Гидролиз стевиоловых гликозидов с помощью бета-глюкозидазы

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ изменения гликозилирования стевиолового гликозида, включающий: a) подвергание первого стевиолового гликозида воздействию бета–глюкозидазы из вида Pichia в течение периода времени, достаточного для образования второго стевиолового гликозида посредством удаления по меньшей мере одной глюкозильной группы из указанного первого стевиолового гликозида; и b) сбор указанного второго стевиолового гликозида. Изобретение позволяет с высокой степенью эффективности изменять гликозилирование стевиолового гликозида. 31 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 8 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно параграфу 119(e) раздела 35 кодекса США по предварительной заявке на патент США № 62/527482, поданной 30 июня 2017 года, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[002] Область техники настоящего изобретения относится к способам и процессам, которые делают получение требуемых стевиоловых гликозидов более эффективным и менее дорогостоящим. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению гидролиза с помощью бета-глюкозидазы для обеспечения получения представляющих интерес стевиоловых гликозидов посредством биоконверсии.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[003] Настоящее изобретение направлено на превращение идентифицированных субстратов в представляющие интерес стевиоловые гликозиды. В частности, настоящее изобретение частично относится к более эффективному получению ребаудиозида M ("Reb M") посредством применения бета-глюкозидазы ("B-glu1") с осуществлением гидролиза конкретных субстратов, присутствующих в разрушенных рекомбинантных клетках, таких как рекомбинантные микробные клетки.

[004] Стевиоловые гликозиды представляют собой природные вещества, выделенные из листьев Stevia rebaudiana, и широко используются в качестве высокоинтенсивных низкокалорийных подсластителей в продуктах питания, кормах и напитках. Встречающиеся в природе стевиоловые гликозиды имеют одинаковую основную каркасную структуру дитерпена (стевиол), однако отличаются по количеству и структуре модификаций углеводных остатков (например, остатков глюкозы, рамнозы и ксилозы) в положениях C13 и C19 каркаса стевиола. Стевиоловые гликозиды с известными структурами включают стевиозид, ребаудиозид A, ребаудиозид B, ребаудиозид C, ребаудиозид D, ребаудиозид E, ребаудиозид F, ребаудиозид M и дулкозид A. С точки зрения коммерческого применения ребаудиозид M обычно считается безопасным (со статусом 'GRAS'), но его крайне трудно получать в ходе осуществления способов экстракции, и он требует значительных модификаций микробов для получения посредством только микробной биоконверсии.

[005] В пересчете на сухую массу, стевиозид, ребаудиозид А, ребаудиозид С и дулкозид А составляют соответственно 9,l, 3,8, 0,6 и 0,30 процента от общего веса стевиоловых гликозидов в листьях Stevia дикого типа, тогда как другие стевиоловые глюкозиды, такие как Reb M, присутствуют в значительно меньших количествах. Применение рекомбинантных микробных клеток для получения представляющих интерес стевиоловых гликозидов известно, однако, учитывая диапазон биохимической активности конкретных ферментов, это может приводить к тому, что можно получить ряд разнообразных стевиоловых гликозидов из такого микробного штамма. В этих ситуациях разрушенные клетки таких штаммов могут содержать большие количества стевиозида (№ по CAS 57817-89-7), ребаудиозида A (№ по CAS 58543-16-1) или других стевиоловых гликозидов, среди которых Reb M представляет собой требуемый продукт. Количества данных соединений находятся в диапазоне от приблизительно 10-20% в случае стевиозида и приблизительно 5-10% в случае ребаудиозида A с другими незначительными компонентами, присутствующими в смеси.

[006] Как природные подсластители, различные стевиоловые гликозиды характеризуются различной степенью сладости, "вкусовыми ощущениями" и специфическими привкусами, связанными с каждым тестируемым видом ребаудиозидов. По сравнению со столовым сахаром (т. е. "сахарозой") сладость стевиоловых гликозидов значительно выше. Например, стевиозид в 100-150 раз слаще сахарозы, но имеет горький привкус, как отмечалось в тестах на вкус, тогда как сладость у ребаудиозидов А и Е в 250-450 раз выше, чем у сахарозы, но привкус, который намного менее заметен, чем у стевиозида, однако все еще присутствует. Соответственно, на вкусовые профили любых экстрактов stevia сильно влияет относительное содержание стевиоловых гликозидов в экстракте, что в свою очередь может зависеть от условий окружающей среды, в которых находятся основные растения, а также от применяемого способа экстракции. Такие различия в получении растений, погодных условиях и условиях экстракции могут приводить к непостоянным композициям стевиоловых гликозидов в экстрактах stevia, так что вкусовой профиль сильно варьируется между различными партиями продуктов экстракции. На вкусовой профиль экстрактов stevia также могут влиять загрязняющие вещества растительного происхождения или из окружающей среды (такие как пигменты, липиды, белки, фенольные смолы и сахариды), которые остаются в продукте после процесса экстракции. Эти загрязняющие вещества обычно имеют свои собственные неприятные запахи, нежелательные для применения экстракта stevia в качестве подсластителя в потребительских продуктах.

[007] Кроме того, стоимость выделения отдельных или конкретных комбинаций стевиоловых гликозидов, которые являются немногочисленными в экстрактах stevia, является чрезмерно затратной и ресурсоемкой. Получение стевиоловых гликозидов из стевиозида и Reb A небиологическими способами является затруднительным. Кислотный гидролиз стевиозида является проблематичным, поскольку в кислотных условиях получаемый стевиол подвергается перегруппировке в изостевиол. Учитывая ограниченное качество и доступность некоторых конкретных стевиоловых гликозидов, коммерческое получение может быть в большей степени удовлетворено с помощью биоконверсии, при этом природные ферменты или конкретные микробы могут быть модифицированы для переноса необходимых ферментов и применения коммерчески значимых способов ферментации для значительного увеличения получения гликозидов, представляющих интерес. Например, ранее сообщалось о биоконверсии стевиозида в Reb E (см. Mao et al., публикация заявки на патент США номер US2016/0207954, Некалорийный подсластитель) посредством пути ферментации с помощью модифицированных микробов. Как альтернатива, для разработки стевиоловых гликозидов, представляющих интерес, можно использовать другие инструменты, отличные от биосинтетических.

[008] С биологической точки, зрения все стевиоловые гликозиды образуются в результате серии реакций гликозилирования стевиола, которые обычно катализируются ферментами UDP-гликозилтрансферазы (UGT) с использованием уридин-5'-дифосфоглюкозы (UDP-глюкозы) в качестве донора фрагмента сахара. У растений UGT представляют собой очень разнородную группу ферментов, которые переносят остаток глюкозы из UDP-глюкозы в стевиол. В таких реакциях стевиозид часто является промежуточным звеном в биосинтезе различных ребаудиозидных соединений. Например, гликозилирование стевиозида в положении C-3' в С-13-О-глюкозе стевиозида дает в результате ребаудиозид А; тогда как гликозилирование в положении C-2' в 19-O-глюкозе стевиозида дает в результате ребаудиозид Е.

[009] В соответствии с настоящим изобретением практический подход для улучшения вкусовых качеств экстрактов stevia состоит в том, чтобы увеличить выход тех ребаудиозидных соединений, которые в целом имеют более желательные вкусовые характеристики, и осуществить это посредством более продуктивного пути синтеза и связанных с ним способов. Считается, что из таких протестированных стевиоловых гликозидов Reb M обладает наиболее желательным вкусом и химическими характеристиками для применения в пищевых продуктах и напитках. Однако, как указывалось выше, растение содержит чрезвычайно малые количества этого соединения, присутствующего в его листьях, а следовательно, необходимы альтернативные способы для обеспечения возможности крупномасштабного производства этого гликозида и содействия ему, а также предоставления альтернативных подсластителей для пищевой промышленности и производства напитков.

[0010] Соответственно, существует необходимость в разработке стевиоловых гликозидов с лучшими и более постоянными вкусовыми профилями в качестве коммерческих продуктов и обеспечении возможности применения в таких стевиоловых гликозидах соответствующего общего исходного субстрата, такого как более распространенные стевиоловые гликозиды в качестве исходной молекулы, таким образом, чтобы такое получение требуемых гликозидов могло быть коммерчески настолько эффективным, насколько это возможно. В настоящем изобретении предусмотрен способ улучшения получения необходимых стевиоловых гликозидов.

[0011] Новые способы получения также необходимы для снижения затрат на получение стевиоловых гликозидов и уменьшения воздействия крупномасштабного культивирования и переработки в отношении окружающей среды (Yao et al., 1994). Одним из таких потенциальных решений является применение технологии ферментационной биоконверсии, которая обеспечивает получение в определенных видах микробов или других рекомбинантных клетках, что повышает селективность, количество и чистоту требуемых стевиоловых гликозидов, доступных для коммерческой деятельности, и увеличение присутствующего количества требуемого ребаудиозида путем применения гидролитического фермента для обеспечения такого получения в клеточном лизате из культур модифицированных микробов или других культур модифицированных клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] Частично настоящее изобретение охватывает способ получения повышенных количеств ребаудиозида M (Reb M) из различных стевиоловых гликозидов посредством применения гидролитической активности бета-глюкозидазы. Более конкретно, в настоящем изобретении предусмотрен улучшенный способ получения требуемых стевиоловых гликозидов из разрушенных рекомбинантных клеток (например, рекомбинантных микробных клеток), содержащих представляющие интерес субстраты. При этом такие клетки (например, микробы) были модифицированы, чтобы нести гены, способные к обеспечению продуцирования представляющих интерес стевиоловых гликозидов, в том числе ребаудиозида A (Reb A), ребаудиозида E (Reb E) и/или стевиозида. В данном варианте осуществления способ включает стадии получения материала из разрушенных клеток (например, микробных клеток) и проведения ферментативного гидролиза стевиозидов, присутствующих в указанных продуктах жизнедеятельности, для увеличения получения Reb M.

[0013] Что касается продукта/коммерческого применения, то в Соединенных Штатах на рынке имеется несколько десятков продуктов, содержащих стевиоловые гликозиды, и их можно использовать в составе чего угодно - от анальгетиков до репеллентов против вредителей, а также в продуктах питания и в пищевых добавках. Продукты, содержащие представляющие интерес стевиоловые гликозиды, могут включать аэрозоли, жидкости или гранулированные составы.

[0014] Что касается клеточной системы согласно настоящему изобретению, то она выбрана из группы, состоящей из бактерий, дрожжей и их комбинации, или любой клеточной системы, которая дала бы возможность осуществить генетическую трансформацию с помощью выбранных генов, а затем биосинтетическое получение требуемых стевиоловых гликозидов из стевиола. В наиболее предпочтительной микробной системе для получения требуемых соединений стевиоловых гликозидов применяют E. coli с проведением впоследствии гидролиза посредством бета-глюкозидазы.

[0015] Бета-глюкозидазы представляют собой конститутивные ферменты, часто присутствующие в нижних отделах желудочно-кишечных трактов животных, и применимы в качестве средства, способствующего пищеварению и всасыванию пищевого материала. В соответствии с настоящим изобретением B-glu1 применяют для осуществления гидролиза стевиозида, ребаудиозида E (Reb E), ребаудиозида A (Reb A), ребаудиозида I (Reb I), ребаудиозида D (Reb D), ребаудиозида G (Reb G) и рубузозида. Гидролиз протекает посредством образования в начале стевиолбиозида с образованием стевиола в качестве конечного продукта гидролиза.

[0016] Соответственно, в аспектах настоящего изобретения предусматриваются способы изменения гликозилирования стевиолового гликозида, включающие a) обеспечение рекомбинантной клетки (например, клетки микроба, водоросли или растения), модифицированной с обеспечением продуцирования первого субстрата; b) разрушение указанной рекомбинантной клетки с высвобождением ее клеточного цитозоля, где такой цитозоль содержит указанный первый субстрат; c) получение цитозоля из указанной рекомбинантной клетки; d) подвергание указанного цитозоля воздействию бета-глюкозидазы, где такая бета-глюкозидаза характеризуется гидролитической активностью в течение периода времени, достаточного для образования второго представляющего интерес субстрата посредством удаления по меньшей мере одной глюкозильной группы из указанного первого субстрата; и e) сбор указанного второго представляющего интерес субстрата.

[0017] В некоторых вариантах осуществления указанный первый субстрат представляет собой стевиоловый гликозид. В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb M. В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb B. В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb A. В некоторых вариантах осуществления первый и второй субстрат представляют собой субстраты, описанные в таблице 1 или на фигуре в данном документе (например, фиг. 9).

[0018] В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 указанного стевиолового гликозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 указанного стевиолового гликозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы либо в положении C19 указанного стевиолового гликозида, либо в положении C13 указанного стевиолового гликозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы как в положении C19 указанного стевиолового гликозида, так и в положении C13 указанного субстрата.

[0019] В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 рубузозида с получением стевиол-13-глюкозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 стевиозида с получением стевиолбиозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb E с получением стевиолбиозида. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb I с получением Reb A. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb A с получением Reb B.

[0020] В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 стевиол-13-глюкозида с получением стевиола. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 Reb D с получением Reb B или Reb A. В некоторых вариантах осуществления указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 и в положении C13 Reb G с получением стевиол-13-глюкозида.

[0021] Способы, представленные в данном документе, в некоторых аспектах дополнительно включают применение ферментов бета-галактозидазы или пектиназы для увеличения скорости ферментативного гидролиза. В некоторых вариантах осуществления способы, представленные в данном документе, дополнительно включают обеспечение экспрессии стевиолового гликозида в трансформированной клеточной системе; выращивание клеточной системы в среде и получение указанного второго представляющего интерес субстрата.

[0022] В некоторых вариантах осуществления указанный период времени воздействия бета-глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 6 часов.

[0023] В некоторых вариантах осуществления указанный период времени воздействия бета-глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 12 часов. В некоторых вариантах осуществления указанный период времени воздействия бета-глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 18 часов. В некоторых вариантах осуществления указанный период времени воздействия бета-глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 24 часа. В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой стевиоловый гликозид.

[0024] В некоторых вариантах осуществления бета-глюкозидаза имеет аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90% (например, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%) идентичностью с SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления бета-глюкозидаза имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95% (например, на по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%) идентична SEQ ID NO:3.

[0025] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная клетка выбрана из группы, состоящей из бактерии, дрожжей, нитчатого гриба, водоросли, представляющей собой цианобактерию, и растительной клетки. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная клетка (например, микроб) выбрана из группы, состоящей из Escherichia; Salmonella; Bacillus; Acinetobacter; Streptomyces; Corynebacterium; Methylosinus; Methylomonas; Rhodococcus; Pseudomonas; Rhodobacter; Synechocystis; Saccharomyces; Zygosaccharomyces; Kluyveromyces; Candida; Hansenula; Debaryomyces; Mucor; Pichia; Torulopsis; Aspergillus; Arthrobotlys; Brevibacteria; Microbacterium; Arthrobacter; Citrobacter; Escherichia; Yarrowia; Klebsiella; Pantoea; Salmonella Corynebacterium; Clostridium и Clostridium acetobutylicum.

[0026] В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой стевиоловый гликозид. В некоторых вариантах осуществления второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb E. В некоторых вариантах осуществления указанный второй субстрат представляет собой смесь Reb E, Reb D4 и Reb M. В некоторых вариантах осуществления второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb D4. В некоторых вариантах осуществления указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой смесь стевиоловых гликозидов, а содержание стевиоловых гликозидов из данной смеси в совокупности выше, чем любых других компонентов полученного из цитозоля концентрата по весу в пересчете на сухое вещество.

[0027] В некоторых вариантах осуществления второй представляющий интерес субстрат на стадии e) представляет собой неочищенный продукт, и стадия e) дополнительно включает i) очистку указанного неочищенного продукта и ii) удаление растворителей под вакуумом с получением концентрированного продукта.

[0028] В некоторых вариантах осуществления очистка указанного неочищенного продукта осуществляется с помощью колоночной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления очистка указанного неочищенного продукта осуществляется с помощью кислотно-щелочной экстракции. В некоторых вариантах очистка указанного неочищенного продукта осуществляется с помощью вакуумной перегонки.

[0029] Способы, представленные в данном документе, в некоторых вариантах осуществления дополнительно включают очистку концентрированного продукта с применением полупрепаративной HPLC.

[0030] Несмотря на то, что настоящее изобретение допускает различные модификации и альтернативные формы, его конкретные варианты осуществления показаны в виде примера в графических материалах и будут подробно описаны в данном документе. Однако следует понимать, что графические материалы и подробное описание, представленные в данном документе, не предназначены для ограничения настоящего изобретения описанным конкретным вариантом осуществления, а напротив - намерение состоит в том, чтобы охватить все модификации, эквиваленты и альтернативы, соответствующие духу и объему настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

[0031] Другие признаки и преимущества данного изобретения станут очевидными из следующего подробного описания предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, взятых со ссылкой на прилагаемые графические материалы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0032] На фиг. 1 показан гидролиз рубузозида посредством фермента B-glu1 и разрушенных клеток Pichia. A: профили HPLC продуктов гидролиза рубузозида, a: стандарт стевиола ("S"); b: стандарт рубузозида ("Rub"); c-d: рубузозид расщепляли с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (c) и 3 часа (d); e-f: рубузозид подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток Pichia в момент времени 1 час (e) и 6 часов (f). B: путь гидролиза рубузозида, катализируемого B-glu1. Рубузозид подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток Pichia с получением стевиол-13-глюкозида ("S-13-G") и стевиола.

[0033] На фиг. 2 показан гидролиз стевиозида посредством фермента B-glu1. A: профили HPLC продуктов гидролиза стевиозида, a: стандарт стевиозида ("ST"); b: стандарт стевиолбиозида ("SB"); c-e: стевиозид подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (c), 6 часов (d) и 24 часа (e). B: путь гидролиза стевиозида, катализируемого B-glu1. Стевиозид подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток pichia с получением стевиолбиозида.

[0034] На фиг. 3 показан гидролиз ребаудиозида E посредством фермента B-glu1. A: профили HPLC продуктов гидролиза ребаудиозида E. a: стандарт стевиолбиозида ("SB"); b: стандарт ребаудиозида E ("E"); c-e: ребаудиозид E подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (c), 6 часов (d) и 24 часа (e). B: путь гидролиза ребаудиозида E, катализируемого B-glu1. Ребаудиозид E подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток pichia с получением стевиолбиозида.

[0035] На фиг. 4 показан гидролиз ребаудиозида A посредством фермента B-glu1. A: профили HPLC продуктов гидролиза ребаудиозида A, a: стандарт ребаудиозида A ("Reb A"); b: стандарт ребаудиозида B ("Reb B"); c-d: ребаудиозид A подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (c) и 6 часов (d). B: путь гидролиза ребаудиозида A, катализируемого B-glu1. Ребаудиозид A подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток pichia с получением ребаудиозида B.

[0036] На фиг. 5 показан гидролиз ребаудиозида I посредством фермента B-glu1. A: профили HPLC продуктов гидролиза ребаудиозида I, a: стандарт ребаудиозида A ("Reb A"); b: стандарт ребаудиозида B ("Reb B"); c: стандарт ребаудиозида I ("Reb I"), d-f: ребаудиозид I подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (d), 6 часов (e) и 24 часа(f). B: путь гидролиза ребаудиозида I, катализируемого B-glu1. Ребаудиозид I подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением ребаудиозида A и ребаудиозида B.

[0037] На фиг. 6 показан гидролиз ребаудиозида D посредством фермента B-glu1. A: профили HPLC продуктов гидролиза ребаудиозида D, a: стандарт ребаудиозида B ("Reb B"); b: стандарт ребаудиозида D ("Reb D"); c-e: ребаудиозид D подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 1 час (c), 6 часов (d) и 24 часа (e). B: путь гидролиза ребаудиозида D, катализируемого B-glu1. Ребаудиозид D подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением ребаудиозида A и ребаудиозида B.

[0038] На фиг. 7 показан гидролиз ребаудиозида G посредством фермента B-glu1 и разрушенных клеток pichia. A: профили HPLC продуктов гидролиза ребаудиозида G, a: стандарт стевиола ("Стевиол"), стевиол-13-глюкозида ("S-13-G"); b: стандарт ребаудиозида G ("G"); b-d: ребаудиозид G подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 в момент времени 0,5 часа (c), 1 час (d) и 6 часов (e); f: ребаудиозид G подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа (f). B: путь гидролиза ребаудиозида G, катализируемого B-glu1. Ребаудиозид G подвергали гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток pichia с получением стевиол-13-глюкозида ("S-13-G") и стевиола.

[0039] На фиг. 8 показан гидролиз стевиоловых гликозидов с помощью разрушенных клеток pichia, a: стандарт стевиолбиозида ("SB"); b: стандарт ребаудиозида B ("B"); c: стевиозид подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа; d: ребаудиозид E ("E") подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа; e: ребаудиозид A ("A") подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа; f: ребаудиозид I ("I") подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа; g: ребаудиозид D ("D") подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток pichia в момент времени 24 часа.

[0040] На фиг. 9 показано, что B-Glu1 может осуществлять гидролиз различных субстратов, представляющих собой стевиоловые гликозиды. Черная линия: гликозилирование; пунктирная линия: гидролиз.

[0041] На фиг. 10 показан путь синтеза для получения Reb M и Reb WB2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Объяснение терминов, используемых в данном документе

[0042] Стевиоловые гликозиды представляют собой класс химических соединений, отвечающих за сладкий вкус листьев южноамериканского растения Stevia rebaudiana (Asteraceae), и могут использоваться в качестве подсластителей в пищевых продуктах, кормах и напитках.

Определения

[0043] Клеточная система представляет собой любые клетки, которые обеспечивают экспрессию эктопических белков. Такая система предусматривает бактерии, дрожжи, растительные клетки и животные клетки. Она включает как прокариотические, так и эукариотические клетки. Она также обеспечивает экспрессию белков in vitro на основе клеточных компонентов, таких как рибосомы.

[0044] Термин кодирующая последовательность представлен в своем обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники и используется без ограничения для обозначения последовательности ДНК, которая кодирует конкретную аминокислотную последовательность.

[0045] Выращивание клеточной системы. Выращивание включает предоставление соответствующей среды, которая дала бы возможность клеткам размножаться и делиться. Оно также предусматривает предоставление ресурсов для того, чтобы клетки или клеточные компоненты могли транслироваться и производить рекомбинантные белки.

[0046] Экспрессия белка. Выработка белка может происходить после экспрессии гена. Она предусматривает стадии, после того, как ДНК была транскрибирована в матричную РНК (mRNA). Затем mRNA транслируется в полипептидные цепи, которые в конечном итоге сворачиваются в белки. ДНК присутствует в клетках в результате трансфекции - процесса намеренного введения нуклеиновых кислот в клетки. Термин часто используется для невирусных способов в эукариотических клетках. Данный термин может также относиться к другим способам и типам клеток, хотя предпочтительными являются другие термины: "трансформация" чаще используется для описания невирусного переноса ДНК в бактериях, эукариотических клетках неживотного происхождения, в том числе растительных клетках. Для животных клеток трансфекция является предпочтительным термином, поскольку трансформация также используется для обозначения прогрессирования до ракового состояния (канцерогенеза) в этих клетках. Термин трансдукция часто используется для описания вирус-опосредованного переноса ДНК. Трансформация, трансдукция и вирусная инфекция включены в определение трансфекции для данного применения.

[0047] Дрожжи. В соответствии с настоящим изобретением, дрожжи, заявленные в данном документе, представляют собой эукариотические одноклеточные микроорганизмы, классифицированные как представители царства грибов. Дрожжи представляют собой одноклеточные организмы, которые произошли от многоклеточных предков, однако некоторые виды, применимые в настоящем изобретении, представляют собой такие, которые обладают способностью развивать многоклеточные характеристики путем образования цепочек связанных почкующихся клеток, известных как псевдогифы или ложные гифы.

[0048] Названия ферментов UGT, применяемых в настоящем изобретении для получения различных стевиоловых гликозидов, соответствуют системе номенклатуры, принятой Комитетом по номенклатуре UGT (Mackenzie et al., "The UDP glycosyltransferase gene super family: recommended nomenclature updated based on evolutionary divergence," Pharmacogenetics, 1997, vol. 7, pp. 255-269), который классифицирует гены UGT посредством комбинации номера семейства, буквы, обозначающей подсемейство, и номера для отдельного гена. Например, название "UGT76Gl" относится к ферменту UGT, кодируемому геном, принадлежащим к семейству UGT № 76 (растительного происхождения), подсемейству G и гену l.

Структурные термины

[0049] Используемые в данном документе формы существительных единственного числа включают ссылки на формы множественного числа, если контекст ясно не указывает на иное.

[0050] В той степени, в которой термин "включать", "иметь" или т. п. используется в описании или формуле изобретения, подразумевается, что такой термин предназначен для включения, аналогичным образом как термин "содержать", так как термин "содержать" интерпретируется при использовании как переходное слово в формуле.

[0051] Слово "примерный" используется в данном документе для обозначения "служащий примером, образцом или иллюстрацией". Любой вариант осуществления, описанный в данном документе как "примерный", не обязательно должен рассматриваться как предпочтительный или преимущественный по сравнению с другими вариантами осуществления.

[0052] Термин "комплементарный" приведен в его обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники и используется без ограничения для описания взаимосвязи между нуклеотидными основаниями, которые способны гибридизироваться друг с другом. Например, в отношении ДНК аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Соответственно, применяемая технология также подразумевает выделенные фрагменты нуклеиновой кислоты, которые являются комплементарными полным последовательностям, как указано в прилагаемом перечне последовательностей, а также эти по существу сходные последовательности нуклеиновых кислот.

[0053] Термины "нуклеиновая кислота" и "нуклеотид" представлены в соответствии с их обычными и общепринятыми значениями для специалиста в данной области техники и используются без ограничения для обозначения дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов и их полимеров в одно- или двухнитевой форме. Если не указаны конкретные ограничения, то данный термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые обладают свойствами связывания, сходными с эталонной нуклеиновой кислотой, и метаболизируются способом, сходным со встречающимися в природе нуклеотидами. Если не указано иное, то конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также косвенно охватывает консервативно модифицированные или вырожденные варианты (например, замены вырожденного кодона) и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность.

[0054] Термин "выделенный" приведен в его обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники, и при использовании в контексте выделенной нуклеиновой кислоты или выделенного полипептида используется без ограничения для обозначения нуклеиновой кислоты или полипептида, которые, посредством производимых человеком манипуляций, существуют отдельно от его природной среды, а следовательно не являются продуктом природы. Выделенная нуклеиновая кислота или полипептид может существовать в очищенной форме или может существовать в ненативной среде, например, такой как трансгенная клетка-хозяин.

[0055] Термины "инкубирование" и "инкубация", используемые в данном документе, означают способ смешивания двух или больше химических или биологических объектов (таких как химическое соединение и фермент) и предоставление им возможности взаимодействовать в условиях, благоприятных для получения композиции стевиоловых гликозидов.

[0056] Термин "вырожденный вариант" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей остаточную последовательность, которая отличается от контрольной последовательности нуклеиновой кислоты по одной или нескольким вырожденным заменам кодонов. Замены вырожденных кодонов могут быть достигнуты путем создания последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов замещено остатками смешанного основания и/или дезоксиинозина. Последовательность нуклеиновой кислоты и все ее вырожденные варианты будут экспрессировать одну и ту же аминокислоту или полипептид.

[0057] Термины "полипептид", "белок" и "пептид" представлены в соответствии с их обычными и общепринятыми значениями для специалиста в данной области техники; эти три термина иногда взаимозаменяемы и используются без ограничения для обозначения полимера аминокислот или аналогов аминокислот, независимо от их размера или функции. Хотя термин "белок" зачастую используется при ссылке на относительно большие полипептиды, а термин "пептид" зачастую используется при ссылке на небольшие полипептиды, - использование этих терминов в уровне техники перекрывается и варьирует. Используемый в данном документе термин "полипептид" относится к пептидам, полипептидам и белкам, если не указано иное. Термины "белок", "полипептид" и "пептид" используются в данном документе взаимозаменяемо в случае ссылки на полинуклеотидный продукт. Таким образом, полипептиды включают полинуклеотидные продукты, встречающиеся в природе полипептиды, гомологи, ортологи, паралоги, фрагменты и другие эквиваленты, варианты и аналоги вышеуказанных.

[0058] Термины "полипептидный фрагмент" и "фрагмент", в случае использования в отношении эталонного полипептида, представлены в их обычных и общепринятых значениях для специалиста в данной области техники и используются без ограничения для ссылки на полипептид, в котором аминокислотные остатки удалены по сравнению с самим эталонным полипептидом, но где оставшаяся аминокислотная последовательность обычно идентична соответствующим положениям в эталонном полипептиде. Такие делеции могут происходить на амино-конце и карбокси-конце эталонного полипептида или, как альтернатива, на обоих.

[0059] Термин "функциональный фрагмент" полипептида или белка относится к пептидному фрагменту, который является частью полноразмерного полипептида или белка и характеризуется практически такой же биологической активностью или выполняет по существу ту же функцию, что и полноразмерный полипептид или белок (например, проведение той же ферментативной реакции).

[0060] Термины "вариантный полипептид", "модифицированная аминокислотная последовательность" или "модифицированный полипептид", которые используются взаимозаменяемо, относятся к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонного полипептида одной или несколькими аминокислотами, например, одной или несколькими аминокислотными заменами, делециями и/или добавлениями. В одном аспекте вариант представляет собой "функциональный вариант", который сохраняет некоторые или все способности эталонного полипептида.

[0061] Термин "функциональный вариант" дополнительно включает консервативно замещенные варианты. Термин "консервативно замещенный вариант" относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от эталонного пептида одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами и сохраняет некоторую или всю активность эталонного пептида. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену аминокислотного остатка функционально подобным остатком. Примеры консервативных замен включают замену одного неполярного (гидрофобного) остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой; замену одного заряженного или полярного (гидрофильного) остатка на другой, как например, между аргинином и лизином, между глутамином и аспарагином, между треонином и серином; замену одного основного остатка, такого как лизин или аргинин, на другой; или замену одного кислотного остатка, такого как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, на другой; или замена одного ароматического остатка, такого как фенилаланин, тирозин или триптофан, на другой. Ожидается, что такие замены будут проявлять незначительный эффект или вообще не будут проявлять эффекта в отношении кажущейся молекулярной массы или изоэлектрической точки белка или полипептида. Фраза "консервативно замещенный вариант" также подразумевает пептиды, в которых остаток заменен химически дериватизированным остатком, при условии, что полученный пептид сохраняет часть или всю активность эталонного пептида, как описано в данном документе.

[0062] Термин "вариант" в связи с полипептидами согласно заявленной технологии дополнительно включает функционально активный полипептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью, на по меньшей мере 75%, по меньшей мере 76%, по меньшей мере 77%, по меньшей мере 78%, по меньшей мере 79%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже на 100% идентичной аминокислотной последовательности эталонного полипептида.

[0063] Термин "гомологичный" во всех его грамматических формах и вариациях правописания относится к связи между полинуклеотидами или полипептидами, которые имеют "общее эволюционное происхождение", в том числе полинуклеотидами или полипептидами из суперсемейств и гомологичными полинуклеотидами или белками из разных видов (Reeck et al., Cell 50:667, 1987). Такие полинуклеотиды или полипептиды характеризуются гомологией последовательностей, что отражается в сходстве их последовательностей, будь то в отношении процентов идентичности или присутствия конкретных аминокислот или мотивов в консервативных положениях. Например, два гомологичных полипептида могут иметь аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 75%, по меньшей мере 76%, по меньшей мере 77%, по меньшей мере 78%, по меньшей мере 79%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 900 по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92% , по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и даже на 100% идентичны.

[0064] Термин "подходящие регуляторные последовательности" представлен в своем обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники, и он используется без ограничения для обозначения нуклеотидных последовательностей, расположенных выше (5'-некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей последовательности, и которые могут оказывать влияние на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или на трансляцию ассоциированной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности могут включать в себя промоторы, лидерные последовательности трансляции, интроны и последовательности распознавания полиаденилирования.

[0065] Термин "промотор" представлен в своем обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники, и он используется без ограничения для обозначения последовательности ДНК, способной контролировать экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК. Как правило, кодирующая последовательность расположена на 3'-конце относительно промоторной последовательности. Промоторы могут быть получены полностью из нативного гена или могут состоять из разных элементов, полученных из разных промоторов, обнаруживаемых в природе, или даже содержать сегменты синтетической ДНК. Специалисты в данной области техники поймут, что различные промоторы могут управлять экспрессией гена в различных тканях или типах клеток, на различных стадиях развития или в ответ на различные условия окружающей среды. Промоторы, которые обуславливают экспрессию генов в большинстве типов клеток в большинстве случаев, чаще всего обычно называют "конститутивными промоторами". Кроме того, известно, что поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей не были полностью определены, то ДНК-фрагменты с разными значениями длины могут характеризоваться идентичной промоторной активностью.

[0066] Термин "функционально связанный" относится к ассоциации последовательностей нуклеиновой кислоты на одном фрагменте нуклеиновой кислоты таким образом, что функция одной регулируется другой. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он способен влиять на экспрессию данной кодирующей последовательности (т.e. кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.

[0067] Используемый в данном документе термин "экспрессия" должен пониматься в его обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники и использоваться без ограничения для обозначения транскрипции и стабильного накопления смысловой (mRNA) или антисмысловой РНК, происходящей из фрагмента нуклеиновой кислоты согласно заявленной технологии. "Сверхэкспрессия" относится к выработке генного продукта в трансгенных или рекомбинантных организмах, которая превышает уровни выработки в нормальных или нетрансформированных организмах.

[0068] Термин "трансформация" должен пониматься в его обычном и общепринятом значении для специалиста в данной области техники и использоваться без ограничения для обозначения переноса полинуклеотида в клетку-мишень. Перенесенный полинуклеотид может быть включен в геном или хромосомную ДНК клетки-мишени, что приводит к генетически стабильному наследованию, или он может реплицироваться независимо от хромосомы хозяина. Организмы-хозяева, содержащие трансформированные фрагменты нуклеиновой кислоты, называются "трансгенными" или

[0069] Термины "трансформированный", "трансгенный" и "рекомбинантный", в случае использования в данном документе в связи с клетками-хозяевами, представлены в их соответствующих обычных и общепринятых значениях для специалиста в данной области техники и используются без ограничения в отношении клетки организма-хозяина, такой как растительная или микробная клетка, в которую была введена гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть стабильно интегрирована в геном клетки-хозяина, или молекула нуклеиновой кислоты может присутствовать в виде внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может быть самореплицирующейся. Под трансформированными клетками, тканями или субъектами понимают не только конечный продукт процесса трансформации, но и его трансгенное потомство.

[0070] Термины "рекомбинантный", "гетерологичный" и "экзогенный", в случае использования в данном документе в связи с полинуклеотидами, представлены в их обычных и общепринятых значениях для специалиста в данной области техники и используются без ограничения для обозначения полинуклеотида (например, последовательности ДНК или гена), который происходит из источника, чужеродного по отношению к конкретной клетке-хозяину, или, если из того же источника, то модифицированного относительно своей первоначальной формы. Таким образом, гетерологичный ген в клетке-хозяине предусматривает ген, который является эндогенным для конкретной клетки-хозяина, однако был модифицирован, например, с помощью применения сайт-направленного мутагенеза или других рекомбинантных методов. Термины также включают не встречающиеся в природе множественные копии встречающейся в природе последовательности ДНК. Таким образом, термины относятся к сегменту ДНК, который является чужеродным или гетерологичным по отношению к клетке, или гомологичным по отношению к клетке, но в положении или форме внутри клетки-хозяина, в которой элемент обычно не обнаруживается.

[0071] Аналогично, термины "рекомбинантный", "гетерологичный" и "экзогенный", в случае использования в данном документе в связи с полипептидной или аминокислотной последовательностью, означают полипептидную или аминокислотную последовательность, которая происходит из источника, чужеродного по отношению к конкретной клетке-хозяину, или, если из того же источника, то модифицированного относительно своей первоначальной формы. Таким образом, рекомбинантные сегменты ДНК могут быть экспрессированы в клетке-хозяине с образованием рекомбинантного полипептида.

[0072] Термины "плазмида", "вектор" и "кассета" представлены в их соответствующих обычных и общепринятых значениях для специалиста в данной области техники и используются без ограничения для обозначения дополнительного хромосомного элемента, часто несущего гены, которые не являются частью центрального метаболизма клетки, и, как правило, в виде кольцевых двухнитевых молекул ДНК. Такие элементы могут представлять собой автономно реплицирующиеся последовательности, интегрируемые в геном последовательности, фаговые или нуклеотидные последовательности, линейные или кольцевые, одно- или двухнитевые ДНК или РНК, полученные из любого источника, в которых число нуклеотидных последовательностей было объединено или рекомбинировано в уникальную конструкцию, которая обладает способностью введения в клетку промоторного фрагмента и последовательности ДНК для выбранного генного продукта вместе с соответствующей 3'-нетранслируемой последовательностью.

[0073] "Кассета для трансформации" относится к конкретному вектору, содержащему чужеродный ген и имеющему элементы, в дополнение к чужеродному гену, которые способствуют трансформации конкретной клетки-хозяина.

[0074] "Кассета экспрессии" относится к конкретному вектору, содержащему чужеродный ген и содержащему элементы, в дополнение к чужеродному гену, которые обеспечивают усиленную экспрессию этого гена в чужеродном хозяине.

[0075] Настоящее изобретение относится к получению представляющего интерес стевиолового гликозида с помощью фермента B-glu1.

Биология синтеза

[0076] Применяемые в данном документе стандартные методики рекомбинантных ДНК и молекулярного клонирования хорошо известны из уровня техники и описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (далее в данном документе "Maniatis"); и в Silhavy, T.J., Bennan, M.L. and Enquist, L.W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1984; и в Ausubel, F.M. et al., In Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing and Wiley-Interscience, 1987; (полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки).

[0077] Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту обычной квалификации в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в данном документе, ниже будут описаны предпочтительные способы и материалы.

[0078] Гликозилирование часто считают убиквитарной реакцией, контролирующей биологическую активность и хранение растительных природных продуктов. Гликозилирование небольших молекул катализируется посредством суперсемейства трансфераз у большинства видов растений, которые были изучены до настоящего времени. Указанные гликозилтрансферазы (GT) были классифицированы на более чем 60 семейств. Из них семейство ферментов GT, также известных как UDP-гликозилтрансферазы (UGT), переносит UDP-активированные фрагменты сахара на специфические акцепторные молекулы. Они представляют собой молекулы, которые переносят такие фрагменты сахара в стевиоловых гликозидах для создания различных ребаудиозидов. Каждая из таких UGT имеет свой собственный профиль активности и предпочтительные структурные месторасположения, куда они переносят свои активированные фрагменты сахара.

Системы для получения

[0079] Экспрессия белков в прокариотах чаще всего осуществляется в бактериальной клетке-хозяине в присутствии векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, направляющие экспрессию слитых или не слитых белков. Слитые векторы добавляют некоторое количество аминокислот к белку, который они кодируют, обычно к аминоконцу рекомбинантного белка. Такие слитые векторы обычно служат трем целям: 1) увеличить экспрессию рекомбинантного белка; 2) повысить растворимость рекомбинантного белка и 3) помочь в очистке рекомбинантного белка, действуя в качестве лиганда в аффинной очистке. Часто в участок соединения слитого фрагмента и рекомбинантного белка вводят сайт протеолитического расщепления для обеспечения отделения рекомбинантного белка от слитого фрагмента после очистки слитого белка. Такие векторы находятся в пределах объема настоящего изобретения.

[0080] В одном варианте осуществления вектор экспрессии включает в себя указанные генетические элементы для экспрессии рекомбинантного полипептида в бактериальных клетках. Элементы для транскрипции и трансляции в бактериальной клетке могут включать в себя промотор, кодирующую область для белкового комплекса и терминатор транскрипции.

[0081] Специалист в данной области техники должен быть знаком с методами молекулярной биологии, доступными для получения векторов экспрессии. Полинуклеотид, используемый для включения в вектор экспрессии согласно заявленной технологии, описанной выше, может быть получен обычными методами, такими как полимеразная цепная реакция (ПЦР).

[0082] Разработан ряд методов молекулярной биологии для функционального связывания ДНК с векторами посредством комплементарных липких концов. В одном варианте осуществления к молекуле нуклеиновой кислоты для вставки в векторную ДНК могут быть добавлены комплементарные гомополимерные участки. Вектор и молекула нуклеиновой кислоты затем соединяются посредством водородных связей между комплементарными гомополимерными хвостами с образованием молекул рекомбинантной ДНК.

[0083] В альтернативном варианте осуществления для функционального связывания полинуклеотида согласно заявленной технологии с вектором экспрессии используют синтетические линкеры, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, В одном варианте осуществления полинуклеотид получают путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой. В одном варианте осуществления молекулу нуклеиновой кислоты обрабатывают ДНК-полимеразой бактериофага T4 или ДНК-полимеразой I E. coli, ферментами, которые удаляют выступающие 3'-однонитевые концы с их 3'-5'-экзонуклеолитическими активностями, и заполняют углубленными 3'-концами с их полимеризующими активностями, с получением тем самым сегментов ДНК с тупыми концами. Затем сегменты с тупыми концами инкубируют с большим молярным избытком молекул линкера в присутствии фермента, который способен катализировать лигирование молекул ДНК с тупыми концами, такого как ДНК-лигаза бактериофага T4. Таким образом, продуктом реакции является полинуклеотид, несущий на своих концах полимерные линкерные последовательности. Такие полинуклеотиды затем расщепляются с помощью соответствующего рестрикционного фермента и лигируются с вектором экспрессии, который расщепляется с помощью фермента, образующего концы, совместимые с таковыми у полинуклеотида.

[0084] Как альтернатива, можно использовать вектор, содержащий сайты безлигазного клонирования (LIC). Необходимый полинуклеотид, амплифицированный с помощью ПЦР, может быть затем клонирован в вектор LIC без рестрикционного расщепления или лигирования (Aslanidis and de Jong, Nucl. Acid. Res. 18 6069-74, (1990), Haun, et al, Biotechniques 13, 515-18 (1992), который включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме в такой степени, что он не противоречит настоящему документу).

[0085] В одном варианте осуществления для выделения и/или модификации полинуклеотида, представляющего интерес, для вставки в выбранную плазмиду целесообразно использовать ПЦР. Для использования при получении последовательности посредством ПЦР могут быть разработаны подходящие праймеры для выделения необходимой кодирующей области молекулы нуклеиновой кислоты, добавления рестрикционных эндонуклеаз или сайтов LIC, размещения кодирующей области в требуемой рамке считывания.

[0086] В одном варианте осуществления полинуклеотид для включения в вектор экспрессии согласно заявленной технологии получен путем применения ПЦР с использованием соответствующих олигонуклеотидных праймеров. Кодирующая область амплифицируется, тогда как сами праймеры включены в амплифицированный продукт последовательности. В одном варианте осуществления праймеры для амплификации содержат сайты узнавания рестрикционной эндонуклеазы, которые дают возможность клонировать амплифицированный продукт последовательности в соответствующий вектор.

[0087] Векторы экспрессии могут быть введены в рекомбинантную клетку-хозяина (например, растительные или микробные клетки-хозяева) с помощью традиционных методик трансформации или трансфекции. Трансформация подходящих клеток с помощью вектора экспрессии согласно заявленной технологии осуществляется с помощью способов, известных из уровня техники, и обычно зависит как от типа вектора, так и от клетки. Подходящие методы включают совместное осаждение фосфата кальция или хлорида кальция, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, липофекцию, химиопорацию или электропорацию.

[0088] Успешно трансформированные клетки, т. е. те клетки, которые содержат вектор экспрессии, можно идентифицировать с помощью способов, хорошо известных из уровня техники. Например, клетки, трансфицированные посредством вектора экспрессии согласно заявленной технологии, можно культивировать для получения полипептидов, описанных в данном документе. Клетки можно исследовать на наличие ДНК вектора экспрессии с помощью методик, хорошо известных из уровня техники.

[0089] Клетки-хозяева могут содержать одну копию описанного ранее вектора экспрессии, или, как альтернатива, несколько копий вектора экспрессии.

[0090] В некоторых вариантах осуществления трансформированная клетка представляет собой животную клетку, клетку насекомого, растительную клетку, клетку водорослей, клетку гриба или дрожжевую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой растительную клетку, выбранную из группы, состоящей из растительной клетки канолы, растительной клетки рапса, растительной клетки пальмы, растительной клетки подсолнечника, растительной клетки хлопка, растительной клетки кукурузы, растительной клетки арахиса, растительной клетки льна, растительной клетки кунжута, растительной клетки сои и растительной клетки петунии.

[0091] Микробная клетка-хозяин и другие системы экспрессии на основе клеток-хозяев и векторы экспрессии, содержащие регуляторные последовательности, которые направляют экспрессию высоких уровней чужеродных белков, хорошо известны специалистам в данной области техники. Любые из них можно использовать для конструирования векторов для экспрессии рекомбинантного полипептида согласно заявленной технологии в микробной клетке-хозяине. Такие векторы могут затем быть введены в соответствующие микроорганизмы посредством трансформации для обеспечения высокого уровня экспрессии рекомбинантного полипептида согласно заявленной технологии.

[0092] Векторы или кассеты, используемые для трансформации подходящих микробных клеток-хозяев и других клеток-хозяев, хорошо известны из уровня техники. Обычно вектор или кассета содержит последовательности, управляющие транскрипцией и трансляцией соответствующего полинуклеотида, селектируемый маркер и последовательности, обеспечивающие автономную репликацию или интеграцию в хромосому. Подходящие векторы содержат 5'-область полинуклеотида, которая несет элементы, управляющие инициацией транскрипции, и 3'-область ДНК фрагмента, которая управляет терминацией транскрипции. Предпочтительно, чтобы обе контрольных области были получены из генов, гомологичных трансформированной клетке-хозяину, хотя следует понимать, что такие контрольные области не должны быть получены из генов, нативных по отношению к конкретным видам, выбранным в качестве хозяина.

[0093] Контролирующие инициацию области или промоторы, которые подходят для управления экспрессией рекомбинантного полипептида в требуемой микробной клетке-хозяине или другой клетке-хозяине, многочисленны и знакомы специалистам в данной области техники. Фактически любой промотор, способный управлять этими генами, подходит для заявленной технологии, в том числе без ограничения CYCI, HIS3, GALI, GALIO, ADHI, PGK, PH05, GAPDH, ADCI, TRPI, URA3, LEU2, ENO, TPI (подходит для экспрессии в Saccharomyces); AOXI (подходит для экспрессии в Pichia); а также lac, trp, JPL, IPR, T7, tac и trc (подходят для экспрессии в Escherichia coli).

[0094] Области управления терминацией также можно получить из различных генов, нативных по отношению к предпочтительной клетке-хозяину. Сайт терминации необязательно может быть включен для микробных хозяев, описанных в данном документе.

[0095] В растительных клетках векторы экспрессии согласно заявленной технологии могут включать в себя кодирующую область, функционально связанную с промоторами, способными направлять экспрессию рекомбинантного полипептида согласно заявленной технологии в требуемых тканях на требуемой стадии развития. Для удобства, экспрессируемые полинуклеотиды могут содержать промоторные последовательности и лидерные последовательности трансляции, полученные из одного и того же полинуклеотида. Также должны присутствовать 3'-некодирующие последовательности, кодирующие сигналы терминации транскрипции. Векторы экспрессии также могут содержать один или несколько интронов для облегчения экспрессии полинуклеотидов.

[0096] Для растительных клеток-хозяев любая комбинация любого промотора и любого терминатора, способных индуцировать экспрессию кодирующей области, может использоваться в векторных последовательностях согласно заявленной технологии. Некоторые подходящие примеры промоторов и терминаторов включают гены нопалинсинтазы (nos), октопинсинтазы (ocs) и вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Одним типом эффективного промотора растения, который можно использовать, является высокоэффективный промотор растения. Такие промоторы в функциональной связи с вектором экспрессии согласно заявленной технологии должны быть способны стимулировать экспрессию вектора. Высокоэффективные растительные промоторы, которые можно использовать в заявленной технологии, включают промотор малой субъединицы(субъединиц) рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы, например, из сои (Berry-Lowe et al., J. Molecular and App. Gen., 1:483 498 (1982), полное содержание которого включено в данный документ в том объеме, в котором оно согласуется с ним), и промотор хлорофилл-связывающего белка. Известно, что эти два промотора индуцируются светом в растительных клетках (см., например, Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum, N.Y. (1983), страницы 29 38; Coruzzi, G. et al., The Journal of Biological Chemistry, 258: 1399 (1983) и Dunsmuir, P. et al., Journal of Molecular and Applied Genetics, 2:285 (1983), полное содержание которого включено в данный документ в том объеме, в котором оно согласуется с ним).

Способы разрушения клеток

[0097] Разрушение клеток представляет собой совокупность методик, применяемых для высвобождения представляющих интерес биомолекул из клетки. Многие получаемые биотехнологическим способом соединения являются внутриклеточными и подлежат высвобождению из клеток перед выделением. Эффективное выделение продуктов требует проведения разрушения клеток, которое может быть достигнуто с помощью различных способов и технологий, способов, являющихся либо механическими, либо немеханическими, в зависимости от представляющей интерес биомолекулы и применяемой клеточной системы. Следует отметить, что все способы разрушения будут обеспечивать высвобождение представляющих интерес молекул, в данном случае стевиоловых гликозидов, и других молекул, которые могут вызвать расщепление представляющих интерес белков в лизате. Для предотвращения этого необходимо принимать меры, если активность белка является важной для последующих операций. Лизирование образцов в высокоденатурирующих растворах или при высоком значении pH минимизирует ферментативную активность. Проведение разрушения на льду или при более низких температурах будет также способствовать минимизации деградации образцов. Таким образом, одной из методик подавления протеазной активности является обеспечение присутствия смеси ингибиторов основных типов фосфатаз в лизате после проведения разрушения.

Известные методики разрушения, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением

[0098] Стандартные способы разрушения включают механическую гомогенизацию, пресс Френча, воздействие ультразвуком, гомогенизацию посредством гранул, растирание, лизис замораживанием-оттаиванием, лизис посредством обработки детергентом, ферментативный лизис и осмотический лизис.

[0099] Механическая гомогенизация включает применение ручного устройства, такого как гомогенизатор Даунса, или чего-то наподобие блендера для гомогенизации ткани. Данный способ является применимым для типа растительного материала, не относящегося к семенам, или для мягких тканей (т. е. ткани печени).

[00100] В прессе Френча применяется сила сдвига для гомогенизации ткани. Примером этого будет служить взятие суспензии клеток и проталкивание ее через шприц малого диаметра с применением цилиндра и поршня шприца. Данный способ эффективен в отношении бактерий, дрожжей, грибов, водорослей и культуры клеток млекопитающих, но является трудным для масштабирования.

[00101] При воздействии ультразвуком применяют короткие импульсы ультразвуковых волн для разрушения ткани. Данный способ приводит к образованию большого количества тепла и, как правило, его нужно будет выполнять на льду для сохранения белка. Данный способ также эффективен в отношении бактерий, дрожжей, грибов, водорослей и культуры клеток млекопитающих и является предпочтительным способом для настоящего изобретения.

[00102] Гомогенизация посредством гранул предусматривает применение стеклянных или металлических гранул для обеспечения мягкого абразивного действия при их перемешивании на вортексе вместе с тканью или суспензией клеток. Растирание предусматривает применение ступки и пестика для гомогенизации образца ткани. Наиболее распространенным способом является замораживание и растирание образца с применением жидкого азота. Лизис замораживанием-оттаиванием фактически соответствует своему названию, при котором применяют жидкий азот или морозильную камеру для замораживания клеток, а затем обеспечивают их оттаивание. Когда клетки замораживают, вода внутри клеток расширяется по мере своего замораживания, обуславливая разрыв клеток. Данный способ эффективен в отношении клеток млекопитающих.

[00103] Ферментативный лизис включает суспендирование клеток в изоосмотических буферах, содержащих ферменты, которые способны расщеплять клеточную стенку (т. е. зимолиазу для дрожжевых клеток). Данный способ лизиса часто применяют в сочетании с другой методикой разрушения (обычно воздействием ультразвуком) для обеспечения полного лизиса образца. Данная методика эффективна в отношении бактерий, дрожжей, грибов, водорослей, не относящегося к семенам растительного материала и культуры клеток млекопитающих и является методикой, которая также предусмотрена для применения в настоящем изобретении.

[00104] Лизис посредством обработки детергентом предусматривает суспендирование клеток в растворе детергента для растворения клеточной мембраны с высвобождением содержимого клеток. В данном способе также обычно применяют другой способ лизиса, такой как воздействие ультразвуком, для обеспечения полного лизиса. Данный способ эффективен в отношении культуры клеток млекопитающих.

[00105] Осмотический лизис предусматривает суспендирование клеток в гипотоническом (с низким содержанием соли) растворе. Это вызывает набухание и впоследствии разрыв клеток с высвобождением содержимого клеток для дальнейшего использования.

[00106] Как правило, в способе in vitro согласно заявленной технологии весовое отношение рекомбинантного полипептида к субстрату в пересчете на сухой вес составляет от приблизительно 1:100 до приблизительно 1:5, предпочтительно от приблизительно 1:50 до приблизительно 1:10, более предпочтительно от приблизительно 1:25 до приблизительно 1:15.

[00107] Как правило, температура реакции в способе in vitro составляет от приблизительно 20°С до приблизительно 40°С, в подходящем случае от 25°С до приблизительно 37°С, в более подходящем случае от 28°С до приблизительно 32°С.

[00108] Специалист в данной области поймет, что композиция стевиоловых гликозидов, полученная с помощью описанного в данном документе способа, может быть дополнительно очищена и смешана с другими стевиоловыми гликозидами, ароматизаторами или подсластителями с получением требуемого вкуса или композиции подсластителя. Например, композицию, обогащенную ребаудиозидом D4 или ребаудиозидом M, полученным, как описано в данном документе, можно смешивать с природным экстрактом стевии, содержащим ребаудиозид А как преобладающий стевиоловый гликозид, или с другими синтетическими или природными стевиол-гликозидными продуктами с получением требуемой композиции подсластителя. Как альтернатива, практически очищенный стевиоловый гликозид (например, ребаудиозид D4 или ребаудиозид M), полученный из композиции стевиоловых гликозидов, описанной в данном документе, можно объединять с другими подсластителями, такими как сахароза, мальтодекстрин, аспартам, сукралоза, неотам, ацесульфам калия и сахарин. Количество стевиолового гликозида относительно других подсластителей можно регулировать для получения требуемого вкуса, как известно из уровня техники. Описанная в данном документе композиция стевиоловых гликозидов (включающая ребаудиозид D, ребаудиозид E, ребаудиозид D4, ребаудиозид M или их комбинацию) может быть включена в пищевые продукты (такие как напитки, безалкогольные напитки, мороженое, молочные продукты, кондитерские изделия, крупы, жевательная резинка, хлебобулочные изделия и др.), биологически активные добавки, лечебное питание, а также фармацевтические продукты.

Анализ сходства последовательностей с использованием оценки идентичности

[00109] Используемый в данном документе термин "идентичность последовательности" относится к степени, в которой две оптимально выровненные полинуклеотидные или пептидные последовательности являются инвариантными во всем окне выравнивания компонентов, например нуклеотидов или аминокислот. "Доля идентичности" для выровненных сегментов тестовой последовательности и эталонной последовательности представляет собой количество идентичных компонентов, которые являются общими для двух выровненных последовательностей, деленное на общее число компонентов в сегменте эталонной последовательности, т. е. всей эталонной последовательности или определенной меньшей части эталонной последовательности.

[00110] Используемый в данном документе термин "процентная идентичность последовательности" или "процентная идентичность" относится к проценту идентичных нуклеотидов в линейной полинуклеотидной последовательности эталонной ("запрашиваемой") молекулы полинуклеотида (или ее комплементарной нити) по сравнению с тестовой ("субъект") полинуклеотидной молекулой (или ее комплементарной нитью), когда две последовательности оптимально выровнены (с соответствующими вставками нуклеотидов, делециями или гэпами, составляющими в общем итоге менее 20 процентов эталонной последовательности в окне сравнения). Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения хорошо известно специалистам в данной области техники и может осуществляться с помощью таких инструментов, как алгоритм локальной гомологии Смита и Ватермана, алгоритм гомологичного выравнивания Нидлмана и Вунша, способ поиска подобия Персона и Липмана, и предпочтительно с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов, таких как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, доступных как часть GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Берлингтон, Массачусетс). "Доля идентичности" для выровненных сегментов тестовой последовательности и эталонной последовательности представляет собой количество идентичных компонентов, которые являются общими для двух выровненных последовательностей, деленное на общее число компонентов в сегменте эталонной последовательности, т. е. всей эталонной последовательности или определенной меньшей части эталонной последовательности. Процент идентичности последовательностей представлен как доля идентичности, умноженная на 100. Сравнение одной или нескольких полинуклеотидных последовательностей можно осуществлять с полноразмерной полинуклеотидной последовательностью или ее частью или с более длинной полинуклеотидной последовательностью. Для целей настоящего изобретения "процент идентичности" также можно определить с использованием BLASTX версии 2.0 для транслированных нуклеотидных последовательностей и BLASTN версии 2.0 для полинуклеотидных последовательностей.

[00111] Процент идентичности последовательностей предпочтительно определяют с использованием программы "Best Fit" или "Gap" Sequence Analysis Software Package™ (версия 10; Genetics Computer Group, Inc., Мадисон, Висконсин). В "Gap" используется алгоритм Нидлмана и Вунша (Needleman and Wunsch, Journal of Molecular Biology 48:443-453, 1970), чтобы найти выравнивание двух последовательностей, который доводит до максимума число совпадений и сводит к минимуму число гэпов. В "BestFit" выполняют оптимальное выравнивание наилучшего сегмента сходства между двумя последовательностями и вставляют гэпы, чтобы максимизировать количество совпадений, с использованием алгоритма локальной гомологии Смита и Ватермана (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981, Smith et al., Nucleic Acids Research 11:2205-2220, 1983). Процент идентичности наиболее предпочтительно определяется с помощью программы "Best Fit".

[00112] Подходящие способы для определения идентичности последовательностей также раскрыты в программах Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), которые общедоступны в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) в Национальной медицинской библиотеке, Национальный институт здравоохранения, Бетесда, Мэриленд. 20894; см. BLAST Manual, Altschul et al., NCBI, NLM, NIH; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); версия 2.0 или выше программ BLAST позволяет вводить гэпы (удаления и вставки) в выравнивания; для пептидной последовательности BLASTX может использоваться для определения идентичности последовательностей и для полинуклеотидной последовательности BLASTN может использоваться для определения идентичности последовательностей.

[00113] Используемый в данном документе термин "существенная процентная идентичность последовательности" относится к процентной идентичности последовательностей, составляющей по меньшей мере приблизительно 70% идентичность последовательностей, по меньшей мере приблизительно 80% идентичность последовательностей, по меньшей мере приблизительно 85% идентичность, по меньшей мере приблизительно 90% идентичность последовательностей или даже большую идентичность последовательностей, такую как приблизительно 98% или приблизительно 99% идентичность последовательностей. Таким образом, один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой полинуклеотидную молекулу, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности или даже большей идентичностью последовательности, такой как приблизительно 98% или приблизительно 99% идентичностью последовательности с полинуклеотидной последовательностью, описанной в данном документе. Полинуклеотидные молекулы, которые характеризуются активностью генов бета-глюкозидазы по настоящему изобретению, способны направлять выработку различных стевиоловых гликозидов и характеризуются значительной процентной идентичностью последовательностей с полинуклеотидными последовательностями, представленными в данном документе, и охвачены объемом настоящего изобретения.

Идентичность и сходство

[00114] Идентичность представляет собой долю аминокислот, которые являются одинаковыми между парой последовательностей после выравнивания последовательностей (что может быть выполнено с использованием только информации о последовательности, или структурной информации, или некоторой другой информации, но обычно она основана только на информации о последовательности), и сходство представляет собой оценку, назначаемую на основе выравнивания с использованием некоторой матрицы сходства. Индекс сходства может быть любым из следующих BLOSUM62, PAM250 или GONNET, или любой матрицей, используемой специалистом в данной области техники для выравнивания последовательностей белков.

[00115] Идентичность представляет собой степень соответствия между двумя подпоследовательностями (без гэпов между последовательностями). Идентичность 25% или выше подразумевает сходство функций, тогда как 18-25% подразумевает сходство структуры или функции. Следует иметь в виду, что две совершенно не связанные или случайные последовательности (которые составляют больше 100 остатков) могут характеризоваться идентичностью, составляющей более 20%. Сходство представляет собой степень подобия между двумя последовательностями при их сравнении. Это зависит от их идентичности.

[00116] Как очевидно из предшествующего описания, определенные аспекты настоящего изобретения не ограничены конкретными деталями примеров, проиллюстрированных в данном документе, и поэтому предполагается, что другие модификации и применения или их эквиваленты будут иметь место для специалистов в данной области техники. Соответственно, предполагается, что формула изобретения должна охватывать все такие модификации и применения, которые не выходят за пределы сущности и объема настоящего изобретения.

[00117] Кроме того, если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные, или эквивалентные, или описанные в данном документе, могут использоваться при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, причем предпочтительные способы и материалы описаны выше.

[00118] Хотя для целей понимания вышеизложенное изобретение было описано более подробно с помощью иллюстрации и примера, специалистам в данной области техники будет очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть осуществлены на практике. Следовательно, описание и примеры не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения, который установлен приложенной формулой изобретения.

[00119] В соответствии с настоящим изобретением бета-глюкозидаза ("B-glu1") может применяться для осуществления гидролиза стевиоловых гликозидов и снижения получения нежелательных стевиоловых гликозидов согласно новому способу. Присутствие нежелательных стевиоловых гликозидов в экстракте или продуктах ферментации стевии негативно влияет на общий вкусовой профиль и применимость стевиоловых гликозидов. Посредством сокращения стадий получения настоящее изобретение обеспечит снижение стоимости как очистки, так и получения требуемых стевиоловых гликозидов в неочищенном экстракте стевии.

[00120] Настоящее изобретение станет более понятным при рассмотрении следующих неограничивающих примеров. Следует понимать, что примеры ниже, несмотря на то, что указываются предпочтительные варианты осуществления заявленной технологии, приведены только для наглядности. Из вышеприведенного обсуждения и этих примеров специалист в данной области техники сможет установить существенные характеристики заявленной технологии и не отклоняясь от его идеи и объема сможет осуществить различные изменения и модификации заявленной технологии для адаптации его к различным видам применения и условиям.

Пример 1. Идентификация бета-гликозидазы в Pichia pastoris

[00121] В соответствии с настоящим изобретением проводили анализ генома Pichia pastoris и идентифицировали несколько кандидатных генов бета-гликозидазы. Полноразмерные фрагменты ДНК всех кандидатных генов бета-глюкозидазы коммерчески синтезировали. Практически все кодоны cDNA заменяли на таковые, являющиеся предпочтительными для E. coli (Genscript, Нью-Джерси). Синтезированную ДНК клонировали в бактериальный вектор экспрессии pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen). Такие же эксперименты можно выполнять в отношении Yarrowia lipolytica с использованием последовательностей, оптимизированных для такого применения.

[00122] Каждую экспрессионную конструкцию трансформировали в E. coli BL21 (DE3), которую впоследствии выращивали в среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, при 37°С до достижения OD600 0,8-1,0. Экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и культуру дополнительно выращивали при 16°C в течение 22 часов. Клетки собирали с помощью центрифугирования (3000 х g; 10 мин; 4°С). Клеточный осадок собирали и использовали сразу или хранили при -80°С.

[00123] Клеточный осадок, как правило, ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,2, 25 мкг/мл лизоцима, 5 мкг/мл ДНКазы I, 20 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 10% глицерина и 0,4% Triton Х-100). Клетки разрушали с помощью ультразвука при 4°С, и клеточный дебрис отделяли с помощью центрифугирования (18000 x g; 30 мин). Надосадочную жидкость загружали в уравновешенную аффинную колонку (уравновешивающий буфер: 50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,2, 20 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, 10% глицерин) Ni-NTA (Qiagen). После загрузки образца белка колонку промывали уравновешивающим буфером для удаления несвязанных загрязняющих белков. His-меченые рекомбинантные полипептиды бета-глюкозидазы элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 250 мМ имидазол.

[00124] Очищенные кандидатные рекомбинантные полипептиды бета-глюкозидазы анализировали в отношении дегликозилирующей активности с применением различных стевиоловых гликозидов в качестве субстрата. Как правило, рекомбинантный полипептид (10 мкг) тестировали в 300 мкл реакционной системы in vitro. Реакционная система содержит 50 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,2, 1 мг/мл стевиолового гликозида. Реакцию проводили при 30-37°C, и в 50 мкл реакционной смеси реакцию прекращали путем добавления 200 мкл 1-бутанола в разные моменты времени. Образцы экстрагировали трижды с помощью 200 мкл 1-бутанола. Объединенную фракцию высушивали и растворяли в 100 мкл 80% метанола для анализа посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

[00125] Клетки Pichia суспендировали в буфере для экстракции (50 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,2; 150 мМ NaCl). После воздействия ультразвуком супернатант (неочищенный экстракт) собирали путем центрифугирования с параметрами 12000 g при 4℃. Полученный в результате неочищенный белок (50 мкг) тестировали в 300 мкл реакционной системы in vitro. Реакционная система содержит 50 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,2, 1 мг/мл стевиолового гликозида. Реакцию проводили при 30-37°C, и в 50 мкл реакционной смеси реакцию прекращали путем добавления 200 мкл 1-бутанола в разные моменты времени. Образцы экстрагировали трижды с помощью 200 мкл 1-бутанола. Объединенную фракцию высушивали и растворяли в 100 мкл 80% метанола для анализа посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

[00126] Затем осуществляли HPLC-анализ с применением системы Dionex UPLC ultimate 3000 (Саннивейл, Калифорния), включающей в себя четвертичный насос, отсек колонки с регулируемой температурой, автоматический пробоотборник и датчик поглощения УФ-излучения. Колонку Synergi Hydro-RP (Phenomenex) с защитной колонкой использовали для получения характеристик стевиоловых гликозидов в объединенных образцах. Ацетонитрил в воде использовали в качестве подвижной фазы в HPLC-анализе. Длина волны детектирования, применяемая в HPLC-анализе, составляла 210 нм. После проведения скрининга активности авторы настоящего изобретения обнаружили, что бета-глюкозидаза (B-glu1, SEQ: 1) обладает сильной активностью в отношении расщепления соответствующих стевиоловых гликозидов и, следовательно, является применимым инструментом в получении представляющих интерес стевиоловых гликозидов.

Пример 2. Гидролиз рубузозида с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia

[00127] Рубузозид можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток Pichia с получением стевиол-13-глюкозида. Полученный стевиол-13-глюкозид можно подвергать последующему гидролизу с получением стевиола (фиг. 1B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л рубузозида в качестве субстрата. Как показано на фиг. 1A, B-glu1 способна удалять глюкозильную группу в положении C19 рубузозида с получением стевиол-13-глюкозида (фиг. 1A - c). Полученный стевиол-13-глюкозид (S-13-G) будет подвергнут превращению в стевиол в более поздний момент времени (фиг. 1A - d). B-glu1 обеспечивает удаление другой глюкозильной группы в положении C13 стевиол-13-глюкозида. Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза рубузозида до стевиол-13-глюкозида и впоследствии получения стевиола непрерывным образом (фиг. 1A - e и f).

Пример 3. Гидролиз стевиозида с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia

[00128] Стевиозид можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток Pichia с получением стевиолбиозида (фиг. 2B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л стевиозида в качестве субстрата. Как показано на фиг. 2, B-glu1 способна удалять глюкозильную группу в положении C19 стевиозида с получением стевиолбиозида (фиг. 2A - c и d). Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенные клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза стевиозида до стевиолбиозида (фиг. 8C).

Пример 4. Гидролиз ребаудиозида E с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia

[00129] Ребаудиозид E можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением стевиолбиозида (фиг. 3B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л ребаудиозида E в качестве субстрата. Как показано на фиг. 3, B-glu1 способна удалять глюкозильную группу в положении C19 ребаудиозида E с получением стевиозида и стевиолбиозида (фиг. 3A, c-e). Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза ребаудиозида E до стевиолбиозида (фиг. 8D).

Пример 5. Гидролиз ребаудиозида A с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia

[00130] Ребаудиозид A можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением ребаудиозида B (фиг. 4B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л ребаудиозида A в качестве субстрата. Как показано на фиг. 4, B-glu1 способна обеспечивать удаление глюкозильных групп в положении C19 ребаудиозида A с получением ребаудиозида B (фиг. 4A, c-d). Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза ребаудиозида A до ребаудиозида B (фиг. 8e).

Пример 6. Гидролиз ребаудиозида I с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia

[00131] Ребаудиозид I можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением ребаудиозида A, а полученный ребаудиозид A можно подвергать гидролизу с получением ребаудиозида B (фиг. 5B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л ребаудиозида I в качестве субстрата. Как показано на фиг. 5, B-glu1 способна удалять глюкозильную группу в положении C19 ребаудиозида I с получением ребаудиозида A и последовательно удалять другую глюкозильную группу в положении C19 ребаудиозида A с получением ребаудиозида B (фиг. 5A, d-f). Ребаудиозид I может быть полностью превращен в ребаудиозид A к моменту времени 24 ч. (фиг.5A, f). Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза ребаудиозида I до ребаудиозида B (фиг. 8, f).

Пример 7. Гидролиз ребаудиозида D с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia

[00132] Ребаудиозид D можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 с получением ребаудиозида B (фиг. 6B) и Reb A. Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л ребаудиозида D в качестве субстрата. Как показано на фиг. 6, B-glu1 способна обеспечивать удаление глюкозильных групп в положении C19 ребаудиозида D с получением ребаудиозида (фиг. 6A, c-e). Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза ребаудиозида D до ребаудиозида B (фиг. 8g).

Пример 8. Гидролиз ребаудиозида G с применением рекомбинантной B-glu1 и разрушенных клеток Pichia

[00133] Ребаудиозид G можно подвергать гидролизу с помощью рекомбинантного фермента B-glu1 и разрушенных клеток Pichia с получением стевиол-13-глюкозида. Полученный стевиол-13-глюкозид может быть непрерывным образом подвергнут последующему гидролизу с получением стевиола (фиг. 7B). Реакции осуществляли, как описано в примере 1. В реакционную смесь добавляли 1 г/л ребаудиозида G в качестве субстрата. Как показано на фиг. 7A, B-glu1 способна обеспечивать удаление глюкозильных групп в положениях C13 и C19 ребаудиозида G с получением стевиол-13-глюкозида (фиг. 7A, b-c). Полученный стевиол-13-глюкозид (S-13-G) будет подвергнут превращению в стевиол (фиг. 7A). Полученный стевиол-13-глюкозид будет полностью превращен в стевиол к моменту времени 24 ч. (фиг. 7A, d). B-glu1 обеспечивает удаление другой глюкозильной группы в положении C13 стевиол-13-глюкозида. Поскольку B-glu1 является внутриклеточным ферментом в клетках Pichia, из разрушенных клеток Pichia высвобождается фермент B-glu1, который характеризуется идентичной ферментативной активностью с осуществлением гидролиза ребаудиозида G до стевиол-13-глюкозида и впоследствии получения стевиола непрерывным образом (фиг.7A, e).

[00134] В соответствии с настоящим изобретением авторы настоящего изобретения идентифицировали и количественно определили ферментативную активность бета-глюкозидазы в отношении клеточного лизата Pichia pastoris. Данный фермент характеризуется специфической активностью, которая позволяет ему осуществлять гидролиз конкретных стевиоловых гликозидов (таблица 1). Со ссылкой на фиг. 7, Reb G гидролизируется ферментом B-glu1 и разрушенными клетками Pichia. HPLC показывает продукты гидролиза Reb G. В ходе этой работы получали стевиол ("S"); стевиол-13-глюкозид ("S-13-G"); рубузозид ("Rub"). Временная динамика представляла собой серию моментов времени на протяжении 24 часов. Стевиол-13-глюкозид ("S-13-G") и стевиол получали с помощью культур рекомбинантной Pichia pastoris.

[00135] Применяя данную методику, авторы настоящего изобретения осуществили гидролиз Reb M с удалением Reb A, Reb D3, Reb D4, Reb W, Reb V, Reb E, Reb I и Reb D для увеличения эффективности очистки (фиг. 9). Данная методика предусматривает применение стевиозида и Reb A с получением стевиола, стевиол-13-O-глюкозида, стевиолбиозида и Reb B посредством бета-глюкозидазной биоконверсии. Со ссылкой на фиг. 8, стевиоловые гликозиды подвергали гидролизу с помощью разрушенных клеток Pichia pastoris. Образцы включали стандарт стевиолбиозида ("SB") и ребаудиозида B ("B"). В ходе проведенных авторами настоящего изобретения экспериментов стевиозид гидролизовали с помощью разрушенных клеток Pichia в момент времени 24 часа; Reb E и Reb A гидролизировали с помощью разрушенных клеток Pichia в момент времени 24 часа. Аналогичным образом, Reb I и Reb D гидролизовали с помощью разрушенных клеток Pichia в момент времени 24 часа (фиг. 8).

[00136] В другом варианте осуществления настоящего изобретения авторы настоящего изобретения могут применять бета-глюкозидазу для контроля путей получения стевиоловых гликозидов. (например, Reb M из Reb W) (фиг. 10).

[00137] В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения бета-глюкозидаза может применяться для осуществления гидролиза дополнительных стевиоловых гликозидов, в том числе Reb V, Reb W, Reb Z1, Reb Z2, Reb D3 и Reb D4, с обеспечением получения из них представляющих интерес стевиоловых гликозидов (фиг. 9). После этого авторы настоящего изобретения могут разделять, собирать и концентрировать гидролизованные продукты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения авторы настоящего изобретения применяют дефицитный по бета-глюкозидазе штамм, который обеспечит снижение получения побочных продуктов согласно способу биоконверсии авторов настоящего изобретения.

Таблица 1. Обобщенные результаты гидролиза стевиоловых гликозидов с помощью B-glu1
Субстрат	Продукты
Rub	Стевиол-13-O-глюкозид (S-13-G), стевиол
Стевиозид	Стевиолбиозид (SB)
Reb E	Стевиозид, стевиолбиозид (SB)
Reb A	Reb B
Reb I	Reb A, Reb B
Reb D	Reb B
Reb G	Стевиол-13-O-глюкозид (S-13-G), стевиол
Reb B	Расщепление не происходит
Reb M	Расщепление не происходит

ЗАЯВЛЕНИЕ О ПРОМЫШЛЕННОЙ ПРИМЕНИМОСТИ/ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[00138] Настоящее изобретение применимо в областях промышленности, связанных с производством продуктов питания, кормов, напитков, а также в фармакологической промышленности. Настоящее изобретение в целом относится к способу биосинтеза стевиоловых гликозидов посредством гидролиза бета-глюкозидазой.

Литературные источники, процитированные и включенные посредством ссылки

1. Brandle, J. E. et al., (1998). Stevia Rebaudiana: Its Agricultural, Biological, and Chemical Properties, Canadian J. Plant Science. 78 (4): 527-36.

2. Ceunen, S., and J.M. C. Geuns, Steviol Glycosides: Chemical Diversity, Metabolism, and Function, J. Nat. Prod., 2013, 76 (6), pp 1201-28 (2013).

3. Du J et al., (2011), Engineering microbial factories for synthesis of value-added products, J Ind Microbiol Biotechnol. 38: 873-90.

4. GRAS Notices, USA Food and Drug Administration, United States Health & Human Services. (2016) (относится к стевиоловым гликозидам и полигликозидам).

5. A, and T., (1997), Microbial production of natural flavors, ASM News 63:551-59.

6. Prakash I., et al.; Isolation and Characterization of a Novel Rebaudioside M Isomer from a Bioconversion Reaction of Rebaudioside A and NMR Comparison Studies of Rebaudioside M Isolated from Stevia rebaudiana Bertoni and Stevia rebaudiana Morita, Biomolecules, 2014 Jun; 4(2): 374-89. (Опубликован онлайн 31 марта 2014 г. 2014).

7. Prakash I., et al., Development of Next Generation Stevia Sweetener: Rebaudioside M, Foods, 2014, 3:162-175.

8. Shockey JM. Et a., (2003), Arabidopsis contains a large superfamily of acyl-activating enzymes: phylogenetic and biochemical analysis reveals a new class of acyl-coenzyme A synthetases. Plant Physiol 132 1065-76.

Последовательности, представляющие интерес

Последовательности

B-glu1

Аминокислотная последовательность B-glu1 (SEQ ID NO: 1) Pichia pastoris (GS115)

Mtqldvesliqeltlnekvqllsgsdfwhttpvrrlgipkmrlsdgpngvrgtkffngvptacfpcgtglgatfdkellkeagslmadeakakaasvvlgptaniargpnggrgfesfgedpvvnglssaaminglqgkyiaatmkhyvcndlemdrncidaqvshralrevyllpfqiavrdanpraimtaynkangehvsqskflldevlrkewgwdgllmsdwfgvydakssitngldlempgppqcrvhsatdhainsgeihindvdervrsllslinychqsgvteedpetsdnntpetieklrkisresivllkdddrnrsilplkksdkiavignnakqaaycgggsasvlsyhtttpfdsiksrledsntpaytigadayknlpplgpqmtdsdgkpgfdakffvgsptskdrklidhfqltnsqvflvdyyneqipenkefyvdvegqfipeedgtynfgltvfgtgrlfvddklvsdssqnqtpgdsffglaaqevigsihlvkgkaykikvlygssvtrtyeiaasvafeggaftfgaakqrnedeeiaraveiakandkvvlciglnqdfesegfdrpdikipgatnkmvsavlkanpntvivnqtgtpvempwasdapvilqawfggseagtaiadvlfgdynpsgkltvtfplrfednpaylnfqsnkqacwygedvyvgyryyetidrpvlfpfghglsftefdftdmfvrleeenlevevvvrntgkydgaevvqlyvapvspslkrpikelkeyakiflasgeaktvhlsvpikyatsffdeyqkkwcsekgeytillgsssadikvsqsitlekttfwkgl

ДНК B-glu1 (SEQ ID NO: 2) (оптимизированная по кодонам для E. coli)

ATGACCCAACTGGATGTGGAGAGCCTGATTCAAGAGCTGACCCTGAACGAAAAGGTGCAACTGCTGAGCGGTAGCGACTTCTGGCATACCACCCCGGTTCGTCGTCTGGGCATCCCGAAGATGCGTCTGAGCGACGGTCCGAACGGCGTTCGTGGTACCAAATTCTTTAACGGTGTTCCGACCGCGTGCTTCCCGTGCGGTACCGGTCTGGGCGCGACCTTTGACAAGGAACTGCTGAAAGAGGCGGGTAGCCTGATGGCGGATGAAGCGAAAGCGAAAGCGGCGAGCGTGGTTCTGGGTCCGACCGCGAACATTGCGCGTGGTCCGAACGGTGGCCGTGGCTTCGAGAGCTTCGGCGAGGACCCGGTGGTTAACGGTCTGAGCAGCGCGGCGATGATCAACGGCCTGCAGGGCAAGTACATTGCGGCGACCATGAAACACTATGTTTGCAACGATCTGGAAATGGACCGTAACTGCATTGACGCGCAAGTTAGCCACCGTGCGCTGCGTGAGGTGTACCTGCTGCCGTTCCAAATCGCGGTGCGTGATGCGAACCCGCGTGCGATTATGACCGCGTATAACAAGGCGAACGGCGAACACGTTAGCCAGAGCAAATTCCTGCTGGACGAAGTGCTGCGTAAGGAGTGGGGCTGGGATGGTCTGCTGATGAGCGACTGGTTTGGTGTTTACGATGCGAAAAGCAGCATCACCAACGGCCTGGACCTGGAGATGCCGGGTCCGCCGCAGTGCCGTGTGCACAGCGCGACCGATCACGCGATCAACAGCGGCGAAATCCACATTAACGATGTTGACGAGCGTGTGCGTAGCCTGCTGAGCCTGATTAACTACTGCCACCAAAGCGGTGTTACCGAGGAAGATCCGGAAACCAGCGACAACAACACCCCGGAAACCATCGAGAAGCTGCGTAAAATCAGCCGTGAGAGCATTGTGCTGCTGAAGGACGATGACCGTAACCGTAGCATTCTGCCGCTGAAGAAAAGCGACAAAATCGCGGTTATTGGTAACAACGCGAAACAAGCGGCGTATTGCGGTGGCGGTAGCGCGAGCGTGCTGAGCTATCACACCACCACCCCGTTCGACAGCATCAAGAGCCGTCTGGAAGATAGCAACACCCCGGCGTACACCATTGGTGCGGACGCGTATAAAAACCTGCCGCCGCTGGGTCCGCAAATGACCGATAGCGACGGCAAGCCGGGTTTTGATGCGAAATTCTTTGTTGGCAGCCCGACCAGCAAGGATCGTAAACTGATCGACCACTTCCAGCTGACCAACAGCCAAGTTTTTCTGGTGGACTACTATAACGAACAGATCCCGGAAAACAAGGAGTTCTACGTTGACGTGGAGGGTCAATTTATTCCGGAGGAAGATGGCACCTATAACTTCGGTCTGACCGTGTTTGGTACCGGCCGTCTGTTCGTTGATGACAAACTGGTTAGCGACAGCAGCCAGAACCAAACCCCGGGCGATAGCTTCTTTGGTCTGGCGGCGCAGGAAGTGATCGGCAGCATTCACCTGGTGAAGGGTAAAGCGTACAAGATCAAAGTTCTGTATGGCAGCAGCGTGACCCGTACCTACGAAATTGCGGCGAGCGTTGCGTTTGAGGGCGGTGCGTTCACCTTTGGTGCGGCGAAACAGCGTAACGAAGACGAGGAAATCGCGCGTGCGGTGGAGATTGCGAAGGCGAACGACAAAGTGGTTCTGTGCATCGGCCTGAACCAAGATTTCGAAAGCGAGGGTTTTGATCGTCCGGACATCAAGATTCCGGGCGCGACCAACAAAATGGTTAGCGCGGTGCTGAAGGCGAACCCGAACACCGTTATTGTGAACCAGACCGGTACCCCGGTTGAGATGCCGTGGGCGAGCGATGCGCCGGTGATCCTGCAAGCGTGGTTTGGCGGTAGCGAGGCGGGTACCGCGATTGCGGATGTTCTGTTTGGCGACTACAACCCGAGCGGCAAGCTGACCGTGACCTTCCCGCTGCGTTTTGAGGATAACCCGGCGTACCTGAACTTCCAGAGCAACAAACAAGCGTGCTGGTATGGCGAAGACGTTTACGTGGGTTATCGTTACTATGAGACCATCGATCGTCCGGTGCTGTTCCCGTTTGGTCACGGCCTGAGCTTCACCGAGTTCGATTTTACCGACATGTTTGTTCGTCTGGAGGAAGAGAACCTGGAAGTTGAGGTGGTTGTGCGTAACACCGGCAAGTACGACGGTGCGGAAGTGGTGCAGCTGTATGTTGCGCCGGTTAGCCCGAGCCTGAAACGTCCGATCAAGGAACTGAAAGAGTACGCGAAAATTTTCCTGGCGAGCGGTGAAGCGAAGACCGTTCACCTGAGCGTGCCGATCAAATACGCGACCAGCTTCTTTGATGAGTATCAAAAGAAATGGTGCAGCGAAAAGGGCGAGTATACCATTCTGCTGGGTAGCAGCAGCGCGGACATCAAAGTTAGCCAAAGCATCACCCTGGAAAAAACCACCTTCTGGAAAGGTCTGTAA

Аминокислотная последовательность B-glu2 (SEQ ID NO: 3) Pichia pastoris (GS115)

MKSQLIFMALASLVASAPLEHQQQHHKHEKRAVVTQTVTVAAGQTAAAGSAQAVVTSSAAPASVASSAAASASSSSSSYTSGASGDLSSFKDGTIKCSEFPSGDGVVSVSWLGFGGWSSIMNLQGGTSESCENGYYCSYACEAGYSKTQWPSNQPSDGRSVGGLLCKDGLLYRSNTAFDTLCVPGKGTASVENNVSKGISICRTDYPGSENMCVPTWVDAGNSNTLTVVDEDNYYEWQGLKTSAQYYVNNAGVSVEDGCIWGDESSGVGNWAPLVLGAGSTGGLTYLSLIPNPNNKKAPNFNVKIVATDGSSINGDCKYENGIFVGSSTDGCTVTVTSGSAKLVFY

Последовательность ДНК B-glu2 (SEQ ID NO: 4) Pichia pastoris (GS115)

atgaaaagccagctgatctttatggctttggcctcccttgtagcaagtgcaccgctggaacaccagcagcagcatcataaacatgagaaacgcgccgtagttacgcagacagtaactgttgcggcgggccagacagcagcagcgggttccgcccaggcagttgttacctcaagcgcggcgccagcatccgttgcttcaagtgcggccgcgtctgctagctcatcttcttccagctatacctctggcgcttcaggcgatcttagtagtttcaaagatggtactattaaatgttcagaattcccatcaggggatggcgtggtgtccgtctcttggttaggcttcggcggctggtctagtattatgaatctgcagggtggtacttcagagagttgtgagaacggctattattgttcatatgcatgtgaagccggttatagcaaaacacagtggccatctaaccagccgtcagatgggagatcagtgggagggttgctgtgtaaagatggcctgttatatcgctccaatacagcgttcgatacattatgtgtgcctggaaaaggtacagcatccgtggagaataatgtgtctaaaggtatttccatttgtagaacggattatccggggtctgaaaacatgtgcgtcccgacgtgggtcgatgccggtaactcaaacaccttgacagtggtagatgaagataattattatgaatggcagggccttaaaactagtgctcagtattatgtgaataacgccggtgttagtgttgaagatgggtgcatctggggcgatgagtccagcggcgttggaaactgggcgccgttggttttgggggccggttccacggggggtctgacctatctgtctctgattccgaatccaaacaacaaaaaagcaccgaattttaacgtaaaaatcgtggccacggatggaagttcaattaacggagattgcaaatatgaaaatgggatctttgtcggttcttcaaccgatggctgcacggtaactgttacctcaggtagtgcaaaactggttttttattaa

Аминокислотная последовательность B-glu3 (SEQ ID NO: 5) Pichia pastoris (GS115)

Mqvksivnlllacslavarplehahhqhdkrgvvvvtktivvdgstveataaaqvqehaetfaestpsavvssssapssassasapassgsfsagtkgvtyspyqagggcktaeevasdlsqltgyeiirlygvdcnqvenvfkakapgqklflgiffvdaiesgvsaiasavksygswddvhtvsvgnelvnngeatvsqigqyvstaksalrsagftgpvlsvdtfiavinnpglcdfadeyvavnahaffdggiaasgagdwaaeqiqrvssacggkdvlivesgwpskgdtngaavpsksnqqaavqslgqkigssciafnafndywkadgpfnaekywgilds

Последовательность ДНК B-glu3 (SEQ ID NO: 6) Pichia pastoris (GS115)

Atgcaggttaaatctattgttaatttactgcttgcctgttccttggctgtggcgcgtccgttggaacacgctcaccatcagcatgataaacgcggcgttgtagtagtaacgaaaaccatcgtcgttgatggtagcacagttgaggctaccgccgctgctcaggtgcaggagcatgcagaaacctttgcagaatcaaccccgtcagccgtcgtttccagttcatccgccccttcatcagcaagctcagcttccgctccagctagttcaggttctttttcagctggtaccaaaggcgtgacatattctccatatcaggccggtggtgggtgtaaaacagcggaagaagtggcatccgatctgtcacagcttaccggttatgaaattattcggctttatggcgtagattgcaaccaggttgagaacgtgtttaaagccaaagcccctggccagaaactttttttgggtatcttttttgtggatgccatcgagtctggcgtatcagctatcgcaagtgccgttaaatcctatggttcttgggatgatgtacacactgtatctgttggcaacgagctggtgaacaatggcgaagccactgttagccagattggacagtatgttagtacggccaaatcagccttacgctctgccggtttcacagggccagtattgtctgttgatacttttattgcagtgattaacaatccggggctgtgtgatttcgcggatgaatatgttgctgtgaacgcccatgcgttcttcgatgggggtattgctgcctcaggggcgggcgattgggcggcagagcagatccagcgcgtctccagtgcgtgcggcgggaaagatgtcttaattgtagaaagcggttggccgtctaaaggagatacgaacggcgccgcagtgccgtcaaaatccaatcagcaggctgcagtccagagtcttggccagaaaattgggagctcatgcattgcctttaacgcatttaatgattattggaaagccgatggtccgttcaacgccgaaaaatattgggggatccttgatagttaa

Аминокислотная последовательность B-glu4 (SEQ ID NO: 7) Pichia pastoris (GS115)

mlstilnifilllfiqaslqapipvvtkyvtegiavvtetnvrvvtktipivqvlisdgatythtlttvstaeengnfqpitttsivnkevvvptsvtpntqqtrptqvdttqnnadtpaaptpspttssnngvfttysttrsvvtsvvvvgpdgspientgqtanptttapttsttaarttsststtptasstpggnhprsivyspysdssqckdattietdlefiaskgisavriygndcnyltvvlpkcaslglkvnqgfwigpsgvdsiddavqefiqavngnngfnwdlfelitvgneaisagyvsassliskikevssilssagytgpittaeppnvyedygdlcstdvmsivgvnahsyfntlfaasdsgsfvksqievvqkacsrsditiietgypsqgatngknvpskenqktaifsifevvgtdvtilstyddlwkdpgpygieqffgaidlfs

Последовательность ДНК B-glu4 (SEQ ID NO: 8) Pichia pastoris (GS115)

atgctgtccacaattctgaatatttttattcttctgttattcatccaggcgtctcttcaggcgcctattccggtggtgaccaaatatgtgaccgaaggtattgccgttgtgactgaaaccaatgtgcgggttgttactaaaaccattccgattgtgcaggtgctgatctccgatggtgcaacctatactcataccctgacgacagtgtcaacggcggaagaaaatggcaacttccagcctattaccacgacatctattgtcaacaaagaagttgtagtaccaacaagcgtaaccccgaatacccagcagacgcgtccgacccaggtagataccacacagaacaatgcggatacaccagcggcgcctacaccatcacctactactagttcaaacaacggcgtgttcaccacatattccacaacacgtagcgtagtcactagtgtagtcgtagtcggaccggatggaagccctattgaaaatactggacagacagcaaaccctactacaactgccccaactacaagcactactgctgcccggaccacaagcagtacgtccaccacacctaccgctagctctacgccaggaggtaatcatccacgtagcatcgtctattctccatattccgatagcagtcagtgtaaagatgcgacaacgatcgaaaccgatcttgagttcattgcctctaaaggcatcagcgcggtacgtatttatggcaatgattgtaactatcttacagttgttttgcctaaatgtgccagtctgggattaaaagtgaatcagggcttttggattggtccaagtggagtagatagcatcgatgatgcagtacaggagtttattcaggcagtcaacggcaacaacggctttaattgggatttattcgaattaattaccgtcggaaacgaagcaatcagtgccggttatgtttcagcgagctccctgatttccaaaattaaagaagtatctagcattctgagctccgcgggttatactggtccaattaccacagccgaaccgcctaacgtatatgaggattatggcgatctgtgctcaaccgatgtaatgtccatcgtgggtgtaaacgcgcattcctattttaataccctttttgcggcctccgattcaggttcatttgtgaaatcacagatcgaagtagtccagaaagcatgctcacgttccgatattactattattgaaaccgggtatccgtcccagggagctaccaatggaaaaaacgttcctagtaaagagaatcagaaaacagcgattttttcaatctttgaggtcgttggaacagatgtaactattcttagtacttatgatgatttgtggaaagatcctggaccgtatgggattgaacagttttttggtgcgatcgatcttttttcttaa

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Conagen Inc.

<120> ГИДРОЛИЗ СТЕВИОЛОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ С ПОМОЩЬЮ БЕТА-ГЛЮКОЗИДАЗЫ

<130> C1497.70026WO00

<140> Not Yet Assigned

<141> Concurrently Herewith

<150> US 62/527,482

<151> 2017-06-30

<160> 8

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 839

<212> БЕЛОК

<213> Pichia pastoris

<400> 1

Met Thr Gln Leu Asp Val Glu Ser Leu Ile Gln Glu Leu Thr Leu Asn

1 5 10 15

Glu Lys Val Gln Leu Leu Ser Gly Ser Asp Phe Trp His Thr Thr Pro

20 25 30

Val Arg Arg Leu Gly Ile Pro Lys Met Arg Leu Ser Asp Gly Pro Asn

35 40 45

Gly Val Arg Gly Thr Lys Phe Phe Asn Gly Val Pro Thr Ala Cys Phe

50 55 60

Pro Cys Gly Thr Gly Leu Gly Ala Thr Phe Asp Lys Glu Leu Leu Lys

65 70 75 80

Glu Ala Gly Ser Leu Met Ala Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ser

85 90 95

Val Val Leu Gly Pro Thr Ala Asn Ile Ala Arg Gly Pro Asn Gly Gly

100 105 110

Arg Gly Phe Glu Ser Phe Gly Glu Asp Pro Val Val Asn Gly Leu Ser

115 120 125

Ser Ala Ala Met Ile Asn Gly Leu Gln Gly Lys Tyr Ile Ala Ala Thr

130 135 140

Met Lys His Tyr Val Cys Asn Asp Leu Glu Met Asp Arg Asn Cys Ile

145 150 155 160

Asp Ala Gln Val Ser His Arg Ala Leu Arg Glu Val Tyr Leu Leu Pro

165 170 175

Phe Gln Ile Ala Val Arg Asp Ala Asn Pro Arg Ala Ile Met Thr Ala

180 185 190

Tyr Asn Lys Ala Asn Gly Glu His Val Ser Gln Ser Lys Phe Leu Leu

195 200 205

Asp Glu Val Leu Arg Lys Glu Trp Gly Trp Asp Gly Leu Leu Met Ser

210 215 220

Asp Trp Phe Gly Val Tyr Asp Ala Lys Ser Ser Ile Thr Asn Gly Leu

225 230 235 240

Asp Leu Glu Met Pro Gly Pro Pro Gln Cys Arg Val His Ser Ala Thr

245 250 255

Asp His Ala Ile Asn Ser Gly Glu Ile His Ile Asn Asp Val Asp Glu

260 265 270

Arg Val Arg Ser Leu Leu Ser Leu Ile Asn Tyr Cys His Gln Ser Gly

275 280 285

Val Thr Glu Glu Asp Pro Glu Thr Ser Asp Asn Asn Thr Pro Glu Thr

290 295 300

Ile Glu Lys Leu Arg Lys Ile Ser Arg Glu Ser Ile Val Leu Leu Lys

305 310 315 320

Asp Asp Asp Arg Asn Arg Ser Ile Leu Pro Leu Lys Lys Ser Asp Lys

325 330 335

Ile Ala Val Ile Gly Asn Asn Ala Lys Gln Ala Ala Tyr Cys Gly Gly

340 345 350

Gly Ser Ala Ser Val Leu Ser Tyr His Thr Thr Thr Pro Phe Asp Ser

355 360 365

Ile Lys Ser Arg Leu Glu Asp Ser Asn Thr Pro Ala Tyr Thr Ile Gly

370 375 380

Ala Asp Ala Tyr Lys Asn Leu Pro Pro Leu Gly Pro Gln Met Thr Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Lys Pro Gly Phe Asp Ala Lys Phe Phe Val Gly Ser Pro

405 410 415

Thr Ser Lys Asp Arg Lys Leu Ile Asp His Phe Gln Leu Thr Asn Ser

420 425 430

Gln Val Phe Leu Val Asp Tyr Tyr Asn Glu Gln Ile Pro Glu Asn Lys

435 440 445

Glu Phe Tyr Val Asp Val Glu Gly Gln Phe Ile Pro Glu Glu Asp Gly

450 455 460

Thr Tyr Asn Phe Gly Leu Thr Val Phe Gly Thr Gly Arg Leu Phe Val

465 470 475 480

Asp Asp Lys Leu Val Ser Asp Ser Ser Gln Asn Gln Thr Pro Gly Asp

485 490 495

Ser Phe Phe Gly Leu Ala Ala Gln Glu Val Ile Gly Ser Ile His Leu

500 505 510

Val Lys Gly Lys Ala Tyr Lys Ile Lys Val Leu Tyr Gly Ser Ser Val

515 520 525

Thr Arg Thr Tyr Glu Ile Ala Ala Ser Val Ala Phe Glu Gly Gly Ala

530 535 540

Phe Thr Phe Gly Ala Ala Lys Gln Arg Asn Glu Asp Glu Glu Ile Ala

545 550 555 560

Arg Ala Val Glu Ile Ala Lys Ala Asn Asp Lys Val Val Leu Cys Ile

565 570 575

Gly Leu Asn Gln Asp Phe Glu Ser Glu Gly Phe Asp Arg Pro Asp Ile

580 585 590

Lys Ile Pro Gly Ala Thr Asn Lys Met Val Ser Ala Val Leu Lys Ala

595 600 605

Asn Pro Asn Thr Val Ile Val Asn Gln Thr Gly Thr Pro Val Glu Met

610 615 620

Pro Trp Ala Ser Asp Ala Pro Val Ile Leu Gln Ala Trp Phe Gly Gly

625 630 635 640

Ser Glu Ala Gly Thr Ala Ile Ala Asp Val Leu Phe Gly Asp Tyr Asn

645 650 655

Pro Ser Gly Lys Leu Thr Val Thr Phe Pro Leu Arg Phe Glu Asp Asn

660 665 670

Pro Ala Tyr Leu Asn Phe Gln Ser Asn Lys Gln Ala Cys Trp Tyr Gly

675 680 685

Glu Asp Val Tyr Val Gly Tyr Arg Tyr Tyr Glu Thr Ile Asp Arg Pro

690 695 700

Val Leu Phe Pro Phe Gly His Gly Leu Ser Phe Thr Glu Phe Asp Phe

705 710 715 720

Thr Asp Met Phe Val Arg Leu Glu Glu Glu Asn Leu Glu Val Glu Val

725 730 735

Val Val Arg Asn Thr Gly Lys Tyr Asp Gly Ala Glu Val Val Gln Leu

740 745 750

Tyr Val Ala Pro Val Ser Pro Ser Leu Lys Arg Pro Ile Lys Glu Leu

755 760 765

Lys Glu Tyr Ala Lys Ile Phe Leu Ala Ser Gly Glu Ala Lys Thr Val

770 775 780

His Leu Ser Val Pro Ile Lys Tyr Ala Thr Ser Phe Phe Asp Glu Tyr

785 790 795 800

Gln Lys Lys Trp Cys Ser Glu Lys Gly Glu Tyr Thr Ile Leu Leu Gly

805 810 815

Ser Ser Ser Ala Asp Ile Lys Val Ser Gln Ser Ile Thr Leu Glu Lys

820 825 830

Thr Thr Phe Trp Lys Gly Leu

835

<210> 2

<211> 2520

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 2

atgacccaac tggatgtgga gagcctgatt caagagctga ccctgaacga aaaggtgcaa 60

ctgctgagcg gtagcgactt ctggcatacc accccggttc gtcgtctggg catcccgaag 120

atgcgtctga gcgacggtcc gaacggcgtt cgtggtacca aattctttaa cggtgttccg 180

accgcgtgct tcccgtgcgg taccggtctg ggcgcgacct ttgacaagga actgctgaaa 240

gaggcgggta gcctgatggc ggatgaagcg aaagcgaaag cggcgagcgt ggttctgggt 300

ccgaccgcga acattgcgcg tggtccgaac ggtggccgtg gcttcgagag cttcggcgag 360

gacccggtgg ttaacggtct gagcagcgcg gcgatgatca acggcctgca gggcaagtac 420

attgcggcga ccatgaaaca ctatgtttgc aacgatctgg aaatggaccg taactgcatt 480

gacgcgcaag ttagccaccg tgcgctgcgt gaggtgtacc tgctgccgtt ccaaatcgcg 540

gtgcgtgatg cgaacccgcg tgcgattatg accgcgtata acaaggcgaa cggcgaacac 600

gttagccaga gcaaattcct gctggacgaa gtgctgcgta aggagtgggg ctgggatggt 660

ctgctgatga gcgactggtt tggtgtttac gatgcgaaaa gcagcatcac caacggcctg 720

gacctggaga tgccgggtcc gccgcagtgc cgtgtgcaca gcgcgaccga tcacgcgatc 780

aacagcggcg aaatccacat taacgatgtt gacgagcgtg tgcgtagcct gctgagcctg 840

attaactact gccaccaaag cggtgttacc gaggaagatc cggaaaccag cgacaacaac 900

accccggaaa ccatcgagaa gctgcgtaaa atcagccgtg agagcattgt gctgctgaag 960

gacgatgacc gtaaccgtag cattctgccg ctgaagaaaa gcgacaaaat cgcggttatt 1020

ggtaacaacg cgaaacaagc ggcgtattgc ggtggcggta gcgcgagcgt gctgagctat 1080

cacaccacca ccccgttcga cagcatcaag agccgtctgg aagatagcaa caccccggcg 1140

tacaccattg gtgcggacgc gtataaaaac ctgccgccgc tgggtccgca aatgaccgat 1200

agcgacggca agccgggttt tgatgcgaaa ttctttgttg gcagcccgac cagcaaggat 1260

cgtaaactga tcgaccactt ccagctgacc aacagccaag tttttctggt ggactactat 1320

aacgaacaga tcccggaaaa caaggagttc tacgttgacg tggagggtca atttattccg 1380

gaggaagatg gcacctataa cttcggtctg accgtgtttg gtaccggccg tctgttcgtt 1440

gatgacaaac tggttagcga cagcagccag aaccaaaccc cgggcgatag cttctttggt 1500

ctggcggcgc aggaagtgat cggcagcatt cacctggtga agggtaaagc gtacaagatc 1560

aaagttctgt atggcagcag cgtgacccgt acctacgaaa ttgcggcgag cgttgcgttt 1620

gagggcggtg cgttcacctt tggtgcggcg aaacagcgta acgaagacga ggaaatcgcg 1680

cgtgcggtgg agattgcgaa ggcgaacgac aaagtggttc tgtgcatcgg cctgaaccaa 1740

gatttcgaaa gcgagggttt tgatcgtccg gacatcaaga ttccgggcgc gaccaacaaa 1800

atggttagcg cggtgctgaa ggcgaacccg aacaccgtta ttgtgaacca gaccggtacc 1860

ccggttgaga tgccgtgggc gagcgatgcg ccggtgatcc tgcaagcgtg gtttggcggt 1920

agcgaggcgg gtaccgcgat tgcggatgtt ctgtttggcg actacaaccc gagcggcaag 1980

ctgaccgtga ccttcccgct gcgttttgag gataacccgg cgtacctgaa cttccagagc 2040

aacaaacaag cgtgctggta tggcgaagac gtttacgtgg gttatcgtta ctatgagacc 2100

atcgatcgtc cggtgctgtt cccgtttggt cacggcctga gcttcaccga gttcgatttt 2160

accgacatgt ttgttcgtct ggaggaagag aacctggaag ttgaggtggt tgtgcgtaac 2220

accggcaagt acgacggtgc ggaagtggtg cagctgtatg ttgcgccggt tagcccgagc 2280

ctgaaacgtc cgatcaagga actgaaagag tacgcgaaaa ttttcctggc gagcggtgaa 2340

gcgaagaccg ttcacctgag cgtgccgatc aaatacgcga ccagcttctt tgatgagtat 2400

caaaagaaat ggtgcagcga aaagggcgag tataccattc tgctgggtag cagcagcgcg 2460

gacatcaaag ttagccaaag catcaccctg gaaaaaacca ccttctggaa aggtctgtaa 2520

<210> 3

<211> 346

<212> БЕЛОК

<213> Pichia pastoris

<400> 3

Met Lys Ser Gln Leu Ile Phe Met Ala Leu Ala Ser Leu Val Ala Ser

1 5 10 15

Ala Pro Leu Glu His Gln Gln Gln His His Lys His Glu Lys Arg Ala

20 25 30

Val Val Thr Gln Thr Val Thr Val Ala Ala Gly Gln Thr Ala Ala Ala

35 40 45

Gly Ser Ala Gln Ala Val Val Thr Ser Ser Ala Ala Pro Ala Ser Val

50 55 60

Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr

65 70 75 80

Ser Gly Ala Ser Gly Asp Leu Ser Ser Phe Lys Asp Gly Thr Ile Lys

85 90 95

Cys Ser Glu Phe Pro Ser Gly Asp Gly Val Val Ser Val Ser Trp Leu

100 105 110

Gly Phe Gly Gly Trp Ser Ser Ile Met Asn Leu Gln Gly Gly Thr Ser

115 120 125

Glu Ser Cys Glu Asn Gly Tyr Tyr Cys Ser Tyr Ala Cys Glu Ala Gly

130 135 140

Tyr Ser Lys Thr Gln Trp Pro Ser Asn Gln Pro Ser Asp Gly Arg Ser

145 150 155 160

Val Gly Gly Leu Leu Cys Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Thr

165 170 175

Ala Phe Asp Thr Leu Cys Val Pro Gly Lys Gly Thr Ala Ser Val Glu

180 185 190

Asn Asn Val Ser Lys Gly Ile Ser Ile Cys Arg Thr Asp Tyr Pro Gly

195 200 205

Ser Glu Asn Met Cys Val Pro Thr Trp Val Asp Ala Gly Asn Ser Asn

210 215 220

Thr Leu Thr Val Val Asp Glu Asp Asn Tyr Tyr Glu Trp Gln Gly Leu

225 230 235 240

Lys Thr Ser Ala Gln Tyr Tyr Val Asn Asn Ala Gly Val Ser Val Glu

245 250 255

Asp Gly Cys Ile Trp Gly Asp Glu Ser Ser Gly Val Gly Asn Trp Ala

260 265 270

Pro Leu Val Leu Gly Ala Gly Ser Thr Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Ser

275 280 285

Leu Ile Pro Asn Pro Asn Asn Lys Lys Ala Pro Asn Phe Asn Val Lys

290 295 300

Ile Val Ala Thr Asp Gly Ser Ser Ile Asn Gly Asp Cys Lys Tyr Glu

305 310 315 320

Asn Gly Ile Phe Val Gly Ser Ser Thr Asp Gly Cys Thr Val Thr Val

325 330 335

Thr Ser Gly Ser Ala Lys Leu Val Phe Tyr

340 345

<210> 4

<211> 1041

<212> ДНК

<213> Pichia pastoris

<400> 4

atgaaaagcc agctgatctt tatggctttg gcctcccttg tagcaagtgc accgctggaa 60

caccagcagc agcatcataa acatgagaaa cgcgccgtag ttacgcagac agtaactgtt 120

gcggcgggcc agacagcagc agcgggttcc gcccaggcag ttgttacctc aagcgcggcg 180

ccagcatccg ttgcttcaag tgcggccgcg tctgctagct catcttcttc cagctatacc 240

tctggcgctt caggcgatct tagtagtttc aaagatggta ctattaaatg ttcagaattc 300

ccatcagggg atggcgtggt gtccgtctct tggttaggct tcggcggctg gtctagtatt 360

atgaatctgc agggtggtac ttcagagagt tgtgagaacg gctattattg ttcatatgca 420

tgtgaagccg gttatagcaa aacacagtgg ccatctaacc agccgtcaga tgggagatca 480

gtgggagggt tgctgtgtaa agatggcctg ttatatcgct ccaatacagc gttcgataca 540

ttatgtgtgc ctggaaaagg tacagcatcc gtggagaata atgtgtctaa aggtatttcc 600

atttgtagaa cggattatcc ggggtctgaa aacatgtgcg tcccgacgtg ggtcgatgcc 660

ggtaactcaa acaccttgac agtggtagat gaagataatt attatgaatg gcagggcctt 720

aaaactagtg ctcagtatta tgtgaataac gccggtgtta gtgttgaaga tgggtgcatc 780

tggggcgatg agtccagcgg cgttggaaac tgggcgccgt tggttttggg ggccggttcc 840

acggggggtc tgacctatct gtctctgatt ccgaatccaa acaacaaaaa agcaccgaat 900

tttaacgtaa aaatcgtggc cacggatgga agttcaatta acggagattg caaatatgaa 960

aatgggatct ttgtcggttc ttcaaccgat ggctgcacgg taactgttac ctcaggtagt 1020

gcaaaactgg ttttttatta a 1041

<210> 5

<211> 348

<212> БЕЛОК

<213> Pichia pastoris

<400> 5

Met Gln Val Lys Ser Ile Val Asn Leu Leu Leu Ala Cys Ser Leu Ala

1 5 10 15

Val Ala Arg Pro Leu Glu His Ala His His Gln His Asp Lys Arg Gly

20 25 30

Val Val Val Val Thr Lys Thr Ile Val Val Asp Gly Ser Thr Val Glu

35 40 45

Ala Thr Ala Ala Ala Gln Val Gln Glu His Ala Glu Thr Phe Ala Glu

50 55 60

Ser Thr Pro Ser Ala Val Val Ser Ser Ser Ser Ala Pro Ser Ser Ala

65 70 75 80

Ser Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ser Ser Gly Ser Phe Ser Ala Gly Thr

85 90 95

Lys Gly Val Thr Tyr Ser Pro Tyr Gln Ala Gly Gly Gly Cys Lys Thr

100 105 110

Ala Glu Glu Val Ala Ser Asp Leu Ser Gln Leu Thr Gly Tyr Glu Ile

115 120 125

Ile Arg Leu Tyr Gly Val Asp Cys Asn Gln Val Glu Asn Val Phe Lys

130 135 140

Ala Lys Ala Pro Gly Gln Lys Leu Phe Leu Gly Ile Phe Phe Val Asp

145 150 155 160

Ala Ile Glu Ser Gly Val Ser Ala Ile Ala Ser Ala Val Lys Ser Tyr

165 170 175

Gly Ser Trp Asp Asp Val His Thr Val Ser Val Gly Asn Glu Leu Val

180 185 190

Asn Asn Gly Glu Ala Thr Val Ser Gln Ile Gly Gln Tyr Val Ser Thr

195 200 205

Ala Lys Ser Ala Leu Arg Ser Ala Gly Phe Thr Gly Pro Val Leu Ser

210 215 220

Val Asp Thr Phe Ile Ala Val Ile Asn Asn Pro Gly Leu Cys Asp Phe

225 230 235 240

Ala Asp Glu Tyr Val Ala Val Asn Ala His Ala Phe Phe Asp Gly Gly

245 250 255

Ile Ala Ala Ser Gly Ala Gly Asp Trp Ala Ala Glu Gln Ile Gln Arg

260 265 270

Val Ser Ser Ala Cys Gly Gly Lys Asp Val Leu Ile Val Glu Ser Gly

275 280 285

Trp Pro Ser Lys Gly Asp Thr Asn Gly Ala Ala Val Pro Ser Lys Ser

290 295 300

Asn Gln Gln Ala Ala Val Gln Ser Leu Gly Gln Lys Ile Gly Ser Ser

305 310 315 320

Cys Ile Ala Phe Asn Ala Phe Asn Asp Tyr Trp Lys Ala Asp Gly Pro

325 330 335

Phe Asn Ala Glu Lys Tyr Trp Gly Ile Leu Asp Ser

340 345

<210> 6

<211> 1047

<212> ДНК

<213> Pichia pastoris

<400> 6

atgcaggtta aatctattgt taatttactg cttgcctgtt ccttggctgt ggcgcgtccg 60

ttggaacacg ctcaccatca gcatgataaa cgcggcgttg tagtagtaac gaaaaccatc 120

gtcgttgatg gtagcacagt tgaggctacc gccgctgctc aggtgcagga gcatgcagaa 180

acctttgcag aatcaacccc gtcagccgtc gtttccagtt catccgcccc ttcatcagca 240

agctcagctt ccgctccagc tagttcaggt tctttttcag ctggtaccaa aggcgtgaca 300

tattctccat atcaggccgg tggtgggtgt aaaacagcgg aagaagtggc atccgatctg 360

tcacagctta ccggttatga aattattcgg ctttatggcg tagattgcaa ccaggttgag 420

aacgtgttta aagccaaagc ccctggccag aaactttttt tgggtatctt ttttgtggat 480

gccatcgagt ctggcgtatc agctatcgca agtgccgtta aatcctatgg ttcttgggat 540

gatgtacaca ctgtatctgt tggcaacgag ctggtgaaca atggcgaagc cactgttagc 600

cagattggac agtatgttag tacggccaaa tcagccttac gctctgccgg tttcacaggg 660

ccagtattgt ctgttgatac ttttattgca gtgattaaca atccggggct gtgtgatttc 720

gcggatgaat atgttgctgt gaacgcccat gcgttcttcg atgggggtat tgctgcctca 780

ggggcgggcg attgggcggc agagcagatc cagcgcgtct ccagtgcgtg cggcgggaaa 840

gatgtcttaa ttgtagaaag cggttggccg tctaaaggag atacgaacgg cgccgcagtg 900

ccgtcaaaat ccaatcagca ggctgcagtc cagagtcttg gccagaaaat tgggagctca 960

tgcattgcct ttaacgcatt taatgattat tggaaagccg atggtccgtt caacgccgaa 1020

aaatattggg ggatccttga tagttaa 1047

<210> 7

<211> 464

<212> БЕЛОК

<213> Pichia pastoris

<400> 7

Met Leu Ser Thr Ile Leu Asn Ile Phe Ile Leu Leu Leu Phe Ile Gln

1 5 10 15

Ala Ser Leu Gln Ala Pro Ile Pro Val Val Thr Lys Tyr Val Thr Glu

20 25 30

Gly Ile Ala Val Val Thr Glu Thr Asn Val Arg Val Val Thr Lys Thr

35 40 45

Ile Pro Ile Val Gln Val Leu Ile Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Thr His

50 55 60

Thr Leu Thr Thr Val Ser Thr Ala Glu Glu Asn Gly Asn Phe Gln Pro

65 70 75 80

Ile Thr Thr Thr Ser Ile Val Asn Lys Glu Val Val Val Pro Thr Ser

85 90 95

Val Thr Pro Asn Thr Gln Gln Thr Arg Pro Thr Gln Val Asp Thr Thr

100 105 110

Gln Asn Asn Ala Asp Thr Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ser Pro Thr Thr

115 120 125

Ser Ser Asn Asn Gly Val Phe Thr Thr Tyr Ser Thr Thr Arg Ser Val

130 135 140

Val Thr Ser Val Val Val Val Gly Pro Asp Gly Ser Pro Ile Glu Asn

145 150 155 160

Thr Gly Gln Thr Ala Asn Pro Thr Thr Thr Ala Pro Thr Thr Ser Thr

165 170 175

Thr Ala Ala Arg Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Pro Thr Ala Ser

180 185 190

Ser Thr Pro Gly Gly Asn His Pro Arg Ser Ile Val Tyr Ser Pro Tyr

195 200 205

Ser Asp Ser Ser Gln Cys Lys Asp Ala Thr Thr Ile Glu Thr Asp Leu

210 215 220

Glu Phe Ile Ala Ser Lys Gly Ile Ser Ala Val Arg Ile Tyr Gly Asn

225 230 235 240

Asp Cys Asn Tyr Leu Thr Val Val Leu Pro Lys Cys Ala Ser Leu Gly

245 250 255

Leu Lys Val Asn Gln Gly Phe Trp Ile Gly Pro Ser Gly Val Asp Ser

260 265 270

Ile Asp Asp Ala Val Gln Glu Phe Ile Gln Ala Val Asn Gly Asn Asn

275 280 285

Gly Phe Asn Trp Asp Leu Phe Glu Leu Ile Thr Val Gly Asn Glu Ala

290 295 300

Ile Ser Ala Gly Tyr Val Ser Ala Ser Ser Leu Ile Ser Lys Ile Lys

305 310 315 320

Glu Val Ser Ser Ile Leu Ser Ser Ala Gly Tyr Thr Gly Pro Ile Thr

325 330 335

Thr Ala Glu Pro Pro Asn Val Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Leu Cys Ser

340 345 350

Thr Asp Val Met Ser Ile Val Gly Val Asn Ala His Ser Tyr Phe Asn

355 360 365

Thr Leu Phe Ala Ala Ser Asp Ser Gly Ser Phe Val Lys Ser Gln Ile

370 375 380

Glu Val Val Gln Lys Ala Cys Ser Arg Ser Asp Ile Thr Ile Ile Glu

385 390 395 400

Thr Gly Tyr Pro Ser Gln Gly Ala Thr Asn Gly Lys Asn Val Pro Ser

405 410 415

Lys Glu Asn Gln Lys Thr Ala Ile Phe Ser Ile Phe Glu Val Val Gly

420 425 430

Thr Asp Val Thr Ile Leu Ser Thr Tyr Asp Asp Leu Trp Lys Asp Pro

435 440 445

Gly Pro Tyr Gly Ile Glu Gln Phe Phe Gly Ala Ile Asp Leu Phe Ser

450 455 460

<210> 8

<211> 1395

<212> ДНК

<213> Pichia pastoris

<400> 8

atgctgtcca caattctgaa tatttttatt cttctgttat tcatccaggc gtctcttcag 60

gcgcctattc cggtggtgac caaatatgtg accgaaggta ttgccgttgt gactgaaacc 120

aatgtgcggg ttgttactaa aaccattccg attgtgcagg tgctgatctc cgatggtgca 180

acctatactc ataccctgac gacagtgtca acggcggaag aaaatggcaa cttccagcct 240

attaccacga catctattgt caacaaagaa gttgtagtac caacaagcgt aaccccgaat 300

acccagcaga cgcgtccgac ccaggtagat accacacaga acaatgcgga tacaccagcg 360

gcgcctacac catcacctac tactagttca aacaacggcg tgttcaccac atattccaca 420

acacgtagcg tagtcactag tgtagtcgta gtcggaccgg atggaagccc tattgaaaat 480

actggacaga cagcaaaccc tactacaact gccccaacta caagcactac tgctgcccgg 540

accacaagca gtacgtccac cacacctacc gctagctcta cgccaggagg taatcatcca 600

cgtagcatcg tctattctcc atattccgat agcagtcagt gtaaagatgc gacaacgatc 660

gaaaccgatc ttgagttcat tgcctctaaa ggcatcagcg cggtacgtat ttatggcaat 720

gattgtaact atcttacagt tgttttgcct aaatgtgcca gtctgggatt aaaagtgaat 780

cagggctttt ggattggtcc aagtggagta gatagcatcg atgatgcagt acaggagttt 840

attcaggcag tcaacggcaa caacggcttt aattgggatt tattcgaatt aattaccgtc 900

ggaaacgaag caatcagtgc cggttatgtt tcagcgagct ccctgatttc caaaattaaa 960

gaagtatcta gcattctgag ctccgcgggt tatactggtc caattaccac agccgaaccg 1020

cctaacgtat atgaggatta tggcgatctg tgctcaaccg atgtaatgtc catcgtgggt 1080

gtaaacgcgc attcctattt taataccctt tttgcggcct ccgattcagg ttcatttgtg 1140

aaatcacaga tcgaagtagt ccagaaagca tgctcacgtt ccgatattac tattattgaa 1200

accgggtatc cgtcccaggg agctaccaat ggaaaaaacg ttcctagtaa agagaatcag 1260

aaaacagcga ttttttcaat ctttgaggtc gttggaacag atgtaactat tcttagtact 1320

tatgatgatt tgtggaaaga tcctggaccg tatgggattg aacagttttt tggtgcgatc 1380

gatctttttt cttaa 1395

<---

1. Способ изменения гликозилирования стевиолового гликозида, включающий:

a) подвергание первого стевиолового гликозида воздействию бета–глюкозидазы из вида Pichia в течение периода времени, достаточного для образования второго стевиолового гликозида посредством удаления по меньшей мере одной глюкозильной группы из указанного первого стевиолового гликозида; и

b) сбор указанного второго стевиолового гликозида.

2. Способ по п. 1, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 указанного первого стевиолового гликозида.

3. Способ по п. 1, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 указанного первого стевиолового гликозида.

4. Способ по п. 1, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы либо в положении C19 указанного первого стевиолового гликозида, либо в положении C13 указанного первого стевиолового гликозида.

5. Способ по п. 1, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы как в положении C19 указанного первого стевиолового гликозида, так и в положении C13 указанного первого стевиолового гликозида.

6. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 рубузозида с получением стевиол–13–глюкозида.

7. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 стевиозида с получением стевиолбиозида.

8. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb E с получением стевиолбиозида.

9. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb I с получением Reb A.

10. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb A с получением Reb B.

11. Способ по п. 3, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 стевиол–13–глюкозида с получением стевиола.

12. Способ по п. 3, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 Reb D с получением Reb B или Reb A.

13. Способ по п. 4, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 и в положении C13 Reb G с получением стевиол–13–глюкозида.

14. Способ по п. 1, где указанный второй стевиоловый гликозид представляет собой Reb M.

15. Способ по п. 1, где указанный второй стевиоловый гликозид представляет собой Reb B.

16. Способ по п. 1, где указанный второй стевиоловый гликозид представляет собой Reb A.

17. Способ по любому из пп. 1–16, дополнительно включающий применение ферментов, представляющих собой бета–галактозидазу или пектиназу, для увеличения скорости ферментативного гидролиза.

18. Способ по любому из пп. 1–17, дополнительно включающий:

обеспечение экспрессии стевиолового гликозида в трансформированной клеточной системе;

выращивание клеточной системы в среде и

получение указанного второго стевиолового гликозида.

19. Способ по любому из пп. 1–18, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый стевиоловый гликозид составляет по меньшей мере 6 часов.

20. Способ по любому из пп. 1–18, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый стевиоловый гликозид составляет по меньшей мере 12 часов.

21. Способ по любому из пп. 1–18, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый стевиоловый гликозид составляет по меньшей мере 18 часов.

22. Способ по любому из пп. 1–18, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый стевиоловый гликозид составляет по меньшей мере 24 часа.

23. Способ по любому из пп. 1–22, где бета–глюкозидаза имеет аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1.

24. Способ по любому из пп. 1–22, где бета–глюкозидаза имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична SEQ ID NO: 3.

25. Способ по п. 1, где второй стевиоловый гликозид представляет собой Reb E.

26. Способ по п. 1, где указанный второй стевиоловый гликозид представляет собой смесь Reb E, Reb D4 и Reb M.

27. Способ по п. 1, где второй стевиоловый гликозид представляет собой Reb D4.

28. Способ по любому из пп. 1–27, где второй стевиоловый гликозид на стадии b) представляет собой неочищенный продукт, и стадия b) дополнительно включает: i) очистку указанного неочищенного продукта и ii) удаление растворителей под вакуумом с получением концентрированного продукта.

29. Способ по п. 28, где указанный неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии.

30. Способ по п. 28, где указанный неочищенный продукт очищают с помощью кислотно–щелочной экстракции.

31. Способ по п. 28, где указанный неочищенный продукт очищают с помощью вакуумной перегонки.

32. Способ по п. 28, дополнительно предусматривающий очистку концентрированного продукта с применением полупрепаративной HPLC.