Местные эритропоэтиновые составы, способы улучшения заживления раны и косметическое применение составов

Группа изобретений относится к фармацевтической композиции для местного нанесения и способам использования такой композиции. Предлагается фармацевтическая композиция для лечения раны, содержащая гель, содержащий смесь эритропоэтина при концентрации 5% (масса/масса); фибронектина при концентрации 30% (масса/масса); глицерин при концентрации 5% (масса/масса); Carbomer 940 при концентрации 1% (масса/масса); бензилового спирта при концентрации 2% (масса/масса); триэтаноламина при концентрации 0,9% (масса/масса); метилпарабена при концентрации 0,2% (масса/масса); и пропилпарабена при концентрации 0,05% (масса/масса). Предлагается также способ лечения раны у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества указанной выше композиции, а также способ косметического лечения поврежденной поверхности кожи и способ заживления поврежденной поверхности кожи, включающие нанесение достаточного количества указанной выше композиции на поврежденную поверхность кожи. Использование композиции обеспечивает ускоренное заживление раны по сравнению с процессом заживления без нанесения такого состава, в том числе, у субъектов с диабетом. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр., 13 ил.

 

Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США с серийным №62/214618, поданной 4 сентября 2015 года, содержание которой, тем самым, включено посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к местным составам, содержащим эритропоэтин (ЕРО), а также предпочтительно фибронектин (FN), особенно, к гелевым составам. Настоящее изобретение также относится к применению таких местных составов для ускорения заживления раны, например, от ожога, по сравнению с процессом заживления без нанесения такого состава. Способы получения составов также составляют часть настоящего изобретения.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Согласно Центрам контроля и профилактики заболеваний (CDC) Соединенных Штатов Америки более 380 миллионов людей во всем мире страдают сахарным диабетом (DM). Также по оценкам CDC у 5% таких индивидуумов разовьется диабетическая кожная язва (DSU), а для 1% потребуется ампутация нижних конечностей. Несмотря на многочисленные успехи в лечении и контролировании ран (Sen, 2009) заживление раны при DM замедляется, потому что нарушаются все фазы согласованного каскада клеточных и биохимических событий заживления раны (Brown, 1992; Shukla, 1998; Mustoe, 2004). Кроме того, заживление DSU замедляется из-за нарушенного ангиогенеза, недостаточного кровотока, усиленного воспаления, сниженной пролиферации фибробластов (Hehenberger, 1999) и сниженной реэпителиализации кератиноцитами (Mansbridge, 1999; Stadelmann, 1998; Sheetz, 2002).

Гликопротеин гормон эритропоэтин (ЕРО) регулирует массу красных кровяных клеток и является одобренным лекарственным средством для лечения анемии. ЕРО также имеет негемопоэтические мишени в коже, и показали, что эти мишени участвуют в заживлении кожных ран (Hamed, 2014). Ранее сообщали, что заживление кожных ран у крыс и мышей с экспериментально индуцированным DM ускоряется после местного нанесения рекомбинантного человеческого ЕРО на кожные раны за счет (а) стимуляции ангиогенеза, реэпителиализации и отложения коллагена, а также (b) подавления воспалительного ответа и апоптоза (Hamed, 2010). Полезные действия ЕРО на заживление раны при DM дополняется фибронектином (FN). FN облегчает образование временной раневой матрицы и предупреждает ее диссоциацию (Hamed, 2011).

Аквапорины (AQP) представляют собой интегральные мембранные белки, функция который заключается в регулировании гемостаза внутриклеточной жидкости путем обеспечения транспорта воды и глицерина. AQP экспрессируются в плазматических мембранах кератиноцитов в базальном слое кожи и собирающих протоках мозгового слоя почки (Agre, 1998). Подавленная экспрессия AQP может быть причиной снижения способности к концентрации мочи при острой почечной недостаточности, и ЕРО может предупреждать такое подавление (Gong, 2004). AQP3 представляет собой AQP, который экспрессируется в коже (Hara-Chikuma, 2005), где он облегчает клеточную миграцию и пролиферацию, а также реэпителиализацию в процессе заживления раны (Hara-Chikuma 2006, Levin, 2006, Hara-Chikuma, 2008). Положительная роль увлажнения в заживлении кожных ран впервые была показана в 1962 году, когда Winter исследовал образование струпа и скорость эпителиализации поверхностных ран на коже свиней и сообщил, что увлажненные раны заживают быстрее, чем сухие раны (Winter, 1962). Вследствие этого, сухость кожи ног коррелирует с изъязвлением стопы у больных DM (Tentolouris, 2010). Особая роль AQP3 при заживлении диабетической раны установили, когда обнаружили, что AQP3 подавляет регенерацию эпидермиса в процессе заживления ран во всю толщу кожи у крыс с DM (Sugimoto, 2012). Данная работа показала, что ЕРО можно использовать для стимуляции заживления незаживающих ран. Такие данные также указывают на наличие причинно-следственной связи между нарушенной экспрессией AQP3 и замедленной реэпителиализацией при DM, которая предусматривает (а) нарушенные перемещение и пролиферацию тех клеток, которые участвуют в ангиогенезе, (b) снижение продуцирования внеклеточного матрикса (ЕСМ) фибробластами и (c) неспособность кератиноцитов к реэпителиализации кожной раны.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к местным составам, содержащим эритропоэтин (ЕРО), а также предпочтительно фибронектин (FN), особенно к гелевым составам. Согласно некоторым вариантам осуществления описывается фармацевтическая композиция, содержащая гель, эритропоэтин и фибронектин. Согласно некоторым аспектам фибронектин присутствует в композиции в количестве, потенцирующим лечебные действия эритропоэтина при нанесении на рану. Согласно другим аспектам описывается способ лечения раны, предусматривающий местное нанесение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей гель, эритропоэтин и фибронектин, при этом фибронектин присутствует в композиции в количестве, потенцирующим лечебные действия эритропоэтина при нанесении на рану для лечения раны. Согласно некоторым вариантам осуществления раной является рана субъекта с диагнозом или с предположением высокого содержания сахара в крови. Согласно другим вариантам осуществления раной является рана субъекта с диагнозом или с предположением наличия инсулиновой резистентности. Согласно другим вариантам осуществления раной является рана субъекта с диагнозом или с предположением наличия дефицита в продуцировании инсулина или резистентности к инсулину. Согласно следующим вариантам осуществления раной является рана субъекта, в которого диагностирован или предполагается сахарный диабет. Согласно конкретным аспектам раной является рана субъекта-человека.

Гелевый состав предпочтительно содержит по меньшей мере одного представителя из неограничивающего перечня вспомогательных средств, в том числе, например, бензиловый спирт, глицерин или другие спирты, полимеры, такие как поливинилкарбоксиполимер, такой как Carbomer 940, который может быть применим, например, в качестве усилителя вязкости, желирующего средства или суспензионного средства (Carbomer 940 представляет собой сшитый со сложными эфирами пентаэритритол), парабены, такие как метилпарабен, пропилпарабен; триэтаноламин и другие вспомогательные средства, известные в уровне техники для создания гелей, а также любая их комбинация. Гелевые составы в соответствии с настоящим изобретением также должны включать в себя воду.

Согласно определенным аспектам фармацевтической композиции, содержащей гель, эритропоэтин и фибронектин, эритропоэтин присутствует в концентрации 5% масса/масса по массе композиции. Согласно другим аспектам фибронектин присутствует в концентрации 30% масса/масса. Согласно следующим аспектам композиция содержит эритропоэтин в концентрации между 0,01% до 30% (масса/масса) и фибронектин в концентрации между 0,01% до 50% (масса/масса). Согласно другим вариантам осуществления композиция содержит эритропоэтин при концентрации между 0,01% до 30% (масса/масса) и фибронектин в концентрации между 0,01% до 50% (масса/масса), глицерин в концентрации между 0,01% до 30% (масса/масса), Carbomer 940 при концентрации между 0,01% до 30% (масса/масса), бензиловый спирт в концентрации между 0,01% до 30% (масса/масса), триэтаноламин в концентрации между 0,01% до 30% (масса/масса), метилпарабен в концентрации между 0,01% до 30% (масса/масса), пропилпарабен в концентрации между 0,01% до 30% (масса/масса). Согласно следующим аспектам содержание глицерина в композиции составляет 5% (масса/масса), Carbomer 940 1% (масса/масса), бензилового спирта 2% (масса/масса), триэтаноламина 0,9% (масса/масса), метилпарабена 0,2% (масса/масса), пропилпарабена 0,05% (масса/масса). Согласно конкретным аспектам содержание глицерина в композиции составляет 5% (масса/масса), Carbomer 940 1% (масса/масса), бензилового спирта 2% (масса/масса), триэтаноламина 0,9% (масса/масса), метилпарабена 0,2% (масса/масса), пропилпарабена 0,05% (масса/масса) и воды до 100% (масса/масса). Согласно некоторым вариантам осуществления гелем является гель из фибрина, коллагена или гиалуроновой кислоты. Согласно другим вариантам осуществления гель содержит фибрин, коллаген или гиалуроновую кислоту. Согласно определенным вариантам осуществления гелем является гидрогель.

Согласно определенным аспектам описывается фармацевтическая композиция, содержащая эритропоэтин, при этом композицию составляют в виде геля. Согласно конкретным вариантам осуществления композиция содержит фибронектин. Согласно следующим вариантам осуществления эритропоэтин присутствует в концентрации 5% масса/масса. Согласно другим вариантам осуществления фибронектин присутствует в концентрации 30% масса/масса. Согласно другим аспектам композиция содержит эритропоэтин в концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), фибронектин в концентрации от 0,01% до 50% (масса/масса), глицерин в концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), Carbomer 940 в концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), бензиловый спирт в концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), триэтаноламин в концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), метилпарабен в концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), пропилпарабен в концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса). Согласно следующим аспектам композиция содержание глицерина в композиции составляет 5% (масса/масса), Carbomer 940 1% (масса/масса), бензилового спирта 2% (масса/масса), триэтаноламина 0,9% (масса/масса), метилпарабена 0,2% (масса/масса), пропилпарабена 0,05% (масса/масса). Согласно другим вариантам осуществления содержание глицерина в композиции составляет 5% (масса/масса), Carbomer 940 1% (масса/масса), бензилового спирта 2% (масса/масса), триэтаноламина 0,9% (масса/масса), метилпарабена 0,2% (масса/масса), пропилпарабена 0,05% (масса/масса) и воды до 100% (масса/масса). Согласно определенным аспектам гелем является гель из фибрина, коллагена или гиалуроновой кислоты. Согласно другим аспектам гель содержит фибрин, коллаген или гиалуроновую кислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления гелем является гидрогель.

Также представлен способ лечения раны у субъекта, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей эритропоэтин, при этом композиция представляет собой гель. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция содержит фибронектин. Согласно другим вариантам осуществления эритропоэтин присутствует в концентрации 5% масса/масса. Согласно некоторым другим вариантам осуществления фибронектин присутствует в концентрации 30% масса/масса. Согласно следующим вариантам осуществления композиция содержит эритропоэтин при концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), фибронектин при концентрации от 0,01% до 50% (масса/масса), глицерин при концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), Carbomer 940 при концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), бензиловый спирт при концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), триэтаноламин при концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), метилпарабен при концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса), пропилпарабен при концентрации от 0,01% до 30% (масса/масса). Согласно другим конкретным вариантам осуществления композиция содержит глицерин при 5% (масса/масса), Carbomer 940 при 1% (масса/масса), бензиловый спирт при 2% (масса/масса), триэтаноламин при 0,9% (масса/масса), метилпарабен при 0,2% (масса/масса), пропилпарабен при 0,05% (масса/масса). Согласно следующим вариантам осуществления композиция содержит глицерин при 5% (масса/масса), Carbomer 940 при 1% (масса/масса), бензиловый спирт при 2% (масса/масса), триэтаноламин при 0,9% (масса/масса), метилпарабен при 0,2% (масса/масса), пропилпарабен при 0,05% (масса/масса) и воду до 100% (масса/масса). Согласно некоторым другим аспектам гелем является гель из фибрина, коллагена или гиалуроновой кислоты. Согласно еще одним аспектам гель содержит фибрин, коллаген или гиалуроновую кислоту. Согласно конкретным аспектам гелем является гидрогель.

Согласно некоторым аспектам представлен способ лечения раны у субъекта, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей эритропоэтин, при этом композиция представляет собой гель, при этом у субъекта диагностировано или предполагается высокое содержание сахара в крови. Согласно другим аспектам у субъекта диагностировано или предполагается наличие инсулиновой резистентности. Согласно следующим аспектам у субъекта диагностировано или предполагается наличие дефицита в продуцировании инсулина. Согласно следующим аспектам у субъекта диагностирован или предполагается сахарный диабет. Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является субъект-человек. Согласно другим вариантам осуществления композицию обеспечивают за несколько введений. Согласно конкретным аспектам композицию вводят 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше раз. Согласно дополнительным аспектам композицию обеспечивают за 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23 или 24 недели. Согласно следующим вариантам осуществления композицию обеспечивают за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23 или 24 месяца. Согласно дополнительным вариантам осуществления временной интервал между введениями составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 суток. Согласно другим вариантам осуществления временной интервал между введениями составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель. Согласно дополнительным вариантам осуществления гель составляют для кожного введения или вводят накожно. Согласно следующим вариантам осуществления раной является язва или ожог. Согласно некоторым другим аспектам раной является диабетическая язва. Согласно дополнительным вариантам осуществления раной является хроническая диабетическая язва. Согласно некоторым вариантам осуществления раной является хроническая диабетическая язва конечностей. Согласно следующим аспектам раной является хроническая диабетическая язва стопы.

Также представлены способы лечения раны у субъекта, предусматривающие введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, которая индуцирует экспрессию аквапорина. Согласно определенным вариантам осуществления аквапорином является аквапорин-3. Согласно некоторым аспектам композиция представляет собой гель из фибрина, коллагена или гиалуроновой кислоты. Согласно другим вариантам осуществления гель содержит фибрин, коллаген или гиалуроновую кислоту. Согласно следующим вариантам осуществления гелем является гидрогель. Согласно определенным вариантам осуществления у субъекта диагностировано или предполагается высокое содержание сахара в крови. Согласно другим аспектам у субъекта диагностировано или предполагается наличие инсулиновой резистентности. Согласно следующим аспектам у субъекта диагностировано или предполагается наличие дефицита в продуцировании инсулина. Согласно следующим аспектам у субъекта диагностирован или предполагается сахарный диабет. Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является субъект-человек. Согласно другим вариантам осуществления композицию обеспечивают за несколько введений. Согласно конкретным аспектам композицию вводят 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше раз. Согласно дополнительным аспектам композицию обеспечивают за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23 или 24 недели. Согласно следующим вариантам осуществления композицию обеспечивают за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23 или 24 месяца. Согласно дополнительным вариантам осуществления временной интервал между введениями составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 суток. Согласно другим вариантам осуществления временной интервал между введениями составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель. Согласно дополнительным вариантам осуществления гель составляют для кожного введения или вводят накожно. Согласно следующим вариантам осуществления раной является язва или ожог. Согласно некоторым другим аспектам раной является диабетическая язва. Согласно дополнительным вариантам осуществления раной является хроническая диабетическая язва. Согласно некоторым вариантам осуществления раной является хроническая диабетическая язва конечностей. Согласно следующим аспектам раной является хроническая диабетическая язва стопы.

В некоторых композициях или способах эритропоэтин и/или фибронектин включают в матрицу. Согласно определенным аспектам эритропоэтин и/или фибронектин включают в матрицу, и по меньшей мере один является расщепляемым. Согласно другим аспектам матрица включает один или несколько расщепляемых хемокинов, хемоаттрактантов, хеморепеллентов, факторов роста, или один или несколько расщепляемых цитокинов. Например, хемокином может быть один хемокин или любая комбинация хемокинов, выбранных из группы, состоящей из CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2 и CX3CL1. Цитокин для применения в способах или композициях, раскрываемых в настоящем документе, может включать в себя представителей из семейств IL 17, IL-10, интерлейкина, лимфокина, монокина, миокина, фактора некроза опухоли или провоспалительного цитокина. Конкретные примеры цитокинов для применения в способах и композициях, описываемых в настоящем документе, включают в себя один цитокин или любую комбинацию из GcMAF, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, фактора роста гепатоцитов, ILIA, интерферона, интерферона бета-1а, интерферона бета-1b, интерферона гамма, интерферона I типа, интерферона II типа, интерферона III типа, интерлейкина 1 бета, антагониста рецептора интерлейкина 1, интерлейкина 10, интерлейкина 12, интерлейкина 13, интерлейкина 16, интерлейкина 2, интерлейкина 23, субъединицы альфа интерлейкина 23, интерлейкина 34, интерлейкина 35, интерлейкина 6, интерлейкина 7, интерлейкина 8, семейства интерлейкина 1, субъединицы бета интерлейкина 12, интерлейкина 36, лейкоз-ингибирующего фактора, фактора стимуляции лейкоцитов, лимфотоксина, лимфотоксина альфа, лимфотоксина бета, макрофагального колониестимулирующего фактора, макрофагального белка воспаления, фактора активации макрофагов, мионектина, никотинамидфосфорибозилтрансферазы, онкостатина М, опрелвекина, тромбоцитарного фактора 4, промегапоэтина, RANKL, стромального клеточного фактора 1, фактора некроза опухоли альфа или ингибитора фактора роста эндотелия сосудов. Конкретно предполагаемые факторы роста включают в себя, например, FGF 1, FGF 2, IGF 1, IGF 2, PDGF, EGF, KGF, HGF, VEGF, SDF-1, GM-CSF, CSF, G-CSF, TGF альфа, TGF бета, NGF и ECGF. Также предусматриваются индуцируемые гипоксией факторы (например, HIF-1 альфа и бета, а также HIF-2), гормоны (например, инсулин, гормон роста (GH), CRH, лептин, пролактин и TSH), ангиогенные факторы (например, ангиогенин и ангиопоэтин), факторы коагуляции и антикоагуляции, например, фактор I, фактор XIII, тканевой фактор, кальций, vWF, белок С, белок S, белок Z, фибронектин, антитромбин, гепарин, плазминоген, низкомолекулярный гепарин (Clixan), высокомолекулярный кининогенин (HMWK), прекалликреин, ингибитор активатора плазминогена-1 (РАН), ингибитор активатора плазминогена-2 (PAI2), урокиназа, тромбомодулин, тканевой активатор плазминогена (tPA), альфа-2-антиплазмин и белок Z-зависимый ингибитор протеазы (ZPI).

Согласно некоторым вариантам осуществления матрица представляет собой гель. Согласно другим вариантам осуществления матрица представляет собой гидрогель. В некоторых случаях гидрогель относится к трехмерным гидрофильным сшитым полимерным сетям, которые могут абсорбировать большие объемы воды и биологических жидкостей без растворения. Гидрогели могут быть составлены из полимеров, которые являются нерастворимыми благодаря присутствию физических поперечных связей (например, кристаллические области, межмолекулярные взаимодействия и переплетения) или химических поперечных связей (например, ковалентное связывание). Согласно конкретным вариантам осуществления гидрогель является фибриновый гидрогель или модифицированный фибриновым доменом полиэтиленгликолевый гидрогель.

Согласно одному варианту осуществления гидрогелем является фибриновый гидрогель, который сшит со сшивающим средством. Согласно некоторым вариантам осуществления сшитый фибриновый гидрогель обладает химическими, физическими или механическими свойствами, которые подходят для их применения в имплантации субъекту или больному, в частности, в подкожной имплантации.

Без ограничения гель может характеризоваться любым отношением сшивающего средства к фибрину. Следовательно, гель может иметь отношение сшивающего средства к фибрину в диапазоне от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 10:1. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гель имеет диапазон сшивающего средства к фибрину от 0,1:1 до 5:1, от 0,1:1 до 4:1, от 0,1:1 до 2:1, от 0,1:1 до 1,5:1, от 0,1:1 до 1:1, от 0,1:1 до 0,9:1, от 0,2 до 0,8:1 и/или от 0,25 до 0,75:1. Согласно некоторым вариантам осуществления гель имеет диапазон сшивающего средства к фибрину от 0,20:1 до 0,5:1. Согласно некоторым вариантам осуществления гель имеет диапазон сшивающего средства к фибрину 0,25:1 или 0,5:1.

Гидрогели могут быть сделаны из фибриновых растворов, содержащих широкий диапазон концентраций фибрина. Следовательно, гель может быть сделан из фибринового раствора, содержащего от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 500 мг/мл, от приблизительно 100 мг/мл до приблизительно 400 мг/мл, от 150 мг/мл до приблизительно 300 мг/мл, от 20 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл фибрина или любой диапазон из перечисленного. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гель делают из фибринового раствора, содержащего приблизительно 200 мг/мл фибрина. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гидрогель делают из фибринового раствора, содержащего приблизительно 250 мг/мл фибрина. Согласно некоторым другим вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гидрогель делают из фибринового раствора, содержащего приблизительно 300 мг/мл фибрина.

Согласно другим вариантам осуществления гидрогель относится к полимеру, который формируют путем свободнорадикальной полимеризации из раствора гидрофильных мономеров, гелированного и сшитого с образованием трехмерной полимерной сети, заякоривающей макромолекулы. Макромолекулы могут содержать компонент основного вещества ткани, такой как нативный коллаген. Коллаген может быть рассеян в полимерной сети с образованием коллагенового гидрогеля. Согласно некоторым вариантам осуществления коллагеновый гидрогель способен обеспечивать рост эпителиальных клеток.

Растворимый коллаген для сшивания может быть получен известными в уровне техники методиками. Кроме того, могут быть использованы другие белки, которые способствуют прикреплению и росту клеток, для образования сшитого гидрогеля. Одним примером дополнительного белка, как известно, способствующего росту клеток, является фибронектин.

Полисахариды и мукополисахариды также могут быть добавлены в гидрогели в соответствии с настоящим изобретением.

Гидрогелевые полимеры, образованные путем свободнорадикальной полимеризации растворов мономеров, требуют сшивания с образованием из трехмерной полимерной структуры сети для гелирования водного раствора. Добавление сшивающего средства, такого как этиленгликоль диметакрилат, в процесс полимеризации может изменить получающийся в результате гидрогель. В целом, добавление сшивающих средств, как правило, повышает упругость и механическую прочность гидрогеля. Добавление сшивающих средств, таких как этиленгликоль диметакрилат и метилметакрилат, в полимеризационную смесь в присутствии нативного коллагена опять же изменяет физические свойства гидрогеля, и такие добавления в полимеризационную смесь совместимы с нативным коллагеном и дают в результате коллагеновый гидрогель. Другие известные сшивающие средства, которые могут быть удовлетворительно использованы в получении коллагенового гидрогеля, включают в себя диакрилаты и диметакрилаты или другие двухвалентные молекулы.

Без ограничения гель может иметь любое отношение сшивающего средства к коллагену. Следовательно, гель может иметь отношение сшивающего средства к коллагену в диапазоне от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 10:1. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гель имеет отношение сшивающего средства к коллагену от 0,1:1 до 5:1, от 0,1:1 до 4:1, от 0,1:1 до 2:1, от 0,1:1 до 1,5:1, от 0,1:1 до 1:1, от 0,1:1 до 0,9:1, от 0,2 до 0,8:1 и/или от 0,25 до 0,75:1. Согласно некоторым вариантам осуществления гель имеет отношение сшивающего средства к коллагену от 0,20:1 до 0,5:1. Согласно некоторым вариантам осуществления гель имеет отношение сшивающего средства к коллагену 0,25:1 или 0,5:1.

Гидрогели могут быть сделаны из коллагеновых растворов, характеризующихся широким диапазоном концентраций коллагена. Следовательно, гель может быть сделан из коллагенового раствора, содержащего от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 500 мг/мл, от приблизительно 100 мг/мл до приблизительно 400 мг/мл, от 150 мг/мл до приблизительно 300 мг/мл, от 20 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл коллагена или любой диапазон из перечисленного. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гель делают из коллагенового раствора, содержащего приблизительно 200 мг/мл коллагена. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гидрогель делают из коллагенового раствора, содержащего приблизительно 250 мг/мл коллагена. Согласно некоторым другим вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гидрогель делают из коллагенового раствора, содержащего приблизительно 300 мг/мл коллагена.

Гидрогели, которые могут быть использованы в качестве синтетических «реагирующих на стимул» полимеров, могут быть основаны на синтетических полимерах, таких как поли(этиленгликоль) (PEG), поли(виниловый спирт) (PVA), поли(N-изопропилакриламид) (поли(NiPAAm)). Такие гидрогели использовали во многочисленных применениях регенеративной медицины (см., например, N.A. Peppas, P. Bures, W. Leobandung, and Н. Ichikawa. Hydrogels in pharmaceutical formulations. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:27-46 (2000)), включенную в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно определенным аспектам гидрогели получают с различными полимерами, такими как поливиниловый спирт (PVA), поливинилпирролидон (PVP) или полиакриламиды. Типичные гидрогели на основе PVA раскрываются, например, в патентах США №№6231605, 5346935, 5981826, 4663358 и 4988761, содержания которых включены в настоящий документ посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам осуществления основанные на полиэтиленгликоле (PEG) гидрогели обеспечивают большую степень набухания в водных растворах. Различные гидрогели на основе PEG раскрываются в патентах США №№5514379, 6362276 и 6541015, содержания которых включены в настоящий документ посредством ссылки. В РСТ заявке WO 2006125082, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представлен гидрогелевый состав, содержащий предварительно отвержденные гидрогелевые частицы в предшествующем гидрогелевом растворе.

Без ограничения гель может характеризоваться любым отношением сшивающего средства к поли(этиленгликолю) (PEG). Следовательно, гель может иметь отношение сшивающего средства к PEG в диапазоне от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 10:1. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гель имеет отношение сшивающего средства к PEG от 0,1:1 до 5:1, от 0,1:1 до 4:1, от 0,1:1 до 2:1, от 0,1:1 до 1,5:1, от 0,1:1 до 1:1, от 0,1:1 до 0,9:1, от 0,2 до 0,8:1 и/или от 0,25 до 0,75:1. Согласно некоторым вариантам осуществления гель имеет отношение сшивающего средства к PEG от 0,20:1 до 0,5:1. Согласно некоторым вариантам осуществления гель имеет отношение сшивающего средства к PEG 0,25:1 или 0,5:1.

Гидрогели могут быть сделаны из растворов PEG, характеризующихся широким диапазоном концентраций PEG. Следовательно, гель может быть сделан из раствора PEG, содержащего от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 500 мг/мл, от приблизительно 100 мг/мл до приблизительно 400 мг/мл, от 150 мг/мл до приблизительно 300 мг/мл, от 20 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл PEG или любой диапазон из перечисленного. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гель делают из раствора PEG, содержащего приблизительно 200 мг/мл PEG. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гидрогель делают из раствора PEG, содержащего приблизительно 250 мг/мл PEG. Согласно некоторым другим вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гидрогель делают из раствора PEG, содержащего приблизительно 300 мг/мл PEG.

Согласно другому варианту осуществления гидрогелем является гидрогель гиалуроновой кислоты, который сшивают сшивающим средством. Согласно некоторым вариантам осуществления сшитый гидрогель гиалуроновой кислоты обладает химическими, физическими или механическими свойствами, которые подходят для его применения в имплантации субъекту или больному, в частности, в подкожной имплантации. Согласно другим вариантам осуществления сшитый гидрогель гиалуроновой кислоты обладает химическими, физическими или механическими свойствами, которые подходят для его применения в лечении дермальных ран субъекта или больного, в частности, для нанесений на кожу.

Без ограничения гель может характеризоваться любым отношением сшивающего средства к гиалуроновой кислоте. Следовательно, гель может иметь отношение сшивающего средства к гиалуроновой кислоте в диапазоне от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 10:1. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гель имеет отношение сшивающего средства к гиалуроновой кислоте от 0,1:1 до 5:1, от 0,1:1 до 4:1, от 0,1:1 до 2:1, от 0,1:1 до 1,5:1, от 0,1:1 до 1:1, от 0,1:1 до 0,9:1, от 0,2 до 0,8:1 и/или от 0,25 до 0,75:1. Согласно некоторым вариантам осуществления гель имеет отношение сшивающего средства к гиалуроновой кислоте от 0,20:1 до 0,5:1. Согласно некоторым вариантам осуществления гель имеет отношение сшивающего средства к гиалуроновой кислоте 0,25:1 или 0,5:1.

Гидрогели могут быть сделаны из растворов гиалуроновой кислоты, характеризующихся широким диапазоном концентраций гиалуроновой кислоты. Следовательно, гель может быть сделан из раствора гиалуроновой кислоты, содержащего от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 500 мг/мл, от приблизительно 100 мг/мл до приблизительно 400 мг/мл, от 150 мг/мл до приблизительно 300 мг/мл, от 20 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл гиалуроновой кислоты или любой диапазон из перечисленного. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гель делают из раствора гиалуроновой кислоты, содержащего приблизительно 200 мг/мл гиалуроновой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гидрогель делают из раствора гиалуроновой кислоты, содержащего приблизительно 250 мг/мл гиалуроновой кислоты. Согласно некоторым другим вариантам осуществления аспектов, описываемых в настоящем документе, гидрогель делают из раствора гиалуроновой кислоты, содержащего приблизительно 300 мг/мл гиалуроновой кислоты.

Использование в настоящем раскрытии объекта в единственном числе может означать один или несколько объектов. Использование в формуле изобретения объекта в единственном числе в сочетании со словом «содержащий» означает один или более чем один объект.

Применение термина «или» в формуле изобретения означает «и/или», если явно не указываются альтернативы, или альтернативы являются взаимоисключающими, хотя раскрытие обосновывает определение, которое относится только к альтернативам и к «и/или». Используемый в настоящем документе термин «другой» может означать по меньшей мере второй или более.

По всей настоящей заявке термин «приблизительно» применяют для указания того, что значение включает в себя закономерную вариацию погрешности для устройства, способа, подлежащего использованию для определения значения, или вариацию, которая существует между субъектами исследования.

Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего подробного описания. Следует, однако, учитывать, что подробное описание и конкретные примеры с указанием предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения приводятся исключительно с целью иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в рамках сущности и объема настоящего изобретения станут очевидными специалистам в данной области из настоящего подробного описания.

Краткое описание графических материалов

Следующие графические материалы составляют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение можно будет лучше понять при обращении к ссылке на один или несколько таких графических материалов в комбинации с подробным раскрытием конкретных вариантов осуществления, представленных в настоящем документе.

Фиг. 1. ЕРО при местном введении ускоряет закрытие раны и усиливает кровоток в регенерирующейся коже при диабетических ранах зависимым от дозы образом; эффект, усиливаемый FN. Скорости закрытия раны и кровотока в регенерирующейся коже недиабетических и диабетических свиней определяли в день 0, 2, 4, 7, 9, 11 и 14 после различных видов обработки. (А) Скорости закрытия раны обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у диабетических свиней. (В) Скорости закрытия раны обработанных средой-носителем, обработанных низкой дозой ЕРО и обработанных высокой дозой ЕРО ожоговых ран у диабетических свиней. (С) Типичные фотографические изображения и полученные лазерным доплеровским методом сканограммы обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у недиабетической (слева) и диабетической свиньи в день 0, 2, 4, 7, 9, 11 и 14 (справа). (D) Типичный набор фотографических изображений и полученных лазерным доплеровским методом сканограмм одинаковых обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у недиабетической (слева) и диабетической свиньи в день 0, 2, 4, 7, 9, 11 и 14 (справа). Белые кружочки на полученных лазерным доплеровским методом сканограммах представляют площадь ожоговой раны в день 0. Темно-синий цвет представляет неваскуляризированные участки, а желтый и красный цвета представляют васкуляризированные участки, при этом окрашенные красным участки изображают участки, которые являются более васкуляризированными, чем окрашенные желтым участки. Размер образца для каждой получавшей обработку группы составлял 12 за исключением группы с обработанными низкой дозой ЕРО ожоговыми ранами, у которой образец составлял шесть. *р < 0,05 и **р < 0,01, и показывает значимость различия между обработанными средой-носителем ожоговыми ранами и другими видами обработки по результатам двухфакторного ANOVA с коррекцией Бонферрони. и показывает значимость различия между (a) обработанными ЕРО или обработанными EPO/FN ожоговыми ранами и обработанными FN ожоговыми ранами, а также (b) обработанными высокой дозой ЕРО ожоговыми ранами и обработанными низкой дозой ЕРО ожоговыми ранами по результатам двухфакторного ANOVA с коррекцией Бонферрони.

Фиг. 2. FN при местном введении не влияет на скорости закрытия раны и кровотока в регенерирующейся коже при недиабетических ранах. Скорости закрытия раны и кровотока в регенерирующейся коже недиабетических свиней определяли в день 0, 4, 9 и 14 после различных видов обработки. (A) Скорости закрытия раны обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у недиабетических свиней. (В) Типичный набор фотографических изображений (слева) и полученных лазерным доплеровским методом сканограмм (справа) обработанной средой-носителем, обработанной FN ожоговой раны, обработанной ЕРО ожоговой раны и обработанной EPO/FN ожоговой раны у недиабетической свиньи в день 0, 4, 9 и 14. Белые кружочки на полученных лазерным доплеровским методом сканограммах представляют площадь ожоговой раны в день 0. Темно-синий цвет представляет неваскуляризированные участки, а желтый и красный цвета представляют васкуляризированные участки, при этом окрашенные красным участки изображают участки, которые являются более васкуляризированными, чем окрашенные желтым участки. Размер образца для каждой получавшей обработку группы у двух недиабетических свиней составлял 12. *р < 0,05 и **р < 0,01, и показывает значимость различия между обработанными средой-носителем ожоговыми ранами и другими видами обработки по результатам двухфакторного ANOVA с коррекцией Бонферрони. и показывает значимость различия между обработанными EPO/FN и обработанными ЕРО ожоговыми ранами по результатам двустороннего t-критерия Стьюдента.

Фиг. 3. ЕРО при местном введении увеличивает микрососудистую плотность (MVD) и экспрессию eNOS в регенерирующейся коже при диабетических ранах, и данные эффекты усиливаются FN. (А) Типичный набор микрофотографий, на которых демонстрируется иммуногистохимическое окрашивание на экспрессию CD31 клетками сосудистого эндотелия капилляров в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем, FN, ЕРО и EPO/FN ожоговых ран у недиабетических свиней (верхняя панель) и диабетических свиней (нижняя панель), которые получали после 14 суток обработки. MVD в регенерирующейся коже определяли путем подсчета числа капилляров на пяти рандомных микроскопических полях (×200 увеличение) под световым микроскопом на каждом участке раны. (В) MVD в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у недиабетических свиней. (С) MVD в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран диабетических свиней. (D и Е) Типичные вестерн-блоттинги экспрессии eNOS в тканях, которые собирали в день 14, а затем измеряли в лизатах, которые получали из регенерирующейся кожи обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у недиабетических свиней (D) и диабетических свиней (Е). α-Актин использовали для нормализации белковой нагрузки, а блотты получали из образцов, которые анализировали параллельно на отдельном геле. Размер образца для каждой получавшей обработку группы составлял 12, и данные выражают как среднее измерений в двух повторностях ± SD (В и С) для каждой получавшей обработку группы. *р < 0,05 и **р < 0,01, и показывает значимость различия между обработанных средой-носителем ожоговыми ранами и другими видами обработки по результатам однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Тьюки (В и С). и показывает значимость различия между обработанными EPO/FN и обработанными ЕРО ожоговыми ранами по результатам однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Тьюки (С). Масштабная полоска: 200 мкм (А).

Фиг. 4. ЕРО при местном введении повышает количество гидроксипролина (HP) и синтез гиалуроновой кислоты (НА) в регенерирующейся коже диабетических ран, и данный эффект усиливается FN. (А) Типичный набор микрофотографий, на которых демонстрируется иммуногистохимическое окрашивание на определение количества HP с помощью трихромного окрашивания по методу Массона в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у недиабетических свиней (верхняя панель) и диабетических свиней (нижняя панель), которые получали после 14 суток обработки. (В) Содержание HP в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у недиабетических свиней в день 14. (С) Содержание HP в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у диабетических свиней. (D) Количество НА в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у недиабетических свиней. (Е) Количество НА в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у диабетических свиней. (F и G) Типичные вестерн-блоттинги уровней экспрессии HAS1 и HAS2 в тканях, которые собирали в день 14, а затем измеряли в лизатах, которые получали из регенерирующейся кожи обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у недиабетических свиней (F) и диабетических свиней (G). α-Актин использовали для нормализации белковой нагрузки, а блотты получали из образцов, которые анализировали параллельно на отдельном геле. Размер образца для каждой получавшей обработку группы составлял 12, и данные выражают как среднее измерений в двух повторностях количества HP (В и С) или НА (D и Е) ± SD. *р < 0,05 и **р < 0,01, и показывает значимость различия между обработанных средой-носителем ожоговыми ранами и другими видами обработки по результатам однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Тьюки. и показывает значимость различия между обработанными EPO/FN (С) и обработанными ЕРО ожоговыми ранами (Е) по результатам однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Тьюки. Масштабные полоски: 200 мкм (А).

Фиг. 5. Экспрессия AQP3 снижается в диабетической коже без раны. Типичный набор микрофотографий иммуногистохимического окрашивания на AQP3 в коже без раны у недиабетической свиньи (А) и диабетической свиньи (В). Масштабные полоски: (слева) 50 мкм; (справа) 200 мкм (А и В). (С) Типичный набор микрофотографий иммунофлуоресцентного окрашивания на AQP3 в коже без раны у недиабетической свиньи и диабетической свиньи (D). Масштабные полоски: 200 мкм (С и D). (Е) Типичные вестерн-блоттинги экспрессии AQP3 в коже без раны у диабетических свиней через 30 суток после индукции DM и в коже без раны у недиабетических свиней. Значения выражали как среднее ± стандартное отклонение определений в трех повторностях экспрессии белка AQP3 и как процентное отношение значений в недиабетической коже без раны (100%). (G) α-Актин использовали для нормализации белковой нагрузки, а блотты получали из образцов, которые параллельно прогоняли на отдельном геле. (F) Общую РНК выделяли из лизатов кожи без раны, которые получали из образцов регенерирующейся кожи из тканей ожоговой раны двух диабетических и двух недиабетических свиней, и собирали в день 14. mRNA AQP3 количественно определяли с помощью RT-PCR. Значения выражали как среднее ± SD измерений в трех повторностях экспрессии mRNA AQP3 и как процентное отношение экспрессии в недиабетической коже без раны (100%). **р < 0,01 и показывает значимость различия между здоровыми и диабетическими свиньями по результатам двустороннего t-критерия Стьюдента.

Фиг. 6. ЕРО при местном введении стимулирует экспрессию AQP3 в регенерирующейся коже диабетических ран, и данный эффект усиливается FN. (А и В) Типичный набор микрофотографий иммуногистохимического окрашивания на AQP3 в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран недиабетических свиней (А) и диабетических свиней (В), которые получали после 14 суток обработки. Масштабные полоски: (А или В; слева) 50 мкм; (А или В; справа) 200 мкм. (С и D) Типичные вестерн-блоттинги экспрессии белка AQP3 после 14-суточной обработки ожоговых ран у двух недиабетических свиней (С) и двух диабетических свиней содержащим среду-носитель, содержащим FN, содержащим ЕРО и содержащим EPO/FN гелем. Значения выражали как среднее ± SD измерений в трех повторностях экспрессии белка AQP3 в обработанных средой-носителем ожоговых ранах недиабетических свиней (100%). Типичные вестерн-блоттинги экспрессии белка AQP3 в лизатах регенерирующейся кожи ожоговых ран от недиабетических свиней (Е) и диабетических свиней (F) после 14 суток обработки, α-Актин использовали для нормализации белковой нагрузки и блотты получали из образцов, которые параллельно прогоняли на отдельном геле (G и Н). Общую РНК выделяли из лизатов регенерирующейся кожи обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран недиабетических свиней (G) и диабетических свиней (Н). mRNA AQP3 количественно определяли с помощью RT-PCR. Значения выражали как среднее ± SD измерений в двух повторностях экспрессии mRNA AQP3 и как процентное отношение экспрессии в недиабетической коже без раны (100%). **р < 0,01 и показывает значимость различия между обработанных средой-носителем ожоговыми ранами и другими видами обработки по результатам двухфакторного ANOVA с коррекцией Бонферрони. и показывает значимость различия между обработанными EPO/FN ожоговыми ранами и обработанными ЕРО ожоговыми ранами по результатам двустороннего t-критерия Стьюдента.

Фиг. 7. Экспрессия белка AQP3 положительно коррелирует со степенью ангиогенеза и количествами гидроксипролина (HP) и гиалуроновой кислоты (НА) в регенерирующейся коже диабетических ран. Экспрессия белка AQP3 в значительной степени коррелирует с (а) плотностью микрососудов (MVD) (r=0,61), (b) количеством HP (r=0,79) и (с) количеством НА (r=0,88) в ожоговых ранах недиабетических свиней. Экспрессия белка AQP3 также в значительной степени коррелирует с (a) tMVD (r=X), (b) количеством HP (r=0,60) и (с) количеством НА (r=0,93) в ожоговых ранах диабетических свиней (r=0,88). Каждая точка представляет средние экспрессию белка AQP3, MVD и количества HP и НА в шести ранах.

Фиг. 8. Ингибирование AQP3 с помощью HgCl₂ снижает эффект ЕРО при местном введении в отношении скорости закрытия раны, степени ангиогенеза и количеств гидроксипролина (HP) и гиалуроновой кислоты (НА) в диабетических ранах. Скорость закрытия раны и степень кровотока в регенерирующейся коже диабетических свиней определяли после 14 суток обработки содержащим среду-носитель, содержащим высокую дозу ЕРО и содержащим EPO/HgCl₂ гелями. (А) Скорости закрытия раны обработанных средой-носителем, обработанных ЕРО и обработанных EPO/HgCl₂ ожоговых ран у диабетических свиней. (В) Типичный набор фотографических изображений (верхняя панель) и полученных лазерным доплеровским методом сканограмм (нижняя панель) обработанной средой-носителем, обработанной ЕРО и обработанной EPO/HgCl₂ ожоговой раны у диабетической свиньи после 14 суток лечения. Темно-синий цвет представляет неваскуляризированные участки, а желтый и красный цвета представляют васкуляризированные участки, при этом окрашенные красным участки изображают участки, которые являются более васкуляризированными, чем окрашенные желтым участки. Оценивали и сравнивали ожоговые раны (n=6) у одной из диабетических свиней в каждой получавшей обработку группе. (С) Типичные вестерн-блоттинги уровней экспрессии eNOS, HAS1 и HAS2 в тканях, которые собирали в день 14, а затем измеряли в лизатах, которые получали из регенерирующейся кожи обработанных средой-носителем, обработанных FN, обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ран у диабетических свиней. α-Актин использовали для нормализации белковой нагрузки, а блотты получали из образцов, которые параллельно прогоняли на отдельном геле (D). MVD регенерирующейся кожи обработанных средой-носителем, обработанных ЕРО и обработанных EPO/HgCl₂ ожоговых ран у диабетических свиней. (Е) Количество HP регенерирующейся кожи обработанных средой-носителем, обработанных ЕРО и обработанных EPO/HgCl₂ ожоговых ран у диабетической свиньи. (F) Количество НА регенерирующейся кожи обработанных средой-носителем, обработанных ЕРО и обработанных EPO/HgCl₂ ожоговых ран диабетических свиней. *р < 0,05 и **р < 0,01, и показывает значимость различия между обработанных средой-носителем ожоговыми ранами и другими видами обработки по результатам двухфакторного ANOVA с коррекцией Бонферрони (А). **р < 0,01 и показывает значимость различия между обработанных средой-носителем ожоговыми ранами и другими видами обработки по результатам однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Тьюки (D-F). и показывает значимость различия между обработанными EPO/HgCl₂ и обработанными ЕРО ожоговыми ранами по результатам двустороннего t-критерия Стьюдента (D-F).

Фиг. 9. Высокое содержание глюкозы подавляет экспрессию AQP3 в кератиноцитах и фибробластах, полученных из человеческой кожи; эффект блокируется ЕРО. (А) Эффект ЕРО в отношении пролиферации HEKC в среде с низким содержанием глюкозы (нормальным) и высоким содержанием глюкозы. (В) Эффект ЕРО в отношении пролиферации NHBC в среде с низким содержанием глюкозы (нормальным, NG) и высоким содержанием глюкозы (HG) (С и D). Типичные вестерн-блоттинги уровней экспрессии AQP3 в лизатах, которые получали в обработанных ЕРО HEKC и NHBC после 5-суточного культивирования либо в среде NG, либо в среде HG. α-Актин использовали для нормализации прогона на отдельном геле (Е и F). Типичный набор микрофотографий иммуногистохимического окрашивания на уровни экспрессии AQP3 в HEKC (Е) и NHBC (F). Масштабная полоска: 500 мкм. **р < 0,01 и показывает значимость различия по результатам однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Тьюки.

Фиг. 10. Линейный график, демонстрирующий уменьшение длины и ширины хронической язвы диабетической стопы за несколько недель лечения с помощью EPO/FN.

Фиг. 11. Линейный график, демонстрирующий уменьшение площади язвы хронической язвы диабетической стопы за несколько недель лечения с помощью EPO/FN.

Фиг. 12. Типичные фотографии закрытия раны хронической диабетической язвы стопы за несколько недель лечения с помощью ЕРО/FN.

Фиг. 13. Типичные фотографии закрытия раны хронической диабетической язвы стопы до лечения и после нескольких недель лечения с помощью ЕРО/FN.

Подробное раскрытие иллюстративных вариантов осуществления

I. Настоящее изобретение

Ввиду вышеизложенного автор настоящего изобретения предположил, что терапевтически благоприятное действие ЕРО на заживление DSU объясняется отчасти его способностью стимулировать экспрессию AQP3 в коже. Эту гипотезу проверяли на свиньях с экспериментально индуцированным DM 1 типа и поверхностным ожогом кожи. Обнаружили, что местная обработка ожогов с помощью ЕРО у диабетических свиней ускоряла их заживление посредством AQP3-зависимого механизма за счет стимуляции ангиогенеза и продуцирования ЕСМ. Дополнительные данные свидетельствуют о том, что FN может усиливать ускоряющее действие ЕРО на заживление ожогов у диабетических свиней. Также предлагают, что раны диабетической стопы можно лечить в соответствии с настоящим изобретением. Также рассматривают лечение людей.

Таким образом, настоящее изобретение относится, в частности, к составам и лечению ран, как описывается выше и в другом месте в настоящем документе. Также оно, в частности, относится к фармацевтической композиции, содержащей гель, эритропоэтин и фибронектин, при этом фибронектин присутствует в композиции в количестве, потенцирующим лечебные действия эритропоэтина при нанесении на рану.

Способ лечения раны предусматривает местное нанесение терапевтически эффективного количества состава, такого как описываемый выше и в другом месте в настоящем документе, на рану для лечения и/или ускорения заживления раны, например, ожога или диабетической раны стопы.

Без ограничения какой-либо конкретной теорией полагают, что заживление действует через AQP3-зависимый механизм, который активирует ангиогенез, запускает синтез коллагена и гиалуроновой кислоты и образование внеклеточного матрикса (ЕСМ), а также стимулирует реэпителиализацию кератиноцитами. Добавление фибронектина в состав может усилить ускоряющее действие ЕРО на заживление ожогового повреждения.

II. Определения

Таким образом, согласно аспекту настоящего изобретения представлен способ стимулирования заживления раны и реконструкции соединительной ткани у субъекта при необходимости этого. Согласно некоторым вариантам осуществления у субъекта диагностировано или предполагается наличие сахарного диабета. Согласно другим вариантам осуществления у субъекта диагностировано или предполагается высокое содержание сахара в крови или инсулиновая резистентность.

Используемая в настоящем документе фраза «соединительная ткань» относится к животной ткани, в которой внеклеточный матрикс (ЕСМ) и особенно коллаген составляет основную часть, при этом ткань функционирует с поддержкой и связыванием разных тканей и частей организма друг с другом. Типичным примером является кожа и внутренние органы.

Используемая в настоящем документе фраза «реконструкция соединительной ткани» относится к восстановлению эстетических характеристик, структуры, функции и физиологии пораженной или нездоровой ткани. Такая реконструкция ведет к регенеративному заживлению. Кроме того, реконструкция соединительной ткани относится к усилению продуцирования коллагена в здоровой ткани. Согласно типичному варианту осуществления реконструкция ведет к остановке разрушения ткани. Согласно другим типичным вариантам осуществления реконструкция соединительной ткани происходит без фиброза.

Используемая в настоящем документе фраза «пораженная или нездоровая ткань» относится к отклонению от здоровой функциональной ткани. В случае кожи это кожа, которая является более слабой, менее эластичной и более склонной к поражению, чем здоровая кожа. Структура нездоровой или пораженной кожи хуже, чем у здоровой кожи (например, дерма и эпидермис содержат меньше клеток и коллагена). Одной целью при лечении нездоровой кожи является снижение дальнейшего ухудшения кожи и восстановления ее функции до нормального уровня или близкого к нормальному.

Используемая в настоящем документе фраза «здоровая ткань» относится к коже, которая является сильной, эластичной, гладкой и плотной. Одной целью при лечении здоровой кожи является предупреждение ухудшения кожи, вызванного старением или стрессовым воздействием окружающей среды, в том числе избыточным солнечным излучением и микробной инфекцией.

Термин «стимулирование» в отношении соединительной ткани относится к процессу усиления продуцирования коллагена клетками кожи, такими как фибробласты и кератиноциты, таким образом, что обеспечивает регенерацию ткани. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения «стимулирование» относится по меньшей мере к приблизительно 10%, 20%, 50%, 80% усилению регенерации ткани или по меньшей мере к приблизительно 10%, 20%, 50%, 80% купированию разрушения ткани. Специалистам в данной области будет понятно, что различные методы и анализы могут быть использованы для оценивания стимулирования регенерации ткани, и, подобным образом, различные методы и анализы могут быть применимы для оценивания купирования разрушения ткани.

Используемый в настоящем документе термин «рана» в широком смысле относится к поражениям кожи и подкожной ткани, а также внутренних органов, вызванным любым из ряда путей (например, диабетические язвы, пролежни из-за длительного постельного режима, раны, вызванные травмой, раны, полученные в ходе или после хирургической процедуры и подобные) и имеющим варьирующие характеристики. Примеры включают в себя без ограничения синяки, струпья, ожоговые раны, раны от солнечных ожогов, инцизионные раны, эксцизионные раны, хирургические раны, некротизирующий фасцит, язвы, трофические язвы, диабетические язвы, язвы-пролежни, афтозные язвы, пролежневые язвы, шрамы, гнездную алопецию, дерматит, аллергический контактный дерматит, атопический дерматит, брелоковый дерматит, пеленочный дерматит, дисгидротический дерматит, псориаз, экзему, эритему, бородавки, анальные бородавки, ангиому, старческую гемангиому, атлетическую стопу, атипические невусы, базальноклеточную карциному, пурпуру Бейтмена, буллезный пемфигоид, кандидоз, хондродерматит завитка ушной раковины, невус Кларка, герпес губ, кондиломы, кисты, болезнь Дарье, дерматофиброму, дискоидную красную волчанку, монетовидную экзему, атопическую экзему, дисгидротическую экзему, экзему рук, мультиформную нодозную эритему, состояние Фордайса, келоидный фолликулит, фолликулит, анулярную гранулему, болезнь Гровера, тепловую сыпь, простой герпес, герпес зостер (опоясывающий лишай), гнойный гидраденит, крапивницу, гипергидроз, ихтиоз, импетиго, волосяной кератоз, келоиды, кератоакантому, плоский лишай, подобный плоскому лишаю кератоз, простой хронический лишай, склеротический лишай, лимфоматоидный папулез, волчанку кожи, болезнь Лайма, линейный лихен, миксоидные кисты, фунгоидную гранулему, контагиозный моллюск, заносы, грибок ногтей, диабетический липоидный некробиоз, монетовидный дерматит, онихошизис, онихомикоз, парапсориаз лихеноидный, розовый питириаз, красный волосистый питириаз, роговые бородавки, поражение сумахом ядоносным, поражение ядовитым дубом, водяницу, псевдофолликулит зоны роста бороды, зуд заднего прохода и себорейную экзему.

Раны, как правило, классифицируют в одну из четырех степеней в зависимости от глубины раны: (i) I степень: раны, ограниченные эпителием; (ii) II степень: раны, распространяющиеся в дерму; (iii) III степень: раны, распространяющиеся в подкожную ткань; и (iv) IV степень (или раны во всю толщину): раны, при которых обнажаются кости (например, точка пережатия кости, например, большого вертела или крестцовой кости).

Используемый в настоящем документе термин «поверхностная рана» относится к ранам I-III степени; примеры поверхностных ран включают в себя ожоговые раны, пролежни, трофические язвы и диабетические язвы.

Используемый в настоящем документе термин «глубокая рана» означает раны как III степени, так и IV степени.

Используемый в настоящем документе термин «хроническая рана» относится к ране, которая не заживает за тридцать суток.

Термин «заживление» в отношении раны относится к процессу восстановления раны, такому как образование шрама (согласно типичным вариантам осуществления при заживлении не происходит образование фиброзной ткани).

Согласно конкретному варианту осуществления композиции некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения стимулируют, т.е. ускоряют, процесс заживления.

Фраза «индуцирование или ускорение процесса заживления кожной раны» относится или к индуцированию образования грануляционной ткани закрытия раны, и/или к индуцированию эпителиализации (т.е. образования новых клеток в эпителии). Заживление раны удобно измеряется уменьшением площади раны.

Согласно некоторым аспектам лечение охватывает все типы раны, в том числе глубокие раны и хронические раны.

Используемый в настоящем документе термин «лечение» относится к предупреждению, излечению, обращению, смягчению, уменьшению, минимизации, подавлению или остановке вредных эффектов ишемического состояния, например, путем усиления перфузии. Специалистам в данной области будет понятно, что различные методы и анализы могут быть использованы для оценивания развития состояния, и, подобным образом, различные методы и анализы могут быть использованы для оценивания снижения, ремиссии или регрессии состояния.

Лечение может быть оценено рутинными экспериментами, такими как с использованием моделей, описанных в приведенном ниже разделе Примеры. Показатели результатов, такие как перфузия и выживаемость, а также гистологический и функциональный критерии, могут быть использованы для оценивания эффективности варьирования различных параметров с целью достижения оптимальной эффективности в количествах клеток, имеющих максимальное терапевтическое значение в лечении кожных ран. Дополнительными известными в уровне техники параметрами, которые могут быть определены количественно для определения перфузии в пораженной ткани, являются ангиография и MRI, а также клинические параметры, такие как степень некроза ткани на пораженном участке, изъязвление ткани и ампутация пальцев и/или конечностей.

В контексте заживления раны «стимулирование» относится к способности обеспечивать заживление раны или помогать заживлению раны, таким образом, что обеспечивается ее лечение. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения стимулирование относится по меньшей мере к приблизительно 10%, 20%, 50%, 80% сокращению времени, необходимого для достижения заживления, или по меньшей мере к приблизительно 10%, 20%, 50%, 80% усилению в закрытии раны.

Используемый в настоящем документе термин «субъект» относится к любому млекопитающему (например, к человеку или домашним животным), особи мужского или женского пола любого возраста, которая испытывает или может испытывать повреждение ткани или страдает от раны или от ишемии любой стадии и/или степени.

Как упоминалось, способ согласно данному аспекту настоящего изобретения осуществляют путем местного введения субъекту указанных дозировок ЕРО и FN.

Используемый в настоящем документе термин «эритропоэтин» (ЕРО) относится к белку эритропоэтину (применяемому поочередно с полипептидом) млекопитающего (например, человека) или к его миметикам, таким как указанный в GenBank под №доступа NP 000790. Эритропоэтин может быть синтезирован с использованием методик рекомбинантной ДНК или твердофазной технологии. Эритропоэтин также коммерчески доступен (например, от Cytolab/Peprotech, Rehovot, Israel; Arenesp, Amgen, Thousand Oaks, Calif., USA; и Epogen, Amgen, Thousand Oaks, Calif., USA, Bristol-Myers Squibb, Roche и Sanofi-Aventis). Эритропоэтин может быть применим в качестве целого гликопротеина или в качестве только лишь белковой субъединицы без связанного сахара. Поскольку эритропоэтин в соответствии с данными вариантами осуществления применяют для клинических целей, он предпочтительно является стерильным или может быть очищен от возможных загрязняющих факторов (например, бактерий или бактериальных компонентов, например, с помощью фильтра).

Используемый в настоящем документе термин «фибронектин» (FN) относится к белку фибронектину (применяемому поочередно с полипептидом) млекопитающего (например, человека) или к его миметикам, таким как указанный в GenBank под №доступа NP_002017. Фибронектин может быть синтезирован с использованием методик рекомбинантной ДНК или твердофазной технологии. Фибронектин также коммерчески доступен (например, от Chemicon International Inc., Temecula, Calif., USA). Поскольку фибронектин в соответствии с настоящим изобретением применяют для клинических целей, он предпочтительно является стерильным или может быть очищен от возможных загрязняющих факторов (например, бактерий или бактериальных компонентов, например, с помощью фильтра).

Следует принимать во внимание, что при использовании композиций миметиков дозировки FN и ЕРО должны быть калиброваны, например, в соответствии с молярным значением. Такая калибровка является обычным расчетом для специалистов данной области.

Фармацевтические или косметические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут содержать эритропоэтин и фибронектин в совместном составе (таком как представленный в приведенном ниже примере 1) или в двух отдельных композициях.

Используемая в настоящем документе фраза «местное введение» относится к нанесению композиций в соответствии с настоящим изобретением на поверхность или к распределению таковых по поверхности организма, т.е. коже, волосистой части головы, волос, ногтей и т.п., предпочтительно на поверхность пораженной ткани (например, кожи), рану или на поверхность раны или диабетической язвы. При отличном от совместного составлении введение эритропоэтина и фибронектина может быть осуществлено параллельно или последовательно.

Следует принимать во внимание, что доза эритропоэтина и фибронектина, наносимых в соответствии с принципами настоящего изобретения, может варьировать. Таким образом, эритропоэтин может быть введен дозой от 10 до 30 мкг на см² ткани в зависимости от тяжести повреждения ткани или от раны, подлежащей лечению. Согласно одному варианту осуществления доза эритропоэтина составляет от 15 до 25 мкг на см² ткани. Согласно другому варианту осуществления доза эритропоэтина составляет приблизительно 20 мкг на см² ткани. Фибронектин может быть введен дозой от 100 до 300 мкг на см² ткани в зависимости от тяжести повреждения ткани или от раны, подлежащей лечению. Согласно одному варианту осуществления доза фибронектина составляет от 150 до 250 мкг на см² ткани. Согласно другому варианту осуществления доза фибронектина составляет приблизительно 200 мкг на см² ткани.

Согласно определенным вариантам осуществления доза вводимого эритропоэтина составляет от 0,1 до 10 мкг на см² ткани. Согласно другим вариантам осуществления доза вводимого фибронектина составляет от 10 до 100 мкг на см² ткани. Согласно некоторым вариантам осуществления дозу эритропоэтина и/или фибронектина адаптируют для применения в косметических средствах. Например, доза эритропоэтина и/или фибронектина может быть адаптирована для лечения поцарапанной кожи. Таким образом, составы в соответствии с настоящим изобретением также могут быть использованы в косметических целях и/или для заживления небольших ран как при лечении состояний кожи с небольшими или незначительными ранами в результате царапин, трещин мягкой кожи, акне и т.п., в качестве нескольких неограничивающих примеров. Таким образом, настоящее изобретение относится, в частности, к способу косметической обработки поцарапанной поверхности кожи путем нанесения достаточного количества композиций в соответствии с настоящим изобретением на поцарапанную поверхность кожи для косметической обработки поверхности, например, если поцарапанная поверхность кожи является результатом царапины, трещины мягкой кожи, акне и т.п.

Настоящее изобретение также относится к способу заживление поцарапанной поверхности кожи путем нанесения достаточного количества композиций в соответствии с настоящим изобретением на поцарапанную поверхность кожи для заживления поцарапанной поверхности кожи, например, если поцарапанная поверхность кожи является результатом царапины, трещины мягкой кожи, акне и т.п.

Композиции, включающие в себя эритропоэтин и/или фибронектин согласно вариантам осуществления, могут быть введены субъекту per se или в фармацевтической или косметической композиции. Согласно некоторым аспектам эритропоэтин и/или фибронектин согласно вариантам осуществления составляют в матрице. Согласно конкретным аспектам матрица представляет собой гель. Согласно другим конкретным вариантам осуществления гелем является гидрогель.

Используемая в настоящем документе фраза «фармацевтическая или косметическая композиция» относится к препарату активных ингредиентов, описываемых в настоящем документе, с другими химическими компонентами, такими как физиологически подходящие носители и вспомогательные средства. Задача композиции заключается в облегчении введения активных ингредиентов (например, ЕРО и FN) субъекту.

Используемый в настоящем документе термин «активный ингредиент» относится к композициям эритропоэтина и фибронектина, обеспечивающим предполагаемый биологический эффект (т.е. стимулирование заживления раны, реконструкцию соединительной ткани и лечение ишемии).

Далее в настоящем документе фразы «физиологически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемый носитель», которые могут применяться взаимозаменяемо, относятся к носителю или разбавителю, который не вызывает значительного раздражения у субъекта и не подавляет биологическую активность и свойства вводимых активных ингредиентов. Данные фразы предусматривают вспомогательное вещество.

В настоящем документе термин «вспомогательное средство» относится к инертному веществу, добавленному в композицию (фармацевтическую композицию или косметическую композицию) для дальнейшего облегчения введения активного ингредиента в соответствии с настоящим изобретением.

Методики для составления и введения лекарственных средств можно найти в "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., самое последнее издание, которое включено в настоящий документ посредством ссылки.

Композиция может быть составлена в виде единичной дозированной формы. В такой форме препарат делят на единичные дозы, содержащие соответствующие количества активных ингредиентов, такие как для однократного введения. Единичная дозированная форма может представлять собой упакованный препарат, упаковку, содержащую дискретные количества препарата, например, адгезивная повязка, неадгезивная повязка, салфетка, детская салфетка, марля, прокладка и гигиеническая прокладка.

Единичная дозированная форме в соответствии с принципами настоящего изобретения может содержать эритропоэтин при дозе приблизительно 10-30 мкг, фибронектин при дозе приблизительно 100-300 мкг или как эритропоэтин при дозе приблизительно 10-30 мкг, так и фибронектин при дозе приблизительно 100-300 мкг. Согласно одному варианту осуществления единичная дозированная форма содержит эритропоэтин при дозе приблизительно 15-25 мкг, фибронектин при дозе приблизительно 150-250 мкг или как эритропоэтин при дозе приблизительно 15-25 мкг, так и фибронектин при дозе приблизительно 150-250 мкг. Согласно другому варианту осуществления единичная дозированная форма содержит эритропоэтин при дозе приблизительно 20 мкг, фибронектин при дозе приблизительно 200 мкг или как эритропоэтин при дозе приблизительно 20 мкг, так и фибронектин при дозе приблизительно 200 мкг. Кроме того, единичная дозированная форма в соответствии с принципами настоящего изобретения может содержать эритропоэтин при дозе приблизительно 0,1-10 мкг, фибронектин при дозе приблизительно 10-100 мкг или как эритропоэтин при дозе приблизительно 0,1-10 мкг, так и фибронектин при дозе приблизительно 10-100 мкг.

Количество активного соединения в единичной дозе препарата можно варьировать или подбирать в соответствии с конкретным применением.

Композиции (например, фармацевтические или косметические композиции) в соответствии с настоящим изобретением могут быть нанесены локально, например, путем введения композиций непосредственно на участок ткани (например, рану) больного. Подходящие пути введения композиций, например, могут включать в себя местное (например, на ороговевшую ткань, такую как кожа, волос, ноготь, волосистая часть головы) и мукозальное (например, пероральное, вагинальное, глазное) введения.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением также могут быть применены посредством инъекционной композиции, включающей в себя активный ингредиент (например, ЕРО и FN) и физиологически приемлемый носитель. Для локального введения композиции могут быть введены инъекцией в рану и/или в здоровую кожу, которая окружает раненную кожу, или и туда, и туда.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть изготовлены с помощью процессов, хорошо известных в уровне техники, например, посредством процессов традиционного смешивания, растворения, гранулирования, дражирования, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, включения или лиофилизации.

Активный ингредиент также может иметь порошковую форму для составления с подходящей средой-носителем, например, раствором на основе стерильной апирогенной воды, перед применением.

Композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, могут быть составлены традиционным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включающих в себя вспомогательные средства и вспомогательные добавки, которые облегчают переработку активных ингредиентов в препараты. Соответствующий состав зависит от выбранного подхода введения.

Специалисты в данной области смогут легко определить терапевтически эффективное количество, особенно в свете подробного раскрытия, представленного в настоящем документе.

Для любого препарата, применяемого в способе в соответствии с настоящим изобретением, (терапевтически) эффективное количество или доза могут быть изначально установлены из in vitro анализов. Кроме того, доза может быть составлена в системах тканевых культур или с помощью животных моделей для достижения желаемой концентрации или титра. Такая информация может быть использована для более точного определения применимых для людей доз.

Токсичность и терапевтическая эффективность активных ингредиентов, описываемых в настоящем документе, могут быть определены с помощью стандартных фармацевтических процедур in vitro, в клеточных культурах или на экспериментальных животных. Данные, полученные из таких анализов in vitro и анализов в клеточной культуре, а также в исследованиях на животных, могут быть использованы в составлении диапазона дозировки для применения людям. Дозировка может варьировать в зависимости от используемой дозированной формы и используемого пути введения. Точный состав, путь введения и дозировка могут быть выбраны отдельным врачом с учетом состояния больного (см., например, Fingl, Е. et al. (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Ch. 1, p. 1).

В зависимости от тяжести состояния (например, площади, глубины и степени повреждения ткани, раны или ишемии) и чувствительности ткани введение дозы может быть однократным или множественным введением при курсе лечения с длительностью от нескольких суток до нескольких недель или до тех пор, пока не произойдет излечение или не уменьшится кожное состояние. Предпочтительно композиции в соответствии с настоящим изобретением вводят по меньшей мере один раз в сутки.

Количество композиции, подлежащей введению, конечно, будет зависеть от субъекта, подлежащего лечению, тяжести поражения, способа введения, решения лечащего врача и т.д.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением при необходимости могут быть представлены в упаковке или дозирующем устройстве, например, в одобренном FDA наборе, который может содержать одну или несколько единичных дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка, например, может содержать металлическую или пластиковую фольгу, например, блистерная упаковка. Упаковка или дозирующее устройство могут быть снабжены инструкциями по введению. Упаковка или дозирующее устройство также могут быть снабжены уведомлением в форме, предписанной государственным органом, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических препаратов, при этом в уведомлении отражено одобрение данным органом формы композиций для введения людям или для ветеринарного введения. Такое уведомление, например, может включать в себя маркировку, одобренную Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для отпускаемых по рецепту лекарственных средств, или одобренный л исток-вкладыш. Композиции, содержащие препарат в соответствии с настоящим изобретением, составленный в фармацевтически приемлемом носителе, также могут быть получены, помещены в соответствующий контейнер и маркированы для лечения указанного состояния, как более подробно описано выше.

Поскольку композиции в соответствии с настоящим изобретением используют in vivo, композиции предпочтительно являются в высокой степени чистыми и практически не содержат потенциально вредных примесей, например, имеют по меньшей мере степень чистоты для национального продукта (NF), обычно по меньшей мере аналитическую степень чистоты и предпочтительно по меньшей мере фармацевтическую степень чистоты. В случае, если данное соединение должно быть синтезировано перед применением, такой синтез или последующая очистка предпочтительно должны давать продукт, который практически не содержит каких-либо потенциально загрязняющих токсических средств, которые могли быть использованы во время процедур синтеза или очистки.

Дополнительные факторы могут быть включены в композиции или гели в соответствии с настоящим изобретением (т.е. эритропоэтин и фибронектин, описываемые в настоящем документе выше). Они включают в себя без ограничения компоненты внеклеточного матрикса (например, витронектин, ламинин, коллаген, эластин), факторы роста (например, FGF 1, FGF 2, IGF 1, IGF 2, PDGF, EGF, KGF, HGF, VEGF, SDF-1, GM-CSF, CSF, G-CSF, TGF альфа, TGF бета, NGF и ECGF), факторы, индуцируемые гипоксией (например, HIF-1 альфа и бета, а также HIF-2), гормоны (например, инсулин, гормон роста (GH), CRH, лептин, пролактин и TSH), ангиогенные факторы (например, ангиогенин и ангиопоэтин), факторы коагуляции и антикоагуляции (например, фактор I, фактор XIII, тканевой фактор, кальций, vWF, белок С, белок S, белок Z, фибронектин, антитромбин, гепарин, плазминоген, низкомолекулярный гепарин (Clixan), высокомолекулярный кининогенин (HMWK), прекалликреин, ингибитор активатора плазминогена-1 (PAIl), ингибитор активатора плазминогена-2 (PAI2), урокиназу, тромбомодулин, тканевой активатор плазминогена (tPA), альфа-2-антиплазмин и белок Z-зависимый ингибитор протеазы (ZPI)), цитокины (IL-1 альфа, IL-1 бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13 и INF-альфа, INF-бета и INF-гамма), хемокины (например, МСР-1 или CCL2), ферменты (например, эндогликозидазы, экзогликозидазы, эндонуклеазы, экзонуклеазы, пептидазы, липазы, оксидазы, декарбоксилазы, гидразы, хондроитиназы, хондроитиназу ABC, хондроитиназу АС, гиалуронидазу, кератиназу, гепараназы, вариант сплайсинга гепараназы, коллагеназу, трипсин, каталазы), нейротрансмиттеры (например, ацетилхолин и моноамины), нейропептиды (например, вещество Р), витамины (например, D-биотин, холина хлорид, фолиевую кислоту, мио-инозитол, ниацинамид, D-пантотеновую кислоту, соли кальция, пиридоксал.HCl, пиридоксин.HCl, рибофлавин, тиамин.HCl, витамин В 12, витамин Е, витамин С, витамин D, витамин В 1-6, витамин K, витамин А и витамин РР), углеводы (например, моно/ди/полисахариды, в том числе глюкозу, маннозу, мальтозу и фруктозу), ионы, хелаторы (например, хелаторы Fe, хелаторы Са), антиоксиданты (например, витамин Е, кверцетин, поглотители супероксидов, супероксиддисмутазу), поглотители Н₂О₂, поглотители свободных радикалов, поглотители Fe), жирные кислоты (например, триглицериды, фосфолипиды, холестерины, свободные жирные кислоты и связанные жирные кислоты, жирный спирт, линолевую кислоту, олеиновую кислоту и липоевую кислоту), антибиотики (например, пенициллины, цефалоспорины и тетрациклины), анальгетики, анестетики, противобактериальные средства, противодрожжевые средства, противогрибковые средства, противовирусные средства, пробиотические средства, противопротозойные средства, противозудные средства, противодерматитные средства, противорвотные средства, противовоспалительные средства, противогиперкератолитические средства, антиперспиранты, противопсориатические средства, противосеборейные средства, антигистаминные средства, аминокислоты (например, незаменимые и заменимые (от А до Z), особенно, глутамин и аргинин), соли (например, пируватные соли и сульфатные соли), сульфаты (например, сульфат кальция), стероиды (например, андрогены, эстрогены, прогестагены, глюкокортикоиды и минералокортикоиды), катехоламины (например, эпинефрин и норэпинефрин), нуклеозиды и нуклеотиды (например, пурины и пиримидины), простагландины (например, простагландин Е2), лейкотриены, эритропоэтины (например, тромбопоэтин), протеогликаны (например, сульфат гепарана, сульфат кератана), гидроксиапатиты (например, гидроксиапатит (Са₁₀(PO₄)₆(ОН)₂)), гаптоглобины (Hp.1-1, Нр2-2 и Hp 1-2), супероксиддисмутазы (например, SOD 1/2/3), оксиды азота, доноры оксида азота (например, нитропруссид, Sigma Aldrich, St. Louis, Mo., USA, глутатионпероксидазы, гидратирующие соединения (например, вазопрессин), клетки (например, тромбоциты), клеточную среду (например, M199, DMEM/F12, RPMI, Iscovs), сыворотку крови (например, сыворотку крови человека, сыворотку крови эмбрионов крупного рогатого скота, сыворотку крови эмбрионов телят), буферы (например, HEPES, бикарбонат натрия), детергенты (например, Tween), дезинфицирующие средства, травы, фруктовые экстракты, овощные экстракты (например, капусты, огурца), цветочные экстракты, растительные экстракты, флавоноиды (например, гранатовый сок), специи, листья (например, зеленого чая, ромашки), полифенолы (например, красного вина), мед, лектины, микрочастицы, наночастицы (липосомы), мицеллы, карбонат кальция (СаСО₃, например, осажденный карбонат кальция, измельченный/перемолотый в порошок карбонат кальция, альбакар, PCC, GCC), кальцит, лиместон, мраморную крошку, измельченный известняк, известняк, мел (например, белый мел, бледно-палевый мел, французский мел) и кофакторы, такие как ВН4 (тетрагидробиобтерин).

Композиция в соответствии с настоящим изобретением также может содержать ингредиенты, вещества, элементы и материалы, включающие в себя водород, алкильные группы, арильные группы, галогеновые группы, гидроксигруппы, алкоксигруппы, алкиламиногруппы, диалкиламиногруппы, ацильные группы, карбоксильные группы, карбамидогруппы, сульфонамидогруппы, аминоацильные группы, амидные группы, аминовые группы, нитрогруппы, селенорганические соединения, углеводороды и циклические углеводороды.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть объединена с веществами, такими как бензолпероксид, сосудосуживающие средства, сосудорасширяющие средства, салициловая кислота, ретиноевая кислота, азелаиновая кислота, молочная кислота, гликолевая кислота, циануровая кислота, таннины, бензилиденкамфора и ее производные, альфа-гидрокси, поверхностно-активные вещества.

Композиции в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения могут быть биоконъюгированы с полиэтиленгликолем (например, PEG, SE-PEG), который сохраняет стабильность (например, против протеазных активностей) и/или растворимость (например, в биологических жидкостях, таких как кровь, пищеварительный сок) активных ингредиентов (т.е. композиций ЕРО и/или FN в соответствии с настоящим изобретением) с сохранением при этом их биологической активности и пролонгированием их времени полужизни.

Кроме фармацевтически эффективного количества средства, раскрываемого в настоящем документе, композиции в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения также включают в себя дерматологически приемлемый носитель.

Фраза «дерматологически приемлемый носитель» относится к носителю, который подходит для местного нанесения на кожу, т.е. на ороговевшую ткань, обладает хорошими эстетическими свойствами, является совместимым с активными средствами в соответствии с настоящим изобретением и любыми другими компонентами, а также является безопасным и нетоксическим для применения млекопитающим.

Для усиления чрескожной абсорбции активных ингредиентов (например, эритропоэтина и/или фибронектина в соответствии с настоящим изобретением) одно или несколько из ряда средств могут быть добавлены в композиции, в том числе без ограничения диметилсульфоксид, диметилацетамид, диметилформамид, поверхностно-активные вещества, азон, спирт, ацетон, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль.

Носитель, используемый в композициях в соответствии с настоящим изобретением, может иметь обширный ряд форм. Они включают в себя эмульсионные носители, в том числе без ограничения эмульсии масло-в-воде, вода-в-масле, вода-в-масле-в-воде и масло-в-воде-в-силиконе, крем, мазь, водной раствор, лосьон, мыло, пасту, эмульсию, гель, спрей или аэрозоль. Как будет понятно специалисту в данной области, данный компонент будет распространяться преимущественно либо в водной, либо в масляной/силиконовой фазе в зависимости от растворимости/диспергируемости в воде компонента в композиции.

Эмульсии в соответствии с настоящим изобретением, как правило, содержат фармацевтически эффективное количество средства, раскрываемого в настоящем документе, и липид или масло. Липиды и масла могут быть получены из животных, растений или нефти и могут быть натуральными или синтетическими (т.е. сделанными человеком). Примеры подходящих эмульгаторов описаны, например, в патенте США №3755560, выданном Dickert, et al. 28 августа 1973 года, патенте США №4421769, выданном Dixon, et al. 20 декабря 1983 гожда, и в McCutcheon's Detergents and Emulsifiers, North American Edition, pages 317-324 (1986), каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте.

Эмульсия также может содержать противовспенивающее средство для минимизации вспенивания при нанесении на ороговевшую ткань. Противовспенивающие средства включают в себя высокомолекулярные силиконы и другие материалы, хорошо известные в уровне техники для такого применения.

Подходящие эмульсии могут характеризоваться обширным диапазоном вязкостей в зависимости от желаемой формы продукта.

Примеры подходящих носителей, содержащих эмульсии масло-в-воде, описаны в патенте США №5073371, Turner, D.J. et al., выданном 17 декабря 1991 года, и в патенте США №5073372, Turner, D.J. et al., выданном 17 декабря 1991 года, каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте. Особенно предпочтительная эмульсия масло-в-воде, содержащая структурирующее средство, гидрофильное поверхностно-активное вещество и воду, подробно описывается далее в настоящем документе.

Предпочтительная эмульсия масло-в-воде содержит структурирующее средство для обеспечения образования жидкокристаллической гелевой сетчатой структуры. Не ограничиваясь теорией, полагают, что структурирующее средство помогает в обеспечении реологических характеристик композиции, которые способствуют стабильности композиции. Структурирующее средство также может функционировать как эмульгатор или поверхностно-активное вещество.

Также в настоящем документе применим широкий ряд анионных поверхностно-активных веществ. См., например, патент США №3929678, Laughlin et al., выданный 30 декабря 1975 г., который включен посредством ссылки во всей своей полноте. Кроме того, также в настоящем документе применимы амфотерные и цвиттерионные поверхностно-активные вещества.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены в любой из ряда форм, используемых в фармацевтической промышленности, для нанесения на кожу, в том числе растворы, лосьоны, спреи, кремы, мази, бальзамы, гели, масла, средство для промывания и т.д., как описывается ниже.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены достаточно вязкими, чтобы оставаться на обработанном участке коже, чтобы легко не испаряться и/или чтобы легко не удаляться при ополаскивании водой, но удаляться с помощью мыла, очищающих средств и/или шампуней.

Способы получения композиций, обладающих такими свойствами, хорошо известны специалистам в данной области и подробно описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990 (supra); и Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed., Williams & Wilkins (1995).

Местные композиции в соответствии с настоящим изобретением, в том числе без ограничения лосьоны и кремы, могут содержать дерматологически приемлемое мягчительное средство. Используемый в настоящем документе термин «мягчительное средство» относится к материалу, применимому для предупреждения или облегчения сухости, а также для защиты кожи. Обширные диапазоны подходящих мягчительных средств известны и могут быть применены в настоящем документе. См., например, Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, pp. 3243 (1972), которая содержит многочисленные примеры материалов, подходящих в качестве мягчительного средства и полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Предпочтительным мягчительным средством является глицерин.

Лосьоны и кремы в соответствии с настоящим изобретением, как правило, содержат систему-носитель в виде раствора и одно или несколько мягчительных средств.

Наносимая местным путем композиция в соответствии с настоящим изобретением также может включать в себя дополнительные компоненты, которые добавляют, например, для обогащения композиций ароматизирующим веществом и факторами питания кожи.

Такие компоненты выбирают подходящими для применения на ороговевшей ткани человека без индуцирования токсичности, несовместимости, нестабильности, аллергической реакции и подобного с медицинской точки зрения. Кроме того, такие необязательные компоненты применимы при условии, что они не изменяют неприемлемым образом эффект активных соединений в соответствии с настоящим изобретением.

В CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992) описан широкий ряд неограничивающих косметических ингредиентов, обычно применяемых в отрасли ухода за кожей, которые подходят для применения в композициях в соответствии с настоящим изобретением. Примеры этих классов ингредиентов включают в себя абразивы, абсорбенты, эстетические компоненты, такие как ароматизирующие вещества, пигменты, окрашивающие средства/красители, летучие масла, вещества, усиливающие чувствительность кожи, вяжущие средства и т.д. (например, гвоздичное масло, ментол, камфара, эвкалиптовое масло, эвгенол, ментил лактат, дистиллят гамамелиса), средства против акне, средства против обезвоживания, противовспениватели, противобактериальные средства (например, йодпропилбутилкарбамат), антиоксиданты, связующие, биологические добавки, буферные средства, увеличивающие объем средства, хелатирующие средства, химические добавки, красители, косметические вяжущие средства, косметические биоциды, денатурирующие средства, вяжущие лекарственные средства, наружные анальгетики, пленкообразующие соединения или материалы, например, полимеры, для содействия формированию пленки и субстантивности композиции (например, сополимер эйкозена и винилпирролидона), замутняющие компоненты, регуляторы рН, газы-вытеснители, восстановители, секвестранты, кондиционирующие средства для кожи (например, увлажнители, в том числе смешанные и окклюзивные), средства для смягчения и/или заживления кожи (например, пантенол и его производные (например, этилпантенол), алоэ вера, пантотеновая кислота и ее производные, аллантоин, бисаболол и глицирризинат калия двойной), средства для лечения кожи, загустители, а также витамины и их производные.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть нанесены непосредственно на кожу. В качестве альтернативы, они могут быть доставлены путем обычного нанесения на кожу с помощью различных систем доставки чрескожных лекарственных средств, которые известны в уровне техники, таких как чрескожные пластыри, которые высвобождают композицию в кожу путем медленного высвобождения. Другие системы доставки лекарственных средств, известные в уровне техники, включают в себя аэрозольный баллон под давлением, ионтофорез или сонофорез. Ионтофорез используют для усиления проницаемости кожи и облегчения чрескожной доставки. В патентах США №№5667487 и 5658247 раскрывается ионно-звуковой аппарат, подходящий для опосредованного ультразвуком-ионтофорезом транспорта терапевтических средств через кожу. В качестве альтернативы или дополнения, липосомы или мицеллы также могут быть использованы в качестве среды-носителя для доставки.

Поскольку раны и ишемия могут захватывать кожу волосистой части головы, композиции в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включают в себя мягчительные средства, поверхностно-активные вещества и/или кондиционеры, которые подходят для применения на коже волосистой части головы и волосах.

Мягчительные средства включают в себя без ограничения углеводородные масла и воски, такие как минеральное масло, вазелин и подобные, растительные и животные масла и жиры, такие как оливковое масло, пальмовое масло, касторовое масло, кукурузное масло, соевое масло и подобные, а также ланолин и его производные, такие как ланолин, ланолиновое масло, ланолиновый воск, ланолиновые спирты и подобные. Другие мягчительные средства включают в себя сложные эфиры жирных кислот с 10-20 атомами углерода, таких как миристиновая, стеариновая, изостеариновая, пальмитиновая и подобные, например, метилмиристат, пропилмиристат, бутилмиристат, пропилстеарат, пропилизостеарат, пропилпальмитат и подобные. Другие мягчительные средства включают в себя жирные кислоты с 10-20 атомами углерода, в том числе стеариновую, миристиновую, лауриновую, изостеариновую, пальмитиновую и подобные. Мягчительные средства также включают в себя жирные спирты с десятью - двадцатью атомами углерода, такие как цетиловый, миристиловый, лауриловый, изостеариловый, стеариловый и подобные.

Эмульгатор/поверхностно-активное вещество предпочтительно используют при составлении композиций в соответствии с настоящим изобретением для применения на волосах.

Примеры поверхностно-активных веществ включают в себя без ограничения продукты конденсации полиоксиалкиленоксида с гидрофобными алкильными, алкеновыми или алкильными ароматическими функциональными группами, имеющими свободный реакционно способный водород, доступный для конденсации с гидрофильным алкиленоксидом, полиэтиленоксидом, пропиленоксидом, бутиленоксидом, полиэтиленоксидом или полиэтиленгликолем. Особенно эффективными являются продукты конденсации октилфенола с от приблизительно 7 до приблизительно 13 молями этиленоксида, продаваемого Rohm & Haas Company под товарным знаком для серий их продуктов TRITON 100®.

Другие ингредиенты, такие как ароматизирующие вещества, стабилизирующие средства, красители, противомикробные средства, противобактериальные средства, антиагломеранты, поглотители ультрафиолетового излучения и подобные, также включают в композицию согласно вариантам осуществления.

Кондиционирующее средство, приемлемое для кислотного гидролиза, такое как кремнийорганическое соединение, имеющее по меньшей мере один фрагмент четвертичного аммония вместе с этоксилированным монокватом, также предпочтительно используют для стабилизации и необязательно загущения композиции согласно вариантам осуществления.

Материалы, которые могут быть использованы для обеспечения непрозрачности композиций, в соответствии с настоящим изобретением включают в себя сложные эфиры жирных кислот, замутняющие полимеры, такие как стирольные полимеры, например, OPACIFIER 653™ от Morton, International, Inc., и жирные спирты. Далее следует неограничивающий перечень жирных спиртов: цетиловый спирт; стеариловый спирт; цетеариловый спирт; бегениловый спирт и арахидиловый спирт. Кондиционирующие композиции в соответствии с настоящим изобретением, которые являются непрозрачными, также могут включать в себя Lexamine S-13, хлорид дицетиламмония и цетеарет-20.

Согласно конкретному варианту осуществления состав эритропоэтина и фибронектина содержит приблизительно 10-30 мкг/мл эритропоэтина и приблизительно 100-300 мкг/мл фибронектина, приблизительно 0,20% метилпарабена, приблизительно 9% лаурета, изопарафина и полиакриламида, приблизительно 12% деионизированной воды и до 100% раствора фосфатного буфера.

Согласно следующему варианту осуществления состав эритропоэтина и фибронектина содержит эритропоэтин (ЕРО) (5% масса/масса), фибронектин (FN) (30% масса/масса), глицерин (5%, масса/масса), Carbomer 940 (1%, масса/масса), бензиловый спирт (ВА) (2%, масса/масса), триэтаноламин (0,9%, масса/масса), метилпарабен (0,2%, масса/масса), пропилпарабен (РР) (0,05%, масса/масса) и воду (до 100%, масса/масса).

Согласно следующим вариантам осуществления состав или композиция эритропоэтина и фибронектина содержит эритропоэтин при концентрации, имеющей любое значение от 0,01% до 30% (масса/масса), фибронектин при концентрации, имеющей любое значение от 0,01% до 50% (масса/масса), глицерин при концентрации, имеющей любое значение от 0,01% до 30% (масса/масса), Carbomer 940 при концентрации, имеющей любое значение от 0,01% до 30% (масса/масса), бензиловый спирт при концентрации, имеющей любое значение от 0,01% до 30% (масса/масса), триэтаноламин при концентрации, имеющей любое значение от 0,01% до 30% (масса/масса), метилпарабен при концентрации, имеющей любое значение от 0,01% до 30% (масса/масса), пропилпарабен при концентрации, имеющей любое значение от 0,01% до 30% (масса/масса), и воду при концентрации, имеющей любое значение от 0,01% до 100% (масса/масса).

Таким образом варианты осуществления в соответствии с настоящим изобретением относятся к местным композициям для стимулирования ангиогенеза и заживления раны.

Следует принимать во внимание, что композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в комбинации с другими применяемыми в настоящее время терапевтическими средствами, такими как без ограничения фото/световая терапия (например, Dermanwand™ для ухода за раной от National Biological Corp. Beachwood, Ohio) и ультразвуковая терапия (см., например, патент США №6960173).

Предполагают, что за время действия патента, полученного на основании настоящей заявки, будет разработано много соответствующих композиций эритропоэтина и фибронектина, и объем термина «композиции эритропоэтина и фибронектина» включает в себя все эти новые технологии a priori.

Используемый в настоящем документе термин «приблизительно» относится к ± 10%.

Композиции и составы эритропоэтина и фибронектина описаны в US 2014/0154205 A1 («Композиции эритропоэтина и фибронектина для терапевтических и косметических применений»), а также в US 2010/0310626 A1 («Композиции эритропоэтина и фибронектина для регенерации костей"), содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

III. Примеры

Следующие примеры приводятся для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Специалистам в данной области будет понятно, что методики, раскрываемые в следующих примерах, представляют собой методики, разработанные автором настоящего изобретения для осуществления настоящего изобретения на практике, и, таким образом, могут считаться предпочтительными способами для его осуществления. Однако в свете настоящего раскрытия специалистам в данной области будет понятно, что могут быть выполнены многочисленные изменения в конкретных раскрываемых вариантах осуществления, и могут быть получены аналогичные или сходные результаты без отступления от принципов и объема настоящего изобретения.

Пример 1

Четыре свиньи - две свиньи с DM и две контрольных свиньи - завершили 14-суточный период исследования. Две диабетических свиньи имели в значительной степени более высокие содержания глюкозы в крови и гликозилированного гемоглобина (HbA1c) и более низкую массу тела, чем две контрольных свиньи. Местная обработка ожогов содержащими среду-носитель, FN, ЕРО и EPO/FN гелями не изменяла (а) количество красных кровяных клеток, лейкоцитов или тромбоцитов и повышенное содержание глюкозы в крови у диабетических свиней и (b) содержания гемоглобина крови и HbA1c у контрольных и диабетических свиней (таблица 1).

Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение, (n) - число свиней. Статистическую значимость устанавливают при 5%. *р < 0,05 и показывает значимость различия в группе от дня 0, 7 до дня 14, NS - отсутствие значимости; RBC - красные кровяные клетки; HbA1c - гликированный гемоглобин.

ЕРО при местном введении ускоряет закрытие раны и усиливает кровоток в регенерирующейся коже при диабетических ранах зависимым от дозы образом, и данный эффект усиливается FN. Обработанные ЕРО, обработанные FN и обработанные EPO/FN диабетические раны закрывались быстрее, чем обработанные средой-носителем диабетические раны. Наиболее значимые различия в скоростях закрытия раны выявляли между обработанными средой-носителем и обработанными EPO/FN диабетическими ранами начиная с дня 4. Начиная с дня 4 скорость закрытия раны обработанных EPO/FN ран была значительно выше скорости закрытия обработанных FN и обработанных ЕРО диабетических ран. Начиная с дня 9 скорость закрытия раны обработанных ЕРО диабетических ран была выше скорости закрытия обработанных FN диабетических ран (фиг. 1А).

Скорость закрытия раны обработанных средой-носителем диабетических ран была значительно ниже скорости закрытия обработанных средой-носителем ран здорового организма. Скорости закрытия раны обработанных ЕРО диабетических ран были зависимыми от дозы. Скорости закрытия раны обработанных высокой дозой ЕРО диабетических ран были значительно выше скоростей закрытия обработанных низкой дозой ЕРО диабетических ран. Кроме того, скорости закрытия раны обработанных низкой дозой ЕРО диабетических ран были значительно выше скоростей закрытия обработанных средой-носителем диабетических ран (фиг. 1В).

Кровоток в обработанных средой-носителем диабетических ранах меньше такового в обработанных средой-носителем недиабетических ранах начиная с дня 2. Выяснили, что кровоток в обработанной ЕРО диабетической ране значительно не отличался от такового в обработанных EPO/FN диабетических ранах, и эти два кровотока был значительно выше такового в обработанных средой-носителем и обработанных FN диабетических ранах (фиг. 1С; правая панель). Кровоток в обработанных высокой дозой ЕРО диабетических ранах был значительно выше такового в обработанных средой-носителем диабетических ранах начиная с дня 4 и такового в обработанных низкой дозой ЕРО диабетических ранах начиная с дня 7. Кровоток в обработанных низкой дозой ЕРО диабетических ранах был значительно выше такового в обработанных средой-носителем диабетических рана начиная с дня 9 (фиг. 1D; правая панель).

FN при местном введении не влияет на закрытие раны и кровоток в регенерирующейся коже при недиабетических ранах. Скорости закрытия раны и кровотока в обработанных средой-носителем и обработанных FN ранах здоровых свиней были очень похожи. Начиная с дня 4 скорости закрытия раны и кровотока в обработанных ЕРО недиабетических ранах были значительно выше таковых в обработанных средой-носителем и обработанных FN недиабетических ранах. Интерес представляет то, что наиболее значимые различия в скоростях закрытия раны и кровотока выявляли между обработанными EPO/FN ранами и обработанными средой-носителем, обработанными FN и обработанными ЕРО ранами у здоровых свиней за период от дня 4 до дня 11 (фиг. 2А и 2В).

ЕРО при местном введении увеличивает микрососудистую плотность (MVD) и экспрессию eNOS в регенерирующейся коже при диабетических ранах, и данные эффекты усиливается FN. Уровни MVD и экспрессии eNOS в обработанных средой-носителем диабетических ранах были ниже таковых в обработанных средой-носителем недиабетических ранах через 14 суток (фиг. 3А-Е). Местная обработка FN в течение 14 суток не оказывала эффекта на уровни MVD и экспрессии eNOS в диабетических и недиабетических ранах (фиг. 3В-Е). С другой стороны, местная обработка ЕРО в течение 14 суток значительно повышала уровни MVD и экспрессии eNOS в диабетических и недиабетических ранах (фиг. 3В-Е). В обработанных EPO/FN недиабетических ранах уровни MVD и экспрессии eNOS значительно не отличались от таковых в обработанных ЕРО недиабетических ранах (фиг. 3В и 3D). Напротив, уровни MVD и экспрессии eNOS в обработанных EPO/FN диабетических ранах были значительно выше таковых в обработанных ЕРО диабетических ранах (фиг. 3С и 3Е).

ЕРО при местном введении усиливает накопление коллагена и синтез гиалуроновой кислоты (НА) в регенерирующейся коже диабетических ран, и данный эффект усиливается FN. Количества гидроксипролина (HP) и НА, а также уровни экспрессии двух НА-синтаз HAS1 и HAS2 в обработанных средой-носителем диабетических ранах были ниже таковых в обработанных средой-носителем недиабетических ранах через 14 суток (фиг. 4А-G). Местная обработка FN в течение 14 суток не изменяла количества HP и НА и уровни экспрессии HAS1 и HAS2 в диабетических и недиабетических ранах (фиг. 4В-G). С другой стороны, местная обработка ЕРО в течение 14 суток значительно повышала количества HP и НА и уровни экспрессии HAS1 и HAS2 в диабетических и недиабетических ранах (фиг. 4В-G). Количества HP в обработанных EPO/FN недиабетических и диабетических ранах были значительно выше таковых в обработанных ЕРО недиабетических и диабетических ранах, соответственно (фиг. 4А-С). Количество НА и уровни экспрессии HAS1 и HAS2 в обработанных EPO/FN недиабетических ранах были очень похожи на таковые в обработанных ЕРО недиабетических ранах (фиг. 4D и 4F). Напротив, количество НА и уровни экспрессии HAS1 и HAS2 в обработанных EPO/FN диабетических ранах были значительно выше таковых в обработанных ЕРО диабетических ранах (фиг. 4Е и 4G).

Экспрессия AQP3 снижается в диабетической коже без раны. Уровни экспрессии AQP3 в коже без раны у диабетической свиньи были ниже таковых в коже без раны у здоровой свиньи (фиг. 5А-D). Уровни экспрессии белка AQP3 в коже без раны у диабетической свиньи были значительно ниже (р < 0,01) таковых в коже без раны у здоровой свиньи (фиг. 5Е & 5G). Данный результат также отражался в уровнях экспрессии mRNA AQP3: урони экспрессии mRNA AQP3 в диабетической коже без раны были значительно ниже (р < 0,01) таковых в коже без раны у здоровой свиньи (фиг. 5F).

ЕРО при местном введении стимулирует экспрессию AQP3 в регенерирующейся коже диабетических ран, и данный эффект усиливается FN. Через 14 суток уровни экспрессии белка AQP3 и mRNA в обработанных средой-носителем диабетических ранах были значительно ниже таковых в обработанных средой-носителем недиабетических ранах (фиг. 6А-Н). У диабетических и контрольных свиней экспрессия белка AQP3 и mRNA (а) в обработанных ЕРО ранах была значительно выше таковой в обработанных средой-носителем и обработанных FN ранах, (b) в обработанных EPO/FN ранах была значительно выше таковой в обработанных ЕРО ранах, и (с) в обработанных средой-носителем и обработанных FN ранах не отличалась (фиг. 6А-6Н).

Экспрессия белка AQP3 положительно коррелирует со степенью ангиогенеза и количествами HP и НА в регенерирующейся коже диабетических ожоговых ран. Корреляцию Пирсона использовали для исследования взаимосвязей между уровнями экспрессии белка AQP3, степенью ангиогенеза и количествами HP и НА в ожоговых ранах у здоровых и диабетических свиней. У диабетических и здоровых свиней уровни экспрессии белка AQP3 положительно коррелировали со степенью ангиогенеза (фиг. 7А и 7В), количеством HP (фиг. 1С и 7D) и количеством НА (фиг. 7Е и 7F). Представляет интерес то, что данные корреляции были значительно сильнее в регенерирующейся коже ожоговых ран у диабетических свиней, чем найденные в регенерирующейся коже ожоговых ран у здоровых свиней.

Ингибирование AQP3 снижает эффект ЕРО при местном введении в отношении скорости закрытия раны, степени ангиогенеза и количеств HP и НА в диабетических ожоговых ранах. Если активность AQP3 блокируется с помощью HgCl₂, то скорости закрытия раны обработанных EPO/HgCl₂ диабетических ран в сутках были значительно снижены (фиг. 8А). Такое снижение скорости закрытия раны сопровождалось пониженным кровотоком (фиг. 8В), низкими уровнями экспрессии eNOS (фиг. 8С), низкими уровнями экспрессии HAS1 и HAS2 (фиг. 8С), низкой степенью ангиогенеза (фиг. 8D), пониженным количеством HP (фиг. 8Е) и пониженным количеством НА (фиг. 8F). Более того, скорости закрытия раны, уровни экспрессии eNOS, HAS1 и HAS2, а также количества HP и НА в обработанных EPO/HgCl₂ диабетических ранах были значительно ниже таковых в обработанных ЕРО диабетических ранах.

Высокое содержание глюкозы подавляет экспрессию AQP3 в кератиноцитах и фибробластах, полученных из человеческой кожи, и данный эффект блокируется ЕРО. Скорость пролиферации HEKC и NHFC, которые подвергали воздействию высоких содержаний глюкозы (HG) в течение пяти суток, была ниже таковой у клеток, которые подвергали воздействию нормальных содержаний глюкозы (NG) (фиг. 9А и 9В). Уровни экспрессии AQP3 в клетках, которые подвергали HG, были существенно ниже таковых в клетках, которые подвергали HG (фиг. 9С и 9D). Обработка ЕРО восстанавливала нормальные уровни экспрессии AQP3 и скорость пролиферации клеток, которые инкубировали в HG в течение пяти суток.

Способы

Свиная модель DM 1 типа. Исследование предусматривало четрые 60-кг самки здоровых свиней (Sus domesticus), которых приобретали в Lahav Institute of Animal Research Institute (Kibbutz Lahav, Israel). Свиней выбирали в качестве экспериментальных животных для данного исследования, поскольку заживление кожной раны у свиней подобно таковому у людей (Sullivan, 2001). Свиней размещали поодиночке в загонах в помещении с искусственным 12-часовым циклом свет/темнота при постоянном температурном диапазоне (24±2°С) и относительной влажности (55±10%). Свиней акклиматизировали в течение одной недели до исследования и обеспечивали свободный доступ к стандартному лабораторному корму и воде. Содержание и условия жизни свиней соответствовали (а) рекомендациям по условиям жизни и гуманному обращению с животными, которые изложены в "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", 7^th edition, National Academies Press, Washington DC, USA, и (b) рекомендациям Technion, которые соответствуют национальному законодательству Израиля об использовании животных для экспериментальных и других научных целей.

Индуцирование DM, создание ожоговых ран, обработку ран, замену повязок и сбор данных выполняли под общей анестезией, поскольку очень трудно было очищать, обрабатывать и перевязывать ран у пребывающих в сознании свиней без обездвиживания. Общую анестезию индуцировали с использованием внутривенно вводимого пропофола (5 мг/кг), а затем поддерживали с использованием 5% изофлурана в смеси 2:1 кислорода/оксида азота после эндотрахеальной интубации. Внутривенный катетер перманентно помещали четырем свиньям в правую яремную вену под общей анестезией для забора образцов крови в ходе исследования и инфузии жидкостей в ходе индуцирования DM у двух свиней. Частоту сердечных сокращений и насыщение крови кислородом у анестезированных свиней контролировали с использованием неинвазивной ушной оксиметрии, а температуру тела свиней контролировали с использованием цифрового ректального термометра. После всех процедур обеспечивали восстановление свиней от анестезии на операционном столе, экстубировали, а затем возвращали в их загоны. В день 14 - последний день эксперимента - свиней анестезировали для сбора данных и образцов, а затем гуманно умертвляли внутривенной инъекцией KCl (2 ммоль/кг; 40 мл) и избыточной дозой изофлурана (5%).

DM индуцировали у двух свиней в соответствии с описанным ранее протоколом (Нага, 2008). Вкратце, свиней не кормили на протяжении ночи, а затем гидратировали внутривенным 0,9% NaCl (10 мл/кг/час) в течение одного часа перед введением стрептозотоцина (STZ; Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA). STZ (200 мг/кг) растворяли в 0,9% NaCl и вводили внутривенно через имплантированную внутривенную канюлю за одну минуту. Содержание глюкозы в крови проверяли каждые 15 минут в течение шести часов после введения STZ с использованием глюкометра (FreeStyle FREEDOM Lite, Abbot Diabetes Care Inc., Alameda, CA, USA). Глюкозу (50 г растворяли в 100 мл воды) вводили внутривенной инфузией либо постоянно, либо периодически на протяжении первых двух часов после введения STZ, чтобы избежать тяжелой гипогликемии, которая могла быть вызвана острым индуцированным STZ поражением β-клеток поджелудочной железы. Содержание глюкозы в крови проверяли по меньшей мере два раза в сутки с помощью глюкометра на протяжении периода исследования. Индуцирование DM считали успешным, если содержание глюкозы в крови равнялось или превышало 300 мг/дл через шесть часов после введения STZ и сохранялись на протяжении 14-суточного периода исследования. Инсулин длительного действия (24 IU Lantus; Aventis Pharmaceuticals, Kansas City, Mo, USA) вводили внутривенной инъекцией для поддержания содержания глюкозы в крови натощак у диабетических свиней от 300 до 400 мг/дл.

Создание поверхностных ожоговых кожных ран. DM под держивали в течение одного месяца перед созданием поверхностных ожоговых кожных ран под анестезией. После анестезирования щетину на коже спины с каждой стороны позвоночного столба у каждой свиньи удаляли с использованием депиляторного крема VEET (Reckitt Benckiser pic, Slough, Berkshire, UK). Затем кожу очищали водой и сушили тканью перед созданием 12-см² округлых поверхностных ожоговых кожных ран на очищенной коже спины у свиньи с использованием асептической методики. Ожоговые раны создавали с использованием ранее описанного способа (Davis, 1990). Вкратце, четыре цилиндрических латунных стержня, каждый диаметром ~2,25 см и массой 358 г, помещали в горячую воду (92°С) на две минуты. Создавали четыре группы из шести поверхностных ожоговых ран путем помещения стержня перпендикулярно на кожу спины каждой анестезированной свиньи на 20 секунд без дополнительного давления. У двух диабетических свиней создавали дополнительную группу из шести поверхностных ожоговых ран. Перед приложением нагретого стержня к коже срежень вытирали насухо для предупреждения образования ожога паром на коже от капель испаряющейся воды.

Составы ЕРО для обработки раны путем местного введения. Шесть разных гелей для обработки раны путем местного введения получали в лаборатории Remedor Biomed в соответствии с рекомендациями Фармакопеи Соединенных Штатов Америки: (a) гель, который не содержал активные ингредиенты (гель со средой-носителем), (b) гель, который содержал 2000 МЕ/г ЕРО (высокая доза ЕРО), (с) гель, который содержал 500 МЕ/г ЕРО (низкая доза ЕРО), (d) гель, который содержал 300 мкг/г FN, (е) гель, который содержал 2000 МЕ/г ЕРО и 300 мкг/г FN, и (f) гель, который содержал 0,1 мМ HgCl₂ и 2000 МЕ/г ЕРО. Рекомбинантный человеческий ЕРО приобретали в виде инъекции (EPREX® 40000 ME, Janssen Cilag Bucks, UK). FN приобретали в виде 1 мг/мл раствора (EMD Millipore, Billerica, Massachusetts, USA). HgCl₂ (0,1 мМ) включали в гель, который содержал 2000 МЕ/г ЕРО для блокирования кожной активности AQP3 в ранах (отрицательный контроль) и был приобретен у Sigma (Sigma-Aldrich, USA). Результаты тестирования стабильности гелей показали, что ЕРО и FN являются стабильными в геле по меньшей мере в течение трех месяцев при 4°С, как определяли с помощью ELISA.

Состав композиции, применяемой в примерах

Способ получения состава

Состав получали следующим образом.

1. Метилпарабен (MP) и пропилпарабен (РР) отвешивали в аналитический стакан и растворяли в глицерине и бензиловом спирте (ВА).

2. Добавляли 1/3 размера порции WFI и взбалтывали при 60°С в течение 30 минут с использованием нагревающей плиты и верхней мешалки.

3. Смесь охлаждали со взбалтыванием до 30°С.

4. Медленно добавляли необходимое количество Carbomer 940 при взбалтывании без нагревания.

5. Добавляли ЕРО в смесь и перемешивали в течение 10 минут.

6. Добавляли FN в смесь и перемешивали в течение 10 минут.

7. Регулировали рН до 6,5±0,3 путем добавления достаточного количества триэтаноламина.

8. Добавляли достаточное количество WFI до получения необходимой массы.

9. Смешивали в течение 30 минут при комнатной температуре.

Получение предпочтительной партии геля для местного введения из Carbopol 9403000 МЕ/г (грамм), эритропоэтина (ЕРО) и 300 мкг/г (грамм) фибронектина (FN)

*Согласно результатам биологической активности (от СоА или исходного тестирования).

ВА = биологическая активность (МЕ/мл).

Масса = 300000/Х.

Способ получения. Готовили необходимое количество каждого ингредиента для общего количества. Каждый ингредиент аккуратно взвешивали. Общее количество метилпарабена и пропилпарабена смешивали с глицерином и бензиловым спиртом. В смесь добавляли приблизительно 40 граммов воды, смесь хорошо смешивали в течение 30 минут и нагревали до 60°С. Carbopol 940р медленно добавляли каплями в энергично взбалтываемую смесь и хорошо смешивали при 30°С. Добавляли весь ЕРО в смесь, которую затем хорошо смешивали в течение 10 минут. Потом добавляли FN в смесь, которую затем хорошо смешивали в течение 10 минут. Достаточно триэтаноламина добавляли в смесь, которую затем смешивали до получения желаемой вязкости после подтверждения отсутствия сгустков Carbopol 940р в смеси. Добавляли достаточно воды до общего количества 100 г (граммов) и смесь хорошо смешивали. Затем гель упаковывали во флаконы Эппендорфа по 1 г (грамму) в каждом. Затем флаконы помечали с указанием номера партии, дня приготовления и условия хранения. Отбирали образец 30 г (граммов) геля для тестов на предмет стабильности и микробиологии и распределяли следующим образом: а. 20 г (граммов) при 4°С для тестов Elisa, b. 10 граммов при 4°С для микробиологических тестов.

Обработка ран различными составами ЕРО для местного введения. Каждой группе из шести поверхностных ожоговых ран рандомно назначали обработку одним из следующих гелей для местного введения: содержащий среду-носитель гель, содержащий высокую дозу ЕРО гель, содержащий FN гель и содержащий EPO/FN гель. Дополнительную группу ожоговых ран у одной диабетической свиньи обрабатывали содержащим EPO/HgCl₂ гелем, а дополнительную группу ожоговых ран у второй диабетической свиньи обрабатывали содержащим низкую дозу ЕРО гелем (низкая доза ЕРО). Гель (3 г) наносили местно на каждую рану каждые двое суток на протяжении 14-суточного периода исследования. Для предупреждения удаления геля после его нанесения с помощью втирания и для защиты ожоговых ран, между обработками обрабатываемые раны покрывали неадгерентными марлевыми салфетками, которые закрепляли эластичной лейкопластырной повязкой Tensoplast (Smith & Nephew, London, UK). Послеоперационные анальгетики и антибиотики не вводили, поскольку данные лекарственные средства могли влиять на процесс заживления и тем самым искажать интерпретацию данных.

Параметры исследования. Каждую свинью взвешивали в начале и в конце 14-суточного периода исследования, а также на протяжении периода исследования. Каждый день обработки каждую рану фотографировали с использованием 12-мегапиксельной цифровой камеры (Olympus, Styles Tough, Tokyo, Japan) и собирали образец крови для поределения количеств красных кровяных клеток, лейкоцитов и тромбоцитов, а также содержаний гемоглобина в плазме и HbA1c. Собирали биоптаты с помощью бритвенной биопсии 6-мм дискообразным лезвием из произвольно выбранных участков регенерирующейся кожи обработанных средой-носителем и обработанных объектом тестирования ожоговых ран и неповрежденной кожи у диабетических и недиабетических свиней в дни 2, 7 и 14. Образцы каждого биоптата фиксировали непосредственно в 10% нейтральном забуференном формалине для гистологического определения MVD (см. ниже для получения подробного описания) или хранили в жидком азоте для определения содержаний белков с использованием иммуногистохимии, анализа вестерн-блоттинга, ELISA и ПНР (см. ниже для получения подробного описания).

Определение скорости закрытия раны. Скорость закрытия раны вычисляли из площади реэпителиализированной ткани в ожоговой ране. Для вычисления скорости площадь каждой ожоговой раны подразделяли на три области (а) область струпа, на которой обожженная кожа покрывается жесткой коркой после получения ожогового поражения, (b) красная область, на которой струп может отделяться, но эпителиальные клетки отсутствуют, и (с) белая область, на которой струп может отделяться, и имеются новые эпителиальные клетки. Скорость закрытия раны вычисляли путем измерения белой области в дни 2, 4, 7, 9, 11 и 14 при обработке ран и замене повязки. Для этого прозрачную бумагу помещали на каждую рану и обводили очертание белой области на бумаге. Затем прозрачную бумагу накладывали на разлинованную 1-мм² бумагу для измерения белой области раны. Зависимые от времени изменения размера белой области вычисляли с использованием следующей формулы:

Все измерения белой области выполнялись тремя исследователями слепым методом в отношении варианта обработки.

Определение кровотока в ожоговых ранах. Кровоток в ранах измеряли неинвазивно с помощью системы визуализация перфузии лазерным доплеровским методом (PeriScan PIM 2 System, Perimed, Stockholm, Sweden) в начале и в конце 14-суточного периода исследования и на протяжении периода исследования. Сканирование ран выполняли при следующих настройках: длина волны лазера - 670 нм (видимая красная область), расстояние от ожоговых ран - 25 см, скорость при разрешении сканирования - 256×64 пикселей и длительность сканирования - 180 секунд. Зонд сканера размещали почти перпендикулярно к коже, чтобы предотвратить отражение лазерного луча от неактуальных областей, как это рекомендовано в руководстве к устройству. Для каждой ожоговой раны параметр перфузии, индекс перфузии, измеренной лазерным доплеровским методом, который линейно измеряют с перфузией ткани, вычисляли по отражению лазерного луча от движущихся эритроцитов. Перфузию в представляющем интерес участке (ROI) измеряли по шкале из шести цветов, среди которых темно-синий изображает наименьшую скорость перфузии, а красный изображает наибольшую скорость перфузии, с использованием программного обеспечения PIMSoft для визуализации перфузии крови (Lisca Development АВ, Linkoping, Sweden). Для каждой ожоговой раны ROI представлял собой 12-см² круг, который был нарисован вокруг первоначальной ожоговой раны, а кровоток в ране представляет собой среднее значение всех цветов в ROI.

Определение степени ангиогенеза в регенерирующейся коже тканей ожоговых ран. CD31 представляет собой адгезионную молекулу, которая экспрессируется клетками сосудистого эндотелия и широко применяется в качестве маркера для демонстрации присутствия эндотелиальных клеток и заново образованных капилляров в тканях. Этот маркер использовали для определения MVD и степени ангиогенеза в регенерирующейся коже заживающих ран. Для этой цели получали срезы толщиной 5 мкм выдерживаемых в формалине полученных бритвенными биопсиями образцов ран, которые собирали в дни 2, 7 и 14, и помещали на предметные стекла для окрашивания на CD31. Вкратце, образцы заливали в парафиновые блоки, депарафинированы с использованием ксилена, регидратировали в сериях ступенчато изменяющихся растворов пропанола (100-0%) в дважды деионизированной воде (ddH₂O), а затем их погружали в забуференный Tri физиологический раствор (TBS, рН 7,5) на пять минут. После обработки с помощью TBS эндогенную пероксидазу в срезах блокировали путем погружения предметных стекол в раствор 3% пероксида водорода/метанола на 20 минут. Предметные стекла затем ополаскивали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и погружали в 10 мМ раствор цитратного буфера (рН 6,0) при 90°С на 10 минут для выявления антигена микроволновым нагреванием. Предметные стекла сначала блокировали 1:50 нормальной сывороткой крови козы (Sigma) в течение 30 минут для устранения неспецифического окрашивания антигеном, ополаскивали в PBS, а затем инкубировали на протяжении ночи при 4°С в темноте с 1:100 антителом против CD31 (R&D Systems, MN, USA). После инкубации на протяжении ночи предметные стекла ополаскивали в PBS и докрашивали гематоксилином Майера (Sigma) в течение десяти секунд перед применением 1% уксусной кислоты для дифференцирования тканевого среза и ополаскиванием проточной водопроводной водой. Предметные стекла осматривали под прямым микроскопом Nikon Eclipse Е800, получали изображения срезов и анализировали с помощью программного обеспечения для анализа изображений Metamorph® (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA). Трое исследователей подсчитывали число капилляров в регенерирующейся коже на каждом участке раны на пяти рандомных микроскопических полях (×200 увеличение) слепым методом в отношении варианта обработки.

Выявление AQP3 в регенерирующейся коже в тканях ожоговых ран. AQP3 выявляли в коже без раны здоровой и диабетической свиней через один месяц после индуцирования DM и через один день после создания ожоговых ран, а также в регенерирующейся коже ран на протяжении 14-суточного периода исследования с помощью иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализа. Для иммуногистохимического анализа AQP3 получали срезы толщиной 5 мкм из образцов, которые собирали из кожи без ран недиабетической и диабетической свиней и в день 2, 7 и 14 из регенерирующейся кожи на протяжении 14-суточного периода исследования и помещали на предметные стекла способом, идентичным описанному для окрашивания на CD31. Срезы сначала блокировали 1:50 сывороткой крови козы (Sigma) в течение 30 минут, осторожно ополаскивали с помощью PBS и инкубировали на протяжении ночи при 4°С в темноте с 1:200 кроличьим поликлональным первичным антителом против AQP3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). После инкубации на протяжении ночи предметные стекла ополаскивали в PBS и инкубировали с 1:400 биотинилированным вторичным антителом IgG (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации срезы осторожно промывали с помощью PBS и инкубировали со стрептавидинпероксидазой (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Выявление антигена облегчали с использованием S-(2-аминоэтил)-1-цистеина (AEC/RED; Invitrogen Corp. Camarillo, CA, USA) в качестве субстрата до тех пор, пока не наблюдали проявление цветного сигнала. Предметные стекла затем ополаскивали непосредственно с помощью PBS и докрашивали раствором гематоксилина Майера (Sigma) в течение десяти секунд перед применением 1% уксусной кислоты в PBS для дифференцирования тканевых срезов. Затем срезы ополаскивали в проточной водопроводной воде и дегидратировали в сериях ступенчато изменяющегося этанола в течение пяти минут перед их помещением в Immu-Mount (Thermo Scientific, Pittsburgh, USA). Изображения срезов анализировали с помощью программного обеспечения для анализа изображений Metamorph®, как описано ранее.

Для подтверждения присутствия AQP3 с помощью иммунофлуоресценции в коже без ран здоровой и диабетической свиней и в регенерирующейся коже ран другую серию депарафинизированных срезов инкубировали с 1:100 кроличьим поликлональным антителом против AQP3 (Santa Cruz) на протяжении ночи при 4°С. После инкубации предметные стекла осторожно промывали проточной водой, инкубировали с 1:200 конъюгированным с родамином вторичным антителом IgG (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре, а затем докрашивали красителем для ядер TOPRO-3 (Invitrogen) в течение 30 минут. По окончании инкубации с TOPRO-3 предметные стекла осматривали под конфокальным микроскопом (Bio-Rad MRC 1024, CA, USA) после осторожного промывания в PBS. Изображения срезов анализировали с помощью программного обеспечения для анализа изображений Metamorph®, как описано ранее.

Выявление коллагена в регенерирующейся коже в тканях ожоговых ран. Количество коллагена в регенерирующейся коже определяли в образцах, которые собирали в дни 2, 7 и 14 после трихромного окрашивания по методу Массона (Sigma-Aldrich) нескольких из срезов толщиной 5 мкм, которые получали для иммуноокрашивания на CD31 и AQP3. С использованием данного способа коллагеновые волокна окрашивали синим, ядра окрашивали черным, а цитоплазму и мышечные волокна окрашивали красным. Изображения срезов анализировали с помощью программного обеспечения для анализа изображений Metamorph®, как описано ранее.

Определение количества коллагена в регенерирующейся коже в тканях ожоговых ран. Гидроксипролин (HP) является аминокислотным компонентом коллагена I типа и часто применяется в качестве маркера коллагена. Следовательно, количество HP в образцах кожи, которые собирали у здоровых и диабетических свиней в дни 2, 7 и 14, использовали в качестве индикатора количества коллагена в регенерирующейся коже ожоговых ран. Для этой цели 100-мг образцы кожи гомогенизировали в PBS, который содержал полный коктейль ингибитора протеазы (Sigma-Aldrich, МО, USA), с использованием гомогенезатора для ткани (HG-300; MRC, Holon, Israel). Гомогенаты сначала центрифугировали при 1500 g в течение пяти минут при 4°С. Супернатант собирали, фильтровали через фильтровальную бумагу Whatman Grade 540 (Sigma-Aldrich), гидролизировали в HCl, а затем разбавляли неионизированной водой. Аликвоты (2 мкл) разбавленного раствора сначала смешивали с раствором хлорамина-Т перед добавлением п-диметил-амино-бензальдегида с использованием ранее описанного протокола (Hamed, 2009). Аликвоты (150 мкл) полученного в результате раствора затем переносили в микротитровальный планшет и поглощение каждого образца измеряли на устройстве для считывания флуоресценции в микропланшетах при 557 нм. Результаты выражали как среднее процентное отношение измерений в трех повторностях количества HP в обработанных средой-носителем ожоговых ранах у здоровых свиней (100%).

Определение количества НА в регенерирующейся коже в тканях ожоговых ран. Поскольку НА связана с прочностью и гидратацией кожи, количество НА в регенерирующейся коже в тканях ожоговых ран определяли в образцах, которые собирали у недиабетических и диабетических свиней в дни 2, 7 и 14 с использованием Hyaluronan Quantikine ELISA Kit (R&D Systems) в соответствии с протоколом изготовителя. Вкратце, аликвоты (150 мкл) идентичных разбавленных растворов, которые получали для определения количества НА в регенерированной коже ожоговых ран переносили в микротитровальный планшет. Поглощение каждого образца затем измеряли на устройстве для считывания флуоресценции в микропланшетах при 450 нм с настройкой коррекции длины волны на 570 нм. Результаты выражали как среднее процентное отношение измерений в трех повторностях количества НА в обработанных средой-носителем ожоговых ранах у здоровых свиней (100%).

Определение уровней экспрессии AQP3, eNOS, HAS1 и HAS2 в регенерирующейся коже в тканях ожоговых ран с помощью анализа вестерн-блоттинга. Поскольку экспрессия AQP3 в регенерирующейся коже связана с гидратацией кожи, исследовали эффект ЕРО в отношении AQP3 и гидратации клеток в основании ожоговой рани, так как AQP3 облегчает поступление воды в клетки. Поскольку НА связана с прочностью и гидратацией кожи, исследовали эффект ЕРО в отношении экспрессии HAS1 и HAS2, так как НА является ключевой молекулой, вовлеченной в увлажнение кожи, и синтезируется с помощью HAS1 и HAS2. Поскольку в регенерирующейся коже происходит ангиогенез, исследовали эффект ЕРО в отношении экспрессии eNOS, так как eNOS является преобладающей изоформой NOS в сосудистой системе, и уровень ее экспрессии указывает на степень ангиогенеза. Уровни экспрессии AQP3, eNOS, HAS1 и HAS2 определяли в регенерирующейся коже в тканях ожоговых ран, которую собирали у здоровых и диабетических свиней в день 14. Вкратце, образцы сначала гомогенизировали в PBS, который содержал полный коктейль ингибитора протеазы (Roche Applied Science), а затем лизировали в буфере RIPA. Использовали электрофорез в SDS-полиакриламидном геле для разделения белков в 40-мкг образцах белков из лизата. Разделенные белки затем переносили на нитроцеллюлозные мембраны, которые сначала инкубировали на протяжении ночи с 1:100 поликлонального антитела против AQP3, 1:150 моноклонального антитела против eNOS, 1:100 моноклонального антитела против HAS1 и 1:100 моноклонального антитела против HAS2 (все из которых приобретали у Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) в темноте при 4°C, а затем инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) вторичным антителом IgG (Jackson ImmunoResearch, Europe) в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. α-Актин (Santa Cruz) использовали для нормализации белковой нагрузки. Уровни экспрессии белков выявляли с помощью денситометрии с использованием системы для выявления хемилюминесценции Bio-Rad Immune-Star HRP (Bio-Rad, USA). Результаты выражали как процентное отношение среднего содержания белков считываний в двух повторностях в обработанных средой-носителем ожоговых ранах у здоровых свиней (100%).

ПЦР в режиме реального времени (RT) для количественного определения уровней mRNA AQP3. RT-PCR использовали для исследования того, что эффект ЕРО в отношении экспрессии AQP3 является результатом его эффекта в отношении гена AQP3. Образцы регенерирующейся кожи из тканей ожоговых ран у диабетических и здоровых свиней собирали в день 14 и гомогенизировали в PBS. Общую РНК экстрагировали из гомогенатов с использованием набора для очистки РНК MasterPure (EPICENTER Biotechnologies, Madison, WI, USA). Для каждого образца приблизительно 2 мкл РНК обратно транскрибировали в трех повторностях с использованием смесей реагентов для обратной транскрипции Absolute QPCR и набора Verso cDNA Reverse Transcriptase, все из которых приобретали у ABgene, UK.

Количественное определение экспрессии гена AQP3 в образцах регенерирующейся кожи выполняли с помощью RT-PCR с использованием SYBR Green PCR Master Mix (Molecular Probes, Eugene, OR) в циклере Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science, Sydney, Australia). Стандартный основанный на построении кривой способ использовали для оценивания эффективности ПЦР и вариации между анализами. Условия термического циклирования были следующими: один цикл (10 минут при 95°С), затем 40 циклов (30 секунд при 95°С, 1 минуту при 60°С и 30 секунд при 72°С), затем один цикл (1 минуту при 95°С, 30 секунд при 55°С и 30 секунд при 95°С). Использовали 2^-ΔΔСТ способ для анализа относительных изменений в экспрессии гена AQP3 в обработанных объектом тестирования, обработанных средой-носителем и необработанных образцах ткани, которые собирали из недиабетических и диабетических ран. Результаты выражали как процентное изменение от контроля после нормализации к эндогенному эталонному гену (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; GAPDH).

Клеточные культуры. Первичные человеческие эпидермальные кератиноциты (HEKC) и первичные человеческие фибробласты (NHFC), все из которых получали из крайней плоти новорожденных (Cell Systems, Kirkland, WA, USA), экспрессируют AQP3. Эти два типа клеток по отдельности размножали в покрытых коллагеном 1 типа колбах в среде CSC (Cell Systems), которую дополняли 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мкг/мл амфотерицина. Определяли их способность к пролиферации в присутствии концентраций NG (5 ммоль/мл D-глюкозы) и концентраций HG (30 ммоль/мл D-глюкозы) и ЕРО (100 МЕ/мл), поскольку AQP3, как считают, важен для их пролиферации. Для этой цели клетки сначала собирали, переносили в лунки (~100000 клеток/лунка) покрытых коллагеном 1 типа 24-луночных планшетов, которые содержали среду CSC с 10% FBS, а затем подвергали воздействию концентраций HG без ЕРО или с ЕРО (100 МЕ/мл) в течение пяти суток в увлажненном инкубаторе, который настраивали на 5% СО₂ и 37°С. Чрез пять суток измеряли пролиферацию HEKC и NHFC с использованием анализа МТТ (Sigma) в соответствии с протоколом изготовителя. Выполняли три повторности данного анализа и результаты выражали как среднее процентное отношение ± стандартное отклонение (SD) скорости пролиферации контрольных необработанных клеток (100%). Экстракты белков двух типов клеток получали для определения уровней экспрессии AQP3 с использованием анализа вестерн-блоттинга, как описано ранее. Анализ иммунофлуоресценции использовали для локализации AQP3 в адгерентных HEKC и NHFC. Для этой цели клетки сначала фиксировали в 2% параформальдегиде, а затем инкубировали с 1:100 кроличьим поликлональным антителом против AQP3 (Santa Cruz) при 4°С в течение двух часов. После инкубации клетки осторожно промывали в PBS перед их инкубацией с 1:200 конъюгированным с родамином вторичным антителом IgG (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре. Затем ядра клеток докрашивали с помощью TOPRO-3 (Invitrogen) в течение 30 минут. После докрашивания с помощью TOPRO-3 клетки осторожно промывали в PBS, а затем осматривали под конфокальным микроскопом (Bio-Rad MRC 1024, CA, USA). Изображения окрашенных клеток анализировали с помощью программного обеспечения для анализа изображений Metamorph®, как описано ранее.

Статистическая характеристика. Все статистические анализы выполняли с использованием компьютерной статистической программы (GraphPad Prism, версия 5.0, GraphPad Software Inc, CA, USA) и все данные представляли как среднее или процентное отношение ± SD. Статистическую значимость устанавливали при 5%. Использовали двусторонний t-критерий Стьюдента для сравнения параметров исследования здоровых и диабетических свиней, а двухфакторный ANOVA с коррекцией Бонферрони с контролем ошибки I рода использовали для множественных сравнений. Коэффициент корреляции Пирсона использовали для определения взаимосвязей между экспрессией белка AQP3 и (а) ангиогенезом, представленным с помощью MVD, (b) содержанием коллагена, представленным количеством HP, и (с) количеством НА в регенерирующейся коже в тканях ожоговых ран. Скорости закрытия раны в группах сравнивали и анализировали с использованием однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Тьюки и двухфакторным ANOVA с коррекцией Бонферрони с контролем ошибки I рода для множественных сравнений. Данные от здоровых и диабетических свиней сравнивали с использованием двустороннего t-критерия Стьюдента.

Обсуждение. Заживление DSU замедляется по причине ухудшенного ангиогенеза, пониженной активности клеток кожи и усиленного воспалительного ответа. Следовательно, развиваются хронические раны, а тяжелых случаях может произойти потеря конечности. Ранее сообщали, что ЕРО при местном введении ускоряет заживление ран во всю толщу кожи у диабетических мышей и крыс посредством нескольких механизмов, которые включают в себя (а) стимуляцию ангиогенеза, (b) повышенное накопление коллагена, (с) подавление воспалительного ответа и (d) сниженный клеточный апоптоз в основании раны (10, 11) (Hamed, 2010; 2011). Был открыт новый механизм, посредством которого ЕРО при местном введении ускоряет заживление диабетической кожной раны: нанесенный местным введением ЕРО усиливает экспрессию AQP3 в основании раны у здоровых и диабетических свиней.

Повышающиеся уровни экспрессии AQP3 в ожоговых ранах диабетических свиней после местной обработки ЕРО отражают положительный эффект ЕРО в отношении ангиогенеза и количеств HP и НА и приводят к ускоренному закрытию раны. Поскольку автор настоящего изобретения обнаружил, что экспрессия AQP3 снижается в коже без раны у диабетической свиньи, было сделано предположение, что низкое содержание клеточного AQP3 лежит в основе, по меньшей мере частично, отсутствия заживления DSU. Кроме того, также обнаружили, что (а) уровни экспрессии AQP3 в обработанных HG кератиноцитах и фибробластах были ниже таковых в обработанных NG кератиноцитах и фибробластах, и (b) способность обработанных HG кератиноцитов и фибробластов к пролиферации была ниже таковой у обработанных NG кератиноцитов и фибробластов. Представляет интерес то, что лечение с ЕРО может блокировать этот отрицательный эффект HG в отношении кератиноцитов и фибробластов. Эти данные предполагают, что содержания HG нарушают экспрессию AQP3 в кожных клетках и обеспечивают in vitro подтверждение для экспериментальных результатов авторов настоящего изобретения на коже свиней с DM. Хотя и выдвигаются возможные объясняющие механизмы, автор настоящего изобретения не намерен углубляться в такие теории.

Выяснили, что уровни экспрессии AQP3 ассоциируются со скоростью закрытия раны в диабетических кожных ранах. Все больше доказательств свидетельствует о том, что дефицит AQP3 в регенерирующейся коже DSU уменьшает миграцию и пролиферацию эпителиальных клеток и приводит к пониженной реэпителиализации и замедленному заживлению раны (Levin, 2006; Sigomoto, 2012). Сообщали, что миграция, пролиферация и реэпителиализация корнеальных эпителиальных клеток стимулируется с помощью AQP3 (Levin, 2006). Также сообщали, что подавленная экспрессия AQP может быть причиной снижения почечной концентрационной способности при острой почечной недостаточности, и что ЕРО может предупреждать данное подавление (Gong, 2004). Следовательно, установили, что стимуляция локальной экспрессии AQP3 в DSU с помощью ЕРО может ускорять заживление раны. Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что гипотеза авторов настоящего изобретения подтверждает гипотезу о том, что местная обработка ЕРО ожоговых повреждений кожи диабетических свиней ускоряет их заживление за счет зависимого от AQP3 механизма путем стимуляции ангиогенеза и продуцирования ЕСМ. Результаты данного исследования также свидетельствуют о том, что стимуляция экспрессии AQP3 в незаживающей язве с помощью ЕРО дополнительно ускоряет заживление за счет усиления гидратации клеток и повышения содержания влаги в ране. Усиление гидратации клеток и повышение содержания влаги облегчают взаимодействия между различными типами клеток и компонентами ЕСМ. Такие взаимодействия приводят к соответствующим клеточным перемещению, миграции и дифференцировке и, в конечном счете, к восстановлению интактной кожи.

Ангиогенез, синтез компонентов ЕСМ, таких как коллаген и НА, и надлежащая гидратация клеток в основании раны являются необходимыми для нормального заживления раны. ЕРО стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток и секрецию ангиогенных цитокинов и факторов роста, таких как фактор роста сосудистого эндотелия, фактор роста фибробластов и подобный инсулину фактор роста-1 из эндотелиальных клеток и кератиноцитов, чтобы вызывать прорастание новых кровеносных сосудов в основании раны (Anagnostou, 1990). В данном исследовании выяснили, что местная обработка ЕРО раны существенно усиливает кровоток в регенерирующейся коже диабетических ожоговых ран, как измеряли с помощью сканирования лазерным доплеровским методом. Данный эффект подтверждали при измерении MVD и уровней экспрессии eNOS в регенерирующейся коже диабетических ожоговых ран: MVD и уровни экспрессии eNOS в регенерирующейся коже обработанных ЕРО диабетических ожоговых ран были выше таковых в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем диабетических ожоговых ран. Местная обработка ЕРО также приводила к значительно повышенным количествам HP и НА в диабетических ожоговых ранах. Vedrenne сообщал о существовании тесной взаимосвязи между ЕСМ и синтезом молекул, которые регулируют присоединения клеток и ЕСМ, ангиогенез, заживление кожной раны и обновление резидентных дермальных фибробластов (Vedrenne, 2012). Гидратация клеток и влажная среда имеют решающее значение для облегчения обновления фибробластов, ангиогенеза и реэпителиализации кератиноцитами при заживлении раны. Поэтому, любой фактор или событие, которые предупреждают или ограничивают локальную экспрессию и/или активацию белка AQP3, могут снижать уровень гидратации клеток и ухудшать заживление раны. Коллаген и НА имеют много функций в ЕСМ, одной из которых является тканевый каркас для поддержания клеточной формы и дифференцировки, поддержания движения и миграции клеток, а также обеспечения возможности для ЕСМ в дермальном слое сопротивляться сжатию.

НА является высокогидрофильной молекулой и это свойство позволяет регулировать гидратацию ткани по причине привлечения и связывания воды. Обнаружили, что уровни экспрессии AQP3 были пониженными в коже без раны у диабетических свиней. Также выяснили, что помимо пониженного ангиогенеза и низких количеств HP и НА уровни экспрессии AQP3 в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем ожоговых ран у диабетических свиней были ниже таковых в регенерирующейся коже обработанных средой-носителем ожоговых ран у здоровых свиней. Также обнаружили, что местная обработка ЕРО значительно повышала ангиогенез и количества HP и НА в диабетических ранах, и что такие повышения сопровождались значительным повышением уровней экспрессии AQP3. Также обнаружили, что ингибирование AQP3 с помощью HgCl₂ в ожоговых ранах диабетических свиней антагонизировало положительные действия ЕРО, и данный результат означает, что опосредованная ЕРО стимуляция AQP3 может стимулировать заживление раны при DM. Кроме того, также выяснили, что уровни экспрессии AQP3 коррелировали со степенью ангиогенеза и количествами HP и НА в обработанных ЕРО ожоговых ранах у здоровых и диабетических свиней. Также открыли, что такие корреляции были сильнее в обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ранах у диабетических свиней, чем таковые в обработанных ЕРО и обработанных EPO/FN ожоговых ранах у здоровых свиней. Поскольку (а) ЕРО оказывает положительный эффект в отношении экспрессии AQP3 в регенерирующейся коже ран у диабетических свиней, и (b) корреляции между уровнями экспрессия AQP3 и степенью ангиогенеза, а также количествами HP и НА в тканях раны перед и после местной обработки являются сильными, можно заключить, что индуцированное ЕРО ускорение заживления опосредуется зависимым от AQP3 механизмом(ами). Если такой(такие) механизм(ы) активировать, то стимулируются ключевые события процесса заживления раны, а именно ангиогенез, синтез коллагена и НА, а также реэпителиализация, и скорость закрытия раны повышается.

О сниженной экспрессии AQP3 в регенерирующейся коже при заживлении ран во всю толщу кожи у диабетических крыс сообщали Sugimoto et al, 2012. Hara-Chikuma и Verkman также сообщали о том, что содержание воды и эластичность рогового слоя являются более низкими, и что заживление раны и ЕСМ биосинтез являются более медленными у нокаутных по AQP3 мышей, чем у мышей дикого типа (Hara-Chikuma, 2008а). Представляет интерес то, что экспрессия AQP3 в человеческой коже повышается при некоторых кожных заболеваниях, таких как атопическая экзема и карциномы кожи (Hara-Chikuma, 2008b), а также при кожных ожоговых ранах (Sebastian, 2015). Эти данные означают, что AQP3 является ключевым фактором в эпидермальной биологии, восстановление кожи после повреждения усиливается при стимулировании AQP3.

Кроме того, обнаружили, что низкая скорость закрытия раны при диабетических ранах ассоциируется с пониженным ангиогенезом и низкими количествами HP и НА в основании раны. Также обнаружили, что пониженная способность у обработанных HG HEKC и NHBC к пролиферации ассоциируется с пониженными уровнями экспрессии AQP3 в клетках. Эти данные означают, что пониженные уровни экспрессии AQP3 объясняются концентрациями HG и лежат в основе сниженной пролиферации кератиноцитов и фибробластов при DM. Поскольку также выяснили, что неблагоприятные эффекты концентраций HG в отношении клеточной пролиферации и экспрессии AQP3 предупреждаются с помощью ЕРО, эти данные свидетельствуют о том, что ЕРО ускоряет заживление диабетических ран посредством зависимого от AQP3 механизма(ов), который(ые) оберегает(ют) ткань от некоторых эффектов концентраций HG.

Другими представляющими данными было то, уровни экспрессии AQP3 в обработанных EPO/FN диабетических ранах были в четыре раза выше таковых в обработанных ЕРО диабетических ранах. Такое существенное повышение уровней экспрессии AQP3 в обработанных EPO/FN диабетических ранах ассоциируется с высокими скоростями закрытия раны и повышенным кровотоком, а также с двукратным увеличением MVD и количеств HP и НА в тканях раны. FN и фибрин являются двумя важными компонентами временной матрицы, которая поддерживает макрофаги, фибробласты, и ангиогенеза (Stadelmann, 1998). Надлежащее образование временной матрицы и грануляционной ткани обеспечивает реэпителиализацию и закрытие раны (Martin, 1997). При DM дефицит FN и/или его разрушение протеазами приводит к дезинтеграции временной матрицы, и реэпителиализация не происходит или замедляется. Ранее сообщали о том, что заживление местно обработанных EPO/FN кожных ран у диабетических мышей быстрее такового в местно обработанных ЕРО кожных ранах у диабетических мышей (Hamed, 2011). FN выполняет существенно важную функцию в образовании грануляционной ткани в ходе пролиферативной фазы заживления раны. Отсюда автор настоящего изобретения установил, что экзогенный FN может восстанавливать нормальную временную матрицу в диабетических ранах. Обнаружили, что FN отдельно не оказывает эффекта на скорость закрытия раны, скорость кровотока, степень ангиогенеза и количества HP и НА в ожоговых ранах у здоровых свиней. Кроме того, открыли, что экзогенный FN не усиливает ускоряющее действие ЕРО в отношении заживления ожоговых рана у здоровых свиней, так как эндогенный FN присутствует с нормальным содержанием и не разрушается у здоровых свиней. Поскольку эндогенный FN разрушается в DSU, желательно включать FN в содержащий ЕРО гель, так как FN усиливает лечебные действия содержащего ЕРО геля.

Автор настоящего изобретения, таким образом, продемонстрировал, что местное нанесение ЕРО на диабетическую рану ускоряет реэпителиализацию и повышает скорость закрытия раны, таким образом, на основании данных, полученных от диабетических свиней, предполагают, что местное нанесение ЕРО может быть терапевтически полезным для стимулирования заживления DSU за счет повышения уровней экспрессии AQP3 в коже.

Пример 2. Лечение хронических диабетических язв у людей

Состав из примера 1 тестировали для определения эффективности в лечении хронических диабетических язв у больного человека. У больного мужского пола возрастом 77 лет з диагнозом сахарного диабета, гипертензии и гиперлипидемии выявили диабетическую язву на дорсальной, медиальной части правой стопы. Поражение составляло приблизительно 9,6 см² (см. фиг. 13, панель «до»).

Параметры больного

Пол:	мужской
Возраст:	77 лет
Этническая принадлежность:	североафриканец
Курение:	не курит
Анамнез заболевания:	сахарный диабет, гипертензия, гиперлипидемия
Рост:	176 см
Масса:	96 кг
BMI:	30,99 кг⋅м-2
ABI:	0,76 (умеренная обструкция)
Гемоглобин:	12,3 г/дл
НСТ:	36,5%
RBC:	4,13×108/мкл
Количество тромбоцитов:	169×103/мкл
Глюкоза:	159 мг/дл

Сопутствующие лекарственные препараты (на момент исследования)

Амлодипин:	с 2015 года
Метформин:	с 2015 года
Правастатин:	с 2013 года
Cartia:	с 2002 года
Эналадекс:	с 2012 года

Диабетическая язва стопы

Локализация:	дорсальное, медиальное расположение
Площадь:	9,6 см2
Анамнез:	более 2 месяцев без улучшения
Тип по Вагнеру:	I

Аэробные бактерии (Pseudomonas aeruginosa)

Рану осторожно очищали перед нанесением композиции в день 1. Композицию из примера 1 наносили местно на рану пять суток в неделю при дозировке 0,25 г/см² раны в соответствии с площадью язвы в день обработки. Лечение длилось в течение почти восьми недель (55 суток) и предусматривало 36 местных нанесений композиции из примера 1 до полного закрытия раны, что было диагностировано врачом. Лечение осуществлялось в доме больного приходящей медсестрой. Больной посещал амбулаторное отделение еженедельно для оценивания язвы, прохождения тестов и оценок. На фиг. 13 (панель «после») представлена фотография полностью закрытой раны после 8 недель лечения.

Лечение композицией из примера 1 на протяжении восьми недель не оказывало какого-либо заметного системного эффекта, т.е. не вызывало существенных изменений в параметрах крови или в кровяном давлении. Некоторые из параметров представлены ниже в таблице 3.

Побочные эффекты

Наблюдали гипергрануляцию после трех недель лечения. Ее расценивали как незначительный побочный эффект. Из-за этого лечение приостановили на 3 суток, при этом было пропущено три суточных нанесения лекарственного средства. После интервала в трое суток эффект гипергрануляции снизился, и лечение продолжили. Никаких дальнейших признаков гипергрануляции не наблюдали до конца курса лечения.

Заключение

Лечение больного K. с помощью RMD-G1 было безопасным и эффективным. Наблюдали полное закрытие хронической диабетической раны за восемь недель лечения.

Все из способов, раскрываемых и заявляемых в настоящем документе, могут быть выполнены и осуществлены без излишних экспериментов в соответствии с настоящим раскрытием. Несмотря на то, что композиции и способы в соответствии с настоящим изобретением описаны в контексте предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области будет понятно, что могут быть использованы вариации в способах и в стадиях или в последовательности стадий способа, описываемого в настоящем документе, без отступления от концепции, принципов и объема настоящего изобретения. Более конкретно, будет понятно, что описываемые в настоящем документе средства можно заменить некоторыми средствами, которые являются как химически, так и физиологически родственными, при этом будут достигнуты те же или подобные результаты. Все подобные замещения и модификации, очевидные специалистам в данной области, считаются предусматриваемыми принципами, объемом и концепцией настоящего изобретения, определяемыми прилагаемой формулой изобретения.

Ссылки

Следующие ссылки, в той мере, в какой они предоставляют типичные процедурные или другие подробности в дополнение к подробностям, изложенным в настоящем документе, специально включены в настоящий документ посредством ссылки.

Agre, et al. "The aquaporins, blueprints for cellular plumbing systems." J Biol Chem. 1998; 12;273(24):14659-62.

Anagnostou, et al., "Erythropoietin has a mitogenic and positive chemotactic effect on endothelial cells." Proc Natl Acad Sci USA. 1990 Aug; 87(15):5978-82.

Brown, et al., "Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) by epidermal keratinocytes during wound healing." J Exp Med. 1992; 176:1375-9.

Davis, et al., "Second-degree burn healing: the effect of occlusive dressings and a cream." J Surg Res. 1990 Mar; 48(3):245-8.

Gong, et al., "EPO and alpha-MSH prevent ischemia/reperfusion-induced down-regulation of AQPs and sodium transporters in rat kidney." Kidney Int. 2004; 66:683-695.

Hamed, et al., "Topical erythropoietin promotes wound repair in diabetic rats." J Invest Dermatol 2010; 130: 287-94.

Hamed, et al., "Fibronectin potentiates topical erythropoietin-induced wound repair in diabetic mice." J Invest Dermatol 2011; 6: 1365-74.

Hamed, et al., "Erythropoietin, a novel repurposed drug: An innovative treatment for wound healing in patients with diabetes mellitus." Wound Repair Regen. 2014 Jan-Feb; 22(1):23-33.

Hara, et al., "Safe induction of diabetes by high-dose streptozotocin in pigs." Pancreas. 2008 Jan; 36(1):31-8. doi: 10.1097/mpa.0b013e3181452886.

Hara-Chikuma & Verkman, "Aquaporin-3 functions as a glycerol transporter in mammalian skin." Biol Cel 2005; 97:479-86.

Hara-Chikuma & Verkman, "Physiological roles of glycerol-transporting aquaporins: the aquaglyceroporins." Cell Mol Life Sci. 2006; 63(12): 1386-92.

Hara-Chikuma & Verkman, "Aquaporin-3 facilitates epidermal cell migration and proliferation during wound healing." J Mol Med. 2008; 86:221-31.

Hara-Chikuma & Verkman, "Roles of aquaporin-3 in the epidermis." J Invest Dermatol. 2008; 128:2145-51.

Hehenberger, et al., "Impaired proliferation and increased L-lactate production of dermal fibroblasts in the GK-rat, a spontaneous model of non-insulin dependent diabetes mellitus." Wound Repair Regen 1999, 7:65-71.

Levin & Verkman, "Aquaporin-3-dependent cell migration and proliferation during corneal re-epithelialization." Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006; 47(10):4365-72.

Mansbridge, et al., "Growth factors secreted by fibroblasts: role in healing diabetic foot ulcers." Diabetes Obes Metab 1999,1:265-79.

Martin, "Wound healing-aiming for perfect skin regeneration." Science 1997; 276:75-81.

Mustoe, "Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis on their pathogenesis and implications for therapy." Am J Surg 2004,187:65S-70S.

Sebastian, et al., "Epidermal aquaporin-3 is increased in the cutaneous burn wound." Burns. 2015 Jan 17.

Sen, et al., "Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy." Wound Repair Regen 2009; 17: 763-71.

Sheetz & King, "Molecular understanding of hyperglycemia's adverse effects for diabetic complications." JAMA 2002, 288:2579-88.

Shukla, et al., "Differential expression of proteins during healing of cutaneous wounds in experimental normal and chronic models." Biochem Biophys Res Commun. 1998; 244:434-9.

Stadelmann, et al., "Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds." Am J Surg. 1998; 176:26S-38S.

Sugimoto, et al., "Impaired Aquaporin 3 Expression in Reepithelialization of Cutaneous Wound Healing in the Diabetic Rat." Biol Res Nurs. 2012; 15(3): 347-55.

Sullivan, et al., "The pig as a model for human wound healing." Wound Repair Regen. 2001;9(2):66-76.

Tentolouris, et al., "Moisture status of the skin of the feet assessed by the visual test neuropad correlates with foot ulceration in diabetes." Diabetes Care. 2010; 33(5):1112-4.

Vedrenne, et al., "The complex dialogue between (myo)fibroblasts and the extracellular matrix during skin repair processes and ageing." Pathol Biol (Paris). 2012; Feb; 60(1):20-7.

Winter, "Formation of the scab and the rate of epithelialization of superficial wounds in the skin of the young domestic pig." Nature. 1962; 20; 193:293-4.

1. Фармацевтическая композиция для лечения раны, содержащая гель, содержащий смесь

эритропоэтина при концентрации 5% (масса/масса);

фибронектина при концентрации 30% (масса/масса);

глицерин при концентрации 5% (масса/масса);

Carbomer 940 при концентрации 1% (масса/масса);

бензилового спирта при концентрации 2% (масса/масса);

триэтаноламина при концентрации 0,9% (масса/масса);

метилпарабена при концентрации 0,2% (масса/масса); и

пропилпарабена при концентрации 0,05% (масса/масса).

2. Композиция по п. 1, при этом гелем является гидрогель.

3. Способ лечения раны у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей:

эритропоэтин при концентрации 5% (масса/масса);

фибронектин при концентрации 30% (масса/масса);

глицерин при концентрации 5% (масса/масса);

Carbomer 940 при концентрации 1% (масса/масса);

бензиловый спирт при концентрации 2% (масса/масса);

триэтаноламин при концентрации 0,9% (масса/масса);

метилпарабен при концентрации 0,2% (масса/масса); и

пропилпарабен при концентрации 0,05% (масса/масса),

при этом композиция представляет собой гель.

4. Способ по п. 3, при котором гелем является гидрогель.

5. Способ по п. 3 или 4, при котором у субъекта диагностировано или предполагается высокое содержание сахара в крови.

6. Способ по любому из пп. 3-5, при котором у субъекта диагностировано или предполагается наличие инсулиновой резистентности.

7. Способ по любому из пп. 3-5, при котором у субъекта диагностировано или предполагается наличие дефицита в продуцировании инсулина.

8. Способ по любому из пп. 3-5, при котором у субъекта диагностировано или предполагается наличие диабета.

9. Способ по любому из пп. 3-5, при котором субъектом является субъект-человек.

10. Способ по любому из пп. 3-9, при котором композицию вводят за несколько введений.

11. Способ по п. 10, при котором композицию вводят 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше раз.

12. Способ по п. 10, при котором композицию вводят за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23 или 24 недели.

13. Способ по п. 10, при котором композицию вводят за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23 или 24 месяца.

14. Способ по п. 10, при котором временной интервал между введениями составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 суток.

15. Способ по п. 10, при котором временной интервал между введениями составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель.

16. Способ по любому из пп. 3-15, при котором гель составляют для кожного введения или вводят накожно.

17. Способ по любому из пп. 3-16, при котором раной является язва.

18. Способ по любому из пп. 3-16, при котором раной является диабетическая язва.

19. Способ по любому из пп. 3-18, при котором раной является хроническая диабетическая язва.

20. Способ по любому из пп. 3-19, при котором раной является хроническая диабетическая язва конечностей.

21. Способ по любому из пп. 3-20, при котором раной является хроническая диабетическая язва стопы.

22. Способ косметического лечения поврежденной поверхности кожи путем нанесения достаточного количества композиции по п. 1 на поврежденную поверхность кожи для косметического лечения поверхности.

23. Способ заживления поврежденной поверхности кожи путем нанесения достаточного количества композиции по п. 1 на поврежденную поверхность кожи для лечения поврежденной поверхности кожи.

24. Способ по любому из пп. 22 или 23, при котором поврежденная поверхность кожи является результатом царапины, трещины мягкой кожи или акне.