Способ формирования экспериментальной модели комбинации сахарного диабета 1 типа и эндометриоза



Владельцы патента RU 2776727:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" (RU)

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к хирургии, эндокринологии. Выполняют моделирование эндометриоза на крысах путем двусторонней овариоэктомии с последующим удалением левого маточного рога в месте бифуркации и формированием фрагментов эндометриоидной ткани размерами 3×3 мм. Сформированные фрагменты ткани имплантируют на наружную поверхность передней брюшной стенки под кожей. В течение 4 недель после хирургического вмешательства вводят масляный раствор этинилэстрадиола 50 мкг/кг дважды в неделю внутримышечно. Через 2 недели после хирургического вмешательства животным, у которых при визуальном контроле сформировалась модель эндометриоза, внутрибрюшинно вводят 0,9% солевой раствор аллоксана в дозировке 150 мг/кг. При этом в течение первых 48 часов после введения аллоксана осуществляют контроль гликемии 2 раза в сутки при постоянном доступе животных к воде и раствору 30% глюкозы. Повышение уровня гликемии выше 11 ммоль/л и уровня кетоновых тел в крови выше 1,5 ммоль/л на 2-5 сутки является подтверждением формирования сахарного диабета 1 типа. После чего ежедневно в течение 2 недель 1-2 раза в день подкожно вводят инсулин-гларгин длительного действия, причем при уровне гликемии 11-19 ммоль/л - 1 ЕД, 20-29 ммоль/л - 2 ЕД, 30-33 ммоль/л - 3 ЕД, выше 33 ммоль/л - однократно инсулин-аспарт короткого действия - 1 ЕД. Способ позволяет изучить особенности течения комбинации эндометриоза и сахарного диабета 1 типа, их взаимного влияния, выявить ограничения и возможности как существующей, так и разрабатываемой терапии с целью улучшения результатов лечения. 1 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для формирования экспериментальной модели комбинации сахарного диабета 1 типа и эндометриоза, например, при проведении многоэтапного исследования по эффективности и безопасности лечения эндометриоза и сахарного диабета 1 типа (СД1 типа).

Изучение влияния особенностей течения и различных методов терапии одного заболевания на другое возможно в рамках доклинических испытаний с использованием экспериментальных моделей на крысах.

Известен способ формирования экспериментальной модели эндометриоза, включающий хирургическое моделирование эндометриоза на крысах линии Wistar массой 200±50 г. в фазе эструс путем двусторонней овариоэктомии с последующим удалением левого маточного рога в месте бифуркации и формированием фрагментов эндометриоидной ткани размерами 3×3 мм [Сравнительная оценка эффективности перспективных препаратов для таргетной терапии эндометриоза на основании экспериментальной модели заболевания. / Ярмолинская М.И., Петросян М.А. и соавт.// Гинекология. - 2018; 20 (5). - С. 46-51].

Недостаток: способ не позволяет оценить взаимное влияние эндометриоза и сахарного диабета 1 типа.

Известен способ моделирования сахарного диабета 1 типа, при котором внутрибрюшинно вводится 0,9% солевой раствор аллоксана в дозировке 150 мг/кг [Можейко, Л.А. (2013). Экспериментальные модели для изучения сахарного диабета часть I. аллоксановый диабет. Журнал Гродненского государственного медицинского университета, (3 (43)), 26-29].

Недостаток: способ не позволяет оценить взаимное влияние эндометриоза и сахарного диабета 1 типа.

Техническим результатом изобретения является формирование экспериментальной модели комбинации СД1 типа и эндометриоза для возможности исследования взаимного влияния эндометриоза и сахарного диабета 1 типа.

Указанный технический результат достигается в способе формирования экспериментальной модели комбинации сахарного диабета 1 типа и эндометриоза, включающем хирургическое моделирование эндометриоза на крысах путем двусторонней овариоэктомии с последующим удалением левого маточного рога в месте бифуркации и формированием фрагментов эндометриоидной ткани размерами 3×3 мм, в котором сформированные фрагменты ткани имплантируют на наружную поверхность передней брюшной стенки под кожей на расстоянии 7-10 мм от места разреза в месте разветвления кровеносных сосудов, причем в первые 3 дня после хирургического вмешательства вводят антибактериальный препарат цефтриаксон 100 мг/кг один раз в сутки и нестероидный противовоспалительный препарат кетопрофен 40 мг/кг один раз в сутки внутримышечно, в течение следующих 4 недель - масляный раствор этинилэстрадиола 50 мкг/кг дважды в неделю внутримышечно, через 2 недели после хирургического вмешательства после 24-часового голодания животным, у которых при визуальном контроле сформировалась модель эндометриоза, внутрибрюшинно вводят 0,9% солевой раствор аллоксана в дозировке 150 мг/кг с последующим проведением антибактериальной, обезболивающей и противовоспалительной терапии в течение 3 дней, при этом в течение первых 48 часов после введения аллоксана осуществляют контроль гликемии 2 раза в сутки при помощи глюкометра и капиллярной крови из области кончика хвоста при постоянном доступе животных к воде и раствору 30% глюкозы, при этом повышение уровня гликемии выше 11 ммоль/л и уровня кетоновых тел в крови выше 1,5 ммоль/л на 3-5 сутки является подтверждением формирования сахарного диабета 1 типа, после чего ежедневно в течение 2 недель 1-2 раза в день подкожно вводят инсулин-гларгин длительного действия, причем при уровне гликемии 11-19 ммоль/л -1 ЕД, 20-29 ммоль/л -2 ЕД, 30-33 ммоль/л - 3 ЕД, выше 33 ммоль/л - однократно инсулин-аспарт короткого действия -1 ЕД.

Фиксация сформированных имплантов на наружную поверхность передней брюшной стенки под кожей позволяет ограничить возможность влияния аллоксана, вводимого на втором этапе моделирования.

Профилактика послеоперационных осложнений проводится с применением антибактериальной, обезболивающей и противовоспалительной терапии в течение 3 дней после каждого этапа моделирования.

Заявляемый способ основан на экспериментальных исследованиях, на 62 крысах-самках линии Wistar. Все лабораторные животные были выведены в ФГУП Питомник лабораторных животных «Рапполово» и содержались в регламентированных условиях вивария при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных (время и порядок проведения карантина, маркировка всех особей, постоянный санитарный контроль, стандартный рацион питания, свободный доступ к воде и пище, автоматический режим освещения «день/ночь»). Уход за животными и проведение экспериментов осуществлялись согласно основным морально- этическим принципам проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированных в следующих документах: «Правила лабораторной практики в РФ» утвержденные приказом Министерства Здравоохранения РФ №199н от 01.04.2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» и Европейской конвенции от 22.09.2010 г.

Исследование включало 2 этапа.

Первый этап - хирургическое моделирование эндометриоза на крысах линии Wistar массой 200±50 г. в фазе эструс согласно существующей методике [Сравнительная оценка эффективности перспективных препаратов для таргетной терапии эндометриоза на основании экспериментальной модели заболевания. /Ярмолинская М.И., Петросян М.А. и соавт.//Гинекология. - 2018; 20 (5). - С. 46-51] с модификацией в виде фиксации сформированных имплантов на наружную поверхность передней брюшной стенки под кожей.

Операции проводились под общей анестезией животных с использованием золазепама гидрохлорида 100 в дозировке 30 мг/кг внутримышечно. После освобождения места хирургического доступа от шерстяного покрова с помощью химического средства депиляции («Veet») выполнялась лапаротомия с последующей двусторонней овариоэктомией и удалением левого маточного рога в месте бифуркации с целью формирования фрагментов ткани размерами 3×3 мм. Далее производилась аутотрансплантация подготовленных участков матки на наружную поверхность передней брюшной стенки подкожно на расстоянии 7-10 мм от места разреза в области разветвления кровеносных сосудов. Как указывалось выше, смена локализации фиксации будущих гетеротопий осуществлялась в связи с необходимостью ограничения возможного влияния аллоксана на втором этапе. В первые 3 дня от момента операции с целью профилактики послеоперационных осложнений внутримышечно вводился антибактериальный препарат - цефтриаксон 100 мг/кг один раз в сутки и нестероидный противовоспалительный препарат - кетопрофен 40 мг/кг один раз в сутки.

Эстрогеннасыщенный гормональный фон достигался путем внутримышечного введения масляного раствора этинилэстрадиола 50 мкг/кг дважды в неделю в течение следующих 4 недель.

Второй этап заключался в формировании СД1 типа (аллоксанового диабета) через 2 недели после первой операции. Процедура проходила также под общей анестезией животных (указана выше) после 24-часового голодания (глюкоза является конкурентным аналогом аллоксана для глюкозного транспортера 2 типа).

После выполнения лапаротомии проводился визуальный контроль гетеротопий. В случае констатации отсутствия формирования имплантов у 11 крыс (18%) - внутрибрюшинно вводился физиологический раствор и формировалась группа контроля по оценке гликемического статуса.

Животным, у которых сформировалась экспериментальная модель эндометриоза, внутрибрюшинно вводился аллоксан в дозировке 150 мг/кг в форме 0,9% солевого раствора [Можейко, Л.А. (2013). Экспериментальные модели для изучения сахарного диабета часть I. аллоксановый диабет.Журнал Гродненского государственного медицинского университета, (3 (43)), 26-29]. Также всем животным проводилась профилактика послеоперационных осложнений с применением антибактериальной, обезболивающей и противовоспалительной терапии в течение 3 дней.

Ввиду высвобождения инсулина из поврежденных бета-клеток поджелудочной железы и высокой вероятности развития фатальной гликемии (менее 1,8 ммоль/л), в нашем случае у 12 крыс (18%) или выраженной гипогликемии (менее 3 ммоль/л) в первые 48 часов после второй операции (введения аллоксана), необходимо проводить контроль гликемии 2 раза в сутки при помощи глюкометра (Accu-Chek Performa) и капиллярной крови из области кончика хвоста, а также у животных должен быть постоянный доступ не только к воде, но и раствору 30% глюкозы.

В качестве неотложной помощи животным с выраженной гипогликемией в отсутствие возможности перорального лечения использовался 1-3 мл 10% декстрозы подкожно с повторной регистрацией уровня глюкозы через 30-40 минут. Выраженная гипогликемия может быть представлена клинически в виде снижения двигательной активности, летаргии, выгибания спины и тремора.

После стабилизации уровня глюкозы повышалась потребность в воде до 120 мл/сутки, наблюдалась полиурия, гипергликемия, резкая потеря в весе и выпадение шерсти.

Подтверждение СД1 типа подразумевало повышение уровня гликемии выше 11 ммоль/л на 3-5 сутки введения аллоксана. Как показывал наш опыт, регистрируется гипергликемия около 25 ммоль/л (+/- 5 ммоль/л) по сравнению с нормогликемией в группе контроля 7 ммоль/л (+/- 2 ммоль/л).

С целью дифференциальной диагностики с СД 2 типа необходима регистрация повышения кетоновых тел в крови выше 1,5 ммоль/л при помощи анализатора (FreeStyle Optimum Neo) (Induction of type-1 diabetes in rats: routes, pitfalls and insulin treatment. Isaac F. Federiuk).

После регистрации аллоксанового диабета препаратом выбора является инсулин-гларгин длительного действия, который вводился подкожно ежедневно утром, и, при необходимости, вечером, в течение 2 недель. Дозировка инсулина проводилась в расчете из 1 ЕД подкожно при уровне гликемии 11-19 ммоль/л, 2 ЕД подкожно при уровне гликемии 20-29 ммоль/л и 3 ЕД при уровне гликемии выше 30 ммоль/л. В случае повышения уровня гликемии выше 33 ммоль/л однократно вводился инсулин-аспарт короткого действия 1 ЕД подкожно с целью адекватного контроля уровня глюкозы в крови.

Спустя 4 недели после начала эксперимента крысы выводились из эксперимента с целью гистологической верификации очагов эндометриоза. У 5 крыс эндометриоидные очаги визуализировались только с одной стороны. У 10 крыс было сформировано 15 эндометриоидных имплантатов. Средняя площадь поверхности эндометриоидных имплантов составила 12±2,5 мм2. Полученный материал подвергался фиксации в течение 24 часов в 10% нейтральном забуференном формалине. Гистологическую проводку материала осуществляли с использованием автоматической станции Leica TP1020 (Leica, Германия), далее образцы заливали в парафиновые блоки и готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм., полученные микросрезы окрашивали гематоксилином и эозином. При световой микроскопии выявляли сформированные эндометриоидные кисты в инфильтратах, оценивали выстилку кист, определяли реактивные и патологические воспалительные изменения. Световую микроскопию проводили на микроскопе Olympus СХ31 (Olympus, Япония) при увеличении ×100, ×200, ×400.

Было исследовано 15 образцов эндометриоидных инфильтратов. Сформированные эндометриоидные кисты выявлены в 6 (40%) случаях, из которых множественные кисты определялись в 2 случаях, до 2 сформированных кист и единичная кисты были выявлены также в 4 случаях (фиг.).

На фиг.- Эндометриоидная киста с уплощенным эпителием у крысы с СД1 типа. Окраска гематоксилиз-эозин, ×200.

Пример осуществления способа.

При заборе мазков у крысы №7 весом 220 грамм был подтверждена фаза эструс. После анестезии животного и подготовки операционного поля, выполнена лапаротомия с помощью срединного вертикального разреза. Далее двусторонняя овариоэктомия и удаление левого маточного рога в месте бифуркации с целью формирования фрагментов ткани размерами 3×3 мм. После произведена аутотрансплантация подготовленных участков матки на расстоянии 8 мм от места разреза в области разветвления кровеносных сосудов. Следующие 3 суток после операции вводился цефтриаксон 9 ЕД, используя инсулиновый шприц на 100 ЕД-1 мл, кетопрофен 30 ЕД один раз в сутки; Также 11 мкг этинилэстрадиола внутримышечно 2 раза в неделю в течение 4 недель. Спустя 2 недели предоперационная подготовка включала в себя 24 часовое голодание, доступ к воде без ограничения. При оценке гетеротопий в процессе повторной лапаротомии визуализируется единичный очаг эндометриоза, далее вводится 33 мг аллоксана внутрибрюшинно. Антибактериальная и противовоспалительная терапия в прежнем объеме проводится в течение 3 дней. Через 12 часов после введения аллоксана уровень гликемии составляет 2.9 ммоль/л, в связи с чем подкожно вводится 1 мл 10% декстрозы. Через 1 час уровень глюкозы - 3.4 ммоль/л, спустя еще 8 часов - 5.6 ммоль/л. Спустя 36 часов после операции уровень глюкозы составляет 24.7 ммоль/л, при контроле уровня кетонов - 2.6 ммоль/л. Подтвержден инсулинозависимый аллоксановый диабет (СД 1 типа). Согласно формуле - введен инсулин-гларгин подкожно в дозировке 2 ЕД. Спустя 12 часов - уровень гликемии 7.2 ммоль/л. В течение следующих 10 дней продолжается инсулинотерапия и поддержание эстрогеннасыщего фона. Далее крыса выведена из эксперимента. Очаг эндометриоидной гетеропии размерами 4,5×5,0 мм подтвержден при гистологическом исследовании.

Заявленный способ формирования экспериментальной модели комбинации сахарного диабета 1 типа и наружного генитального эндометриоза позволяет изучить особенности течения заболеваний, их взаимного влияния, выявить ограничения и возможности как существующей, так и разрабатываемой терапии с целью улучшения результатов лечения.

Способ формирования экспериментальной модели комбинации сахарного диабета 1 типа и эндометриоза, включающий хирургическое моделирование эндометриоза на крысах путем двусторонней овариоэктомии с последующим удалением левого маточного рога в месте бифуркации и формированием фрагментов эндометриоидной ткани размерами 3×3 мм, в котором сформированные фрагменты ткани имплантируют на наружную поверхность передней брюшной стенки под кожей на расстоянии 7-10 мм от места разреза в месте разветвления кровеносных сосудов, причем в первые 3 дня после хирургического вмешательства вводят антибактериальный препарат цефтриаксон 100 мг/кг один раз в сутки и нестероидный противовоспалительный препарат кетопрофен 40 мг/кг один раз в сутки внутримышечно, также в течение следующих 4 недель после хирургического вмешательства - масляный раствор этинилэстрадиола 50 мкг/кг дважды в неделю внутримышечно, через 2 недели после хирургического вмешательства после 24-часового голодания животным, у которых при визуальном контроле сформировалась модель эндометриоза, внутрибрюшинно вводят 0,9% солевой раствор аллоксана в дозировке 150 мг/кг с последующим проведением антибактериальной, обезболивающей и противовоспалительной терапии в течение 3 дней, при этом в течение первых 48 часов после введения аллоксана осуществляют контроль гликемии 2 раза в сутки при помощи глюкометра и капиллярной крови из области кончика хвоста при постоянном доступе животных к воде и раствору 30% глюкозы, при этом повышение уровня гликемии выше 11 ммоль/л и уровня кетоновых тел в крови выше 1,5 ммоль/л на 2-5 сутки является подтверждением формирования сахарного диабета 1 типа, после чего ежедневно в течение 2 недель 1-2 раза в день подкожно вводят инсулин-гларгин длительного действия, причем при уровне гликемии 11-19 ммоль/л - 1 ЕД, 20-29 ммоль/л - 2 ЕД, 30-33 ммоль/л - 3 ЕД, выше 33 ммоль/л - однократно инсулин-аспарт короткого действия - 1 ЕД.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для проведения фотодинамической терапии (ФДТ) перевивной поверхностной солидной соединительнотканной опухоли саркома М-1 крыс. Для этого внутривенно вводят фотосенсибилизатор Гелиохлорин в дозе 2,5 мг/кг.

Изобретение относится к области экспертиментальной медицины. При отключении левого полушария головного мозга у подопытных животных внутрибрюшинно вводят амтизол в эквимолентной дозе 25 мг/кг за 30 мин до гипоксического эпизода.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для лечения синдрома поликистозных яичников (СПЯ) на экспериментальной модели крыс линии Wistar. Способ заключается в том, что на модели лекарственно-индуцированного синдрома поликистозных яичников с применением летрозола в дозировке 800 мкг/сут или 400 мкг/сут в течение 60 дней выполняют пероральное введение природного фитоалексина ресвератрола в дозировке 30 мг/кг/сут или 20 мг/кг/сут в течение 30 дней.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и урологии, и может быть использовано для моделирования туберкулеза почки в эксперименте. Способ включает введение культуры микобактерий туберкулеза в корковый слой почки.

Изобретение относится к медицине, области экспериментальной фармакологии. Способ коррекции остеопороза и остеопоротических переломов в эксперименте включает моделирование остеопороза с помощью билатеральной овариэктомии и остеопоротических переломов бедренной кости у самок крыс линии Wistar.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для проведения фотодинамической терапии перевивной солидной карциномы Эрлиха мышей. Для этого вводят внутривенно фотосенсибилизатор Гелиохлорин в дозе 5 мг/кг.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и токсикологии, и может быть использовано для определения персонифицированной эффективной дозы ингибиторов холинэстераз для организма на доклиническом уровне. Проводят предварительное разделение экспериментальных животных на функциональные группы по значению дибукаинового числа по бутирилхолинэстеразе: более 75%, от 35 до 75%, менее 35%.

Изобретение относится к области изготовления искусственных глаз для роботов и кукол. Способ изготовления искусственных глаз включает формирование глазного яблока с использованием силиконовой формы, предварительно из фотобумаги методом фотопечати изготавливают подложку для радужной оболочки глазного яблока, на подложке путем нанесения капель жидкого алифатического полиуретана формируют радужную оболочку, далее ее высушивают, подвергают вакуумной дегазации и выдержке на горизонтальной поверхности при комнатной температуре, затем радужную оболочку помещают вглубь силиконовой формы, а поверх радужной оболочки заливают порцию жидкой полимерной смеси на основе алифатического полиуретана, после дегазации доливают следующую порцию жидкой полимерной смеси, в силиконовую форму помещают вставку, формирующую имитацию белка глазного яблока и тонкие склеры глаза, затем всю конструкцию подвергают вакуумной дегазации, после чего заготовку снимают с формы и помещают в духовой шкаф, затем очищают от облоя и полируют.

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано для профилактики аутоиммунного ревматоидного артрита у крыс в эксперименте. Способ включает защиту соединительной ткани с использованием минеральной воды.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к хирургии желудка и двенадцатиперстной кишки. Выполняют мобилизацию желудка по большой и малой кривизне.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития диастолической дисфункции левого желудочка у больных с ожирением. Проводят определение значений метаболических факторов риска и профибротических факторов - глюкозы, холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП), триглицеридов (ТГ), рецептора к лептину, лептина, матричной металлопротеиназы 3 типа (ММР-3), свободных жирных кислот (СЖК), проколлагена I С-концевого пропептида (PICP), толщины эпикардиальной жировой ткани (тЭЖТ).
Наверх