Лентивирусные векторы для доставки pklr для лечения дефицита пируваткиназы

Группа изобретений относится к кассете экспрессии для лечения дефицита пируваткиназы (PKD) и ее применению. Предложена кассета экспрессии для лечения дефицита PKD, содержащая полинуклеотидную последовательность, содержащую, в следующем порядке от 5’- к 3’-концу: а) промоторную последовательность; и b) оптимизированную по кодонам последовательность, кодирующую продукт гена PKLR человека. При этом указанная промоторная последовательность функционально связана с оптимизированной по кодонам последовательностью, кодирующей продукт гена PKLR человека, и представляет собой промотор фосфоглицераткиназы (PGK), промотор цитомегаловируса (CMV), промотор lac, промотор Т3 или промотор Т7. Указанная оптимизированная по кодонам последовательность, кодирующая продукт гена PKLR человека, обладает по меньшей мере 95% идентичностью SEQ ID NO: 8. Предложены также вектор доставки рекомбинантного гена, содержащий кассету экспрессии, клетка млекопитающего для лечения дефицита PKD, содержащая кассету экспрессии или вектор доставки, фармацевтическая композиция для лечения дефицита PKD, содержащая вектор доставки или клетку, способ лечения или предотвращения дефицита PKD у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтической композиции, а также способ экспрессии гена PKLR человека в эритроидных клетках. Группа изобретений обеспечивает эффективную экспрессию целевого гена. 6 н. и 15 з.п. ф-лы, 24 ил., 4 табл., 11 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[1] Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 62/573037, поданной 16 октября 2017 г., полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[2] Перечень последовательностей, связанный с данной заявкой, представлен в текстовом формате вместо бумажной копии и настоящим включен в данное описание посредством ссылки. Указанный текстовый файл, содержащий перечень последовательностей, имеет название ROPA_004_01WO_SeqList_ST25.txt. Указанный текстовый файл имеет размер 29 КБ, создан 15 октября 2018 г. и подается в электронном виде через EFS-Web.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[3] Данное изобретение относится к генной терапии дефицита пируваткиназы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[4] Дефицит пируваткиназы (PKD) представляет собой моногенное метаболическое заболевание, вызываемое мутациями в гене PKLR, которое приводит к гемолитической анемии с различной симптоматикой и может привести к летальному исходу в неонатальном периоде. Рецессивный тип наследования PKD и его излечение с помощью аллогенной трансплантации костного мозга обеспечивают идеальные условия для разработки подходов генной терапии.

[5] Среди многих других наследственных ферментативных нарушений, влияющих на эритроциты, дефицит пируваткиназы (PKD) наиболее часто вызывает хроническую несфероцитарную гемолитическую анемию (CNSHA) (Zanella et al., 2007). Начало и степень тяжести PKD очень различны и варьируют от легкой до тяжелой неонатальной анемии, которая в детском возрасте в наиболее тяжелых случаях приводит к летальному исходу (Pissard et al. 2006). Также сообщалось о редко встречающихся задержке роста, водянке плода и смерти в течение неонатального периода (Gilsanz et al., 1993). Распространенность PKD была оценена в 1:20 000 среди всей европеоидной популяции (Beutler et al., 2000) и до настоящего времени было идентифицировано более 195 различных мутаций в гене PKLR (http://www.lovd.nl/pklr).

[6] Аллогенная трансплантация костного мозга (ТКМ) успешно применяется для излечения пациентов с тяжелой формой PKD (Tanphaichitr et al., 2000), но низкая доступность гистосовместимых доноров и серьезные осложнения, связанные с ТКМ у этих пациентов (т.е. реакция «трансплантат против хозяина», оппортунистические инфекции и т. д.), делают периодические переливания крови и спленэктомию основными возможными видами лечения большинства тяжелых форм PKD (Zanella et al., 2005), вследствие чего значительно повышена тяжесть течения заболевания и смертность пациентов (Hilgard et al., 2005). Ограниченная эффективность и побочные действия возможных видов лечения пациентов с тяжелой формой PKD и его рецессивный тип наследования делают PKD подходящим заболеванием для лечения с помощью генной терапии.

[7] PKD вызван дефектами фермента пируваткиназы (PK) (Zanella 2005), который катализирует последнюю АТФ-генерирующую реакцию гликолитического пути во всех клетках. В зрелых эритроцитах PK становится необходимой, поскольку эритроциты экспрессируют только специфическую изоформу типа R (RPK) (Kanno et al., 1992) из-за регуляции эритроид-специфичного альтернативного промотора локуса PKLR (Noguchi et al., 1987). Таким образом, любая потеря активности RPK отрицательно влияет на метаболизм и продолжительность жизни эритроцитов (Zanella 2005), приводя к развитию CNSHA.

[8] Перспективным подходом к лечению и предотвращению генетических и других заболеваний и нарушений является доставка терапевтических агентов с помощью вектора для генной терапии. В настоящее время вирусные векторы демонстрируют наибольшую эффективность в переносе генов, и для коррекции генетических заболеваний, при которых требуется постоянная экспрессия генов, желательны векторы на основе герпесвируса, ретровируса, лентивируса, аденовируса или AAV (аденоассоциированного вируса) из-за интеграционной природы жизненного цикла вируса.

[9] Генная терапия моногенных заболеваний, в особенности влияющих на кроветворную систему, обеспечила убедительные доказательства того, что генетическая коррекция аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (HSC) представляет собой терапевтическую альтернативу аллогенной трансплантации HSC, позволяющую избежать ее основных осложнений (Cartier et al., 2009; Cavazzana-Calvo et al., 2010; Cartier et al 2012; Aiuti et al., 2013; Biffi et al 2013). Генетическая коррекция заболеваний, влияющих на эритроциты, таких как бета-талассемия и серповидноклеточная анемия, была рассмотрена на животных моделях (Pestina et al., 2009l Breda et al., 2012), а также у людей (Cavazzana-Calvo et al., 2010). Однако методы генной терапии для наследственных нарушений метаболизма эритроидных клеток, таких как PKD, все еще ограничены.

[10] Возможность применения генной терапии HSC для лечения PKD была продемонстрирована на экспериментальных моделях с дефицитом RPK как у мышей (Tani et al., 1994; Meza et al., 2009), так и у собак (Trobridge et al., 2012), где было показано, что донорский химеризм или уровень генно-модифицированных клеток являются ключевыми моментами для достижения эффективной коррекции гемолитического фенотипа (Richard et al., 2004) с учетом отсутствия избирательного преимущества генно-скорректированных HSC. Ранее проведенная работа с мышиной моделью PKD показала, что экспрессия RPK человека, обеспечиваемая ретровирусом, позволила полностью скорректировать фенотип PKD при трансплантации более 25% генетически скорректированных клеток (Meza et al., 2009). О подобном терапевтическом пороге скорректированных клеток было недавно сообщено у одной собаки басенджи с PKD, которой вводили размноженные in vivo и скорректированные пенящим вектором HSC (Trobridge et al., 2012).

[11] Остается ряд сложностей в отношении разработки полинуклеотидных кассет и векторов экспрессии для применения в генной терапии. Одна значительная сложность заключается в достижении достаточной экспрессии трансгена в клетках-мишенях. Давно неудовлетворенная потребность в данной области заключается в достаточно устойчивой экспрессии трансгенов после переноса генов. В некоторых случаях для эффективности отдельных векторов, например, векторов на основе плазмидной ДНК, требуется более эффективная экспрессия. В других случаях более эффективные кассеты для экспрессии генов желательны для обеспечения более низкой терапевтической дозы, которая характеризуется более благоприятным профилем безопасности или менее инвазивным способом введения.

[12] Высокие уровни экспрессии трансгена могут быть достигнуты при использовании гамма-ретровирусных (гамма-RV) векторов благодаря тому, что экспрессия терапевтического трансгена регулируется их длинными концевыми повторами (LTR). Тем не менее первые клинические исследования с этим типом вектора вызвали опасения относительно безопасности, так как у нескольких пациентов развились неожиданные лейкозы (Hacein-Bey-Abina et al 2008). Сильная промоторная активность LTR может влиять на регуляцию окружающих генов, либо путем активации промоторов протоонкогена, либо путем ингибирования генов-супрессоров опухоли, что приводит к инсерционному мутагенезу (Ott et al., 2006; Howe et al., 2008; Stein et al., 2010; Braun et al., 2014). Эти данные выдвинули на первый план необходимость использовать для генной терапии PKD более безопасные и более эффективные векторы, чем векторы гамма-RV.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[13] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к кассете экспрессии, содержащей полинуклеотидную последовательность, содержащую: a) промоторную последовательность; b) последовательность, кодирующую продукт гена; и c) сигнал экспорта рибонуклеиновой кислоты (РНК), где указанная промоторная последовательность функционально связана с последовательностью, кодирующей полипептид пируваткиназы, и, необязательно, где a)-c) присутствуют в кассете экспрессии в порядке от 5’- к 3’-концу. В отдельных вариантах осуществления промотор представляет собой промотор фосфоглицераткиназы (PGK). В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой терапевтический продукт гена. В некоторых вариантах осуществления терапевтический продукт гена представляет собой полипептид пируваткиназы (PK), необязательно полипептид печеночной и эритроцитарной пируваткиназы (PKLR). В отдельных вариантах осуществления последовательность, кодирующая продукт гена, оптимизирована по кодонам. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая продукт гена, представляет собой оптимизированную по кодонам версию кДНК пируваткиназы человека, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью SEQ ID NO: 8. В частных вариантах осуществления сигнал экспорта РНК представляет собой мутированный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (wPRE).

[14] В отдельных вариантах осуществления мутированный wPRE представляет собой химерный wPRE, содержащий последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит одну или более энхансерных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит полипуриновый тракт (PPT) или последовательность сигнала полиаденилирования (полиА). В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит одну или более из следующих последовательностей: i) последовательность сигнала упаковки; ii) усеченную последовательность Gag; iii) Rev-отвечающий элемент (RRE); iv) центральный полипуриновый тракт (cPPT); v) центральную терминирующую последовательность (CTS); и vi) расположенный против хода транскрипции элемент последовательности (upstream sequence element, USE), необязательно из вируса обезьян 40 (SV40-USE). В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит последовательности 5’- и 3’-концевого длинного концевого повтора (LTR).

[15] В связанном варианте осуществления настоящее изобретение относится к вектору доставки рекомбинантного гена, содержащему кассету экспрессии, раскрытую в настоящем документе. В отдельных вариантах осуществления вектор доставки рекомбинантного гена представляет собой вирус или вирусный вектор. В отдельных вариантах осуществления вирус или вирусный вектор представляет собой лентивирус (LV).

[16] В еще одном связанном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке, содержащей кассету экспрессии или вектор доставки гена, раскрытые в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку крови. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку костного мозга, например, клетку костного мозга, обедненного по линии клеток. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой CD34+ гемопоэтическую стволовую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой коммитированного гемопоэтического предшественника эритроидной клетки.

[17] В еще одном связанном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество и вектор доставки рекомбинантного гена или клетку, раскрытые в настоящем документе.

[18] В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения или предотвращения заболевания или нарушения у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение указанному субъекту кассеты экспрессии, вектора доставки гена или фармацевтической композиции, раскрытых в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления заболевание или нарушение представляет собой PKD, а продукт гена представляет собой полипептид PK, необязательно полипептид PKLR. В отдельных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит указанный вектор доставки рекомбинантного гена. В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит указанную клетку. В одном из вариантов осуществления клетка является аутологичной для субъекта.

[19] В связанном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу экспрессии трансгена в эритроидных клетках, включающему приведение одной или более эритроидных клеток в контакт с эффективным количеством рекомбинантного вирусного вектора, где вектор содержит промотор PGK человека, оптимизированную по кодонам версию трансгена кДНК PKLR человека и мутированный wPRE, где после указанного приведения в контакт PKLR экспрессируется на обнаружимых уровнях в одной или более эритроидных клетках.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[20] Новые признаки изобретения подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Более полное понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения можно получить при обращении к нижеследующему подробному описанию, в котором изложены иллюстративные варианты осуществления, в которых используются принципы изобретения, и прилагаемым графическим материалам, где:

[21] На ФИГ. 1 изображена схема, отражающая положение различных элементов, присутствующих в основной структуре иллюстративного LV вектора.

[22] ФИГ. 2А представляет собой схематическое изображение иллюстративных самоинактивирующихся (SIN) LV векторов, используемых в экспериментах по генной терапии, несущих промотор PGK человека, регулирующий экспрессию трансгена EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок) в контрольном векторе (верхняя диаграмма) или экспрессию оптимизированной по кодонам последовательности кДНК гена PKLR (coRPK) в терапевтическом векторе (нижняя диаграмма).

[23] ФИГ. 2В представляет собой схему протокола генной терапии, проведенного для определения функциональности разработанного вектора PGK-coRPK LV.

[24] На ФИГ. 3A-3D изображены данные, демонстрирующие коррекцию фенотипа PKD в периферической крови первичных реципиентов после генетической коррекции. На ФИГ. 3А и 3В показаны уровни RBC и ретикулоцитов, соответственно, у здоровых мышей (черный столбец, n = 5) и мышей с PKD анемией (серый столбец, n = 6), и мышей с PKD анемией, которым трансплантировали клетки, трансдуцированные EGFP (белый столбец, n = 9) или coRPK (заштрихованный столбец, n = 17). Данные представлены как среднее значение ± SEM и были проанализированы с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. На ФИГ. 3С показана стратегия проточной цитометрии, использованная для обнаружения меченных биотином эритроцитов на протяжении всего времени, а на ФИГ. 3D показана кинетика выживания эритроцитов у здоровых (черная линия, n = 2), имеющих анемию мышей (серая линия, n = 2) и мышей с генетической коррекцией (прерывистая линия, n = 4). Данные представлены в виде среднего ± SEM и были проанализированы с помощью двустороннего критерия ANOVA. Здоровые - не подвергшиеся трансплантации контрольные мыши; PKD - не подвергшиеся трансплантации мыши с PKD; coRPK - мыши с PKD, экспрессирующие терапевтический трансген.

[25] На ФИГ. 4А-4С показано мультилинейное восстановление гемопоэтических клеток у мышей, подвергшихся вторичной трансплантации. ФИГ. 4А представляет собой диаграмму стратегии проточной цитометрии, использованной для идентификации различных линий гемопоэтических клеток путем мечения антителами CD3-PE, B220-PE, B220-PECy5, Gr1-биотин и Mac1-биотин плюс SAV-PE-Cy5. На ФИГ. 4B показаны иллюстративные точечные диаграммы, а на ФИГ. 4С показаны процентные доли каждой линии в ПК через 140 дней после трансплантации. Столбцы представляют собой средний процент ± SEM для контрольных здоровых мышей (n = 2, черный столбец) и контрольных мышей с PKD (n = 2, серый столбец), и подвергшихся вторичной трансплантации мышей, экспрессирующих терапевтический трансген coRPK (n = 4, заштрихованный столбец).

[26] На ФИГ. 5A-5D изображена коррекция фенотипа PKD у подвергшихся вторичной трансплантации мышей. На ФИГ. 5А показано окрашивание бриллиант-крезилом блау мазков крови от не подвергшихся трансплантации мышей и вторичных реципиентов для идентификации популяции ретикулоцитов (показана синим цветом). ФИГ. 5B представляет собой анализ уровней ретикулоцитов в периферической крови методом проточной цитометрии. На ФИГ. 5C представлен процент эритроцитов, а на ФИГ. 5D представлен процент ретикулоцитов у подвергшихся вторичной трансплантации мышей, экспрессирующих трансген coRPK (заштрихованный столбец, n = 4), у здоровых мышей (черный столбец, n = 3) и у контрольных мышей с анемией (серый столбец, n = 3). Данные представлены как среднее значение ± SEM и были проанализированы с помощью непараметрического двустороннего критерия Манна-Уитни.

[27] На ФИГ. 6А-6С показана количественная оценка интеграций провируса. На ФИГ. 6А показано количество копий вектора на клетку в КОЕ в КМ от отдельных подвергшихся трансплантации мышей через 120-170 дней после трансплантации. Также показан процент трансдукции и химеризма. На ФИГ. 6B показано количество копий провируса в клетках из разных гемопоэтических компартментов. Столбцы представляют собой среднее значение ± SEM для разных групп подвергшихся трансплантации мышей. На ФИГ. 6С показана кинетика интеграции провируса в клетках КМ от отдельных подвергшихся трансплантации экспрессирующих EGFP мышей (серые линии) и мышей, несущих трансген coRPK (черные линии).

[28] На ФИГ. 7A-7C изображено нормирование характера дифференцировки эритроидных клеток у мышей с генетической коррекцией. На ФИГ. 7А показан процент различных субпопуляций эритроидных клеток в костном мозге и селезенке через 140 дней после трансплантации. На ФИГ. 7B изображены иллюстративные точечные диаграммы использованной стратегии проточной цитометрии. Интенсивность экспрессии маркеров CD71 и Ter119 позволяет идентифицировать четыре субпопуляции эритроидных клеток. Популяция I: ранние проэритробласты (Ter119^средн CD71^выс), популяция II: базофильные эритробласты (Ter119^выс CD71^выс), популяция III: поздние базофильные и полихроматофильные эритробласты (Ter119^выс CD71^средн) и популяция IV: ортохроматофильные эритробласты, ретикулоциты и зрелые эритроидные клетки (Ter119^выс CD71^низк). На ФИГ. 7C показаны уровни эритропоэтина в плазме, измеренные с помощью ELISA у не подвергшихся трансплантации и подвергшихся трансплантации мышей. Точки представляют собой значения отдельных мышей. Линии представляют собой среднее значение ± SEM и были проанализированы с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Здоровые - не подвергшиеся трансплантации контрольные мыши; PKD - не подвергшиеся трансплантации мыши с PKD; EGFP - мыши с PKD, экспрессирующие трансген EGFP; coRPK - мыши с PKD, экспрессирующие терапевтический трансген.

[29] На ФИГ. 8А-8В показаны анализы гемопоэтических предшественников у контрольных мышей и подвергшихся трансплантации мышей с трансдуцированными клетками. Данные демонстрируют общие КОЕ из селезенки (ФИГ. 8А) и костного мозга (ФИГ. 8В) через 140 дней после трансплантации. Точки представляют собой количество проанализированных колоний на одну мышь, а линии представляют среднее значение ± SEM в каждой группе. Данные были статистически проанализированы с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса.

[30] ФИГ. 9А-9С демонстрируют реверсию спленомегалии и патологии органов у мышей с генетической коррекцией через 140 дней после трансплантации. На ФИГ. 9А показаны изображения иллюстративных селезенок, а на ФИГ. 9B показано отношение массы селезенки к общей массе тела у мышей с PKD, подвергшихся первичной и вторичной трансплантации. Точки представляют собой значения отдельных мышей. Линии представляют собой среднее значение ± SEM на группу. Данные были проанализированы с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. На ФИГ. 9C показано гистологическое исследование селезенки и печени от подвергшихся первичной трансплантации мышей с PKD. В первом и втором столбцах показаны иллюстративные гистологические срезы селезенки и печени, окрашенные гематоксилин-эозином и сфотографированные с использованием объектива с 4- и 10-кратным увеличением, соответственно, в оптическом микроскопе. Стрелки указывают на кластеры эритроидных клеток, свидетельствующие об экстрамедуллярном эритропоэзе. В третьем столбце показаны окрашенные прусским синим (Fe) срезы печени для обнаружения отложений железа, на которые указывают стрелки. Фотографии были сделаны с использованием объектива с 20-кратным увеличением. Легенда групп такая же, как на ФИГ. 7. Вторичные, coPRK - вторичные реципиенты.

[31] На ФИГ. 10A-10G изображено метаболическое профилирование в образцах эритроцитов от мышей, которым трансплантировали генетически модифицированные клетки. Анализ значительных изменений метаболического профиля у здоровых и подвергшихся трансплантации мышей по сравнению с животными с PKD в двух независимых экспериментах. На ФИГ. 10А показана полная тепловая карта эритроцитов, полученная посредством нецелевого профилирования, где более высокие и более низкие уровни метаболитов представлены соответственно красным и синим. Перечисленные метаболиты обладают по меньшей мере одной сравнительной характеристикой, которая является значимой по следующим критериям: абсолютное кратное изменение >1,5; минимальный сигнал >2000; скорректированное р-значение <0,01. Черные квадраты обозначают кластер метаболических изменений с уникальным профилем среди групп. На ФИГ. 10B, 10C и 10D показаны уровни АТФ, АДФ и пирувата в эритроцитах, соответственно, измеренные путем нецелевого профилирования, по сравнению с мышами с PKD через 140 дней после трансплантации. Анализ 1: здоровые мыши (черные столбцы) n = 1, PKD (серые столбцы) n = 1, hPGK-EGFP (белые столбцы) n = 2, hPGK-coRPK (заштрихованные столбцы) n = 3. Анализ 2: здоровые мыши n = 2, PKD n = 2, hPGK-EGFP n = 6, hPGK-coRPK n = 10. На ФИГ. 10E, 10F и 10G показано целевое метаболическое профилирование эритроцитов для выбранного количества метаболитов, участвующих в гликолитическом пути (ФЕП (фосфоенолпируват), 3-фосфоглицериновая кислота и D-молочная кислота, соответственно) через 280 дней после трансплантации. Точки представляют собой значения отдельных мышей. Линии представляют собой среднее значение ± SEM и были проанализированы с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Анализ 2: здоровые мыши n = 7, PKD n = 5, hPGK-EGFP n = 3, hPGK-coRPK n = 5.

[32] На ФИГ. 11А-11С изображена активность пируваткиназы, активность гексокиназы и соотношение ферментативных активностей пируваткиназы и гексокиназы соответственно в эритроцитах контрольных мышей и мышей, которым трансплантировали трансдуцированные клетки. Эритроциты были очищены от образцов крови через колонку с целлюлозой во избежание искажения активности PK лейкоцитами, и подвергнуты оценке ферментативной активности. Черные столбцы, здоровые мыши (n = 2); белые столбцы, мыши, которым трансплантировали клетки, трансдуцированные вектором, экспрессирующим EGFP (n = 3); заштрихованные столбцы, мыши, которым трансплантировали клетки, трансдуцированные вектором, экспрессирующим coRPK (n = 3). Окрашенные в клетку столбцы представляют собой значения, полученные на здоровом добровольце (n = 1). Данные представляют собой среднее значение ± SEM для каждой группы.

[33] На ФИГ. 12A-12D показано нецелевое метаболическое профилирование в образцах лейкоцитов от мышей, которым трансплантировали генетически модифицированные клетки. На ФИГ. 12А представлен анализ основных компонентов нецелевого метаболического профиля в эритроцитах (красные точки; слева и в центре) и в лейкоцитах (синие точки; кластер справа) у контрольных и подвергшихся трансплантации мышей. На ФИГ. 12B, 12C и 12D изображены уровни АТФ, АДФ и пирувата, соответственно, в лейкоцитах по сравнению с мышами с PKD. Анализ 1: здоровые мыши (черные столбцы) n = 1, PKD (серые столбцы) n = 1, hPGK-EGFP (белые столбцы) n = 2, hPGK-coRPK (заштрихованные столбцы) n = 3. Анализ 2: здоровые мыши n = 2, PKD n = 2, hPGK-EGFP n = 6, hPGK-coRPK n = 10. Данные представляют собой среднее значение ± SEM на группу и были проанализированы с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса.

[34] На ФИГ. 13 показано полученное с помощью гель-документирующей системы изображение продуктов LAM-ПЦР, полученных с помощью фермента Tsp509I, для образцов, собранных у всех мышей в разные моменты времени и в разных тканях. Сайты интеграции вектора идентифицировали с помощью LAM-ПЦР-амплификации соединений 3’-концевой LTR вектора-геном. Была использована автоматизированная система MultiNA, генерирующая картину, характеризующуюся несколькими полосами. Полоса внутреннего контроля (IC) Tsp509I, полученная из основной структуры вектора, обозначена стрелкой.

[35] На ФИГ. 14 показано полученное с помощью гель-документирующей системы изображение продуктов LAM-ПЦР, полученных с помощью фермента HpyCH4IV5, для образцов, собранных у всех мышей в разные моменты времени и в разных тканях. Сайты интеграции вектора идентифицировали с помощью LAM-ПЦР-амплификации соединений 3’-концевой LTR вектора-геном. Была использована автоматизированная система MultiNA, генерирующая картину, характеризующуюся несколькими полосами. IC HpyCH4IV5, полученный из основной структуры вектора, обозначен стрелкой.

[36] На ФИГ. 15 изображена общая схема анализа картирования сайтов интеграции, проведенного у мышей, которым трансплантировали генетически модифицированные гемопоэтические предшественники. Образцы костного мозга и лейкоцитов от подвергшихся трансплантации мышей, принадлежащие к двум независимым экспериментам (таблица 3) и собранные в разные моменты времени после трансплантации, анализировали, как описано в дополнительных методах после показанного конвейера.

[37] На ФИГ. 16А-16В показано распределение интегрирований LV в геноме подвергшихся трансплантации мышей. На ФИГ. 16А изображена плотность распределения сайтов интеграции (IS) вокруг сайта инициации транскрипции (TSS) ближайшего гена из RefSeq, на расстоянии 500 т. п. н. против хода и по ходу транскрипции от TSS. Числа сверху представляют собой количество IS, обнаруженных для всех образцов и моментов времени. На ФИГ. 16В показано хромосомное распределение сайтов интеграции LV у подвергшихся трансплантации мышей, экспрессирующих трансген EGFP (черные столбцы) или терапевтический трансген coRPK (серые столбцы), демонстрирующее отсутствие отклонения в сторону какой-либо конкретной хромосомы.

[38] На ФИГ. 17А-17С продемонстрирован анализ клональной представленности клеток, трансдуцированных coRPK-LV. На точечной диаграмме отражена клональная представленность объединенных интеграций у каждой мыши из анализов 1 (ФИГ. 17A) и 2 (ФИГ. 17B и 17C). Относительный процент (ось y) для каждого IS относится к общему количеству прочтений, полученных в каждом наборе данных. КМ - костный мозг; ПК - периферическая кровь; coRPK1-14 - мыши, которым трансплантировали гемопоэтические клетки, трансдуцированные терапевтическим вектором.

[39] На ФИГ. 18 представлены отслеженные общие интеграции между первичными и вторичными мышами-реципиентами, несущими терапевтический вектор PGK-coRPK LV. Интеграции, обнаруженные у любой из мышей в любом органе и в любое время, объединены. Вторичные реципиенты получали объединенный КМ от подвергшихся трансплантации мышей coRPK с 11 по 14. Остальные обнаруженные IS были обнаружены либо у первичных, либо у вторичных реципиентов. Числа в квадратиках показывают репрезентативность в процентах соответствующей интеграции в указанной мыши. Помимо фильтра ≥5%, применяемого при анализе интеграций, были исключены все интеграции с числом последовательностей < 3.

[40] На ФИГ. 19 продемонстрирован анализ клональной представленности клеток, трансдуцированных EGFP-LV. На точечной диаграмме отражена клональная представленность объединенных интеграций у каждой мыши в костном мозге. Относительный процент (ось y) для каждого IS относится к общему количеству прочтений, полученных в каждом наборе данных. Аналогично клеткам, трансдуцированным co-RPK (фиг. 17), график демонстрирует, что у подавляющего большинства подвергшихся трансплантации мышей наблюдается поликлональная картина гемопоэтической репопуляции.

[41] На ФИГ. 20 изображен профиль геномной интеграции LV. Анализ генной онтологии (GO) проводили с использованием программного обеспечения GREAT на образцах от подвергшейся трансплантации мыши. Все интеграции, полученные из этого исследования (N = 2220), показали превалирование функций генов, указанных в левой части фигуры. Чтобы определить, были ли наиболее распространенные интеграции обогащены в определенных классах генов, были выбраны все IS с относительным числом последовательностей > 5% всего набора данных (показаны на фиг. 17), в результате чего не было выявлено чрезмерной представленности классов генов GO.

[42] На ФИГ. 21 показана схема лентивирусного вектора PGK-coRPK LV.

[43] На ФИГ. 22 изображена диаграмма плазмиды (CPcoRPKW-17), содержащей лентивирусный вектор PGK-coRPK LV.

[44] ФИГ. 23A-23F представляют собой нуклеотидную последовательность лентивирусного вектора PGK-coRPK LV, снабженную примечаниями, показывающими расположение различных функциональных элементов.

[45] На ФИГ. 24A-24B показан механизм действия лентивирусного вектора PGK-coRPK LV. На ФИГ. 24A показано, что эктопическая экспрессия вектора PGK-coRPK LV восстанавливает фенотип дикого типа эритроцитов с PKD, которые в противном случае неспособны генерировать функциональный белок RPK для производства достаточной энергии для выполнения их функций. На ФИГ. 24B показана стратегия генной терапии для пациентов с PKD, основанная на трансдукции ex vivo CD34⁺ гемопоэтических предшественников с дефицитом RPK с помощью лентивирусного вектора PGK-coRPK LV и последующей трансплантации пациенту. Разработанный лентивирусный вектор LVK-coRPK LV, несущий кДНК терапевтического гена PKLR человека, будет интегрирован в геном CD34⁺ клеток пациента после трансдукции ex vivo. Эти генетически скорректированные клетки затем будут введены обратно пациенту, где они будут продуцировать эритроциты, экспрессирующие терапевтический трансген, и, следовательно, продуцировать функциональные белки RPK, которые будут корректировать патологический фенотип PKD. Фигура является измененным изображением из блога Бостонской детской больницы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[46] Термин «вектор» в контексте настоящего документа относится к макромолекуле или ассоциации макромолекул, которая содержит или ассоциирует с полинуклеотидом и которая может опосредовать доставку полинуклеотида в клетку. Иллюстративные векторы включают, например, плазмиды, вирусные векторы, липосомы и другие носители для доставки генов.

[47] Термин «LV» является аббревиатурой для лентивируса и может относиться к самому вирусу или его производным. Данный термин охватывает все подтипы и как встречающиеся в природе, так и рекомбинантные формы, если не требуется иное.

[48] В контексте настоящего документа термин «ген» или «кодирующая последовательность» относится к нуклеотидной последовательности in vitro или in vivo, кодирующей продукт гена. В некоторых случаях ген состоит или по существу состоит из кодирующей последовательности, то есть последовательности, кодирующей продукт гена. В других случаях ген содержит дополнительную некодирующую последовательность. Например, ген может включать или не включать области, предшествующие и следующие за кодирующей областью, например, 5’-концевые нетранслируемые (5’-UTR) или «лидерные» последовательности и 3’-UTR или «трейлерные» последовательности, а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

[49] В контексте настоящего документа термин «терапевтический ген» относится к гену, который при экспрессии оказывает благоприятный эффект на клетку или ткань, в которой он присутствует, или на млекопитающее, в котором экспрессируется ген. Примеры благоприятных эффектов включают устранение признака или симптома состояния или заболевания, предотвращение или ингибирование состояния или заболевания или придание желаемой характеристики. Терапевтические гены включают гены, корректирующие генетический дефицит в клетке или организме млекопитающего.

[50] В настоящем документе трансген представляет собой ген, доставляемый в клетку вектором.

[51] В контексте настоящего документа термин «продукт гена» относится к желаемому продукту экспрессии полинуклеотидной последовательности, такому как полипептид, пептид, белок или интерферирующая РНК, включая малую интерферирующую РНК (миРНК), микроРНК или малую шпилечную РНК (мшРНК).

[52] В контексте настоящего документа термины «полипептид», «пептид» и «белок» относятся к полимерам аминокислот любой длины. Данные термины также охватывают полимер аминокислот, который был модифицирован; например, путем образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидирования, фосфорилирования или конъюгации с метящим компонентом.

[53] Под «содержащим» подразумевается, что перечисленные элементы требуются, например, в композиции, способе, наборе и т. д., но могут быть включены и другие элементы для формирования, например, композиции, способа, набора и т. д. в пределах объема пункта формулы изобретения. Например, кассета экспрессии, «содержащая» ген, кодирующий терапевтический полипептид, функционально связанный с промотором, представляет собой кассету экспрессии, которая может включать другие элементы помимо гена и промотора, например, последовательность полиаденилирования, энхансерные элементы, другие гены, линкерные домены и т.д.

[54] Под «по существу состоящим из» подразумевается ограничение объема, например, описанных композиции, способа, набора и т. д., указанными материалами или стадиями, которые не оказывают существенного влияния на основную и новую характеристику(и), например, композиции, способа, набора и т.д. Например, кассета экспрессии, «по существу состоящая из» гена, кодирующего терапевтический полипептид, функционально связанный с промотором и последовательностью полиаденилирования, может включать дополнительные последовательности, например, линкерные последовательности, при условии, что они не оказывают существенного влияния на транскрипцию или трансляцию указанного гена. В качестве другого примера, вариантный или мутантный полипептидный фрагмент, «по существу состоящий из» указанной последовательности, имеет аминокислотную последовательность указанной последовательности плюс или минус приблизительно 10 аминокислотных остатков на границах последовательности, основанной на полноразмерном наивном полипептиде, из которого он был получен, например, на 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 остаток меньше, чем указанный граничный аминокислотный остаток, или на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков больше, чем указанный граничный аминокислотный остаток.

[55] Под «состоящим из» подразумевается исключение из композиции, способа или набора любого элемента, стадии или ингредиента, не указанного в пункте формулы изобретения. Например, кассета экспрессии, «состоящая из» гена, кодирующего терапевтический полипептид, функционально связанного с промотором, и посттранскрипционного регуляторного элемента, состоит только из промотора, полинуклеотидной последовательности, кодирующей терапевтический полипептид, и посттранскрипционного регуляторного элемента. В качестве другого примера, полипептид, «состоящий из» указанной последовательности, содержит только указанную последовательность.

[56] «Вектор экспрессии» в контексте настоящего документа охватывает вектор, например, плазмиду, миникольцо, вирусный вектор, липосому и тому подобное, как обсуждается выше или как известно из уровня техники, содержащий полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес продукт гена, и влияющий на экспрессию продукта гена в предполагаемой клетке-мишени. Вектор экспрессии также содержит контрольные элементы, функционально связанные с кодирующей областью, для способствования экспрессии продукта гена в мишени. Комбинацию контрольных элементов, например, промоторов, энхансеров, UTR, последовательностей, нацеленных на микроРНК и т. д., и гена или генов, с которыми они функционально связаны для экспрессии, иногда называют «кассетой экспрессии». Многие такие контрольные элементы известны и доступны в данной области техники или могут быть легко сконструированы из компонентов, доступных в данной области техники.

[57] «Промотор» в контексте настоящего документа охватывает последовательность ДНК, управляющую связыванием РНК-полимеразы и тем самым способствующую синтезу РНК, то есть, минимальную последовательность, достаточную для управления транскрипцией. Промоторы и экспрессия соответствующих белков или полипептидов могут быть универсальными, что означает высокую активность в широком диапазоне клеток, тканей и видов, или быть клеточно-специфичными, тканеспецифичными или видоспецифичными. Промоторы могут быть «конститутивными», то есть постоянно активными, или «индуцибельными», что означает, что промотор может быть активирован или деактивирован при наличии или отсутствии биотических или абиотических факторов. В конструкции нуклеиновых кислот или векторов согласно изобретению также включены энхансерные последовательности, которые могут быть или не быть смежными с промоторной последовательностью. Энхансерные последовательности влияют на промотор-зависимую экспрессию генов и могут быть расположены в 5’-концевой или 3’-концевой областях нативного гена.

[58] «Энхансер» в контексте настоящего документа охватывает цис-действующий элемент, стимулирующий или ингибирующий транскрипцию соседних генов. Энхансер, ингибирующий транскрипцию, также называют «сайленсером». Энхансеры могут функционировать (то есть, могут быть связаны с кодирующей последовательностью) в любой ориентации, на расстояниях вплоть до нескольких тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.) от кодирующей последовательности и из положения ниже по ходу транскрипции от транскрибируемой области.

[59] «Последовательность сигнала терминации» в контексте настоящего документа охватывает любой генетический элемент, который заставляет РНК-полимеразу прекращать транскрипцию, такой как, например, сигнальная последовательность полиаденилирования.

[60] В контексте настоящего документа термин «функционально связанный» относится к смежному расположению генетических элементов, например, промотора, энхансера, последовательности сигнала терминации, последовательности полиаденилирования и т. д., при котором элементы находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать ожидаемым образом. Например, промотор функционально связан с кодирующей областью, если промотор помогает инициировать транскрипцию кодирующей последовательности. Между промотором и кодирующей областью могут присутствовать промежуточные остатки при условии сохранения этой функциональной взаимосвязи.

[61] В контексте настоящего документа термин «гетерологичный» означает полученный от объекта, генотипически отличного от остальной части объекта, с которым он сравнивается. Например, полинуклеотид, введенный методами генной инженерии в плазмиду или вектор, полученный от другого вида, представляет собой гетерологичный полинуклеотид. В качестве другого примера, промотор, удаленный из его нативной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, с которой он не связан естественным образом, представляет собой гетерологичный промотор. Таким образом, например, LV вектор, включающий гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичный продукт гена, представляет собой LV вектор, включающий нуклеиновую кислоту, в обычных условиях не включенную во встречающийся в природе LV дикого типа, и кодируемый гетерологичный продукт гена представляет собой продукт гена, в обычных условиях не кодируемый встречающимся в природе LV дикого типа.

[62] Термин «эндогенный» в контексте настоящего документа в отношении молекулы нуклеотида или продукта гена относится к последовательности нуклеиновой кислоты, например, гену или генетическому элементу, или продукту гена, например, РНК, белку, который встречается в природе в вирусе- или клетке-хозяине или связан с ними.

[63] Термин «нативный» в контексте настоящего документа относится к нуклеотидной последовательности, например, гену или продукту гена, например, РНК, белку, который присутствует в вирусе или клетке дикого типа.

[64] Термин «вариант» в контексте настоящего документа относится к мутанту референсной полинуклеотидной или полипептидной последовательности, например, нативной полинуклеотидной или полипептидной последовательности, то есть обладающему менее чем 100% идентичностью референсной полинуклеотидной или полипептидной последовательности. Другими словами, вариант полинуклеотидной последовательности отличается по меньшей мере одним нуклеотидом (например, содержит замену нуклеотида, инсерцию нуклеотида или делецию нуклеотида) от референсной полинуклеотидной последовательности, например, нативной полинуклеотидной последовательности. Вариант полипептидной последовательности отличается по меньшей мере одной аминокислотой (например, содержит замену аминокислоты, инсерцию аминокислоты, делецию аминокислоты) от референсной полипептидной последовательности, например, нативной полипептидной последовательности. Например, вариант может представлять собой полинуклеотид, последовательность которого на 70% или более идентична полноразмерной нативной полинуклеотидной последовательности, например, на 75% или 80% или более, например, на 85%, 90% или 95% или более, например, на 98% или 99% идентична полноразмерной нативной полинуклеотидной последовательности. В качестве другого примера, вариант может представлять собой полипептид, последовательность которого на 70% или более идентична полноразмерной нативной полипептидной последовательности, например, на 75% или 80% или боле, например, на 85%, 90% или 95% или более, например, на 98% или 99% идентична полноразмерной нативной полипептидной последовательности. Варианты могут также включать вариантные фрагменты референсной, например, нативной, последовательности, последовательность которых на 70% или более идентична фрагменту референсной, например, нативной, последовательности, например, на 75% или 80% или более, например, на 85%, 90% или 95% или более, например, на 98% или 99% идентична нативной последовательности.

[65] В контексте настоящего документа термины «биологическая активность» и «биологически активный» относятся к активности, относимой к конкретному биологическому элементу в клетке. Например, «биологическая активность» «иммуноглобулина», «антитела» или их фрагмента или варианта относится к способности связывать антигенную детерминанту и тем самым способствовать иммунологической функции. В качестве другого примера, биологическая активность полипептида или его функционального фрагмента или варианта относится к способности полипептида или его функционального фрагмента или варианта выполнять свои нативные функции, например, связывание, ферментативную активность и т. д. В качестве третьего примера, биологическая активность регуляторного элемента гена, например, промотора, энхансера, последовательности Козак и тому подобного, относится к способности регуляторного элемента или его функционального фрагмента или варианта регулировать, то есть стимулировать, усиливать или активировать трансляцию соответственно экспрессии гена, с которым он функционально связан.

[66] Термин «введение» в контексте настоящего документа относится к доставке вектора для экспрессии рекомбинантного белка в клетку, в клетки и/или органы субъекта, или субъекту. Такое введение может иметь место in vivo, in vitro или ex vivo. Вектор для экспрессии продукта гена может быть введен в клетку путем трансфекции, что обычно означает введение гетерологичной ДНК в клетку физическими средствами (например, трансфекцией с фосфатом кальция, электропорацией, микроинъекцией или липофекцией); инфицирования, что обычно относится к введению посредством инфекционного агента, то есть вируса; или трансдукции, что обычно означает стабильное инфицирование клетки вирусом или передачу генетического материала от одного микроорганизма к другому посредством вирусного агента (например, бактериофага).

[67] «Трансформация» обычно используется для обозначения бактерий, содержащих гетерологичную ДНК, или клеток, которые экспрессируют онкоген и были преобразованы в режим непрерывного роста, таких как опухолевые клетки. Вектор, используемый для «трансформации» клетки, может представлять собой плазмиду, вирус или другой носитель.

[68] Как правило, клетка называется «трансдуцированной», «инфицированной»; использование термина «трансфицированный» или «трансформированный» зависит от средства, используемого для введения или вставки гетерологичной ДНК (то есть, вектора) в клетку. Термины «трансдуцированный», «трансфицированный» и «трансформированный» в контексте настоящего документа могут использоваться взаимозаменяемо независимо от способа введения гетерологичной ДНК.

[69] Термин «клетка-хозяин» в контексте настоящего документа относится к клетке, которая была трансдуцирована, инфицирована, трансфицирована или трансформирована вектором. Вектор может представлять собой плазмиду, вирусную частицу, фаг и т. д. Условия культивирования, такие как температура, рН и тому подобное, являются такими, которые ранее использовались для клетки-хозяина, выбранной для экспрессии, и будут очевидны для специалистов в данной области техники. Следует иметь в виду, что термин «клетка-хозяин» относится к исходной трансдуцированной, инфицированной, трансфицированной или трансформированной клетке и ее потомству.

[70] Термины «лечение», «лечить» и тому подобное используются в настоящем документе в общем случае для обозначения достижения желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Данный эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома, например, снижение вероятности того, что заболевание или его симптом возникнет у субъекта, и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения от заболевания и/или неблагоприятного эффекта, связанного с заболеванием. «Лечение» в контексте настоящего документа охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего и включает: (a) предотвращение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к развитию заболевания, но у которого оно еще не было диагностировано; (b) подавление заболевания, то есть прекращение его развития; или (c) облегчение заболевания, то есть инициирование регрессии заболевания. Терапевтический агент может быть введен до, во время или после начала заболевания или травмы. Особый интерес представляет лечение существующего заболевания, где лечение стабилизирует или ослабляет нежелательные клинические симптомы у пациента. Проведение такого лечения желательно до полной потери функции пораженных тканей. Желательно введение рассматриваемой терапии во время симптоматической стадии заболевания, и, в некоторых случаях, после симптоматической стадии заболевания.

[71] Термины «индивидуум», «хозяин», «субъект» и «пациент» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к млекопитающему, включая, не ограничиваясь перечисленным, человекообразных и нечеловекообразных приматов, включая обезьян и людей; спортивным млекопитающим (например, лошадям); сельскохозяйственным млекопитающим (например, овцам, козам и т.д.); домашним животным (собакам, кошкам и т.д.); и грызунам (например, мышам, крысам и т.д.).

[72] Терминология, используемая в настоящем документе, предназначена для описания частных вариантов осуществления изобретения и не предназначена для ограничения его объема. В контексте настоящего документа формы единственного числа включают также формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Кроме того, в той мере, в которой термины «включающий», «включает», «имеющий», «имеет», «с» или их варианты используются в подробном описании и/или в формуле изобретения, подразумевается включительный характер данных терминов аналогично термину «содержащий».

[73] Термин «приблизительно» или «примерно» означает нахождение в пределах допустимого диапазона погрешности для конкретного значения, определенного специалистом в данной области техники, который будет частично зависеть от способа измерения или определения указанного значения, то есть ограничений системы измерения. Например, «приблизительно» может означать в пределах 1 или более 1 среднеквадратического отклонения, в соответствии с практикой в данной области техники. В качестве альтернативы, «приблизительно» может означать диапазон до 20%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5% и еще более предпочтительно до 1% от заданного значения. В качестве альтернативы, особенно в отношении биологических систем или процессов, данный термин может означать в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 5-кратного и более предпочтительно 2-кратного значения. В случаях, где в заявке и формуле изобретения описаны конкретные значения, если не указано иное, термин «приблизительно» означает в пределах допустимого интервала погрешности для конкретного значения.

[74] Если не указано иное, все используемые в настоящем документе термины имеют то же значение, что и для специалиста в данной области техники, и при осуществлении настоящего изобретения будут применяться общепринятые методы микробиологии и технологии рекомбинантных ДНК, которые известны специалистам в данной области техники.

[75] При осуществлении настоящего изобретения применяются, если не указано иное, общепринятые методы цитологии, молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, биохимии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие методы полностью описаны в литературе, например, в источниках «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», second edition (Sambrook et al., 1989); «Oligonucleotide Synthesis» (M. J. Gait, ed., 1984); «Animal Cell Culture» (R. I. Freshney, ed., 1987); «Methods in Enzymology» (Academic Press, Inc.); «Handbook of Experimental Immunology» (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); «Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells» (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); «Current Protocols in Molecular Biology» (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); «PCR: The Polymerase Chain Reaction», (Mullis et al., eds., 1994); и «Current Protocols in Immunology» (J. E. Coligan et al., eds., 1991), каждый из которых явным образом включен в настоящий документ посредством ссылки.

[76] В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения предложены полинуклеотиды, полинуклеотидные кассеты и векторы экспрессии для экспрессии гена в клетках. Также предложены фармацевтические композиции и способы применения любой из композиций для способствования экспрессии гена в клетках, например, в организме индивидуума, например, для лечения или профилактики нарушения. Эти и другие цели, преимущества и признаки изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения подробных сведений о композициях и способах, более полно приведенных ниже.

[77] Настоящее изобретение в целом относится к областям молекулярной биологии и вирусологии и, в частности, к кассетам экспрессии генетической информации и содержащим их векторам, которые могут быть использованы для доставки сегментов нуклеиновой кислоты, кодирующих выбранные терапевтические конструкции (включая, например, пептиды, полипептиды, рибозимы и молекулы каталитических РНК), в выбранные клетки и ткани позвоночных животных. В частности, эти генетические конструкции полезны при разработке векторов для генной терапии, включая, например, LV векторы, для лечения заболеваний, нарушений и функциональных нарушений млекопитающих и, в частности, человека.

[78] Раскрытые композиции могут быть использованы в различных исследовательских, диагностических и терапевтических режимах, включая предотвращение и лечение различных заболеваний человека. Различные композиции и способы согласно изобретению описаны ниже.

[79] Хотя в настоящем документе проиллюстрированы конкретные композиции и способы, подразумевается, что любые из ряда альтернативных композиций и способов применимы и пригодны для применения при осуществлении изобретения. Также подразумевается, что оценка экспрессирующих конструкций и способов согласно изобретению может быть проведена с использованием процедур, стандартных в данной области техники.

[80] В отдельных вариантах осуществления предложены способы и композиции для получения композиций вектора для генной терапии, например, вирусных векторов, содержащих эти кассеты экспрессии генетической информации для применения для получения лекарственных средств, используемых для центральной и направленной генной терапии заболеваний, нарушений и функциональных нарушений у животных, и, в частности, у людей.

[81] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена генная терапия PKD на основе LV вектора, несущего эукариотический промотор PGK, управляющий экспрессией кДНК PKLR. Этот терапевтический вектор может быть использован для трансдукции гемопоэтических стволовых клеток (HSC), которые впоследствии могут быть трансплантированы субъекту. Эктопическая экспрессия RPK нормализует эритроидный компартмент, приводя к коррекции гематологического фенотипа и реверсии патологии органа. Метаболические исследования демонстрируют функциональную коррекцию гликолитического пути в эритроцитах, полученных из генетически скорректированных HSC с PKD, без нарушений метаболизма лейкоцитов. Анализ IS LV в геноме трансплантированных гемопоэтических клеток не демонстрирует никаких признаков генотоксичности ни у одного из подвергшихся трансплантации животных. В целом, результаты подчеркивают терапевтический потенциал вектора PGK-coRPK LV и дают большие надежды на генную терапию PKD и других генетических нарушений метаболизма эритроидных клеток.

[82] В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к LV вектору с RPK для генетической коррекции PKD. Генетическая модификация мышиных PKD-HSC этим вектором может обеспечить эффективную коррекцию гемолитического фенотипа и метаболического профиля эритроцитов у подвергшихся трансплантации мышей с PKD. Никаких признаков нарушений метаболизма лейкоцитов и генотоксичности, обусловленной интеграцией вектора, не наблюдается, что подтверждает терапевтический потенциал вектора PGK-coRPK LV. В целом, результаты предоставляют обнадеживающие доказательства возможности применения генной терапии PKD с помощью LV, предназначенного для клинического применения.

[83] Отдельные варианты осуществления настоящего изобретения включают самоинактивирующийся (SIN) LV вектор, экспрессирующий оптимизированную по кодонам версию гена PLKR человека. Вектор экспрессии содержит промоторную область, кодирующую последовательность и посттранскрипционный регуляторный элемент.

[84] Отдельные варианты осуществления полинуклеотидных кассет согласно настоящему изобретению содержат промоторную область, содержащую промоторную последовательность или ее функциональный фрагмент. В одном из вариантов осуществления промотор представляет собой промотор PGK человека.

[85] Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают полинуклеотидные кассеты для усиленной экспрессии пируваткиназы (например, гена PLKR человека). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная кассета содержит оптимизированную по кодонам версию кДНК PKLR человека (coRPK) для повышения стабильности мРНК при транскрипции. Для оптимизации может быть использовано программное обеспечение GeneArt^®, увеличивающее содержание GC и удаляющее криптические сайты сплайсинга, чтобы избежать сайленсинга транскрипции и, следовательно, повысить экспрессию трансгена. Оптимизированная последовательность coRPK демонстрирует 80,4% гомологии гену PKLR человека без изменений в аминокислотной последовательности белка. В качестве альтернативы может быть использован любой способ оптимизации, известный в данной области техники.

[86] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная кассета содержит сигнал экспорта РНК, расположенный по ходу транскрипции от второго энхансера. Сигнал экспорта РНК может содержать последовательность wPRE. В некоторых вариантах осуществления также включен мутированный wPRE, лишенный какой-либо остаточной открытой рамки считывания (Schambach, Bohne et al., 2006), для улучшения уровня экспрессии и стабильности терапевтического гена. Термин «сигнал экспорта РНК» может относиться к любому из «посттранскрипционных регуляторных элементов», известных в данной области техники. Термины «сигнал экспорта РНК» и «посттранскрипционный регуляторный элемент» и тому подобное используются в настоящем документе взаимозаменяемо, как они обычно используются в области векторных технологий и разработок. Иллюстративные сигналы экспорта РНК или посттранскрипционные регуляторные элементы, используемые в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь перечисленным, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита B (HBVPRE) или конститутивный транспортный элемент (CTE), происходящий из разных ретровирусов обезьян, включая ретровирус обезьян 1 типа (SRV-1) и 2 типа (SRV-2) и Мезон-Пфайзера (MPV). Посттранскрипционные регуляторные элементы описаны в патенте США № 6136597; Donello et al. J. Virol. 72:5085-92 (1998); Hlavaty et al. Virology 341:1-11 (2005); и Oh et al. Retrovirology 4:38 (2007). Другие альтернативные последовательности wPRE описаны в Zanta-Boussif et al. Gene Therapy 16:605-19 (2009). Содержание вышеупомянутых источников полностью включено в настоящий документ.

[87] В некоторых аспектах изобретения предложены векторы доставки генов, содержащие полинуклеотидную кассету согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления вектор доставки гена представляет собой LV.

[88] В некоторых аспектах изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотидную кассету согласно изобретению и фармацевтическое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит вектор доставки гена согласно изобретению и фармацевтическое вспомогательное вещество.

[89] В некоторых аспектах изобретения предложены способы экспрессии трансгена в клетках млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение одной или более клеток млекопитающих в контакт с эффективным количеством полинуклеотидной кассеты согласно изобретению или вектора доставки гена согласно изобретению, где в одной или более клетках млекопитающих экспрессируется трансген на обнаружимых уровнях. В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение одной или более клеток млекопитающих в контакт с эффективным количеством полинуклеотидной кассеты согласно изобретению или вектора доставки гена согласно изобретению, где в одной или более клетках млекопитающих экспрессируется трансген на терапевтических уровнях. В некоторых вариантах осуществления способ осуществляют in vitro. В других вариантах осуществления способ осуществляют in vivo.

[90] В некоторых аспектах изобретения предложены способы лечения или профилактики заболевания или нарушения у млекопитающего, нуждающегося в лечении или профилактике заболевания или нарушения. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение указанному млекопитающему эффективного количества фармацевтической композиции согласно изобретению, где кодирующая последовательность кодирует терапевтический продукт гена.

Композиции

[91] В некоторых аспектах изобретения предложены композиции для экспрессии трансгена в эукариотической клетке (клетках). В некоторых аспектах эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых аспектах клетка млекопитающего представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку костного мозга, например, клетку костного мозга, обедненного по линии клеток. В некоторых аспектах клетка млекопитающего представляет собой коммитированного гемопоэтического предшественника эритроидной клетки.

[92] В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция представляет собой полинуклеотидную кассету. Под «полинуклеотидной кассетой» подразумевается полинуклеотидная последовательность, содержащая две или более функциональных полинуклеотидных последовательностей, например, регуляторных элементов, последовательностей инициации трансляции, кодирующих последовательностей и/или последовательностей терминации, и т. д., обычно в функциональной связи друг с другом. Аналогичным образом под «полинуклеотидной кассетой для экспрессии трансгена в клетке млекопитающего» подразумевается комбинация двух или более функциональных полинуклеотидных последовательностей, например, промотора, энхансера, 5’UTR, последовательности инициации трансляции, кодирующей последовательности и/или последовательностей терминации, и т.д., которая способствует экспрессии трансгена в клетке.

[93] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные кассеты согласно настоящему изобретению обеспечивают усиленную экспрессию трансгена в клетках млекопитающих. В контексте настоящего документа «экспрессия трансгена» или «экспрессирование трансгена» относится как к транскрипции трансгена в матричную РНК (мРНК) клеткой-хозяином, так и к трансляции этой мРНК в полипептид (т. е. продукт трансгена). Таким образом, экспрессия трансгена может быть измерена либо на уровне мРНК (т. е. путем сиквенс-специфичного количественного определения уровня мРНК в клетке), либо на уровне полипептида (т. е. путем измерения уровня полипептида продукта гена с использованием вестерн-блоттинга, иммуноферментного анализа (ELISA), иммунофлуоресцентной микроскопии или других способов количественного определения конкретного полипептида). Как показано в примерах осуществления настоящего изобретения, авторы настоящего изобретения обнаружили ряд полинуклеотидных элементов, то есть улучшенных элементов по сравнению с известными из уровня техники, которые самостоятельно и синергетически обеспечивают усиленную экспрессию трансгенов в клетках млекопитающих. В отдельных вариантах осуществления расположение двух или более функциональных полинуклеотидных последовательностей в полинуклеотидных кассетах согласно настоящему изобретению обеспечивает усиленную экспрессию трансгена в клетках млекопитающих. Под термином «усиленная» подразумевается, что экспрессия трансгена в клетках, несущих полинуклеотидные кассеты согласно настоящему изобретению, повышена, увеличена или является более сильной относительно клеток, несущих трансген, функционально связанный с сопоставимыми регуляторными элементами, например, известными из уровня техники. Другими словами, экспрессия трансгена повышена, увеличена или является более сильной из полинуклеотидных кассет согласно настоящему изобретению по сравнению с экспрессией из полинуклеотидной кассеты, не содержащей один или более оптимизированных элементов согласно настоящему изобретению, то есть сравнительным контролем. В отдельных вариантах осуществления усиленная экспрессия является специфичной для одного или более желаемых типов клеток или ограниченной ими.

[94] Например, экспрессия трансгена может быть усилена, или увеличена, или повышена в клетках, содержащих полинуклеотидную кассету, содержащую промотор, раскрытый в настоящем документа, по сравнению с клетками, несущими трансген, функционально связанный с другим промотором, например, известным из уровня техники. В качестве другого примера, экспрессия трансгена может быть усилена, или повышена, увеличена или быть более сильной в клетках, содержащих полинуклеотидную кассету, содержащую энхансерную последовательность, раскрытую в настоящем документе, по сравнению с клетками, несущими трансген, функционально связанный с другой энхансерной последовательностью.

[95] Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что усиленная экспрессия трансгена в клетках обусловлена более быстрым накоплением продукта гена в клетках или большей стабильностью продукта гена в клетках. Таким образом, усиленная экспрессия трансгена полинуклеотидными кассетами согласно настоящему изобретению может быть определена различными путями. Например, усиленная экспрессия может быть определена по обнаружению экспрессии трансгена после приведения в контакт полинуклеотидной кассеты с клетками раньше, например, на 2 дня раньше, на 7 дней раньше, на 2 недели раньше, на 3 недели раньше, на 4 недели раньше, на 8 недель раньше, на 12 недель раньше или более, чем она была бы обнаружена, если бы трансген был функционально связан с сопоставимыми регуляторными элементами, например, известными из уровня техники. Усиленная экспрессия также может быть определена как увеличение количества продукта гена на клетку. Например, может наблюдаться увеличение количества продукта гена на клетку млекопитающего в 2 раза или более, например, увеличение в 3 раза или более, увеличение в 4 раза или более, увеличение в 5 раз или более, или увеличение в 10 раз или более. Усиленная экспрессия также может быть определена как увеличение количества клеток млекопитающих, экспрессирующих обнаружимые уровни трансгена, переносимого полинуклеотидной кассетой. Например, может наблюдаться увеличение количества клеток млекопитающих, экспрессирующих обнаружимые уровни трансгена, в 2 раза или более, например, увеличение в 3 раза или более, увеличение в 4 раза или более, увеличение в 5 раз или более, или увеличение в 10 раз или более.

[96] В качестве другого примера, полинуклеотид согласно настоящему изобретению может обеспечивать обнаружимые уровни трансгена в более высоком проценте клеток по сравнению с обычной полинуклеотидной кассетой; например, если обычная кассета может обеспечивать обнаружимые уровни экспрессии трансгена, например, в менее чем 5% клеток в определенной области, полинуклеотид согласно настоящему изобретению обеспечивает обнаружимые уровни экспрессии в 5% или более клеток в этой области; например, 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, или 45% или более, в некоторых случаях 50% или более, 55% или более; 60% или более, 65% или более, 70% или более, или 75% или более, например, 80% или более, 85% или более, 90% или более или 95% или более клеток, которые были приведены в контакт, будут экспрессировать обнаружимые уровни продукта гена. Усиленная экспрессия также может быть определена как изменение жизнеспособности и/или функции клеток.

[97] Полинуклеотидные кассеты согласно настоящему изобретению обычно содержат промоторную область. Любая подходящая промоторная область или промоторная последовательность в ней могут быть использованы в рассматриваемых полинуклеотидных кассетах при условии, что промоторная область способствует экспрессии кодирующей последовательности в эукариотических клетках. В отдельных вариантах осуществления промоторная область способствует экспрессии кодирующей последовательности в клетках млекопитающих. В некоторых случаях промотор является универсальным промотором, то есть представляет собой промотор, активный в широком диапазоне клеток, тканей и видов. В других случаях промотор является промотором PGK человека.

[98] Промоторные и энхансерные элементы могут быть тканеспецифичными или специфичными для стадии. Например, тканеспецифичный промотор или энхансер избирательно управляет экспрессией (или более высоким уровнем экспрессии) в одном или более конкретных типах клеток. Примеры типов клеток включают, не ограничиваясь перечисленным, гемопоэтические стволовые клетки, долгосрочные гемопоэтические стволовые клетки, краткосрочные гемопоэтические стволовые клетки, мультипотентные предшественники, гемопоэтические CD34+ клетки и любая субпопуляция кластера дифференцировки в CD34+ популяции. Специфичный для стадии промотор или энхансер избирательно управляет экспрессией (или более высоким уровнем экспрессии) во время одной или более определенных стадий клеточного цикла или развития. Они включают, не ограничиваясь перечисленным, область контроля локуса бета-глобина, промотор спектрина и эритроид-специфичный промотор.

[99] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит один или более энхансеров. Энхансеры представляют собой элементы нуклеиновых кислот, которые, как известно в данной области техники, усиливают транскрипцию, и могут быть расположены в любом месте в ассоциации с геном, который они регулируют, например, против хода транскрипции, по ходу транскрипции, в интроне и т.д. Любой энхансерный элемент может быть использован в полинуклеотидных кассетах и векторах для генной терапии согласно настоящему изобретению при условии, что он усиливает экспрессию гена при использовании в комбинации с промотором.

[100] Кодирующая последовательность, которая должна экспрессироваться в клетках, может представлять собой любую полинуклеотидную последовательность, например, ген или кДНК, кодирующую продукт гена, например, полипептид или терапевтическое средство на основе РНК (миРНК, антисмысловой, рибозима, мшРНК и т.д.). Кодирующая последовательность может быть гетерологичной по отношению к промоторной последовательности, с которой она функционально связана, т.е. быть не связанной с ней в природе. В качестве альтернативы, кодирующая последовательность может быть эндогенной по отношению к промоторной последовательности, с которой она функционально связана, т. е. быть связанной с этим промотором в природе. Продукт гена может действовать внутри клетки млекопитающего или он может действовать извне, например, он может секретироваться. Например, когда трансген представляет собой терапевтический ген, кодирующая последовательность может представлять собой любой ген, кодирующий желаемый продукт гена или его функциональный фрагмент или вариант, который может применяться в качестве терапевтического средства для лечения заболевания или нарушения. В различных предпочтительных вариантах осуществления трансген кодирует PKLR человека.

[101] В одном из вариантов осуществления изобретения кодирующая последовательность трансгена модифицирована или «оптимизирована по кодонам» для усиления экспрессии путем замены редко встречающихся кодонов более часто встречающимися кодонами. Кодирующая последовательность представляет собой часть последовательности мРНК, кодирующую аминокислоты для трансляции. Во время трансляции каждый из 61 тринуклеотидного кодона транслируется в одну из 20 аминокислот, что приводит к вырожденности или избыточности в генетическом коде. Однако разные типы клеток и разные виды животных используют тРНК (каждая из которых содержит антикодон), кодирующие одни и те же аминокислоты с различной частотой. Когда последовательность гена содержит кодоны, редко представленные соответствующей тРНК, механизм трансляции в рибосомах может замедляться, препятствуя эффективной трансляции. Экспрессия может быть улучшена с помощью «оптимизации кодонов» для конкретного вида, при которой кодирующую последовательность изменяют так, чтобы она кодировала ту же последовательность белка, но с использованием кодонов, которые широко представлены и/или используются высокоэкспрессируемыми белками человека (Cid-Arregui et al., 2003; J. Virol. 77: 4928). В одном из аспектов настоящего изобретения кодирующая последовательность трансгена модифицирована для замены кодонов, редко экспрессируемых у млекопитающих или приматов, кодонами, часто экспрессируемыми у приматов. Например, в некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность, кодируемая трансгеном, кодирует полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична полипептиду, кодируемому последовательностью, раскрытой выше или в настоящем документе, например, по меньшей мере на 90% идентична, например, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 98% идентична, по меньшей мере на 99% идентична, где по меньшей мере один кодон кодирующей последовательности имеет более высокую частоту тРНК у людей, чем соответствующий кодон в последовательности, раскрытой выше или в настоящем документе.

[102] В дополнительном варианте осуществления изобретения кодирующая последовательность трансгена модифицирована для усиления экспрессии путем прерывания или удаления открытых рамок считывания (ORF), которые не кодируют желаемый трансген. Открытая рамка считывания (ORF) представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая следует за стартовым кодоном и не содержит стоп-кодона. ORF могут иметь прямую или обратную ориентацию и могут быть «в рамке» или «вне рамки» по сравнению с представляющим интерес геном. Такие открытые рамки считывания могут быть экспрессированы в кассете экспрессии наряду с представляющим интерес геном и могут приводить к нежелательным побочным действиям. В одном из аспектов настоящего изобретения кодирующая последовательность трансгена модифицирована для удаления открытых рамок считывания путем дополнительного изменения использования кодонов. Это осуществляют путем удаления стартовых кодонов (ATG) и введения стоп-кодонов (TAG, TAA или TGA) в ORF в обратной ориентации или внерамочные ORF, сохраняя при этом аминокислотную последовательность и сохраняя в представляющем интерес гене часто используемые кодоны (т. е. избегая кодонов с частотой < 20%). В настоящем изобретении кодирующая последовательность трансгена может быть оптимизирована путем оптимизации кодонов и удаления не относящихся к трансгену ORF, либо с использованием обеих этих методик. Как будет очевидно специалисту в данной области техники, предпочтительно удалять или минимизировать не относящиеся к трансгену ORF после оптимизации кодонов для удаления ORF, введенных во время оптимизации кодонов.

[103] Последовательность RRE повышает эффективность переноса генов. В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, последовательность RRE содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

AGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCT (SEQ ID NO: 1).

[104] Ретровирусная лидерная область содержит сигнал упаковки (Ψ), участвующий в упаковке ретровирусного генома в вирусный капсид. Полагали, что для LV векторов требуется приблизительно 300 п. н. гена Gag в этой области. В настоящее время эта последовательность Gag была уменьшена до всего 40 п. н. (фиг. 1). В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, последовательность ψ представляет собой последовательность ψ ВИЧ-1, или последовательность ψ содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

CTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTC (SEQ ID NO: 2).

[105] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, усеченный 5’-LTR ВИЧ-1 содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA (SEQ ID NO: 3).

[106] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, самоинактивирующийся 3’-LTR содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA (SEQ ID NO: 4).

[107] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, предранний промотор цитомегаловируса (CMV) человека содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

GTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT (SEQ ID NO: 5).

[108] Было обнаружено, что cPPT, облегчающий ядерную транслокацию прединтеграционных комплексов, вместе с CTS, участвующей в разделении обратной транскриптазы, улучшает титр вируса (Zennou, et al. 2000; Follenzi et al. 2000). В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, центральный полипуриновый тракт и центральная терминирующая последовательность ВИЧ-1 (cPPT/CTS) содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

TTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTT (SEQ ID NO: 6).

[109] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, промотор фосфоглицераткиназы 1 человека (hPGK) содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

GGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG (SEQ ID NO:7).

[110] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, оптимизированная по кодонам версия кДНК PKLR человека (coRPK) содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

ATGAGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGCTGA (SEQ ID NO: 8).

[111] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, энхансер CMV человека содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG (SEQ ID NO: 9).

[112] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, сигнал поли(А) вируса обезьян 40 (SV40) содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA (SEQ ID NO: 10).

[113] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, ориджин репликации SV40 содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

ATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCC (SEQ ID NO: 11).

[114] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, cPPT, присутствующий в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности: TTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGT (SEQ ID NO: 12), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 12.

[115] В некоторых вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, сигнал dNEF, присутствующий в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности:

GAATTCGAGCTCGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGAC (SEQ ID NO: 13), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 13.

[116] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, последовательность NeoR/KanR, присутствующая в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности:

ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA (SEQ ID NO: 14), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 14.

[117] В некоторых вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, терминатор rrnG (терминатор транскрипции из оперона rrnG рибосомной РНК E.coli (Albrechtsen et al., 1991)), присутствующий в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности:

GCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAA (SEQ ID NO: 15), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 15.

[118] В некоторых вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, ori (ориджин репликации многокопийной ColE1/pMB1/pBR322/pUC), присутствующая в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности:

TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA (SEQ ID NO: 16), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 16.

[119] В некоторых вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, сайт связывания CAP, присутствующий в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности: TAATGTGAGTTAGCTCACTCAT (SEQ ID NO: 17), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 17.

[120] В некоторых вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, промотор lac E.coli, присутствующий в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности: TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTG (SEQ ID NO: 18), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 18.

[121] В некоторых вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, оператор lac, присутствующий в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности: TTGTGAGCGGATAACAA (SEQ ID NO: 19), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 19.

[122] В некоторых вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, промотор T3 (промотор для РНК-полимеразы бактериофага T3), присутствующий в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности: AATTAACCCTCACTAAAGG (SEQ ID NO: 20), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 20.

[123] В некоторых вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, энхансер CMV, присутствующий в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности:

GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG (SEQ ID NO: 21), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 21.

[124] В некоторых вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, промотор T7 (промотор для РНК-полимеразы бактериофага T7), присутствующий в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности: CCTATAGTGAGTCGTATTA (SEQ ID NO: 22), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 22.

[125] В некоторых вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, ori f1 (ориджин репликации бактериофага f1), присутствующая в любых с кассет экспрессии или векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности:

ACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATT (SEQ ID NO: 23), или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 23.

[126] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная кассета согласно настоящему изобретению дополнительно содержит сигнал экспорта РНК. Иллюстративные последовательности экспорта РНК включают, не ограничиваясь перечисленным, wPRE. wPRE значительно увеличивает экспрессию трансгена в клетках-мишенях, повышая стабильность РНК трансген-, промотор- и вектор-независимым образом (Zuffrey et al., 1999). Однако он может экспрессировать усеченный белок из 60 аминокислот, полученный из гена X WHV, участвующего в развитии рака печени (Kingsman et al., 2005). Поэтому большинство доклинических разработок и клинических исследований включают мутированную версию элемента wPRE (Zanta-Boussif et al., 2009). С другой стороны, использование двух элементов SV40-USE в векторах SIN-LV показало себя более эффективным, чем последовательность wPRE, в подавлении транскрипционного сквозного прохождения (Schambach et al., 2007). А именно, wPRE, раскрытый в настоящем документе, представляет собой химерный wPRE, несущий 589 нуклеотидов из модифицированного WPRE, полученного Axel Schambach (нуклеотиды 1-589) (WO 2008136670 A2; [5]) и 88 из прежнего wPRE (нуклеотиды 590-677) (Zuffrey et al., 1999). Данные, раскрытые в настоящем документе, демонстрируют, что этот химерный wPRE функционирует лучше, чем прежний wPRE. Последовательность химерного wPRE содержит следующую последовательность:

CGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (SEQ ID NO: 24).

[127] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, последовательность wPRE содержит или состоит из последовательности SEQ ID NO: 24 или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности SEQ ID NO: 24.

CGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (SEQ ID NO: 24)

[128] Другие комбинации элементов, как раскрытых в настоящем документе, так и известных в данной области техники, будут очевидны специалисту в данной области техники.

[129] Кроме того, как будет ясно специалисту в данной области техники, полинуклеотидные кассеты могут необязательно содержать другие элементы, включая, не ограничиваясь перечисленным, сайты рестрикции для облегчения клонирования и регуляторные элементы для вектора экспрессии конкретного гена.

[130] В некоторых аспектах настоящего изобретения рассматриваемые полинуклеотидные кассеты используются для доставки гена в клетки животного, например, для определения влияния, которое ген оказывает на жизнеспособность и/или функцию клеток, для лечения клеточного нарушения и т. д. Соответственно, в некоторых аспектах изобретения композиция, обеспечивающая экспрессию трансгена в клетках млекопитающих, представляет собой вектор доставки гена, где указанный вектор доставки гена содержит полинуклеотидные кассеты согласно настоящему изобретению.

[131] Любой подходящий вектор для генной терапии, применяемый для доставки полинуклеотидных последовательностей в клетки млекопитающих, охватывается векторами доставки генов согласно настоящему изобретению. Например, вектор может содержать одноцепочечную или двухцепочечную нуклеиновую кислоту, например, одноцепочечную или двухцепочечную ДНК. Например, вектор доставки гена может представлять собой ДНК, например, голую ДНК, например, плазмиду, миникольцо и т.д. Вектор может содержать одноцепочечную или двухцепочечную РНК, включая модифицированные формы РНК. В еще одном примере вектор доставки гена может представлять собой РНК, например, мРНК или модифицированную мРНК.

[132] В качестве другого примера, вектор доставки гена может представлять собой вирусный вектор, полученный из вируса, например, аденовируса, аденоассоциированного вируса, LV, вируса герпеса, альфавируса или ретровируса, например, вируса лейкоза мышей Молони (M-MuLV), вируса саркомы мышей Молони (MoMSV), вируса саркомы мышей Харви (HaMuSV), вируса опухоли молочной железы мыши (MuMTV), вируса лейкоза гиббонов (GaLV), вируса лейкоза кошачьих (FLV), спумавируса, вируса лейкоза мышей Френда, вируса стволовых клеток мышей (MSCV) или вируса саркомы Рауса (RSV). Хотя варианты осуществления, охватывающие применение LV, более подробно описаны ниже, ожидается, что специалисту в данной области техники будет ясно, что аналогичные сведения и навыки в данной области техники могут быть применены также к векторам для генной терапии, не основанным на LV.

[133] В некоторых вариантах осуществления вектор доставки гена представляет собой самоограничивающийся LV. В некоторых вариантах осуществления вектор доставки гена представляет собой самоинактивирующийся LV. В некоторых вариантах осуществления вектор доставки гена представляет собой неинтегрирующийся LV. В конкретном варианте осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, самоограничивающийся LV (фиг. 22 и 23) согласно изобретению содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

GTGTTTAAACCTAGATATTGATAGTCTGATCGGTCAACGTATAATCGAGTCCTAGCTTTTGCAAACATCTATCAAGAGACAGGATCAGCAGGAGGCTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGACCGATTCTAGGTGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAACGATCGGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTGCAAGCTTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCGATCACGAGACTAGCCTCGAGAAGCTTGATATCGAATTCCACGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAGGGGGATCCGTCGACACCGGTGCCACCATGAGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGCTGACCGCGGTCTAGAGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCTCGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGGACGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATCGTTCCCTCAGGACGTC (SEQ ID NO: 25).

[134] В конкретном варианте осуществления кассет экспрессии, описанных в настоящем документе, экспрессия содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

GGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAGGGGGATCCGTCGACACCGGTGCCACCATGAGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGCTGACCGCGGTCTAGAGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCC (SEQ ID NO: 26).

[135] В таких вариантах осуществления рассматриваемая полинуклеотидная кассета фланкирована на 5’- и 3’-концах функциональными последовательностями LTR. В одном из вариантов осуществления положение различных элементов, присутствующих в основной структуре LV вектора, изображено на фиг. 1. Обе последовательности LTR были модифицированы для получения SIN LV векторов. SIN векторы имеют делецию в 400 п. н. в 3’-LTR, охватывающую промоторные/энхансерные элементы из области U3. Экспрессия трансгена, таким образом, зависит от внутренних промоторов, что снижает риск RCL и уменьшает интерференцию промоторов (Ginn et al., 2003). Посредством этой делеции в 3’-LTR удаляется TATA-бокс, что предотвращает инициацию транскрипции (Miyoshi et al., 1998; Zuffrey et al 1998); и, следовательно, инактивирует вектор. Область U3 5’-LTR была заменена другими гетерологичными промоторными последовательностями (т. е. CMV или RSV) для достижения Tat-независимой транскрипции и для повышения синтеза геномной РНК, что приводит к увеличению титра вируса. Поскольку 5’-концевая область U3 управляет экспрессией первичных транскриптов, ее модификации не будут присутствовать в трансдуцированных клетках (Schambach et al., 2009).

[136] Экзогенные элементы, такие как сигналы полиаденилирования β-глобина или SV40 (Iwakuma et al., 1999) или USE из SV40-USE (Schambach et al., 2007), также были включены в R-область 3’LTR вируса для уменьшения транскрипционного сквозного прохождения от внутренних промоторов (Zaiss et al., 2002) или от остатков удаленной области U3 SIN-LV векторов (Almarza et al., 2011), что предотвращает потенциальную активацию транскрипции генов, расположенных ниже по ходу транкрипции.

[137] В отдельных вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор доставки гена, например, LV, содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую следующие последовательности, в порядке от 5’- к 3’-концу:

a) последовательность промотора PGK, необязательно последовательность промотора PGK человека;

b) последовательность, кодирующую полипептид пируваткиназы, необязательно кодирующую последовательность или последовательность кДНК coRPK; и

c) последовательность мутированного wPRE, необязательно содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 24.

[138] В отдельных вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор доставки гена, например, LV, содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую следующие последовательности, в порядке от 5’- к 3’-концу:

a) последовательность cPPT;

b) последовательность промотора PGK, необязательно последовательность промотора PGK человека;

c) последовательность, кодирующую полипептид пируваткиназы, необязательно кодирующую последовательность или последовательность кДНК coRPK; и

d) последовательность мутированного wPRE, необязательно содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 24.

[139] В отдельных вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор доставки гена, например, LV, содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую следующие последовательности, в порядке от 5’- к 3’-концу:

a) 5’ LTR, необязательно модифицированный 5’ LTR;

b) последовательность cPPT;

c) последовательность промотора PGK, необязательно последовательность промотора PGK человека;

d) последовательность, кодирующую полипептид пируваткиназы, необязательно кодирующую последовательность или последовательность кДНК coRPK;

e) последовательность мутированного wPRE, необязательно содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 24; и

f) 3’ LTR, необязательно модифицированный 3’ LTR.

[140] В отдельных вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор доставки гена, например, LV, содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую следующие последовательности, в порядке от 5’- к 3’-концу:

a) 5’ LTR, необязательно модифицированный 5’ LTR;

b) последовательность cPPT;

c) последовательность промотора PGK, необязательно последовательность промотора PGK человека;

d) последовательность, кодирующую полипептид пируваткиназы, необязательно кодирующую последовательность или последовательность кДНК coRPK;

e) последовательность мутированного wPRE, необязательно содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 24;

f) 3’ LTR, необязательно модифицированный 3’ LTR;

g) сигнал поли(А) SV40; и

h) ориджин репликации (ori) SV40.

[141] В отдельных вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор доставки гена, например, LV, содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую следующие последовательности, в порядке от 5’- к 3’-концу:

a) 5’ LTR, необязательно модифицированный 5’ LTR;

b) последовательность cPPT;

c) последовательность промотора PGK, необязательно последовательность промотора PGK человека;

d) последовательность, кодирующую полипептид пируваткиназы, необязательно кодирующую последовательность или последовательность кДНК coRPK;

e) последовательность мутированного wPRE, необязательно содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 24;

f) 3’ LTR, необязательно модифицированный 3’ LTR;

g) сигнал поли(А) SV40;

h) ориджин репликации (ori) SV40;

i) промотор Т7;

j) ori f1; и

k) последовательность NeoR/KanR.

[142] В отдельных вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор доставки гена, например, LV, содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую следующие последовательности, в порядке от 5’- к 3’-концу:

a) 5’ LTR, необязательно модифицированный 5’ LTR;

b) последовательность ψ ВИЧ-1;

c) RRE;

d) последовательность cPPT/CTS;

e) последовательность промотора PGK, необязательно последовательность промотора PGK человека;

f) последовательность, кодирующую полипептид пируваткиназы, необязательно кодирующую последовательность или последовательность кДНК coRPK;

g) последовательность мутированного wPRE, необязательно содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 24;

h) сигнал dNEF;

i) 3’ LTR, необязательно модифицированный 3’ LTR;

j) сигнал поли(А) SV40;

k) ориджин репликации (ori) SV40;

l) промотор Т7;

m) ori f1;

n) последовательность NeoR/KanR;

o) терминатор rrnG;

р) последовательность ori;

q) сайт связывания CAP;

r) последовательность промотора lac;

s) последовательность оператора lac;

t) последовательность промотора Т3;

u) последовательность энхансера CMV; и

v) последовательность промотора CMV.

[143] В отдельных вариантах осуществления вектор доставки гена представляет собой PGK-coRPK LV или содержит элементы, изображенные на ФИГ. 21.

[144] В отдельных вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор доставки гена, например, LV, содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую следующие последовательности, в порядке от 5’- к 3’-концу:

a) 5’ LTR, необязательно модифицированный 5’ LTR;

b) последовательность ψ ВИЧ-1;

c) RRE;

d) последовательность cPPT/CTS;

e) последовательность промотора PGK, необязательно последовательность промотора PGK человека;

f) последовательность, кодирующую полипептид пируваткиназы, необязательно кодирующую последовательность или последовательность кДНК coRPK;

g) последовательность мутированного wPRE, необязательно содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 24;

h) необязательно, сигнал dNEF;

i) 3’ LTR, необязательно модифицированный 3’ LTR;

j) сигнал поли(А) SV40;

k) ориджин репликации (ori) SV40;

l) промотор Т7;

m) ori pUC;

u) последовательность энхансера CMV; и

v) последовательность промотора CMV.

[145] В частных вариантах осуществления любых с кассет экспрессии и векторов доставки генов, описанных в настоящем документе, кДНК или кодирующая последовательность coRPK кодирует полипептид PKLR, содержащий или состоящий из последовательности, раскрытой в любом из номеров доступа GenBank XP_016856982.1, XP_011507942.1, XP_006711449.1, NP_870986.1 или NP_000289.1, или функционального фрагмента любой из этих последовательностей, или последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью любой из этих последовательностей.

[146] Векторы для генной терапии, инкапсулирующие полинуклеотидные кассеты согласно настоящему изобретению, могут быть получены с использованием стандартной методики. Например, в случае LV вирионов LV вектор экспрессии согласно изобретению может быть введен в клетку-продуцента с последующим введением вспомогательной конструкции LV, где вспомогательная конструкция включает кодирующие области LV, способные экспрессироваться в клетке-продуценте и дополняющие вспомогательные функции LV, отсутствующие в LV векторе. Затем следует введение вируса-помощника и/или дополнительных векторов в клетку-продуцента, где вирус-помощник и/или дополнительные векторы обеспечивают вспомогательные функции, способные поддерживать эффективную продукцию LV вируса. Затем клетки-продуценты культивируют для получения LV. Эти стадии выполняют с использованием стандартной методики.

[147] Может быть использован любой подходящий способ получения вирусных частиц для доставки рассматриваемых полинуклеотидных кассет, включая, не ограничиваясь перечисленным, способы, описанные в приведенных ниже примерах. Для контакта с клетками млекопитающих in vitro или in vivo может быть приготовлена любая концентрация вирусных частиц, подходящая для эффективной трансдукции клеток млекопитающих. Например, вирусные частицы могут быть приготовлены в концентрации 10⁸ векторных геномов на мл или более, например, 5x10⁸ векторных геномов на мл; 10⁹ векторных геномов на мл; 5 x 10⁹ векторных геномов на мл, 10¹⁰ векторных геномов на мл, 5x10¹⁰ векторных геномов на мл; 10¹¹ векторных геномов на мл; 5 x10¹¹ векторных геномов на мл; 10¹² векторных геномов на мл; 5x10¹² векторных геномов на мл; 10¹³ векторных геномов на мл; 1.5 x10¹³ векторных геномов на мл; 3x10¹³ векторных геномов на мл; 5x10¹³ векторных геномов на мл; 7.5x10¹³ векторных геномов на мл; 9x10¹³ векторных геномов на мл; 1 x 10¹⁴ векторных геномов на мл, 5 x 10¹⁴ векторных геномов на мл или более, но обычно не более 1 x 10¹⁵ векторных геномов на мл.

[148] При приготовлении рассматриваемых композиций LV для продуцирования LV вирионов могут быть использованы любые клетки-хозяева, включая, например, клетки млекопитающих (например, клетки 293), клетки насекомых (например, клетки SF9), микроорганизмы и дрожжи. Клетки-хозяева также могут представлять собой упаковывающие клетки, в которых гены LV rep и cap стабильно поддерживаются в клетке-хозяине или клетках-продуцентах, в которых упакован и стабильно поддерживается геном LV вектора. Иллюстративные упаковывающие клетки и клетки-продуценты происходят из клеток SF-9, 293, A549 или HeLa. Векторы LV очищают и вводят в состав препарата с использованием стандартных методик, известных в данной области техники.

[149] В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение включает клетку, содержащую кассету экспрессии или вектор доставки гена, раскрытые в настоящем документе. В связанных вариантах осуществления клетка трансдуцирована вирусным вектором, содержащим кассету экспрессии, раскрытую в настоящем документе, или кассета экспрессии, раскрытая в настоящем документе, интегрирована в геном клетки. В отдельных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку, используемую для продуцирования вирусного вектора доставки гена. В других вариантах осуществления клетка представляет собой клетку, подлежащую доставке субъекту, чтобы предоставить субъекту продукт гена, кодируемый кассетой экспрессии. Таким образом, в отдельных вариантах осуществления клетка является аутологичной для субъекта, подлежащего лечению, или была получена от субъекта, подлежащего лечению. В других вариантах осуществления клетка является аллогенной для субъекта, подлежащего лечению, или была получена от донора, отличного от субъекта, подлежащего лечению. В частных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего, например, клетку человека. В отдельных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку крови, эритроцит, гемопоэтическую клетку-предшественника, клетку костного мозга, подвергнутую, обедненного по линии клеток, гемопоэтическую стволовую клетку (например, CD34+) или коммитированного гемопоэтического предшественника эритроидной клетки.

[150] Настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотидную кассету, вектор доставки гена или клетку, описанные в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Рассматриваемая полинуклеотидная кассета, вектор доставки гена или клетка могут быть объединены с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и реагентами, подходящими для приготовления препарата, который в целом является безопасным, нетоксичным и целесообразным, и включает вспомогательные вещества, приемлемые для применения у приматов. Такие вспомогательные вещества могут быть твердыми, жидкими, полужидкими или, в случае аэрозольной композиции, газообразными. Примеры таких вспомогательных веществ, носителей или разбавителей включают, не ограничиваясь перечисленным, воду, физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% человеческий сывороточный альбумин. В препараты также могут быть включены дополнительные активные соединения. Растворы или суспензии, используемые для препаратов, могут включать стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные соединения, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразующие соединения, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; детергенты, такие как Твин 20, для предотвращения агрегации; и соединения для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. pH может быть скорректирован с помощью кислот или оснований, таких как соляная кислота или гидроксид натрия. В частных вариантах осуществления фармацевтические композиции являются стерильными.

[151] Фармацевтические композиции, подходящие для применения в настоящем изобретении, дополнительно включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий.

[152] Стерильные растворы могут быть получены путем объединения активного соединения в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизующей фильтрацией. Обычно дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофилизация, которые позволяют получить порошок активного ингредиента в комбинации с любым дополнительным желаемым ингредиентом из их раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией.

[153] В одном из вариантов осуществления композиции готовят с носителями, которые будут защищать кассеты генов или векторы экспрессии от быстрого выведения из организма, такими как состав с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы поддающиеся биологическому разложению, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы приготовления таких препаратов будут очевидны для специалистов в данной области техники. Материалы также могут быть получены коммерчески.

[154] Особенно предпочтительным является приготовление пероральных, офтальмологических или парентеральных композиций в виде единичной дозированной формы для простоты введения и единообразия дозировок. Единичная дозированная форма в контексте настоящего документа относится к физически разделенным единицам, пригодным в качестве однократных доз для субъекта, подлежащего лечению; причем каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Характеристики единичных дозированных форм согласно изобретению обусловлены и напрямую зависят от уникальных характеристик активного соединения, а также от конкретного требуемого терапевтического эффекта, и от ограничений, существующих в области приготовления препаратов такого активного соединения для лечения индивидуумов.

[155] Фармацевтические композиции могут быть помещены в емкость, упаковку или дозатор, например, шприц, например, предварительно заполненный шприц, вместе с инструкциями по введению.

[156] Фармацевтические композиции согласно изобретению охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любое другое соединение, которое при введении животному, включающему человека, способно обеспечить (прямо или опосредованно) биологически активный метаболит или его остаток.

[157] Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений согласно изобретению, то есть солям, которые сохраняют желаемую биологическую активность исходного соединения и не наделяют его нежелательными токсическими действиями. Различные фармацевтически приемлемые соли известны в данной области техники и описаны, например в «Remington’s Pharmaceutical Sciences», 17-е издание, Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 (и его более поздних изданиях), в «Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology», 3-е издание, James Swarbrick (Ed.), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007, и в J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977). Кроме того, обзор подходящих солей см. в Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use за авт. Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002).

[158] Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания получают с металлами или аминами, такими как щелочные и щелочноземельные металлы или органические амины. Металлы, используемые в качестве катионов, включают натрий, калий, магний, кальций и тому подобные. Амины включают N-N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, дициклогексиламин, этилендиамин, N-метилглюкамин и прокаин (см., например, Berge et al., «Pharmaceutical Salts», J. Pharma Sci., 1977, 66, 119). Соли присоединения основания указанных кислотных соединений получают приведением формы свободной кислоты в контакт с достаточным количеством желаемого основания для получения соли общепринятым способом. Форма свободной кислоты может быть регенерирована путем приведения солевой формы в контакт с кислотой и выделения свободной кислоты общепринятым способом. Формы свободной кислоты несколько отличаются от их соответствующих солевых форм некоторыми физическими свойствами, такими как растворимость в полярных растворителях, но в остальном соли являются эквивалентными их соответствующей свободной кислоте для целей настоящего изобретения.

[159] Рассматриваемая полинуклеотидная кассета, вектор доставки гена, например, рекомбинантный вирус (вирионы), или клетка (например, трансдуцированная вектором доставки гена, раскрытым в настоящем документе) могут быть включены в фармацевтические композиции для введения пациентам-млекопитающим, в частности, приматам, и более конкретно людям. Рассматриваемая полинуклеотидная кассета, вектор доставки гена, например, вирионы, или клетка могут быть приготовлены в виде препарата в нетоксичных, инертных, фармацевтически приемлемых водных носителях, предпочтительно при рН в диапазоне от 3 до 8, более предпочтительно в диапазоне от 6 до 8. Такие стерильные композиции будут содержать вектор или вирион, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтическую молекулу, растворенные в водном буфере, имеющем приемлемый pH при разведении.

[160] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предложенная в настоящем документе, содержит терапевтически эффективное количество клетки, вектора или вириона, раскрытых в настоящем документе, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем и/или вспомогательным веществом, например, физиологическим раствором, натрий-фосфатным буфером, фосфатом и аминокислотами, полимерами, многоатомными спиртами, сахарами, буферами, консервантами и другими белками. Примерами аминокислот, полимеров и сахаров и тому подобного являются соединения октилфеноксиполиэтоксиэтанола, соединения моностеарата полиэтиленгликоля, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, сахароза, фруктоза, декстроза, мальтоза, глюкоза, маннит, декстран, сорбит, инозитол, галактитол, ксилит, лактоза, трегалоза, бычий или человеческий сывороточный альбумин, цитрат, ацетат, растворы Рингера и Хэнка, цистеин, аргинин, карнитин, аланин, глицин, лизин, валин, лейцин, поливинилпирролидон, полиэтилен и гликоль. Предпочтительно этот препарат стабилен в течение по меньшей мере шести месяцев при 4°С.

[161] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предложенная в настоящем документе, содержит буфер, такой как натрий-фосфатный буфер (PBS) или фосфат натрия/сульфат натрия, трис-буфер, глициновый буфер, стерильная вода и другие буферы, известные обычному специалисту, такие как описанные в Good et al. (1966) Biochemistry 5:467. pH буфера, в котором приготовлена фармацевтическая композиция, содержащая ген-супрессор опухолей, содержащийся в системе доставки на основе аденовирусного вектора, может находиться в диапазоне от 6,5 до 7,75, предпочтительно от 7 до 7,5 и наиболее предпочтительно от 7,2 до 7,4.

[162] В отдельных вариантах осуществления вирусные векторы могут быть включены в состав препарата в любой подходящей однократной дозировке, включая, не ограничиваясь перечисленным, 1x10⁸ векторных геномов или более, например, 1x10⁹, 1x10¹⁰, 1x10¹¹, 1x10¹² или 1x10¹³ векторных геномов или более, в отдельных случаях 1x10¹⁴ векторных геномов, но обычно не более 4x10¹⁵ векторных геномов. В некоторых случаях однократная дозировка составляет не более приблизительно 5x10¹⁵ векторных геномов, например, 1x10¹⁴ векторных геномов или менее, например, 1x10¹³, 1x10¹², 1x10¹¹, 1x10¹⁰ или 1x10⁹ векторных геномов или менее, в отдельных случаях 1x10⁸ векторных геномов или менее, и как правило не менее 1x10⁸ векторных геномов. В некоторых случаях однократная дозировка составляет от 1x10¹⁰ до 1x10¹¹ векторных геномов. В некоторых случаях однократная дозировка составляет от 1x10¹⁰ до 3x10¹² векторных геномов. В некоторых случаях однократная дозировка составляет от 1x10⁹ до 3x10¹³ векторных геномов. В некоторых случаях однократная дозировка составляет от 1x10⁸ до 3x10¹⁴ векторных геномов. В одном из вариантов осуществления диапазон составляет от приблизительно 5x10¹⁰ до приблизительно 1x10¹¹ векторных геномов. В некоторых вариантах осуществления диапазон составляет от приблизительно 1x10⁹ до приблизительно 1x10¹⁰ векторных геномов.

[163] В некоторых случаях однократная дозировка фармацевтической композиции может быть измерена с использованием множественности заражения (MOI). Под MOI подразумевается соотношение или кратность векторных или вирусных геномов к клеткам, в которые может быть доставлена нуклеиновая кислота. В некоторых случаях MOI может составлять 1x10⁶. В некоторых случаях MOI может составлять 1x10⁵ -1x10⁷. В некоторых случаях MOI может составлять 1x10⁴-1x10⁸. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы согласно изобретению имеют MOI, равную по меньшей мере приблизительно 1x10¹, 1x10², 1x10³, 1x10⁴, 1x10⁵, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸, 1x10⁹, 1x10¹⁰, 1x10¹¹, 1x10¹², 1x10¹³, 1x10¹⁴, 1x10¹⁵, 1x10¹⁶, 1x10¹⁷ и 1x10¹⁸. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы согласно данному изобретению имеют MOI от 1x10⁸ до 3x10¹⁴. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы согласно изобретению имеют MOI, равную не более 1x10¹, 1x10², 1x10³, 1x10⁴, 1x10⁵, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸, 1x10⁹, 1x10¹⁰, 1x10¹¹, 1x10¹², 1x10¹³, 1x10¹⁴, 1x10¹⁵, 1x10¹⁶, 1x10¹⁷ и 1x10¹⁸. В некоторых вариантах осуществления диапазон MOI составляет от приблизительно 20 до приблизительно 400.

[164] В некоторых аспектах количество фармацевтической композиции содержит от приблизительно 1 x 10⁸ до приблизительно 1 x 10¹⁵ рекомбинантных вирусов, от приблизительно 1 x 10⁹ до приблизительно 1 x 10¹⁴ рекомбинантных вирусов, от приблизительно 1 x 10¹⁰ до приблизительно 1 x 10¹³ рекомбинантных вирусов или от приблизительно 1 x 10¹¹ до приблизительно 3 x 10¹² рекомбинантных вирусов.

МЕТОДЫ

[165] Как раскрыто в настоящем документе, рассматриваемые полинуклеотидные кассеты и векторы доставки генов, в совокупности называемые в настоящем документе «рассматриваемыми композициями», находят применение для экспрессии трансгена в клетках животного. Например, рассматриваемые композиции могут быть использованы в исследованиях, например, для определения влияния, которое ген оказывает на жизнеспособность и/или функцию клеток. В качестве другого примера, рассматриваемые композиции могут быть использованы в медицине, например, для лечения или предотвращения заболевания или нарушения. Таким образом, в некоторых аспектах изобретения предложены способы экспрессии гена в клетках, включающие приведение клеток в контакт с композицией согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт осуществляют in vitro или ex vivo. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт осуществляют in vivo, т.е. рассматриваемую композицию вводят субъекту.

[166] В тех случаях, когда клетки млекопитающих подлежат приведению в контакт с рассматриваемой полинуклеотидной кассетой или вектором доставки гена, содержащим рассматриваемую полинуклеотидную кассету, in vitro или ex vivo, клетки могут принадлежать любому виду млекопитающих, например, грызунам (например, мышам, крысам, песчанкам, белкам), кролику, кошке, собаке, козе, овце, свинье, лошади, быку, примату, человеку. Клетки могут принадлежать иммортализованным клеточным линиям или они могут представлять собой первичные клетки, где термины «первичные клетки», «первичные клеточные линии» и «первичные культуры» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения клеток и клеточных культур, которые были получены от субъекта и росли in vitro в течение ограниченного числа пассажей, т.е. разделений, культуры. Например, первичные культуры представляют собой культуры, которые могли быть пассированы 0 раз, 1 раз, 2 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз или 15 раз, но недостаточное количество раз для того, чтобы пройти стадию кризиса. Как правило, первичные клеточные линии согласно настоящему изобретению поддерживают in vitro в течение менее 10 пассажей.

[167] В частных вариантах осуществления клетка, подлежащая приведения в контакт с раскрытой полинуклеотидной кассетой или вектором доставки гена, представляет собой гемопоэтические стволовые клетки (HSC) от субъекта или от донора, например, аллогенного донора. В некоторых вариантах осуществления биологический образец, например, периферическую кровь, получают от субъекта после мобилизации гемопоэтических стволовых клеток (HSC). В одном из вариантов осуществления HSC и/или клетки-предшественники мобилизуют путем введения субъекту Г-КСФ или его аналога. HSC и клетки-предшественники (HSPC) в периферической крови могут быть мобилизованы перед сбором биологического образца. HSC и HSPC периферической крови могут быть мобилизованы любым способом, известным в данной области техники. HSC и HSPC периферической крови могут быть мобилизованы путем введения субъекту любого агента(ов), описанного в настоящем документе или известного в данной области техники, увеличивающего количество HSPC, циркулирующих в периферической крови субъекта. Например, в частных вариантах осуществления периферическую кровь мобилизуют путем введения субъекту одного или более цитокинов или факторов роста (например, Г-КСФ, лиганда kit (KL), ИЛ-1, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-11, лиганда Flt3, SCF, тромбопоэтина или ГМ-КСФ (такого как сарграмостим)). Различные типы Г-КСФ, которые могут быть использованы в способах мобилизации периферической крови, включают филграстим и обладающий более длительным действием Г-КСФ : пэгфилграстим. В частных вариантах осуществления периферическую кровь мобилизуют путем введения субъекту одного или более хемокинов (например, макрофагального воспалительного белка-1a (MIP1a/CCL3)), лигандов хемокиновых рецепторов (например, лигандов хемокинового рецептора 2, GROl3 и GR013M), аналогов хемокиновых рецепторов (например, аналогов белка фактора стромальных клеток-1a (SDF-1a), таких как CTCE-0021, CTCE-0214 или SDF-1a, таких как Met-SDF-113), или антагонистов хемокиновых рецепторов (например, антагонистов хемокинового рецептора 4 (мотив C-X-C) (CXCR4), таких как AMD3100). В частных вариантах осуществления периферическую кровь мобилизуют путем введения субъекту одного или более анти-интегриновых сигнальных агентов (например, блокирующего функцию антитела против очень позднего антигена 4 (VLA-4) или антитела против молекулы адгезии клеток сосудов 1 типа (VCAM-1)). В частных вариантах осуществления периферическую кровь мобилизуют путем введения субъекту одного или более цитотоксических лекарственных средств, таких как циклофосфамид, этопозид или паклитаксел. В частных вариантах осуществления периферическая кровь может быть мобилизована путем введения субъекту одного или более агентов, перечисленных выше, в течение определенного периода времени. Например, субъекту могут быть введены один или более агентов (например, Г-КСФ) путем инъекции (например, подкожной, внутривенной или внутрибрюшинной), раз в сутки или два раза в сутки, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней до сбора HSPC. В конкретных вариантах осуществления HSPC собирают в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 14, 16, 18, 20 или 24 часов после последней дозы агента, используемого для мобилизации HSPC в периферическую кровь. В частных вариантах осуществления HSC и HSPC мобилизуют путем введения субъекту двух или более различных типов агентов, описанных выше или известных в данной области техники, таких как фактор роста (например, Г-КСФ) и антагонист хемокинового рецептора (например, антагонист рецептора CXCR4, такой как AMD3100), или фактор роста (например, Г-КСФ или KL) и анти-интегриновый агент (например, блокирующее функцию антитело против VLA-4). В одном из вариантов осуществления HSC и/или клетки-предшественники мобилизуют путем введения субъекту Г-КСФ или его аналога. В одном из вариантов осуществления Г-КСФ представляет собой филграстим. В одном из вариантов осуществления HSC и/или клетки-предшественники мобилизуют путем введения субъекту плериксафора. В отдельном варианте осуществления HSC и/или клетки-предшественники мобилизуют с помощью комбинации филграстима и плериксафора, только филграстима или только плериксафора. В частных вариантах осуществления различные типы мобилизующих агентов вводят одновременно или последовательно. Для получения дополнительной информации относительно способов мобилизации периферической крови см., например, Craddock et al., 1997, Blood 90(12):4779-4788; Jin et al., 2008, Journal of Translational Medicine 6:39; Pelus, 2008, Curr. Opin. Hematol. 15(4):285-292; Papayannopoulou et al., 1998, Blood 91(7):2231-2239; Tricot et al., 2008, Haematologica 93(11):1739-1742; и Weaver et al., 2001, Bone Marrow Transplantation 27(2):S23-S29).

[1] В некоторых вариантах осуществления клетки обогащают перед приведением клеток в контакт с раскрытой полинуклеотидной кассетой или вектором доставки гена. В контексте настоящего документа термин «обогащенный» или «высокообогащенный» относится к способу обогащения клеточной популяции, предназначенному для значительного обогащения клеток клетками, экспрессирующими определенный биологический маркер, например, CD34. Например, использованное клинически обогащение CD34 приводит к среднему 61,6% и медианному 65,7% выходу CD34⁺ клеток и средней 88,5% и медианой 95,9% относительной чистоте (N=166) (Clin Lab. 2016 Jul 1;62(7):1243-1248 (PMID: 28164638)). «Обогащение» относится к процессу, проводимому с целью значительного обогащения относительно редким типом клеток, CD34+, который обычно составляет от 0,2 до 2% клеточного продукта лейкофереза или материала костного мозга, полученных после мобилизации. Обогащение CD34+ клетками продукта лейкофереза или материала костного мозга, полученных после мобилизации, направлено на достижение конечного процента CD34+, возросшего с 0,2-2% до > 80%. Для этого после первоначального нанесения биологического образца на матрицу для захвата проводят повторные замены буфера, называемые в настоящем документе «отмывками», с целью удаления клеток, слабо или неспецифически связанных с матрицей для захвата. Как правило, для каждого цикла отмывки клетки удаляют с матрицы для захвата и наносят повторно. Удаление и повторное нанесение могут быть осуществлены вручную путем пипетирования из пробирок или автоматизированы с использованием системы насосов и трубок. Например, с помощью Quad Technologies MagCloudz® в сочетании с системой магнитного разделения клеток Dynabeads® комплексы клетка-магнитная частица разделяются в пробирках на магнитном стенде, и отмывки осуществляют вручную. С помощью системы Miltenyi Biotec CliniMACS® автоматизированная программа с предварительно заданными параметрами наносит комплексы клетка-магнитная частица на магнитную колонку посредством набора трубок, а отмывки/повторные нанесения осуществляются с помощью системы клапанного насоса. В отдельных вариантах осуществления отбор может быть проведен на различных приборах, включая, не ограничиваясь перечисленным, Miltenyi Biotec MACSQuant Tyto®, Quad Technologies MagCloudz®, систему разделения клеток GE Sepax®, систему разделения клеток Terumo Elutra®, клеточный сепаратор COBE Spectra®, системы SynGen LAB® или WASH®, Fresenius-Kabi Lovo®, систему Miltenyi Biotec CliniMACS® или систему CliniMACS Prodigy®. Отбор может быть проведен в лаборатории или в месте оказания медицинской помощи. Способы получения и обогащения клеток и клеточных популяций, включая иллюстративные способы отбора CD34+ клеток, подробно описаны, например, в публикации международной заявки WO 2016/118790. Иллюстративный способ отбора, пригодный для отбора с высокой строгостью, приведен в патенте США № 8727132.

[2] В отдельных вариантах осуществления периферическую кровь получают через шприц или катетер, вставленный в вену субъекта или донора. Например, периферическая кровь может быть собрана с использованием аппарата для афереза. Кровь течет из вены через катетер в аппарат для афереза, который отделяет лейкоциты, включая HSPC, от остальной крови, а затем возвращает остаток крови в тело субъекта. Аферез может проводиться несколько часов в течение нескольких дней подряд (например, от 1 до 5 дней), пока не будет собрано достаточное количество HSPC.

[3] В отдельных вариантах осуществления костный мозг получают из заднего подвздошного гребня субъекта путем аспирации иглой (см., например, Koda et al., 1984, J. Clin Invest. 73:1377-1384).

[4] В отдельных вариантах осуществления может быть определен уровень гематокрита в биологическом образце. Уровень гематокрита может быть определен путем центрифугирования образца в камере для обработки для образования слоя эритроцитов образца, так что может быть определен объем осажденных эритроцитов. Следует иметь в виду, что образец может быть объединен с антикоагулянтом, чтобы помочь определить уровень гематокрита, и что такой антикоагулянт может быть добавлен в камеру для обработки до или во время центрифугирования. В качестве альтернативы, уровень гематокрита может быть определен путем измерения оптических свойств образца. Например, для анализа образца может быть использован спектрометр. Следует иметь в виду, что могут быть использованы любые известные спектроскопические методы определения уровня гематокрита, такие как, например, Рамановская спектроскопия и/или методы на основе рассеяния света.

[5] В отдельных вариантах осуществления биологический образец обеднен эритроцитами, например, перед приготовлением из биологического образца одной или более популяций клеток, обогащенных CD34+ клетками. В некоторых вариантах осуществления клетки, оставшиеся после методов обеднения, отмывают. В еще одном варианте осуществления к отмытым клеткам добавляют неспецифическое IgG. В некоторых вариантах осуществления неспецифическое IgG представляет собой флебогамму.

[168] Варианты осуществления настоящего изобретения включают клетки млекопитающих (например, CD34+ клетки), трансдуцированные вирусным вектором доставки, например, LV вектором, содержащим ген PKLR человека. Соответственно, настоящее изобретение включает способ трансдукции клетки млекопитающего, например, гемопоэтической стволовой клетки человека или другой клетки, описанной в настоящем документе, включающий приведение указанной клетки в контакт с вирусным вектором доставки, например, LV вектором, содержащим кассету экспрессии, описанную в настоящем документе. В отдельных вариантах осуществления клетка была ранее получена от подлежащего лечению субъекта или от другого донора. В частных вариантах осуществления субъекту был поставлен диагноз PKD, и клетка трансдуцирована LV, содержащим кассету экспрессии, кодирующую пируваткиназу, например, кодирующую область или кДНК coRPK. Подразумевается, что раскрытые способы, например, способы, используемые для доставки субъекту продукта гена пируваткиназы, например, с использованием последовательности кДНК coPRK, также могут применяться для лечения гемолитической анемии и/или нормализации дифференцировки эритроидных клеток, увеличения числа функциональных зрелых эритроцитов, снижения экстрамедуллярного эритропоэза, уменьшения спленомегалии и других вторичных эффектов гемолитической анемии или PKD.

[169] Для стимуляции экспрессии трансгена рассматриваемую полинуклеотидную кассету или вектор доставки гена, содержащий рассматриваемую полинуклеотидную кассету, будут приводить в контакт с клетками в течение приблизительно от 30 минут до 24 часов или более, например, 1 часа, 1,5 часов, 2 часов, 2,5 часов, 3 часов, 3,5 часов, 4 часов, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 12 часов, 16 часов, 18 часов, 20 часов, 24 часов и т. д.

[170] Рассматриваемая полинуклеотидная кассета или вектор доставки гена, содержащий рассматриваемую полинуклеотидную кассету, могут быть предоставлены в клетки субъекта один или более раз, например, один раз, два раза, три раза или более трех раз, и может быть обеспечена возможность инкубации клеток с агентом(ами) в течение некоторого времени после каждого приведения в контакт, например, в течение 16-24 часов, после чего среду заменяют свежей средой и продолжают культивирование клеток. Приведение клеток в контакт может быть осуществлено в любых культуральных средах и при любых условиях культивирования, которые способствуют выживанию клеток. Культура может содержать факторы роста, на которые реагируют клетки. Факторы роста, как определено в настоящем документе, представляют собой молекулы, способные стимулировать выживание, рост и/или дифференцировку клеток, в культуре либо в интактной ткани, посредством специфического воздействия на трансмембранный рецептор. Факторы роста включают полипептиды и неполипептидные факторы.

[171] Как правило, предоставляется эффективное количество рассматриваемой полинуклеотидной кассеты или вектора доставки гена, содержащего рассматриваемую полинуклеотидную кассету, для экспрессии трансгена в клетках. Как обсуждается в других местах настоящего документа, эффективное количество может быть легко определено опытным путем, например, путем обнаружения наличия или уровней трансгенного продукта гена, путем обнаружения влияния на жизнеспособность или функцию клеток и т. д. Как правило, эффективное количество рассматриваемой полинуклеотидной кассеты или вектора доставки гена, содержащего рассматриваемую полинуклеотидную кассету, будет способствовать большей экспрессии трансгена в клетках, чем такое же количество полинуклеотидной кассеты, известной из уровня техники. Как правило, экспрессия будет усилена в 2 раза или более по сравнению с экспрессией из референсной или контрольной полинуклеотидной кассеты, например, известной из уровня техники, например, в 3, 4 или 5 раз или более, в некоторых случаях в 10 раз, 20 раз или 50 раз, например, в 100 раз.

[172] В тех случаях, когда клетки подлежат приведению в контакт с рассматриваемой полинуклеотидной кассетой или вектором доставки гена, содержащим рассматриваемую полинуклеотидную кассету, in vivo, субъект может представлять собой любое млекопитающее, например, грызуна (например, мышей, крыс, песчанок), кролика, кошку, собаку, козу, овцу, свинью, лошадь, быка или примата. В предпочтительных вариантах осуществления примат представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой CD34+ клетки.

[173] Способы и композиции согласно настоящему изобретению находят применение, например, при лечении дефицита пируваткиназы.

[174] В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение включает способ лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества клеток, трансдуцированных вектором доставки гена, например, вирусным вектором, экспрессирующим в клетках терапевтический продукт гена. В частных вариантах осуществления клетки являются аутологичными для субъекта. В отдельных вариантах осуществления изобретения клетки представляют собой эритроидные клетки, например, гемопоэтические стволовые клетки или коммитированные гемопоэтические предшественники эритроидных клеток. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку костного мозга, например, клетку костного мозга, обедненного по линии клеток. В частных вариантах осуществления способ применяют для лечения PKD, и вирусный вектор представляет собой LV, содержащий экспрессирующую конструкцию, раскрытую в настоящем документе, содержащую промотор PGK человека, функционально связанный с кДНК или кодирующей последовательностью гена coRPK, и мутированный wPRE, раскрытый в настоящем документе. В частных вариантах осуществления клетки предоставляют субъекту парентерально, например, посредством внутривенной инъекции. В некоторых вариантах осуществления клетки предоставляют субъекту путем переливания крови.

[175] В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение включает способ лечения PKD у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества аутологичных CD34+ стволовых клеток, трансдуцированных LV вектором, экспрессирующим кДНК coRPK в клетках, где указанный LV вектор содержит промотор PGK человека, функционально связанный с кДНК или кодирующей последовательностью coRPK, и последовательность мутированного wPRE, раскрытую в настоящем документе. В частных вариантах осуществления клетки представляют собой гемопоэтические стволовые клетки или коммитированные гемопоэтические предшественники эритроидных клеток, например, клетки костного мозга. В частных вариантах осуществления клетки предоставляют субъекту парентерально, например, посредством внутривенной инъекции.

[176] В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает лечение заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающее введение указанному субъекту эффективного количества вектора доставки гена, например, вирусного вектора, экспрессирующего в организме субъекта терапевтический продукт гена. В частных вариантах осуществления способ применяют для лечения PKD, и вирусный вектор представляет собой LV, содержащий экспрессирующую конструкцию, раскрытую в настоящем документе, содержащую промотор PGK человека, функционально связанный с кДНК или кодирующей последовательностью гена coRPK, и мутированный wPRE, раскрытый в настоящем документе. В частных вариантах осуществления вектор доставки гена предоставляют субъекту парентерально, например, посредством внутривенной инъекции.

[177] В частных вариантах осуществления клетки или векторы доставки генов предоставляют субъекту в составе фармацевтических композиций.

[178] В некоторых вариантах осуществления рассматриваемые способы обеспечивают терапевтический эффект, например, предотвращение развития нарушения, остановку прогрессирования нарушения, реверсию прогрессирования нарушения и т. д. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый способ включает стадию определения того, был ли достигнут терапевтический эффект. Специалисту в данной области техники будет ясно, что такие критерии терапевтической эффективности будут применимы к конкретному изменяемому заболеванию, и сможет установить подходящие способы обнаружения, подходящие для измерения терапевтической эффективности.

[179] Ожидается, что экспрессия трансгена с использованием рассматриваемого трансгена будет устойчивой. Соответственно, в некоторых случаях экспрессия трансгена, например, определяемая путем измерения уровней продукта гена, измерения терапевтической эффективности и т. д., может наблюдаться через два месяца или менее после введения, например, через 4, 3 или 2 недели или менее после введения, например, через 1 неделю после введения рассматриваемой композиции. Ожидается, что экспрессия трансгена также будет сохраняться с течением времени. Соответственно, в некоторых случаях экспрессия трансгена, например, определяемая путем измерения уровней продукта гена, измерения терапевтической эффективности и т.д., может наблюдаться через 2 месяца или более после введения рассматриваемой композиции, например, через 4, 6, 8 или 10 месяцев или более, в некоторых случаях через 1 год или более, например, через 2, 3, 4 или 5 лет, в некоторых случаях более чем через 5 лет.

[180] В отдельных вариантах осуществления способ включает стадию обнаружения экспрессии трансгена в клетках или в организме субъекта, где экспрессия усилена по сравнению с экспрессией из полинуклеотидной кассеты, не содержащей один или более улучшенных элементов согласно настоящему изобретению. Как правило, экспрессия будет усилена в 2 раза или более по сравнению с экспрессией из референсной, т. е. контрольной полинуклеотидной кассеты, например, известной из уровня техники, например, в 3, 4 или 5 раз или более, в некоторых случаях в 10, 20 или 50 раз или более, например, в 100 раз, о чем свидетельствует, например, более раннее обнаружение, более высокие уровни продукта гена, более сильное функциональное воздействие на клетки и т.д.

[181] Как правило, если рассматриваемая композиция представляет собой LV, содержащий рассматриваемую полинуклеотидную кассету согласно настоящему изобретению, эффективное количество для достижения изменения будет составлять приблизительно 1x10⁸ векторных геномов или более, в некоторых случаях 1x10⁹, 1x10¹⁰, 1x10¹¹, 1x10¹² или 1x10¹³ векторных геномов или более, в отдельных случаях 1x10¹⁴ векторных геномов или более, и как правило не более 1x10¹⁵ векторных геномов. В некоторых случаях доставляемое количество векторных геномов составляет не более приблизительно 1x10¹⁵ векторных геномов, например, 1x10¹⁴ векторных геномов или менее, например, 1x10¹³, 1x10¹², 1x10¹¹, 1x10¹⁰ или 1x10⁹ векторных геномов или менее, в отдельных случаях 1x10⁸ векторных геномов, и как правило не менее 1x10⁸ векторных геномов. В некоторых случаях количество доставляемых векторных геномов составляет от 1x10¹⁰ до 1x10¹¹ векторных геномов. В некоторых случаях количество доставляемых векторных геномов составляет от 1x10¹⁰ до 3x10¹² векторных геномов. В некоторых случаях количество доставляемых векторных геномов составляет от 1x10⁹ до 3x10¹³ векторных геномов. В некоторых случаях количество доставляемых векторных геномов составляет от 1x10⁸ до 3x10¹⁴ векторных геномов.

[182] В некоторых случаях количество фармацевтической композиции, подлежащее введению, может быть измерено с использованием множественности заражения (MOI). В некоторых случаях MOI может относиться к соотношению или кратности векторных или вирусных геномов к клеткам, в которые может быть доставлена нуклеиновая кислота. В некоторых случаях MOI может составлять 1x10⁶. В некоторых случаях MOI может составлять 1x10⁵ -1x10⁷. В некоторых случаях MOI может составлять 1x10⁴-1x10⁸. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы согласно изобретению имеют MOI, равную по меньшей мере приблизительно 1x10¹, 1x10², 1x10³, 1x10⁴, 1x10⁵, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸, 1x10⁹, 1x10¹⁰, 1x10¹¹, 1x10¹², 1x10¹³, 1x10¹⁴, 1x10¹⁵, 1x10¹⁶, 1x10¹⁷ и 1x10¹⁸. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы согласно данному изобретению имеют MOI от 1x10⁸ до 3x10¹⁴. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы согласно изобретению имеют MOI, равную не более 1x10¹, 1x10², 1x10³, 1x10⁴, 1x10⁵, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸, 1x10⁹, 1x10¹⁰, 1x10¹¹, 1x10¹², 1x10¹³, 1x10¹⁴, 1x10¹⁵, 1x10¹⁶, 1x10¹⁷ и 1x10¹⁸.

[183] В некоторых аспектах количество фармацевтической композиции содержит от приблизительно 1 x 10⁸ до приблизительно 1 x 10¹⁵ частиц рекомбинантных вирусов, от приблизительно 1 x 10⁹ до приблизительно 1 x 10¹⁴ частиц рекомбинантных вирусов, от приблизительно 1 x 10¹⁰ до приблизительно 1 x 10¹³ частиц рекомбинантных вирусов или от приблизительно 1 x 10¹¹ до приблизительно 3 x 10¹² частиц рекомбинантных вирусов.

[184] Млекопитающему может быть введено любое общее количество вирусных частиц, подходящее для обеспечения надлежащей трансдукции клеток для обеспечения желаемого эффекта или лечения заболевания. В различных предпочтительных вариантах осуществления инъецируют по меньшей мере 10⁸; 5x10⁸; 10⁹; 5 x 10⁹, 10¹⁰, 5x10¹⁰; 10¹¹; 5 x10¹¹; 10¹²; 5x10¹²; 10¹³; 1.5 x10¹³; 3x10¹³; 5x10¹³; 7,5x10¹³; 9x10¹³, 1 x 10¹⁴ вирусных частиц или 5 x 10¹⁴ вирусных частиц или более, но как правило не более 1 x 10¹⁵ вирусных частиц. Может быть осуществлено любое подходящее количество введений вектора в глаз млекопитающего или примата. В одном из вариантов осуществления способы включают однократное введение; в других вариантах осуществления выполняют несколько введений за определенный период времени, если лечащий врач считает это целесообразным. В некоторых вариантах осуществления для достижения высокой эффективности трансдукции на однократное введение (трансдукция в течение 24 часов) требуется по меньшей мере 2 x 10⁸ векторных геномов/мл в количестве 5 x 10⁵ клеток/мл. Индивидуальные дозы обычно составляют не менее количества, необходимого для оказания на субъекта измеримого действия, и могут быть определены на основе фармакокинетики и фармакологии в отношении абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции («ADME») рассматриваемой композиции или продуктов ее обмена, и поэтому основаны на рассредоточении композиции в организме субъекта. Их определение включает рассмотрение пути введения, а также величины дозировки. Эффективные количества дозы и/или режим дозирования могут быть легко определены опытным путем из доклинических исследований, из испытаний на безопасность и повышение и диапазон доз, индивидуальных взаимоотношений между врачом и пациентом, а также анализов in vitro и in vivo, таких как описанные в настоящем документе и проиллюстрированные в разделе примеров.

[185] Несколько аспектов изобретения для демонстрации описаны в настоящем документе со ссылкой на иллюстративные примеры его использования. Следует понимать, что многочисленные конкретные детали, взаимосвязи и способы изложены для обеспечения полного понимания изобретения. Однако специалист в соответствующей области техники легко поймет, что изобретение может быть осуществлено на практике без одной или нескольких конкретных деталей или с помощью других способов. Настоящее изобретение не ограничено иллюстрированным порядком действий или событий, поскольку некоторые действия могут происходить в другом порядке и/или одновременно с другими действиями или событиями. Кроме того, не все проиллюстрированные действия или события необходимы для осуществления методики в соответствии с настоящим изобретением.

[186] Следует также отметить, что формула изобретения может быть составлена таким образом, чтобы исключить любой необязательный элемент. Таким образом, данное утверждение служит в качестве основания для использования такой исключающей терминологии, как выражения «исключительно», «только» и тому подобное, в связи с перечислением элементов формулы изобретения, или использования «отрицательного» ограничения.

[187] Публикации, обсуждаемые в настоящем документе, приведены исключительно ради содержащейся в них информации, известной до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не должно быть истолковано как признание того, что настоящее изобретение не может предшествовать такой публикации в силу более раннего раскрытия. Кроме того, представленные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.

[188] Все вышеупомянутые патенты США, публикации патентных заявок США, патентные заявки США, зарубежные патенты, зарубежные патентные заявки и непатентные публикации, упомянутые в данном описании и/или перечисленные в информационном листе заявки, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте, например, для раскрытия и описания методов и/или материалов, в связи с которыми цитируются публикации. Следует понимать, что в случае противоречия настоящее изобретение превалирует над любым раскрытием во включенной публикации.

[189] Из вышеизложенного будет ясно, что, хотя в настоящем документе были описаны конкретные варианты осуществления изобретения с целью иллюстрации, без отклонения от сущности и объема изобретения могут быть сделаны различные модификации. Соответственно, объем изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

ПРИМЕРЫ

[190] Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как реализовывать и применять настоящее изобретение, и не носят ограничительного характера в отношении того, что авторы рассматривают в качестве созданного ими изобретения, а также не подразумевается, что не было проведено каких-либо иных экспериментов помимо приведенных ниже. Были предприняты меры для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количеств, температуры и т.д.), однако необходимо учитывать возможность некоторых экспериментальных погрешностей и отклонений. Если не указано иное, части являются массовыми частями, молекулярная масса представляет собой среднемассовую молекулярную массу, температура представлена в градусах Цельсия, а давление равно или близко к атмосферному.

Методика экспериментов

[191] Получение супернатанта векторов и LV. LV были созданы, как описано в настоящем документе. Последовательность CoRPK была разработана с использованием программного обеспечения GeneArt® для увеличения содержания GC в последовательности и для избежания криптических сайтов сплайсинга. Векторы были разработаны с использованием в качестве основной структуры конструкции pCCL.sin.ppt.hPGK-EGFP-wPRE*, великодушно предоставленной доктором Naldini (HSR-TIGET, Институт San Raffaele Telethon, Милан, Италия). Исходный лентивирусный вектор переноса pCCL и его элементы описаны в источнике Dull et al., J Virol, 1998; 72(11): 8463-8471, полностью включенном в настоящий документ. Исходные запасы векторов псевдотипированных VSV-G LV получали путем 3-плазмидной трансфекции, опосредованной фосфатом кальция, в клетках 293T (ATCC: CRL-1573, Роквилл, Мэриленд, США), как описано ранее [Follenzi A, et al. (2000). Nat Genet 25: 217-222]. Титры инфицирующих LV определяли в клетках HT1080 (ATCC: CCL-121) с помощью количественной ПЦР, как описано в других источниках [Charrier S, et al. (2005). Gene Ther 12: 597-606]. Исходные запасы LV с титрами 10⁷-10⁸ вирусных частиц (вч)/мл получали согласно обычной практике.

[192] Очистка и трансдукция мышиных HSC. КМ собирали из костей ног самцов мышей с PKD возрастом 8-14 недель, и очищали клетки, не несущие линейных маркеров (Lin^-), с использованием набора Lin^- Cell Depletion kit (Miltenyi Biotec, Гладбах, Германия) с получением 70-90% чистоты. Lin^- клетки предварительно стимулировали 100 нг/мл рекомбинантного человеческого ИЛ-11 (Peprotech EC Ltd., Лондон, Великобритания) и 100 нг/мл рекомбинантного мышиного SCF (фактор стволовых клеток) (R&D Systems Inc., Миннеаполис, Миннесота) в среде IMDM от Glutamax с добавками 20% FBS и 0,5% антибиотиков (50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) в течение 24 часов, а затем трансдуцировали LV, несущими EGFP или coRPK, в двух циклах трансдукции при MOI 1-10 вч/клетка. Каждую трансдукцию проводили в течение 24 часов в присутствии вышеупомянутых цитокинов на планшетах, предварительно покрытых фрагментом фибронектина CH-296 (2 мкг/см²; Retronectin, TakaraShuzo, Оцу, Япония), в течение ночи при 4°C.

[193] In vivo выживание эритроцитов. Подвергшимся трансплантации мышам, несущим трансген coRPK, делали три последовательные внутривенные инъекции (с интервалом 12 часов) натриевой соли 3-сульфо-N-гидроксисукцинимидного эфира биотина (50 мг/кг) (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури). Через двенадцать часов после последней инъекции брали кровь из хвостовой вены и метили 2 мкг/мл антимышиного Ter119-PE (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния) и стрептавидином-FITC (50 мкг/мл, BD Biosciences, Сан-Хосе, CA) в течение 30 мин при 4°C. Образцы анализировали в проточном цитометре EPICS XL (Beckman Coulter, Брея, Калифорния) каждые 2-4 дня в течение 40 дней после инъекции. Кинетику выживания эритроцитов измеряли по проценту биотинилированных клеток в общей популяции эритроцитов.

[194] Анализ колониеобразующих клеток. Анализ колониеобразующих клеток проводили в КМ и селезенке от контрольных и подвергшихся трансплантации мышей в соответствии с процедурой производителя из среды Methocult GF M3434 (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Канада). Клетки КМ собирали в разные моменты времени после трансплантации от всех групп мышей и через 7 дней после посева оценивали КОЕ (кластеры из 30 или более клеток) в микроскоп Nikon Diaphot-TMD.

[195] Выявление гемопоэтических линий. МНПК получали из хвостовой вены подвергшихся трансплантации животных и метили панелью антител для обнаружения различных гемопоэтических клеток. Миелоидные клетки обнаруживали с помощью биотинилированных антител против GR-1 и против Mac-1 (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, 5 мкг/мл), тогда как лимфоидные клетки обнаруживали с помощью антитела против CD3-PE для Т-клеток и антител против B220-PE и против B220-PECy5 для B-клеток (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, 10 мкг/мл), вместе со вторичным антителом SAV-TRC (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Образцы анализировали в цитометре BD LSR Fortessa (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, США) с добавлением DAPI (Boehringer, Ингельхайм, Германия, 2 мкг/мл) для исключения мертвых клеток.

[196] Структурные и гистологические исследования. Селезенки собирали, фотографировали и взвешивали на прецизионных весах для определения наличия спленомегалии. Гистологические исследования проводили на срезах селезенки и печени, полученных общепринятыми гистологическими методами и окрашенных гематоксилином (гематоксилин Gill-2, Thermo, Питтсбург, США) и эозином (эозин, спиртовой раствор, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Также исследовали отложения железа в селезенке путем окраски прусским синим или по Перлсу (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в соответствии с инструкциями производителя. Все срезы исследовали с помощью оптического микроскопа Olympus BX40 и фотографировали с помощью фотоаппарата Olympus DP21 с конечным увеличением в 100 или 200 раз.

[197] Дифференцировка эритроидных клеток. Для идентификации различных субпопуляций эритроидных клеток использовали анализ методом проточной цитометрии интенсивности маркеров Ter119 и CD71 в КМ и селезенке, как описано в других источниках [Socolovsky M, et al. (2001). Blood 98: 3261-3273], с использованием 4 мкг/мл антимышиного антитела Ter119-PE (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния), 10 мкг/мл биотинилированного антитела против CD71 (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния) и конъюгированного стрептавидина для трехцветной проточной цитометрии (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Затем клетки анализировали в проточном цитометре EPICS XL (Beckman Coulter, Брея, Калифорния) с использованием йодида пропидия (IP, 2 мкг/мл) для обнаружения живых клеток.

[198] Количественная оценка провируса. Обнаружение и количественную оценку интегрированного провируса на клетку осуществляли с использованием комплементарных праймеров к упаковочной провирусной последовательности (Ψ) и гену домашнего хозяйства титина мыши. Периодически собирали образцы общего КМ и периферической крови, а геномную ДНК из ядросодержащих клеток выделяли с использованием набора DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen, Венло, Лимбург, Нидерланды). От 20 до 50 нг геномной ДНК (гДНК) амплифицировали с помощью мультиплексной количественной ПЦР с использованием системы 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) и праймеров и зондов, описанных ранее [Charrier S, et al. (2011). Gene Ther 18: 479-487].

[199] Химеризм. Наличие донорских клеток количественно оценивали с помощью количественной ПЦР с обнаружением гена SRY Y-хромосомы и гена домашнего хозяйства β-актина мыши. Использовали ранее описанные праймеры и зонды [Navarro S et al (2006). Mol Ther 14: 525-535], и геномную ДНК из ПК подвергшихся трансплантации мышей амплифицировали с использованием системы 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Стандартные кривые получали с использованием экстрактов гДНК из образцов, содержащих от 0 до 100% клеток КМ из смесей образцов от самцов и самок мышей, и рассчитывали химеризм как: % приживления донорских клеток = 100 x 2^{(CtβAct - CtSRY).}

[200] Процедура LAM-ПЦР. Для идентификации сайтов интеграции вектора соединения 3’-вектор LTR-геном амплифицировали с помощью LAM-ПЦР в соответствии с методом, опубликованным Schmidt et al. 2007 [Nat Methods 4: 1051-1057]. Начальную линейную амплификацию (100 циклов) проводили с использованием биотинилированных LTR-специфичных праймеров и до 100 нг гДНК в качестве матрицы. Продукты линейной амплификации очищали с использованием магнитных гранул со стрептавидином с последующим синтезом комплементарной цепи, параллельным расщеплением 2 различными ферментами рестрикции (Tsp509I и HpyCH4IV) и двумя реакциями лигирования с использованием кассет линкера, комплементарных концам, оставленным после разрезания ферментом. Полученные фрагменты амплифицировали с помощью двух дополнительных экспоненциальных стадий ПЦР. Продукты LAM-ПЦР разделяли и количественно оценивали с помощью гель-электрофореза на автоматизированной системе MultiNA (Shimadzu).

[201] Подготовка продуктов LAM-ПЦР для секвенирования Illumina MiSeq. Следуя методу, опубликованному Parazynski et al [Paruzynski A, et al. (2010). Nat Protoc 5: 1379-1395], 40 нг продуктов второй экспоненциальной стадии ПЦР, генерированных ферментами Tsp509I и HpyCH4IV, повторно амплифицировали с использованием гибридных праймеров, содержащих специфические последовательности, позволяющие осуществлять секвенирование спаренных концов на секвенаторе Illumina MiSeq. Образцы LAM-ПЦР были адаптированы для 454-пиросеквенирования с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами для добавления адапторов GS-FLX Roche 454: адаптор A плюс 8-нуклеотидный штрихкод был добавлен к LTR-концу ампликона LAM-ПЦР; адаптор B был добавлен на стороне кассеты линкера. В порядке от 5’- к 3’-концу конечный ампликон был составлен следующим образом: адаптер А, штрихкод, последовательность LTR, неизвестная последовательность генома, последовательность кассеты линкера и праймер B. Очищенные продукты ПЦР с перекрывающимися праймерами анализировали и количественно оценивали на автоматизированной системе электрофореза MultiNA, и объединяли, чтобы получить конечную эквимолярную библиотеку 10 нМ. Затем конечную библиотеку повторно количественно оценивали с использованием набора для KAPA Library Quantification для платформы секвенирования Illumina (Kapa Biosystems, Уилмингтон, Массачусетс) в системе ПЦР в реальном времени Viia7 real-time PCR (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс), с получением оценочной концентрации 16,35 нМ. Наконец, библиотеки секвенировали с использованием набора реагентов Illumina MiSeq.

[202] Биоинформатический анализ. Для извлечения IS вектора из платформы для высокопроизводительного секвенирования, как Roche 454, так и Illumina MiSeq/HiSeq, был разработан конвейер, принимающий первичные данные (обычно в формате файла FastQ), предоставляющий список достоверных IS и ближайшего гена. Анализы превосходящего уровня для количественной оценки клональной представленности и анализа обогащения генной онтологии проводили с использованием Excel, GraphPad Prism (TM) и доступных онлайн-инструментов.

[203] Обработка данных NGS и использование конвейера. Стадия обработки данных NGS (секвенирования нового поколения) связана с работой с данными с платформ для высокопроизводительного секвенирования Illumina MiSeq и направлена на идентификацию IS, в которых все корректные прочтения выровнены с референсным геномом. Обработка данных включает два основных вида деятельности: 1. Проверка качества и анализ данных, где обрезаются последовательности LV вектора и другие загрязнители. 2. Идентификация сайта интеграции, где все корректные прочтения выравнивают с референсным геномом и получают корректные IS.

[204] Анализ качества данных. Для идентификации IS на основе первичных данных Illumina MiSeq был разработан биоинформатический конвейер. Стандартные продукты LAM-ПЦР содержат последовательность LTR, фланкирующую геномную последовательность человека и последовательность кассеты линкера (LC). Технология 459 позволила получить последовательности LAM-ПЦР длиной от 10 до 900 п. н. Схожие результаты были получены из прочтений секвенирования спаренных концов Illumina MiSeq. Эти границы длины являются важными параметрами, которые необходимо учитывать в процессе анализа качества, поскольку они влияют как на последующую процедуру выравнивания, так и на алгоритм идентификации компонентов вектора. Последовательности, слишком короткие для правильного выравнивания с референсным геном, отбрасывали, как и последовательности, превышающие максимальный размер, доступный с помощью технологии NSG, чтобы избежать пропуска части или всей последовательности LC. После завершения прохождения конвейера каждым пулом все сайты интеграции собирали как в файлы (архивированные в сетевом хранилище данных -NAS-, подключенном к сети TIGET), так и во внутреннюю базу данных, и хранили на сервере хранения данных, фиксирующем измененные копии.

[205] Идентификация сайта интеграции. Для идентификации уникальных сайтов интеграции и извлечения файла Excel, содержащего все IS в строках и каждый из образцов в столбцах (матрицы IS) с аннотациями ближайших генов, авторы выполнили следующие этапы: 1. Создание матрицы IS с помощью программы под названием create_matrix, позволяющей выявлять коллизии между проектами. Эта программа создаст файл с разделением знаками табуляции (TSV); 2. Аннотирование файла матрицы сайтов интеграции с использованием программы annotate_bed, которая будет вызываться следующим образом для каждого пула с использованием входного файла TSV: awk ‘{print “chr”$1”\t”$2”\t”$2}’ TSV_FILE | tail -n +2 > TSV_FILE.bed; annotate_bed -a /opt/genome/mouse/mm9/annotation/mm9.refGene.TIGET.gtf -b TSV_FILE.bed -o TSV_FILE.annotated.bed; 3. Импорт как аннотации, так и файла матрицы в новый лист Excel, называемый в настоящем документе XLS.

[206] Выявление коллизий. Чтобы получить достоверный набор данных IS для каждой подвергшейся трансплантации мыши авторы отфильтровали данные от потенциальных загрязнений/коллизий и ложноположительных результатов на основе числа последовательностей. Для объединения сайтов интеграции, полученных из разных экспериментов, потребовался дополнительный этап нормирования данных.

[207] Термин «коллизия» используется для обозначения наличия идентичных IS в независимых образцах. В рассматриваемых условиях эксперимента интеграция вектора в одном и том же положении в геноме в разных клетках является очень маловероятным событием. Таким образом, выявление идентичных IS в независимых образцах вероятнее всего является следствием загрязнения, которое может происходить на разных этапах влажных лабораторных процедур (очистка образца, экстракция ДНК, LAM-ПЦР и секвенирование). Несмотря на то, рабочий конвейер был спроектирован авторами так, чтобы минимизировать возникновение контактов между образцами, высокопроизводительный анализ IS по своей природе несет определенную степень фонового загрязнения. Определение степени загрязнения между образцами имеет решающее значение также потому, что выявление одного и того же IS в разных образцах, полученных от одной и той же мыши, используется на последующих этапах для вывода о биологических свойствах гемопоэтических клеток, меченных вектором (т.е. мультилинейном потенциале и устойчивой клоногенной активности). Таким образом, авторам необходимо было иметь возможность отличить фактическое появление одного и того же IS в разных образцах (от одной и той же мыши) от загрязнения/коллизии.

[208] Чтобы решить эти проблемы, авторы оценили степень общих IS среди образцов, полученных из разных объектов испытаний и мышей, в качестве способа измерения степени коллизии в проводимых анализах, а затем разработали правила для отбрасывания из набора данных для каждой мыши тех IS, которые можно отнести на счет коллизии и минимизировать вероятность получения ложноположительных результатов при поиске общих IS среди образцов от одной и той же мыши. Авторы разработали процесс выявления коллизий, позволяющий проверять каждый локус интеграции. Общий результат должен состоять в том, что в некотором наборе I локусов интеграции в случае классификации локуса интеграции i в I как коллизии, i отбрасывается из I. Авторы применили процесс выявления коллизий между 3 независимыми группами трансплантации: 1. coPKR170s: мыши из анализа 1, умерщвленные через 170 дней после трансплантации клетками Lin^-, трансдуцированными экспрессирующим coRPK LV вектором (coRPK 1-3). 2. EGFP: мыши из анализа 2, которым трансплантировали клетки Lin^-, несущие экспрессирующий EGFP LV вектор (EGFP 1-6). 3. coPKR-TC: мыши из анализа 2, которым трансплантировали клетки Lin^-, трансдуцированные экспрессирующим coPKR LV вектором (coRPK 1-14), чью кровь и КМ анализировали в разные моменты времени, включая вторичных реципиентов, которым трансплантировали объединенный КМ из подгруппы первично трансплантированных мышей (coRPK 11-14).

[209] Каждый идентичный IS имеет разные количества прочтений (число последовательностей) среди разных мышей. Число последовательностей может быть использовано для определения того, загрязняют ли образцы от одной мыши образцы других мышей на основании критерия представленности. Согласно логике авторов интеграция, найденная у двух мышей, будет отнесена к мыши, у которой наблюдается наибольшая представленность, в то время как у другой мыши она будет считаться загрязнителем. Таким образом авторы смогли определить пороговое значение дифференцирующего числа последовательностей, позволяющее отнести отдельно взятую коллизию к одной мыши и удалить из других. Авторы вычислили пороговое значение из полученных данных, получив значение 10, что означает, что для каждого IS среди всех TI, если IS получил значение представленности (отношение числа последовательностей в процентах) в 10 раз ниже самого высокого значения представленности (числа последовательностей в процентах) других TI, то он удаляется из текущего TI. Авторы применили эти правила как к TI, так и к выбранным группам, и использовали файлы Excel для вычисления выявления коллизий, применяя следующие правила (здесь подробно описано для фильтрации TI, но они также распространяются на фильтрацию групп): 1. Изолировать каждый TI, сгруппировать все образцы одного и того же TI, суммируя число последовательностей. 2. Для трех полученных TI для каждого IS рассчитать процентное соотношение числа последовательностей IS к общей сумме прочтений для TI. 3. Затем применить следующее правило для вычисления шага принятия решения с пороговым значением 10, которое позволило отнести каждый IS к достоверному TI.

[210] При обнаружении IS, подлежащего удалению, прочтения этого IS удаляли из группы, так чтобы он больше не был отнесен также к этой группе. Описанный выше фильтр применяли для мышей, которым трансплантировали различные трансдуцированных ex vivo популяции клеток (одна когорта мышей, экспрессирующих EGFP, из анализа 2, и две когорты мышей coPKR, принадлежащих к двум независимым экспериментам по трансплантации). Кроме того, для группы coPKR-TC (анализ 2) упомянутый выше метод фильтрации был изменен двумя способами: a) чтобы лучше выделить общие интеграции между временными точками в контексте анализа клональной представленности, авторы добавили следующее правило: если одна интеграция является общей для одной или более мышей, то она будет сохранена для всех временных точек, даже если их число последовательностей меньше, чем 10% от максимального числа последовательностей среди мышей; b) для отслеживания линий авторы применили более строгий фильтр, исключив IS с числом последовательностей ниже 3 и фильтром по 10% числу последовательностей для общих сайтов интеграции между временными точками. Это означает, что интеграция, общая для двух временных точек, будет сохранена или отброшена, только если она больше или меньше другой, соответственно.

[211] Генный онтологический анализ. Все генные онтологические анализы проводили с использованием онлайнового программного обеспечения GREAT (http://bejerano.stanford.edu/great/public/html/). Веб-страница позволяет загружать геномные координаты интеграций каждого набора данных и рассчитывает уровни обогащения в тестируемом наборе данных путем сопоставления информации о положении (на основе анализа биномиального распределения для расчета p-значения) и аннотированной функции генов, ближайших к сайтам интеграции (на основе анализа гипергеометрического распределения для расчета p-значения) [Groeschel S, et al. (2011). J Inherit Metab Dis 34: 1095-1102]. Биологические процессы и молекулярные функции базы данных GO были выбраны для анализа обогащения. Для обоих статистических анализов были рассмотрены только классы генов с уровнем ложноположительных результатов <0,05 (фиг. 20).

[212] Хранение данных. Все данные, как первичные данные, так и результаты, хранятся в сетевом хранилище данных (NAS), подключенном к сети TIGET, в корневой папке, в которой доступны все выравнивания из конвейера, а также матрица представленности и графики. Хранилище NAS защищено принципами аутентификации и авторизации и было построено на основе надежной и масштабируемой инфраструктуры с использованием избыточного массива независимых дисков RAID 5, и продублировано на программном обеспечении авторов CrashPlan, зарегистрированном в TIGET.

Пример 1

Терапевтический LV вектор PGK-coRPK приводит к стабильной и долговременной коррекции анемического фенотипа у мышей с генетически скорректированным PKD.

[213] Эффективность PGK-coRPK LV (фиг. 2a) in vivo оценивали путем трансдукции и трансплантации клеток КМ, обедненного по линии клеток (клеток Lin^-), от мышей с PKD (фиг. 2b). Фиг. 2a представляет собой схематическое изображение SIN LV векторов, использованных в экспериментах по генной терапии, несущих промотор PGK человека, регулирующий экспрессию трансгена EGFP в контрольном векторе (верхняя диаграмма) или экспрессию кДНК coRPK в терапевтическом векторе (нижняя диаграмма). Последовательность coRPK показала 80,4% гомологии с кДНК PKLR человека и 76,5% гомологии с кДНК Pklr мыши, без изменений в аминокислотной последовательности. Фиг. 2b представляет собой схему протокола генной терапии, проведенного для определения функциональности разработанного вектора PGK-coRPK LV. Коррекцию фенотипа PKD изучали в течение 4-9 месяцев после трансплантации в ПК и КМ посредством гематологического анализа и метаболического профилирования. Интеграционный анализ проводили в разных тканях и в разные моменты времени у всех мышей для оценки безопасности LV вектора. Через 280 дней после трансплантации общий КМ от повергшихся первичной трансплантации мышей, несущих трансген coRPK, снова трансплантировали облученным летальной дозой самкам мышей с PKD (вторичным реципиентам), чтобы проверить стабильность и безопасность приживления. У облученных летальной дозой мыши с PKD, которым трансплантировали клетки с дефицитом, трансдуцированные LV с coRPK, наблюдалось значительное улучшение всех тестируемых параметров эритроидных клеток крови по сравнению с не подвергшимися трансплантации животными с PKD из того же помета или с мышами, которым трансплантировали клетки, трансдуцированные LV с EGFP (фиг. 3 и таблица 2).

[214] Данные представляют собой среднее значение ± SEM и были статистически проанализированы путем сравнения с экспрессирующими EGFP мышами с использованием непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. *p<0,05; **p0,01.

Количество эритроцитов возросло уже через 40 дней после трансплантации (фиг. 3a), и конститутивный ретикулоцитоз, который является одним из наиболее распространенных признаков PKD, был значительно реверсирован у мышей, несущих трансген PGK-coRPK, достигая уровней, близких к тем, которые наблюдаются у здоровых контролей, в течение по меньшей мере 9 месяцев после трансплантации (фиг. 3b). Напротив, у животных с PKD, которым трансплантировали клетки, трансдуцированные LV с EGFP, наблюдалась анемия и значительный ретикулоцитоз параллельно с мышами с PKD во всех проанализированных моментах времени. Уровни гемоглобина (HGB), гематокритное число (HTC), среднеклеточный объем эритроцитов (MCV) и среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (MCH) также были скорректированы у мышей, которым трансплантировали скорректированные LV клетками, по сравнению с не подвергшимися трансплантации животными с PKD из того же помета (таблица 2). Эта гематологическая коррекция была достигнута при 63,66 ± 4,45% донорского химеризма и эффективности трансдукции в диапазоне от 60% до 90% (таблица 3).

[215] Данные представляют собой среднее значение ± SEM; н. о. - не определено. ^a расчетный процент трансдукции, полученный путем интерполяции в линейной регрессии, построенной из эксперимента 1 (ось x: VCN/лейкоциты, ось y: % провирус⁺ КОЕ).

[216] Трансдуцированные клетки продемонстрировали в среднем 1,65 ± 0,08 интегрированных векторных копий на клетку, что свидетельствует о том, что вектор PGK-coRPK LV обеспечивал достаточную экспрессию трансгена RPK человека, чтобы вызвать реверсию гемолитической анемии. Примечательно, что экспрессия трансгена coRPK приводила к увеличению периода полужизни эритроидных клеток по сравнению с не подвергшимися трансплантации мышами с PKD (фиг. 3c,d). В среднем у мышей с PKD период полужизни эритроцитов составлял 19 дней, в то время как у мышей с генетической коррекцией этот период был увеличен до 25 дней (на 6 дней), достигая значений, близких к периоду полужизни эритроцитов дикого типа (фиг. 3d). Таким образом, эритроциты мышей, экспрессирующих coRPK, демонстрировали промежуточную кинетику выживания между здоровыми мышами и контрольными мышами с дефицитом (фиг. 3c), скорее всего потому, что у этих животных не был достигнут полный химеризм (таблица 3).

[217] Через девять месяцев после трансплантации гемопоэтические предшественники от первичных реципиентов были трансплантированы вторичным реципиентам, у которых сохранились уровни приживления (62,89 ± 5,61%) и VCN (1,44 ± 0,08 копий) (таблица 3). У подвергшихся вторичной трансплантации реципиентов наблюдалось мультилинейное восстановление гемопоэза вплоть до 5 месяцев после трансплантации (фиг. 4) и значительное улучшение всех параметров эритроидных клеток ПК (фиг. 5 и таблица 2). Фиг. 4a представляет собой диаграмму стратегии проточной цитометрии, использованной для идентификации различных линий гемопоэтических клеток путем мечения антителами CD3-PE, B220-PE, B220-PECy5, Gr1-биотин и Mac1-биотин плюс SAV-PE-Cy5. На фиг. 4b показаны иллюстративные точечные диаграммы и проценты (фиг. 4c) каждой линии в ПК через 140 дней после трансплантации. Столбцы представляют собой средний процент ± SEM для контрольных здоровых мышей (n = 2, черный столбец) и контрольных мышей с PKD (n = 2, серый столбец), и подвергшихся вторичной трансплантации мышей, экспрессирующих терапевтический трансген coRPK (n = 4, заштрихованный столбец). Кроме того, интеграции провируса были обнаружены у гемопоэтических предшественников различной коммитированности (фиг. 6a,b), и их количество оставалось постоянным во времени (фиг. 6c), демонстрируя стабильность генетической коррекции и подчеркивая безопасность PGK-coRPK LV. На фиг. 6а показано количество копий вектора на клетку в КОЕ КМ от отдельных трансплантированных мышей через 120-170 дней после трансплантации. Также показан процент трансдукции и химеризма. На фиг. 6b показано количество копий провируса в клетках из разных гемопоэтических компартментов. Столбцы представляют собой среднее значение ± SEM для разных групп подвергшихся трансплантации мышей. На фиг. 6с показана кинетика интеграций провируса в клетках КМ от отдельных трансплантированных экспрессирующих EGFP мышей (серые линии) и мышей, несущих трансген coRPK (черные линии).

Пример 2

Экспрессия RPK, обеспечиваемая LV, нормализует дифференцировку эритроидных клеток и обеспечивает продукцию функциональных зрелых эритроцитов

[218] У мышей с PKD наблюдается характерное расширение эритроидного компартмента, вызванное компенсаторным механизмом эритропоэза (Min-oo et al 2004). Изучение характера дифференцировки эритроидных клеток у подвергшихся трансплантации мышей показало, что эктопическая экспрессия RPK вызвала реверсию этого механизма (фиг. 7a,b). У мышей с PKD и мышей, экспрессирующих EGFP, наблюдалось преобладание незрелых предшественников эритроидных клеток (субпопуляция I: проэритробласты и субпопуляция II: базофильные эритробласты) в КМ и селезенке, а также значительное снижение поздних эритроидных клеток (популяция IV: ретикулоциты и зрелые эритроциты), тогда как у мышей, которым трансплантировали клетки, трансдуцированные LV с coRPK, наблюдалось значительное снижение количества незрелых предшественников эритроидных клеток (субпопуляции I и II) в КМ и селезенке и значительное увеличение последнего эритроидного компартмента (субпопуляции IV), эквивалентное здоровым мышам (фиг. 7a,b). Кроме того, в отличие от мышей с PKD и мышей, экспрессирующих EGFP, у носителей трансгена coRPK наблюдалось значительное снижение уровней эритропоэтина (Epo) в плазме (фиг. 7c). На фиг. 8a показаны общие КОЕ из селезенки, а на фиг. 8b показан костный мозг через 140 дней после трансплантации. Точки обозначают количество проанализированных колоний на одну мышь, а линии представляют среднее значение ± SEM в каждой группе. Данные были статистически проанализированы с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Нормализация эритропоэза у мышей с PKD, получавших терапевтический вектор, сопровождалась снижением содержания числа предшественников в селезенке до нормальных уровней (фиг. 8a), хотя никаких изменений в содержании КОЕ в КМ не было отмечено (фиг. 8b).

Пример 3

Трансплантация клеток, трансдуцированных LV вектором с coRPK, вызывает реверсию экстрамедуллярного эритропоэза и патологии органов.

[219] Из-за активного разрушения эритроцитов с дефицитом RPK у мышей с PKD и мышей, экспрессирующих EGFP, наблюдалась острая спленомегалия с увеличением массы и размера селезенки более чем на 200% по сравнению со здоровыми контролями (фиг. 9a,b). У этих животных также наблюдалось нарушение структуры ткани селезенки и расширение красной пульпы селезенки, что свидетельствует об интенсивном экстрамедуллярном эритропоэзе, что также подтверждается наличием кластеров эритроидных клеток в срезах печени мышей с PKD и мышей, экспрессирующих EGFP (фиг. 9c). Примечательно, что эктопическая экспрессия трансгена coRPK привела к полной реверсии патологии селезенки и печени у мышей с генетической коррекцией, снижая накопления эритроцитов и нормализуя гистологическую структуру и размер селезенки (фиг. 9). Кроме того, гистологические исследования выявили полное отсутствие отложений железа в печени у мышей с генетической коррекцией, в то время как у мышей с PKD из группы, не подвергшейся трансплантации, либо из группы, которой трансплантировали HSC, трансдуцированные вектором, несущим EGFP, наблюдался значительный избыток железа из-за непрерывного гемолитического процесса (фиг. 9c). В целом, у мышей с PKD трансплантация генетически скорректированных HSC восстановила нормальный статус эритропоэза и всех вторичных эффектов, вызванных гемолитической анемией.

Пример 4

Экспрессия, обеспечиваемая PGK-coRPK LV, восстанавливает гликолитический путь в эритроцитах без изменения метаболического баланса лейкоцитов.

[220] Далее авторы провели обширный метаболический анализ всех подвергшихся трансплантации и контрольных мышей для изучения функциональной коррекции ферментативной активности RPK. Основываясь на стратегии нецелевого профилирования, авторы наблюдали значительные изменения промежуточных продуктов гликолиза в эритроцитах разных групп, и было идентифицировано три широких кластера метаболических профилей с отчетливыми тенденциями (фиг. 10a). Эритроциты от мышей, экспрессирующих coRPK, продемонстрировали увеличение уровня метаболитов из кластера 1, схожее со здоровыми контролями, но отличающееся от подвергшихся трансплантации мышей, несущих трансген EGFP. Аналогичным образом кластер 3 отражает тенденцию к снижению метаболитов у мышей с генетической коррекцией, схожее с мышами дикого типа и отличающееся от мышей, экспрессирующих EGFP. Тем не менее, кластер 2 из анализа 1 не продемонстрировал различий в профиле метаболитов между группами подвергшихся трансплантации мышей (мышей, экспрессирующих EGFP и coRPK) (фиг. 10a). Нецелевое метаболическое профилирование также показало, что генетическая модификация позволила модифицировать некоторые важные промежуточные продукты гликолиза с увеличением уровней АТФ (фиг. 10b), АДФ (фиг. 10c) и пирувата (фиг. 10d) в эритроцитах, выделенных у мышей, которым трансплантировали HSC, трансдуцированные PGK-coRPK LV. Учитывая эти метаболические тенденции, авторы затем проанализировали другие метаболиты, расположенные ближе к катализируемой PK реакции, используя подход целевого профилирования. Уровни непосредственного субстрата PK, фосфоенолпирувата (ФЕП) (фиг. 10e), и 3-фосфоглицерата (3-ФГ) (фиг. 10f), расположенных выше катализируемой PK реакции, приближались к таковым у здоровых контрольных мышей. Эритроциты с дефицитом, экспрессирующие трансген coRPK, также вызывали увеличение D-лактата (фиг. 10g), конечного продукта анаэробного гликолиза, по сравнению с мышами, экспрессирующими PKD и EGFP. Чтобы проверить, была ли компенсация метаболитов гликолиза результатом нормализации активности PK в зрелых эритроцитах, авторы измерили активность этого фермента и нормировали ее по отношению к активности гексокиназы, чтобы избежать влияния больших количеств ретикулоцитов у животных с дефицитом. Эритроциты очищали через колонку с целлюлозой во избежание искажения активности PK лейкоцитами. Полная компенсация активности PK наблюдалась у животных, экспрессирующих coRPK, у которых были достигнуты соотношения, аналогичные полученным у здоровых животных дикого типа и у нормального здорового добровольца-донора крови (фиг. 11). На фиг. 11а показана активность пируваткиназы, на фиг. 11b показана активность гексокиназы, а на фиг. 11с показано соотношение ферментативных активностей пируваткиназы и гексокиназы в эритроцитах контрольных мышей и мышей, которым трансплантировали трансдуцированные клетки. Эритроциты были очищены от образцов крови через колонку с целлюлозой во избежание искажения активности PK лейкоцитами, и подвергнуты оценке ферментативной активности. Черные столбцы - здоровые мыши (n = 2); белые столбцы - мыши, которым трансплантировали клетки, трансдуцированные вектором, экспрессирующим EGFP (n = 3); заштрихованные столбцы - мыши, которым трансплантировали клетки, трансдуцированные вектором, экспрессирующим coRPK (n = 3). Окрашенные в клетку столбцы представляют собой значения, полученные на здоровом добровольце (n = 1). Данные представляют собой среднее значение ± SEM для каждой группы.

[221] Анализ основных компонентов показал, что метаболический профиль эритроцитов различался в зависимости от группы и заметно отличался от профиля лейкоцитов (фиг. 12а). Напротив, подгруппы лейкоцитов группировались в кластеры, причем между группами наблюдалось незначительное отличие, что указывает на отсутствие изменений в метаболическом балансе лейкоцитов при экспрессии эктопической coRPK (фиг. 12a). Кроме того, специфические изменения метаболитов, наблюдаемые в нецелевом профилировании эритроцитов, не наблюдались в лейкоцитах (фиг. 12b-d).

Пример 5

Клетки, трансдуцированные PGK-coRPK LV, обеспечивают поликлональное восстановление гемопоэза без признаков генотоксичности вектора.

[222] У подвергшихся трансплантации мышей анализировали профиль интеграции LV, несущих трансген coRPK либо EGFP. Ввиду полногеномного профиля интеграции LV каждая вставка создавала уникальную генетическую метку, которая может быть использована для отслеживания клонального поведения в отдельных трансдуцированных клетках. Геномную ДНК (гДНК) получали из лейкоцитов и из клеток КМ, а также из подвергшихся первичной и вторичной трансплантации мышей, и из пулов трансдуцированных клеток перед трансплантацией (клеток Lin^-). Для амплификации соединений вектор/геном и для идентификации IS вектора использовали ПЦР, опосредованную линейной амплификацией (LAM-ПЦР) (фиг. 13 и 14). На фиг. 13 показано, что IS вектора были идентифицированы с помощью LAM-ПЦР-амплификации соединений 3’-концевой LTR вектора-геном. Была использована автоматизированная система MultiNA, генерирующая картину, характеризующуюся несколькими полосами. Полоса внутреннего контроля (IC) Tsp509I, полученная из основной структуры вектора, обозначена стрелкой. На фиг. 14 показано, что IS вектора были идентифицированы с помощью LAM-ПЦР-амплификации соединений 3’-концевой LTR вектора-геном. Была использована автоматизированная система MultiNA, генерирующая картину, характеризующуюся несколькими полосами. IC HpyCH4IV5, полученный из основной структуры вектора, обозначена стрелкой.

[223] Продукты ПЦР секвенировали на платформе MiSeq Illumina, и полученные последовательности картировали на геном мыши с помощью биоинформатического конвейера и фильтровали от коллизий, как описано в разделе «Методы» выше (фиг. 15). Фиг. 15 представляет собой общую схему анализа картирования IS, проведенного у мышей, которым трансплантировали генетически модифицированные гемопоэтические предшественники. Образцы костного мозга и лейкоцитов от подвергшихся трансплантации мышей, принадлежащие к двум независимым экспериментам (таблица 3) и собранные в разные моменты времени после трансплантации, анализировали, как описано в дополнительных методах после показанного конвейера.

[224] В общей сложности авторы картировали 5 173 892 прочтения на геном подвергшихся трансплантации мышей, в результате чего получили 2220 уникальных сайтов интеграции вектора. Геномное распределение IS из двух независимых экспериментов соответствовало ранее описанной избирательной интеграции LV в единицы транскрипции (особенно в пределах первых 50 т. п. н. по ходу транскрипции от сайта инициации транскрипции -TSS-) (фиг. 16a), без какого-либо отклонения в сторону какой-либо конкретной хромосомы в геноме мыши (фиг. 16b). На фиг. 16a показана плотность распределения IS вокруг TSS ближайшего гена из RefSeq, на расстоянии 500 т. п. н. против хода и по ходу транскрипции от TSS. Числа сверху представляют собой количество IS, обнаруженных для всех образцов и моментов времени. На фиг. 16b показано хромосомное распределение IS LV у подвергшихся трансплантации мышей, экспрессирующих трансген EGFP (черные столбцы) или терапевтический трансген coRPK (серые столбцы), демонстрирующее отсутствие отклонения в сторону какой-либо конкретной хромосомы.

[225] Безопасность генной терапии на основе PGK-coRPK LV изучали на основе оценок клональной представленности, вычисляя процент числа последовательностей для каждого IS (клональная метка) по отношению к общему количеству последовательностей в наборе данных. Точечные диаграммы и тепловые карты, демонстрирующие относительную представленность каждого IS, найденного для каждой мыши (фиг. 17, 18 и 19), показали значительные колебания клонального состава для различных мышей и культивируемых in vitro клеток Lin^-. Фиг. 17 представляет собой таблицу отслеженных общих интеграций между первичными и вторичными мышами-реципиентами, несущими терапевтический вектор PGK-coRPK LV. Интеграции, обнаруженные у любой из мышей в любом органе и в любое время, объединяются. Вторичные реципиенты получали объединенный КМ от подвергшихся трансплантации мышей coRPK с 11 по 14. Остальные обнаруженные IS были обнаружены у первичных либо у вторичных реципиентов. Числа в квадратиках показывают репрезентативность в процентах соответствующей интеграции в указанной мыши. Помимо фильтра ≥5%, применяемого при анализе интеграций, были исключены все интеграции с числом последовательностей < 3. Фиг. 19 представляет собой представление на точечной диаграмме клональной представленности объединенных интеграций у каждой мыши в костном мозге. Относительный процент (ось y) для каждого IS относится к общему количеству прочтений, полученных в каждом наборе данных. Аналогично клеткам, трансдуцированным co-RPK (фиг. 17), график демонстрирует, что у подавляющего большинства подвергшихся трансплантации мышей наблюдается поликлональная картина гемопоэтической репопуляции.

[226] Также было выявлено, что для нескольких образцов небольшое количество интеграций обеспечивало большое количество прочтений (фиг. 17 и 18), что характеризует поликлональную картину репопуляции трансдуцированных HSC. Кроме того, отслеживание общих интеграций между первичными мышами, несущими терапевтический PGK-coRPK LV, и впоследствии подвергшимися трансплантации вторичными мышами не показало большого количества общих интеграций между группами, подтверждая отсутствие клональной доминантности (фиг. 18).

[227] Чтобы определить, присутствовали ли признаки инсерционного мутагенеза у подвергшихся трансплантации мышей, авторы оценили частоту общих сайтов интеграции (CIS) аналогично проводимым в настоящее время клиническим исследованиям LV. CIS являются инсерционными горячими точками, которые могут быть результатом ошибки интеграции во время трансдукции или отбора in vivo клонов, содержащих интеграции вектора, обеспечивающие преимущество роста. CIS были идентифицированы с использованием алгоритма, основанного на Abel и cols, и критерия Граббса для выбросов, и по этим данным не было обнаружено CIS, и, таким образом, никаких вызывающих тревогу признаков генотоксичности. Более того, анализ GO не выявил какого-либо отклонения в сторону классов генов, участвующих в развитии рака, пролиферации клеток или регуляции апоптоза, ни в одном из интеграционных наборов данных, отсортированных по тканевому распределению, моменту времени или представленности репопулирующих клонов гемопоэтических клеток (фиг. 20). Фиг. 20 представляет собой профиль геномной интеграции LV. Анализ GO проводили с использованием программного обеспечения GREAT на образцах от подвергшейся трансплантации мыши. Все интеграции, полученные из этого исследования (N = 2220), показали превалирование функций генов, указанных в левой части фигуры. Чтобы определить, были ли наиболее распространенные интеграции обогащены в определенных классах генов, были выбраны все IS с относительным числом последовательностей > 5% всего набора данных (показаны на фиг. 17), в результате чего не было выявлено чрезмерной представленности классов генов GO.

[228] Эти результаты свидетельствуют о нейтральности интеграции вектора и демонстрируют безопасность PGK-coRPK LV в доклинических условиях.

Пример 6

Клиническое исследование на людях

[229] Для оценки безопасности и предварительной эффективности аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) с использованием лекарственного средства EU/3/14/1130 (аутологичные CD34+ гемопоэтические стволовые клетки, трансдуцированные LV вектором, содержащим ген RPK) у пациентов с PKD с историей тяжелой и трансфузионно-зависимой анемии, резистентной к спленэктомии, проводится клиническое исследование.

[230] ODD (орфанный препарат) EU/3/14/1130 содержит SIN LV вектор, экспрессирующий ген coRPK (фиг. 21).

[231] SIN LV векторы обеспечивают более устойчивую экспрессию (Ellis 2005) и менее восприимчивы к сайленсингу транскрипции, чем гамма-ретровирусные векторы (Pfeifer, Ikawa et al., 2002). Они также характеризуются гораздо более безопасным профилем интеграции (Schroder, Shinn et al. 2002) (Mitchell, Beitzel et al. 2004) (Wu, Li et al., 2003), и из-за делеции в 400 п. н., которую они несут в последовательности 3’-LTR (Miyoshi, Blomer et al., 1998) (Zufferey, Dull et al., 1998), экспрессия трансгена регулируется внутренними промоторами, повышая безопасность генетической модификации на основе LV.

[232] Последовательность утвержденного LV вектора также включает несколько модификаций для улучшения экспрессии трансгена и безопасности в клетках-мишенях.

[233] Одной из модификаций является использование промотора PGK человека, который уже был охарактеризован как обладающий стабильной активностью in vivo и улучшенным профилем безопасности по сравнению с другими промоторами, используемыми в генной терапии (Montini, Cesana et al. 2006, Modlich, Navarro et al., 2009, Montini, Cesana et al., 2009, Biffi, Montini et al., 2013). Включение промотора PGK приводит к физиологичной экспрессии трансгена и более низкой восприимчивости к сайленсингу транскрипции (Gerolami, Uch et al., 2000, Zychlinski, Schambach et al., 2008).

[234] Другой модификацией является ген coRPK для повышения стабильности мРНК при транскрипции. Для оптимизации было использовано программное обеспечение GeneArt^®, увеличивающее содержание GC и удаляющее криптические сайты сплайсинга, чтобы избежать сайленсинга транскрипции и, следовательно, повысить экспрессию трансгена. Оптимизированная последовательность coRPK демонстрирует 80,4% гомологии гену PKLR человека без изменений в аминокислотной последовательности белка.

[235] Другая модификация представляет собой мутированный wPRE, лишенный какой-либо остаточной открытой рамки считывания (Schambach, Bohne et al. 2006), включенный для улучшения уровня экспрессии и стабильности терапевтического гена. Последовательности основной структуры, промотора и wPRE* этого LV вектора (PGK-coRPK LV) являются такими же, как последовательности, соответствующие лекарственному препарату «Лентивирусный вектор, содержащий ген анемии Фанкони A (FANCA), для терапии пациентов с анемией Фанкони типа A» (№ 141/2000), а также основной структуре вектора, используемого в проводимом в настоящее время клиническом исследовании лечения метахроматической лейкодистрофии (MLD) (Biffi, Montini et al. 2013).

[236] Образ действий

[237] После сбора CD34⁺ клеток-предшественников от пациентов с PKD, либо из костного мозга (КМ), либо из мобилизованных клеток периферической крови, их трансдуцируют лекарственным средством ex vivo, и терапевтический вектор будет интегрирован в геном клеток. После интеграции терапевтический ген человека (coRPK) транскрибируется и транслируется в клетках с дефицитом, обеспечивая продукцию терапевтического белка RPK, который отсутствует или снижен в зрелых эритроцитах с PKD. Затем трансдуцированные гемопоэтические предшественники с PKD претерпевают генетическую коррекцию и, таким образом, способны продуцировать эритроциты с достаточным количеством АТФ для осуществления их функций (фиг. 22). Затем эти генетически скорректированные гемопоэтические предшественники (которые будут входить в состав лекарственного средства) трансплантируют обратно пациенту, где после приживления из них образуются нормальные эритроциты, обеспечивающие пожизненное излечение заболевания.

[238] Активное начало представляет собой клеточную суспензию скорректированных гемопоэтических стволовых клеток (CD34⁺) с терапевтическим LV вектором PGK.coRPK.wpre, которому Комиссией Европейского союза был присвоен статус орфанного препарата (ODD EU/3/14/1130) для лечения PKD. Таким образом, это новое лекарственное средство должно быть включено в группы разработки передовой терапии в подклассе генной терапии.

[239] Активное начало состоит из генетически модифицированной клеточной суспензии, содержащей по меньшей мере 2×10⁶ CD34⁺ клеток/кг массы тела, с по меньшей мере 0,1 копий терапевтического вектора на клетку. Клетки суспендированы в солевом буфере с 2% HSA.

[240] Конечный терапевтический продукт производится в соответствии с принципами GMP (правила производства и контроля качества лекарственных средств), поэтому требования к продукту в отношении его выпуска и его инфузии в организм пациента будут связаны с качеством продукта. В связи с этим эти спецификации будут включать жизнеспособность клеток ≥30%, стерильность (окраска по Граму и стерильность по фармакопее), отсутствие микоплазмы, отсутствие компетентных по репликации частиц LV и демонстрацию величины терапевтического потенциала путем обнаружения наличие не менее 0,1 копий вектора на клетку с помощью количественной ПЦР. Кроме того, проводится изучение и научные исследования содержания гемопоэтических предшественников и количества копий векторов в них. Со здоровыми контрольными клетками проводят три независимые проверки, чтобы убедиться в том, что процедура удовлетворяет вышеописанным требованиям.

[241] Конечный продукт упаковывают в транспортировочный пакет, запечатанный нагреванием, особенно для замораживания и хранения до его инфузии пациенту; до этого отбирают образцы для соответствующего контроля качества.

Мобилизация

[242] Пациенты проходят мобилизацию в соответствующих больницах, за исключением двух первых пациентов, проходящих мобилизацию в больнице Hospital del Niño Jesús, Мадрид (Испания). Процесс мобилизации включает в себя введение рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ, Neupogen, Amgen, Таузенд-Оукс, Калифорния, США) в дозах 12 мг/кг два раза в сутки в течение вплоть до восьми дней от рождения, плериксафора на 4 день в дозе 240 мг/кг/сут (Mozobil®, Genzyme Europe BV, Нарден, Нидерланды) в количестве до четырех подкожных доз в течение 4 дней подряд. Гемопоэтические клетки-предшественники из периферической крови собирают с помощью лейкафереза, и большие объемы с 5 дня мобилизации пропускают через сепаратор клеток в соответствии со стандартными протоколами больницы Hospital Niño Jesús в Мадриде. Все приборы и решения имеют маркировку СЕ и соответствуют законодательно установленным спецификациям для медицинских приборов.

Очистка CD34⁺ клеток

[243] Аналогично процессу мобилизации аферез проводят в больнице, где пациент проходит мобилизацию. Продукт афереза немедленно обрабатывают для отбора гемопоэтических предшественников (CD34⁺ клетки) с помощью технологии «магнитной сортировки клеток» MACS (Miltenyi Biotec, Германия), которая позволяет разделять клетки с помощью высокого градиента магнитного поля посредством мощного постоянного магнита и разделительной колонки с ферромагнитной матрицей. Система CliniMACS (Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия) состоит из компьютера (CliniMACS®plus Instrument), специального программного обеспечения для отбора CD34⁺, набора стерильных трубок (наборы трубок CliniMACS), реакционноспособного стерильного инструмента с магнитным управлением (реагент CliniMACS CD34) и стерильного буфера (буфер CliniMACS PBS/EDTA). Используемые приборы и реагенты имеют маркировку СЕ и соответствуют законодательно установленным спецификациям для медицинских приборов. Во время этой фазы и последующих отмывок используют неспецифический иммуноглобулин (флебогамма 5% для внутривенного введения, 0,5 г, Grifols) и человеческий альбумин (человеческий альбумин Grifols® 20%, Grifols), которые затем удаляют отмывкой после центрифугирования. Затем проводят количественную оценку CD34+ клеток. Микробиологический контроль полученных продуктов будет осуществляться путем отбора стандартных образцов грибов, аэробных бактерий и анаэробов для культивирования в соответствии со специальными протоколами.

Трансдукция CD34⁺

[244] Трансдукцию очищенных CD34⁺ клеток с помощью ODD EU/3/14/1130 проводят в условиях GMP в пределах 48 часов с момента взятия клеток у пациента (афереза). Культура клеток ex-vivo существует менее 48 часов и будет культивирована в соответствии с установленными стандартами, включая использование правильно составленной среды X-vivo-20 (Lonza), добавление гемопоэтических факторов роста (100 нг/мл hrSCF, 100 нг/мл hrFlt-3, 100 нг/мл ТРО и 20 нг/мл ИЛ-3 (все от Prepotech), 1 мкг/мл пульмозима и контролируемую концентрацию 5% O₂. Трансдукция будет проводиться с использованием GMP партии LV ODD EU/3/14/1130 производства VIVEbiotech (Сан-Себастьян, Испания). После трансдукции клетки отмывают в X-vivo-20 (Lonza) для окончательной упаковки в транспортировочный пакет, подходящий для криоконсервации. Отдельные образцы отбирают, чтобы определить, соответствует ли конечный продукт всем упомянутым спецификациям для его окончательного выпуска. Для оценки стабильности продукта проводят три независимые проверки. Все продукты и решения, включая вектор, будут соответствовать законодательно установленным спецификациям для медицинских приборов и клинического применения. Перед производством все сырье (включая расходные материалы, биологические реагенты и химические порошки) будут проверено отделом контроля качества (QC) CliniStem в соответствии с производственной инструкцией (SOP).

Подготовка

[245] Пациентов подготавливают в соответствии со стандартизированными и специальными протоколами, принятыми для исследования. При рассмотрении пациента для подготовки в качестве альтернативы, хранят замороженный запас 2×10⁶ не подвергшихся манипуляциям CD34⁺ клеток/кг для использования в случае, если приготовленный продукт не полностью восстановит гемопоэз у получившего лечение пациента.

Инфузия

[246] Перед инфузией проверяют соответствие пациентов критериям для участия в исследовании. День инфузии, использованные лекарственные средства для премедикации и профилактические средства фиксируют.

Пример 7

Доклиническая разработка

[247] Ранее проведенная работа продемонстрировала возможность применения генной терапии HSC для лечения PKD у мышей при трансплантации более 25% генетически скорректированных клеток. Эти результаты свидетельствуют о том, что для достижения терапевтического эффекта при PKD необходимо значительное количество донорских генетически скорректированных HSC (Zaucha, Yu et al. 2001) и высокие уровни экспрессии трансгена. Авторы разработали новый терапевтический LV вектор, предложенный для данного клинического исследования, несущий эукариотический промотор hPGK, управляющий экспрессией кДНК PKLR, которому был присвоен статус орфанного препарата в августе 2014 года (EU/3/14/1130). Используя этот вектор, авторы осуществили протокол доклинической генной терапии PKD на мышиной модели заболевания. При дозах LV, основанных на клинических стандартах, эктопическая экспрессия RPK была способна нормализовать эритроидный компартмент, корректируя гематологический фенотип и устраняя патологию органа. Метаболические исследования продемонстрировали функциональную коррекцию гликолитического пути в генетически скорректированных эритроцитах, при которой не наблюдалось нарушений метаболизма лейкоцитов. Примечательно, что параллельно анализируемые лейкоциты не показали изменений метаболического баланса в лейкоцитах при эктопической экспрессии RPK под действием универсального промотора, такого как PGK, что позволило исключить метаболическое преимущество лейкоцитов как возможный фактор опасности и является еще одним аргументов в пользу терапевтического потенциала вектора EU/3/14/1130.

[248] Мультилинейное восстановление и отсутствие каких-либо случаев лейкоза или клональной экспансии у вторичных реципиентов после пролиферативного стресса, вызванного повторной трансплантацией КМ, демонстрируют долгосрочную стабильность и безопасность протокола на основе вектора PGK-coRPK LV. Использование эукариотического промотора PGK человека, который i) по-видимому, приводил к более физиологичной экспрессии трансгена RPK, ii) как было показано, является слабым трансактиватором, и iii) в настоящее время используется в клинических исследованиях метахроматической лейкодистрофии (MLD), также могло внести вклад в безопасность всей процедуры.

[249] Для оценки долгосрочной безопасности генной терапии HSC посредством анализа IS вектора было использовано секвенирование нового поколения для прогнозирования риска инсерционного онкогенеза в HSC. Более 5 173 892 прочтений были картированы на геном мыши, в результаты чего было получено в общей сложности 2220 уникальных IS вектора без каких-либо свидетельств расширения или отбора клонов, несущих IS, in vivo. Полученные авторами данные, напротив, демонстрируют клональный состав и динамику гемопоэза после трансплантации трансдуцированных HSC у мышей, свидетельствующие об истинной и стабильной генетической модификации HSC in vivo в долгосрочной перспективе. В целом, анализ профиля интеграции вектора подчеркивает профиль безопасности вектора PGK-coRPK LV, который обеспечивает генетическую коррекцию PKD без признаков генотоксичности.

Пример 8

Клиническая разработка

[250] Содействие в составлении протокола клинического исследования запрашивается у надзорного органа. Цель авторов состоит в проведении клинического исследования, спонсируемого Комиссией Европейского союза. Был создан консорциум ForGeTPKD, в состав которого входят различные клиницисты и фундаментальные исследователи в Европе, чтобы сосредоточиться на исследованиях PKD и разработке новых стратегий терапии. Клиническое исследование ForGeTPKD будет первым случаем введения этого лекарственного средства людям. Оно разработано как международное многоцентровое исследование фазы I/II с открытой маркировкой для оценки безопасности и эффективности трансплантации аутологичных CD34+ клеток, трансдуцированных ex vivo лентивирусным вектором, содержащим ген эритроцитарной пируваткиназы (RPK) (EU/3/14/1130) у пациентов с тяжелой формой дефицита пируваткиназы.

Регуляторный статус

[251] В настоящее время лекарственное средство не имеет разрешения на реализацию. Целью Консорциума PKD является продвижение к клинической разработке лекарственного средства, чтобы в конечном итоге получить разрешение на реализацию.

[252] Упомянутый конечный продукт будет производиться с LV вектором, получившим статус орфанного препарата ввиду:

[253] Показаний: лечение дефицита пируваткиназы.

[254] Критериев: единственным видом лечения PKD является аллогенная ТКМ, которая использовалась у пациентов с трансфузионно-зависимой тяжелой анемией, резистентной к другим мерам. Тем не менее, аллогенная ТКМ не является широко распространенным вариантом лечения PKD (в литературе сообщается только об одном пациенте (Tanphaichitr, Suvatte et al. 2000)), так как она связана с тяжелыми осложнениями, связанными с интенсивной подготовкой к аллогенной ТКМ с помощью химиотерапии или химио-лучевой терапии, а также острой и хронической реакцией «трансплантат против хозяина» (РТПХ). Гипотеза авторов состоит в том, что генная терапия с использованием аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, трансдуцированных вирусными векторами, содержащими дикий тип этого гена, обеспечиваемая с помощью ODD EU/3/14/1130, может представлять потенциальную возможность излечения этих пациентов, избегая при этом рисков РТПХ - основной причины неблагоприятного исхода трансплантации гемопоэтических предшественников.

[255] Активное вещество: аутологичные CD34⁺ гемопоэтические стволовые клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, содержащим ген эритроцитарной пируваткиназы (RPK) (ODD EU/3/14/1130), экспрессирующим белок дикого типа.

[256] Готовый продукт: замороженный пакет, содержащий по меньшей мере 2х10⁶ активных веществ/кг массы тела пациента, суспендированных в солевом буфере с 2% HAS.

Пример 9

Фармакология

[257] Завершенные исследования: разработанное лекарственное средство включает несколько модификаций в его последовательности, которые обеспечивают некоторые преимущества для генной терапии PKD: 1) использование векторной конструкции SIN-LV позволило относительно легко и безопасно получить исходные запасы вируса, способные эффективно трансдуцировать HSC; 2) использование слабого эукариотического промотора, такого как hPGK, который менее восприимчив к сайленсингу посредством метилирования (Gerolami, Uch et al. 2000), обеспечивает физиологичную экспрессию трансгена, достигая терапевтических уровней с дозировкой вируса (1,65 VCN) в рамках клинических стандартов (Matrai, Chuah et al. 2010); и 3) оптимизированная по кодонам последовательность трансгена и присутствие мутированной последовательности wPRE увеличивает стабильность мРНК трансгена. Репортерный ген не был включен в последовательность терапевтического вектора во избежание возможных проблем, связанных с иммуногенностью (Morris, Conerly et al. 2004); (Stripecke, Carmen Villacres et al. 1999).

[258] Разработанное лекарственное средство на основе hPGK-coRPK LV эффективно устраняло патологию PKD у первичных и вторичных мышей с дефицитом, которым трансплантировали предшественников, трансдуцированных и скорректированных с помощью ODD EU/3/14/1130. Коррекция была достигнута с клетками, несущими в среднем 1,65 копий терапевтического трансгена на клетку.

[259] Промотор PGK человека был достаточно мощным, чтобы экспрессировать клинически значимые уровни белка coRPK, восстанавливая гемолитический фенотип у подвергшихся трансплантации мышей.

[260] Генетическая коррекция обеспечила: продление периода полужизни эритроцитов; нормализацию гематологических показателей и уровней ретикулоцитов; реверсию компенсаторного эритропоэза, конститутивно активированного у мышей с PKD; и купирование патологии в селезенке и печени, путем значительного снижения избытка железа, который является одним из опасных для жизни осложнений PKD. Кроме того, эктопическая экспрессия RPK человека скорректировала энергетический дефект в эритроцитах без изменения метаболического баланса в лейкоцитах, что подчеркивает эффективность и безопасность лекарственного средства.

Пример 10

Текущие исследования

[261] Трансдукция человеческих гемопоэтических предшественников от здоровых доноров и пациентов с PKD для исследования: 1) определения эффективности трансдукции ODD EU/3/14/1130 в человеческих клетках; 2) определения оптимального количества копий вектора на клетку для достижения эффективной и терапевтической экспрессии терапевтического белка RPK; и 3) определения оптимальных условий для достижения терапевтических уровней трансдукции без потери функции гемопоэтических стволовых клеток.

[262] Запланированные исследования включают в себя создание условий для крупномасштабной трансдукции в учреждении GMP, а также предварительную проверку и 3 подтверждающих исследования, чтобы установить оптимальные условия для достижения требуемых спецификаций, определенных для конечного терапевтического продукта.

[263] Токсикология

[264] Результаты завершенного исследования включают следующие: 1) эктопическая экспрессия RPK человека корректировала энергетический дефект в эритроцитах без изменения метаболического баланса в лейкоцитах; 2) анализ геномной интеграции вектора показал, что (i) анализ относительной представленности специфических клеточных клонов выявил олигоклональное гемопоэтическое восстановление у некоторых мышей в отсутствие клонального доминирования у подвергшихся первичной и вторичной трансплантации мышей; (ii) анализ CIS, считающийся признаком инсерционного мутагенеза, не выявил каких-либо признаков генотоксичности или аномального обогащения CIS с течением времени, так как детектируемые CIS из двух независимых экспериментов по генной терапии, проведенных на мышах, не были представлены высоким числом последовательностей и не характеризовались избирательным присутствием в трансформирующих генах; (iii) анализ GO генов, на которые нацелена интеграция LV, и анализ положения интеграций вектора в конкретных областях генома не продемонстрировали отклонений в направлении классов генов, участвующих в развитии рака, пролиферации клеток или регуляции апоптоза; и (iv) в целом, анализ интеграции лекарственного средства не показал каких-либо признаков генотоксичности.

[265] Запланированные исследования включают 1) анализ продукции рекомбинантных компетентных лентивирусов (RCL): человеческие Т-лимфоциты от здоровых доноров и от пациентов с PKD будут трансдуцированы ODD EU/3/14/1130 и культивированы in vitro в течение длительных периодов времени. Присутствие вирусного белка p24 будет проанализировано в супернатантах с помощью ELISA для оценки потенциальной генерации RCL; и 2) биораспределение лекарственного средства: мышиные гемопоэтические предшественники будут трансдуцированы ODD EU/3/14/1130 и трансплантированы облученным летальной дозой реципиентам. Через месяц после трансплантации животные будут умерщвлены, а различные органы (гонады, печень, почки, головной мозг, костный мозг, селезенка и периферическая кровь) будут проанализированы на наличие векторной ДНК; и 3) интеграция вектора в человеческие клетки: гемопоэтические предшественники от здоровых доноров и от пациентов с PKD будут трансдуцированы ODD EU/3/14/1130 и трансплантированы мышам с тяжелым иммунодефицитом, чтобы обеспечить приживление и пролиферацию человеческих гемопоэтических клеток. В разные моменты времени (через 1, 2 и 3 месяца после трансплантации) будут взяты трансплантаты крови и КМ, отсортированы по человеческим клеткам и подвергнуты анализу интеграции вектора, как уже было выполнено с мышиными клетками.

Пример 11

Клиническое исследование на людях

[266] Для проверки клинической эффективности будет проведено исследование ForGeTPKD. Предложенное клиническое исследование направлено на оценку безопасности и предварительной эффективности аутологичной HSCT с использованием лекарственного средства EU/3/14/1130 (аутологичные CD34⁺ гемопоэтические стволовые клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, содержащим ген эритроцитарной пируваткиназы (RPK)) у пациентов с PKD с историей тяжелой и трансфузионно-зависимой анемии, резистентной к спленэктомии.

[267] Основной целью является оценка лечения, безопасности и переносимости/возможности применения. Соответственно, будут измеряться следующие конечные точки: 1) частота и характеристика нежелательных явлений (AE), включая: AE, связанные с инфузией трансдуцированных клеток, AE, являющиеся результатом подготовки перед инфузией клеток, и AE, являющиеся результатом клональной эволюции, связанной с трансдуцированными клетками; и 2) количество пациентов с приживлением стволовых клеток через 30 дней после трансплантации.

[268] Дополнительные цели состоят в оценке предварительной эффективности лечения. Соответственно, будут измеряться следующие конечные точки: 1) количество пациентов, которые стали «трансфузионно-независимыми» в конце исследования, и количество пациентов, которым по-прежнему необходимы переливания крови после лечения; 2) соотношение между средним количеством переливаний, необходимых в течение периода исследования (1 год), и средним количеством переливаний за последние 1,5 года перед оценкой на момент включения в исследование; 3) клинически значимое снижение анемии, определяемое как количество пациентов с повышением уровня гемоглобина на 2 г/дл от исходного уровня, в конце исследования; 4) клинически значимое снижение ретикулоцитоза, определяемое как количество пациентов со снижением на 50% от исходного уровня, в конце исследования; и 5) количество пациентов с приживлением стволовых клеток, у которых может быть обнаружен 1% трансдуцированных клеток через 6 и 12 месяцев после инфузии клеток, в конце исследования.

[269] Исследовательская цель состоит в оценке влияния лечения на качество жизни пациента. Соответственно, будет измеряться следующая конечная точка: улучшение качества жизни от исходного уровня в конце исследования с использованием опросника о качестве жизни (SF-36 для взрослых или PEDSQL для детей) и его переведенных утвержденных версий на языке стран-участниц (итальянский, нидерландский и испанский).

[270] Исследование ForGetPKD представляет собой многоцентровое международное исследование, которое будет проводиться в 3 странах-членах Евросоюза: Испании, Италии и Нидерландах. Участвующие центры включают Референсных национальных исследователей и учреждения для диагностики и лечения PKD.

[271] Исследование будет представлять собой первый случая введения человеку описанного продукта. Оно разработано как несравнительное, открытое исследование фазы I/II с однократным введением препарата.

[272] Общая продолжительность исследования составит 2 года с момента первого посещения первого пациента до последнего посещения последнего пациента. Этот период включает 1 год периода набора пациентов и 1 год периода лечения и первоначальное (немедленное) последующее наблюдение. После окончания исследования включенным в него субъектам будет предложено принять участие в последующем исследовании отдаленных результатов, в котором будет контролироваться безопасность и эффективность в течение вплоть до 5 лет после трансплантации.

[273] Процедуры, предусмотренные исследованием, включают период обследования, период лечения и период последующего наблюдения. Подробная информация о посещениях на каждом этапе и связанных с ними процедурах, предусмотренных исследованием, приведена ниже и обобщена в таблице 4.

Период скрининга

Визит 1: визит перед скринингом

[274] Потенциальные кандидаты будут проинформированы о целях и особенностях исследования, и пациентом (или законным представителем, если он является несовершеннолетним) будет получено, исполнено и подписано письменное информированное согласие в двух экземплярах. Чтобы иметь право на участие в исследовании, пациенты должны соответствовать всем критериям включения и ни одному из критериев исключения, которые будут проверены. Эта проверка включает в себя процедуру предварительного лечения для мобилизации и получения жизнеспособных CD34⁺ клеток для A. хранения 2x10⁶ CD34+ клеток/кг массы тела, служащих резервным вариантом в случае неприживления, B. трансдукции по меньшей мере 6x10⁶ CD34+ клеток/кг массы тела вектором EU/3/14/1130 для получения лекарственного средства и для осуществления всех процедур контроля качества, необходимых для выпуска лекарственного средства. Только пациенты с достаточным количеством трансдуцированных клеток, доступных после выпуска лекарственного средства (2x10⁶ трансдуцированных CD34⁺ клеток/кг массы тела), будут включены в исследование.

[275] В ходе этого посещения также будут проведены следующие процедуры:

- Регистрация значимых сведений о ранее перенесенных заболеваниях или хирургических вмешательствах.

- Регистрация демографических данных и клинически значимых результатов физикального обследования

- Регистрация значимых сопутствующих лекарственных препаратов.

- Тестирование периферической крови путем проведения стандартных клинических анализов крови (CBC), биохимии, определения коагуляции и серологии.

- Эхокардиограмма, исследование функции легких и рентгенография грудной клетки.

- Опросник качества жизни (SF-36 или PEDSQL).

- Генетическая диагностика PKD.

[276] Чтобы иметь право на участие в исследовании, пациенты должны соответствовать всем нижеуказанным критериям включения и ни одному из критериев исключения.

[277] Критериями включения являются пациенты мужского или женского пола, возраст >2 лет на момент набора пациентов, готовность дать подписанное информированное согласие (которое будет подписано их родителями или законным представителем в случае детей в возрасте до 18 лет), ранее установленный диагноз PKD, подтвержденный генетическим тестированием, история тяжелой трансфузионно-зависимой анемии, не отвечающей на спленэктомию, кандидат на аутологичную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток, доступность ≥2x10⁶ трансдуцированных CD34⁺ клеток/кг массы тела, и лечение и наблюдение в течение по меньшей мере последних 2 лет в специализированном центре, который вел подробные медицинские записи, включая историю переливания крови.

[278] Критериями исключения являются: положительный результат на наличие вируса иммунодефицита человека 1 или 2 типа (ВИЧ 1 и ВИЧ 2), нескорректированное нарушение свертываемости крови, наличие других причин гемолиза, любое предшествующее или текущее злокачественное новообразование или миелопролиферативное или иммунодефицитное нарушение, ближайший член семьи с известным или предполагаемым семейным раковым синдромом (включая, не ограничиваясь перечисленным, наследственный синдром рака молочной железы и яичников, наследственный неполипозный колоректальный рак и семейный аденоматозный полипоз), у пациентов с предшествующей аллогенной трансплантацией - наличие остаточных клеток донорского происхождения, пациенты с тяжелыми осложнениями, которые после медицинской оценки считаются страдающими нарушениями сердечной, легочной, печеночной или почечной функции III/IV степени, неконтролируемое судорожное расстройство (нарушение), диффузионная способность легких по монооксиду углерода (DLco) <50% от прогнозируемой (с поправкой на гемоглобин), любые другие свидетельства большого избытка железа, которое, по мнению исследователя, служит основанием для исключения, участие в другом клиническом исследовании с исследуемым лекарственным средством в течение 30 дней после скрининга, наличие HLA-идентичного донора из членов семьи для аллогенной трансплантации костного мозга, беременные или кормящие женщины, пациенты, которые, согласно критериям исследователя, не смогут понять цели исследования, преимущества и риски, и/или соблюсти процедуры, предусмотренные исследованиям, плохое функциональное состояние, о чем свидетельствует индекс Карновского ≤80 у взрослых или Лански ≤80 у детей.

[279] Статистический анализ исследования будет описательным. Качественные конечные точки будут описаны частотами и процентами. К качественным конечным точкам относятся нежелательные явления, количество пациентов с приживлением стволовых клеток, количество пациентов, которые становятся «трансфузионно-независимыми», количество пациентов, у которых наблюдается клинически значимое снижение анемии, количество пациентов, у которых наблюдается клинически значимое снижение ретикулоцитоза, количество пациентов с приживлением стволовых клеток, у которых может быть обнаружено наличие трансдуцированных клеток, и улучшение качества жизни по сравнению с исходным уровнем, измеренное с помощью опросника SF-36 или PEDSQL. Количественные конечные точки будут описаны средним и стандартным отклонением или медианой и квартилями. Количественные конечные точки включают снижение анемии и ретикулоцитоза по сравнению с исходным уровнем, количество переливаний, необходимое в течение периода исследования, по отношению к количеству переливаний за последний год перед оценкой на момент включения в исследование, и количество копий вектора в периферической крови и костном мозге. Все конечные точки будут описаны в конце исследования.

[280] Ранее проведенная работа продемонстрировала возможность применения генной терапии HSC для лечения PKD у мышей при трансплантации более 25% генетически скорректированных клеток. Эти результаты свидетельствуют о том, что для достижения терапевтического эффекта при PKD необходимо значительное количество донорских генетически скорректированных HSC (Zaucha, Yu et al., 2001) и высокие уровни экспрессии трансгена. Авторы разработали новый терапевтический LV вектор, предложенный для данного клинического исследования, несущий эукариотический промотор hPGK, управляющий экспрессией кДНК PKLR, которому был присвоен статус орфанного препарата в августе 2014 года (EU/3/14/1130). Используя этот вектор, авторы осуществили протокол доклинической генной терапии PKD на мышиной модели заболевания. При дозах LV, основанных на клинических стандартах, эктопическая экспрессия RPK была способна нормализовать эритроидный компартмент, корректируя гематологический фенотип и устраняя патологию органа. Метаболические исследования продемонстрировали функциональную коррекцию гликолитического пути в генетически скорректированных эритроцитах, при этом не наблюдалось нарушений метаболизма лейкоцитов. Примечательно, что параллельно анализируемые лейкоциты не показали изменений метаболического баланса в лейкоцитах при эктопической экспрессии RPK под действием универсального промотора, такого как PGK, что позволило исключить метаболическое преимущество лейкоцитов как возможный фактор опасности и является еще одним аргументов в пользу терапевтического потенциала вектора EU/3/14/1130.

[281] Мультилинейное восстановление и отсутствие каких-либо случаев лейкоза или клональной экспансии у вторичных реципиентов после пролиферативного стресса, вызванного повторной трансплантацией КМ, демонстрируют долгосрочную стабильность и безопасность протокола на основе вектора PGK-coRPK LV. Использование эукариотического промотора PGK человека, который, по-видимому, приводил к более физиологичной экспрессии трансгена RPK, который, как было показано, является слабым трансактиватором, и в настоящее время используется в клинических исследованиях метахроматической лейкодистрофии (MLD), также могло внести вклад в безопасность всей процедуры.

[282] Для оценки долгосрочной безопасности генной терапии HSC посредством анализа IS вектора было использовано секвенирование нового поколения для прогнозирования риска инсерционного онкогенеза в HSC. Более 5 173 892 прочтений были картированы на геном мыши, в результаты чего было получено в общей сложности 2220 уникальных IS вектора без каких-либо свидетельств расширения или отбора клонов, несущих IS, in vivo. Полученные авторами данные, напротив, демонстрируют клональный состав и динамику гемопоэза после трансплантации трансдуцированных HSC у мышей, свидетельствующие об истинной и стабильной генетической модификации HSC in vivo в долгосрочной перспективе. В целом, анализ профиля интеграции вектора подчеркивает профиль безопасности вектора PGK-coRPK LV, который обеспечивает генетическую коррекцию PKD без признаков генотоксичности.

[283] Изобретение может быть дополнительно определено посредством ссылки на следующие иллюстративные положения.

1. Кассета экспрессии, содержащая полинуклеотидную последовательность, содержащую, в следующем порядке от 5’- к 3’-концу:

а) промоторную последовательность;

b) последовательность, кодирующую продукт гена; и

c) сигнал экспорта рибонуклеиновой кислоты (РНК),

где указанная промоторная последовательность функционально связана с последовательностью, кодирующей продукт гена.

2. Кассета экспрессии по положению 1, где промотор представляет собой промотор фосфоглицераткиназы (PGK).

3. Кассета экспрессии по положению 1 или положению 2, где продукт гена представляет собой терапевтический продукт гена.

4. Кассета экспрессии по положению 3, где терапевтический продукт гена представляет собой полипептид пируваткиназы (PK), необязательно полипептид печеночной и эритроцитарной пируваткиназы пируваткиназы (PKLR).

5. Кассета экспрессии по любому из положений 1-4, где последовательность, кодирующая продукт гена, оптимизирована по кодонам.

6. Кассета экспрессии по положению 5, где оптимизированная по кодонам последовательность содержит последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью SEQ ID NO: 8.

7. Кассета экспрессии по любому из положений 1-6, где сигнал экспорта РНК представляет собой мутированный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (wPRE).

8. Кассета экспрессии по положению 7, где мутированный wPRE представляет собой химерный wPRE, содержащий последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью SEQ ID NO: 24.

9. Кассета экспрессии по любому из положений 1-8, дополнительно содержащая одну или более энхансерных последовательностей.

10. Кассета экспрессии по любому из положений 1-9, дополнительно содержащая полипуриновый тракт (PPT) или последовательность сигнала полиаденилирования (полиА).

11. Кассета экспрессии по любому из положений 1-10, дополнительно содержащая одну или более из следующих последовательностей:

i) последовательность сигнала упаковки;

ii) усеченную последовательность Gag;

iii) Rev-отвечающий элемент (RRE);

iv) центральный полипуриновый тракт (cPPT);

v) центральную терминирующую последовательность (CTS); и

vi) расположенный против хода транскрипции элемент последовательности (USE), необязательно из вируса обезьян 40 (SV40-USE).

12. Кассета экспрессии по любому из положений 1-11, дополнительно содержащая последовательности 5’- и 3’-концевого длинного концевого повтора.

13. Вектор доставки рекомбинантного гена, содержащий кассету экспрессии по любому из положений 1-12.

14. Вектор доставки рекомбинантного гена по положению 13, представляющий собой вирус или вирусный вектор.

15. Вектор доставки рекомбинантного гена по положению 14, где вирус или вирусный вектор представляет собой лентивирус (LV).

16. Клетка, содержащая кассету экспрессии по любому из положений 1-12 или вектор доставки рекомбинантного гена по любому из положений 13-15.

17. Клетка по положению 16, представляющая собой гемопоэтическую стволовую клетку.

18. Клетка по положению 16, являющаяся коммитированным гемопоэтическим предшественником эритроидной клетки.

19. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество и вектор доставки рекомбинантного гена по любому из положений 13-15 или клетку по любому из положений 16-18.

20. Способ лечения или предотвращения заболевания или нарушения у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтической композиции по положению 19.

21. Способ по положению 20, где заболевание или нарушение представляет собой дефицит пируваткиназы (PKD), а продукт гена представляет собой полипептид пируваткиназы (PK), необязательно полипептид печеночной и эритроцитарной пируваткиназы (PKLR).

22. Способ по положению 20 или 21, где фармацевтическая композиция содержит вектор доставки рекомбинантного гена.

23. Способ по положению 20 или положению 21, где фармацевтическая композиция содержит указанную клетку.

24. Способ по положению 23, где клетка является аутологичной для субъекта.

25. Способ экспрессии трансгена в эритроидных клетках, включающий приведение одной или более эритроидных клеток в контакт с эффективным количеством рекомбинантного вирусного вектора, где указанный вектор содержит промотор фосфоглицераткиназы человека, оптимизированную по кодонам версию трансгена кДНК печеночной и эритроцитарной пируваткиназы (PKLR) человека и мутированный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков, где после указанного приведения в контакт PKLR экспрессируется на обнаружимых уровнях в одной или более эритроидных клетках.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> СЕНТРО ДЕ ИНВЕСТИГАСЬОНЕС ЭНЕРХЕТИКАС, МЕДИОАМБЬЕНТАЛЕС И

ТЕКНОЛОХИКАС, О.А., М.П.

ФУНДАСЬОН ИНСТИТУТО ДЕ ИНВЕСТИГАСЬОН САНИТАРИА ФУНДАСЬОН ХИМЕНЕС ДИАС

СЕНТРО ДЕ ИНВЕСТИГАСЬОН БИОМЕДИКА ЭН РЕД

<120> ЛЕНТИВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ PKLR ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕФИЦИТА

ПИРУВАТКИНАЗЫ

<130> ROPA-004/01US 329592-2050

<150> US 62/573,037

<151> 2017-10-16

<160> 26

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 234

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Rev-отвечающий элемент (RRE)

<400> 1

aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 60

gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120

gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180

gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct 234

<210> 2

<211> 126

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнал упаковки ВИЧ-1 (пси)

<400> 2

ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga 60

ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag 120

agcgtc 126

<210> 3

<211> 181

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5' LTR ВИЧ-1

<400> 3

gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60

ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120

tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180

a 181

<210> 4

<211> 234

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> самоинактивирующийся 3' LTR ВИЧ-1

<400> 4

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca 234

<210> 5

<211> 204

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> предранний промотор цитомегаловируса (CMV) человека

<400> 5

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120

tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180

tgggaggtct atataagcag agct 204

<210> 6

<211> 118

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> центральный полипуриновый тракт и центральная терминирующая

последовательность ВИЧ-1 (cPPT/CTS)

<400> 6

ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60

agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaatttt 118

<210> 7

<211> 511

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> промотор фосфоглицераткиназы 1 человека (hPGK)

<400> 7

ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60

tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120

cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180

tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240

ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300

gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360

cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420

gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480

cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca g 511

<210> 8

<211> 1725

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> оптимизированная по кодонам версия кДНК PKLR человека (coRPK)

<400> 8

atgagcatcc aggaaaatat cagctctctg cagctgcggt cctgggtgtc caagagccag 60

agagacctgg ccaagagcat cctgatcgga gcccctggcg gaccagccgg atacctgaga 120

agggctagcg tggcccagct gacccaggaa ctgggcaccg cctttttcca gcagcagcag 180

ctgccagccg ccatggccga cacctttctg gaacacctgt gcctgctgga catcgactct 240

gagcccgtgg ccgccagaag caccagcatc attgccacca tcggccctgc cagcagaagc 300

gtggagcggc tgaaagagat gatcaaggcc ggcatgaata tcgcccggct gaacttctcc 360

cacggcagcc acgagtacca cgcagagagc attgccaacg tccgggaggc cgtggagagc 420

tttgccggca gccccctgag ctacagaccc gtggccattg ccctggacac caagggcccc 480

gagatcagaa caggaattct gcagggaggg cctgagagcg aggtggagct ggtgaagggc 540

agccaagtgc tggtgaccgt ggaccccgcc ttcagaacca gaggcaacgc caacacagtg 600

tgggtggact accccaacat cgtgcgggtg gtgcctgtgg gcggcagaat ctacatcgac 660

gacggcctga tcagcctggt ggtgcagaag atcggacctg agggcctggt gacccaggtc 720

gagaatggcg gcgtgctggg cagcagaaag ggcgtgaatc tgccaggcgc ccaggtggac 780

ctgcctggcc tgtctgagca ggacgtgaga gacctgagat ttggcgtgga gcacggcgtg 840

gacatcgtgt tcgccagctt cgtgcggaag gcctctgatg tggccgccgt gagagccgct 900

ctgggccctg aaggccacgg catcaagatc atcagcaaga tcgagaacca cgagggcgtg 960

aagcggttcg acgagatcct ggaagtgtcc gacggcatca tggtggccag aggcgacctg 1020

ggcatcgaga tccccgccga gaaggtgttc ctggcccaga aaatgatgat cggacggtgc 1080

aacctggccg gcaaacctgt ggtgtgcgcc acccagatgc tggaaagcat gatcaccaag 1140

cccagaccca ccagagccga gacaagcgac gtggccaacg ccgtgctgga tggcgctgac 1200

tgcatcatgc tgtccggcga gacagccaag ggcaacttcc ccgtggaggc cgtgaagatg 1260

cagcacgcca ttgccagaga agccgaggcc gccgtgtacc accggcagct gttcgaggaa 1320

ctgcggagag ccgcccctct gagcagagat cccaccgaag tgaccgccat cggagccgtg 1380

gaagccgcct tcaagtgctg cgccgctgca atcatcgtgc tgaccaccac aggcagaagc 1440

gcccagctgc tgtccagata cagacccaga gccgccgtga tcgccgtgac aagatccgcc 1500

caggccgcta gacaggtcca cctgtgcaga ggcgtgttcc ccctgctgta ccgggagcct 1560

cccgaggcca tctgggccga cgacgtggac agacgggtgc agttcggcat cgagagcggc 1620

aagctgcggg gcttcctgag agtgggcgac ctggtgatcg tggtgacagg ctggcggcct 1680

ggcagcggct acaccaacat catgagggtg ctgtccatca gctga 1725

<210> 9

<211> 380

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> энхансер CMV человека

<400> 9

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg 380

<210> 10

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнал поли(А) вируса обезьян 40 (SV40)

<400> 10

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120

ta 122

<210> 11

<211> 136

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> точка начала репликации SV40

<400> 11

atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 60

tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 120

ggcttttttg gaggcc 136

<210> 12

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> центральный полипуриновый тракт (cPPT)

<400> 12

tttaaaagaa aaggggggat tggggggt 28

<210> 13

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнальная последовательность dNEF

<400> 13

gaattcgagc tcggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca 60

ctttttaaaa gaaaaggggg gac 83

<210> 14

<211> 795

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность NeoR/KanR

<400> 14

atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggcgg cttgggtgga gaggctattc 60

ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120

gcgcaggggc gtccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180

caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gcgacgacgg gcgttccttg cgcggctgtg 240

ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300

gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360

cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420

atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480

gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgtc tatgcccgac 540

ggcgaggatc tcgtcgtgac ccacggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600

ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cgtctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660

atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720

cttgtgcttt acggtatcgc cgcgcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780

gacgagttct tctga 795

<210> 15

<211> 137

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> терминатор rrnG (терминатор транскрипции из оперона rcnG

рибосомной РНК E.coli)

<400> 15

gcattggcgc agaaaaaaat gcctgatgcg acgctgcgcg tcttatactc ccacatatgc 60

cagattcagc aacggatacg gcttccccaa cttgcccact tccatacgtg tcctccttac 120

cagaaattta tccttaa 137

<210> 16

<211> 589

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ori (точка начала репликации многокопийной

ColE1/pMB1/pBR322/pUC)

<400> 16

ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60

agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120

cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180

caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240

tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300

ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360

ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420

gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480

gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540

tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589

<210> 17

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность сайта связывания CAP

<400> 17

taatgtgagt tagctcactc at 22

<210> 18

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> промотор lac E.coli

<400> 18

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt g 31

<210> 19

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность оператора lac

<400> 19

ttgtgagcgg ataacaa 17

<210> 20

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> промотор T3 (промотор для РНК-полимеразы бактериофага T3)

<400> 20

aattaaccct cactaaagg 19

<210> 21

<211> 380

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> энхансер CMV

<400> 21

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg 380

<210> 22

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> промотор T7 (промотор для РНК-полимеразы бактериофага T7)

<400> 22

cctatagtga gtcgtatta 19

<210> 23

<211> 429

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ori f1 (точка начала репликации бактериофага f1)

<400> 23

acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 60

ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 120

cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 180

gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 240

catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 300

gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 360

aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 420

acgcgaatt 429

<210> 24

<211> 677

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнал экспорта РНК химерного wPRE

<400> 24

cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca 60

tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg gatatgtaat 120

tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag aaactttccc gttatttacg 180

ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct 240

taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc 300

tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct 360

ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga 420

cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc 480

tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac 540

aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg gcctgctgcc 600

ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 660

ggccgcctcc ccgcctg 677

<210> 25

<211> 9087

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> самоограничивающийся лентивирусный вектор доставки гена

<400> 25

gtgtttaaac ctagatattg atagtctgat cggtcaacgt ataatcgagt cctagctttt 60

gcaaacatct atcaagagac aggatcagca ggaggctttc gcatgattga acaagatgga 120

ttgcacgcag gttctccggc ggcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 180

cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgtccggtt 240

ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg 300

ctatcgtggc tggcgacgac gggcgttcct tgcgcggctg tgctcgacgt tgtcactgaa 360

gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 420

cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 480

gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 540

cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 600

ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg tctatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 660

acccacggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 720

atcgactgtg gccgtctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 780

gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tccttgtgct ttacggtatc 840

gccgcgcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaccg 900

attctaggtg cattggcgca gaaaaaaatg cctgatgcga cgctgcgcgt cttatactcc 960

cacatatgcc agattcagca acggatacgg cttccccaac ttgcccactt ccatacgtgt 1020

cctccttacc agaaatttat ccttaacgat cggacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 1080

cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 1140

caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 1200

taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 1260

cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 1320

cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 1380

gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 1440

aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 1500

cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 1560

tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 1620

acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 1680

ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 1740

ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 1800

tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 1860

tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 1920

ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 1980

gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 2040

cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 2100

gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc 2160

agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac 2220

tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga 2280

aacagctatg accatgatta cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag 2340

ctggagctgc aagcttggcc attgcatacg ttgtatccat atcataatat gtacatttat 2400

attggctcat gtccaacatt accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag 2460

taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt 2520

acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg 2580

acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat 2640

ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 2700

attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg 2760

gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg 2820

ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc 2880

caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa 2940

tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 3000

tatataagca gagctcgttt agtgaaccgg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct 3060

gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag 3120

tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac 3180

ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg aacagggact tgaaagcgaa 3240

agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt gctgaagcgc gcacggcaag 3300

aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg actagcggag gctagaagga 3360

gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga attagatcgc gatgggaaaa 3420

aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta aaacatatag tatgggcaag 3480

cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta gaaacatcag aaggctgtag 3540

acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga tcagaagaac ttagatcatt 3600

atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa 3660

ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt aagaccaccg cacagcaagc 3720

ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga caattggaga agtgaattat 3780

ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc acccaccaag gcaaagagaa 3840

gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc tttgttcctt gggttcttgg 3900

gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct gacggtacag gccagacaat 3960

tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag ggctattgag gcgcaacagc 4020

atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca ggcaagaatc ctggctgtgg 4080

aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg ttgctctgga aaactcattt 4140

gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa atctctggaa cagatttgga 4200

atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa ttacacaagc ttaatacact 4260

ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga acaagaatta ttggaattag 4320

ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa ttggctgtgg tatataaaat 4380

tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat agtttttgct gtactttcta 4440

tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt tcagacccac ctcccaaccc 4500

cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg tggagagaga gacagagaca 4560

gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt aacttttaaa agaaaagggg 4620

ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa 4680

ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt tatcgatcac gagactagcc 4740

tcgagaagct tgatatcgaa ttccacgggg ttggggttgc gccttttcca aggcagccct 4800

gggtttgcgc agggacgcgg ctgctctggg cgtggttccg ggaaacgcag cggcgccgac 4860

cctgggtctc gcacattctt cacgtccgtt cgcagcgtca cccggatctt cgccgctacc 4920

cttgtgggcc ccccggcgac gcttcctgct ccgcccctaa gtcgggaagg ttccttgcgg 4980

ttcgcggcgt gccggacgtg acaaacggaa gccgcacgtc tcactagtac cctcgcagac 5040

ggacagcgcc agggagcaat ggcagcgcgc cgaccgcgat gggctgtggc caatagcggc 5100

tgctcagcag ggcgcgccga gagcagcggc cgggaagggg cggtgcggga ggcggggtgt 5160

ggggcggtag tgtgggccct gttcctgccc gcgcggtgtt ccgcattctg caagcctccg 5220

gagcgcacgt cggcagtcgg ctccctcgtt gaccgaatca ccgacctctc tccccagggg 5280

gatccgtcga caccggtgcc accatgagca tccaggaaaa tatcagctct ctgcagctgc 5340

ggtcctgggt gtccaagagc cagagagacc tggccaagag catcctgatc ggagcccctg 5400

gcggaccagc cggatacctg agaagggcta gcgtggccca gctgacccag gaactgggca 5460

ccgccttttt ccagcagcag cagctgccag ccgccatggc cgacaccttt ctggaacacc 5520

tgtgcctgct ggacatcgac tctgagcccg tggccgccag aagcaccagc atcattgcca 5580

ccatcggccc tgccagcaga agcgtggagc ggctgaaaga gatgatcaag gccggcatga 5640

atatcgcccg gctgaacttc tcccacggca gccacgagta ccacgcagag agcattgcca 5700

acgtccggga ggccgtggag agctttgccg gcagccccct gagctacaga cccgtggcca 5760

ttgccctgga caccaagggc cccgagatca gaacaggaat tctgcaggga gggcctgaga 5820

gcgaggtgga gctggtgaag ggcagccaag tgctggtgac cgtggacccc gccttcagaa 5880

ccagaggcaa cgccaacaca gtgtgggtgg actaccccaa catcgtgcgg gtggtgcctg 5940

tgggcggcag aatctacatc gacgacggcc tgatcagcct ggtggtgcag aagatcggac 6000

ctgagggcct ggtgacccag gtcgagaatg gcggcgtgct gggcagcaga aagggcgtga 6060

atctgccagg cgcccaggtg gacctgcctg gcctgtctga gcaggacgtg agagacctga 6120

gatttggcgt ggagcacggc gtggacatcg tgttcgccag cttcgtgcgg aaggcctctg 6180

atgtggccgc cgtgagagcc gctctgggcc ctgaaggcca cggcatcaag atcatcagca 6240

agatcgagaa ccacgagggc gtgaagcggt tcgacgagat cctggaagtg tccgacggca 6300

tcatggtggc cagaggcgac ctgggcatcg agatccccgc cgagaaggtg ttcctggccc 6360

agaaaatgat gatcggacgg tgcaacctgg ccggcaaacc tgtggtgtgc gccacccaga 6420

tgctggaaag catgatcacc aagcccagac ccaccagagc cgagacaagc gacgtggcca 6480

acgccgtgct ggatggcgct gactgcatca tgctgtccgg cgagacagcc aagggcaact 6540

tccccgtgga ggccgtgaag atgcagcacg ccattgccag agaagccgag gccgccgtgt 6600

accaccggca gctgttcgag gaactgcgga gagccgcccc tctgagcaga gatcccaccg 6660

aagtgaccgc catcggagcc gtggaagccg ccttcaagtg ctgcgccgct gcaatcatcg 6720

tgctgaccac cacaggcaga agcgcccagc tgctgtccag atacagaccc agagccgccg 6780

tgatcgccgt gacaagatcc gcccaggccg ctagacaggt ccacctgtgc agaggcgtgt 6840

tccccctgct gtaccgggag cctcccgagg ccatctgggc cgacgacgtg gacagacggg 6900

tgcagttcgg catcgagagc ggcaagctgc ggggcttcct gagagtgggc gacctggtga 6960

tcgtggtgac aggctggcgg cctggcagcg gctacaccaa catcatgagg gtgctgtcca 7020

tcagctgacc gcggtctaga ggatcccccg ggctgcagga attcgagcat cttaccgcca 7080

tttattccca tatttgttct gtttttcttg atttgggtat acatttaaat gttaataaaa 7140

caaaatggtg gggcaatcat ttacattttt agggatatgt aattactagt tcaggtgtat 7200

tgccacaaga caaacatgtt aagaaacttt cccgttattt acgctctgtt cctgttaatc 7260

aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactgatat tcttaactat gttgctcctt 7320

ttacgctgtg tggatatgct gctttaatgc ctctgtatca tgctattgct tcccgtacgg 7380

ctttcgtttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc 7440

ccgttgtccg tcaacgtggc gtggtgtgct ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggct 7500

ggggcattgc caccacctgt caactccttt ctgggacttt cgctttcccc ctcccgatcg 7560

ccacggcaga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct aggttgctgg 7620

gcactgataa ttccgtggtg ttgtcgggga agggcctgct gccggctctg cggcctcttc 7680

cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcctg 7740

gaattcgagc tcggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca 7800

ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct 7860

gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg 7920

ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt 7980

gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt 8040

gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc 8100

aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 8160

ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 8220

tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta 8280

actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga 8340

ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag 8400

tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggg acgtacccaa ttcgccctat agtgagtcgt 8460

attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta 8520

cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 8580

cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct 8640

gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 8700

ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 8760

gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 8820

ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 8880

gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 8940

tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 9000

tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 9060

ttaacaaaat cgttccctca ggacgtc 9087

<210> 26

<211> 2890

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность кассеты экспрессии PKD (5`-3`)

<400> 26

ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60

tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120

cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180

tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240

ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300

gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360

cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420

gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480

cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca gggggatccg tcgacaccgg tgccaccatg 540

agcatccagg aaaatatcag ctctctgcag ctgcggtcct gggtgtccaa gagccagaga 600

gacctggcca agagcatcct gatcggagcc cctggcggac cagccggata cctgagaagg 660

gctagcgtgg cccagctgac ccaggaactg ggcaccgcct ttttccagca gcagcagctg 720

ccagccgcca tggccgacac ctttctggaa cacctgtgcc tgctggacat cgactctgag 780

cccgtggccg ccagaagcac cagcatcatt gccaccatcg gccctgccag cagaagcgtg 840

gagcggctga aagagatgat caaggccggc atgaatatcg cccggctgaa cttctcccac 900

ggcagccacg agtaccacgc agagagcatt gccaacgtcc gggaggccgt ggagagcttt 960

gccggcagcc ccctgagcta cagacccgtg gccattgccc tggacaccaa gggccccgag 1020

atcagaacag gaattctgca gggagggcct gagagcgagg tggagctggt gaagggcagc 1080

caagtgctgg tgaccgtgga ccccgccttc agaaccagag gcaacgccaa cacagtgtgg 1140

gtggactacc ccaacatcgt gcgggtggtg cctgtgggcg gcagaatcta catcgacgac 1200

ggcctgatca gcctggtggt gcagaagatc ggacctgagg gcctggtgac ccaggtcgag 1260

aatggcggcg tgctgggcag cagaaagggc gtgaatctgc caggcgccca ggtggacctg 1320

cctggcctgt ctgagcagga cgtgagagac ctgagatttg gcgtggagca cggcgtggac 1380

atcgtgttcg ccagcttcgt gcggaaggcc tctgatgtgg ccgccgtgag agccgctctg 1440

ggccctgaag gccacggcat caagatcatc agcaagatcg agaaccacga gggcgtgaag 1500

cggttcgacg agatcctgga agtgtccgac ggcatcatgg tggccagagg cgacctgggc 1560

atcgagatcc ccgccgagaa ggtgttcctg gcccagaaaa tgatgatcgg acggtgcaac 1620

ctggccggca aacctgtggt gtgcgccacc cagatgctgg aaagcatgat caccaagccc 1680

agacccacca gagccgagac aagcgacgtg gccaacgccg tgctggatgg cgctgactgc 1740

atcatgctgt ccggcgagac agccaagggc aacttccccg tggaggccgt gaagatgcag 1800

cacgccattg ccagagaagc cgaggccgcc gtgtaccacc ggcagctgtt cgaggaactg 1860

cggagagccg cccctctgag cagagatccc accgaagtga ccgccatcgg agccgtggaa 1920

gccgccttca agtgctgcgc cgctgcaatc atcgtgctga ccaccacagg cagaagcgcc 1980

cagctgctgt ccagatacag acccagagcc gccgtgatcg ccgtgacaag atccgcccag 2040

gccgctagac aggtccacct gtgcagaggc gtgttccccc tgctgtaccg ggagcctccc 2100

gaggccatct gggccgacga cgtggacaga cgggtgcagt tcggcatcga gagcggcaag 2160

ctgcggggct tcctgagagt gggcgacctg gtgatcgtgg tgacaggctg gcggcctggc 2220

agcggctaca ccaacatcat gagggtgctg tccatcagct gaccgcggtc tagaggatcc 2280

cccgggctgc aggaattcga gcatcttacc gccatttatt cccatatttg ttctgttttt 2340

cttgatttgg gtatacattt aaatgttaat aaaacaaaat ggtggggcaa tcatttacat 2400

ttttagggat atgtaattac tagttcaggt gtattgccac aagacaaaca tgttaagaaa 2460

ctttcccgtt atttacgctc tgttcctgtt aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 2520

agattgactg atattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta 2580

atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa 2640

tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tccgtcaacg tggcgtggtg 2700

tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc 2760

ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc 2820

cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg ctgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg 2880

gggaagggcc 2890

<---

1. Кассета экспрессии для лечения дефицита пируваткиназы (PKD), содержащая полинуклеотидную последовательность, содержащую, в следующем порядке от 5’- к 3’-концу:

а) промоторную последовательность; и

b) оптимизированную по кодонам последовательность, кодирующую продукт гена PKLR человека;

где указанная промоторная последовательность функционально связана с оптимизированной по кодонам последовательностью, кодирующей продукт гена PKLR человека,

где указанная оптимизированная по кодонам последовательность, кодирующая продукт гена PKLR человека, обладает по меньшей мере 95% идентичностью SEQ ID NO: 8, и

где указанная промоторная последовательность представляет собой промотор фосфоглицераткиназы (PGK), промотор цитомегаловируса (CMV), промотор lac, промотор Т3 или промотор Т7.

2. Кассета экспрессии по п. 1, где промотор представляет собой промотор фосфоглицераткиназы (PGK).

3. Кассета экспрессии по п. 1 или 2, дополнительно содержащая мутированный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (wPRE).

4. Кассета экспрессии по п. 3, где мутированный wPRE представляет собой химерный wPRE, содержащий последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 24.

5. Кассета экспрессии по любому из пп. 1-4, дополнительно содержащая полипуриновый тракт (PPT).

6. Кассета экспрессии по любому из пп. 1-5, дополнительно содержащая последовательность сигнала полиаденилирования (полиА).

7. Кассета экспрессии по любому из пп. 1-6, обладающая по меньшей мере 95% идентичностью SEQ ID NO: 26.

8. Кассета экспрессии по п. 7, обладающая по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 26.

9. Вектор доставки рекомбинантного гена, содержащий кассету экспрессии по любому из пп. 1-8, где вектор доставки рекомбинантного гена представляет собой лентивирусный вектор.

10. Вектор доставки рекомбинантного гена по п. 9, содержащий следующие последовательности, в порядке от 5’- к 3’-концу:

a) 5’ LTR;

b) последовательность ψ ВИЧ-1;

c) RRE;

d) последовательность cPPT/CTS;

e) последовательность промотора PGK, необязательно последовательность промотора PGK человека;

f) оптимизированную по кодонам последовательность, кодирующую продукт гена PKLR человека, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью SEQ ID NO: 8;

g) последовательность мутированного wPRE, обладающую по меньшей мере 100% идентичностью SEQ ID NO: 24;

i) 3’-LTR;

j) сигнал поли(А) SV40;

k) ориджин репликации (ori) SV40;

u) последовательность энхансера CMV; и

v) последовательность промотора CMV.

11. Вектор доставки рекомбинантного гена по п. 9, представляющий собой терапевтический вектор доставки гена.

12. Вектор доставки рекомбинантного гена по п. 11, способный обеспечивать долгосрочную стабильность и безопасность при клиническом применении.

13. Клетка млекопитающего для лечения дефицита пируваткиназы (PKD), содержащая кассету экспрессии по любому из пп. 1-8 или вектор доставки рекомбинантного гена по любому из пп. 9-12.

14. Клетка по п. 13, представляющая собой гемопоэтическую стволовую клетку.

15. Клетка по п. 14, являющаяся коммитированным гемопоэтическим предшественником эритроидной клетки.

16. Фармацевтическая композиция для лечения дефицита пируваткиназы (PKD), содержащая фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество и вектор доставки рекомбинантного гена по любому из пп. 9-12 или клетку по любому из пп. 13-15.

17. Способ лечения или предотвращения дефицита пируваткиназы (PKD) у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтической композиции по п. 16.

18. Способ по п. 17, где фармацевтическая композиция содержит вектор доставки рекомбинантного гена.

19. Способ по п. 17, где фармацевтическая композиция содержит указанную клетку.

20. Способ по п. 19, где клетка является аутологичной для субъекта.

21. Способ экспрессии гена PKLR человека в эритроидных клетках, включающий приведение одной или более эритроидных клеток в контакт с эффективным количеством рекомбинантного вирусного вектора, где указанный вектор содержит промотор фосфоглицераткиназы человека, оптимизированный по кодонам трансген PKLR и мутированный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков, где указанный оптимизированный по кодонам трансген PKLR обладает по меньшей мере 95% идентичностью SEQ ID NO: 8, и где после указанного приведения в контакт PKLR экспрессируется на обнаружимых уровнях в одной или более эритроидных клетках.