Эукариотическая клеточная линия

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной линии, содержащей стабильно интегрированный в ее геном ген, кодирующий тетрациклиновый репрессор (Tet-R), под контролем промотора CAG. Также раскрыт способ получения инфекционных вирусных частиц, предусматривающий использование клеток вышеуказанной клеточной линии. Изобретение эффективно для продуцирования инфекционных вирусных частиц. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 11 ил., 10 пр.

 

Настоящее изобретение относится к клеточной линии, применению клеточной линии и способу продуцирования инфекционных вирусных частиц с использованием указанной клеточной линии.

Предпосылки создания изобретения

Новые вакцины необходимы для предупреждения или лечения таких заболеваний, как ВИЧ, гепатит С, малярия, туберкулез и рак. Доклинические и клинические данные подтверждают роль Т-клеточного иммунитета и, в частности, CD8+ Т-клеток в клиренсе этих заболеваний. Одним из способов индукции CD8+ Т-клеточного ответа против конкретного антигена является внутриклеточная экспрессия этого антигена и подходящих патоген-опосредованных активаторов врожденного иммунитета посредством доставки генов; генетические или генные вакцины объединяют физиологический процессинг антигена и его презентацию молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I для активации CD8+ Т-клеточного ответа. Дефектные по репликации аденовирусные векторы широко использовались для получения генетической вакцины путем замены основной области Е1 экспрессионной кассетой для антигена. Ad векторы являются привлекательными в качестве системы доставки генов, так как они инфицируют как делящиеся, так и неделящиеся клетки, имеют широкий тканевой тропизм, очень эффективно размножаются в доступных пакующих клеточных линиях и имеют масштабируемый и доступный процесс получения. Действительно, векторы на основе Ad вызывают более сильные антиген-специфические CD8+ Т-клеточные ответы по сравнению с другими векторами генетической вакцины на основе поксвирусов, лентивирусов, альфавируса и «голой (naked)» ДНК в животных моделях и клинических испытаниях на человеке. Однако успешная разработка аденовирусных векторов в качестве носителей генетической вакцины в конечном итоге будет зависеть не только от их иммунологической активности, но также от доступности клеточных субстратов для масштабируемых и воспроизводимых процессов получения. Аденовирусные векторы способны экспрессировать высокие уровни антигенного белка, который они доставляют не только в ткани-мишени in vivo, но также и во время процесса продуцирования в дополняющей клеточной линии. В современной векторной системе экспрессия трансгена управляется сильным промотором немедленно-ранних генов цитомегаловируса человека (промотор HCMV), который обеспечивает высокий уровень экспрессии трансгена не только в ткани-мишени, но также и в пакующей клеточной линии во время процесса продуцирования вектора. У нас имеется несколько доказательств, указывающих на то, что высокая экспрессия трансгена в пакующей клеточной линии может препятствовать репликации аденовируса. В нашем обширном опыте по спасению и размножению аденовирусного вектора наблюдались пагубные эффекты на репликацию вируса, опосредованные избыточной экспрессией трансгена, начиная от сниженных выходов вектора и кончая полным ингибированием репликации. Кроме того, вмешательство в репликацию вектора может привести к генетической нестабильности самого вектора с отбором перегруппированных видов векторов.

Разработка клеточной линии, способной подавлять экспрессию трансгена, переносимого аденовирусным вектором во время процесса продуцирования, может предотвратить негативные эффекты чрезмерной экспрессии трансгена. Таким образом, система основана на клеточной линии, экспрессирующей высокие уровни TetR, и на Ad векторах, несущих трансген под контролем промотора цитомегаловируса человека или других сильных промоторов, таких как промотор CASI, промотор С AG, промотор EF1α с двумя или более копиями сайтов связывания TetR, вставленными ниже «даунстрим» от TATA-бокс промотора.

Краткое описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает клеточную линию, в которой тетрациклиновый репрессор (Tet-R) экспрессируется под контролем клеточного или частично клеточного промотора.

Во втором аспекте изобретение относится к применению клеточной линии в соответствии с первым аспектом изобретения для продуцирования инфекционных вирусных частиц.

В третьем аспекте изобретение относится к способу продуцирования инфекционных вирусных частиц, включающему следующие стадии:

(i) выращивание клеток клеточной линии по первому аспекту изобретения, кроме того, содержащей вирусный геном, способный собираться в инфекционную вирусную частицу in vitro в отсутствие тетрациклина или аналога тетрациклина; или

(ii) инфицирование клеток клеточной линии по первому аспекту изобретения вирусным вектором, предпочтительно аденовирусным вектором; и

(iii) извлечение вирусных частиц.

Перечень фигур

Далее описаны фигуры, представленные в данном описании. В этом контексте просим также обратиться к подробному описанию изобретения, представленному выше и/или ниже.

Фигура 1: Схема pneo/CAG-TetR. Pneo/CAG-TetR содержит экспрессионную кассету для тетрациклинового репрессора и гена устойчивости к G418.

Фигура 2: Экспрессия SeAP в клонах М9 и М38. Клоны высевали во флаконы Т25 и инфицировали ChAdETetOSeap при moi 30 (множественность заражения) в присутствии или в отсутствие тетрациклина. Оценку для каждого отдельного клона затем получали путем вычисления отношения с тетрациклином и без него через 48 ч после инфицирования. Клон М9 показал лучшее отношение +/- tet.

Фигура 3: Продуцирование AdTetO Е1Е2р7 в клетках М9, М38 и Hek293. М9, М38 и HEK 293 инфицировали при moi 100 (множественность заражения) AdTetOE1/F78E2p7 (аденовектор, который не способен расти без TetR-опосредованного контроля экспрессии). Клоны М9 и М38 показали лучшие величины продуктивности.

Фигура 4: Экспрессия белка TetR в клетках М9 и М38. Экспрессию TetR оценивали с помощью вестерн-блоттинга на клеточном лизате клонов М9 и М38 с использованием антитела к TetR. TetR экспрессируется на высоких уровнях в клетках как М9, так и М38.

Фигура 5: Эффективность спасения векторов ChAd в клетках М9. Эффективность спасения аденовирусных векторов видов С и Е (ChAdN13 ТРА4-Т1Ро1у (фигура 5А) и ChAdE egfp (фигура 5В)) оценивали в клетках М9 по сравнению с HEK-293. Монослои клеток М9 и HEK293 параллельно трансфицировали плазмидной ДНК preAd. Продуцирование вируса оценивали с помощью QPCR через 12 дней после трансфекции на клеточных лизатах. Результаты показали более высокую эффективность продуцирования аденовирусного вектора в клетках М9 после трансфекции.

Фигура 6: Продуктивность векторов ChAd С - Venus и ChAd Е - EGFP. Продуктивность Ad-векторов шимпанзе ChAd С - Venus (фигура 6А) и ChAd Е - EGFP (фигура 6В) оценивали в клетках М9 по сравнению с клетками НЕК 293 и 293Т. Монослои клеток инфицировали с использованием такой же множественности инфицирования ChAds. Клетки собирали через 72 часа после инфицирования и титр вектора оценивали с помощью QPCR в неочищенном лизате. Результаты выражены в виде клеточно-специфической продуктивности.

Фигура 7: Оценка транскрипционного контроля в клетках М9 и T-Rex с помощью анализа FACS. Клеточные линии высевали во флаконы Т25 и инфицировали ChAd С TetO-VENUS, используя moi=100 vp/клетку (множественность инфицирования). Экспрессия достаточного количества TetR на уровне одиночных клеток должна выключать экспрессию репортерного гена venus. 3,8% клеток М9 показали детектируемый флуоресцентный сигнал против 26% клеток T-Rex. Было показано, что клеточная линия М9 способна контролировать экспрессию генов в 96,2% клеток, тогда как 74% клеток T-Rex эффективно контролируют экспрессию.

Фигура 8: Продуктивность вектора ChAd в клеточных линиях М9 (фигура 8А) и T-Rex (фигура 8 В). Анализ проводили в клетках, высеянных в Т-флаконы (флаконы Т25, засеянные 5е6 клетками в 10 мл среды). Клеточные монослои инфицировали ChAd-C TetO-VENUS с использованием множественности инфицирования 100 vp/клетку. Клетки собирали, когда с помощью микроскопии наблюдался полный СРЕ (7 дней после заражения). Продуктивность вектора определяли методом QPCR с использованием праймеров и зонда, сконструированных на основе последовательности ДНК промотора HCMV.

Фигура 9: Схематическое представление аденовирусного вектора и экспрессионной кассеты. Аденовирусный вектор несет промотор HCMV с TetO, и экспрессионная кассета включает последовательности TetO.

Фигура 10: Экспрессия TetR, управляемая промотором CAG по сравнению с экспрессией, управляемой HCMV. Клетки HCMV-TetR 293 были впервые разработаны путем трансфекции клеток HEK 293 экспрессионным вектором HCMV-TetR. Клон, экспрессирующий TetR, выделяли путем отбора на G418 и размножали. Экспрессию TetR тестировали вестерн-блоттингом на 40 пассаже и 60 пассаже, и сравнивали с экспрессией TetR в клетках М9 на 60 пассаже. Общие клеточные белки экстрагировали из 3×10⁶ клеток, разделяли на SDS-PAGE, переносили на мембрану и метили антителом против TetR (разведение антитела: 1:1000, инкубация в течение 12 часов при 4°C). Результаты показали, что экспрессия TetR, управляемая промотором HCMV, постепенно утрачивалась при пассировании клеточной культуры, в то время как экспрессия TetR, управляемая промотором CAG, сохранялась при пассировании (р60).

Фигура 11: Сайленсинг промотора HCMV с помощью эпигенетических механизмов. Постепенная утрата экспрессии TetR, наблюдаемая в клеточной линии HCMV-TetR, может быть устранена путем воздействия на клетки ингибиторов HDAC (Belinostat). Клетки TetR HCMV культивировали в присутствии 200 нМ Belinostat (ингибитор PXD101 - HDAC), затем экспрессию TetR оценивали вестерн-блоттингом путем сбора клеток. Однако повторная активация человеческого промотора CMV является временной, и экспрессия TetR снова утрачивается в отсутствие Belinostat.

Подробное описание изобретения

До подробного описания настоящего изобретения, следующего ниже, следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут изменяться. Кроме того, следует понимать, что в настоящем документе терминология используется с целью описания только конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют те же смыслы, которые вкладываются в них обычными специалистами в данной области.

Предпочтительно термины, используемые в настоящем документе, определяются согласно описанию в «А multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations))), Leuenberger, H.G.W, Nagel, В. и Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).

Во всем данном описании и в формуле изобретения, которая следует ниже, если контекст не требует иного, слово «включает» и вариации, такие как «содержит» и «содержащий», будут подразумевать включение заявленного целого числа или стадии, или группы целых чисел или стадий, но не исключение любого другого целого числа или стадии, или группы целых чисел или стадий. В следующих отрывках различные аспекты изобретения определены более подробно. Каждый определенный таким образом аспект может быть объединен с любым другим аспектом или аспектами, если явно не указано иное. В частности, любой признак, указанный как необязательный, предпочтительный или преимущественный, может быть объединен с любым другим признаком или признаками, указанными как необязательные, предпочтительные или преимущественные.

Несколько документов цитируются по всему тексту данного описания. Каждый из документов, процитированных выше или ниже в настоящем документе (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), включены настоящим в качестве ссылки в полном объеме. Ничто в настоящем документе не должно быть истолковано как признание того, что изобретение не дает права датировать задним числом такое раскрытие на основании предшествующего изобретения. Некоторые из документов, цитированных в настоящем документе, характеризуются как «включенные путем ссылки». В случае противоречия между определениями или учениями таких включенных ссылок и определениями или учениями, приведенными в настоящем описании, текст настоящего описания имеет приоритет.

Далее будут описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы перечислены с конкретными вариантами осуществления; однако следует понимать, что они могут быть комбинированы любым способом и в любом количестве для создания дополнительных вариантов осуществления. Различные описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления не должны истолковываться как ограничивающие настоящее изобретение только конкретно описанными вариантами осуществления. Это описание следует понимать как поддерживающее и охватывающее варианты осуществления, которые объединяют конкретно описанные варианты осуществления с любым количеством раскрытых и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в данной заявке следует рассматривать как раскрытые описанием настоящей заявки, если только контекст не указывает на иное.

Определения

Далее приведены некоторые определения терминов, часто используемых в данном описании. Эти термины, в каждом случае их использования, в остальной части описания будут иметь соответственно определенное значение и предпочтительные значения.

Как используется в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа "a", "an" и "the" включают ссылки на множественное число, если содержание явно не предписывает иное.

Выражение «экспрессирует ген» или «экспрессирует белок» используется в контексте настоящего изобретения для обозначения процесса транскрипции мРНК с последующей трансляцией мРНК в кодируемый белок. Уровень экспрессии может быть измерен на уровне мРНК и/или белка. В случае измерения на уровне мРНК количество мРНК будет обеспечивать по меньшей мере качественный показатель количества белка, присутствующего в клетке. В большинстве случаев вся мРНК будет транслироваться в белок и, таким образом, измерение количества мРНК позволяет подсчитать количество вновь продуцируемого белка. Количество белка может быть определено рядом известных в данной области способов, включая мечение антителами, специфически связывающимися с белком. Специалисту в данной области известно несколько способов качественного и/или количественного определения экспрессии гена на основе одиночных клеток. Эти способы включают FISH, внутриклеточное окрашивание (ICS) и секвенирование РНК одиночных клеток.

Термин «мутация», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к замене нуклеотида или аминокислоты другим нуклеотидом в последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотой в аминокислотной последовательности, соответственно. Термин «делеция», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к удалению нуклеотида из последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислоты в аминокислотной последовательности, соответственно. Термин «вставка», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к добавлению нуклеотида к последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислоты к аминокислотной последовательности. Замещение также может рассматриваться как последовательный процесс вставки и делеции или наоборот. В контексте настоящего изобретения термин «замещение» используется для изменения последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, которое не изменяет число нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты или количество аминокислот в аминокислотной последовательности.

Термин «бессмертная» или «иммортализованная», используемый в контексте изобретения, относится к свойству клетки делиться бесконечно. Иммортализованная клетка будет расти в популяцию клеток, также называемых «клеточной линией». Предпочтительно такая клеточная линия содержит или состоит из изолированных клеток. Предпочтительно такая клеточная линия не станет стареющей. Предпочтительно она также не вступит в апоптоз в условиях культивирования клеток. Несмотря на то, что клеточная линия, как правило, имеет клональное происхождение, то есть все клетки являются потомками одной трансформированной клетки, обычно имеется гетерогенность в пределах клеточной линии. Это обусловлено перестройками хромосом, дупликациями хромосом или неправильным разделением хромосом, которое может происходить во время митоза. Такие события чаще встречаются в трансформированных клетках. Термин «трансформированная» относится к дополнительному свойству клеточной линии, то есть в дополнение к бесконечному росту. Эти свойства представляют собой одно или несколько свойств, которые ассоциированы с опухолевыми клетками, включая независимый от прикрепления рост, потерю контактного торможения роста, инвазивность и полиплоидию. Предпочтительно трансформированная клеточная линия трансформируется аденовирусом или аденовирусной частицей.

Термин «клеточная линия» относится к клеточной линии, которая проявляет гетерогенность в отношении одного или нескольких свойств. Как правило, гетерогенность значительно или совсем не изменяется во время последовательных митотических циклов клеток клеточной линии. Конкретным свойством, в отношении которого клеточная линия может быть гетерогенной, является экспрессия заданного трансгена, предпочтительно Tet-R, и/или плоидность.

Термин «Tet-R» используется в контексте изобретения для обозначения тетрациклинового репрессора.

Термины «TRE» и «TetO» используются для обозначения элементов ДНК, с которыми специфически связывается Tet-R. Предпочтительно последовательность TetO представляет собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 (TCCCTATCAGTGATAGAGA).

Если TetO вставлен во множестве копий в базальный промотор гена или рядом с ним, Tet-R может действовать в качестве репрессора транскрипции с этого базального промотора. Чтобы максимально повысить эффект связывания Tet-R, часто желательно включить два или более TetO последовательно в один промотор. Предпочтительно две, три, четыре, пять, шесть или по меньшей мере 7 копий TetO последовательно включены в один промотор.

Термин «гетерологичный ген» используется в контексте настоящего изобретения для обозначения гена, который не встречается в природе или взят из своего природного окружения и вставлен либо в другое положение в пределах генома, где он встречается в природе, либо в другой организм или геном. Например, человеческий ген, кодирующий опухолевый антиген, который вставлен в аденовирусный геном, является гетерологичным аденовирусному геному.

Термин «токсичный» используется в контексте настоящего изобретения для обозначения активности соединения в отношении ингибирования пролиферации клеточной линии. В зависимости от соединения и концентрации это ингибирование может быть полным, то есть отдельные клетки прекращают рост или переходят к апоптозу.

Термин «вирусные частицы» используется в контексте настоящего изобретения для обозначения вируса, предпочтительно рекомбинантного вируса или вириона, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты. Эта последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой полный или частичный вирусный геном. В последнем случае вирусный геном предпочтительно содержит гетерологичный ген. Для некоторых вирусных частиц требуются только очень короткие последовательности вирусного генома, чтобы осуществить сборку вируса или вириона. Например, для аденоассоциированного вируса короткая (длиной около 200 bp (пар оснований)) повторяющаяся последовательность, помещенная на 5'- и 3'-концах гетерологичной нуклеиновой кислоты заданной длины (обычно в диапазоне от 4,5 до 5,3 кВ (т.п.н.) для аденоассоциированного вируса) обеспечит сборку инфекционного аденоассоциированного вируса. Вирусная частица является «инфекционной» в контексте изобретения, если она может переносить содержащуюся в ней нуклеиновую кислоту в клетку в случае контакта с клеткой.

Предпочтительной клеточной линией по изобретению является клеточная линия, полученная из НЕК293, называемая М9. Эта клеточная линия была депонирована 9 августа 2017 года в Европейской коллекции аутентифицированных клеточных культур (ЕСАСС) в Public Health England, Culture Collections, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, United Kingdom, под регистрационным номером 17080901. Депонирование было осуществлено от имени Nouscom AG, Baumleingasse 18, Basel, CH-4051, Switzerland. Клеточную линию получали из клеточной линии раннего пассажа, полученной из эмбриональных клеток почки человека (Homo Sapiens).

Варианты осуществления

В последующем описании более подробно поясняются различные аспекты изобретения. Каждый описанный таким образом аспект может быть объединен с любым другим аспектом или аспектами, если явно не указано иное. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или выгодный, может быть объединен с любым другим признаком или признаками, указанными как предпочтительные или выгодные.

В работе, результатом которой стало настоящее изобретение, удивительным образом показано, что высокая продуктивность аденовирусного вектора может быть достигнута с помощью клеточной линии в соответствии с настоящим изобретением.

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает клеточную линию, в которой тетрациклиновый репрессор (TetR) экспрессируется под контролем клеточного или частично клеточного промотора. Настоящее изобретения обеспечивает также клеточную линию, в которой тетрациклиновый репрессор (TetR) экспрессируется по меньшей мере в 70% клеток клеточной линии. Предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80% и более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% клеток в клеточной линии(линиях) экспрессируют Tet-R. Процент клеток в клеточной линии (линиях), которые экспрессируют Tet-R, может быть измерен известными в данной области способами, включая флуоресцентное окрашивание белков или анализ мРНК и FACS.

Уровень экспрессии генов, приходящийся на клетку, может быть измерен с помощью количественной полимеразной цепной реакции (QPCR), предпочтительно QPCR одиночной клетки. Количественная полимеразная цепная реакция является известным способом для специалиста в данной области. Для справки можно сделать ссылку на Applied Biosystems QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System -Publication Part Number 4470050 Rev. A.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения Tet-R экспрессируется в тех клетках клеточной линии, которые экспрессируют белок Tet-R на уровне по меньшей мере 10³ молекул белка/клетку, предпочтительно по меньшей мере 10⁴ молекул белка/клетку, предпочтительно по меньшей мере 10⁵ молекул белка/клетку, предпочтительно по меньшей мере 10⁶ молекул белка/клетка, более предпочтительно по меньшей мере 10⁷ молекул белка/клетку, таком как от 10³ до 10⁶, от 10⁴ до 10⁵ молекул белка/клетку. Соответственно, предпочтительно, чтобы клеточная линия, экспрессирующая белок Tet-R, содержала от 10³ до 10⁶, более предпочтительно от 10⁴ до 10⁵ копий мРНК на клетку.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения клеточная линия содержит стабильно интегрированный в ее геном ген, кодирующий тетрациклиновый репрессор (Tet-R). Предпочтительно ген, кодирующий Tet-R, стабильно интегрирован только в клетки, которые экспрессируют Tet-R. Предпочтительно ген, кодирующий Tet-R, стабильно интегрирован по меньшей мере в 70%, предпочтительно в 75%, 80% или 85% клеток клеточной линии. Более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 97% клеток в клеточной линии содержат стабильно интегрированный в ее геном ген, кодирующий Tet-R.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения экспрессия Tet-R является стабильной во времени. «Время» в контексте настоящего изобретения может быть определено как число пассажей клеток клеточной линии. При этом 10 пассажей соответствуют примерно 30-70 дням, предпочтительно 40-60 дням и более предпочтительно примерно 50 дням. В пределах этой временной рамки, составляющей 10 дней, 5 пассажей может, но необязательно, соответствовать 15-35 дням, предпочтительно 20-30 дням и более предпочтительно 25 дням. В пределах временной рамки, составляющей 10 дней, 1 пассаж может, но необязательно, соответствовать 3-7 дням, предпочтительно 4-6 дням и более предпочтительно 5 дням. Предпочтительно «стабильный во времени» означает стабильный в течение по меньшей мере 40 (или более 40) пассажей, в течение по меньшей мере 45 (или более 45) пассажей, в течение по меньшей мере 50 (или более 50) пассажей, в течение по меньшей мере 60 (или более 60) пассажей или в течение по меньшей мере 75 (или более 75) пассажей. Для всех этих вариантов осуществления экспрессия является предпочтительно стабильной в течение вплоть до 100 пассажей. Количество соответствующих дней может быть рассчитано для указанного и любого другого количества пассажей с использованием определения, приведенного выше для 10, 5 и/или 1 дня. Например, 40 пассажей соответствуют 120-280 дням, предпочтительно 160-240 дням и более предпочтительно 200 дням; 45 пассажей соответствуют 135-315 дням, предпочтительно 180-270 дням и более предпочтительно 225 дням; 50 пассажей соответствуют 150-350 дням, предпочтительно 200-300 дням и более предпочтительно 250 дням; 60 пассажей соответствуют 180-420 дням, предпочтительно 240-360 дням и более предпочтительно 300 дням; 75 пассажей соответствуют 225-525 дням, предпочтительно 300-450 дням и более предпочтительно 375 дням; 100 пассажей соответствуют 300-700 дням, предпочтительно 400-600 дням и более предпочтительно 500 дням. Варианты осуществления верхних пределов объединяют с нижними пределами в соответствии с их ранжированием предпочтений. «Время» также определяется независимо от пассажей только по количеству дней. В этом случае вышеуказанные диапазоны, приведенные в отношении количества пассажей, применяются как варианты осуществления (например, «120-280 дней» относится к варианту осуществления «по меньшей мере 120-280 дней», который не ограничивается каким-либо количеством пассажей, т.е. оно может составлять меньше или больше 40 пассажей; тогда предпочтительные диапазоны представляют предпочтительные варианты осуществления). «Стабильный» в настоящем документе означает увеличение снижения не более чем на 50%, предпочтительно не более чем на 25% и более предпочтительно не более чем на 10% от среднего уровня экспрессии во время пассажей 10-20. В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения Tet-R репрессирует транскрипцию генов, содержащих в своих промоторах один или несколько тетрациклиновых операторов (TetO) в присутствии или в отсутствие тетрациклина или аналога тетрациклина. Например, промотор содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более TetO.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения ген Tet-R находится под контролем конститутивного промотора. В следующем предпочтительном варианте осуществления конститутивный промотор выбран из группы, состоящей из промотора EF1 альфа, промотора PGK-1, промотора убиквитина В, промотора β-актина, промотора EGR1, промотора HCMV, промотора SV40, промотора RSV, промотора CMV мыши, промотора CASI и промотора CAG. Более предпочтительно, ген Tet-R находится под контролем промотора CAG. Промотор предпочтительно представляет собой клеточный или частично клеточный промотор. Клеточный промотор предпочтительно представляет собой промотор эукариотической клетки. Предпочтительно промотор представляет собой клеточный промотор или частично клеточный промотор. Примерами клеточных промоторов являются промоторы мыши, крысы, кролика, морской свинки, курицы и, в частности, человека. «Частично клеточные промоторы» представляют собой гибридные промоторы, содержащие часть(и) одного или нескольких клеточных промоторов и часть(и) одного или нескольких неклеточных промоторов. Неклеточный промотор предпочтительно представляет собой вирусный промотор. Клеточные и неклеточные части представляют собой слияние, которое обладает активностью промотора (активность, которая приводит к транскрипции представляющей интерес кодирующей последовательности). Предпочтительными клеточными промоторами являются промотор EF1 альфа, промотор PGK-1, промотор убиквитина В, промотор β-актина и промотор EGR1. Предпочтительными частично клеточными промоторами являются промотор CASI (частично цитомегаловирус и частично курица) и промотор CAG. Промотор CAG (промотор, используемый в клетках М9 в примерах) является наиболее предпочтительным. Он содержит (С) элемент раннего энхансера цитомегаловируса, (А) промотор, первый экзон и первый интрон гена бета-актина курицы, и (G) акцептор сплайсинга гена бета-глобина кролика.

Промоторы, содержащие один или несколько тетрациклиновых операторов (TetO), которые могут быть репрессированы Tet-R, конкретно не ограничиваются, например, они могут быть клеточными, частично клеточными, вирусными или частично вирусными промоторами (гибридные промоторы, содержащие часть вирусного промотора и часть невирусного промотора).

В другом предпочтительном варианте осуществления ген, кодирующий Tet-R, кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотических клетках (предпочтительно клетках млекопитающих). В настоящем документе термин «кодон-оптимизирован» означает, что эффективность трансляции для экспрессии в эукариотических клетках (предпочтительно, клетках млекопитающих) увеличивается путем замены кодонов, которые имеют низкую частоту в эукариотических клетках (предпочтительно, клетках млекопитающих), кодонами, которые транслируются в такую же аминокислоту, но которые имеют высокую частоту в эукариотических клетках (предпочтительно клетках млекопитающих).

В следующем предпочтительном варианте осуществления клеточная линия, кроме того, содержит в своем геноме мутацию, делецию или вставку, которая уменьшает или предотвращает экспрессию функционального белка, выбранного из группы, состоящей из стимулятора одного или нескольких генов IFN, предпочтительно cGas и STING, одной или нескольких сигнальных систем JAK/активатор транскрипции STAT, и одного или нескольких IFN-стимулированных генов (ISG), предпочтительно PKR, МХ1, OAS1, APOBEC3G, TRIM5, ZAP, ISG15, ADAR, IFITM1/2/3, BST2 и/или RSAD2.

В предпочтительном варианте осуществления первого варианта осуществления настоящего изобретения клеточная линия, кроме того, содержит ген, кодирующий маркер селекции. Предпочтительно ген устойчивости находится в генетической связи с геном, кодирующим Tet-R. В предпочтительном варианте осуществления ген, кодирующий маркер селекции, выбран из группы, состоящей из гена устойчивости к G418, гигромицину В, пуромицину, бластицидину или зеоцину в генетической связи с геном, кодирующим Tet-R. Более предпочтительно, ген, кодирующий маркер селекции, представляет собой ген устойчивости к G418 в генетической связи с геном, кодирующим Tet-R.

В следующем предпочтительном варианте осуществления клеточная линия экспрессирует по меньшей мере один вирусный ген, который требуется для образования инфекционных вирусных частиц. Более предпочтительно, в случае, если клеточная линия используется для продуцирования рекомбинантных аденовирусов, по меньшей мере один вирусный ген представляет собой Е1-А и/или E1-В, кодированный в области Е1. Например, области Е1 могут происходить из человеческих аденовирусов или аденовирусов человекообразных обезьян, таких как Chimpanzee Ad, Bonobo Ad или Gorilla Ad. Более предпочтительно клеточная линия содержит в своем геноме нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 или 2, или ее вариант, кодирующий тот же белок Е1-А и/или Е1-В.

В предпочтительном варианте осуществления клетки клеточной линии представляют собой трансформированные клетки.

В следующем предпочтительном варианте осуществления клетки клеточной линии представляют собой клетки человека. Более предпочтительно клетки клеточной линии представляют собой эмбриональные клетки почки человека.

В предпочтительном варианте осуществления клетки клеточной линии выбраны из группы, состоящей из клеток HEK293, клеток А549, клеток HeLa, клеток MRC5, клеток VERO, клеток DF-1 или клеток SK-OV-3.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления клеточная линия представляет собой клеточную линию, депонированную под номером доступа 1708091 в ЕСАСС.

В следующем предпочтительном варианте осуществления клеточная линия, кроме того, содержит вирусный геном, способный собираться в инфекционную вирусную частицу и содержащий по меньшей мере один гетерологичный ген под контролем промотора, содержащего один или несколько тетрациклиновых операторов (TetO).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления вирусный геном выбран из группы, состоящей из генома вируса герпеса, генома модифицированной осповакцины Анкара и аденовирусного генома. Более предпочтительно вирусный геном представляет собой аденовирусный геном. Примером генома вируса герпеса является HSV-1.

В предпочтительном варианте осуществления гетерологичный ген является токсичным для клетки или нарушает цикл репликации вируса.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления гетерологичный ген выбран из группы, состоящей из аутоантигенов, вирусных генов, генов клеточного происхождения, синтетических цепочек, кодирующих комбинацию опухоль-ассоциированных неоантигенов, и цепочек, кодирующих неоэпитопы. Предпочтительно аутоантиген выбран из группы, состоящей из HER2/neu, СЕА, Hepcam, PSA, PSMA, теломеразы, gplOO, Melan-A/MART-1, Muc-1, NY-ES0-1, сурвивина, стромелизина 3, тирозиназы, MAGE3, CML6S, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NYC0-5S, NY-BR-62, hKLP2 и VEGF. Предпочтительно вирусный ген выбран из группы, состоящей из белка Е1-Е2 HCV, гликопротеина вируса бешенства и GP 160 HIV-1. Предпочтительно ген клеточного происхождения выбран из группы, состоящей из Tim-3, Her2 и Е2 F-1.

Второй аспект изобретения обеспечивает применение клеточной линии в соответствии с первым аспектом изобретения для продуцирования вирусных частиц.

Третий аспект изобретения обеспечивает способ продуцирования инфекционных вирусных частиц, включающий следующие стадии:

(i) выращивание клеток клеточной линии по первому аспекту изобретения, кроме того, содержащих вирусный геном, способный собираться в инфекционную вирусную частицу in vitro в присутствии или в отсутствие тетрациклина или аналога тетрациклина; или

(ii) инфицирование клеток клеточной линии по первому аспекту изобретения вирусным вектором, предпочтительно аденовирусным вектором; и

(iii) извлечение вирусных частиц.

В предпочтительном варианте осуществления третьего варианта осуществления настоящего изобретения стадию выращивания (i) осуществляют в отсутствие тетрациклина или аналога тетрациклина.

Изобретение относится, в частности, к следующим пунктам:

1. Клеточная линия, в которой тетрациклиновый репрессор (Tet-R) экспрессируется по меньшей мере в 70% клеток клеточной линии.

2. Клеточная линия по п. 1, отличающаяся тем, что Tet-R экспрессируется в тех клетках клеточной линии, которые экспрессируют Tet-R на уровне по меньшей мере 1000 копий мРНК или молекул белка Tet-R на клетку.

3. Клеточная линия по п. 1 или 2, содержащая стабильно интегрированный в ее геном ген, кодирующий тетрациклиновый репрессор (Tet-R).

4. Клеточная линия по любому из пунктов 1-3, отличающаяся тем, что

(i) Tet-R репрессирует транскрипцию генов, содержащих в своих промоторах один или несколько тетрациклиновых операторов (TetO) в присутствии или в отсутствие тетрациклина или аналога тетрациклина, и/или

(ii) ген Tet-R находится под контролем конститутивного промотора, предпочтительно конститутивный промотор выбран из группы, состоящей из промотора EF1 альфа, промотора PGK-1, промотора убиквитина В, промотора β-актина, промотора EGR1, промотора HCMV, промотора SV40, промотора RSV, промотора CMV мыши, промотора CASI и промотора CAG, более предпочтительно конститутивный промотор представляет собой промотор CAG.

5. Клеточная линия по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что ген, кодирующий Tet-R, кодон-оптимизирован для экспрессии в клетках млекопитающего.

6. Клеточная линия по любому из пп. 1-5, кроме того, содержащая в ее геноме мутацию, делецию или вставку, которая уменьшает или предотвращает экспрессию функционального белка, выбранного из группы, состоящей из одного или нескольких стимуляторов гена IFN, предпочтительно cGas и STING, одной или нескольких сигнальных систем JAK/активатор транскрипции STAT, и одного или нескольких IFN-стимулированных генов (ISG), предпочтительно PKR, МХ1, OAS1, APOBEC3G, TRIM5, ZAP, ISG15, ADAR, IFITM1/2/3, BST2 и/или RSAD2.

7. Клеточная линия по любому из пп. 1-6, кроме того, содержащая ген, кодирующий маркер селекции, предпочтительно ген устойчивости к G418, гигромицину В, пуромицину, бластицидину или зеоцину в генетической связи с геном, кодирующим Tet-R.

8. Клеточная линия по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что клетки клеточной линии экспрессируют по меньшей мере один вирусный ген, требуемый для образования инфекционных вирусных частиц, предпочтительно при этом по меньшей мере один вирусный ген выбран из группы, состоящей из Е1, предпочтительно содержащей ген с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.

9. Клеточная линия по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что клетки клеточной линии представляют собой клетки человека, предпочтительно эмбриональные клетки почки человека.

10. Клеточная линия по п. 8 или 9, отличающаяся тем, что клетки клеточной линии представляют собой клетки НЕК293, клетки А549, клетки HeLa, клетки MRC5, клетки VERO, клетки DF-1 или клетки SK-OV-3.

11. Клеточная линия по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что указанная клеточная линия депонирована в ЕСАСС под номером доступа 17080901.

12. Клеточная линия по любому из пп. 1-11, кроме того, содержащая вирусный геном, способный собираться в инфекционную вирусную частицу, и содержащая по меньшей мере один гетерологичный ген под контролем промотора, содержащего один или несколько тетрациклиновых операторов (TetO), предпочтительно при этом

(i) вирусный геном выбран из группы, состоящей из генома вируса герпеса, генома модифицированного вируса осповакцины Анкара и аденовирусного генома, предпочтительно, вирусный геном представляет собой аденовирусный геном, и/или

(ii) гетерологичный ген является токсичным для клетки.

13. Клеточная линия по п. 12, отличающаяся тем, что гетерологичный ген выбран из группы, состоящей из аутоантигенов, вирусных генов, генов клеточного происхождения, синтетических цепочек, кодирующих комбинацию опухоль-ассоциированных неоантигенов, и цепочек, кодирующих неоэпитопы, предпочтительно при этом

(i) аутоантиген выбран из группы, состоящей из HER2/neu, СЕА, Нерсат, PSA, PSMA, теломеразы, gplOO, Melan-A/MART-1, Muc-1, NY-ES0-1, сурвивина, стромелизина 3, тирозиназы, MAGE3, CML6S, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NYC0-5S, NY-BR-62, hKLP2 и VEGF,

(ii) вирусный ген выбран из группы, состоящей из белка Е1-Е2 HCV, гликопротеина вируса бешенства и GP 160 HIV-1, и/или

(iii) ген клеточного происхождения выбран из группы, состоящей из Tim-3, Her2 и Е2 F-1.

14. Применение клеточной линии по любому из пунктов 1-13 для продуцирования инфекционных вирусных частиц.

15. Способ продуцирования инфекционных вирусных частиц, включающий следующие стадии:

(i) выращивание клеток клеточной линии по п. 12 или 13 in vitro в присутствии или в отсутствие тетрациклина или аналога тетрациклина; или

(ii) инфицирование клеток клеточной линии по любому из пп. 1-11 вирусным вектором, предпочтительно аденовирусным вектором; и

(iii) извлечение вирусных частиц.

Примеры

Пример 1: Создание стабильного клона, экспрессирующего TetR

Клетки HEK 293 культивировали в DMEM, 10% эмбриональной бычьей сыворотке и размножали. На пассаже 30 клетки высевали во флакон для культивирования клеток Т-75 и трансфицировали 24 мкг плазмиды pneo/CAG-TetR, расщепленной BsaXl. Pneo/CAG-TetR содержит экспрессионную кассету для тетрациклинового репрессора и гена устойчивости к G418 (фигура 1). Через 48 часов после трансфекции клетки НЕК 293 разводили до соотношения 1:80 в полной среде DMEM, дополненной 0,8 мг/мл G-418. Одиночные выделенные клоны, устойчивые к G-418, собирали с использованием стандартных процедур и переносили в 24-луночные планшеты. Каждый 24-луночный планшет использовали для создания 3 планшетов: 2 из них использовали для скрининга одиночных клонов, а третий сохраняли в качестве «контрольного планшета». Все клоны трансдуцировали ChAdE TetOSeap в двух повторах в присутствии или в отсутствие 1 мкг/мл тетрациклина. Через 48 часов после инфицирования супернатант оценивали на экспрессию секретируемой щелочной фосфатазы путем использования хемилюминесцентного анализа (набор Phospha-Light kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) в соответствии с инструкцией производителя. Клоны ранжировали путем вычисления отношения экспрессии SEAP в присутствии/в отсутствие тетрациклина. Величина представляет меру строгости транскрипционного контроля: чем выше величина, тем строже транскрипционный контроль. Лучшие клоны оценивали также на продуктивность аденовирусных векторов. Клон М9 оказался высоко эффективным в отношении контроля экспрессии посредством тетрациклинового репрессора, а также поддержки высоких уровней продуцирования аденовирусных векторов.

Пример 2. Оценка регулирования TetR с помощью анализа SeAp - сравнение клонов М9 и М38

Клоны М9 и М38 высевали в трех повторах во флаконы Т25. Когда клеточные монослои достигали 80-90% конфлюэнтности (около 3×10⁶ клеток/флакон), их инфицировали следующим образом. Кондиционированную среду аспирировали и заменяли 5 мл свежей среды. Затем клетки инфицировали ChAdE TetOSeap с использованием множественности инфицирования (moi) 30 частиц/клетку (vp/клетку) в присутствии или в отсутствие тетрациклина (1 мкг/мл). Экспрессию SeAp оценивали через два дня после инфицирования путем тестирования 50 мкл супернатанта на флакон. Супернатанты, собранные из каждого флакона, переносили в лунки 96-луночного планшета (50 мкл/лунку) для тестирования на активность щелочной фосфатазы с помощью хемилюминесцентного анализа (набор Phospha-Light kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Сигнал получали с использованием планшетного анализатора Envision 2012 Multilabel reader (Perkin Elmer). Эффективность транскрипционного контроля оценивали путем расчета отношения величины экспрессии SeAp, полученной в присутствии и в отсутствие тетрациклина, как показано на фигуре 2. Экспрессия SeAp в присутствии тетрациклина (Tet) является сопоставимой в двух клонах, что указывает на то, что в отсутствие транскрипционного контроля промотор HCMV является полностью активным в клетках М9, а также в клетках М38. Напротив, когда Tet не присутствует в среде, и TetR является активным и связан с промотором, активность SeAP является примерно в 5 раз более низкой в клоне М9, что указывает на более сильную репрессию промотора HCMV по сравнению с М38.

Пример 3: Оценка продуктивности аденовектора в клетках М9 и М38

Клоны М9 и М38 высевали в двух повторах во флаконы Т25. Когда клетки достигали 80-90% конфлюэнтности, их инфицировали AdTetOE1/F78E2p7 с использованием moi 100 vp/клетку. AdTetOE1/F78E2p7 представляет собой аденовирусный вектор, несущий ген, который является токсичным при экспрессии в клетках HEK293 и, следовательно, он не может размножаться без транскрипционного контроля. Клетки HEK 293 инфицировали параллельно в качестве контроля. Когда полный цитопатический эффект наблюдался с помощью микроскопии (через 4 дня после инфицирования), клетки и среду собирали из каждого флакона, и замораживали при -80°C. Вирусный вектор высвобождался из инфицированных клеток за три цикла замораживания/оттаивания (-80°C/37°C). Затем клеточные лизаты осветляли путем центрифугирования. Осветленные супернатанты анализировали с помощью капельной цифровой полимеразной цепной реакции, используя химию красителя репортера-гасителя TaqMan (Biorad QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System), с праймерами, сконструированными для амплификации специфической целевой области промотора цитомегаловируса человека (HCMVp), присутствующего в геноме аденовектора, и флуоресцентным зондом с двойной меткой (FAM-TAMRA). Выход вируса оценивали в неочищенном лизате и выражали как удельную продуктивность в vp/клетку. Результаты (фигура 3) показали, что клоны М9 имеют более высокую продуктивность по сравнению с М38, и что родительские клетки HEK293 не способны поддерживать продуцирование аденовектора, экспрессирующего токсичный ген. Более высокая продуктивность, показанная клетками М9, согласуется с результатами, представленными на фигуре 2, демонстрирующими лучший транскрипционный контроль М9 по сравнению с М38. Кроме того, клетки HEK293 не способны поддерживать репликацию аденовирусного вектора, экспрессирующего токсичный ген.

Пример 4. Экспрессия белка TetR в клетках М9 и М38

Продуцирование TetR в клонах М9 и М38 оценивали с помощью вестерн-блоттинга с использованием клеточного лизата. Клеточные белки экстрагировали из клонов М9 и М38, и количественно оценивали путем использования анализа Bio-Rad Protein Assay с помощью стандартной кривой, построенной с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA). 45 мкг белкового экстракта денатурировали при 100°C в присутствии загрузочного буфера, содержащего SDS, и наносили на 4-12% гель Bis-Tris NuPAGE®. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали с моноклональным антителом TetR (Clontech, номер по каталогу 631131), разведенным 1:1000. Сигнал выявляли путем инкубации мембраны с анти-мышиным вторичным антителом, конъюгированным с HRP (SIGMA, номер по каталогу А9044), разведенным 1:3000. Как показано на фигуре 4, экспрессия TetR была более высокой в клетках М9, чем в М38.

Пример 5: Эффективность спасения векторов ChAd в клетках М9

Для дополнительной оценки эффективности клеток М9 в отношении поддержки продуцирования аденовирусных векторов, авторы проводили тестирование на эффективность спасения аденовирусных векторов видов С и Е путем трансфекции ДНК (ChAdN13 ТРА4-T1Poly - фигура 5А и ChAdE egfp - фигура 5В) по сравнению с родительскими HEK293. Клетки М9 и НЕК293 культивировали во флаконе Т25 для параллельной трансфекции 10 мкг плазмидной ДНК pre Ad с использованием Lipofectamine® 2000 (Thermo Fisher Scientific, номер по каталогу 11668-019) в соответствии с инструкциями производителя. Спасение и амплификацию аденовирусного вектора оценивали с помощью QPCR на клеточных лизатах через 12 дней после трансфекции. Праймеры, используемые в анализе, были сконструированы для амплификации специфической целевой области промотора цитомегаловируса человека (HCMV), и гибридизация флуоресцентного зонда с двойной меткой (FAM-TAMRA) происходит внутри ампликона. Результаты показаны на фигуре 5 и демонстрируют более высокую эффективность продуцирования аденовирусного вектора в клетках М9 после трансфекции для обоих видов С и Е аденовирусных векторов.

Пример 6: Продуктивность векторов ChAd С-Venus и ChAd E-EGFP

Продуктивность двух различных векторов Ad шимпанзе, несущих репортерные гены - ChAdC-Venus (фигура 6А) и ChAdE-EGFP (фигура 6В) оценивали в клетках М9 по сравнению с родительскими клетками HEK 293 и 293Т. Монослои клеток во флаконе Т25 инфицировали с использованием одинаковой множественности инфицирования для обоих ChAd. Клетки собирали через 72 часа после инфицирования, когда полный цитопатический эффект становился очевидным. Векторы высвобождались из инфицированных клеток за три цикла замораживания/оттаивания (-80°C/37°C). Затем клеточные лизаты осветляли центрифугированием и титр вектора оценивали с помощью QPCR в реальном времени в осветленном клеточном лизате. Используемые праймеры были сконструированы для амплификации специфической целевой области цитомегаловируса человека (HCMV), присутствующего в геноме аденоассоциированного вируса. Гибридизация флуоресцентного зонда с двойной меткой (FAM-TAMRA) происходит внутри ампликона. Результаты показаны на фигуре 6.

Пример 7. Оценка гомогенности транскрипционного контроля в клетках М9 и Т-Rex - экспрессия репортерного гена Venus на уровне одиночных клеток с помощью анализа FACS

Гомогенность транскрипционного контроля в клеточной линии является важной характеристикой клеточной линии, предназначенная для контроля экспрессии посредством процесса продуцирования аденовирусного вектора. Гетерогенная экспрессия на уровне одиночных клеток в клеточной линии, используемой для продуцирования, может привести к отбору перегруппированных видов вектора в субпопуляции клеток, которые эффективно не репрессируют транскрипцию. Гомогенность транскрипционного контроля оценивали в клетке М9 по сравнению с коммерчески доступными клетками T-Rex, экспрессирующими Tet-R (Invitrogen, номер партии 1804535). Клетки высевали во флаконы Т25 и инфицировали ChAdC-Venus с использованием moi=100 vp/клетку. Через два дня после инфицирования клетки открепляли от флаконов и промывали PBS 1X, и извлекали путем центрифугирования. Клеточный осадок ресуспендировали в PBS 1X, содержащем 1% формальдегид, 2,5 мМ EDTA, при конечной клеточной плотности 1,55×10⁶ клеток/мл. 200 мкл клеточной суспензии (всего ~ 3е5 клеток) переносили в лунку 96-луночного планшета и анализировали с помощью FACS. Результаты анализа FACS, представленные на фигуре 7, показали, что флуоресцентный сигнал обнаруживался в 3,8% клеточной линии М9, при этом 26% клеток T-Rex оказались положительными. Этот результат продемонстрировал, что клеточная линия М9 является более гомогенной с более высоким % клеток (96,2%), которые способны контролировать экспрессию, по сравнению с T-Rex (74%).

Пример 8. Продуктивность вектора ChAd в клеточных линиях М9 и T-Rex

Для сравнения клеточно-специфической и объемной продуктивности аденовирусных векторов в клетках М9 по сравнению с клетками T-REX (Invitrogen, номер партии 1804535), клеточные линии высевали во флаконы Т25. При достижении конфлюэнтности монослои клеток инфицировали ChAdC-Venus с использованием moi 100 vp/клетку. Клетки собирали, когда полный СРЕ был очевиден при микроскопическом наблюдении (7 дней после заражения). Продуктивность вектора затем определяли с помощью QPCR в реальном времени с использованием праймеров, сконструированных на последовательности промотора HCMV, и гибридизация флуоресцентного зонда с двойной меткой (FAM-TAMRA) происходила внутри ампликона. Результаты, представленные на фигуре 8, показали более высокую продуктивность ChAdC-Venus в клетках М9, чем в T-Rex.

Пример 9. Анализ экспрессии TetR в клетках HCMV-TetR и М9 методом вестерн-блоттинга

3×10⁶ клеток каждого образца (см. фигуру 10) лизировали путем ресуспендирования клеточного осадка в 20 мМ TRIS-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, рН 8,0, 10% Triton-X, коктейль ингибиторов протеаз Roche, номер по каталогу 11697498001, в течение 30 мин при 4°C. После инкубации образцы центрифугировали при 4°C в течение 30 мин при 14000 об/мин для осветления. Концентрацию общего белка оценивали с помощью анализа белка Bio-Rad, следуя инструкции производителя, а затем анализировали вестерн-блоттингом.

45 мкг белкового экстракта разделяли 4-12% SDS-PAGE в восстанавливающих условиях и затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану с помощью Dry Blot (iBlot Gel Transfer system, Invitrogen). После переноса белка мембрану обрабатывали блокирующим буфером (5% молока в PBS-Tween 0,1%) в течение 1 часа при комнатной температуре и инкубировали в течение 12 часов при +4°C с анти-TetR моноклональным антителом (клон 9G9 - Clontech, номер по каталогу 631132) в разведении 1:1000. На следующий день мембрану инкубировали с HRP-конъюгированным кроличьим анти-мышиным IgG (SIGMA, номер по каталогу А9044) в течение 1 часа при комнатной температуре и затем визуализировали с использованием субстрата для блоттинга Pierce ECL Western (Thermo Scientific, Rockford, IL) согласно протоколу производителя. Антитело против тубулина использовали в качестве контроля и для нормализации результатов. Результаты, показанные на фигуре 10, демонстрируют, что экспрессия TetR, управляемая промотором HCMV, со временем уменьшается, и наблюдается сильное уменьшение сигнала TetR при сравнении образцов HEK293 р40 - hCMV TetR и HEK293 р60 - hCMV TetR. Напротив, экспрессия TetR, управляемая промотором CAG, не снижается во времени.

Пример 10. Реактивация экспрессии TetR путем воздействия на клетку НЕК293 р60 - hCMV TetR ингибитора гистондеацетилазы (HDAC)

Для изучения механизма сайленсинга HCMV клетки НЕК293 hCMV TetR на пассаже 60 культивировали в присутствии ингибитора HDAC. Среду для культивирования клеток дополняли 200 нМ белиностата (PXD101) и затем собирали в разные моменты времени, как показано на фигуре 11. Экспрессию TetR оценивали вестерн-блоттингом, как указано в предыдущем примере. Результаты ясно показывают, что экспрессия TetR может быть реактивирована белиностатом, но эффект на экспрессию является лишь временным. Такая реактивация не подходит для практических целей, поскольку белиностат является токсичным для клеток после более продолжительного воздействия.

На основании этого эксперимента авторы изобретения предполагают, что hCMV-IE (вирусный промотор) склонен к транскрипционному сайленсингу, который связан с метилированием ДНК. Напротив, экспрессия TetR, управляемая промотором CAG (наиболее предпочтительный частичный клеточный промотор по изобретению), является стабильной во время пассирования клеток. Авторы изобретения полагают, что это удивительное открытие связано с тем, что клетки более склонны к сайленсингу вирусных промоторов, чем клеточных или частично клеточных промоторов.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> НОУСКОМ АГ

<120> Эукариотическая клеточная линия

<130> 854-13 PCT

<150> EP17198339.8

<151> 2017-10-25

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4344

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60

ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120

gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180

gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240

taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300

agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360

gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420

cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480

tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540

tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600

aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc 660

tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc 720

cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt 780

gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc ggttctccgg agccgcctca 840

cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa 900

ccttgtaccg gaggtgatcg atcttacctg ccacgaggct ggctttccac ccagtgacga 960

cgaggatgaa gagggtgagg agtttgtgtt agattatgtg gagcaccccg ggcacggttg 1020

caggtcttgt cattatcacc ggaggaatac gggggaccca gatattatgt gttcgctttg 1080

ctatatgagg acctgtggca tgtttgtcta cagtaagtga aaattatggg cagtgggtga 1140

tagagtggtg ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt ttacagtttt gtggtttaaa 1200

gaattttgta ttgtgatttt tttaaaaggt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag 1260

ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga 1320

cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt 1380

ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 1440

gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag 1500

cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtga 1560

ttgcgtgtgt ggttaacgcc tttgtttgct gaatgagttg atgtaagttt aataaagggt 1620

gagataatgt ttaacttgca tggcgtgtta aatggggcgg ggcttaaagg gtatataatg 1680

cgccgtgggc taatcttggt tacatctgac ctcatggagg cttgggagtg tttggaagat 1740

ttttctgctg tgcgtaactt gctggaacag agctctaaca gtacctcttg gttttggagg 1800

tttctgtggg gctcatccca ggcaaagtta gtctgcagaa ttaaggagga ttacaagtgg 1860

gaatttgaag agcttttgaa atcctgtggt gagctgtttg attctttgaa tctgggtcac 1920

caggcgcttt tccaagagaa ggtcatcaag actttggatt tttccacacc ggggcgcgct 1980

gcggctgctg ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga aacccatctg 2040

agcggggggt acctgctgga ttttctggcc atgcatctgt ggagagcggt tgtgagacac 2100

aagaatcgcc tgctactgtt gtcttccgtc cgcccggcga taataccgac ggaggagcag 2160

cagcagcagc aggaggaagc caggcggcgg cggcaggagc agagcccatg gaacccgaga 2220

gccggcctgg accctcggga atgaatgttg tacaggtggc tgaactgtat ccagaactga 2280

gacgcatttt gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa gggggtaaag agggagcggg 2340

gggcttgtga ggctacagag gaggctagga atctagcttt tagcttaatg accagacacc 2400

gtcctgagtg tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag cttgatctgc 2460

tggcgcagaa gtattccata gagcagctga ccacttactg gctgcagcca ggggatgatt 2520

ttgaggaggc tattagggta tatgcaaagg tggcacttag gccagattgc aagtacaaga 2580

tcagcaaact tgtaaatatc aggaattgtt gctacatttc tgggaacggg gccgaggtgg 2640

agatagatac ggaggatagg gtggccttta gatgtagcat gataaatatg tggccggggg 2700

tgcttggcat ggacggggtg gttattatga atgtaaggtt tactggcccc aattttagcg 2760

gtacggtttt cctggccaat accaacctta tcctacacgg tgtaagcttc tatgggttta 2820

acaatacctg tgtggaagcc tggaccgatg taagggttcg gggctgtgcc ttttactgct 2880

gctggaaggg ggtggtgtgt cgccccaaaa gcagggcttc aattaagaaa tgcctctttg 2940

aaaggtgtac cttgggtatc ctgtctgagg gtaactccag ggtgcgccac aatgtggcct 3000

ccgactgtgg ttgcttcatg ctagtgaaaa gcgtggctgt gattaagcat aacatggtat 3060

gtggcaactg cgaggacagg gcctctcaga tgctgacctg ctcggacggc aactgtcacc 3120

tgctgaagac cattcacgta gccagccact ctcgcaaggc ctggccagtg tttgagcata 3180

acatactgac ccgctgttcc ttgcatttgg gtaacaggag gggggtgttc ctaccttacc 3240

aatgcaattt gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc aaggtgaacc 3300

tgaacggggt gtttgacatg accatgaaga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc 3360

gcaccaggtg cagaccctgc gagtgtggcg gtaaacatat taggaaccag cctgtgatgc 3420

tggatgtgac cgaggagctg aggcccgatc acttggtgct ggcctgcacc cgcgctgagt 3480

ttggctctag cgatgaagat acagattgag gtactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggg 3540

tgggaaagaa tatataaggt gggggtctta tgtagttttg tatctgtttt gcagcagccg 3600

ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc 3660

gcatgccccc atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg ctccagcatt gatggtcgcc 3720

ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg 3780

agactgcagc ctccgccgcc gcttcagccg ctgcagccac cgcccgcggg attgtgactg 3840

actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg 3900

acaagttgac ggctcttttg gcacaattgg attctttgac ccgggaactt aatgtcgttt 3960

ctcagcagct gttggatctg cgccagcagg tttctgccct gaaggcttcc tcccctccca 4020

atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt 4080

cttgctgtct ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt 4140

cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat 4200

acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg 4260

gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt 4320

ctttcagtag caagctgatt gcca 4344

<210> 2

<211> 4273

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

catcatcaat aatatacctt attttggatt gaggccaata tgataatgag gtgggcgggg 60

cgaggcgggg cgggtgacgt aggacgcgcg agtagggttg ggaggtgtgg cggaagtgtg 120

gcatttgcaa gtgggaggag ctgacatgca atcttccgtc gcggaaaatg tgacgttttt 180

gatgagcgcc gcctacctcc ggaagtgcca attttcgcgc gcttttcacc ggatatcgta 240

gtaattttgg gcgggaccat gtaagatttg gccattttcg cgcgaaaagt gaaacgggga 300

agtgaaaact gaataatagg gcgttagtca tagcgcgtaa tatttaccga gggccgaggg 360

actttgaccg attacgtgga ggactcgccc aggtgttttt tacgtgaatt tccgcgttcc 420

gggtcaaagt ctccgttttt attgtcgccg tcatctgacg cggagggtat ttaaacccgc 480

tgcgctccta aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc tccgctccgt 540

ttcggcgatc gaaaaatgag acatttagcc tgcactccgg gtcttttgtc cggccgggcg 600

gcgtccgagc ttttggacgc tttgctcaat gaggttctga gcgatgattt tccgtctact 660

acccacttta gcccacctac tcttcacgaa ctgtacgatc tggatgtact ggtggatgtg 720

aacgatccca acgaggaggc ggtttctacg ttttttcccg agtctgcgct tttggctgcc 780

caggagggat ttgacctaca cactccgccg ctgcctattt tagagtctcc gctgccggag 840

cccagtggta taccttatat gcctgaactg cttcccgaag tggtagacct gacctgccac 900

gagccgggct ttccgcccag cgacgatgag ggtgagcctt ttgctttaga ctatgctgag 960

atacctgggc tcggttgcag gtcttgtgca tatcatcaga gggttaccgg agaccccgag 1020

gttaagtgtt cgctgtgcta tatgaggctg acctcttcct ttatctacag taagtttttt 1080

tgtgtaggtg ggctttttgg gtaggtgggt tttgtggcag gacaggtgta aatgttgctt 1140

gtgttttttg tacctgcagg tccggtgtcc gagccagacc cggagcccga ccgcgatccc 1200

gagccggatc ccgagcctcc tcgcaggcca aggaaattac cttccatttt gtgcaagcct 1260

aagacacctg tgaggaccag cgaggcggac agcactgact ctggcacttc tacctctcct 1320

cctgaaattc acccagtggt tcctctgggt atacatagac ctgttgctgt tagagtttgc 1380

gggcgacgcc ctgcagtaga gtgcattgag gacttgctta acgatcccga gggacctttg 1440

gacttgagca ttaaacgccc taggcaataa accccaccta agtaataaac cccacctaag 1500

taataaactt taccgccctt ggttattgag atgacgccca atgtttgctt ttgaatgact 1560

tcatgtgtat aataaaagtg agtgtggtca taggtctctt gtttgtctgg gcggggttta 1620

agggtatata agtttctcgg ggctaaactt ggttacactt gaccccaatg gaggcgtggg 1680

ggtgcttgga ggagtttgcg gacgtgcgcc gtttgctgga cgagagctct agcaatacct 1740

atagtatttg gaggtatctg tggggctcta ctcaggccaa gttggtcttc agaattaagc 1800

aggattacaa gtgcgatttt gaagagcttt ttagttcctg tggtgagctt ttgcaatcct 1860

tgaatctggg ccaccaggct atcttccagg aaaaggttct ctcgactttg gatttttcca 1920

ctcccgggcg caccgccgct tgtgtggctt ttgtgtcttt tgtgcaagat aaatggagcg 1980

gggagaccca cctgagtcac ggctacgtgc tggatttcat ggcgatggct ctttggaggg 2040

cttacaacaa atggaagatt cagaaggaac tgtacggttc cgccctacgt cgtccacttc 2100

tgcagcggca ggggctgatg tttcccgacc atcgccagca tcagaatctg gaagacgagc 2160

gagcggagaa gatcagcttg agagccggcc tggaccctcc tcaggaggaa tgaatctccc 2220

gcaggtggtt gagctgtttc ccgaactgag acgggtcctg actatcaggg aggatggtca 2280

gtttgtgaag aagctgaaga gggatcgggg tgagggagat gatgaggcgg ctagcaattt 2340

agcttttagt ctgataactc gccaccgacc ggaatgtatt acctatcagc agattaagga 2400

gagttgtgcc aacgagctgg atcttttggg tcagaagtat agcatagaac agcttaccac 2460

ttactggctt cagcccgggg atgattggga agaggcgatt agggtgtatg caaaggtggc 2520

cctgcggccc gattgcaagt ataagattac taagttggtt aatattagaa actgctgcta 2580

tatttctgga aacggggccg aagtggagat agatactgag gacagggtgg ctattaggtg 2640

ttgcatgata aacatgtggc ccgggatact ggggatggat ggggtgatat ttatgaatgt 2700

gaggttcacg ggccccaact ttaatggtac ggtgttcatg ggcaacacca acttgctcct 2760

gcatggtgcg agtttctatg ggtttaacaa cacctgtata gaggcctgga ccgatgtaaa 2820

ggttcgaggt tgttcctttt atagctgttg gaaggcggtg gtgtgtcgcc ctaaaagcag 2880

gggttctgtg aagaaatgct tgtttgaaag gtgcacccta ggtatccttt ctgagggcaa 2940

ctccagggtg cgccataatg tggcttcgaa ctgcggttgc ttcatgcaag tgaagggggt 3000

gagcgttatc aagcataact cggtctgtgg aaactgcgag gatcgcgcct ctcagatgct 3060

gacctgcttt gatggcaact gtcacctgtt gaagaccatt catataagca gtcaccccag 3120

aaaggcctgg cccgtgtttg agcataacat tctgacccgc tgttccttgc atctgggggt 3180

caggaggggt atgttcctgc cttaccagtg taactttagc cacactaaaa tcctgctgga 3240

acccgagtgc atgactaagg tcagcctgaa tggtgtgttt gatgtgagtc tgaagatttg 3300

gaaggtgctg aggtatgatg agaccaggac caggtgccga ccctgcgagt gcggcggcaa 3360

gcacatgaga aatcagcctg tgatgttgga tgtgaccgag gagcttaggc ctgaccatct 3420

ggtgctggcc tgcaccaggg ccgagtttgg gtctagcgat gaggataccg attgaggtgg 3480

gtaaggtggg cgtggctagc agggtgggcg tgtataaatt gggggtctaa ggggtctctc 3540

tgtttgtctt gcaacagccg ccgccatgag cgacaccggc aacagctttg atggaagcat 3600

ctttagtccc tatctgacag tgcgcatgcc tcactgggcc ggagtgcgtc agaatgtgat 3660

gggttccaac gtggatggac gtcccgttct gccttcaaat tcgtctacta tggcctacgc 3720

gaccgtggga ggaactccgc tggacgccgc gacctccgcc gccgcctccg ccgccgccgc 3780

gaccgcgcgc agcatggcta cggaccttta cagctctttg gtggcgagca gcgcggcctc 3840

tcgcgcgtct gctcgggatg agaaactgac tgctctgctg cttaaactgg aagacttgac 3900

ccgggagctg ggtcaactga cccagcaggt ttccagcttg cgtgagagca gccttgcctc 3960

cccctaatgg cccataatat aaataaaagc cagtctgttt ggattaagca agtgtatgtt 4020

ctttatttaa ctctccgcgc gcggtaagcc cgggaccagc ggtctcggtc gtttagggtg 4080

cggtggattt tttccaacac gtggtacagg tggctctgga tgtttagata catgggcatg 4140

agtccatccc tggggtggag gtagcaccac tgcagagctt cgtgctcggg ggtggtgttg 4200

tatatgatcc agtcgtagca ggagcgctgg gcgtggtgct gaaaaatgtc cttaagcaag 4260

aggcttatag cta 4273

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

tccctatcag tgatagaga 19

<---

1. Клеточная линия, способная подавлять экспрессию трансгена, в которой клетки клеточной линии представляют собой HEK293 и которая содержит стабильно интегрированный в ее геном ген, кодирующий тетрациклиновый репрессор (Tet-R), и в которой Tet-R экспрессируется под контролем промотора CAG.

2. Клеточная линия по п. 1, в которой Tet-R репрессирует транскрипцию генов, содержащих в своих промоторах один или несколько тетрациклиновых операторов (TetO) в присутствии или в отсутствие тетрациклина или аналога тетрациклина.

3. Клеточная линия по любому из пп. 1, 2, в которой ген, кодирующий Tet-R, кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотических клетках, предпочтительно в клетках млекопитающего.

4. Клеточная линия по любому из пп. 1-3, которая дополнительно содержит:

(i) в своем геноме мутацию, делецию или вставку, которая уменьшает или предотвращает экспрессию функционального белка, выбранного из группы, состоящей из одного или нескольких стимуляторов гена IFN, предпочтительно cGas и STING, одной или нескольких сигнальных систем JAK/активатор транскрипции STAT и одного или нескольких IFN-стимулированных генов (ISG), предпочтительно PKR, МХ1, OAS1, APOBEC3G, TRIM5, ZAP, ISG15, ADAR, IFITM1/2/3, BST2 и/или RSAD2, и/или

(ii) ген, кодирующий маркер селекции, предпочтительно ген устойчивости к G418, гигромицину В, пуромицину, бластицидину или зеоцину в генетической связи с геном, кодирующим Tet-R.

5. Клеточная линия по любому из пп. 1-4, в которой клетки клеточной линии экспрессируют по меньшей мере один вирусный ген, который требуется для образования инфекционных вирусных частиц, предпочтительно при этом по меньшей мере один вирусный ген выбран из группы, состоящей из Е1-Аи Е1-В, предпочтительно клеточная линия содержит в своем геноме нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 или 2.

6. Клеточная линия по любому из пп. 1-5, которая представляет собой клеточную линию, депонированную в ЕСАСС под номером доступа 17080901.

7. Клеточная линия по любому из пп. 1-6, дополнительно содержащая вирусный геном, способный к сборке в инфекционную вирусную частицу, и содержащая по меньшей мере один гетерологичный ген под контролем промотора, содержащего один или несколько тетрациклиновых операторов (TetO), предпочтительно при этом

(i) вирусный геном выбран из группы, состоящей из генома вируса герпеса, генома модифицированного вируса осповакцины Анкара и аденовирусного генома, предпочтительно вирусный геном представляет собой аденовирусный геном, и/или

(ii) гетерологичный ген является токсичным для клетки или нарушает цикл репликации вируса.

8. Клеточная линия по п. 7, отличающаяся тем, что гетерологичный ген выбран из группы, состоящей из аутоантигенов, вирусных генов, генов клеточного происхождения, синтетических цепочек, кодирующих комбинацию опухоль-ассоциированных неоантигенов, и цепочек, кодирующих неоэпитопы, предпочтительно при этом

(i) аутоантиген выбран из группы, состоящей из HER2/neu, СЕА, Hepcam, PSA, PSMA, теломеразы, gplOO, Melan-A/MART-1, Muc-1, NY-ES0-1, сурвивина, стромелизина 3, тирозиназы, MAGE3, CML6S, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NYC0-5S, NY-BR-62, hKLP2 и VEGF,

(ii) вирусный ген выбран из группы, состоящей из белка Е1-Е2 HCV, гликопротеина вируса бешенства и GP 160 HIV-1, и/или

iii) ген клеточного происхождения выбран из группы, состоящей из Tim-3, Her2 и Е2 F-1.

9. Применение клеточной линии по любому из пп. 1-8 для продуцирования инфекционных вирусных частиц, причем применение включает инфицирование клеток клеточной линии вирусным вектором.

10. Способ получения инфекционных вирусных частиц, включающий следующие стадии:

(i) выращивание клеток клеточной линии по п. 7 или 8 in vitro в присутствии или в отсутствие тетрациклина или аналога тетрациклина или

(ii) инфицирование клеток клеточной линии по любому из пп. 1-6 вирусным вектором, предпочтительно аденовирусным вектором; и

(iii) извлечение вирусных частиц.