc-типа 1 (Asc-1; SLC7A10), натрий- и хлор-зависимого транспортера нейтральных и основных аминокислот B(0+)(ATB0,+; SLC6A14), натрий-зависимого транспортера нейтральных аминокислот B(0)AT1 (B(0)AT1; SLC6A19), транспортера монокарбоксилата 10 (TAT1; SLC16A10) и протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4) или их части. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь содержит тяжелую цепь CD98 (4F2hc; SLC3A2) и транспортер аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5) или их часть.

[65] В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 36-44 или их части, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 36-44 или их части. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь выбраны из одного или более из тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) и протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4) или их части. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь содержит тяжелую цепь CD98 (4F2hc; SLC3A2) и транспортер аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5) или их часть.

[66] В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO:37-39 и 44 или их части, или аминокислотную последовательности, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 37-39 и 44 или их части. В некоторых вариантах осуществления экспрессия молекулы в клетке находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

[67] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модификация включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования и/или эктопическую экспрессию белка или его функциональной и/или каталитически активной части или варианта. В некоторых вариантах осуществления экспрессия белка в клетке находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

[68] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, молекула, белок или фактор, ассоциированные с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированные с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированные с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, являются киназой GCN2, BLIMP-1, арил-углеводородным рецептором (AHR) или ядерным транспортером AHR (ARNT). В некоторых вариантах осуществления молекула выбрана из киназы GCN2, BLIMP-1, арил-углеводородного рецептора (AHR), ядерного транспортера AHR (ARNT), эукариотического фактора инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующего фактора транскрипции 4 (ATF4) или белка, гомологичного CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 и ИФНγ-R2. В некоторых вариантах осуществления молекула является GCN2 или CHOP.

[69] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модификация включает сниженную экспрессию молекулы. В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка включает ингибиторную нуклеиновую кислоту или генетическое повреждение, снижающее экспрессию молекулы. В некоторых вариантах осуществления экспрессия молекулы в клетке снижена по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с экспрессией в клетке в отсутствие средства или генетического повреждения.

[70] В некоторых вариантах осуществления любого из способов, представленных в настоящем описании, способ включает введение ингибиторной нуклеиновой кислоты в клетку и, таким образом, осуществление снижения экспрессии молекулы. В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка включает ингибиторную нуклеиновую кислоту, и ингибиторная нуклеиновая кислота включает средство РНК-интерференции. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота представляет собой или включает или кодирует малую интерферирующую РНК (миРНК), микроРНК-адаптированную shRNA, короткую шпилечную РНК (shRNA), шпилечную миРНК, микроРНК (мкРНК-предшественник) или микроРНК (мкРНК). В некоторых вариантах осуществления способ включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей или приводящей к продукции ингибиторной нуклеиновой кислоты, в клетку и, таким образом осуществление снижения экспрессии молекулы.

[71] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, экспрессия ингибиторной нуклеиновой кислоты находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

[72] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, сконструированная клетка включает генетическое повреждение, где: повреждение включает повреждение гена, кодирующего молекулу на уровне ДНК, и/или повреждение не является обратимым; и/или повреждение не является транзиторным. В некоторых вариантах осуществления повреждение включает встраивание в клетку ДНК-связывающего белка или ДНК-связывающей нуклеиновой кислоты, специфически связывающейся или гибридизующейся с геном, кодирующим молекулу.

[73] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, повреждение включает встраивание: (a) слитого белка, включающего направленно воздействующий на ДНК белок и нуклеазу, или (b) РНК-направляемой нуклеазы. В некоторых вариантах осуществления направленно воздействующий на ДНК белок или РНК-направляемая нуклеаза включает белок с цинковыми пальцами (ZFP), белок TAL или короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR), специфические для гена. В некоторых вариантах осуществления повреждение включает встраивание средства в клетку, включая нуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN), TAL-эффекторную нуклеазу (TALEN) или комбинацию CRISPR-Cas9, специфически связывающуюся, распознающую или гибридизующуюся с геном, кодирующим молекулу. В некоторых вариантах осуществления средство является комбинацией CRISPR-Cas9, и комбинация CRISPR-Cas9 включает гидовую РНК (gRNA), содержащую гидовую последовательность, комплементарную и/или способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в гене.

[74] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, генетическое повреждение является индуцибельным. В некоторых вариантах осуществления комплекс CRISPR-Cas9 является индуцибельным CRISPR-Cas9, и/или Cas9 находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

[75] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, повреждение включает делецию, по меньшей мере, части по меньшей мере одного экзона гена, кодирующего молекулу.

[76] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, повреждение включает делецию, мутацию и/или инсерцию в гене, приводящую к наличию преждевременного стоп-кодона в гене; и/или повреждение включает делецию, мутацию и/или инсерцию в первом или втором экзоне гена, кодирующего молекулу.

[77] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, зависящий от условий промотор, или энхансер, или трансактиватор является индуцибельным промотором, энхансером или трансактиватором или репрессируемым промотором, энхансером или трансактиватором. В некоторых вариантах осуществления промотор выбран из промотора РНК-полимеразы I, РНК-полимеразы II или РНК-полимеразы II. В некоторых вариантах осуществления промотор выбран из: промотора РНК-полимеразы III, являющегося промотором U6 или H1; или промотора РНК-полимеразы II, являющегося промотором CMV, ранним промотором SV40 или главным поздним промотором аденовируса.

[78] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, промотор является индуцибельным промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор содержит последовательность оператора Lac, последовательность тетрациклинового оператора, последовательность галактозного оператора или последовательность доксициклинового оператора или является ее аналогом.

[79] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, промотор является репрессируемым промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор способен связываться с репрессором Lac или тетрациклиновым репрессором или является его аналогом.

[80] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, является функциональным не-T-клеточным рецептором. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, является химерным антигенным рецептором (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, специфически связывающийся с антигеном, и внутриклеточную сигнальную область, включающую ITAM. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный домен цепи CD3-дзета (CD3ζ).

[81] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, CAR также содержит костимуляторную сигнальную область. В некоторых вариантах осуществления костимуляторная сигнальная область содержит сигнальный домен CD28 или 4-1BB или ICOS или его сигнальную часть. В некоторых вариантах осуществления костимуляторная сигнальная область является сигнальным доменом CD28.

[82] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, рекомбинантный рецептор является трансгенным T-клеточным рецептором (TCR). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор является химерным антигенным рецептором (CAR).

[83] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, T-клеточное терапевтическое средство распознает или направленно воздействует на антиген, ассоциированный со злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор связывается, распознает или направленно воздействует на антиген, ассоциированный со злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления антиген выбран из ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA, поверхностного антигена вируса гепатита B, рецептор фолата альфа, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, фетального рецептора ацетилхолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, ИЛ-22R-альфа, ИЛ-13R-альфа 2, kdr, каппа-легкой цепи, антигена Льюиса Y, молекулы адгезии клеток L1, MAGE-A1, мезотелина, MUC1, MUC16, PSCA, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкоэмбрионального антигена, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбрионального антигена (CEA), простатспецифического антигена, PSMA, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфрина B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, белка опухоли Вильмса 1 (WT-1) и циклина A1 (CCNA1).

[84] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназе 1 (IDO1), и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназе 1 (IDO1) до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование включает опухоль, положительную по экспрессии транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), тяжелой цепи CD98 (4F2hc; CD98hc; SLC3A2) и/или протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4), или злокачественное новообразование содержит клетки в микроокружении опухоли, положительные по экспрессии LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4.

[85] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, злокачественное новообразование является миеломой, лимфомой, лейкозом. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование является неходжкинской лимфомой (NHL), острым лимфобластным лейкозом (ALL), хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL), диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой (DLBCL), и миеломой. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование не экспрессирует B-клеточный антиген или не является B-клеточным злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование не экспрессирует CD19, и/или T-клеточное терапевтическое средство не включает рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с CD19, и/или T-клеточное терапевтическое средство является CAR-T-клеточным терапевтическим средством, невключающим антигенсвязывающий домен против CD19.

[86] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, злокачественное новообразование является негематологическим злокачественным новообразованием или является солидной опухолью.

[87] В некоторых вариантах осуществления способ приводит к повышению уровней триптофана и/или снижению уровней кинуренина в опухоли или биологическом образце индивидуума, необязательно, образце сыворотки, плазмы или опухоли, по сравнению со способом, включающим введение T-клеточного терапевтического средства, но в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина или по сравнению со способом, в котором вводят клетку, несодержащую модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию.

[88] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, T-клеточное терапевтическое средство демонстрирует повышенную или пролонгированную экспансию и/или персистирование в организме индивидуума по сравнению со способом, в котором T-клеточное терапевтическое средство вводят индивидууму в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[89] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят перорально, подкожно или внутривенно. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят перорально.

[90] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в количестве или в количестве приблизительно от 2,5 мг до приблизительно 5000 мг, от 2,5 мг до 2000 мг, от 2,5 мг до 1000 мг, от 2,5 мг до 500 мг, от 2,5 мг до 200 мг, от 2,5 мг до 100 мг, от 2,5 мг до 50 мг, от 2,5 мг до 25 мг, от 2,5 мг до 10 мг, от 25 мг до 5000 мг, от 25 мг до 2000 мг, от 25 мг до 1000 мг, от 25 мг до 500 мг, от 25 мг до 200 мг, от 25 мг до 100 мг, от 25 мг до 50 мг, от 50 мг до 5000 мг, от 50 мг до 2000 мг, от 50 мг до 1000 мг, от 50 мг до 500 мг, от 50 мг до 200 мг, от 50 мг до 100 мг, от 100 мг до 5000 мг, от 100 мг до 2000 мг, от 100 мг до 1000 мг, от 100 мг до 500 мг, от 100 мг до 200 мг, от 200 мг до 5000 мг, от 200 мг до 2000 мг, от 200 мг до 1000 мг, от 200 мг до 500 мг, от 500 мг до 5000 мг, от 500 мг до 2000 мг, от 500 мг до 1000 мг или от 1000 мг до 2000 мг, включительно. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят шесть раз в сутки, пять раз в сутки, четыре раза в сутки, три раза в сутки, два раза в сутки или раз в сутки. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в общей суточной дозе по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 5 мг/сутки, 10 мг/сутки, 25 мг/сутки, 50 мг/сутки, 100 мг/сутки, 200 мг/сутки, 400 мг/сутки, 500 мг/сутки, 600 мг/сутки, 800 мг/сутки, 1000 мг/сутки, 1200 мг/сутки, 1600 мг/сутки, 2000 мг/сутки, 5000 мг/сутки или 10000 мг/сутки.

[91] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина продолжают после начала введения T-клеточного терапевтического средства до того, как: наблюдают повышение уровней триптофана, снижение уровней кинуренина и/или снижение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем непосредственно перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина или по сравнению со временем непосредственно перед началом введения T-клеточного терапевтического средства; количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, повысится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке непосредственно перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина или по сравнению с предшествующей временной точкой после введения T-клеточного терапевтического средства; количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови, будет находиться в пределах 2,0-кратного (более или менее) пикового или максимального количества клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума после начала введения T-клеточного терапевтического средства; и/или количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, составит более или более приблизительно 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50% или 60% всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) в крови индивидуума.

[92] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят до того, как: концентрация или количество сконструированных клеток в крови индивидуума составит (i) по меньшей мере или приблизительно 10 сконструированных клеток на микролитр, (ii) по меньшей мере 20%, 30%, 40% или 50% общего количества мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), (iii) по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1×10⁵ сконструированных клеток; или (iv) кровь будет содержать по меньшей мере 5000 копий ДНК, кодирующей рекомбинантный рецептор на микрограмм ДНК; и/или в день 90 после начала введения на стадии (a) CAR-экспрессирующие клетки будут детектируемыми в крови или сыворотке индивидуума; и/или в день 90 после начала введения на стадии (a) кровь индивидуума будет содержать по меньшей мере 20% CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере 10 CAR-экспрессирующих клеток на микролитр или по меньшей мере 1×10⁴ CAR-экспрессирующих клеток.

[93] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в течение периода времени до 2 дней, до 7 дней, до 14 дней, до 21 дня, до одного месяца, до двух месяцев, до трех месяцев, до 6 месяцев или до 1 года после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[94] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, T-клеточная терапия включает T-клетки, являющиеся CD4+ или CD8+. В некоторых вариантах осуществления T-клеточное терапевтическое средство включает клетки, являющиеся аутологичными для индивидуума. В некоторых вариантах осуществления T-клеточное терапевтическое средство включает T-клетки, являющиеся аллогенными для индивидуума.

[95] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, T-клеточное терапевтическое средство вводят в количестве, подходящем для положительной регуляции экспрессии IDO1 в микроокружении опухоли. В некоторых вариантах осуществления экспрессия IDO1 подвергается положительной регуляции в миелоидных клетках, стромальных клетках или опухолевых клетках или со стороны миелоидных клеток, стромальных клеток или опухолевых клеток. В некоторых вариантах осуществления экспрессия IDO1 подвергается положительной регуляции в стромальных клетках костного мозга или со стороны стромальных клеток костного мозга.

[96] В некоторых вариантах осуществления любого из способов, представленных в настоящем описании, клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 3×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 2×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 1×10⁶ клетка/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 3×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 2×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 2,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 2,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 3×10⁶ клеток/кг или от или приблизительно от 3,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, включительно.

[97] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, вводимая доза клеток является более низкой, чем доза в способе, в котором клеточное терапевтическое средство вводят без введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, или способе, в котором клетки не содержат модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию. В некоторых вариантах осуществления доза является по меньшей мере в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз или 10 раз меньшей.

[98] В некоторых вариантах осуществления любого из способов, представленных в настоящем описании, T-клеточное терапевтическое средство вводят в виде единой фармацевтической композиции, содержащей клетки. В некоторых вариантах осуществления T-клеточная терапия включает дозу клеток, являющуюся фракционированной дозой, где клетки из дозы вводят во множестве композиций, в совокупности содержащих клетки из дозы, в течение периода времени не более трех дней.

[99] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, способ дополнительно включает введение противолимфоцитарного химиотерапевтического средства перед введением T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления способ не включает введение индивидууму флударабина. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, способы по изобретению не включают введение индивидууму противолимфоцитарного химиотерапевтического средства перед введением T-клеточного терапевтического средства.

[100] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор конструируют посредством встраивания в клетку первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, и одной или более вторых последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих средство, способное модифицировать или вовлеченное в модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в одном или более полинуклеотидах. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в двух полинуклеотидах. В некоторых вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота и вторые нуклеиновые кислоты содержатся в одном или более векторах, необязательно, являющихся вирусными векторами.

[101] Изобретение относится к способам выбора индивидуума, имеющего заболевание или состояние, для введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, включающим: (a) анализ уровня триптофана или метаболита триптофана, уровня экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO или уровня интерферона-гамма (ИФНγ) в одном или более биологических образцах индивидуума, где биологический образец получают из индивидуума, являющегося кандидатом для лечения с использованием T-клеточной терапии; и (b) выбор индивидуума, у которого: (i) уровень триптофана в образце ниже порогового уровня; (ii) уровень метаболита триптофана выше порогового уровня; (iii) уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO выше порогового уровня; или (iv) уровень ИФНγ выше порогового уровня.

[102] В некоторых вариантах осуществления один или более биологических образцов получают перед введением T-клеточного терапевтического средства.

[103] В некоторых вариантах осуществления способы также включают введение индивидууму T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления способы также включают введение выбранному индивидууму модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят выбранному индивидууму до или одновременно с началом введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[104] Изобретение относится к способам выбора индивидуума, имеющего заболевание или состояние, для введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, включающим: (a) анализ уровня триптофана или метаболита триптофана, уровня экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO или уровня интерферона-гамма (ИФНγ) в одном или более биологических образцах индивидуума, где биологический образец получают из индивидуума, которому вводили T-клеточное терапевтическое средство; и (b) выбор индивидуума, у которого: (i) уровень триптофана в образце ниже порогового уровня или снижен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; (ii) уровень метаболита триптофана выше порогового уровня или повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; (iii) уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO выше порогового уровня или повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; или (iv) уровень ИФНγ выше порогового уровня или повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[105] В некоторых вариантах осуществления один или более биологических образцов получают после введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления способы также включают введение индивидууму клеточного терапевтического средства перед оценкой. В некоторых вариантах осуществления способы также включают введение модулятора пути кинуренина индивидууму.

[106] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда: наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства; до того, как количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; до того, как T-клетки начнут проявлять признаки длительного триптофанового голодания, истощения, снижения эффекторной функции, экспрессии ингибиторных рецепторов и/или утраты пролиферативной способности; до того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства станет детектируемым в крови индивидуума, и/или уровень интерферона-гамма (ИФНγ) повысится в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

[107] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней после начала T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов или 48 часов после начала T-клеточной терапии.

[108] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние является злокачественным новообразованием.

[109] В некоторых вариантах осуществления индивидуума выбирают, если уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления индивидуума выбирают, если уровень триптофана в образце ниже порогового уровня или снижен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[110] В некоторых вариантах осуществления пороговый уровень составляет в пределах 25%, 20%, 15%, 10% или 5% от среднего уровня, концентрации или количества, и/или находится в пределах стандартного отклонения среднего уровня, концентрации или количества в биологических образцах множества контрольных индивидуумов. В некоторых вариантах осуществления контрольные индивидуумы являются здоровыми или нормальными индивидуумами, являются индивидуумами, неимеющими злокачественное новообразование, и/или индивидуумами до введения T-клеточного терапевтического средства.

[111] В некоторых вариантах осуществления повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

[112] В некоторых вариантах осуществления перед оценкой индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

[113] В некоторых вариантах осуществления биологический образец представляет собой образец сыворотки, плазмы или опухоли или его получают из него.

[114] В некоторых вариантах осуществления метаболит триптофана выбран из кинуренина, 3-гидроксикинуренина и 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA).

[115] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является низкомолекулярным соединением, пептидом, белком, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты.

[116] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является антагонистом фермента кинурениназы.

[117] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), ингибитором IDO2 и ингибитором триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO/TDO двойного действия.

[118] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1). В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из 1-метил-D-триптофана (1-MT) (индоксимода), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (INCB024360, эпакадостата), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанола (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или их комбинации.

[119] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (INCB024360, эпакадостатом). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 1-метил-D-триптофаном (1-MT) (индоксимодом). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

[120] В некоторых вариантах осуществления T-клетка содержит рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, являющийся функциональным не-T-клеточным рецептором.

[121] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, является функциональным не-T-клеточным рецептором. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, является химерным антигенным рецептором (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, специфически связывающийся с антигеном, и внутриклеточную сигнальную область, включающую ITAM. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный домен цепи CD3-дзета (CD3ζ).

[122] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, CAR также содержит костимуляторную сигнальную область. В некоторых вариантах осуществления костимуляторная сигнальная область содержит сигнальный домен CD28 или 4-1BB или ICOS или его сигнальную часть. В некоторых вариантах осуществления костимуляторная сигнальная область является сигнальным доменом CD28.

[123] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, рекомбинантный рецептор является трансгенным T-клеточным рецептором (TCR). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор является химерным антигенным рецептором (CAR).

[124] В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, T-клеточное терапевтическое средство распознает или направленно воздействует на антиген, ассоциированный со злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор связывается, распознает или направленно воздействует на антиген, ассоциированный со злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления антиген выбран из ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA, поверхностного антигена вируса гепатита B, рецептора фолата альфа, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, фетального рецептора ацетилхолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, ИЛ-22R-альфа, ИЛ-13R-альфа 2, kdr, каппа-легкой цепи, антигена Льюиса Y, молекула адгезии клеток L1, MAGE-A1, мезотелина, MUC1, MUC16, PSCA, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкоэмбрионального антигена, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбрионального антигена (CEA), простатспецифического антигена, PSMA, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфрина B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, белка опухоли Вильмса 1 (WT-1) и циклина A1 (CCNA1).

[125] Изобретение относится к сконструированным клеткам, содержащим (a) генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом; и (b) модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала в клетке, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию.

[126] В некоторых вариантах осуществления молекула является mTOR или протеинкиназой C тета (PKC-Θ).

[127] Изобретение относится к сконструированным клеткам, включающим (a) рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом; и (b) модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке.

[128] В некоторых вариантах осуществления модификация включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования и/или эктопическую экспрессию в клетке молекулы или ее функциональной и/или каталитически активной части или варианта. В некоторых вариантах осуществления молекула является mTOR или протеинкиназой C тета (PKC-Θ).

[129] В некоторых вариантах осуществления молекула является транспортером аминокислот или его цепью или его функциональной и/или каталитически активной частью или вариантом.

[130] Изобретение также относится к сконструированным клеткам, включающим (a) рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом; и (b) рекомбинантный, сконструированный и/или эктопически экспрессируемый транспортер аминокислот или его цепь или его функциональную и/или каталитически активную часть или вариант.

[131] В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является транспортером триптофана. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь выбраны из одного или более из rBAT (SLC3A1), тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), транспортера аминокислот Asc-типа 1 (Asc-1; SLC7A10), натрий- и хлор-зависимого транспортера нейтральных и основных аминокислот B(0+)(ATB0,+; SLC6A14), натрий-зависимого транспортера нейтральных аминокислот B(0)AT1 (B(0)AT1; SLC6A19), транспортера монокарбоксилата 10 (TAT1; SLC16A10) и протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4) или их части. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь содержит тяжелую цепь CD98 (4F2hc; SLC3A2) и транспортер аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5) или их часть.

[132] В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 36-115, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 36-115. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь выбраны из одного или более из тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) и протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4) или их части. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь содержит тяжелую цепь CD98 (4F2hc; SLC3A2) и транспортер аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5) или их часть.

[133] В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот или его цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 37-39 и 115, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 37-39 и 115.

[134] В некоторых вариантах осуществления экспрессия молекулы или транспортера аминокислот в клетке находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

[135] В некоторых вариантах осуществления молекула выбрана из киназы GCN2, BLIMP-1, арил-углеводородного рецептора (AHR), ядерного транспортера AHR (ARNT), эукариотического фактора инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующего фактора транскрипции 4 (ATF4), или белка, гомологичного CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 и ИФНγ-R2. В некоторых вариантах осуществления молекула является GCN2 или CHOP.

[136] В некоторых вариантах осуществления модификация включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования и/или эктопическую экспрессию в клетке молекулы или ее функциональной и/или каталитически активной части или варианта. В некоторых вариантах осуществления экспрессия молекулы в клетке находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

[137] В некоторых вариантах осуществления молекула является киназой GCN2, арил-углеводородным рецептором (AHR) или ядерным транспортером AHR (ARNT).

[138] В некоторых вариантах осуществления модификация включает сниженную экспрессию молекулы в клетке. В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка содержит ингибиторную нуклеиновую кислоту или генетическое повреждение, снижающее экспрессию молекулы. В некоторых вариантах осуществления экспрессия молекулы в клетке снижена по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с экспрессией в клетке в отсутствие ингибиторной нуклеиновой кислоты или генетического повреждения.

[139] В некоторых вариантах осуществления клетка содержит ингибиторную нуклеиновую кислоту, таким образом, осуществляя снижение экспрессии молекулы. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота включает средство РНК-интерференции. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота представляет собой, или включает, или кодирует малую интерферирующую РНК (миРНК), микроРНК-адаптированную shRNA, короткую шпилечную РНК (shRNA), шпилечную миРНК, микроРНК (мкРНК-предшественник) или микроРНК (мкРНК). В некоторых вариантах осуществления экспрессия ингибиторной нуклеиновой кислоты находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

[140] В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка содержит поврежденный ген, кодирующий молекулу, средство для повреждения гена, кодирующего молекулу, и/или повреждение гена, кодирующего молекулу. В некоторых вариантах осуществления повреждение включает повреждение гена, кодирующего молекулу, на уровне ДНК, и/или повреждение не является обратимым; и/или повреждение не является транзиторным.

[141] В некоторых вариантах осуществления повреждение опосредовано ДНК-связывающим белком или ДНК-связывающей нуклеиновой кислотой, специфически связывающейся или гибридизующейся с геном, кодирующим молекулу. В некоторых вариантах осуществления повреждение опосредовано (a) слитым белком, включая направленно воздействующий на ДНК белок и нуклеазу, или (b) РНК-направляемой нуклеазой. В некоторых вариантах осуществления повреждение опосредовано редактирующей геном нуклеазой, нуклеазой с цинковыми пальцами (ZFN), TAL-эффекторной нуклеазой (TALEN) или короткими палиндромныи повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR)/Cas9. В некоторых вариантах осуществления повреждение опосредовано CRISPR/Cas9, и CRISPR/Cas9 включает гидовую РНК (gRNA), содержащую гидовую последовательность, комплементарную и/или способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в гене.

[142] В некоторых вариантах осуществления генетическое повреждение является зависящим от условий или индуцибельным. В некоторых вариантах осуществления комплекс CRISPR-Cas9 является индуцибельным CRISPR-Cas9, и/или Cas9 находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

[143] В некоторых вариантах осуществления повреждение включает делецию, по меньшей мере, части по меньшей мере одного экзона гена, кодирующего молекулу. В некоторых вариантах осуществления повреждение включает делецию, мутацию и/или инсерцию в гене, приводящую к наличию преждевременного стоп-кодона в гене; и/или повреждение включает делецию, мутацию и/или инсерцию в первом или втором экзоне гена, кодирующего молекулу.

[144] В некоторых вариантах осуществления зависящий от условий промотор, или энхансер, или трансактиватор является индуцибельным промотором, энхансером или трансактиватором или репрессируемым промотором, энхансером или трансактиватором, таким как промотор РНК-полимеразы I, РНК-полимеразы II или РНК-полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления промотор выбран из: промотора РНК-полимеразы III, являющегося промотором U6 или H1; или промотора РНК-полимеразы II, являющегося промотором CMV, ранним промотором SV40 или главным поздним промотором аденовируса.

[145] В некоторых вариантах осуществления промотор является индуцибельным промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор включает участок связывания NFκB или NFAT. В некоторых вариантах осуществления промотор включает последовательность оператора Lac, последовательность тетрациклинового оператора, последовательность галактозного оператора или последовательность доксициклинового оператора или является ее аналогом.

[146] В некоторых вариантах осуществления промотор является репрессируемым промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор способен связываться с репрессором Lac или тетрациклиновым репрессором или является его аналогом.

[147] В некоторых вариантах осуществления клетка является T-клеткой. В некоторых вариантах осуществления T-клетка является CD8+ T-клеткой. В некоторых вариантах осуществления T-клетка является CD4+ T-клеткой. В некоторых вариантах осуществления клетка является естественным киллером (NK). В некоторых вариантах осуществления клетка является полученной из iPS клеткой.

[148] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, является функциональным не-T-клеточным рецептором. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, является химерным антигенным рецептором (CAR).

[149] В некоторых вариантах осуществления CAR включает внеклеточный антигенраспознающий домен, специфически связывающийся с антигеном, и внутриклеточную сигнальную область, включающую ITAM.

[150] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область включает внутриклеточный домен цепи CD3-дзета (CD3ζ).

[151] В некоторых вариантах осуществления CAR также включает костимуляторную сигнальную область. В некоторых вариантах осуществления костимуляторная сигнальная область включает сигнальный домен CD28 или 4-1BB или ICOS или его сигнальную часть. В некоторых вариантах осуществления костимуляторная сигнальная область является сигнальным доменом CD28.

[152] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом является рекомбинантным рецептором.

[153] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, является трансгенным T-клеточным рецептором (TCR).

[154] В некоторых вариантах осуществления клетку конструируют посредством встраивания в клетку первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, и одной или более вторых последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих средство, способное модифицировать или вовлеченное в модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в одном или более полинуклеотидах. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в двух полинуклеотидах. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в одном или более векторах, необязательно, являющихся вирусными векторами.

[155] Изобретение также относится к композициям, включающим любые из сконструированных клеток, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления композиций клетки являются CD4+ или CD8+ клетками. В некоторых вариантах осуществления композиции также включают фармацевтически приемлемый носитель.

[156] Изобретение также относится к комбинациям, включающим генетически сконструированные клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, связывающийся с лигандом, где рекомбинантный рецептор, необязательно, является T-клеточным рецептором (TCR) или химерным антигенным рецептором (CAR); и модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[157] Изобретение также относится к комбинациям, включающим любые из сконструированных клеток, представленных в настоящем описании, или любые из композиций, представленных в настоящем описании, и модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[158] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает образование, концентрацию, доступность, метаболизм и/или эффект фермента и/или метаболита пути кинуренина и/или снижает соотношение кинуренин/триптофан.

[159] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает катаболизм триптофана или предотвращает или снижает синтез или накопление метаболита триптофана. В некоторых вариантах осуществления метаболит триптофана выбран из кинуренина, 3-гидроксикинуренина и 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA).

[160] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является низкомолекулярным соединением, пептидом, белком, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты.

[161] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является антагонистом фермента кинурениназы.

[162] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), ингибитором IDO2 и ингибитором триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO/TDO двойного действия. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1).

[163] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из 1-метил-D-триптофана (1-MT) (индоксимода), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (INCB024360, эпакадостата), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил} амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанола (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или их комбинации.

[164] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (INCB024360, эпакадостатом). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 1-метил-D-триптофаном (1-MT) (индоксимодом). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

[165] В некоторых вариантах осуществления комбинацию, представленную в настоящем описании, упаковывают в виде промышленного изделия, такого как набор. В некоторых вариантах осуществления изделие и/или набор дополнительно содержит инструкции или печатные материалы о введении сконструированных клеток и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[166] Изобретение также относится к способам конструирования иммунных клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, включающим приведение популяции клеток, содержащих иммунные клетки, в контакт с модулятором метаболизма триптофана и/или пути кинуренина; и встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, в популяцию клеток в условиях, в которых экспрессируется рекомбинантный рецептор.

[167] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор связывается с лигандом, необязательно, антигеном. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор является T-клеточным рецептором (TCR) или химерным антигенным рецептором (CAR). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток представляет собой или содержит мононуклеарные клетки периферической крови. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток представляет собой или содержит T-клетки. В некоторых вариантах осуществления T-клетки являются CD4+ и/или CD8+. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток выделяют из индивидуума, необязательно, человека.

[168] В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт осуществляют до и/или во время встраивания.

[169] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает образование, концентрацию, доступность, метаболизм и/или эффект фермента и/или метаболита пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает катаболизм триптофана или предотвращает или снижает синтез или накопление метаболита триптофана. В некоторых вариантах осуществления метаболит триптофана выбран из кинуренина, 3-гидроксикинуренина и 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA).

[170] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является низкомолекулярным соединением, пептидом, белком, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты.

[171] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является антагонистом фермента кинурениназы.

[172] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), ингибитором IDO2 и ингибитором триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO/TDO двойного действия. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1).

[173] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из 1-метил-D-триптофана (1-MT) (индоксимода), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (INCB024360, эпакадостата), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанола (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или их комбинации.

[174] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (INCB024360, эпакадостатом). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 1-метил-D-триптофаном (1-MT) (индоксимодом). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

[175] Изобретение также относится к способам конструирования иммунных клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, включающим встраивание первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, в популяцию клеток в условиях, в которых экспрессируется рекомбинантный рецептор; и встраивание одной или более вторых последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих средство, способное модифицировать или вовлеченное в модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке, в популяцию клеток в условиях, в которых экспрессируется средство.

[176] Изобретение также относится к способам конструирования иммунных клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, включающим встраивание первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, в популяцию клеток в условиях, в которых экспрессируется рекомбинантный рецептор; и встраивание одной или более вторых последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих рекомбинантный, сконструированный и/или эктопически экспрессируемый транспортер аминокислот или его цепь или его функциональную и/или каталитически активную часть или вариант.

[177] В некоторых вариантах осуществления модификация включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования и/или эктопическую экспрессию молекулы или ее функциональной и/или каталитически активной цепи, части или варианта. В некоторых вариантах осуществления модификация включает сниженную экспрессию молекулы. В некоторых вариантах осуществления способ включает ингибиторную нуклеиновую кислоту или генетическое повреждение, снижающее экспрессию молекулы.

[178] В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в одном или более полинуклеотидах. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в двух полинуклеотидах. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в одном или более векторах, необязательно, являющихся вирусными векторами.

[179] В некоторых вариантах осуществления комбинацию, представленную в настоящем описании, упаковывают в виде набора. В некоторых вариантах осуществления набор также включает инструкции по введению сконструированных клеток и модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к промышленным изделиям и/или наборам, таким как изделия и/или наборы, содержащие модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, в терапевтически эффективной дозе. В некоторых аспектах промышленные изделия дополнительно содержат инструкции и/или печатные материалы о введении модуляторов индивидууму, которому вводили или собираются вводить терапевтическое средство, такое как клеточное терапевтическое средство, такое как терапевтическое средство на основе сконструированных T-клеток. В некоторых аспектах в инструкциях или печатных материалах дополнительно описывают введение индивидууму, имеющему заболевание или состояние, где заболевание или состояние или ассоциированные с ним клетки или ткани экспрессируют, или подтверждено, что они экспрессируют, IDO, необязательно, после введения терапевтического средства, и/или один или более транспортеров аминокислот, таких как LAT-1. В некоторых вариантах осуществления в инструкциях или печатных материалах не указана экспрессия IDO и/или не указана экспрессия транспортера или другого маркера, как необходимое условие для введения клеточного терапевтического средства.

Краткое описание чертежей

[180] На фиг. 1A показан уровень экспрессии индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы (IDO1), определяемый посредством проточной цитометрии, в клетках аденокарциномы A549, экспрессирующих CD19 (CD19.A549), после стимуляции интерфероном гамма (ИФНγ) в течение 24 или 48 часов и в нестимулированных клетках CD19.A549, как описано в примере 1.

[181] На фиг. 1B показан уровень экспрессии IDO1, определяемый посредством проточной цитометрии, в линии клеток рака молочной железы человека HCC1806; линии клеток мелкоклеточного рака легких человека H2286; линии клеток немелкоклеточного рака легких человека H1975; линии клеток метастаза немелкоклеточного рака легких человека в лимфоузлах H1299; линии клеток рака молочной железы человека BT-549 и клетках аденокарциномы A549, экспрессирующих CD19 (A549.CD19), после стимуляции интерфероном гамма (ИФНγ).

[182] На фиг. 1C показан уровень экспрессии IDO1, определяемый посредством проточной цитометрии, в клетках Дауди, клетках K562, экспрессирующих CD19 (K562.CD19), клетках A549, экспрессирующих CD19 (A549.CD19), линии клеток рака молочной железы человека BT-549 и стромальных клетках костного мозга человека HS-5 после стимуляции интерфероном гамма (ИФНγ).

[183] На фиг. 1D показан уровень экспрессии IDO1, определяемый посредством проточной цитометрии, в клетках аденокарциномы A549, экспрессирующих CD19 (CD19.A549), после сокультивирования с T-клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR) против CD19, или T-клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR) против CD19, вместе с 10 мкг/мл антитела против ИФНγ в течение 24 часов или 48 часов по сравнению с клетками CD19.A549, культивируемыми в отдельности, как описано в примере 1.

[184] Фиг. 1E представляет собой столбиковую диаграмму, на которой показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) IDO1 в совместной культуре с T-клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR) против CD19, или T-клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR) против CD19, вместе с 10 мкг/мл антитела против ИФНγ по сравнению с клетками CD19.A549, культивируемыми в отдельности.

[185] На фиг. 1F показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) IDO1, определяемая посредством проточной цитометрии, в клетках-мишенях A549.CD19 после сокультивирования с T-клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR) против CD19, или T-клетками с CAR против CD19 вместе с отсутствием (без обработки, без Tx) или наличием увеличивающихся концентраций (от 0,75 до 2,0 мкг/мл) антитела против рецептора интерферона-гамма (ИФНγR) или изотипического контроля.

[186] На фиг. 1G показан уровень экспрессии IDO1, определяемый посредством проточной цитометрии, в клетках аденокарциномы A549, экспрессирующих CD19 (A549.CD19), или родительских клетках A549 после сокультивирования с T-клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR) против CD19, T-клетками экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR) против ROR1, или ложнотрансдуцированными клетками в течение 24 часов.

[187] На фиг. 1H показана продукция ИФНγ в супернатантах культур после сокультивирования T-клеток с CAR против CD19 или ложнотрансдуцированных клеток с клетками аденокарциномы A549, экспрессирующими CD19 (A549.CD19), или родительскими клетками A549.

[188] На фиг. 1I показан уровень экспрессии CD19 в клетках-мишенях A549, экспрессирующих эндогенный CD19 под контролем одного из двух разных промоторов.

[189] На фиг. 1J показана продукция ИФНγ в совместной культуре клеток-мишеней A549, экспрессирующих эндогенный CD19 под контролем одного из двух разных промоторов, и T-клеток с CAR против CD19 или контрольных T-клеток без CAR.

[190] На фиг. 1K показана экспрессия IDO, определяемая посредством проточной цитометрии, в совместных культурах, приведенных на фиг. 1J.

[191] На фиг. 1L показана экспрессия IDO1 в клетках CD19.A549, культивируемых с различными концентрациями рекомбинантного ИФНγ человека.

[192] На фиг. 2A показаны концентрации триптофана (мкМ), измеряемые посредством ELISA, в супернатанте совместной культуры клеток CD19.A549 и T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, при соотношении эффектор-мишень (E:T) 0,3:1, 1:1 или 3:1 в присутствие 0, 0,1, 10 и 1000 нМ ингибитора IDO1 эпакадостата, как описано в примере 2. Клетки культивировали и сравнивали уровни триптофана с уровнями триптофана в свежей среде для культивирования.

[193] На фиг. 2B показаны концентрации кинуренина (мкМ), измеряемые посредством ELISA, в супернатанте совместной культуры клеток CD19.A549 и T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, при E:T 3:1 в присутствие 0, 0,1, 10 и 1000 нМ эпакадостата, как описано в примере 2. Клетки культивировали и сравнивали уровни кинуренина с уровнями кинуренина в свежей среде для культивирования.

[194] На фиг. 2C показаны концентрации триптофана и кинуренина (мкМ) после сокультивирования T-клетками с CAR против CD19 и IDO⁺ клетками-мишенями A549.CD19 в присутствие различных концентраций эпакадостата в течение 96 часов.

[195] На фиг. 2D показаны концентрации триптофана и кинуренина (мкМ), измеряемые посредством ELISA в супернатанте совместной культуры клеток CD19.A549 (IDO1+) или CD19.Дауди (IDO1-) и T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, при соотношении эффектор:мишень (E:T) 1:1.

[196] На фиг. 2E показаны концентрации триптофана и кинуренина (мкМ), в супернатанте культуры клеток A549.CD19 (IDO⁺ клеток-мишеней), культивируемых в отдельности (необработанных) или с T-клетками, экспрессирующими CAR против CD19 (α-CD19 CAR), в течение 24 часов.

[197] На фиг. 3 показана пролиферация T-клеток, CD4+ и CD8+ T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, после сокультивирования с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями A549 (CD19.A549) при соотношении E:T 0,3:1, 1:1 или 3:1 в присутствие 0, 0,1, 10 и 1000 нМ эпакадостата, как описано в примере 3A. Пролиферацию T-клеток измеряли с использованием разведения CellTrace™ Violet посредством проточной цитометрии.

[198] На фиг. 4A и 4B показано среднее число делений CD4+ (фиг. 4A) или CD8+ (фиг. 4B) T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, полученных от трех разных здоровых доноров после сокультивирования с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями A549 (CD19.A549) в присутствие 0, 10, 100, 250, 500 и 1000 нМ эпакадостата, как описано в примере 3A.

[199] На фиг. 4C показано количество CAR-T-клеток на лунку в совместных культурах T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, полученных из одного из трех разных здоровых доноров, при соотношении E:T 1:1 или T-клеток, экспрессирующих CAR против ROR1, полученных из другого донора, при соотношении E:T 3:1 с клетками CD19.A549 в течение 96 часов в присутствие 250 нМ эпакадостата.

[200] На фиг. 5A показана пролиферация T-клеток, CD4+ и CD8+ T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, после сокультивирования с IDO1+ клетками-мишенями A549 (CD19.A549) или IDO1- клетками-мишенями Дауди (CD19.Дауди) при соотношении E:T 1:1 в присутствие 0, 10, 100, 250, 500 и 1000 нМ эпакадостата, как описано в примере 3A. Пролиферацию T-клеток измеряли с использованием разведения CellTrace™ Violet посредством проточной цитометрии.

[201] На фиг. 5B и 5C показано среднее число делений CD4+ (фиг. 5B) или CD8+ (фиг. 5C) T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, после сокультивирования с IDO1+ клетками-мишенями A549 или IDO1- клетками-мишенями Дауди в присутствие 0, 10, 100, 250, 500 и 1000 нМ эпакадостата, как описано в примере 3A.

[202] На фиг. 6 показан уровень фактора некроза опухоли альфа (ФНО) (пг/мл), измеряемый с помощью набора для анализа ФНО, в супернатанте совместной культуры клеток CD19.A549 и T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, при соотношении E:T 1:1 в присутствие 0, 10, 100, 250, 500 и 1000 нМ эпакадостата, как описано в примере 3B.

[203] На фиг. 7A и 7B показаны уровни поверхностной экспрессии CD25, определяемой посредством проточной цитометрии, CD4+ (фиг. 7A) или CD8+ (фиг. 7B) T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, после сокультивирования с IDO1+ клетками-мишенями A549 или IDO1- клетками-мишенями Дауди в присутствие 0, 10, 100, 250, 500 и 1000 нМ эпакадостата, как описано в примере 3B.

[204] На фиг. 8A и 8B показаны уровни поверхностной экспрессии CD25, определяемый посредством проточной цитометрии, CD4+ (фиг. 8A) или CD8+ (фиг. 8B) T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, полученных из трех разных здоровых доноров, после сокультивирования с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями A549 (CD19.A549) в присутствие 0, 10, 100, 250, 500 и 1000 нМ эпакадостата, как описано в примере 3B.

[205] На фиг. 8C показана площадь под кривой (AUC) для графика NucRed-меченых клеток CD19.A549, сокультивируемых с T-клетками, экспрессирующими CAR против CD19, инкубируемыми в течение приблизительно 340 часов в присутствие 0, 3,9, 15,6, 62,5, 250 и 1000 нМ эпакадостата при соотношении E:T 0,25:1.

[206] На фиг. 9A показан уровень экспрессии IDO1, определяемый посредством проточной цитометрии, в клетках аденокарциномы A549, экспрессирующих CD19 (CD19.A549), со стимуляцией интерфероном гамма (ИФНγ) или без нее в течение 48 часов в присутствие увеличивающихся концентраций аналога пурина флударабина.

[207] На фиг. 9B показан процент жизнеспособных клеток в культуре клеток аденокарциномы A549, экспрессирующих CD19 (CD19.A549), со стимуляцией интерфероном гамма (ИФНγ) или без нее в течение 48 часов в присутствие увеличивающихся концентраций аналога пурина флударабина.

[208] На фиг. 9C показан % жизнеспособных клеток и результаты окрашивания аннексином V в течение 96 часов для клеток CD19.A549, культивируемых с ИФНγ или без него, в присутствие 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 200 или 1000 мкМ флударабина, добавляемого через 48 часов.

[209] На фиг. 9D показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) для экспрессии IDO1 в течение 96 часов в клетках CD19.A549, культивируемых с ИФНγ или без него, в присутствие 0, 6,25 или 12,5 мкМ флударабина.

[210] На фиг. 10A показано общее количество CD3+ клеток на лунку в совместной культуре T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, инкубируемых в течение 96 часов с CD19.A549 при соотношении E:T 1:1 в присутствие 0, 10, 100 и 1000 нМ эпакадостата, добавляемого в начале сокультивирования, или 5 мкг/мл добавочного триптофана, добавляемого в культуру каждые 24 часа. На фиг. 10B-10E показано количество цитокинов ГМ-КСФ (фиг. 10B), ИФНγ (фиг. 10C), ИЛ-2 (фиг. 10D) и ФНО (фиг. 10E) в совместной культуре. На фиг. 10F и 10G показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) при экспрессии CD25 в CD4+ (фиг. 10F) и CD8+ (фиг. 10G) T-клетках в совместной культуре.

[211] На фиг. 11A показан уровень экспрессии индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы (IDO1), определяемый посредством проточной цитометрии, в стромальных клетках костного мозга человека HS-5, стимулируемых 20 нг/мл рекомбинантного ИФНγ человека в течение 24 часов. На фиг. 11B показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) IDO1 в дендритных клетках (DC) и макрофагах (MФ) после стимуляции интерфероном-гамма (ИФНγ) или липополисахаридом (LPS), определяемая посредством проточной цитометрии.

[212] На фиг. 12A показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1, кодируемый геном SLC7A5 у людей), определяемая посредством проточной цитометрии, в клетках Дауди, клетках K562, HS-5 и A549.

[213] На фиг. 12B показаны уровни экспрессии LAT1, определяемые посредством проточной цитометрии, в линии клеток рака молочной железы человека HCC1806; линии клеток мелкоклеточного рака легких человека H2286; линии клеток немелкоклеточного рака легких человека H1975; линии клеток метастаза немелкоклеточного рака легких человека в лимфоузлах H1299; линии клеток рака молочной железы человека BT-549 и клетках аденокарциномы A549, экспрессирующих CD19 (A549.CD19), после стимуляции интерфероном гамма (ИФНγ).

[214] На фиг. 12C показана MFI LAT1 в дендритных клетках (DC) и макрофагах (MФ) после стимуляции интерфероном-гамма (ИФНγ) или липополисахаридом (LPS), определяемая посредством проточной цитометрии.

[215] На фиг. 13 показана пролиферация CAR-экспрессирующих T-клеток после сокультивирования со стромальными клетками костного мозга человека HS-5 или клетками-мишенями при соотношении E:T 1:1 или клетками HS-5 и клетками-мишенями при соотношении 1:1:1. Пролиферацию T-клеток измеряли с использованием разведения CellTrace™ Violet посредством проточной цитометрии.

[216] На фиг. 14A и 14B показана пролиферация T-клеток (фиг. 14A) и количество CAR-T-клеток в каждой лунке (фиг. 14B) для клеток, экспрессирующих CAR против CD19, полученных из трех разных доноров, после сокультивирования с клетками A549.CD19 в течение 96 часов с 5 мкг/мл дополнительного триптофана каждые 24 часа или в присутствие 250 нМ эпакадостата. Пролиферацию T-клеток измеряли с использованием разведения CellTrace™ Violet посредством проточной цитометрии.

[217] На фиг. 15A и 15B показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) красителя CellTrace™ Violet в совместной культуре меченых CD4+ CAR+ T-клеток (фиг. 15A) или CD8+ CAR+ T-клеток (фиг. 15B) с клетками-мишенями миелогенного лейкоза человека K562, трансдуцированными с использованием CD19 (CD19.K562), в средах с истощением триптофана с добавлением различных концентраций добавочного триптофана или без него. Триптофан-содержащие среды использовали в качестве контроля (Trp-контроль). На фиг. 15C показано количество клеток-мишеней CD19.K562.

[218] На фиг. 15D показано количество CAR+ T-клеток в культуре клеток, экспрессирующих CAR против CD19, инкубируемых со связанным с пластиком, антиидиотипическим агонистическим антителом в средах с истощением триптофана в отдельности или с добавлением различных концентраций триптофана. На фиг. 15E показаны количества CAR+ T-клеток (ось y) из схожего исследования для T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, полученных из трех разных доноров.

[219] На фиг. 16A показано количество CAR-T-клеток в каждой лунке в совместной культуре T-клеток с CAR против CD19 и CD19-экспрессирующих клеток-мишеней A549 (CD19.A549), инкубируемых в течение 96 часов в присутствие 0, 15,6, 62,5, 250 и 1000 нМ эпакадостата. На фиг. 16B показано количество CAR-T-клеток в каждой лунке в совместной культуре без эпакадостата, которую впоследствии культивировали еще в течение 96 часов с добавочным триптофаном, добавляемым каждые 24 часа, или без него.

[220] На фиг. 16C и 16D показан процент ИФНγ+ клеток (фиг. 16C) и ИЛ-2+ клеток (фиг. 16D) среди CD4+ или CD8+ клеток, экспрессирующих CAR против CD19, полученных с использованием T-клеток из двух разных доноров, сокультивируемых с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями A549 (CD19.A549) в течение 96 часов в клеточных средах в отсутствие эпакадостата (без обработки (без Tx)) или с 250 нМ эпакадостата (эпакадостат); с последующим повторным культивированием со свежими CD19-экспрессирующими клетками-мишенями A549 (CD19.A549) в средах с истощением триптофана (среды из культур "без tx" через 96 часов) с добавочным триптофаном или без него.

[221] На фиг. 17A показана пролиферация T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, после сокультивирования с клетками-мишенями CD19.Дауди (IDO1^- клетками-мишенями, как наблюдают, неиндуцирующими экспрессию IDO1) при соотношении эффектор:мишень (E:T) 1:1 в присутствие 0, 6,25, 12,5, 25, 50 и 100 мкМ L-кинуренина, 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA) или 0, 6,25, 12,5, 25, 50 и 100 мкМ каждого из L-кинуренина и 3-HAA. Пролиферацию T-клеток измеряли с использованием разведения CellTrace™ Violet посредством проточной цитометрии.

[222] На фиг. 17B показано количество CAR+ T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, после сокультивирования с IDO1^- клетками CD19.K562 в течение 96 часов в присутствие от 6,25 до 100 мкМ L-кинуренина, 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA) или от 6,25 до 100 мкМ каждого из L-кинуренина и 3-HAA.

[223] На фиг. 18A показано количество CD3+ клеток из клеток с CAR против CD19, культивируемых в условиях триптофанового голодания (химически определенные несодержащие триптофан среды) в течение 24, 48, 72 или 96 часов (24, 48, 72 или 96 ч. триптофанового голодания); с последующим добавлением добавочного триптофана и культивируемым в присутствие триптофана до сбора клеток через 24, 48, 72 или 96 часов. В качестве контроля клетки культивировали в средах с достаточным количеством триптофана в течение каждого соответствующего периода времени (полные среды). Продукция цитокинов в CD4+ или CD8+ клетках при триптофановым голодании показана на фиг. 18B или 18C, соответственно, для ИФНγ и ФИГ. 18D или 18E, соответственно, для ФНО.

[224] На фиг. 19A представлена вулканная диаграмма, на которой показана статистическая значимость различий экспрессии (log₁₀ скорректированного значения p) продуктов генов между CAR+ T-клетками, культивируемыми в условиях достаточного триптофана и условиях триптофанового голодания, с log_2-кратным изменением экспрессии каждого продукта гена, включая гены, подвергнутые значительной положительной регуляции (правая сторона) или отрицательной регуляции (левая сторона).

[225] На фиг. 19B показаны результаты RNAseq в CAR+ T-клетках, культивируемых в условиях достаточного триптофана (контроль) и триптофанового голодания (триптофан), представленные в виде значения транскриптов на т.п.н. на миллион (TPM) для двух примеров генов, кодирующих членов интегрированного пути стрессовой реакции eIF2α/ATF4, ATF4 и DDIT3 (также известный как белок, гомологичный CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP)).

[226] На фиг. 19C показаны результаты анализа онтологии гена, при котором оценивали клеточные пути передачи сигнала, наблюдаемые с учетом анализов экспрессии генов, подвергающихся воздействию в условиях триптофанового голодания, и схематически представлены примеры генов, вовлеченных в путь ATF4, экспрессия которых изменена.

[227] На фиг. 20 показаны графики проточной цитометрии для отдельных клеточных суспензий, выделенных из клеток A549.CD19 (IDO⁺), в модели ксенотрансплантата опухоли мыши с введением T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, (CAR против CD19-T) или без него (наивных), на графиках представлено гейтирование по живым, немышиным клеткам и оценка экспрессии CD3, CD8 и IDO.

[228] На фиг. 21 показано окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и гибридизация in situ (ISH) с использованием зондов, специфических для мРНК, кодирующей CAR против CD19, и иммунофлуоресцентное окрашивание для оценки экспрессии IDO1 и белка лиганда программируемой гибели 1 (PD-L1) в серийных срезах биоптатов опухоли людей с диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой (DLBCL) до и после однократной инфузии аутологичных T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19.

Подробное описание

[229] Изобретение относится к способам повышения или модуляции пролиферации и/или активности иммунных клеток применительно к иммунотерапии или иммунотерапевтическому средству, такому как композиция, включающая клетки для адоптивной клеточной терапии, например, такой как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство, такое как биспецифическое или мультиспецифическое средство или антитело, способное рекрутировать одну или более T-клеток или других иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапия или иммунотерапевтическое средство включает один или более модуляторов контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления способы включают проведение комбинированного лечения с использованием иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство, и модулятора метаболического пути триптофана, такого как модулятор пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапия является T-клеточной терапией, и комбинированное лечение по изобретению с использованием модулятора метаболического пути триптофана, такого как модулятор пути кинуренина, повышает или модулирует пролиферацию или активность T-клеток из T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления повышение пролиферации или активности достигает уровня, являющегося восстановленным исходным или стационарным уровнем такой активности, таким как уровень или активность, наблюдаемая в отсутствие эффектов, опосредованных иммуносупрессорными эффектами по причине метаболизма, например, катаболизма, незаменимой аминокислоты триптофана (TRP).

[230] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором фермента индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1). В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство, такое как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство, является экспрессирующим рекомбинантный рецептор T-клеточным терапевтическим средством, необязательно, являющимся экспрессирующим химерный антигенный рецептор (CAR) клеточным терапевтическим средством, терапевтическим средством на основе инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) или терапевтическим средством с трансгенным TCR. В некоторых случаях рекомбинантный рецептор является химерным антигенным рецептором (CAR). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором фермента индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), ингибитором IDO2 и/или ингибитором триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO). В некоторых вариантах осуществления модулятор является ингибитором IDO1, необязательно, являющимся эпакадостатом.

[231] Все публикации, включая патентные документы, научные статьи и базы данных, на которые ссылаются в настоящей заявке, включены в качестве ссылки в полном объеме для всех целей до той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была отдельно включена в качестве ссылки. Если определение, приведенное в настоящем описании, отличается или иным образом не соответствует определению, приведенному в патентах, заявках, опубликованных заявках и других публикациях, включенных в настоящее описание в качестве ссылки, определение, приведенное в настоящем описании, обладает приоритетом относительно определения, включенного в настоящее описание в качестве ссылки.

[232] Для ясности описания, но не для ограничения, подробное описание разделено на следующие подразделы. Заголовки разделов, используемые в настоящем описании, представлены исключительно в организационных целях, и их не следует истолковывать в качестве ограничения описываемого объекта изобретения.

I. МОДУЛЯЦИЯ ПУТИ КИНУРЕНИНА В ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ СПОСОБАХ, ВКЛЮЧАЮЩИХ ИММУНОТЕРАПИЮ

[233] Изобретение относится к комбинированному лечению, включающему введение иммунотерапевтического средства, такого как клеточное терапевтическое средство, и модулятора метаболических путей триптофана, таких как альтернативные метаболические пути, такие как модуляторы пути кинуренина.

[234] В некоторых аспектах в микроокружении опухоли (TME) многих типов злокачественных новообразований метаболизм, например, катаболизм, незаменимой аминокислоты триптофана (TRP) участвует в поддержании иммуносупрессорного окружения. В некоторых аспектах в TME многих типов злокачественных новообразований метаболизм, например, катаболизм, незаменимой аминокислоты триптофана (TRP) участвует в поддержании иммуносупрессорного окружения. Например, в некоторых аспектах участвует один или более альтернативных путей метаболизма триптофана. Среди путей, участвующих в метаболизме TRP, катаболизм представляет собой путь кинуренина, в котором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназа 1 (IDO1) участвует в деградации TRP посредством преобразования L-триптофана в N-формил-L-кинуренин, затем метаболизируемый посредством серии стадий с образованием никотинамидадениндинуклеотида (NAD). Несколько типов клеток в TME, включая опухолевые клетки и конкретные субпопуляции дендритных клеток (DC), макрофагов и незрелых моноцитов, экспрессируют повышенные уровни IDO1 в ответ на воспалительные сигналы, такие как интерферон γ (ИФНγ), фактор некроза опухоли альфа (ФНО) или передатчик сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3)-активаторные стимулы. В некоторых аспектах "фоновые" клетки в микроокружении опухоли, например, стромальные клетки, такие как стромальные клетки костного мозга, также могут экспрессировать повышенные уровни IDO1 в ответ на воспалительные сигналы, такие как ИФНγ или ФНО.

[235] В некоторых аспектах злокачественные клетки или опухолевые клетки в TME могут способствовать резистентности к адаптивному иммунитету, процессу, при котором злокачественные клетки или опухолевые клетки изменяют свой фенотип в ответ на цитотоксический или провоспалительный иммунный ответ для ограничения и уклонения от противоопухолевого иммунного ответа. В некоторых аспектах специфическое распознавание злокачественных клеток иммунными клетками, такими как T-клетки или подвергнутые адоптивному переносу T-клетки, может приводить к продукции иммуноактивирующих цитокинов, например, ИФНγ или ФНО. После продукции цитокинов, злокачественные или опухолевые клетки, в свою очередь, отвечают посредством ограничения или уклонения от иммунных ответов, например, посредством экспрессии IDO1, истощения триптофана в микроокружении или посредством экспрессии лиганда программируемой гибели 1 (PD-L1) злокачественными клетками (см., например, Ribas, A. (2015) Cancer Discov. 5(9): 915-919). В некоторых случаях ответ с развитием резистентности к адаптивному иммунитету может ограничивать активность T-клеток в TME через катаболизм триптофана, что приводит к локальной недостаточности аминокислоты и накоплению катаболитов триптофана.

[236] В некоторых аспектах конкретные опухолевые клетки, или злокачественные клетки, или другие клетки в TME могут демонстрировать высокие уровни экспрессии или положительно регулировать экспрессию транспортеров аминокислот, например, транспортеров триптофана, таких как LAT1/CD98hc или LAT2/CD98hc, например, в ответ на триптофановое голодание или воздействие окружения с триптофановым (или другой аминокислоты) голоданием. В некоторых вариантах осуществления такая положительная регуляция и/или экспрессия делает возможным захват или повышение захвата аминокислот, например, триптофана, опухолевыми клетками из окружения. В некоторых аспектах такой захват или повышение захвата опухолевой клеткой может способствовать развитию или усиливать окружение или условия истощения триптофана или триптофанового голодания в TME (см., например, Broer et al. (2011) Biochem. J. 436, 193-211; Wang et al. (2015) Am J Cancer Res 5(4):1281-1294; Ribas, A. (2015) Cancer Discov. 5(9): 915-919). В некоторых аспектах такие экспрессия и захват или повышение захвата усиливают эффекты окружения с уже имеющимся голоданием, например, в котором опухоль или опухоле-ассоциированные клетки с положительно регулируемым или экспрессируемым транспортером захватывают большую часть или весь доступный триптофан таким образом, что T-клетки и/или другие иммунные клетки, например, сконструированные T-клетки из терапевтического средства, неспособны конкурировать за триптофан и/или испытывают эффекты триптофанового голодания.

[237] В некоторых аспектах, как представлено в настоящем описании, возникновение или усиление условий с истощением триптофана или триптофановым голоданием, например, посредством повышения экспрессии и/или активности IDO1 или посредством положительной регуляции экспрессии транспортеров триптофана, например, LAT1/CD98hc или LAT2/CD98hc, пораженными клетками и/или ассоциированными клетками или тканями может ингибировать или препятствовать одному или более эффектам клеточной терапии и/или иммунных клеток, таким как активность, пролиферация и/или экспансия противоопухолевых иммунных клеток, например, T-клеток. В некоторых аспектах активность пути кинуренина и/или метаболизма триптофана в микроокружении опухоли (TME) может приводить к одной или более иммуносупрессорным активностям. В некоторых аспектах экспрессия IDO1 опухолевыми клетками, миелоидными клетками и/или стромальными клетками в микроокружении опухоли (TME) вносит свой вклад в формирование иммуносупрессорных условий в TME. Высокие уровни экспрессии IDO1 в TME могут приводить к снижению или истощению TRP и повышению кинуренина (KYN) и ингибированию противоопухолевых иммунных ответов. В некоторых аспектах экспрессия IDO1 в TME может приводить к истощению факторов или метаболитов, необходимых для активности, функции, пролиферации, выживания и/или персистирования иммунных клеток, например, T-клеток. В некоторых аспектах IDO1-экспрессирующие клетки могут вызывать обширные и устойчивые иммуносупрессорные эффекты, например, в TME, посредством (1) направления супрессии пролиферации и эффекторных функций цитотоксических T-лимфоцитов, NK-клеток и плазматических клеток; (2) стимуляции преобразования наивных CD4+ T-клеток в CD4+ CD25+ FOXP3+ Treg и их активации; и/или (3) запуска иммуносупрессорной активности в соседних IDO1-экспрессирующих DC, например, с помощью процесса, известного как фоновая супрессия (Vacchelli et al., (2014) OncoImmunology 3:10, e957994). В некоторых аспектах кинуренин (KYN) и его производные могут связываться с арил-углеводородным рецептором (AHR). Связывание KYN с AHR приводит к перепрограммированию дифференцировки наивных CD4+ T-хелперных (Th) клеток, способствующих фенотипу Treg, одновременно супрессирующих дифференцировку в интерлейкин-17 (ИЛ-17)-продуцирующие Th-клетки (Th17). Активация AHR также может приводить к стимуляции толерогенного фенотипа дендритных клеток (DC) и супрессии ответов CD8+ T-клеток, иммунологической толерантности к опухолевому антигену и антиген-индуцированной гибели клеток или анергии. Накопление KYN и его производных также может являться цитотоксическим для CD8+ T-клеток, NK-клеток и NKT-клеток.

[238] В некоторых случаях IDO1 постоянно активирован у некоторых пациентов со злокачественными новообразованиями, и повышенная экспрессия IDO1 может являться независимой прогностической переменной для сниженной выживаемости у некоторых пациентов со злокачественными новообразованиями, например, пациентов с острым миелолейкозом (AML), мелкоклеточным раком легких, меланомой, раком яичников, толстого кишечника, поджелудочной железы и эндометрия (см., например, Moon et al., Journal for Immunotherapy of Cancer (2015) 3:51; Platten et al., Front Immunol. 2015 Jan 12;5:673; Weinmann, H., ChemMedChem 2016, 11:450-466). В некоторых вариантах осуществления ингибирование IDO1 может снижать или реверсировать иммуносупрессорные эффекты и/или другие эффекты IDO1 в TME, такие как истощение TRP в иммунных эффекторных клетках, способствование накоплению KYN и его производных, например, 3-гидроксикинуренина, кинуреновой кислоты и 3-гидроксиантраниловой кислоты, некоторые из которых могут являться цитотоксическими для CD8+ T-клеток, NK-клеток и NKT-клеток, а также может способствовать дифференцировке CD4+ T-клеток в регуляторные T-клетки (Treg).

[239] В некоторых аспектах T-клетки могут быть чувствительными к активности пути кинуренина и/или метаболизма триптофана. В некоторых аспектах T-клетки чувствительны к истощению триптофана в окружении, например, в TME. В некоторых случаях T-клетки могут воспринимать низкие уровни триптофана (TRP) через свободные тРНК, что приводит к активации киназы general control nonderepressible 2 (GCN2) и инициации ответа на аминокислотное голодание или стрессовой реакции, приводящей к аресту клеточного цикла, гибели клеток или отсутствию пролиферации. Активация GCN2 также способствует дифференцировке регуляторных T-клеток (Treg) и повышает активность Treg, что приводит к дальнейшей иммуносупрессии. В некоторых случаях путь кинуренина и/или метаболизм триптофана могут индуцировать истощение, анергию или гибель эффекторных T-клеток, супрессию противоопухолевых иммунных ответов или толерантности к опухолевым антигенам, образованию и активации Treg и вносить свой вклад в формирование иммуносупрессорных условий в TME (см., например, Moon et al., Journal for Immunotherapy of Cancer (2015) 3:51; Platten et al., Front Immunol. 2015 Jan 12;5:673; Weinmann, H., ChemMedChem 2016, 11:450-466). В некоторых аспектах экспрессия IDO1 в TME может приводить к образованию факторов или метаболитов, вносящих вклад в истощение, низкую отвечаемость (анергию), отсутствие пролиферации, терминальную дифференцировку и/или дифференцировку в супрессорное состояние. В некоторых аспектах TME может индуцировать истощение T-клеток, которое может приводить к прогрессирующей утрате функций T-клеток и/или истощению клеток.

[240] В некоторых аспектах злокачественные или опухолевые клетки могут повышать экспрессию транспортеров аминокислот для повышения захвата аминокислот из TME. Например, экспрессия компонентов транспортеров аминокислот L-типа (LAT), которые в некоторых аспектах могут опосредовать захват и обмен аминокислот в клетки и из клеток, может повышаться в различных злокачественных клетках (и/или они могут подвергаться положительной регуляции опухолями и/или злокачественными клетками или опухоле-ассоциированными клетками в ответ на аминокислотное голодание или другие условия TME), таким образом, регулируя передачу сигнала mTORC1 и синтез белка. Повышенная экспрессия транспортеров, таких как LAT, может приводить к возникновению истощения или дальнейшему истощению аминокислот, например, триптофана, в TME, что, таким образом, приводит к образованию окружения с низким содержанием аминокислот.

[241] В некоторых аспектах активность иммунотерапии, например, T-клеточной терапии, может ограничиваться иммуносупрессорной активностью или факторами, присутствующими в локальном микроокружении заболевания или нарушения, например, TME. В некоторых аспектах TME содержит или продуцирует факторы или условия, которые могут супрессировать активность, функцию, пролиферацию, выживаемость и/или персистирование T-клеток, вводимых для T-клеточной терапии.

[242] В некоторых аспектах варианты осуществления изобретения основаны, по меньшей мере частично, на наблюдении, представленном в настоящем описании, о том, что T-клетки, такие как CAR-T-клетки, чувствительны к триптофановому голоданию. Положительная регуляция IDO1 в клетках в TME, включая опухолевые клетки, может приводить к образованию окружения с триптофановым голоданием, которое затем может ингибировать выживаемость и/или активность CAR-T-клеток. В некоторых аспектах супрессорные эффекты триптофанового голодания можно снижать, преодолевать и/или реверсировать посредством ингибирования факторов, ассоциированных с метаболизмом, например, катаболизмом, незаменимой аминокислоты триптофана (TRP), таких как IDO1, добавления триптофана и/или увеличения захвата триптофана CAR-T-клетками.

[243] В некоторых аспектах длительное триптофановое голодание в CAR-T-клетках может влиять на способность CAR-T-клеток позднее восстанавливаться после голодания в условиях, в которых триптофан пополняется, и/или условиях, приводящих к реверсированию или ослаблению триптофанового голодания. В некоторых случаях длительное триптофановое голодание, например, длительное истощение триптофана в TME, может приводить к замедлению или невозможности восстановления CAR-T-клеток, например, замедлению или прекращению роста и/или функциональной активности. В некоторых аспектах варианты осуществления изобретения можно использовать для предотвращения или снижения длительного триптофанового голодания и/или облегчения восстановления CAR-T-клеток после триптофанового голодания. В некоторых аспектах варианты осуществления изобретения можно использовать для предотвращения или снижения длительного триптофанового голодания и/или облегчения восстановления CAR-T-клеток после триптофанового голодания. В некоторых аспектах варианты осуществления изобретения позволяют вводимым CAR-T-клеткам восстанавливать функциональную активность и/или рост T-клеток до исходного или стационарного уровня, например, уровней функциональной активности и/или роста в нормальных или стационарных условиях и/или в условиях без истощения триптофана.

[244] Терапия на основе T-клеток, такая как адоптивная T-клеточная терапия (включая терапию, включающую введение клеток, экспрессирующих химерные рецепторы, специфические для интересующего заболевания или нарушения, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR) и/или другие рекомбинантные антигенные рецепторы, а также другая адоптивная терапия иммунными клетками и адоптивная терапия T-клетками) может быть эффективной в лечении злокачественного новообразования и других заболеваний и нарушений. В конкретных случаях доступные подходы адоптивной клеточной терапии не всегда могут быть полностью удовлетворительными. В некоторых случаях оптимальная активность или исход может зависеть от способности вводимых клеток распознавать мишень и связываться с ней, например, антиген-мишень, для транспорта, локализации и успешного проникновения в соответствующие места в организме индивидуума, опухолях и их окружении. В некоторых случаях оптимальная активность или исход может зависеть от способности вводимых клеток активироваться, расти, осуществлять различные эффекторные функции, включая цитотоксический цитолиз и секрецию различных факторов, таких как цитокины, персистировать, включая длительное персистирование, дифференцироваться, переходить или вовлекать в перепрограммирование в конкретные фенотипические состояния (такие как долговременная память, менее дифференцированное и эффекторное состояние), избегать или снижать иммуносупрессорные условия в локальном микроокружении заболевания, обеспечивать эффективные и устойчивые вторичные ответы после клиренса и повторного воздействия лиганда- или антигена-мишени, и избегать или снижать истощение, анергию, периферическую толерантность, терминальную дифференцировку и/или дифференцировку в супрессорное состояние.

[245] В некоторых аспектах варианты осуществления изобретения основаны на наблюдении того, что CAR-T-клетки могут индуцировать экспрессию функциональной индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1) в клетках, таких как опухолевые клетки, при стимуляции антигеном, и что функциональные исходы повышения (например, через модуляцию пути кинуренина метаболизма триптофана) можно модулировать с помощью ингибитора фермента. В дополнение к опухолевым клеткам, IDO1 может экспрессироваться эндотелиальными клетками, мезенхимальными стромальными клетками, такими как стромальные клетки костного мозга, фибробластами и различными антигенпрезентирующими клетками миелоидного происхождения, такими как дендритные клетки (DC) и макрофаги, которые также могут присутствовать в микроокружении опухоли. В некоторых аспектах индукция экспрессии IDO1 в таких клетках может быть прямой или косвенной, например, через продукцию интерферона-гамма (ИФНγ) или фактора некроза опухоли альфа (ФНО), в CAR-T-клетках или со стороны CAR-T-клеток после стимуляции антигеном.

[246] В некоторых аспектах наблюдения, представленные в настоящем описании, свидетельствуют о том, что опухолевые клетки и другие клетки в TME могут экспрессировать повышенные уровни IDO1 после введения CAR-T-клеток in vivo. В некоторых аспектах повышение экспрессии IDO1 опухолевыми клетками и другими клетками происходит в ответ на воспалительные сигналы, такие как интерферон γ (ИФНγ). В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующие T-клетки способны индуцировать экспрессию IDO1 в антиген-положительных клетках, на которые направленно воздействуют CAR, и индукция частично опосредована ИФНγ.

[247] Таким образом, некоторые варианты осуществления основаны на наблюдениях, представленных в настоящем описании, свидетельствующих о том, что в некоторых случаях антиген-специфическая стимуляция T-клеток, таких как T-клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор (например, CAR-T-клетки), может приводить к положительно регулируемой экспрессии IDO1 в одной или более клетках, которые можно обнаруживать в опухоли или опухолевом микроокружении, или которые могут быть ассоциированы с опухолью или опухолевым микроокружением. Такие иммуносупрессорные эффекты в конкретных случаях могут отрицательно регулировать конкретные признаки, например, конкретную активность, персистирование, пролиферацию или другую функцию, клеточного терапевтического средства, такого как T-клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор (например, CAR-T-клетки).

[248] В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана или пути кинуренина, такого как ингибитор IDO1, в комбинации с клеточной терапией повышает эффекторную функцию (например, секрецию цитокинов), экспансию и/или персистирование клеток из клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления повышение пролиферации или активности происходит до уровня, являющегося восстановленным до исходного или стационарного уровня такой активности, такого как уровень или активность, наблюдаемые в отсутствие эффектов, опосредованных иммуносупрессорными эффектами по причине метаболизма, например, катаболизма, незаменимой аминокислоты триптофана (TRP). В некоторых аспектах повышение эффекторной функции (например, секреция цитокинов), экспансии и/или персистирования клеток из клеточного терапевтического средства происходит без повышения (и/или со снижением) одного или более маркеров, индуцируемых после активации клеток, таких как маркеры активации T-клеток, такие как CD25. В некоторых вариантах осуществления клетки демонстрируют менее дифференцированный или менее активированный поверхностный фенотип, несмотря на демонстрацию значительной экспансии и/или эффекторной функции.

[249] В некоторых вариантах осуществления T-клетки чувствительны к окружению с истощением триптофана или триптофановым голоданием, например, если активность, пролиферация и/или экспансия T-клеток может ингибироваться в окружении с триптофановым голоданием, истощением триптофана или недостаточностью триптофана. Опухолевые клетки, или злокачественные клетки, или ассоциированные клетки, такие как ассоциированные стромальные или миелоидные клетки, в некоторых аспектах могут генерировать, приводить к образованию или усиливать такое иммуносупрессорное окружение или условия посредством положительно регуляции активности и/или экспрессии IDO1 и/или посредством повышения активности и/или экспрессии транспортеров триптофана, например, LAT1/CD98hc или LAT2/CD98hc. В некоторых аспектах положительная регуляция транспортеров может происходить в ответ на окружение с триптофановым голоданием или голоданием по другим аминокислотам. В некоторых аспектах это может заставлять опухолевые или другие клетки повышать захват триптофана или другой аминокислоты в TME, что в некоторых случаях может истощать или снижать поступление или уровни доступного триптофана, например, в окружении с уже имеющимся голоданием, например, доступного для иммунных клеток, таких как клетки из адоптивного клеточного терапевтического средства. В некоторых случаях клетки в TME, например, фоновые клетки, такие как стромальные клетки, также могут положительно регулировать активность и/или экспрессию IDO1. В некоторых случаях на активность, пролиферацию и/или экспансию T-клеток значительно влияет наличие клеток, демонстрирующих высокую экспрессию транспортеров триптофана, таких как LAT1/CD98hc.

[250] Результаты, представленные в настоящем описании, соответствуют представлению о том, что T-клетки, экспрессирующие CAR, вводимые для T-клеточной терапии, в вариантах осуществления могут быть особенно чувствительными к низким уровням TRP и/или накоплению кинуренина и/или особенно восприимчивыми к таким эффектам, например, по причине своей способности стимулировать пути, приводящие к триптофановому голоданию и/или положительной регуляции IDO, например, после введения и активации. В настоящем описании отмечено, что иммуносупрессорные эффекты TME, такие как эффекты, индуцируемые наличием и/или активностью CAR-T-клеток и/или воспалительных сигналов, можно преодолевать посредством введения модуляторов метаболических путей триптофана, таких как альтернативные метаболические пути, таких как модуляторы пути кинуренина, например, ингибиторы IDO1.

[251] В некоторых аспектах иммуносупрессорные эффекты TME можно преодолевать посредством конструирования CAR-T-клеток для конкуренции или выживания в окружении с истощением триптофана, например, посредством гиперэкспрессии транспортеров триптофана, и/или так, чтобы сделать их менее чувствительными к истощению триптофана, например, посредством снижения экспрессии молекул, участвующих в IDO-опосредованной, или IDO-индуцированной, или индуцированной триптофановым голоданием иммуносупрессорной передачи сигнала, такой как передача сигнала, ассоциированная с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированная с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, включая молекулы, положительно или отрицательно регулируемые IDO-опосредованным катаболизмом, например, недостаточностью триптофана или накоплением кинуренина или другого метаболита триптофана. Ингибирование частей пути кинуренина, вносящих вклад в формирование иммуносупрессорных условий TME, например, ингибирование истощения TRP и/или продукции KYN и его производных или конструирование клеток так, чтобы они были более резистентными к иммуносупрессорному окружению с триптофановым голоданием или истощением триптофана, может повышать один или более параметров после введения или исходы после введения иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство.

[252] Таким образом, комбинированное лечение с использованием иммунотерапии, такой как T-клеточная терапия (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или терапия с привлечением T-клеток, и модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина может снижать или реверсировать некоторые из иммуносупрессорных эффектов TME и условий истощения триптофана, а также восстанавливать и/или повышать активность, исход, ответ и/или персистирование иммунотерапевтического средства, например, клеточного терапевтического средства.

II. КОМБИНИРОВАННОЕ ЛЕЧЕНИЕ

[253] Изобретение относится к способам комбинированного лечения, включающим введение индивидууму 1) модулятора, такого как триптофан или модулятор метаболизма триптофана, такого как модулятор альтернативного метаболического пути триптофана, например, модулятора пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, и 2) иммунотерапии или иммунотерапевтического средства, такого как адоптивное терапевтическое средство на основе иммунных клеток, например, T-клеточного терапевтического средства (например, CAR-экспрессирующих клеток, например, T-клеток) или T-клетки-привлекающего или иммуномодулирующего терапевтического средства, например, мультиспецифического T-клетки-рекрутирующего антитела и/или ингибитора контрольных точек. Изобретение также относится к комбинациям и промышленным изделиям, таким как наборы, содержащим композицию, содержащую иммунотерапевтическое средство, такое как клетки, и композиции, содержащей модулятор пути кинуренина, и применению таких композиций и комбинаций для лечения или профилактики заболеваний, состояний и нарушений, включая злокачественные новообразования. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапия является клеточной терапией, например, терапией иммунными клетками, например, клеточной терапией, включающей клетки, содержащие один или более рекомбинантных иммунных рецепторов, например, T-клеточной терапией (например, введением CAR-экспрессирующих T-клеток). Такие способы могут включать введение модулятора, например, модулятора пути кинуренина, до, одновременно, во время, в течение курса (включая однократно и/или периодически в течение курса) и/или после введения (например, начала введения) иммунотерапевтического средства или иммунотерапии, такой как T-клеточная терапия (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или другая терапия, такая как терапия с привлечением T-клеток. В некоторых вариантах осуществления введение может включать последовательное или периодическое введение модулятора, например, модулятора пути кинуренина, и/или иммунотерапии или иммунотерапевтического средства, например, T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления модулятор пути кинуренина вводят до, во время и/или после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[254] В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство, такое как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство, и модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предоставляют в виде фармацевтических композиций для введения индивидууму. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат терапевтически эффективные количества одного или обоих средств для комбинированного лечения, например, T-клеток для адоптивной клеточной терапии и ингибитора IDO1. В некоторых вариантах осуществления средства составляют для введения в отдельных фармацевтических композициях. В некоторых вариантах осуществления любые из фармацевтических композиций, представленных в настоящем описании, можно составлять в лекарственных формах, подходящих для каждого пути введения.

[255] В некоторых вариантах осуществления комбинированному лечению, включающему введение иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, включающего сконструированные клетки, такие как CAR-T-клеточное терапевтическое средство) и модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина или их композиций, подвергают индивидуума или пациента, имеющего заболевание или состояние, подлежащее лечению (например, злокачественное новообразование), или имеющего риск развития заболевания или состояния (например, злокачественного новообразования). В некоторых аспектах с помощью способов лечат, например, улучшают один или более симптомов заболевания или состояния, например, посредством уменьшения опухолевой массы при злокачественном новообразовании, экспрессирующем антиген, распознаваемый сконструированной T-клеткой.

[256] В некоторых вариантах осуществления иммунотерапия для использования со способами по изобретению включает T-клеточную терапию с использованием сконструированных T-клеток, включая клетки, сконструированные с использованием рекомбинантного рецептора (например, CAR-T-клетки). В некоторых случаях T-клетки могут быть чувствительными к активности пути кинуренина и/или метаболизма триптофана. В некоторых аспектах T-клетки могут быть чувствительными к триптофановому голоданию или истощению в окружении, например, в TME. В некоторых случаях опухолевые клетки и/или другие клетки в TME могут повышать экспрессию IDO1 и/или транспортеров аминокислот, таких как транспортеры триптофана, например, LAT1/CD98hc или LAT2/CD98hc, которые могут снижать количество триптофана, доступного CAR-T-клеткам в TME, посредством метаболизма триптофана и/или транспорта внеклеточного триптофана в опухолевые клетки и/или другие клетки. В некоторых случаях, триптофановое голодание или истощение может приводить к истощению, анергии или гибели эффекторных T-клеток, супрессии противоопухолевых иммунных ответов или толерантности к опухолевым антигенам, образованию и активации Treg и может вносить свой вклад в формирование иммуносупрессорных условий в TME (см., например, Moon et al., Journal for Immunotherapy of Cancer (2015) 3:51; Platten et al., Front Immunol. 2015 Jan 12;5:673; Weinmann, H., ChemMedChem 2016, 11:450-466). В некоторых аспектах триптофановое голодание или истощение может снижать или ингибировать функциональную активность и/или выживаемость CAR-T-клеток.

[257] В некоторых аспектах длительное триптофановое голодание или истощение в CAR-T-клетках может влиять на их способность восстанавливаться после голодания или истощения и/или реверсировать эффект голодания или истощения. В некоторых случаях длительное триптофановое голодание или истощение, например, длительное воздействие условий истощения триптофана в TME, может приводить к задержке или невозможности восстановления CAR-T-клеток, например, задержке или прекращению роста и/или функциональной активности. В некоторых случаях длительное триптофановое голодание или истощение, например, триптофановое голодание или истощение в течение приблизительно 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней или более может снижать или устранять способность T-клеток восстанавливаться после голодания или истощения или реверсировать его эффект.

[258] В некоторых аспектах варианты осуществления изобретения можно использовать для предотвращения или снижения длительного триптофанового голодания или истощения, и/или облегчения восстановления CAR-T-клеток после триптофанового голодания или истощения, и/или предотвращения, снижения или реверсирования иммуносупрессорных эффектов и/или других эффектов положительной регуляции IDO1 в TME. В некоторых аспектах варианты осуществления изобретения можно использовать для снижения или предотвращения триптофанового голодания или истощения и/или восстановления функциональной активности и/или роста T-клеток, например, сконструированных T-клеток для клеточной терапии, до исходного или стационарного уровня, например, уровней функциональной активности и/или роста в нормальных или стационарных условиях, например, условиях с достаточным количеством триптофана. В некоторых вариантах осуществления предотвращения и/или восстановления достигают посредством ингибирования активности IDO1, предотвращения истощения триптофана в TME и/или повышения способности T-клеток захватывать доступный триптофан из окружения. В некоторых вариантах осуществления комбинированное лечение, такое как любое комбинированное лечение, представленное в настоящем описании, можно использовать для предотвращения или снижения триптофанового голодания или истощения, или облегчения восстановления CAR-T-клеток после триптофанового голодания или истощения. В некоторых случаях в вариантах осуществления изобретения предотвращение триптофанового голодания или истощения и/или облегчение восстановления после триптофанового голодания или истощения, например, для восстановления или поддержания исходной или стационарной активности T-клеток, осуществляют до развития длительного триптофанового голодания или истощения, например, до того, как T-клетки будут неспособны реверсировать или восстановливаться после голодания или истощения.

[259] В некоторых аспектах в вариантах осуществления изобретения, например, комбинированное лекарственное средство из T-клеточной терапии, такой как CAR-T, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина можно вводить индивидууму, потерпевшему неудачу, больше не отвечающему и/или имеющему рецидив после введения других терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления варианты осуществления изобретения можно использовать для лечения индивидуумов, потерпевших неудачу при другой терапии, ставших резистентными к другой терапии и/или имеющих рецидив после введения других терапевтических средств, таких как предшествующее лечение модулятором метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитором IDO1. В некоторых аспектах варианты осуществления изобретения, например, комбинированному лечению с использованием T-клеточной терапии, такой как CAR-T, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина можно подвергать индивидуума, потерпевшего неудачу, больше не отвечающего и/или имеющего рецидив после введения ингибитора IDO, такого как эпакадостат.

[260] Варианты осуществления введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина могут улучшать ответы на недавно введенное клеточное терапевтическое средство. Т.к. индивидууму вводят свежий источник T-клеток (например, CAR-T-клеток, полученных посредством выделения T-клеток из индивидуума, конструирования для экспрессии рекомбинантного рецептора, активации и/или экспансии), модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, может проявлять свои эффекты в отношении вводимых T-клеток, даже если T-клетки индивидуума, не подвергнутые конструированию, потерпели неудачу или больше не отвечают на лечение при предшествующем введении модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, такого как эпакадостат. В некоторых вариантах осуществления свежий источник клеток, например, сконструированных T-клеток, может не подвергаться триптофановому голоданию. Таким образом, даже если индивидуум мог потерпеть неудачу или больше не отвечать на предшествующее лечение модулятором метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина может облегчать предотвращение триптофанового голодания или истощения и/или облегчать восстановление после триптофанового голодания или истощения, например, для восстановления или поддержания исходной или стационарной активности T-клеток из свежего источника клеток, например, сконструированных T-клеток.

[261] В некоторых вариантах осуществления комбинированное лекарственное средство можно вводить индивидуумам, потерпевшим неудачу, ставшим резистентными и/или имеющим рецидив после введения других предшествующих терапевтических средств, такого как предшествующее комбинированное лечение модулятором метаболизма триптофана и/или пути кинуренина и иммуномодулирующим терапевтическим средством, например, ингибитором иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления предшествующая иммуномодулирующая терапия не является предшествующей T-клеточной терапией. В некоторых вариантах осуществления индивидуумам не вводили предшествующее T-клеточное терапевтическое средство.

[262] В некоторых вариантах осуществления индивидууму перед введением CAR-T-клеток вводят комбинацию модулятора пути триптофана и ингибитора контрольных точек или другого иммунотерапевтического средства. В некоторых аспектах у индивидуума не наблюдают благоприятного эффекта модулятора пути триптофана по сравнению с введением иммунотерапевтического средства или ингибитора контрольных точек в отдельности.

[263] В некоторых вариантах осуществления индивидуума идентифицируют или выбирают для проведения одной или более стадий вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, если индивидуум потерпел неудачу, стал резистентным и/или имел рецидив после предшествующего лечения, такого как предшествующее введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, такого как эпакадостат, необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим терапевтическим средством, неявляющимся T-клеточным терапевтическим средством, например, ингибитором иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления комбинированное лекарственное средство можно вводить индивидуумам, потерпевшим неудачу, ставшим резистентными и/или имеющим рецидив после другого предшествующего лечения, такого как предшествующее комбинированное лечение модулятором метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитором IDO1, таким как эпакадостат, и иммуномодулятором, например, ингибитором иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления предшествующая иммуномодулирующая терапия не является предшествующей T-клеточной терапией. В некоторых вариантах осуществления индивидуумам не вводили предшествующее T-клеточное терапевтическое средство.

[264] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние, подвергаемое лечению, может являться любым заболеванием или состоянием, при котором экспрессия антигена ассоциирована и/или вовлечена в этиологию заболевания, состояния или нарушения, например, вызывает, усиливает или иным образом вносит свой вклад в такое заболевание, состояние или нарушение. Примеры заболеваний и состояний могут включать заболевания или состояния, ассоциированные с озлокачествлением или трансформацией клеток (например, злокачественным новообразованием), аутоиммунным или воспалительным заболеванием или инфекционным заболеванием, например, вызываемым бактериальными, вирусными или другими патогенами. Примеры антигенов, включающих антигены, ассоциированные с различными заболеваниями и состояниями, которые можно подвергать лечению, включают любые из антигенов, представленных в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, экспрессируемый на сконструированных клетках из комбинированного лекарственного средства, включая химерный антигенный рецептор или трансгенный TCR, специфически связывается с антигеном, ассоциированным с заболеванием или состоянием.

[265] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние является опухолью, такой как солидная опухоль, лимфома, лейкоз, гемобластоз, метастазирующая опухоль или другой тип злокачественного новообразования или опухоли.

[266] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние является инфекционным заболеванием или состоянием, в качестве неограничивающих примеров, таким как вирусные, ретровирусные, бактериальные и протозойные инфекции, иммунодефицит, инфекция цитомегаловирусом (CMV), вирусом Эпштейна-Барр (EBV), аденовирусом, полиомавирусом BK. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние является аутоиммунным или воспалительным заболеванием или состоянием, таким как артрит, например, ревматоидный артрит (RA), диабет типа I, системная красная волчанка (SLE), воспалительное заболевание кишечника, псориаз, склеродермия, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, болезнь Грейва, болезнь Крона, рассеянный склероз, астма и/или заболевание или состояние, ассоциированное с трансплантацией.

[267] В некоторых вариантах осуществления антиген, ассоциированный с заболеванием или нарушением, выбран из группы, состоящей из орфанного тирозинкиназного рецептора ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA, поверхностного антигена вируса гепатита B, рецептора фолата альфа, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 или 4, FBP, фетального ацетилхолина рецептора e, GD2, GD3, HMW-MAA, ИЛ-22R-альфа, ИЛ-13R-альфа 2, kdr, каппа-легкой цепи, антигена Льюиса Y, молекулы адгезии клеток L1, MAGE-A1, мезотелина, MUC1, MUC16, PSCA, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкоэмбрионального антигена, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбрионального антигена (CEA), простатспецифического антигена, PSMA, Her2/neu, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфрина B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2 и MAGE A3, CE7, белка опухоли Вильмса 1 (WT-1), циклина, такого как циклин A1 (CCNA1), и/или биотинилированных молекул, и/или молекул, экспрессируемых ВИЧ, HCV, HBV или другими патогенами. В некоторых вариантах осуществления антиген, ассоциированный с заболеванием или нарушением, выбран из группы, состоящей из орфанного тирозинкиназного рецептора ROR1, антигена созревания B-клеток (BCMA), карбоангидразы 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (рецепторной тирозинкиназы erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA, поверхностного антигена вируса гепатита B, рецептора фолата альфа, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, эпителиального гликопротеина 2 (EPG-2), эпителиального гликопротеина 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, димеров erbB, EGFR vIII, фолат-связывающего белка (FBP), FCRL5, FCRH5, фетального рецептора ацетилхолина, GD2, GD3, HMW-MAA, ИЛ-22R-альфа, ИЛ-13R-альфа 2, рецептора, содержащего домен вставки киназы (kdr), каппа-легкой цепи, антигена Льюиса Y, молекулы адгезии клеток L1, (L1-CAM), меланома-ассоциированного антигена (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, преференциально экспрессирующегося антигена меланомы (PRAME), сурвивина, TAG72, B7-H6, рецептора ИЛ-13 альфа 2 (ИЛ-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, рецептора фолата a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 интегрина, 8H9, NCAM, рецепторов VEGF, 5T4, фетального AchR, лигандов NKG2D, CD44v6, двойного антигена, антигена рака яичек, мезотелина, CMV мыши, муцина 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкоэмбрионального антигена, ROR1, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбрионального антигена (CEA), Her2/neu, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфрина B2, CD123, c-Met, GD-2, O-ацетилированного GD2 (OGD2), CE7, белка опухоли Вильмса 1 (WT-1), циклина, циклина A2, CCL-1, CD138, патоген-специфического антигена и антигена, ассоциированного с универсальной меткой, и/или биотинилированных молекул, и/или молекул, экспрессируемых ВИЧ, HCV, HBV или другими патогенами. Антигены, являющиеся мишенями для рецепторов, в некоторых вариантах осуществления включают антигены, ассоциированные с B-клеточным злокачественным новообразованием, такие как любые антигены из ряда известных маркеров B-клеток. В некоторых вариантах осуществления антигеном, являющимся мишенью для рецептора, является CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, каппа-цепь Ig, лямбда-цепь Ig, CD79a, CD79b или CD30.

[268] В некоторых вариантах осуществления способы можно использовать для лечения миеломы, лимфомы или лейкоза. В некоторых вариантах осуществления способы можно использовать для лечения неходжкинской лимфомы (NHL), острого лимфобластного лейкоза (ALL), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (DLBCL), острого миелолейкоза (AML) или миеломы, например, множественной миеломы (MM). В некоторых вариантах осуществления способы можно использовать для лечения MM или DBCBL.

[269] В некоторых вариантах осуществления способы можно использовать для лечения злокачественного новообразования, неявляющегося B-клеточным злокачественным новообразованием и/или неэкспрессирующим антиген B-клеток. В некоторых вариантах осуществления способы можно использовать для лечения злокачественного новообразования, неэкспрессирующего CD19. В некоторых вариантах осуществления в способах по изобретению используют T-клетку, экспрессирующую рекомбинантный рецептор (например, CAR-T-клетку), невоздействующий или несвязывающийся специфически с CD19.

[270] В некоторых вариантах осуществления способы можно использовать для лечения негематологического злокачественного новообразования, такого как солидная опухоль. В некоторых вариантах осуществления способы можно использовать для лечения рака мочевого пузыря, легких, злокачественных новообразований головного мозга, меланомы (например, меланомы с мелкоклеточным раком легких), рака молочной железы, шейки матки, яичника, колоректального рака, рака поджелудочной железы, эндометрия, пищевода, почки, печени, предстательной железы, кожи, щитовидной железы или матки.

[271] В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение ассоциировано с иммуносупрессорным локальным окружением. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение ассоциировано с активацией метаболизма триптофана и/или пути кинуренина в локальном окружении заболевания. Например, в некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение ассоциировано со сниженными уровнями триптофана и/или повышенными уровнями кинуренина (KYN) или его производных в локальном микроокружении заболевания или нарушения, например, микроокружении опухоли (TME). В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение ассоциировано с повышенной экспрессией ферментов или факторов, вовлеченных в путь кинуренина, например, индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), в клетках в TME, или клетки в TME индуцированы так, что экспрессируют ферменты или факторы, вовлеченные в путь кинуренина, например, индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназу 1 (IDO1).

[272] В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение не ассоциировано с повышенной экспрессией ферментов или факторов, вовлеченных в путь кинуренина, например, индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1). В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение, например, злокачественное новообразование, включает опухоль, отрицательную по IDO1, IDO2 или TDO, и/или индивидуум не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1, IDO2 или TDO.

[273] В случае профилактики или лечения заболевания, подходящая доза модуляторов метаболизма триптофана и/или пути кинуренина (например, ингибитора IDO1) и/или иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающего терапевтического средства, может зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, клеток и/или рекомбинантных рецепторов, экспрессирующихся на клетках, тяжести и течения заболевания, пути введения, того, вводят ли модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, и/или иммунотерапевтическое средство, например, T-клеточное терапевтическое средство, в профилактических или терапевтических целях, предшествующей терапии, частоты введения, анамнеза индивидуума и ответа на клетки и решения лечащего врача. В некоторых вариантах осуществления композиции и клетки соответствующим образом вводят индивидууму за один раз или в серии введений. Описаны примеры режимов и схем дозирования для комбинированного лечения по изобретению.

[274] В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство, например, T-клеточное терапевтическое средство, и модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят как часть дальнейшего комбинированного лечения, которые можно вводить одновременно или последовательно, в любом порядке, с другим терапевтическим средством. В некоторых случаях клетки вводят совместно с другим терапевтическим средством достаточно близко по времени таким образом, что популяции клеток повышают эффект одного или более дополнительных терапевтических средств, или наоборот. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят до одного или более дополнительных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят после одного или более дополнительных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают противолимфоцитарную терапию, такую как введение химиотерапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления способы не включают противолимфоцитарную терапию.

[275] В некоторых вариантах осуществления до, во время или после введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство) и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, биологическую активность иммунотерапевтического средства, например, биологическую активность популяций сконструированных клеток, измеряют, например, любым из ряда известных способов. Оцениваемые параметры включают способность сконструированных клеток разрушать клетки-мишени, измеряемую с использованием любого подходящего известного в этой области способа, такого как анализы, описываемые ниже в разделе III. В некоторых вариантах осуществления биологическую активность клеток, например, T-клеток, вводимых для T-клеточной терапии, измеряют посредством анализа экспрессия и/или секреции одного или более цитокинов. В некоторых аспектах биологическую активность измеряют посредством оценки бремени заболевания и/или клинического исхода, такого как снижение опухолевой массы или нагрузки. В некоторых вариантах осуществления измеряют уровни и/или изменения уровней факторов или эффекторов, например, ферментов и/или метаболитов пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления введение одного или обоих средств из комбинированного лечения и/или любое повторное введение терапевтического средства можно определять с учетом результатов анализов, осуществляемых до, во время, в течение курса или после введения одного или обоих средств из комбинированного лечения. В некоторых вариантах осуществления результаты таких анализов можно использовать для идентификации, выбора, скрининга и/или исключения индивидуумов до и/или после проведения одной или более стадий комбинированного лечения, например, введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство) и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления конкретных индивидуумов идентифицируют или выбирают для лечения с использованием иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство) и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина с учетом результатов анализа.

A. Введение иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства или T-клетки-привлекающего терапевтического средства)

[276] В некоторых вариантах осуществления способов, композиций, комбинаций, наборов и применения, представленных в настоящем описании, комбинированное лечение включает введение индивидууму иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающего терапевтического средства. Такие терапевтические средства можно вводить до, во время и после введения одного или более модуляторов метаболизма триптофана и/или пути кинуренина (например, ингибиторов IDO1), как описано.

[277] В некоторых вариантах осуществления иммунотерапия является клеточной терапией, представляющей собой или включающей введение клеток, таких как иммунные клетки, например, T-клетки или NK-клетки, направленное воздействующие на молекулу, экспрессирующуюся на поверхности повреждения, такого как опухоль или злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки экспрессируют T-клеточный рецептор (TCR) или другой антигенсвязывающий рецептор. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки экспрессируют рекомбинантный рецептор, такой как трансгенный TCR или химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления клетки являются аутологичными для индивидуума. В некоторых вариантах осуществления клетки являются аллогенными для индивидуума. Примеры таких клеточных терапевтических средств, например, T-клеточных терапевтических средств, для использования в способах по изобретению описаны ниже.

[278] В некоторых вариантах осуществления иммунотерапия представляет собой или включает терапию с привлечением T-клеток, представляющую собой или включающую связывающую молекулу, способную связываться с поверхностной молекулой, экспрессирующейся на T-клетке. В некоторых вариантах осуществления поверхностная молекула является активирующим компонентом T-клетки, таким как компонент комплекса T-клеточного рецептора. В некоторых вариантах осуществления поверхностная молекула является CD3 или CD2. В некоторых вариантах осуществления T-клетки-привлекающее терапевтическое средство представляет собой или включает антитело или антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления T-клетки-привлекающее терапевтическое средство представляет собой биспецифическое антитело, содержащее по меньшей мере один антигенсвязывающий домен, связывающийся с активирующим компонентом T-клетки (например, T-клеточной поверхностной молекулой, например, CD3 или CD2), и по меньшей мере один антигенсвязывающий домен, связывающийся с поверхностным антигеном на клетке-мишени, таким как поверхностный антиген на опухолевой или злокачественной клетке, например, любой из указанных антигенов, представленных в настоящем описании, например, CD19. В некоторых вариантах осуществления одновременное или почти одновременное связывание такого антитела с обоими из его мишеней может приводить к временному взаимодействию между клеткой-мишенью и T-клеткой, таким образом, приводя к активации, например, цитотоксической активности, T-клетки и последующему лизису клетки-мишени. Примерами таких биспецифических T-клетки-привлекающих антител являются молекулы биспецифического T-клетки-привлекающего активатора (BiTE), содержащие тандемные молекулы scFv, слитые с помощью гибкого линкера (см., например, Nagorsen and Bauerle, Exp Cell 317 Res 1255-1260 (2011); тандемные молекулы scFv, слитые друг с другом с помощью, например, гибкого линкера, и дополнительно содержащие Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединицы, способной к стабильной ассоциации (WO2013026837); диатела и их производные, включая тандемные диатела (Holliger et al, Prot Eng 9, 299-305 (1996); Kipriyanov et al, J Mol Biol 293, 41-66 (1999)); переориентирующиеся молекулы с двойной аффинностью (DART), которые могут включать формат диатела с C-концевым дисульфидным мостиком; или триатела, включающие целые гибридные молекулы IgG мыши/крысы (Seimetz et al, Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). В некоторых вариантах осуществления T-клетки-привлекающее терапевтическое средство является блинатумомабом (CD3xCD19 BiTE) или AMG 330. Любые из таких T-клетки-привлекающих активаторов можно использовать в способах по изобретению.

1. T-клеточная терапия

[279] В некоторых аспектах T-клеточное терапевтическое средство представляет собой или включает терапевтическое средство на основе инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL), терапевтическое средство с трансгенным TCR или T-клеточное терапевтическое средство, содержащее генетически сконструированные клетки, такое как терапевтическое средство на основе клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор специфически связывается с лигандом, таким как лиганд, ассоциированный с заболеванием или состоянием, например, ассоциированный или экспрессирующийся на клетке опухоли или злокачественного новообразования. В некоторых вариантах осуществления T-клеточная терапия включает введение T-клеток, сконструированных для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR).

[280] В некоторых вариантах осуществления клетки по изобретению экспрессируют и/или сконструированы для экспрессии рецепторов, таких как рекомбинантные рецепторы, включая рецепторы, содержащие лиганд-связывающие домены или их связывающие фрагменты, и T-клеточные рецепторы (TCR) и их компоненты, и/или функциональные не-TCR антигенные рецепторы, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор содержит внеклеточный лиганд-связывающий домен, специфически связывающийся с антигеном. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор является CAR, содержащим внеклеточный антигенраспознающий домен, специфически связывающийся с антигеном. В некоторых вариантах осуществления лиганд, такой как антиген, является белком, экспрессирующимся на поверхности клеток. В некоторых вариантах осуществления CAR является TCR-подобным CAR, и антиген является процессированным пептидным антигеном, таким как пептидный антиген внутриклеточного белка, который, подобно TCR, распознается на поверхности клетки в контексте молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC).

[281] Сконструированные клетки, включая сконструированные клетки, содержащие рекомбинантные рецепторы, описаны в разделе IV ниже. Примеры рекомбинантных рецепторов, включая CAR и рекомбинантные TCR, а также способы конструирования и встраивания рецепторов в клетки, включают примеры, описанные, например, в публикациях международных патентных заявок №№ WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, публикациях патентных заявок США №№ US2002131960, US2013287748, US20130149337, патентах США №№: 6451995, 7446190, 8252592, 8339645, 8398282, 7446179, 6410319, 7070995, 7265209, 7354762, 7446191, 8324353 и 8479118, и европейской патентной заявке № EP2537416, и/или примеры, описанные в Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. В некоторых аспектах генетически сконструированные антигенные рецепторы включают CAR, описанные в патенте США № 7446190 и публикации международной патентной заявки № WO/2014055668 A1.

[282] В некоторых вариантах осуществления T-клеточное терапевтическое средство для использования со способами по изобретению включает сконструированные T-клетки, включая клетки, сконструированные с использованием рекомбинантного рецептора (например, CAR-T-клетки), модифицированные по экспрессии, например, со снижением или повышением экспрессии одной или более молекул, ассоциированных с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание, недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию (например, по причине накопление метаболита триптофана) в клетке, по сравнению с экспрессией таких белков, индуцированных в ходе нормальных процессов IDO-опосредованной передачи сигнала, и/или в ответ на триптофановое голодание или недостаточность, или ассоциированных с восприятием триптофанового голодания или недостаточности, и/или в ответ на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, или ассоциированных с восприятием кинуренин-опосредованной иммуносупрессии. Такие белки включают белки, экспрессия которых, при ее изменении в T-клетках в ответ на метаболизм триптофана, например, катаболизм, например, в результате активности IDO, вносит свой вклад, вызывает или ассоциирована с иммуносупрессией T-клеток, в некоторых случаях приводящей к иммунологической толерантности и ускользанию опухоли от иммунного надзора. Такие белки могут включать белки, отвечающие на снижение, истощение или недостаточность конкретных аминокислот, например, триптофана, и/или отвечающие на повышение или накопление конкретных метаболитов аминокислот, например, кинуренина. Неограничивающие примеры таких белков включают киназу GCN2, BLIMP-1/PRDM1, арил-углеводородный рецептор (AHR), ядерный транслокатор AHR (ARNT), mTOR, протеинкиназу C тета (PKC-θ). Положительная регуляция экспрессии или транслоцированная экспрессия GCN2, CHOP, BLIMP-1, AHR или ядерного транслокатора AHR (ARNT) и/или негативная регуляция или сниженная экспрессия mTOR или PKC-тета в некоторых случаях ассоциирована с аутофагией, анергией T-клеток, сниженной активацией T-клеток и/или сниженной пролиферацией T-клеток (см., например, Metz et al. (2012) Oncoimmunology, 1:1460-1468; Moon et al. (2015) J Immunother Cancer, 3:51; Platten et al. (2015) Frontiers in Immunology, 5:1).

[283] В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки по изобретению модифицируют посредством рекомбинантной, достигнутой посредством конструирования и/или эктопической экспрессии одного или более белков, экспрессия которых в норме или в природных условиях снижается в T-клетке после IDO-опосредованной передачи сигнала и/или в ответ на недостаточность триптофана или накопление метаболита триптофана (например, кинуренина). В некоторых вариантах осуществления один или более белков являются mTOR или PKC-тета. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки по изобретению модифицируют посредством рекомбинантной, достигнутой посредством конструирования и/или эктопической экспрессии одной или более молекул, которые могут способствовать захвату триптофана или другой аминокислоты клетками, экспрессирующими такие молекулы, в условиях триптофанового голодания или недостаточности триптофана, например, одной или более цепей транспортера аминокислот или одного или более транспортеров аминокислот, таких как тяжелая цепь CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортер аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) и/или протонный транспортер аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4).

[284] В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки по изобретению включают рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования или эктопическую экспрессию mTOR, PKC-тета, CD98hc, LAT1, LAT2 или PAT4 или их функциональной части или варианта, например, посредством встраивания конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей mTOR, PKC-тета, CD98hc, LAT1, LAT2 или PAT4. В некоторых вариантах осуществления экспрессия mTOR, PKC-тета, CD98hc, LAT1, LAT2 или PAT4 находится под контролем гетерологичного промотора или энхансера, например, находится под контролем индуцибельного промотора. В некоторых вариантах осуществления после IDO-опосредованной передачи сигнала и/или в ответ на недостаточность триптофана или экспрессию белка такие сконструированные клетки способны к более высокой или повышенной экспрессии mTOR, PKC-тета, CD98hc, LAT1, LAT2 или PAT4 в клетке относительно экспрессии белка в схожей клетке, но не модифицированной таким образом посредством рекомбинантной, достигнутой посредством конструирования и/или эктопической экспрессии. В некоторых вариантах осуществления экспрессия такого белка, например, mTOR, PKC-тета, CD98hc, LAT1, LAT2 или PAT4, повышена по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно в 1,2 раза, 1,5 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 5,0 раз, 6,0 раз, 7,0 раз, 8,0 раз, 9,0 раз, 10,0 раз или более в конкретных условиях, ассоциированных с IDO-опосредованной передачей сигнала, недостаточностью триптофана и/или накоплением метаболита триптофана, по сравнению с экспрессией белка в тех же условиях в клетке, не модифицированной таким образом посредством рекомбинантной, достигнутой посредством конструирования или эктопической.

[285] В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки по изобретению модифицируют посредством сниженной экспрессии одного или более белков, экспрессия которых в норме является повышенный и/или транслоцированной в T-клетке после IDO-опосредованной передачи сигнала и/или в ответ на недостаточность триптофана или накопление метаболита триптофана (например, кинуренина). В некоторых вариантах осуществления один или более белков являются киназой GCN2, BLIMP-1/PRDM1, AHR или ядерным транслокатором AHR (ARNT). В некоторых вариантах осуществления такие клетки имеют сниженную экспрессию GCN2, CHOP, BLIMP-1/PRDM1, AHR или ARNT. В некоторых вариантах осуществления снижение экспрессии осуществляют с помощью средства, такого как ингибиторная молекула нуклеиновой кислоты или средство, способное опосредовать генетическое повреждение гена, кодирующего белок. В некоторых вариантах осуществления экспрессия средства находится под контролем зависящего от условий промотора или энхансера, такого как индуцибельный промотор, таким образом, в зависимости от условий регулирующего снижение экспрессии такого белка. Примеры систем и средств для осуществления снижения экспрессии и/или генетического повреждения описаны ниже. В некоторых вариантах осуществления экспрессия одного или более белков (например, GCN2, CHOP, BLIMP-1/PRDM1 и/или AHR) в клетке снижена по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с экспрессией в схожей клетке в отсутствие средства или генетического повреждения в тех же условиях.

[286] В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования или эктопическую экспрессию одного или более из mTOR, PKC-тета, тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) и/или протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4) или их функциональной части или варианта и включает сниженную экспрессию одного или более из GCN2, CHOP, BLIMP-1/PRDM1 или AHR.

[287] В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки по изобретению, модифицированные по экспрессии белка, ассоциированного с IDO-опосредованной передачей сигнала, например, в ответ на недостаточность триптофана или накопление метаболита триптофана, можно использовать в комбинации с модулятором метаболизма триптофана и/или пути кинуренина (например, ингибитором IDO1) для получения конкретных дополнительных преимуществ по сравнению со способом, в котором сконструированные клетки не модифицируют таким образом. В некоторых аспектах конкретные модуляторы метаболизма триптофана и/или пути кинуренина могут не воздействовать направленно, например, ингибировать, на все нижележащие активности, ассоциированные с катаболизмом триптофана, в случае чего сконструированные клетки по изобретению могут обеспечивать дополнительную резистентность сконструированного T-клеточного терапевтического средства к иммуносупрессорным эффектам пути кинуренина и/или передаче сигнала IDO1 или другого фермента пути. В некоторых случаях комбинирование таких модифицированных сконструированных клеток с комбинированным лечением, включающим модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина (например, ингибитор IDO1), может снижать количество или частоту введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина (например, ингибитора IDO1). В определенных аспектах модификация белка в сконструированных клетках по изобретению зависит от условий, например, является индуцибельной, при этом модификацию экспрессии белка (например, одного или более из GCN2, CHOP, BLIMP-1, ARH, ARNT, mTOR, PKC-тета, CD98hc, LAT1, LAT2 или PAT4) можно контролировать в конкретных условиях, например, во время, когда модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина может быть недоступным или неактивным.

[288] В некоторых вариантах осуществления индукцию модифицированной экспрессии (например, сниженной или повышенной экспрессии) осуществляют, когда наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления индукцию модифицированной экспрессии (например, сниженной или повышенной экспрессии) осуществляют, когда наблюдают признаки повышенной анергии T-клеток или истощения T-клеточного терапевтического средства, снижение пролиферации T-клеток и/или снижение активации T-клеток. В любом из таких вариантов осуществления такое повышение или снижение может являться более чем или более чем приблизительно 1,5-кратным, 2,0-кратным, 3,0-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или большим по сравнению с уровнем или активностью до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления индукцию модифицированной экспрессии (например, сниженной или повышенной экспрессии) осуществляют, когда количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови: снижено (например, снижено в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз или более) по сравнению с количеством T-клеток в предшествующей временной точке после начала T-клеточной терапии; менее чем в 1,5 раза 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз или более меньше пикового или максимального количества клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума после начала T-клеточной терапии; менее чем или приблизительно менее чем 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% или 0,1% клеток из T-клеточного терапевтического средства являются детектируемыми в крови после определения пикового или максимального уровня таких клеток в крови.

[289] В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению включают введение индуцибельного средства для индукции модификации экспрессии (например, сниженной или повышенной экспрессии) такого белка в сконструированной клетке. В некоторых вариантах осуществления индуцибельное средство является аллолактозой или IPTG, тетрациклином или производным тетрациклина или доксициклином или производным доксициклина. Выбор индуктора зависит, например, от конкретной индуцибельной системы, такой как конкретный промотор, для контроля экспрессии белка или контроля экспрессии средства, опосредующего нарушенную или сниженную экспрессию белка (например, ингибиторной нуклеиновой кислоты, нуклеазы или системы или комплекса нуклеазы). В некоторых вариантах осуществления индуктор является рапамицином или другим индуктором, способным облегчать химически индуцированную димеризацию двух субъединиц, необходимых для активности, например, индуцибельного split-Cas9 (Zetche et al. (2015) Nat. Biotechnol., 33:139-142). Примеры систем, зависящих от условий, таких как индуцибельные системы, описаны ниже.

[290] Известны способы введения сконструированных клеток для адоптивной клеточной терапии, и их можно использовать со способами и композициями по изобретению. Например, описаны способы адоптивной T-клеточной терапии, например, в публикации патентной заявки США № 2003/0170238 Gruenberg et al; патенте США № 4690915 Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85. См., например, Themeli et al., (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al., (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al., (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.

[291] В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную T-клеточную терапия, осуществляют посредством аутологичного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают из индивидуума, подлежащего клеточной терапии, или из образца, полученного из такого индивидуума. Таким образом, в некоторых аспектах клетки получают из индивидуума, например, пациента, нуждающегося в лечении, и после выделения и обработки клетки вводят тому же индивидууму.

[292] В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную T-клеточную терапию, осуществляют посредством аллогенного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают из индивидуума, иного чем индивидуум, которого подвергают или, в конечном итоге, подвергнут клеточной терапии, например, первого индивидуума. В таких вариантах осуществления клетки затем вводят другому индивидууму, например, второму индивидууму, того же вида. В некоторых вариантах осуществления первый и второй индивидуум являются генетически идентичными. В некоторых вариантах осуществления первый и второй индивидуумы являются генетически схожими. В некоторых вариантах осуществления второй индивидуум экспрессирует тот же класс или супертип HLA, что и первый индивидуум.

[293] Клетки можно вводить любыми подходящими способами. Клетки вводят в рамках схемы дозирования для достижения терапевтического эффекта, такого как снижение опухолевой массы. Дозирование и введение могут частично зависеть от режима введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, который можно вводить до, во время и/или после начала введения T-клеточного терапевтического средства. Различные режимы дозирования T-клеточного терапевтического средства включают, в качестве неограничивающих примеров, однократное или многократное введение в различные моменты времени, болюсное введение и импульсную инфузию.

a. Композиции и составы

[294] В некоторых вариантах осуществления дозу клеток из T-клеточного терапевтического средства, такого T-клеточное терапевтическое средство, содержащее клетки, сконструированные с использованием рекомбинантного антигенного рецептора, например, CAR или TCR, предоставляют в виде композиции или состава, такого как фармацевтическая композиция или состав. Такие композиции можно использовать способами по изобретению, такими как профилактика или лечение заболеваний, состояний и нарушений.

[295] В некоторых вариантах осуществления T-клеточное терапевтическое средство, такое как сконструированные T-клетки (например, CAR-T-клетки), составляют с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых аспектах выбор носителя частично определяется конкретной клеткой или средством и/или способом введения. Таким образом, существует множество подходящих составов. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. В некоторых аспектах используют смесь двух или более консервантов. Консервант или его смеси, как правило, присутствуют в количестве от приблизительно 0,0001% до приблизительно 2% по массе от общей композиции. Носители описывают, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают, в качестве неограничивающих примеров: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и m-крезол; низкомолекулярные полипептиды (менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексные соединения с металлами (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные средства, такие как полиэтиленгликоль (PEG).

[296] В некоторых аспектах композиции включают буферные средства. Подходящие буферные средства включают, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. В некоторых аспектах используют смесь двух или более буферных средств. Буферное средство или его смеси, как правило, присутствуют в количестве от приблизительно 0,001% до приблизительно 4% по массе от общей композиции. Известны способы получения вводимых фармацевтических композиций. Примеры способов более подробно описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (1 мая 2005 года).

[297] Состав или композиция также могут содержать несколько активных ингредиентов, применимых для конкретного показания, заболевания или состояния, подвергаемого профилактике или лечению с использованием клеток или средств, где соответствующие активности не влияют друг на друга неблагоприятно. Такие активные ингредиенты соответствующим образом присутствуют в комбинации в количествах, эффективных для предполагаемой цели. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает другие фармацевтически активные средства или лекарственные средства, такие как химиотерапевтические средства, например, аспарагиназа, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и т.д. В некоторых вариантах осуществления средства или клетки вводят в форме соли, например, фармацевтически приемлемой соли. Подходящие фармацевтически приемлемые кислые соли присоединения включают соли, полученные из неорганических кислот, таких как соляная, бромистоводородная, фосфорная, метафосфорная, азотная и серная кислота, и органических кислот, таких как винная, уксусная, лимонная, яблочная, молочная, фумаровая, бензойная, гликолевая, глюконовая, янтарная и арилсульфоновая кислота, например, p-толуолсульфоновая кислота.

[298] Активные ингредиенты можно заключать в микрокапсулы, коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или макроэмульсии. В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию составляют в виде комплекса включения, такого как циклодекстриновый комплекс включения, или в виде липосомы. Липосомы могут направлять средство или клетки-хозяева (например, T-клетки или NK-клетки) к конкретной ткани. Доступно множество способов получения липосом, таких как описано, например, в Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980) и патентах США № 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369.

[299] В некоторых аспектах в фармацевтической композиции можно использовать системы доставки с медленным высвобождением, отсроченным высвобождением и замедленным высвобождением таким образом, что доставка композиции происходит до сенсибилизации участка, подлежащего воздействию, и с достаточным количеством времени, чтобы вызывать эту сенсибилизацию. Доступно и известно множество типов систем доставки с высвобождением. С помощью таких систем можно избегать повторных введений композиций, таким образом, повышая удобство для индивидуума и лечащего врача.

[300] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит средства или клетки в количествах, эффективных для лечения или профилактики заболевания или состояния, таких как терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество. В некоторых вариантах осуществления терапевтические или профилактические исходы и/или эффективность подвергают мониторингу посредством периодической оценки подвергаемых лечению индивидуумов. В случае повторных введений за несколько дней или более, в зависимости от состояния, введение повторяют до достижения желаемой супрессии, или улучшения, или профилактики признака или симптомов заболевания или состояния, или когда предполагают, что его достигли или достигнут. Однако могут быть полезными другие режимы дозирования, и можно их определять. Желаемую дозу можно доставлять посредством однократного болюсного введения композиции, многократных болюсных введений композиции или непрерывного инфузионного введения композиции.

[301] Средства или клетки можно вводить любыми подходящими способами, например, посредством болюсной инфузии, инъекции, например, внутривенных или подкожных инъекций, внутриглазной инъекции, окологлазной инъекции, субретинальной инъекции, инъекции в стекловидное тело, транссептальной инъекции, инъекции под склеру, интрахориоидальной инъекции, внутрикамерной инъекции, подконъюктивальной инъекции, субтеноновой инъекции, ретробульбарной инъекции, околобульбарной инъекции или задней околосклеральной доставки. В некоторых вариантах осуществления их вводят посредством парентерального, внутрилегочного, интраназального введения и, при желании в случае местного введения, введения в очаг повреждения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное или подкожное введение.

[302] В некоторых случаях клеточное терапевтическое вводят в виде единой фармацевтической композиции, содержащей клетки. В некоторых вариантах осуществления указанную дозу вводят посредством однократного болюсного введения клеток или средства. В некоторых вариантах осуществления ее вводят посредством многократных болюсных введений клеток или средства, например, в течение периода времени не более 3 дней, или посредством непрерывного инфузионного введения клеток или средства.

[303] В случае профилактики или лечения заболевания подходящая доза может зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа средства или средств, типа клеток или рекомбинантных рецепторов, тяжести и течения заболевания, того, вводят ли средство или клетки в профилактических или терапевтических целях, предшествующей терапии, анамнеза индивидуума, ответа на средство или клетки и решения лечащего врача. В некоторых вариантах осуществления композиции соответствующим образом вводят индивидууму за один раз или в серии введений.

[304] Клетки или средства можно вводить с использованием стандартных способов введения, составов и/или устройств. Изобретение относится к составам и устройствам, таким как шприцы и сосуды, для хранения и введения композиций. Что касается клеток, введение может являться аутологичным или гетерологичным. Например, иммунореспонсивные клетки или клетки-предшественники можно получать из одного индивидуума и вводить тому же индивидууму или другому, совместимому индивидууму. Иммунореспонсивные клетки, полученные из периферической крови, или их потомство (например, полученное in vivo, ex vivo или in vitro) можно вводить посредством локализованной инъекции, включая введение с помощью катетера, системной инъекции, локализованной инъекции, внутривенной инъекции или парентерального введения. При введении терапевтической композиции (например, фармацевтической композиции, содержащей генетически модифицированные иммунореспонсивную клетку или средство, с помощью которого лечат или улучшают симптомы нейротоксичности), ее, как правило, будут составлять в форме инъецируемой единицы дозирования (раствора, суспензии, эмульсии).

[305] Составы включают составы для перорального, внутривенного, интраперитонеального, подкожного, легочного, трансдермального, внутримышечного, интраназального, буккального, сублингвального введения или введения с помощью суппозиториев. В некоторых вариантах осуществления средство или популяции клеток вводят парентерально. В рамках изобретения термин "парентеральный" включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное и интраперитонеальное введение. В некоторых вариантах осуществления средство или популяции клеток вводят индивидууму с использованием периферической системы доставки посредством внутривенной, интраперитонеальной или подкожной инъекции.

[306] Композиции в некоторых вариантах осуществления предоставляют в виде стерильных жидких препаратов, например, изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий, дисперсий или вязких композиций, которые в некоторых аспектах можно забуферивать до выбранного pH. Жидкие препараты, как правило, легче получать, чем гели, другие вязкие композиции и твердые композиции. Кроме того, жидкие композиции удобнее вводить, особенно посредством инъекции. С другой стороны, вязкие композиции можно составлять в подходящем диапазоне вязкости для обеспечения более длительных периодов контакта с конкретными тканями. Жидкие или вязкие композиции могут содержать носители, которые могут являться растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и подходящие их смеси.

[307] Стерильные инъецируемые растворы можно получать посредством включения средства или клеток в растворитель, например, в смеси с подходящим носителем, дилюентом или эксципиентом, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза, декстроза или т.п. Композиции также можно лиофилизировать. Композиции могут содержать вспомогательные средства, такие как увлажнители, диспергирующие средства или эмульгаторы (например, метилцеллюлозу), pH-буферные средства, желирующие добавки или добавки, повышающие вязкость, консерванты, ароматизаторы, красители и т.п., в зависимости от желаемого пути введения и получения. В некоторых аспектах для получения подходящих препаратов можно обращаться к известным руководствам.

[308] Можно добавлять различные добавки, повышающие стабильность и стерильность композиций, включая антимикробные консерванты, антиоксиданты, хелатирующие средства и буферы. Предотвращения воздействия микроорганизмов можно достигать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Пролонгированной абсорбции инъецируемой фармацевтической формы можно достигать с использованием средств, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

[309] Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, где матрицы находятся в форме профилированных изделий, например, пленок, или микрокапсул.

[310] Составы, подлежащие использованию для введения in vivo, как правило, являются стерильными. Стерильности можно достигать, например, посредством фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны.

b. Режим дозирования и введение

[311] В некоторых вариантах осуществления дозу клеток вводят индивидуумам способами по изобретению. В некоторых вариантах осуществления размер или временной режим введения доз определяют как функцию конкретного заболевания или состояния у индивидуума. В объем навыков специалистов в этой области входит эмпирическое определение размера или временного режима введения доз для конкретного заболевания с учетом представленного описания.

[312] В определенных вариантах осуществления клетки или отдельные популяции подтипов клеток вводят индивидууму в количестве в диапазоне от приблизительно 0,1 миллиона до приблизительно 100 миллиардов клеток и/или в таком количестве клеток на килограмм массы тела индивидуума, как, например, от 0,1 миллиона до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 25 миллионов клеток, приблизительно 500 миллионов клеток, приблизительно 1 миллиард клеток, приблизительно 5 миллиардов клеток, приблизительно 20 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 40 миллиардов клеток или диапазон, определенный любыми двумя из указанных выше значений), от 1 миллиона до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 25 миллионов клеток, приблизительно 500 миллионов клеток, приблизительно 1 миллиард клеток, приблизительно 5 миллиардов клеток, приблизительно 20 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 40 миллиардов клеток или диапазон, определенный любыми двумя из указанных выше значений), например, от приблизительно 10 миллионов до приблизительно 100 миллиардов клеток (например, приблизительно 20 миллионов клеток, приблизительно 30 миллионов клеток, приблизительно 40 миллионов клеток, приблизительно 60 миллионов клеток, приблизительно 70 миллионов клеток, приблизительно 80 миллионов клеток, приблизительно 90 миллионов клеток, приблизительно 10 миллиардов клеток, приблизительно 25 миллиардов клеток, приблизительно 50 миллиардов клеток, приблизительно 75 миллиардов клеток, приблизительно 90 миллиардов клеток или диапазон, определенный любыми двумя из указанных выше значений), и в некоторых случаях от приблизительно 100 миллионов клеток до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 120 миллионов клеток, приблизительно 250 миллионов клеток, приблизительно 350 миллионов клеток, приблизительно 450 миллионов клеток, приблизительно 650 миллионов клеток, приблизительно 800 миллионов клеток, приблизительно 900 миллионов клеток, приблизительно 3 миллиарда клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 45 миллиардов клеток), включая любое значение между этими диапазонами и/или количество на килограмм массы тела индивидуума. Дозы могут варьироваться в зависимости от конкретных признаков заболевания или нарушения, и/или пациента, и/или другого лечения. В некоторых вариантах осуществления такие значения относятся к количествами клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор; в других вариантах осуществления они относятся к количеству T-клеток, или PBMC, или всех вводимых клеток.

[313] В некоторых вариантах осуществления, например, если индивидуум является человеком, доза включает менее приблизительно 1×10⁸ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR), T-клеток или мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), например, в диапазоне от приблизительно 1×10⁶ до 1×10⁸ таких клеток, например, 2×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷ или 1×10⁸ или всех таких клеток, включая диапазон между любыми двумя из указанных выше значений. В некоторых вариантах осуществления, если индивидуум является человеком, доза включает приблизительно от 1×10⁶ до 3×10⁸ всех клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR), например, в диапазоне приблизительно от 1×10⁷ до 2×10⁸ таких клеток, например, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸ или 1,5×10⁸ всех таких клеток, включая диапазон между любыми двумя из указанных выше значений. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят множество доз, и каждая из доз или общая доза может находиться в пределах любого из указанных выше значений. В некоторых вариантах осуществления доза клеток включает введение от или приблизительно от 1×10⁵ до 5×10⁸ всех T-клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, или всех T-клеток, от 1×10⁵ до 1×10⁸ всех T-клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, или всех T-клеток, от или приблизительно от 5×10⁵ до 1×10⁷ всех T-клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, или всех T-клеток, или от или приблизительно от 1×10⁶ до 1×10⁷ всех T-клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, или всех T-клеток, включительно.

[314] В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток, составляющее по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно или составляющее или составляющее приблизительно 0,1×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума, 0,2×10⁶ клеток/кг, 0,3×10⁶ клеток/кг, 0,4×10⁶ клеток/кг, 0,5×10⁶ клеток/кг, 1×10⁶ клетка/кг, 2,0×10⁶ клеток/кг, 3×10⁶ клеток/кг или 5×10⁶ клеток/кг.

[315] В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток, составляющее от или приблизительно от 0,1×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 1,0×10⁷ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг до 3×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг до 2×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг до 1×10⁶ клетка/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг до 3×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг до 2×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 2,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 2,0×10⁶ клеток/кг до 3×10⁶ клеток/кг или от или приблизительно от 3,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, включительно.

[316] В некоторых вариантах осуществления доза клеток содержит от или приблизительно от 2×10⁵ клеток/кг до или приблизительно до 2×10⁶ клеток/кг, например, от или приблизительно от 4×10⁵ клеток/кг и до или приблизительно до 1×10⁶ клеток/кг или от или приблизительно от 6×10⁵ клеток/кг и до или приблизительно до 8×10⁵ клеток/кг. В некоторых вариантах осуществления доза клеток содержит не более чем 2×10⁵ клеток (например, антиген-экспрессирующих клеток, таких как CAR-экспрессирующие клетки) на килограмм массы тела индивидуума (клеток/кг), например, не более чем или приблизительно 3×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 4×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 5×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 6×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 7×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 8×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 9×10⁵ клеток/кг, не более чем или приблизительно 1×10⁶ клеток/кг или не более чем или приблизительно 2×10⁶ клеток/кг. В некоторых вариантах осуществления доза клеток содержит по меньшей мере, или, по меньшей мере приблизительно, или точно, или приблизительно 2×10⁵ клеток (например, антиген-экспрессирующих клеток, таких как CAR-экспрессирующие клетки) на килограмм массы тела индивидуума (клеток/кг), например, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или приблизительно 3×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или приблизительно 4×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или приблизительно 5×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или приблизительно 6×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или приблизительно 7×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или приблизительно 8×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или приблизительно 9×10⁵ клеток/кг, по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или приблизительно 1×10⁶ клеток/кг или по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или приблизительно 2×10⁶ клеток/кг.

[317] В контексте адоптивной клеточной терапии введение указанной "дозы" клеток включает введение указанного количества клеток в виде единой композиции и/или единого непрерывного введения, например, в виде однократной инъекции или непрерывной инфузии, а также включает введение указанного количества клеток в виде фракционированной дозы, предоставленной во множестве отдельных композиций или инфузий, в течение определенного периода времени, составляющее не более 3 дней. Таким образом, в некоторых случаях доза представляет собой однократное или непрерывное введение определенного количества клеток, вводимых в один момент времени. Однако в некоторых случаях дозу вводят во множестве инъекций или инфузий в течение периода времени не более трех дней, например, один раз в сутки в течение трех дней или в течение двух дней или посредством множества инфузий за один день.

[318] Таким образом, в некоторых аспектах клетки из дозы вводят в единой фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления клетки из дозы вводят во множестве композиций, в совокупности содержащих клетки из дозы.

[319] Термин "фракционированная доза" относится к дозе, разделенной таким образом, что ее вводят в течение более одного дня. Этот тип дозирования включен в способы по изобретению, и его рассматривают как однократную дозу. В некоторых вариантах осуществления клетки фракционированной дозы вводят во множестве композиций, в совокупности содержащих клетки из дозы, в течение периода времени не более трех дней.

[320] Таким образом, дозу клеток можно вводить в виде фракционированной дозы. Например, в некоторых вариантах осуществления дозу можно вводить индивидууму в течение 2 дней или 3 дней. Примеры способов введения фракционированных доз включают введение 25% дозы в первый день и введение остальных 75% дозы во второй день. В других вариантах осуществления 33% дозы можно вводить в первый день и остальные 67% вводят во второй день. В некоторых аспектах 10% дозы вводят в первый день, 30% дозы вводят во второй день, и 60% дозы вводят в третий день. В некоторых вариантах осуществления фракционированную дозу не разделяют на более чем 3 дня.

[321] В некоторых вариантах осуществления клетки из дозы можно вводить посредством введения множества композиций или растворов, таких как первая и вторая композиция или раствор, необязательно больше, каждый из которых содержит некоторые клетки из дозы. В некоторых аспектах множество композиций, каждая из которых содержит разные популяции и/или подтипы клеток, вводят раздельно или независимо, необязательно, в пределах конкретного периода времени. Например, популяции или подтипы клеток могут включать CD8⁺ и CD4⁺ T-клетки, соответственно, и/или CD8+- и CD4+-обогащенные популяции, соответственно, например, CD4+ и/или CD8+ T-клетки, каждая из которых отдельно включает клетки, генетически сконструированные для экспрессии рекомбинантного рецептора. В некоторых вариантах осуществления введение дозы включает введение первой композиции, содержащей дозу CD8+ T-клеток или дозу CD4+ T-клеток, и введение второй композиции, содержащей другую дозу CD4+ T-клеток и CD8+ T-клеток.

[322] В некоторых вариантах осуществления введение композиции или дозы, например, введение множества композиций клеток, включает раздельное введение композиций клеток. В некоторых аспектах раздельные введения осуществляют одновременно или последовательно в любом порядке. В некоторых вариантах осуществления доза содержит первую композицию и вторую композицию, и первую композицию и вторую композицию вводят с интервалом от 0 до 12 часов, от 0 до 6 часов или 0 до 2 часов. В некоторых вариантах осуществления начало введения первой композиции и начало введения второй композиции осуществляют с интервалом не более 2 часов, не более 1 часа или не более 30 минут, не более 15 минут, не более 10 минут или не более 5 минут. В некоторых вариантах осуществления начало и/или завершение введения первой композиции и завершение и/или начало введения второй композиции осуществляют с интервалом не более 2 часов, не более 1 часа или не более 30 минут, не более 15 минут, не более 10 минут или не более 5 минут.

[323] В некоторых случаях первая композиция, например, первая композиция из дозы, содержит CD4+ T-клетки. некоторых случаях первая композиция, например, первая композиция из дозы, содержит CD8+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления первую композицию вводят перед второй композицией.

[324] В некоторых вариантах осуществления доза или композиция клеток включает определенное или целевое соотношение CD4+-клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, и CD8+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, и/или CD4+-клеток и CD8+ клеток, где соотношение, необязательно, составляет приблизительно 1:1 или составляет от приблизительно 1:3 до приблизительно 3:1, например, приблизительно 1:1. В некоторых аспектах введение композиции или дозы с целевым или желаемым соотношением различных популяций клеток (таким как соотношение CD4+:CD8+ или соотношение CAR+CD4+:CAR+CD8+, например, 1:1) включает введение композиции клеток, содержащей одну из популяций, а затем введение отдельной композиции клеток, содержащей другие популяции, где введение осуществляют в или приблизительно в целевом или желаемом соотношении.

[325] В некоторых вариантах осуществления доза клеток, как правило, является достаточно большой, чтобы быть эффективной для снижения бремени заболевания.

[326] В некоторых вариантах осуществления клетки вводят в желаемой дозе, которая в некоторых аспектах включает желаемую дозу, или количество клеток, или типы клеток, и/или желаемое соотношение типов клеток. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления доза клеток основана на общем количестве клеток (или количестве на кг массы тела) и желаемом соотношении отдельных популяций или подтипов, таком как соотношение CD4+ и CD8+. В некоторых вариантах осуществления доза клеток основана на желаемом общем количестве (или количестве на кг массы тела) клеток в отдельных популяциях или отдельных типах клеток. В некоторых вариантах осуществления доза основана на комбинации таких признаков, как желаемое количество всех клеток, желаемое соотношение и желаемое общее количество клеток в отдельных популяциях.

[327] В некоторых вариантах осуществления популяции или подтипы клеток, такие как CD8⁺ и CD4⁺ T-клетки, вводят при переносимом различии желаемой дозы всех клеток, такой как желаемая доза T-клеток. В некоторых аспектах желаемая доза является желаемым количеством клеток или желаемым количеством клеток на единицу массы тела индивидуума, которому вводят клетки, например, количество клеток/кг. В некоторых аспектах желаемая доза является минимальным количеством клеток или минимальным количеством клеток на единицу массы тела или превышает его. В некоторых аспектах среди всех клеток, вводимых в желаемой дозе, отдельные популяции или подтипы присутствуют в желаемом выходном соотношении или близком к нему соотношении (таком как соотношение CD4⁺ и CD8⁺), например, в пределах конкретного переносимого различия или ошибки такого соотношения.

[328] В некоторых вариантах осуществления клетки вводят в пределах переносимого различия желаемой дозы одной или более отдельных популяций или подтипов клеток, такой как желаемая доза CD4+-клеток и/или желаемая доза CD8+ клеток. В некоторых аспектах желаемая доза является желаемым количеством клеток подтипа или популяции или желаемым количеством таких клеток на единицу массы тела индивидуума, которому вводят клетки, например, количество клеток/кг. В некоторых аспектах желаемая доза является минимальным количеством клеток популяции или подтипа или минимальным количеством клеток популяции или подтипа на единицу массы тела или превышает его.

[329] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления доза основана на желаемой фиксированной дозе всех клеток и желаемом соотношении и/или основана на желаемой фиксированной дозе одного или более, например, каждого, из отдельных подтипов или субпопуляций. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления доза основана на желаемой фиксированной или минимальной дозе T-клеток и желаемом соотношении CD4⁺ и CD8⁺ клеток и/или основана на желаемой фиксированной или минимальной дозе CD4⁺ и/или CD8⁺ клеток.

[330] В некоторых вариантах осуществления клетки вводят в пределах переносимого диапазона желаемого выходного соотношения множества популяций или подтипов клеток, таких как CD4+ и CD8+ клетки или их подтипы. В некоторых аспектах желаемое соотношение может являться определенным соотношением или может представлять собой диапазон соотношений. Например, в некоторых вариантах осуществления желаемое соотношение (например, соотношение CD4⁺ и CD8⁺ клеток) составляет от или приблизительно от 5:1 и до или приблизительно до 5:1 (или более приблизительно 1:5 и менее приблизительно 5:1) или от или приблизительно от 1:3 и до или приблизительно до 3:1 (или более приблизительно 1:3 и менее приблизительно 3:1), например, от или приблизительно от 2:1 и до или приблизительно до 1:5 (или более приблизительно 1:5 и менее приблизительно 2:1, например, точно или приблизительно 5:1, 4,5:1, 4:1, 3,5:1, 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,9:1, 1,8:1, 1,7:1, 1,6:1, 1,5:1, 1,4:1, 1,3:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4, 1:1,5, 1:1,6, 1:1,7, 1:1,8, 1:1,9: 1:2, 1:2,5, 1:3, 1:3,5, 1:4, 1:4,5 или 1:5. В некоторых аспектах переносимое различие составляет в пределах приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 3%, приблизительно 4% приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50% желаемого соотношения, включая любое значение между этими диапазонами.

[331] В конкретных вариантах осуществления количества и/или концентрации клеток относятся к количеству клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR). В других вариантах осуществления количества и/или концентрации клеток относятся к количеству или концентрации всех вводимых клеток, T-клеток или мононуклеарных клетки периферической крови (PBMC).

[332] В некоторых аспектах размер дозы определяют с учетом одного или более критериев, таких как ответ индивидуума на предшествующее лечение, например, химиотерапию, бремя заболевания у индивидуума, такое как опухолевая нагрузка, объем, размер или степень опухоли, степень или тип метастазирования, стадия и/или вероятность или частота развития у индивидуума токсических исходов, например, CRS, синдрома активации макрофагов, синдрома лизиса опухоли, нейротоксичности и/или иммунного ответа реципиента против вводимых клеток и/или рекомбинантных рецепторов.

[333] В некоторых случаях способы по изобретению делают возможным введение меньшей дозы таких клеток для достижения той же или лучшей эффективности или другого исхода лечения относительно дозы в способе, в котором клеточное терапевтическое средство вводят без введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина (например, ингибитора IDO1), или способе, в котором клетки не содержат модификацию экспрессии белка, ассоциированного с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или возникающей в ответ на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или возникающей в ответ на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию. В некоторых вариантах осуществления доза вводимых клеток меньше дозы в способе, в котором клеточное терапевтическое средство вводят без введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина (например, ингибитора IDO1), или способе, в котором клетки не содержат модификацию экспрессии белка, ассоциированного с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, индуцируемой или активируемой в ответ на голодание или недостаточность или ассоциированной с восприятием голодания или недостаточности и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, например, по меньшей мере в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз или 10 раз меньше дозы в способе, в котором клеточное терапевтическое средство вводят без введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина (например, ингибитора IDO1), или способе, в котором клетки не содержат модификацию экспрессии белка, ассоциированного с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию. В некоторых вариантах осуществления, например, более низкая доза содержит менее приблизительно 5×10⁶ клеток, клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR), T-клеток и/или PBMC на килограмм массы тела индивидуума, например, приблизительно или менее приблизительно 4×10⁶, 3×10⁶, 2×10⁶, 1×10⁶, 0,5×10⁶ или 0,1×10⁶ таких клеток на килограмм массы тела индивидуума.

[334] В некоторых вариантах осуществления индивидууму можно вводить одну или более последующих доз клеток. В некоторых вариантах осуществления последующую дозу клеток вводят через более чем или более чем приблизительно 7 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней или 35 дней после начала введения первой дозы клеток. Последующая доза клеток может быть больше, приблизительно такой же или меньше первой дозы. В некоторых вариантах осуществления можно повторять введение T-клеточного терапевтического средства, такое как введение первой и/или второй дозы клеток.

[335] В некоторых вариантах осуществления начало введения клеточного терапевтического средства, например, дозы клеток или первой дозы из фракционированной дозы клеток, осуществляют до, одновременно или после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1.

[336] В некоторых вариантах осуществления дозу клеток или последующую дозу клеток вводят через от 0 до 90 дней, например, от 0 до 30 дней, от 0 до 15 дней, от 0 до 6 дней, от 0 до 96 часов, от 0 до 24 часов, от 0 до 12 часов, от 0 до 6 часов или 0 до 2 часов, от 2 часов до 30 дней, от 2 часов до 15 дней, от 2 часов до 6 дней, от 2 часов до 96 часов, от 2 часов до 24 часов, от 2 часов до 12 часов, от 2 часов до 6 часов, от 6 часов до 90 дней, от 6 часов до 30 дней, от 6 часов до 15 дней, от 6 часов до 6 дней, от 6 часов до 96 часов, от 6 часов до 24 часов, от 6 часов до 12 часов, от 12 часов до 90 дней, от 12 часов до 30 дней, от 12 часов до 15 дней, от 12 часов до 6 дней, от 12 часов до 96 часов, от 12 часов до 24 часов, от 24 часов до 90 дней, от 24 часов до 30 дней, от 24 часов до 15 дней, от 24 часов до 6 дней, от 24 часов до 96 часов, от 96 часов до 90 дней, от 96 часов до 30 дней, от 96 часов до 15 дней, от 96 часов до 6 дней, от 6 дней до 90 дней, от 6 дней до 30 дней, от 6 дней до 15 дней, от 15 дней до 90 дней, от 15 дней до 30 дней или от 30 дней до 90 дней после начала введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления дозу клеток или последующую дозу клеток вводят после начала введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления дозу клеток вводят через по меньшей мере, или приблизительно по меньшей мере, или приблизительно 1 час, 2 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 2 дня, 3 дня, 6 дней, 12 дней, 15 дней, 30 дней, 60 дней или 90 дней после начала введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[337] В некоторых вариантах осуществления дозу клеток во время, когда достигают одного или более эффектов модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых вариантах осуществления способ включает, после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, но перед введением T-клеточного терапевтического средства, например, адоптивного T-клеточного терапевтического средства, анализ образца индивидуума на изменение уровней метаболитов пути кинуренина, например, TRP, KYN или производных KYN, и/или уровней экспрессии факторов или эффекторов, например, ферментов, вовлеченных в путь кинуренина, например, IDO1, или другие фенотипы или желаемые исходы, как представлено в настоящем описании, например, как описано в разделе III. В некоторых вариантах осуществления дозу клеток вводят, когда модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина (например, ингибитор IDO1) приведет или, вероятно, приведет к изменению уровней метаболитов в пути кинуренина, такому как повышение уровней TRP или снижение уровней KYN или производного KYN (например, повышение или снижение по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере в 1,2 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 10 раз или более) по сравнению с уровнем непосредственно перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. Такие параметры и другие параметры и примеры их определения или анализа описаны в разделе III.

[338] В некоторых вариантах осуществления начало введения дозы клеток из T-клеточного терапевтического средства, например, адоптивного T-клеточного терапевтического средства, осуществляют перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых вариантах осуществления дозу клеток вводят за по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1 час, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 2 часа, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 3 часа, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 6 часов, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 12 часов, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1 день, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 2 дня, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 3 дня, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 4 дня, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 5 дней, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 6 дней, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 12 дней, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 14 дней, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 15 дней, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 21 день, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 28 дней, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 30 дней, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 35 дней, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 42 дня, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 60 дней или по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90 дней перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина (например, ингибитора IDO1).

[339] В некоторых вариантах осуществления способ включает, после введения дозы клеток из T-клеточного терапевтического средства, например, адоптивного T-клеточного терапевтического средства, но перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, анализ образца индивидуума на изменение уровней метаболитов в пути кинуренина, например, TRP, KYN или производных KYN, и/или уровней экспрессии факторов или эффекторов, например, ферментов, вовлеченных в путь кинуренина, например, IDO1, или другие фенотипы или желаемые исходы, как представлено в настоящем описании, например, такие как описано в разделе III. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина осуществляют, когда предшествующее введение иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство) вызывает или индуцирует или, вероятно, вызывает или индуцирует, прямо или косвенно, изменение уровней метаболитов в пути кинуренина, такое как снижение уровней TRP или повышение уровней KYN или производного KYN (например, повышение или снижение по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере в 1,2 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 10 раз или более) по сравнению с уровнем непосредственно перед началом иммунотерапии (например, T-клеточной терапии, такой как CAR-T-клеточная терапия) или в предшествующей временной точке после начала иммунотерапии. Различные параметры для определения или оценки схемы комбинированного лечения описаны в разделе III.

B. Введение модуляторов метаболизма триптофана и/или пути кинуренина

[340] Способы, композиции, комбинации, наборы и применение по изобретению включают введение модулятора пути кинуренина, например, ингибитора фермента индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят до, после, во время, одновременно или почти одновременно, последовательно и/или попеременно с введением иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, например, введением T-клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR).

1. Модуляторы метаболизма триптофана и/или пути кинуренина

[341] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором и/или антагонистом, ингибирующим активность фактора и/или фермента в пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина влияет на уровни метаболитов пути кинуренина, например, приводит к повышению или снижению конкретного метаболита пути кинуренина.

[342] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина модулирует, например, регулирует, ингибирует, индуцирует или активирует, один или более факторов или эффекторов, например, ферментов, вовлеченных в путь. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина модулирует, например, регулирует, ингибирует или активирует, индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназу 1 (IDO1), IDO2, триптофан-2,3-диоксигеназу (TDO), кинуренинформамидазу, кинурениназу, L-кинуренингидролазу, кинуренин-3-монооксигеназу, кинуренин-3-гидроксилазу, оксигеназу 3-гидроксиантраниловой кислоты, 3-гидроксиантранилат-3,4-диоксигеназу, кинуренинаминотрансферазу и/или фосфорибозилтрансферазу хинолиновой кислоты.

[343] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина модулирует или регулирует, например, повышает или снижает, уровень, доступность, концентрацию, эффект, активность, метаболизм, синтез и/или деградацию одного или более метаболитов в пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления метаболит пути кинуренина является L-триптофаном, n-формилкинуренином, DL-кинуренином, L-кинуренином, 3-гидрокси-DL-кинуренином, кинуреновой кислотой, хинальдиновой кислотой, кинурамином, 3-гидрокси-L-кинуренином, 3-гидрокси-D-кинуренином, 3-гидрокси-антраниловой кислотой, ксантомматином, антраниловой кислотой, ксантуреновой кислотой, пиколиновой кислотой, хинолиновой кислотой и/или циннабариновой кислотой, а также всеми, по существу, гомологичными аналогами и вариантами.

[344] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина модулирует, например, регулирует, ингибирует или активирует, катаболизм триптофана и/или синтез N-формил-L-кинуренина, кинуренина и/или его производных, например, 3-гидроксикинуренина, кинуреновой кислоты и 3-гидроксиантраниловой кислоты, вносящих вклад в формирование иммуносупрессорных условий в TME. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вызывает, опосредует или приводит к повышению уровня триптофана (TRP) и/или снижению уровня кинуренина (KYN). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO2 и/или триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO).

[345] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина модулирует, например, регулирует, ингибирует или активирует, вышележащие и/или нижележащие факторы или эффекторы, например, ферменты, в катаболизме триптофана, например, компоненты передачи сигнала, транскрипции и/или транспорта триптофана и/или катаболизме триптофана или катаболизме компонентов, посредством модуляции пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина модулирует факторы или эффекторы, вовлеченные в катаболизм триптофана, например, general control nonderepressible 2 (GCN2), воспалительные сигналы, такие как интерферон γ (ИФНγ), фактор некроза опухоли альфа (ФНО), передатчик сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3), мишень рапамицина у млекопитающих (mTOR), арил-углеводородный рецептор (AHR), ядерный транслокатор AHR (ARNT), диоксин-чувствительный элемент (DRE), транспортеры аминокислот, такие как транспортеры TRP (триптофана) (например, CD98 и/или ассоциированные цепи, такие как один или более из комплекса транспортера CD98/LAT-1, например, тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2) и/или транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4), Asc-1, Asc-2, ATB0, B0AT1, TAT1), белок с цинковыми пальцами и доменом PR 1 (PRDM1, также известный как BLIMP-1), эукариотический фактор инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующий фактор транскрипции 4 (ATF4), белок, гомологичный CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 и/или ИФНγ-R2.

[346] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является низкомолекулярным соединением, пептидом, полипептидом, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты (например, миРНК), липидом, полисахаридом или любой их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором или активатором конкретного фактора и/или фермента пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является агонистом или антагонистом конкретного фактора и/или фермента пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления ингибитор кинуренина является аналогом или производным одного или более метаболитов пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором, являющимся низкомолекулярным соединением. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является белком или полипептидом.

[347] Средство, например, модулятор метаболического пути, например, модулятор метаболического пути триптофана, например, модулятор альтернативного пути триптофана, например, модулятор пути кинуренина, вводят любым из ряда подходящих способов, например, посредством перорального введения, инъекции, болюсной инфузии, парентерального, внутрилегочного введения, интраназального введения и/или введения в очаг повреждения. В некоторых аспектах средство вводят местно и/или системно. В некоторых аспектах средство добавляют или используют для обработки одного или более других терапевтических средств или продуктов или их предшественников. В одном из примеров его добавляют во время получения клеток для введения в адоптивном клеточном терапевтическом средстве, таком как клетки, экспрессирующие один или более сконструированных иммунорецепторов, таких как CAR, например, CAR-экспрессирующие T-клетки.

[348] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном, например, добавочным триптофаном.

a. Ингибиторы IDO1

[349] В некоторых вариантах осуществления ингибитор в комбинированном лечении является ингибитором IDO1. IDO1 принадлежит к семейству трех гем-зависимых диоксигеназ, как правило, играющих роль в катализе первой скорость-лимитирующей стадии метаболизма L-триптофана в пути кинуренина, включающему IDO1, IDO2 и TDO. Три фермента преобразуют L-триптофан в N-формил-L-кинуренин, который затем метаболизируется с помощью серии стадий с образованием никотинамидадениндинуклеотида (NAD).

[350] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является любым из ингибиторов, описанных и/или приведенных в международных публикациях PCT №№ WO 2011/056652; WO 2012/142237; WO 2014/159248; WO 2008/058178; WO2010/005958; WO 2014/150646; WO 2014/150677; WO 2015/002918; WO 2015/006520; WO 2016/024233, WO 2016/026772; WO 2015/082499; WO 2016/012615; WO 2011/045341; WO 2015/119944; WO 2006/005185; WO 2016/051181; WO 2014/186035; WO 2008/052352; WO 2009/073620; публикациях патентов США №№ US2005/186289; US 2007/0105907; US 2016/0060266; US 2016/0046596; патенте США № US7098209; патентных публикациях Китая №№ CN105567690; CN 103070868; CN 102579452; Zádori et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents (2016), DOI:10.1080/13543776.2016.1189531; Rohrig et al., J. Med. Chem. 2012, 55:5270-5290; Rohrig et al., J. Med. Chem. 2015, 58:9421-9437; Meininger et al., Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteomics 2011? 1814:1947-1954; Tojo et al., ACS Med. Chem. Lett. 2014, 5:1119-1123; Vacchelli et al., (2014) OncoImmunology 3:10, e957994; Moon et al., Journal for Immunotherapy of Cancer (2015) 3:51; Platten et al., Front Immunol. 2015 Jan 12;5:673; Weinmann, H., ChemMedChem 2016, 11:450-466; Liu et al., Blood. 2010 Apr 29;115(17):3520-30; Ninomiya et al., Blood. 2015 Jun 18;125(25):3905-16; Sheridan, C. Nature Biotechnology 33, 321-322 (2015); Carvalho et al., Org. Biomol. Chem. 2014, 12:2663-2674; Eguchi et al., Arch. Biochem. Biophys. 1984, 232:602-609; Peterson et al., Med. Chem. Res. 1993, 3:473-482; Sono et al., Biochemistry 1989, 28:5392-5399; Opitz et al., PLoS One. 2011; 6(5): e19823; и Saito et al., Biochem. J. 1993, 291:11-14. Примеры ингибиторов IDO1 включают: эпакадостат (INCB024360), индоксимод (1-метил-D-триптофан), пептидную вакцину IDO и NLG919.

[351] В некоторых вариантах осуществления ингибиторы IDO1 включают ингибиторы, которые могут повышать противоопухолевые активности различных химиотерапевтических средств (например, соединений платины, производных таксана, циклофосфамида) без повышенной токсичности.

[352] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является низкомолекулярным соединением, пептидом, белком, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты (например, миРНК).

[353] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является низкомолекулярным соединением. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является производным гидроксиамидина, аналогом или производным триптофана, производным или аналогом индола, соединением с хиноновым или иминохиноновым каркасом, производным имидазола, таким как фенилимидазол (PIM) или производное фенилимидазола, производным 1,2,3-триазола, соединением на основе тиазолотриазолового каркаса, производным имидазотиазола, производным 2,3-диамино-фуро[2,3-c]пиридина и 2,3-диаминобензо[b]тиофена, природным ингибитором или производным или соединением или производным с одним ароматическим кольцом.

[354] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является производным гидроксиамидина.

[355] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является соединением формулы I:

или его фармацевтически приемлемой солью; где:

X является

R¹ является Cl, Br, CF3, или CN; R² является H или F; и R³ является Cl или Br.

[356] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является соединением формулы Ia:

или его фармацевтически приемлемой солью.

[357] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO является соединением формулы Ib:

или его фармацевтически приемлемой солью.

[358] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (эпакадостатом, также известным как INCB024360) или его фармацевтически приемлемой солью или производными. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом или его фармацевтически приемлемой солью. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом или его фармацевтически приемлемой солью. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом или его фармацевтически приемлемой солью. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом или его фармацевтически приемлемой солью. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом или его фармацевтически приемлемой солью. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом или его фармацевтически приемлемой солью. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является любым из ингибиторов, описанных в международных публикациях PCT № WO 2008/058178, WO 2010/005958 и WO 2015/119944.

[359] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (эпакадостатом, также известным как INCB024360) или его фармацевтически приемлемой солью или производными.

[360] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO является следующим соединением:

или его фармацевтически приемлемой солью.

[361] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является аналогом или производным триптофана или производным или аналогом индола. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 1-метилтриптофаном (1-MT), например, 1-метил-D-триптофаном или 1-метил-L-триптофаном, 2,5-дигидро-L-фенилаланином, или метилтиогидантоин-D,L-триптофаном (MTH-trp или некростатином 1). В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является брассинином и его производным, например, S-аллил-брассинином, S-бензил-брассинином, 5-бром-брассинином, дитиокарбаматом, полученным из брассинина, соединением 1-метилтриптофантирапазамина, производным триптолина или производным триптамина. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 1-метилтриптофаном, конкурентным ингибитором IDO1 (и IDO2), существующим в виде смеси хиральных изоформ (т.е. 1-метил-D-триптофана и 1-метил-L-триптофана). В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 1-метил-D-триптофаном (1-D-MT; также известным как индоксимод или NLG8189). В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является таким, как любой из ингибиторов, описанных в US 2005/186289 и US 7098209. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 1-метил-L-триптофаном (1-L-MT).

[362] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является соединением с хиноновым или иминохиноновым каркасом. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является катехолом, гидрохиноном, p-хиноном, L-дигидроксифенилаланином, L-эпинефрином, менадионом, бензофуранохиноном, β-лапахоном или соединением на основе нафтохинона, эксигуамином A, аннулином B, пиранонафтохиноном, индолхиноном, пиранонафтохиноном, пирролоиминохиноном, β-лапахоном, циннабариновой кислотой, бензофуранохиноном, аналогом зестосапрола O, производным 4-иминонафтален-1-она, NSC111041, митомицином C или их производными. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является таким, как ингибиторы, описанные в WO 2008/052352; WO 2006/005185; и Carvalhoet al., Org. Biomol.Chem. 2014, 12:2663-2674, или их производные.

[363] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является производным имидазола, таким как фенилимидазол (PIM) или производное фенилимидазола. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 2-гидроксифенилимидазолом, или 4-фенилимидазолом, или их производные, такие, как описано в международной публикации PCT № WO 2011/056652. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является трициклическим соединением на основе PIM, таким, как описано в международных публикациях PCT № WO 2012/142237 и WO 2014/159248. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанолом (NLG919; также известным как GDC-0919 или GTPL9019), эконазолом или их производными.

[364] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO является производным 1,2,3-триазол, таким как производное 4-фенил-1,2,3-триазола, такое, как описано в Rohrig et al., J. Med. Chem. 2012, 55:5270-5290.

[365] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является соединением на основе тиазолотриазолового каркаса, таким, как описано в Meininger et al., Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteomics 2011, 1814:1947-1954. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является N-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-2-{[5-(4-метилфенил)[1,3]тиазоло[2,3-c][1,2,4]триазол-3-ил]сульфанил}ацетамидом (AMG-1) или его производными.

[366] В некоторых вариантах осуществления IDO ингибитор является производным имидазотиазол, таким, как описано в Tojo et al., ACS Med. Chem. Lett. 2014, 5:1119-1123. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO является миконазолом. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является соединением на основе каркаса 2-аминофенилмочевины, таким, как описано в WO 2014/150646, WO 2014/150677, WO 2015/002918 и WO 2015/006520.

[367] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является природным ингибитором или его производным. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является норгарманом/β-карболином, бензмальвином, halicloic acid, тиелавином, триптантрином или галаналом, таким, как описано в Eguchi et al., Arch. Biochem. Biophys. 1984, 232:602-609; Peterson et al., Med. Chem. Res. 1993, 3:473-482; Sono et al., Biochemistry 1989, 28:5392-5399; и Saito et al., Biochem. J. 1993, 291:11-14.

[368] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является соединением с одним ароматическим кольцом или его производным, таким как O-бензилгидроксиламин, фенилгидразин, бензилмеркаптан, производное S-бензилизотиомочевины, производное тиосемикарбазида, производное дитиокарбамата или AC12308 или их производные и любым из описанных в WO 2009/073620.

[369] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является 2,3-диамино-фуро[2,3-c]пиридином и производным 2,3-диаминобензо[b]тиофена, таким как (N³-(3-хлор-4-фторфенил)фуро[2,3-c]пиридин-2,3-диамин или N³-(3-хлор-4-фторфенил)бензо[b]тиофен-2,3-диамин и любой из описанных в WO 2014/186035.

[370] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является средством, которое может снижать экспрессию, устранять, или нарушать экспрессию гена IDO1. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является отрицательным регулятором факторов транскрипции, контролирующих экспрессию IDO1. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является отрицательным регулятором передачи сигнала Bin1 или KIT. В некоторых вариантах осуществления ингибитор является ингибиторной нуклеиновой кислотой, которая может снижать или контролировать экспрессию эндогенного гена IDO1. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота представляет собой, или содержит, или кодирует малую интерферирующую РНК (миРНК), микроРНК-адаптированную shRNA, короткую шпилечную РНК (shRNA), шпилечную миРНК, микроРНК-предшественника (пре-мкРНК или при-мкРНК), микроРНК (мкРНК), антисмысловую РНК или рибозимы, см., например, ингибиторные нуклеиновые кислоты, описанные в CN105567690, или их варианты, или ингибиторные нуклеиновые кислоты, описанные в Opitz et al., PLoS One. 2011; 6(5): e19823.

[371] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 выбран из 1-метил-D-триптофана (также известного как индоксимод и NLG8189), 1-метил-L-триптофана, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (эпакадостата; INCB024360), метилтиогидантоин-D,L-триптофана, 4-фенилимидазола, NSC401366, NLG919, F001287, PF-06840003, INCB023843, 2-гидроксифенилимидазола, 4-фенил-1,2,3-триазола, гидроксиамидина, соединений с тиазолотриазоловым каркасом, имидазотиазола, соединений с каркасом 2-аминофенилмочевины, вакцин, направленных на IDO1, и направленных на IDO-1 ингибиторных нуклеиновых кислот.

[372] В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является MTH-Trp, β-карболином, соединением на основе нафтохинона, S-аллил-брассинином, S-бензил-брассинином, 5-бром-брассинином, соединениями на основе фенилимидазола, 4-фенилимидазолом, эксигуамином A или NSC401366 или любым из описанных в Moon et al., Journal for Immunotherapy of Cancer (2015) 3:51.

[373] В некоторых вариантах осуществления ингибиторы IDO1 включают ингибиторы, находящиеся на стадии клинической разработки в качестве монотерапии или комбинированного лечения вместе с другими противоопухолевыми средствами, например, наб-паклитаксел, гемцитабин, доцетаксел, ипилимумаб, моноклональное антитело против PDCD1, p53-вакцина на основе дендритных клеток и мультипептидная вакцина. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 выбран из ингибиторов IDO1, находящихся на стадии клинической разработки, таких как эпакадостат (INCB024360; разработчик: Incyte), индоксимод (1-D-MT; разработчик: NewLink Genetics), пептидная вакцина IDO (разработчик: Copenhagen University), F001287, PF-06840003 (разработчик Pfizer/iTeos) и NLG919 (разработчик: NewLink Genetics). Примеры ингибиторов IDO1, разрабатываемых для клинических исследований, типы терапевтических средств и показания для них включают описываемые в Moon et al., Journal for Immunotherapy of Cancer (2015) 3:51.

b. Другие модуляторы метаболизма триптофана и/или пути кинуренина

[374] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO2 или TDO, которые также могут катализировать первую скорость-лимитирующую стадию пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 является ингибитором широкого действия, который также может ингибировать IDO2 и/или TDO. В некоторых вариантах осуществления ингибитор является специфическим для IDO1, IDO2 или TDO. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO/TDO двойного действия.

[375] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором TDO, таким как фторированные производные индола 680C91 или LM10, и/или любые из описанных в Dolusic et al., J Med Chem. 2011 Aug 11;54(15):5320-34. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является специфическим ингибитором IDO2, таким как тенатопрозол, и/или любым из описанных в Bakmiwewa et al., Bioorg Med Chem Lett. 2012;22(24):7641-7646. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO1 может ингибировать и IDO1, и IDO2, например, индоксимод (1-D-MT). В некоторых вариантах осуществления ингибиторы IDO1 также могут ингибировать IDO2 и/или TDO.

[376] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина модулирует последующие стадии пути кинуренина, такие как реакции, катализируемые кинуренинаминотрансферазой, кинуренин-3-монооксигеназой, кинурениназой и/или 3-гидроксиантранилат-3,4-диоксигеназой. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором кинуренинаминотрансферазы, кинуренин-3-монооксигеназы, кинурениназы и/или 3-гидроксиантранилат-3,4-диоксигеназы. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина включает любой из описанных в EP 2331095; EP 2420494; EP 2736337; EP 2750677; EP 2751086; EP 2833879; US 2012/0046324; US 2012/0329812; US 2013/0029988; US 2013/0331370; US 2014/0329795; US 2014/0329816; US 2015/0057238; US 8710237; WO 2008/022286; WO 2010/017132; WO 2010/017179; WO 2011/091153; WO 2013/016488; WO 2013/033068; WO 2013/033085; WO 2013/033085; WO 2013/151707; WO 2015/047978 и Zádori et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents (2016), DOI:10.1080/13543776.2016.1189531.

[377] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина модулирует или регулирует уровень, доступность, концентрацию, эффект, активность, метаболизм, синтез и/или деградацию 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA), L-кинуренина, хинолиновой кислоты и/или циннабариновой кислоты.

[378] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает синтез или накопление кинуренина, 3-гидроксикинуренина или 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором или антагонистом кинурениназы. Кинурениназа катализует преобразование 3-гидроксикинуренина в 3-гидроксиантраниловую кислоту (3-HAA) и преобразование кинуренина в антраниловую кислоту. Ингибирование кинурениназы снижает уровни 3-HAA. Примеры ингибиторов кинурениназа включают O-метоксибензоилаланин, 2-амино-4-[3′-гидроксифенил]-4-гидроксибутановую кислоту и описываемые в US 2015/0175712.

[379] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ферментом, например, ферментом, вовлеченным в путь кинуренина, или его производными или модифицированными формами. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ферментом кинурениназой, снижающим уровни кинуренина посредством катализа катаболизма L-кинуренина и 3-гидрокси-L-кинуренина. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является модифицированной кинурениназой, такой, как описанная в US 2015/0064154.

[380] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является модулятором других компонентов пути кинуренина или вышележащих или нижележащих эффекторов, например, компонентов, вовлеченных в метаболизм триптофана и/или передачу сигнала, например, general control nonderepressible 2 (GCN2), воспалительных сигналов, таких как интерферон γ (ИФНγ), передатчика сигнала и активатора транскрипции 3 (STAT3), арил-углеводородного рецептора (AHR), ядерного транслокатора AHR (ARNT), диоксин-чувствительного элемента (DRE), транспортеров аминокислот, таких как транспортеры TRP (триптофана) (например, CD98 и/или ассоциированные цепи, такие как один или более из комплекса транспортера CD98/LAT-1, например, тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2) и/или транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4), Asc-1, Asc-2, ATB0, B0AT1, TAT1), белка с цинковыми пальцами и доменом PR 1 (PRDM1, также известного как BLIMP-1), эукариотического фактора инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующего фактора транскрипции 4 (ATF4), белка, гомологичного CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 и/или ИФНγ-R2(см., например, McGaha et al. (2012) Immunol. Rev. 249(1):135-157; Munn et al. (2005) Immunity 22;633-642; Broer et al. (2011) Biochem. J. 436:193-211).

2. Композиции и составы

[381] В некоторых вариантах осуществления способов, композиций, комбинаций, наборов и применения, представленных в настоящем описании, комбинированное лекарственное средство можно вводить в одной или более композициях, например, фармацевтической композиции, содержащей модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, и/или иммунотерапевтическое средство, например, T-клеточное терапевтическое средство.

[382] В некоторых вариантах осуществления композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, может включать носители, такие как дилюент, вспомогательное средство, эксципиент или наполнитель, с которым вводят модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, и/или клетки. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" E. W. Martin. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, как правило, в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя для получения формы для правильного введения пациенту. Такие фармацевтические носители могут являться стерильными жидкостями, такими как вода и масла, включая масла из нефтепродуктов, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло и сезамовое масло. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъецируемых растворов. Фармацевтические композиции могут содержать любой один или более из дилюентов, вспомогательных средств, антиадгезивов, связывающих средств, покрытий, наполнителей, ароматизаторов, красителей, смазочных средств, глидантов, консервантов, детергентов, сорбентов, эмульгаторов, фармацевтических эксципиентов, pH-буферных средств, или подсластителей и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может быть жидкой, твердой, лиофилизированным порошком, гелем и/или их комбинацией. В некоторых аспектах выбор носителя частично определяется конкретным ингибитором и/или способом введения.

[383] Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают, в качестве неограничивающих примеров: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и m-крезол); низкомолекулярные полипептиды (менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексные соединения с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные средства, такие как полиэтиленгликоль (PEG), стабилизаторы и/или консерванты. Композиции, содержащие модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, также можно лиофилизировать.

[384] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции можно составлять для введения любым путем, известным специалистам в этой области, включая внутримышечное, внутривенное, внутрикожное введение, введение в очаг повреждения, интраперитонеальную инъекцию, подкожное, внутриопухолевое, эпидуральное, назальное, пероральное, вагинальное, ректальное, местное, ушное, ингаляционное, буккальное (например, сублингвальное) и трансдермальное введение или любой путь. В некоторых вариантах осуществления также предусмотрены другие способы введения. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством болюсной инфузии, инъекции, например, внутривенной или подкожной инъекции, внутриглазной инъекции, окологлазной инъекции, субретинальной инъекции, инъекции в стекловидное тело, транссептальной инъекции, инъекции под склеру, интрахориоидальной инъекции, внутрикамерной инъекции, подконъюктивальной инъекции, субтеноновой инъекции, ретробульбарной инъекции, околобульбарной инъекции или задней околосклеральной доставки. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством парентерального, внутрилегочного, интраназального введения и, при желании в случае местного введения, введения в очаг повреждения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное или подкожное введение. В некоторых вариантах осуществления указанную дозу вводят посредством однократного болюсного введения. В некоторых вариантах осуществления ее вводят посредством многократных болюсных введений, например, в течение периода времени не более 3 дней, или посредством непрерывного инфузионного введения.

[385] В некоторых вариантах осуществления введение может быть местным или системным в зависимости от места, подвергаемого лечению. В некоторых вариантах осуществления местного введения в область, нуждающуюся в лечении, достигают посредством, в качестве неограничивающих примеров, местной инфузии во время хирургического вмешательства, местного введения, например, в комбинации с повязкой на рану после хирургического вмешательства, посредством инъекции, с помощью катетера, суппозитория или имплантата. В некоторых вариантах осуществления композиции также можно вводить с другими биологически активными средствами последовательно, попеременной или в одной композиции. В некоторых вариантах осуществления введение также может включать системы с контролируемым высвобождением, включая составы с контролируемым высвобождением и устройства с контролируемым высвобождением, например, с использованием насоса. В некоторых вариантах осуществления введение является пероральным.

[386] В некоторых вариантах осуществления фармацевтически и терапевтически активные соединения и их производные, как правило, составляют и вводят в стандартных лекарственных формах или многократных лекарственных формах. Каждая однократная доза содержит заранее определенное количество терапевтически активного соединения, достаточное для достижения желаемого терапевтического эффекта, вместе с необходимым фармацевтическим носителем, наполнителем или дилюентом. В некоторых вариантах осуществления стандартные лекарственные формы включают, в качестве неограничивающих примеров, таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, стерильные парентеральные растворы или суспензии и пероральные растворы или суспензии и масляно-водные эмульсии, содержащие подходящие количества соединений или их фармацевтически приемлемых производных. Стандартные лекарственные формы могут включать ампулы и шприцы или отдельно упакованные таблетки или капсулы. Стандартные лекарственные формы можно вводить фракционно или многократно. В некоторых вариантах осуществления форма многократных доз представляет собой множество идентичных стандартных лекарственных форм, упакованных в один контейнер для введения в отдельных стандартных лекарственных формах. Примеры форм многократных доз включают сосуды, бутыли с таблетками или капсулами или бутыли объемом в пинтах или галлонах.

3. Дозы и режим введения модуляторов метаболизма триптофана и/или пути кинуренина

[387] В некоторых вариантах осуществления способ включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, и иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят до, после, во время, в течение курса, одновременно, почти одновременно, последовательно и/или попеременно с введением иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, перед введением T-клеточного терапевтического средства. В других вариантах осуществления способ включает введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, после введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, больше не вводят после начала T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, до и после начала T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, одновременно с введением T-клеточного терапевтического средства.

[388] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят множество раз во множестве доз. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят однократно. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят шесть раз в сутки, пять раз в сутки, четыре раза в сутки, три раза в сутки, два раза в сутки, раз в сутки, через день, каждые три дня, дважды в неделю, один раз в неделю или линь однократно до или после начала введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство). В некоторых аспектах частота введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, составляет дважды в неделю, один раз в неделю, каждые 14 дней, каждый 21 день или раз в месяц. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят во множестве доз с равными интервалами до, во время, в течение курса и/или после периода введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят в одной или более дозах с равными интервалами перед введением иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят в одной или более дозах с равными интервалами после введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство). В некоторых вариантах осуществления одну или более доз модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, можно вводить одновременно с введением дозы иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство).

[389] В некоторых вариантах осуществления дозу, частоту, длительность, временной режим и/или порядок введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, определяют с учетом конкретных пороговых значений или критериев результатов, полученных на стадии скрининга и/или при оценке исходов лечения, представленных в настоящем описании, например, описанных в разделе III в настоящем описании.

[390] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят перед введением иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство). В некоторых аспектах временной режим введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является таким, что есть достаточно времени для повышения уровней триптофана (TRP) или снижения уровней кинуренина (KYN) в биологическом образце индивидуума, таком как микроокружение опухоли (TME), подвергаемой лечению. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина осуществляют, когда модулятор (например, ингибитор IDO1) приводит или, вероятно, приводит к изменению уровней метаболитов в пути кинуренина, такому как повышение уровней TRP или снижение уровней KYN или производного KYN (например, повышение или снижение по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере в 1,2 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 10 раз или более) по сравнению с уровнем непосредственно перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. Примеры способов оценки или определения параметров, ассоциированных с изменением уровня таких метаболитов в пути кинуренина, описаны в разделе III.

[391] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят за от или приблизительно от 0 до 90 дней, например, от 0 до 30 дней, от 0 до 15 дней, от 0 до 6 дней, от 0 до 96 часов, от 0 до 24 часов, от 0 до 12 часов, от 0 до 6 часов, или 0 до 2 часов, от 2 часов до 30 дней, от 2 часов до 15 дней, от 2 часов до 6 дней, от 2 часов до 96 часов, от 2 часов до 24 часов, от 2 часов до 12 часов, от 2 часов до 6 часов, от 6 часов до 90 дней, от 6 часов до 30 дней, от 6 часов до 15 дней, от 6 часов до 6 дней, от 6 часов до 96 часов, от 6 часов до 24 часов, от 6 часов до 12 часов, от 12 часов до 90 дней, от 12 часов до 30 дней, от 12 часов до 15 дней, от 12 часов до 6 дней, от 12 часов до 96 часов, от 12 часов до 24 часов, от 24 часов до 90 дней, от 24 часов до 30 дней, от 24 часов до 15 дней, от 24 часов до 6 дней, от 24 часов до 96 часов, от 96 часов до 90 дней, от 96 часов до 30 дней, от 96 часов до 15 дней, от 96 часов до 6 дней, от 6 дней до 90 дней, от 6 дней до 30 дней, от 6 дней до 15 дней, от 15 дней до 90 дней, от 15 дней до 30 дней или от 30 дней до 90 дней до начала иммунотерапии (например, T-клеточной терапии, такой как CAR-T-клеточная терапия). В некоторых аспектах модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят за не более чем приблизительно 96 часов, 72 часа, 48 часов, 24 часа, 12 часов, 6 часов, 2 часа или 1 час до начала иммунотерапии (например, T-клеточной терапии, такой как CAR-T-клеточная терапия).

[392] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят за по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 1 час, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 2 часа, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 1 день, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 2 дня, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 3 дня, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 4 дня, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 5 дней, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 6 дней, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 12 дней, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 14 дней, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 15 дней, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 21 день, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 24 дня, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 28 дней, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 30 дней, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 35 дней или по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 42 дня, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 60 дней, или, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 90 дней до начала введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство). В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят за до 2 дней, до 3 дней, до 4 дней, до 5 дней, до 6 дней, до 7 дней, до 8 дней, до 12 дней, до 14 дней, до 15 дней, до 21 дня, до 24 дней, до 28 дней, до 30 дней, до 35 дней, до 42 дней, до 60 дней или до 90 дней до начала введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточного терапевтическое средство). В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, начинают более чем за 1 день до начала введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточного терапевтическое средство).

[393] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят после введения T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство (например, после начала введения), но до времени, когда некоторые из T-клеток достигают пиковой или максимальной экспансии, состояния длительного триптофанового голодания, истощения, анергии, гибели клеток, сокращения, супрессии противоопухолевых иммунных ответов или толерантности к опухолевым антигенам и/или неспособны восстановиться после голодания, например, триптофанового голодания, и/или реверсировать эффект голодания. В некоторых случаях модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят до того, как T-клетки начнут проявлять задержку или прекращение роста и/или функциональной активности по причине истощения триптофана. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят через менее чем или менее чем приблизительно 1 час, менее чем или менее чем приблизительно 2 часа, менее чем или менее чем приблизительно 6 часов, менее чем или менее чем приблизительно 12 часов, менее чем или менее чем приблизительно 1 день, менее чем или менее чем приблизительно 2 дня, менее чем или менее чем приблизительно 3 дня, менее чем или менее чем приблизительно 4 дня, менее чем или менее чем приблизительно 5 дней, менее чем или менее чем приблизительно 6 дней, менее чем или менее чем приблизительно 7 дней после введения (например, начала введения) T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней после начала T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней или 7 дней после начала T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней или 14 дней после начала T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов или 48 часов после начала T-клеточной терапии.

[394] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят после введения T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство (например, после начала введения), во время или после того, как индивидуум, которому вводят T-клеточное терапевтическое средство, проявит повышенную экспрессию IDO1 и/или экспрессию транспортеров аминокислот, таких как транспортеры триптофана, например, LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4, в образце опухоли индивидуума по сравнению с образцом, полученным перед введением T-клеточного терапевтического средства, образцом, полученным в референсный момент времени, и/или образцом другого индивидуума. В некоторых вариантах осуществления индивидуума идентифицируют или выбирают для введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, если в образце опухоли индивидуума наблюдают повышенную экспрессию IDO1 и/или экспрессию транспортеров аминокислот, таких как транспортеры триптофана, например, LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4, по сравнению с образцом, полученным перед введением T-клеточного терапевтического средства, образцом, полученным в референсный момент времени, и/или образцом другого индивидуума.

[395] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда: наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства; до того, как количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; до того, как T-клетки начнут проявлять признаки длительного триптофанового голодания, истощения, снижения эффекторной функции, экспрессии ингибиторных рецепторов и/или утраты пролиферативной способности; до того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства станет детектируемым в крови индивидуума; и/или уровень интерферона-гамма (ИФНγ) повысится в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

[396] В некоторых из любых таких вариантов осуществления, в которых модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят до иммунотерапии (например, T-клеточной терапии, такой как CAR-T-клеточная терапия), введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, продолжают с равными интервалами до начала иммунотерапии и/или после начала иммунотерапии.

[397] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят после введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточного терапевтическое средство). В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина осуществляют, когда предшествующее введение иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточного терапевтическое средство) вызывает или индуцирует или, вероятно, вызывает или индуцирует, прямо или косвенно, изменение уровней метаболитов в пути кинуренина, такое как снижение уровней TRP или повышение уровней KYN или производного KYN (например, повышение или снижение по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере в 1,2 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 10 раз или более) по сравнению с уровнем непосредственно перед началом иммунотерапии (например, T-клеточной терапии, такой как CAR-T-клеточная терапия) или в предшествующей временной точке после начала иммунотерапии. Примеры способов оценки или определения параметров, ассоциированных с изменением уровня таких метаболитов в пути кинуренина, описаны в разделе III.

[398] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 96 часов, 4 дней, 5 дней, 6 дней или 7 дней, 14 дней, 15 дней, 21 дня, 24 дней, 28 дней, 30 дней, 36 дней, 42 дней, 60 дней, 72 дней или 90 дней после начала введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства). В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению включают продолжение введения, например, с равными интервалами, модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина после начала введения иммунотерапевтического средства.

[399] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят через до или до приблизительно 1 дня, до или до приблизительно 2 дней, до или до приблизительно 3 дней, до или до приблизительно 4 дней, до или до приблизительно 5 дней, до или до приблизительно 6 дней, до или до приблизительно 7 дней, до или до приблизительно 12 дней, до или до приблизительно 14 дней, до или до приблизительно 21 дня, до или до приблизительно 24 дней, до или до приблизительно 28 дней, до или до приблизительно 30 дней, до или до приблизительно 35 дней, до или до приблизительно 42 дней, до или до приблизительно 60 дней или до или до приблизительно 90 дней, до или до приблизительно 120 дней, до или до приблизительно 180 дней, до или до приблизительно 240 дней или до или до приблизительно 360 дней или более после введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточного терапевтическое средство).

[400] В некоторых из любых таких указанных выше вариантов осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят до и после начала введения иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточного терапевтическое средство).

[401] В некоторых вариантах осуществления способов, представленных в настоящем описании, модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, и иммунотерапевтическое средство (например, T-клеточное терапевтическое средство, такое как CAR-T-клеточное терапевтическое средство) вводят одновременно или почти одновременно.

[402] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина (например, ингибитор IDO1) вводят дважды в сутки.

[403] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, независимо вводят в дозе от или от приблизительно 0,02 мг на кг массы тела индивидуума (мг/кг) до приблизительно 200 мг/кг массы тела, например, от 0,02 мг/кг до 100 мг/кг, от 0,02 мг/кг до 100 мг/кг, от 0,02 мг/кг до 50 мг/кг, от 0,02 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,02 мг/кг до 1,0 мг/кг, от 0,02 мг/кг до 0,2 мг/кг, от 0,2 мг/кг до 100 мг/кг, от 0,2 мг/кг до 50 мг/кг, от 0,2 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,2 мг/кг до 1,0 мг/кг, от 1,0 мг/кг до 200 мг/кг, от 1,0 мг/кг до 100 мг/кг, от 1,0 мг/кг до 50 мг/кг, от 1,0 мг/кг до 10 мг/кг, от 10 мг/кг до 200 мг/кг, от 10 мг/кг до 100 мг/кг, от 10 мг/кг до 50 мг/кг, от 50 мг/кг до 200 мг/кг, от 50 мг/кг до 100 мг/кг или от 100 мг/кг до 200 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят в дозе или приблизительно в дозе 0,02 мг/кг, 0,03 мг/кг, 0,04 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,06 мг/кг, 0,07 мг/кг, 0,08 мг/кг, 0,09 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,30 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,40 мг/кг, 0,45 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,55 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,9 мг/кг, 1,0 мг/кг, 1,1 мг/кг, 1,2 мг/кг, 1,3 мг/кг, 1,4 мг/кг, 1,5 мг/кг, 1,6 мг/кг, 1,7 мг/кг, 1,8 мг/кг, 1,9 мг/кг, 2 мг/кг, 2,5 мг/кг, 3 мг/кг, 3,5 мг/кг, 4 мг/кг, 4,5 мг/кг, 5 мг/кг, 5,5 мг/кг, 6 мг/кг, 6,5 мг/кг, 7 мг/кг, 7,5 мг/кг, 8 мг/кг, 8,5 мг/кг, 9 мг/кг, 9,5 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг, 18 мг/кг, 19 мг/кг, 20 мг/кг, 21 мг/кг, 22 мг/кг, 23 мг/кг, 24 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/кг, 75 мг/кг, 100 мг/кг, 250 мг/кг или более.

[404] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят, или каждое введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина независимо осуществляют, в дозе от или от приблизительно 2,5 мг до приблизительно 5000 мг, например, от 2,5 мг до 2000 мг, от 2,5 мг до 1000 мг, от 2,5 мг до 500 мг, от 2,5 мг до 200 мг, от 2,5 мг до 100 мг, от 2,5 мг до 50 мг, от 2,5 мг до 25 мг, от 2,5 мг до 10 мг, от 25 мг до 5000 мг, от 25 мг до 2000 мг, от 25 мг до 1000 мг, от 25 мг до 500 мг, от 25 мг до 200 мг, от 25 мг до 100 мг, от 25 мг до 50 мг, от 50 мг до 5000 мг, от 50 мг до 2000 мг, от 50 мг до 1000 мг, от 50 мг до 500 мг, от 50 мг до 200 мг, от 50 мг до 100 мг, от 100 мг до 5000 мг, от 100 мг до 2000 мг, от 100 мг до 1000 мг, от 100 мг до 500 мг, от 100 мг до 200 мг, от 200 мг до 5000 мг, от 200 мг до 2000 мг, от 200 мг до 1000 мг, от 200 мг до 500 мг, от 500 мг до 5000 мг, от 500 мг до 2000 мг, от 500 мг до 1000 мг или от 1000 мг до 2000 мг, включительно.

[405] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят, или каждое введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина независимо осуществляют перорально, в дозе от или от приблизительно 2,5 мг до приблизительно 5000 мг, например, от 2,5 мг до 2000 мг, от 2,5 мг до 1000 мг, от 2,5 мг до 500 мг, от 2,5 мг до 200 мг, от 2,5 мг до 100 мг, от 2,5 мг до 50 мг, от 2,5 мг до 25 мг, от 2,5 мг до 10 мг, от 25 мг до 5000 мг, от 25 мг до 2000 мг, от 25 мг до 1000 мг, от 25 мг до 500 мг, от 25 мг до 200 мг, от 25 мг до 100 мг, от 25 мг до 50 мг, от 50 мг до 5000 мг, от 50 мг до 2000 мг, от 50 мг до 1000 мг, от 50 мг до 500 мг, от 50 мг до 200 мг, от 50 мг до 100 мг, от 100 мг до 5000 мг, от 100 мг до 2000 мг, от 100 мг до 1000 мг, от 100 мг до 500 мг, от 100 мг до 200 мг, от 200 мг до 5000 мг, от 200 мг до 2000 мг, от 200 мг до 1000 мг, от 200 мг до 500 мг, от 500 мг до 5000 мг, от 500 мг до 2000 мг, от 500 мг до 1000 мг или от 1000 мг до 2000 мг, включительно.

[406] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят, или каждое введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина независимо осуществляют, перорально, с частотой шесть раз в сутки, пять раз в сутки, четыре раза в сутки, три раза в сутки, два раза в сутки, раз в сутки, через день, каждые три дня, дважды в неделю или раз в неделю. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят, или каждое введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина независимо осуществляют, шесть раз в сутки, пять раз в сутки, четыре раза в сутки, три раза в сутки, два раза в сутки или раз в сутки.

[407] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят, или каждое введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина независимо осуществляют, в общей суточной дозе по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 5 мг/сутки, 10 мг/сутки, 25 мг/сутки, 50 мг/сутки, 100 мг/сутки, 200 мг/сутки, 400 мг/сутки, 500 мг/сутки, 600 мг/сутки, 800 мг/сутки, 1000 мг/сутки, 1200 мг/сутки, 1600 мг/сутки, 2000 мг/сутки, 5000 мг/сутки или 10000 мг/сутки.

[408] В некоторых аспектах модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят, или каждое введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина независимо осуществляют, в дозе по меньшей мере, или по меньшей мере приблизительно, или приблизительно 0,02 мг на кг массы тела индивидуума (мг/кг), 0,2 мг/кг, 1 мг/кг, 3 мг/кг, 6 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, 30 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг или 200 мг/кг; или в дозе по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 2,5 мг, 25 мг, 50 мг, 100 мг, 200 мг, 400 мг, 500 мг, 600 мг, 800 мг, 1000 мг, 1200 мг, 1600 мг, 2000 мг или 5000 мг.

[409] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является белком, или полипептидом, или его производным, и модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в дозе приблизительно 1 мкг/кг массы тела, приблизительно 5 мкг/кг массы тела, приблизительно 10 мкг/кг массы тела, приблизительно 50 мкг/кг массы тела, приблизительно 100 мкг/кг массы тела, приблизительно 200 мкг/кг массы тела, приблизительно 350 мкг/кг массы тела, приблизительно 500 мкг/кг массы тела, приблизительно 1 мг/кг массы тела, приблизительно 5 мг/кг массы тела, приблизительно 10 мг/кг массы тела, приблизительно 50 мг/кг массы тела, приблизительно 100 мг/кг массы тела, приблизительно 200 мг/кг массы тела, приблизительно 350 мг/кг массы тела, приблизительно 500 мг/кг массы тела, до приблизительно 1000 мг/кг массы тела или более на введение, включая любой диапазон между дозами.

[410] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят, или каждое введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина независимо осуществляют, посредством внутривенного введения, например, внутривенной инъекции. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является белком, или полипептидом, или его производным, и модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в дозе приблизительно 1 мкг/кг массы тела, приблизительно 5 мкг/кг массы тела, приблизительно 10 мкг/кг массы тела, приблизительно 50 мкг/кг массы тела, приблизительно 100 мкг/кг массы тела, приблизительно 200 мкг/кг массы тела, приблизительно 350 мкг/кг массы тела, приблизительно 500 мкг/кг массы тела, приблизительно 1 мг/кг массы тела, приблизительно 5 мг/кг массы тела, приблизительно 10 мг/кг массы тела, приблизительно 50 мг/кг массы тела, приблизительно 100 мг/кг массы тела, приблизительно 200 мг/кг массы тела, приблизительно 350 мг/кг массы тела, приблизительно 500 мг/кг массы тела, до приблизительно 1000 мг/кг массы тела или более на введение, включая любой диапазон между дозами.

C. Противолимфоцитарное лечение

[411] В некоторых аспектах способы по изобретению могут дополнительно включать введение одного или более противолимфоцитарных терапевтических средств, например, до или одновременно с началом введения иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающего терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления противолимфоцитарная терапия включает введение фосфамида, такого как циклофосфамид. В некоторых вариантах осуществления противолимфоцитарная терапия может включать введение флударабина. В некоторых вариантах осуществления флударабин исключают из противолимфоцитарой терапии. В некоторых вариантах осуществления противолимфоцитарное терапевтическое средство не вводят.

[412] В некоторых вариантах осуществления прекондиционирование индивидуумов с использованием терапевтических средств для иммунодеплеции (например, противолимфоцитарных) может улучшать эффекты адоптивной клеточной терапии (ACT). Прекондиционирование с использованием противолимфоцитарных средств, включая комбинации циклоспорина и флударабина, является эффективным в улучшении исхода переноса инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) при клеточной терапии, включая улучшение ответа и/или персистирования вводимых клеток. См., например, Dudley et al., Science, 298, 850-54 (2002); Rosenberg et al., Clin Cancer Res, 17(13):4550-4557 (2011). Аналогично, что касается CAR⁺ T-клеток, несколько исследований включали противолимфоцитарные средства, чаще всего циклофосфамид, флударабин, бендамустин или их комбинации, иногда с сопутствующим низкодозовым облучением. См. Han et al., Journal of Hematology & Oncology, 6:47 (2013); Kochenderfer et al., Blood, 119: 2709-2720 (2012); Kalos et al., Sci Transl Med, 3(95):95ra73 (2011); записи клинических исследований №№ NCT02315612; NCT01822652.

[413] Такое прекондиционирование можно осуществлять с целью снижения риска одного или более различных исходов, которые могут снижать активность, или исход, или ответ терапевтического средства или на терапевтическое средство. Это включает явление, известное как "цитокиновый слив", при котором T-клетки, B-клетки, NK-клетки конкурируют с TIL за гомеостатические и активирующие цитокины, такие как ИЛ-2, ИЛ-7 и/или ИЛ-15; супрессию TIL регуляторными T-клетками, NK-клетками или другими клетками иммунной системы; влияние отрицательных регуляторов в микроокружении опухоли. Muranski et al., Nat Clin Pract Oncol. December; 3(12): 668-681 (2006).

[414] В некоторых вариантах осуществления способ по изобретению дополнительно включает введение индивидууму противолимфоцитарного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение индивидууму противолимфоцитарного терапевтического средства перед введением дозы клеток для терапии на основе T-клеток. В некоторых вариантах осуществления противолимфоцитарное терапевтическое средство включает химиотерапевтическое средство, такое как флударабин и/или циклофосфамид. В некоторых вариантах осуществления противолимфоцитарное терапевтическое средство не содержит флударабин. В некоторых вариантах осуществления противолимфоцитарное терапевтическое средство содержит только циклофосфамид. В некоторых вариантах осуществления введение клеток и/или противолимфоцитарного терапевтического средства осуществляют посредством амбулаторного введения.

[415] В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают введение индивидууму прекондиционирующего средства, такого как противолимфоцитарное или химиотерапевтическое средство, такое как циклофосфамид, флударабин или их комбинации, перед введением дозы клеток. Например, индивидууму можно вводить прекондиционирующее средство по меньшей мере за 2 дня, например, по меньшей мере за 3, 4, 5, 6 или 7 дней, до первой или последующих доз иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее средство. В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят прекондиционирующее средство не более чем за 7 дней, например, не более чем за 6, 5, 4, 3 или 2 дня, до введения дозы клеток.

[416] В некоторых вариантах осуществления индивидуума подвергают прекондиционированию циклофосфамидом в дозе от или приблизительно от 20 мг/кг до 100 мг/кг, например, от или приблизительно от 40 мг/кг до 80 мг/кг. В некоторых аспектах индивидуума подвергают прекондиционированию с использованием или с использованием приблизительно 60 мг/кг циклофосфамида. В некоторых вариантах осуществления циклофосфамид можно вводить в однократной дозе или можно вводить во множестве доз, например, ежедневно, через день или каждые три дня. В некоторых вариантах осуществления циклофосфамид вводят раз в сутки в течение одного или двух дней.

[417] В некоторых вариантах осуществления, если противолимфоцитарное средство содержит флударабин, индивидууму вводят флударабин в дозе от или приблизительно от 1 мг/м² до 100 мг/м², например, от или приблизительно от 10 мг/м² до 75 мг/м², 15 мг/м² до 50 мг/м², 20 мг/м² до 30 мг/м² или 24 мг/м² до 26 мг/м². В некоторых случаях индивидууму вводят 25 мг/м² флударабина. В некоторых вариантах осуществления флударабин можно вводить в однократной дозе или множестве доз, например, ежедневно, через день или каждые три дня. В некоторых вариантах осуществления флударабин вводят ежедневно, например, в течение 1-5 дней, например, в течение от 3 до 5 дней.

[418] В некоторых вариантах осуществления противолимфоцитарное средство содержит комбинацию средств, такую как комбинация циклофосфамида и флударабина. Таким образом, комбинация средств может включать циклофосфамид в любой дозе или режиме введения, таких, как описано выше, и флударабин в любой дозе или режиме введения, таких, как описано выше. Например, в некоторых аспектах индивидууму вводят 60 мг/кг (~2 г/м²) циклофосфамида и 3-5 доз 25 мг/м² флударабина перед дозой клеток.

[419] В некоторых вариантах осуществления перед введением T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, индивидууму вводят модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина по меньшей мере за 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней или 30 дней до введения клеток и противолимфоцитарное прекондиционирующее химиотерапевтическое средство циклофосфамид вводят по меньшей мере за два дня перед T-клетками, например, CAR-экспрессирующими T-клетками, и, как правило, не более чем за 7 дней до введения клеток. В некоторых случаях, например, циклофосфамид вводят по меньшей мере через 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней или 30 дней после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. После прекондиционирования индивидуумам вводят дозу CAR-экспрессирующих T-клеток, как представлено в настоящем описании.

[420] В некоторых вариантах осуществления введение прекондиционирующего средства, например, для противолимфоцитарной терапии, перед инфузией дозы клеток улучшает исход лечения. Например, в некоторых аспектах прекондиционирование улучшает эффективность, исход или активность лечения с использованием дозы или повышает персистирование клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR-экспрессирующих клеток, таких как CAR-экспрессирующие T-клетки), у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления прекондиционирование повышает выживаемость без признаков заболевания, такую как процент индивидуумов, живых и непроявляющих минимальную остаточную болезнь или детектируемое на молекулярном уровне заболевание после указанного периода времени после введения дозы клеток. В некоторых вариантах осуществления время до медианы выживаемости без признаков заболевания повышено.

[421] После введения клеток индивидууму (например, человеку), биологическую активность популяций сконструированных клеток в некоторых аспектах измеряют любым из ряда известных способов, или любыми способами анализа, или с помощью анализов, представленных в настоящем описании, например, в разделе III. Параметры, подлежащие анализу, включают специфическое связывание сконструированной или природной T-клетки или другой иммунной клетки с антигеном in vivo, например, анализируемое посредством визуализации, или ex vivo, например, анализируемое посредством ELISA или проточной цитометрии. В определенных вариантах осуществления способность сконструированных клеток разрушать клетки-мишени можно измерять с использованием любого подходящего известного в этой области способа, такого как анализы цитотоксичности, описанные, например, в Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) и Herman et al., J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). В определенных вариантах осуществления биологическую активность клеток также можно измерять посредством анализа экспрессии и/или секреции конкретных цитокинов. В некоторых аспектах биологическую активность измеряют посредством оценки клинического исхода, такого как снижение опухолевой массы или нагрузки. В некоторых аспектах оценивают токсические исходы, персистирование и/или экспансию клеток и/или наличие или отсутствие иммунного ответа реципиента.

[422] В некоторых вариантах осуществления введение прекондиционирующего средства, например, противолимфоцитарного терапевтического средства, перед инфузией дозы клеток улучшает исход лечения, например, посредством улучшения эффективности, исхода или активности лечения с использованием дозы или повышает персистирование клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR-экспрессирующих клеток, таких как CAR-экспрессирующие T-клетки), у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления противолимфоцитарное терапевтическое средство не вводят перед введением иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1.

III. СКРИНИНГ, ОЦЕНКА ИЛИ ВЫБОР ИНДИВИДУУМОВ И ОЦЕНКА ИСХОДОВ ЛЕЧЕНИЯ

[423] В некоторых вариантах осуществления способов, композиций, комбинаций, наборов и применения, представленных в настоящем описании, комбинированное лечение может дополнительно включать одну или более стадий скрининга и/или оценки для определения пригодности для комбинированного лечения, идентификации или выбора индивидуумов для комбинированного лечения и/или продолжения комбинированного лечения, и/или стадию оценки исходов лечения и/или мониторинга исходов лечения. В некоторых вариантах осуществления стадия скрининга может включать стадию идентификации индивидуумов для лечения, такую как оценка конкретных параметров, таких как любые параметры, представленные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления стадия оценки исходов лечения может включать стадии оценки и/или мониторинга лечения и/или идентификации индивидуумов для введения на дальнейших или остальных стадиях терапии и/или повторной терапии. В некоторых вариантах осуществления стадию скрининга и/или оценки исходов лечения можно использовать для определения дозы, частоты, длительности, временного режима и/или порядка комбинированного лечения, представленного в настоящем описании.

[424] В некоторых вариантах осуществления комбинированное лечение по изобретению приводит к любому одному или более исходам лечения, таким как признак, ассоциированный с любым одним или более из параметров, ассоциированных с терапией или лечением, как описано ниже.

[425] В некоторых вариантах осуществления комбинированное лечение можно использовать для преодоления иммуносупрессорных условий TME и повышения активности иммунотерапии, такой как T-клеточная терапия (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или терапии с привлечением T-клеток. В некоторых вариантах осуществления модуляция пути кинуренина, например, ингибирование истощения триптофана (TRP) и/или продукции кинуренина (KYN) и его производных, приводит к повышенной пролиферации и/или активности T-клеток, таким образом, приводя к повышенной активности иммунотерапии, такой как T-клеточная терапия (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или терапии с привлечением T-клеток, по сравнению с активностью иммунотерапии в отдельности. В некоторых вариантах осуществления стадии скрининга и/или оценки исходов лечения можно использовать для определения и/или мониторинга активности комбинированного лечения.

[426] В некоторых аспектах скрининг или оценку конкретных параметров, как описано, можно использовать для идентификации индивидуумов, подходящих, восприимчивых и/или отвечающих на конкретное лечение, например, способы комбинированного лечения, представленные в настоящем описании, или для мониторинга лечения и/или идентификации эффективной дозы для индивидуума или подгруппы или другой группы индивидуумов. В некоторых вариантах осуществления такой скрининг или оценку можно использовать для выбора или идентификации пациентов, которые, как предполагают, будут отвечать на лечение. В некоторых вариантах осуществления стадию скрининга используют для определения дозы, частоты, длительности, временного режима и/или порядка комбинированного лечения, представленного в настоящем описании.

[427] В некоторых вариантах осуществления любые из стадий скрининга и/или оценки исходов лечения, представленных в настоящем описании, можно использовать до, во время, в течение курса или после проведения одной или более стадии комбинированного лечения по изобретению, например, введения иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающего терапевтического средства, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют до, во время, в течение курса или после осуществления любого из способов, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют до осуществления способов, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют после осуществления одной или более стадии способов, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют перед проведением одной или более стадий комбинированного лечения по изобретению, например, для скрининга и идентификации пациентов, подходящих и/или восприимчивых к комбинированному лечению. В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют во время, в течение курса или после проведения одной или более стадий комбинированного лечения по изобретению, например, для оценки промежуточного или конечного исхода лечения, например, для определения активности лечения, и/или определения необходимости продолжения или повторения лечения и/или определения необходимости осуществления остальных стадий комбинированного лечения.

[428] В некоторых вариантах осуществления стадия скрининга и/или оценки исходов лечения включает оценку уровней и изменений уровней факторов, например, ферментов, и/или метаболитов пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления стадия скрининга и/или оценки исходов лечения включает оценку иммунных функций, например, иммунных функций T-клеток, вводимых для клеточной терапии, и/или эндогенных T-клеток в организме. В некоторых вариантах осуществления стадия скрининга и/или оценки исходов лечения включает оценку выживания и/или функции T-клеток, вводимых для клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления стадия скрининга и/или оценки исходов лечения включает оценку уровней цитокинов или факторов роста. В некоторых вариантах осуществления стадия скрининга и/или оценки исходов лечения включает оценку бремени заболевания и/или улучшений, например, оценку опухолевой массы и/или клинических исходов. В некоторых вариантах осуществления любая из стадий скрининга и/или оценки исходов лечения может включать любой из способов оценки и/или анализов, представленных в настоящем описании и/или известных в этой области, и их можно осуществлять один или более раз, например, до, во время, в течение курса или после проведения одной или более стадий комбинированного лечения.

[429] В некоторых вариантах осуществления можно оценивать конкретные параметры для выбора пациентов для комбинированного лечения, определения порядка, дозы или схемы комбинированного лечения, определения исходов лечения и/или определения активности комбинированного лечения. В некоторых вариантах осуществления такие параметры включают, например, уровни метаболитов пути кинуренина, например, TRP, KYN или производных KYN, уровни экспрессии факторов или эффекторов, например, ферментов, вовлеченных в путь кинуренина, например, IDO1, пролиферацию T-клеток, активность T-клеток, оценку фенотипа клеток, например, экспрессию поверхностных T-клеточных маркеров, и/или активность лечения. Оценку можно осуществлять in vivo, ex vivo или in vitro, и конкретный параметр можно определять в биологическом образце, например, образце сыворотки, образце плазмы, биоптате опухоли или посредством визуализации in vivo. Биологические образцы включают, в качестве неограничивающих примеров, физиологические жидкости, такие как кровь, плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы тканей и органов или образцы опухоли, включая обработанные образцы, полученные из них, такие как выделенные клетки и/или тканевые срезы из биоптата опухоли.

[430] Примеры наборов параметров, ассоциированных с исходом лечения, которые можно оценивать в некоторых вариантах осуществления способов, представленных в настоящем описании, включают соотношение кинуренин/триптофан в плазме, профиль популяций иммунных клеток периферической крови, опухолевую массу и уровни экспрессии опухолевых маркеров плазмы и маркеров иммунной модуляции и экспрессии IDO1⁺.

A. Скрининг, идентификация и/или выбор индивидуумов и определение дозы и режима введения

[431] В некоторых вариантах осуществления индивидуума можно подвергать скринингу перед проведением одной или более стадий комбинированного лечения. Например, индивидуума можно подвергать скринингу на уровень, доступность, концентрацию, эффект, активность, метаболизм, синтез и/или деградацию факторов, например, ферментов, и/или метаболитов пути кинуренина, и/или характеристики заболевания и/или бремя заболевания, например, опухолевую массу, до или после проведения одной или более стадий комбинированного лечения, и/или характеристики или анамнез предшествующего лечения и/или ответ на предшествующее лечение, для определения пригодности, отвечаемости и/или восприимчивости к одной или более стадиям комбинированного лечения.

[432] В некоторых вариантах осуществления индивидуума можно подвергать скринингу на уровень, доступность, концентрацию, эффект, активность, метаболизм, синтез и/или деградацию факторов или эффекторов, например, ферментов, и/или метаболитов пути кинуренина, например, уровни метаболитов пути кинуренина, например, TRP, KYN или производных KYN, уровни экспрессии факторов или эффекторов, например, ферментов, вовлеченных в путь кинуренина, например, IDO1, и/или транспортеров аминокислот, например, LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4, в биологическом образце индивидуума, например, образцах опухоли, крови и/или сыворотки. В некоторых вариантах осуществления любые из параметров, ассоциированных с терапией, скринингом, идентификацией или исходами лечения, представленными в настоящем описании, такие как описываемые в разделе III.C. ниже, можно использовать в качестве значимых параметров для определения пригодности, отвечаемости и/или восприимчивости к лечению и/или скрининга, идентификации и/или выбора индивидуумов для лечения, например, с использованием некоторых из вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, например, одной или более стадий комбинированного лечения.

[433] В некоторых вариантах осуществления индивидуума можно подвергать скринингу после проведения одной из стадий комбинированного лечения для определения и идентификации индивидуумов для проведения остальных стадий комбинированного лечения. Например, в некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят перед введением иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающего терапевтического средства, и перед введением иммунотерапевтического средства оценивают уровень факторов, например, ферментов, и/или метаболитов пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство, такое как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство, вводят перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, и перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина оценивают пролиферацию и/или активность вводимых T-клеток и/или уровень факторов, например, ферментов, и/или метаболитов пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления индивидуума перед введением комбинированного лечения можно подвергать скринингу на конкретные характеристики заболевания, например, опухоль или микроокружение опухоли (TME) и/или бремя заболевания, например, опухолевую массу. Например, в некоторых вариантах осуществления индивидуума, которому вводили T-клеточное терапевтическое средство, например, CAR-T-клеточное терапевтическое средство, оценивают на повышенную экспрессию IDO1 в образце опухоли и/или уровни циркулирующих метаболитов, таких как уровни циркулирующего триптофана или кинуренина, для выбора и/или идентификации индивидуума для введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. Любой из способов оценки и/или анализов, представленных в настоящем описании и/или известных в этой области, можно осуществлять как стадию скрининга индивидуумов для комбинированного лечения.

[434] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам выбора индивидуумов, имеющих заболевание или состояние, для лечения. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам оценки параметров, например, любых параметров, представленных в настоящем описании, для скрининга и/или идентификации индивидуумов для лечения. В некоторых вариантах осуществления лечение представляет собой введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, в частности, в комбинации с T-клеточной терапией.

[435] В некоторых вариантах осуществления способы скрининга, идентификации и/или выбора включает способы оценки параметров, таких как уровни и/или количество факторов, молекул и/или средств, свидетельствующих или ассоциированных с индукцией или образованием факторов, молекул и/или средств, вовлеченных в резистентность к адаптивному иммунитету или свидетельствующих о ней, активацией метаболизма триптофана/пути кинуренина, экспрессией IDO1 и/или истощением триптофана. В некоторых вариантах осуществления такая оценка включает определение уровней и/или количества параметров, таких как факторы, молекулы и/или средства, и/или определение изменения параметров. В некоторых вариантах осуществления такие уровни и/или количество параметров и/или изменения уровней и/или количества параметров прямо или обратно пропорционально коррелируют с активацией метаболизма триптофана/пути кинуренина, экспрессией IDO1 и/или истощением триптофана у индивидуума.

[436] В некоторых вариантах осуществления способы включают идентификацию и/или выбор индивидуумов, имеющих заболевание или состояние, для лечения с учетом результатов скрининга и/или оценки. В некоторых вариантах осуществления выбирают или идентифицируют индивидуума, при этом уровни и/или количество параметров и/или изменения уровней и/или количества параметров свидетельствуют, например, прямо или обратно коррелируют, об активации метаболизма триптофана/пути кинуренина, экспрессии IDO1 и/или истощения триптофана. В некоторых вариантах осуществления таких индивидуумов идентифицируют и/или выбирают для введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина и/или T-клеточного терапевтического средства.

[437] В некоторых вариантах осуществления параметр, такой как уровни и/или количество факторов, молекул и/или средств, свидетельствующих или ассоциированных с резистентностью к адаптивному иммунитету, активацией метаболизма триптофана/пути кинуренина, экспрессией IDO1 и/или истощением триптофана, включает уровень триптофана или метаболита триптофана, уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO или уровень интерферона-гамма (ИФНγ).

[438] В некоторых вариантах осуществления высокий уровень параметра, такой как уровень выше порогового уровня, или повышение параметра по сравнению с предшествующей временной точкой ассоциировано или свидетельствует о резистентности к адаптивному иммунитету, активации метаболизма триптофана/пути кинуренина, экспрессии IDO1 и/или истощении триптофана. В некоторых вариантах осуществления низкий уровень параметра, такой как уровень ниже порогового уровня, или снижение параметра по сравнению с предшествующей временной точкой ассоциировано или свидетельствует о резистентности к адаптивному иммунитету, активации метаболизма триптофана/пути кинуренина, экспрессии IDO1 и/или истощении триптофана. В некоторых вариантах осуществления индивидуумов выбирают для введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, если результаты оценки ассоциированы или свидетельствуют о резистентности к адаптивному иммунитету, активации метаболизма триптофана/пути кинуренина, экспрессии IDO1 и/или истощении триптофана.

[439] В некоторых вариантах осуществления параметр можно оценивать in vivo, ex vivo или in vitro, и параметр можно определять в биологическом образце, например, образце сыворотки, образце плазмы, биоптате опухоли или посредством визуализации in vivo. Биологические образцы включают, в качестве неограничивающих примеров, физиологические жидкости, такие как кровь, плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы тканей и органов или образцы опухоли, включая обработанные образцы, полученные из них, такие как выделенные клетки и/или тканевые срезы из биоптата опухоли.

[440] В некоторых вариантах осуществления один или более биологических образцов получают перед введением T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления один или более биологических образцов получают после введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления один или более биологических образцов получают после введения T-клеточного терапевтического средства и модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[441] В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют перед введением T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют после введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют после введения T-клеточного терапевтического средства и модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[442] В некоторых вариантах осуществления параметр является уровнем триптофана, и уровень триптофана в образце ниже порогового уровня или снижен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления уровень триптофана может быть обратно пропорционален резистентности к адаптивному иммунитету, активации метаболизма триптофана/пути кинуренина, экспрессии IDO1 и/или истощению триптофана.

[443] В некоторых вариантах осуществления параметр является уровнем экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO, и уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO выше порогового уровня или повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO может быть напрямую связан с резистентностью к адаптивному иммунитету, активацией метаболизма триптофана/пути кинуренина, экспрессией IDO1 и/или истощением триптофана.

[444] В некоторых вариантах осуществления параметр является уровнем ИФНγ, и уровень ИФНγ выше порогового уровня или повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO может быть напрямую связан резистентностью к адаптивному иммунитету, активацией метаболизма триптофана/пути кинуренина, экспрессией IDO1 и/или истощением триптофана.

[445] В некоторых вариантах осуществления индивидуума идентифицируют или выбирают, если уровень триптофана в образце ниже порогового уровня или снижен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; уровень метаболита триптофана выше порогового уровня или повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO выше порогового уровня или повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; или уровень ИФНγ выше порогового уровня или повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[446] В некоторых вариантах осуществления индивидуума выбирают, если уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления индивидуума выбирают, если уровень триптофана в образце ниже порогового уровня или снижен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[447] В некоторых вариантах осуществления пороговый уровень составляет в пределах 25%, 20%, 15%, 10% или 5% от среднего уровня, концентрации или количества, и/или находится в пределах стандартного отклонения среднего уровня, концентрации или количества в биологических образцах множества контрольных индивидуумов. В некоторых вариантах осуществления контрольные индивидуумы являются здоровыми или нормальными индивидуумами, индивидуумами, не имеющими злокачественное новообразование, и/или индивидуумами до введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

[448] В некоторых вариантах осуществления скрининг и/или оценка включает оценку количества, функции, состояния и/или фенотипа вводимых T-клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления скрининг и/или оценка включает оценку пикового или максимального уровня клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума. В некоторых вариантах осуществления скрининг и/или оценка включает оценку функции, состояния и/или фенотипа T-клеток, включая состояние длительного триптофанового голодания, истощение, анергию, гибель клеток, сокращение, супрессию противоопухолевых иммунных ответов или толерантность к опухолевым антигенам и/или способность восстанавливаться после голодания, например, триптофанового голодания, и/или реверсировать эффект голодания.

[449] В некоторых вариантах осуществления скрининг и/или оценка включает оценку клеток, присутствующих в опухоли или вблизи нее, например, CAR-T-клеток, опухолевых клеток и/или фоновых клеток, и/или характеризацию клеток, присутствующих в опухоли или вблизи нее, например, CAR-T-клеток, опухолевых клеток и/или фоновых клеток. В некоторых вариантах осуществления скрининг и/или оценка включает оценку экспрессии IDO1 и/или экспрессии транспортеров аминокислот, таких как транспортеры триптофана, например, LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4, в образце индивидуума, например, образце опухоли индивидуума, таком как биоптат и/или выделенные клетки. В некоторых вариантах осуществления индивидуума идентифицируют или выбирают для введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, если в образце опухоли индивидуума наблюдают повышенную экспрессию IDO1 и/или экспрессию транспортеров аминокислот, таких как транспортеры триптофана, например, LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4, по сравнению с образцом, полученным перед введением T-клеточного терапевтического средства, образцом, полученным в референсной точке, и/или образцом другого индивидуума.

[450] В некоторых вариантах осуществления скрининг и/или оценка включает оценку уровней метаболитов пути кинуренина, например, триптофана, или кинуренина, и/или их производных. В некоторых вариантах осуществления скрининг и/или оценка включает оценку уровней метаболитов пути кинуренина в биологическом образце, например, образце крови, сыворотки, плазмы или опухоли, индивидуума. В некоторых вариантах осуществления индивидуума идентифицируют или выбирают для введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, если метаболиты пути кинуренина в биологическом образце, например, образце сыворотки или плазмы, индивидуума изменены, например, повышены или снижены, по сравнению с образцом, полученным перед введением T-клеточного терапевтического средства, образцом, полученным в референсной точке и/или образцом другого индивидуума.

[451] В некоторых вариантах осуществления скрининг и/или оценка включает оценку любой предшествующей терапии и/или исходов. В некоторых вариантах осуществления скрининг и/или оценка включает оценку отвечаемости или безуспешности предшествующего лечения, резистентности к предшествующему лечению и/или рецидива после предшествующего лечения. В некоторых аспектах скрининг и/или оценка включает оценку ответа индивидуума на предшествующее лечение, например, химиотерапию или иммунотерапию, бремя заболевания у индивидуума, такое как опухолевая нагрузка, объем, размер или степень, степень или тип метастазирования, стадия и/или вероятность или частота развития токсических исходов, например, CRS, синдрома активации макрофагов, синдрома лизиса опухоли, нейротоксичности и/или иммунного ответа реципиента против вводимых клеток и/или рекомбинантных рецепторов. В некоторых вариантах осуществления предшествующее лечение может являться любой терапией, например, любой общепринятой противоопухолевой терапией, такой как химиотерапия. В некоторых вариантах осуществления предшествующее лечение представляет собой введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, и/или иммуномодулирующего терапевтического средства, неявляющегося T-клеточным терапевтическим средством, например, ингибитора иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления предшествующее лечение является комбинированным лечением модулятором метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитором IDO1, и иммуномодулятором, например, ингибитором иммунных контрольных точек.

[452] В некоторых вариантах осуществления индивидуума идентифицируют или выбирают для проведения одной или более стадий вариантов осуществления, представленных в настоящем описании, если индивидуум потерпел неудачу, стал резистентным и/или имел рецидив после предшествующего лечения, такого как предшествующее введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим терапевтическим средством, неявляющимся T-клеточным терапевтическим средством, например, ингибитором иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления комбинированное лекарственное средство можно вводить индивидуумам, потерпевшим неудачу, ставшим резистентным и/или имевшим рецидив после другого предшествующего лечения, такого как предшествующее комбинированное лечение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, и иммуномодулятора, например, ингибитора иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления предшествующая иммуномодулирующая терапия не является предшествующей T-клеточной терапией. В некоторых вариантах осуществления индивидуумов не подвергали предшествующей T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления стадию скрининга и/или оценки исходов лечения можно использовать для определения дозы, частоты, длительности, временного режима и/или порядка комбинированного лечения, представленного в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят после начала введения клеток, экспрессирующих рекомбинантные рецепторы, когда: наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1 в образце сыворотки или плазмы индивидуума по сравнению со временем до начала введения сконструированных клеток или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения сконструированных клеток; и/или количество сконструированных клеток, детектируемых в крови индивидуума, снижено по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после введения сконструированных клеток.

[453] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда: наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства; количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства; количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови, меньше или меньше чем приблизительно в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз или 100 раз или менее пикового или максимального количества клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума после начала введения T-клеточного терапевтического средства; и/или после того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства становится детектируемым в крови индивидуума, количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, составит менее 10%, менее 5%, менее 1% или менее 0,1% от всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) в крови индивидуума; уровень ИФНγ или ФНО повышен в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[454] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят до того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства станет детектируемым в крови индивидуума. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят во время до сокращения относительно пикового или максимального уровня клеток при T-клеточной терапии, например, до момента, когда количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[455] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят, когда наблюдают повышение экспрессии или активности IDO1 в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

[456] В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, продолжают после начала введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, до достижения устойчивого максимального повышения уровней триптофана, устойчивого максимального повышения уровней кинуренина или устойчивого максимального повышения экспрессии или активности IDO1 в биологическом образце индивидуума, необязательно, образце сыворотки или плазмы, по сравнению со временем непосредственно перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, или по сравнению со временем непосредственно перед началом иммунотерапии, например, T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят до достижения устойчивого максимального повышения количества сконструированных клеток, детектируемых в крови индивидуума, по сравнению с индивидуумом непосредственно перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. Например, в некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят в течение периода времени до 2 дней, до 7 дней, до 14 дней, до 21 дня, до 28 дней, до 35 дней или до 42 дней, до одного месяца, до двух месяцев, до трех месяцев, до 6 месяцев или до 1 года после начала введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства.

[457] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят до тех пор, пока концентрация или количество сконструированных клеток в крови индивидуума не составит (i) по меньшей мере или приблизительно 10 сконструированных клеток на микролитр, (ii) по меньшей мере 20%, 30%, 40% или 50% общего количества мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), (iii) по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1×10⁵ сконструированных клеток; или (iv) по меньшей мере 5000 копий ДНК, кодирующей рекомбинантный рецептор, на микрограмм ДНК; и/или в день 90 после начала введения на стадии (a), когда CAR-экспрессирующие клетки являются детектируемыми в крови или сыворотке индивидуума; и/или в день 90 после начала введения на стадии (a), когда кровь индивидуума содержит по меньшей мере 20% CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере 10 CAR-экспрессирующих клеток на микролитр или по меньшей мере 1×10⁴ CAR-экспрессирующих клеток.

[458] В некоторых вариантах осуществления способ используют по отношению к индивидуумам со злокачественным новообразованием, включающим опухоль, отрицательную по IDO1, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1; и/или способ используют по отношению к индивидуумам со злокачественным новообразованием, включающим опухоль, отрицательную по TDO, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии TDO.

[459] В некоторых вариантах осуществления индивидуум (например, которому вводят терапевтические средства по изобретения) является индивидуумом, имеющим или, как предполагают, имеющим злокачественное новообразование или опухоле-ассоциированную ткань или клетку, являющуюся или, как предполагают, являющуюся положительной по экспрессии транспортера аминокислот, способного захватывать или обменивать триптофан, такого как транспортер аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5) или одна или более цепей его комплекса, LAT2 (SLC7A8), тяжелая цепь CD98 (4F2hc; CD98hc; SLC3A2) и/или протонный транспортер аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4), или индивидуумами со злокачественным новообразованием, содержащим клетки, например, фоновые клетки в микроокружении опухоли, экспрессирующие высокие уровни или положительные по экспрессии LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4. В вариантах осуществления промышленные изделия содержат одно или более средств и печатных материалов и/или инструкций, в которых указано введение терапевтического средства такому индивидууму и/или указано, что индивидуумы перед лечением подлежат оценке на такую опухоль, опухоле-ассоциированную ткань или клетку или маркер.

[460] В некоторых вариантах осуществления любые из способов оценки, скрининга, идентификации и/или выбора индивидуумов дополнительно включают введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина и/или T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение индивидууму T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение выбранному индивидууму модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления любые из способов оценки, скрининга, идентификации и/или выбора индивидуумов дополнительно включают введение индивидууму клеточного терапевтического средства перед оценкой. В некоторых вариантах осуществления любые из способов оценки, скрининга, идентификации и/или выбора индивидуумов дополнительно включают введение индивидууму модулятора пути кинуренина.

[461] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят выбранному индивидууму до или одновременно с началом введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят после начала введения T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления один или более биологических образцов получают после введения T-клеточного терапевтического средства.

B. Оценка исходов лечения и/или мониторинг исходов лечения

[462] В некоторых вариантах осуществления способов, композиций, комбинаций, наборов и применения, представленных в настоящем описании, комбинированное лечение может включать стадию оценки исхода лечения и/или мониторинга исходов лечения. В некоторых вариантах осуществления стадия оценки исходов лечения и/или мониторинга исходов лечения включает способы оценки и/или анализы для мониторинга лечения и оценки исхода, такого как активность или эффективность лечения. В некоторых вариантах осуществления стадия оценки исходов лечения может включать стадии оценки и/или мониторинга лечения и/или идентификации индивидуумов для дальнейших или остальных стадий терапии и/или повторения терапии. В некоторых вариантах осуществления стадию оценки исхода лечения и/или мониторинга исходов лечения используют для определения дозы, частоты, длительности, временного режима и/или порядка комбинированного лечения, представленного в настоящем описании.

[463] В некоторых вариантах осуществления оценку исходов лечения, представленную в настоящем описании, можно использовать во время, в течение курса или после проведения одной или более стадий комбинированного лечения по изобретению, например, введения иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающего терапевтического средства, и модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, для оценки промежуточного или конечного исхода лечения, например, для определения или мониторинга активности лечения, определения продолжения или повтора лечения, для определения необходимости проведения остальных стадий комбинированного лечения, и/или для определения конкретной дозы, частоты, длительности, временного режима и/или порядка комбинированного лечения. В некоторых вариантах осуществления оценку исходов лечения, представленную в настоящем описании, используют после осуществления и введения иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающего средства, и введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[464] В некоторых вариантах осуществления оценка исхода лечения и/или мониторинг исходов лечения включает способы оценки и/или анализы, представленные в настоящем описании, например, оценку уровней и/или изменения уровней факторов или эффекторов, например, ферментов, и/или метаболитов пути кинуренина, иммунных функций, например, иммунных функций T-клеток, вводимых для клеточной терапии, и/или эндогенных T-клеток в организме, выживания и/или функции T-клеток, вводимых для клеточной терапии, цитокинов или факторов роста, бремени заболевания и/или улучшений, например, оценку опухолевой массы и/или клинических исходов. Любые из способов оценки и/или анализов, представленных в настоящем описании и/или известных в этой области, можно осуществлять как стадию оценки исхода лечения и/или мониторинга исходов лечения.

[465] В некоторых вариантах осуществления любые из способов оценки и/или анализов можно осуществлять однократно, или многократно, или повторно. В некоторых вариантах осуществления введение одного или обоих средств комбинированного лечения и/или любое повторное введение терапевтического средства можно определять с учетом результатов анализов, проводимых до, во время или после введения одного или обоих средств комбинированного лечения.

[466] В некоторых вариантах осуществления примеры исходов лечения способами, представленными в настоящем описании, включают изменения уровней метаболитов пути кинуренина, например, повышенные уровни TRP или реверсирование истощения триптофана, снижение продукции KYN и его производных, повышенную пролиферацию T-клеток, повышенную функциональную активность T-клеток, изменения экспрессии фенотипических маркеров иммунных клеток, сниженное бремя заболевания, например, опухолевую массу, улучшенные клинические исходы и/или повышенную активность терапии. В некоторых вариантах осуществления способы, представленные в настоящем описании, приводят к повышению уровней триптофана и/или снижению уровней кинуренина в биологическом образце, например, образце сыворотки или плазмы, индивидуума по сравнению со способом, включающим введение клеточного терапевтического средства в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[467] В некоторых вариантах осуществления способов иммунотерапии, представленных в настоящем описании, такой как T-клеточная терапия (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или терапия с привлечением T-клеток, оценка параметра включает оценку экспансии и/или персистирования у индивидуума вводимых T-клеток для иммунотерапии, например, T-клеточной терапии, по сравнению со способом, в котором иммунотерапевтическое средство вводят индивидууму в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых вариантах осуществления способы приводят к тому, что вводимые T-клетки демонстрируют повышенную или пролонгированную экспансию и/или персистирование в организме индивидуума по сравнению со способом, в котором T-клеточное терапевтическое средство вводят индивидууму в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[468] В некоторых вариантах осуществления способы также влияют на активность клеточной терапии в организме индивидуума. В некоторых вариантах осуществления персистирование, экспансия и/или наличие клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, например, CAR-экспрессирующих клеток, у индивидуума после введения дозы клеток в способе с использованием модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, выше персистирования, экспансии и/или наличия, достигаемых с помощью способа без использования модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, снижает бремя заболевания, например, опухолевую массу, у индивидуума по сравнению со способом, в котором дозу клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, вводят индивидууму в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, снижает количество бластных клеток в костном мозге индивидуума по сравнению со способом, в котором дозу клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, вводят индивидууму в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, приводит к улучшенным клиническим исходами, например, частоте объективных ответов (ORR), выживаемости без прогрессирования (PFS) и общей выживаемости (OS), по сравнению со способом, в котором дозу клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, вводят индивидууму в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[469] В некоторых вариантах осуществления определяют или оценивают изменение, например, повышение или снижение, уровней, значений или измерений параметра по сравнению с уровнями, значениями или измерениями того же параметра в другой момент времени, когда проводили оценку, в других условиях, в референсный момент времени и/или у другого индивидуума. Например, в некоторых вариантах осуществления можно определять кратное изменение, например, повышение или снижение, конкретных параметров, например, количества сконструированных T-клеток в образце, по сравнению с тем же параметром в других условиях, например, до или после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления определяют уровни, значения или измерения двух или более параметров и сравнивают относительные уровни. В некоторых вариантах осуществления определенные уровни, значения или измерения параметров сравнивают с уровнями, значениями или измерениями в контрольном образце или необработанном образце. В некоторых вариантах осуществления определенные уровни, значения или измерения параметров сравнивают с уровнями в образце, полученном из того же индивидуума, но в другой момент времени. Значения, полученные при количественном анализе отдельного параметра, можно комбинировать в целях оценки заболевания, например, осуществляя арифметическую или логическую операцию в отношении уровней, значений или измерений параметров с использованием многопараметрического анализа. В некоторых вариантах осуществления можно вычислять соотношение двух или более конкретных параметров.

C. Параметры, ассоциированные с терапией, скринингом, идентификацией или исходами лечения

1. Уровни триптофана, метаболитов кинуренина и ферментов

[470] В некоторых вариантах осуществления параметры, ассоциированные с терапией или исходом лечения, включающие параметры, которые можно оценивать на стадиях скрининга, и/или оценки исходов лечения, и/или мониторинга исходов лечения, включают уровни метаболитов пути кинуренина, например, триптофана и/или кинуренина, или факторов или эффекторов, например, ферментов, рецепторов или сигнальных молекул, вовлеченных в путь кинуренина. Как указано выше в разделе II.B.1, путь кинуренина является ключевым путем метаболизма триптофана и включает многочисленные стадии и различные метаболиты, некоторые из которых вносят свой вклад в формирование иммуносупрессорного TME. В некоторых вариантах осуществления оценку уровней метаболитов пути кинуренина можно осуществлять для выбора пациентов для комбинированного лечения, определения порядка, дозы или схемы комбинированного лечения, определения исходов лечения и/или определения активности комбинированного лечения.

[471] В некоторых вариантах осуществления оцениваемый параметр является уровнем, изменениями уровней и/или уровней экспрессии одного или более ферментов в пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления фермент пути кинуренина является индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназой 1 (IDO1), IDO2, триптофан-2,3-диоксигеназой (TDO), кинуренинформамидазой, кинурениназой, L-кинуренингидролазой, кинуренин-3-монооксигеназой, кинуренин-3-гидроксилазой, оксигеназой 3-гидроксиантраниловой кислоты, 3-гидроксиантранилат-3,4-диоксигеназой, кинуренинаминотрансферазой, и/или фосфорибозилтрансферазой хинолиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления уровни одного или более ферментов в биологическом образце определяют с использованием любого из общепринятых способов определения экспрессии гена и/или продукта гена, например, способов определения нуклеиновых кислот и/или белков, например, внутриклеточных ферментов.

[472] В некоторых вариантах осуществления оцениваемый параметр является уровнем экспрессии и/или статусом активации факторов, например, эффекторов, вовлеченных в путь кинуренина, и/или компонентов, вовлеченных в метаболизм триптофана, передачу сигнала и/или транспорт, таким как уровни экспрессии транспортера триптофана или комплекса транспортера, такого как LAT-1 или родственные транспортеры. В некоторых вариантах осуществления примеры оцениваемых параметров включают уровень экспрессии или состояние активации, например, состояние фосфорилирования или клеточную локализацию, компонентов, вовлеченных в метаболизм триптофана, транспорт и/или передачу сигнала, например, general control nonderepressible 2 (GCN2), интерферона γ (ИФНγ), фактора некроза опухоли альфа (ФНО), передатчика сигнала и активатора транскрипции 3 (STAT3), мишени рапамицина у млекопитающих (mTOR), арил-углеводородного рецептора (AHR), ядерного транслокатора AHR (ARNT), диоксин-чувствительного элемента (DRE), транспортеров аминокислот, таких как транспортеры TRP (триптофана) (например, CD98 и/или ассоциированных цепей, таких как один или более из комплекса транспортера CD98/LAT-1, например, тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2) и/или транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4), Asc-1, Asc-2, ATB0, B0AT1, TAT1), белка с цинковыми пальцами с доменом PR 1 (PRDM1, также известного как BLIMP-1), эукариотического фактора инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующего фактора транскрипции 4 (ATF4), белка, гомологичного CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 и/или ИФНγ-R2.

[473] В некоторых вариантах осуществления оцениваемый параметр является уровнями или изменениями уровней, доступности, концентрации, эффекта, активности, метаболизма, синтеза и/или деградации одного или более метаболитов в пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления метаболит пути кинуренина является L-триптофаном, n-формилкинуренином, D- и/или L-кинуренином, кинуреновой кислотой, хинальдиновой кислотой, кинурамином, 3-гидрокси-L-кинуренином, 3-гидрокси-D-кинуренином, ксантомматином, антраниловой кислотой, ксантуреновой кислотой, 3-гидроксиантраниловой кислотой, пиколиновой кислотой, хинолиновой кислотой и/или циннабариновой кислотой.

[474] В некоторых вариантах осуществления способы или анализы для детекции или определения уровня, доступности, концентрации, эффекта, активности, метаболизма, синтеза и/или деградации метаболитов, или факторов, или эффекторов, например, ферментов, рецепторов или сигнальных молекул, вовлеченных в путь кинуренина, включают любые из известных в этой области способов определения уровней метаболитов, белков, нуклеиновых кислот или других биологических молекул в биологическом образце. Например, способы детекции включают иммуногистохимию, ELISA, EIA, иммунофлуоресценцию, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), ПЦР с обратной транскрипцией (RT-ПЦР), ПЦР in situ, количественную ПЦР, проточную цитометрию, активируемую флуоресценцией сортировку клеток (FACS), анализы ферментативной активности, газовую хроматографию/масс-спектроскопию (GC/MS), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию (LC-MS/MS), тандемную масс-спектрометрию с жидкостной хроматографией и ионизацией электрораспылением (LC-ESI-MS), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), гибридизацию in situ, вестерн-блоттинг, нозерн-блоттинг, Саузерн-блоттинг, визуализацию in vivo, микрочипы, секвенирование транскриптома и/или любые высокопроизводительные способы, известные в этой области.

[475] В некоторых вариантах осуществления уровни метаболитов можно определять с использованием любых способов, известных в этой области. Например, уровни TRP, KYN и/или производного KYN в биологическом образце можно определять с использованием биосенсоров, оптических устройств, сопряженных с ферментативными анализами, биочипов, аналитических устройств, таких как масс-спектрометры, ЯМР-анализаторов, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунологического анализа или хроматографических способов, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS/MS), тандемная масс-спектрометрия с жидкостной хроматографией и ионизацией электрораспылением (LC-ESI-MS), детекции флуоресценции и/или спектрофотометрических способов, включая измерение спектроскопического поглощения после реакции с реактивом Эрлиха (2% p-диметиламинобензальдегидом в ледяной уксусной кислоте). В некоторых вариантах осуществления уровни метаболитов можно определять с использованием ВЭЖХ. Например, в некоторых вариантах осуществления уровни триптофана и кинуренина можно определять с помощью ВЭЖХ посредством сравнения со стандартом аминокислоты и/или стандартом аминокислоты+кинуренин.

[476] В некоторых вариантах осуществления биологический образец является образцом сыворотки, образцом плазмы, образцом ткани и/или образцом опухоли, например, биоптатом опухоли. В некоторых вариантах осуществления биологические образцы включают, в качестве неограничивающих примеров, физиологические жидкости, такие как кровь, плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы тканей и органов или образцы опухоли, включая обработанные образцы, полученные из них. В некоторых вариантах осуществления биологический образец включает выделенные клетки и/или тканевые срезы из биоптата опухоли. В некоторых вариантах осуществления оценку можно осуществлять in vivo, ex vivo или in vitro, и конкретный параметр можно определять в биологическом образце или посредством визуализации in vivo.

[477] В некоторых вариантах осуществления захват триптофана клетками и внутриклеточные уровни триптофана можно определять с использованием триптофан-чувствительного флуоресцентного индикаторного белка (FLIP). В некоторых вариантах осуществления FLIP включает триптофан-чувствительную молекулу на основе репрессора триптофанового оперона, полученного из Escherichia coli, и включает пару флуорофоров с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET). Связывание триптофана с FLIP приводит к изменению конформации и соотношения FRET (см., например, Kaper et al. (2007) PLoS Biol 5(10): e257), таким образом, позволяя определять внутриклеточные уровни триптофана.

[478] В некоторых аспектах определение уровней экспрессии включает осуществление анализа in vitro. В некоторых вариантах осуществления анализ in vitro является иммунологическим анализом, анализом на основе аптамеров, гистологическим или цитологическим анализом или анализом уровня экспрессии мРНК. В некоторых вариантах осуществления параметр или параметры для одного или более из факторов, эффекторов, ферментов и/или поверхностных маркеров определяют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), иммуноблоттинга, иммунопреципитации, радиоиммунологического анализа (RIA), иммуноокрашивания, проточной цитометрии, поверхностного плазмонного резонанса (SPR), анализа хемилюминесценции, иммунохроматографического анализа, анализа ингибирования или анализа авидности.

[479] В некоторых вариантах осуществления параметр для по меньшей мере одного из одного или более факторов, эффекторов, ферментов и/или поверхностных маркеров определяют с использованием связывающего реагента, специфически связывающегося по меньшей мере с одним биомаркером. В некоторых случаях связывающий реагент является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, аптамером или зондом нуклеиновой кислоты.

[480] В некоторых вариантах осуществления можно использовать ферментативные анализы для детекции уровней IDO1 в биологическом образце, например, образце сыворотки, образце плазмы, образце ткани или образце опухоли. Примеры ферментативных анализов IDO1 включают анализ антиоксиданта 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH), анализ окисления-восстановления менадиона (2-метил-1,4-нафтохинон) или анализы окисления-восстановления на основе гема.

[481] В некоторых вариантах осуществления определяют уровень двух или более факторов или эффекторов, например, ферментов, и/или метаболитов, и сравнивают относительные уровни. В некоторых вариантах осуществления определенный уровень фермента, фактора и/или метаболита сравнивают с уровнями в контрольном образце или необработанном образце. В некоторых вариантах осуществления определенный уровень фермента, фактора и/или метаболита сравнивают с уровнями в образце, полученном из того же индивидуума, но в другой момент времени. Значения, полученные при количественном анализе отдельных ферментов или метаболитов пути кинуренина, можно комбинировать в целях оценки заболевания, например, осуществляя арифметическую или логическую операцию в отношении определенных концентраций или с использованием многопараметрического анализа. В некоторых вариантах осуществления оцениваемым параметром является соотношение кинуренин/триптофан в плазме.

[482] В некоторых вариантах осуществления оцениваемый параметр является изменением, например, повышением или снижением, относительно другого момента времени, когда проводили оценку, в других условиях и/или по сравнению с референсным моментом времени, уровней метаболитов пути кинуренина, например, триптофана и/или кинуренина, или факторов или эффекторов, например, ферментов, рецепторов или сигнальных молекул, вовлеченных в путь кинуренина. Например, в некоторых вариантах осуществления оцениваемый параметр является изменением уровней триптофана, уровней кинуренина и/или уровней экспрессии IDO1, IDO2 и/или TDO. В некоторых вариантах осуществления определяют кратное изменение повышения или снижения. В некоторых вариантах осуществления изменение, например, повышение или снижение, уровней факторов или эффекторов, например, ферментов, или метаболитов в пути кинуренина является изменением более или более чем приблизительно в 1,2 раза, 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз или более. В некоторых вариантах осуществления любые из описанных параметров, например, уровень экспрессии IDO1, IDO2 и/или TDO или других биомаркеров, связанных с триптофаном, можно использовать помимо других параметров или биомаркеров для оценки или характеризации активности, фенотипов, пролиферации и/или функции T-клеток, используемых для терапии, до, во время или после конструирования, коррелирующих с исходами лечения или токсичными исходами, для идентификации или выбора пациентов для лечения и/или для определения дозы или других схем лечения.

[483] В некоторых вариантах осуществления оцениваемые параметры включают экспрессию и/или активность транспортеров аминокислот, например, транспортеров триптофана, в злокачественном новообразовании, опухоли или клетках в микроокружении опухоли (TME). В некоторых вариантах осуществления оценивают экспрессию и/или активность одного или более транспортеров аминокислот или их цепей, например, транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), тяжелой цепи CD98 (4F2hc; CD98hc; SLC3A2) и/или протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4). В некоторых вариантах осуществления опухолевые клетки или злокачественные клетки в биологическом образце, полученном из индивидуума, экспрессируют высокие уровни LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4 или являются положительными по экспрессии LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4. В некоторых вариантах осуществления другие клетки в микроокружении опухоли, например, фоновые клетки, такие как стромальные клетки или миелоидные клетки, также экспрессируют высокие уровни LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4. В некоторых вариантах осуществления стромальные клетки костного мозга, дендритные клетки и/или макрофаги могут экспрессировать высокие уровни LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4.

[484] В некоторых вариантах осуществления с учетом таких параметров можно идентифицировать или выбирать индивидуумов для лечения с использованием способов, клеток, композиций и/или наборов, представленных в настоящем описании, например, с использованием клеток, экспрессирующих рекомбинантные рецепторы (например, CAR-T-клеток), модифицированных по экспрессии молекулы (например, белка), вовлеченной в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, включая молекулы, положительно или отрицательно регулируемые IDO-опосредованным катаболизмом, например, недостаточностью триптофана или накоплением кинуренина или другого метаболита триптофана. Например, в некоторых вариантах осуществления индивидуумам, опухолевые или злокачественные клетки которых экспрессируют высокие уровни LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4 или являются положительными по экспрессии LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4, можно вводить клетки, экспрессирующие рекомбинантные рецепторы, также модифицированные так, что они рекомбинантно экспрессируют молекулу (например, белок), вовлеченную в захват, транспорт и/или метаболизм триптофана, например, LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4.

2. Воздействие, персистирование и пролиферация T-клеток

[485] В некоторых вариантах осуществления параметр, ассоциированный с терапией или исходом лечения, включающий параметры, которые можно оценивать на стадиях скрининга, и/или оценки исходов лечения, и/или мониторинга исходов лечения, представляет собой или включает оценку воздействия, персистирования и пролиферации T-клеток, например, T-клеток, вводимых для T-клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления повышенное воздействие, или пролонгированную экспансию и/или персистирование клеток, и/или изменения фенотипов клеток или функциональной активности клеток, например, клеток, вводимых для иммунотерапии, например, T-клеточной терапии, в способах, представленных в настоящем описании, можно измерять посредством оценки характеристик T-клеток in vitro или ex vivo. В некоторых вариантах осуществления такие анализы можно использовать для определения или подтверждения функции T-клеток, используемых для иммунотерапии, например, T-клеточной терапии, до или после проведения одной или более стадий комбинированного лечения, представленных в настоящем описании.

[486] В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, предназначено для стимуляции воздействия клеток, например, T-клеток, вводимых для T-клеточной терапии, на индивидуума, например, посредством стимуляции их экспансии и/или персистирования с течением времени, например, посредством преодоления иммуносупрессорных эффектов или условий в микроокружении опухоли (TME).

[487] В некоторых вариантах осуществления T-клеточное терапевтическое средство проявляет повышенную или пролонгированную экспансию и/или персистирование в организме индивидуума по сравнению со способом, в котором T-клеточное терапевтическое средство вводят индивидууму в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1.

[488] В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению повышают воздействие вводимых клеток на индивидуума (например, повышенное количество клеток или длительность) и/или улучшают активность и терапевтические исходы иммунотерапии, например, T-клеточной терапии. В некоторых аспектах способы имеют преимущество, заключающееся в большем и/или более длительном воздействии клеток, экспрессирующих рекомбинантные рецепторы, например, CAR-экспрессирующих клеток, улучшении исходов лечения по сравнению с другими способами. Такие исходы могут включать выживаемость и ремиссию у пациента даже в случае индивидуумов со значительной опухолевой массой.

[489] В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, может повышать максимальное воздействие, общее воздействие и/или длительность воздействия клеток, например, T-клеток, вводимых для T-клеточной терапии, у индивидуума по сравнению с введением только T-клеток в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых аспектах введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, в контексте высокого бремени заболевания (и, таким образом, более высоких количеств антигена) повышает активность по сравнению с введением только T-клеток в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина в том же контексте, что может приводить к иммуносупрессии, анергии и/или истощению, что может предотвращать экспансию и/или персистирование клеток. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, в контексте высокого бремени заболевания снижает истощение вводимых клеток, таким образом, повышая клиническую активность по сравнению с другими способами, такими как способы, в которых вводят более высокую начальную дозу.

[490] В некоторых вариантах осуществления определяют наличие и/или количество клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR-экспрессирующих клеток, вводимых для T-клеточной терапии), у индивидуума после введения T-клеток и до, во время и/или после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых аспектах количественную ПЦР (qPCR) используют для оценки количества клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR-экспрессирующих клеток, вводимых для T-клеточной терапии) в образце крови, или сыворотки, или органа, или ткани (например, очаге заболевания, например, образце опухоли) индивидуума. В некоторых аспектах персистирование количественно анализируют как число копий ДНК или плазмиды, кодирующей рецептор, например, CAR, на микрограмм ДНК, или как количество клеток, экспрессирующих рецептор, например, экспрессирующих CAR, на микролитр образца, например, крови или сыворотки, или на общее количество мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), или лейкоцитов, или T-клеток на микролитр образца.

[491] В некоторых вариантах осуществления клетки определяют у индивидуума через или по меньшей мере через 4, 14, 15, 27 или 28 дней после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток. В некоторых аспектах клетки определяют через или по меньшей мере через 2, 4 или 6 недель, или 3, 6 или 12, 18 или 24, или 30 или 36 месяцев, или 1, 2, 3, 4, 5 или более лет после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

[492] В некоторых вариантах осуществления персистирование экспрессирующих рецептор клеток (например, CAR-экспрессирующих клеток) у индивидуума после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, является более высоким по сравнению с персистированием, которого можно было бы достичь альтернативными способами, такими как способы, включающие введение только иммунотерапевтического средства, например, введение T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, в отсутствие модулятора кинуренина.

[493] Воздействие, например, количество клеток, например, T-клеток, вводимых для T-клеточной терапии, свидетельствующее об экспансии и/или персистировании, можно указывать в терминах максимального количества клеток, воздействию которых подвергают индивидуума, длительности периода, когда детектируемые клетки или клетки превышают конкретное количество или процентную долю, площади под кривой количества клеток с течением времени и/или их комбинаций и показателей. Такие исходы можно оценивать известными способами, такими как qPCR для детекции количества копий нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, по сравнению с общим количеством нуклеиновой кислоты или ДНК в конкретном образце, например, крови, сыворотке, плазме или ткани, таком как образец опухоли, и/или проточная цитометрия, посредством которой определяют клетки, экспрессирующие рецептор, как правило, с использованием антител, специфических для рецепторов. Клеточные анализы также можно использовать для детекции количества или процента функциональных клеток, таких как клетки, способные связываться, и/или нейтрализовать, и/или индуцировать ответы, например, цитотоксические ответы, против клеток заболевания или состояния или клеток, экспрессирующих антиген, распознаваемый рецептором.

[494] В некоторых вариантах осуществления оценка наличия и/или количества T-клеток, вводимых при T-клеточной терапии, включает оценку наличия и/или количества T-клеток в очаге опухоли или вблизи него, например, в микроокружении опухоли (TME). В некоторых вариантах осуществления оценка включает определение наличия и/или количества вводимых T-клеток, инфильтрирующих опухоль, например, солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления наличие и/или количество вводимых T-клеток оценивают в биологическом образце индивидуума, например, физиологических жидкостях, таких как кровь, плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы тканей и органов или образцы опухоли включая обработанные образцы, полученные из них. В некоторых вариантах осуществления биологический образец включает выделенные клетки и/или тканевые срезы из биоптата опухоли. В некоторых вариантах осуществления оценка наличия и/или количества T-клеток, вводимых при T-клеточной терапии, включает оценку наличия и/или количества вводимых T-клеток, инфильтрирующих опухоль, в образце выделенных клеток и/или тканевых срезах из биоптата опухоли.

[495] В некоторых аспектах повышенное воздействие клеток на индивидуума включает повышенную экспансию клеток. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие рецептор клетки, например, CAR-экспрессирующие клетки, подвергаются экспансии в организме индивидуума после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, и/или после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых аспектах способы приводят к более высокой экспансии клеток по сравнению с другими способами, такими как способы, включающие введение T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, в отсутствие введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1.

[496] В некоторых аспектах способ приводит к высокой пролиферации вводимых клеток in vivo, например, измеряемой посредством проточной цитометрии. В некоторых аспектах определяют высокие пиковые доли клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления на пиковом или максимальном уровне после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, в крови или очаге заболевания индивидуума или их лейкоцитарной фракции, например, фракции PBMC или T-клеточной фракции, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80% или по меньшей мере приблизительно 90% клеток экспрессируют рекомбинантный рецептор, например, CAR.

[497] В некоторых вариантах осуществления способ приводит к максимальной концентрации в крови, или сыворотке, или другой физиологической жидкости, или органе, или ткани индивидуума по меньшей мере 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000 или 15000 копий нуклеиновой кислоты, кодирующей рецептор, например, CAR, на микрограмм ДНК или по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, или 0,9 экспрессирующих рецептор, например, CAR,-экспрессирующих, клеток на общее количество мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), общее количество мононуклеарных клеток, общее количество T-клеток или общее количество микролитров. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие рецептор, определяют как по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50 или 60% всех PBMC в крови индивидуума и/или на таком уровне в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36, 48 или 52 недель после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина или в течение 1, 2, 3, 4 или 5 или более лет после такого введения.

[498] В некоторых аспектах способ приводит к по меньшей мере 2-кратному, по меньшей мере 4-кратному, по меньшей мере 10-кратному или по меньшей мере 20-кратному повышению числа копий нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, например, CAR, на микрограмм ДНК, например, в сыворотке, плазме, крови или ткани, например, образце опухоли, индивидуума.

[499] В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие рецептор, являются детектируемыми в сыворотке, плазме, крови или ткани, например, образце опухоли, индивидуума, например, с помощью определенного способа, такого как qPCR или способ детекции на основе проточной цитометрии, через по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или более дней после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, или после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, в течение по меньшей мере или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более недель после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1.

[500] В некоторых аспектах по меньшей мере приблизительно 1×10², по меньшей мере приблизительно 1×10³, по меньшей мере приблизительно 1×10⁴, по меньшей мере приблизительно 1×10⁵, или, по меньшей мере приблизительно 1×10⁶ или, по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ или, по меньшей мере приблизительно 1×10⁷ или, по меньшей мере приблизительно 5×10⁷ или по меньшей мере приблизительно 1×10⁸ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, например, CAR-экспрессирующих клеток, и/или по меньшей мере 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 экспрессирующих рецептор клеток на микролитр, например, по меньшей мере 10 на микролитр, являются детектируемыми или присутствуют в организме индивидуума или жидкости, плазме, сыворотке, ткани или компартменте из него, например, в крови, например, периферической крови, или очаге заболевания, например, опухоли. В некоторых вариантах осуществления такое количество или концентрация клеток является детектируемой у индивидуума в течение по меньшей мере приблизительно 20 дней, по меньшей мере приблизительно 40 дней, или по меньшей мере приблизительно 60 дней, или по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев, или по меньшей мере 2 или 3 лет после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, и/или после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. Такое количество клеток можно определять способами на основе проточной цитометрии или количественной ПЦР и экстраполировать на общее количество клеток известными способами. См., например, Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177), Park et al, Molecular Therapy 15(4):825-833 (2007), Savoldo et al., JCI 121(5):1822-1826 (2011), Davila et al., (2013) PLoS ONE 8(4):e61338, Davila et al., Oncoimmunology 1(9):1577-1583 (2012), Lamers, Blood 2011 117:72-82, Jensen et al., Biol Blood Marrow Transplant 2010 September; 16(9): 1245-1256, Brentjens et al., Blood 2011 118(18):4817-4828.

[501] В некоторых аспектах число копий нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, например, число копий вектора, на 100 клеток, например, в периферической крови, или костном мозге, или другом компартменте, измеряемое посредством иммуногистохимии, ПЦР и/или проточной цитометрии, составляет по меньшей мере 0,01, по меньшей мере 0,1, по меньшей мере 1 или по меньшей мере 10 через приблизительно 1 неделю, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, приблизительно 4 недели, приблизительно 5 недель или по меньшей мере приблизительно 6 недель, или по меньшей мере приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев, или по меньшей мере 2 или 3 года после введения клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых вариантах осуществления число копий вектора, экспрессирующего рецептор, например, CAR, на микрограмм геномной ДНК составляет по меньшей мере 100, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 5000, или по меньшей мере 10000, или по меньшей мере 15000, или по меньшей мере 20000 через приблизительно 1 неделю, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели или по меньшей мере приблизительно 4 недели после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, или, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или по меньшей мере 2 или 3 года после такого введения.

[502] В некоторых аспектах рецептор, например, CAR, экспрессируемый клетками, является детектируемым посредством количественной ПЦР (qPCR) или посредством проточной цитометрии в организме индивидуума, плазме, сыворотке, крови, ткани и/или очаге заболевания, например, очаге опухоли, через по меньшей мере приблизительно 3 месяца, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 12 месяцев, по меньшей мере приблизительно 1 год, по меньшей мере приблизительно 2 года, по меньшей мере приблизительно 3 года или более 3 лет после введения клеток, например, после начала введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1.

[503] В некоторых вариантах осуществления площадь под кривой (AUC) концентрации клеток, экспрессирующих рецептор (например, CAR), в жидкости, плазме, сыворотке, крови, ткани, органе и/или очаге заболевания, например, очаге опухоли, индивидуума с течением времени после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, и/или после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, является более высокой по сравнению с площадью под кривой, достигаемой с использованием альтернативной схемы дозирования, в которой индивидууму вводят T-клетки, например, CAR-экспрессирующие T-клетки, в отсутствие введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1.

[504] В некоторых аспектах способ приводит к высокой пролиферации in vivo вводимых клеток, например, измеряемой посредством проточной цитометрии. В некоторых аспектах определяют высокие пиковые доли клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления на пиковом или максимальном уровне после введения T-клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, в крови, плазме, сыворотке, ткани или очаге заболевания индивидуума или их лейкоцитарной фракции, например, фракции PBMC или T-клеточной фракции, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, или, по меньшей мере приблизительно 90% клеток экспрессируют рекомбинантный рецептор, например, CAR.

3. Функциональная активность T-клеток

[505] В некоторых вариантах осуществления параметры, ассоциированные с терапией или исходом лечения, включающие параметры, которые можно оценивать для стадии скрининга, и/или оценки исходов лечения, и/или мониторинга исходов лечения, включают одно или более из активности, фенотипа, пролиферации или функции T-клеток. В некоторых вариантах осуществления можно использовать любые из анализов, известных в этой области, для оценки активности, фенотипов, пролиферации и/или функции T-клеток, например, T-клеток, вводимых для T-клеточной терапии. До и/или после введения клеток и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина в некоторых вариантах осуществления измеряют биологическую активность популяций сконструированных клеток, например, с использованием любого из ряда известных способов. Параметры, подлежащие оценке, включают специфическое связывание сконструированной или природной T-клетки или другой иммунной клетки с антигеном in vivo, например, посредством визуализации, или ex vivo, например, посредством ELISA или проточной цитометрии. В определенных вариантах осуществления способность сконструированных клеток разрушать клетки-мишени можно измерять с использованием любого подходящего, известного в этой области способа, такого как анализы цитотоксичности, описанные, например, в Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) и Herman et al., J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). В определенных вариантах осуществления биологическую активность клеток измеряют посредством анализа экспрессии и/или секреции одного или более цитокинов, таких как CD107a, ИФНγ, ИЛ-2, ГМ-КСФ и ФНО, и/или посредством оценки цитолитической активности.

[506] В некоторых вариантах осуществления анализы на активность, фенотипы, пролиферацию и/или функцию T-клеток, например, T-клеток, вводимых для T-клеточной терапии, включают, в качестве неограничивающих примеров, ELISPOT, ELISA, анализы пролиферации клеток, анализ цитотоксических лимфоцитов (CTL), анализ связывания с T-клеточным эпитопом, антигеном или лигандом, или окрашивание на внутриклеточные цитокины, анализы пролиферации, анализы секреции лимфокинов, прямые анализы цитотоксичности и анализы предельных разведений. В некоторых вариантах осуществления можно измерять пролиферативные ответы T-клеток, например, посредством включения ³H-тимидина, BrdU (5-бром-2'-дезоксиуридина) или 2'-дезокси-5-этинилуридина (EdU) в их ДНК или анализов разведения красителей с использованием таких красителей как сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина (CFSE), CellTrace Violet или мембранный краситель PKH26.

[507] В некоторых вариантах осуществления оценка активности, фенотипов, пролиферации и/или функции T-клеток, например, T-клеток, вводимых для T-клеточной терапии, включают измерение продукции цитокинов T-клетками и/или измерение продукции цитокинов в биологическом образце индивидуума, например, образцах плазмы, сыворотки, крови и/или ткани, например, образцах опухоли. В некоторых случаях такие измеряемые цитокины могут включать, в качестве неограничивающих примеров, интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерферон-гамма (ИФНγ), интерлейкин-4 (ИЛ-4), ФНО альфа (ФНО), интерлейкин-6 (ИЛ-6), интерлейкин-10 (ИЛ-10), интерлейкин-12 (ИЛ-12), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), CD107a и/или TGF-бета (TGFβ). Анализы для измерения цитокинов хорошо известны в этой области и включают, в качестве неограничивающих примеров, ELISA, окрашивание на внутриклеточные цитокины, цитометрический анализ с использованием микрочастиц, RT-ПЦР, ELISPOT, проточную цитометрию и биологические анализы, в которых клетки, отвечающие на соответствующий цитокин, тестируют на отвечаемость (например, пролиферацию) в присутствие тестируемого образца.

[508] В некоторых вариантах осуществления оценка активности, фенотипов, пролиферации и/или функции T-клеток, например, T-клеток, вводимых для T-клеточной терапии, включают оценку фенотипов клеток, например, экспрессии конкретных поверхностных клеточных маркеров. В некоторых вариантах осуществления T-клетки, например, T-клетки, вводимые для T-клеточной терапии, оценивают на экспрессию маркеров активации T-клеток, маркеров истощения T-клеток и/или маркеры дифференцировки T-клеток. В некоторых вариантах осуществления фенотип клеток оценивают до введения. В некоторых вариантах осуществления фенотип клеток оценивают после введения. Маркеры активации T-клеток, маркеры истощения T-клеток, и/или маркеры дифференцировки T-клеток, подлежащие оценке, включают любые маркеры, известные в этой области, для конкретных субпопуляций T-клеток, например, CD25, CD38, лейкоцитарный антиген человека-DR (HLA-DR), CD69, CD44, CD137, KLRG1, CD62L^low, CCR7^low, CD71, CD2, CD54, CD58, CD244, CD160, белок программируемой гибели клеток 1 (PD-1), белок гена активации лимфоцитов 3 (LAG-3), иммуноглобулиновый домен T-клетки и белок с муциновым доменом 3 (TIM-3), антиген цитотоксических T-лимфоцитов 4 (CTLA-4), B- и T-лимфоцитарный аттенюатор (BTLA) и/или T-клеточный иммуноглобулиновый и иммунорецепторный тирозиновый ингибиторный мотив (TIGIT) (см., например, Liu et al., Cell Death and Disease (2015) 6, e1792). В некоторых вариантах осуществления оцениваемый поверхностный клеточный маркер является CD25, PD-1 и/или TIM-3. В некоторых вариантах осуществления оцениваемый поверхностный клеточный маркер является CD25.

[509] В некоторых аспектах определение уровней экспрессии включает осуществление анализа in vitro. В некоторых вариантах осуществления анализ in vitro является иммунологическим анализом, анализом на основе аптамеров, гистологическим или цитологическим анализом или анализом уровня экспрессии мРНК. В некоторых вариантах осуществления параметр или параметры для одного или более факторов, эффекторов, ферментов и/или поверхностных маркеров определяют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), иммуноблоттинга, иммунопреципитации, радиоиммунологического анализа (RIA), иммуноокрашивания, проточной цитометрии, поверхностного плазмонного резонанса (SPR), анализа хемилюминесценции, иммунохроматографического анализа, анализа ингибирования или анализа авидности. В некоторых вариантах осуществления цитокины и/или поверхностные маркеры определяют с использованием связывающего реагента, специфически связывающегося по меньшей мере с одним биомаркером. В некоторых случаях связывающий реагент является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, аптамером или зондом нуклеиновой кислоты.

[510] В некоторых вариантах осуществления активность, фенотипы, пролиферацию и/или функцию сконструированных клеток, например, при комбинированном лечении, и/или клеток, сконструированных так, что они содержат модификацию экспрессии белка, ассоциированного с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетках, например, в ответ на недостаточность триптофана или накопление кинуренина или другого метаболита триптофана, и/или белка, вовлеченного в захват или транспорт триптофана в клетки, также можно оценивать с использованием схожих анализов, например, функциональных анализов и/или анализов in vitro, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления активность, фенотипы, пролиферацию и/или функцию сконструированных клеток можно тестировать после культивирования в триптофан-содержащих средах с добавлением добавочного триптофана или без него или в триптофан-несодержащих средах с добавлением добавочного триптофана или без него. В некоторых вариантах осуществления анализы можно осуществлять после культивирования в условиях с низким содержанием триптофана, или условиях триптофанового голодания, или в триптофан-несодержащих средах.

[511] В некоторых вариантах осуществления оценка одного или более из активности, фенотипа, пролиферации или функции T-клеток включает оценку ответа на аминокислотное голодание, например, истощение триптофана или триптофановое голодание. В некоторых вариантах осуществления оценка активности, фенотипа, пролиферации или функции T-клеток включает оценку истощения, анергии или гибели эффекторных T-клеток, супрессии противоопухолевых иммунных ответов или толерантности к опухолевым антигенам, функциональной активности и/или выживания в ответ на истощение триптофана и/или триптофановое голодание. В некоторых вариантах осуществления оценка активности, фенотипа, пролиферации или функции T-клеток включает оценку T-клеток в условиях длительного триптофанового голодания, например, в условиях триптофанового голодания, которые могут влиять на способность T-клеток восстанавливаться после голодания и/или реверсировать эффект голодания, например, задержку или прекращение роста и/или функциональной активности. В некоторых вариантах осуществления оценка одного или более из активности, фенотипа, пролиферации или функции T-клеток включает оценку восстановления после триптофанового голодания или реверсирования эффекта триптофанового голодания, например, длительного триптофанового голодания. В некоторых вариантах осуществления восстановление после триптофанового голодания включает восстановление исходной или стационарной активности T-клеток, например, оцениваемое с помощью любых функциональных анализов T-клеток, представленных в настоящем описании.

4. Бремя заболевания

[512] В некоторых вариантах осуществления параметры, ассоциированные с терапией или исходом лечения, включающие параметры, которые можно оценивать на стадиях скрининга, и/или оценки исходов лечения, и/или мониторинга исходов лечения, включает опухолевую массу или бремя заболевания. Введение иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, может снижать или предотвращать экспансию или бремя заболевания или состояния у индивидуума. Например, если заболевание или состояние является опухолью, с помощью способов, как правило, снижают размер опухоли, объем, метастазирование, процентную долю бластных клеток в костном мозге или детектируемое на молекулярном уровне злокачественное новообразование и/или улучшают прогноз, или выживаемость, или другой симптом, ассоциированный с опухолевой массой. В некоторых вариантах осуществления введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, регулируют по времени в отношении снижения бремени и/или рецидивирования после введения иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство.

[513] В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, вводят индивидууму после введения иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающего терапевтического средства, при этом, вероятно, опухолевую массу у индивидуума снижают посредством введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного тераевтического средства. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство, такое как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство, вводят индивидууму после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, при этом, вероятно, опухолевую массу у индивидуума снижают посредством введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых вариантах осуществления необязательно, чтобы опухолевая масса фактически снижалась у всех индивидуумов перед введением иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающего терапевтическое средство, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, но опухолевая масса должна быть снижена в среднем у подвергаемых лечению индивидуумов, например, с учетом клинических данных, при этом у большинства индивидуумов, подвергаемых такому комбинированному лечению, наблюдают снижение опухолевой массы, например, снижение опухолевой массы наблюдают по меньшей мере у 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более индивидуумов, подвергаемых комбинированному лечению.

[514] В некоторых вариантах осуществления после снижения бремени заболевания посредством иммунотерапии, например, T-клеточной терапии, или вероятного снижения посредством иммунотерапии, например, T-клеточной терапии, индивидууму вводят модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, таким образом, дополнительно снижая и/или устраняя заболевание или его симптом или исход или предотвращая его экспансию или прогрессирование, повышая выживаемость, пролиферацию и/или экспансию вводимых T-клеток. В некоторых вариантах осуществления после снижения бремени заболевания посредством введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, или вероятного снижения посредством введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, индивидууму вводят модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1, иммунотерапевтическое средство, такое как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство, таким образом, дополнительно снижая и/или устраняя заболевание или его симптом или исход или предотвращая его экспансию или прогрессирование, повышая выживаемость, пролиферацию и/или экспансию вводимых T-клеток. Контекст сниженного бремени заболевания на момент введения иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающего терапевтического средства, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, в некоторых аспектах снижает вероятность истощения вводимых клеток, например, CAR-экспрессирующих T-клеток, таким образом, улучшая активность.

[515] Бремя заболевания может включать общее количество клеток заболевания в организме индивидуума или в органе, ткани или физиологической жидкости индивидуума, таких как орган или ткань опухоли или другой локализации, например, свидетельствующей о метастазировании. Например, опухолевые клетки можно определять и/или подсчитывать в крови, лимфе или костном мозге в контексте конкретных гемобластозов. В некоторых вариантах осуществления бремя заболевания может включать массу опухоли, количество или распространенность метастазов и/или процентную долю бластных клеток в костном мозге.

[516] Заболевания, состояния и нарушения включают опухоли, включая солидные опухоли, гемобластозы и меланомы, локализованные и метастазирующие опухоли, инфекционные заболевания, такие как инфекция вирусом или другим патогеном, например, ВИЧ, HCV, HBV, CMV, HPV, паразитарное заболевание и аутоиммунные и воспалительные заболевания. В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние является опухолью, злокачественным новообразованием, неоплазией или другим пролиферативным заболеванием или нарушением. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет миелому, лимфому или лейкоз. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет неходжкинскую лимфому (NHL), острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL) или миелому, например, множественную миелому (MM). В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет MM или DBCBL. Такие заболевания включают, в качестве неограничивающих примеров, лейкоз, лимфому, например, острый миелоидный (или миелогенный) лейкоз (AML), хронический миелоидный (или миелогенный) лейкоз (CML), острый лимфоцитарный (или лимфобластный) лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз (HCL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому из клеток маргинальной зоны, лимфому Беркитта, лимфому Ходжкина (HL), неходжкинскую лимфому (NHL), анапластическую крупноклеточную лимфому (ALCL), фолликулярную лимфому, рефрактерную фолликулярную лимфому, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL) и множественную миелому (MM).

[517] В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет солидную опухоль.

[518] В случае MM, примеры параметров, подлежащих оценке в отношении степени бремени заболевания, включают такие параметры, как количество клональных плазматических клеток (например, >10% при биопсии костного мозга или в любом количестве при биопсии других тканей; плазмоцитома), наличие моноклонального белка (парапротеина) в сыворотке или моче, признаки циркуляторно-ишемического поражения органов, относящегося к нарушению плазматических клеток (например, гиперкальцемия (скорректированный кальций >2,75 ммоль/л); почечная недостаточность, приписываемая миеломе; анемия (гемоглобин <10 г/дл); и/или повреждения костей (литические повреждения или остеопороз с компрессионными переломами)).

[519] В случае DLBCL примеры параметров, подлежащих оценке в отношении степени бремени заболевания, включают такие параметры, как клеточная морфология (например, центробластные, иммунобластные и анапластические клетки), экспрессия генов, экспрессия мкРНК и экспрессия белка (например, экспрессия BCL2, BCL6, MUM1, LMO2, MYC и p21).

[520] В случае лейкоза степень бремени заболевания можно определять посредством оценки остаточного лейкоза в крови или костном мозге. В некоторых вариантах осуществления у индивидуума наблюдают морфологические признаки заболевания, если определяют 5% более бластных клеток в костном мозге, например, определяемых с помощью световой микроскопии. В некоторых вариантах осуществления у индивидуума наблюдают полную или клиническую ремиссию, если определяют менее 5% бластных клеток в костном мозге.

[521] В некоторых вариантах осуществления в случае лейкоза у индивидуума могут наблюдать полную ремиссию, но присутствует небольшая доля морфологически недетектируемых (с помощью световой микроскопии) остаточных лейкозных клеток. Указывают, что у индивидуума наблюдают минимальную остаточную болезнь (MRD), если у индивидуума определяют менее 5% бластных клеток в костном мозге и детектируемое на молекулярном уровне злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления детектируемое на молекулярном уровне злокачественное новообразование можно оценивать с использованием любых из множества молекулярных способов, делающих возможной чувствительную детекцию небольшого количества клеток. В некоторых аспектах такие способы включают анализы ПЦР, с помощью которых можно определять уникальную перестановку генов Ig/T-клеточного рецептора или слитые транскрипты, образующиеся при транслокации хромосом. В некоторых вариантах осуществления можно использовать проточную цитометрию для идентификации злокачественных клеток с учетом лейкоз-специфических иммунофенотипов. В некоторых вариантах осуществления с помощью молекулярной детекции злокачественного новообразования можно определять всего лишь 1 лейкозную клетку на 100000 нормальных клеток. В некоторых вариантах осуществления у индивидуума наблюдают MRD, детектируемую на молекулярном уровне, если определяют по меньшей мере 1 лейкозную клетку или более на 100000 клеток, например, посредством ПЦР или проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления бремя заболевания у индивидуума является недетектируемым на молекулярном уровне или MRD^-, таким образом, что в некоторых случаях нельзя определить лейкозные клетки у индивидуума с использованием ПЦР или проточной цитометрии.

[522] В некоторых вариантах осуществления способы и/или введение иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее терапевтическое средство, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, снижает бремя заболевания по сравнению с бременем заболевания непосредственно перед введением иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых аспектах введение иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, снижает бремя заболевания, например, опухолевую массу. В некоторых вариантах осуществления с помощью модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, осуществляют снижение, например, дальнейшее снижение, бремени заболевания.

[523] В некоторых аспектах введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, снижает бремя заболевания, например, опухолевую массу. В некоторых вариантах осуществления с помощью введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, осуществляют снижение, например, дальнейшее снижение, бремени заболевания.

[524] В некоторых аспектах введение иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, может предотвращать повышение бремени заболевания, и об этом может свидетельствовать отсутствие изменения бремени заболевания.

[525] В некоторых аспектах заболевание или состояние сохраняется после введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, и/или введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, недостаточно для эрадикации заболевания или состояния у индивидуума.

[526] В некоторых аспектах введение иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, снижает бремя заболевания по сравнению с бременем заболевания непосредственно перед введением иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, или непосредственно перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых аспектах, например, в контексте рецидива, с помощью введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, осуществляют снижение бремени заболевания по сравнению с пиковым уровнем бремени заболевания после введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства.

[527] В некоторых вариантах осуществления с помощью способа снижают бремя заболевания или состояния, например, количество опухолевых клеток, размер опухоли, длительность выживания пациента или бессобытийную выживаемость, в большей степени и/или на больший период времени по сравнению со снижением, которое можно было бы наблюдать при использовании сравнимого способа с использованием альтернативной терапии, такого как способ, в котором индивидууму вводят иммунотерапевтическое средство, например, только T-клеточное терапевтическое средство, в отсутствие введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых вариантах осуществления бремя заболевания снижают в большей степени или на больший период времени после комбинированного лечения с введением иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, и модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, по сравнению со снижением, которого можно было бы достичь посредством введения каждого из средств в отдельности, например, введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, индивидууму, которому не вводили иммунотерапевтическое средство, например, T-клеточное терапевтическое средство; или введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, индивидууму, которому не вводили модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1.

[528] В некоторых вариантах осуществления определяют, оценивают или измеряют бремя заболевания или состояния у индивидуума. Бремя заболевания в некоторых аспектах можно определять посредством детекции общего количества ассоциированных с заболеванием клеток, например, опухолевых клеток, в организме индивидуума или в органе, ткани или физиологической жидкости индивидуума, такой как кровь или сыворотка. В некоторых вариантах осуществления бремя заболевания, например, опухолевую массу, оценивают посредством измерения массы солидной опухоли и/или количества или распространения метастазов. В некоторых аспектах оценивают выживаемость индивидуума, выживаемость в пределах конкретного периода времени, степень выживаемости, наличие или длительность бессобытийной или бессимптомной выживаемости или безрецидивную выживаемость. В некоторых вариантах осуществления оценивают любой симптом заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления определяют меру бремени заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления примеры параметров, подлежащих определению, включают конкретные клинические исходы, свидетельствующие об улучшении заболевания или состояния, например, опухоли. Такие параметры включают: длительность контроля заболевания, включая полный ответ (CR), частичный ответ (PR) или стабильное заболевание (SD) (см., например, руководство "Критерии оценки ответа при солидных опухолях" (RECIST)), частоту объективных ответов (ORR), выживаемость без прогрессирования (PFS) и общую выживаемость (OS). Можно устанавливать конкретные пороговые значения параметров для определения активности способа комбинированного лечения, представленного в настоящем описании.

[529] В некоторых аспектах бремя заболевания измеряют или определяют перед введением иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, после введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, но перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, но перед введением иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, и/или после введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, и модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В контексте многократного проведения одной или более стадий комбинированного лечения бремя заболевания в некоторых вариантах осуществления можно измерять до или после проведения любой из стадий, введения доз и/или проведения циклов введения, или между проведением любых из стадий, введением доз и/или проведением циклов введения.

[530] В некоторых вариантах осуществления бремя снижается на, или по меньшей мере на, или приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 процентов после введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства. В некоторых аспектах введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, приводит к дальнейшему снижению бремени заболевания, например, опухолевой массы, например, на или приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 процентов по сравнению со временем непосредственно перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, или, в целом, по сравнению со временем непосредственно перед иммунотерапией, например, T-клеточной терапией. В некоторых вариантах осуществления бремя снижается на, или по меньшей мере на, или приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 процентов после введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1. В некоторых аспектах введение иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, приводит к дальнейшему снижению бремени заболевания, например, опухолевой массы, например, на или приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 процентов по сравнению со временем непосредственно перед введением иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, или в целом по сравнению со временем непосредственно перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1.

[531] В некоторых вариантах осуществления бремя заболевания, размер опухоли, объем опухоли, массу опухоли и/или опухолевую нагрузку или объем снижается после введения иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, по меньшей мере на или приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более по сравнению со временем непосредственно перед введением иммунотерапевтического средства, например, T-клеточного терапевтического средства, или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1.

[532] В некоторых вариантах осуществления снижение бремени заболевания с помощью способа включает индукцию морфологически полной ремиссии, например, оцениваемой через 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца или более 3 месяцев после введения, например, начала введения, комбинированного лекарственного средства.

[533] В некоторых аспектах анализ на минимальную остаточную болезнь, например, измеряемую посредством многопараметрической проточной цитометрии, является отрицательным, или уровень минимальной остаточной болезни составляет менее приблизительно 0,3%, менее приблизительно 0,2%, менее приблизительно 0,1% или менее приблизительно 0,05%.

[534] В некоторых вариантах осуществления бессобытийную выживаемость или общую выживаемость индивидуума улучшают с помощью способов по сравнению с другими способами. Например, в некоторых вариантах осуществления бессобытийная выживаемость или вероятность выживаемости для индивидуумов, подвергнутых лечению с помощью способов, через 6 месяцев после использования способа комбинированного лечения, представленного в настоящем описании, составляет более приблизительно 40%, более приблизительно 50%, более приблизительно 60%, более приблизительно 70%, более приблизительно 80%, более приблизительно 90% или более приблизительно 95%. В некоторых аспектах общая выживаемость составляет более приблизительно 40%, более приблизительно 50%, более приблизительно 60%, более приблизительно 70%, более приблизительно 80%, более приблизительно 90% или более приблизительно 95%. В некоторых вариантах осуществления у индивидуума, подвергнутого лечению с использованием способов, наблюдают бессобытийную выживаемость, безрецидивную выживаемость или выживаемость до по меньшей мере 6 месяцев или по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет. В некоторых вариантах осуществления улучшают время до прогрессирования, например, до времени до прогрессирования более или приблизительно 6 месяцев или по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет.

[535] В некоторых вариантах осуществления после лечения с помощью способа вероятность рецидивирования снижают по сравнению с другими способами. Например, в некоторых вариантах осуществления вероятность рецидивирования через 6 месяцев после использования способа комбинированного лечения составляет менее приблизительно 80%, менее приблизительно 70%, менее приблизительно 60%, менее приблизительно 50%, менее приблизительно 40%, менее приблизительно 30%, менее приблизительно 20% или менее приблизительно 10%.

[536] В некоторых аспектах снижение бремени заболевания, например, циторедукция опухоли, после введения комбинированного лечения, снижает токсичность или токсические исходы после введения. Токсические исходы после снижения опухолевой массы можно оценивать с использованием любых из известных в этой области способов.

[537] В некоторых аспектах снижение бремени заболевания, например, циторедукция опухоли, являющееся результатом способов по изобретению, улучшает персистирование клеток, например, T-клеток, вводимых для иммунотерапии, например, T-клеточной терапии, у индивидуума. Например, в некоторых аспектах введение комбинированного лекарственного средства, например, введение иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающее средство, и модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, снижает бремя заболевания, например, опухолевую массу, таким образом, что клетки, вводимые при комбинированном лечении, персистируют в течение большего периода времени, чем клетки, вводимые с использованием других способов терапии, таких как введение только иммунотерапевтического средства, такого как T-клеточное терапевтическое средство (например, CAR-экспрессирующие T-клетки) или T-клетки-привлекающего терапевтическое средство, в отсутствие введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

В некоторых аспектах повышенная или пролонгированная экспансия и/или персистирование дозы клеток у индивидуума, вводимых с модулятором метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитором IDO1, ассоциирована с благоприятным эффектом в отношении связанных с опухолью исходов у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления связанный с опухолью исход включает снижение опухолевой массы или снижение количества бластных клеток в костном мозге у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления опухолевая масса снижается на, или по меньшей мере на, или приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 процентов после введения с помощью способа. В некоторых вариантах осуществления бремя заболевания, размер опухоли, объем опухоли, массу опухоли и/или опухолевую нагрузку или объем снижают после введения дозы клеток по меньшей мере на или приблизительно на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с индивидуумом, которого подвергали лечению с помощью способа, невключающего введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1.

IV. T-КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ И КОНСТРУИРОВАНИЕ КЛЕТОК

[538] В некоторых вариантах осуществления T-клеточная терапия для использования в способах комбинированного лечения по изобретению включает введение сконструированных клеток, экспрессирующих рекомбинантные рецепторы, предназначенные для распознавания и/или специфического связывания с молекулами, ассоциированными с заболеванием или состоянием, и приводящих к ответу, такому как иммунный ответ, против таких молекул после связывания с такими молекулами. Рецепторы могут включать химерные рецепторы, например, химерные антигенные рецепторы (CAR), и другие трансгенные антигенные рецепторы, включая трансгенные T-клеточные рецепторы (TCR).

[539] В некоторых вариантах осуществления клетки содержат или сконструированы так, чтобы содержать сконструированный рецептор, например, сконструированный антигенный рецептор, такой как химерный антигенный рецептор (CAR), или T-клеточный рецептор (TCR). Изобретение также относится к популяциям таких клеток, композициям, содержащим такие клетки и/или обогащенным такими клетками, таким, в которых клетки конкретного типа, такие как T-клетки или CD8⁺ или CD4+-клетки, обогащены или подвергнуты селекции. Композиции включают фармацевтические композиции и составы для введения, такие как композиции для адоптивной клеточной терапии. Изобретение также относится к терапевтическим способам введения клеток и композиций индивидуумам, например, пациентам.

[540] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более нуклеиновых кислот, встроенных посредством генетической инженерии, и, таким образом, экспрессируют рекомбинантные или генетически сконструированные продукты таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления перенос генов осуществляют, сначала стимулируя клетки, например, комбинируя их со стимулом, индуцирующим ответ, такой как пролиферация, выживание и/или активация, например, измеряемые по экспрессии цитокина или маркера активации, с последующей трансдукцией активированных клеток и выращиванием в культуре до количеств, достаточных для клинического использования.

[541] В некоторых вариантах осуществления, как описано, клетки дополнительно конструируют так, чтобы они содержали модификацию экспрессии белка, ассоциированного с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетках, например, в ответ на недостаточность триптофана или накопление кинуренина или другого метаболита триптофана, и/или вовлеченного в захват или транспорт триптофана в клетки. В некоторых вариантах осуществления модификация включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования и/или эктопическую экспрессию молекулы или его функциональной или каталитически активной части или варианта, вовлеченных в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, такую как рекомбинантная, достигнутая посредством конструирования и/или эктопическая экспрессия mTOR или протеинкиназы C тета (PKC-Θ) или их функциональной или каталитически активной части или варианта. В некоторых вариантах осуществления модификация включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования и/или эктопическую экспрессию молекулы или его функциональной или каталитически активной части или варианта, вовлеченных в захват или транспорт триптофана в клетки, например, одного или более транспортеров аминокислот.

[542] В некоторых вариантах осуществления модификации включают сниженную экспрессию молекулы или ее функциональной или каталитически активной части или варианта, вовлеченных в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в сконструированных клетках, такую как сниженная экспрессия киназы GCN2, Blimp-1 (PRDM1), арил-углеводородного рецептора (AHR) или ядерного транспортера AHR (ARNT) или его функциональной или каталитически активной части или варианта. В некоторых случаях сниженная экспрессия является результатом нарушенной экспрессии гена белка. В некоторых аспектах экспрессия снижена по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с экспрессией в клетке в отсутствие модификации.

A. Рекомбинантные рецепторы

[543] Клетки, как правило, экспрессируют рекомбинантные рецепторы, такие как антигенные рецепторы, включая функциональные не-TCR антигенные рецепторы, например, химерные антигенные рецепторы (CAR), и другие антигенсвязывающие рецепторы, такие как трансгенные T-клеточные рецепторы (TCR). Также рецепторы включают другие химерные рецепторы. В некоторых вариантах осуществления другие химерные рецепторы включают химерные рецепторы аутоантител (CAAR), таких как любые из описанных в публикации патентной заявки США № 2017/0051035.

1. Химерные антигенные рецепторы (CAR)

[544] Примеры антигенных рецепторов, включая CAR, и способы конструирования и встраивания таких рецепторов в клетки, включают описываемые, например, в публикациях международных патентных заявок №№ WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, публикациях патентных заявок США №№ US2002131960, US2013287748, US20130149337, патентах США №№ 6451995, 7446190, 8252592, 8339645, 8398282, 7446179, 6410319, 7070995, 7265209, 7354762, 7446191, 8324353 и 8479118, европейской патентной заявке № EP2537416 и/или в Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4): 388-398 (2013); Davila et al., PLoS ONE 8(4): e61338 (2013); Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 24(5): 633-39 (2012); Wu et al., Cancer, 18(2): 160-75 (2012). В некоторых аспектах антигенные рецепторы включают CAR, как описано в патенте США № 7446190, и описываемые в публикации международной патентной заявки № WO/2014055668 A1. Примеры CAR включают CAR, как описано в любой из указанных выше публикациях, таких как WO2014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США № 7446190, патент США № 8389282, Kochenderfer et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al., J. Immunother. 35(9): 689-701 (2012); и Brentjens et al., Sci Transl Med. 5(177) (2013). См. также WO2014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США № 7446190 и патент США № 8389282. Химерные рецепторы, такие как CAR, как правило, включают внеклеточный антигенсвязывающий домен, такой как часть молекулы антитела, как правило, вариабельной области тяжелой цепи (V_H) и/или вариабельной области легкой цепи (V_L) антитела, например, scFv-фрагмент антитела.

[545] В некоторых вариантах осуществления антиген, на который направлен рецептор, является полипептидом. В некоторых вариантах осуществления он является углеводом или другой молекулой. В некоторых вариантах осуществления антиген селективно экспрессируется или гиперэкспрессируется на клетках заболевания или состояния, например, опухолевых или патогенных клетках, по сравнению с нормальными или неподвергающимися направленному воздействию клетками или тканями. В других вариантах осуществления антиген экспрессируется на нормальных клетках и/или сконструированных клетках.

[546] Антигены, на которые направлены рецепторы, в некоторых вариантах осуществления включают орфанный тирозинкиназный рецептор ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелин, CEA, и поверхностный антиген вируса гепатита B, рецептор фолата альфа, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, или 4, FBP, фетальный рецептор ацетилхолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, ИЛ-22R-альфа, ИЛ-13R-альфа 2, kdr, каппа-легкую цепь, антиген Льюиса Y, молекулу адгезии клеток L1, MAGE-A1, мезотелин, MUC1, MUC16, PSCA, лиганды NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкоэмбриональный антиген, ROR1, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбриональный антиген (CEA), простатспецифический антиген, PSMA, Her2/neu, рецептор эстрогена, рецептор прогестерона, эфрин B2, CD123, c-Met, GD-2, и MAGE A3, CE7, белок опухоли Вильмса 1 (WT-1), циклин, такой как циклин A1 (CCNA1), и/или биотинилированные молекулы, и/или молекулы, экспрессируемые ВИЧ, HCV, HBV или другими патогенами.

[547] В некоторых вариантах осуществления CAR связывается с патоген-специфическим антигеном. В некоторых вариантах осуществления CAR является специфическим для вирусных антигенов (таких как ВИЧ, HCV, HBV, и т.д.), бактериальных антигенов и/или паразитарных антигенов.

[548] В некоторых вариантах осуществления антительная часть рекомбинантного рецептора, например, CAR, дополнительно включает, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина, такую как шарнирная область, например, шарнирная область IgG4, и/или C_H1/C_L, и/или Fc-область. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть принадлежит IgG человека, такому как IgG4 или IgG1. В некоторых аспектах часть константной области служит в качестве спейсерной области между антигенраспознающим компонентом, например, scFv, и трансмембранным доменом. Спейсер может иметь длину, обеспечивающую повышенную отвечаемость клетки после связывания антигена по сравнению с отсутствием спейсера. Примеры спейсеров, например, шарнирные области, включают спейсеры, описанные в публикации международной патентной заявки № WO2014031687. В некоторых примерах спейсер имеет длину или имеет длину приблизительно 12 аминокислот или не более 12 аминокислот. Примеры спейсеров включают спейсеры, содержащие по меньшей мере приблизительно от 10 до 229 аминокислот, приблизительно от 10 до 200 аминокислот, приблизительно от 10 до 175 аминокислот, приблизительно от 10 до 150 аминокислот, приблизительно от 10 до 125 аминокислот, приблизительно от 10 до 100 аминокислот, приблизительно от 10 до 75 аминокислот, приблизительно от 10 до 50 аминокислот, приблизительно от 10 до 40 аминокислот, приблизительно от 10 до 30 аминокислот, приблизительно от 10 до 20 аминокислот или приблизительно от 10 до 15 аминокислот, включая любое целое число между конечными точками любого из указанных диапазонов. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область содержит приблизительно 12 аминокислот или менее, приблизительно 119 аминокислот или менее или приблизительно 229 аминокислот или менее. Примеры спейсеров включают шарнирную область IgG4 в отдельности, шарнирную область IgG4, соединенную с доменами C_H2 и C_H3, или шарнирную область IgG4, соединенную с доменом CH3. Неограничивающие примеры спейсеров включают спейсеры, описываемые в Hudecek et al., Clin. Cancer Res., 19:3153 (2013), публикации международной патентной заявке № WO2014031687, патенте США № 8822647 или опубликованной заявке № US2014/0271635.

[549] В некоторых вариантах осуществления константная область или часть принадлежит IgG человека, такому как IgG4 или IgG1. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность ESKYGPPCPPCP (приведенную в SEQ ID NO: 1) и кодируется последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть принадлежит IgD. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к любой из SEQ ID NO: 1, 3, 4 или 5.

[550] Этот антигенраспознающий домен, в основном, соединяют с одним или более внутриклеточными сигнальными компонентами, такими как сигнальные компоненты, имитирующие активацию через комплекс антигенного рецептора, такого как комплекс TCR, в случае CAR, и/или сигнал через другой рецептор поверхности клетки. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий компонент (например, антитело) соединяют с одним или более трансмембранными и внутриклеточными сигнальными доменами. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен подвергают слиянию с внеклеточным доменом. В одном из вариантов осуществления используют трансмембранный домен, в природе ассоциированный с одним из доменов рецептора, например, CAR. В некоторых случаях, трансмембранный домен выбирают или модифицируют посредством замены аминокислоты во избежание связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или других белков поверхности мембраны для минимизации взаимодействий с другими членами рецепторного комплекса.

[551] В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен получают из природного или синтетического источника. Если источник является природным, в некоторых аспектах домен получают из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные области включают области, полученные из (т.е. содержащие, по меньшей мере, трансмембранные области) альфа-, бета- или дзета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3 эпсилон, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137 или CD154. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен является синтетическим. В некоторых аспектах синтетический трансмембранный домен содержит преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых аспектах триплет из фенилаланина, триптофана и валина будут обнаруживать на каждом конце синтетического трансмембранного домена. В некоторых вариантах осуществления соединение осуществляют посредством линкеров, спейсеров и/или трансмембранных доменов.

[552] Внутриклеточные сигнальные домены включают домены, имитирующие передачу сигнала через природный антигенный рецептор, передачу сигнала через такой рецептор в комбинации с костимуляторным рецептором и/или передачу сигнала только через костимуляторный рецептор. В некоторых вариантах осуществления присутствует короткий олиго- или полипептидный линкер, например, линкер от 2 до 10 аминокислот в длину, такой как линкер, содержащий глицины и серины, например, дублет глицин-серин, и он образует соединение между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом CAR.

[553] Рецептор, например, CAR, как правило, включает по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный компонент или компоненты. В некоторых вариантах осуществления рецептор включает внутриклеточный компонент комплекса TCR, такой как цепь CD3 TCR, опосредующая активацию и цитотоксичность T-клеток, например, дзета-цепь CD3. Таким образом, в некоторых аспектах антигенсвязывающую часть соединяют с одним или более модулями передачи сигнала в клетке. В некоторых вариантах осуществления модули передачи сигнала в клетке включают трансмембранный домен CD3, внутриклеточные сигнальные домены CD3 и/или трансмембранные домены других CD. В некоторых вариантах осуществления рецептор, например, CAR, дополнительно включает часть одной или более дополнительных молекул, таких как Fc-рецептор γ, CD8, CD4, CD25 или CD16. Например, в некоторых аспектах CAR или другой химерный рецептор включает химерную молекулу между CD3-дзета (CD3-ζ) или Fc-рецептором γ и CD8, CD4, CD25 или CD16.

[554] В некоторых вариантах осуществления после лигирования CAR или другого химерного рецептора цитоплазматический домен или внутриклеточный сигнальный домен рецептора активирует по меньшей мере одну из нормальных эффекторных функций или ответов иммунной клетки, например, T-клетки, сконструированной для экспрессии CAR. Например, в некоторых случаях CAR индуцирует функцию T-клетки, такую как цитолитическая активность или T-хелперная активность, такая как секреция цитокинов или других факторов. В некоторых вариантах осуществления укороченную часть внутриклеточного сигнального домена компонента антигенного рецептора или костимуляторной молекулы используют вместо интактной иммуностимуляторной цепи, например, если она передает сигнал эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или домены включают цитоплазматические последовательности T-клеточного рецептора (TCR) и, в некоторых аспектах, также корецепторов, которые в природном контексте действуют совместно с такими рецепторами для инициации передачи сигнала после активации антигенного рецептора.

[555] Что касается природного TCR, для полной активации, как правило, требуется не только передача сигнала через TCR, но также и костимуляторный сигнал. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления для стимуляции полной активации в CAR также включают компонент для получения вторичного или костимуляторного сигнала. В других вариантах осуществления CAR не включает компонент для получения костимуляторного сигнала. В некоторых аспектах в той же клетке экспрессируется дополнительный CAR, и он предоставляет компонент для получения вторичного или костимуляторного сигнала.

[556] В некоторых аспектах активацию T-клеток описывают как опосредованную двумя классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: последовательностей, инициирующих антиген-зависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и последовательностей, действующих антиген-независимым образом, обеспечивая вторичный или костимуляторный сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). В некоторых аспектах CAR включает один или оба таких сигнальных компонента.

[557] В некоторых аспектах CAR включает первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, регулирующую первичную активацию комплекса TCR. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, действующие стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, известные как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM. Примеры ITAM-содержащих первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают последовательности, полученные из TCR дзета, FcR гамма, FcR бета, CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CDS, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматические сигнальные молекулы в CAR содержат цитоплазматический сигнальный домен, его часть, или последовательность, полученную из CD3 дзета.

[558] В некоторых вариантах осуществления CAR включает сигнальный домен и/или трансмембранную часть костимуляторного рецептора, такого как CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 и ICOS. В некоторых аспектах тот же CAR включает активирующие и костимуляторные компоненты.

[559] В некоторых вариантах осуществления активирующий домен включают в один CAR, в то время как костимуляторный компонент получают из другого CAR, распознающего другой антиген. В некоторых вариантах осуществления CAR включают активирующие или стимуляторные CAR, костимуляторные CAR, оба из которых экспрессируются на одной и той же клетке (см. WO2014/055668). В некоторых аспектах клетки включают один или более стимуляторных или активирующих CAR и/или костимуляторных CAR. В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно включают ингибиторные CAR (iCAR, см. Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013), такие как CAR, распознающий антиген, иной, чем антиген, ассоциированный и/или специфический для заболевания или состояния, посредством которого активирующий сигнал, передаваемый через ассоциированный с заболеванием CAR, снижается или ингибируется в результате связывания ингибиторного CAR со своим лигандом, например, для снижения побочных эффектов.

[560] В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит трансмембранный и сигнальный домен CD28, соединенный с внутриклеточным доменом CD3 (например, CD3-дзета). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит химерные костимуляторные домены CD28 и CD137 (4-1BB, TNFRSF9), соединенные с внутриклеточным доменом CD3-дзета.

[561] В некоторых вариантах осуществления CAR включает один или более, например, два или более, костимуляторных доменов и активирующий домен, например, первичный активирующий домен, в цитоплазматической части. Примеры CAR включают внутриклеточные компоненты CD3-дзета, CD28 и 4-1BB.

[562] В некоторых вариантах осуществления CAR или другой антигенный рецептор дополнительно включает маркер, и/или клетки, экспрессирующие CAR или другой антигенный рецептор, дополнительно включают суррогатный маркер, такой как поверхностный клеточный маркер, который можно использовать для подтверждения трансдукции или конструирования клетки для экспрессии рецептора, такого как укороченная версия рецептора поверхности клетки, такая как укороченный EGFR (tEGFR). В некоторых аспектах маркер, например, суррогатный маркер, включает весь или часть (например, укороченную форму) CD34, NGFR или рецептора эпидермального фактора роста (например, tEGFR). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая маркер, функционально связана с полинуклеотидом, кодирующим линкерную последовательность, такую как расщепляемая линкерная последовательность, например, T2A. Например, маркер и, необязательно, линкерная последовательность, может быть любой последовательностью, описанной в публикации PCT № WO2014031687. Например, маркер может являться укороченным EGFR (tEGFR), необязательно, соединенным с линкерной последовательностью, такой как расщепляемая линкерная последовательность T2A. Пример полипептиды укороченного EGFR (например, tEGFR) содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 7. Пример линкерной последовательности T2A содержит аминокислотную последовательность, приведенную SEQ ID NO: 6 или 45, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 6 или 45.

[563] В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой молекулу, например, белок поверхности клетки, необнаруживаемую в природе на T-клетках или необнаруживаемую в природе на поверхности T-клеток, или ее часть. В некоторых вариантах осуществления молекула является чужеродной молекулой, например, чужеродным белком, т.е. молекулой, нераспознаваемой как "своя" иммунной системой реципиента, по отношению к которому осуществляют адоптивный перенос клеток.

[564] В некоторых вариантах осуществления маркер не выполняет терапевтическую функцию и/или не имеет иного эффекта, чем его использованием в качестве маркера для генетической инженерии, например, для селекции успешно сконструированных клеток. В других вариантах осуществления маркер может являться терапевтической молекулой или молекулой, иным образом вызывающей некоторый желаемый эффект, такой как лиганд для клетки, встречающейся in vivo, такой как костимуляторная молекула или молекула иммунной контрольной точки для повышения и/или снижения ответов клеток после адоптивного переноса и контакта с лигандом.

[565] В некоторых случаях CAR обозначают как CAR первого, второго и/или третьего поколения. В некоторых аспектах CAR первого поколения является CAR, обеспечивающим исключительно индуцируемый CD3-цепью сигнал после связывания антигена; в некоторых аспектах CAR второго поколения являются CAR, обеспечивающими такой сигнал и костимуляторный сигнал, такими как CAR, включающий внутриклеточный сигнальный домен из костимуляторного рецептора, такого как CD28 или CD137; в некоторых аспектах CAR третьего поколения является CAR, включающим множество костимуляторных доменов различных костимуляторных рецепторов.

[566] В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент антитела. В некоторых аспектах химерный антигенный рецептор включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент, и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент включает scFv, и внутриклеточный домен содержит ITAM. В некоторых аспектах внутриклеточный сигнальный домен включает сигнальный домен дзета-цепи CD3-дзета (CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает трансмембранный домен, соединяющий внеклеточный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых аспектах трансмембранный домен содержит трансмембранную часть CD28. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен T-клеточной костимуляторной молекулы. Внеклеточный домен и трансмембранный домен можно соединять прямо или косвенно. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен и трансмембранный домен соединяют спейсером, таким как любой спейсер, представленный в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления рецептор содержит внеклеточную часть молекулы, из которой получают трансмембранный домен, такой как внеклеточная часть CD28. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен, полученный из T-клеточной костимуляторной молекулы или ее функционального варианта или части, например, между трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых аспектах T-клеточная костимуляторная молекула является CD28 или 41BB.

[567] Например, в некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например, фрагмент антитела, трансмембранный домен, представляющий собой или содержащий трансмембранную часть CD28 или ее функциональный вариант или часть, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальную часть CD28 или ее функциональный вариант или часть и сигнальную часть CD3-дзета или ее функциональный вариант или часть. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например, фрагмент антитела, трансмембранный домен, представляющий собой или содержащий трансмембранную часть CD28 или ее функциональный вариант или часть, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальную часть 4-1BB или ее функциональный вариант или часть и сигнальную часть CD3-дзета или ее функциональный вариант или часть. В некоторых таких вариантах осуществления рецептор дополнительно включает спейсер, содержащий часть молекулы Ig, такой как молекула Ig человека, такую как шарнирная область Ig, например, шарнирная область IgG4, такая как спейсер только из шарнирной области.

[568] В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен рекомбинантного рецептора, например, CAR, представляет собой или включает трансмембранный домен CD28 человека (например, регистрационный номер P01747.1) или его вариант, такой как трансмембранный домен, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 8; в некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен, содержащий часть рекомбинантного рецептора, содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере или приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к ней.

[569] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточные сигнальные компоненты рекомбинантного рецептора, например, CAR, содержат внутриклеточный костимуляторный сигнальный домен CD28 человека или его функциональный вариант или часть, такой как домен с заменой LL на GG в положениях 186-187 нативного белка CD28. Например, внутриклеточный сигнальный домен может содержать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10 или 11, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 10 или 11. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточный костимуляторный сигнальный домен 4-1BB (например, регистрационный номер Q07011.1) или его функциональный вариант или часть, такой как аминокислотная последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 12, или аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 12.

[570] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен рекомбинантного рецептора, например, CAR, содержит стимуляторный сигнальный домен CD3-дзета человека или его функциональный вариант или часть, такой как цитоплазматический домен 112 AA изоформы 3 CD3ζ человека (регистрационный номер P20963.2) или сигнальный домен CD3-дзета, как описано в патенте США № 7446190 или патенте США № 8911993. Например, в некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13, 14 или 15, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 13, 14 или 15.

[571] В некоторых аспектах спейсер содержит только шарнирную область IgG, например, только шарнирную область IgG4 или IgG1, такую как спейсер только из шарнирной области, приведенный в SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления спейсер представляет собой или содержит шарнирную область Ig, например, полученную из IgG4 шарнирную область, необязательно, соединенную с доменами CH2 и/или CH3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнирную область Ig, например, шарнирную область IgG4, соединенную с доменами CH2 и CH3, например, приведенную в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнирную область Ig, например, шарнирную область IgG4, соединенную только с доменом CH3, например, приведенную в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой или содержит богатую глицином и серином последовательность или другой гибкий линкер, такой как известные гибкие линкеры.

[572] Например, в некоторых вариантах осуществления CAR включает антитело, такое как фрагмент антитела, включая scFv, спейсер, такой как спейсер, содержащий часть молекулы иммуноглобулина, такой как шарнирная область и/или одна или более константных областей молекулы тяжелой цепи, такой как шарнирная область Ig, содержащая спейсер, трансмембранный домен, содержащий весь или часть полученного из CD28 трансмембранного домена, полученный из CD28 внутриклеточный сигнальный домен и сигнальный домен CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления CAR включает антитело или фрагмент, такой как scFv, спейсер, такой как любой из спейсеров, содержащих шарнирную область Ig, полученный из CD28 трансмембранный домен, полученный из 4-1BB внутриклеточный сигнальный домен и полученный из CD3 дзета сигнальный домен.

[573] В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие конструкции CAR, дополнительно включают последовательность, кодирующую элемент проскакивания рибосомы T2A, и/или последовательность tEGFR, например, ниже последовательности, кодирующей CAR. В некоторых вариантах осуществления последовательность кодирует элемент проскакивания рибосомы T2A, приведенный в SEQ ID NO: 6 или 45, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 6 или 45. В некоторых вариантах осуществления T-клетки, экспрессирующие антигенный рецептор (например, CAR), также можно получать для экспрессии укороченного EGFR (EGFRt) в качестве неиммуногенного эпитопа для селекции (например, посредством встраивания конструкции, кодирующей CAR и EGFRt, разделенные элементом переключения рибосомы T2A, для экспрессии двух белков с одной конструкции), который затем можно использовать в качестве маркера для детекции таких клеток (см., например, патент США № 8802374). В некоторых вариантах осуществления последовательность кодирует последовательность tEGFR, приведенную в SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 7.

[574] Рекомбинантные рецепторы, такие как CAR, экспрессируемые клетками, вводимыми индивидууму, как правило, распознают или специфически связываются с молекулой, экспрессируемой, ассоциированной и/или специфической для заболевания или состояния, подвергаемого лечению, или его клеток. После специфического связывания с молекулой, например, антигеном, рецептор, как правило, передает иммуностимуляторной сигнал, такой как ITAM-передаваемый сигнал, в клетку, таким образом, стимулируя иммунный ответ, направленный против заболевания или состояния. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки экспрессируют CAR, специфически связывающийся с антигеном, экспрессируемым клеткой или тканью заболевания или состояния или ассоциированным с заболеванием или состоянием.

2. TCR

[575] В некоторых вариантах осуществления получают сконструированные клетки, такие как T-клетки, экспрессирующие T-клеточный рецептор (TCR) или его антигенсвязывающую часть, распознающую пептидный эпитоп или T-клеточный эпитоп полипептида-мишени, такой как антиген опухоли, вирусный или аутоиммунный белок.

[576] В некоторых вариантах осуществления "T-клеточный рецептор" или "TCR" представляет собой молекулу, содержащую вариабельные цепи α и β (также известные как TCRα и TCRβ, соответственно), или вариабельные цепи γ и δ (также известные как TCRα и TCRβ, соответственно), или их антигенсвязывающие части, и способную специфически связываться с пептидом, связанным с молекулой MHC. В некоторых вариантах осуществления TCR находится в форме αβ. Как правило, TCR, существующие в формах αβ и γδ, как правило, являются структурно схожими, но T-клетки, экспрессирующие их, могут иметь разную анатомическую локализацию или функции. TCR можно обнаруживать на поверхности клетки или в растворимой форме. Как правило, TCR обнаруживают на поверхности T-клеток (или T-лимфоцитов), где он, как правило, отвечает за распознавание антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC).

[577] Если не указано иначе, следует понимать, что термин "TCR" включает полные TCR, а также их антигенсвязывающие части или антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления TCR является интактным или полноразмерным TCR, включая TCR в форме αβ или форме γδ. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой антигенсвязывающую часть меньше полноразмерного TCR, но связывающуюся со специфическим пептидом, связанным с молекулой MHC, например, связывается с комплексом MHC-пептид. В некоторых случаях антигенсвязывающая часть или фрагмент TCR может содержать только часть структурных доменов полноразмерного или интактного TCR, но все равно способна связываться с пептидным эпитопом, таким как комплекс MHC-пептид, с которым связывается полный TCR. В некоторых случаях антигенсвязывающая часть содержит вариабельные домены TCR, такие как вариабельная цепь α и вариабельная цепь β TCR, достаточные для образования участка связывания для связывания со специфическим комплексом MHC-пептид. Как правило, вариабельные цепи TCR содержат определяющие комплементарность области, вовлеченные в распознавание пептида, MHC и/или комплекса MHC-пептид.

[578] В некоторых вариантах осуществления вариабельные домены TCR содержат гипервариабельные петли или определяющие комплементарность области (CDR), как правило, являющиеся основными участниками распознавания антигена и способности и специфичности связывания. В некоторых вариантах осуществления CDR TCR или их комбинация образуют весь или, по существу, весь антигенсвязывающий участок указанной молекулы TCR. Различные CDR в вариабельной области цепи TCR, как правило, разделены каркасными областями (FR), как правило, демонстрирующими меньше вариабельности в молекулах TCR по сравнению с CDR (см., например, Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; см. также Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). В некоторых вариантах осуществления CDR3 является основной CDR, отвечающим за связывание антигена или специфичность, или наиболее важной среди трех CDR указанной вариабельной области TCR для распознавания антигена и/или взаимодействия с процессированной пептидной частью комплекса пептид-MHC. В некоторых случаях CDR1 альфа-цепи может взаимодействовать с N-концевой частью конкретных антигенных пептидов. В некоторых случаях CDR1 бета-цепи может взаимодействовать с C-концевой частью пептида. В некоторых случаях CDR2 вносит наибольший вклад или является основной CDR, отвечающей за взаимодействие или распознавание MHC-части комплекса MHC-пептид. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область β-цепи может содержать дополнительную гипервариабельную область (CDR4 или HVR4), как правило, вовлеченную в связывание суперантигена, но не распознавание антигена (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).

[579] В некоторых вариантах осуществления TCR также может содержать константный домен, трансмембранный домен и/или короткий цитоплазматический хвост (см., например, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). В некоторых аспектах каждая цепь TCR может иметь один N-концевой вариабельный домен иммуноглобулина, один константный домен иммуноглобулина, трансмембранную область и короткий цитоплазматический хвост на C-конце. В некоторых вариантах осуществления TCR ассоциирован с инвариантными белками комплекса CD3, вовлеченными в опосредование передачи сигнала.

[580] В некоторых вариантах осуществления цепь TCR содержит один или более константных доменов. Например, внеклеточная часть указанной цепи TCR (например, α-цепи или β-цепи) может содержать два иммуноглобулин-подобных домена, таких как вариабельный домен (например, Vα или Vβ; как правило, аминокислоты 1-116 в соответствии с нумерацией по Kabat из Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.) и константный домен (например, константный домен α-цепи или Cα, как правило, в положениях 117-259 цепи в соответствии с нумерацией по Kabat или константный домен β-цепи или Cβ, как правило, в положениях 117-295 цепи в соответствии с нумерацией по Kabat), смежный с клеточной мембраной. Например, в некоторых случаях внеклеточная часть TCR, образованная двумя цепями, содержит два проксимальных к мембране константных домена, и два дистальных к мембране вариабельных домена, где каждый из вариабельных доменов содержат CDR. Константный домен TCR может содержать короткие соединительные последовательности, в которых остаток цистеина образует дисульфидную связь, таким образом, соединяя две цепи TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR может содержать дополнительный остаток цистеина в каждой из цепей α и β, таким образом, что TCR содержит две дисульфидные связи в константных домена.

[581] В некоторых вариантах осуществления цепи TCR содержат трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен является положительно заряженным. В некоторых случаях цепь TCR содержит цитоплазматический хвост. В некоторых случаях структура позволяет TCR связываться с другими молекулами, подобными CD3 и его субъединицам. Например, TCR, содержащий константные домены с трансмембранной областью, может заякоривать белок в клеточной мембране и связываться с инвариантными субъединицами сигнального аппарата или комплекса CD3. Внутриклеточные хвосты сигнальных субъединиц CD3 (например, цепей CD3γ, CD3δ, CD3ε и CD3ζ) содержат один или более иммунорецепторных тирозиновых активирующих мотивов или ITAM, вовлеченных в сигнальную способность комплекса TCR.

[582] В некоторых вариантах осуществления TCR может являться гетеродимером двух цепей α и β (или, необязательно, γ и δ) или конструкцией одной цепи TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR является гетеродимером, содержащим две отдельные цепи (цепи α и β или цепи γ и δ), соединенные, например, дисульфидной связью или дисульфидными связями.

[583] В некоторых вариантах осуществления TCR можно получать из известных последовательностей TCR, таких как последовательности цепей Vα,β, в случае которых, по существу, общедоступна полноразмерная кодирующая последовательность. Хорошо известны способы получения полноразмерных последовательностей TCR, включая последовательности цепи V, из клеточных источников. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие TCR, можно получать из множества источников, например, посредством амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) TCR-кодирующих нуклеиновых кислот в указанных клетках или выделенных из указанных клеток, или посредством синтеза общедоступных последовательностей ДНК TCR.

[584] В некоторых вариантах осуществления TCR получают из биологического источника, например, из клеток, например, из T-клетки (например, цитотоксической T-клетки), T-клеточных гибридом или другого общедоступного источника. В некоторых вариантах осуществления T-клетки можно получать из выделенных клеток in vivo. В некоторых вариантах осуществления TCR является подвергнутым селекции в тимусе TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR является рестрицированным по неоэпитопу TCR. В некоторых вариантах осуществления T-клетки могут являться культивируемой T-клеточной гибридомой или клоном. В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающую часть можно получать синтетически с учетом знания о последовательности TCR.

[585] В некоторых вариантах осуществления TCR получают из TCR, идентифицированного или выбранного при скрининге библиотеки TCR-кандидатов против полипептидного антигена-мишени или T-клеточного эпитопа-мишени. Библиотеки TCR можно получать посредством амплификации репертуара Vα и Vβ из T-клеток, выделенных из индивидуума, включая клетки, присутствующие в PBMC, селезенке или другом лимфоидном органе. В некоторых случаях, T-клетки можно амплифицировать из инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL). В некоторых вариантах осуществления библиотеки TCR можно получать из CD4⁺ или CD8⁺ клеток. В некоторых вариантах осуществления TCR можно амплифицировать из источника T-клеток нормального или здорового индивидуума, т.е. библиотек нормальных TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR можно амплифицировать из источника T-клеток индивидуума с заболеванием, т.е. библиотеки TCR, специфических для заболевания. В некоторых вариантах осуществления вырожденные праймеры используют для амплификации репертуара генов Vα и Vβ, например, посредством RT-ПЦР в образцах, таких как T-клетки, полученные из людей. В некоторых вариантах осуществления библиотеки scTv можно собирать из библиотек наивных Vα и Vβ, в которых амплифицированные продукты клонируют или собирают так, чтобы разделять их линкером. В зависимости от источника индивидуума и клеток, библиотеки могут быть HLA-аллелеспецифическими. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления библиотеки TCR можно получать посредством мутагенеза или диверсификации родительской молекулы TCR или TCR-основы. В некоторых аспектах TCR подвергают направленной эволюции, например, посредством мутагенеза, например, α- или β-цепи. В некоторых аспектах изменяют конкретные остатки в CDR TCR. В некоторых вариантах осуществления выбранные TCR можно модифицировать посредством созревания аффинности. В некоторых вариантах осуществления антиген-специфические T-клетки можно подвергать селекции, например, посредством скрининга для оценки активности CTL против пептида. В некоторых аспектах TCR, например, присутствующие на антиген-специфических T-клетках, можно подвергать селекции, например, по активности связывания, например, конкретной аффинности или авидности к антигену.

[586] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающую часть модифицируют или конструируют. В некоторых вариантах осуществления способы направленной эволюции используют для получения TCR с измененными свойствами, например, с более высокой аффинностью к специфическому комплексу MHC-пептид. В некоторых вариантах осуществления направленной эволюции достигают способами дисплея, включая, в качестве неограничивающих примеров, дрожжевой дисплей (Holler et al., (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al., (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), фаговый дисплей (Li et al., (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), или T-клеточный дисплей (Chervin et al., (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). В некоторых вариантах осуществления способы дисплея включают конструирование или модифицирование известного, родительского или референсного TCR. Например, в некоторых случаях TCR дикого типа можно использовать в качестве матрицы для получения мутантных TCR, в которых один или более остатков из CDR являются мутантными, и затем выбирают мутантов с желаемым измененным свойством, таким как более высокая аффинность к желаемому антигену-мишени.

[587] В некоторых вариантах осуществления пептиды из полипептида-мишени для использования в получении интересующего TCR известны, или специалисты в этой области легко могут идентифицировать их. В некоторых вариантах осуществления пептиды, пригодные для использования в получении TCR или антигенсвязывающих частей, можно определять с учетом наличия HLA-рестрицированного мотива в интересующем полипептиде-мишени, таком как полипептид-мишень, описанный ниже. В некоторых вариантах осуществления пептиды идентифицируют с использованием компьютерных прогностических моделей, известных специалистам в этой области. В некоторых вариантах осуществления в случае прогнозирования участков связывания MHC класса I такие модели включают, в качестве неограничивающих примеров, ProPred1 (Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237) и SYFPEITHI (см. Schuler et al., (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular biology, 409(1): 75-93 2007). В некоторых вариантах осуществления MHC-рестрицированный эпитоп является HLA-A0201, экспрессирующимся у приблизительно 39-46% всех европеоидов и, таким образом, представляющим собой подходящий выбор антигена MHC для использования в получении TCR или другой MHC-пептид-связывающей молекулы.

[588] Специалистам в этой области известны HLA-A0201-связывающие мотивы и участки расщепления протеасом и иммунопротеасом, определяемые с использованием компьютерных прогностических моделей. В случае прогнозирования участков связывания MHC класса I такие модели включают, в качестве неограничивающих примеров, ProPred1 (более подробно описываемую в Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001) и SYFPEITHI (см. Schuler et al., SYFPEITHI, Database for Searching и T-Cell Epitope Prediction. в Immunoinformatics Methods in Molecular biology, vol 409(1): 75-93 2007).

[589] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающая часть может являться рекомбинантно продуцируемым природным белком или его мутантной формой, в которой изменено одно или более свойств, таких как характеристика связывания. В некоторых вариантах осуществления TCR можно получать из одного из различных видов животных, таких как человек, мышь, крыса или другие млекопитающее. TCR может быть связан с клеткой или находиться в растворимой форме. В некоторых вариантах осуществления в способах по изобретению TCR является клеточно-связанной формой, экспрессирующейся на поверхности клетки.

[590] В некоторых вариантах осуществления TCR является полноразмерным TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR является антигенсвязывающей частью. В некоторых вариантах осуществления TCR является димерным TCR (dTCR). В некоторых вариантах осуществления TCR является одноцепочечным TCR (sc-TCR). В некоторых вариантах осуществления dTCR или scTCR имеют структуры, описанные в WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186.

[591] В некоторых вариантах осуществления TCR содержит последовательность, соответствующую трансмембранной последовательности. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит последовательность, соответствующую цитоплазматическим последовательностям. В некоторых вариантах осуществления TCR может образовывать комплекс TCR с CD3. В некоторых вариантах осуществления любой из TCR, включая dTCR или scTCR, можно соединять с сигнальными доменами, получая активный TCR на поверхности T-клетки. В некоторых вариантах осуществления TCR экспрессируется на поверхности клеток.

[592] В некоторых вариантах осуществления dTCR содержит первый полипептид, где последовательность, соответствующую последовательности вариабельной области α-цепи TCR, подвергают слиянию с N-концом последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константной области α-цепи TCR, и второй полипептид, где последовательность, соответствующую последовательности вариабельной области β-цепи TCR, подвергают слиянию с N-концом последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константной области β-цепи TCR, первый и второй полипептиды соединяют дисульфидной связью. В некоторых вариантах осуществления связь может соответствовать нативной межцепочечной дисульфидной связи, присутствующей в нативных димерных TCR αβ. В некоторых вариантах осуществления межцепочечные дисульфидные связи отсутствуют в нативном TCR. Например, в некоторых вариантах осуществления во внеклеточные последовательности константной области пары полипептидов dTCR можно включать один или более цистеинов. В некоторых случаях и нативная, и ненативная дисульфидная связь может быть желательной. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит трансмембранную последовательность для заякоривания в мембране.

[593] В некоторых вариантах осуществления dTCR содержит α-цепь TCR, содержащую вариабельный α-домен, константный α-домен и первый мотив димеризации, соединенный с C-концом константного α-домена, и β-цепь TCR, содержащую вариабельный β-домен, константный β-домен и первый мотив димеризации, соединенный с C-концом константного β-домена, где первый и второй мотивы димеризации легко взаимодействуют с образованием ковалентной связи между аминокислотой в первом мотиве димеризации и аминокислотой во втором мотиве димеризации, соединяя α-цепь TCR и β-цепь TCR.

[594] В некоторых вариантах осуществления TCR является scTCR. Как правило, scTCR можно получать способами, известными специалистам в этой области, См. например, Soo Hoo, W. F. et al., PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wülfing, C. and Plückthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al., PNAS (USA) 90 3830 (1993); международные публикации PCT №№ WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; и Schlueter, C. J. et al., J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит встроенную ненативную дисульфидную межцепочечную связь для облегчения ассоциации цепей TCR (см., например, международную публикацию PCT № WO 03/020763). В некоторых вариантах осуществления scTCR является соединенным дисульфидной связью, укороченным TCR, в котором гетерологичные лейциновые молнии, слитые с его C-концами, облегчают ассоциацию цепей (см., например, международную публикацию PCT № WO99/60120). В некоторых вариантах осуществления scTCR содержат вариабельный домен TCRα, ковалентно связанный с вариабельным доменом TCRβ с помощью пептидного линкера (см., например, международную публикацию PCT № WO99/18129).

[595] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит первый сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей вариабельной области α-цепи TCR, второй сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности вариабельной области β-цепи TCR, слитой с N-концом аминокислотной последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константного домена β-цепи TCR, и линкерную последовательность, соединяющую C-конец первого сегмента и N-конец второго сегмента.

[596] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит первый сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области α-цепи, слитой с N-концом внеклеточной последовательности константного домена α-цепи, и второй сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области β-цепи, слитой с N-концом внеклеточной последовательность и трансмембранной последовательности константного домена β-цепи, и, необязательно, линкерную последовательность, соединяющую C-конец первого сегмента и N-конец второго сегмента.

[597] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит первый сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области β-цепи TCR, слитой с N-концом внеклеточной последовательности константного домена β-цепи, и второй сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области α-цепи, слитой с N-концом внеклеточной последовательности и трансмембранной последовательности константного домена α-цепи, и, необязательно, линкерную последовательность, соединяющую C-конец первого сегмента и N-конец второго сегмента.

[598] В некоторых вариантах осуществления линкер scTCR, соединяющий первый и второй сегменты TCR, может являться любым линкером, способным образовывать одну полипептидную цепь, при этом сохраняющую специфичность связывания TCR. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность, например, может иметь формулу -P-AA-P-, где P является пролином, и AA представляет собой аминокислотную последовательность, где аминокислотами являются глицин и серин. В некоторых вариантах осуществления первый и второй сегменты спарены таким образом, что последовательности их вариабельных областей ориентированы для такого связывания. Таким образом, в некоторых случаях линкер имеет достаточную длину, чтобы покрывать расстояние между C-концом первого сегмента и N-концом второго сегмента, или наоборот, но он должен быть не слишком длинным, чтобы блокировать или снижать связывание scTCR с лигандом-мишенью. В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать от или приблизительно от 10 до 45 аминокислот, например, от 10 до 30 аминокислот или 26 до 41 аминокислоты, например, 29, 30, 31 или 32 аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет формулу -PGGG-(SGGGG)5-P-, где P является пролином, G является глицином, и S является серином (SEQ ID NO: 16). В некоторых вариантах осуществления линкер имеет последовательность GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO: 17).

[599] В некоторых вариантах осуществления scTCR содержит ковалентную дисульфидную связь, соединяющую остаток иммуноглобулиновой области константного домена α-цепи с остатком иммуноглобулиновой области константного домена β-цепи. В некоторых вариантах осуществления межцепочечная дисульфидная связь отсутствует в нативном TCR. Например, в некоторых вариантах осуществления во внеклеточные последовательности константной области первого и второго сегментов полипептида scTCR можно включать один или более цистеинов. В некоторых случаях, желательной может являться и нативная, и ненативная дисульфидная связь.

[600] В некоторых вариантах осуществления dTCR или scTCR, содержащих встроенные межцепочечные дисульфидные связи, нативные дисульфидные связи отсутствуют. В некоторых вариантах осуществления один или более нативных цистеинов, образующих нативные межцепочечные дисульфидные связи, заменяют другим остатком, таким как серин или аланин. В некоторых вариантах осуществления встроенную дисульфидную связь можно получать посредством мутагенеза нецистеиновых остатков на первом и втором сегментах в цистеин. Примеры ненативных дисульфидных связей TCR описаны в международной публикации PCT № WO2006/000830.

[601] В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент проявляется аффинность с равновесной константой связывания для антигена-мишени от или приблизительно от 10^-5 до 10^-12 M, включая все отдельные значения и диапазоны в этом диапазоне. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень является комплексом MHC-пептид или лигандом.

[602] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или нуклеиновые кислоты, кодирующие TCR, такой как α- и β-цепи, можно амплифицировать посредством ПЦР, клонирования или других подходящих способов и клонировать в подходящий экспрессирующий вектор или векторы. Экспрессирующий вектор может являться любым подходящим рекомбинантным экспрессирующим вектор, и его можно использовать для трансформации или трансфекции любого подходящего хозяина. Подходящие векторы включают векторы, предназначенные для размножения и экспансии, или для экспрессии, или для того и другого, такие как плазмиды и вирусы.

[603] В некоторых вариантах осуществления вектор может являться вектором серии pUC (Fermentas Life Sciences), серии pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.), серии pET (Novagen, Madison, Wis.), серии pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) или серии pEX (Clontech, Palo Alto, Calif.). В некоторых случаях, также можно использовать бактериофаговые векторы, такие как λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4 и λNM1149. В некоторых вариантах осуществления можно использовать растительные экспрессирующие векторы, и они включают pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 и pBIN19 (Clontech). В некоторых вариантах осуществления животное экспрессирующие векторы включают pEUK-Cl, pMAM и pMAMneo (Clontech). В некоторых вариантах осуществления используют вирусный вектор, такой как ретровирусный вектор.

[604] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные экспрессирующие векторы можно получать стандартными способами рекомбинантной ДНК. В некоторых вариантах осуществления векторы могут содержать регуляторные последовательности, такие как инициирующие транскрипцию и трансляцию кодоны и терминирующие кодоны, специфические для типа хозяина (например, бактерии, гриба, растения или животного), в которого собираются вводить вектор, при необходимости и с учетом того, основан ли вектор на ДНК или РНК. В некоторых вариантах осуществления вектор может содержать ненативный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей TCR или его антигенсвязывающую часть (или другую MHC-пептид-связывающую молекулу). В некоторых вариантах осуществления промотор может являться невирусным промотором или вирусным промотором, таким как промотор цитомегаловируса (CMV), промотор SV40, промотор RSV и промотор, обнаруживаемый в длинном концевом повторе вируса стволовых клеток мыши. Также предусмотрены другие промоторы, известные специалистам в этой области.

[605] В некоторых вариантах осуществления для получения вектора, кодирующего TCR, α- и β-цепи амплифицируют посредством ПЦР с использованием тотальной кДНК, выделенной из клона T-клетки, экспрессирующего интересующий TCR, и клонируют в экспрессирующий вектор. В некоторых вариантах осуществления α- и β-цепи клонируют в один и тот же вектор. В некоторых вариантах осуществления α- и β-цепи клонируют в разные векторы. В некоторых вариантах осуществления полученные α- и β-цепи встраивают в ретровирусный, например, лентивирусный, вектор.

3. Мультитаргетинг

[606] В некоторых вариантах осуществления клетки и способы включают стратегии мультитаргетинга, такие как экспрессия двух или более генетически сконструированных рецепторов на клетке, каждый из которых распознает тот же или другой антиген и, как правило, включает другой внутриклеточный сигнальный компонент. Такие стратегии мультитаргетинга описывают, например, в публикации PCT № WO 2014055668 A1 (в которой описывают комбинации активирующих и костимуляторных CAR, например, направленных на два разных антигена, присутствующих по отдельности на нецелевых, например, нормальных клетках, но вместе присутствующих только на клетках заболевания или состояния, подлежащего лечению) и Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013) (в которой описывают клетки, экспрессирующие активирующий и ингибиторный CAR, такие как клетки, в которых активирующий CAR связывается с одним антигеном, экспрессирующимся на нормальных или непораженных клетках и клетках заболевания или состояния, подлежащего лечению, и ингибиторный CAR связывается с другим антигеном, экспрессирующимся только на нормальных клетках или клетках, которые нежелательно подвергать лечению).

[607] Например, в некоторых вариантах осуществления клетки включают первый генетически сконструированный антигенный рецептор (например, CAR или TCR), способный индуцировать активирующий сигнал в клетке, как правило, после специфического связывания с антигеном, распознаваемым первым рецептором, например, первым антигеном. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно включает второй генетически сконструированный антигенный рецептор (например, CAR или TCR), например, химерный костимуляторный рецептор, способный индуцировать костимуляторный сигнал в иммунной клетке, как правило, после специфического связывания со вторым антигеном, распознаваемым вторым рецептором. В некоторых вариантах осуществления первый антиген и второй антиген являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления первый антиген и второй антиген являются разными.

[608] В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй генетически сконструированный антигенный рецептор (например, CAR или TCR) способен индуцировать активирующий сигнал в клетке. В некоторых вариантах осуществления рецептор включает внутриклеточный сигнальный компонент, содержащий ITAM или ITAM-подобный мотивы. В некоторых вариантах осуществления активация, индуцируемая первым рецептором, включает передачу сигнала или изменение экспрессии белка в клетке, приводящие к инициации иммунного ответа, такой как фосфорилирование ITAM и/или инициация ITAM-опосредованного каскада передачи сигнала, образование иммунологического синапса и/или кластеризация молекул вблизи связанного рецептора (например, CD4 или CD8 и т.д.), активация одного или более факторов транскрипции, таких как NF-κB и/или AP-1, и/или индукция экспрессии генов факторов, таких как цитокины, пролиферация и/или выживаемость.

[609] В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй рецептор включает внутриклеточные сигнальные домены костимуляторных рецепторов, таких как CD28, CD137 (4-1 BB), OX40 и/или ICOS. В некоторых вариантах осуществления первый и второй рецепторы включают внутриклеточный сигнальный домен костимуляторного рецептора, являющегося другим. В одном из вариантов осуществления первый рецептор содержит костимуляторную сигнальную область CD28, и второй рецептор содержит костимуляторную сигнальную область 4-1BB, или наоборот.

[610] В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй рецептор включает внутриклеточный сигнальный домен, содержащий ITAM или ITAM-подобные мотивы, и внутриклеточный сигнальный домен костимуляторного рецептора.

[611] В некоторых вариантах осуществления первый рецептор содержит внутриклеточный сигнальный домен, содержащий ITAM или ITAM-подобные мотивы, и второй рецептор содержит внутриклеточный сигнальный домен костимуляторного рецептора. Костимуляторный сигнал в комбинации с активирующим сигналом, индуцированным в той же клетке, приводит к иммунному ответу, такому как устойчивый и длительный иммунный ответ, такой как повышенная экспрессия генов, секреция цитокинов и других факторов, и опосредованные T-клетками эффекторные функции, такие как цитолиз.

[612] В некоторых вариантах осуществления ни исключительно лигирование первого рецептора, ни исключительно лигирование второго рецептора не индуцирует устойчивый иммунный ответ. В некоторых аспектах, если только один рецептор лигирован, клетка становится толерантной или неотвечающей на антиген, или ингибируется, и/или не индуцируется для пролиферации, или секреции факторов, или выполнения эффекторных функций. Однако, в некоторых таких вариантах осуществления, если лигируется множество рецепторов, например, после контакта с клеткой, экспрессирующей первый и второй антигены, достигают желаемого ответа, такого как полная иммунная активация или стимуляция, например, о чем свидетельствует секреция одного или более цитокинов, пролиферация, персистирование и/или выполнение иммунной эффекторной функции, такой как цитолиз клетки-мишени.

[613] В некоторых вариантах осуществления два рецептора индуцируют, соответственно, активирующий и ингибиторный сигнал в клетке таким образом, что связывание одного из рецепторов с его антигеном активирует клетку или индуцирует ответ, но связывание второго ингибиторного рецептора со своим антигеном индуцирует сигнал, супрессирующий или уменьшающий этот ответ. Примерами являются комбинации активирующих CAR и ингибиторных CAR или iCAR. Можно использовать такую стратегию, например, в которой активирующий CAR связывается с антигеном, экспрессирующимся при заболевании или состоянии, но также экспрессирующимся на нормальных клетках, и ингибиторный рецептор связывается с отдельным антигеном, экспрессирующимся на нормальных клетках, но не клетках заболевания или состояния.

[614] В некоторых вариантах осуществления стратегию мультитаргетинга используют в случае, когда антиген, ассоциированный с конкретным заболеванием или состоянием, экспрессируется на непораженной клетке и/или экспрессируется на самой сконструированной клетке транзиторно (например, после стимуляции посредством генетической инженерии) или постоянно. В таких случаях благодаря необходимости лигирования двух отдельных и по отдельности специфических антигенных рецепторов можно улучшать специфичность, селективность и/или активность.

[615] В некоторых вариантах осуществления множество антигенов, например, первый и второй антигены, экспрессируются на клетке, ткани или при заболевании или состоянии, подвергаемом лечению, например, на злокачественной клетке. В некоторых аспектах клетка, ткань, заболевание или состояние являются множественной миеломой или клеткой множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления один или более из множества антигенов, как правило, также экспрессируется на клетке, которую желательно не подвергать воздействию при клеточной терапии, такой как нормальная или непораженная клетка или ткань, и/или самих сконструированных клетках. В таких вариантах осуществления благодаря необходимости лигирования множества рецепторов для достижения ответа клетки достигают специфичности и/или активности.

B. Клетки и получение клеток для генетической инженерии

[616] Клетки, экспрессирующие рецепторы и вводимые способами по изобретению, включают сконструированные клетки. Генетическая инженерия, как правило, включает встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный или сконструированный компонент, в композицию, содержащую клетки, например, посредством ретровирусной трансдукции, трансфекции или трансформации.

[617] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, т.е. в норме не присутствуют в клетке или образце, полученном из клетки, такими как нуклеиновые кислоты, полученные из другого организма или клетки, например, как правило, необнаруживаемые в клетке, подвергнутой конструированию, и/или организме, из которого такую клетку получают. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не являются природными, такими как нуклеиновая кислота, необнаруживаемая в природе, включая нуклеиновую кислоту, содержащую химерный комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих различные домены из множества различных типов клеток.

[618] Клетки, как правило, являются эукариотическими клетками, такими как клетки млекопитающих, и, как правило, являются клетками человека. В некоторых вариантах осуществления клетки получают из крови, костного мозга, лимфы или лимфоидных органов, они являются клетками иммунной системы, такими как клетки врожденного или адаптивного иммунитета, например, миелоидные или лимфоидные клетки, включая лимфоциты, как правило, T-клетки и/или NK-клетки. Другие примеры клеток включают стволовые клетки, такие как мультипотентные и плюрипотентные стволовые клетки, включая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Клетки, как правило, являются первичными клетками, такими как клетки, выделенные непосредственно из индивидуума и/или выделенные из индивидуума и замороженные. В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более субпопуляций T-клеток или других типов клеток, таких как цельные популяции T-клеток, CD4+-клетки, CD8⁺ клетки и их субпопуляции, такие как субпопуляции, определяемые функцией, состоянием активации, зрелостью, дифференцировочным потенциалом, экспансией, рециркуляцией, локализацией и/или способностью к персистированию, антиген-специфичностью, типом антигенного рецептора, присутствием в конкретном органе или компартменте, профилем секреция маркеров или цитокинов и/или степенью дифференцировки. С учетом индивидуума, подлежащего лечению, клетки могут являться аллогенными и/или аутологичными. Способы включают готовые к использованию способы. В некоторых аспектах в случае готовых к использованию технологий клетки являются плюрипотентными и/или мультипотентными, такими как стволовые клетки, такие как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs). В некоторых вариантах осуществления способы включают выделение клеток из индивидуума, их подготовку, обработку, культивирование и/или конструирование и повторное введение тому же индивидууму до или после криоконсервации.

[619] Подтипы и субпопуляции T-клеток и/или CD4⁺ и/или CD8⁺ T-клеток включают наивные T-клетки (T_N), эффекторные T-клетки (T_EFF), T-клетки памяти и их подтипы, такие как стволовые T-клетки памяти (T_SCM), T-клетки центральной памяти (T_CM), эффекторные T-клетки памяти (T_EM), или терминально дифференцированные эффекторные T-клетки памяти, инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL), незрелые T-клетки, зрелые T-клетки, цитотоксические T-клетки, инвариантные T-клетки слизистой оболочки (MAIT), природные и адаптивные регуляторные T-клетки (Treg), хелперные T-клетки, такие как TH1-клетки, TH2-клетки, TH3-клетки, TH17-клетки, TH9-клетки, TH22-клетки, фолликулярные хелперные T-клетки, альфа/бета T-клетки и дельта/гамма T-клетки.

[620] В некоторых вариантах осуществления клетки являются естественными киллерами (NK). В некоторых вариантах осуществления клетки являются моноцитами или гранулоцитами, например, миелоидными клетками, макрофагами, нейтрофилами, дендритными клетками, тучными клетками, эозинофилами и/или базофилами.

[621] В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более нуклеиновых кислот, встроенных с помощью генетической инженерии, и, таким образом, экспрессируют рекомбинантные или генетически сконструированные продукты таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, т.е., как правило, неприсутствующими в клетке или образце, полученном из клетки, такими как нуклеиновые кислоты, полученные из другого организма или клетки, например, как правило, необнаруживаемые в клетке, подвергнутой конструированию, и/или организме, из которого такую клетку получают. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются неприродными, такими как нуклеиновая кислота, необнаруживаемая в природе, включая нуклеиновую кислоту, содержащую химерные комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих различные домены из множества различных типов клеток.

[622] В некоторых вариантах осуществления получение сконструированных клеток включает одну или более стадий культивирования и/или получения. Клетки для встраивания нуклеиновой кислоты, кодирующей трансгенный рецептор, такой как CAR, можно выделять из образца, такого как биологический образец, например, образец, полученный из индивидуума. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, из которого выделяют клетку, является индивидуумом, имеющим заболевание или состояние, или нуждающимся в клеточной терапии, или которого будут подвергать клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком, нуждающимся в конкретном терапевтическом вмешательстве, таком как адоптивная клеточная терапия, для которой клетки выделяют, обрабатывают и/или конструируют.

[623] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления клетки являются первичными клетками, например, первичными клетками человека. Образцы включают ткань, жидкость и другие образцы, полученные непосредственно из индивидуума, а также образцы, полученные на одной или более стадиях обработки, таких как разделение, центрифугирование, генетическая инженерия (например, трансдукция с использованием вирусного вектора), промывка и/или инкубация. Биологический образец может являться образцом, полученным непосредственно из биологического источника, или образцом, подвергнутым обработке. Биологические образцы, в качестве неограничивающих примеров, включают физиологические жидкости, такие как кровь, плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы тканей и органов, включая обработанные образцы, полученные из них.

[624] В некоторых аспектах образец, из которого получают или выделяют клетки, является кровью или полученным из крови образцом, или он представляет собой продукт афереза или лейкафереза, или его получают из такого продукта. Примеры образцов включают цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), лейкоциты, костный мозг, тимус, биоптат ткани, опухоль, лейкоз, лимфому, лимфоузел, лимфоидную ткань кишечника, лимфоидную ткань слизистых оболочек, селезенку, другие лимфоидные ткани, печень, легкие, желудок, кишечник, толстый кишечник, почки, поджелудочную железу, молочную железу, кость, предстательную железу, шейку матки, яички, яичники, миндалину или другой орган, и/или клетки, полученные из него. В контексте клеточной терапии, например, адоптивной клеточной терапии, образцы включают образцы из аутологичных и аллогенных источников.

[625] В некоторых вариантах осуществления клетки получают из линий клеток, например, линий T-клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки получают из ксеногенного источника, например, из мыши, крысы, не являющегося человеком примата и свиньи.

[626] В некоторых вариантах осуществления выделение клеток включает одну или более стадий получения и/или разделения клеток не на основе аффинности. В некоторых примерах клетки промывают, центрифугируют и/или инкубируют в присутствие одного или более реагентов, например, для удаления нежелательных компонентов, обогащения желаемыми компонентами, лизиса или удаления клеток, чувствительных к конкретным реагентам. В некоторых примерах клетки разделяют с учетом одного или более свойств, таких как плотность, адгезивные свойства, размер, чувствительность и/или резистентность к конкретным компонентам.

[627] В некоторых примерах клетки из циркулирующей крови индивидуума получают, например, посредством афереза или лейкафереза. В некоторых аспектах образцы содержат лимфоциты, включая T-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядерные лейкоциты, эритроциты и/или тромбоциты, и в некоторых аспектах они содержат клетки, иные, чем эритроциты и тромбоциты.

[628] В некоторых вариантах осуществления клетки крови, полученные из индивидуума, промывают, например, для удаления фракции плазмы и помещения клеток в соответствующий буфер или среды для последующих стадий обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают фосфатно-солевым буфером (PBS). В некоторых вариантах осуществления в промывочном растворе отсутствует кальций, и/или магний, и/или многие или все двухвалентные катионы. В некоторых аспектах стадию промывки осуществляют с помощью полуавтоматической проточной центрифуги (например, клеточного процессора Cobe 2991, Baxter) по инструкциям производителя. В некоторых аспектах стадию промывки осуществляют посредством фильтрации тангенциальным потоком (TFF) по инструкциям производителя. В некоторых вариантах осуществления клетки ресуспендируют в различных биосовместимых буферах после промывки, таких как, например, Ca⁺⁺/Mg⁺⁺-несодержащий PBS. В определенных вариантах осуществления удаляют компоненты образца клеток крови и ресуспендируют клетки непосредственно в средах для культивирования.

[629] В некоторых вариантах осуществления способы включают способы разделения клеток с учетом плотности клеток, такие как получение лейкоцитов из периферической крови посредством лизиса эритроцитов и центрифугирования в градиенте перколла или фиколла.

[630] В некоторых вариантах осуществления способы выделения включают разделение различных типов клеток с учетом экспрессии или наличия в клетке одной или более конкретных молекул, таких как поверхностные маркеры, например, поверхностные белки, внутриклеточные маркеры или нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления можно использовать любой известный способ разделения с использованием таких маркеров. В некоторых вариантах осуществления разделение является аффинным или иммуноаффинным разделением. Например, в некоторых аспектах выделение включает разделение клеток и популяций клеток с учетом экспрессии или уровня экспрессии одного или более маркеров в клетках, как правило, поверхностных клеточных маркеров, например, посредством инкубации с антителом или партнером по связыванию, специфически связывающимся с такими маркерами, как правило, с последующими стадиями промывки и отделения клеток со связанным антителом или партнером по связыванию от клеток без связанного антитела или партнера по связыванию.

[631] Такие стадии разделения могут быть основаны на положительной селекции, при которой клетки со связанными реагентами сохраняют для последующего использования, и/или отрицательной селекции, при которой сохраняют клетки без связанного антитела или партнера по связыванию. В некоторых примерах обе фракции сохраняют для последующего использования. В некоторых аспектах отрицательная селекция может быть особенно пригодной, если нет доступного антитела, с помощью которого специфически идентифицируют тип клеток в гетерогенной популяции, таким образом, что разделение лучше всего осуществлять с использованием маркеров, экспрессируемых иными клетками, чем желаемая популяция.

[632] Разделение может не приводить к 100% обогащению или удалению конкретной популяции клеток или клеток, экспрессирующих конкретный маркер. Например, положительная селекция или обогащение клетками конкретного типа, такими как клетки, экспрессирующие маркер, относится к повышению количества или процентной доли таких клеток, но может не приводить к полному отсутствию клеток, неэкспрессирующих маркер. Аналогично, отрицательная селекция, удаление или истощение клеток конкретного типа, таких как клетки, экспрессирующие маркер, относится к снижению количества или процентной доли таких клеток, но может не приводить к полному удалению всех таких клеток.

[633] В некоторых примерах осуществляют множество раундов стадий разделения, где подвергнутую положительной или отрицательной селекции фракцию из одной стадии подвергают другой стадии разделения, такой как последующая положительная или отрицательная селекция. В некоторых примерах с помощью одной стадии разделения можно истощать клетки, одновременно экспрессирующих множество маркеров, например, посредством инкубации клеток с множеством антител или партнеров по связыванию, каждый из которых является специфическим для маркера, намеченного для отрицательной селекции. Аналогично, множество типов клеток можно одновременно подвергать положительной селекции посредством инкубации клеток с множеством антител или партнеров по связыванию, экспрессирующихся на различных типах клеток.

[634] Например, в некоторых аспектах конкретные субпопуляции T-клеток, такие как клетки, положительные или экспрессирующие высокие уровни одного или более поверхностных маркеров, например, CD28⁺, CD62L⁺, CCR7⁺, CD27⁺, CD127⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD45RA⁺ и/или CD45RO⁺, выделяют способами положительной или отрицательной селекции.

[635] Например, CD3⁺, CD28⁺ T-клетки можно подвергать положительной селекции с использованием магнитных частиц, конъюгированных с антителами против CD3/против CD28 (например, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).

[636] В некоторых вариантах осуществления выделение осуществляют посредством обогащения конкретными популяциями клеток с помощью положительной селекции или посредством истощения конкретной популяции клеток с помощью отрицательной селекции. В некоторых вариантах осуществления положительную или отрицательную селекцию осуществляют посредством инкубации клеток с одним или более антителами или другими связывающими средствами, специфически связывающимися с одним или более поверхностными маркерами, экспрессирующимися или экспрессирующимися (маркер⁺) на относительно более высоком уровне (маркер^high) на подвергнутых положительной или отрицательной селекции клетках, соответственно.

[637] В некоторых вариантах осуществления T-клетки отделяют от образца PBMC посредством отрицательной селекции по маркерам, экспрессирующимся на не-T-клетках, таких как B-клетки, моноциты или другие лейкоциты, такие как CD14. В некоторых аспектах стадию селекции CD4⁺ или CD8⁺ используют для разделения CD4⁺ хелперов и CD8⁺ цитотоксических T-клеток. Такие CD4⁺ и CD8⁺ популяции можно дополнительно сортировать на субпопуляции посредством положительной или отрицательной селекции по маркерам, экспрессирующимся или экспрессирующимся на относительно более высоком уровне на одной или более субпопуляциях наивных T-клеток, T-клеток памяти и/или эффекторных T-клеток.

[638] В некоторых вариантах осуществления CD8⁺ клетки дополнительно обогащают или истощают по наивным клеткам, клеткам центральной памяти, клеткам эффекторной памяти и/или стволовым клеткам центральной памяти, например, посредством положительной или отрицательной селекции с учетом поверхностных антигенов, ассоциированных с соответствующей субпопуляцией. В некоторых вариантах осуществления обогащение T-клетками центральной памяти (T_CM) осуществляют для повышения одного или более параметров или исходов после введения, например, для улучшения долговременной выживаемости, экспансии и/или приживления после введения, которые в некоторых аспектах являются особенно устойчивыми в таких субпопуляциях. См. Terakuraet al., Blood.1:72-82 (2012); Wang et al., J Immunother. 35(9):689-701 (2012). В некоторых вариантах осуществления комбинирование TCM-обогащенных CD8⁺ T-клеток и CD4⁺ T-клеток дополнительно повышает один или более параметров или исходов после введения.

[639] В вариантах осуществления T-клетки памяти присутствуют и в CD62L⁺, и в CD62L- субпопуляциях CD8⁺ лимфоцитов периферической крови. PBMC можно обогащать или истощать по CD62L-CD8⁺ и/или CD62L⁺CD8⁺ фракциям, например, с использованием антител против CD8 и против CD62L.

[640] В некоторых вариантах осуществления обогащение T-клетками центральной памяти (T_CM) основано на положительной или высокой поверхностной экспрессии CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, и/или CD127; в некоторых аспектах оно основано на отрицательной селекции клеток, экспрессирующих CD45RA и/или гранзим B или экспрессирующих CD45RA и/или гранзим на высоком уровне. В некоторых аспектах выделение CD8⁺ популяции, обогащенной клетками TCM, осуществляют посредством истощения клеток, экспрессирующих CD4, CD14, CD45RA, и положительной селекции или обогащения клетками, экспрессирующими CD62L. В одном из аспектов обогащение T-клетками центральной памяти (TCM) осуществляют, начиная с фракции клеток, подвергнутых отрицательной селекции по экспрессии CD4, которую подвергают отрицательной селекции с учетом экспрессии CD14 и CD45RA и положительной селекции с учетом CD62L. В некоторых аспектах такую селекцию осуществляют одновременно и в других аспектах ее осуществляют последовательно в любом порядке. В некоторых аспектах ту же стадию селекции с учетом экспрессии CD4, используемую для получения CD8⁺ популяции или субпопуляции клеток, также используют для получения CD4+-популяции или субпопуляции клеток, таким образом, что сохраняют положительные и отрицательные фракции после разделения с использованием CD4 и используют их в последующих стадиях способов, необязательно, после одной или более дополнительных стадий положительной или отрицательной селекции.

[641] В конкретном примере образец PBMC или другой образец лейкоцитов подвергают селекции на CD4+-клетки, при этом сохраняя отрицательные и положительные фракции. Затем отрицательную фракцию подвергают отрицательной селекции с учетом экспрессии CD14 и CD45RA или CD19 и положительной селекции с учетом характеристик маркеров T-клеток центральной памяти, таких как CD62L или CCR7, где положительную и отрицательную селекцию осуществляют в любом порядке.

[642] CD4⁺ T-хелперные клетки сортируют на наивные клетки, клетки центральной памяти и эффекторные клетки посредством идентификации популяций клеток, имеющих поверхностные клеточные антигены. CD4⁺ лимфоциты можно получать стандартными способами. В некоторых вариантах осуществления наивные CD4⁺ T-лимфоциты являются CD45RO-, CD45RA⁺, CD62L⁺, CD4⁺ T-клетками. В некоторых вариантах осуществления CD4+-клетки центральной памяти являются CD62L⁺ и CD45RO⁺. В некоторых вариантах осуществления эффекторные CD4+-клетки являются CD62L- и CD45RO-.

[643] В одном из примеров в случае обогащения CD4+-клетками посредством отрицательной селекции смесь моноклональных антител, как правило, включает антитела против CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах осуществления антитело или партнер по связыванию связаны с твердой подложкой или матрицей, такой как магнитная частица или парамагнитная частица, для осуществления разделения клеток для положительной и/или отрицательной селекции. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки и популяции клеток разделяют или выделяют способами иммуно-магнитного (или аффинно-магнитного) разделения (обзор в Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In vitro and In vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks и U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).

[644] В некоторых аспектах образец или композицию клеток, подлежащие разделению, инкубируют с небольшим, намагничивающимся или чувствительным к магнитному полю материалом, таким как чувствительные к магнитному полю частицы или микрочастицы, такие как парамагнитные частицы (например, такие как Dynabeads или частицы для MACS). Чувствительный к магнитному полю материал, например, частицы, как правило, прямо или косвенно соединяют с партнером по связыванию, например, антителом, специфически связывающимся с молекулой, например, поверхностным маркером, присутствующим на клетке, клетках или популяции клеток, которые желательно отделить, например, желательно подвергнуть отрицательной или положительной селекции.

[645] В некоторых вариантах осуществления магнитная частица содержит чувствительный к магнитному полю материал, связанный со специфическим связывающим веществом, таким как антитело или другой партнер по связыванию. Существу множество хорошо известных чувствительных к магнитному полю материалов, используемых в способах магнитного разделения. Подходящие магнитные частицы включают частицы, описанные в патенте США № 4452773 Molday и европейской патентной публикации № EP 452342 B, включенных, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки. Другими примерами являются коллоидные частицы, такие как частицы, описанные в патенте США № 4795698 Owen и патенте США № 5200084 Liberti et al.

[646] Инкубацию, как правило, осуществляют в условиях, в которых антитела или партнеры по связыванию или молекулы, такие как вторичные антитела или другие реагенты, специфически связывающиеся с такими антителами или партнерами по связыванию, соединенными с магнитной частицей, специфически связываются с молекулами поверхности клетки, если они присутствуют на клетках в образце.

[647] В некоторых аспектах образец помещают в магнитное поле, и клетки, содержащие чувствительные к магнитному полю или намагничивающиеся частицы, присоединенные к ним, будут притягиваться к магниту и отделяться от немеченых клеток. В случае положительной селекции сохраняют клетки, притягиваемые к магниту; в случае отрицательной селекции сохраняют клетки, непритягиваемые к магниту (немеченые клетки). В некоторых аспектах комбинирование положительной и отрицательной селекции осуществляют в ходе одной и той же стадии селекции, при этом сохраняют положительные и отрицательные фракции и затем обрабатывают их или подвергают дополнительным стадиям разделения.

[648] В определенных вариантах осуществления чувствительные к магнитному полю частицы покрывают первичными антителами или другими партнерами по связыванию, вторичными антителами, лектинами, ферментами или стрептавидином. В определенных вариантах осуществления магнитные частицы присоединяют к клеткам посредством покрытия первичными антителами, специфическими для одного или более маркеров. В определенных вариантах осуществления клетки, а не частицы, метят первичным антителом или партнером по связыванию, а затем добавляют магнитные частицы, покрытые специфическим для типа клеток вторичным антителом или другим партнером по связыванию (например, стрептавидином). В определенных вариантах осуществления покрытые стрептавидином магнитные частицы используют в комбинации с биотинилированными первичными или вторичными антителами.

[649] В некоторых вариантах осуществления чувствительные к магнитному полю частицы оставляют неприсоединенными к клеткам, подлежащим дальнейшей инкубации, культивированию и/или конструированию; в некоторых аспектах частицы оставляют присоединенными к клеткам для введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления намагничивающиеся или чувствительные к магнитному полю частицы удаляют из клеток. Способы удаления намагничивающихся частиц из клеток известны и включают, например, использование конкурирующих немеченых антител и намагничивающихся частиц или антител, конъюгированных с расщепляющимися линкерами. В некоторых вариантах осуществления намагничивающиеся частицы являются биодеградируемыми.

[650] В некоторых вариантах осуществления аффинную селекцию осуществляют посредством активируемой магнитным полем сортировки клеток (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Системы для активируемой магнитным полем сортировки клеток (MACS) можно использовать для селекции клеток с присоединенными намагниченными частицами с высокой чистотой. В определенных вариантах осуществления MACS используют в режиме, в котором нецелевые и целевые молекулы последовательно элюируют после приложения внешнего магнитного поля. Т.е. клетки, присоединенные к намагниченным частицами, удерживаются на месте, в то время как неприсоединенные молекулы элюируют. Затем, после завершения этой первой стадии элюции, молекулы, захваченные магнитным полем и удерживаемые от элюции, высвобождают таким образом, что их можно элюировать и выделять. В определенных вариантах осуществления нецелевые клетки метят и истощают в гетерогенной популяции клеток.

[651] В определенных вариантах осуществления выделение или разделение осуществляют с использованием системы или устройства, с помощью которого осуществляют одну или более стадий способов выделения, получения клеток, разделения, обработки, инкубации, культивирования и/или составления. В некоторых аспектах систему используют для осуществления каждой из этих стадий в закрытой или стерильной среде, например, для минимизации ошибок, работы пользователя и/или контаминации. В одном из примеров система является системой, описанной в публикации PCT № WO2009/072003 или US 20110003380 A1.

[652] В некоторых вариантах осуществления с помощью системы или устройства осуществляют одно или более, например, все из стадий выделения, обработки, конструирования и составления во встроенной или автономной системе и/или автоматизированной или программируемой системе. В некоторых аспектах система или устройство включает компьютер и/или компьютерную программу, сопряженную с системой или устройством, позволяющую пользователю программировать, контролировать, оценивать исход и/или корректировать различные аспекты стадий обработки, выделения, конструирования и составления.

[653] В некоторых аспектах разделение и/или другие стадии осуществляют с использованием системы CliniMACS (Miltenyi Biotec), например, для автоматизированного разделения клеток на клиническом уровне в закрытой и стерильной системе. Компоненты могут включать встроенный микрокомпьютер, модуль для магнитного разделения, перистальтический насос и различные запорные клапаны. В некоторых аспектах встроенный компьютер контролирует все компоненты устройства и направляет выполнение системой повторных операций в стандартизированной последовательности. В некоторых аспектах модуль магнитного разделения включает передвижной постоянный магнит и держатель для селекционной колонки. Перистальтический насос контролирует скорость потока на всем протяжении комплекта трубок и вместе с запорными клапанами обеспечивает контролируемый ток буфера через систему и непрерывное суспендирование клеток.

[654] В некоторых аспектах в системе CliniMACS используют соединенные с антителом намагничивающиеся частицы, поставляемые в стерильном непирогенном растворе. В некоторых вариантах осуществления после мечения клеток магнитными частицами клетки промывают для удаления избытка частиц. Затем мешок для препарата клеток подсоединяют к комплекту трубок, который в свою очередь подсоединяют к мешку, содержащему буфер, и мешку для сбора клеток. Комплект трубок состоит из заранее собранных стерильных трубок, включая предколонку и колонку для разделения, и предназначен исключительно для однократного использования. После начала программы разделения система автоматически подает образец клеток на колонку для разделения. Меченые клетки удерживаются в колонке, в то время как немеченые клетки удаляют с помощью серии стадий промывки. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для использования со способами, представленными в настоящем описании, являются немечеными и не удерживаются в колонке. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для использования со способами, представленными в настоящем описании, являются мечеными и удерживаются в колонке. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для использования со способами, представленными в настоящем описании, элюируют из колонки после устранения магнитного поля и собирают в мешок для сбора клеток.

[655] В определенных вариантах осуществления разделение и/или другие стадии осуществляют с использованием системы CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). В некоторых аспектах система CliniMACS Prodigy оборудована модулем для обработки клеток, делающим возможной автоматизированную промывку и фракционирование клеток посредством центрифугирования. Система CliniMACS Prodigy также может включать встроенную камеру и программное обеспечение для распознавания изображений, с помощью которых определяют оптимальную конечную точку фракционирования клеток посредством различения макроскопических слоев исходного клеточного продукта. Например, периферическую кровь автоматически разделяют на слои эритроцитов, лейкоцитов и плазмы. Система CliniMACS Prodigy также может включать встроенную камеру для культивирования клеток, выполняющую протоколы культивирования клеток, такие как, например, дифференцировка и экспансия клеток, нагрузку антигеном и длительное культивирование клеток. С помощью входных портов можно осуществлять стерильное удаление и пополнение сред и клетки можно подвергать мониторингу с использованием встроенного микроскопа. См., например, Klebanoff et al., J Immunother. 35(9): 651-660 (2012), Terakura et al., Blood. 1:72-82 (2012), и Wang et al., J Immunother. 35(9):689-701 (2012).

[656] В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, представленную в настоящем описании, собирают и обогащают (или истощают) посредством проточной цитометрии, при которой клетки, окрашенные на множество поверхностных клеточных маркеров, перемещаются в потоке жидкости. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, представленную в настоящем описании, собирают и обогащают (или истощают) посредством препаративной сортировки (FACS). В определенных вариантах осуществления популяцию клеток, представленную в настоящем описании, собирают и обогащают (или истощают) с использованием чипов микроэлектромеханических систем (MEMS) в комбинации с системой детекции на основе FACS (см., например, WO 2010/033140, Cho et al., Lab 10 Chip 1567-1573 (2010); и Godin et al., J Biophoton. 1(5):355-376 (2008)). В обоих случаях клетки можно метить множеством маркеров, делая возможным выделение хорошо известных субпопуляций T-клеток с высокой чистотой.

[657] В некоторых вариантах осуществления антитела или партнеров по связыванию метят одним или более детектируемыми маркерами для облегчения разделения при положительной и/или отрицательной селекции. Например, разделение может быть основано на связывании с флуоресцентно мечеными антителами. В некоторых примерах разделение клеток, основанное на связывании антител или других партнеров по связыванию, специфических для одного или более поверхностных клеточных маркеров, осуществляют в потоке жидкости, например, посредством активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS), включая препаративную FACS и/или чипы микроэлектромеханических систем (MEMS), например, в комбинации с системой детекции на основе проточной цитометрии. Такие способы делают возможной положительную и отрицательную селекцию одновременно на основе множества маркеров.

[658] В некоторых вариантах осуществления способы получения включают стадии замораживания, например, криоконсервации, клеток до или после выделения, инкубации и/или конструирования. В некоторых вариантах осуществления на стадии замораживания и последующего размораживания удаляют гранулоциты и, в некоторой степени, моноциты в популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки суспендируют в растворе для замораживания, например, после стадии промывки для удаления плазмы и тромбоцитов. В некоторых аспектах можно использовать любой из множества известных растворов и параметров для замораживания. Один из примеров включает использование PBS, содержащего 20% DMSO и 8% сывороточного альбумина человека (HSA), или другие подходящие среды для замораживания клеток. Затем их разводят 1:1 средами таким образом, что конечная концентрация DMSO и HSA составляет 10% и 4%, соответственно. Затем клетки, как правило, замораживают до -80°C со скоростью 1°C в минуту и хранят в паровой фазе в резервуаре для хранения с жидким азотом.

[659] В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют и/или культивируют до использования генетической инженерии или применительно к ней. Стадии инкубации могут включать культивирование, стимуляцию, активацию и/или выращивание. Инкубацию и/или конструирование можно осуществлять в культуральном сосуде, таком как модуль, камера, лунка, колонка, пробирка, комплект трубок, клапан, сосуд, культуральная чашка, мешок или другой контейнер для культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления композиции или клетки инкубируют в присутствие стимулирующих условий или стимулирующего средства. Такие условия включают условия, предназначенные для индуцирования пролиферации, экспансии, активации и/или выживаемости клеток в популяции, для имитации воздействия антигена и/или примирования клеток для генетической инженерии, такой как встраивание рекомбинантного антигенного рецептора.

[660] Условия могут включать одно или более из конкретных сред, температуры, содержания кислорода, содержания диоксида углерода, времени, средств, например, питательных веществ, аминокислот, антибиотиков, ионов и/или стимулирующих факторов, таких как цитокины, хемокины, антигены, партнеры по связыванию, слитые белки, рекомбинантные растворимые рецепторы и любые другие средства, предназначенные для активации клеток.

[661] В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия или средства включают одно или более средств, например, лигандов, способных активировать внутриклеточный сигнальный домен комплекса TCR. В некоторых аспектах средство запускает или инициирует внутриклеточный сигнальный каскад TCR/CD3 в T-клетке. Такие средства могут включать антитела, такие как антитела, специфические для TCR, например, антитела против CD3. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают одно или более средств, например, лигандов, способных стимулировать костимуляторный рецептор, например, антитело против CD28. В некоторых вариантах осуществления такие средства и/или лиганды могут быть связаны с твердой подложкой, такой как частица, и/или одним или более цитокинами. Необязательно, способ выращивания может дополнительно включать стадию добавления антитела против CD3 и/или антитела против CD28 в среду для культивирования (например, в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5 нг/мл). В некоторых вариантах осуществления стимулирующие средства включают ИЛ-2 и/или ИЛ-15, например, концентрация ИЛ-2 составляет по меньшей мере приблизительно 10 ед./мл.

[662] В некоторых аспектах инкубацию осуществляют такими способами, как описано в патенте США № 6040177 Riddell et al., Klebanoff et al., J Immunother. 35(9): 651-660 (2012), Terakura et al., Blood. 1:72-82(2012) и/или Wang et al., J Immunother. 35(9):689-701 (2012).

[663] В некоторых вариантах осуществления T-клетки выращивают посредством добавления в композицию поддерживающих культуру фидерных клеток, таких как неделящиеся мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), (например, таким образом, что получаемая популяция клеток содержит по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20 или 40 или более фидерных клеток PBMC на каждый T-лимфоцит в исходной популяции, подлежащей выращиванию), и инкубации культуры (например, в течение периода времени, достаточного для выращивания количеств T-клеток). В некоторых аспектах неделящиеся фидерные клетки могут содержать гамма-облученные фидерные клетки PBMC. В некоторых вариантах осуществления PBMC облучают гамма-излучением в диапазоне приблизительно от 3000 до 3600 рад для предотвращения деления клеток. В некоторых аспектах фидерные клетки добавляют в среду для культивирования перед добавлением популяций T-клеток.

[664] В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают температуру, подходящую для роста T-лимфоцитов человека, например, по меньшей мере приблизительно 25°C, как правило, по меньшей мере приблизительно 30°C и, как правило, 37°C или приблизительно 37°C. Необязательно, инкубация может дополнительно включать добавление неделящихся EBV-трансформированных лимфобластных клеток (LCL) в качестве фидерных клеток. LCL можно облучать гамма-излучением в диапазоне приблизительно от 6000 до 10000 рад. В некоторых аспектах фидерные клетки LCL используют в любом подходящем количестве, например, при соотношении фидерных клеток LCL и исходных T-лимфоцитов по меньшей мере приблизительно 10:1.

[665] В вариантах осуществления антиген-специфические T-клетки, такие как антиген-специфические CD4⁺ и/или CD8⁺ T-клетки, получают посредством стимуляции наивных или антиген-специфических T-лимфоцитов антигеном. Например, можно получать антиген-специфические линии или клоны T-клеток для антигенов цитомегаловируса посредством выделения T-клеток из инфицированных индивидуумов и стимуляции клеток in vitro тем же антигеном.

C. Модифицированная экспрессия молекул, ассоциированных с иммуносупрессорной передачей сигнала

[666] В некоторых аспектах изобретение относится к генетически сконструированным клеткам, включая клетки, экспрессирующие рекомбинантные рецепторы (например, CAR-T-клетки), модифицированные по экспрессии молекулы (например, белка), вовлеченной в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, включая молекулы, положительно или отрицательно регулируемые IDO-опосредованным катаболизмом, например, недостаточностью триптофана или накоплением кинуренина или другого метаболита триптофана. В некоторых аспектах модификация включает экспрессию молекулы (например, белка), вовлеченной в захват, транспорт и/или метаболизм триптофана.

[667] В некоторых вариантах осуществления молекула представляет собой молекулу, отрицательно регулируемую IDO-опосредованным катаболизмом, такую как молекула, экспрессия или активность которой снижена или ингибирована в ответ на IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, триптофановое голодание или недостаточность и/или кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, при этом сниженная экспрессия или активность приводит к иммуносупрессорной активности клетки, вовлечена в нее, или ассоциирована с ней, или облегчает ее. Неограничивающие примеры таких белков включают mTOR и PKC тета, являющиеся белками, ингибируемыми в ответ на IDO-опосредованный катаболизм (см., например, Metz et al. (2012) Oncoimmunology, 1:1460-1468). Другие примеры включают транспортеры аминокислот, такие как транспортеры аминокислот L-типа (LAT), вовлеченные в захват аминокислот из окружения (Wang et al. (2015) Am J Cancer Res 5(4):1281-1294). В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированные клетки по изобретению модифицируют посредством рекомбинантной, достигнутой посредством конструирования или эктопической экспрессии белка, отрицательно регулируемого IDO-опосредованным катаболизмом, например, посредством встраивания в клетку экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, например, кодирующей mTOR или PKC-тета. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированные клетки по изобретению модифицируют посредством рекомбинантной, достигнутой посредством конструирования или эктопической экспрессии молекулы, которая может повышать захват аминокислот, таких как триптофан, из микроокружения, которое может содержать низкие уровни аминокислот, такой как транспортеры аминокислот, например, тяжелая цепь CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортер аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) и/или протонный транспортер аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4).

[668] В некоторых вариантах осуществления молекула представляет собой молекулу, положительно регулируемую IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или в ответ на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, такую как молекула, экспрессия, активность или транспорт которой в клетке повышены или стимулируются в ответ на IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, триптофановое голодание или недостаточность и/или в ответ на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, при этом повышенные или стимулированные экспрессия, активность или транспорт приводят к иммуносупрессорной активности клетки, вовлечены в нее, или ассоциированы с ней, или облегчают ее. Неограничивающие примеры таких белков включают GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2. Например, GCN2 вовлечен в стрессовый киназный путь, активирующийся после IDO-опосредованной деградации триптофана (Sucher et al. (2010) Int. J. Tryptophan Res., 3:113-120). В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированные клетки по изобретению модифицируют посредством сниженной или нарушенной экспрессии гена, кодирующего такие белки, например, посредством сниженной или нарушенной экспрессии гена, кодирующего GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2.

[669] В некоторых аспектах опухолевые клетки или злокачественные клетки могут демонстрировать высокие уровни экспрессии или положительную регуляцию экспрессии транспортеров аминокислот, например, транспортеров триптофана, таких как LAT1/CD98hc или LAT2/CD98hc, с повышением захвата аминокислот, например, триптофана, из окружения и созданием условий с истощением триптофана, препятствующим пролиферации иммунных клеток, например, T-клеток (см., например, Broer et al. (2011) Biochem. J. 436, 193-211; Wang et al. (2015) Am J Cancer Res 5(4):1281-1294; Ribas, A. (2015) Cancer Discov. 5(9): 915-919), в качестве механизма уклонения от противоопухолевого иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления клетки, вводимые для клеточной терапии, например, адоптивной клеточной терапии, можно конструировать так, чтобы они выживали, конкурировали или пролиферировали в таком окружении, например, посредством рекомбинантной экспрессии или гиперэкспрессии транспортеров аминокислот и/или снижения экспрессии молекулы, вовлеченной в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, например, GCN2, белка, гомологичного CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), Blimp-1, AHR или ARNT. В некоторых вариантах осуществления индивидуумов, имеющих опухоли или злокачественные новообразования с повышенными уровнями LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4, можно идентифицировать или выбирать для лечения с помощью любых из способов, клеток, композиций и/или наборов, представленных в настоящем описании.

[670] В некоторых вариантах осуществления модификацию экспрессии молекулы (например, белка), вовлеченной в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, включая молекулы, положительно или отрицательно регулируемые IDO-опосредованным катаболизмом, например, недостаточностью триптофана или накоплением кинуренина или другого метаболита триптофана, осуществляют посредством встраивания в клетку, подлежащую конструированию, нуклеиновых кислот для эктопической или рекомбинантной экспрессии молекулы или нуклеиновых кислот, которые могут репрессировать, снижать экспрессию или повреждать ген, кодирующий молекулу, вместе с нуклеиновыми кислотами, кодирующими рекомбинантный рецептор, например, CAR. Например, в некоторых вариантах осуществления в клетку встраивают первую нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный рецептор, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу или ее часть или средство, способное модифицировать экспрессию молекулы (например, средство, являющееся средством, снижающим или способным снижать экспрессию молекулы или средства, способного повреждать ген, кодирующий молекулу).

[671] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный рецептор, и нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу или ее часть или средство, способное модифицировать экспрессию молекулы, могут содержаться в одном, двух, трех или более полинуклеотидах и/или векторах в любой комбинации или расположении. Векторы могут являться любыми из векторов, представленных в настоящем описании, включая вирусные векторы и экспрессирующие векторы. Например, в некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид, вектор или конструкция содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный рецептор, и второй полинуклеотид, вектор или конструкция содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный рецептор, и нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу или ее часть или средство, способное модифицировать экспрессию молекулы. В некоторых вариантах осуществления один или более компонентов молекулы или средства, способного модифицировать экспрессию молекулы, может кодироваться одним или более полинуклеотидами. Каждая из нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, и нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу или ее часть или средство, способное модифицировать экспрессию молекулы, может быть функционально связана с промотором для экспрессии или может быть функционально связана с одним промотором в одном полинуклеотиде. Каждый из полинуклеотидов может являться мультицистронным. Каждый из полинуклеотидов также может кодировать один или более маркеров, таких как поверхностный маркер, например, укороченный EGFR (tEGFR) или Thy1.1. В некоторых вариантах осуществления, если встраивают два или более полинуклеотидов, два или более полинуклеотидов могут кодировать одинаковые или разные поверхностные маркеры.

[672] Изобретение также относится к композициям, содержащим один или более из полинуклеотидов, векторов или конструкций, таких как любые из описанных выше. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, векторы, конструкции или композиции можно использовать для конструирования клеток, таких как T-клетки, для экспрессии любых рекомбинантных рецепторов, молекул, вовлеченных в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, включая молекулы, положительно или отрицательно регулируемые IDO-опосредованным катаболизмом, например, недостаточностью триптофана или накоплением кинуренина или другого метаболита триптофана, и/или средства, способного модифицировать экспрессию таких молекул.

1. Рекомбинантная, достигнутая посредством конструирования и/или эктопическая экспрессия

[673] В некоторых вариантах осуществления способы получения генетически сконструированных клеток включают рекомбинантную или эктопическую экспрессию в клетке молекулы, например, белка, вовлеченной в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, такой как молекула, отрицательно регулируемая IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией, например, mTOR или PKC-тета, или транспортеров аминокислот, таких как транспортеры аминокислот L-типа (LAT). В некоторых вариантах осуществления в клетку встраивают молекулу нуклеиновой кислоты, например, вектор, кодирующую молекулу, отрицательно регулируемую IDO-опосредованным катаболизмом (например, mTOR или PKC-тета), или кодирующую одну или более цепей транспортеров аминокислот (например, тяжелую цепь CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортер аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) и/или протонный транспортер аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4)), при этом встраивание можно осуществлять одновременно или последовательно с встраиванием нуклеиновой кислоты, кодирующей трансгенный рецептор, такой как CAR.

[674] В некоторых вариантах осуществления молекула, например, белок, вовлеченная в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, такая как молекула, отрицательно регулируемая IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией, представляет собой или содержит mTOR или его функциональный фрагмент, или функциональный вариант, или часть, такие как функциональный фрагмент, или функциональный вариант, или часть, являющиеся каталитически активными, и/или экспрессия или активность которых отрицательно регулируется (например, снижена) IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией. Известны плазмиды или векторы, приводящие к эктопической экспрессией mTOR, и их можно получать с помощью стандартной технологии рекомбинантных ДНК или можно приобретать в коммерческих источниках (см., например, Zhao et al. (2016) Nature Communications, 7:11309; Dressen et al. (2010) Biotechnolgoy and Bioengineering, 108:853-866). В некоторых вариантах осуществления mTOR содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 20, или ее функциональный вариант или часть, содержащие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 20, или является ее функциональным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления mTOR кодируется последовательностью нуклеотидов, содержащей последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 21, или последовательность нуклеотидов, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 21, и кодирующую функциональный белок, его вариант или фрагмент. В некоторых вариантах осуществления mTOR является белком человека.

[675] В некоторых вариантах осуществления молекула, например, белок, вовлеченная в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, такая как молекула, отрицательно регулируемая IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией, представляет собой или содержит PKC-тета или ее функциональный фрагмент, или функциональный вариант, или часть, такие как функциональный фрагмент, или функциональный вариант, или часть, являющиеся каталитически активными, и/или экспрессия или активность которых отрицательно регулируется (например, снижена) IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией. Известны плазмиды или векторы, приводящие к эктопической экспрессии PKC-тета, и их можно получать с помощью стандартной технологии рекомбинантных ДНК или можно приобретать в коммерческих источниках (см., например, Belguise et al. (2012) Oncogene, 31:4889-4897; Wing-yiu et al. (2010) J Biol. Chem., 285:23889-98). В некоторых вариантах осуществления PKC-тета содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22, или ее функциональный вариант или часть, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 22, или является ее функциональный фрагментом. В некоторых вариантах осуществления PKC-тета кодируется последовательностью нуклеотидов, содержащей последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO: 23, или последовательность нуклеотидов, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 23, и кодирующую функциональный белок, его вариант или фрагмент. В некоторых вариантах осуществления PKC-тета является белком человека.

[676] В некоторых вариантах осуществления молекула, например, белок, вовлеченная в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, такая как молекула, отрицательно регулируемая IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией, представляет собой или содержит транспортер аминокислот, например, транспортер триптофана. В TME положительная регуляция IDO1 и/или транспортеров аминокислот злокачественными или опухолевыми клетками или "фоновыми" клетками может приводить к условиям аминокислотного голодания, например, условиям триптофанового голодания. Таким образом, пролиферация и/или функция иммунных клеток, например, сконструированных T-клеток, может супрессироваться в результате отсутствия достаточного количества триптофана в микроокружении. Рекомбинантно или эктопически экспрессирующиеся молекулы, например, транспортеры аминокислот, в иммунной клетке могут позволять иммунным клеткам отвечать на триптофановое голодание или недостаточность, например, посредством более эффективного захвата триптофана или других аминокислот в окружении с аминокислотным голоданием, сформировавшимся в результате активности IDO1 и/или положительной регуляции транспортеров аминокислот опухолевыми или злокачественными клетками и/или фоновыми клетками. В некоторых вариантах осуществления сконструированные T-клетки также конструируют для рекомбинантной или эктопической экспрессии одной или более цепей транспортеров аминокислот или одного или более транспортеров аминокислот, выбранных из тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) и/или протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4).

[677] В некоторых вариантах осуществления молекула, например, белок, ассоциированная с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность, является транспортером аминокислот. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является транспортером из семейства SLC (транспортера растворенных веществ). В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является транспортером триптофана. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является транспортером аргинина.

[678] В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является гетеромерным транспортером аминокислот (HAT). HAT являются антипортерами аминокислот (обменниками) со стехиометрией 1:1. В некоторых вариантах осуществления HAT состоят из тяжелой цепи (семейство SLC3) и легкой цепи (семейство SLC7), соединенных консервативным дисульфидным мостиком. В основном, тяжелая цепь необходима для транспорта голотранспортера к мембране, в то время как легкая цепь катализует функцию транспортера. Как правило, люди имеют две тяжелые цепи: rBAT (относящуюся к транспорту нейтральных или катионных аминокислот широкой специфичности, также названную SLC3A1; пример последовательности приведен в SEQ ID NO: 36) и 4F2hc (тяжелая цепь поверхностного клеточного антигена 4F2; также названную тяжелой цепью CD98 или SLC3A2; пример последовательности приведен в SEQ ID NO:37) в семействе SLC3 человека. Члены семейства тяжелых цепей (SLC3) представляют собой мембранные N-гликопротеины типа II с одним трансмембранным сегментом, внутриклеточным N-концом и большим внеклеточным C-концом. Как правило, у людей шесть членов SLC7 (LAT1 (SLC7A5; пример последовательности приведен в SEQ ID NO:38), LAT2 (SLC7A8; пример последовательности приведен в SEQ ID NO:39), y+LAT1 (SLC7A7), y+LAT2 (SLC7A6), Asc-1 (SLC7A10; пример последовательности приведен в SEQ ID NO:40) и xCT (SLC7A11)) гетеродимеризуются с 4F2hc. Члены семейства легких цепей (SLC7) имеют 12-трансмембранную топологию доменов и обладают гомологией с бактериальными транспортерами аминокислот (см., например, Broer et al. (2011) Biochem. J. 436, 193-211; Wang et al. (2015) Am J Cancer Res 5(4):1281-1294). Также см. Lin et al., Neoplasia. 2004 Jan; 6(1): 74-84; Barollo et al., PLoS One. 2016; 11(5): e0156044.

[679] В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является транспортером аминокислот L-типа (LAT). В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот содержит гетеродимер 4F2hc (CD98hc)/LAT1 или гетеродимер 4F2hc (CD98hc)/LAT2, образующие систему транспорта L-типа (переносит большие нейтральные аминокислоты, например, лейцин). В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот содержит гетеродимер 4F2hc (CD98hc)/Asc-1 или гетеродимер, содержащий Asc-2, которые могут образовывать транспортер ASC (транспортеры с предпочтением в отношении аланина, серина и цистеина).

[680] В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является транспортером семейства SLC6. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является SLC6A14 (ATB^0,+; пример последовательности приведен в SEQ ID NO:41), транспортером нейтральных и катионных аминокислот (система B0,+), или SLC6A19 (B⁰AT1, транспортером нейтральных (0) аминокислот 1 широкого спектра; пример последовательности приведен в SEQ ID NO:42), переносящими все 16 нейтральных аминокислот при совместном транспорте с 1 Na⁺. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является транспортером T-типа (транспортером ароматических аминокислот), таким как TAT1 (также известный как транспортер монокарбоксилата 10 или SLC16A10; пример последовательности приведен в SEQ ID NO:43). В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является транспортером семейства SLC36. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является протонным транспортером аминокислот 4 (PAT4; также известным как SLC36A4; пример последовательности приведен в SEQ ID NO:44), равновесным транспортером пролина и триптофана, несопряженным с совместным протонным транспортом.

[681] В некоторых вариантах осуществления молекула, например, белок, вовлеченная в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, такая как молекула, отрицательно регулируемая IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией, представляет собой или содержит транспортер аминокислот, например, транспортер аминокислот, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36-44, или ее функциональный вариант или часть, например, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 36-44. В некоторых вариантах осуществления транспортеры аминокислот кодируются последовательностью нуклеотидов, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36-44, или ее функциональный вариант или часть, например, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 36-44, и кодирующую функциональный белок, его вариант или фрагмент. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является белком человека или его вариантом.

[682] В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является гетеродимером, содержащим тяжелую цепь (например, 4F2hc), содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36 или 37, или ее функциональный вариант или часть, например, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 36 или 37, и легкую цепь (например, LAT1, LAT2 или Asc-1), содержащую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 38-40, или ее функциональный вариант или часть, например, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к любой из SEQ ID NO: 38-40. В некоторых вариантах осуществления транспортеры аминокислот кодируются последовательностью нуклеотидов, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую тяжелую цепь (например, 4F2hc), содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36 или 37, или ее функциональный вариант или часть, например, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 36 или 37, и легкую цепь (например, LAT1, LAT2 или Asc-1), содержащую любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 38-40, или ее функциональный вариант или часть, например, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к любой из SEQ ID NO: 38-40. В некоторых вариантах осуществления транспортер аминокислот является белком человека или его вариантом.

[683] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, такой как рекомбинантный, например, химерный, рецептор, и молекулу, отрицательно регулируемую IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией, такую как mTOR или PKC-тета, или ее функциональную часть, встраивают в клетку для экспрессии. В некоторых вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота кодирует генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, и вторая нуклеиновая кислота кодирует молекулу, отрицательно регулируемую IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией, такую как mTOR или PKC-тета, или одну или более цепей транспортеров аминокислот или один или более транспортеров аминокислот, выбранных из тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) и/или протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4). В некоторых вариантах осуществления первая и вторая нуклеиновые кислоты.

[684] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, такой как рекомбинантный, например, химерный, рецептор, и молекула, вовлеченная и/или ассоциированная с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность, например, транспортер аминокислот, такой как одна или более цепей транспортера аминокислот, например, транспортер семейства SLC (транспортер растворенных веществ) или его функциональная часть, встраивают в клетку для экспрессии. В некоторых вариантах осуществления в клетку встраивают одну или более молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих одну или более цепей или компонентов транспортера аминокислот и один или более компонентов генетически сконструированного рецептора. Например, в некоторых вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота кодирует генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, и вторая нуклеиновая кислота кодирует одну или более цепей транспортера аминокислот, такую как одна или более цепей CD98hc и/или LAT1 или LAT2. В некоторых вариантах осуществления одна или более цепей транспортера аминокислот L-типа рекомбинантно или эктопически экспрессируется в клетке, например, при встраивании одного или более полинуклеотидов, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие одну или более цепей транспортера аминокислот и/или один или более транспортеров аминокислот.

[685] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота является мультицистронной, такой как бицистронная, или иным образом делает возможной коэкспрессию множества отдельных пептидных цепей, например, двух или более, с одного промотора. В некоторых вариантах осуществления транскрипт потенциально может кодировать несколько конечных продуктов, например, два конечных продукта. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот содержит внутренний участок связывания рибосомы (IRES), разделяющий кодируемые молекулы таким образом, что генетически сконструированный рецептор и молекула, вовлеченная в метаболический путь, экспрессируются под контролем одного промотора. В рамках изобретения термин "внутренний участок связывания рибосомы" (IRES) относится к нуклеотидной последовательности, делающей возможной инициацию трансляции в середине последовательности матричной РНК (мРНК) как часть синтеза белка.

[686] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает одну или более последовательностей проскакивания рибосомы, такие как пептид проскакивания рибосомы 2A пикорнавируса, таким образом, что две или более пептидных цепи или другие продукты могут экспрессироваться в функциональной связи с одним промотором, но продуцироваться в виде отдельных цепей. Например, в некоторых вариантах осуществления один промотор может регулировать экспрессию РНК, содержащей в одной открытой рамке считывания (ORF) два или три гена (например, кодирующих молекулу, вовлеченную в модуляцию метаболического пути, и кодирующих рекомбинантный рецептор), отделенных друг от друга последовательностями, кодирующими саморасщепляющийся пептид (например, последовательности 2A) или участок распознавания протеазы (например, фурина). Таким образом, ORF кодирует один полипептид, который во время (в случае 2A) или после трансляции процессируется в отдельные белки. В некоторых случаях пептид, такой как T2A, может вызывать проскакивание рибосомы при синтезе пептидной связи на C-конце элемента 2A, что приводит к отделению конца последовательности 2A и следующего нижележащего пептида (см., например, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) и deFelipe et al.Traffic 5:616-626 (2004)). Многие элементы 2A известны в этой области. Неограничивающие примеры последовательностей 2A, которые можно использовать в способах и нуклеиновых кислотах, представленных в настоящем описании, включают последовательности 2A вируса ящура (F2A, например, SEQ ID NO: 49), вируса ринита лошадей A (E2A, например, SEQ ID NO: 48), вируса Thosea asigna (T2A, например, SEQ ID NO: 6 или 45), и тешовируса свиней-1 (P2A, например, SEQ ID NO: 46 или 47), как описано в патентной публикации США № 20070116690.

[687] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или нуклеиновые кислоты, кодирующие генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, и молекула, отрицательно регулируемая IDO-опосредованным катаболизмом, такая как mTOR или PKC-тета, или молекула, ассоциированная с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность, такая как одна или более цепей транспортеров аминокислот или один или более транспортеров аминокислот, таких как один или более из тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) и/или протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4), экспрессируется в одной или разных молекулах нуклеиновой кислоты и/или векторах. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты может содержать первую нуклеиновую кислоту, кодирующую генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или более цепей транспортера аминокислот, такие как одна или более цепей CD98hc и/или LAT1 или LAT2. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты и/или вектор может содержать первую нуклеиновую кислоту, кодирующую генетически сконструированный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую одну цепь транспортера аминокислот, таких как CD98hc, и третью нуклеиновую кислоту, кодирующую другую цепь транспортера аминокислот, такого как LAT1 или LAT2. В некоторых вариантах осуществления первая, вторая и/или третья нуклеиновые кислоты могут содержаться в двух или более отдельных полинуклеотидах и/или векторах. Векторы могут являться любыми из векторов, представленных в настоящем описании, включая вирусные векторы и экспрессирующие векторы.

2. Репрессия, снижение или нарушение экспрессии генов

[688] В некоторых вариантах осуществления способы получения генетически сконструированных клеток включают встраивание средства, снижающего или способного снижать экспрессию молекулы, вовлеченной в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию, такого как белок, положительно регулируемый IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией, например, GCN2, белок, гомологичный CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), Blimp-1, AHR, ARNT, эукариотический фактор инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующий фактор транскрипции 4 (ATF4), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2, в клетке, при этом встраивание можно осуществлять одновременно или последовательно со встраиванием нуклеиновой кислоты, кодирующей трансгенный рецептор, такой как CAR. В некоторых вариантах осуществления в клетки встраивают молекулу нуклеиновой кислоты, включающую средство, включенную в средство или кодирующую средство. Изобретение также относится к клеткам, содержащим генетически сконструированные (рекомбинантные) поверхностные клеточные рецепторы и имеющим сниженную или нарушенную экспрессию гена, кодирующего белок, положительно регулируемый IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией, такой как GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2. В некоторых вариантах осуществления клетки содержат средство, такое как ингибиторная молекула нуклеиновой кислоты, снижающее или репрессирующее экспрессию белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). В некоторых вариантах осуществления экспрессия, активность и/или функция снижена в результате репрессии одного или более генов, кодирующих один или более белков в клетке.

[689] В некоторых вариантах осуществления репрессию гена осуществляют посредством нарушения в гене, такого как нокаут, инсерция, миссенс-мутация или мутация со сдвигом рамки считывания, такая как биаллельная мутация со сдвигом рамки считывания, делеция всего или части гена, например, одного или более экзонов или его части, и/или нокин. В некоторых вариантах осуществления такие нарушения можно осуществлять с помощью средства, включающего специфические в отношении последовательности или направленные нуклеазы, включая ДНК-связывающие направленные нуклеазы и редактирующие геном нуклеазы, такие как нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) и подобные активатору транскрипции эффекторные нуклеазы (TALEN), и РНК-направляемые нуклеазы, такие как CRISPR-ассоциированная нуклеаза (Cas), специфически направленная на последовательность гена или его части. В некоторых вариантах осуществления такие специфические в отношении последовательности или направленные нуклеазы кодируются ингибиторной молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления такие нуклеазы могут быть направляемыми или направленными благодаря ДНК-связывающим молекулам нуклеиновой кислоты, таким как гидовая РНК (gRNA).

[100] В некоторых вариантах осуществления репрессию гена осуществляют посредством снижения экспрессии белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). В некоторых вариантах осуществления такой репрессии гена достигают с использованием ингибиторной молекулы нуклеиновой кислоты, такой как интерферирующая РНК (РНКи), короткая интерферирующая РНК (миРНК), короткая шпилечная (shRNA), микроРНК (мкРНК), антисмысловая РНК, и/или рибозимы, которые можно использовать для селективной супрессии или репрессии экспрессии гена. Технология миРНК включает технологию, основанную на РНКи с использованием двухцепочечной молекулы РНК, имеющей последовательность, гомологичную нуклеотидной последовательности мРНК, транскрибирующейся с гена, и последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности. Как правило, миРНК является гомологичной/комплементарной одной области мРНК, транскрибируемой с гена, или может являться миРНК, включающей множество молекул РНК, являющихся гомологичными/комплементарными разным областям. В некоторых вариантах осуществления репрессии гена достигают с использованием ДНК-связывающей молекулы нуклеиновой кислоты, такой как гидовая РНК (gRNA), и варианта РНК-направляемой нуклеазы, такой как ферментативно неактивный белок Cas9 (eiCas9) или слитый белок, содержащий eiCas9. В некоторых вариантах осуществления репрессии гена достигают с помощью ДНК-связывающих направленных белков, таких как белки с цинковыми пальцами (ZFP) или слитые белки, содержащие ZFP.

a. Снижение экспрессии белка

[690] В некоторых вариантах осуществления способы и клетки по изобретению приводят к нокдауну, такому как снижение или репрессия, экспрессии белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, эукариотического фактора инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующего фактора транскрипции 4 (ATF4), белка, гомологичного CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), в клетках. В некоторых вариантах осуществления нокдаун может являться транзиторным, например, зависеть от условий. В некоторых вариантах осуществления нокдаун является нетранзиторным или постоянным.

[691] В некоторых вариантах осуществления нокдауна, репрессии или снижения экспрессии белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, эукариотического фактора инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующего фактора транскрипции 4 (ATF4), белка, гомологичного CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), можно достигать с помощью РНК-интерференции (РНКи). В некоторых вариантах осуществления РНКи может быть опосредована двухцепочечными молекулами РНК (дцРНК), имеющими специфическую в отношении последовательности гомологию со своими целевыми последовательностями нуклеиновой кислоты (Caplen, N. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9742-9747 (2001)). Биохимические исследования на лизатах, несодержащих клетки дрозофилы, показали, что в некоторых вариантах осуществления медиаторы РНК-зависимого сайленсинга генов представляют собой дуплексы "малых интерферирующих" РНК размером 21-25 нуклеотидов (миРНК). миРНК можно получать при обработке дцРНК ферментом РНКазой, известной как Dicer (Bernstein, E., et al., Nature 409:363-366 (2001)). Дуплексные продукты миРНК могут рекрутироваться в многобелковый комплекс миРНК, названный РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC). В некоторых вариантах осуществления RISC затем может направляться к нуклеиновой кислоте-мишени (соответственно, мРНК), где дуплекс миРНК взаимодействует в зависимости от последовательности, опосредуя каталитическое расщепление (Bernstein, E., et al., Nature 409: 363-366 (2001); Boutla, A., et al., Curr. Biol. 11:1776-1780 (2001)). Малые интерферирующие РНК можно синтезировать и использовать способами, хорошо известными в этой области и, как правило, знакомыми специалистам в этой области. Малые интерферирующие РНК содержат от приблизительно 0 до приблизительно 50 нуклеотидов (н.). В неограничивающих примерах вариантов осуществления миРНК может содержать от приблизительно 5 до приблизительно 40 нуклеотидов, от приблизительно 5 до приблизительно 30 нуклеотидов, от приблизительно 10 до приблизительно 30 нуклеотидов, от приблизительно 15 до приблизительно 25 нуклеотидов или приблизительно 20-25 нуклеотидов.

[692] В некоторых вариантах осуществления средство РНК-интерференции, по меньшей мере, частично является двухцепочечной РНК, имеющей структуру, характерную для молекул, которые, как известно в этой области, опосредуют ингибирование экспрессии гена с помощью механизма РНКи, или цепью РНК, содержащей, по меньшей мере, частично комплементарные части, гибридизующиеся друг с другом с образованием такой структуры. Если РНК содержит комплементарные области, гибридизующиеся друг с другом, РНК будет указана как самогибридизующаяся. В некоторых вариантах осуществления ингибиторная нуклеиновая кислота, такая как средство РНК-интерференции, включает часть, по существу, комплементарную гену-мишени. В некоторых вариантах осуществления средство РНК-интерференции, необязательно, включает один или более аналогов или модификаций нуклеотидов. Специалисту в этой области будет понятно, что средства РНКи могут включать рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, аналоги нуклеотидов, модифицированные нуклеотиды или остовы и т.д. В некоторых вариантах осуществления средства РНК-интерференции можно модифицировать после транскрипции. В некоторых вариантах осуществления средства РНК-интерференции содержат одну или более цепей, гибридизующихся или самогибридизующихся с образованием структуры, содержащей дуплексную часть длиной приблизительно 15-29 нуклеотидов, необязательно, содержащую один или более неправильно спаренных или неспаренных нуклеотидов в дуплексе. В некоторых вариантах осуществления средства РНК-интерференции включают короткую интерферирующую РНК (миРНК), короткую шпилечную РНК (shRNA) и другие виды РНК, которые могут внутриклеточно процессироваться с образованием shRNA, включая, в качестве неограничивающих примеров, виды РНК, идентичные природному мкРНК-предшественнику или сконструированному предшественнику мкРНК-подобной РНК.

[693] В некоторых вариантах осуществления термин "короткая интерферирующая РНК" (миРНК) относится к нуклеиновой кислоте, включающей двухцепочечную часть длиной приблизительно 15-29 нуклеотидов и, необязательно, дополнительно содержащей одноцепочечный липкий конец (например, 1-6 нуклеотидов в длину) на одной или обеих цепях. В некоторых вариантах осуществления двухцепочечная часть может иметь длину 17-21 нуклеотид, например, 19 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления липкие концы находятся на 3′-конце каждой цепи, могут иметь длину 2 нуклеотидов и могут состоять из ДНК или аналогов нуклеотидов. миРНК может образовываться из двух цепей РНК, гибридизующихся друг с другом или, альтернативно, из более длинной двухцепочечной РНК или одной цепи РНК, включающей самогибридизующуюся часть, такую как короткая шпилечная РНК. Специалисту в этой области будет понятно, что в дуплексе, образованном двумя цепями миРНК, могут присутствовать один или более неправильно спаренных или неспаренных нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления одна цепь миРНК ("антисмысловая" или "гидовая" цепь) включает часть, гибридизующуюся с нуклеиновой кислотой-мишенью, например, транскриптом мРНК. В некоторых вариантах осуществления антисмысловая цепь полностью комплементарна мишени на протяжении приблизительно 15-29 нуклеотидов, иногда 17-21 нуклеотида, например, 19 нуклеотидов, что означает, что миРНК гибридизуется с транскриптом-мишенью без единого несовпадения по этой длине. Однако специалисту в этой области будет понятно, что в дуплексе, образованном цепью миРНК и транскриптом-мишенью, может присутствовать один или более неправильно спаренных или неспаренных нуклеотидов.

[694] В некоторых вариантах осуществления экспрессию белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), снижают или репрессируют с использованием короткой шпилечной РНК (shRNA), направленно воздействующей на нуклеиновые кислоты, кодирующие белок, положительно регулируемый IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). В некоторых вариантах осуществления короткая шпилечная РНК (shRNA) является молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере две комплементарных части, гибридизующихся или способных гибридизоваться с образованием дуплексной структуры, достаточно длинной, чтобы опосредовать РНКи (как правило, 15-29 нуклеотиды в длину), и по меньшей мере одну одноцепочечную часть, как правило, приблизительно от 1 до 10 нуклеотидов в длину, образующих петлю, соединяющую концы двух последовательностей, образующих дуплекс. В некоторых вариантах осуществления структура может дополнительно содержать липкий конец. Подходящие последовательности shRNA для нокдауна указанного гена-мишени хорошо известны в этой области, или их легко может определять специалист в этой области.

[695] В некоторых вариантах осуществления дуплекс, образующийся посредством гибридизации самокомплементарных частей shRNA, может обладать свойствами, схожими с миРНК и, как описано ниже, shRNA может процессироваться в миРНК с помощью консервативного клеточного аппарата РНКи. Таким образом, shRNA могут являться предшественниками миРНК и могут схожим образом ингибировать экспрессию транскрипта-мишени. В некоторых вариантах осуществления shRNA включает часть, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, например, транскриптом мРНК, и может быть полностью комплементарной мишени на протяжении приблизительно 15-29 нуклеотидов, иногда 17-21 нуклеотида, например, 19 нуклеотидов. Однако специалисту в этой области будет понятно, что в дуплексе, образовавшемся между цепью shRNA и транскриптом-мишенью, могут присутствовать один или более неправильно спаренных или неспаренных нуклеотидов.

[696] В некоторых вариантах осуществления shRNA содержит нуклеотидную последовательность (например, ДНК) со структурой A-B-C или C-B-A. В некоторых вариантах осуществления кассета содержит по меньшей мере два сегмента ДНК A и C или C и A, где каждый из указанных по меньшей мере двух сегментов находится под контролем отдельного промотора, как определено выше (такого как промотор РНК-полимеразы III, включая индуцибельный U6, H1 или т.п.). В указанных выше сегментах: A может являться последовательностью ДНК размером от 15 до 35 п.н. или от 19 до 29 п.н., по меньшей мере на 90% или 100% комплементарной гену, подлежащему нокдауну (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2); B может являться спейсерной последовательностью ДНК, содержащей от 5 до 9 п.н., образующей петлю экспрессирующейся молекулы шпилечной РНК, и C может являться последовательностью ДНК размером от 15 до 35 или от 19 до 29 п.н., по меньшей мере на 85% комплементарной последовательности A.

[697] В некоторых вариантах осуществления средство РНК-интерференции считают "направленным" для транскрипта и гена, кодирующего транскрипт, если (1) средство РНКи содержит часть, например, цепь, являющуюся по меньшей мере на приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% комплементарной транскрипту на протяжении области длиной приблизительно 15-29 нуклеотидов, например, области длиной по меньшей мере приблизительно 15, приблизительно 17, приблизительно 18 или приблизительно 19 нуклеотидов; и/или (2) Tm дуплекса, образованного участком из 15 нуклеотидов одной цепи средства РНКи, и 15-нуклеотидной частью транскрипта, в условиях (за исключением температуры), как правило, обнаруживаемых в цитоплазме или ядре клеток млекопитающих, составляет не более чем на приблизительно 15°C ниже или не более чем на приблизительно 10°C ниже Tm дуплекса, который мог бы быть образован теми же 15 нуклеотидами средства РНК-интерференции и точно комплементарной ему последовательности; и/или (3) стабильность транскрипта снижается в присутствие средства РНК-интерференции по сравнению с его отсутствием. В некоторых вариантах осуществления средство РНК-интерференции, направленно воздействующее на транскрипт, также можно считать направленно воздействующим на ген, кодирующий и регулирующий синтез транскрипта. В некоторых вариантах осуществления область-мишень может являться областью транскрипта-мишени, гибридизующейся с антисмысловой цепью средства РНК-интерференции. В некоторых вариантах осуществления транскрипт-мишень может являться любой РНК, являющейся мишенью для ингибирования посредством РНК-интерференции.

[698] В некоторых вариантах осуществления миРНК селективно супрессирует экспрессию белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). Кроме того, все из нуклеотидных последовательностей миРНК можно получать из нуклеотидной последовательности мРНК белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), или ее часть можно получать из нуклеотидной последовательности.

[699] В некоторых вариантах осуществления миРНК может состоять из рибонуклеотидов, и ее часть может включать иные нуклеотиды, чем рибонуклеотиды, например, дезоксирибонуклеотиды, производное дезоксирибонуклеотидов, производное рибонуклеотидов, и т.д. миРНК можно синтезировать известным способом химического синтеза, но способ конкретно не ограничен. В некоторых вариантах осуществления ее можно получать ферментативно (например, с использованием РНК-полимеразы) с использованием подходящей матричной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления миРНК может находиться в форме одноцепочечной РНК, которая может образовывать дуплекс в молекуле, и одноцепочечной РНК со структурой стебель-петля (короткая шпилечная структура: структура sh), содержащей миРНК-часть в качестве стебля и произвольную последовательность в качестве петли (shRNA). В некоторых вариантах осуществления в качестве произвольной последовательности можно использовать последовательность из от 1 до 30 нуклеотидов, от 1 до 25 нуклеотидов или от 5 до 22 нуклеотидов.

[700] Последовательность миРНК можно соответствующим образом конструировать с учетом последовательности гена, экспрессию которого желательно супрессировать. Описано множество алгоритмов для дизайна миРНК (см., например, WO 2004/0455543, и WO 2004/048566), а также можно использовать коммерчески доступное программное обеспечение. Кроме того, существует множество компаний, конструирующих миРНК с учетом информации о последовательности гена, экспрессию которого желательно супрессировать, и синтезируют и предоставляют миРНК. Таким образом, специалист в этой области легко может получать миРНК с учетом последовательности гена, экспрессию которого желательно супрессировать. В некоторых вариантах осуществления любую миРНК, селективно супрессирующую экспрессию белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), можно получать или приобретать в коммерческих источниках. Примеры миРНК для таргетинга GCN2 включают миРНК, описываемые в Barnes et al. (2009) J. Biol. Chem., 183:5768-5777; Malmberg and Adams (2008) J. Biol. Chem., 283:19229-19234 или коммерчески доступные, например, в Dharmacon (Lafayette, CO; например, кат. № D-044353-02). Примеры миРНК для таргетинга BLIMP-1 включают миРНК, описываемые в Yu et al. (2012) PLoS One, e33287; Yan et al. (2007) PNAS, 104:1841-1846) или коммерчески доступные, например, в Santa Cruz Biotechnology (CA; например, кат. № sc-37714). Примеры миРНК для таргетинга белка, гомологичного CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), включают миРНК, описываемые в Kim et al. (2012) Horm Metab Res 45 (1):9-14, Ryder et al., Biochem Biophys Res Commun. (2013) 430(4): 1283-1288 или коммерчески доступные, например, в ThermoFisher Scientific (например, кат. № AM16708). Примеры миРНК для таргетинга AHR или ARNT включают миРНК, описываемые в Adelrahim et al. (2003) Mol. Pharmacol., 63:1373-81; Overvik et al. (2014) Cell Communication and Signaling, 12:48; Ishida et al. (2010) Carcinogenesis, 31:287-295) или коммерчески доступные, например, в Applied Biological Materials (Richmond, BC, Canada; кат. № iV000726). Примеры миРНК для таргетинга ATF4 включают миРНК, описываемые в Armstrong et al., (2010) J. Biol. Chem. 285:6091:6100 или коммерчески доступные, например, в ThermoFisher Scientific (например, кат. № AM16708). Примеры миРНК для таргетинга eIF2α включают миРНК, описываемые в Fan et al. (2016) Scientific Reports 6:21145, Wang et al. (2015) PLoS ONE 10(6): e0130806 или коммерчески доступные, например, в Santa Cruz Biotechnology (например, кат. № sc-35272).

[701] В некоторых вариантах осуществления сегменты shRNA и миРНК могут дополнительно содержать стоп-последовательность и/или последовательности полиаденилирования.

[702] В некоторых вариантах осуществления антисмысловой нуклеотид можно использовать для супрессии экспрессии белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). В некоторых вариантах осуществления антисмысловой нуклеотид можно использовать для супрессии экспрессии белка, например, посредством прямого противодействия трансляции молекулы мРНК белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), посредством деградации мРНК с помощью фермента деградации РНК H, посредством противодействия 5'-кэпированию мРНК, посредством маскирования 5'-кэпа, посредством предотвращения связывания фактора трансляции с мРНК или посредством ингибирования полиаденилирования мРНК. В некоторых вариантах осуществления супрессию экспрессии белка можно осуществлять посредством гибридизации антисмыслового нуклеотида и мРНК белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). В некоторых вариантах осуществления специфический участок таргетинга на мРНК выбирают в качестве мишени антисмыслового нуклеотида для снижения стабильности или для деградации мРНК. В некоторых вариантах осуществления, если идентифицируют один или более участков-мишеней, можно конструировать нуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, в достаточной степени комплементарную участку-мишени (т.е. гибридизующуюся в достаточной степени и с достаточной специфичностью в физиологических условиях). В некоторых вариантах осуществления антисмысловой нуклеотид может иметь, например, длину цепи от 8 до 100 нуклеотидов, от 10 до 80 нуклеотидов или от 14 до 35 нуклеотидов.

[703] В некоторых вариантах осуществления способы встраивания или доставки в клетку могут быть теми же или схожими со способами, описанными выше для встраивания в клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей генетически сконструированный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления экспрессии ингибиторной нуклеиновой кислоты, такой как shRNA или миРНК, в клетках, например, T-клетках, можно достигать с использованием любой общепринятой системы экспрессии, например, лентивирусной системы экспрессии. В некоторых вариантах осуществления РНК может являться компонентом вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор содержит олигонуклеотид, ингибирующий экспрессию белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), или кодирует shRNA или другую ингибиторную нуклеиновую кислоту, имеющую такую способность. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор является лентивирусным вектором. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор является интегрирующим лентивирусным вектором.

[704] В некоторых вариантах осуществления подходящие промоторы включают, например, промоторы РНК-полимеразы III, включая, в качестве неограничивающих примеров, промоторы U6 (человека и мыши), промоторы H1 (человека и мыши) и промоторы 7SK (человека и мыши). В некоторых вариантах осуществления также можно получать гибридный промотор, содержащий элементы, полученные, например, из различных типов промоторов РНК-полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления специалист в этой области может комбинировать модифицированные промоторы, содержащие элементы последовательности, полученные из двух или более природных промоторных последовательностей, для осуществления транскрипции в желаемых условиях или в конкретном контексте. Например, хорошо охарактеризованы промоторы U6 РНК-полимеразы III человека и мыши и промоторы H1 РНК-полимеразы III. Специалист в этой области может выбирать и/или модифицировать промотор, наиболее эффективный для желаемого использования и типа клеток для оптимизации модуляции экспрессии одного или более генов. В некоторых вариантах осуществления последовательность промотора может являться промотором, не встречающимся в природе, при условии, что он функционирует в эукариотической клетке, такой как, например, клетка млекопитающего.

[705] В некоторых вариантах осуществления примером средства доставки является наночастица, например, липосома или другая подходящая система доставки субмикронного размера. В некоторых вариантах осуществления предусмотрено использование липидных составов для встраивания нуклеиновых кислот в клетку. Липидная частица может являться частицей нуклеиновая кислота-липид, которую можно получать из катионного липида, некатионного липида и, необязательно, конъюгированного липида, предотвращающего агрегацию частицы. Нуклеиновую кислоту можно инкапсулировать в липидной части частицы, таким образом, защищая ее от ферментативной деградации. Стабильная частица нуклеиновая кислота-липид может являться частицей, полученной из липидов (например, катионного липида, некатионного липида и, необязательно, конъюгированного липида, предотвращающего агрегацию частицы), где нуклеиновую кислоту полностью инкапсулируют в липиде.

[706] В некоторых вариантах осуществления липидные частицы имеют средний диаметр от приблизительно 30 нм до приблизительно 150 нм, от приблизительно 40 нм до приблизительно 150 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 150 нм, от приблизительно 60 нм до приблизительно 130 нм, от приблизительно 70 нм до приблизительно 110 нм, от приблизительно 70 нм до приблизительно 100 нм, от приблизительно 80 нм до приблизительно 100 нм, от приблизительно 90 нм до приблизительно 100 нм, от приблизительно 70 до приблизительно 90 нм, от приблизительно 80 нм до приблизительно 90 нм, от приблизительно 70 нм до приблизительно 80 нм или приблизительно 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 55 нм, 60 нм, 65 нм, 70 нм, 75 нм, 80 нм, 85 нм, 90 нм, 95 нм, 100 нм, 105 нм, 110 нм, 115 нм, 120 нм, 125 нм, 130 нм, 135 нм, 140 нм, 145 нм или 150 нм. В некоторых вариантах осуществления липидные частицы являются, по существу, нетоксичными. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, если они присутствуют в липидных частицах по настоящему изобретению, могут быть резистентными к деградации нуклеазой в водном растворе.

[707] В некоторых вариантах осуществления липидная частица обеспечивает полную инкапсуляцию нуклеиновой кислоты, частичную инкапсуляцию или и то, и другое. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту полностью инкапсулируют в липидной частице с получением частицы нуклеиновая кислота-липид.

[708] В некоторых вариантах осуществления конъюгированный липид ингибирует агрегацию липидных частиц, включая, конъюгаты полиэтиленгликоль (PEG)-липид, такие как, например, PEG, соединенный с диалкилоксипропилами (например, конъюгаты PEG-DAA), PEG, соединенный с диацилглицеринами (например, конъюгаты PEG-DAG), PEG, соединенный с холестерином, PEG, соединенный с фосфатидилэтаноламинами, и PEG, конъюгированный с церамидами, катионные PEG-липиды, конъюгаты полиоксазолин (POZ)-липид (например, конъюгаты POZ-DAA; олигомеры полиамида (например, конъюгаты ATTA-липид) и их смеси. В некоторых вариантах осуществления PEG или POZ можно конъюгировать непосредственно с липидом или можно соединять с липидом через линкерный остаток. Можно использовать любой линкерный остаток, подходящий для соединения PEG или POZ с липидом, включая, например, несодержащие сложный эфир линкерные остатки и содержащие сложный эфир линкерные остатки. В некоторых вариантах осуществления используют несодержащие сложный эфир линкерные остатки, такие как амиды или карбаматы.

[709] В некоторых вариантах осуществления амфипатический липид может иметь гидрофобную часть, ориентированную к гидрофобной фазе, и гидрофильную часть, ориентированную к водной фазе. В некоторых вариантах осуществления гидрофильные характеристики являются результатом наличия полярных или заряженных групп, таких как углеводы, фосфатная группа, карбоксильная группа, сульфатная группа, аминогруппа, сульфгидрильная группа, нитрогруппа, гидроксильная группа и другие подобные группы. В некоторых вариантах осуществления можно придавать гидрофобность посредством включения неполярных групп, включающих, в качестве неограничивающих примеров, длинноцепочечные насыщенные и ненасыщенные алифатические углеводородные группы и такие группы, замещенные одной или более ароматическими, циклоалифатическими или гетероциклическими группами. Неограничивающие примеры амфипатических соединений включают фосфолипиды, аминолипиды и сфинголипиды.

[710] Типичные неограничивающие примеры фосфолипидов включают фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидную кислоту, пальмитоилолеоилфосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин и дилинолеоилфосфатидилхолин. Другие соединения, в которых отсутствует фосфор, такие как семейства сфинголипидов, гликосфинголипидов, диацилглицерины и 3-ацилоксикислоты, также входят в группу, обозначенную как амфипатические липиды. Кроме того, амфипатические липиды, описанные выше, можно смешивать с другими липидами, включая триглицериды и стеролы.

[711] В некоторых вариантах осуществления нейтральный липид существует в незаряженной или нейтральной цвиттер-ионной форме при выбранном pH. В некоторых вариантах осуществления при физиологическом pH такие липиды включают, например, диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, церамид, сфингомиелин, цефалин, холестерин, цереброзиды и диацилглицерины.

[712] В некоторых вариантах осуществления некатионный липид может являться любым амфипатическим липидом, а также любым другим нейтральным липидом или анионным липидом.

[713] В некоторых вариантах осуществления анионный липид является отрицательно заряженным при физиологическом pH. Эти липиды включают, в качестве неограничивающих примеров, фосфатидилглицерины, кардиолипины, диацилфосфатидилсерины, диацилфосфатидные кислоты, N-додеканоилфосфатидилэтаноламины, N-сукцинилфосфатидилэтаноламины, N-глутарилфосфатидилэтаноламины, лизилфосфатидилглицерины, пальмитоилолеилфосфатидилглицерин (POPG) и другие анионные модифицирующие группы, соединенные с нейтральными липидами.

[714] В некоторых вариантах осуществления гидрофобный липид содержит неполярные группы, включающие, в качестве неограничивающих примеров, длинноцепочечные насыщенные и ненасыщенные алифатические углеводородные группы и такие группы, необязательно, замещенные одной или более ароматическими, циклоалифатическими или гетероциклическими группами. Подходящие неограничивающие примеры включают диацилглицерин, диалкилглицерин, N-N-диалкиламино,1,2-диацилокси-3-аминопропан и 1,2-диалкил-3-аминопропан. В некоторых вариантах осуществления частица нуклеиновая кислота-липид содержит: (a) нуклеиновую кислоту (например, интерферирующую РНК); (b) катионный липид, составляющий от приблизительно 50 моль % до приблизительно 65 моль % всех липидов, присутствующих в частице; (c) некатионный липид, составляющий от приблизительно 25 моль % до приблизительно 45 моль % всех липидов, присутствующих в частице; и (d) конъюгированный липид, ингибирующий агрегацию частиц, составляющий от приблизительно 5 моль % до приблизительно 10 моль % всех липидов, присутствующих в частице.

[715] В некоторых вариантах осуществления частица нуклеиновая кислота-липид содержит: (a) нуклеиновую кислоту (например, интерферирующую РНК); (b) катионный липид, составляющий от приблизительно 50 моль % до приблизительно 60 моль % всех липидов, присутствующих в частице; (c) смесь фосфолипида и холестерина или его производного, составляющую от приблизительно 35 моль % до приблизительно 45 моль % всех липидов, присутствующих в частице; и (d) конъюгат PEG-липид, составляющий от приблизительно 5 моль % до приблизительно 10 моль % всех липидов, присутствующих в частице.

[716] В некоторых вариантах осуществления частица нуклеиновая кислота-липид содержит: (a) нуклеиновую кислоту (например, интерферирующую РНК); (b) катионный липид, составляющий от приблизительно 55 моль % до приблизительно 65 моль % всех липидов, присутствующих в частице; (c) холестерин или его производное, составляющее от приблизительно 30 моль % до приблизительно 40 моль % всех липидов, присутствующих в частице; и (d) конъюгат PEG-липид, составляющий от приблизительно 5 моль % до приблизительно 10 моль % всех липидов, присутствующих в частице. В некоторых вариантах осуществления систему CRISPR/Cas можно использовать для нокдауна, такого как снижение или супрессия, экспрессии белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), например, с использованием способом, схожих с описанными в WO2015/161276. Примеры признаков системы CRISPR/Cas описаны ниже, и их можно адаптировать для использования в снижении или супрессии экспрессии молекулы вместо повреждения или делеции гена, кодирующего молекулу, с использованием ферментативно неактивной нуклеазы. В некоторых вариантах осуществления гидовую РНК (gRNA) против гена, кодирующего белок, положительно регулируемый IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), или промотор, энхансер или другие цис- или транс-регуляторные области, можно встраивать в комбинации с модифицированным белком Cas9 или слитым белком, содержащим модифицированный белок Cas9, для супрессии экспрессии, например, нокдауна, генов. В некоторых вариантах осуществления молекула Cas9 является ферментативно неактивной молекулой Cas9 (eiCas9), содержащей мутацию, например, точечную мутацию, вызывающую неактивность молекулы Cas9, например, мутацию, устраняющую или, по существу, снижающую расщепляющую активность молекулы Cas9. В некоторых вариантах осуществления молекулу eiCas9 подвергают слиянию прямо или косвенно с активатором транскрипции или репрессорным белком.

[717] В некоторых вариантах осуществления промоторная область гена является мишенью для нокдауна экспрессии белка, положительно регулируемого IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). С помощью подхода направленного нокдауна снижают или устраняют экспрессию функционального продукта гена. В некоторых вариантах осуществления направленный нокдаун опосредован таргетингом ферментативно неактивной Cas9 (eiCas9) или eiCas9, слитой с доменом репрессора транскрипции или хроматин-модифицирующим белком для изменения транскрипции, например, для блокирования, снижения или противодействия транскрипции гена. gRNA, направленная против последовательности-мишени в гене или вблизи гена, если таргетинг осуществляют посредством eiCas9 или слитого белка eiCas9, приводит к снижению или устранению экспрессии функционального продукта гена, такого как белок, положительно регулируемый IDO-опосредованным катаболизмом (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). В некоторых вариантах осуществления транскрипцию снижают или устраняют.

[718] В некоторых вариантах осуществления направляющий домен молекулы gRNA сконфигурирован для направления ферментативно неактивной Cas9 (eiCas9) или слитого белка eiCas9 (например, eiCas9, слитой с доменом репрессора транскрипции) достаточно близко к последовательности-мишени в геноме для снижения или репрессии экспрессии гена. В некоторых вариантах осуществления eiCas9 подвергают слиянию с доменом репрессора транскрипции или хроматин-модифицирующим белком для изменения транскрипции, например, для блокирования, снижения или противодействия транскрипции гена. В некоторых вариантах осуществления одну или более eiCas9 можно использовать для блокирования связывания одного или более эндогенных факторов транскрипции. В другом варианте осуществления eiCas9 можно подвергать слиянию с хроматин-модифицирующим белком. Изменение статуса хроматина может приводить к сниженной экспрессии гена-мишени. Для изменения статуса хроматина можно использовать одну или более eiCas9, слитых с одним или более хроматин-модифицирующими белками.

[719] В некоторых вариантах осуществления направляющий домен конфигурируют для направленного воздействия на промоторную область гена для блокирования инициации транскрипции, связывания одного или более энхансеров или активаторов транскрипции и/или РНК-полимеразы. Одну или более gRNA можно использовать для направления eiCas9 к промоторной области гена.

[720] В некоторых вариантах осуществления комплекс направленной CRISPR gRNA и ферментативно неактивной нуклеазы, например, iCas9 или слитый белок eiCas9, можно встраивать в клетку способами, известными специалистам в этой области, включая способы, описанные ниже в отношении система CRISPR/Cas. В некоторых вариантах осуществления CRISPR gRNA и ферментативно неактивную нуклеазу, например, iCas9 или слитый белок eiCas9, транзиторно встраивают в клетку, например, посредством транзиторного встраивания рибонуклеопротеинового комплекса (RNP). В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие gRNA и/или eiCas9, встраивают в клетку с использованием любой общепринятой системы экспрессии, например, лентивирусной системы экспрессии. В некоторых вариантах осуществления способы встраивания или доставки в клетку могут быть теми же или схожими со способами, описанными ниже для встраивания в клетку комплекса нуклеиновая кислота-белок, такого как рибонуклеопротеиновый комплекс (RNP).

[721] В некоторых вариантах осуществления нокдауна гена достигают с помощью ДНК-связывающих направленных белков, таких как белки с цинковыми пальцами (ZFP) или слитые белки, содержащие ZFP, направленно воздействующие на гены, кодирующие белок, вовлеченный в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). В некоторых вариантах осуществления ДНК-связывающие белки, такие как ZFP, могут осуществлять направленную репрессию гена, противодействуя экспрессии гена-мишени или ингибируя ее. Примеры признаков ДНК-связывающих белков, включая ZFP, описывают ниже, и их можно адаптировать для использования в снижении или супрессии экспрессии молекулы вместо разрушения или делеции гена, кодирующего молекулу, посредством встраивания без эффекторного белка (например, эндонуклеазы, такой как нуклеаза с цинковыми пальцами (ZFN)).

b. Нокаут экспрессии

[722] В некоторых аспектах нокаут, такой как повреждение, генов, кодирующих белок, положительно регулируемый IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), осуществляют посредством редактирования генома, например, с использованием ДНК-связывающего белка или ДНК-связывающей нуклеиновой кислоты, специфически связывающейся или гибридизующейся с геном в области, предназначенной для внесения нарушения. В некоторых аспектах белок или нуклеиновую кислоту соединяют или комплексируют с редактирующей геном нуклеазой, например, в химерном или слитом белке. Например, в некоторых вариантах осуществления повреждение осуществляют с использованием слитого белка, содержащего направленно воздействующий на ДНК белок и нуклеазу, такую как нуклеаза с цинковыми пальцами (ZFN) или TAL-эффекторная нуклеаза (TALEN), или РНК-направляемую нуклеазу, такую как система коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR)-Cas, такая как система CRISPR-Cas9, специфическая для гена, подвергаемого нарушению. В некоторых вариантах осуществления редактирование генома приводит к геномному повреждению или нокауту генов, кодирующих белок, положительно регулируемый IDO-опосредованным катаболизмом (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2).

[723] В некоторых вариантах осуществления репрессии достигают с использованием направленно воздействующей на ДНК молекулы, такой как ДНК-связывающий белок или ДНК-связывающая нуклеиновая кислота, или комплекса, соединения или композиции, содержащих ее, специфически связывающихся или гибридизующихся с геном. В некоторых вариантах осуществления направленно воздействующая на ДНК молекула содержит ДНК-связывающий домен, например, ДНК-связывающий домен белка с цинковыми пальцами (ZFP), подобный активатору транскрипции белок (TAL) или ДНК-связывающий домен TAL-эффектора (TALE), ДНК-связывающий домен коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), или ДНК-связывающий домен мегануклеазы.

[724] Связывающие домены белка с цинковыми пальцами, TALE и системы CRISPR можно конструировать так, чтобы они связывались с заранее определенной нуклеотидной последовательностью, например, посредством конструирования (изменения одной или более аминокислот) области спирали распознавания природного белка с цинковыми пальцами или белка TALE. Сконструированные ДНК-связывающие белки (белки с цинковыми пальцами или TALE) являются неприродными белками. Рациональные критерии дизайна включают использование правил замен и компьютеризированных алгоритмов обработки информации в базе данных, в которой хранят информацию о существующем дизайне ZFP и/или TALE и данных о связывании. См., например, патенты США №№ 6140081; 6453242 и 6534261; также см. WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 и WO 03/016496 и патентные публикации США №№ 20110301073 и US20140120622.

[725] В некоторых вариантах осуществления направленно воздействующая на ДНК молекула, комплекс или комбинация содержит ДНК-связывающую молекулу и один или более дополнительных доменов, таких как эффекторный домен, для облегчения репрессии или нарушения гена. Например, в некоторых вариантах осуществления повреждение или репрессию гена осуществляют с помощью слитых белков, содержащих ДНК-связывающий белки и гетерологичный регуляторный домен или его функциональный фрагмент. В некоторых аспектах домены включают, например, домены факторов транскрипции, таких как активаторы, репрессоры, коактиваторы, корепрессоры, сайленсеры, онкогены, ферменты репарации ДНК и ассоциированные с ними факторы и модификаторы, ферменты перестановки ДНК и ассоциированные с ними факторы и модификаторы, хроматин-ассоциированные белки и их модификаторы, например, киназы, ацетилазы и деацетилазы, и ДНК-модифицирующие ферменты, например, метилтрансферазы, топоизомеразы, хеликазы, лигазы, киназы, фосфатазы, полимеразы, эндонуклеазы и ассоциированные с ними факторы и модификаторы. См., например, публикации патентных заявок США №№ 20050064474; 20060188987 и 2007/0218528, включенные в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме в том, что касается слитых белков ДНК-связывающих доменов и расщепляющих доменов нуклеаз. В некоторых аспектах дополнительный домен является нуклеазным доменом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления повреждение гена облегчают с помощью редактирования гена или генома с использованием сконструированных белков, таких как редактирующие геном нуклеазы и комплексы или слитые белки, содержащие редактирующую геном нуклеазу, состоящие из специфических в отношении последовательности ДНК-связывающих доменов, слитых или комплексированных с неспецифическими, расщепляющими ДНК молекулами, такими как нуклеазы.

[726] В некоторых аспектах эти направленные химерные нуклеазы или комплексы, содержащие нуклеазу, осуществляют точные генетические модификации посредством индуцирования направленных двухцепочечных разрывов или одноцепочечных разрывов, стимулируя клеточные механизмы репарации ДНК, включая подверженное ошибкам негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичную репарацию (HDR). В некоторых вариантах осуществления нуклеаза является эндонуклеазой, такой как нуклеаза с цинковыми пальцами (ZFN), нуклеаза TALE (TALEN), РНК-направляемая эндонуклеаза (RGEN), такая как CRISPR-ассоциированный (Cas) белок, или мегануклеаза.

[727] В некоторых вариантах осуществления получают донорную нуклеиновую кислоту, например, донорную плазмиду или нуклеиновую кислоту, кодирующую генетически сконструированный антигенный рецептор, и встраивают ее посредством HDR в участок редактирования генома после встраивания DSB. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления повреждение гена и встраивание антигенного рецептора, например, CAR, осуществляют одновременно, при этом ген разрешают частично посредством нокина или инсерции кодирующей CAR нуклеиновой кислоты.

[728] В некоторых вариантах осуществления не получают донорную нуклеиновую кислоту. В некоторых аспектах NHEJ-опосредованная репарация после встраивания DSB приводит к инсерции или делеции, которые могут вызывать повреждение гена, например, создавая миссенс-мутации или мутации со сдвигом рамки считывания.

1) ZFP и ZFN; TAL, TALE и TALEN

[729] В некоторых вариантах осуществления направленно воздействующая на ДНК молекула включает ДНК-связывающий белок, такой как один или более белков с цинковыми пальцами (ZFP) или подобных активатору транскрипции белков (TAL), слитых с эффекторным белком, таким как эндонуклеаза. Примеры включают ZFN, TALE и TALEN. См. Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221), 1-7 (2013).

[730] В некоторых вариантах осуществления направленно воздействующая на ДНК молекула содержит один или более белков с цинковыми пальцами (ZFP) или их доменов, связывающихся с ДНК специфическим в отношении последовательности образом. ZFP или его домен является белком или доменом в более крупном белке, связывающимся с ДНК специфическим в отношении последовательности образом с помощью одного или более цинковых пальцев, областей аминокислотной последовательности в связывающем домене, структура которых стабилизирована посредством координации ионом цинка. Термин "ДНК-связывающий белок с цинковыми пальцами" зачастую сокращают как белок с цинковыми пальцами или ZFP.

[731] ZFP включают искусственные домены ZFP, направленно воздействующие на специфические последовательности ДНК, как правило, длиной 9-18 нуклеотидов, полученные посредством сборки отдельных пальцев. ZFP включают ZFP, в которых один пальцевый домен имеет длину приблизительно 30 аминокислот и содержит альфа-спираль, содержащую два инвариантных остатка гистидина, с помощью цинка скоординированных с двумя цистеинами одного бета-поворота, и ZFP, содержащие два, три, четыре, пять или шесть пальцев. Как правило, специфичность ZFP в отношении последовательности можно изменять, осуществляя замены аминокислот в четырех положениях спирали (-1, 2, 3 и 6) на спирали распознавания цинкового пальца. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления ZFP или ZFP-содержащая молекула является неприродной, например, сконструированной для связывания с выбранным участком-мишенью. См., например, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; патенты США №№ 6453242; 6534261; 6599692; 6503717; 6689558; 7030215; 6794136; 7067317; 7262054; 7070934; 7361635; 7253273; и патентные публикации США №№ 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061, все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

[732] В некоторых аспектах репрессию гена осуществляют посредством приведения первого участка-мишени в гене в контакт с первым ZFP, таким образом, репрессируя ген. В некоторых вариантах осуществления участок-мишень в гене приводят в контакт со слитым ZFP, содержащим шесть пальцев и регуляторный домен, таким образом, ингибируя экспрессию гена.

[733] В некоторых вариантах осуществления стадия приведения в контакт дополнительно включает приведение второго участка-мишени в гене в контакт со вторым ZFP. В некоторых аспектах первый и второй участки-мишени являются смежными. В некоторых вариантах осуществления первый и второй ZFP ковалентно связаны. В некоторых аспектах первый ZFP является слитым белком, содержащим регуляторный домен или по меньшей мере два регуляторных домена. В некоторых вариантах осуществления первый и второй ZFP являются слитыми белками, каждый из которых содержит регуляторный домен или каждый из которых содержит по меньшей мере два регуляторных домена. В некоторых вариантах осуществления регуляторный домен является транскрипционным репрессором, транскрипционным активатором, эндонуклеазой, метилтрансферазой, гистонацетилтрансферазой или гистондеацетилазой.

[734] В некоторых вариантах осуществления ZFP кодируется нуклеиновой кислотой ZFP, функционально связанной с промотором. В некоторых аспектах способ дополнительно включает стадию первого введения нуклеиновой кислоты в клетку в комплексе липид:нуклеиновая кислота или в виде депротеинизированной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления ZFP кодируется экспрессирующим вектором, содержащим нуклеиновую кислоту ZFP, функционально связанную с промотором. В некоторых вариантах осуществления ZFP кодируется нуклеиновой кислотой, функционально связанной с индуцибельным промотором. В некоторых аспектах ZFP кодируется нуклеиновой кислотой, функционально связанной со слабым промотором.

[735] В некоторых вариантах осуществления участок-мишень расположен выше участка инициации транскрипции гена. В некоторых аспектах участок-мишень является смежным с участком инициации транскрипции гена. В некоторых аспектах участок-мишень является смежным с участком приостановки РНК-полимеразы ниже участка инициации транскрипции гена.

[736] В некоторых вариантах осуществления направленно воздействующая на ДНК молекула представляет собой или содержит ДНК-связывающий домен с цинковыми пальцами, слитый с ДНК-расщепляющим доменом с образованием нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN). В некоторых вариантах осуществления слитые белки содержат расщепляющий домен (или расщепляющий полу-домен) из по меньшей мере одного фермента рестрикции типа IIS и один или более связывающих доменов с цинковыми пальцами, которые могут быть сконструированными или нет. В некоторых вариантах осуществления расщепляющий домен получают из эндонуклеазы рестрикции типа IIS Fok I. Fok I, как правило, катализует двухцепочечное расщепление ДНК в 9 нуклеотидах от его участка распознавания на одной цепи и 13 нуклеотидах от его участка распознавания на другой цепи. См., например, патенты США №№ 5356802; 5436150 и 5487994; а также Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982.

[737] В некоторых вариантах осуществления ZFN направленно воздействуют на ген, кодирующий белок, положительно регулируемый IDO-опосредованным катаболизмом (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). В некоторых аспектах ZFN эффективно вызывают двухцепочечный разрыв (DSB), например, в заранее определенном участке в кодирующей области гена. Типичные подвергаемые направленному воздействию области включают экзоны, области, кодирующие N-концевые области, первый экзон, второй экзон и промоторные или энхансерные области. В некоторых вариантах осуществления транзиторная экспрессия ZFN способствует высокоэффективному и постоянному повреждению гена-мишени в сконструированных клетках. В некоторых конкретных вариантах осуществления доставка ZFN приводит к постоянному повреждению гена с эффективностью, превышающей 50%.

[738] Многие гено-специфические сконструированные белки с цинковыми пальцами доступны в коммерческих источниках. Например, Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA) разработали платформу (CompoZr) для конструирования цинковых пальцев в сотрудничестве с Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), что позволяет исследователям пренебрегать конструированием цинковых пальцев и валидацией, и предоставляют специфические цинковые пальцы для тысяч белков. Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405. В некоторых вариантах осуществления используют коммерчески доступные цинковые пальцы или делают их на заказ. (См., например, Sigma-Aldrich кат. № CSTZFND, CSTZFN, CTI1-1KT, и PZD0020).

2) TALE и TALEN

[739] В некоторых вариантах осуществления направленно воздействующая на ДНК молекула содержит природный или сконструированный (неприродный) ДНК-связывающий домен подобного активатору транскрипции белка (TAL), такого как эффекторный подобный активатору транскрипции белок (TALE), см., например, патентную публикацию США № 20110301073, включенную в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

[740] ДНК-связывающий домен TALE или TALE является полипептидом, содержащим один или более доменов повторов/единиц TALE. Домены повторов вовлечены в связывание TALE с его когнатной последовательность ДНК-мишени. Одна "единица повтора" (также обозначаемая как "повтор"), как правило, имеет длину 33-35 аминокислот и демонстрирует, по меньшей мере, некоторую гомологию последовательности с другими последовательностями повторов TALE в природном белке TALE. Каждая единица повтора TALE включает 1 или 2 ДНК-связывающих остатков, составляющих вариабельный двойной остаток повтора (RVD), как правило, в положениях 12 и/или 13 повтора. Природный (канонический) код распознавания ДНК этих TALE определяют таким образом, что последовательность HD в положениях 12 и 13 приводит к связыванию с цитозином (C), NG связывается с T, NI с A, NN связывается с G или A, и NG связывается T, а также известны неканонические (атипичные) RVD. См., патентную публикацию США № 20110301073. В некоторых вариантах осуществления TALE можно направлять против любого гена посредством дизайна наборов TAL со специфичностью к последовательности ДНК-мишени. Последовательность-мишень, как правило, начинается с тимидина.

[741] В некоторых вариантах осуществления молекула является ДНК-связывающей эндонуклеазой, такой как TALE-нуклеаза (TALEN). В некоторых аспектах TALEN является слитым белком, содержащим ДНК-связывающий домен, полученным из TALE, и каталитический домен нуклеазы для расщепления последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах осуществления ДНК-связывающий домен TALE конструируют так, чтобы он связывался с последовательностью-мишенью в генах, кодирующих антиген-мишень и/или иммуносупрессорную молекулу. Например, в некоторых аспектах ДНК-связывающий домен TALE может направленно воздействовать на ген, кодирующий белок, вовлеченный в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2).

[742] В некоторых вариантах осуществления TALEN распознает и расщепляет последовательность-мишень в гене. В некоторых аспектах расщепление ДНК приводит к двухцепочечным разрывам. В некоторых аспектах разрывы повышают частоту гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов (NHEJ). Как правило, NHEJ является несовершенным процессом репарации, зачастую приводящим к изменениям последовательности ДНК в участке расщепления. В некоторых аспектах механизмы репарации включают повторное соединение оставшихся частей двух концов ДНК посредством прямого повторного лигирования (Critchlow and Jackson, Trends Biochem Sci. 1998 Oct;23(10):394-8) или с помощью так называемого микрогомологичного соединения концов. В некоторых вариантах осуществления репарация посредством NHEJ приводит к небольшим инсерциям или делециям, и ее можно использовать для повреждения и, таким образом, репрессии гена. В некоторых вариантах осуществления модификация может являться заменой, делецией или добавлением по меньшей мере одного нуклеотида. В некоторых аспектах клетки, в которых происходит индуцированный расщеплением мутагенез, т.е. в которых мутагенез происходит после NHEJ, можно идентифицировать и/или подвергать селекции способами хорошо известными в этой области.

[743] В некоторых вариантах осуществления повторы TALE собираются для специфического направленного воздействия на ген. (Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). Сконструируирована библиотека TALEN, направленно воздействующих на 18740 белок-кодирующих генов человека (Kim et al., Nature Biotechnology. 31, 251-258 (2013)). Сделанные на заказ наборы TALE коммерчески доступны в Cellectis Bioresearch (Paris, France), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA) и Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Известны нуклеазы TALE, направленно воздействующие на GCN2 или BLIMP-1 (см., например, публикацию № WO2015155341).

[744] В некоторых вариантах осуществления TALEN встраивают в виде трансгенов, кодируемых одним или более плазмидными векторами. В некоторых аспектах плазмидный вектор может содержать селективный маркер, обеспечивающий идентификацию и/или селекцию клеток, в которые встраивали указанный вектор.

3) RGEN (системы CRISPR/Cas)

[745] В некоторых вариантах осуществления репрессию осуществляют с использованием одной или более ДНК-связывающих нуклеиновых кислот, например, посредством нарушения с помощью РНК-направляемой эндонуклеазы (RGEN) или другой формы репрессии с помощью другой РНК-направляемой эффекторной молекулы. Например, в некоторых вариантах осуществления репрессию осуществляют с использованием коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), и CRISPR-ассоциированных (Cas) белков. См. Sander and Joung, Nature Biotechnology, 32(4): 347-355.

[746] В основном, термин "система CRISPR" в совокупности относится к транскриптам и другим элементам, вовлеченным в экспрессию или регуляцию активности CRISPR-ассоциированных ("Cas") генов, включая последовательности, кодирующие ген Cas, последовательность tracr (транс-активирующие CRISPR) (например, tracrRNA или активная частичная tracrRNA), последовательность tracr-mate (включающую "прямой повтор" и tracrRNA-процессированный частичный прямой повтор в контексте эндогенной системы CRISPR), гидовую последовательность (также обозначаемую как "спейсер" в контексте эндогенной системы CRISPR или "направляющая последовательность") и/или другие последовательности и транскрипты из локуса CRISPR.

[747] В некоторых вариантах осуществления система нуклеазы CRISPR/Cas или нуклеазы CRISPR/Cas включают некодирующую молекулу РНК (гидовую) (gRNA), связывающуюся с ДНК со специфичностью к последовательности, и белок Cas (например, Cas9) с функциональностью нуклеазы (например, содержащи два нуклеазных домена) или его вариант.

[748] В некоторых вариантах осуществления один или более элементов системы CRISPR получают из системы CRISPR типа I, типа II или типа III. В некоторых вариантах осуществления один или более элементов системы CRISPR получают из конкретного организма, содержащего эндогенную систему CRISPR, такого как Streptococcus pyogenes или Staphylococcus aureus. В некоторых вариантах осуществления в клетки встраивают нуклеазу Cas9 (например, кодируемую мРНК из Staphylococcus aureus или Streptococcus pyogenes, например, pCW-Cas9, Addgene #50661, Wang et al. (2014) Science, 3:343-80-4; или лентивирусные векторы с нуклеазой или никазой, доступные в Applied Biological Materials (ABM; Canada) как кат. № K002, K003, K005 или K006), и гидовую РНК, специфическую для гена-мишени (например, гена кодирующего белок, вовлеченный в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, такой как GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2).

[749] В основном, система CRISPR отличается элементами, способствующими образованию комплекса CRISPR в участке последовательности-мишени. В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень или участок-мишень является геном, кодирующим белок, вовлеченный в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). Например, последовательность-мишень находится в гене или вблизи гена, кодирующего GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2. Как правило, в контексте образования комплекса CRISPR термин "последовательность-мишень", как правило, относится к последовательности, например, гену или геномной последовательности, которой комплементарна гидовая последовательность, при этом гибридизация между последовательностью-мишенью и гидовой последовательностью способствует образованию комплекса CRISPR. Полная комплементарность не является необходимой при условии, что существует достаточная комплементарность гибридизации и стимуляции образования комплекса CRISPR. В некоторых вариантах осуществления гидовую последовательность выбирают для снижения степени образования вторичной структуры в ней. Вторичную структуру можно определять с помощью любого подходящего алгоритма определения фолдинга полинуклеотида.

[750] В основном, гидовая последовательность включает направляющий домен, содержащий полинуклеотидную последовательность, имеющую достаточную комплементарность по отношению к полинуклеотидной последовательности-мишени для гибридизации с последовательностью-мишенью и регуляции специфического в отношении последовательности связывания комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности между гидовой последовательностью и соответствующей ей последовательностью-мишенью при оптимальном выравнивании с использованием подходящего алгоритма выравнивания составляет приблизительно или более приблизительно 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более. В некоторых примерах направляющий домен gRNA является комплементарным, например, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% комплементарным, например, полностью комплементарным, последовательности-мишени в нуклеиновой кислоте-мишени, такой как последовательность-мишень в гене, кодирующем белок, положительно регулируемый IDO-опосредованным катаболизмом (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2).

[751] Оптимальное выравнивание можно определять с использованием любого подходящего алгоритма для выравнивания последовательностей, неограничивающий пример которой включает алгоритм Смита-Уотермана, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритмы на основе преобразования Барроуза-Уилера (например, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (доступный на soap.genomics.org.cn) и Maq (доступный на maq.sourceforge.net). В некоторых вариантах осуществления гидовая последовательность составляет приблизительно или более чем приблизительно 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления гидовая последовательность составляет менее приблизительно 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 или менее нуклеотидов в длину. Способность гидовой последовательности направлять специфическое в отношении последовательности связывание комплекса CRISPR/Cas к последовательности-мишени можно оценивать с помощью любого подходящего анализа. Например, компоненты системы CRISPR/Cas, достаточные для образования комплекса CRISPR/Cas, включая гидовую последовательность, подлежащую тестированию, можно вносить в клетку, имеющую соответствующую последовательность-мишень, например, посредством трансфекции с использованием векторов, кодирующих компоненты комплекса CRISPR/Cas с последующей оценкой предпочтительного расщепления в последовательности-мишени, например, посредством анализа Surveyor, как представлено в настоящем описании. Аналогично, расщепление полинуклеотидной последовательности-мишени можно оценивать в пробирке, получая последовательность-мишень, компоненты комплекса CRISPR/Cas, включая гидовую последовательность, подлежащую тестированию, и контрольную гидовую последовательность, отличающуюся от тестируемой гидовой последовательности, и сравнивая связывание или скорость расщепления последовательности-мишени в реакциях тестируемой и контрольной гидовой последовательности.

[752] В некоторых вариантах осуществления в клетку встраивают нуклеазу Cas и gRNA (например, включающую продукт слияния crRNA, специфической для последовательности-мишени, и фиксированной tracrRNA). В основном, участки-мишени на 5'-конце gRNA направляют нуклеазу Cas к участку-мишени, например, гену, с использованием комплементарного спаривания оснований. В некоторых вариантах осуществления участок-мишень выбирают с учетом его локализации непосредственно на 5'-последовательности мотива, смежного с протоспейсером (PAM), такой как, как правило, NGG или NAG. В связи с этим, gRNA направляют к желаемой последовательности посредством модификации первых 20 нуклеотидов гидовой РНК так, чтобы они соответствовали последовательности ДНК-мишени.

[753] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень, комплементарная направляющему домену, локализуется в ранней кодирующей области интересующего гена. Таргетинг ранней кодирующей области можно использовать для нокаута (т.е. устранения экспрессии) интересующего гена. В некоторых вариантах осуществления ранняя кодирующая область интересующего гена включает последовательность, следующую непосредственно за инициаторным кодоном (например, AUG) или в пределах 500 п.н. от инициаторного кодона (например, менее 500, 450, 400 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 п.н.). В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень находится в пределах 200, 150 или 100 п.н. от инициаторного кодона гена. Таргетинг промоторной области или областей вблизи участка начала транскрипции можно использовать для нокдауна (т.е. снижения экспрессии) интересующего гена. Например, области вблизи участка начала транскрипции могут включать области в пределах 500 п.н. выше участка начала транскрипции (например, менее 500, 450, 400 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 п.н.). В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень может находиться в промоторе, энхансере или других цис- или транс-регуляторных областях.

[754] В уровень навыков специалистов в этой области входит дизайн или идентификация последовательности gRNA, представляющей собой или содержащей последовательность для таргетинга гена, кодирующего белок, положительно регулируемый IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), включая последовательность экзона и последовательности регуляторных областей, включая промоторы и активаторы. Общедоступной является база данных полногеномных gRNA для редактирующих геном CRISPR, содержащая примеры одиночной гидовой РНК (sgRNA) для последовательностей в последовательных экзонах генов в геноме человека или геноме мыши (см. например, http://genescript.com/gRNA-database.html; см. также, Sanjana et al. (2014) Nat. Methods, 11:783-4; http://www.e-crisp.org/E-CRISP/; http://crispr.mit.edu/; https://www.dna20.com/eCommerce/cas9/input). В некоторых вариантах осуществления последовательность gRNA представляет собой или содержит последовательность с минимальным нецелевым связыванием с нецелевым геном.

[755] Известны примеры последовательностей-мишеней в гене, кодирующем белок, положительно регулируемый IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, триптофановым голоданием или недостаточностью и/или кинуренин-опосредованной иммуносупрессией (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), комплементарных последовательностей направляющих доменов gRNA, или их можно конструировать. Примеры последовательностей-мишеней для гена, кодирующего AHR, комплементарных последовательностям направляющих доменов gRNA, приведены в SEQ ID NO: 24-29. Примеры последовательностей-мишеней для гена, кодирующего ARNT, комплементарных последовательностям направляющих доменов gRNA, приведены в SEQ ID NO: 30-35. Примеры последовательностей-мишеней для гена, кодирующего GCN2, комплементарных последовательностям направляющих доменов gRNA, приведены в SEQ ID NO: 50-55. Примеры последовательностей-мишеней для гена, кодирующего CHOP, комплементарных последовательностям направляющих доменов gRNA, приведены в SEQ ID NO: 56-61. Примеры последовательностей-мишеней для гена, кодирующего ATF4, комплементарных последовательностям направляющих доменов gRNA, приведены в SEQ ID NO: 62-67. Примеры последовательностей-мишеней для гена, кодирующего eIF2α, комплементарных последовательностям направляющих доменов gRNA, приведены в SEQ ID NO: 68-73.

[756] В некоторых вариантах осуществления система CRISPR индуцирует двухцепочечные разрывы (DSB) в участке-мишени с последующими нарушениями, как представлено в настоящем описании. В других вариантах осуществления варианты Cas9, считающиеся "никазами", используют для никирования одиночной цепи в участке-мишени. В некоторых аспектах парные никазы используют, например, для улучшения специфичности, при этом каждая из них направляется парой разных направляющих последовательностей gRNA таким образом, что после встраивания ников одновременно образуется 5'-липкий конец. В других вариантах осуществления каталитически неактивную Cas9 подвергают слиянию с гетерологичным эффекторным доменом, таким как репрессор или активатор транскрипции, для влияния на экспрессию гена.

[757] В некоторых вариантах осуществления нарушение включает инсерцию последовательности в ген. В основном, последовательность или матрицу, которую можно использовать для рекомбинации в целевой локус, содержащий последовательности-мишени, обозначают как "матрицу редактирования", или "полинуклеотид редактирования", или "последовательность редактирования". В некоторых аспектах экзогенный полинуклеотид-матрицу можно обозначать как матрицу редактирования. В некоторых аспектах рекомбинация является гомологичной рекомбинацией.

[758] Как правило, в контексте эндогенной системы CRISPR образование комплекса CRISPR (содержащего гидовую последовательность, гибридизующуюся с последовательностью-мишенью и комплексированную с одним или более белками Cas) приводит к расщеплению одной или обеих цепей в последовательности-мишени или вблизи нее (например, в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 или более пар оснований от последовательности-мишени).

[759] В некоторых вариантах осуществления также можно включать последовательность tracr, которая может содержать или состоять из всей или части последовательности tracr дикого типа (например, приблизительно или более чем приблизительно 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 или более нуклеотидов последовательности tracr дикого типа), а также может образовывать часть комплекса CRISPR, например, при гибридизации, по меньшей мере, части последовательности tracr со всей или частью последовательности tracr mate, функционально связанной с гидовой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления последовательность tracr имеет достаточную комплементарность с последовательностью tracr mate для гибридизации и участия в образовании комплекса CRISPR. Что касается последовательности-мишени, в некоторых вариантах осуществления полная комплементарность не является необходимой. В некоторых вариантах осуществления последовательность tracr имеет по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% комплементарности последовательности по длине последовательности tracr mate при оптимальном выравнивании.

[760] В основном, последовательность tracr mate включает любую последовательность, имеющую достаточную комплементарность с последовательностью tracr для стимуляции одного или более из: (1) эксцизии гидовой последовательности, фланкированной последовательностями tracr mate, в клетке, содержащей соответствующую последовательность tracr; и (2) образования комплекса CRISPR в последовательности-мишени, где комплекс CRISPR содержит последовательность tracr mate, гибридизованную с последовательностью tracr. В основном, степень комплементарность определяют с учетом оптимального выравнивания последовательности tracr mate и последовательности tracr по длине более короткой из двух последовательностей.

[761] Оптимальное выравнивание можно определять с помощью любого подходящего алгоритма выравнивания, при этом можно дополнительно учитывать вторичные структуры, например, самокомплементарность в любой из последовательности tracr или последовательности tracr mate. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности между последовательностью tracr и последовательностью tracr mate по длине более короткой из двух последовательностей при оптимальном выравнивании, составляет приблизительно или более чем приблизительно 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более. В некоторых вариантах осуществления последовательность tracr составляет приблизительно или более чем приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 или более нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления последовательность tracr и последовательность tracr mate содержатся в одном транскрипте, таким образом, что при гибридизации между ними образуется транскрипт, имеющий вторичную структуру, такую как шпилька. В некоторых аспектах образующие петлю последовательности для использования в шпилечных структурах составляют четыре нуклеотида в длину и имеют последовательность GAAA. Однако можно использовать более длинные или короткие петлевые последовательности, а также альтернативные последовательности. В некоторых вариантах осуществления последовательности включают триплет нуклеотидов (например, AAA) и дополнительный нуклеотид (например, C или G). Примеры образующих петлю последовательностей включают CAAA и AAAG. В некоторых вариантах осуществления транскрипт или транскрибируемая полинуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере две или более шпильки. В некоторых вариантах осуществления транскрипт имеет две, три, четыре или пять шпилек. В дополнительном варианте осуществления транскрипт имеет по большей мере пять шпилек. В некоторых вариантах осуществления единый транскрипт дополнительно включает последовательность терминации транскрипции, такую как поли-T-последовательность, например, шесть нуклеотидов T.

[762] В некоторых вариантах осуществления один или более векторов, запускающих экспрессию одного или более элементов системы CRISPR, встраивают в клетку таким образом, что экспрессия элементов системы CRISPR направляет образование комплекса CRISPR в одном или более участках-мишенях. Например, каждый из фермента Cas, гидовой последовательности, соединенной с последовательностью tracr mate, и последовательности tracr можно функционально связывать с отдельными регуляторными элементами на отдельных векторах. Альтернативно, два или более элементов, экспрессирующихся с использованием одних и тех же или разных регуляторных элементов, можно комбинировать в одном векторе, при этом один или более дополнительных векторов несут любые компоненты системы CRISPR, невключенные в первый вектор. В некоторых вариантах осуществления элементы системы CRISPR, комбинируемые в одном векторе, можно располагать в любой подходящей ориентации, например, один элемент располагают в 5'-направлении ("выше") или 3'-направлении ("ниже") второго элемента. Кодирующую последовательность одного элемента можно располагать на той же или противоположной цепи относительно кодирующей последовательности второго элемента и ориентировать в том же или противоположном направлении. В некоторых вариантах осуществления один промотор регулирует экспрессию транскрипта, кодирующего фермент CRISPR и одну или более из гидовой последовательности, последовательности tracr mate (необязательно, функционально связанной с гидовой последовательностью) и последовательности tracr, встроенной в одну или более последовательностей интронов (например, каждую помещают в разный интрон, две или более помещают по меньшей мере в один интрон или все из них помещают в один интрон). В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR, гидовая последовательность, последовательность tracr mate и последовательность tracr функционально связаны с одним и тем же промотором и экспрессируются с него.

[763] В некоторых вариантах осуществления вектор содержит один или более участков инсерции, таких как последовательность распознавания эндонуклеазы рестрикции (также обозначаемую как "участок клонирования"). В некоторых вариантах осуществления один или более участков инсерции (например, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более участков инсерции) локализуются выше и/или ниже одного или более элементов последовательности одного или более векторов. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит участок инсерции выше последовательности tracr mate и, необязательно, ниже регуляторного элемента, функционально связанного с последовательностью tracr mate, таким образом, что после инсерции гидовой последовательности в участок инсерции и после экспрессии гидовая последовательность направляет специфическое в отношении последовательности связывание комплекса CRISPR в последовательности-мишени в эукариотической клетке. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит два или более участка инсерции, при этом каждый участок инсерции локализуется между двумя последовательностями tracr mate так, что становится возможной инсерция гидовой последовательности в каждый участок. При таком расположении две или более гидовые последовательности могут содержать две или более копий одной гидовой последовательности, двух или более разных гидовых последовательностей или их комбинаций. При использовании множества разных гидовых последовательностей можно использовать одну экспрессирующую конструкцию для направления активности CRISPR ко множеству различных соответствующих последовательностей-мишеней в клетке. Например, один вектор может содержать приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более гидовых последовательностей. В некоторых вариантах осуществления можно получать приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более таких векторов, содержащих гидовые последовательности, и, необязательно, доставлять их в клетку.

[764] В некоторых вариантах осуществления вектор содержит регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, такой как белок Cas. Неограничивающие примеры белков Cas включают Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (также известный как Csn1 и Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, их гомологи или модифицированные версии. Эти ферменты известны; например, аминокислотную последовательность белка Cas9 S. pyogenes можно найти в базе данных SwissProt под регистрационным номером Q99ZW2. В некоторых вариантах осуществления немодифицированный фермент CRISPR, такой как Cas9, имеет ДНК-расщепляющую активность. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является Cas9 и может являться Cas9 из S. Pyogenes, S. aureus или S. pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR направляет расщепление одной или обеих цепей в участке локализации последовательности-мишени, например, в последовательности-мишени и/или в последовательности, комплементарной последовательности-мишени. В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR направляет расщепление одной или обеих цепей в пределах приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 или более пар оснований от первого или последнего нуклеотида последовательности-мишени.

[765] В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует фермент CRISPR, мутантный относительно соответствующего фермента дикого типа таким образом, что у мутантного фермента CRISPR отсутствует способность расщеплять одну или обе цепи полинуклеотида-мишени, содержащего последовательность-мишень. Например, замена аспартата из S. pyogenes преобразует Cas9 из нуклеазы, расщепляющей обе цепи, в никазу (расщепляющую одну цепь). В некоторых вариантах осуществления никазу Cas9 можно использовать в комбинации с гидовыми последовательностями, например, двумя гидовыми последовательностями, направляющими, соответственно, к смысловым и антисмысловым цепям ДНК-мишени. Эта комбинация позволяет никировать обе цепи, и ее используют для индукции NHEJ.

[766] В некоторых вариантах осуществления у Cas9 или раздельной Cas9 отсутствует эндонуклеазная активность. В некоторых вариантах осуществления получаемый Cas9 или split-Cas9 коэкспрессируют с гидовой РНК, сконструированной так, что она содержит последовательность, комплементарную последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, например, гену, кодирующему белок, вовлеченный в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2). В некоторых вариантах осуществления экспрессия Cas9 без эндонуклеазной активности приводит к специфическому сайленсингу или снижению экспрессии интересующего гена. Эту систему называют CRISPR-интерференцией (CRISPRi) (Qi, Larson et al. 2013). В некоторых вариантах осуществления сайленсинг может осуществлять на стадии транскрипции или трансляции. В некоторых вариантах осуществления сайленсинг осуществлять посредством прямого блокирования транскрипции, например, посредством блокирования элонгации при транскрипции или направленного воздействия на ключевые цис-действующие мотивы в любом промоторе, стерически блокируя связывание их когнатных транс-действующих факторов транскрипции. В некоторых вариантах осуществления Cas9 без эндонуклеазной активности содержит нефункциональные домены HNH и RuvC. В некоторых вариантах осуществления полипептид Cas9 или split-Cas9 содержит инактивирующие мутации в каталитических остатках RuvC-подобных доменов и доменов HNH. Например, каталитические остатки, необходимые для расщепляющей активности Cas9, могут являться D10, D31, H840, H865, H868, N882 и N891 Cas9 S. pyogenes (COG3513 - SEQ ID NO:18) или выровненными способом CLUSTALW положениями в гомологичных членах семейства Cas. В некоторых вариантах осуществления остатки, содержащиеся в мотивах HNH или RuvC, могут являться остатками, описанными в приведенном выше параграфе. В некоторых вариантах осуществления любой из этих остатком можно заменять любой из других аминокислот, например, остатком аланина. В некоторых вариантах осуществления мутация в каталитических остатках означает замену другими аминокислотами или делецию или добавление аминокислот, вызывающую инактивацию по меньшей мере одного каталитического домена Cas9.

[767] В этой области известны неограничивающие примеры мутаций в белке Cas9 (см., например, WO2015/161276), любую из которых можно включать в систему CRISPR/Cas9 способами по изобретению.

[768] В некоторых вариантах осуществления кодирующую фермент последовательность, кодирующую фермент CRISPR, подвергают оптимизации кодонов для экспрессии в конкретных клетках, таких как эукариотические клетки. Эукариотические клетки могут являться клетками конкретного организма, или их можно получать из конкретного организма, такого как млекопитающее, включая, в качестве неограничивающих примеров, человека, мышь, крысу, кролика, собаку или не являющегося человеком примата. В основном, термин "оптимизация кодонов" относится к модификации последовательности нуклеиновой кислоты для повышения экспрессии в интересующих клетках-хозяевах посредством замены по меньшей мере одного кодона (например, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более кодонов) нативной последовательности кодонами, чаще или наиболее часто используемыми в генах этой клетки-хозяина, при сохранении нативной аминокислотной последовательности. У различных видов наблюдают конкретное отклонение в пользу конкретных кодонов для конкретной аминокислоты. Отклонение в использовании кодонов (различия в использовании кодонов между организмами) зачастую коррелирует с эффективностью трансляции матричной РНК (мРНК), которая, в свою очередь, как считают, зависит, в частности, от свойств транслируемых кодонов и доступности конкретных молекул транспортной РНК (тРНК). Преобладание выбранных тРНК в клетке, как правило, является отражением кодонов, чаще всего используемых в синтезе пептидов. Таким образом, гены можно адаптировать для оптимальной экспрессии гена в указанном организме с учетом оптимизации кодонов. В некоторых вариантах осуществления один или более кодонов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более или все кодоны) в последовательности, кодирующей фермент CRISPR, соответствуют чаще всего используемому кодону для конкретной аминокислоты.

[769] В некоторых вариантах осуществления фермент CRISPR является частью слитого белка, содержащего один или более доменов гетерологичного белка (например, приблизительно или более чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доменов в дополнение к ферменту CRISPR). Слитый белок фермента CRISPR может содержать любую дополнительную белковую последовательность и, необязательно, линкерную последовательность между любыми двумя доменами. Неограничивающие примеры белковых доменов, которые могут подвергать слиянию с ферментом CRISPR, включают эпитопные метки, последовательности репортерного гена и белковые домены, имеющие одну или более из следующих активностей: метилазную активность, деметилазную активность, активирующую транскрипцию активность, репрессирующую транскрипцию активность, активность фактора высвобождения транскрипта, гистон-модифицирующую активность, РНК-расщепляющую активность и активность связывания нуклеиновой кислоты. Неограничивающие примеры эпитопных меток включают гистидиновые метки (His), метки V5, метки FLAG, метки гемагглютинина вируса гриппа (HA), метки Myc, метки VSV-G и тиоредоксиновые метки (Trx). Неограничивающие примеры репортерных генов включают глутатион-5-трансферазу (GST), пероксидазу хрена (HRP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), бета-галактозидазу, бета-глюкуронидазу, люциферазу, зеленый флуоресцентный белок (GFP), HcRed, DsRed, голубой флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и аутофлуоресцентные белки, включая синий флуоресцентный белок (BFP). Фермент CRISPR можно подвергать слиянию с последовательностью гена, кодирующей белок или фрагмент белка, связывающий молекулы ДНК или другие клеточные молекулы, включая, в качестве неограничивающих примеров, мальтозо-связывающий белок (MBP), S-метку, слитые белки ДНК-связывающего домена (DBD) Lex A, слитые белки ДНК-связывающего домена GAL4A и слитые белки белка BP16 вируса простого герпеса (HSV). Дополнительные домены, которые могут являться частью слитого белка, содержащего фермент CRISPR, описаны в US20110059502, включенном в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления меченый фермент CRISPR используют для идентификации локализации последовательности-мишени.

[770] В некоторых вариантах осуществления в клетку доставляют фермент CRISPR в комбинации (и, необязательно, в комплексе) с гидовой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления способы встраивания белкового компонента в клетку по изобретению (например, RNP Cas9/gRNA) могут являться способами физической доставки (например, с помощью электропорации, биобаллистической пушки, трансфекции с фосфатом кальция, компрессии или сжатия клеток), способами с использованием липосом или наночастиц.

[771] Коммерчески доступные наборы, векторы gRNA и донорные векторы для нокаута белка, вовлеченного в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), с помощью CRISPR доступны, например, в Santa Cruz Biotechnology (например, плазмида CRISPR/Cas9 для KO GCN2, кат. № sc-402313; плазмида CRISPR/Cas9 для KO Blimp-1, кат. № sc-400585; плазмида CRISPR/Cas9 для KO ARNT, кат. № sc-401039); Origene (например, набор для нокаута AHR и вектор gRNA, кат. № KN209832; набор для нокаута Blimp-1 (PRDM1) и вектор gRNA, кат. № KN217363, набор для нокаута CHOP (DDIT3) и вектор gRNA, кат. № KN201301, набор для нокаута ATF4 и вектор gRNA, кат. № 202233, и набор для нокаута EIF2S1 и вектор gRNA, кат. № KN200368).

[772] В некоторых аспектах полинуклеотиды-мишени, такие как гены, кодирующие белок, вовлеченный в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), подвергаются модификации в клетке, в которую встраивают комплекс CRISPR. В некоторых вариантах осуществления способ включает связывание комплекса CRISPR с полинуклеотидом-мишенью дл расщепления указанного полинуклеотида-мишени и, таким образом, модификации полинуклеотида-мишени, где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, комплексированный с гидовой последовательностью, гибридизующейся с последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде-мишени, где указанную гидовую последовательность соединяют с последовательностью tracr mate, в свою очередь, гибридизующейся с последовательностью tracr.

[773] В некоторых вариантах осуществления способ включает связывание комплекса CRISPR с полинуклеотидом таким образом, что указанное связывание приводит к повышенной или сниженной экспрессии указанного полинуклеотида; где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, комплексированный с гидовой последовательностью, гибридизующейся с последовательностью-мишенью в указанном полинуклеотиде, где указанную гидовую последовательность соединяют с последовательностью tracr mate, в свою очередь, гибридизующейся с последовательностью tracr.

c. Доставка средств, нуклеиновых кислот, кодирующих разрушающие молекулы, и комплексов

[774] В некоторых аспектах в клетку вводят или встраивают нуклеиновая кислоту, кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, представляющую собой, включающую или кодирующую ингибиторную молекулу нуклеиновой кислоты, такую как молекула РНК-интерференции, направленно воздействующая на молекулу ДНК, ее комплекс (например, RNP Cas9/gRNA) или комбинацию. В некоторых вариантах осуществления такую молекулу нуклеиновой кислоты или ее комплекс можно встраивать в клетки, такие как T-клетки, способами, хорошо известными в этой области. Такие способы включают, в качестве неограничивающих примеров, встраивание в форме рекомбинантных вирусных векторов (например, ретровирусов, лентивирусов, аденовирусов), липосом или наночастиц. В некоторых вариантах осуществления способы могут включать микроинъекцию, электропорацию, бомбардировку частицами, трансфекцию с фосфатом кальция, компрессию клеток, сжатие клеток. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды можно включать в векторы, более конкретно - плазмиды или вирус, экспрессирующиеся в клетках.

[775] В некоторых вариантах осуществления можно использовать вирусные и невирусные способы переноса генов для встраивания нуклеиновых кислот в клетки, такие как T-клетки. Такие способы можно использовать для введения нуклеиновых кислот, кодирующих компоненты, в клетки в культуре или организме-хозяине. Невирусные векторные системы доставки включают ДНК-плазмиды, РНК (например, транскрипт вектора, представленного в настоящем описании), депротеинизированную нуклеиновую кислоту и нуклеиновую кислоту, комплексированную со средством доставки, таким как липосома. Способы невирусной доставки нуклеиновых кислот включают липофекцию, нуклеофекцию, микроинъекцию, биолистику, виросомы, липосомы, иммунолипосомы, поликатионные конъюгаты или конъюгаты липид:нуклеиновая кислота, депротеинизированную ДНК, искусственные вирионы и усиленный средствами захват ДНК. Липофекцию описывают, например, в патентах США №№ 5049386, 4946787 и 4897355), и реагенты для липофекции доступны в коммерческих источниках (например, Transfectam™ и Lipofectin™). Катионные и нейтральные липиды, подходящие для эффективной липофекции полинуклеотидов с распознаванием рецептора, включают липиды, описанные в Felgner, WO 91/17424; WO 91/16024. Можно осуществлять доставку в клетки (например, введение in vitro или ex vivo) или ткани-мишени (например, введение in vivo). Другие средства доставки включают полимерные носители, химические носители, липоплексы, полиплексы, дендримеры, наночастицы, эмульсии и/или средства, запускающие природные пути эндоцитоза или фагоцитоза.

[776] В некоторых вариантах осуществления доставку осуществляют с использованием систем на основе РНК- или ДНК-вирусов для доставки нуклеиновых кислот. Системы доставки на основе вирусных векторов включают ДНК- и РНК-вирусы, имеющие эписомные или интегрированные геномы после доставки в клетку. Обзор способов генной терапии см. в Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon. TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., в Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995); и Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994). В некоторых вариантах осуществления системы на основе вирусов включают векторы на основе ретровируса, лентивируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса и вируса простого герпеса для переноса генов.

[777] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту вводят в форме экспрессирующего вектора, такого как вирусный экспрессирующий вектор. В некоторых аспектах экспрессирующий вектор является ретровирусным экспрессирующим вектором, аденовирусным экспрессирующим вектором, экспрессирующим вектором на основе ДНК-плазмиды или экспрессирующим вектором на основе AAV. В некоторых вариантах осуществления встраиваемый вектор, такой как вирусный вектор, также включает нуклеиновую кислоту, кодирующую генетически сконструированный антигенный рецептор, такой как CAR. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты можно получать на отдельных экспрессирующих кассетах, функционально связанных с промотором для контроля отдельной экспрессии с него.

[778] В некоторых аспектах репортерный ген, включающий, в качестве неограничивающих примеров, глутатион-5-трансферазу (GST), пероксидазу хрена (HRP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT) бета-галактозидазу, бета-глюкуронидазу, люциферазу, зеленый флуоресцентный белок (GFP), HcRed, DsRed, голубой флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и аутофлуоресцентные белки, включая синий флуоресцентный белок (BFP), можно встраивать в клетку для кодирования продукта гена, служащего в качестве маркера, с помощью которого измеряют изменение или модификацию экспрессии продукта гена. В дополнительном варианте осуществления молекулу ДНК, кодирующую продукт гена, можно встраивать в клетку с помощью векторов. В некоторых вариантах осуществления продукт гена является люциферазой. В дополнительном варианте осуществления экспрессия продукта гена снижена.

[779] В некоторых вариантах осуществления средство, способное индуцировать генетическое повреждение, такое как нокдаун или нокаут генов, кодирующих белок, вовлеченный в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), встраивают в виде комплекса, такого как рибонуклеопротеиновый комплекс (RNP). Комплексы RNP включают последовательность рибонуклеотидов, такую как молекула РНК или gRNA, и полипептид, такой как белок Cas9 или его вариант. В некоторых вариантах осуществления белок Cas9 доставляют в виде комплекса RNP, содержащего белок Cas9 и молекулу gRNA, например, gRNA, направленную против конкретного гена. В некоторых вариантах осуществления RNP, включающий одну или более молекул gRNA, направленных против гена, и фермент Cas9 или его вариант, встраивают непосредственно в клетку посредством физической доставки (например, электропорации, биобаллистической пушки, трансфекции с фосфатом кальция, компрессии или сжатия клеток), липосом или наночастиц. В конкретных вариантах осуществления RNP, включающий одну или более молекул gRNA, направленных против гена, кодирующего GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2, и фермент Cas9 или его вариант, встраивают посредством электропорации.

[780] В некоторых вариантах осуществления степень нокаута гена, кодирующего белок, вовлеченный в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), в различные моменты времени, например, через 24-72 часа после встраивания средства, можно оценивать с использованием любого из ряда хорошо известных анализов для оценки нарушения гена в клетках. Такие анализы могут включать определение уровня транскрипции, или экспрессии белка, или экспрессии на поверхности клетки.

3. Системы, зависящие от условий

[781] В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки по изобретению включают клетки, модифицированные так, чтобы достигать зависящей от условий, например, индуцибельной, экспрессии белка, вовлеченного в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, включая белки, положительно или отрицательно регулируемые IDO-опосредованным катаболизмом. В некоторых вариантах осуществления экспрессия гена, приводящего к рекомбинантной, достигнутой посредством конструирования или эктопической экспрессии белка, вовлеченного в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, отрицательно регулируемого IDO-опосредованным катаболизмом (например, mTOR или PKC тета), или транспортера аминокислот (например, CD98hc, LAT1, LAT2 или PAT4) зависит от условий. В некоторых вариантах осуществления делеция, нокаут, повреждение, снижение экспрессии, нарушение экспрессии, ингибирование положительной регуляции и/или ингибирование функции генов, кодирующих белок, положительно регулируемый IDO-опосредованным катаболизмом (например, GCN2, CHOP, Blimp-1, AHR, ARNT, eIF2α, ATF4, Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8, ИФНγ-R2), зависит от условий. В некоторых вариантах осуществления зависящая от условий супрессия генов может инициироваться или индуцироваться после передачи сигнала, индуцируемой антигенным рецептором (например, CAR), снижения детектируемых клеток, экспрессирующих антигенный рецептор (например, CAR-T-клеток), в крови, повышения ИФН-гамма или ФНО в биологическом образце, снижения триптофана и/или повышения кинуренина или другого метаболита триптофана в биологическом образце, снижения персистирования вводимых клеток, сконструированных с использованием антигенного рецептора (например, CAR), и/или после того, как такие клетки начинают проявлять фенотип истощения, например, любых из параметров, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления зависящая от условий супрессия может облегчать терапевтическое использования благодаря получению клеток, характеризующихся повышенной длительностью воздействия, и/или возможности контроля времени и/или дозы лечения.

[782] В некоторых вариантах осуществления экспрессия или активность белка, вовлеченного в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, является конститутивной; в некоторых вариантах осуществления одной или более из экспрессии или активностей достигают посредством конструирования таким образом, что они зависят от условий, например, индуцируются или репрессируются одним или более природными или неприродными событиями или молекулами.

[783] В некоторых вариантах осуществления белок, вовлеченный в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, функционально связан с индуцирующим или репрессирующим элементом, таким как один или более энхансеров, и/или трансактиваторов, или репрессоров, или других последовательностей или молекул для контроля экспрессии, например, посредством контроля транскрипции или трансляции. В рамках изобретения термин "функционально связанный" или "функционально ассоциированный" включает функциональную связь по меньшей мере двух последовательностей. Например, термин "функционально связанный" включает связь между промотором и второй последовательностью, где промоторная последовательность инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Термин "функционально ассоциированный" включает связь между индуцирующим или репрессирующим элементом и промотором, где индуцирующий или репрессирующий элемент действует в качестве транскрипционного активатора промотора.

[784] В некоторых вариантах осуществления экспрессия белка, вовлеченного в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, находится под контролем конститутивного промотора, энхансера или трансактиватора. В некоторых вариантах осуществления экспрессия находится под контролем зависящего от условий промотора, энхансера или трансактиватора. В некоторых вариантах осуществления зависящий от условий промотор, энхансер или трансактиватор является индуцибельным промотором, энхансером или трансактиватором, репрессируемым промотором, энхансером или трансактиватором или тканеспецифическим промотором, энхансером или трансактиватором.

[785] Неограничивающие примеры тканеспецифических промоторов включают промоторы, активные в сердце, легком, пищеводе, мышце, кишечнике, молочной железе, предстательной железе, желудке, мочевом пузыре, печени, селезенке, поджелудочной железе, почке, нейронах, миоцитах, лейкоцитах, иммортализованных клетках, неопластических клетках, опухолевых клетках, злокачественных клетках, двенадцатиперстной кишке, тощей кишке, подвздошной кишке, слепой кишке, толстой кишке, прямой кишке, слюнных железах, желчном пузыре, мочевом пузыре, трахее, гортани, глотке, аорте, артериях, капиллярах, венах, тимусе, нижнечелюстных лимфоузлах, брыжеечных лимфоузлах, костном мозге, гипофизе, щитовидной железе, паращитовидных железах, надпочечниках, головном мозге, полушариях головного мозга, мозжечке, продолговатом мозге, варолиевом мосту, спинном мозге, седалищном нерве, скелетной мышце, гладкой мышце, кости, яичках, придатке яичка, предстательной железе, семенных пузырьках, половом члене, яичниках, матке, молочных железах, влагалище, коже, глазах или зрительном нерве.

[786] Примеры клеточно-специфических промоторов включают специфические для T-клеток промоторы, такие как мини-промотор/энхансер CD4, описанный в Zhao-Emonet, et al. (2000) J. Gene. Med., 2: 416-425.

[787] В некоторых вариантах осуществления экспрессия белка, вовлеченного в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, зависит от условий (например, индуцируются или репрессируются, например, с помощью индуцибельного промотора или другого элемента), например, одного или более конкретных условий, событий или молекул, обнаруживаемых или обнаруживаемых на относительно более высоких уровнях в конкретных областях организма, при конкретном заболевании, состоянии активации или в конкретных тканях. Например, в некоторых вариантах осуществления промотор может являться индуцибельным или супрессируемым под действием гипоксии, условий с недостаточностью глюкозы или других питательных веществ, недостаточности метаболитов, таких как аминокислоты (например, триптофан), или нуклеиновые кислоты или липиды, элементов опухолевого микроокружения или других элементов метаболических путей или метаболитов или их уровней. См., например, Cao, et al. (2001) Gene Ther., 8: 1357-1362 и Dachs, et al. (2000) Eur. J. Cancer, 36:1649-1660, и Greco et al., (2002) Gene Ther., 9:1403-1411. В некоторых вариантах осуществления экспрессия обусловлена сигналами или путями активации или передачей сигнала через конкретный рецептор, такой как цитокиновый или антигенный рецептор (например, CAR или TCR). В некоторых вариантах осуществления экспрессия регулируется активацией или пролиферативными явлениями. Примерами индуцибельных систем являются системы, активируемые NFκB, NFAT или Nur77.

[788] В некоторых вариантах осуществления экспрессию любой из нуклеиновых кислот, представленных в настоящем описании, можно подвергать внешнему контролю посредством обработки клетки модулирующим фактором, таким как доксициклин, тетрациклин или их аналоги. Аналогами тетрациклина являются, например, хлортетрациклин, окситетрациклин, деметилхлортетрациклин, метациклин, доксициклин и миноциклин.

[789] В некоторых вариантах осуществления индуцибельную транскрипцию и/или экспрессию можно осуществлять с использованием трансактиватор-индуцируемого промотора вместе с указанным трансактиватором. В некоторых вариантах осуществления такой трансактиватор-индуцируемый промотор содержит контрольные элементы для повышения или репрессии транскрипции интересующего трансгена или нуклеиновой кислоты. Контрольные элементы включают, в качестве неограничивающих примеров, операторы, энхансеры и промоторы. В некоторых вариантах осуществления трансактиватор-индуцируемый промотор является транскрипционно активным при связывании с трансактиватором, который, в свою очередь, активируется в конкретных условиях, например, в присутствие или отсутствие конкретной комбинации химических сигналов, например, под действием модулирующего фактора, выбранного, например, из указанного выше списка.

[790] Трансактиватор-индуцируемый промотор может являться любым промотором, упомянутым в настоящем описании, модифицированных так, чтобы включать трансактиватор-связывающие последовательности, такие как несколько последовательностей tet-оператора, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательностей tet-оператора. В некоторых вариантах осуществления последовательности tet-оператора расположены тандемом. В некоторых вариантах осуществления промотор является тетрациклин-чувствительным элементом (TRE). Такими последовательностями, например, можно заменять функциональные участки распознавания Staf и Oct-1 в дистальном элементе последовательности (DSE) промотора U6, включая промотор U6 человека.

[791] Конкретные неограничивающие примеры доменов модуляторов транскрипции, индуцирующих экспрессию в присутствие модулирующего фактора, включают домены модуляторов транскрипции, обнаруживаемые в следующих модуляторах транскрипции: модуляторе транскрипции Tet-On, модуляторе транскрипции Tet-On Advanced и модуляторе транскрипции Tet-On 3G, все из которых доступны в Clontech Laboratories, Mountain View, CA. Конкретные неограничивающие примеры доменов модуляторов транскрипции, индуцирующих экспрессию в отсутствие модулирующего фактора, включают домены модуляторов транскрипции, обнаруживаемые в следующих модуляторах транскрипции: модуляторе транскрипции Tet-off и модуляторе транскрипции Tet-Off Advanced, оба из которых доступны в Clontech Laboratories, Mountain View, CA. Эти системы можно адаптировать и использовать способами, хорошо известными в этой области и, как правило, знакомыми специалистам в этой области.

[792] В некоторых вариантах осуществления трансактиватор-индуцируемый промотор содержит множество трансактиватор-связывающих последовательностей, функционально связанных с ингибиторной молекулой нуклеиновой кислоты.

[793] Трансактиватор можно получать с помощью последовательности нуклеиновой кислоты в том же экспрессирующем векторе или другом экспрессирующем векторе, содержащем промотор, зависящий от модулирующего фактора, функционально связанный с последовательностью, кодирующей трансактиватор. Термин "другой экспрессирующий вектор" предназначен для включения любого средства для доставки нуклеиновой кислоты, например, вируса, плазмиды, космиды или транспозона. Подходящие промоторы для использования в указанной последовательности нуклеиновой кислоты включают, например, конститутивные, регулируемые, тканеспецифические или универсальные промоторы, которые могут иметь клеточное, вирусное или синтетическое происхождение, такие как промоторы CMV, RSV, PGK, EF1α, NSE, синапсина, β-актина, GFAP.

[794] В некоторых вариантах осуществления примером трансактиватора является трансактиватор rtTA-Oct2, состоящий из ДНК-связывающего домена rtTA2-M2 и активирующего домена Oct-2Q(Q→A). Другим примером трансактиватора в некоторых вариантах осуществления является трансактиватор rtTA-Oct3, состоящий из ДНК-связывающего домена белка Tet-репрессора (E. coli) и активирующего домена Oct-2Q(Q→A). Оба из них описаны в патентной заявке № WO 2007/004062.

[795] Некоторые варианты осуществления включают выделенную нуклеотидную последовательность, кодирующую регуляторный слитый белок (RPR), где слитый белок содержит (1) блокирующий транскрипцию домен, способный ингибировать экспрессию интересующей нуклеотидной последовательности, и (2) лиганд-связывающий домен, где в присутствие когнатного лиганда, способного связываться с лиганд-связывающим доменом, слитый белок стабилизируется.

[796] В некоторых вариантах осуществления блокирующий транскрипцию домен можно получать из репрессорного белка бактерий, бактериофага, эукариот или дрожжей. В некоторых вариантах осуществления блокирующий транскрипцию домен получают из репрессорного белка бактерии или бактериофага, такого как, например, TetR, LexA, LacI, TrpR, Arc и LambdaCI. В некоторых вариантах осуществления блокирующий транскрипцию домен получают из эукариотического репрессорного белка, такого как, например, GAL4. В некоторых вариантах осуществления блокирующий транскрипцию домен является мутантным ферментом рестрикции, способным связываться с ДНК, но не расщеплять ее, и оператор является участком распознавания фермента рестрикции. В некоторых вариантах осуществления, например, блокирующий транскрипцию домен является мутантным NotI.

[797] В некоторых вариантах осуществления лиганд-связывающий домен получают из рецептора стероидов, гормонов щитовидной железы или ретиноидов. В некоторых вариантах осуществления лиганд-связывающий домен получают из рецептора эстрогена, и когнатным лигандом является эстрогеном. В некоторых вариантах осуществления рецептор эстрогена содержит одну или более мутаций, например, мутаций T2, и когнатным лигандом является тамоксифен. Эти системы можно адаптировать и использовать способами, хорошо известными в этой области и, как правило, знакомыми специалистам в этой области.

[798] В некоторых вариантах осуществления для модуляции транскрипции можно использовать систему RheoSwitch. В некоторых вариантах осуществления система RheoSwitch включает белки Rheoreceptor и Rheoactivator, которые могут активироваться в присутствие лиганда RSL1. В некоторых вариантах осуществления рецептор и активатор стабильно димеризуются, связываются с чувствительным элементом и запускают транскрипцию в присутствие лиганда RSL1 (см., например, инструкции к "RheoSwitch® Mammalian Inducible Expression System", New England BioLabs® Inc., версии 1.3 от ноября 2007 года; Karzenowski, D. et al., BioTechiques 39:191-196 (2005); Dai, X. et al., Protein Expr. Purif 42:236-245 (2005); Palli, S. R. et al., Eur. J. Biochem. 270:1308-1515 (2003); Dhadialla, T. S. et al., Annual Rev. Entomol. 43:545-569 (1998); Kumar, M. B, et al., J. Biol. Chem. 279:27211-27218 (2004); Verhaegent, M. and Christopoulos, T. K., Annal. Chem. 74:4378-4385 (2002); Katalam, A. K., et al., Molecular Therapy 13:S103 (2006); и Karzenowski, D. et al., Molecular Therapy 13:S194 (2006)).

[799] В некоторых вариантах осуществления для модуляции транскрипции можно использовать электромагнитную энергию, включая, например, системы и способы, описанные в WO 2014/018423, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.

[800] В некоторых вариантах осуществления контролируемой регуляции транскрипции РНК можно достигать посредством включения связывающей репрессор области, такой как, например, область из системы репрессора/оператора lac, модифицированной для млекопитающих. См. Hu and Davidson, 1987, и Kozak, 1986.

[801] В некоторых вариантах осуществления встроенную нуклеиновую кислоту, такую как нуклеиновая кислота, представляющая собой или кодирующая ингибиторное средство, можно удалять после ее интеграции в геном хозяина, например, с использованием способов сайт-специфической рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления ингибиторное средство, такое как нуклеиновая кислота, представляющая собой или кодирующая CRISPR, gRNA, Cas, ZFP, ZFN, TALE, TALEN, РНКи, миРНК, shRNA, мкРНК, антисмысловую РНК и/или рибозимы, помещают между последовательностями участков рекомбинации, таких как loxP. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает по меньшей мере один (как правило, два) участок для рекомбинации, опосредованной сайт-специфической рекомбиназой. В некоторых вариантах осуществления сайт-специфические рекомбиназы катализуют встраивание или эксцизию фрагментов ДНК из более длинной молекулы ДНК. В некоторых вариантах осуществления эти ферменты распознают относительно короткую уникальную последовательность нуклеиновой кислоты, служащую для распознавания и рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления участок рекомбинации содержит короткие инвертированные повторы (длиной 6, 7 или 8 пар оснований), и длина ДНК-связывающего элемента может составлять от приблизительно 11 до приблизительно 13 п.н.

[802] В некоторых вариантах осуществления векторы могут содержать один или более участков рекомбинации для любой из широкого спектра сайт-специфических рекомбиназ. Следует понимать, что участок-мишень для сайт-специфической рекомбиназы является дополнением к любым участкам, необходимым для интеграции вирусного, например, лентивирусного, генома. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота включает один или более участков для фермента рекомбиназы, выбранной из группы, состоящей из Cre, XerD, HP1 и Flp. Эти ферменты и их участки рекомбинации хорошо известны в этой области (см., например, Sauer et al., 1989, Nucleic Acids Res., 17:147; Gorman et al., 2000, Curr. Op. Biotechnol, 11:455; O'Gorman et al., 1991, Science, 251: 1351; Kolb, 2002, Cloning Stem Cells, 4:65; Kuhn et al., 2002, Methods MoI. Biol, 180:175).

[803] В некоторых вариантах осуществления эти рекомбиназы катализуют консервативную рекомбинацию ДНК между двумя участками распознавания размером 34 п.н. (loxP и FRT, соответственно). В некоторых вариантах осуществления помещение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промоторным элементом, между двумя участками loxP (в этом случае последовательность является "loxP-фланкированной") делает возможной контролируемую экспрессию встроенной нуклеиновой кислоты, кодирующей ингибиторное средство, такое как любое из ингибиторных средств, представленных в настоящем описании, после переноса в клетку. При индукции экспрессии Cre в клетке гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты подвергается эксцизии, что, таким образом, предотвращает дальнейшую транскрипцию и/или эффективно устраняет экспрессию последовательности. Некоторые варианты осуществления включают Cre-опосредованную активацию гена, посредством которой можно активировать гетерологичные или эндогенные гены, например, посредством удаления ингибиторного элемента или участка полиаденилирования.

[804] Как описано выше, помещение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты между участками loxP делает возможной контролируемую экспрессию гетерологичной последовательности после переноса в клетку. При индукции экспрессии Cre в клетке гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может подвергаться эксцизии, что, таким образом, предотвращает дальнейшую транскрипцию и/или эффективно устраняет экспрессию последовательности. Экспрессию Cre можно индуцировать любым из множества способов. Например, Cre может присутствовать в клетках под контролем индуцибельного промотора, и экспрессию Cre можно индуцировать с помощью активирующего промотора. Альтернативно или дополнительно, экспрессию Cre можно индуцировать посредством встраивания экспрессирующего вектора, регулирующего экспрессию Cre в клетке. Можно использовать любой подходящий экспрессирующий вектор, включая, в качестве неограничивающих примеров, вирусные векторы, такие как лентивирусные или аденовирусные векторы. В рамках изобретения фраза "индукция экспрессии Cre" относится к любому процессу, приводящему к повышенному уровню Cre в клетке.

[805] Лентивирусные трансферные плазмиды, содержащие два участка loxP, применимы в любом случае, в котором можно использовать стандартные векторы, содержащие два участка loxP. Например, селективные маркеры можно помещать между участками loxP. Это делает возможным последовательный и повторный таргетинг множества генов в одной клетке (или ее потомстве). После встраивания в клетку трансферной плазмиды, содержащей loxP-фланкированный селективный маркер, стабильных трансфектантов можно подвергать селекции. После выделения стабильного трансфектанта маркер можно подвергать эксцизии посредством индукции Cre. Затем маркер можно использовать для таргетинга второго гена в клетку или ее потомство. Аналогично можно использовать лентивирусные частицы, содержащие лентивирусный геном, полученный из трансферных плазмид.

[806] В некоторых вариантах осуществления трансферные плазмиды и лентивирусные частицы можно использовать для достижения конститутивной, зависящей от условий, обратимой или тканеспецифической экспрессии в клетках, тканях или организмах. Некоторые варианты осуществления включают способ обратимой экспрессии транскрипта в клетке, включающий: (i) доставку лентивирусного вектора в клетку, где лентивирусный вектор содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, и где гетерологичную нуклеиновую кислоту располагают между участками для сайт-специфической рекомбиназы; и (ii) индукцию экспрессии сайт-специфической рекомбиназы в клетке и, таким образом, предотвращение синтеза транскрипта в этих клетках. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая сайт-специфическую рекомбиназу, функционально связана с индуцибельным промотором, и стадия индукции включает использование индуцирующего промотора, как описано выше.

D. Векторы и способы генетической инженерии

[807] Встраивание молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих рекомбинантный рецептор и/или белок, вовлеченный в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке, или кодирующих средство, регулирующее экспрессию белка, вовлеченного в IDO-опосредованную иммуносупрессорную передачу сигнала, ассоциированную с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированную с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке, можно осуществлять с использованием любого из ряда известных векторов. Такие векторы включают вирусные и невирусные системы, включая лентивирусные и гамма-ретровирусные системы, а также системы на основе транспозонов, такие как системы переноса на основе транспозонов PiggyBac или Sleeping Beauty. Примеры способов включают способы переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы, включающие использование вирусов, например, ретровирусов или лентивирусов, трансдукции, транспозонов и электропорации.

[808] В некоторых вариантах осуществления перенос гена осуществляют сначала посредством стимуляции клетки, например, посредством ее комбинирования со стимулом, индуцирующим ответ, такой как пролиферация, выживаемость и/или активация, например, измеряемый по экспрессии цитокина или маркера активации, с последующей трансдукцией активированных клеток и выращиванием в культуре до количеств, достаточных для клинического использования.

[809] В некоторых вариантах осуществления до переноса гена или после него клетки инкубируют или культивируют в присутствие модулятора метаболического пути триптофана, такого как модулятор пути кинуренина, включая любой из модуляторов, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления модулятор метаболизма триптофана и/или кинуренин (например, ингибитор IDO1) добавляют во время производства клеток, например, во время конструирования CAR-T-клеток. В некоторых аспектах наличие модулятора может улучшать качество получаемой популяции клеток. В некоторых аспектах модулятор (например, ингибитор IDO1) может повышать пролиферацию или экспансию клеток или может изменять один или более путей передачи сигнала, таким образом, приводя к получению клеток с менее дифференцированным или менее активированным поверхностным фенотипом, несмотря на то, что эти клетки демонстрируют значительную экспансию и/или эффекторную функцию.

[810] В некоторых случаях гиперэкспрессия стимуляторного фактора (например, лимфокина или цитокина) может быть токсичной для индивидуума. Таким образом, в некоторых случаях сконструированные клетки включают сегменты генов, делающие клетки восприимчивыми к отрицательной селекции in vivo, например, после введения при адоптивной иммунотерапии. Например, в некоторых аспектах клетки сконструируют таким образом, что они могут подвергаться элиминации в результате изменения in vivo состояния пациента, которому их вводят. Подвергаемый отрицательной селекции фенотип может являться результатом инсерции гена, придающего чувствительность к вводимому средству, например, соединению. Подвергаемые отрицательной селекции гены включают ген тимидинкиназы вируса простого герпеса тип I (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell II:223, I977), придающий чувствительность к ганцикловиру; ген клеточной гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), ген клеточной аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT), ген бактериальной цитозиндезаминазы (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).

[811] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в клетки с использованием рекомбинантных инфекционных вирусных частиц, таких как, например, векторы, полученные из вируса обезьян 40 (SV40), аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки с использованием рекомбинантных лентивирусных векторов или ретровирусных векторов, таких как гамма-ретровирусные векторы (см., например, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557).

[812] В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор имеет последовательность длинного концевого повтора (LTR), например, ретровирусный вектор, полученный из вируса лейкоза мышей Молони (MoMLV), вируса миелопролиферативной саркомы (MPSV), вируса эмбриональных стволовых клеток мыши (MESV), вируса стволовых клеток мыши (MSCV), вируса некроза селезенки (SFFV) или аденоассоциированного вируса (AAV). Большинство ретровирусных векторов получают из ретровирусов мыши. В некоторых вариантах осуществления ретровирусы включают ретровирусы, полученные из любых клеток птиц или млекопитающих. Ретровирусы, как правило, являются амфотропными, что означает, что они способны инфицировать клетки-хозяева нескольких видов, включая людей. В одном из вариантов осуществления геном, подлежащим экспрессии, заменяют ретровирусные последовательности gag, pol и/или env. Описан ряд иллюстративных ретровирусных систем (например, патенты США №№ 5219740; 6207453; 5219740; Miller and Rosman (1989) BioMethods 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; и Boris-Lawrie и Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109).

[813] Известны способы лентивирусной трансдукции. Примеры способов описаны, например, в Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; и Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.

[814] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки посредством электропорации (см., например, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE8(3):e60298 и Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки посредством транспозиции (см., например, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; и Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Другие способы встраивания и экспрессии генетического материала в иммунных клетках включают трансфекцию с фосфатом кальция (например, как описано, в Current Protocols in Molecular biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), слияние протопластов, трансфекцию, опосредованную катионными липосомами; бомбардировку микрочастицами вольфрама (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)) и совместное осаждение ДНК фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

[815] Другие подходы и векторы для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантные продукты, описаны, например, в публикации международной патентной заявки № WO2014055668 и патенте США № 7446190.

[816] В некоторых вариантах осуществления клетки, например, T-клетки, можно трансфицировать во время или после экспансии, например, с использованием T-клеточного рецептора (TCR) или химерного антигенного рецептора (CAR). Эту трансфекцию для встраивания гена желаемого рецептора можно осуществлять, например, с использованием любого подходящего ретровирусного вектора. Затем генетически модифицированную популяцию клеток можно освобождать от воздействия исходного стимула (стимула против CD3/против CD28, например), а затем стимулировать вторым типом стимула, например, с помощью встроенного de novo рецептора. Этот второй тип стимула может включать антигенный стимул в форме молекулы пептид/MHC, когнатный (перекрестно сшивающий) лиганд генетически встроенного рецептора (например, природный лиганд CAR) или любой лиганд (такой как антитело), напрямую связывающийся с каркасом нового рецептора (например, посредством распознавания константных областей в рецепторе). См., например, Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 или Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014).

[817] В некоторых случаях можно использовать вектор, для которого не требуется активация клеток, например, T-клеток. В некоторых из таких случаев клетки можно подвергать селекции и/или трансдуцировать перед активацией. Таким образом, клетки можно конструировать до или после культивирования клеток и, в некоторых случаях, во время культивирования или во время, по меньшей мере, его части.

[818] В некоторых аспектах клетки далее конструируют для стимуляции экспрессии цитокинов или других факторов. Дополнительные нуклеиновые кислоты, например, гены для встраивания, включают нуклеиновые кислоты для улучшения активности или исхода терапии, например, посредством стимуляции жизнеспособности и/или функции клеток, подвергнутых переносу; гены, обеспечивающие получение маркера для селекции и/или оценки клеток, например, для оценки выживаемости in vivo или локализации; гены для улучшения безопасности, например, делающие клетку восприимчивой к отрицательной селекции in vivo, как описано в Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); и Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); см. также публикации PCT/US91/08442 и PCT/US94/05601 Lupton et al., в которых описывают использованием бифункциональных подвергаемых селекции слитых генов, полученных при слиянии доминантного положительного селективного маркера с отрицательным селективным маркером. См., например, патент США № 6040177 Riddell et al., колонки 14-17.

V. ПРОМЫШЛЕННЫЕ ИЗДЕЛИЯ И НАБОРЫ

[819] Изобретение также относится к наборам и промышленным изделиям, содержащим модуляторы метаболизма триптофана и/или пути кинуренина по изобретению, например, ингибиторы IDO1, и компоненты для иммунотерапии, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или T-клеточное терапевтическое средство, например, сконструированные клетки, и/или их композиции. Промышленные изделия могут включать контейнер и ярлык или вкладыш в упаковку, расположенные на контейнере или связанные с ним. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, сосуды, шприцы, мешки для IV растворов и т.д. Контейнеры можно получать из различных материалов, таких как стекло или пластик. В некоторых вариантах осуществления в контейнере содержится композиция, которая сама по себе или в комбинации с другой композицией является эффективной для лечения, профилактики и/или диагностики состояния. В некоторых вариантах осуществления контейнер имеет стерильное входное отверстие. Примеры контейнеров включают мешки для внутривенных растворов, сосуды, включая сосуды с пробками, прокалываемыми иглой для инъекции, или бутыли или сосуды для перорально вводимых средств. На ярлыке или вкладыше в упаковку можно указывать, что композицию используют для лечения заболевания или состояния. Промышленное изделие может включать (a) первый контейнер с композицией, содержащейся в нем, где композиция включает антитело или сконструированные клетки, используемые для иммунотерапии, например, T-клеточной терапии; и (b) второй контейнер с композицией, содержащейся в нем, где композиция включает второе средство, такое как модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитор IDO1. Промышленное изделие может дополнительно включать вкладыш в упаковку, на котором указывают, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. Альтернативно или дополнительно, промышленное изделие может дополнительно включать другой или тот же контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер. Оно также может дополнительно включать другие материалы, такие как другие буферы, дилюенты, фильтры, иглы и/или шприцы.

[820] В некоторых вариантах осуществления набор или промышленное изделие включает любые из сконструированных клеток, модуляторов метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, комбинаций, композиций, полинуклеотидов, набора полинуклеотидов, композиции, содержащей набор полинуклеотидов, векторов, набора векторов, композиции, содержащей набор векторов, наборов, дополнительных терапевтических средств, средств, используемых для диагностики и/или оценки, и/или средств, используемых для конструирования клеток для иммунотерапии.

[821] В некоторых вариантах осуществления набор или промышленное изделие дополнительно содержит инструкции по введению комбинированного лекарственного средства, например, иммунотерапевтического средства (например, T-клеточного терапевтического средства, такого как CAR-T-клеточное терапевтическое средство) и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина. В некоторых вариантах осуществления набор или промышленное изделие дополнительно содержит инструкции для стадий скрининга и/или оценки для определения пригодности для комбинированного лечения, для идентификации индивидуумов для лечения с использованием комбинированного лекарственного средства и/или продолжения комбинированного лечения, и/или стадии оценки исходов лечения и/или мониторинга исходов лечения.

VI. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[822] Если не указано иначе, все термины, известные в этой области, номенклатура и другие технические и научные термины или терминология, используемые в настоящем описании, должны иметь значение, общепринято понятное специалисту в области, к которой относится изобретение. В некоторых случаях термины с общепринято понимаемыми значениями определены в настоящем описании для ясности и/или в качестве готовой ссылки, и включение таких определений в настоящее описание не следует обязательно истолковывать как существенное отличие от значения, как правило, понимаемого в этой области.

[823] Термин "фармацевтический состав" относится к препарату, находящемуся в такой форме, которая позволяет биологической активности активного ингредиента, содержащегося в нем, быть эффективной, и препарату, несодержащему дополнительные компоненты, являющиеся неприемлемо токсичными для индивидуума, которому будут вводить этот состав.

[824] В рамках изобретения термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной приводить к размножению другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую его встраивают. Конкретные векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем описании обозначают как "экспрессирующие векторы". Векторы включают вирусные векторы, такие как ретровирусные, например, гамма-ретровирусные и лентивирусные векторы.

[825] Термины "клетка-хозяин", "линия клеток-хозяев" и "культура клеток-хозяев" используют взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые встраивают экзогенную нуклеиновую кислоту, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформантов" и "трансформированные клетки", включающие первичную трансформированную клетку и ее потомство без учета количества пассажей. Потомство может не являться полностью идентичным по содержанию нуклеиновой кислоты относительно родительской клетки, но может содержать мутации. В настоящее описание включено мутантное потомство, имеющее ту же функцию или биологическую активность, что и подвергнутая скринингу или селекции исходно трансформированная клетка.

[826] В рамках изобретения указание на то, что клетка или популяция клеток является "положительной" по конкретному маркеру, относится к детектируемому наличию конкретного маркера, как правило, поверхностного маркера, на клетке или в клетке. В случае поверхностного маркера термин относится к наличию поверхностной экспрессии, определяемой посредством проточной цитометрии, например, посредством окрашивания с использованием антитела, специфически связывающегося с маркером, и детекции указанного антитела, где окрашивание определяют посредством проточной цитометрии на уровне, значительно более высоком, чем окрашивание, определяемое тем же способом с использованием изотипического контроля в, в остальном, идентичных условиях, и/или на уровне, по существу, схожим с уровнем для клетки, о которой известно, что она является положительной по маркеру, и/или на уровне, значительно более высоком, чем уровень для клетки, о которой известно, что она является отрицательной по маркеру.

[827] В рамках изобретения указание на то, что клетка или популяция клеток является "отрицательной" по конкретному маркеру, относится к отсутствию значительного детектируемого наличия конкретного маркера, как правило, поверхностного маркера, на клетке или в клетке. В случае поверхностного маркера термин относится к отсутствию поверхностной экспрессии, определяемой посредством проточной цитометрии, например, посредством окрашивания с использованием антитела, специфически связывающегося с маркером, и детекции указанного антитела, где окрашивание не определяют при проточной цитометрии на уровне, значительно более высоком, чем окрашивание, определяемое тем же способом с использованием изотипического контроля в, в остальном, идентичных условиях, и/или не уровне, значительно более низком, чем уровень для клетки, о которой известно, что она является положительной по маркеру, и/или на уровне, по существу, схожем с уровнем для клетки, о которой известно, что она является отрицательной по маркеру.

[828] В рамках изобретения термин "процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей" и "процент идентичности" в отношении аминокислотной последовательности (референсной полипептидной последовательности) определяют как процентную долю аминокислотных остатков в последовательности-кандидате (например, отдельном антителе или фрагменте), идентичных аминокислотным остаткам в референсной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и включения пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивания в целях определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно достигать различными способами, известными специалистам в этой области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в этой области могут определять соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.

[829] В рамках изобретения термины в единственном числе включают ссылку на множественное число, если контекст четко не указывает на иное. Например, "один" означает "по меньшей мере" или "один или более". Следует понимать, что аспекты и варианты, представленные в настоящем описании, включают "состоящие" и/или "состоящие, по существу, из" аспекты и варианты.

[830] На всем протяжении настоящей заявки различные аспекты объектов изобретения представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона представлено исключительно для удобства и краткости, и его не следует истолковывать в качестве жесткого ограничения объема изобретения. Таким образом, описание диапазона необходимо считать конкретно включающим все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, если представлен диапазон значений, следует понимать, что каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределами этого диапазона и другие указанные или промежуточные значения в указанном диапазоне включены в объем изобретения. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов можно независимо включать в меньшие диапазоны, и они также входят в объем изобретения, указывая любой конкретно исключенный предел в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба включенных предела, также включены в объем изобретения. Это применимо независимо от ширины диапазона.

[831] В рамках изобретения термин "приблизительно" относится к обычному диапазону ошибки для соответствующего значения, известному специалисту в этой области. Ссылка на "приблизительное" значение или параметр в настоящем описании включает (и описывает) варианты осуществления, относящиеся к этому значению или параметру как таковому. Например, описание "приблизительно X" включает описание "X".

[832] В рамках изобретения термин "композиция" относится к любой смеси двух или более продуктов, веществ или соединений, включая клетки. Она может являться раствором, суспензией, жидкостью, порошком, пастой, водным раствором, неводным раствором или любой их комбинацией.

[833] Термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к иному ингредиенту в фармацевтическом составе, чем активный ингредиент, являющемуся нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемый носитель включает, в качестве неограничивающих примеров, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

[834] В рамках изобретения термин "индивидуум" представляет собой млекопитающего, такого как человек или другое животное, и, как правило, является человеком. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, например, пациент, которому вводят модуляторы метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, сконструированные клетки или композиции, представляет собой млекопитающего, как правило, примата, такого как человек. В некоторых вариантах осуществления примат является обезьяной. Индивидуум может иметь мужской или женский пол и любой подходящий возраст, включая младенца, подростка, взрослого и пожилого индивидуума. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является неявляющимся приматом млекопитающим, таким как грызун.

[835] В рамках изобретения термин "лечение" (и его грамматические варианты, такие как "лечить") относится к полному или частичному улучшению или снижению заболевания, или состояния или нарушения, или симптома, неблагоприятного воздействия или исхода, или фенотипа, ассоциированного с ними. Желаемые эффекты лечения включают, в качестве неограничивающих примеров, профилактику возникновения или рецидивирования заболевания, улучшение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, профилактику метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевание, улучшение или временное облегчение состояния заболевания, ремиссию или улучшенный прогноз. Под терминами не подразумевают полное излечение заболевания или полное устранение любого симптома или эффектов всех симптомом или исходом.

[836] В рамках изобретения термин "задержка развития заболевания" означает отсрочивание, препятствование, замедление, торможение, стабилизацию, супрессию и/или отдаление развития заболевания (такого как злокачественное новообразование). Эта задержка может иметь различную длительность в зависимости от анамнеза заболевания и/или индивидуума, подвергаемого лечению. Как очевидно специалисту в этой области, достаточная или значительная задержка, фактически, может включать профилактику, при которой у индивидуума не развивается заболевание. Например, можно замедлять развитие поздней стадии злокачественного новообразования, например, развитие метастазирования.

[837] В рамках изобретения термин "профилактика" включает осуществление профилактики в отношении возникновения или рецидивирования заболевания у индивидуума, предрасположенного к заболеванию, но у которого еще не диагностировали заболевание. В некоторых вариантах осуществления клетки и композиции по изобретению используют для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.

[838] В рамках изобретения "супрессия" функции или активности означает снижение функции или активности по сравнению с, в остальном, теми же условиями, за исключением интересующего условия или параметра, или альтернативно, по сравнению с другими условиями. Например, клетки, супрессирующие рост опухоли, снижают скорость роста опухоли по сравнению со скоростью роста опухоли в отсутствие клеток.

[839] Термин "эффективное количество" средства, например, фармацевтического состава, клеток или композиции, в контексте введения относится к количеству, эффективному в необходимых дозах/количествах и в течение необходимых периодов времени для достижения желаемого результата, такого как терапевтический или профилактический результат.

[840] Термин "терапевтически эффективное количество" средства, например, фармацевтического состава или сконструированных клеток, относится к количеству, эффективному в необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого терапевтического результата, такого как лечение заболевания, состояния или нарушения, и/или фармакокинетического или фармакодинамического эффекта лечения. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивидуума, и вводимого модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, или сконструированных клеток. В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению включают введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, например, ингибитора IDO1, сконструированных клеток или композиций в эффективных количествах, например, терапевтически эффективных количествах.

VII. ПРИМЕРЫ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[841] Варианты осуществления изобретения включают:

1. Способ лечения, включающий:

(a) введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием; и

(b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина начинают более чем за 1 день до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства.

2. Способ лечения, включающий введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, где индивидууму ранее вводили терапевтически эффективное количество модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, начиная более чем за 1 день до начала T-клеточной терапии.

3. Способ по п. 1 или 2, где введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина начинают в момент времени в пределах или в пределах приблизительно 2 дней, 3 дней, 6 дней, 12 дней, 15 дней, 30 дней, 60 дней или 90 дней или более до начала введения T-клеточного терапевтического средства.

4. Способ по любому из пп. 1-3, дополнительно включающий продолжение введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина с началом или после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или с введением или после введения T-клеточного терапевтического средства.

5. Способ по любому из пп. 1-4, дополнительно включающий введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

6. Способ лечения, включающий:

(a) введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием; и

(b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

7. Способ лечения, включающий введение индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где индивидууму ранее вводили T-клеточное терапевтическое средство.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где до начала введения композиции, содержащей T-клетки, индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

9. Способ лечения, включающий:

(a) введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием; и

(b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где до начала введения композиции, содержащей T-клетки, индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

10. Способ лечения, включающий введение индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где индивидууму вводили T-клеточное терапевтическое средство, где до начала введения композиции, содержащей T-клетки, индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где заболевание или состояние является злокачественным новообразованием.

12. Способ по п. 9 или 11, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят до, во время и/или после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до, во время и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

13. Способ по любому из пп. 9, 11 или 12, где введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимого на стадии (b), начинают в момент времени в пределах или в пределах приблизительно 2 дней, 3 дней, 6 дней, 12 дней, 15 дней, 30 дней, 60 дней или 90 дней или более до начала введения T-клеточного терапевтического средства.

14. Способ по любому из пп. 9-12, включающий введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимого на стадии (b), после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

15. Способ по любому из пп. 5-12, и 14, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда:

наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

до того, как количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

до того, как T-клетки начнут проявлять признаки длительного триптофанового голодания, истощения, снижения эффекторной функции, экспрессии ингибиторных рецепторов и/или утраты пролиферативной способности;

до того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства станет детектируемым в крови индивидуума;

уровень интерферона-гамма (ИФНγ) повысится в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится более или более чем приблизительно в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз или 100 раз или более по сравнению с пиковым или максимальным количеством клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства; и/или

после того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства становится детектируемым в крови индивидуума, количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, составит менее 10%, менее 5%, менее 1% или менее 0,1% от всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) в крови индивидуума.

16. Способ по п. 15, где повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

17. Способ по любому из пп. 5-12 и 14-16, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней после начала T-клеточной терапии.

18. Способ по любому из пп. 5-12 и 14-17, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов или 48 часов после начала T-клеточной терапии.

19. Способ по п. 15 или 16, где биологический образец является образцом сыворотки, или плазмы, или опухоли или является опухолью.

20. Способ по любому из пп. 1-19, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает образование, концентрацию, доступность, метаболизм и/или эффект фермента и/или метаболита пути кинуренина.

21. Способ по любому из пп. 1-20, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает катаболизм триптофана, предотвращает или снижает синтез или накопление метаболита триптофана или снижает соотношение кинуренина и триптофана.

22. Способ по п. 21, где метаболит триптофана выбран из кинуренина, 3-гидроксикинуренина и 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA).

23. Способ по любому из пп. 1-22, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является низкомолекулярным соединением, пептидом, белком, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты.

24. Способ по любому из пп. 1-23, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является антагонистом фермента кинурениназы.

25. Способ по любому из пп. 1-23, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), ингибитором IDO2 и ингибитором триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO).

26. Способ по любому из пп. 1-23 и 25, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO/TDO двойного действия.

27. Способ по любому из пп. 1-23 и 25, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1).

28. Способ по любому из пп. 6-23, 25 и 27, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO1, и ингибитор IDO1 вводят, когда наблюдают повышение экспрессии или активности IDO1 в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

29. Способ по любому из пп. 1-23, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

30. Способ по любому из пп. 1-29, где:

злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства; и/или

злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по TDO до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии TDO до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства.

31. Способ по п. 30, где злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства.

32. Способ лечения, включающий:

(a) введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, где злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназе 1 (IDO1) или триптофан-2,3-диоксигеназе (TDO) до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1, или опухоли, положительной по TDO до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства; и

(b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, являющегося ингибитором IDO1.

33. Способ по п. 32, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят до, во время и/или после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до, во время и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

34. Способ лечения, включающий введение индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, являющегося ингибитором IDO1, где индивидууму вводили T-клеточное терапевтическое средство, где злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназе 1 (IDO1) или триптофан-2,3-диоксигеназе (TDO) до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1, или опухоли, положительной по TDO до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства.

35. Способ лечения, включающий введение индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, T-клеточного терапевтического средства, где индивидууму вводили терапевтически эффективное количество модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, являющегося ингибитором IDO1, где злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназе 1 (IDO1) или триптофан-2,3-диоксигеназе (TDO) до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1, или опухоли, положительной по TDO до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства.

36. Способ по любому из пп. 32-35, где заболевание или состояние является злокачественным новообразованием.

37. Способ по любому из пп. 32-35, где до начала введения композиции, содержащей T-клетки, индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

38. Способ по любому из пп. 35-37, включающий введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимого на стадии (b), после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

39. Способ по любому из пп. 32-34 и 36-38, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда:

наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

до того, как количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

до того, как T-клетки начнут проявлять признаки длительного триптофанового голодания, истощения, снижения эффекторной функции, экспрессии ингибиторных рецепторов и/или утраты пролиферативной способности;

до того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства станет детектируемым в крови индивидуума;

уровень интерферона-гамма (ИФНγ) повысится в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится более или более чем приблизительно в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз или 100 раз или более по сравнению с пиковым или максимальным количеством клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства; и/или

после того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства становится детектируемым в крови индивидуума, количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, составит менее 10%, менее 5%, менее 1% или менее 0,1% от всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) в крови индивидуума.

40. Способ по п. 39, где повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

41. Способ по любому из пп. 32-34 и 36-40, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней после начала T-клеточной терапии.

42. Способ по любому из пп. 32-34 и 36-41, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов или 48 часов после начала T-клеточной терапии.

43. Способ по любому из пп. 32, 33 и 35-37, где:

модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят за от или приблизительно от 0 до 96 часов, от 0 до 72 часов, от 0 до 48 часов, от 0 до 24 часов, от 0 до 12 часов или 0 до 6 часов или 0 до 2 часов до начала T-клеточной терапии; или

модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят не более чем за 96 часов, 72 часов, 48 часов, 24 часа, 12 часов, 6 часов, 2 часа или 1 час до начала T-клеточной терапии.

44. Способ по любому из пп. 1-23 и 25-43, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из 1-метил-D-триптофана (1-MT) (индоксимода), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (INCB024360, эпакадостата), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил} амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанола (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или их комбинации.

45. Способ по п. 44, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (INCB024360, эпакадостатом).

46. Способ по п. 44, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 1-метил-D-триптофаном (1-MT) (индоксимодом).

47. Способ по любому из пп. 32-43, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

48. Способ лечения, включающий:

(a) введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием; и

(b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина представляет собой или содержит 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамид (INCB024360, эпакадостат), необязательно, являющийся эпакадостатом.

49. Способ лечения, включающий введение индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина представляет собой или содержит 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамид (INCB024360, эпакадостат), необязательно, являющийся эпакадостатом, где индивидууму вводили T-клеточное терапевтическое средство.

50. Способ лечения, включающий введение индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, T-клеточного терапевтического средства, где индивидууму вводили терапевтически эффективное количество модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина представляет собой или содержит 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамид (INCB024360, эпакадостат), необязательно, являющийся эпакадостатом.

51. Способ по любому из пп. 48-50, где заболевание или состояние является злокачественным новообразованием.

52. Способ по любому из пп. 1-51, где после введения индивидууму T-клеточное терапевтическое средство вызывает повышение уровня интерферона-гамма (ИФНγ) у индивидуума в локальном окружении опухоли или в образце сыворотки или плазмы индивидуума по сравнению с уровнем ИФН-гамма у индивидуума до начала T-клеточной терапии.

53. Способ по любому из пп. 1-52, где T-клеточное терапия представляет собой или включает терапию инфильтрирующими опухоль лимфоцитами (TIL) или T-клеточную терапию, включающую генетически сконструированные клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом.

54. Способ по п. 53, где T-клеточная терапия представляет собой или включает генетически сконструированные клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом.

55. Способ по п. 54, где сконструированная клетка дополнительно содержит модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке.

56. Способ лечения, включающий введение генетически сконструированных T-клеток индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, где генетически сконструированная T-клетка содержит (i) рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, и (ii) модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке.

57. Способ лечения, включающий введение генетически сконструированных T-клеток индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, где генетически сконструированная T-клетка содержит (i) рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, и (ii) рекомбинантный, сконструированный и/или эктопически экспрессируемый транспортер аминокислот или его цепь или его функциональную и/или каталитически активную часть или вариант.

58. Способ по п. 57, дополнительно включающий (b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

59. Способ лечения, включающий:

(a) введение генетически сконструированных T-клеток индивидууму, имеющему заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, где генетически сконструированная T-клетка содержит (i) рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, и (ii) модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке; и

(b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

60. Способ по любому из пп. 56-59, где заболевание или состояние является злокачественным новообразованием.

61. Способ по любому из пп. 55-60, где индивидуума выбирают по наличию опухоли, положительной по экспрессия транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), тяжелой цепи CD98 (4F2hc; CD98hc; SLC3A2) и/или протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4), или по наличию клеток в микроокружении опухоли, положительных по экспрессии LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4.

62. Способ по любому из пп. 58-60, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает образование, концентрацию, доступность, метаболизм и/или эффект фермента и/или метаболита пути кинуренина.

63. Способ по любому из пп. 59-62, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает катаболизм триптофана или предотвращает или снижает синтез или накопление метаболита триптофана.

64. Способ по п. 63, где метаболит триптофана выбран из кинуренина, 3-гидроксикинуренина и 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA).

65. Способ по любому из пп. 59-64, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является низкомолекулярным соединением, пептидом, белком, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты.

66. Способ по любому из пп. 59-65, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является антагонистом фермента кинурениназы.

67. Способ по любому из пп. 59-66, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), ингибитором IDO2 и ингибитором триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO).

68. Способ по любому из пп. 59-65 и 67, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO/TDO двойного действия.

69. Способ по любому из пп. 59-65 и 67, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1).

70. Способ по любому из пп. 59-65 и 50-52, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из 1-метил-D-триптофана (1-MT) (индоксимода), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (INCB024360, эпакадостата), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанола (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или их комбинации.

71. Способ по п. 70, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (INCB024360, эпакадостатом).

72. Способ по п. 70, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 1-метил-D-триптофаном (1-MT) (индоксимодом).

73. Способ по любому из пп. 59-65, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

74. Способ по любому из пп. 48-73, где до начала введения композиции, содержащей T-клетки, индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

75. Способ по любому из пп. 48-55 и 57-74, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимый на стадии (b), вводят до, во время и/или после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до, во время и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

76. Способ по любому из пп. 48-55 и 57-75, включающий введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, вводимого на стадии (b), после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

77. Способ по любому из пп. 48-55 и 57-76, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда:

наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

до того, как количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

до того, как T-клетки начнут проявлять признаки длительного триптофанового голодания, истощения, снижения эффекторной функции, экспрессии ингибиторных рецепторов и/или утраты пролиферативной способности;

до того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства станет детектируемым в крови индивидуума;

уровень интерферона-гамма (ИФНγ) повысится в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится более или более чем приблизительно в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз или 100 раз или более по сравнению с пиковым или максимальным количеством клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства; и/или

после того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства становится детектируемым в крови индивидуума, количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, составит менее 10%, менее 5%, менее 1% или менее 0,1% от всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) в крови индивидуума.

78. Способ по п. 77, где повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

79. Способ по любому из пп. 48-55 и 57-78, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней после начала T-клеточной терапии.

80. Способ по любому из пп. 48-55 и 57-79, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов или 48 часов после начала T-клеточной терапии.

81. Способ по любому из пп. 48-55 и 57-75, где:

модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят за от или приблизительно от 0 до 96 часов, от 0 до 72 часов, от 0 до 48 часов, от 0 до 24 часов, от 0 до 12 часов или 0 до 6 часов или 0 до 2 часов до начала T-клеточной терапии; или

модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят не более чем за 96 часов, 72 часа, 48 часов, 24 часа, 12 часов, 6 часов, 2 часа или 1 час до начала T-клеточной терапии.

82. Способ по любому из пп. 55-81, где модификация включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования и/или эктопическую экспрессию молекулы или ее функциональной и/или каталитически активной цепи, части или варианта.

83. Способ по любому из пп. 55-82, где молекула является mTOR или протеинкиназой C тета (PKC-Θ).

84. Способ по любому из пп. 55-82, где молекула является транспортером аминокислот или его цепью или его функциональной и/или каталитически активной частью или вариантом.

85. Способ по п. 84, где транспортер аминокислот является транспортером триптофана.

86. Способ по п. 84 или 85, где транспортер аминокислот или его цепь выбраны из одного или более из rBAT (SLC3A1), тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), транспортера аминокислот Asc-типа 1 (Asc-1; SLC7A10), натрий- и хлор-зависимого транспортера нейтральных и основных аминокислот B(0+)(ATB0,+; SLC6A14), натрий-зависимого транспортера нейтральных аминокислот B(0)AT1 (B(0)AT1; SLC6A19), транспортера монокарбоксилата 10 (TAT1; SLC16A10) и протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4) или их части.

87. Способ по любому из пп. 84-86, где транспортер аминокислот или его цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 36-44 или ее часть, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 36-44 или ее части.

88. Способ по любому из пп. 84-87, где транспортер аминокислот или его цепь выбраны из одного или более из тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) и протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4) или их части.

89. Способ по любому из пп. 84-87, где транспортер аминокислот или его цепь содержит тяжелую цепь CD98 (4F2hc; SLC3A2) и транспортер аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5) или их часть.

90. Способ по любому из пп. 84-88, где транспортер аминокислот или его цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO:37-39 и 44 или ее части, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 37-39 и 44 или ее части.

91. Способ по любому из пп. 82-90, где экспрессия молекулы в клетке находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

92. Способ по любому из пп. 55-91, где молекула выбрана из киназы GCN2, BLIMP-1, арил-углеводородного рецептора (AHR), ядерного транспортера AHR (ARNT), эукариотического фактора инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующего фактора транскрипции 4 (ATF4) или белка, гомологичного CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 и ИФНγ-R2.

93. Способ по п. 92, где молекула является GCN2 или CHOP.

94. Способ по пп. 55-81, 92 и 93, где модификация включает сниженную экспрессию молекулы.

95. Способ по п. 94, где сконструированная клетка содержит ингибиторную нуклеиновую кислоту или генетическое повреждение, снижающие экспрессию молекулы.

96. Способ по п. 94 или 95, где экспрессия молекулы в клетке снижена по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, или 95% по сравнению с экспрессией в клетке в отсутствие ингибиторной нуклеиновой кислоты или ген нарушение.

97. Способ по п. 95 или 96, включающий встраивание ингибиторной нуклеиновой кислоты в клетку и, таким образом, осуществление снижения экспрессии молекулы.

98. Способ по п. 96 или 97, включающий встраивание в клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей или приводящей к образованию ингибиторной нуклеиновой кислоты и, таким образом, осуществление снижения экспрессии молекулы.

99. Способ по любому из пп. 95-98, где сконструированная клетка содержит ингибиторную нуклеиновую кислоту, и ингибиторная нуклеиновая кислота содержит средство РНК-интерференции.

100. Способ по любому из пп. 95-99, где ингибиторная нуклеиновая кислота представляет собой, или содержит, или кодирует малую интерферирующую РНК (миРНК), микроРНК-адаптированную shRNA, короткую шпилечную РНК (shRNA), шпилечную миРНК, микроРНК (мкРНК-предшественник) или микроРНК (мкРНК).

101. Способ по любому из пп. 95-100, где экспрессия ингибиторной нуклеиновой кислоты находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

102. Способ по п. 95 или 96, где сконструированная клетка содержит генетическое повреждение, где:

повреждение включает повреждение гена, кодирующего молекулу на уровне ДНК и/или

повреждение не является обратимым; и/или

повреждение не является транзиторным.

103. способ по любому из пп. 95, 96 и 102, где повреждение включает встраивание в клетку ДНК-связывающего белка или ДНК-связывающей нуклеиновой кислоты, специфически связывающейся или гибридизующейся с геном, кодирующим молекулу.

104. Способ по любому из пп. 95, 96, 102 и 103, где повреждение включает встраивание: (a) слитого белка, содержащего направленно воздействующий на ДНК белок и нуклеазу, или (b) РНК-направляемой нуклеазы.

105. Способ по п.104, где направленно воздействующий на ДНК белок или РНК-направляемая нуклеаза содержит белок с цинковыми пальцами (ZFP), белок TAL или короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR), специфические для гена.

106. Способ по любому из пп. 95, 96 и 102-105, где повреждение включает встраивание в клетку средства, содержащего нуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN), TAL-эффекторную нуклеазу (TALEN) или комбинацию CRISPR-Cas9, специфически связывающуюся, распознающую или гибридизующуюся с геном, кодирующим молекулу.

107. Способ по п. 106, где средство является комбинацией CRISPR-Cas9, и комбинация CRISPR-Cas9 содержит гидовую РНК (gRNA), содержащую гидовую последовательность, комплементарную и/или способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в гене.

108. Способ по любому из пп. 95, 96 и 102-107, где генетическое повреждение является индуцибельным.

109. Способ по п. 108, где комплекс CRISPR-Cas9 является индуцибельным CRISPR-Cas9, и/или Cas9 находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

110. Способ по любому из пп. 95, 96 и 102-109, где повреждение включает делецию, по меньшей мере, части по меньшей мере одного экзона гена, кодирующего молекулу.

111. Способ по любому из пп. 95, 96 и 102-110, где:

повреждение включает делецию, мутацию и/или инсерцию в гене, приводящую к наличию преждевременного стоп-кодона в гене; и/или

повреждение включает делецию, мутацию и/или инсерцию в первом или втором экзоне гена, кодирующего молекулу.

112. Способ по любому из пп. 91, 101 или 109, где зависящий от условий промотор, или энхансер, или трансактиватор является индуцибельным промотором, энхансером или трансактиватором или репрессируемым промотором, энхансером или трансактиватором.

113. Способ по п. 112, где промотор выбран из промотора РНК-полимеразы I; промотора РНК-полимеразы II, необязательно, промотора CMV, раннего промотора SV40 или главного позднего промотора аденовируса; или промотора РНК-полимеразы III, необязательно, промотора U6 или H1.

114. Способ по п. 112 или 113, где промотор является индуцибельным промотором.

115. Способ по п. 114, где промотор содержит участок связывания NFκB или NFAT.

116. Способ по п. 114, где промотор содержит последовательность оператора Lac, последовательность тетрациклинового оператора, последовательность галактозного оператора или последовательность доксициклинового оператора или является ее аналогом.

117. Способ по п. 112 или 113, где промотор является репрессируемым промотором.

118. Способ по п. 117, где промотор способен связываться или распознаваться репрессором Lac, или тетрациклиновым репрессором, или его аналогом.

119. Способ по любому из пп. 1-118, где T-клетка содержит рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, являющийся функциональным не-T-клеточным рецептором.

120. Способ по любому из пп. 1-119, где T-клетка содержит рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, являющийся химерным антигенным рецептором (CAR).

121. Способ по п. 120, где CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, специфически связывающийся с антигеном, и внутриклеточную сигнальную область, содержащую ITAM.

122. Способ по п. 121, где внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный домен цепи CD3-дзета (CD3ζ).

123. Способ по п. 121 или 122, где CAR дополнительно содержит костимуляторную сигнальную область.

124. Способ по п.123, где костимуляторная сигнальная область содержит сигнальный домен CD28, 4-1BB или ICOS или его сигнальную часть.

125. Способ по п. 123 или 124, где костимуляторная сигнальная область является сигнальным доменом CD28.

126. Способ по любому из пп. 53-125, где рекомбинантный рецептор является трансгенным T-клеточным рецептором (TCR).

127. Способ по любому из пп. 53-125, где рекомбинантный рецептор является химерным антигенным рецептором (CAR).

128. Способ по любому из пп. 1-127, где T-клеточное терапевтическое средство распознает или направленно воздействует на антиген, ассоциированный со злокачественным новообразованием.

129. Способ по любому из пп. 53-128, где рекомбинантный рецептор связывается, распознает или направленно воздействует на антиген, ассоциированный со злокачественным новообразованием.

130. Способ по п. 129, где антиген выбран из ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA, поверхностного антигена вируса гепатита B, рецептора фолата альфа, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, фетального рецептора ацетилхолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, ИЛ-22R-альфа, ИЛ-13R-альфа 2, kdr, каппа-легкой цепи, антигена Льюиса Y, молекулы адгезии клеток L1, MAGE-A1, мезотелина, MUC1, MUC16, PSCA, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкоэмбрионального антигена, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбрионального антигена (CEA), простатспецифического антигена, PSMA, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфрина B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, белка опухоли Вильмса 1 (WT-1) и циклина A1 (CCNA1).

131. Способ по любому из пп. 48-130, где злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназе 1 (IDO1) до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства.

132. Способ по любому из пп. 48-131, где злокачественное новообразование включает опухоль, положительную по экспрессии транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), тяжелой цепи CD98 (4F2hc; CD98hc; SLC3A2) и/или протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4), или злокачественное новообразование содержит клетки в микроокружении опухоли, являющиеся положительными по экспрессии LAT1, LAT2, CD98hc и/или PAT4.

133. Способ по любому из пп. 1-132, где злокачественное новообразование является миеломой, лимфомой, лейкозом.

134. способ по любому из пп. 1-133, где злокачественное новообразование является неходжкинской лимфомой (NHL), острым лимфобластным лейкозом (ALL), хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL), диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой (DLBCL), или миеломой.

135. Способ по любому из пп. 1-133, где злокачественное новообразование не экспрессирует B-клеточный антиген или не является B-клеточным злокачественным новообразованием.

136. Способ по любому из пп. 1-133 и 135, где злокачественное новообразование не экспрессирует CD19, и/или T-клеточное терапевтическое средство не содержит рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся CD19, и/или T-клеточное терапевтическое средство является CAR-T-клеточным терапевтическим средством, несодержащим антигенсвязывающий домен против CD19.

137. Способ по любому из пп. 1-133, 135 и 136, где злокачественное новообразование является негематологическим злокачественным новообразованием или солидной опухолью.

138. Способ по любому из пп. 1-137, где способ приводит к повышению уровней триптофана и/или снижению уровней кинуренина в опухоли или биологическом образце индивидуума, необязательно, образце сыворотки, плазмы или опухоли, по сравнению со способом, включающим введение T-клеточного терапевтического средства в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

139. Способ по любому из пп. 1-138, где T-клеточная терапия демонстрирует повышенную или пролонгированную экспансию и/или персистирование в организме индивидуума по сравнению со способом, в котором T-клеточное терапевтическое средство вводят индивидууму в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, или способом, в котором вводят схожую T-клетку, но T-клетки не содержат модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию.

140. Способ по любому из пп. 1-139, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят перорально, подкожно или внутривенно.

141. Способ по п. 140, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят перорально.

142. Способ по любому из пп. 1-141, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в количестве от или приблизительно от 2,5 мг до приблизительно 5000 мг, от 2,5 мг до 2000 мг, от 2,5 мг до 1000 мг, от 2,5 мг до 500 мг, от 2,5 мг до 200 мг, от 2,5 мг до 100 мг, от 2,5 мг до 50 мг, от 2,5 мг до 25 мг, от 2,5 мг до 10 мг, от 25 мг до 5000 мг, от 25 мг до 2000 мг, от 25 мг до 1000 мг, от 25 мг до 500 мг, от 25 мг до 200 мг, от 25 мг до 100 мг, от 25 мг до 50 мг, от 50 мг до 5000 мг, от 50 мг до 2000 мг, от 50 мг до 1000 мг, от 50 мг до 500 мг, от 50 мг до 200 мг, от 50 мг до 100 мг, от 100 мг до 5000 мг, от 100 мг до 2000 мг, от 100 мг до 1000 мг, от 100 мг до 500 мг, от 100 мг до 200 мг, от 200 мг до 5000 мг, от 200 мг до 2000 мг, от 200 мг до 1000 мг, от 200 мг до 500 мг, от 500 мг до 5000 мг, от 500 мг до 2000 мг, от 500 мг до 1000 мг или от 1000 мг до 2000 мг, включительно.

143. Способ по любому из пп. 1-142, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят шесть раз в сутки, пять раз в сутки, четыре раза в сутки, три раза в сутки, два раза в сутки или раз в сутки.

144. Способ по любому из пп. 1-143, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в общей суточной дозе по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 5 мг/сутки, 10 мг/сутки, 25 мг/сутки, 50 мг/сутки, 100 мг/сутки, 200 мг/сутки, 400 мг/сутки, 500 мг/сутки, 600 мг/сутки, 800 мг/сутки, 1000 мг/сутки, 1200 мг/сутки, 1600 мг/сутки, 2000 мг/сутки, 5000 мг/сутки или 10000 мг/сутки.

145. Способ по любому из пп. 1-144, где введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина продолжают после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства до того, как:

наблюдают повышение уровней триптофана, снижение уровней кинуренина и/или снижение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем непосредственно перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина или по сравнению со временем непосредственно перед началом введения T-клеточного терапевтического средства;

количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума повысится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке непосредственно перед введением модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина или по сравнению с предшествующей временной точкой после введения T-клеточного терапевтического средства;

количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови, будет отличаться в пределах 2,0 раз (более или менее) от пикового или максимального количества клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства; и/или

количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, составит более или более чем приблизительно 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, или 60% от всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) в крови индивидуума.

146. Способ по любому из пп. 1-145, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят до того, как:

концентрация или количество сконструированных клеток в крови индивидуума составит (i) по меньшей мере или приблизительно 10 сконструированных клеток на микролитр, (ii), по меньшей мере 20%, 30%, 40% или 50% общего количества мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), (iii), по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1×10⁵ сконструированных клеток; или (iv) кровь индивидуума будет содержать по меньшей мере 5000 копий ДНК, кодирующей рекомбинантный рецептор, на микрограмм ДНК; и/или

в день 90 после начала введения на стадии (a) CAR-экспрессирующие клетки будут детектируемыми в крови или сыворотке индивидуума; и/или

в день 90 после начала введения на стадии (a) кровь индивидуума будет содержать по меньшей мере 20% CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере 10 CAR-экспрессирующих клеток на микролитр или по меньшей мере 1×10⁴ CAR-экспрессирующих клеток.

147. Способ по любому из пп. 1-146, где экспрессия или уровень CD25 на поверхности клеток из T-клеточного терапевтического средства снижается после указанного введения индивидууму по сравнению с экспрессией или уровнем в способе, в котором T-клеточное терапевтическое средство вводят индивидууму в отсутствие модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, или способе, в котором вводят схожее T-клеточное терапевтическое средство, T-клетки не содержат модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию.

148. Способ по п. 147, где экспрессия снижена по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно в 1,2 раза, 1,5 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или более.

149. Способ по любому из пп. 1-148, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в течение периода времени до 2 дней, до 7 дней, до 14 дней, до 21 дня, до одного месяца, до двух месяцев, до трех месяцев, до 6 месяцев или до 1 года после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

150. Способ по любому из пп. 1-149, где T-клеточное терапевтическое средство содержит T-клетки, являющиеся CD4+ или CD8+.

151. Способ по любому из пп. 1-150, где T-клеточное терапевтическое средство содержит клетки, являющиеся аутологичными для индивидуума.

152. Способ по любому из пп. 1-150, где T-клеточное терапевтическое средство содержит T-клетки, являющиеся аллогенными для индивидуума.

153. Способ по любому из пп. 1-152, где T-клеточное терапевтическое средство вводят в количестве, достаточном для положительной регуляции экспрессии IDO1 в микроокружении опухоли.

154. Способ по п. 153, где экспрессия IDO1 подвергается положительной регуляции в миелоидных клетках, стромальных клетках или опухолевых клетках или со стороны миелоидных клеток, стромальных клеток или опухолевых клеток.

155. Способ по п. 154, где IDO1 экспрессия подвергается положительной регуляции в стромальных клетках костного мозга или со стороны стромальных клеток костного мозга.

156. Способ по любому из пп. 1-155, где клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг до 3×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг до 2×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 0,5×10⁶ клеток/кг до 1×10⁶ клетка/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг до 3×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 1,0×10⁶ клеток/кг до 2×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 2,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, от или приблизительно от 2,0×10⁶ клеток/кг до 3×10⁶ клеток/кг или от или приблизительно от 3,0×10⁶ клеток/кг массы тела индивидуума до 5×10⁶ клеток/кг, включительно.

157. Способ по любому из пп. 1-156, где вводимая доза клеток меньше дозы в способе, в котором клеточное терапевтическое средство вводят без введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, или способе, в котором клетки не содержат модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию.

158. Способ по п. 157, где доза является по меньшей мере в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз или 10 раз более низкой.

159. Способ по любому из пп. 1-158, где T-клеточное терапевтическое средство вводят в виде единой фармацевтической композиции, содержащей клетки.

160. Способ по любому из пп. 1-159, где T-клеточное терапевтическое средство содержит дозу клеток, являющуюся фракционированной дозой, где клетки из дозы вводят во множестве композиций, в совокупности содержащих клетки из дозы, в течение периода времени не более трех дней.

161. Способ по любому из пп. 1-160, где способ дополнительно включает введение противолимфоцитарного химиотерапевтического средства перед введением T-клеточного терапевтического средства.

162. Способ по п. 161, где способ не включает введение индивидууму флударабина.

163. Способ по любому из пп. 1-160, невключающий введение противолимфоцитарного химиотерапевтического средства индивидууму перед введением T-клеточного терапевтического средства.

164. Способ по любому из пп. 55-163, где рекомбинантный рецептор сконструирован посредством встраивания первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, в клетку, и одной или более вторых последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих средство, способное модифицировать или вовлеченное в модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке, в клетку.

165. Способ по п. 164, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в одном или более полинуклеотидах.

166. Способ по п. 164, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в двух полинуклеотидах.

167. Способ по любому из пп. 164-166, где первая нуклеиновая кислота и вторые нуклеиновые кислоты содержатся в одном или более векторах, необязательно, являющихся вирусными векторами.

168. Способ выбора индивидуума, имеющего заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, для введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, включающий:

(a) анализ уровня триптофана или метаболита триптофана, уровня экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO или уровня интерферона-гамма (ИФНγ) в одном или более биологических образцах индивидуума, где биологический образец получают из индивидуума, являющегося кандидатом для лечения с использованием T-клеточной терапии; и

(b) выбор индивидуума, у которого:

(i) уровень триптофана в образце ниже порогового уровня;

(ii) уровень метаболита триптофана выше порогового уровня;

(iii) уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO выше порогового уровня; или

(iv) уровень ИФНγ выше порогового уровня.

169. Способ по п. 168, где один или более биологических образцов получают перед введением T-клеточного терапевтического средства.

170. Способ по п. 168 или 169, дополнительно включающий введение индивидууму T-клеточного терапевтического средства.

171. Способ по любому из пп. 168-170, дополнительно включающий введение модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбранному индивидууму.

172. Способ по п. 171, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят выбранному индивидууму до или одновременно с началом введения T-клеточного терапевтического средства и/или до или одновременно с введением T-клеточного терапевтического средства.

173. Способ по п. 171, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

174. Способ выбора индивидуума, имеющего заболевание или состояние, необязательно, являющееся злокачественным новообразованием, для введения модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, включающий:

(a) анализ уровня триптофана или метаболита триптофана, уровня экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO или уровня интерферона-гамма (ИФНγ) в одном или более биологических образцах индивидуума, где биологический образец получают из индивидуума, которому вводили T-клеточное терапевтическое средство; и

(b) выбор индивидуум, у которого:

(i) уровень триптофана в образце ниже порогового уровня или снижен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или до введения T-клеточного терапевтического средства, или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

(ii) уровень метаболита триптофана выше порогового уровня или повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или до введения T-клеточного терапевтического средства, или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

(iii) уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO выше порогового уровня или повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или до введения T-клеточного терапевтического средства, или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства; или

(iv) уровень ИФНγ выше порогового уровня или повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или до введения T-клеточного терапевтического средства, или в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

175. Способ по п. 174, где один или более биологических образцов получают после введения T-клеточного терапевтического средства.

176. Способ по п. 174 или 175, дополнительно включающий введение клеточного терапевтического средства индивидууму перед анализом.

177. Способ по любому из пп. 174-176, дополнительно включающий введение модулятора пути кинуренина индивидууму.

178. Способ по любому из пп. 173-177, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда:

наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

до того, как количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства;

до того, как T-клетки начнут проявлять признаки длительного триптофанового голодания, истощения, снижения эффекторной функции, экспрессии ингибиторных рецепторов и/или утраты пролиферативной способности;

до того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства станет детектируемым в крови индивидуума; и/или

уровень интерферона-гамма (ИФНγ) повысится в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или после введения T-клеточного терапевтического средства.

179. Способ по п. 178, где повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

180. Способ по любому из пп. 173-179, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней после начала T-клеточной терапии.

181. Способ по любому из пп. 173-180, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов или 48 часов после начала T-клеточной терапии.

182. Способ по любому из пп. 168-171, где заболевание или состояние является злокачественным новообразованием.

183. Способ по п. 168-172, где индивидуума выбирают, если уровень экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO повышен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства.

184. Способ по п. 168-183, где индивидуума выбирают, если уровень триптофана в образце ниже порогового уровня или снижен по сравнению с уровнем, оцениваемым до начала введения T-клеточного терапевтического средства и/или до введения T-клеточного терапевтического средства.

185. Способ по любому из пп. 168-184, где пороговый уровень составляет в пределах 25%, в пределах 20%, в пределах 15%, в пределах 10% или в пределах 5% от среднего уровня, концентрации или количества, и/или находится в пределах стандартного отклонения среднего уровня, концентрации или количества в биологических образцах множества контрольных индивидуумов.

186. Способ по п. 185, где контрольные индивидуумы являются здоровыми или нормальными индивидуумами, индивидуумами, неимеющими злокачественное новообразование, и/или индивидуумами до введения T-клеточного терапевтического средства.

187. Способ по любому из пп. 168-184, где повышение или снижение является более или более чем приблизительно 1,2-кратным, 1,5-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 10-кратным или большим.

188. Способ по любому из пп. 168-187, где перед оценкой индивидуум не ответил или не ответил полностью на лечение, перенес рецидив после ремиссии после лечения или стал рефрактерным к предшествующему введению модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, необязательно, где такое предшествующее введение осуществляли в комбинации с иммуномодулирующим средством, необязательно, ингибитором контрольных точек.

189. Способ по любому из пп. 168-184, где биологический образец представляет собой образец сыворотки, плазмы или опухоли или его получают из него.

190. Способ по любому из пп. 168-170, где метаболит триптофана выбран из кинуренина, 3-гидроксикинуренина и 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA).

191. Способ по любому из пп. 168-190, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является низкомолекулярным соединением, пептидом, белком, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты.

192. Способ по любому из пп. 168-191, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является антагонистом фермента кинурениназы.

193. Способ по любому из пп. 168-192, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), ингибитором IDO2 и ингибитором триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO).

194. Способ по любому из пп. 168-191 и 193, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO/TDO двойного действия.

195. Способ по любому из пп. 168-191 и 193, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1).

196. Способ по любому из пп. 168-191 и 193-195, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из 1-метил-D-триптофана (1-MT) (индоксимода), 14-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-14-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (INCB024360, эпакадостата), 14-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-14-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 14-({2-[(аминосульфонил)амино]этил} амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 14-({2-[(аминосульфонил)амино]этил} амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 14-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-14-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 14-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 14-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанола (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или их комбинации.

197. Способ по п. 196, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 14-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-14-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (INCB024360, эпакадостатом).

198. Способ по п. 196, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 1-метил-D-триптофаном (1-MT) (индоксимодом).

199. Способ по любому из пп. 168-191, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

200. Способ по любому из пп. 168-199, где T-клетка содержит рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, являющийся функциональным не-T-клеточным рецептором.

201. Способ по любому из пп. 168-200, где T-клетка содержит рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, являющийся химерным антигенным рецептором (CAR).

202. Способ по п. 201, где CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, специфически связывающийся с антигеном, и внутриклеточную сигнальную область, содержащую ITAM.

203. Способ по п. 202, где внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный домен цепи CD3-дзета (CD3ζ).

204. Способ по п. 202 или 203, где CAR дополнительно содержит костимуляторную сигнальную область.

205. Способ по п. 204, где костимуляторная сигнальная область содержит сигнальный домен CD28, 4-1BB или ICOS или его сигнальную часть.

206. Способ по п. 204 или 205, где костимуляторная сигнальная область является сигнальным доменом CD28.

207. Способ по любому из пп. 53-206, где рекомбинантный рецептор является трансгенным T-клеточным рецептором (TCR).

208. Способ по любому из пп. 53-206, где рекомбинантный рецептор является химерным антигенным рецептором (CAR).

209. Способ по любому из пп. 1-208, где T-клеточное терапевтическое средство распознает или направленно воздействует на антиген, ассоциированный со злокачественным новообразованием.

210. Способ по любому из пп. 53-209, где рекомбинантный рецептор связывается, распознает или направленно воздействует на антиген, ассоциированный со злокачественным новообразованием.

211. Способ по п. 210, где антиген выбран из ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA, поверхностного антигена вируса гепатита B, рецептора фолата альфа, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, фетального рецептора ацетилхолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, ИЛ-22R-альфа, ИЛ-13R-альфа 2, kdr, каппа-легкой цепи, антигена Льюиса Y, молекулы адгезии клеток L1, MAGE-A1, мезотелина, MUC1, MUC16, PSCA, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкоэмбрионального антигена, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбрионального антигена (CEA), простатспецифического антигена, PSMA, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфрина B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, белка опухоли Вильмса 1 (WT-1) и циклина A1 (CCNA1).

212. Сконструированная клетка, содержащая:

(a) рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом; и

(b) модификацию экспрессии молекулы, ассоциированный с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке.

213. Сконструированная клетка по п. 212, где модификация включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования и/или эктопическую экспрессию в клетке молекулы или ее функциональной и/или каталитически активной части или варианта.

214. Сконструированная клетка по п. 212 или 213, где молекула является mTOR или протеинкиназой C тета (PKC-Θ).

215. Сконструированная клетка по п. 212 или 213, где молекула является транспортером аминокислот или его цепью или его функциональной и/или каталитически активной частью или вариантом.

216. Сконструированная клетка, содержащая:

(a) рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом; и

(b) рекомбинантный, сконструированный и/или эктопически экспрессируемый транспортер аминокислот или его цепь или его функциональную и/или каталитически активную часть или вариант.

217. Сконструированная клетка по п. 215 или 216, где транспортер аминокислот является транспортером триптофана.

218. Сконструированная клетка по любому из пп. 215-217, где транспортер аминокислот или его цепь выбраны из одного или более из rBAT (SLC3A1), тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), транспортера аминокислот Asc-типа 1 (Asc-1; SLC7A10), натрий- и хлор-зависимого транспортера нейтральных и основных аминокислот B(0+)(ATB0,+; SLC6A14), натрий-зависимого транспортера нейтральных аминокислот B(0)AT1 (B(0)AT1; SLC6A19), транспортера монокарбоксилата 10 (TAT1; SLC16A10) и протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4) или их части.

219. Сконструированная клетка по любому из пп. 215-218, где транспортер аминокислот или его цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 36-115, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 36-115.

220. Сконструированная клетка по любому из пп. 215-219, где транспортер аминокислот или его цепь выбраны из одного или более из тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) и протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4) или их части.

221. Сконструированная клетка по любому из пп. 215-219, где транспортер аминокислот или его цепь содержит тяжелую цепь CD98 (4F2hc; SLC3A2) и транспортер аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5) или их часть.

222. Сконструированная клетка по любому из пп. 215-220, где транспортер аминокислот или его цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO:37-39 и 115, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 37-39 и 115.

223. Сконструированная клетка по любому из пп. 212-222, где экспрессия молекулы или транспортера аминокислот в клетке находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

224. Сконструированная клетка по п. 212, где молекула выбрана из киназы GCN2, BLIMP-1, арил-углеводородного рецептора (AHR), ядерного транспортера AHR (ARNT), эукариотического фактора инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующего фактора транскрипции 4 (ATF4) или белка, гомологичного CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 и ИФНγ-R2.

225. Сконструированная клетка по п. 224, где молекула является GCN2 или CHOP.

226. Сконструированная клетка по п. 224 или 225, где модификация включает сниженную экспрессию молекулы в клетке.

227. Сконструированная клетка по любому из пп. 224-226, где сконструированная клетка содержит ингибиторную нуклеиновую кислоту или генетическое повреждение, снижающие экспрессию молекулы.

228. Сконструированная клетка по п. 226 или 227, где экспрессия молекулы в клетке снижена по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с экспрессией в клетке в отсутствие ингибиторной нуклеиновой кислоты или нарушения гена.

229. Сконструированная клетка по любому из пп. 226-228, где клетка содержит ингибиторную нуклеиновую кислоту, что, таким образом, снижает экспрессию молекулы.

230. Сконструированная клетка по п. 229, где ингибиторная нуклеиновая кислота содержит средство РНК-интерференции.

231. Сконструированная клетка по п. 229 или 230, где ингибиторная нуклеиновая кислота представляет или содержит или кодирует малую интерферирующую РНК (миРНК), микроРНК-адаптированную shRNA, короткую шпилечную РНК (shRNA), шпилечную миРНК, микроРНК (мкРНК-предшественник) или микроРНК (мкРНК).

232. Сконструированная клетка по любому из пп. 229-231, где экспрессия ингибиторной нуклеиновой кислоты находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

233. Сконструированная клетка по п. 227 или 228, где сконструированная клетка содержит поврежденный ген, кодирующий молекулу, средство для повреждения гена, кодирующего молекулу, и/или повреждение гена, кодирующего молекулу.

234. Сконструированная клетка по п. 233, где:

повреждение включает повреждение гена, кодирующего молекулу, на уровне ДНК и/или

повреждение не является обратимым; и/или

повреждение не является транзиторным.

235. Сконструированная клетка по п. 233 или 234, где повреждение опосредовано ДНК-связывающим белком или ДНК-связывающей нуклеиновой кислотой, специфически связывающейся или гибридизующейся с геном, кодирующим молекулу.

236. Сконструированная клетка по любому из пп. 233-235, где повреждение опосредовано (a) слитым белком, содержащим направленно воздействующий на ДНК белок и нуклеазу, или (b) РНК-направляемой нуклеазой.

237. Сконструированная клетка по любому из пп. 233-236, где повреждение опосредовано редактирующей геном нуклеазой, нуклеазой с цинковыми пальцами (ZFN), TAL-эффекторной нуклеазой (TALEN) или короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR)/Cas9.

238. Сконструированная клетка по п. 237, где повреждение опосредовано CRISPR/Cas9, и CRISPR/Cas9 содержит гидовую РНК (gRNA), содержащую гидовую последовательность, комплементарную и/или способную гибридизоваться с последовательностью-мишенью в гене.

239. Сконструированная клетка по любому из пп. 233-238, где генетическое повреждение зависит от условий или является индуцибельным.

240. Сконструированная клетка по п. 239, где комплекс CRISPR-Cas9 является индуцибельным CRISPR-Cas9, и/или Cas9 находится под контролем зависящего от условий промотора, или энхансера, или трансактиватора.

241. Сконструированная клетка по любому из пп. 233-240, где повреждение включает делецию, по меньшей мере, части по меньшей мере одного экзона гена, кодирующего молекулу.

242. Сконструированная клетка по любому из пп. 233-241, где:

повреждение включает делецию, мутацию и/или инсерцию в гене, приводящую к наличию преждевременного стоп-кодона в гене; и/или

повреждение включает делецию, мутацию и/или инсерцию в первом или втором экзоне гена, кодирующего молекулу.

243. Сконструированная клетка по любому из пп. 196, 232, 239 и 240, где зависящий от условий промотор или энхансер или трансактиватор является индуцибельным промотором, энхансером или трансактиватором или репрессируемым промотором, энхансером или трансактиватором.

244. Сконструированная клетка по п. 243, где промотор выбран из промотора РНК-полимеразы I, РНК-полимеразы II или РНК-полимеразы III.

245. Сконструированная клетка по п. 244, где промотор выбран из:

промотора РНК-полимеразы III, являющегося промотором U6 или H1; или

промотора РНК-полимеразы II, являющегося промотором CMV, ранним промотором SV40 или главным поздним промотором аденовируса.

246. Сконструированная клетка по любому из пп. 243-245, где промотор является индуцибельным промотором.

247. Сконструированная клетка по п. 246, где промотор содержит участок связывания NFκB или NFAT.

248. Сконструированная клетка по п. 246, где промотор содержит последовательность оператора Lac, последовательность тетрациклинового оператора, последовательность галактозного оператора или последовательность доксициклинового оператора или является ее аналогом.

249. Сконструированная клетка по любому из пп. 243-245, где промотор является репрессируемым промотором.

250. Сконструированная клетка по п. 249, где промотор способен связываться или распознаваться репрессором Lac, или тетрациклиновым репрессором, или его аналогом.

251. Сконструированная клетка по любому из пп. 212-250, где клетка является T-клеткой.

252. Сконструированная клетка по п. 251, где T-клетка является CD8+ T-клеткой.

253. Сконструированная клетка по п. 251, где T-клетка является CD4+ T-клеткой.

254. Сконструированная клетка по любому из пп. 212-250, где клетка является естественным киллером (NK).

255. Сконструированная клетка по любому из пп. 212-250, где клетка является полученной из iPS клеткой.

256. Сконструированная клетка по любому из пп. 212-255, где рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, является функциональным не-T-клеточным рецептором.

257. Сконструированная клетка по любому из пп. 212-256, где рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, является химерным антигенным рецептором (CAR).

258. Сконструированная клетка по п. 257, где CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, специфически связывающийся с антигеном, и внутриклеточную сигнальную область, содержащую ITAM.

259. Сконструированная клетка по п. 258, где внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный домен цепи CD3-дзета (CD3ζ).

260. Сконструированная клетка по п. 258 или 259, где CAR дополнительно содержит костимуляторную сигнальную область.

261. Сконструированная клетка по п. 260, где костимуляторная сигнальная область содержит сигнальный домен CD28, 4-1BB или ICOS или его сигнальную часть.

262. Сконструированная клетка по п. 260 или 261, где костимуляторная сигнальная область является сигнальным доменом CD28.

263. Сконструированная клетка по любому из пп. 212-262, где рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, является функциональным не-T-клеточным рецептором

264. Сконструированная клетка по любому из пп. 212-262, где рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом, является трансгенным T-клеточным рецептором (TCR).

265. Сконструированная клетка по любому из пп. 212-264, где клетка сконструирована посредством встраивания в клетку первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, и одной или более вторых последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих средство, способное модифицировать или вовлеченное в модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке.

266. Сконструированная клетка по п. 265, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в одном или более полинуклеотидах.

267. Сконструированная клетка по п. 265, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в двух полинуклеотидах.

268. Сконструированная клетка по любому из пп. 265-267, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в одном или более векторах, необязательно, являющихся вирусными векторами.

269. Композиция, содержащая сконструированную клетку по любому из пп. 212-268.

270. Композиция по п. 269, где клетки являются CD4+ или CD8+ клетками.

271. Композиция по п. 270, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый носитель.

272. Комбинация, содержащая:

генетически сконструированные клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, связывающийся с лигандом, где рекомбинантный рецептор, необязательно, является T-клеточным рецептором (TCR) или химерным антигенным рецептором (CAR); и

модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

273. Комбинация, содержащая:

сконструированные клетки по любому из пп. 212-268 или композицию по любому из пп. 199-201; и

модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

274. Комбинация по п. 272 или 273, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает образование, концентрацию, доступность, метаболизм и/или эффект фермента и/или метаболита пути кинуренина.

275. Комбинация по любому из пп. 272-274, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает катаболизм триптофана или предотвращает или снижает синтез или накопление метаболита триптофана.

276. Комбинация по п. 275, где метаболит триптофана выбран из кинуренина, 3-гидроксикинуренина и 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA).

277. Комбинация по любому из пп. 272-276, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является низкомолекулярным соединением, пептидом, белком, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты.

278. Комбинация по любому из пп. 272-277, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является антагонистом фермента кинурениназы.

279. Комбинация по любому из пп. 272-277, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), ингибитором IDO2 и ингибитором триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO).

280. Комбинация по любому из пп. 272-277 и 279, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO/TDO двойного действия.

281. Комбинация по любому из пп. 272-277, 279 и 280, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1).

282. Комбинация по любому из пп. 272-277 и 279-281, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из 1-метил-D-триптофана (1-MT) (индоксимода), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (INCB024360, эпакадостата), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил} амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанола (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или их комбинации.

283. Комбинация по п. 282, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (INCB024360, эпакадостатом).

284. Комбинация по п. 282, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 1-метил-D-триптофаном (1-MT) (индоксимодом).

285. Комбинация по п. 272-277, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

286. Комбинация по любому из пп. 272-285, упакованная в виде промышленного изделия, такого как набор.

287. Комбинация по п. 286, где промышленное изделие и/или набор дополнительно содержит инструкции или печатные материалы о введении сконструированных клеток и/или модулятора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

288. Способ конструирования иммунных клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, включающий:

приведение популяции клеток, содержащей иммунные клетки, в контакт с модулятором метаболизма триптофана и/или пути кинуренина; и

встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, в популяцию клеток в условиях, в которых экспрессируется рекомбинантный рецептор.

289. Способ по п. 288, где рекомбинантный рецептор связывается с лигандом, необязательно, антигеном.

290. Способ по п. 288 или 289, где рекомбинантный рецептор является T-клеточным рецептором (TCR) или химерным антигенным рецептором (CAR).

291. Способ по любому из пп. 288-290, где популяция клеток представляет собой или содержит мононуклеарные клетки периферической крови.

292. Способ по любому из пп. 288-290, где популяция клеток представляет собой или содержит T-клетки.

293. Способ по п. 292, где T-клетки являются CD4+ и/или CD8+.

294. Способ по любому из пп. 288-293, где популяцию клеток выделяют из индивидуума, необязательно, человека.

295. Способ по любому из пп. 288-294, где приведение в контакт осуществляют до и/или во время встраивания.

296. Способ по любому из пп. 288-295, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает образование, концентрацию, доступность, метаболизм и/или эффект фермента и/или метаболита пути кинуренина.

297. Способ по любому из пп. 288-296, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает катаболизм триптофана или предотвращает или снижает синтез или накопление метаболита триптофана.

298. Способ по п. 297, где метаболит триптофана выбран из кинуренина, 3-гидроксикинуренина и 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA).

299. Способ по любому из пп. 288-298, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является низкомолекулярным соединением, пептидом, белком, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, миметиком антитела, аптамером или молекулой нуклеиновой кислоты.

300. Способ по любому из пп. 288-299, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является антагонистом фермента кинурениназы.

301. Способ по любому из пп. 288-299, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), ингибитором IDO2 и ингибитором триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO).

302. Способ по любому из пп. 288-299 и 301, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором IDO/TDO двойного действия.

303. Способ по любому из пп. 288-299, 301 и 302, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является ингибитором индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1).

304. Способ по любому из пп. 288-299 и 301-303, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из 1-метил-D-триптофана (1-MT) (индоксимода), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (INCB024360, эпакадостата), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил} амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанола (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003 или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или их комбинации.

305. Способ по п. 304, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (INCB024360, эпакадостатом).

306. Способ по п. 304, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 1-метил-D-триптофаном (1-MT) (индоксимодом).

307. Способ по любому из пп. 288-299, где модулятор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является триптофаном.

308. Способ конструирования иммунных клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, включающий:

встраивание первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, в популяцию клеток в условиях, в которых экспрессируется рекомбинантный рецептор; и

встраивание одной или более вторых последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих средство, способное модифицировать или вовлеченное в модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке, в популяцию клеток в условиях, в которых экспрессируется средство.

309. Способ конструирования иммунных клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, включающий:

встраивание первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, в популяцию клеток в условиях, в которых экспрессируется рекомбинантный рецептор; и

встраивание одной или более вторых последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих рекомбинантный, сконструированный и/или эктопически экспрессируемый транспортер аминокислот или его цепь или его функциональную и/или каталитически активную часть или вариант.

310. Способ по п. 308, где модификация включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования и/или эктопическую экспрессию молекулы или ее функциональной и/или каталитически активной цепи, части или варианта.

311. Способ по п. 308, где модификация включает сниженную экспрессию молекулы.

312. Способ по п. 311, где способ включает ингибиторную нуклеиновую кислоту или генетическое повреждение, снижающие экспрессию молекулы.

313. Способ по любому из пп. 308-312, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в одном или более полинуклеотидах.

314. Способ по любому из пп. 308-312, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в двух полинуклеотидах.

315. Способ по любому из пп. 308-314, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторые последовательности нуклеиновой кислоты содержатся в одном или более векторах, необязательно, являющихся вирусными векторами.

VIII. ПРИМЕРЫ

[842] Следующие примеры включены исключительно в иллюстративных целях, и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Пример 1: Оценка экспрессии индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы (IDO1) после инкубации опухолевых клеток в присутствие интерферона-гамма (ИФНγ) или T-клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR)

[843] Экспрессию индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1) в различных опухолевых клетках оценивают после инкубации с интерфероном-гамма (ИФНγ) или T-клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR), специфический для антигена, экспрессируемого опухолевыми клетками.

A. Стимуляция интерфероном-гамма (ИФНγ)

[844] Альвеолярные базальные эпителиальные клетки аденокарциномы человека A549, трансдуцированные с использованием CD19 человека (клетки CD19.A549, которые также можно обозначать как клетки A549.CD19), анализировали на экспрессию индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1) после стимуляции интерфероном-гамма (ИФНγ). Клетки CD19.A549 стимулировали ИФНγ в течение 24 или 48 часов и анализировали уровни IDO1 посредством проточной цитометрии с использованием антитела против IDO. Как показано на фиг. 1A, после стимуляции ИФНγ в течение 24 и 48 часов в клетках наблюдали повышенную экспрессию эндогенной IDO1 по сравнению с нестимулированными клетками. Повышенную экспрессию IDO1 не наблюдали в других CD19⁺ линиях опухолевых клеток в этом анализе, включая клетки JeKo-1, Дауди, Raji и Nalm-6, после инкубации ИФНγ в схожих условиях.

[845] Кроме того, экспрессию IDO1 анализировали в различных линиях клеток, экспрессирующих антиген подобный рецепторной тирозинкиназе орфанный рецептор 1 (ROR1) после инкубации клеток с интерфероном-гамма (ИФНγ). Линию клеток рака молочной железы человека HCC1806 (ATCC® CRL-2335™); линию клеток мелкоклеточного рака легких человека H2286 (ATCC® CRL-5938™); линию клеток немелкоклеточного рака легких человека H1975 (ATCC® CRL-5908™); линию клеток метастаза немелкоклеточного рака легких человека в лимфоузлах H1299 (ATCC® CRL-5803™); линию клеток рака молочной железы человека BT-549 (ATCC® HTB-122™) и клетки CD19.A549, описанные выше, экспрессирующие эндогенный ROR1, инкубировали в присутствие 20 нг/мл рекомбинантного ИФНγ человека в течение ночи. Экспрессию IDO1 анализировали с использованием проточной цитометрии, как описано выше. Результаты представлены на фиг. 1B.

[846] Уровни экспрессии IDO1 в различных CD19-экспрессирующих линиях опухолевых клеток (Дауди, K562.CD19 или A549.CD19), ROR1-экспрессирующих линиях опухолевых клеток (A549.CD19 или BT-549) и линии стромальных клеток костного мозга человека HS-5 анализировали после инкубации в течение ночи с 20 нг/мл рекомбинантного ИФНγ человека. Результаты представлены на фиг. 1C.

B. Сокультивирование с T-клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR)

[847] Для оценки того, модулирует ли инкубация в присутствие T-клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), экспрессию IDO1, клетки, экспрессирующие CAR против CD19, сокультивировали с клетками CD19.A549. CAR включал scFv против CD19, полученный из Ig спейсер, полученный из CD28 человека трансмембранный домен, полученный из 4-1BB человека внутриклеточный домен и полученный из CD3 дзета человека сигнальный домен. Лентивирусный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, использовали для трансдукции первичных T-клеток человека, выделенных из крови здоровых доноров посредством афереза.

[848] Генетически сконструированные T-клетки, экспрессирующие CAR против CD19, сокультивировали с клетками CD19.A549 при соотношении эффектор:мишень (E:T) 1:1 в течение 24 часов или 48 часов и анализировали экспрессию IDO1 с помощью внутриклеточного окрашивания посредством проточной цитометрии. Культивирование осуществляли в присутствие или отсутствие блокирующего антитела против ИФН-гамма (в концентрации 10 мкг/мл). Как показано на фиг. 1D и 1E, повышенные уровни экспрессии IDO1 наблюдали в клетках CD19.A549, культивируемых в присутствие CAR-экспрессирующих клеток, по сравнению с уровнями в клетках CD19.A549, культивируемых в отдельности. Результаты соответствовали способности CAR-экспрессирующих T-клеток индуцировать экспрессию IDO1 в подвергнутых направленному воздействию CAR, антиген-положительных клетках. Наблюдали, что добавление блокирующего антитела против ИФН-гамма снижало повышенные уровни экспрессии IDO1 (фиг. 1D и 1E). Повышенные уровни экспрессии IDO1 в этих клетках также наблюдали через 96 часов после начала сокультивирования с T-клетками, экспрессирующими CAR против CD19.

[849] В другом исследовании IDO⁺ клетки-мишени A549.CD19 сокультивировали в течение 24 часов с T-клетками, экспрессирующими CAR против CD19, (или нетрансдуцированными контрольными T-клетками) при соотношении эффектор:мишень (E:T) 1:1 в присутствие увеличивающихся концентраций (от 0,75 до 2,0 мкг/мл) антитела против рецептора интерферона-гамма (ИФНγR) или изотипического контроля. Экспрессию IDO1 на клетках-мишенях измеряли посредством проточной цитометрии. Как показано на фиг. 1F (mfi=средняя интенсивность флуоресценции), наблюдали дозозависимое снижение повышенных уровней экспрессии IDO в присутствие CAR-T-клеток (по сравнению с нетрансдуцированными контрольными клетками) в присутствие увеличивающихся концентрации блокирующего антитела против ИФНγR.

[850] В другом исследовании клетки CD19.A549, которые также экспрессируют эндогенный ROR1, или родительские A549 клетки (CD19-) культивировали в течение 24 часов в отдельности (необработанные) или с первичными T-клетками человека, сконструированными для экспрессии CAR против CD19 или CAR против ROR1 (включающего scFv против ROR1, полученный из Ig спейсер, полученный из 4-1BB человека внутриклеточный домен и полученный из CD3 дзета человека сигнальный домен). Супернатанты клеток собирали для анализа интерферона гамма (ИФНγ) и анализировали клетки-мишени на экспрессию IDO1 посредством проточной цитометрии.

[851] Типичные гистограммы представлены на фиг. 1G и 1H. Как показано на фиг. 1G, наблюдали повышение экспрессии IDO1 после культивирования с T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19 или CAR против ROR1, в клетках CD19.A549, но не наблюдали в родительских (CD19^-) клетках A549 после культивирования с T-клетками, экспрессирующими CAR против CD19. Аналогично, как показано на фиг. 1H, повышенные концентрации ИФНγ наблюдали в супернатантах после сокультивирования T-клеток с CAR против CD19 с клетками CD19.A549 (экспрессирующими антиген CD19, являющийся мишенью для CAR) по сравнению с родительскими контрольными A549.

C. Продукция ИФНγ и экспрессия IDO1

[852] Клетки-мишени, сконструированные для экспрессии различных уровней антигена CD19, сокультивировали с T-клетками, экспрессирующими CAR против CD19, и анализировали продукцию ИФНγ CAR-T-клетками и индукцию IDO1 антиген-экспрессирующими клетками.

[853] T-клетки, экспрессирующие CAR против CD19, сокультивировали с клетками-мишенями A549, экспрессирующими эндогенный CD19 под контролем одного из двух разных промоторов, регулирующими разные уровни экспрессии CD19 (см. фиг. 1I). Экспрессию IDO1 и продукцию ИФНγ определяли, как описано выше. Результаты представлены на фиг. 1J-1K.

[854] Клетки CD19.A549 культивировали с различными концентрациями рекомбинантного ИФНγ человека. Как показано на фиг. 1L, наблюдали дозозависимое повышение экспрессии IDO1, определяемое по средней интенсивности флуоресценции (MFI) посредством проточной цитометрии, с повышением концентраций ИФНγ.

Пример 2: Уровни триптофана и метаболита триптофана после сокультивирования опухолевых клеток с T-клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR)

[855] IDO1 вовлечен в окисление триптофана в кинуренин. Уровни метаболита триптофана анализировали после сокультивирования антиген-экспрессирующих клеток с антиген-специфическими CAR-T-клетками в присутствие или отсутствие ингибитора IDO1 эпакадостата.

A. Уровни триптофана и кинуренина в присутствие ингибитора IDO1

[856] T-клетки, экспрессирующие CAR против CD19, полученные, по существу, как описано в примере 1, сокультивировали с клетками CD19.A549 в течение 96 часов при соотношении эффектор-мишень (E:T) 0,3:1, 1:1 или 3:1 в присутствие 0, 0,1, 10 или 1000 нМ эпакадостата. Количества триптофана (и кинуренина в случае образцов с соотношением E:T 3:1) в супернатантах совместных культур измеряли посредством ELISA и сравнивали с уровнями, определяемыми в свежей среде для культивирования.

[857] Как показано на фиг. 2A, количества триптофана, измеряемые в супернатанте совместных культур при всех соотношениях E:T, были более низкими, чем количества, определяемые в среде в отдельности. Этот результат соответствовал способности CAR-экспрессирующих T-клеток стимулировать повышенную экспрессию и/или функцию IDO1 в экспрессирующих мишень CAR клетках CD19.A549. Наблюдали, что сокультивирование в присутствие эпакадостата (например, 1000 нМ) восстанавливало уровни триптофана. На фиг. 2B также показано, что количества кинуренина, определяемые в супернатантах совместных культур CAR-экспрессирующих T-клеток и антиген-экспрессирующих клеток CD19.A549, были более высокими, чем количества, определяемые в культуре в среде в отдельности. Этот результат также соответствовал способности CAR-экспрессирующих T-клеток индуцировать или повышать IDO1 в мишень-экспрессирующих клетках CD19.A549. Наблюдали, что эпакадостат в количестве 1000 нМ снижал уровни кинуренина в супернатантах совместных культур. Эти результаты соответствовали данным о том, что CAR-экспрессирующие T-клетки могут индуцировать экспрессию функционального IDO1, и что функциональные исходы этого повышения (например, модуляцию пути кинуренина) можно модулировать с помощью ингибитора фермент.

[858] В другом исследовании T-клетки с CAR против CD19 и IDO⁺ клетки-мишени A549.CD19 сокультивировали в присутствие увеличивающихся концентраций эпакадостата в течение 96 часов. Результаты представлены на фиг. 2C.

B. Уровни триптофана и кинуренина в совместной культуре с IDO1⁺ или IDO1^- клетками-мишенями

[859] Уровни триптофана и кинуренина в супернатанте культуры измеряли после сокультивирования T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, полученных, по существу, как описано в примере 1, с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями, являвшимися клетками CD19.A549 (IDO1⁺ клетками-мишенями, способными индуцировать экспрессию IDO1) или клетками CD19.Дауди (IDO1^- клетками-мишенями, в которых не наблюдали экспрессию IDO или индукцию экспрессии IDO1 в ответ на стимулы) при соотношении эффектор:мишень (E:T) 1:1. Количества триптофана и кинуренина в супернатантах измеряли посредством ELISA.

[860] Как показано на фиг. 2D, определяемые уровни триптофана были более высокими в совместных культурах, содержащих клетки Дауди, по сравнению с совместными культурами, содержащими клетки A549. И наоборот, наблюдали, что количество кинуренина было более высоким в совместной культуре, содержащей клетки A549, по сравнению с совместной культурой, содержащей клетки Дауди. Этот результат соответствовал выводу о том, что CAR-экспрессирующие T-клетки могут, например, после активации в ответ на контакт с антигеном для CAR, стимулировать повышенную экспрессию IDO1 на конкретных клетках, таких как конкретные линии опухолевых клеток или другие клетки, такие как клетки-мишени A549. Повышенная экспрессия IDO1 в некоторых случаях может приводить к метаболизации триптофана, например, в кинуренин, что может приводить к истощению триптофана и/или накоплению кинуренина или других метаболитов триптофана в окружении, таком как микроокружение опухоли (TME).

C. Уровни триптофана и кинуренина в совместной культуре клеток-мишеней с CAR⁺ T-клетками

[861] Уровни триптофана и кинуренина в супернатанте культуры измеряли с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используя клетки A549.CD19 (IDO⁺ клетки-мишени), культивируемые в отдельности (необработанные) или с T-клетками, экспрессирующими CAR против CD19 (α-CD19 CAR), в течение 24 часов. Результаты представлены на фиг. 2E (n.d.: не определено), супернатант клеток A549.CD19, культивируемых в отдельности, имел высокий уровень триптофана, но недетектируемые уровни кинуренина, а супернатант совместной культуры T-клеток с CAR против CD19 и IDO⁺ клеток-мишеней A549.CD19 содержал недетектируемые уровни триптофана, но повышенные уровни кинуренина.

Пример 3: Эффект ингибитора IDO1 эпакадостата в отношении функциональных ответов T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, культивируемых с CD19-экспрессирующими опухолевыми клетками

[862] Осуществляли исследования для анализа функциональных ответов после сокультивирования с антиген-экспрессирующими опухолевыми клетками. Пролиферацию, продукцию цитокинов и экспрессию поверхностных клеточных маркеров в T-клетках, экспрессирующих CAR против CD19, анализировали после сокультивирования с линиями опухолевых клеток, экспрессирующих мишень (CD19). CAR-экспрессирующие T-клетки получали, по существу, как описано в примере 1.

A. Оценка пролиферации T-клеток с CAR против CD19 в присутствие ингибитора IDO1 и/или IDO+ клеток-мишеней

[863] T-клетки, экспрессирующие CAR против CD19, метили красителем для анализа пролиферации клеток CellTrace™ violet (ThermoFisher), промывали и инкубировали в течение 96 часов с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями A549 (CD19.A549) при соотношении эффектор:мишень (E:T) 0,3:1, 1:1 или 3:1 в присутствие 0, 0,1, 10 и 1000 нМ эпакадостата. Клетки окрашивали на экспрессию CD4 и CD8 и определяли пролиферацию популяций T-клеток посредством проточной цитометрии с учетом степени разведения красителя CellTrace™ Violet. Как показано на фиг. 3, зависящее од дозы ингибитора IDO1 повышение пролиферации наблюдали и в CD4⁺, и в CD8⁺ CAR-экспрессирующих T-клетках.

[864] Схожие способы использовали для анализа пролиферации T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, полученных из трех разных здоровых доноров, после сокультивирования с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями A549 (CD19.A549). Меченые T-клетки, экспрессирующие CAR против CD19, из каждого донора сокультивировали с CD19.A549 в течение 96 часов в присутствие различных концентраций ингибитора IDO эпакадостата и анализировали пролиферацию, как описано выше. Как показано на фиг. 4A и 4B, наблюдали, что наличие ингибитора повышало пролиферацию CD4⁺ и CD8⁺ CAR-экспрессирующих T-клеток, полученных из всех трех доноров, дозозависимым образом.

[865] Схожий эксперимент осуществляли посредством сокультивирования T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, полученных из одного из трех разных здоровых доноров, с клетками CD19.A549 в течение 96 часов в присутствие 250 нМ эпакадостата. Количество CAR-T-клеток в каждой лунке определяли с использованием частиц CountBright Absolute Counting. Как показано на фиг. 4C, наличие ингибитора IDO1 приводило к получению большего количества CAR-T-клеток по сравнению с отсутствием ингибитора в случае CAR-T-клеток из всех трех доноров. При окрашивании на субпопуляции T-клеток CD3, CD4 и CD8 посредством проточной цитометрии наблюдали схожее кратное повышение количества каждой субпопуляции CAR-T-клеток после инкубации в присутствие эпакадостата по сравнению с отсутствием ингибитора. Результаты соответствовали данным о том, что ингибитор IDO1 может противодействовать ингибиторном эффекту экспрессии IDO1, приводя к повышенной пролиферации CAR-T-клеток.

B. Пролиферация T-клеток с CAR против ROR1 в присутствие ингибитора IDO1 и IDO+ клеток-мишеней

[866] Схожие способы использовали для анализа эффекта ингибитора IDO1 в отношении пролиферации T-клеток, экспрессирующих CAR против ROR1, культивируемых в присутствие антиген-экспрессирующих клеток-мишеней. Клетки, экспрессирующие CAR против ROR1, описанные в примере 1, сокультивировали с клетками CD19.A549, экспрессирующими эндогенный ROR1, при соотношении E:T 3:1 в течение 96 часов в присутствие 250 нМ эпакадостата. Как показано на фиг. 4C, наличие ингибитора IDO1 приводило к получению большего количества CAR-T-клеток по сравнению с клетками, инкубируемыми в отсутствие ингибитора.

C. Пролиферация T-клеток с CAR против CD19 в присутствие ингибитора IDO1 и IDO+ и IDO- клеток-мишеней

[867] Эффект эпакадостата в отношении пролиферации CAR-экспрессирующих T-клеток сравнивали после сокультивирования клеток, экспрессирующих CAR против CD19, с IDO1⁺ клетками (CD19.A549) или IDO1^- клетками (CD19.Дауди) при соотношении E:T 1:1. Пролиферацию анализировали, как описано выше, в отсутствие или присутствие различных концентраций эпакадостата. Как показано на фиг. 5A, 5B и 5C, наблюдали, что наличие ингибитора в совместных культурах приводило к повышенной пролиферации CD4⁺ и CD8⁺ CAR-экспрессирующих T-клеток дозозависимым образом при сокультивировании с IDO1⁺ клетками (A549), но не при сокультивировании с IDO1^- клетками (Дауди). Приблизительная EC₅₀ эпакадостата в клетках A549 составляла приблизительно 223 нМ.

[868] Схожие способы использовали для анализа эффекта ингибитора IDO1 в отношении пролиферации CAR-экспрессирующих T-клеток после сокультивирования клеток, экспрессирующих CAR против CD19, с IDO1⁺ клетками (A549.CD19) или IDO1^- клетками (K562.CD19). Пролиферацию анализировали, как описано выше, в отсутствие или присутствие различных концентраций эпакадостата (в количестве 0, 15,6, 62,5, 250 или 1000 нМ) при соотношении E:T 1:1 для клеток A549.CD19 или 5:1 для клеток K562.CD19. Среднее количество делений CAR-T-клеток вычисляли с учетом пиков разведения красителя и сравнивали пролиферацию CD4⁺ и CD8⁺ субпопуляций. Наблюдали, что наличие ингибитора в совместных культурах приводило к дозозависимому повышению пролиферации CAR-экспрессирующих T-клеток, включая CD4+ и CD8+ популяции, когда такие клетки сокультивировали с IDO1⁺ клетками, но не с IDO1^- клетками.

[869] Наблюдаемый дозозависимый эффект ингибитора в отношении пролиферации и экспансии CAR-T-клеток в культуре также визуализировали посредством микроскопии после сокультивирования меченых клеток-мишеней CD19-A549 с немечеными CAR-экспрессирующими T-клетками при соотношении эффектор:мишень 1:1 в присутствие 1 мкМ эпакадостата или в отсутствие ингибитора. Клетки визуализировали через 72 часа и 120 часов. Через 120 часов наблюдали значительное повышение CAR-экспрессирующих T-клеток (немеченых), ассоциированное с относительно более низким количеством меченых эффекторных клеток после инкубации в присутствие ингибитора по сравнению с контрольными клетками, инкубируемыми в отсутствие ингибитора. Эти результаты соответствовали способности IDO1, представленной в настоящем описании, индуцироваться под воздействием CAR-экспрессирующих T-клеток, что, в свою очередь, снижает экспансию и/или выживаемость CAR-экспрессирующих T-клеток в зависимости от функции IDO1 (о чем свидетельствует реверсирование этого эффекта в присутствие ингибитора IDO1).

D. Устойчивая пролиферация T-клеток с CAR против CD19 в присутствие ингибитора IDO1

[870] Экспансию клеток, экспрессирующих CAR против CD19, после сокультивирования с альвеолярными базальными эпителиальными клетками аденокарциномы человека A549, трансдуцированными с использованием CD19 человека (клетками CD19.A549), анализировали в течение более 10 дней. T-клетки, экспрессирующие CAR против CD19, из каждого донора сокультивировали с CD19.A549 в течение до приблизительно 340 часов в присутствие 0, 3,9, 15,6, 62,5, 250 и 1000 нМ эпакадостата при соотношении E:T 1:1, 0,5:1 или 0,25:1. Экспансию анализировали с учетом % конфлюэнтности в культуре, определяемого с течением времени. Наблюдали дозозависимый эффект ингибитора с повышением экспансии CAR-экспрессирующих T-клеток, становящегося более очевидным в более поздние моменты времени, и увеличением экспансии в культуре до более 5 дней. Стимулируемое ингибитором IDO1 повышение экспансии в культуре поддерживали в течение более 10 дней. Результаты соответствовали выводу о том, что IDO-положительная регуляция и/или IDO-зависимая передача сигнала может происходить или стимулироваться после антиген-специфической активации CAR-T, и она может приводить к ослаблению пролиферации CAR-T-клеток, например, в течение 5 или 10 дней, и что ингибирование IDO в некоторых случаях может восстанавливать такое ингибирование.

E. Высвобождение цитокинов

[871] Анализировали количества фактора некроза опухоли альфа (ФНО) в супернатанте T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, сокультивируемых в течение 48 часов при соотношении E:T 1:1 с клетками CD19.A549 в присутствие различных концентраций эпакадостата. Как показано на фиг. 6, наблюдали, что наличие ингибитора в совместных культурах приводило к повышению продукции ФНО дозозависимым образом. Уровни ФНО были ниже уровней, определяемых в культурах в присутствие IDO1^- клеток CD19.Дауди, которые были выше пределов чувствительности в этом анализе для всех тестируемых условий.

F. Экспрессия маркеров фенотипа клеток

[872] Экспрессию CD25 на поверхности клеток определяли посредством проточной цитометрии на CD4⁺ и CD8⁺ CAR-экспрессирующих T-клеток после сокультивирования T-клеток при соотношении E:T 1:1 с IDO1⁺ клетками CD19.A549 или IDO1^- клетками CD19.Дауди в течение 96 часов в присутствие различных концентраций эпакадостата.

[873] Как показано на фиг. 7A и 7B, наблюдаемые уровни поверхностной экспрессии (средняя интенсивность флуоресценции (MFI)) CD25 на CD4⁺ и CD8⁺ популяциях CAR-экспрессирующих T-клеток через 96 часов после сокультивирования T-клеток с IDO1⁺ клетками CD19.A549, снижались при наличии эпакадостата в культурах a дозозависимым образом. И наоборот, на уровни поверхностной экспрессии CD25, наблюдаемые через 96 часов, не влияло наличие эпакадостата в совместных культурах CAR-экспрессирующих клеток с IDO1^- клетками-мишенями (клетками CD19.Дауди).

[874] Как показано на фиг. 8A и 8B, схожее влияние на экспрессию CD25 также наблюдали в CD4⁺ и CD8⁺ T-клетках, экспрессирующих CAR против CD19, полученных из трех разных здоровых доноров после сокультивирования с клетками CD19.A549.

G. Цитолитическая активность

[875] Определяли цитолитическую активность T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, в присутствие различных концентраций эпакадостата. T-клетки, экспрессирующие CAR против CD19, по отдельности полученные из T-клеток каждого донора, сокультивировали с CD19.A549, мечеными красителем NucRed, в течение до приблизительно 340 часов в присутствие 0, 3,9, 15,6, 62,5, 250 и 1000 нМ эпакадостата, при соотношении E:T 0,25:1. Измеряли лизис клеток-мишеней с течением времени с использованием системы количественного анализа клеток Incucyte (Essen BioScience) посредством оценки интенсивности окрашивания клеток красителем NucRed. Клетки, в которых произошел лизис, демонстрировали сниженную интенсивность окрашивания красителем. Площадь под кривой (AUC) для NucRed⁺ клеток определяли в течение до приблизительно 340 часов для каждой концентрации эпакадостата.

[876] Как показано на фиг. 8C, в культурах, инкубируемых с эпакадостатом, наблюдали дозозависимое снижение интенсивности окрашивания NucRed, что наблюдали по снижению AUC. Результаты соответствовали представлению о том, что наличие эпакадостата повышает функцию, и/или пролиферацию, и/или выживаемость CAR против CD19+ клеток в культурах с клетками CD19.A549 (IDO⁺) дозозависимым образом.

Пример 4: Оценка эффекта флударабина в отношении экспрессии IDO1 и жизнеспособности клеток в линиях опухолевых клеток

[877] Анализировали эффекты флударабина, аналога пурина, используемого в химиотерапии и/или адоптивной T-клеточной терапии (например, в противолимфоцитарном прекондиционировании), в отношении экспрессии IDO1 и жизнеспособности опухолевых клеток. Клетки CD19.A549 инкубировали с ИФНγ или без него в течение 48 часов. Через 24 часа в культуру добавляли увеличивающиеся концентрации флударабина. Уровни экспрессии IDO1 определяли посредством проточной цитометрии, как описано в примере 1A, и вычисляли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). Также анализировали жизнеспособность клеток.

[878] Как показано на фиг. 9A, добавление флударабина снижало уровни IDO1 дозозависимым образом. Эффект флударабина приводил к снижению базального уровня IDO1 в нестимулированных клетках, CD19.A549 а также снижению ИФНγ-опосредованной положительной регуляции уровней IDO1 до уровней ниже базального уровня IDO1 в нестимулированных клетках CD19.A549. Как показано на фиг. 9B, 24 часов обработки флударабина, по существу, не влияли на жизнеспособность клеток CD19.A549.

[879] Также анализировали эффект высоких доз флударабина в отношении жизнеспособности и апоптоза клеток CD19.A549 с течением времени. Клетки CD19.A549 инкубировали с ИФНγ или без него в течение 48 часов. Через 48 часов добавляли дозу 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 200 или 1000 мкМ флударабина. Экспрессию IDO1 и % жизнеспособности измеряли, как описано выше, и апоптоз измеряли с использованием окрашивания аннексином V каждые 24 часа в течение 96 часов. Наблюдали, что более высокие дозы флударабина приводили к снижению жизнеспособности клеток и повышению апоптоза через 24 или более часов в культуре (фиг. 9C), а более низкие дозы флударабина не влияли на уровни экспрессии IDO1 в ИФНγ-стимулированных клетках CD19.A549 с течением времени (фиг. 9D).

Пример 5: Добавление триптофана в совместные культуры T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, и CD19-экспрессирующих опухолевых клеток, способных индуцировать экспрессию IDO в ответ на активность CAR-T

[880] CAR-T-клетки сокультивировали с клетками-мишенями и ингибитором IDO1 эпакадостатом или добавочным триптофаном. CAR-экспрессирующие T-клетки получали, по существу, как описано в примере 1.

A. Пролиферация CAR-T-клеток в присутствие ингибитора IDO1 или триптофана

[881] T-клетки, экспрессирующие CAR против CD19, инкубировали в течение 96 часов с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями A549 (CD19.A549) при соотношении эффектор:мишень (E:T) 1:1 в присутствие 0, 10, 100 и 1000 нМ эпакадостата, добавляемого в начале сокультивирования, или 5 мкг/мл триптофана, добавляемого в культуру каждые 24 часа.

[882] На фиг. 10A показано общее количество CD3⁺ клеток, определяемое в отдельных лунках. Как показано на фиг. 10A, схожие количества T-клеток с течением времени наблюдали после культивирования клеток с добавочным триптофаном или 100 нМ или 1000 нМ эпакадостата. Результаты соответствовали данным о том, что добавочный триптофан может восстанавливать пролиферацию и/или выживаемость CAR-T-клеток в окружении с триптофановым голоданием и/или окружении, в котором в клетках индуцирована экспрессия IDO, например, в ответ на активность CAR, и что триптофановое голодание может обуславливать супрессорные эффекты индукции IDO в опухоли или ассоциированных клетках, таких как в TME. В некоторых аспектах восстановление с помощью триптофана и/или ингибитора IDO или другого модулятора метаболизма или пути триптофана можно использовать для противодействия супрессии функций и/или активности CAR-T-клеток, например, в окружении, в котором индуцирована IDO, например, в ответ на индуцируемые CAR-T-клетками активности.

B. Высвобождение цитокинов

[883] Анализировали количества гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), интерферона-гамма (ИФНγ), интерлейкина-2 (ИЛ-2) и фактора некроза опухоли альфа (ФНО) в супернатантах совместных культур, описанных в примере 5.A выше.

[884] Как показано на фиг. 10B, 10C и 10E, наличие эпакадостата (10, 100 или 1000 нМ) или добавочного триптофана в совместной культуре приводило к повышению уровня ГМ-КСФ, ИФНγ и ФНО, соответственно, по сравнению с совместной культурой без добавления эпакадостата или добавочного триптофана. Как показано на фиг. 10D, уровни ИЛ-2 были повышены в совместных культурах, содержащих эпакадостат (10, 100 или 1000 нМ) или добавочный триптофан, в течение до 72 часов, и уровни снижались через 96 часов. Результаты соответствовали данным о том, что добавочный триптофан мог восстанавливать пролиферацию и/или выживаемость CAR-T-клеток в окружении с триптофановым голоданием и/или окружении, в котором была индуцирована экспрессия IDO в клетках, например, в ответ на активность CAR, и что триптофановое голодание может обуславливать супрессорные эффекты индукции IDO в опухоли или ассоциированных клетках, например, в TME.

C. Экспрессия маркеров фенотипа клетки

[885] Экспрессию CD25 на поверхности клеток анализировали посредством проточной цитометрии в CD4⁺ и CD8⁺ CAR-экспрессирующих T-клетках из совместных культур, описанных в примере 5.A выше.

[886] Как показано на фиг. 10F и 10G, после сокультивирования CD4⁺ или CD8⁺ T-клеток с клетками CD19.A549 (IDO1⁺ клетками-мишенями, способными индуцировать экспрессию IDO1) наблюдаемые уровни поверхностной экспрессии (средняя интенсивность флуоресценции (MFI)) CD25 были снижены в присутствие добавочного триптофана или 100 нМ или 1000 нМ эпакадостата в культурах. Результаты соответствовали данным о том, что добавочный триптофан может восстанавливать пролиферацию и/или выживаемость CAR-T-клеток в окружении с триптофановым голоданием и/или окружении, в котором в клетках индуцирована экспрессия IDO, например, в ответ на активность CAR, и что триптофановое голодание может обуславливать супрессорные эффекты индукции IDO в опухоли или ассоциированных клетках, например, в TME.

Пример 6: Оценка экспрессии индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы (IDO1) в различных клетках

A. Экспрессия IDO1 в стромальных клетках костного мозга в присутствие интерферона-гамма (ИФНγ) или CAR-T-клеток

[887] Уровень экспрессии индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1) определяли в стромальных клетках костного мозга после стимуляции интерфероном-гамма (ИФНγ) или совместной инкубации с CAR-экспрессирующими T-клетками. Стромальные клетки костного мозга являются примером фоновых клеток, например, неопухолевых клеток, присутствующих в TME.

[888] Стромальные клетки костного мозга человека HS-5 стимулировали 20 нг/мл рекомбинантного ИФНγ человека в течение 24 часов.

[889] Как показано на фиг. 11A, инкубация стромальных клеток костного мозга HS-5 с ИФНγ приводила к повышению экспрессии IDO1 в клетках. Сокультивирование клеток HS-5 со злокачественными клетками-мишенями и CAR+ T-клетками также приводило к повышению экспрессии IDO1 в клетках HS-5. Результаты соответствовали данным о том, что инкубация неопухолевых фоновых клеток с ИФНγ или клетками-мишенями и CAR+ T-клетками может способствовать экспрессии IDO1 фоновыми клетками.

B. Экспрессия IDO1 в дендритных клетках и макрофагах в присутствие интерферона гамма (ИФНγ)

[890] Для оценки того, могут ли миелоидные клетки, присутствующие в TME, включая опухоле-ассоциированные макрофаги и дендритные клетки, индуцироваться для экспрессии IDO1, определяли уровень экспрессии IDO1 в дендритных клетках и макрофагах после стимуляции интерфероном-гамма (ИФНγ) или липополисахаридом (LPS) посредством проточной цитометрии. Дендритные клетки подвергали монокультивированию с ГМ-КСФ и интерлейкином-4 (ИЛ-4) и макрофаги подвергали монокультивированию с М-КСФ в течение 6 дней. После монокультивирования клетки стимулировали ИФНγ и/или LPS в течение 24 часов и определяли экспрессию IDO1 посредством проточной цитометрии. Как показано на фиг. 11B, дендритные клетки (DC) индуцировали экспрессию IDO1 после стимуляции ИФНγ, и макрофаги M1 (MФ) индуцировали экспрессию IDO1 в отсутствие стимуляции LPS.

C. Пролиферация CAR-T-клеток в присутствие IDO⁺ стромальных клеток костного мозга

[891] Определяли пролиферацию CAR-T-клеток в присутствие IDO1-экспрессирующих стромальных клеток костного мозга или ингибитора IDO1. CAR-T-клетки и злокачественные клетки-мишени, экспрессирующие антиген, распознаваемые CAR, сокультивировали в присутствие или отсутствие клеток HS-5 (IDO1⁺ фоновых клеток, способных индуцировать экспрессию IDO1) в течение 96 часов в присутствие различных концентраций эпакадостата. На пролиферацию CAR-T-клеток, по существу, не влияло наличие IDO1⁺ стволовых клеток костного мозга в присутствие или отсутствие ингибитора IDO1 эпакадостата.

Пример 7: Оценка экспрессии транспортера аминокислот L-типа (LAT) на клетках-мишенях, первичных T-клетках человека, T-клетках, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), дендритных клетках и макрофагах

A. Уровни экспрессии LAT1

[892] Анализировали уровни экспрессии транспортера аминокислота L-типа 1 (LAT1, кодируемого геном SLC7A5 у людей) различными клетками.

[893] Экспрессия LAT1 на клетках Дауди, K562, HS-5 (стромальных клетках костного мозга человека) и A549 измеряли посредством проточной цитометрии с использованием антитела LAT1. Результаты представлены на фиг. 12A. Примеры уровней экспрессии мРНК приведены в таблице 1 ниже (см. базу данных "Энциклопедия линий злокачественных клеток" (CCLE)).

Таблица 1. Уровни экспрессии SLC7A в линиях злокачественных клеток (из "Энциклопедии линий злокачественных клеток" (CCLE))

ID линии клеток	SLC7A5 (FPKM)
A549_LUNG	602.5735
DAUDI_HAEMATOPOIETIC_AND_LYMPHOID_TISSUE	44.94462
GRANTA519_HAEMATOPOIETIC_AND_LYMPHOID_TISSUE	159.1588
JURKAT_HAEMATOPOIETIC_AND_LYMPHOID_TISSUE	180.9491
K562_HAEMATOPOIETIC_AND_LYMPHOID_TISSUE	122.664
MM1S_HAEMATOPOIETIC_AND_LYMPHOID_TISSUE	73.09056
NALM6_HAEMATOPOIETIC_AND_LYMPHOID_TISSUE	106.7949
OPM2_HAEMATOPOIETIC_AND_LYMPHOID_TISSUE	173.9881
RAJI_HAEMATOPOIETIC_AND_LYMPHOID_TISSUE	127.4476
RPMI8226_HAEMATOPOIETIC_AND_LYMPHOID_TISSUE	82.51015
SKMEL28_SKIN	137.2393

[894] Уровни экспрессии LAT1 в линиях клеток, экспрессирующих подобный рецепторной тирозинкиназе орфанный рецептор 1 (ROR1), измеряли посредством проточной цитометрии с использованием антитела против LAT1 после стимуляции интерфероном-гамма (ИФНγ). HCC1806, H2286, H1975, H1299, BT-549 и CD19.A549, описанные в примере 1C выше, стимулировали 20 нг/мл рекомбинантного ИФНγ человека в течение ночи и оценивали на экспрессию LAT1. Результаты представлены на фиг. 12B.

B. Уровень экспрессии LAT1 на дендритных клетках и макрофагах

[895] Уровни экспрессии LAT1 в дендритных клетках и макрофагах после культивирования со стимуляцией интерфероном-гамма (ИФНγ) или липополисахаридом (LPS), как описано в примере 6B, определяли посредством проточной цитометрии. Результаты представлены на фиг. 12C. Также наблюдали, что экспрессия LAT1 повышалась в T-клетках после активации, включая CAR-экспрессирующие T-клетки.

C. Уровень экспрессии LAT1 и CD98hc на CAR-T-клетках

[896] Уровни экспрессии мРНК SLC7A5 (кодирующего LAT1) анализировали с использованием RNAseq в различных популяциях первичных T-клеток человека, включая различные популяции T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19. В частности, отдельно анализировали CD4+ и CD8+ популяции клеток для каждой из трех разных композиций CAR против CD19+ T-клеток. В случае каждой популяции, клетки анализировали после конструирования первичных T-клеток человека для экспрессии CAR (как правило, посредством селекции, вирусной трансдукции, экспансии и криоконсервации) и размораживания или после последующей стимуляции в присутствие клеток-мишеней, экспрессирующих антиген CD19. Также анализировали уровни мРНК SLC7A5 в CD4+ и CD8+ клетках из исходных образцов первичных PBMC человека, сконструированных для получения одной из композиций CAR против CD19+ клеток. Результаты свидетельствовали об экспрессии мРНК LAT1 в каждом образце с повышением мРНК LAT1 в CAR-экспрессирующих клетках по сравнению с клетками из образца PBMC человека и повышении уровней после стимуляции CAR-T-клеток в присутствие клеток, экспрессирующих антиген-мишень CAR. Схожие результаты наблюдали для

[897] Кроме того, определяли схожие уровни мРНК SLC7A5 (кодирующего LAT1, легкую цепь) и мРНК SLC3A2 (кодирующего тяжелую цепь CD98) в одном из примеров композиций CAR против CD19+ T-клеток.

[898] Уровни экспрессии белка LAT1 сравнивали в клетках, экспрессирующих два разных CAR, CD4+ и CD8+ популяциях в образцах мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека и линии опухолевых клеток A549 посредством проточной цитометрии с использованием антитела против LAT1. Результаты свидетельствовали о более высокой экспрессии LAT1 в CAR-T-клетках по сравнению с образцами PBMC и значительном повышении экспрессии LAT1 в опухолевых клетках (клетках A549) по сравнению с PBMC и CAR+ популяциями.

Пример 8: Пролиферация T-клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), сокультивируемых с IDO1⁺ LAT1^- стромальными клетками костного мозга

[899] Анализировали пролиферацию CAR-экспрессирующих T-клеток, культивируемых с IDO1⁺ клетками, неэкспрессирующими высокие уровни LAT1.

[900] CAR-экспрессирующие CD4⁺ и CD8⁺ T-клетки метили красителем CellTrace™ violet (ThermoFisher) и сокультивировали в течение 96 часов с клетками-мишенями, экспрессирующими антиген, распознаваемый CAR (соотношение E:T1:1), стромальными клетками костного мозга человека HS-5 (IDO1⁺ фоновыми клетками способными индуцировать экспрессию IDO1; при соотношении CAR+:фоновые клетки 1:1) или и клетками-мишенями, и клетками HS-5 (соотношение CAR+:клетки-мишени:фоновые клетки1:1:1). Фоновые клетки HS-5 экспрессируют высокие уровни IDO1 и низкие уровни LAT1. Пролиферацию CD4⁺ и CD8⁺ CAR-экспрессирующих T-клеток определяли посредством разведения красителя CellTrace™ violet.

[901] Результаты свидетельствовали о том, что сокультивирование клеток-мишеней и CAR-T-клеток индуцировало пролиферацию CAR-T-клеток, в то время как сокультивирование фоновых клеток HS-5 в отдельности и CAR-T-клеток не индуцировало пролиферацию CAR-T-клеток, как показано на фиг. 13. При сокультивировании с клетками-мишенями и клетками HS-5 наблюдали пролиферацию, схожую с пролиферацией при сокультивировании клеток-мишеней. Результаты соответствовали данным о том, что наличие клеток HS-5, которые можно индуцировать так, чтобы они экспрессировали IDO1 после стимуляции интерфероном-гамма (ИФНγ), но не экспрессирующим высокие уровни LAT1, не влияло на пролиферацию CAR-T-клеток после стимуляции.

Пример 9: Триптофановое голодание и восполнение

A. Добавление добавочного триптофана к CAR-T-клеткам после ингибирования IDO1-экспрессирующими клетками-мишенями

[902] Клетки, экспрессирующие CAR против CD19, полученные, по существу, как описано в примере 1, метили красителем CellTrace™ Violet и культивировали с IDO1⁺ клетками A549.CD19 в течение 96 часов в отдельности или в присутствие 5 мкг/мл добавочного триптофана (добавляемого каждые 24 часа) или 250 нМ ингибитора IDO эпакадостата. Пролиферацию определяли посредством проточной цитометрии и определяли количество CAR+ T-клеток в каждой лунке.

[903] Результаты представлены на фиг. 14A и 14B. Наблюдали, что восполнение триптофана в CAR-T-клетках, сокультивируемых в присутствие клеток-мишеней (как показано, положительно регулирующих IDO1 и ингибирующих пролиферацию в этом контексте), восстанавливало пролиферацию CAR-T-клеток до степени, схожей со степенью при добавлении ингибитора IDO-, по сравнению с отсутствием обработки (без Tx). Результаты соответствовали выводу о том, что триптофановое голодание опосредует ингибиторные эффекты IDO1-экспрессирующих клеток-мишеней после индуцируемой CAR-T-клетками положительной регуляции IDO.

B. Влияние триптофанового голодания на антиген-специфическую функцию CAR-T-клеток

[904] Анализировали эффекты триптофанового голодания в отношении антиген-индуцированной функции CAR-T-клеток. CAR-экспрессирующие T-клетки, меченые CellTrace™ violet, сокультивировали с клетками-мишенями (клетками-мишенями миелогенного лейкоза человека K562, трансдуцированными с использованием CD19 (CD19.K562)), неиндуцирующими экспрессию IDO1, в средах с истощением триптофана с добавлением различных концентраций добавочного триптофана или без него. Триптофан-содержащие среды использовали в качестве контроля (триптофановый контроль). Количество и пролиферацию клеток-мишеней анализировали посредством проточной цитометрии с помощью разведения красителя CTV (MFI=средняя интенсивность флуоресценции).

[905] Результаты представлены на фиг. 15A, 15B и 15C, и они соответствовали ингибиторному эффекту триптофанового голодания в отношении антиген-специфической функции CAR-T-клеток, являвшемуся схожим с эффекту, наблюдаемому в присутствие положительно регулируемой IDO1, который можно реверсировать посредством добавления добавочного триптофана в течение культивирования.

[906] Схожее исследование осуществляли для анализа эффектов триптофанового голодания, но в этом случае CAR-опосредованную функцию индуцировали с использованием агонистического антиидиотипического антитела, специфического для CAR, в противоположность антиген-экспрессирующим клеткам-мишеням. Клетки, экспрессирующие CAR против CD19, полученные, по существу, как описано в примере 1, стимулировали в течение 96 часов с использованием связанного с планшетом антиидиотипического агонистического антитела в средах с истощением триптофана в отдельности или с добавлением различных концентраций триптофана. Определяли количество CD3⁺ клеток на лунку. Типичные результаты примеров исследований показаны на фиг. 15D и фиг. 15E (результаты для трех разных доноров). Схожие результаты наблюдали в схожих экспериментах с использованием T-клеток, экспрессирующих CAR против другого антигена. Результаты соответствовали ингибированию CAR-опосредованной функции при триптофановом голодании, которую можно восстанавливать с помощью добавочного триптофана.

C. Влияние условий с триптофановым голоданием в отношении функции CAR-T-клеток после повторного воздействия антигена в условиях триптофанового голодания и достаточного количества триптофана

[907] Клетки, экспрессирующие CAR против CD19, полученные, по существу, как описано в примере 1, инкубировали в течение 96 часов с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями A549 (CD19.A549) (которые, как описано, демонстрируют экспрессию IDO1 после сокультивирования с CAR-T-клетками). Сокультивирование осуществляли в течение 96 часов в присутствие 0, 15,6, 62,5, 250 или 1000 нМ ингибитора IDO эпакадостата. Результаты представлены на фиг. 16A.

[908] Затем клетки, инкубируемые без эпакадостата (0 нМ), культивировали еще в течение 96 часов с добавочным триптофаном, добавляемого в культуру каждые 24 часа, или без него и без добавления свежих клеток-мишеней или другого дополнительного стимуляторного средства. Результаты представлены на фиг. 16B.

[909] Как показано на фиг. 16B, после IDO-опосредованного ингибирования пролиферации CAR⁺ T-клеток, инкубируемых с добавочным триптофаном, но без эпакадостата, наблюдали схожее повышение количества T-клеток с течением времени после последующей инкубации в течение 96 часов с добавочным триптофаном или без него.

[910] Анализировали эффект триптофанового голодания в отношении функции CAR-T-клеток (пролиферации, продукции цитокинов) после последующего повторного воздействия антигена. Клетки, экспрессирующие CAR против CD19, полученные с использованием T-клеток из двух разных доноров, по существу, как описано в примере 1, сокультивировали с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями A549 (CD19.A549), способными индуцировать IDO1, в течение 96 часов в средах для культивирования клеток в отсутствие эпакадостата (отсутствие обработки (без Tx)) или с 250 нМ эпакадостата (эпакадостат). Клетки собирали, подсчитывали и повторно культивировали со свежими CD19-экспрессирующими клетками-мишенями A549 (CD19.A549) в средах с истощением триптофана (средах из культур "без tx" через 96 часов) с добавочным триптофаном или без него. Внутриклеточные уровни интерферона-гамма (ИФНγ) и интерлейкина-2 (ИЛ-2) анализировали посредством окрашивания на внутриклеточные цитокины и определяли процентную долю CD4+ или CD8+ клеток, считающихся положительными по продукции указанного внутриклеточного цитокина.

[911] Результаты представлены на фиг. 16C и 16D. Как показано, CAR-T-клетки, считающиеся находящимися в условиях триптофанового голодания (клетки, инкубируемые с клетками-мишенями, по наблюдениям индуцирующими экспрессию IDO-1 в условиях инкубации без ингибитора IDO (без Tx)), демонстрировали снижение продукции цитокинов (по сравнению с клетками, инкубируемыми в присутствие ингибитора IDO1) после повторного контакта клеток с клетками-мишенями. Наблюдаемое снижение частично восстанавливалось при добавлении триптофана при последующем культивировании, при этом наблюдали, что добавление триптофана после триптофанового голодания CAR-T-клеток может восстанавливать функциональность до некоторой степени, но не обязательно полностью.

Пример 10: Эффект повышения метаболита триптофана в отношении пролиферации CAR-экспрессирующих T-клеток, культивируемых с CD19-экспрессирующими опухолевыми клетками

[912] Метаболиты триптофана добавляли в совместную культуру CAR+ T-клеток и IDO- клеток-мишеней для определения того, влияет ли наличие метаболитов триптофана на пролиферацию CAR-T-клеток.

[913] T-клетки, экспрессирующие CAR против CD19, полученные, по существу, как описано в примере 1, метили красителем CellTrace™ violet (ThermoFisher), промывали и сокультивировали в течение 96 часов с клетками-мишенями CD19.Дауди (IDO1^- клетками-мишенями, неиндуцирующими экспрессию IDO1) при соотношении эффектор:мишень (E:T) 1:1 в присутствие 0, 6,25, 12,5, 25, 50 и 100 мкМ L-кинуренина, 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA) или 0, 6,25, 12,5, 25, 50 и 100 мкМ каждого из L-кинуренина и 3-HAA. L-кинуренин и 3-HAA являются метаболитами, продуцирующимися в результате IDO1-опосредованного окисления триптофана. Клетки окрашивали на поверхностную экспрессию CD4 и CD8. Пролиферацию популяций T-клеток определяли посредством проточной цитометрии с учетом степени разведения красителя CellTrace™ violet.

[914] Как показано на фиг. 17A, наличие метаболитов триптофана L-кинуренина и 3-HAA не ингибировало пролиферацию CAR-T-клеток при сокультивировании с клетками-мишенями CD19.Дауди.

[915] Схожее исследование осуществляли посредством сокультивирования клеток, экспрессирующих CAR против CD19, с IDO1^- клетками CD19.K562 в течение 96 часов в присутствие от 6,25 до 100 мкМ L-кинуренина, 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA) или от 6,25 до 100 мкМ каждого из L-кинуренина и 3-HAA. Количество CD3⁺ клеток на лунку определяли с использованием частиц CountBright. Как показано на фиг. 17B, наличие метаболитов триптофана L-кинуренина и 3-HAA, по существу, не влияло на количества CAR-T-клеток при сокультивировании с клетками-мишенями CD19.K562.

Пример 11: Оценка восстановления после триптофанового голодания

[916] CAR-экспрессирующие T-клетки подвергали триптофановому голоданию в течение различных периодов времени и анализировали восстановление пролиферации клеток и продукции цитокинов после триптофанового голодания.

[917] T-клетки, экспрессирующие CAR против CD19, полученные, как описано в примере 1, культивировали в условиях триптофанового голодания (химически определенных средах без триптофана) в течение 24, 48, 72 или 96 часов (24, 48, 72 или 96 ч. триптофанового голодания). После триптофанового голодания в течение указанного времени в культуры добавляли добавочный триптофан. Затем клетки культивировали в присутствие триптофана до того, как клетки собирали через 24, 48, 72 или 96 часов. В качестве контроля, отражающего условия с достаточным количеством триптофана, клетки культивировали в средах с достаточным количеством триптофана в течение каждого соответствующего периода времени (полные среды). Анализировали количество CD3⁺ клеток на лунку. Внутриклеточную продукцию интерферона-гамма (ИФНγ) и фактора некроза опухоли альфа (ФНО) анализировали посредством окрашивания на внутриклеточные цитокины и определяли процентную долю CD4+ или CD8+ клеток, положительных по накоплению цитокинов.

[918] Результаты представлены на фиг. 18A. Результаты соответствовали наблюдению о том, что триптофановое голодание в течение по меньшей мере 48 часов или более снижало способность клеток к пролиферации. Наблюдали, что добавление добавочного триптофана не восстанавливало пролиферативную способность полностью до 96 часов. Схожие результаты наблюдали при оценке продукции цитокинов в подвергнутых триптофановому голоданию CD4+ или CD8+ клетках (ИФНγ (фиг. 18B или 18C, соответственно) или ФНО (фиг. 18D или 18E, соответственно)). Результаты соответствовали данным о том, что триптофановое голодание CAR-T-клеток в течение более 24 часов, например, 48 часов или более, может приводить к нарушению функции, которую не обязательно можно восстановить посредством восстановления нормальных или достаточных уровней триптофана.

Пример 12: Анализ экспрессии генов в T-клетках, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), в условиях триптофанового голодания

[919] CAR-экспрессирующие T-клетки анализировали посредством RNASeq для оценки изменений экспрессии генов и изменений в пути передачи сигнала в условиях триптофанового голодания в присутствие антигена-мишени CAR.

[920] CAR-экспрессирующие T-клетки, полученные с использованием T-клеток из семи (7) разных доноров, по существу, как описано в примере 1 выше, стимулировали связанным с планшетом антиидиотипическим антителом в течение 2 дней в средах без триптофана, дополненных оптимальными (5 мкг/мл; достаточное количество триптофана) или субоптимальными (0,625 мкг/мл; триптофановое голодание) концентрациями триптофана. Выделяли РНК из собранных клеток. Получали библиотеки цепь-специфических кДНК со штрихкодами. Образцы секвенировали для получения одноконцевые риды RNAseq размером 75 оснований.

[921] Риды RNASeq картировали по геному человеку и выравнивали. Осуществляли анализ уровня дифференциальной экспрессии генов, учитывая донора и обработку. Перед анализом дифференциальной экспрессии набор генов фильтровали на белок-кодирующие гены. Дифференциально экспрессирующиеся гены идентифицировали, используя пороговое значение log₂ кратного изменения ± 1 и пороговое значение на уровня ложноположительных результатов (FDR) с поправкой Бенджамини-Хохберга 0,01.

[922] На фиг. 19A представлена вулканная диаграмма, на которой показана статистическая значимость различий экспрессии (log₁₀ скорректированного значения p) продуктов генов в условиях достаточного количества триптофана (контроль) и триптофанового голодания (триптофан) log₂ кратного изменения экспрессии каждого продукта гена, включая гены, подвергнутые значительной положительной регуляции (правая сторона) или отрицательной регуляции (левая сторона). Результаты RNAseq, представленные в виде значений транскриптов на т.п.н. на миллион (TPM), для двух примеров генов, кодирующих членов интегрированного пути стрессовой реакции eIF2α/ATF4, ATF4 и DDIT3 (также известного как белок, гомологичный CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP)), представлены на фиг. 19B. Как показано, эти гены подвергались значительной положительной регуляции в условиях с низким содержанием триптофана. Экспрессию белка DDIT3 (CHOP) подтверждали посредством вестерн-блоттинга.

[923] На фиг. 19C показаны результаты анализа онтологии генов, в котором оценивали клеточные пути передачи сигнала, проводимого с учетом анализов экспрессии генов, подвергающихся влиянию в условиях триптофанового голодания, и пример схематического изображения генов, вовлеченных в путь ATF4, экспрессия которых была изменена.

[924] Результаты соответствовали данным о том, что триптофановое голодание приводит к изменениям экспрессии различных генов, включая гены, вовлеченные в пути стрессовой реакции и другие пути.

Пример 13: Оценка экспрессии индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы (IDO1) в модели ксенотрансплантата опухоли мыши после введения T-клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR)

[925] Экспрессию IDO1 в опухолях после обработки CAR-экспрессирующими T-клетками, направленно воздействующими на антиген, экспрессируемый опухолью (или без обработки (наивные)), анализировали в модели ксенотрансплантата мыши.

[926] Модель ксенотрансплантата опухоли мыши получали посредством подкожной имплантации 5×10⁶ клеток A549.CD19 (IDO⁺). Через девятнадцать (19) дней после имплантации опухоли животным в исследуемой группе вводили T-клетки, экспрессирующие CAR против CD19. В день 9 после введения CAR+ T-клеток собирали опухоли. Образцы опухоли обрабатывали, получая суспензии отдельных клеток, которые анализировали посредством проточной цитометрии. Осуществляя гейтирование по живым немышиным клеткам, анализировали экспрессию CD3, CD8 и IDO. Результаты представлены на фиг. 20. Результаты свидетельствовали о наличии CD8+ и CD8-отрицательных CAR+ T-клеток (немышиных CD3+ клеток) у животных, которым вводили CAR+ T-клетки, но не у животных, которым их не вводили. Экспрессию IDO1 наблюдали в популяциях не-CD3+ немышиных клеток (считающихся содержащими A549.CD19+ опухолевые клетки) у животных, которым вводили клетки, но не у животных, которым их не вводили. Результаты соответствовали положительной регуляции IDO в опухолях с внутриопухолевыми опухолеспецифичными CAR-T-клетками.

[927] Фиксированные формалином срезы опухолевых тканей окрашивали и анализировали посредством иммунофлуоресцентной микроскопии на CD3, CD19 и IDO1. Наблюдали устойчивое окрашивание CD19 в опухоли, окруженной и инфильтрированной CD3-экспрессирующими клетками человека (что соответствует наличию T-клеток с CAR против CD19, окружающих и инфильтрующих опухоль). Кроме того, наблюдали окрашивание IDO1 на границе CD19+ опухоли и CD3+ популяции. Результаты соответствовали положительной регуляции экспрессии IDO1 в модели ксенотрансплантата опухоли мыши после введения направленных на опухоль CAR+ T-клеток.

Пример 14: Оценка экспрессии индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы (IDO1) и резистентность к адаптивному иммунитету в биоптатах человека после введения T-клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR)

[928] Экспрессию IDO1 анализировали в образцах биоптатов опухоли, полученных из людей с диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой (DLBCL) до и после однократной инфузии аутологичных T-клеток, экспрессирующих CAR против CD19, содержащих цитоплазматические сигнальные домены 41BB и CD3-дзета.

[929] Анализировали биоптаты опухолей, полученные из индивидуумов до и через 7-20 дней после введения CAR+ T-клеток. Срезы биоптатов опухолей окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и оценивали на качество тканей и для идентификации опухолей. Инфильтрацию CAR+ клетками в биоптате анализировали с использованием зонда для гибридизации in situ (ISH), специфического для мРНК, кодирующей CAR против CD19. Иммунофлуоресцентное окрашивание использовали для анализа экспрессии белка IDO1 и лиганда программируемой гибели клеток 1 (PD-L1).

[930] На фиг. 21 показана повышенная экспрессия IDO1 и PD-L1 в опухолях некоторых индивидуумов DLBCL после введения CAR+ T-клеток и локализация CAR+ T-клеток в опухолях.

Пример 15: Конструирование CAR-T-клеток для гиперэкспрессии транспортеров аминокислот

[931] В примере способа T-клетки, выделенные из человека, конструируют для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), такого как CAR против CD19, и для гиперэкспрессии транспортера аминокислот или одной или более его цепей, например, транспортера, включающего транспортер аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5) в качестве легкой цепи и, необязательно, тяжелой цепи CD98 (CD98hc; 4F2hc; SLC3A2) в качестве тяжелой цепи. CD4⁺ и CD8⁺ T-клетки подвергают селекции из образца продукта афереза из индивидуума. В некоторых примерах в клетку также встраивают одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих CAR. В некоторых примерах последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, можно соединять с поверхностным маркером (например, EGFRt) для подтверждения трансдукции. В некоторых случаях в клетку встраивают одну или более нуклеиновых кислот, например, нуклеиновых кислот, содержащихся в одном или более вирусных векторах, кодирующих одну или более цепей транспортера аминокислот или один или более транспортеров аминокислот. В некоторых случаях кодируемый транспортер аминокислот является мономером. В некоторых случаях кодируемый транспортер аминокислот является димером, таким как гетеродимер. В некоторых примерах цепь транспортера аминокислот может являться LAT1 (SLC7A5), LAT2 (SLC7A8) или протонным транспортером аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4). В некоторых примерах последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие транспортер аминокислот, также включают последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую цепь CD98 (CD98hc; 4F2hc; SLC3A2). В некоторых примерах последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие транспортеры аминокислот или их цепи, соединяют с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей другой поверхностный маркер (например, Thy1.1), для подтверждения трансдукции последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих транспортер аминокислот.

[932] Один или более вирусных векторов, содержащих последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR и/или транспортеры аминокислот или их цепи, встраивают в CD4⁺ и CD8⁺ клетки посредством вирусной трансдукции. В некоторых примерах после встраивания клетки дополнительно инкубируют, как правило, при 37°C, например, делая возможной экспансию клеток. Полученные T-клетки экспрессируют химерный антигенный рецептор и гиперэкспрессируют транспортер аминокислот.

[933] В некоторых примерах функцию сконструированных клеток, например, CAR LAT1/CD98hc+ клеток, анализируют в условиях триптофанового голодания (например, средах без триптофана, дополненных ограниченными количествами триптофана, и/или средах в присутствие IDO1⁺ и/или LAT1⁺ клеток).

Пример 16: Конструирование CAR+ T-клеток для снижения экспрессии регуляторов аминокислотного голодания

[934] В примере способа T-клетки, выделенные из человека, конструируют для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), такого как CAR против CD19, и для снижения или устранения экспрессии регуляторов аминокислотного голодания. В некоторых примерах T-клетки конструируют для устранения или снижения экспрессии регуляторов аминокислотного голодания, таких как general control nonderepressible 2 (GCN2), эукариотический фактор инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующий фактор транскрипции 4 (ATF4) или белок, гомологичный CCAAT/энхансер-связывающему белку (CHOP). В некоторых примерах T-клетки конструируют для устранения или снижения экспрессии компонентов пути, регулируемых GCN2, например, CHOP, Gadd45α, Herp 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 или ИФНγ-R2. В некоторых примерах экспрессию GCN2, eIF2α, ATF4 или CHOP устраняют или снижают с помощью ингибиторных нуклеиновых кислот, таких как средство РНК-интерференции, например, короткая шпилечная РНК (shRNA) или малая интерферирующая РНК (миРНК). В некоторых примерах ингибиторные нуклеиновые кислоты или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие ингибиторные нуклеиновые кислоты, встраивают в CAR-экспрессирующие клетки. В некоторых примерах GCN2, eIF2α, ATF4 или CHOP устраняют или снижают посредством повреждения генов, кодирующих белки. В некоторых примерах повреждения достигают посредством редактирования генома. Например, повреждения GCN2, eIF2α, ATF4 или CHOP достигают посредством встраивания редактирующей геном нуклеазы, нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR)/Cas9, и/или TAL-эффекторной нуклеазы (TALEN). В некоторых примерах нуклеиновые кислоты, направленно воздействующие на гены, например, гидовую РНК, также встраивают в сконструированную T-клетку. В некоторых случаях в клетку встраивают рибонуклеопротеиновый комплекс (RNP), содержащий редактирующую геном нуклеазу и направляющую нуклеиновую кислоту, например, гидовую РНК.

[935] В некоторых примерах функцию сконструированных клеток, например, CAR-экспрессирующих GCN2- клеток, оценивают в условиях триптофанового голодания (например, в средах без триптофана, дополненных ограниченными количествами триптофана, и/или средах в присутствие IDO1⁺ и/или LAT1⁺ клеток).

[936] Настоящее описание не предназначено для ограничения объема конкретными описанными вариантами осуществления, представленными, например, для иллюстрирования различных аспектов изобретения. Различные модификации описанных композиций и способов будут очевидны из описания и идей, представленных в настоящем описании. Такие варианты можно осуществлять на практике без отклонения от объема и сущности изобретения, и они предназначены для включения в объем настоящего изобретения.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

SEQ ID NO	ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ	ОПИСАНИЕ
1	ESKYGPPCPPCP	Спейсер (шарнирная область IgG4) (аминокислоты) Homo sapiens
2	GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT	Спейсер (шарнирная область IgG4) (нуклеотиды) Homo sapiens
3	ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK	Спейсер шарнирная область-CH3 Homo sapiens
4	ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK	Спейсер шарнирная область-CH2-CH3 Homo sapiens
5	RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH	IgD-шарнирная область-Fc Homo sapiens
6	LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR	T2A Искусственный
7	RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM	tEGFR Искусственный
8	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV	CD28 (аминокислоты 153-179 из регистрационного номера P10747) Homo sapiens
9	IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV	CD28 (аминокислоты 114-179 из регистрационного номера P10747) Homo sapiens
10	RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS	CD28 (аминокислоты 180-220 из P10747) Homo sapiens
11	RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS	CD28 (замена LL на GG) Homo sapiens
12	KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL	4-1BB (аминокислоты 214-255 из Q07011.1) Homo sapiens
13	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	CD3 дзета Homo sapiens
14	RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	CD3 дзета Homo sapiens
15	RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	CD3 дзета Homo sapiens
16	PGGG-(SGGGG)5-P-, где P является пролином, G является глицином, и S является серином	Линкер
17	GSADDAKKDAAKKDGKS	Линкер
18	MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD	Cas9 S. Pyogenes Q99ZW2
19	MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD	Cas9 S. Pyogenes D10A
20	MLGTGPAAATTAATTSSNVSVLQQFASGLKSRNEETRAKAAKELQHYVTMELREMSQEESTRFYDQLNHHIFELVSSSDANERKGGILAIASLIGVEGGNATRIGRFANYLRNLLPSNDPVVMEMASKAIGRLAMAGDTFTAEYVEFEVKRALEWLGADRNEGRRHAAVLVLRELAISVPTFFFQQVQPFFDNIFVAVWDPKQAIREGAVAALRACLILTTQREPKEMQKPQWYRHTFEEAEKGFDETLAKEKGMNRDDRIHGALLILNELVRISSMEGERLREEMEEITQQQLVHDKYCKDLMGFGTKPRHITPFTSFQAVQPQQSNALVGLLGYSSHQGLMGFGTSPSPAKSTLVESRCCRDLMEEKFDQVCQWVLKCRNSKNSLIQMTILNLLPRLAAFRPSAFTDTQYLQDTMNHVLSCVKKEKERTAAFQALGLLSVAVRSEFKVYLPRVLDIIRAALPPKDFAHKRQKAMQVDATVFTCISMLARAMGPGIQQDIKELLEPMLAVGLSPALTAVLYDLSRQIPQLKKDIQDGLLKMLSLVLMHKPLRHPGMPKGLAHQLASPGLTTLPEASDVGSITLALRTLGSFEFEGHSLTQFVRHCADHFLNSEHKEIRMEAARTCSRLLTPSIHLISGHAHVVSQTAVQVVADVLSKLLVVGITDPDPDIRYCVLASLDERFDAHLAQAENLQALFVALNDQVFEIRELAICTVGRLSSMNPAFVMPFLRKMLIQILTELEHSGIGRIKEQSARMLGHLVSNAPRLIRPYMEPILKALILKLKDPDPDPNPGVINNVLATIGELAQVSGLEMRKWVDELFIIIMDMLQDSSLLAKRQVALWTLGQLVASTGYVVEPYRKYPTLLEVLLNFLKTEQNQGTRREAIRVLGLLGALDPYKHKVNIGMIDQSRDASAVSLSESKSSQDSSDYSTSEMLVNMGNLPLDEFYPAVSMVALMRIFRDQSLSHHHTMVVQAITFIFKSLGLKCVQFLPQVMPTFLNVIRVCDGAIREFLFQQLGMLVSFVKSHIRPYMDEIVTLMREFWVMNTSIQSTIILLIEQIVVALGGEFKLYLPQLIPHMLRVFMHDNSPGRIVSIKLLAAIQLFGANLDDYLHLLLPPIVKLFDAPEAPLPSRKAALETVDRLTESLDFTDYASRIIHPIVRTLDQSPELRSTAMDTLSSLVFQLGKKYQIFIPMVNKVLVRHRINHQRYDVLICRIVKGYTLADEEEDPLIYQHRMLRSGQGDALASGPVETGPMKKLHVSTINLQKAWGAARRVSKDDWLEWLRRLSLELLKDSSSPSLRSCWALAQAYNPMARDLFNAAFVSCWSELNEDQQDELIRSIELALTSQDIAEVTQTLLNLAEFMEHSDKGPLPLRDDNGIVLLGERAAKCRAYAKALHYKELEFQKGPTPAILESLISINNKLQQPEAAAGVLEYAMKHFGELEIQATWYEKLHEWEDALVAYDKKMDTNKDDPELMLGRMRCLEALGEWGQLHQQCCEKWTLVNDETQAKMARMAAAAAWGLGQWDSMEEYTCMIPRDTHDGAFYRAVLALHQDLFSLAQQCIDKARDLLDAELTAMAGESYSRAYGAMVSCHMLSELEEVIQYKLVPERREIIRQIWWERLQGCQRIVEDWQKILMVRSLVVSPHEDMRTWLKYASLCGKSGRLALAHKTLVLLLGVDPSRQLDHPLPTVHPQVTYAYMKNMWKSARKIDAFQHMQHFVQTMQQQAQHAIATEDQQHKQELHKLMARCFLKLGEWQLNLQGINESTIPKVLQYYSAATEHDRSWYKAWHAWAVMNFEAVLHYKHQNQARDEKKKLRHASGANITNATTAATTAATATTTASTEGSNSESEAESTENSPTPSPLQKKVTEDLSKTLLMYTVPAVQGFFRSISLSRGNNLQDTLRVLTLWFDYGHWPDVNEALVEGVKAIQIDTWLQVIPQLIARIDTPRPLVGRLIHQLLTDIGRYHPQALIYPLTVASKSTTTARHNAANKILKNMCEHSNTLVQQAMMVSEELIRVAILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKQLPQLTSLELQYVSPKLLMCRDLELAVPGTYDPNQPIIRIQSIAPSLQVITSKQRPRKLTLMGSNGHEFVFLLKGHEDLRQDERVMQLFGLVNTLLANDPTSLRKNLSIQRYAVIPLSTNSGLIGWVPHCDTLHALIRDYREKKKILLNIEHRIMLRMAPDYDHLTLMQKVEVFEHAVNNTAGDDLAKLLWLKSPSSEVWFDRRTNYTRSLAVMSMVGYILGLGDRHPSNLMLDRLSGKILHIDFGDCFEVAMTREKFPEKIPFRLTRMLTNAMEVTGLDGNYRITCHTVMEVLREHKDSVMAVLEAFVYDPLLNWRLMDTNTKGNKRSRTRTDSYSAGQSVEILDGVELGEPAHKKTGTTVPESIHSFIGDGLVKPEALNKKAIQIINRVRDKLTGRDFSHDDTLDVPTQVELLIKQATSHENLCQCYIGWCPFW	MTOR_HUMAN Серин/треониновая протеинкиназа mTOR; UniProt № P42345
21	GCTCCCGGCTTAGAGGACAGCGGGGAAGGCGGGCGGTGGGGCAGGGGGCCTGAAGCGGCGGTACCGGTGCTGGCGGCGGCAGCTGAGGCCTTGGCCGAAGCCGCGCGAACCTCAGGGCAAGATGCTTGGAACCGGACCTGCCGCCGCCACCACCGCTGCCACCACATCTAGCAATGTGAGCGTCCTGCAGCAGTTTGCCAGTGGCCTAAAGAGCCGGAATGAGGAAACCAGGGCCAAAGCCGCCAAGGAGCTCCAGCACTATGTCACCATGGAACTCCGAGAGATGAGTCAAGAGGAGTCTACTCGCTTCTATGACCAACTGAACCATCACATTTTTGAATTGGTTTCCAGCTCAGATGCCAATGAGAGGAAAGGTGGCATCTTGGCCATAGCTAGCCTCATAGGAGTGGAAGGTGGGAATGCCACCCGAATTGGCAGATTTGCCAACTATCTTCGGAACCTCCTCCCCTCCAATGACCCAGTTGTCATGGAAATGGCATCCAAGGCCATTGGCCGTCTTGCCATGGCAGGGGACACTTTTACCGCTGAGTACGTGGAATTTGAGGTGAAGCGAGCCCTGGAATGGCTGGGTGCTGACCGCAATGAGGGCCGGAGACATGCAGCTGTCCTGGTTCTCCGTGAGCTGGCCATCAGCGTCCCTACCTTCTTCTTCCAGCAAGTGCAACCCTTCTTTGACAACATTTTTGTGGCCGTGTGGGACCCCAAACAGGCCATCCGTGAGGGAGCTGTAGCCGCCCTTCGTGCCTGTCTGATTCTCACAACCCAGCGTGAGCCGAAGGAGATGCAGAAGCCTCAGTGGTACAGGCACACATTTGAAGAAGCAGAGAAGGGATTTGATGAGACCTTGGCCAAAGAGAAGGGCATGAATCGGGATGATCGGATCCATGGAGCCTTGTTGATCCTTAACGAGCTGGTCCGAATCAGCAGCATGGAGGGAGAGCGTCTGAGAGAAGAAATGGAAGAAATCACACAGCAGCAGCTGGTACACGACAAGTACTGCAAAGATCTCATGGGCTTCGGAACAAAACCTCGTCACATTACCCCCTTCACCAGTTTCCAGGCTGTACAGCCCCAGCAGTCAAATGCCTTGGTGGGGCTGCTGGGGTACAGCTCTCACCAAGGCCTCATGGGATTTGGGACCTCCCCCAGTCCAGCTAAGTCCACCCTGGTGGAGAGCCGGTGTTGCAGAGACTTGATGGAGGAGAAATTTGATCAGGTGTGCCAGTGGGTGCTGAAATGCAGGAATAGCAAGAACTCGCTGATCCAAATGACAATCCTTAATTTGTTGCCCCGCTTGGCTGCATTCCGACCTTCTGCCTTCACAGATACCCAGTATCTCCAAGATACCATGAACCATGTCCTAAGCTGTGTCAAGAAGGAGAAGGAACGTACAGCGGCCTTCCAAGCCCTGGGGCTACTTTCTGTGGCTGTGAGGTCTGAGTTTAAGGTCTATTTGCCTCGCGTGCTGGACATCATCCGAGCGGCCCTGCCCCCAAAGGACTTCGCCCATAAGAGGCAGAAGGCAATGCAGGTGGATGCCACAGTCTTCACTTGCATCAGCATGCTGGCTCGAGCAATGGGGCCAGGCATCCAGCAGGATATCAAGGAGCTGCTGGAGCCCATGCTGGCAGTGGGACTAAGCCCTGCCCTCACTGCAGTGCTCTACGACCTGAGCCGTCAGATTCCACAGCTAAAGAAGGACATTCAAGATGGGCTACTGAAAATGCTGTCCCTGGTCCTTATGCACAAACCCCTTCGCCACCCAGGCATGCCCAAGGGCCTGGCCCATCAGCTGGCCTCTCCTGGCCTCACGACCCTCCCTGAGGCCAGCGATGTGGGCAGCATCACTCTTGCCCTCCGAACGCTTGGCAGCTTTGAATTTGAAGGCCACTCTCTGACCCAATTTGTTCGCCACTGTGCGGATCATTTCCTGAACAGTGAGCACAAGGAGATCCGCATGGAGGCTGCCCGCACCTGCTCCCGCCTGCTCACACCCTCCATCCACCTCATCAGTGGCCATGCTCATGTGGTTAGCCAGACCGCAGTGCAAGTGGTGGCAGATGTGCTTAGCAAACTGCTCGTAGTTGGGATAACAGATCCTGACCCTGACATTCGCTACTGTGTCTTGGCGTCCCTGGACGAGCGCTTTGATGCACACCTGGCCCAGGCGGAGAACTTGCAGGCCTTGTTTGTGGCTCTGAATGACCAGGTGTTTGAGATCCGGGAGCTGGCCATCTGCACTGTGGGCCGACTCAGTAGCATGAACCCTGCCTTTGTCATGCCTTTCCTGCGCAAGATGCTCATCCAGATTTTGACAGAGTTGGAGCACAGTGGGATTGGAAGAATCAAAGAGCAGAGTGCCCGCATGCTGGGGCACCTGGTCTCCAATGCCCCCCGACTCATCCGCCCCTACATGGAGCCTATTCTGAAGGCATTAATTTTGAAACTGAAAGATCCAGACCCTGATCCAAACCCAGGTGTGATCAATAATGTCCTGGCAACAATAGGAGAATTGGCACAGGTTAGTGGCCTGGAAATGAGGAAATGGGTTGATGAACTTTTTATTATCATCATGGACATGCTCCAGGATTCCTCTTTGTTGGCCAAAAGGCAGGTGGCTCTGTGGACCCTGGGACAGTTGGTGGCCAGCACTGGCTATGTAGTAGAGCCCTACAGGAAGTACCCTACTTTGCTTGAGGTGCTACTGAATTTTCTGAAGACTGAGCAGAACCAGGGTACACGCAGAGAGGCCATCCGTGTGTTAGGGCTTTTAGGGGCTTTGGATCCTTACAAGCACAAAGTGAACATTGGCATGATAGACCAGTCCCGGGATGCCTCTGCTGTCAGCCTGTCAGAATCCAAGTCAAGTCAGGATTCCTCTGACTATAGCACTAGTGAAATGCTGGTCAACATGGGAAACTTGCCTCTGGATGAGTTCTACCCAGCTGTGTCCATGGTGGCCCTGATGCGGATCTTCCGAGACCAGTCACTCTCTCATCATCACACCATGGTTGTCCAGGCCATCACCTTCATCTTCAAGTCCCTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTCCTGCCCCAGGTCATGCCCACGTTCCTTAACGTCATTCGAGTCTGTGATGGGGCCATCCGGGAATTTTTGTTCCAGCAGCTGGGAATGTTGGTGTCCTTTGTGAAGAGCCACATCAGACCTTATATGGATGAAATAGTCACCCTCATGAGAGAATTCTGGGTCATGAACACCTCAATTCAGAGCACGATCATTCTTCTCATTGAGCAAATTGTGGTAGCTCTTGGGGGTGAATTTAAGCTCTACCTGCCCCAGCTGATCCCACACATGCTGCGTGTCTTCATGCATGACAACAGCCCAGGCCGCATTGTCTCTATCAAGTTACTGGCTGCAATCCAGCTGTTTGGCGCCAACCTGGATGACTACCTGCATTTACTGCTGCCTCCTATTGTTAAGTTGTTTGATGCCCCTGAAGCTCCACTGCCATCTCGAAAGGCAGCGCTAGAGACTGTGGACCGCCTGACGGAGTCCCTGGATTTCACTGACTATGCCTCCCGGATCATTCACCCTATTGTTCGAACACTGGACCAGAGCCCAGAACTGCGCTCCACAGCCATGGACACGCTGTCTTCACTTGTTTTTCAGCTGGGGAAGAAGTACCAAATTTTCATTCCAATGGTGAATAAAGTTCTGGTGCGACACCGAATCAATCATCAGCGCTATGATGTGCTCATCTGCAGAATTGTCAAGGGATACACACTTGCTGATGAAGAGGAGGATCCTTTGATTTACCAGCATCGGATGCTTAGGAGTGGCCAAGGGGATGCATTGGCTAGTGGACCAGTGGAAACAGGACCCATGAAGAAACTGCACGTCAGCACCATCAACCTCCAAAAGGCCTGGGGCGCTGCCAGGAGGGTCTCCAAAGATGACTGGCTGGAATGGCTGAGACGGCTGAGCCTGGAGCTGCTGAAGGACTCATCATCGCCCTCCCTGCGCTCCTGCTGGGCCCTGGCACAGGCCTACAACCCGATGGCCAGGGATCTCTTCAATGCTGCATTTGTGTCCTGCTGGTCTGAACTGAATGAAGATCAACAGGATGAGCTCATCAGAAGCATCGAGTTGGCCCTCACCTCACAAGACATCGCTGAAGTCACACAGACCCTCTTAAACTTGGCTGAATTCATGGAACACAGTGACAAGGGCCCCCTGCCACTGAGAGATGACAATGGCATTGTTCTGCTGGGTGAGAGAGCTGCCAAGTGCCGAGCATATGCCAAAGCACTACACTACAAAGAACTGGAGTTCCAGAAAGGCCCCACCCCTGCCATTCTAGAATCTCTCATCAGCATTAATAATAAGCTACAGCAGCCGGAGGCAGCGGCCGGAGTGTTAGAATATGCCATGAAACACTTTGGAGAGCTGGAGATCCAGGCTACCTGGTATGAGAAACTGCACGAGTGGGAGGATGCCCTTGTGGCCTATGACAAGAAAATGGACACCAACAAGGACGACCCAGAGCTGATGCTGGGCCGCATGCGCTGCCTCGAGGCCTTGGGGGAATGGGGTCAACTCCACCAGCAGTGCTGTGAAAAGTGGACCCTGGTTAATGATGAGACCCAAGCCAAGATGGCCCGGATGGCTGCTGCAGCTGCATGGGGTTTAGGTCAGTGGGACAGCATGGAAGAATACACCTGTATGATCCCTCGGGACACCCATGATGGGGCATTTTATAGAGCTGTGCTGGCACTGCATCAGGACCTCTTCTCCTTGGCACAACAGTGCATTGACAAGGCCAGGGACCTGCTGGATGCTGAATTAACTGCGATGGCAGGAGAGAGTTACAGTCGGGCATATGGGGCCATGGTTTCTTGCCACATGCTGTCCGAGCTGGAGGAGGTTATCCAGTACAAACTTGTCCCCGAGCGACGAGAGATCATCCGCCAGATCTGGTGGGAGAGACTGCAGGGCTGCCAGCGTATCGTAGAGGACTGGCAGAAAATCCTTATGGTGCGGTCCCTTGTGGTCAGCCCTCATGAAGACATGAGAACCTGGCTCAAGTATGCAAGCCTGTGCGGCAAGAGTGGCAGGCTGGCTCTTGCTCATAAAACTTTAGTGTTGCTCCTGGGAGTTGATCCGTCTCGGCAACTTGACCATCCTCTGCCAACAGTTCACCCTCAGGTGACCTATGCCTACATGAAAAACATGTGGAAGAGTGCCCGCAAGATCGATGCCTTCCAGCACATGCAGCATTTTGTCCAGACCATGCAGCAACAGGCCCAGCATGCCATCGCTACTGAGGACCAGCAGCATAAGCAGGAACTGCACAAGCTCATGGCCCGATGCTTCCTGAAACTTGGAGAGTGGCAGCTGAATCTACAGGGCATCAATGAGAGCACAATCCCCAAAGTGCTGCAGTACTACAGCGCCGCCACAGAGCACGACCGCAGCTGGTACAAGGCCTGGCATGCGTGGGCAGTGATGAACTTCGAAGCTGTGCTACACTACAAACATCAGAACCAAGCCCGCGATGAGAAGAAGAAACTGCGTCATGCCAGCGGGGCCAACATCACCAACGCCACCACTGCCGCCACCACGGCCGCCACTGCCACCACCACTGCCAGCACCGAGGGCAGCAACAGTGAGAGCGAGGCCGAGAGCACCGAGAACAGCCCCACCCCATCGCCGCTGCAGAAGAAGGTCACTGAGGATCTGTCCAAAACCCTCCTGATGTACACGGTGCCTGCCGTCCAGGGCTTCTTCCGTTCCATCTCCTTGTCACGAGGCAACAACCTCCAGGATACACTCAGAGTTCTCACCTTATGGTTTGATTATGGTCACTGGCCAGATGTCAATGAGGCCTTAGTGGAGGGGGTGAAAGCCATCCAGATTGATACCTGGCTACAGGTTATACCTCAGCTCATTGCAAGAATTGATACGCCCAGACCCTTGGTGGGACGTCTCATTCACCAGCTTCTCACAGACATTGGTCGGTACCACCCCCAGGCCCTCATCTACCCACTGACAGTGGCTTCTAAGTCTACCACGACAGCCCGGCACAATGCAGCCAACAAGATTCTGAAGAACATGTGTGAGCACAGCAACACCCTGGTCCAGCAGGCCATGATGGTGAGCGAGGAGCTGATCCGAGTGGCCATCCTCTGGCATGAGATGTGGCATGAAGGCCTGGAAGAGGCATCTCGTTTGTACTTTGGGGAAAGGAACGTGAAAGGCATGTTTGAGGTGCTGGAGCCCTTGCATGCTATGATGGAACGGGGCCCCCAGACTCTGAAGGAAACATCCTTTAATCAGGCCTATGGTCGAGATTTAATGGAGGCCCAAGAGTGGTGCAGGAAGTACATGAAATCAGGGAATGTCAAGGACCTCACCCAAGCCTGGGACCTCTATTATCATGTGTTCCGACGAATCTCAAAGCAGCTGCCTCAGCTCACATCCTTAGAGCTGCAATATGTTTCCCCAAAACTTCTGATGTGCCGGGACCTTGAATTGGCTGTGCCAGGAACATATGACCCCAACCAGCCAATCATTCGCATTCAGTCCATAGCACCGTCTTTGCAAGTCATCACATCCAAGCAGAGGCCCCGGAAATTGACACTTATGGGCAGCAACGGACATGAGTTTGTTTTCCTTCTAAAAGGCCATGAAGATCTGCGCCAGGATGAGCGTGTGATGCAGCTCTTCGGCCTGGTTAACACCCTTCTGGCCAATGACCCAACATCTCTTCGGAAAAACCTCAGCATCCAGAGATACGCTGTCATCCCTTTATCGACCAACTCGGGCCTCATTGGCTGGGTTCCCCACTGTGACACACTGCACGCCCTCATCCGGGACTACAGGGAGAAGAAGAAGATCCTTCTCAACATCGAGCATCGCATCATGTTGCGGATGGCTCCGGACTATGACCACTTGACTCTGATGCAGAAGGTGGAGGTGTTTGAGCATGCCGTCAATAATACAGCTGGGGACGACCTGGCCAAGCTGCTGTGGCTGAAAAGCCCCAGCTCCGAGGTGTGGTTTGACCGAAGAACCAATTATACCCGTTCTTTAGCGGTCATGTCAATGGTTGGGTATATTTTAGGCCTGGGAGATAGACACCCATCCAACCTGATGCTGGACCGTCTGAGTGGGAAGATCCTGCACATTGACTTTGGGGACTGCTTTGAGGTTGCTATGACCCGAGAGAAGTTTCCAGAGAAGATTCCATTTAGACTAACAAGAATGTTGACCAATGCTATGGAGGTTACAGGCCTGGATGGCAACTACAGAATCACATGCCACACAGTGATGGAGGTGCTGCGAGAGCACAAGGACAGTGTCATGGCCGTGCTGGAAGCCTTTGTCTATGACCCCTTGCTGAACTGGAGGCTGATGGACACAAATACCAAAGGCAACAAGCGATCCCGAACGAGGACGGATTCCTACTCTGCTGGCCAGTCAGTCGAAATTTTGGACGGTGTGGAACTTGGAGAGCCAGCCCATAAGAAAACGGGGACCACAGTGCCAGAATCTATTCATTCTTTCATTGGAGACGGTTTGGTGAAACCAGAGGCCCTAAATAAGAAAGCTATCCAGATTATTAACAGGGTTCGAGATAAGCTCACTGGTCGGGACTTCTCTCATGATGACACTTTGGATGTTCCAACGCAAGTTGAGCTGCTCATCAAACAAGCGACATCCCATGAAAACCTCTGCCAGTGCTATATTGGCTGGTGCCCTTTCTGGTAACTGGAGGCCCAGATGTGCCCATCACGTTTTTTCTGAGGCTTTTGTACTTTAGTAAATGCTTCCACTAAACTGAAACCATGGTGAGAAAGTTTGACTTTGTTAAATATTTTGAAATGTAAATGAAAAGAACTACTGTATATTAAAAGTTGGTTTGAACCAACTTTCTAGCTGCTGTTGAAGAATATATTGTCAGAAACACAAGGCTTGATTTGGTTCCCAGGACAGTGAAACATAGTAATACCACGTAAATCAAGCCATTCATTTTGGGGAACAGAAGATCCATAACTTTAGAAATACGGGTTTTGACTTAACTCACAAGAGAACTCATCATAAGTACTTGCTGATGGAAGAATGACCTAGTTGCTCCTCTCAACATGGGTACAGCAAACTCAGCACAGCCAAGAAGCCTCAGGTCGTGGAGAACATGGATTAGGATCCTAGACTGTAAAGACACAGAAGATGCTGACCTCACCCCTGCCACCTATCCCAAGACCTCACTGGTCTGTGGACAGCAGCAGAAATGTTTGCAAGATAGGCCAAAATGAGTACAAAAGGTCTGTCTTCCATCAGACCCAGTGATGCTGCGACTCACACGCTTCAATTCAAGACCTGACCGCTAGTAGGGAGGTTTATTCAGATCGCTGGCAGCCTCGGCTGAGCAGATGCACAGAGGGGATCACTGTGCAGTGGGACCACCCTCACTGGCCTTCTGCAGCAGGGTTCTGGGATGTTTTCAGTGGTCAAAATACTCTGTTTAGAGCAAGGGCTCAGAAAACAGAAATACTGTCATGGAGGTGCTGAACACAGGGAAGGTCTGGTACATATTGGAAATTATGAGCAGAACAAATACTCAACTAAATGCACAAAGTATAAAGTGTAGCCATGTCTAGACACCATGTTGTATCAGAATAATTTTTGTGCCAATAAATGACATCAGAATTTTAAACATATGTAAAAAAAAA	Мишень рапамицина у млекопитающих (MTOR) Homo sapiens, мРНК; регистрационный номер NM_004958.3
22	MSPFLRIGLSNFDCGSCQSCQGEAVNPYCAVLVKEYVESENGQMYIQKKPTMYPPWDSTFDAHINKGRVMQIIVKGKNVDLISETTVELYSLAERCRKNNGKTEIWLELKPQGRMLMNARYFLEMSDTKDMNEFETEGFFALHQRRGAIKQAKVHHVKCHEFTATFFPQPTFCSVCHEFVWGLNKQGYQCRQCNAAIHKKCIDKVIAKCTGSAINSRETMFHKERFKIDMPHRFKVYNYKSPTFCEHCGTLLWGLARQGLKCDACGMNVHHRCQTKVANLCGINQKLMAEALAMIESTQQARCLRDTEQIFREGPVEIGLPCSIKNEARPPCLPTPGKREPQGISWESPLDEVDKMCHLPEPELNKERPSLQIKLKIEDFILHKMLGKGSFGKVFLAEFKKTNQFFAIKALKKDVVLMDDDVECTMVEKRVLSLAWEHPFLTHMFCTFQTKENLFFVMEYLNGGDLMYHIQSCHKFDLSRATFYAAEIILGLQFLHSKGIVYRDLKLDNILLDKDGHIKIADFGMCKENMLGDAKTNTFCGTPDYIAPEILLGQKYNHSVDWWSFGVLLYEMLIGQSPFHGQDEEELFHSIRMDNPFYPRWLEKEAKDLLVKLFVREPEKRLGVRGDIRQHPLFREINWEELERKEIDPPFRPKVKSPFDCSNFDKEFLNEKPRLSFADRALINSMDQNMFRNFSFMNPGMERLIS	Протеинкиназа C тета человека UniProt № Q04759
23	CCGCCAGCCCCGCCAGTCCCCGCGCAGTCCCCGCGCAGTCCCCGCGCAGTCCCAGCGCCACCGGGCAGCAGCGGCGCCGTGCTCGCTCCAGGGCGCAACCATGTCGCCATTTCTTCGGATTGGCTTGTCCAACTTTGACTGCGGGTCCTGCCAGTCTTGTCAGGGCGAGGCTGTTAACCCTTACTGTGCTGTGCTCGTCAAAGAGTATGTCGAATCAGAGAACGGGCAGATGTATATCCAGAAAAAGCCTACCATGTACCCACCCTGGGACAGCACTTTTGATGCCCATATCAACAAGGGAAGAGTCATGCAGATCATTGTGAAAGGCAAAAACGTGGACCTCATCTCTGAAACCACCGTGGAGCTCTACTCGCTGGCTGAGAGGTGCAGGAAGAACAACGGGAAGACAGAAATATGGTTAGAGCTGAAACCTCAAGGCCGAATGCTAATGAATGCAAGATACTTTCTGGAAATGAGTGACACAAAGGACATGAATGAATTTGAGACGGAAGGCTTCTTTGCTTTGCATCAGCGCCGGGGTGCCATCAAGCAGGCAAAGGTCCACCACGTCAAGTGCCACGAGTTCACTGCCACCTTCTTCCCACAGCCCACATTTTGCTCTGTCTGCCACGAGTTTGTCTGGGGCCTGAACAAACAGGGCTACCAGTGCCGACAATGCAATGCAGCAATTCACAAGAAGTGTATTGATAAAGTTATAGCAAAGTGCACAGGATCAGCTATCAATAGCCGAGAAACCATGTTCCACAAGGAGAGATTCAAAATTGACATGCCACACAGATTTAAAGTCTACAATTACAAGAGCCCGACCTTCTGTGAACACTGTGGGACCCTGCTGTGGGGACTGGCACGGCAAGGACTCAAGTGTGATGCATGTGGCATGAATGTGCATCATAGATGCCAGACAAAGGTGGCCAACCTTTGTGGCATAAACCAGAAGCTAATGGCTGAAGCGCTGGCCATGATTGAGAGCACTCAACAGGCTCGCTGCTTAAGAGATACTGAACAGATCTTCAGAGAAGGTCCGGTTGAAATTGGTCTCCCATGCTCCATCAAAAATGAAGCAAGGCCGCCATGTTTACCGACACCGGGAAAAAGAGAGCCTCAGGGCATTTCCTGGGAGTCTCCGTTGGATGAGGTGGATAAAATGTGCCATCTTCCAGAACCTGAACTGAACAAAGAAAGACCATCTCTGCAGATTAAACTAAAAATTGAGGATTTTATCTTGCACAAAATGTTGGGGAAAGGAAGTTTTGGCAAGGTCTTCCTGGCAGAATTCAAGAAAACCAATCAATTTTTCGCAATAAAGGCCTTAAAGAAAGATGTGGTCTTGATGGACGATGATGTTGAGTGCACGATGGTAGAGAAGAGAGTTCTTTCCTTGGCCTGGGAGCATCCGTTTCTGACGCACATGTTTTGTACATTCCAGACCAAGGAAAACCTCTTTTTTGTGATGGAGTACCTCAACGGAGGGGACTTAATGTACCACATCCAAAGCTGCCACAAGTTCGACCTTTCCAGAGCGACGTTTTATGCTGCTGAAATCATTCTTGGTCTGCAGTTCCTTCATTCCAAAGGAATAGTCTACAGGGACCTGAAGCTAGATAACATCCTGTTAGACAAAGATGGACATATCAAGATCGCGGATTTTGGAATGTGCAAGGAGAACATGTTAGGAGATGCCAAGACGAATACCTTCTGTGGGACACCTGACTACATCGCCCCAGAGATCTTGCTGGGTCAGAAATACAACCACTCTGTGGACTGGTGGTCCTTCGGGGTTCTCCTTTATGAAATGCTGATTGGTCAGTCGCCTTTCCACGGGCAGGATGAGGAGGAGCTCTTCCACTCCATCCGCATGGACAATCCCTTTTACCCACGGTGGCTGGAGAAGGAAGCAAAGGACCTTCTGGTGAAGCTCTTCGTGCGAGAACCTGAGAAGAGGCTGGGCGTGAGGGGAGACATCCGCCAGCACCCTTTGTTTCGGGAGATCAACTGGGAGGAACTTGAACGGAAGGAGATTGACCCACCGTTCCGGCCGAAAGTGAAATCACCATTTGACTGCAGCAATTTCGACAAAGAATTCTTAAACGAGAAGCCCCGGCTGTCATTTGCCGACAGAGCACTGATCAACAGCATGGACCAGAATATGTTCAGGAACTTTTCCTTCATGAACCCCGGGATGGAGCGGCTGATATCCTGAATCTTGCCCCTCCAGAGACAGGAAAGAATTTGCCTTCTCCCTGGGAACTGGTTCAAGAGACACTGCTTGGGTTCCTTTTTCAACTTGGAAAAAGAAAGAAACACTCAACAATAAAGACTGAGACCCGTTCGCCCCCATGTGACTTTTATCTGTAGCAGAAACCAAGTCTACTTCACTAATGACGATGCCGTGTGTCTCGTCTCCTGACATGTCTCACAGACGCTCCTGAAGTTAGGTCATTACTAACCATAGTTATTTACTTGAAAGATGGGTCTCCGCACTTGGAAAGGTTTCAAGACTTGATACTGCAATAAATTATGGCTCTTCACCTGGGCGCCAACTGCTGATCAATGAAATGCTTGTTGAATCAGGGGCAAACGGAGTACAGACGTCTCAAGACTGAAACGGCCCCATTGCCTGGTCTAGTAGCGGATCTCACTCAGCCGCAGACAAGTAATCACTAACCCGTTTTATTCTATTCCTATCTGTGGATGTGTAAATGGCTGGGGGGCCAGCCCTGGATAGGTTTTTATGGGAATTCTTTACAATAAACATAGCTTGTAACTTGAGATCTACAAATCCATTCATCCTGATTGGGCATGAAATCCATGGTCAAGAGGACAAGTGGAAAGTGAGAGGGAAGGTTTGCTAGACACCTTCGCTTGTTATCTTGTCAAGATAGAAAAGATAGTATCATTTCACCCTTGCCAGTAAAAACCTTTCCATCCACCCATTCTCAGCAGACTCCAGTATTGGCACAGTCACTCACTGCCATTCTCACACTATAACAAGAAAAGAAATGAAGTGCATAAGTCTCCTGGGAAAAGAACCTTAACCCCTTCTCGTGCCATGACTGGTGATTTCATGACTCATAAGCCCCTCCGTAGGCATCATTCAAGATCAATGGCCCATGCATGCTGTTTGCAGCAGTCAATTGAGTTGAATTAGAATTCCAACCATACATTTTAAAGGTATTTGTGCTGTGTGTATATTTTGATAAAATGTTGTGACTTCATGGCAAACAGGTGGATGTGTAAAAATGGAATAAAAAAAAAAAAAGAGTCAAAAAAAAAA	Протеинкиназа C тета Homo sapiens (PRKCQ, мРНК; регистрационный номер NM_006257.4
24	AAGTCGGTCTCTATGCCGCT	Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR
25	TTGCTGCTCTACAGTTATCC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR
26	AATTTCAGCGTCAGCTACAC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR
27	AGACCGACTTAATACAGAGT	Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR
28	TCCGTTTCTTTCAGTAGGGG	Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR
29	AGTTGTCACTACAGATGCTT	Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR
30	GTCGCCGCTTAATAGCCCTC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT
31	TGATCAGATGTCTAACGATA	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT
32	GACATCAGATGTACCATCAC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT
33	CTCAGCCTATTCACAGAAAC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT
34	TGAATAGGCTGAGCTTTGTG	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT
35	GTGGAGGAGCCATTGTCCAG	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT
36	MAEDKSKRDSIEMSMKGCQTNNGFVHNEDILEQTPDPGSSTDNLKHSTRGILGSQEPDFKGVQPYAGMPKEVLFQFSGQARYRIPREILFWLTVASVLVLIAATIAIIALSPKCLDWWQEGPMYQIYPRSFKDSNKDGNGDLKGIQDKLDYITALNIKTVWITSFYKSSLKDFRYGVEDFREVDPIFGTMEDFENLVAAIHDKGLKLIIDFIPNHTSDKHIWFQLSRTRTGKYTDYYIWHDCTHENGKTIPPNNWLSVYGNSSWHFDEVRNQCYFHQFMKEQPDLNFRNPDVQEEIKEILRFWLTKGVDGFSLDAVKFLLEAKHLRDEIQVNKTQIPDTVTQYSELYHDFTTTQVGMHDIVRSFRQTMDQYSTEPGRYRFMGTEAYAESIDRTVMYYGLPFIQEADFPFNNYLSMLDTVSGNSVYEVITSWMENMPEGKWPNWMIGGPDSSRLTSRLGNQYVNVMNMLLFTLPGTPITYYGEEIGMGNIVAANLNESYDINTLRSKSPMQWDNSSNAGFSEASNTWLPTNSDYHTVNVDVQKTQPRSALKLYQDLSLLHANELLLNRGWFCHLRNDSHYVVYTRELDGIDRIFIVVLNFGESTLLNLHNMISGLPAKMRIRLSTNSADKGSKVDTSGIFLDKGEGLIFEHNTKNLLHRQTAFRDRCFVSNRACYSSVLNILYTSC	Транспортер нейтральных и основных аминокислот rBAT человека (SLC3A1), изоформа 1 Uniprot № Q07837
37	MELQPPEASIAVVSIPRQLPGSHSEAGVQGLSAGDDSELGSHCVAQTGLELLASGDPLPSASQNAEMIETGSDCVTQAGLQLLASSDPPALASKNAEVTGTMSQDTEVDMKEVELNELEPEKQPMNAASGAAMSLAGAEKNGLVKIKVAEDEAEAAAAAKFTGLSKEELLKVAGSPGWVRTRWALLLLFWLGWLGMLAGAVVIIVRAPRCRELPAQKWWHTGALYRIGDLQAFQGHGAGNLAGLKGRLDYLSSLKVKGLVLGPIHKNQKDDVAQTDLLQIDPNFGSKEDFDSLLQSAKKKSIRVILDLTPNYRGENSWFSTQVDTVATKVKDALEFWLQAGVDGFQVRDIENLKDASSFLAEWQNITKGFSEDRLLIAGTNSSDLQQILSLLESNKDLLLTSSYLSDSGSTGEHTKSLVTQYLNATGNRWCSWSLSQARLLTSFLPAQLLRLYQLMLFTLPGTPVFSYGDEIGLDAAALPGQPMEAPVMLWDESSFPDIPGAVSANMTVKGQSEDPGSLLSLFRRLSDQRSKERSLLHGDFHAFSAGPGLFSYIRHWDQNERFLVVLNFGDVGLSAGLQASDLPASASLPAKADLLLSTQPGREEGSPLELERLKLEPHEGLLLRFPYAA	Антиген поверхности клетки 4F2 человека Тяжелая цепь (CD98hc; SLC3A2), изоформа 1 Uniprot P08195
38	MAGAGPKRRALAAPAAEEKEEAREKMLAAKSADGSAPAGEGEGVTLQRNITLLNGVAIIVGTIIGSGIFVTPTGVLKEAGSPGLALVVWAACGVFSIVGALCYAELGTTISKSGGDYAYMLEVYGSLPAFLKLWIELLIIRPSSQYIVALVFATYLLKPLFPTCPVPEEAAKLVACLCVLLLTAVNCYSVKAATRVQDAFAAAKLLALALIILLGFVQIGKGDVSNLDPNFSFEGTKLDVGNIVLALYSGLFAYGGWNYLNFVTEEMINPYRNLPLAIIISLPIVTLVYVLTNLAYFTTLSTEQMLSSEAVAVDFGNYHLGVMSWIIPVFVGLSCFGSVNGSLFTSSRLFFVGSREGHLPSILSMIHPQLLTPVPSLVFTCVMTLLYAFSKDIFSVINFFSFFNWLCVALAIIGMIWLRHRKPELERPIKVNLALPVFFILACLFLIAVSFWKTPVECGIGFTIILSGLPVYFFGVWWKNKPKWLLQGIFSTTVLCQKLMQVVPQET	Малая субъединица транспортера крупных нейтральных аминокислот человека 1 (LAT1; SLC7A5), изоформа 1 Uniprot № Q01650
39	MEEGARHRNNTEKKHPGGGESDASPEAGSGGGGVALKKEIGLVSACGIIVGNIIGSGIFVSPKGVLENAGSVGLALIVWIVTGFITVVGALCYAELGVTIPKSGGDYSYVKDIFGGLAGFLRLWIAVLVIYPTNQAVIALTFSNYVLQPLFPTCFPPESGLRLLAAICLLLLTWVNCSSVRWATRVQDIFTAGKLLALALIIIMGIVQICKGEYFWLEPKNAFENFQEPDIGLVALAFLQGSFAYGGWNFLNYVTEELVDPYKNLPRAIFISIPLVTFVYVFANVAYVTAMSPQELLASNAVAVTFGEKLLGVMAWIMPISVALSTFGGVNGSLFTSSRLFFAGAREGHLPSVLAMIHVKRCTPIPALLFTCISTLLMLVTSDMYTLINYVGFINYLFYGVTVAGQIVLRWKKPDIPRPIKINLLFPIIYLLFWAFLLVFSLWSEPVVCGIGLAIMLTGVPVYFLGVYWQHKPKCFSDFIELLTLVSQKMCVVVYPEVERGSGTEEANEDMEEQQQPMYQPTPTKDKDVAGQPQP	Малая субъединица транспортера крупных нейтральных аминокислот человека 2 (LAT2; SLC7A8), изоформа 1 Uniprot № Q9UHI5
40	MAGHTQQPSGRGNPRPAPSPSPVPGTVPGASERVALKKEIGLLSACTIIIGNIIGSGIFISPKGVLEHSGSVGLALFVWVLGGGVTALGSLCYAELGVAIPKSGGDYAYVTEIFGGLAGFLLLWSAVLIMYPTSLAVISMTFSNYVLQPVFPNCIPPTTASRVLSMACLMLLTWVNSSSVRWATRIQDMFTGGKLLALSLIIGVGLLQIFQGHFEELRPSNAFAFWMTPSVGHLALAFLQGSFAFSGWNFLNYVTEEMVDARKNLPRAIFISIPLVTFVYTFTNIAYFTAMSPQELLSSNAVAVTFGEKLLGYFSWVMPVSVALSTFGGINGYLFTYSRLCFSGAREGHLPSLLAMIHVRHCTPIPALLVCCGATAVIMLVGDTYTLINYVSFINYLCYGVTILGLLLLRWRRPALHRPIKVNLLIPVAYLVFWAFLLVFSFISEPMVCGVGVIIILTGVPIFFLGVFWRSKPKCVHRLTESMTHWGQELCFVVYPQDAPEEEENGPCPPSLLPATDKPSKPQ	Транспортер аминокислот Asc-типа 1 человека (Asc-1; SLC7A10), изоформа 1 Uniprot № Q9NS82
41	MDKLKCPSFFKCREKEKVSASSENFHVGENDENQDRGNWSKKSDYLLSMIGYAVGLGNVWRFPYLTYSNGGGAFLIPYAIMLALAGLPLFFLECSLGQFASLGPVSVWRILPLFQGVGITMVLISIFVTIYYNVIIAYSLYYMFASFQSELPWKNCSSWSDKNCSRSPIVTHCNVSTVNKGIQEIIQMNKSWVDINNFTCINGSEIYQPGQLPSEQYWNKVALQRSSGMNETGVIVWYLALCLLLAWLIVGAALFKGIKSSGKVVYFTALFPYVVLLILLVRGATLEGASKGISYYIGAQSNFTKLKEAEVWKDAATQIFYSLSVAWGGLVALSSYNKFKNNCFSDAIVVCLTNCLTSVFAGFAIFSILGHMAHISGKEVSQVVKSGFDLAFIAYPEALAQLPGGPFWSILFFFMLLTLGLDSQFASIETITTTIQDLFPKVMKKMRVPITLGCCLVLFLLGLVCVTQAGIYWVHLIDHFCAGWGILIAAILELVGIIWIYGGNRFIEDTEMMIGAKRWIFWLWWRACWFVITPILLIAIFIWSLVQFHRPNYGAIPYPDWGVALGWCMIVFCIIWIPIMAIIKIIQAKGNIFQRLISCCRPASNWGPYLEQHRGERYKDMVDPKKEADHEIPTVSGSRKPE	Натрий- и хлор-зависимый транспортер нейтральных и основных аминокислот B(0+) человека (ATB0,+; SLC6A14), изоформа 1 Uniprot № Q9UN76
42	MVRLVLPNPGLDARIPSLAELETIEQEEASSRPKWDNKAQYMLTCLGFCVGLGNVWRFPYLCQSHGGGAFMIPFLILLVLEGIPLLYLEFAIGQRLRRGSLGVWSSIHPALKGLGLASMLTSFMVGLYYNTIISWIMWYLFNSFQEPLPWSDCPLNENQTGYVDECARSSPVDYFWYRETLNISTSISDSGSIQWWMLLCLACAWSVLYMCTIRGIETTGKAVYITSTLPYVVLTIFLIRGLTLKGATNGIVFLFTPNVTELAQPDTWLDAGAQVFFSFSLAFGGLISFSSYNSVHNNCEKDSVIVSIINGFTSVYVAIVVYSVIGFRATQRYDDCFSTNILTLINGFDLPEGNVTQENFVDMQQRCNASDPAAYAQLVFQTCDINAFLSEAVEGTGLAFIVFTEAITKMPLSPLWSVLFFIMLFCLGLSSMFGNMEGVVVPLQDLRVIPPKWPKEVLTGLICLGTFLIGFIFTLNSGQYWLSLLDSYAGSIPLLIIAFCEMFSVVYVYGVDRFNKDIEFMIGHKPNIFWQVTWRVVSPLLMLIIFLFFFVVEVSQELTYSIWDPGYEEFPKSQKISYPNWVYVVVVIVAGVPSLTIPGYAIYKLIRNHCQKPGDHQGLVSTLSTASMNGDLKY	Натрий-зависимый транспортер нейтральных аминокислот B(0)AT1 человека (B(0)AT1; SLC6A19), изоформа 1 Uniprot № Q695T7
43	MVLSQEEPDSARGTSEAQPLGPAPTGAAPPPGPGPSDSPEAAVEKVEVELAGPATAEPHEPPEPPEGGWGWLVMLAAMWCNGSVFGIQNACGVLFVSMLETFGSKDDDKMVFKTAWVGSLSMGMIFFCCPIVSVFTDLFGCRKTAVVGAAVGFVGLMSSSFVSSIEPLYLTYGIIFACGCSFAYQPSLVILGHYFKKRLGLVNGIVTAGSSVFTILLPLLLRVLIDSVGLFYTLRVLCIFMFVLFLAGFTYRPLATSTKDKESGGSGSSLFSRKKFSPPKKIFNFAIFKVTAYAVWAVGIPLALFGYFVPYVHLMKHVNERFQDEKNKEVVLMCIGVTSGVGRLLFGRIADYVPGVKKVYLQVLSFFFIGLMSMMIPLCSIFGALIAVCLIMGLFDGCFISIMAPIAFELVGAQDVSQAIGFLLGFMSIPMTVGPPIAGLLRDKLGSYDVAFYLAGVPPLIGGAVLCFIPWIHSKKQREISKTTGKEKMEKMLENQNSLLSSSSGMFKKESDSII	Транспортер монокарбоксилата 10 человека (TAT1; SLC16A10), изоформа 1 Uniprot № Q8TF71
44	MEAAATPAAAGAARREELDMDVMRPLINEQNFDGTSDEEHEQELLPVQKHYQLDDQEGISFVQTLMHLLKGNIGTGLLGLPLAIKNAGIVLGPISLVFIGIISVHCMHILVRCSHFLCLRFKKSTLGYSDTVSFAMEVSPWSCLQKQAAWGRSVVDFFLVITQLGFCSVYIVFLAENVKQVHEGFLESKVFISNSTNSSNPCERRSVDLRIYMLCFLPFIILLVFIRELKNLFVLSFLANVSMAVSLVIIYQYVVRNMPDPHNLPIVAGWKKYPLFFGTAVFAFEGIGVVLPLENQMKESKRFPQALNIGMGIVTTLYVTLATLGYMCFHDEIKGSITLNLPQDVWLYQSVKILYSFGIFVTYSIQFYVPAEIIIPGITSKFHTKWKQICEFGIRSFLVSITCAGAILIPRLDIVISFVGAVSSSTLALILPPLVEILTFSKEHYNIWMVLKNISIAFTGVVGFLLGTYITVEEIIYPTPKVVAGTPQSPFLNLNSTCLTSGLK	Протонный транспортер аминокислот 4 человека (PAT4; SLC36A4), изоформа 1 Uniprot № Q6YBV0
45	EGRGSLLTCGDVEENPGP	T2A
46	GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP	P2A
47	ATNFSLLKQAGDVEENPGP	P2A
48	QCTNYALLKLAGDVESNPGP	E2A
49	VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP	F2A
50	CGCTGAGAAATGACTGCACG	Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2
51	CATATACTTCTTCACCAGTT	Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2
52	ATGTACTCACACATCTGGAT	Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2
53	TTAGGTGATGATCTTTGAAC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2
54	TACCTCCCCACAGTGTTTCT	Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2
55	AAAATCTCGCCTAGAAGAAC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2
56	CCGAGCTCTGATTGACCGAA	Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP
57	AGGAAATCGAGCGCCTGACC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP
58	CCAGCTGGACAGTGTCCCGA	Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP
59	CTCTTGCAGGTCCTCATACC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP
60	GCGAGTCGCCTCTACTTCCC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP
61	GGCTGGAAAGCAGCGCATGA	Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP
62	AGGATCGTAAGGTTTGGGAC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4
63	TAATAAGCAGCCCCCCCAGA	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4
64	CCACTCACCCTTGCTGTTGT	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4
65	TCTCTTAGATGATTACCTGG	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4
66	GCAACGTAAGCAGTGTAGTC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4
67	TTTGCAGAGGATGCCTTCTC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4
68	CAGGCTGTCAAAATTCGAGC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha
69	CATTCTTCGTCATGTTGCTG	Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha
70	GTACTTGTCATCAAAGACCC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha
71	GTAAAAGAAGCCCTAAGAGC	Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha
72	GACCAGAGACCCATCTATTT	Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha
73	TACAGAAAACATGCCCATTA	Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Juno Therapeutics, Inc.

Ports, Michael

Thomas, Evan P

Levitsky, Hyam I

<120> СПОСОБЫ ИММУНОТЕРАПИИ И КОМПОЗИЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ МОДУЛЯТОРЫ

МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПУТИ ТРИПТОФАНА

<130> 735042007540

<150> US 62/407,776

<151> 2016-10-13

<150> US 62/514,767

<151> 2017-06-02

<160> 73

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер, полученный из шарнирной области IgG4 Homo Sapiens

<400> 1

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер, полученный из шарнирной области IgG4 Homo sapiens

<400> 2

gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36

<210> 3

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер шарнирная область-CH3, полученный из Homo sapiens

<400> 3

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg

1 5 10 15

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

20 25 30

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

35 40 45

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

50 55 60

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

65 70 75 80

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

85 90 95

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

100 105 110

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

115

<210> 4

<211> 229

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Спейсер шарнирная область-CH2-CH3, полученный из Homo sapiens

<400> 4

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 5

<211> 282

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IgD-шарнирная область-Fc Homo sapiens

<400> 5

Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala

1 5 10 15

Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys

35 40 45

Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln

65 70 75 80

Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly

85 90 95

Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val

100 105 110

Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly

115 120 125

Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn

130 135 140

Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro

145 150 155 160

Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys

165 170 175

Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser

180 185 190

Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu

195 200 205

Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro

210 215 220

Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser

225 230 235 240

Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr

245 250 255

Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg

260 265 270

Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His

275 280

<210> 6

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность T2A

<400> 6

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

20

<210> 7

<211> 335

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность tEGFR

<400> 7

Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile

20 25 30

Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe

35 40 45

Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr

50 55 60

Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn

65 70 75 80

Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg

85 90 95

Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile

100 105 110

Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val

115 120 125

Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp

130 135 140

Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn

145 150 155 160

Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu

165 170 175

Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser

180 185 190

Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu

195 200 205

Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln

210 215 220

Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly

225 230 235 240

Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro

245 250 255

His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr

260 265 270

Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His

275 280 285

Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro

290 295 300

Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala

305 310 315 320

Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met

325 330 335

<210> 8

<211> 27

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> CD28 (аминокислоты 153-179 из Регистрационного номера P10747) Homo sapiens

<400> 8

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 9

<211> 66

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> CD28 (аминокислоты 114-179 из Регистрационного номера P10747) Homo sapiens

<400> 9

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

50 55 60

Trp Val

65

<210> 10

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> CD28 (аминокислоты 180-220 из P10747) Homo sapiens

<400> 10

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 11

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD28 (LL в GG) Homo sapiens

<400> 11

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 12

<211> 42

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 4-1BB (аминокислоты 214-из Q07011.1) Homo sapiens

<400> 12

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 13

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> CD3-дзета Homo sapiens

<400> 13

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 14

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> CD3-дзета Homo sapiens

<400> 14

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 15

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> CD3-дзета Homo sapiens

<400> 15

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 16

Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro

20 25 30

<210> 17

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 17

Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 18

<211> 1368

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus pyogenes

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Cas9 S. Pyogenes Q99ZW2

<400> 18

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1010 1015 1020

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

1025 1030 1035

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1040 1045 1050

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

1055 1060 1065

Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

1070 1075 1080

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

1085 1090 1095

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys

1100 1105 1110

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

1115 1120 1125

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

1130 1135 1140

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

1145 1150 1155

Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1160 1165 1170

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1175 1180 1185

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1190 1195 1200

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly

1205 1210 1215

Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

1250 1255 1260

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

1265 1270 1275

Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

1280 1285 1290

Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

1295 1300 1305

Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala

1310 1315 1320

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

1325 1330 1335

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

1340 1345 1350

Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

<210> 19

<211> 1368

<212> БЕЛОК

<213> Streptococcus pyogenes

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Cas9 S. Pyogenes D10A

<400> 19

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1010 1015 1020

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

1025 1030 1035

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1040 1045 1050

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

1055 1060 1065

Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

1070 1075 1080

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

1085 1090 1095

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys

1100 1105 1110

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

1115 1120 1125

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

1130 1135 1140

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

1145 1150 1155

Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1160 1165 1170

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1175 1180 1185

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1190 1195 1200

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly

1205 1210 1215

Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

1250 1255 1260

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

1265 1270 1275

Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

1280 1285 1290

Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

1295 1300 1305

Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala

1310 1315 1320

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

1325 1330 1335

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

1340 1345 1350

Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

<210> 20

<211> 2549

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> MTOR_HUMAN серин/треониновая протеинкиназа mTOR; UniProt № P42345

<400> 20

Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser

1 5 10 15

Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Lys Ser Arg

20 25 30

Asn Glu Glu Thr Arg Ala Lys Ala Ala Lys Glu Leu Gln His Tyr Val

35 40 45

Thr Met Glu Leu Arg Glu Met Ser Gln Glu Glu Ser Thr Arg Phe Tyr

50 55 60

Asp Gln Leu Asn His His Ile Phe Glu Leu Val Ser Ser Ser Asp Ala

65 70 75 80

Asn Glu Arg Lys Gly Gly Ile Leu Ala Ile Ala Ser Leu Ile Gly Val

85 90 95

Glu Gly Gly Asn Ala Thr Arg Ile Gly Arg Phe Ala Asn Tyr Leu Arg

100 105 110

Asn Leu Leu Pro Ser Asn Asp Pro Val Val Met Glu Met Ala Ser Lys

115 120 125

Ala Ile Gly Arg Leu Ala Met Ala Gly Asp Thr Phe Thr Ala Glu Tyr

130 135 140

Val Glu Phe Glu Val Lys Arg Ala Leu Glu Trp Leu Gly Ala Asp Arg

145 150 155 160

Asn Glu Gly Arg Arg His Ala Ala Val Leu Val Leu Arg Glu Leu Ala

165 170 175

Ile Ser Val Pro Thr Phe Phe Phe Gln Gln Val Gln Pro Phe Phe Asp

180 185 190

Asn Ile Phe Val Ala Val Trp Asp Pro Lys Gln Ala Ile Arg Glu Gly

195 200 205

Ala Val Ala Ala Leu Arg Ala Cys Leu Ile Leu Thr Thr Gln Arg Glu

210 215 220

Pro Lys Glu Met Gln Lys Pro Gln Trp Tyr Arg His Thr Phe Glu Glu

225 230 235 240

Ala Glu Lys Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Lys Glu Lys Gly Met Asn

245 250 255

Arg Asp Asp Arg Ile His Gly Ala Leu Leu Ile Leu Asn Glu Leu Val

260 265 270

Arg Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Glu Met Glu Glu

275 280 285

Ile Thr Gln Gln Gln Leu Val His Asp Lys Tyr Cys Lys Asp Leu Met

290 295 300

Gly Phe Gly Thr Lys Pro Arg His Ile Thr Pro Phe Thr Ser Phe Gln

305 310 315 320

Ala Val Gln Pro Gln Gln Ser Asn Ala Leu Val Gly Leu Leu Gly Tyr

325 330 335

Ser Ser His Gln Gly Leu Met Gly Phe Gly Thr Ser Pro Ser Pro Ala

340 345 350

Lys Ser Thr Leu Val Glu Ser Arg Cys Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu

355 360 365

Lys Phe Asp Gln Val Cys Gln Trp Val Leu Lys Cys Arg Asn Ser Lys

370 375 380

Asn Ser Leu Ile Gln Met Thr Ile Leu Asn Leu Leu Pro Arg Leu Ala

385 390 395 400

Ala Phe Arg Pro Ser Ala Phe Thr Asp Thr Gln Tyr Leu Gln Asp Thr

405 410 415

Met Asn His Val Leu Ser Cys Val Lys Lys Glu Lys Glu Arg Thr Ala

420 425 430

Ala Phe Gln Ala Leu Gly Leu Leu Ser Val Ala Val Arg Ser Glu Phe

435 440 445

Lys Val Tyr Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Pro

450 455 460

Pro Lys Asp Phe Ala His Lys Arg Gln Lys Ala Met Gln Val Asp Ala

465 470 475 480

Thr Val Phe Thr Cys Ile Ser Met Leu Ala Arg Ala Met Gly Pro Gly

485 490 495

Ile Gln Gln Asp Ile Lys Glu Leu Leu Glu Pro Met Leu Ala Val Gly

500 505 510

Leu Ser Pro Ala Leu Thr Ala Val Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Ile

515 520 525

Pro Gln Leu Lys Lys Asp Ile Gln Asp Gly Leu Leu Lys Met Leu Ser

530 535 540

Leu Val Leu Met His Lys Pro Leu Arg His Pro Gly Met Pro Lys Gly

545 550 555 560

Leu Ala His Gln Leu Ala Ser Pro Gly Leu Thr Thr Leu Pro Glu Ala

565 570 575

Ser Asp Val Gly Ser Ile Thr Leu Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Phe

580 585 590

Glu Phe Glu Gly His Ser Leu Thr Gln Phe Val Arg His Cys Ala Asp

595 600 605

His Phe Leu Asn Ser Glu His Lys Glu Ile Arg Met Glu Ala Ala Arg

610 615 620

Thr Cys Ser Arg Leu Leu Thr Pro Ser Ile His Leu Ile Ser Gly His

625 630 635 640

Ala His Val Val Ser Gln Thr Ala Val Gln Val Val Ala Asp Val Leu

645 650 655

Ser Lys Leu Leu Val Val Gly Ile Thr Asp Pro Asp Pro Asp Ile Arg

660 665 670

Tyr Cys Val Leu Ala Ser Leu Asp Glu Arg Phe Asp Ala His Leu Ala

675 680 685

Gln Ala Glu Asn Leu Gln Ala Leu Phe Val Ala Leu Asn Asp Gln Val

690 695 700

Phe Glu Ile Arg Glu Leu Ala Ile Cys Thr Val Gly Arg Leu Ser Ser

705 710 715 720

Met Asn Pro Ala Phe Val Met Pro Phe Leu Arg Lys Met Leu Ile Gln

725 730 735

Ile Leu Thr Glu Leu Glu His Ser Gly Ile Gly Arg Ile Lys Glu Gln

740 745 750

Ser Ala Arg Met Leu Gly His Leu Val Ser Asn Ala Pro Arg Leu Ile

755 760 765

Arg Pro Tyr Met Glu Pro Ile Leu Lys Ala Leu Ile Leu Lys Leu Lys

770 775 780

Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asn Pro Gly Val Ile Asn Asn Val Leu Ala

785 790 795 800

Thr Ile Gly Glu Leu Ala Gln Val Ser Gly Leu Glu Met Arg Lys Trp

805 810 815

Val Asp Glu Leu Phe Ile Ile Ile Met Asp Met Leu Gln Asp Ser Ser

820 825 830

Leu Leu Ala Lys Arg Gln Val Ala Leu Trp Thr Leu Gly Gln Leu Val

835 840 845

Ala Ser Thr Gly Tyr Val Val Glu Pro Tyr Arg Lys Tyr Pro Thr Leu

850 855 860

Leu Glu Val Leu Leu Asn Phe Leu Lys Thr Glu Gln Asn Gln Gly Thr

865 870 875 880

Arg Arg Glu Ala Ile Arg Val Leu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Asp Pro

885 890 895

Tyr Lys His Lys Val Asn Ile Gly Met Ile Asp Gln Ser Arg Asp Ala

900 905 910

Ser Ala Val Ser Leu Ser Glu Ser Lys Ser Ser Gln Asp Ser Ser Asp

915 920 925

Tyr Ser Thr Ser Glu Met Leu Val Asn Met Gly Asn Leu Pro Leu Asp

930 935 940

Glu Phe Tyr Pro Ala Val Ser Met Val Ala Leu Met Arg Ile Phe Arg

945 950 955 960

Asp Gln Ser Leu Ser His His His Thr Met Val Val Gln Ala Ile Thr

965 970 975

Phe Ile Phe Lys Ser Leu Gly Leu Lys Cys Val Gln Phe Leu Pro Gln

980 985 990

Val Met Pro Thr Phe Leu Asn Val Ile Arg Val Cys Asp Gly Ala Ile

995 1000 1005

Arg Glu Phe Leu Phe Gln Gln Leu Gly Met Leu Val Ser Phe Val

1010 1015 1020

Lys Ser His Ile Arg Pro Tyr Met Asp Glu Ile Val Thr Leu Met

1025 1030 1035

Arg Glu Phe Trp Val Met Asn Thr Ser Ile Gln Ser Thr Ile Ile

1040 1045 1050

Leu Leu Ile Glu Gln Ile Val Val Ala Leu Gly Gly Glu Phe Lys

1055 1060 1065

Leu Tyr Leu Pro Gln Leu Ile Pro His Met Leu Arg Val Phe Met

1070 1075 1080

His Asp Asn Ser Pro Gly Arg Ile Val Ser Ile Lys Leu Leu Ala

1085 1090 1095

Ala Ile Gln Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asp Asp Tyr Leu His Leu

1100 1105 1110

Leu Leu Pro Pro Ile Val Lys Leu Phe Asp Ala Pro Glu Ala Pro

1115 1120 1125

Leu Pro Ser Arg Lys Ala Ala Leu Glu Thr Val Asp Arg Leu Thr

1130 1135 1140

Glu Ser Leu Asp Phe Thr Asp Tyr Ala Ser Arg Ile Ile His Pro

1145 1150 1155

Ile Val Arg Thr Leu Asp Gln Ser Pro Glu Leu Arg Ser Thr Ala

1160 1165 1170

Met Asp Thr Leu Ser Ser Leu Val Phe Gln Leu Gly Lys Lys Tyr

1175 1180 1185

Gln Ile Phe Ile Pro Met Val Asn Lys Val Leu Val Arg His Arg

1190 1195 1200

Ile Asn His Gln Arg Tyr Asp Val Leu Ile Cys Arg Ile Val Lys

1205 1210 1215

Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Glu Glu Glu Asp Pro Leu Ile Tyr Gln

1220 1225 1230

His Arg Met Leu Arg Ser Gly Gln Gly Asp Ala Leu Ala Ser Gly

1235 1240 1245

Pro Val Glu Thr Gly Pro Met Lys Lys Leu His Val Ser Thr Ile

1250 1255 1260

Asn Leu Gln Lys Ala Trp Gly Ala Ala Arg Arg Val Ser Lys Asp

1265 1270 1275

Asp Trp Leu Glu Trp Leu Arg Arg Leu Ser Leu Glu Leu Leu Lys

1280 1285 1290

Asp Ser Ser Ser Pro Ser Leu Arg Ser Cys Trp Ala Leu Ala Gln

1295 1300 1305

Ala Tyr Asn Pro Met Ala Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ala Phe Val

1310 1315 1320

Ser Cys Trp Ser Glu Leu Asn Glu Asp Gln Gln Asp Glu Leu Ile

1325 1330 1335

Arg Ser Ile Glu Leu Ala Leu Thr Ser Gln Asp Ile Ala Glu Val

1340 1345 1350

Thr Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Glu Phe Met Glu His Ser Asp

1355 1360 1365

Lys Gly Pro Leu Pro Leu Arg Asp Asp Asn Gly Ile Val Leu Leu

1370 1375 1380

Gly Glu Arg Ala Ala Lys Cys Arg Ala Tyr Ala Lys Ala Leu His

1385 1390 1395

Tyr Lys Glu Leu Glu Phe Gln Lys Gly Pro Thr Pro Ala Ile Leu

1400 1405 1410

Glu Ser Leu Ile Ser Ile Asn Asn Lys Leu Gln Gln Pro Glu Ala

1415 1420 1425

Ala Ala Gly Val Leu Glu Tyr Ala Met Lys His Phe Gly Glu Leu

1430 1435 1440

Glu Ile Gln Ala Thr Trp Tyr Glu Lys Leu His Glu Trp Glu Asp

1445 1450 1455

Ala Leu Val Ala Tyr Asp Lys Lys Met Asp Thr Asn Lys Asp Asp

1460 1465 1470

Pro Glu Leu Met Leu Gly Arg Met Arg Cys Leu Glu Ala Leu Gly

1475 1480 1485

Glu Trp Gly Gln Leu His Gln Gln Cys Cys Glu Lys Trp Thr Leu

1490 1495 1500

Val Asn Asp Glu Thr Gln Ala Lys Met Ala Arg Met Ala Ala Ala

1505 1510 1515

Ala Ala Trp Gly Leu Gly Gln Trp Asp Ser Met Glu Glu Tyr Thr

1520 1525 1530

Cys Met Ile Pro Arg Asp Thr His Asp Gly Ala Phe Tyr Arg Ala

1535 1540 1545

Val Leu Ala Leu His Gln Asp Leu Phe Ser Leu Ala Gln Gln Cys

1550 1555 1560

Ile Asp Lys Ala Arg Asp Leu Leu Asp Ala Glu Leu Thr Ala Met

1565 1570 1575

Ala Gly Glu Ser Tyr Ser Arg Ala Tyr Gly Ala Met Val Ser Cys

1580 1585 1590

His Met Leu Ser Glu Leu Glu Glu Val Ile Gln Tyr Lys Leu Val

1595 1600 1605

Pro Glu Arg Arg Glu Ile Ile Arg Gln Ile Trp Trp Glu Arg Leu

1610 1615 1620

Gln Gly Cys Gln Arg Ile Val Glu Asp Trp Gln Lys Ile Leu Met

1625 1630 1635

Val Arg Ser Leu Val Val Ser Pro His Glu Asp Met Arg Thr Trp

1640 1645 1650

Leu Lys Tyr Ala Ser Leu Cys Gly Lys Ser Gly Arg Leu Ala Leu

1655 1660 1665

Ala His Lys Thr Leu Val Leu Leu Leu Gly Val Asp Pro Ser Arg

1670 1675 1680

Gln Leu Asp His Pro Leu Pro Thr Val His Pro Gln Val Thr Tyr

1685 1690 1695

Ala Tyr Met Lys Asn Met Trp Lys Ser Ala Arg Lys Ile Asp Ala

1700 1705 1710

Phe Gln His Met Gln His Phe Val Gln Thr Met Gln Gln Gln Ala

1715 1720 1725

Gln His Ala Ile Ala Thr Glu Asp Gln Gln His Lys Gln Glu Leu

1730 1735 1740

His Lys Leu Met Ala Arg Cys Phe Leu Lys Leu Gly Glu Trp Gln

1745 1750 1755

Leu Asn Leu Gln Gly Ile Asn Glu Ser Thr Ile Pro Lys Val Leu

1760 1765 1770

Gln Tyr Tyr Ser Ala Ala Thr Glu His Asp Arg Ser Trp Tyr Lys

1775 1780 1785

Ala Trp His Ala Trp Ala Val Met Asn Phe Glu Ala Val Leu His

1790 1795 1800

Tyr Lys His Gln Asn Gln Ala Arg Asp Glu Lys Lys Lys Leu Arg

1805 1810 1815

His Ala Ser Gly Ala Asn Ile Thr Asn Ala Thr Thr Ala Ala Thr

1820 1825 1830

Thr Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ser Thr Glu Gly Ser Asn

1835 1840 1845

Ser Glu Ser Glu Ala Glu Ser Thr Glu Asn Ser Pro Thr Pro Ser

1850 1855 1860

Pro Leu Gln Lys Lys Val Thr Glu Asp Leu Ser Lys Thr Leu Leu

1865 1870 1875

Met Tyr Thr Val Pro Ala Val Gln Gly Phe Phe Arg Ser Ile Ser

1880 1885 1890

Leu Ser Arg Gly Asn Asn Leu Gln Asp Thr Leu Arg Val Leu Thr

1895 1900 1905

Leu Trp Phe Asp Tyr Gly His Trp Pro Asp Val Asn Glu Ala Leu

1910 1915 1920

Val Glu Gly Val Lys Ala Ile Gln Ile Asp Thr Trp Leu Gln Val

1925 1930 1935

Ile Pro Gln Leu Ile Ala Arg Ile Asp Thr Pro Arg Pro Leu Val

1940 1945 1950

Gly Arg Leu Ile His Gln Leu Leu Thr Asp Ile Gly Arg Tyr His

1955 1960 1965

Pro Gln Ala Leu Ile Tyr Pro Leu Thr Val Ala Ser Lys Ser Thr

1970 1975 1980

Thr Thr Ala Arg His Asn Ala Ala Asn Lys Ile Leu Lys Asn Met

1985 1990 1995

Cys Glu His Ser Asn Thr Leu Val Gln Gln Ala Met Met Val Ser

2000 2005 2010

Glu Glu Leu Ile Arg Val Ala Ile Leu Trp His Glu Met Trp His

2015 2020 2025

Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn

2030 2035 2040

Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met

2045 2050 2055

Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala

2060 2065 2070

Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr

2075 2080 2085

Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu

2090 2095 2100

Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Gln Leu Pro Gln Leu

2105 2110 2115

Thr Ser Leu Glu Leu Gln Tyr Val Ser Pro Lys Leu Leu Met Cys

2120 2125 2130

Arg Asp Leu Glu Leu Ala Val Pro Gly Thr Tyr Asp Pro Asn Gln

2135 2140 2145

Pro Ile Ile Arg Ile Gln Ser Ile Ala Pro Ser Leu Gln Val Ile

2150 2155 2160

Thr Ser Lys Gln Arg Pro Arg Lys Leu Thr Leu Met Gly Ser Asn

2165 2170 2175

Gly His Glu Phe Val Phe Leu Leu Lys Gly His Glu Asp Leu Arg

2180 2185 2190

Gln Asp Glu Arg Val Met Gln Leu Phe Gly Leu Val Asn Thr Leu

2195 2200 2205

Leu Ala Asn Asp Pro Thr Ser Leu Arg Lys Asn Leu Ser Ile Gln

2210 2215 2220

Arg Tyr Ala Val Ile Pro Leu Ser Thr Asn Ser Gly Leu Ile Gly

2225 2230 2235

Trp Val Pro His Cys Asp Thr Leu His Ala Leu Ile Arg Asp Tyr

2240 2245 2250

Arg Glu Lys Lys Lys Ile Leu Leu Asn Ile Glu His Arg Ile Met

2255 2260 2265

Leu Arg Met Ala Pro Asp Tyr Asp His Leu Thr Leu Met Gln Lys

2270 2275 2280

Val Glu Val Phe Glu His Ala Val Asn Asn Thr Ala Gly Asp Asp

2285 2290 2295

Leu Ala Lys Leu Leu Trp Leu Lys Ser Pro Ser Ser Glu Val Trp

2300 2305 2310

Phe Asp Arg Arg Thr Asn Tyr Thr Arg Ser Leu Ala Val Met Ser

2315 2320 2325

Met Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu Gly Asp Arg His Pro Ser Asn

2330 2335 2340

Leu Met Leu Asp Arg Leu Ser Gly Lys Ile Leu His Ile Asp Phe

2345 2350 2355

Gly Asp Cys Phe Glu Val Ala Met Thr Arg Glu Lys Phe Pro Glu

2360 2365 2370

Lys Ile Pro Phe Arg Leu Thr Arg Met Leu Thr Asn Ala Met Glu

2375 2380 2385

Val Thr Gly Leu Asp Gly Asn Tyr Arg Ile Thr Cys His Thr Val

2390 2395 2400

Met Glu Val Leu Arg Glu His Lys Asp Ser Val Met Ala Val Leu

2405 2410 2415

Glu Ala Phe Val Tyr Asp Pro Leu Leu Asn Trp Arg Leu Met Asp

2420 2425 2430

Thr Asn Thr Lys Gly Asn Lys Arg Ser Arg Thr Arg Thr Asp Ser

2435 2440 2445

Tyr Ser Ala Gly Gln Ser Val Glu Ile Leu Asp Gly Val Glu Leu

2450 2455 2460

Gly Glu Pro Ala His Lys Lys Thr Gly Thr Thr Val Pro Glu Ser

2465 2470 2475

Ile His Ser Phe Ile Gly Asp Gly Leu Val Lys Pro Glu Ala Leu

2480 2485 2490

Asn Lys Lys Ala Ile Gln Ile Ile Asn Arg Val Arg Asp Lys Leu

2495 2500 2505

Thr Gly Arg Asp Phe Ser His Asp Asp Thr Leu Asp Val Pro Thr

2510 2515 2520

Gln Val Glu Leu Leu Ile Lys Gln Ala Thr Ser His Glu Asn Leu

2525 2530 2535

Cys Gln Cys Tyr Ile Gly Trp Cys Pro Phe Trp

2540 2545

<210> 21

<211> 8733

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> Мишень рапамицина в клетках млекопитающих (MTOR) Homo sapiens, мРНК;

Регистрационный номер NM_004958.3

<400> 21

gctcccggct tagaggacag cggggaaggc gggcggtggg gcagggggcc tgaagcggcg 60

gtaccggtgc tggcggcggc agctgaggcc ttggccgaag ccgcgcgaac ctcagggcaa 120

gatgcttgga accggacctg ccgccgccac caccgctgcc accacatcta gcaatgtgag 180

cgtcctgcag cagtttgcca gtggcctaaa gagccggaat gaggaaacca gggccaaagc 240

cgccaaggag ctccagcact atgtcaccat ggaactccga gagatgagtc aagaggagtc 300

tactcgcttc tatgaccaac tgaaccatca catttttgaa ttggtttcca gctcagatgc 360

caatgagagg aaaggtggca tcttggccat agctagcctc ataggagtgg aaggtgggaa 420

tgccacccga attggcagat ttgccaacta tcttcggaac ctcctcccct ccaatgaccc 480

agttgtcatg gaaatggcat ccaaggccat tggccgtctt gccatggcag gggacacttt 540

taccgctgag tacgtggaat ttgaggtgaa gcgagccctg gaatggctgg gtgctgaccg 600

caatgagggc cggagacatg cagctgtcct ggttctccgt gagctggcca tcagcgtccc 660

taccttcttc ttccagcaag tgcaaccctt ctttgacaac atttttgtgg ccgtgtggga 720

ccccaaacag gccatccgtg agggagctgt agccgccctt cgtgcctgtc tgattctcac 780

aacccagcgt gagccgaagg agatgcagaa gcctcagtgg tacaggcaca catttgaaga 840

agcagagaag ggatttgatg agaccttggc caaagagaag ggcatgaatc gggatgatcg 900

gatccatgga gccttgttga tccttaacga gctggtccga atcagcagca tggagggaga 960

gcgtctgaga gaagaaatgg aagaaatcac acagcagcag ctggtacacg acaagtactg 1020

caaagatctc atgggcttcg gaacaaaacc tcgtcacatt acccccttca ccagtttcca 1080

ggctgtacag ccccagcagt caaatgcctt ggtggggctg ctggggtaca gctctcacca 1140

aggcctcatg ggatttggga cctcccccag tccagctaag tccaccctgg tggagagccg 1200

gtgttgcaga gacttgatgg aggagaaatt tgatcaggtg tgccagtggg tgctgaaatg 1260

caggaatagc aagaactcgc tgatccaaat gacaatcctt aatttgttgc cccgcttggc 1320

tgcattccga ccttctgcct tcacagatac ccagtatctc caagatacca tgaaccatgt 1380

cctaagctgt gtcaagaagg agaaggaacg tacagcggcc ttccaagccc tggggctact 1440

ttctgtggct gtgaggtctg agtttaaggt ctatttgcct cgcgtgctgg acatcatccg 1500

agcggccctg cccccaaagg acttcgccca taagaggcag aaggcaatgc aggtggatgc 1560

cacagtcttc acttgcatca gcatgctggc tcgagcaatg gggccaggca tccagcagga 1620

tatcaaggag ctgctggagc ccatgctggc agtgggacta agccctgccc tcactgcagt 1680

gctctacgac ctgagccgtc agattccaca gctaaagaag gacattcaag atgggctact 1740

gaaaatgctg tccctggtcc ttatgcacaa accccttcgc cacccaggca tgcccaaggg 1800

cctggcccat cagctggcct ctcctggcct cacgaccctc cctgaggcca gcgatgtggg 1860

cagcatcact cttgccctcc gaacgcttgg cagctttgaa tttgaaggcc actctctgac 1920

ccaatttgtt cgccactgtg cggatcattt cctgaacagt gagcacaagg agatccgcat 1980

ggaggctgcc cgcacctgct cccgcctgct cacaccctcc atccacctca tcagtggcca 2040

tgctcatgtg gttagccaga ccgcagtgca agtggtggca gatgtgctta gcaaactgct 2100

cgtagttggg ataacagatc ctgaccctga cattcgctac tgtgtcttgg cgtccctgga 2160

cgagcgcttt gatgcacacc tggcccaggc ggagaacttg caggccttgt ttgtggctct 2220

gaatgaccag gtgtttgaga tccgggagct ggccatctgc actgtgggcc gactcagtag 2280

catgaaccct gcctttgtca tgcctttcct gcgcaagatg ctcatccaga ttttgacaga 2340

gttggagcac agtgggattg gaagaatcaa agagcagagt gcccgcatgc tggggcacct 2400

ggtctccaat gccccccgac tcatccgccc ctacatggag cctattctga aggcattaat 2460

tttgaaactg aaagatccag accctgatcc aaacccaggt gtgatcaata atgtcctggc 2520

aacaatagga gaattggcac aggttagtgg cctggaaatg aggaaatggg ttgatgaact 2580

ttttattatc atcatggaca tgctccagga ttcctctttg ttggccaaaa ggcaggtggc 2640

tctgtggacc ctgggacagt tggtggccag cactggctat gtagtagagc cctacaggaa 2700

gtaccctact ttgcttgagg tgctactgaa ttttctgaag actgagcaga accagggtac 2760

acgcagagag gccatccgtg tgttagggct tttaggggct ttggatcctt acaagcacaa 2820

agtgaacatt ggcatgatag accagtcccg ggatgcctct gctgtcagcc tgtcagaatc 2880

caagtcaagt caggattcct ctgactatag cactagtgaa atgctggtca acatgggaaa 2940

cttgcctctg gatgagttct acccagctgt gtccatggtg gccctgatgc ggatcttccg 3000

agaccagtca ctctctcatc atcacaccat ggttgtccag gccatcacct tcatcttcaa 3060

gtccctggga ctcaaatgtg tgcagttcct gccccaggtc atgcccacgt tccttaacgt 3120

cattcgagtc tgtgatgggg ccatccggga atttttgttc cagcagctgg gaatgttggt 3180

gtcctttgtg aagagccaca tcagacctta tatggatgaa atagtcaccc tcatgagaga 3240

attctgggtc atgaacacct caattcagag cacgatcatt cttctcattg agcaaattgt 3300

ggtagctctt gggggtgaat ttaagctcta cctgccccag ctgatcccac acatgctgcg 3360

tgtcttcatg catgacaaca gcccaggccg cattgtctct atcaagttac tggctgcaat 3420

ccagctgttt ggcgccaacc tggatgacta cctgcattta ctgctgcctc ctattgttaa 3480

gttgtttgat gcccctgaag ctccactgcc atctcgaaag gcagcgctag agactgtgga 3540

ccgcctgacg gagtccctgg atttcactga ctatgcctcc cggatcattc accctattgt 3600

tcgaacactg gaccagagcc cagaactgcg ctccacagcc atggacacgc tgtcttcact 3660

tgtttttcag ctggggaaga agtaccaaat tttcattcca atggtgaata aagttctggt 3720

gcgacaccga atcaatcatc agcgctatga tgtgctcatc tgcagaattg tcaagggata 3780

cacacttgct gatgaagagg aggatccttt gatttaccag catcggatgc ttaggagtgg 3840

ccaaggggat gcattggcta gtggaccagt ggaaacagga cccatgaaga aactgcacgt 3900

cagcaccatc aacctccaaa aggcctgggg cgctgccagg agggtctcca aagatgactg 3960

gctggaatgg ctgagacggc tgagcctgga gctgctgaag gactcatcat cgccctccct 4020

gcgctcctgc tgggccctgg cacaggccta caacccgatg gccagggatc tcttcaatgc 4080

tgcatttgtg tcctgctggt ctgaactgaa tgaagatcaa caggatgagc tcatcagaag 4140

catcgagttg gccctcacct cacaagacat cgctgaagtc acacagaccc tcttaaactt 4200

ggctgaattc atggaacaca gtgacaaggg ccccctgcca ctgagagatg acaatggcat 4260

tgttctgctg ggtgagagag ctgccaagtg ccgagcatat gccaaagcac tacactacaa 4320

agaactggag ttccagaaag gccccacccc tgccattcta gaatctctca tcagcattaa 4380

taataagcta cagcagccgg aggcagcggc cggagtgtta gaatatgcca tgaaacactt 4440

tggagagctg gagatccagg ctacctggta tgagaaactg cacgagtggg aggatgccct 4500

tgtggcctat gacaagaaaa tggacaccaa caaggacgac ccagagctga tgctgggccg 4560

catgcgctgc ctcgaggcct tgggggaatg gggtcaactc caccagcagt gctgtgaaaa 4620

gtggaccctg gttaatgatg agacccaagc caagatggcc cggatggctg ctgcagctgc 4680

atggggttta ggtcagtggg acagcatgga agaatacacc tgtatgatcc ctcgggacac 4740

ccatgatggg gcattttata gagctgtgct ggcactgcat caggacctct tctccttggc 4800

acaacagtgc attgacaagg ccagggacct gctggatgct gaattaactg cgatggcagg 4860

agagagttac agtcgggcat atggggccat ggtttcttgc cacatgctgt ccgagctgga 4920

ggaggttatc cagtacaaac ttgtccccga gcgacgagag atcatccgcc agatctggtg 4980

ggagagactg cagggctgcc agcgtatcgt agaggactgg cagaaaatcc ttatggtgcg 5040

gtcccttgtg gtcagccctc atgaagacat gagaacctgg ctcaagtatg caagcctgtg 5100

cggcaagagt ggcaggctgg ctcttgctca taaaacttta gtgttgctcc tgggagttga 5160

tccgtctcgg caacttgacc atcctctgcc aacagttcac cctcaggtga cctatgccta 5220

catgaaaaac atgtggaaga gtgcccgcaa gatcgatgcc ttccagcaca tgcagcattt 5280

tgtccagacc atgcagcaac aggcccagca tgccatcgct actgaggacc agcagcataa 5340

gcaggaactg cacaagctca tggcccgatg cttcctgaaa cttggagagt ggcagctgaa 5400

tctacagggc atcaatgaga gcacaatccc caaagtgctg cagtactaca gcgccgccac 5460

agagcacgac cgcagctggt acaaggcctg gcatgcgtgg gcagtgatga acttcgaagc 5520

tgtgctacac tacaaacatc agaaccaagc ccgcgatgag aagaagaaac tgcgtcatgc 5580

cagcggggcc aacatcacca acgccaccac tgccgccacc acggccgcca ctgccaccac 5640

cactgccagc accgagggca gcaacagtga gagcgaggcc gagagcaccg agaacagccc 5700

caccccatcg ccgctgcaga agaaggtcac tgaggatctg tccaaaaccc tcctgatgta 5760

cacggtgcct gccgtccagg gcttcttccg ttccatctcc ttgtcacgag gcaacaacct 5820

ccaggataca ctcagagttc tcaccttatg gtttgattat ggtcactggc cagatgtcaa 5880

tgaggcctta gtggaggggg tgaaagccat ccagattgat acctggctac aggttatacc 5940

tcagctcatt gcaagaattg atacgcccag acccttggtg ggacgtctca ttcaccagct 6000

tctcacagac attggtcggt accaccccca ggccctcatc tacccactga cagtggcttc 6060

taagtctacc acgacagccc ggcacaatgc agccaacaag attctgaaga acatgtgtga 6120

gcacagcaac accctggtcc agcaggccat gatggtgagc gaggagctga tccgagtggc 6180

catcctctgg catgagatgt ggcatgaagg cctggaagag gcatctcgtt tgtactttgg 6240

ggaaaggaac gtgaaaggca tgtttgaggt gctggagccc ttgcatgcta tgatggaacg 6300

gggcccccag actctgaagg aaacatcctt taatcaggcc tatggtcgag atttaatgga 6360

ggcccaagag tggtgcagga agtacatgaa atcagggaat gtcaaggacc tcacccaagc 6420

ctgggacctc tattatcatg tgttccgacg aatctcaaag cagctgcctc agctcacatc 6480

cttagagctg caatatgttt ccccaaaact tctgatgtgc cgggaccttg aattggctgt 6540

gccaggaaca tatgacccca accagccaat cattcgcatt cagtccatag caccgtcttt 6600

gcaagtcatc acatccaagc agaggccccg gaaattgaca cttatgggca gcaacggaca 6660

tgagtttgtt ttccttctaa aaggccatga agatctgcgc caggatgagc gtgtgatgca 6720

gctcttcggc ctggttaaca cccttctggc caatgaccca acatctcttc ggaaaaacct 6780

cagcatccag agatacgctg tcatcccttt atcgaccaac tcgggcctca ttggctgggt 6840

tccccactgt gacacactgc acgccctcat ccgggactac agggagaaga agaagatcct 6900

tctcaacatc gagcatcgca tcatgttgcg gatggctccg gactatgacc acttgactct 6960

gatgcagaag gtggaggtgt ttgagcatgc cgtcaataat acagctgggg acgacctggc 7020

caagctgctg tggctgaaaa gccccagctc cgaggtgtgg tttgaccgaa gaaccaatta 7080

tacccgttct ttagcggtca tgtcaatggt tgggtatatt ttaggcctgg gagatagaca 7140

cccatccaac ctgatgctgg accgtctgag tgggaagatc ctgcacattg actttgggga 7200

ctgctttgag gttgctatga cccgagagaa gtttccagag aagattccat ttagactaac 7260

aagaatgttg accaatgcta tggaggttac aggcctggat ggcaactaca gaatcacatg 7320

ccacacagtg atggaggtgc tgcgagagca caaggacagt gtcatggccg tgctggaagc 7380

ctttgtctat gaccccttgc tgaactggag gctgatggac acaaatacca aaggcaacaa 7440

gcgatcccga acgaggacgg attcctactc tgctggccag tcagtcgaaa ttttggacgg 7500

tgtggaactt ggagagccag cccataagaa aacggggacc acagtgccag aatctattca 7560

ttctttcatt ggagacggtt tggtgaaacc agaggcccta aataagaaag ctatccagat 7620

tattaacagg gttcgagata agctcactgg tcgggacttc tctcatgatg acactttgga 7680

tgttccaacg caagttgagc tgctcatcaa acaagcgaca tcccatgaaa acctctgcca 7740

gtgctatatt ggctggtgcc ctttctggta actggaggcc cagatgtgcc catcacgttt 7800

tttctgaggc ttttgtactt tagtaaatgc ttccactaaa ctgaaaccat ggtgagaaag 7860

tttgactttg ttaaatattt tgaaatgtaa atgaaaagaa ctactgtata ttaaaagttg 7920

gtttgaacca actttctagc tgctgttgaa gaatatattg tcagaaacac aaggcttgat 7980

ttggttccca ggacagtgaa acatagtaat accacgtaaa tcaagccatt cattttgggg 8040

aacagaagat ccataacttt agaaatacgg gttttgactt aactcacaag agaactcatc 8100

ataagtactt gctgatggaa gaatgaccta gttgctcctc tcaacatggg tacagcaaac 8160

tcagcacagc caagaagcct caggtcgtgg agaacatgga ttaggatcct agactgtaaa 8220

gacacagaag atgctgacct cacccctgcc acctatccca agacctcact ggtctgtgga 8280

cagcagcaga aatgtttgca agataggcca aaatgagtac aaaaggtctg tcttccatca 8340

gacccagtga tgctgcgact cacacgcttc aattcaagac ctgaccgcta gtagggaggt 8400

ttattcagat cgctggcagc ctcggctgag cagatgcaca gaggggatca ctgtgcagtg 8460

ggaccaccct cactggcctt ctgcagcagg gttctgggat gttttcagtg gtcaaaatac 8520

tctgtttaga gcaagggctc agaaaacaga aatactgtca tggaggtgct gaacacaggg 8580

aaggtctggt acatattgga aattatgagc agaacaaata ctcaactaaa tgcacaaagt 8640

ataaagtgta gccatgtcta gacaccatgt tgtatcagaa taatttttgt gccaataaat 8700

gacatcagaa ttttaaacat atgtaaaaaa aaa 8733

<210> 22

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> HUMAN Протеинкиназа C тета, UniProt № Q04759

<400> 22

Met Ser Pro Phe Leu Arg Ile Gly Leu Ser Asn Phe Asp Cys Gly Ser

1 5 10 15

Cys Gln Ser Cys Gln Gly Glu Ala Val Asn Pro Tyr Cys Ala Val Leu

20 25 30

Val Lys Glu Tyr Val Glu Ser Glu Asn Gly Gln Met Tyr Ile Gln Lys

35 40 45

Lys Pro Thr Met Tyr Pro Pro Trp Asp Ser Thr Phe Asp Ala His Ile

50 55 60

Asn Lys Gly Arg Val Met Gln Ile Ile Val Lys Gly Lys Asn Val Asp

65 70 75 80

Leu Ile Ser Glu Thr Thr Val Glu Leu Tyr Ser Leu Ala Glu Arg Cys

85 90 95

Arg Lys Asn Asn Gly Lys Thr Glu Ile Trp Leu Glu Leu Lys Pro Gln

100 105 110

Gly Arg Met Leu Met Asn Ala Arg Tyr Phe Leu Glu Met Ser Asp Thr

115 120 125

Lys Asp Met Asn Glu Phe Glu Thr Glu Gly Phe Phe Ala Leu His Gln

130 135 140

Arg Arg Gly Ala Ile Lys Gln Ala Lys Val His His Val Lys Cys His

145 150 155 160

Glu Phe Thr Ala Thr Phe Phe Pro Gln Pro Thr Phe Cys Ser Val Cys

165 170 175

His Glu Phe Val Trp Gly Leu Asn Lys Gln Gly Tyr Gln Cys Arg Gln

180 185 190

Cys Asn Ala Ala Ile His Lys Lys Cys Ile Asp Lys Val Ile Ala Lys

195 200 205

Cys Thr Gly Ser Ala Ile Asn Ser Arg Glu Thr Met Phe His Lys Glu

210 215 220

Arg Phe Lys Ile Asp Met Pro His Arg Phe Lys Val Tyr Asn Tyr Lys

225 230 235 240

Ser Pro Thr Phe Cys Glu His Cys Gly Thr Leu Leu Trp Gly Leu Ala

245 250 255

Arg Gln Gly Leu Lys Cys Asp Ala Cys Gly Met Asn Val His His Arg

260 265 270

Cys Gln Thr Lys Val Ala Asn Leu Cys Gly Ile Asn Gln Lys Leu Met

275 280 285

Ala Glu Ala Leu Ala Met Ile Glu Ser Thr Gln Gln Ala Arg Cys Leu

290 295 300

Arg Asp Thr Glu Gln Ile Phe Arg Glu Gly Pro Val Glu Ile Gly Leu

305 310 315 320

Pro Cys Ser Ile Lys Asn Glu Ala Arg Pro Pro Cys Leu Pro Thr Pro

325 330 335

Gly Lys Arg Glu Pro Gln Gly Ile Ser Trp Glu Ser Pro Leu Asp Glu

340 345 350

Val Asp Lys Met Cys His Leu Pro Glu Pro Glu Leu Asn Lys Glu Arg

355 360 365

Pro Ser Leu Gln Ile Lys Leu Lys Ile Glu Asp Phe Ile Leu His Lys

370 375 380

Met Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Phe Lys

385 390 395 400

Lys Thr Asn Gln Phe Phe Ala Ile Lys Ala Leu Lys Lys Asp Val Val

405 410 415

Leu Met Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu

420 425 430

Ser Leu Ala Trp Glu His Pro Phe Leu Thr His Met Phe Cys Thr Phe

435 440 445

Gln Thr Lys Glu Asn Leu Phe Phe Val Met Glu Tyr Leu Asn Gly Gly

450 455 460

Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Ser Cys His Lys Phe Asp Leu Ser Arg

465 470 475 480

Ala Thr Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ile Leu Gly Leu Gln Phe Leu His

485 490 495

Ser Lys Gly Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Ile Leu Leu

500 505 510

Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu

515 520 525

Asn Met Leu Gly Asp Ala Lys Thr Asn Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp

530 535 540

Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Leu Leu Gly Gln Lys Tyr Asn His Ser Val

545 550 555 560

Asp Trp Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ile Gly Gln

565 570 575

Ser Pro Phe His Gly Gln Asp Glu Glu Glu Leu Phe His Ser Ile Arg

580 585 590

Met Asp Asn Pro Phe Tyr Pro Arg Trp Leu Glu Lys Glu Ala Lys Asp

595 600 605

Leu Leu Val Lys Leu Phe Val Arg Glu Pro Glu Lys Arg Leu Gly Val

610 615 620

Arg Gly Asp Ile Arg Gln His Pro Leu Phe Arg Glu Ile Asn Trp Glu

625 630 635 640

Glu Leu Glu Arg Lys Glu Ile Asp Pro Pro Phe Arg Pro Lys Val Lys

645 650 655

Ser Pro Phe Asp Cys Ser Asn Phe Asp Lys Glu Phe Leu Asn Glu Lys

660 665 670

Pro Arg Leu Ser Phe Ala Asp Arg Ala Leu Ile Asn Ser Met Asp Gln

675 680 685

Asn Met Phe Arg Asn Phe Ser Phe Met Asn Pro Gly Met Glu Arg Leu

690 695 700

Ile Ser

705

<210> 23

<211> 3295

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> Протеинкиназа C тета Homo sapiens (PRKCQ), мРНК; Регистрационный номер

NM_006257.4

<400> 23

ccgccagccc cgccagtccc cgcgcagtcc ccgcgcagtc cccgcgcagt cccagcgcca 60

ccgggcagca gcggcgccgt gctcgctcca gggcgcaacc atgtcgccat ttcttcggat 120

tggcttgtcc aactttgact gcgggtcctg ccagtcttgt cagggcgagg ctgttaaccc 180

ttactgtgct gtgctcgtca aagagtatgt cgaatcagag aacgggcaga tgtatatcca 240

gaaaaagcct accatgtacc caccctggga cagcactttt gatgcccata tcaacaaggg 300

aagagtcatg cagatcattg tgaaaggcaa aaacgtggac ctcatctctg aaaccaccgt 360

ggagctctac tcgctggctg agaggtgcag gaagaacaac gggaagacag aaatatggtt 420

agagctgaaa cctcaaggcc gaatgctaat gaatgcaaga tactttctgg aaatgagtga 480

cacaaaggac atgaatgaat ttgagacgga aggcttcttt gctttgcatc agcgccgggg 540

tgccatcaag caggcaaagg tccaccacgt caagtgccac gagttcactg ccaccttctt 600

cccacagccc acattttgct ctgtctgcca cgagtttgtc tggggcctga acaaacaggg 660

ctaccagtgc cgacaatgca atgcagcaat tcacaagaag tgtattgata aagttatagc 720

aaagtgcaca ggatcagcta tcaatagccg agaaaccatg ttccacaagg agagattcaa 780

aattgacatg ccacacagat ttaaagtcta caattacaag agcccgacct tctgtgaaca 840

ctgtgggacc ctgctgtggg gactggcacg gcaaggactc aagtgtgatg catgtggcat 900

gaatgtgcat catagatgcc agacaaaggt ggccaacctt tgtggcataa accagaagct 960

aatggctgaa gcgctggcca tgattgagag cactcaacag gctcgctgct taagagatac 1020

tgaacagatc ttcagagaag gtccggttga aattggtctc ccatgctcca tcaaaaatga 1080

agcaaggccg ccatgtttac cgacaccggg aaaaagagag cctcagggca tttcctggga 1140

gtctccgttg gatgaggtgg ataaaatgtg ccatcttcca gaacctgaac tgaacaaaga 1200

aagaccatct ctgcagatta aactaaaaat tgaggatttt atcttgcaca aaatgttggg 1260

gaaaggaagt tttggcaagg tcttcctggc agaattcaag aaaaccaatc aatttttcgc 1320

aataaaggcc ttaaagaaag atgtggtctt gatggacgat gatgttgagt gcacgatggt 1380

agagaagaga gttctttcct tggcctggga gcatccgttt ctgacgcaca tgttttgtac 1440

attccagacc aaggaaaacc tcttttttgt gatggagtac ctcaacggag gggacttaat 1500

gtaccacatc caaagctgcc acaagttcga cctttccaga gcgacgtttt atgctgctga 1560

aatcattctt ggtctgcagt tccttcattc caaaggaata gtctacaggg acctgaagct 1620

agataacatc ctgttagaca aagatggaca tatcaagatc gcggattttg gaatgtgcaa 1680

ggagaacatg ttaggagatg ccaagacgaa taccttctgt gggacacctg actacatcgc 1740

cccagagatc ttgctgggtc agaaatacaa ccactctgtg gactggtggt ccttcggggt 1800

tctcctttat gaaatgctga ttggtcagtc gcctttccac gggcaggatg aggaggagct 1860

cttccactcc atccgcatgg acaatccctt ttacccacgg tggctggaga aggaagcaaa 1920

ggaccttctg gtgaagctct tcgtgcgaga acctgagaag aggctgggcg tgaggggaga 1980

catccgccag caccctttgt ttcgggagat caactgggag gaacttgaac ggaaggagat 2040

tgacccaccg ttccggccga aagtgaaatc accatttgac tgcagcaatt tcgacaaaga 2100

attcttaaac gagaagcccc ggctgtcatt tgccgacaga gcactgatca acagcatgga 2160

ccagaatatg ttcaggaact tttccttcat gaaccccggg atggagcggc tgatatcctg 2220

aatcttgccc ctccagagac aggaaagaat ttgccttctc cctgggaact ggttcaagag 2280

acactgcttg ggttcctttt tcaacttgga aaaagaaaga aacactcaac aataaagact 2340

gagacccgtt cgcccccatg tgacttttat ctgtagcaga aaccaagtct acttcactaa 2400

tgacgatgcc gtgtgtctcg tctcctgaca tgtctcacag acgctcctga agttaggtca 2460

ttactaacca tagttattta cttgaaagat gggtctccgc acttggaaag gtttcaagac 2520

ttgatactgc aataaattat ggctcttcac ctgggcgcca actgctgatc aatgaaatgc 2580

ttgttgaatc aggggcaaac ggagtacaga cgtctcaaga ctgaaacggc cccattgcct 2640

ggtctagtag cggatctcac tcagccgcag acaagtaatc actaacccgt tttattctat 2700

tcctatctgt ggatgtgtaa atggctgggg ggccagccct ggataggttt ttatgggaat 2760

tctttacaat aaacatagct tgtaacttga gatctacaaa tccattcatc ctgattgggc 2820

atgaaatcca tggtcaagag gacaagtgga aagtgagagg gaaggtttgc tagacacctt 2880

cgcttgttat cttgtcaaga tagaaaagat agtatcattt cacccttgcc agtaaaaacc 2940

tttccatcca cccattctca gcagactcca gtattggcac agtcactcac tgccattctc 3000

acactataac aagaaaagaa atgaagtgca taagtctcct gggaaaagaa ccttaacccc 3060

ttctcgtgcc atgactggtg atttcatgac tcataagccc ctccgtaggc atcattcaag 3120

atcaatggcc catgcatgct gtttgcagca gtcaattgag ttgaattaga attccaacca 3180

tacattttaa aggtatttgt gctgtgtgta tattttgata aaatgttgtg acttcatggc 3240

aaacaggtgg atgtgtaaaa atggaataaa aaaaaaaaaa gagtcaaaaa aaaaa 3295

<210> 24

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR

<400> 24

aagtcggtct ctatgccgct 20

<210> 25

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR

<400> 25

ttgctgctct acagttatcc 20

<210> 26

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR

<400> 26

aatttcagcg tcagctacac 20

<210> 27

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR

<400> 27

agaccgactt aatacagagt 20

<210> 28

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR

<400> 28

tccgtttctt tcagtagggg 20

<210> 29

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR AHR

<400> 29

agttgtcact acagatgctt 20

<210> 30

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT

<400> 30

gtcgccgctt aatagccctc 20

<210> 31

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT

<400> 31

tgatcagatg tctaacgata 20

<210> 32

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT

<400> 32

gacatcagat gtaccatcac 20

<210> 33

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT

<400> 33

ctcagcctat tcacagaaac 20

<210> 34

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT

<400> 34

tgaataggct gagctttgtg 20

<210> 35

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ARNT

<400> 35

gtggaggagc cattgtccag 20

<210> 36

<211> 685

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Транспортер нейтральных и основных аминокислот человека rBAT (SLC3A1),

изоформа 1, Uniprot № Q07837

<400> 36

Met Ala Glu Asp Lys Ser Lys Arg Asp Ser Ile Glu Met Ser Met Lys

1 5 10 15

Gly Cys Gln Thr Asn Asn Gly Phe Val His Asn Glu Asp Ile Leu Glu

20 25 30

Gln Thr Pro Asp Pro Gly Ser Ser Thr Asp Asn Leu Lys His Ser Thr

35 40 45

Arg Gly Ile Leu Gly Ser Gln Glu Pro Asp Phe Lys Gly Val Gln Pro

50 55 60

Tyr Ala Gly Met Pro Lys Glu Val Leu Phe Gln Phe Ser Gly Gln Ala

65 70 75 80

Arg Tyr Arg Ile Pro Arg Glu Ile Leu Phe Trp Leu Thr Val Ala Ser

85 90 95

Val Leu Val Leu Ile Ala Ala Thr Ile Ala Ile Ile Ala Leu Ser Pro

100 105 110

Lys Cys Leu Asp Trp Trp Gln Glu Gly Pro Met Tyr Gln Ile Tyr Pro

115 120 125

Arg Ser Phe Lys Asp Ser Asn Lys Asp Gly Asn Gly Asp Leu Lys Gly

130 135 140

Ile Gln Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Thr Ala Leu Asn Ile Lys Thr Val

145 150 155 160

Trp Ile Thr Ser Phe Tyr Lys Ser Ser Leu Lys Asp Phe Arg Tyr Gly

165 170 175

Val Glu Asp Phe Arg Glu Val Asp Pro Ile Phe Gly Thr Met Glu Asp

180 185 190

Phe Glu Asn Leu Val Ala Ala Ile His Asp Lys Gly Leu Lys Leu Ile

195 200 205

Ile Asp Phe Ile Pro Asn His Thr Ser Asp Lys His Ile Trp Phe Gln

210 215 220

Leu Ser Arg Thr Arg Thr Gly Lys Tyr Thr Asp Tyr Tyr Ile Trp His

225 230 235 240

Asp Cys Thr His Glu Asn Gly Lys Thr Ile Pro Pro Asn Asn Trp Leu

245 250 255

Ser Val Tyr Gly Asn Ser Ser Trp His Phe Asp Glu Val Arg Asn Gln

260 265 270

Cys Tyr Phe His Gln Phe Met Lys Glu Gln Pro Asp Leu Asn Phe Arg

275 280 285

Asn Pro Asp Val Gln Glu Glu Ile Lys Glu Ile Leu Arg Phe Trp Leu

290 295 300

Thr Lys Gly Val Asp Gly Phe Ser Leu Asp Ala Val Lys Phe Leu Leu

305 310 315 320

Glu Ala Lys His Leu Arg Asp Glu Ile Gln Val Asn Lys Thr Gln Ile

325 330 335

Pro Asp Thr Val Thr Gln Tyr Ser Glu Leu Tyr His Asp Phe Thr Thr

340 345 350

Thr Gln Val Gly Met His Asp Ile Val Arg Ser Phe Arg Gln Thr Met

355 360 365

Asp Gln Tyr Ser Thr Glu Pro Gly Arg Tyr Arg Phe Met Gly Thr Glu

370 375 380

Ala Tyr Ala Glu Ser Ile Asp Arg Thr Val Met Tyr Tyr Gly Leu Pro

385 390 395 400

Phe Ile Gln Glu Ala Asp Phe Pro Phe Asn Asn Tyr Leu Ser Met Leu

405 410 415

Asp Thr Val Ser Gly Asn Ser Val Tyr Glu Val Ile Thr Ser Trp Met

420 425 430

Glu Asn Met Pro Glu Gly Lys Trp Pro Asn Trp Met Ile Gly Gly Pro

435 440 445

Asp Ser Ser Arg Leu Thr Ser Arg Leu Gly Asn Gln Tyr Val Asn Val

450 455 460

Met Asn Met Leu Leu Phe Thr Leu Pro Gly Thr Pro Ile Thr Tyr Tyr

465 470 475 480

Gly Glu Glu Ile Gly Met Gly Asn Ile Val Ala Ala Asn Leu Asn Glu

485 490 495

Ser Tyr Asp Ile Asn Thr Leu Arg Ser Lys Ser Pro Met Gln Trp Asp

500 505 510

Asn Ser Ser Asn Ala Gly Phe Ser Glu Ala Ser Asn Thr Trp Leu Pro

515 520 525

Thr Asn Ser Asp Tyr His Thr Val Asn Val Asp Val Gln Lys Thr Gln

530 535 540

Pro Arg Ser Ala Leu Lys Leu Tyr Gln Asp Leu Ser Leu Leu His Ala

545 550 555 560

Asn Glu Leu Leu Leu Asn Arg Gly Trp Phe Cys His Leu Arg Asn Asp

565 570 575

Ser His Tyr Val Val Tyr Thr Arg Glu Leu Asp Gly Ile Asp Arg Ile

580 585 590

Phe Ile Val Val Leu Asn Phe Gly Glu Ser Thr Leu Leu Asn Leu His

595 600 605

Asn Met Ile Ser Gly Leu Pro Ala Lys Met Arg Ile Arg Leu Ser Thr

610 615 620

Asn Ser Ala Asp Lys Gly Ser Lys Val Asp Thr Ser Gly Ile Phe Leu

625 630 635 640

Asp Lys Gly Glu Gly Leu Ile Phe Glu His Asn Thr Lys Asn Leu Leu

645 650 655

His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Asp Arg Cys Phe Val Ser Asn Arg Ala

660 665 670

Cys Tyr Ser Ser Val Leu Asn Ile Leu Tyr Thr Ser Cys

675 680 685

<210> 37

<211> 630

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Антиген поверхности клетки 4F2 человека Тяжелая цепь (CD98hc; SLC3A2),

изоформа 1, Uniprot № P08195

<400> 37

Met Glu Leu Gln Pro Pro Glu Ala Ser Ile Ala Val Val Ser Ile Pro

1 5 10 15

Arg Gln Leu Pro Gly Ser His Ser Glu Ala Gly Val Gln Gly Leu Ser

20 25 30

Ala Gly Asp Asp Ser Glu Leu Gly Ser His Cys Val Ala Gln Thr Gly

35 40 45

Leu Glu Leu Leu Ala Ser Gly Asp Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gln Asn

50 55 60

Ala Glu Met Ile Glu Thr Gly Ser Asp Cys Val Thr Gln Ala Gly Leu

65 70 75 80

Gln Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Ala Leu Ala Ser Lys Asn Ala

85 90 95

Glu Val Thr Gly Thr Met Ser Gln Asp Thr Glu Val Asp Met Lys Glu

100 105 110

Val Glu Leu Asn Glu Leu Glu Pro Glu Lys Gln Pro Met Asn Ala Ala

115 120 125

Ser Gly Ala Ala Met Ser Leu Ala Gly Ala Glu Lys Asn Gly Leu Val

130 135 140

Lys Ile Lys Val Ala Glu Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys

145 150 155 160

Phe Thr Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser Pro

165 170 175

Gly Trp Val Arg Thr Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu Phe Trp Leu Gly

180 185 190

Trp Leu Gly Met Leu Ala Gly Ala Val Val Ile Ile Val Arg Ala Pro

195 200 205

Arg Cys Arg Glu Leu Pro Ala Gln Lys Trp Trp His Thr Gly Ala Leu

210 215 220

Tyr Arg Ile Gly Asp Leu Gln Ala Phe Gln Gly His Gly Ala Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ala Gly Leu Lys Gly Arg Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Val

245 250 255

Lys Gly Leu Val Leu Gly Pro Ile His Lys Asn Gln Lys Asp Asp Val

260 265 270

Ala Gln Thr Asp Leu Leu Gln Ile Asp Pro Asn Phe Gly Ser Lys Glu

275 280 285

Asp Phe Asp Ser Leu Leu Gln Ser Ala Lys Lys Lys Ser Ile Arg Val

290 295 300

Ile Leu Asp Leu Thr Pro Asn Tyr Arg Gly Glu Asn Ser Trp Phe Ser

305 310 315 320

Thr Gln Val Asp Thr Val Ala Thr Lys Val Lys Asp Ala Leu Glu Phe

325 330 335

Trp Leu Gln Ala Gly Val Asp Gly Phe Gln Val Arg Asp Ile Glu Asn

340 345 350

Leu Lys Asp Ala Ser Ser Phe Leu Ala Glu Trp Gln Asn Ile Thr Lys

355 360 365

Gly Phe Ser Glu Asp Arg Leu Leu Ile Ala Gly Thr Asn Ser Ser Asp

370 375 380

Leu Gln Gln Ile Leu Ser Leu Leu Glu Ser Asn Lys Asp Leu Leu Leu

385 390 395 400

Thr Ser Ser Tyr Leu Ser Asp Ser Gly Ser Thr Gly Glu His Thr Lys

405 410 415

Ser Leu Val Thr Gln Tyr Leu Asn Ala Thr Gly Asn Arg Trp Cys Ser

420 425 430

Trp Ser Leu Ser Gln Ala Arg Leu Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ala Gln

435 440 445

Leu Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Met Leu Phe Thr Leu Pro Gly Thr Pro

450 455 460

Val Phe Ser Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Leu Asp Ala Ala Ala Leu Pro

465 470 475 480

Gly Gln Pro Met Glu Ala Pro Val Met Leu Trp Asp Glu Ser Ser Phe

485 490 495

Pro Asp Ile Pro Gly Ala Val Ser Ala Asn Met Thr Val Lys Gly Gln

500 505 510

Ser Glu Asp Pro Gly Ser Leu Leu Ser Leu Phe Arg Arg Leu Ser Asp

515 520 525

Gln Arg Ser Lys Glu Arg Ser Leu Leu His Gly Asp Phe His Ala Phe

530 535 540

Ser Ala Gly Pro Gly Leu Phe Ser Tyr Ile Arg His Trp Asp Gln Asn

545 550 555 560

Glu Arg Phe Leu Val Val Leu Asn Phe Gly Asp Val Gly Leu Ser Ala

565 570 575

Gly Leu Gln Ala Ser Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Leu Pro Ala Lys

580 585 590

Ala Asp Leu Leu Leu Ser Thr Gln Pro Gly Arg Glu Glu Gly Ser Pro

595 600 605

Leu Glu Leu Glu Arg Leu Lys Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Leu Leu

610 615 620

Arg Phe Pro Tyr Ala Ala

625 630

<210> 38

<211> 507

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Малая субъединица транспортера крупных нейтральных аминокислот

человека 1 (LAT1; SLC7A5), изоформа 1, Uniprot № Q01650

<400> 38

Met Ala Gly Ala Gly Pro Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

Glu Glu Lys Glu Glu Ala Arg Glu Lys Met Leu Ala Ala Lys Ser Ala

20 25 30

Asp Gly Ser Ala Pro Ala Gly Glu Gly Glu Gly Val Thr Leu Gln Arg

35 40 45

Asn Ile Thr Leu Leu Asn Gly Val Ala Ile Ile Val Gly Thr Ile Ile

50 55 60

Gly Ser Gly Ile Phe Val Thr Pro Thr Gly Val Leu Lys Glu Ala Gly

65 70 75 80

Ser Pro Gly Leu Ala Leu Val Val Trp Ala Ala Cys Gly Val Phe Ser

85 90 95

Ile Val Gly Ala Leu Cys Tyr Ala Glu Leu Gly Thr Thr Ile Ser Lys

100 105 110

Ser Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Met Leu Glu Val Tyr Gly Ser Leu Pro

115 120 125

Ala Phe Leu Lys Leu Trp Ile Glu Leu Leu Ile Ile Arg Pro Ser Ser

130 135 140

Gln Tyr Ile Val Ala Leu Val Phe Ala Thr Tyr Leu Leu Lys Pro Leu

145 150 155 160

Phe Pro Thr Cys Pro Val Pro Glu Glu Ala Ala Lys Leu Val Ala Cys

165 170 175

Leu Cys Val Leu Leu Leu Thr Ala Val Asn Cys Tyr Ser Val Lys Ala

180 185 190

Ala Thr Arg Val Gln Asp Ala Phe Ala Ala Ala Lys Leu Leu Ala Leu

195 200 205

Ala Leu Ile Ile Leu Leu Gly Phe Val Gln Ile Gly Lys Gly Asp Val

210 215 220

Ser Asn Leu Asp Pro Asn Phe Ser Phe Glu Gly Thr Lys Leu Asp Val

225 230 235 240

Gly Asn Ile Val Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Phe Ala Tyr Gly Gly

245 250 255

Trp Asn Tyr Leu Asn Phe Val Thr Glu Glu Met Ile Asn Pro Tyr Arg

260 265 270

Asn Leu Pro Leu Ala Ile Ile Ile Ser Leu Pro Ile Val Thr Leu Val

275 280 285

Tyr Val Leu Thr Asn Leu Ala Tyr Phe Thr Thr Leu Ser Thr Glu Gln

290 295 300

Met Leu Ser Ser Glu Ala Val Ala Val Asp Phe Gly Asn Tyr His Leu

305 310 315 320

Gly Val Met Ser Trp Ile Ile Pro Val Phe Val Gly Leu Ser Cys Phe

325 330 335

Gly Ser Val Asn Gly Ser Leu Phe Thr Ser Ser Arg Leu Phe Phe Val

340 345 350

Gly Ser Arg Glu Gly His Leu Pro Ser Ile Leu Ser Met Ile His Pro

355 360 365

Gln Leu Leu Thr Pro Val Pro Ser Leu Val Phe Thr Cys Val Met Thr

370 375 380

Leu Leu Tyr Ala Phe Ser Lys Asp Ile Phe Ser Val Ile Asn Phe Phe

385 390 395 400

Ser Phe Phe Asn Trp Leu Cys Val Ala Leu Ala Ile Ile Gly Met Ile

405 410 415

Trp Leu Arg His Arg Lys Pro Glu Leu Glu Arg Pro Ile Lys Val Asn

420 425 430

Leu Ala Leu Pro Val Phe Phe Ile Leu Ala Cys Leu Phe Leu Ile Ala

435 440 445

Val Ser Phe Trp Lys Thr Pro Val Glu Cys Gly Ile Gly Phe Thr Ile

450 455 460

Ile Leu Ser Gly Leu Pro Val Tyr Phe Phe Gly Val Trp Trp Lys Asn

465 470 475 480

Lys Pro Lys Trp Leu Leu Gln Gly Ile Phe Ser Thr Thr Val Leu Cys

485 490 495

Gln Lys Leu Met Gln Val Val Pro Gln Glu Thr

500 505

<210> 39

<211> 535

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Малая субъединица транспортера крупных нейтральных аминокислот

человека 2 (LAT2; SLC7A8), изоформа 1, Uniprot № Q9UHI5

<400> 39

Met Glu Glu Gly Ala Arg His Arg Asn Asn Thr Glu Lys Lys His Pro

1 5 10 15

Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ala Ser Pro Glu Ala Gly Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Val Ala Leu Lys Lys Glu Ile Gly Leu Val Ser Ala Cys Gly Ile

35 40 45

Ile Val Gly Asn Ile Ile Gly Ser Gly Ile Phe Val Ser Pro Lys Gly

50 55 60

Val Leu Glu Asn Ala Gly Ser Val Gly Leu Ala Leu Ile Val Trp Ile

65 70 75 80

Val Thr Gly Phe Ile Thr Val Val Gly Ala Leu Cys Tyr Ala Glu Leu

85 90 95

Gly Val Thr Ile Pro Lys Ser Gly Gly Asp Tyr Ser Tyr Val Lys Asp

100 105 110

Ile Phe Gly Gly Leu Ala Gly Phe Leu Arg Leu Trp Ile Ala Val Leu

115 120 125

Val Ile Tyr Pro Thr Asn Gln Ala Val Ile Ala Leu Thr Phe Ser Asn

130 135 140

Tyr Val Leu Gln Pro Leu Phe Pro Thr Cys Phe Pro Pro Glu Ser Gly

145 150 155 160

Leu Arg Leu Leu Ala Ala Ile Cys Leu Leu Leu Leu Thr Trp Val Asn

165 170 175

Cys Ser Ser Val Arg Trp Ala Thr Arg Val Gln Asp Ile Phe Thr Ala

180 185 190

Gly Lys Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile Ile Ile Met Gly Ile Val Gln

195 200 205

Ile Cys Lys Gly Glu Tyr Phe Trp Leu Glu Pro Lys Asn Ala Phe Glu

210 215 220

Asn Phe Gln Glu Pro Asp Ile Gly Leu Val Ala Leu Ala Phe Leu Gln

225 230 235 240

Gly Ser Phe Ala Tyr Gly Gly Trp Asn Phe Leu Asn Tyr Val Thr Glu

245 250 255

Glu Leu Val Asp Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Arg Ala Ile Phe Ile Ser

260 265 270

Ile Pro Leu Val Thr Phe Val Tyr Val Phe Ala Asn Val Ala Tyr Val

275 280 285

Thr Ala Met Ser Pro Gln Glu Leu Leu Ala Ser Asn Ala Val Ala Val

290 295 300

Thr Phe Gly Glu Lys Leu Leu Gly Val Met Ala Trp Ile Met Pro Ile

305 310 315 320

Ser Val Ala Leu Ser Thr Phe Gly Gly Val Asn Gly Ser Leu Phe Thr

325 330 335

Ser Ser Arg Leu Phe Phe Ala Gly Ala Arg Glu Gly His Leu Pro Ser

340 345 350

Val Leu Ala Met Ile His Val Lys Arg Cys Thr Pro Ile Pro Ala Leu

355 360 365

Leu Phe Thr Cys Ile Ser Thr Leu Leu Met Leu Val Thr Ser Asp Met

370 375 380

Tyr Thr Leu Ile Asn Tyr Val Gly Phe Ile Asn Tyr Leu Phe Tyr Gly

385 390 395 400

Val Thr Val Ala Gly Gln Ile Val Leu Arg Trp Lys Lys Pro Asp Ile

405 410 415

Pro Arg Pro Ile Lys Ile Asn Leu Leu Phe Pro Ile Ile Tyr Leu Leu

420 425 430

Phe Trp Ala Phe Leu Leu Val Phe Ser Leu Trp Ser Glu Pro Val Val

435 440 445

Cys Gly Ile Gly Leu Ala Ile Met Leu Thr Gly Val Pro Val Tyr Phe

450 455 460

Leu Gly Val Tyr Trp Gln His Lys Pro Lys Cys Phe Ser Asp Phe Ile

465 470 475 480

Glu Leu Leu Thr Leu Val Ser Gln Lys Met Cys Val Val Val Tyr Pro

485 490 495

Glu Val Glu Arg Gly Ser Gly Thr Glu Glu Ala Asn Glu Asp Met Glu

500 505 510

Glu Gln Gln Gln Pro Met Tyr Gln Pro Thr Pro Thr Lys Asp Lys Asp

515 520 525

Val Ala Gly Gln Pro Gln Pro

530 535

<210> 40

<211> 523

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Транспортер аминокислот Asc-типа 1 человека (Asc-1; SLC7A10),

изоформа 1, Uniprot № Q9NS82

<400> 40

Met Ala Gly His Thr Gln Gln Pro Ser Gly Arg Gly Asn Pro Arg Pro

1 5 10 15

Ala Pro Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Thr Val Pro Gly Ala Ser Glu

20 25 30

Arg Val Ala Leu Lys Lys Glu Ile Gly Leu Leu Ser Ala Cys Thr Ile

35 40 45

Ile Ile Gly Asn Ile Ile Gly Ser Gly Ile Phe Ile Ser Pro Lys Gly

50 55 60

Val Leu Glu His Ser Gly Ser Val Gly Leu Ala Leu Phe Val Trp Val

65 70 75 80

Leu Gly Gly Gly Val Thr Ala Leu Gly Ser Leu Cys Tyr Ala Glu Leu

85 90 95

Gly Val Ala Ile Pro Lys Ser Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Val Thr Glu

100 105 110

Ile Phe Gly Gly Leu Ala Gly Phe Leu Leu Leu Trp Ser Ala Val Leu

115 120 125

Ile Met Tyr Pro Thr Ser Leu Ala Val Ile Ser Met Thr Phe Ser Asn

130 135 140

Tyr Val Leu Gln Pro Val Phe Pro Asn Cys Ile Pro Pro Thr Thr Ala

145 150 155 160

Ser Arg Val Leu Ser Met Ala Cys Leu Met Leu Leu Thr Trp Val Asn

165 170 175

Ser Ser Ser Val Arg Trp Ala Thr Arg Ile Gln Asp Met Phe Thr Gly

180 185 190

Gly Lys Leu Leu Ala Leu Ser Leu Ile Ile Gly Val Gly Leu Leu Gln

195 200 205

Ile Phe Gln Gly His Phe Glu Glu Leu Arg Pro Ser Asn Ala Phe Ala

210 215 220

Phe Trp Met Thr Pro Ser Val Gly His Leu Ala Leu Ala Phe Leu Gln

225 230 235 240

Gly Ser Phe Ala Phe Ser Gly Trp Asn Phe Leu Asn Tyr Val Thr Glu

245 250 255

Glu Met Val Asp Ala Arg Lys Asn Leu Pro Arg Ala Ile Phe Ile Ser

260 265 270

Ile Pro Leu Val Thr Phe Val Tyr Thr Phe Thr Asn Ile Ala Tyr Phe

275 280 285

Thr Ala Met Ser Pro Gln Glu Leu Leu Ser Ser Asn Ala Val Ala Val

290 295 300

Thr Phe Gly Glu Lys Leu Leu Gly Tyr Phe Ser Trp Val Met Pro Val

305 310 315 320

Ser Val Ala Leu Ser Thr Phe Gly Gly Ile Asn Gly Tyr Leu Phe Thr

325 330 335

Tyr Ser Arg Leu Cys Phe Ser Gly Ala Arg Glu Gly His Leu Pro Ser

340 345 350

Leu Leu Ala Met Ile His Val Arg His Cys Thr Pro Ile Pro Ala Leu

355 360 365

Leu Val Cys Cys Gly Ala Thr Ala Val Ile Met Leu Val Gly Asp Thr

370 375 380

Tyr Thr Leu Ile Asn Tyr Val Ser Phe Ile Asn Tyr Leu Cys Tyr Gly

385 390 395 400

Val Thr Ile Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Arg Arg Pro Ala Leu

405 410 415

His Arg Pro Ile Lys Val Asn Leu Leu Ile Pro Val Ala Tyr Leu Val

420 425 430

Phe Trp Ala Phe Leu Leu Val Phe Ser Phe Ile Ser Glu Pro Met Val

435 440 445

Cys Gly Val Gly Val Ile Ile Ile Leu Thr Gly Val Pro Ile Phe Phe

450 455 460

Leu Gly Val Phe Trp Arg Ser Lys Pro Lys Cys Val His Arg Leu Thr

465 470 475 480

Glu Ser Met Thr His Trp Gly Gln Glu Leu Cys Phe Val Val Tyr Pro

485 490 495

Gln Asp Ala Pro Glu Glu Glu Glu Asn Gly Pro Cys Pro Pro Ser Leu

500 505 510

Leu Pro Ala Thr Asp Lys Pro Ser Lys Pro Gln

515 520

<210> 41

<211> 642

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Натрий- и хлор-зависимый транспортер нейтральных и основных

аминокислот B(0+) человека (ATB0,+; SLC6A14), изоформа 1, Uniprot № Q9UN76

<400> 41

Met Asp Lys Leu Lys Cys Pro Ser Phe Phe Lys Cys Arg Glu Lys Glu

1 5 10 15

Lys Val Ser Ala Ser Ser Glu Asn Phe His Val Gly Glu Asn Asp Glu

20 25 30

Asn Gln Asp Arg Gly Asn Trp Ser Lys Lys Ser Asp Tyr Leu Leu Ser

35 40 45

Met Ile Gly Tyr Ala Val Gly Leu Gly Asn Val Trp Arg Phe Pro Tyr

50 55 60

Leu Thr Tyr Ser Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu Ile Pro Tyr Ala Ile

65 70 75 80

Met Leu Ala Leu Ala Gly Leu Pro Leu Phe Phe Leu Glu Cys Ser Leu

85 90 95

Gly Gln Phe Ala Ser Leu Gly Pro Val Ser Val Trp Arg Ile Leu Pro

100 105 110

Leu Phe Gln Gly Val Gly Ile Thr Met Val Leu Ile Ser Ile Phe Val

115 120 125

Thr Ile Tyr Tyr Asn Val Ile Ile Ala Tyr Ser Leu Tyr Tyr Met Phe

130 135 140

Ala Ser Phe Gln Ser Glu Leu Pro Trp Lys Asn Cys Ser Ser Trp Ser

145 150 155 160

Asp Lys Asn Cys Ser Arg Ser Pro Ile Val Thr His Cys Asn Val Ser

165 170 175

Thr Val Asn Lys Gly Ile Gln Glu Ile Ile Gln Met Asn Lys Ser Trp

180 185 190

Val Asp Ile Asn Asn Phe Thr Cys Ile Asn Gly Ser Glu Ile Tyr Gln

195 200 205

Pro Gly Gln Leu Pro Ser Glu Gln Tyr Trp Asn Lys Val Ala Leu Gln

210 215 220

Arg Ser Ser Gly Met Asn Glu Thr Gly Val Ile Val Trp Tyr Leu Ala

225 230 235 240

Leu Cys Leu Leu Leu Ala Trp Leu Ile Val Gly Ala Ala Leu Phe Lys

245 250 255

Gly Ile Lys Ser Ser Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Leu Phe Pro

260 265 270

Tyr Val Val Leu Leu Ile Leu Leu Val Arg Gly Ala Thr Leu Glu Gly

275 280 285

Ala Ser Lys Gly Ile Ser Tyr Tyr Ile Gly Ala Gln Ser Asn Phe Thr

290 295 300

Lys Leu Lys Glu Ala Glu Val Trp Lys Asp Ala Ala Thr Gln Ile Phe

305 310 315 320

Tyr Ser Leu Ser Val Ala Trp Gly Gly Leu Val Ala Leu Ser Ser Tyr

325 330 335

Asn Lys Phe Lys Asn Asn Cys Phe Ser Asp Ala Ile Val Val Cys Leu

340 345 350

Thr Asn Cys Leu Thr Ser Val Phe Ala Gly Phe Ala Ile Phe Ser Ile

355 360 365

Leu Gly His Met Ala His Ile Ser Gly Lys Glu Val Ser Gln Val Val

370 375 380

Lys Ser Gly Phe Asp Leu Ala Phe Ile Ala Tyr Pro Glu Ala Leu Ala

385 390 395 400

Gln Leu Pro Gly Gly Pro Phe Trp Ser Ile Leu Phe Phe Phe Met Leu

405 410 415

Leu Thr Leu Gly Leu Asp Ser Gln Phe Ala Ser Ile Glu Thr Ile Thr

420 425 430

Thr Thr Ile Gln Asp Leu Phe Pro Lys Val Met Lys Lys Met Arg Val

435 440 445

Pro Ile Thr Leu Gly Cys Cys Leu Val Leu Phe Leu Leu Gly Leu Val

450 455 460

Cys Val Thr Gln Ala Gly Ile Tyr Trp Val His Leu Ile Asp His Phe

465 470 475 480

Cys Ala Gly Trp Gly Ile Leu Ile Ala Ala Ile Leu Glu Leu Val Gly

485 490 495

Ile Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Asn Arg Phe Ile Glu Asp Thr Glu Met

500 505 510

Met Ile Gly Ala Lys Arg Trp Ile Phe Trp Leu Trp Trp Arg Ala Cys

515 520 525

Trp Phe Val Ile Thr Pro Ile Leu Leu Ile Ala Ile Phe Ile Trp Ser

530 535 540

Leu Val Gln Phe His Arg Pro Asn Tyr Gly Ala Ile Pro Tyr Pro Asp

545 550 555 560

Trp Gly Val Ala Leu Gly Trp Cys Met Ile Val Phe Cys Ile Ile Trp

565 570 575

Ile Pro Ile Met Ala Ile Ile Lys Ile Ile Gln Ala Lys Gly Asn Ile

580 585 590

Phe Gln Arg Leu Ile Ser Cys Cys Arg Pro Ala Ser Asn Trp Gly Pro

595 600 605

Tyr Leu Glu Gln His Arg Gly Glu Arg Tyr Lys Asp Met Val Asp Pro

610 615 620

Lys Lys Glu Ala Asp His Glu Ile Pro Thr Val Ser Gly Ser Arg Lys

625 630 635 640

Pro Glu

<210> 42

<211> 634

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Натрий-зависимый транспортер нейтральных аминокислот B(0)AT1

человека (B(0)AT1; SLC6A19), изоформа 1, Uniprot № Q695T7

<400> 42

Met Val Arg Leu Val Leu Pro Asn Pro Gly Leu Asp Ala Arg Ile Pro

1 5 10 15

Ser Leu Ala Glu Leu Glu Thr Ile Glu Gln Glu Glu Ala Ser Ser Arg

20 25 30

Pro Lys Trp Asp Asn Lys Ala Gln Tyr Met Leu Thr Cys Leu Gly Phe

35 40 45

Cys Val Gly Leu Gly Asn Val Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Gln Ser

50 55 60

His Gly Gly Gly Ala Phe Met Ile Pro Phe Leu Ile Leu Leu Val Leu

65 70 75 80

Glu Gly Ile Pro Leu Leu Tyr Leu Glu Phe Ala Ile Gly Gln Arg Leu

85 90 95

Arg Arg Gly Ser Leu Gly Val Trp Ser Ser Ile His Pro Ala Leu Lys

100 105 110

Gly Leu Gly Leu Ala Ser Met Leu Thr Ser Phe Met Val Gly Leu Tyr

115 120 125

Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Trp Ile Met Trp Tyr Leu Phe Asn Ser Phe

130 135 140

Gln Glu Pro Leu Pro Trp Ser Asp Cys Pro Leu Asn Glu Asn Gln Thr

145 150 155 160

Gly Tyr Val Asp Glu Cys Ala Arg Ser Ser Pro Val Asp Tyr Phe Trp

165 170 175

Tyr Arg Glu Thr Leu Asn Ile Ser Thr Ser Ile Ser Asp Ser Gly Ser

180 185 190

Ile Gln Trp Trp Met Leu Leu Cys Leu Ala Cys Ala Trp Ser Val Leu

195 200 205

Tyr Met Cys Thr Ile Arg Gly Ile Glu Thr Thr Gly Lys Ala Val Tyr

210 215 220

Ile Thr Ser Thr Leu Pro Tyr Val Val Leu Thr Ile Phe Leu Ile Arg

225 230 235 240

Gly Leu Thr Leu Lys Gly Ala Thr Asn Gly Ile Val Phe Leu Phe Thr

245 250 255

Pro Asn Val Thr Glu Leu Ala Gln Pro Asp Thr Trp Leu Asp Ala Gly

260 265 270

Ala Gln Val Phe Phe Ser Phe Ser Leu Ala Phe Gly Gly Leu Ile Ser

275 280 285

Phe Ser Ser Tyr Asn Ser Val His Asn Asn Cys Glu Lys Asp Ser Val

290 295 300

Ile Val Ser Ile Ile Asn Gly Phe Thr Ser Val Tyr Val Ala Ile Val

305 310 315 320

Val Tyr Ser Val Ile Gly Phe Arg Ala Thr Gln Arg Tyr Asp Asp Cys

325 330 335

Phe Ser Thr Asn Ile Leu Thr Leu Ile Asn Gly Phe Asp Leu Pro Glu

340 345 350

Gly Asn Val Thr Gln Glu Asn Phe Val Asp Met Gln Gln Arg Cys Asn

355 360 365

Ala Ser Asp Pro Ala Ala Tyr Ala Gln Leu Val Phe Gln Thr Cys Asp

370 375 380

Ile Asn Ala Phe Leu Ser Glu Ala Val Glu Gly Thr Gly Leu Ala Phe

385 390 395 400

Ile Val Phe Thr Glu Ala Ile Thr Lys Met Pro Leu Ser Pro Leu Trp

405 410 415

Ser Val Leu Phe Phe Ile Met Leu Phe Cys Leu Gly Leu Ser Ser Met

420 425 430

Phe Gly Asn Met Glu Gly Val Val Val Pro Leu Gln Asp Leu Arg Val

435 440 445

Ile Pro Pro Lys Trp Pro Lys Glu Val Leu Thr Gly Leu Ile Cys Leu

450 455 460

Gly Thr Phe Leu Ile Gly Phe Ile Phe Thr Leu Asn Ser Gly Gln Tyr

465 470 475 480

Trp Leu Ser Leu Leu Asp Ser Tyr Ala Gly Ser Ile Pro Leu Leu Ile

485 490 495

Ile Ala Phe Cys Glu Met Phe Ser Val Val Tyr Val Tyr Gly Val Asp

500 505 510

Arg Phe Asn Lys Asp Ile Glu Phe Met Ile Gly His Lys Pro Asn Ile

515 520 525

Phe Trp Gln Val Thr Trp Arg Val Val Ser Pro Leu Leu Met Leu Ile

530 535 540

Ile Phe Leu Phe Phe Phe Val Val Glu Val Ser Gln Glu Leu Thr Tyr

545 550 555 560

Ser Ile Trp Asp Pro Gly Tyr Glu Glu Phe Pro Lys Ser Gln Lys Ile

565 570 575

Ser Tyr Pro Asn Trp Val Tyr Val Val Val Val Ile Val Ala Gly Val

580 585 590

Pro Ser Leu Thr Ile Pro Gly Tyr Ala Ile Tyr Lys Leu Ile Arg Asn

595 600 605

His Cys Gln Lys Pro Gly Asp His Gln Gly Leu Val Ser Thr Leu Ser

610 615 620

Thr Ala Ser Met Asn Gly Asp Leu Lys Tyr

625 630

<210> 43

<211> 515

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Транспортер монокарбоксилата 10 человека (TAT1; SLC16A10),

изоформа 1, Uniprot № Q8TF71

<400> 43

Met Val Leu Ser Gln Glu Glu Pro Asp Ser Ala Arg Gly Thr Ser Glu

1 5 10 15

Ala Gln Pro Leu Gly Pro Ala Pro Thr Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gly

20 25 30

Pro Gly Pro Ser Asp Ser Pro Glu Ala Ala Val Glu Lys Val Glu Val

35 40 45

Glu Leu Ala Gly Pro Ala Thr Ala Glu Pro His Glu Pro Pro Glu Pro

50 55 60

Pro Glu Gly Gly Trp Gly Trp Leu Val Met Leu Ala Ala Met Trp Cys

65 70 75 80

Asn Gly Ser Val Phe Gly Ile Gln Asn Ala Cys Gly Val Leu Phe Val

85 90 95

Ser Met Leu Glu Thr Phe Gly Ser Lys Asp Asp Asp Lys Met Val Phe

100 105 110

Lys Thr Ala Trp Val Gly Ser Leu Ser Met Gly Met Ile Phe Phe Cys

115 120 125

Cys Pro Ile Val Ser Val Phe Thr Asp Leu Phe Gly Cys Arg Lys Thr

130 135 140

Ala Val Val Gly Ala Ala Val Gly Phe Val Gly Leu Met Ser Ser Ser

145 150 155 160

Phe Val Ser Ser Ile Glu Pro Leu Tyr Leu Thr Tyr Gly Ile Ile Phe

165 170 175

Ala Cys Gly Cys Ser Phe Ala Tyr Gln Pro Ser Leu Val Ile Leu Gly

180 185 190

His Tyr Phe Lys Lys Arg Leu Gly Leu Val Asn Gly Ile Val Thr Ala

195 200 205

Gly Ser Ser Val Phe Thr Ile Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Val Leu

210 215 220

Ile Asp Ser Val Gly Leu Phe Tyr Thr Leu Arg Val Leu Cys Ile Phe

225 230 235 240

Met Phe Val Leu Phe Leu Ala Gly Phe Thr Tyr Arg Pro Leu Ala Thr

245 250 255

Ser Thr Lys Asp Lys Glu Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Leu Phe Ser

260 265 270

Arg Lys Lys Phe Ser Pro Pro Lys Lys Ile Phe Asn Phe Ala Ile Phe

275 280 285

Lys Val Thr Ala Tyr Ala Val Trp Ala Val Gly Ile Pro Leu Ala Leu

290 295 300

Phe Gly Tyr Phe Val Pro Tyr Val His Leu Met Lys His Val Asn Glu

305 310 315 320

Arg Phe Gln Asp Glu Lys Asn Lys Glu Val Val Leu Met Cys Ile Gly

325 330 335

Val Thr Ser Gly Val Gly Arg Leu Leu Phe Gly Arg Ile Ala Asp Tyr

340 345 350

Val Pro Gly Val Lys Lys Val Tyr Leu Gln Val Leu Ser Phe Phe Phe

355 360 365

Ile Gly Leu Met Ser Met Met Ile Pro Leu Cys Ser Ile Phe Gly Ala

370 375 380

Leu Ile Ala Val Cys Leu Ile Met Gly Leu Phe Asp Gly Cys Phe Ile

385 390 395 400

Ser Ile Met Ala Pro Ile Ala Phe Glu Leu Val Gly Ala Gln Asp Val

405 410 415

Ser Gln Ala Ile Gly Phe Leu Leu Gly Phe Met Ser Ile Pro Met Thr

420 425 430

Val Gly Pro Pro Ile Ala Gly Leu Leu Arg Asp Lys Leu Gly Ser Tyr

435 440 445

Asp Val Ala Phe Tyr Leu Ala Gly Val Pro Pro Leu Ile Gly Gly Ala

450 455 460

Val Leu Cys Phe Ile Pro Trp Ile His Ser Lys Lys Gln Arg Glu Ile

465 470 475 480

Ser Lys Thr Thr Gly Lys Glu Lys Met Glu Lys Met Leu Glu Asn Gln

485 490 495

Asn Ser Leu Leu Ser Ser Ser Ser Gly Met Phe Lys Lys Glu Ser Asp

500 505 510

Ser Ile Ile

515

<210> 44

<211> 504

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Протонный транспортер аминокислот 4 человека (PAT4; SLC36A4),

изоформа 1, Uniprot № Q6YBV0

<400> 44

Met Glu Ala Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Ala Ala Arg Arg Glu

1 5 10 15

Glu Leu Asp Met Asp Val Met Arg Pro Leu Ile Asn Glu Gln Asn Phe

20 25 30

Asp Gly Thr Ser Asp Glu Glu His Glu Gln Glu Leu Leu Pro Val Gln

35 40 45

Lys His Tyr Gln Leu Asp Asp Gln Glu Gly Ile Ser Phe Val Gln Thr

50 55 60

Leu Met His Leu Leu Lys Gly Asn Ile Gly Thr Gly Leu Leu Gly Leu

65 70 75 80

Pro Leu Ala Ile Lys Asn Ala Gly Ile Val Leu Gly Pro Ile Ser Leu

85 90 95

Val Phe Ile Gly Ile Ile Ser Val His Cys Met His Ile Leu Val Arg

100 105 110

Cys Ser His Phe Leu Cys Leu Arg Phe Lys Lys Ser Thr Leu Gly Tyr

115 120 125

Ser Asp Thr Val Ser Phe Ala Met Glu Val Ser Pro Trp Ser Cys Leu

130 135 140

Gln Lys Gln Ala Ala Trp Gly Arg Ser Val Val Asp Phe Phe Leu Val

145 150 155 160

Ile Thr Gln Leu Gly Phe Cys Ser Val Tyr Ile Val Phe Leu Ala Glu

165 170 175

Asn Val Lys Gln Val His Glu Gly Phe Leu Glu Ser Lys Val Phe Ile

180 185 190

Ser Asn Ser Thr Asn Ser Ser Asn Pro Cys Glu Arg Arg Ser Val Asp

195 200 205

Leu Arg Ile Tyr Met Leu Cys Phe Leu Pro Phe Ile Ile Leu Leu Val

210 215 220

Phe Ile Arg Glu Leu Lys Asn Leu Phe Val Leu Ser Phe Leu Ala Asn

225 230 235 240

Val Ser Met Ala Val Ser Leu Val Ile Ile Tyr Gln Tyr Val Val Arg

245 250 255

Asn Met Pro Asp Pro His Asn Leu Pro Ile Val Ala Gly Trp Lys Lys

260 265 270

Tyr Pro Leu Phe Phe Gly Thr Ala Val Phe Ala Phe Glu Gly Ile Gly

275 280 285

Val Val Leu Pro Leu Glu Asn Gln Met Lys Glu Ser Lys Arg Phe Pro

290 295 300

Gln Ala Leu Asn Ile Gly Met Gly Ile Val Thr Thr Leu Tyr Val Thr

305 310 315 320

Leu Ala Thr Leu Gly Tyr Met Cys Phe His Asp Glu Ile Lys Gly Ser

325 330 335

Ile Thr Leu Asn Leu Pro Gln Asp Val Trp Leu Tyr Gln Ser Val Lys

340 345 350

Ile Leu Tyr Ser Phe Gly Ile Phe Val Thr Tyr Ser Ile Gln Phe Tyr

355 360 365

Val Pro Ala Glu Ile Ile Ile Pro Gly Ile Thr Ser Lys Phe His Thr

370 375 380

Lys Trp Lys Gln Ile Cys Glu Phe Gly Ile Arg Ser Phe Leu Val Ser

385 390 395 400

Ile Thr Cys Ala Gly Ala Ile Leu Ile Pro Arg Leu Asp Ile Val Ile

405 410 415

Ser Phe Val Gly Ala Val Ser Ser Ser Thr Leu Ala Leu Ile Leu Pro

420 425 430

Pro Leu Val Glu Ile Leu Thr Phe Ser Lys Glu His Tyr Asn Ile Trp

435 440 445

Met Val Leu Lys Asn Ile Ser Ile Ala Phe Thr Gly Val Val Gly Phe

450 455 460

Leu Leu Gly Thr Tyr Ile Thr Val Glu Glu Ile Ile Tyr Pro Thr Pro

465 470 475 480

Lys Val Val Ala Gly Thr Pro Gln Ser Pro Phe Leu Asn Leu Asn Ser

485 490 495

Thr Cys Leu Thr Ser Gly Leu Lys

500

<210> 45

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность T2A

<400> 45

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 46

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность P2A

<400> 46

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 47

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность P2A

<400> 47

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 48

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность E2A

<400> 48

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro Ser Glu

20

<210> 49

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность F2A

<400> 49

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 50

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2

<400> 50

cgctgagaaa tgactgcacg 20

<210> 51

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2

<400> 51

catatacttc ttcaccagtt 20

<210> 52

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2

<400> 52

atgtactcac acatctggat 20

<210> 53

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2

<400> 53

ttaggtgatg atctttgaac 20

<210> 54

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2

<400> 54

tacctcccca cagtgtttct 20

<210> 55

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR GCN2

<400> 55

aaaatctcgc ctagaagaac 20

<210> 56

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP

<400> 56

ccgagctctg attgaccgaa 20

<210> 57

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP

<400> 57

aggaaatcga gcgcctgacc 20

<210> 58

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP

<400> 58

ccagctggac agtgtcccga 20

<210> 59

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP

<400> 59

ctcttgcagg tcctcatacc 20

<210> 60

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP

<400> 60

gcgagtcgcc tctacttccc 20

<210> 61

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR CHOP

<400> 61

ggctggaaag cagcgcatga 20

<210> 62

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4

<400> 62

aggatcgtaa ggtttgggac 20

<210> 63

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4

<400> 63

taataagcag cccccccaga 20

<210> 64

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4

<400> 64

ccactcaccc ttgctgttgt 20

<210> 65

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4

<400> 65

tctcttagat gattacctgg 20

<210> 66

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4

<400> 66

gcaacgtaag cagtgtagtc 20

<210> 67

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR ATF4

<400> 67

tttgcagagg atgccttctc 20

<210> 68

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha

<400> 68

caggctgtca aaattcgagc 20

<210> 69

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha

<400> 69

cattcttcgt catgttgctg 20

<210> 70

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha

<400> 70

gtacttgtca tcaaagaccc 20

<210> 71

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha

<400> 71

gtaaaagaag ccctaagagc 20

<210> 72

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha

<400> 72

gaccagagac ccatctattt 20

<210> 73

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность-мишень gRNA CRISPR eIF2alpha

<400> 73

tacagaaaac atgcccatta 20

<---

1. Способ лечения злокачественного новообразования, включающий:

(a) введение T-клеточного терапевтического средства индивидууму, имеющему заболевание или состояние, представляющие собой злокачественное новообразование; и

(b) введение индивидууму терапевтически эффективного количества ингибитора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

2. Способ лечения злокачественного новообразования, включающий введение индивидууму, имеющему заболевание или состояние, представляющие собой злокачественное новообразование, терапевтически эффективного количества ингибитора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, где индивидууму ранее вводили T-клеточное терапевтическое средство.

3. Способ по п. 1 или 2, где ингибитор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает образование, концентрацию, доступность, метаболизм и/или эффект фермента и/или метаболита пути кинуренина; и/или ингибитор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина предотвращает или снижает катаболизм триптофана, предотвращает или снижает синтез или накопление метаболита триптофана или снижает соотношение кинуренина к триптофану.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где ингибитор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из: антагониста фермента кинурениназы; ингибитора одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1), IDO2 и триптофан-2,3-диоксигеназы (TDO); триптофана; ингибитора индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1) и/или ингибитора IDO/TDO двойного действия.

5. Способ по п. 4, где ингибитор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина представляет собой ингибитор IDO1.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где ингибитор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина выбран из 1-метил-D-триптофана (1-MT) (индоксимода), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида (INCB024360, эпакадостата), 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-хлор-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N'-гидрокси-N-[3-(трифторметил)фенил]-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-циано-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-бром-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-[(4-хлор-2-фурил)метил]-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамида, 1-циклогексил-2-(5H-имидазо[5,1-a]изоиндол-5-ил)этанола (NLG919), GDC-0919, F001287, PF-06840003, или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства, или их комбинации.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где ингибитор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина является 4-({2-[(аминосульфонил)амино]этил}амино)-N-(3-бром-4-фторфенил)-N'-гидрокси-1,2,5-оксадиазол-3-карбоксимидамидом (INCB024360, эпакадостатом).

8. Способ по любому из пп. 1-7, где:

злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии IDO1 до начала введения T-клеточного терапевтического средства; и/или

злокачественное новообразование включает опухоль, отрицательную по TDO до начала введения T-клеточного терапевтического средства, и/или индивидуума не выбирают по опухоли, положительной по экспрессии TDO до начала введения T-клеточного терапевтического средства.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где после введения индивидууму T-клеточное терапевтическое средство вызывает повышение уровня интерферона-гамма (ИФНγ) у индивидуума в локальном окружении опухоли или в образце сыворотки или плазмы индивидуума по сравнению с уровнем ИФН-гамма у индивидуума до начала T-клеточной терапии.

10. Способ по п. 9, где повышение уровня ИФНγ у индивидуума приводит к повышению экспрессии IDO1 в клетках, присутствующих в локальном окружении опухоли, необязательно опухолевых клетках.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где ингибитор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят, когда:

наблюдают снижение уровней триптофана, повышение уровней кинуренина и/или повышение экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства;

до того, как количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, снизится по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке после начала введения T-клеточного терапевтического средства;

до того, как T-клетки начнут проявлять признаки длительного триптофанового голодания, истощения, снижения эффекторной функции, экспрессии ингибиторных рецепторов и/или утраты пролиферативной способности;

до того, как пиковый или максимальный уровень клеток из T-клеточного терапевтического средства станет детектируемым в крови индивидуума; и/или

уровень интерферона-гамма (ИФНγ) повысится в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем до начала введения T-клеточного терапевтического средства или по сравнению с предшествующей временной точкой после начала введения T-клеточного терапевтического средства.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где ингибитор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 1 часа, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней после начала T-клеточной терапии.

13. Способ по п. 12, где ингибитор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина вводят в пределах или в пределах приблизительно 14 дней после начала T-клеточной терапии.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где T-клеточная терапия представляет собой или содержит терапию инфильтрирующими опухоль лимфоцитами (TIL) или T-клеточную терапию, включающую генетически сконструированные клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом.

15. Способ по п. 14, где генетически сконструированная клетка дополнительно содержит модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию в клетке.

16. Способ по п. 15, где модификация включает рекомбинантную, достигнутую посредством конструирования и/или эктопическую экспрессию молекулы или ее функциональной и/или каталитически активной цепи, части или варианта.

17. Способ по п. 15 или 16, где молекула выбрана из одной или более, выбранных из:

mTOR или протеинкиназы C тета (PKC-Θ);

rBAT (SLC3A1), тяжелой цепи CD98 (4F2hc; SLC3A2), транспортера аминокислот L-типа 1 (LAT1; SLC7A5), LAT2 (SLC7A8), транспортера аминокислот Asc-типа 1 (Asc-1; SLC7A10), натрий- и хлорзависимого транспортера нейтральных и основных аминокислот B(0+)(ATB0,+; SLC6A14), натрийзависимого транспортера нейтральных аминокислот B(0)AT1 (B(0)AT1; SLC6A19), транспортера монокарбоксилата 10 (TAT1; SLC16A10) и протонного транспортера аминокислот 4 (PAT4; SLC36A4) или их части; и

киназы GCN2, BLIMP-1, арил-углеводородного рецептора (AHR), ядерного транспортера AHR (ARNT), эукариотического фактора инициации трансляции 2 α (eIF2α), активирующего фактора транскрипции 4 (ATF4) или белка, гомологичного CCAAT/энхансерсвязывающему белку (CHOP), Gadd45α, Herp, 4E-BP1, eIF4G, JAK1, NFκB-2, FK506-BP8 и ИФНγ-R2.

18. Способ по п. 17, где модификация включает введение ингибиторной нуклеиновой кислоты.

19. Способ по п. 18, где ингибиторная нуклеиновая кислота содержит средство РНК-интерференции, которое снижает экспрессию указанной молекулы; или модификация включает введение генетического повреждения в ген, кодирующий молекулу, которая снижает экспрессию молекулы.

20. Способ по п. 19, где повреждение включает введение в клетку средства, содержащего нуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN), TAL-эффекторную нуклеазу (TALEN) или комбинацию CRISPR-Cas9, специфически связывающуюся с геном, кодирующим молекулу, распознающую его или гибридизующуюся с ним.

21. Способ по любому из пп. 1-20, где T-клетка содержит рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся с лигандом.

22. Способ по п. 21, где рекомбинантный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или трансгенный T-клеточный рецептор (TCR).

23. Способ по п. 21 или 22, где рекомбинантный рецептор представляет собой CAR и CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, специфически связывающийся с антигеном, и внутриклеточную сигнальную область, содержащую ITAM.

24. Способ по п. 23, где внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный домен цепи CD3-дзета (CD3ζ).

25. Способ по п. 23 или 24, где CAR дополнительно содержит костимуляторную сигнальную область.

26. Способ по п. 25, где костимуляторная сигнальная область содержит сигнальный домен CD28, 4-1BB или ICOS или его сигнальную часть.

27. Способ по любому из пп. 1-26, где рекомбинантный рецептор связывается, распознает или направленно воздействует на антиген, ассоциированный со злокачественным новообразованием.

28. Способ по п. 27, где антиген выбран из ROR1, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA, поверхностного антигена вируса гепатита B, рецептора фолата альфа, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, фетального рецептора ацетилхолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, ИЛ-22R-альфа, ИЛ-13R-альфа 2, kdr, каппа-легкой цепи, антигена Льюиса Y, молекулы адгезии клеток L1, MAGE-A1, мезотелина, MUC1, MUC16, PSCA, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкоэмбрионального антигена, TAG72, VEGF-R2, карциноэмбрионального антигена (CEA), простатспецифического антигена, PSMA, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфрина B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, белка опухоли Вильмса 1 (WT-1) и циклина A1 (CCNA1).

29. Способ по любому из пп. 1-28, где злокачественное новообразование является миеломой, лимфомой или лейкозом.

30. Способ по п. 29, где злокачественное новообразование является неходжкинской лимфомой (NHL), острым лимфобластным лейкозом (ALL), хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL), диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой (DLBCL) или миеломой.

31. Способ по любому из пп. 1-28, где злокачественное новообразование является негематологическим злокачественным новообразованием или солидной опухолью.

32. Способ по любому из пп. 1-27, где злокачественное новообразование не экспрессирует B-клеточный антиген или не является B-клеточным злокачественным новообразованием.

33. Способ по п. 32, где злокачественное новообразование не экспрессирует CD19, и/или T-клеточное терапевтическое средство не содержит рекомбинантный рецептор, специфически связывающийся CD19, и/или T-клеточное терапевтическое средство является CAR-T-клеточным терапевтическим средством, не содержащим антигенсвязывающий домен против CD19.

34. Способ по любому из пп. 1-33, где введение T-клеточного терапевтического средства или генетически сконструированных Т-клеток приводит к повышению уровней триптофана и/или снижению уровней кинуренина в опухоли или биологическом образце индивидуума, необязательно образце сыворотки, плазмы или опухоли, по сравнению со способом, включающим введение T-клеточного терапевтического средства, но в отсутствие ингибитора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина.

35. Способ по любому из пп. 1-34, где указанное применение приводит к:

повышенной или пролонгированной экспансии и/или персистированию Т-клеток или Т-клеточного терапевтического средства в организме индивидуума по сравнению со способом, в котором T-клеточное терапевтическое средство вводят индивидууму в отсутствие ингибитора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, или способом, в котором вводят схожую T-клетку, но в котором T-клетки не содержат модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию; и/или

пониженной экспрессии или уровню CD25 на поверхности клеток из T-клеточного терапевтического средства после указанного введения индивидууму по сравнению с экспрессией или уровнем в способе, в котором T-клеточное терапевтическое средство вводят индивидууму в отсутствие ингибитора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина, или способе, в котором вводят схожее T-клеточное терапевтическое средство, но в котором T-клетки не содержат модификацию экспрессии молекулы, ассоциированной с IDO-опосредованной иммуносупрессорной передачей сигнала, ассоциированной с восприятием или ответом на триптофановое голодание или недостаточность и/или ассоциированной с восприятием или ответом на кинуренин-опосредованную иммуносупрессию.

36. Способ по любому из пп. 1-35, где ингибитор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина составляют для введения в количестве от или приблизительно от 2,5 мг до приблизительно 5000 мг, от 2,5 мг до 2000 мг, от 2,5 мг до 1000 мг, от 2,5 мг до 500 мг, от 2,5 мг до 200 мг, от 2,5 мг до 100 мг, от 2,5 мг до 50 мг, от 2,5 мг до 25 мг, от 2,5 мг до 10 мг, от 25 мг до 5000 мг, от 25 мг до 2000 мг, от 25 мг до 1000 мг, от 25 мг до 500 мг, от 25 мг до 200 мг, от 25 мг до 100 мг, от 25 мг до 50 мг, от 50 мг до 5000 мг, от 50 мг до 2000 мг, от 50 мг до 1000 мг, от 50 мг до 500 мг, от 50 мг до 200 мг, от 50 мг до 100 мг, от 100 мг до 5000 мг, от 100 мг до 2000 мг, от 100 мг до 1000 мг, от 100 мг до 500 мг, от 100 мг до 200 мг, от 200 мг до 5000 мг, от 200 мг до 2000 мг, от 200 мг до 1000 мг, от 200 мг до 500 мг, от 500 мг до 5000 мг, от 500 мг до 2000 мг, от 500 мг до 1000 мг или от 1000 мг до 2000 мг включительно.

37. Способ по любому из пп. 1-35, где ингибитор метаболизма триптофана и/или пути кинуренина составляют для введения в общей суточной дозе по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 5 мг/сутки, 10 мг/сутки, 25 мг/сутки, 50 мг/сутки, 100 мг/сутки, 200 мг/сутки, 400 мг/сутки, 500 мг/сутки, 600 мг/сутки, 800 мг/сутки, 1000 мг/сутки, 1200 мг/сутки, 1600 мг/сутки, 2000 мг/сутки, 5000 мг/сутки или 10000 мг/сутки.

38. Способ по любому из пп. 1-37, где указанное применение приводит к:

повышению уровней триптофана, снижению уровней кинуренина и/или снижению экспрессии или активности IDO1, IDO2 или TDO в биологическом образце индивидуума по сравнению со временем непосредственно перед введением ингибитора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина или по сравнению со временем непосредственно перед началом введения T-клеточного терапевтического средства;

повышению количества клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, по сравнению с индивидуумом в предшествующей временной точке непосредственно перед введением ингибитора метаболизма триптофана и/или пути кинуренина или по сравнению с предшествующей временной точкой после введения T-клеточного терапевтического средства;

отличию количества клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови, в пределах 2,0 раз (более или менее) от пикового или максимального количества клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума после начала введения T-клеточного терапевтического средства;

тому, что количество клеток из T-клеточного терапевтического средства, детектируемых в крови индивидуума, составит более или более чем приблизительно 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50% или 60% от всех мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) в крови индивидуума;

тому, что концентрация или количество сконструированных клеток в крови индивидуума составит (i) по меньшей мере или приблизительно 10 сконструированных клеток на микролитр, (ii) по меньшей мере 20%, 30%, 40% или 50% общего количества мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), (iii) по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1×10⁵ сконструированных клеток или (iv) кровь индивидуума содержит по меньшей мере 5000 копий ДНК, кодирующей рекомбинантный рецептор, на микрограмм ДНК;

тому, что в день 90 после начала введения на стадии (a) CAR-экспрессирующие клетки будут детектируемыми в крови или сыворотке индивидуума; и/или

тому, что в день 90 после начала введения на стадии (a) кровь индивидуума будет содержать по меньшей мере 20% CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере 10 CAR-экспрессирующих клеток на микролитр или по меньшей мере 1×10⁴ CAR-экспрессирующих клеток.

39. Способ по любому из пп. 1-38, где T-клеточное терапевтическое средство содержит T-клетки, являющиеся CD4+ или CD8+.

40. Способ по п. 39, где клетки являются аутологичными для индивидуума или аллогенными для индивидуума.

41. Способ по любому из пп. 1-40, где Т-клеточная терапия или введение генетически сконструированных Т-клеток включает введение дозы клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, содержащей от или приблизительно от 1×10⁶ и до или приблизительно до 3×10⁸, от или приблизительно от 1×10⁷ до или приблизительно до 2×10⁸.

42. Способ по п. 41, где Т-клеточная терапия или введение генетически сконструированных Т-клеток включает введение дозы клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, содержащей 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸ или 1,5×10⁸, или в интервале между любыми из двух вышеприведенных значений.