Живая пробиотическая вакцина для профилактики инфекции, вызванной вирусом гриппа

Изобретение относится к области медицины, вирусологии, микробиологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве живых вакцин для профилактики и лечения инфекций, вызванных вирусами гриппа. Создана живая вакцина на основе пробиотического биологически активного штамма Еnterococcus faecium L3 за счет включения в структуру его пилей фрагмента гена нейраминидазы вируса гриппа. В качестве вакцинного антигена использован один из двух поверхностных антигенов вакцинного вируса гриппа A17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) - гликопротеин NA. Для оценки протективной эффективности полученной вакцины проводили пероральную вакцинацию мышей живой пробиотической вакциной и определяли специфические к нейраминидазе антитела в крови и вагинальных смывах мышей. Пероральное введение вакцины Еnterococcus faecium L3-NA стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интраназальной летальной гриппозной инфекции у мышей было показано, что трехкратная пероральная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной гриппозной инфекции. Конструирование живой вакцины на основе биологически активного пробиотического штамма Еnterococcus faecium L3 за счет включения в его пили антигена NA позволило объединить в одном препарате эффективность полезных свойств пробиотика и специфического антигенного стимула. Созданный вакцинный препарат проявил выраженный иммуногенный и протективный эффекты в отношении вируса гриппа, активируя все компоненты иммунной системы и вызывая сбалансированный прочный иммунный ответ. 6 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, вирусологии, микробиологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве живых вакцин для профилактики и лечения инфекций, вызванных вирусами гриппа.

На рубеже второго и третьего тысячелетий произошли кардинальные изменения эпидемического процесса при гриппе. Более 30 лет в мире наблюдается одновременная циркуляция двух штаммов вирусов подтипа А. Усилилась активность вирусов гриппа типа В. Кроме эпидемических штаммов вируса гриппа A подтипов A(H1N1) и A(H3N2), которые циркулируют в человеческой популяции, большую угрозу людям создают вирусы гриппа птиц, способные преодолевать межвидовой барьер - это высокопатогенные штаммы A(H5N1) и A(H7N9) [Bui C. et al. Transbound Emerg Dis.12327(10):102-111, (2015)].С каждым годом появляется все больше новых лекарственных препаратов, обладающих противовирусными и другими свойствами, способными предупреждать заболевания гриппом. Но, несмотря на значительные успехи медицинской науки, грипп по-прежнему остается мало контролируемой инфекцией, способной вызывать ежегодные эпидемии, а при появлении нового варианта возбудителя - и пандемии [Ерофеева М.К., Никоноров И.Ю., Terra medica nova. 2 (2009)].

Заболевания, вызванные вирусами гриппа A, по распространению, показателям заболеваемости и смертности, относятся к социально значимым для населения Российской Федерации. Ежегодно от гриппа умирает от 291 000 до 646 000 человек во всем мире.

Основные антигены вируса гриппа - это поверхностные гликопротеины - гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA). Антитела против HA являются вируснейтрализующими, антитела, специфичные к NA облегчают протекание инфекции, но они также являются защитными, как показали еще в 70-е годы А. Н. Слепушкин и соавт. [Slepushkin A. N. et al. Journal of Hygiene. 69(4): 571-578, (1971)].

Ранее было показано наличие у части людей перекрестно реагирующих антител к минорному антигенному компоненту вируса гриппа - NA подтипа N1 в результате контактов с ранее циркулирующими вариантами [Hancock K. et al. New England Journal of Medicine. 361(20): 1945-1952, (2009)]. В условиях появления в циркуляции антигенных вариантов вирусов гриппа с новым подтипом НА антитела к NA могут сыграть решающую роль в защите от тяжелых форм инфекции в период, пока не будет развернута вакцинация новым антигенным вариантом.

В настоящее время активная иммунопрофилактика инфекции вирусами гриппа осуществляется путем вакцинации населения. Из-за высокой изменчивости гемагглютинина вирусов гриппа штаммовый состав гриппозных вакцин необходимо обновлять почти ежегодно. Активно ведутся исследования в направлении создания универсальной противогриппозной вакцины. Р. де Врис с соавт. [de Vries R.D. et al. Expert Review of Vaccines. 1299-1301, (2015)] в своей статье суммируют имеющиеся данные по некоторым направлениям создания универсальной противогриппозной вакцины, включая возможность создания вакцины, которая индуцирует перекрестно-реагирующие антитела против NA вируса гриппа. Т. Готтлиб с соавт. [Gottlieb T., Ben-Yedidia T. Journal of autoimmunity. 54: 15-20, (2014)] в своем обзоре освещает возможности создания универсальной противогриппозной вакцины, которая вызывала бы иммунный ответ против консервативных эпитопов вируса гриппа, включая NA. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рассматривает NA как один из целевых антигенов для создания гриппозной вакцины с наиболее широким спектром перекрестной реактивности.

Для специфической профилактики гриппа применяются инактивированные (убитые) или живые аттенуированные (ослабленные) гриппозные вакцины [Sridhar, S., K.A. Brokstad and R.J. Cox, Vaccines (Basel), 3(2): 373-89, (2015)]. Инактивированные вакцины - цельновирионные вакцины из инактивированных цельных вирусов; расщепленные вакцины, или сплит-вакцины; субъединичные вакцины - вакцины, содержащие вирусные субъединицы или виросомальные [Rajao D.S. and D.R. Perez, Front Microbiol, 9: 123 (2018)]. Живые гриппозные вакцины, содержащие аттенуированные вирусы, полученные методом генетической реассортации, разработаны в России и США [Belshe, R.B., et al.. N Engl J Med, 356(7): 685-96, (2007), Rudenko L. In proceedings of the international conference on options for the control of influenza VI, Toronto, Ontario, Canada. Jun 17-23, 122-124 (2007)].

Современные трехвалентные гриппозные вакцины включают штаммы вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. В последние несколько лет появились четырехвалентные гриппозные вакцины, включающие два вируса гриппа В - В/Виктория и В/Ямагата [Desheva YA, Smolonogina TA, Doroshenko EM, Rudenko LG. Vopr Virusol, 61(1): 16-20, (2016)].

Живые вакцины обеспечивают не только общий гуморальный, но и местный иммунитет за счет синтеза секреторных IgА. Эти вакцины вводятся естественным путем - через нос или через рот, что в значительной мере облегчает их применение.

Традиционные инактивированные гриппозные вакцины содержат поверхностные вирусные гликопротеины, однако в отличие от НА, количество NA в составе вакцин не стандартизировано. Большим преимуществом NA является ее медленная эволюция и способность вызывать длительный иммунитет и перекрестную защиту. Используя технологию вирусоподобных частиц, Smith et al. изучили экспериментальную вакцину на основе NA на хорьковой модели гриппозной инфекции H5N1; вакцина оказалась способной обеспечить эффективную защиту [Smith GE., et al, Virology, 509: 90-97 (2017)].

Другой подход к созданию вакцин на основе NA - встраивание консервативных последовательностей NA в пробиотические векторы. То есть, альтернативой использованию химических адъювантов для вакцинации является применение так называемых живых вакцин на основе пробиотиков. Живые вакцины применяют, как правило, однократно, вводят подкожно, накожно или внутримышечно, а некоторые вакцины перорально и ингаляционно. Главным преимуществом живых вакцин является то, что они активируют все компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный прочный иммунный ответ.

Пробиотики - препараты, оказывающие общее благотворное влияние на организм человека (чаще всего молочнокислые бактерии). Установлено, что некоторые пробиотики являются эффективными неспецифическими стимуляторами выработки специфических иммуноглобулинов против различных инфекций [Vintini EO., Medina MS., BMC Immunol., 12: 46 (2011), Bermudez-Hurnarun LG., Kharrat P., Chatel JM., Microb. Cell. Fact., 10: 17-24 (2011)]. Пробиотики стали использоваться в качестве векторов, в часть из которых успешно внесены плазмидные конструкции, обеспечивающие зкспрессию антигенов патогенных бактерий [Me Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. еt al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011)].

Персистенция подобных вариантов пробиотиков в организме способна не только стимулировать выработку протективных иммуноглобулинов, специфичных в отношении целевых антигенов возбудителя, но и обеспечить благоприятный фон для борьбы с инфекцией за счет усиления защитных реакций врожденного иммунитета.

Пробиотические микроорганизмы рассматриваются в настоящее время как хорошая основа для получения рекомбинантных живых вакцин, экспрессирующих вакцинные антигены возбудителей актуальных инфекций [Vintini E.O., Medina M.S., BMC Immunol., 12: 46 (2011); Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact., 10: 17-24 (2011); Mе Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. еt al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011), Lei H. et al. Virology. Т. 476: 189-195 (2015)].

В 2015 г. Хан Л. со своими коллегами создали химерную конструкцию на основе бактерии Lactococcus lactis, содержащую на своей поверхности нейраминидазу вируса гриппа А, и доказали, что она способна защищать мышей от инфекции вирусами гриппа [Lei H. et al. Virology. Т. 476: 189-195, (2015)]. Такая химерная конструкция может быть кандидатом для создания универсальной противогриппозной вакцины.

Существующие вакцины против гриппа А преимущественно сосредоточены на гемагглютинине и формируют штаммо-специфическую защиту. Нейраминидаза намного меньше изучена в контексте гуморального иммунитета против вирусов гриппа. Целью исследования в работе Хан Л. является оценка перекрестного защитного иммунитета NA, представленного на поверхности Lactococcus lactis (L. lactis), против гомологичных и гетерологичных вирусов гриппа А в мышиной модели. Важно отметить, что L. lactis / pNZ8110-pgsA-NA обеспечил защиту на 80% против H5N1, на 60% - защиту против H3N2 и H1N1, соответственно. Эти выводы свидетельствуют о том, что рекомбинантный L. lactis / pNZ110-pgs ANA при отсутствии адъюванта через пероральное введение может быть подан в качестве эффективной вакцины против различных штаммов вирусов гриппа.

Известен способ создания живой вакцины на основе штамма пробиотика Еnterococcus faecium L3 для профилактики вагинальной инфекции, вызванной Streptococcus agalactiae (СГВ). На основе штамма пробиотика Еnterococcus faecium L3 сконструирована первая генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена белка патогенного СГВ [Гупалова Т.В., c соавт., 2013).

Также описано создание живой вакцины против СГВ, в которой использовался подход, основанный на введении bac гена патогенных СГВ в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 при экспрессии в пилях. Пили из энтерококков являются идеальными кандидатами для вакцин из-за их экспозиции на клеточной поверхности. Они выступают за пределы бактериальных клеток и способны проникать сквозь капсулу, которая экранирует большинство белков-антигенов. Пили состоят из мономеров, способных к агрегации, за счет чего увеличивается доза антигена, и повышаются титры антител, специфичных к встраиваемому в структуру поверхностного белка энтерококка полипептидного фрагмента штамма патогенного СГВ. Поэтому способ введения гена патогенных стрептококков в пили пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 выгодно отличается тем, что рекомбинантный белок экспрессируется не в цитоплазме, а на поверхности бактерии [Суворов А.Н., с соавт., патент RU № 2640250].

Обычный подход к работе с живыми вакцинами на основе пробиотиков состоит в том, что пробиотики используют в качестве природных адъювантов иммунного ответа, а антиген вводится отдельно.

Принципиальное отличие заявляемого решения заключается в интеграции участка ДНК, кодирующего антигенный фрагмент белка патогенного микроорганизма, в структуру хромосомной ДНК энтерококка. Соответственно, задача генетической части работы состоит в осуществлении интеграции гетерологичного участка ДНК в структуру гена поверхностного белка пробиотика без нарушения открытой рамки считывания и повреждения участков кодирования компонентов, участвующих в процессинге поверхностного белка PilF.

В качестве бактерии-реципиента использовали хорошо изученный пробиотический штамм Enterococcus faecium L3, обладающий целым рядом уникальных биологических свойств. Штамм Еnterococcus faecium L3 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, способностью восстанавливать микробиоценоз кишечника на фоне дисбиотических состояний [Yermolenko E., Suvorov A., Chernush A., et al. International Congress Series, 1289: 363-366 (2006)], а также оказывать иммуномодулирующее действие на организм хозяина [Tarasova E., et al, 2010].

Осуществлено физическое картирование штамма Еnterococcus faecium L3 [Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al. Prebiotic sand probiotic s potencial for human health, 104-112, (2011)]. В экспериментах на здоровых самках мышей показано, что интравагинальное введение высоких доз штамма Еnterococcus faecium L3 не только не оказывает токсического действия на организм, но и не влияет на состояние слизистой оболочки влагалища [Суворов А., Алехина Г.Г., Пигаревский П.В. и др. Гастробюллетень, 4: 29-31, (2001)], а также способствует экспрессии IL-10 клетками слизистой оболочки влагалища крыс с экспериментальным вагинитом, вызванном S.agalactiae и Staphylococcu aureus [Tarasova E., Yermolenko E., Donets V. et al. Beneficial Microbs, 1: 265-270, (2010)].

В штамме Еnterococcus faecium L3, как и у других грамположительных бактерий, были найдены пили, которые представляют собой фимбрии длиной 0,3-3 μm и диаметром 2-10 nm [Telford JL, Barocchi MA, Margarit I et al. Nature Reviews Microbiology 4: 509-519, (2006)]. Это длинные белок-подобные полимеры, тянущиеся на поверхности бактерий, которые представляют собой субъединицы белка пилина, соединенные ковалентной связью. Они играют большую роль в адгезии колонизации хозяина. Пили являются высокоиммуногенными структурами, которые находятся под селективным давлением иммунных реакций хозяина [Camille Danne, Shaynoor Dramsi. Researchin Microbiology, 163: 645-658, (2012)]. Принцип модификации пилей энтерококков вакцинными антигенами является эффективным решением при создании живых вакцин благодаря экспозиции целевого антигена на поверхности энтерококка.

Этот принцип введения генов патогенных стрептококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях был использован при создании живой вакцины для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumonie [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., с соавт. Патент RU № 2701733 (14.12.2018)]. Авторами данного изобретения сконструирована генно-инженерная живая вакцина на основе штамма пробиотика Еnterococcus faecium L3, содержащего пили на своей поверхности, со встроенным в хромосому участком гена pspf патогенного Streptococcus pneumoniae.

Интраназальное введение вакцины Еnterococcus faecium L3-PSPF+ стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интравазальной летальной пневмококковой инфекции инфекции у мышей СВА было показано, что трехкратная интравазальная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной пневмококковой инфекции.

Эта живая вакцина принята в качестве прототипа заявляемого изобретения.

Задачей настоящего изобретения явилось создание живой вакцины на основе пробиотического биологически активного штамма Еnterococcus faecium L3 путем включения в структуру его пилей фрагмента гена нейраминидазы вируса гриппа.

Авторами сконструирована генно-инженерная живая вакцина на основе штамма пробиотика Еnterococcus faecium L3, содержащего пили на своей поверхности. В качестве антигена использовали один из двух поверхностных антигенов вакцинного вируса гриппа A17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) - гликопротеин NA за счет встраивания в хромосому участка гена нейраминидазы.

Задачу введения гена нейраминидазы (na) вируса гриппа в хромосомную ДНК пробиотического штамма Еnterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях решали следующим образом:

а) получали слитый ген entF-na и клонировали его;

б) выявляли бактериальные клоны, экспрессирущие ген слитого белка NA в пилях.

Для оценки протективной эффективности полученной вакцины проводили пероральную вакцинацию мышей живой пробиотической вакциной и определяли специфические к нейраминидазе антитела в крови и вагинальных смывах мышей. Пероральное введение вакцины Еnterococcus faecium L3-NA стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интраназальной летальной гриппозной инфекции у мышей было показано, что трехкратная пероральная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной гриппозной инфекции.

Конструирование живой вакцины на основе биологически активного пробиотического штамма Еnterococcus faecium L3 за счет включения в его пили антигена NA позволило объединить в одном препарате эффективность полезных свойств пробиотика и специфического антигенного стимула.

Для получения слитого гена entF-na были сконструированы уникальные праймеры, представленные в таблице.

Таблица. Олигонуклеотидные праймеры

Название	Ориентация	Нуклеотидная последовательность от 5' к 3'
EV	прямой	GCATATGGCGATCCTGGCAAGTGTTAT
FV	обратный	GGAATTCCTAGAGCTGTCGTCGTTCC
A1	прямой	GCTCTAGAGCCGATGAGAGCAGCTGGTATTG
D1	обратный	CAACAGGATCCAAAGCATCGTTGG
B1	прямой	TGAGTGAACCACAGCCAGAA
Seq F	прямой	GGACACCACAACCATCGAAG
Seq R	обратный	AGCTGGACCATGCTACACA

Подчеркнутые звенья нуклеотидной последовательности указывают на сайты рестрикции.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pentF-pspf, представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf, описанная нами ранее [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., с соавт. Патент RU № 2701733 (14.12.2018)], была использована для настоящей конструкции. Для этого из плазмидной ДНК pentF-pspf удаляли вставку гена пневмококка pspf и заменяли ее на вставку гена na. Для этого плазмидную ДНК pentF-pspf гидролизовали ферментами NdEI и EcoRI, сайты для которых ограничивают последовательность гена pspf (фиг. 1). Такие же сайты рестрикции были заложены в праймеры EV и FV для амплификации фрагмента гена na. Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования.

РНК вируса гриппа A17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) была выделена из вируссодержащей аллантоисной жидкости с помощью Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Германия). ДНК на матрице вирусной РНК была получена с помощью одношаговой обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами EV и FV с помощью набора OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, Германия). После электрофореза в 1.5% агарозном геле полученный ПЦР-продукт был вырезан из агарозного геля и гидролизован ферментами NdEI и EcoRI. Клонирование рестрицированного фрагмента после амплификации фрагмента ДНК, кодирующего фрагмент NA, осуществляли, используя верхний фрагмент после гидролиза плазмиды pentF-pspf. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК рестрикты выделяли из агарозы с помощью набора «QIA quick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему E.coli DH5α. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина. Из полученных 17 клонов после трансформации были выделены ДНК, которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами EV и FV и со специально сконструированными праймерами SeqF и SeqR. Положительный ответ дали 8 трансформантов. Из двух из них были выделены плазмиды, которые содержали ожидаемую вставку. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdEI и EcoRI (фиг. 2).

Таким образом, в результате клонирования были получена плазмида pentF-na с ожидаемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину.

В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой было получено 13 трансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами EV и FV. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали 12 трансформантов (фиг. 3).

Из них выбрали один и обозначили его как NA+ клон. Была проведена амплификация ДНК, выделенной из этого клона с праймерами В1 и FV и B1 и SeqR для проведения секвенирования. Секвенирование ДНК, выделенной из NA+ клона, было проведено с праймерами, соответствующими последовательности гена na (праймер SeqR) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер В1) для подтверждения интеграции плазмидной ДНК pentF-na в хромосомную ДНК энтерококка (фиг. 4).

Этот клон энтерококков, экспрессирующий ген NA белка, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования. Вакцинацию выбранным клоном энтерококков, экспрессирующим ген NA белка, проводили перорально путем кормления мышей. Корм был получен на основе пшена, обработанного культурой E. faecium L3, содержащей рекомбинантный белок в структуре пилей. Один грамм сухого корма содержал (4-8)х10⁶ КОЕ модифицированного E. faecium L3. Для контрольной группы мышей готовили корм на основе той же партии пшена, обработав его исходным вариантом E. faecium L3.

Вакцинацию проводили тремя курсами по пять дней с интервалом в две недели между курсами. Каждый вечер у мышей убирали традиционный комбикорм и в кормушки насыпали пшено, содержащее вакцинный препарат E. faecium. Утром пшено заменяли комбикормом. В среднем за ночь мыши съедали по 2 г модифицированного энтерококком пшена. Режим кормления в контрольной и опытной группах был одинаковым.

Для оценки гуморального и местного специфического иммунного ответа через 4 дня после окончания второго и третьего курса вакцинации у контрольных и вакцинированных мышей забирали кровь. В сыворотке крови определяли уровень специфических IgG.

Было показано, что пероральная иммунизация мышей пробиотическим вектором, содержащим нейраминидазу подтипа N2, не только вызывала иммунный ответ к рекомбинантной нейраминидазе N1, но и защищала 67% иммунизированных животных от летальной инфекции вирусом пандемического гриппа A/Южная Африка/3626/13(H1N1) pdm.

Пример 1. Получение слитого гена entF-na и его клонирование.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pentF-pspf, представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf, описанная нами ранее [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., с соавт. Патент RU № 2701733 (14.12.2018)], была использована для создания слитого гена entF-na. Для этого из плазмидной ДНК pentF-pspf вырезали вставку гена пневмококка pspf, проведя гидролиз плазмидной ДНК pentF-pspf ферментами NdEI и EcoRI. Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования.

На фиг. 1 представлена электрофореграмма рестрицированной плазмидной ДНК pentF-psp f ферментами NdEI и EcoRI, где цифрами обозначены:

1 - плазмида pentF-pspf - исходная;

2 - плазмида pentF-pspf рестрицированная;

3 - 100 п.н. ДНК-маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).

К-ДНК, полученная на матрице РНК вируса гриппа A17/утка/Потсдам/86/92(H5N2), была амплифицирована с праймерами EV и FV. Программа ПЦР состояла из: а) денатурации при 94°С в течение 30 сек, б) отжига праймеров при 55°С в течение 1 мин и в) синтеза при 72°С в течение 2 мин. Этот цикл повторяли 30 раз, после чего смесь инкубировали при 72°С на 10 мин. Полученный ПЦР продукт был вырезан из геля и также гидролизован ферментами NdEI и EcoRI. Клонирование рестрицированного фрагмента после амплификации ДНК, кодирующего фрагмент NA, осуществляли, используя верхний фрагмент после гидролиза плазмиды pentF-pspf. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК-рестрикты выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему E. coli DH5α. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина. Из полученных 17 клонов после трансформации были выделены ДНК, которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами EV и FV, а также со специально сконструированными праймерами SeqF и SeqR. Положительный ответ дали 8 трансформантов. Из двух из них были выделены плазмиды, которые содержали ожидаемую вставку. На фиг. 2 показана электрофореграмма рестрицированных плазмид NdEI и EcoRI), где цифрами обозначены: 1 - плазмида 1; 2 - плазмида 2; 3 - 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).

Для дальнейшей работы выбрали плазмиду, выделенную из клона 1, характеризующуюся нуклеотидной последовательностью SEQ ID No:1 и обозначенную как pentF-na, которая кодирует слитый белок NA, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID No:2.

Пример 2. Электропорация энтерококков.

Для электропорации энтерококков культуру Еnterococcus faecium L3 сеяли в 3 мл бульона Tood-Hewitt (THB) («Hi Media», Индия) и выращивали в течение ночи при 37°С, затем пересевали в 50 мл бульона THB 1 мл ночной культуры и выращивали ее до оптической плотности 0.3 при длине волны 650 нм. После этого культуру помещали в лед и затем отмывали трижды в 20 мл 10% глицерина при температуре 4°С. Полученный осадок суспендировали в 0.5 мл стерильного раствора глицерола, переосаждали, конечный осадок ресуспендировали в 0.3 мл того же раствора, разлили в пробирки по 50 мкл и проводили электропорацию в кювете с расстоянием между электродами 1 мм при напряжении 2100 В. Во льду к клеткам добавили полученную интегративную плазмиду pentF-na, 300 нг. Оптимальная продолжительность импульса составила 4-5 миллисекунд. После проведения разряда тока в кювету добавляли 1 мл THB, инкубировали 1 час и высевали на чашки с селективной средой, которая содержала 10 мкг/мл эритромицина. Затем ожидали появления трансформантов через 24 часа.

В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой было получено 13 трансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами EV и FV. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали 12 трансформантов. На фиг. 3 приведена электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов, где цифрами обозначены:

1 - 8 - продукты ПЦР ДНК из полученных клонов (1-8);

9 - 100 п.н. ДНК-маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар);

10 - продукт ПЦР плазмидной ДНК pentF-na;

11-15 - продукты ПЦР ДНК из полученных клонов (9-13);

16- 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар);

17 - продукт ПЦР плазмидной ДНК pentF-na;

18-19 - продукт ПЦР без добавления ДНК.

Из них выбрали один и обозначили его как NA+ клон. Была проведена амплификация ДНК, выделенной из этого клона, с праймерами EV и FV и SeqF и SeqR. Для подтверждения интеграции плазмидной ДНК pentF-na в хромосомную ДНК энтерококка было проведено секвенирование ДНК, выделенной из NA+ клона, с праймерами, соответствующими последовательности гена na (праймер SeqR) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер В1).

На фиг. 4 показан фрагмент нуклеотидной последовательности, SEQ ID No:1, отражающий интеграцию плазмидной ДНК pentF-na в хромосомную ДНК энтерококка. Жирным шрифтом выделены последовательности праймеров В1 и SeqR.

Клон энтерококков NA+, экспрессирующий ген слитого NA белка, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.

Пример 3. Живая пробиотическая вакцина с включением NA при пероральном введении защищала мышей от летальной инфекции вирусом гриппа.

Мыши линии СВА были иммунизированы перорально (по 10 животных в группе). Сыворотки крови были собраны через 4 дня после окончания второго и третьего цикла кормления для определения IgG антител к NA подтипа N1. Результаты изучения иммуногенности представлены на фиг. 5, IgG к рекомбинантной NA подтипа N1, в сыворотках иммунизированных животных после пероральной иммунизации (ИФА)).

Через 10дней после окончания третьего цикла вакцинации мыши были интраназально инфицированы вирусом пандемического гриппа A/Южная Африка/3626/13(H1N1)pdm09, десять 50 процентных мышиных летальных доз (МЛД₅₀). Результаты изучения защитной эффективности представлены на фиг. 6, где показана летальность (а) и динамика изменения веса (б) после инфицирования мышей вирусом A/Южная Африка/3626/13(H1N1)pdm09).

Показано, что пероральная иммунизация мышей пробиотическим вектором, содержащим нейраминидазу подтипа N2, не только вызывала иммунный ответ к рекомбинантной нейраминидазе N1, но и защищала 67% иммунизированных животных от летальной инфекции вирусом пандемического гриппа A/Южная Африка/3626/13 (H1N1) pdm.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ФГБНУ "ИЭМ"

<120> Живая пробиотическая вакцина для профилактики инфекции, вызванной

вирусом гриппа

<140>

<141>

<150>

<151>

<160> 1

<170>

<210> 1

<211> 1692

<212> Нуклеотидная последовательность

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность гена нейраминидазы вируса гриппа,

экспрессированная в системе Escherichia coli

<400> 1

atgagagcag ctggtattga gttgaatgat acatttctat ctatttacag tttaaatgga 60

cagtatcagc aacgtgtgtc ttggtataat gacaataatg aatctgtcgg tgaacgtaat 120

attgatatga gagaatttgt tgggtatgaa aaaatgggta gcttacctta ttttgtcaca 180

acagatacag catgtgcaga atacaaagct cctgcgttat caacaaacaa tttaacttca 240

aaagtagtgg gaggacgtgc agaaaaggct tatagctcga atgatcattt caccgatgtt 300

gtaggagctg atacttatca cagaagtggt gtaacgtata cgcttcaagg cgcttcccca 360

acattcatga ttggcgcaaa tacgaatagt atgatgttta gctttgatac tgcattgcta 420

tggacaccac aaccatcgaa gcctacaaaa gaagtgttta acaaagctaa tactgaagag 480

gcagcacaca atattgacaa aaaagtgatt ccacaaggat cagatgttta ctatcatatt 540

catcaaaagt ttgatgcatt aacagtcaac acaatgaaca aatacaaatc atttaaaatc 600

actgatacct ttgacagcaa aaattttgat atggtatcgg atgggaaaaa ctatgatggc 660

gcattggcat atggcgatcc tggcaagtgt tatcaatttg cactcgggca ggggaccaca 720

ctagacaaca aacattcaaa tggcacaata catgatagaa tccctcatcg aaccctatta 780

atgaatgagt tgggtgttcc atttcattta ggaaccaaac aagtgtgtgt agcatggtcc 840

agctcaagtt gtcacgatgg aaaagcatgg ttgcatgttt gtgtcactgg ggatgataga 900

aatgcaactg ctagcttcat ttatgacggg aggcttgtgg acagtattgg ttcatggtct 960

caaaatatcc tcaggaccca ggagtcggaa tgcgtttgta tcaatgggac ttgcacagta 1020

gtaatgactg atggaagtgc atcaggaaga gccgatacta gaatactatt cattaaagag 1080

gggaaaattg tccatattag cccattgtca ggaagtgctc agcatataga ggagtgttcc 1140

tgttaccctc gatatcctga cgtcagatgt atctgcagag acaactggaa aggctctaat 1200

aggcccgtta tagacataaa tatggaagat tatagcattg attccagtta tgtgtgctca 1260

gggcttgttg gcgacacacc caggaacgac gacagctcta ggaattccgg ttctgcgcga 1320

gtgatagata tgagtacagg aaaagatatt acttcagaag gtacactaac ctatgatagc 1380

aatttaagaa cgctgaaatg ggaagcttcc gctgatttct taagtaaaaa tcttttagat 1440

ggacgagaaa ttcaactgat atttacagct aaaactccac tacagtcaga aaaaaatatt 1500

gataaccaag ccgtagcagc agtagagaat gtttctaata aaacgaatgt tgtaacaatt 1560

ggtgttgatc ctaacttacc acaagtcatt gttcctagaa caggttctac acatttagta 1620

acaattttag tggttagctt agtattactt gtgttagcta ctcttagtta tgtggctctg 1680

aagttcaatt aa 1692

<210> 2

<211> 563

<212> Аминокислотная последовательность

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность гена слитого белка NA, способного

вызывать синтез анти-NA IgG антител, обладающих протективными свойствами в

отношении вируса гриппа

<400> 2

Met Arg Ala Ala Gly Ile Glu Leu Asn Asp Thr Phe Leu Ser Ile Tyr

1 5 10 15

Ser Leu Asn Gly Gln Tyr Gln Gln Arg Val Ser Trp Tyr Asn Asp Asn

20 25 30

Asn Glu Ser Val Gly Glu Arg Asn Ile Asp Met Arg Glu Phe Val Gly

35 40 45

Tyr Glu Lys Met Gly Ser Leu Pro Tyr Phe Val Thr Thr Asp Thr Ala

50 55 60

Cys Ala Glu Tyr Lys Ala Pro Ala Leu Ser Thr Asn Asn Leu Thr Ser

65 70 75 80

Lys Val Val Gly Gly Arg Ala Glu Lys Ala Tyr Ser Ser Asn Asp His

85 90 95

Phe Thr Asp Val Val Gly Ala Asp Thr Tyr His Arg Ser Gly Val Thr

100 105 110

Tyr Thr Leu Gln Gly Ala Ser Pro Thr Phe Met Ile Gly Ala Asn Thr

115 120 125

Asn Ser Met Met Phe Ser Phe Asp Thr Ala Leu Leu Trp Thr Pro Gln

130 135 140

Pro Ser Lys Pro Thr Lys Glu Val Phe Asn Lys Ala Asn Thr Glu Glu

145 150 155 160

Ala Ala His Asn Ile Asp Lys Lys Val Ile Pro Gln Gly Ser Asp Val

165 170 175

Tyr Tyr His Ile His Gln Lys Phe Asp Ala Leu Thr Val Asn Thr Met

180 185 190

Asn Lys Tyr Lys Ser Phe Lys Ile Thr Asp Thr Phe Asp Ser Lys Asn

195 200 205

Phe Asp Met Val Ser Asp Gly Lys Asn Tyr Asp Gly Ala Leu Ala Tyr

210 215 220

Gly Asp Pro Gly Lys Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr

225 230 235 240

Leu Asp Asn Lys His Ser Asn Gly Thr Ile His Asp Arg Ile Pro His

245 250 255

Arg Thr Leu Leu Met Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr

260 265 270

Lys Gln Val Cys Val Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys

275 280 285

Ala Trp Leu His Val Cys Val Thr Gly Asp Asp Arg Asn Ala Thr Ala

290 295 300

Ser Phe Ile Tyr Asp Gly Arg Leu Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser

305 310 315 320

Gln Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly

325 330 335

Thr Cys Thr Val Val Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Arg Ala Asp

340 345 350

Thr Arg Ile Leu Phe Ile Lys Glu Gly Lys Ile Val His Ile Ser Pro

355 360 365

Leu Ser Gly Ser Ala Gln His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg

370 375 380

Tyr Pro Asp Val Arg Cys Ile Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn

385 390 395 400

Arg Pro Val Ile Asp Ile Asn Met Glu Asp Tyr Ser Ile Asp Ser Ser

405 410 415

Tyr Val Cys Ser Gly Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Ser

420 425 430

Ser Arg Asn Ser Gly Ser Ala Arg Val Ile Asp Met Ser Thr Gly Lys

435 440 445

Asp Ile Thr Ser Glu Gly Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Asn Leu Arg Thr

450 455 460

Leu Lys Trp Glu Ala Ser Ala Asp Phe Leu Ser Lys Asn Leu Leu Asp

465 470 475 480

Gly Arg Glu Ile Gln Leu Ile Phe Thr Ala Lys Thr Pro Leu Gln Ser

485 490 495

Glu Lys Asn Ile Asp Asn Gln Ala Val Ala Ala Val Glu Asn Val Ser

500 505 510

Asn Lys Thr Asn Val Val Thr Ile Gly Val Asp Pro Asn Leu Pro Gln

515 520 525

Val Ile Val Pro Arg Thr Gly Ser Thr His Leu Val Thr Ile Leu Val

530 535 540

Val Ser Leu Val Leu Leu Val Leu Ala Thr Leu Ser Tyr Val Ala Leu

545 550 555 560

Lys Phe Asn

563

<---

Способ создания живого вакцинного препарата на основе биологически активного штамма E. faecium L3, заключающийся в том, что проводят электропорацию культуры энтерококков Enterococcus faecium L3 c рекомбинантной плазмидой ДНК entF-na, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, и выбирают клон энтерококков NA+, экспрессирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.