Рекомбинантные связывающие белки и их применение

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных связывающих рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) белков с анкириновыми повторами, и может быть использовано в медицине для лечения HER2 экспрессирующего рака. Предложен рекомбинантный бипаратопный связывающий белок, вызывающий антагонизм передачи сигнала ErbB, который содержит два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 и два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. Изобретение обеспечивает улучшенную стабильность при хранении терапевтически активного рекомбинантного белка, связывающего HER2 и сывороточный альбумин. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 17 пр.

 

Ссылка на родственную заявку

Согласно настоящей заявке испрашивается преимущество и приоритет в соответствии с заявкой на выдачу европейского патента ЕР 16190221, поданной 22 сентября 2016 г. в Европейское патентное ведомство. Содержание заявки на выдачу европейского патента ЕР 16190221 полностью включено в настоящий документ посредством ссылки для всех целей, включая в себя все таблицы, фигуры и формулу изобретения, а также включая в себя включение любого элемента или части описания, формулы изобретения или графических материалов, не содержащихся в настоящем документе и упомянутых в правиле 20.5 (а) РСТ, в соответствии с правилом 4.18 РСТ.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Предусмотрены новые рекомбинантные связывающие белки. Белки содержат два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 и два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, соединенные с помощью полипептидных линкеров. Рекомбинантные связывающие белки являются применимыми для лечения заболевания. В частности, рекомбинантные связывающие белки содержат сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, проявляющие высокую стабильность при хранении. Более того, предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные рекомбинантные связывающие белки, фармацевтические композиции, содержащие указанные рекомбинантные связывающие белки или нуклеиновые кислоты, и применение указанных рекомбинантных связывающих белков, нуклеиновых кислот или фармацевтических композиций в лечении заболеваний.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Библиотеки сконструированных белков с анкириновыми повторами (международная патентная публикация WO 2002/020565; Binz, Н.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., , M.G., and , A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004; Stumpp, M.T., Binz, H.K and Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008) можно использовать для отбора целевых специфических сконструированных доменов с анкириновыми повторами. Такие целевые специфические сконструированные домены с анкириновыми повторами, в свою очередь, можно использовать в качестве ценных компонентов рекомбинантных связывающих белков для лечения заболеваний. Был описан отбор различных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2 или ErbB2; UniProt Р04626) (международная патентная публикация WO 2014/083208). Согласно настоящему изобретению раскрыты рекомбинантные связывающие белки, содержащие сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2.

В отличие, например, от антител IgG, которые проявляют длительные системные периоды полужизни, опосредованные рециклингом FcRn, белки, содержащие сконструированные домены с анкириновыми повторами, как правило, проявляют быстрый фармакокинетический клиренс и короткие конечные периоды полужизни, если только белок не содержит элементы, которые улучшают фармакокинетические свойства, такие как, например, сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания с сывороточным альбумином, описанный в международной патентной публикации WO 2012/069654. Использование связывания с сывороточным альбумином для улучшения фармакокинетических свойств белков представляет собой способ, хорошо известный в настоящей области техники (см., например, международную патентную публикацию WO 1991/001743; Frejd F.Y., 2012 (в Kontermann, R (Ed.) "Therapeutic proteins: strategies to modulate their plasma half-lives", Wiley-VCH Verlag GmbH, 2012, ISBN 978-3-527-32849-9); и международную патентную публикацию WO 2012/069654). Для применения сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина в клинических лекарственных средствах-кандидатах, желательно, чтобы стабильность при хранении известных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина была улучшена. В настоящем документе раскрыты рекомбинантные связывающие белки, содержащие сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, причем указанные сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина проявляют улучшенные свойства стабильности при хранении. В отличие от предыдущих публикаций (Норр, J., Horning, N., Zettlitz, K.A., Schwarz, A., Fuss, N., , D., Kontermann, R.E. Protein Eng. Des. Sel. 23, 827-834, 2010), авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что благодаря наличию двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина вместо одного в рекомбинантном связывающем белке можно улучшить фармакокинетические свойства рекомбинантного связывающего белка.

HER2 играет важную роль в патогенезе и прогрессировании некоторых типов рака. HER2 представляет собой трансмембранную рецепторную тирозинкиназу (RTK), принадлежащую к более обширному семейству рецепторов ErbB (Bublil, Е.М. and Yarden, Y. Curr. Opin. Cell Biol. 19(2), 124-34, 2007). Семейство рецепторов ErbB является консервативным у позвоночных и также включает в себя ErbB1 или рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) или HER1 (UniProt Р00533) и рецепторы HER3 (ErbB3; UniProt Р21860) и HER4 (ErbB4; UniProt Q15303). Все рецепторы ErbB характеризуются обширными гомологиями последовательностей и доменов и образуют функциональные гомодимеры (например, ErbB1-ErbB1, HER2-HER2 и HER4-HER4) и гетеродимеры во всех комбинациях. Гомо- и гетеродимеризация рецепторов происходит при связывании лиганда или избыточной экспрессии рецептора и, в свою очередь, активирует внутриклеточные домены рецепторной киназы путем аутофосфорилирования. Это затем запускает нижележащую внутриклеточную передачу сигналов и биологические ответы. Хорошо известные антагонисты сигнальных путей ErbB включают в себя моноклональные антитела трастузумаб (связывание с доменом IV внеклеточного домена HER2 и ингибирование гомодимеризации HER2) и пертузумаб (связывание с доменом II внеклеточного домена HER2 и ингибирование гетеродимеризации HER2/HER3). Важно, что трастузумаб характеризуется, главным образом, антипролиферативным эффектом, и опухоли могут избежать такого лечения на поздних стадиях заболевания. Пертузумаб, который характеризуется неожиданно низкой терапевтической эффективностью в качестве отдельного средства, может дополнять активность трастузумаба, препятствуя гетеродимеризации HER2/HER3. Таким образом, комбинация трастузумаба с пертузумабом является привлекательной для лечения HER2-положительного рака (Capelan М., et al., Ann. Oncol., 24, 273-82, 2013).

Комбинация трастузумаба и пертузумаба привела к концепции, что для превосходной противоопухолевой эффективности необходимо двойное нацеленное воздействие на два домена в HER2. Сообщалось о смесях антител, нацеленных на домены II и IV HER2, или одновременно нацеленных на домен I и другой домен HER2 (US 20110033460; например, также домен IV) или домен I и домен IV (международная патентная публикация WO 2014/060365; Jost, Ch., et al., Structure 27, 1-13, 2013; Tamaskovic, R., et al., Nat Commun 7, 11672, 2016), или домен II и домен IV (международная патентная публикация WO 2014/083208), или об одновременном нацеливании эпитопа трастузумаба на домен IV HER2 и эпитопа пертузумаба на домен II HER2 (международная патентная публикация WO 2009/068625). Некоторые из подходов включали в себя бипаратопные связывающие белки. Интересно, что некоторые из бипаратопных связывающих белков, протестированных в международной патентной публикации WO 2009/068625, характеризовались антагонистическим эффектом, другие - агонистическим эффектом. Данные в международной патентной публикации WO 2014/083208 и Jost, Ch. et a.l (там же; международная патентная публикация WO 2014/060365) указывают на то, что генерация антагонистических бипаратопных связывающих белков не является прямой. Вместо этого для эффективного антагонизма необходимо оптимизировать тщательный выбор отдельных доменов (эпитоп, свойства связующего), а также структурного расположения (ориентация, расстояние, длина линкера, состав линкера). Кроме того, выбор фрагмента для фармакокинетической инженерии и его структурного расположения также необходимо оптимизировать. Вместе это представляет собой выбор по меньшей мере из 250000 различных вариантов.

В настоящем документе раскрыт рекомбинантный связывающий белок, содержащий (i) бипаратопный связывающий белок, вызывающий антагонизм передаче сигнала ErbB, состоящий из двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 и (ii) два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина и с улучшенной стабильностью при хранении. Указанный рекомбинантный связывающий белок, лекарственное средство - кандидат DARPin®, как показано, является ценным лекарственным средством - кандидатом для лечения различных заболеваний. DARPin® представляет собой зарегистрированный товарный знак Molecular Partners AG, Швейцария.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным связывающим белкам, содержащим четыре сконструированных домена с анкириновыми повторами, причем два из указанных четырех сконструированных доменов с анкириновыми повторами представляют собой сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, и при этом два из указанных четырех сконструированных доменов с анкириновыми повторами представляют собой сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. В частности, настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 21. Настоящее изобретение также относится к такому рекомбинантному связывающему белку, в котором каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 14. В частности, настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, который характеризуется по меньшей мере 95% идентичности последовательностей по отношению к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из SEQ ID NO: 21. Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, содержащий SEQ ID NO: 14, проявляет улучшенную стабильность при хранении в PBS по сравнению со сконструированным доменом с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, содержащим аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 13. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 21. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 21. Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок, содержащий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 21, проявляет более высокую стабильность при хранении, чем рекомбинантный связывающий белок, содержащий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 22. Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок согласно настоящему изобретению ингибирует пролиферацию клеток ВТ474 с константой ингибирования ниже 10^-7 М. Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок согласно настоящему изобретению в концентрации, составляющей 100 нМ, проявляет более сильную отрицательную регуляцию фосфорилирования AKT-S473 в клетках ВТ474, чем трастузумаб в концентрации, составляющей 100 нМ. Настоящее изобретение дополнительно относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим рекомбинантный связывающий белок согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям, содержащим рекомбинантный связывающий белок и/или нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для применения в лечении заболевания, неопластического заболевания, рака, рака молочной железы, рака яичника, рака желудка, рака желудка, рака матки, рака толстой и прямой кишки, рака мочевого пузыря, рака с избыточной экспрессией HER2, рака с экспрессией HER2, рака с аддикцией к HER2, рака с частичной аддикцией к HER2, рака с амплификацией HER2, резистентного к трастузумабу рака, чувствительного к трастузумабу рака, рака желудочно-кишечного тракта или рака головного мозга. Настоящее изобретение дополнительно относится к набору, содержащему рекомбинантный связывающий белок согласно настоящему изобретению или нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению или фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению, причем способ предусматривает стадии (i) экспрессии указанного рекомбинантного связывающего белка в бактериях, и (ii) очистки указанного рекомбинантного связывающего белка с использованием хроматографии.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Графическое представление рекомбинантных связывающих белков со специфичностью связывания в отношении HER2, содержащих сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина.

(а) Графическое представление сконструированного домена анкиринового повтора со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. Примеры таких доменов с анкириновыми повторами представляют собой сконструированные домены с анкириновыми повторами, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-15, в частности, сконструированный домен с анкириновыми повторами, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. (b) Графическое представление сконструированного домена анкиринового повтора со специфичностью связывания в отношении HER2. Примеры таких доменов с анкириновыми повторами представляют собой сконструированные домены с анкириновыми повторами, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16-20, в частности, сконструированные домены с анкириновыми повторами, содержащие аминокислотные последовательности согласно SEQ ID NO: 16 и 17. (с) Графическое представление полипептидного линкера (например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую любой из SEQ ID NO: 2-9, в частности, полипептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 9). (d) Графическое представление N-концевой аминокислотной последовательности. Примеры таких N-концевых аминокислотных последовательностей представляют собой, например, последовательности MGS или GS (как, например, представлено на N-конце любой из SEQ ID NO: 21-30 и 32 и 33), или полипептидные метки, как проиллюстрировано аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 1. (е) Графическое представление рекомбинантного связывающего белка, представленного в настоящем документе, содержащего два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина и два сконструированных домена с анкириновыми повторами, каждый из которых характеризуется специфичностью связывания в отношении HER2, соединенных с помощью полипептидных линкеров и характеризующихся N-концевой аминокислотной последовательностью. Два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина фланкированы двумя другими сконструированными доменами с анкириновыми повторами. Рекомбинантный связывающий белок, содержащий аминокислоты согласно SEQ ID NO: 21, соответствует этому графическому представлению.

Фигура 2. Улучшенная стабильность при хранении белка, содержащего SEQ ID NO: 14

Анализ SDS 15% PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) белка #13-His (#13) и белка #14-His (#14; см. пример 1), которые хранили при 10 мг/мл в PBS в течение 1 недели при 4°С (1), 25°С (2), 40°С (3) и 60°С (4). Белок #14-His проявляет более высокую стабильность при хранении, чем белок #13-His. М: Маркер (нижняя полоса: 6,5 кДа; полоса на уровне белка #14-His: 14,4 кДа; верхняя полоса в случае PAGE белка #14-His: 21,5 кДа).

Фигура 3. Ингибирование пролиферации клеток ВТ474 с помощью рекомбинантных связывающих белков со специфичностью связывания в отношении HER2.

Ингибирование пролиферации клеток рака молочной железы ВТ474 проводили, как описано в примере 6. Рекомбинантный связывающий белок, содержащий SEQ ID NO: 21, проявляет более низкую IC50, чем рекомбинантный связывающий белок, содержащий SEQ ID NO: 23, что указывает на то, что наличие SEQ ID NO: 16 и 17 в рекомбинантном связывающем белке является более благоприятным, чем наличие SEQ ID NO: 18 и 17. Закрашенные кружки и сплошная линия: белок #21-His; закрашенные квадраты и штриховая линия: белок #23-His; треугольник: отсутствие ингибитора. OD (оптическая плотность): OD405-OD620; С: концентрация в нМ.

Фигура 4. Эксперименты с использованием ксенотрансплантатной модели опухоли у мышей.

а.) Ксенотрансплантатная модель опухоли - рака молочной железы ВТ474 у мышей. Модель проводили, как описано в примере 7. Треугольники: PBS; незакрашенные квадраты: трастузумаб; ромбы с штриховой линией: трастузумаб и пертузумаб; закрашенные кружки: рекомбинантный связывающий белок со специфичностью связывания в отношении HER2 (белок #21-His); V: объем опухоли [мм³]; t: время [d]. b.) Ксенотрансплантатная модель опухоли - рака молочной железы ВТ474 у мышей, на которой сравнивают белок #21-His (21), белок #23-His (23), белок #24-His (24) или белок #25-His (25) на 18 день лечения. Эксперимент проводили, как описано в примере 7. Белок #21-His является значимо более эффективным в ингибировании роста опухоли, чем белок #24-His (р=0,0003), белок #23-His или белок #25. V: объем опухоли [мм³]; t: время [d]. с.) и d.) Модель опухоли с использованием полученного от пациента ксенотранспланта рака желудка GXA3039 у мышей. Эксперимент проводили дважды, как описано в примере 7. PBS (треугольники), пертузумаб (незакрашенные перевернутые треугольники), трастузумаб (незакрашенные квадраты), смесь трастузумаба и пертузумаба (ромбы со штриховой линией), а также белок #21 использовали в указанных экспериментах, с.) Белок #21 проявляет сильное ингибирование роста опухоли, аналогичное комбинации трастузумаба и пертузумаба, тогда как трастузумаб отдельно является менее эффективным, d.) Белок #21 проявляет сильное ингибирование роста опухоли, аналогичное комбинации трастузумаба и пертузумаба. Трастузумаб отдельно и пертузумаб отдельно являются значимо менее эффективными. RTV: относительный объем опухоли относительно объема опухоли в начале лечения [%]; t: время [d]. е.) Модель опухоли с использованием полученного от пациента ксенотранспланта рака желудка GXF281 у мышей. Эксперимент проводили, как описано в примере 7. PBS (треугольники), лапатиниб (незакрашенные квадраты), а также белок #21 (закрашенные кружки). Белок #21 показывает сильное ингибирование роста опухоли по сравнению с лапатинибом в этой модели. RTV: относительный объем опухоли относительно объема опухоли в начале лечения [%]; t: время [d].

Фигура 5. Фармакокинетические анализы у мышей.

а.) Анализ фармакокинетических свойств у мыши, сравнивающий белок #21-His (закрашенные кружки) с белком #23-His (квадраты) в соответствии с примером 8. Этот эксперимент указывает на фармакокинетическое преимущество наличия SEQ ID NO: 16 в рекомбинантном связывающем белке по сравнению с наличием SEQ ID NO: 18. b.) Анализ фармакокинетических свойств у мыши, сравнивающий белок #30-His (закрашенные кружки; содержит два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина) с белком #29-His (закрашенные квадраты; содержит один сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина) в соответствии с примерами 8 и 11. Наличие двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина улучшает фармакокинетический профиль, выходя за пределы профиля, достигнутого с помощью одного сконструированного домена анкиринового повтора со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. с.) Фармакокинетическое сравнение рекомбинантного связывающего белка, содержащего полипептидные линкеры GlySer (белок #26-His; закрашенные квадраты), с рекомбинантным связывающим белком, содержащим полипептидные линкеры ProThr (белок #27-His; закрашенные кружки), как описано в примерах 8 и 10. Наличие полипептидных линкеров ProThr оказывает благоприятное влияние на фармакокинетические свойства у мыши. %ID: процентное отношение введенной с помощью инъекции дозы, нормированное к значению измерения за 1 ч [%]; t: время [часы].

Фигура 6. Фармакокинетические анализы у яванского макака.

а) Анализ фармакокинетических свойств белка #21-His (закрашенные кружки) и белка #23-His (закрашенные квадраты) при дозе, составляющей 1 мг/кг, у яванского макака согласно примеру 9. Более длительный конечный период полужизни наблюдают для белка #21-His, что указывает на то, что наличие SEQ ID NO: 16 в рекомбинантном связывающем белке является более благоприятным, чем наличие SEQ ID NO: 18. b) Анализ фармакокинетических свойств белка #21-His в дозе, составляющей 1 мг/кг (закрашенные кружки), 5 мг/кг (закрашенные квадраты) и 10 мг/кг (закрашенные треугольники) у яванского макака согласно примеру 9. Белок #21-His проявляет зависимое от дозы увеличение конечного периода полужизни от 47 часов в дозе, составляющей 1 мг/кг, до 100 часов в дозе, составляющей 5 мг/кг, до приблизительно 180 часов в дозе, составляющей 10 мг/кг. С: Концентрация [нМ]; t: время [часы].

Фигура 7. Индукция апоптоза в клетках ВТ474.

Измерение апоптоза клеток ВТ474, индуцированного изменяющимися концентрациями белка #21 (закрашенные кружки), трастузумаба (незакрашенные квадраты), пертузумаба (незакрашенные перевернутые треугольники) или смеси 100 нМ трастузумаба и изменяющихся концентраций пертузумаба (незакрашенные ромбы; штриховая линия) согласно примеру 6. Результаты наносили на график, включая в себя аппроксимирующие кривые нелинейной регрессии. Измерения для PBS (закрашенный треугольник) и 100 нМ трастузумаба (закрашенный перевернутый треугольник) показаны в качестве эталонных значений при 50 пМ. С: концентрация в [нМ]; RLU: относительные световые единицы.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным связывающим белкам, содержащим четыре сконструированных домена с анкириновыми повторами, причем два из указанных четырех сконструированных доменов с анкириновыми повторами представляют собой сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, и при этом два из указанных четырех сконструированных доменов с анкириновыми повторами представляют собой сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. SEQ ID NO: 21 представляет собой пример такого рекомбинантного связывающего белка.

Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина характеризуется по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 14. Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 14, и/или (ii) последовательностей, в которых вплоть до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот согласно SEQ ID NO: 14 заменены любой аминокислотой. Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 14, и/или (ii) последовательностей, в которых вплоть до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот согласно SEQ ID NO: 14 заменены любой аминокислотой, и каждый из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина не является идентичным последовательности сконструированного домена анкиринового повтора со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 13 или 15 согласно настоящей заявке, а также SEQ ID NO: 17-25 и 43-48 согласно международной патентной публикации WO 2012/069654.

Согласно одному варианту осуществления предпоследняя аминокислота любой из SEQ ID NO: 10-20 представляет собой Ala или Leu, предпочтительно Ala. Согласно одному варианту осуществления С-концевая аминокислота любой из SEQ ID NO: 10-20 представляет собой Ala или Asn, предпочтительно Ala или необязательно отсутствует. Например, SEQ ID NO: 29 содержит, например, SEQ ID NO: 15, в которой предпоследняя аминокислота представляет собой Leu, и С-концевая аминокислота отсутствует. Предпочтительно как предпоследняя аминокислота, так и С-концевая аминокислота любого сконструированного домена анкиринового повтора (т.е. любая из SEQ ID NO: 10-20), присутствующего в рекомбинантном связывающем белке согласно настоящему изобретению, представляют собой Ala.

Согласно одному варианту осуществления аминокислоты Gly Ser на N-конце любой из SEQ ID NO: 10-30 и 32-33 необязательно отсутствуют.

Согласно одному варианту осуществления указанные два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина являются по меньшей мере на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичными в отношении аминокислотной последовательности. Согласно одному варианту осуществления указанные два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина из указанного рекомбинантного связывающего белка являются идентичными в отношении аминокислотной последовательности.

Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 14. Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению состоит из SEQ ID NO: 14.

Согласно одному варианту осуществления два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина из указанного рекомбинантного связывающего белка способны одновременно связывать по одной молекуле сывороточного альбумина каждый.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантным связывающим белкам, содержащим четыре сконструированных домена с анкириновыми повторами, причем два из указанных четырех сконструированных доменов с анкириновыми повторами представляют собой сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, и при этом два из указанных четырех сконструированных доменов с анкириновыми повторами представляют собой сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, и причем каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина состоит из SEQ ID NO: 14.

Согласно одному варианту осуществления указанный сконструированный домен с анкириновыми повторами, содержащий SEQ ID NO: 14, проявляет улучшенную стабильность при хранении в PBS по сравнению со сконструированным доменом с анкириновыми повторами, содержащим SEQ ID NO: 13. Согласно одному варианту осуществления указанный сконструированный домен с анкириновыми повторами, содержащий SEQ ID NO: 14, проявляет улучшенную стабильность при хранении в PBS по сравнению со сконструированным доменом с анкириновыми повторами, содержащим SEQ ID NO: 15. Согласно одному варианту осуществления указанный сконструированный домен с анкириновыми повторами, состоящий из SEQ ID NO: 14, проявляет улучшенную стабильность при хранении в PBS по сравнению со сконструированным доменом с анкириновыми повторами, состоящим из SEQ ID NO: 13. Согласно одному варианту осуществления указанный сконструированный домен с анкириновыми повторами, состоящий из SEQ ID NO: 14, проявляет улучшенную стабильность при хранении в PBS по сравнению со сконструированным доменом с анкириновыми повторами, состоящим из SEQ ID NO: 15. Сконструированные домены с анкириновыми повторами, состоящие из SEQ ID NO: 12-15, представляют собой примеры сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок содержит два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, причем каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и при этом каждый из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина проявляет улучшенную стабильность при хранении в PBS, предпочтительно сниженные количества продуктов разложения после хранения при 40°С в течение 1 месяца в концентрации 10 мг/мл в PBS, по сравнению со сконструированным доменом с анкириновыми повторами, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, причем каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 14, проявляет улучшенную стабильность при хранении, предпочтительно сниженные количества продуктов разложения после хранения при 40°С в течение 1 месяца в концентрации 10 мг/мл в PBS, по сравнению с соответствующим рекомбинантным связывающим белком, причем каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO: 21 и 22 представляют собой примеры таких рекомбинантных связывающих белков, содержащих SEQ ID NO: 14 и 13, соответственно.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, проявляет улучшенные фармакокинетические свойства по сравнению с соответствующим рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, проявляет более длительный конечный период полужизни у яванского макака по сравнению с соответствующим рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. В примере 11 (см. фигуру 5b) раскрыты рекомбинантные связывающие белки с улучшенными фармакокинетическими свойствами.

Согласно одному варианту осуществления указанные два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина представляют собой один N-концевой и один С-концевой из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2.

Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 характеризуется по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 16. Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 16, и/или (ii) последовательностей, в которых вплоть до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот согласно SEQ ID NO: 16 заменены любой аминокислотой. Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит SEQ ID NO: 16. Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 состоит из SEQ ID NO: 16.

Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 характеризуется по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 17. Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 17, и/или (ii) последовательностей, в которых вплоть до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот согласно SEQ ID NO: 17 заменены любой аминокислотой. Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит SEQ ID NO: 17. Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 состоит из SEQ ID NO: 17.

Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 характеризуется по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 16, и один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 характеризуется по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 17. Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 16, и/или (ii) последовательностей, в которых вплоть до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот согласно SEQ ID NO: 16 заменены любой аминокислотой, и один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 17, и/или (ii) последовательностей, в которых вплоть до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот согласно SEQ ID NO: 17 заменены любой аминокислотой. Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит SEQ ID NO: 16, и один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит SEQ ID NO: 17. Согласно одному варианту осуществления один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 состоит из SEQ ID NO: 16, и один из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 состоит из SEQ ID NO: 17. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок содержит SEQ ID NO: 16 на N-конце SEQ ID NO: 17.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 32. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 32 и/или (ii) последовательностей, в которых вплоть до 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот согласно SEQ ID NO: 32 заменены любой аминокислотой.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему четыре сконструированных домена с анкириновыми повторами, причем два из указанных четырех сконструированных доменов с анкириновыми повторами представляют собой сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, состоящие из SEQ ID NO: 16 и 17, и причем два из указанных четырех сконструированных доменов с анкириновыми повторами представляют собой сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, и причем каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина состоят из SEQ ID NO: 14.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему SEQ ID NO: 32 и дважды SEQ ID NO: 14. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему SEQ ID NO: 32 и дважды SEQ ID NO: 14, причем SEQ ID NO: 32 фланкирована одной SEQ ID NO: 14 на N-конце и одной SEQ ID NO: 14 на С-конце.

Согласно одному варианту осуществления полипептидные линкеры, соединяющие сконструированные домены с анкириновыми повторами, присутствующие в рекомбинантном связывающем белке согласно настоящему изобретению, содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9, в которых вплоть до 4, 3, 2, 1,0 аминокислот из указанных SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9 заменены любой аминокислотой. Согласно одному варианту осуществления фланкирующая N-концевая Gly Ser любой из SEQ ID NO: 7-9 и/или фланкирующая С-концевая Gly Ser любой из SEQ ID NO: 2-6 необязательно отсутствуют. Согласно одному варианту осуществления любая из SEQ ID NO: 2-9 необязательно дополнительно содержит Arg Ser на С-конце (как, например, представлено в SEQ ID NO: 29). Согласно одному варианту осуществления указанные полипептидные линкеры содержат аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9. Согласно одному варианту осуществления полипептидные линкеры, соединяющие сконструированные домены с анкириновыми повторами, присутствующие в рекомбинантном связывающем белке согласно настоящему изобретению, состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 3-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 4-9, более предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 9, более предпочтительно SEQ ID NO: 9. Согласно одному варианту осуществления каждый из полипептидных линкеров, соединяющих сконструированные домены с анкириновыми повторами, присутствующих в рекомбинантном связывающем белке согласно настоящему изобретению, состоит из SEQ ID NO: 9. Согласно одному варианту осуществления указанные полипептидные линкеры, присутствующие в рекомбинантном связывающем белке согласно настоящему изобретению, являются на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичными, предпочтительно идентичными. Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина состоит из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 14, и указанные четыре сконструированных домена с анкириновыми повторами соединены с помощью полипептидных линкеров, каждый из которых состоит из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 9.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему, в направлении от N-конца к С-концу: SEQ ID NO: 14 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 17 - SEQ ID NO: 14, соединенные с помощью полипептидных линкеров. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему в направлении от N-конца к С-концу: SEQ ID NO: 14 - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 17 - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 14.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из SEQ ID NO: 21. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 21 и/или (ii) аминокислотных последовательностей, в которых вплоть до 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот согласно SEQ ID NO: 21 заменены другими аминокислотами. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из SEQ ID NO: 21. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 21 и (ii) аминокислотных последовательностей, в которых вплоть до 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот согласно SEQ ID NO: 21 заменены другими аминокислотами. Предпочтительно указанные аминокислотные замены в SEQ ID NO: 21 расположены в положениях 127-444 согласно SEQ ID NO: 21.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из SEQ ID NO: 21, причем указанный рекомбинантный связывающий белок содержит два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, и причем каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из SEQ ID NO: 21, причем указанный рекомбинантный связывающий белок содержит два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, и причем каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 21 и/или (ii) аминокислотных последовательностей, в которых вплоть до 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот согласно SEQ ID NO: 21 заменены другими аминокислотами, причем указанный рекомбинантный связывающий белок содержит два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, и причем каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 21 и/или (ii) аминокислотных последовательностей, в которых вплоть до 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот согласно SEQ ID NO: 21 заменены другими аминокислотами, причем указанный рекомбинантный связывающий белок содержит два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, и причем каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 21. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 21. Предпочтительным является рекомбинантный связывающий белок, содержащий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 21. Предпочтительной является SEQ ID NO: 21. Предпочтительным является рекомбинантный связывающий белок, причем аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 21. Предпочтительным является белок, в котором аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 21. Предпочтительным является рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21. Предпочтительным является рекомбинантный связывающий белок, состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 21.

Множество признаков делает белок, кодируемый SEQ ID NO: 21, предпочтительным рекомбинантным связывающим белком согласно настоящему изобретению. Он содержит два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 и два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, причем каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина состоит из SEQ ID NO: 14. Два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 связываются с HER2 на двух различных эпитопах. Это первый рекомбинантный связывающий белок, объединяющий связывание с сывороточным альбумином и бипаратопное связывание с HER2. Сконструированный домен с анкириновыми повторами согласно SEQ ID NO: 14 показывает улучшенные свойства в отношении стабильности при хранении (см. пример 2 и 3; фигуру 2) по сравнению с известными сконструированными доменами с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. Указанные два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина неожиданно приводят к улучшенным фармакокинетическим свойствам рекомбинантного связывающего белка по сравнению с соответствующим рекомбинантным связывающим белком, характеризующимся наличием только одного сконструированного домена анкиринового повтора со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина (пример 11, фигуры 5). Когда два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина фланкируют другие сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, наблюдают лучшие фармакокинетические свойства (пример 11). Выбор сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, а также их структурного расположения приводит в результате к максимальной активности соединения (примеры 5, 6 и 7). Сконструированные домены с анкириновыми повторами соединены с использованием обогащенного РТ линкера, что неожиданно приводит к улучшенным фармакокинетическим свойствам (примеры 10 и 11). Молекулы объединяют функциональность по меньшей мере двух лекарственных средств (например, трастузумаба и пертузумаба) в одной молекуле, и дополнительно могут индуцировать апоптоз в экспрессирующих HER2 клетках (пример 6, фигура 7).

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, проявляет улучшенную стабильность при хранении по сравнению с соответствующим рекомбинантным связывающим белком, состоящим из SEQ ID NO: 22. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, проявляет сниженные количества продуктов разложения после хранения при 40°С в течение 1 месяца в концентрации 10 мг/мл в PBS по сравнению с соответствующим рекомбинантным связывающим белком, состоящим из SEQ ID NO: 22.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, проявляет улучшенные фармакокинетические свойства по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, состоящим из SEQ ID NO: 21, в котором С-концевой сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина был удален. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, проявляет улучшенные фармакокинетические свойства по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, состоящим из аминокислот 1-422 согласно SEQ ID NO: 21. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, проявляет улучшенные фармакокинетические свойства по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, состоящим из SEQ ID NO: 33.

Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина связывает сывороточный альбумин мыши, крысы, собаки, яванского макака или человека, более предпочтительно сывороточный альбумин мыши, яванского макака или человека, более предпочтительно сывороточный альбумин яванского макака или человека, более предпочтительно сывороточный альбумин человека, в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-5 М; предпочтительно ниже 10^-6 М; или более предпочтительно ниже 10^-7 М. Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина состоит из SEQ ID NO: 14 и связывает сывороточный альбумин человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-5 М; предпочтительно ниже 10^-6 М; или более предпочтительно ниже 10^-7 М. Примеры определения константы диссоциации с использованием поверхностного плазмонного резонанса приведены в примере 5 и в международной патентной публикации WO 2014/083208.

Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 связывается с HER2 человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-6 М; предпочтительно ниже 10^-7 М; более предпочтительно ниже 10^-8 М или более предпочтительно ниже 10^-9 М. Согласно одному варианту осуществления указанный сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, состоящий из SEQ ID NO: 16, связывается с HER2 человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-6 М; предпочтительно ниже 10^-7 М; более предпочтительно ниже 10^-8 М, более предпочтительно ниже 10^-9 М, более предпочтительно ниже 10^-10 М или более предпочтительно ниже 10^-11 М. Согласно одному варианту осуществления указанный сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, состоящий из SEQ ID NO: 17, связывается с HER2 человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-6 М; предпочтительно ниже 10^-7 М; более предпочтительно ниже 10^-8 М или более предпочтительно ниже 10^-9 М.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок связывается с HER2 человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-7 М; предпочтительно ниже 10^-8 М; более предпочтительно ниже 10^-9 М или более предпочтительно ниже 10^-10 М. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок со специфичностью связывания в отношении HER2, содержащий SEQ ID NO: 32, связывается с сывороточным альбумином человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-8 М; предпочтительно ниже 10^-9 М или более предпочтительно ниже 10^-10 М. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок со специфичностью связывания в отношении HER2, содержащий SEQ ID NO: 21, связывается с HER2 человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-7 М; предпочтительно ниже 10^-8 М; более предпочтительно ниже 10^-9 М или более предпочтительно ниже 10^-10 М. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок со специфичностью связывания в отношении HER2, состоящий из SEQ ID NO: 21, связывается с HER2 человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-7 М; предпочтительно ниже 10^-8 М; более предпочтительно ниже 10^-9 М или более предпочтительно ниже 10^-10 М. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок связывается с сывороточным альбумином человека с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-5 М, предпочтительно ниже 10^-6 М или более предпочтительно ниже 10^-7 М. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок со специфичностью связывания в отношении HER2, содержащий SEQ ID NO: 21, связывается с сывороточным альбумином человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-5 М; предпочтительно ниже 10^-6 М или более предпочтительно ниже 10^-7 М. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок со специфичностью связывания в отношении HER2, состоящий из SEQ ID NO: 21, связывается с сывороточным альбумином человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-5 М; предпочтительно ниже 10^-6 М или более предпочтительно ниже 10^-7 М.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок ингибирует клеточную пролиферацию экспрессирующих HER2 клеток с константой ингибирования (IC₅₀) ниже 10^-6 М; предпочтительно ниже 10^-7 М или более предпочтительно ниже 10^-8 М. Примеры таких клеток включают в себя клетки ВТ474, SKBR-3, SKOV-3, NCI-N87, ZR-75-30, НСС1419 или MDA-MB175. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок ингибирует пролиферацию клеток ВТ474 с константой ингибирования (IC₅₀) ниже 10^-6 М; предпочтительно ниже 10^-7 М или более предпочтительно ниже 10^-8 М. Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок, содержащий SEQ ID NO: 32, ингибирует пролиферацию клеток ВТ474 с константой ингибирования (IC₅₀) ниже 10^-6 М; предпочтительно ниже 10^-7 М или более предпочтительно ниже 10^-8 М. Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок, содержащий SEQ ID NO: 21, ингибирует пролиферацию клеток ВТ474 с константой ингибирования (IC₅₀) ниже 10^-6 М; предпочтительно ниже 10^-7 М или более предпочтительно ниже 10^-8 М. Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, ингибирует пролиферацию клеток ВТ474 с константой ингибирования (IC₅₀) ниже 10^-6 М; предпочтительно ниже 10^-7 М или более предпочтительно ниже 10^-8 М. Анализы ингибирования клеток хорошо известны в настоящей области техники. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, ингибирует пролиферацию клеток ВТ474 сильнее, чем рекомбинантный связывающий белок, характеризующийся наличием только одного сконструированного домена анкиринового повтора со специфичностью связывания в отношении HER2. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, ингибирует пролиферацию клеток ВТ474 без помощи антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC; хорошо известная специалисту в настоящей области техники). Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, ингибирует пролиферацию клеток ВТ474 без помощи фрагмента IgG1-Fc.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий, предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 21, индуцирует апоптоз а клетках ВТ474. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий, предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 21, индуцирует апоптоз в клетках ВТ474 со значением полумаксимальной эффективной концентрации (EC₅₀), составляющим меньше чем 100 нМ. Предпочтительно указанный рекомбинантный связывающий белок индуцирует апоптоз в клетках ВТ474 со значением EC₅₀, составляющим меньше чем 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нМ. Предпочтительно указанный рекомбинантный связывающий белок в дозе 100 нМ индуцирует апоптоз в ВТ474 в большей степени, чем 100 нМ трастузумаба, 100 нМ пертузумаба или смесь 100 нМ трастузумаба и 100 нМ пертузумаба. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий, предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 21, индуцирует апоптоз в экспрессирующих HER2 клетках.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий SEQ ID NO: 21, ингибирует путь RAS. Согласно одному варианту осуществления HER2 в ВТ474 является менее фосфорилированным при лечении с помощью указанного рекомбинантного связывающего белка, содержащего SEQ ID NO: 21, чем при лечении с помощью трастузумаба.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок способен связываться с HER2 и сывороточным альбумином человека одновременно. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок способен связываться с двумя молекулами сывороточного альбумина человека одновременно. Такое одновременное связывание можно продемонстрировать с использованием экспериментов с применением поверхностного плазмонного резонанса (пример 5) или техник эксклюзионной хроматографии в сочетании со статическим светорассеиванием (пример 14), хорошо известных специалисту в настоящей области техники.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок связывается с HER2 в бипаратопном режиме. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок связывается с HER2 на двух различных эпитопах.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему первый, второй, третий и четвертый сконструированный домен с анкириновыми повторами, причем каждый из указанных первого и второго сконструированных доменов с анкириновыми повторами характеризуется специфичностью связывания в отношении HER2, и при этом каждый из указанных третьего и четвертого сконструированных доменов с анкириновыми повторами характеризуется специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. Предпочтительно указанный рекомбинантный связывающий белок состоит из одной полипептидной цепи. Более предпочтительно указанные первый, второй, третий и четвертый сконструированный домен с анкириновыми повторами соединены с помощью полипептидных линкеров. SEQ ID NO: 21 представляет собой пример такого рекомбинантного связывающего белка.

Согласно одному варианту осуществления указанный первый сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 связывается с доменом II HER2. Согласно одному варианту осуществления указанный второй сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 связывается с доменом IV HER2. Согласно одному варианту осуществления указанный первый сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 связывается с доменом II HER2, и указанный второй сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 связывается с доменом IV HER2. Согласно одному варианту осуществления указанный первый сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит SEQ ID NO: 16. Согласно одному варианту осуществления указанный второй сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит SEQ ID NO: 17. Согласно одному варианту осуществления указанный первый сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит SEQ ID NO: 16, и указанный второй сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 содержит SEQ ID NO: 17.

Согласно одному варианту осуществления указанный первый сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, содержащий SEQ ID NO: 16, связывается с HER2 человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-6 М; предпочтительно ниже 10^-7 М; более предпочтительно ниже 10^-8 М, более предпочтительно ниже 10^-9 М, более предпочтительно ниже 10^-10 М или более предпочтительно ниже 10^-11 М. Согласно одному варианту осуществления указанный второй сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, содержащий SEQ ID NO: 17, связывается с HER2 человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-6 М; предпочтительно ниже 10^-7 М; более предпочтительно ниже 10^-8 М или более предпочтительно ниже 10^-9 М.

Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных третьего и четвертого сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина связывается с сывороточным альбумином человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-5 М, предпочтительно ниже 10^-6 М или более предпочтительно ниже 10^-7 М. Согласно одному варианту осуществления каждый из указанных третьего и четвертого сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, содержащий SEQ ID NO: 14, связывается с сывороточным альбумином человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-5 М; предпочтительно ниже 10^-6 М или более предпочтительно ниже 10^-7 М.

Термины "первый, "второй", "третий" и необязательно "четвертый", используемые во фразах "первый сконструированный домен с анкириновыми повторами", "второй сконструированный домен с анкириновыми повторами", "третий сконструированный домен с анкириновыми повторами" и "четвертый сконструированный домен с анкириновыми повторами", не указывают и не подразумевают какого-либо позиционного расположения указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами внутри рекомбинантного связывающего белка. Согласно одному варианту осуществления указанные четыре сконструированных домена с анкириновыми повторами расположены от N-конца к С-концу: третий - первый - второй - четвертый.

Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок ингибирует пролиферацию клеток ВТ474 в модели опухоли с использованием ксенотрансплантата у мышей. Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок ингибирует рост опухоли в модели рака с использованием экспрессирующего HER2 ксенотрансплантата, полученного от пациента, у мышей. Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок ингибирует рост опухоли в модели рака желудка с использованием экспрессирующего HER2 ксенотрансплантата, полученного от пациента, у мышей. Термин "экспрессирующий HER2 ксенотрансплантат, полученный от пациента" означает ксенотрансплантат полученной от пациента раковой ткани, причем в указанной ткани по меньшей мере одна клетка экспрессирует HER2 выше фонового значения.

Согласно любому варианту осуществления настоящего изобретения, относящемуся к сконструированному домену анкиринового повтора или рекомбинантному связывающему белку, содержащему аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к данной аминокислотной последовательности, неидентичные аминокислоты могут быть расположены в любом положении сконструированного домена анкиринового повтора или рекомбинантного связывающего белка.

Аналогично, согласно любому варианту осуществления настоящего изобретения, относящемуся к сконструированному домену анкиринового повтора или рекомбинантному связывающему белку, в которых вплоть до 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот заменены любой аминокислотой, замененные аминокислоты могут быть расположены в любом положении сконструированного домена анкиринового повтора. Техники для модификации, например, с помощью точечной мутации, рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению хорошо известны специалисту в настоящей области техники. Начиная с SEQ ID NO: 21, специалист в настоящей области техники знает, как и где заменить аминокислоты (например, с использованием знаний, раскрытых в международной патентной публикации WO 2002/020565) для создания вариантов последовательностей согласно SEQ ID NO: 21 с высокой вероятностью неизменной функциональной активности.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок проявляет увеличение конечного периода полужизни, предпочтительно увеличение конечного периода полужизни по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% или 45%, по сравнению с соответствующим рекомбинантным связывающим белком, в котором отсутствует указанный четвертый сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок проявляет увеличение конечного периода полужизни, предпочтительно увеличение конечного периода полужизни по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% или 45% по сравнению с соответствующим рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. Примеры такого увеличения конечного периода полужизни представлены в примере 11.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий, предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 21, проявляет конечный период полужизни, составляющий приблизительно 47 часов в концентрации 1 мг/кг у яванского макака. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий, предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 21, проявляет конечный период полужизни, составляющий приблизительно 100 часов в концентрации 5 мг/кг у яванского макака. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий, предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 21, проявляет конечный период полужизни, составляющий больше чем 100 часов в концентрации 10 мг/кг у яванского макака. Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок, содержащий, предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 21, проявляет конечный период полужизни, составляющий больше чем 100 часов в концентрации 100 мг/кг у яванского макака.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность сконструированного домена анкиринового повтора или рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению, предпочтительно рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 21. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей указанный рекомбинантный связывающий белок. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21. Более того, настоящее изобретение относится к векторам, содержащим любую нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению. Нуклеиновые кислоты хорошо известны специалисту. В примерах нуклеиновые кислоты использовали для получения сконструированных доменов с анкириновыми повторами или рекомбинантных связывающих белков согласно настоящему изобретению в Е. coli.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный связывающий белок и/или сконструированный домен с анкириновыми повторами согласно настоящему изобретению, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный связывающий белок и/или сконструированный домен с анкириновыми повторами согласно настоящему изобретению, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный связывающий белок или нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный связывающий белок и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

Фармацевтически приемлемые носители и/или разбавители известны специалисту в настоящей области техники и объясняются более подробно ниже. Кроме того, предусмотрена диагностическая композиция, содержащая один или несколько упомянутых выше рекомбинантных связывающих белков и/или сконструированных доменов с анкириновыми повторами, и/или нуклеиновых кислот, в частности, рекомбинантные связывающие белки и/или нуклеиновые кислоты.

Фармацевтическая композиция содержит рекомбинантный связывающий белок, и/или сконструированный домен с анкириновыми повторами, и/или нуклеиновую кислоту, предпочтительно рекомбинантный связывающий белок и/или нуклеиновую кислоту, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или стабилизатор, например, как описано в Remington's Pharmaceutical Sciences 16-е издание, Osol, A. Ed., 1980. Подходящие носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы, известные специалисту в настоящей области техники, представляют собой водный раствор хлорида натрия, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Хэнка, нелетучие масла, этилолеат, 5% декстрозу в водном растворе хлорида натрия, вещества, которые усиливают изотоничность и химическую стабильность, буферы и консерванты. Другие подходящие носители включают в себя любой носитель, который сам по себе не вызывает выработку антител, вредных для индивидуума, получающего композицию, такой как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты и аминокислотные сополимеры. Фармацевтическая композиция также может представлять собой комбинированный состав, содержащий дополнительное активное средство, такое как противораковое средство или антиангиогенное средство, или дополнительное биологически активное соединение.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению, содержащего два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, для изготовления фармацевтической композиции, причем указанный рекомбинантный связывающий белок проявляет увеличенный конечный период полужизни, предпочтительно конечный период полужизни, увеличенный по меньшей мере на 5%, предпочтительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% или 250% по сравнению с соответствующим рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина.

Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один рекомбинантный связывающий белок, как описано в настоящем документе, и такой детергент, как неионный детергент, такой буфер, как фосфат, и такой сахар, как сахароза. Согласно одному варианту осуществления такая композиция содержит рекомбинантные связывающие белки, как описано выше, и PBS.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции или рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению для лечения заболевания. С этой целью фармацевтическую композицию или рекомбинантный связывающий белок согласно настоящему изобретению вводят нуждающемуся в этом пациенту в терапевтически эффективном количестве. Введение может включать в себя местное введение, пероральное введение и парентеральное введение. Типичный путь введения представляет собой парентеральное введение. При парентеральном введении фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению будут составлять в единичной лекарственной инъекционной форме, такой как раствор, суспензия или эмульсия, совместно с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, как определено выше. Дозировка и способ введения будут зависеть от индивидуума, подлежащего лечению, и конкретного заболевания.

Кроме того, любая из вышеупомянутой фармацевтической композиции или рекомбинантного связывающего белка предусмотрен(а) для лечения нарушения.

Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок или такую другую фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, применяют внутривенно. Для парентерального применения рекомбинантный связывающий белок или указанную фармацевтическую композицию можно вводить с помощью инъекции в виде болюсной инъекции или с помощью медленной инфузии в терапевтически эффективном количестве.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения медицинского состояния, причем способ предусматривает стадию введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения медицинского состояния, причем способ предусматривает стадию введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. В примере 7 (фигура 4) проиллюстрирована применимость применения рекомбинантного связывающего белка, содержащего SEQ ID NO: 21, для лечения рака. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для лечения заболевания. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для применения в лечении заболевания. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для применения в лечении медицинского состояния.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из SEQ ID NO: 21, для применения в качестве лекарственного средства. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, состоящему из SEQ ID NO: 21, для применения в лечении заболевания. Согласно одному варианту осуществления указанная фармацевтическая композиция, рекомбинантный связывающий белок или молекула нуклеиновой кислоты предусмотрены для применения в лечении заболевания. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к лекарственному средству, содержащему указанную фармацевтическую композицию, рекомбинантный связывающий белок или молекулу нуклеиновой кислоты. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению рекомбинантного связывающего белка, состоящего из SEQ ID NO: 21, в фармацевтической композиции для лечения заболевания. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к указанной фармацевтической композиции для применения в лечении заболевания. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к указанному рекомбинантному связывающему белку для применения в лечении заболевания. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к указанной нуклеиновой кислоте для применения в лечении заболевания. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению указанной фармацевтической композиции, рекомбинантного связывающего белка или молекулы нуклеиновой кислоты в качестве лекарственного средства для лечения заболевания. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению указанной фармацевтической композиции, рекомбинантного связывающего белка или молекулы нуклеиновой кислоты для лечения заболевания. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению указанной фармацевтической композиции, рекомбинантного связывающего белка или молекулы нуклеиновой кислоты для изготовления лекарственного средства. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению указанной фармацевтической композиции, рекомбинантного связывающего белка или молекулы нуклеиновой кислоты для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция, рекомбинантный связывающий белок или молекула нуклеиновой кислоты представляют собой активный ингредиент лекарственного средства. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания с использованием указанной фармацевтической композиции, рекомбинантного связывающего белка или молекулы нуклеиновой кислоты.

Термин "медицинское состояние" (или нарушение или заболевание) включает в себя аутоиммунные нарушения, воспалительные нарушения, ретинопатии (особенно пролиферативные ретинопатии), нейродегенеративные нарушения, инфекции, метаболические заболевания и неопластические заболевания. Любой из рекомбинантных связывающих белков, описанных в настоящем документе, можно использовать для получения лекарственного средства для лечения такого нарушения, в частности нарушения, выбранного из группы, содержащей следующее: аутоиммунное нарушение, воспалительное нарушение, ретинопатия и неопластическое заболевание. "Медицинское состояние" может представлять собой состояние, которое характеризуется неадекватной клеточной пролиферацией. Медицинское состояние может представлять собой гиперпролиферативное состояние. В частности, настоящее изобретение относится к способу лечения медицинского состояния, причем способ предусматривает стадию введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества рекомбинантного связывающего белка или указанной фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанное медицинское состояние представляет собой неопластическое заболевание. Используемый в настоящем документе термин "неопластическое заболевание" относится к патологическому состоянию или состоянию клеток или ткани, характеризующемуся ростом быстро пролиферирующих клеток или новообразованием. Согласно одному варианту осуществления указанное медицинское состояние представляет собой злокачественное неопластическое заболевание. Согласно одному варианту осуществления указанное медицинское состояние относится к раку. Согласно одному варианту осуществления указанное медицинское состояние относится к следующему: рак с экспрессией HER2, рак с аддикцией к HER2, рак с частичной аддикцией к HER2, рак с избыточной экспрессией HER2, рак с амплификацией HER2, резистентный к трастузумабу рак, чувствительный к трастузумабу рак. Согласно одному варианту осуществления указанное медицинское состояние относится к раку молочной железы, и/или раку желудочно-кишечного тракта, и/или раку головного мозга. Согласно одному варианту осуществления указанное медицинское состояние относится к раку молочной железы, раку яичника, раку желудка, раку желудка, раку матки, раку толстой и прямой кишки, раку мочевого пузыря и/или раку с избыточной экспрессией HER2. Термин "рак головного мозга" может относиться к метастазу в головной мозг рака с избыточной экспрессией HER2, метастазу в головной мозг рака с амплификацией HER2, раку головного мозга с избыточной экспрессией HER2 или раку головного мозга с амплификацией HER2. Термин "рак желудочно-кишечного тракта" может относиться к раку желудка, раку пищевода, раку толстой и прямой кишки, раку желез желчных протоков, раку мочевого пузыря или аденокарциноме поджелудочной железы. Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество, которое является достаточным для оказания требуемого эффекта на пациента. Согласно одному варианту осуществления указанное медицинское состояние относится к раку, причем клетки указанного рака проявляют уровни экспрессии HER2 выше фонового значения, как определено с помощью ИГХ. Согласно одному варианту осуществления указанное медицинское состояние относится к раку, причем клетки указанного рака проявляют уровни экспрессии HER2 выше уровней экспрессии HER2 здоровых клеток в их окружении, как определено с помощью ИГХ. Такие уровни экспрессии HER2 выше фонового значения хорошо известны специалисту в настоящей области техники, например, из анализов, таких как HercepTest® (Dako). Предпочтительно уровни экспрессии HER2 выше фонового значения относятся к показателю по шкале HercepTest®, составляющему 1+, 2+ или 3+, более предпочтительно 2+ или 3+. Избыточная экспрессия HER2 хорошо известна специалисту в настоящей области техники ( et al., 2012. Modern Pathology 25, 637-650; Wolff et al., 2013. J. Clin. Oncol. 31 (31), 3997-4014).

В частности, настоящее изобретение относится к лечению медицинского состояния с использованием фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, причем указанное медицинское состояние представляет собой рак.

Применение рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению или указанных фармацевтических композиций для лечения раковых заболеваний также можно проводить в комбинации с одной или несколькими другими видами терапии, известными в настоящей области техники. Используемый в настоящем документе термин "применение в комбинации с" должен относиться к совместному введению, которое проводят согласно данной схеме. Это включает в себя синхронное введение различных соединений, а также введение различных соединений со сдвигом во времени (например, соединение А вводят один раз и соединение В вводят несколько раз после этого, или наоборот, или оба соединения вводят синхронно и одно из двух также вводят на более поздних этапах). Примеры соединений, которые можно, например, вводить совместно, содержат следующее: таксаны, антрациклины, химиотерапевтические препараты на основе платины, ингибиторы 5-FU, PI3K (такие как, например, апитолисиб, таселисиб или алпелисиб), ингибиторы MEK (такие как, например, траметиниб или кобиметиниб), ингибиторы RAS (такие как, например, салиразиб), ингибиторы RAF, ингибиторы mTOR (включая, например, апитолисиб и эверолимус), ингибиторы любых форм EGFR, ингибиторы микротрубочек (включая в себя эрибулин), виды таргетной терапии, включая в себя ингибиторы киназы клеточного цикла (такие как, например, палбоциклиб), ингибиторы HER2, трастузумаб, трастузумаб-DM1, пертузумаб, цетуксимаб, панитумумаб, нимотузумаб, бевацизумаб, ранибизумаб, МР0250, ипилимумаб, пембролизумаб, ниволумаб, урелумаб, утолимумаб или атезолизумаб. Предпочтительно эти соединения используют в рекомендуемых дозах. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий SEQ ID NO: 21, потенцирует действие ингибиторов PI3K, ингибиторов mTOR, эрибулина, трастузумаба или лапатиниба. Согласно одному варианту осуществления указанный рекомбинантный связывающий белок, содержащий SEQ ID NO: 21, позволят использовать более низкие дозы ингибиторов PI3K, ингибиторов mTOR, эрибулина, трастузумаба или лапатиниба для лечения заболевания. Примеры таких комбинаций представлены в примере 17.

Согласно дополнительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства, которое используют для лечения медицинского состояния, предпочтительно неопластического заболевания, более предпочтительно рака.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства, которое используют для лечения медицинского состояния, которое может представлять собой неопластическое заболевание, в частности рак.

Составы, подлежащие использованию для in vivo введения, должны являться асептическими или стерильными. Это легко осуществить с помощью фильтрования через стерильные фильтрующие мембраны.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему любой из вышеупомянутых доменов с повторами.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему указанный рекомбинантный связывающий белок. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный рекомбинантный связывающий белок. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему указанную фармацевтическую композицию. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему указанный рекомбинантный связывающий белок, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный рекомбинантный связывающий белок, и/или указанную фармацевтическую композицию. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему рекомбинантный связывающий белок, содержащий, предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 21, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный связывающий белок, содержащий, предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 21, и/или фармацевтическую композицию, содержащую рекомбинантный связывающий белок, содержащий, предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 21, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный связывающий белок, содержащий, предпочтительно состоящий из SEQ ID NO: 21.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного связывающего белка, содержащего, предпочтительно состоящего из SEQ ID NO: 21, причем способ предусматривает стадии, на которых (i) экспрессируют указанный рекомбинантный связывающий белок в бактериях, и (ii) очищают указанный рекомбинантный связывающий белок с использованием хроматографии. Указанный способ может предусматривать дополнительные стадии. Такой способ получения рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению представлен в примере 1.

Настоящее изобретение не ограничено конкретными вариантами осуществления, описанными в примерах. Другие источники можно использовать и обрабатывать, следуя общим принципам, описанным ниже.

Ряд документов процитирован в настоящем описании изобретения. Раскрытие содержания этих документов включено в настоящий документ посредством ссылки.

Настоящее описание изобретения относится к ряду аминокислотных последовательностей из перечня аминокислотных последовательностей согласно настоящему описанию изобретения с названием "P015_Sequence_Listing.txt", и аминокислотные последовательности из протокола последовательностей включены в настоящий документ посредством ссылки.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В контексте настоящего изобретения термин "белок" относится к полипептиду, причем по меньшей мере часть полипептида имеет или способна приобретать определенное трехмерное расположение путем образования вторичных, третичных или четвертичных структур в пределах одной полипептидной цепи и/или между несколькими полипептидными цепями. Если белок содержит две или более полипептидные цепи, отдельные полипептидные цепи могут быть связаны нековалентно или ковалентно, например, дисульфидной связью между двумя полипептидами. Часть белка, которая индивидуально имеет или способна приобретать определенное трехмерное расположение путем образования вторичной или третичной структуры, называется "белковым доменом". Такие белковые домены хорошо известны специалисту в настоящей области техники.

Термин "рекомбинантный", используемый в рекомбинантном белке, домене рекомбинантного белка, рекомбинантном связывающем белке и т.п., означает, что указанные полипептиды получают с использованием технологий рекомбинантной ДНК, хорошо известных специалисту в настоящей области техники. Например, молекулу рекомбинантной ДНК (например, полученную за счет синтеза генов), кодирующую полипептид, можно клонировать в бактериальную экспрессионную плазмиду (например, pQE30, QIAgen), дрожжевую экспрессионную плазмиду, экспрессионную плазмиду млекопитающих или экспрессионную плазмиду растений или ДНК, обеспечивающую возможность экспрессии in vitro. Если, например, такую рекомбинантную бактериальную экспрессионную плазмиду вставить в соответствующие бактерии (например, Escherichia coli), эти бактерии могут продуцировать полипептид, кодируемый этой рекомбинантной ДНК. Соответственно продуцируемый полипептид называется рекомбинантным полипептидом или рекомбинантным белком.

В контексте настоящего изобретения термин "связывающий белок" относится к белку, содержащему два или больше, предпочтительно три или больше, более предпочтительно четыре или больше связывающих доменов. Предпочтительно указанный связывающий белок представляет собой рекомбинантный связывающий белок. Предпочтительно указанный связывающий белок содержит четыре домена с повторами. Более предпочтительно указанный связывающий белок содержит четыре сконструированных домена с анкириновыми повторами. Предпочтительно каждый из двух из указанных связывающих доменов указанного связывающего белка характеризуется целевой специфичностью в отношении сывороточного альбумина. Также предпочтительно, что каждый из двух из указанных связывающих доменов указанного связывающего белка характеризуется целевой специфичностью в отношении HER2.

Более того, любой такой связывающий белок может содержать дополнительные полипептиды (такие как, например, полипептидные метки, полипептидные линкеры, слияние с другими связывающими белковыми доменами, цитокинами, гормонами или антагонистами) или химические модификации (такие как сочетание с полиэтиленгликолем, токсинами (например, DM1 от Immunogen), малые молекулы, антибиотики и тому подобное), хорошо известные специалисту в настоящей области техники.

Термин "связывающий домен" означает белковый домен, проявляющий ту же "укладку" (т.е. вторичную, третичную и/или четвертичную структуру), что и белковый каркас, и характеризующийся предварительно определенным свойством, как определено ниже. Такой связывающий домен можно получить с помощью рациональных или, чаще всего, комбинаторных техник белковой инженерии, которые известны специалистам в настоящей области техники (Binz, Н.K., Amstutz, P., , A., 2005. Nat. Biotech. 23, 1257-1268). Например, связывающий домен, характеризующийся предварительно определенным свойством, можно получить с помощью способа, предусматривающего следующие стадии: (а) обеспечение разнообразной коллекции белковых доменов, проявляющих такую же укладку, что и белковый каркас, как определено дополнительно ниже; и (b) скрининг указанной разнообразной коллекции и/или отбор из указанной разнообразной коллекции для получения по меньшей мере одного белкового домена, обладающего указанным предварительно определенным свойством. Разнообразную коллекцию белковых доменов можно получить несколькими способами в соответствии с используемой системой скрининга и/или отбора, и это может включать в себя использование способов, хорошо известных специалисту в настоящей области техники, таких как фаговый дисплей или рибосомный дисплей. Предпочтительно указанный связывающий домен представляет собой рекомбинантный связывающий домен.

Термин "белковый каркас" означает белок с открытыми воздействию участками поверхности, в которых аминокислотные вставки, замены или делеции являются в высокой степени переносимыми. Примерами белковых каркасов, которые можно использовать для создания связывающих доменов согласно настоящему изобретению, являются антитела или их фрагменты, такие как одноцепочечные фрагменты Fv или Fab, белок А из Staphylococcus aureus, связывающий билин белок из Pieris brassicae или другие липокалины, белки с анкириновыми повторами или белки с другими повторами и человеческий фибронектин. Белковые каркасы известны специалисту в настоящей области техники (Binz et al., 2005, там же; Binz et al., 2004, там же).

Термин "мишень" относится к отдельной молекуле, такой как молекула нуклеиновой кислоты, полипептид или белок, углевод или любая другая встречающаяся в природе молекула, включая в себя любую часть такой отдельной молекулы или комплексы из двух или более таких молекул. Мишенью может являться целая клетка или образец ткани, или это может быть любое неприродное соединение. Предпочтительно мишень представляет собой встречающийся в природе или неприродный полипептид или полипептид, содержащий химические модификации, например, модифицированные с помощью природного или неприродного фосфорилирования, ацетилирования или метилирования. В конкретном применении согласно настоящему изобретению мишени представляют собой сывороточный альбумин и HER2.

Термин "предварительно определенное свойство" относится к свойству, такому как связывание с мишенью, блокирование мишени, активация мишень-опосредованной реакции, ферментативная активность и связанные с ними дополнительные свойства. В зависимости от типа требуемого свойства, специалист в настоящей области техники сможет идентифицировать формат и необходимые стадии для выполнения скрининга и/или отбора связывающего домена с требуемым свойством. Предпочтительно указанное предварительно определенное свойство представляет собой специфическое связывание с мишенью.

В контексте настоящего изобретения термин "полипептид" относится к молекуле, состоящей из цепи, состоящей из множества, т.е. двух или больше аминокислот, соединенных посредством пептидных связей. Предпочтительно полипептид состоит из более чем восьми аминокислот, соединенных посредством пептидных связей. Термин "полипептид" также включает в себя множество цепей аминокислот, соединенных вместе S-S-мостиками цистеинов. Полипептиды хорошо известны специалисту в настоящей области техники.

Термин "полипептидная метка" относится к аминокислотной последовательности, прикрепленной к полипептиду/белку, причем указанная аминокислотная последовательность является применимой для очистки, обнаружения или "нацеливания" (т.е. локализации на сайт мишени) указанного полипептид а/белка, или при этом указанная аминокислотная последовательность улучшает физико-химическое поведение полипептид а/белка, или причем указанная аминокислотная последовательность обладает эффекторной функцией. Отдельные полипептидные метки связывающего белка могут быть соединены с другими частями связывающего белка напрямую или через полипептидные линкеры. Все эти полипептидные метки хорошо известны в настоящей области техники и полностью доступны для специалиста в настоящей области техники. Примерами полипептидных меток являются небольшие полипептидные последовательности, например метки His (например, гистидиновая метка согласно SEQ ID NO: 1), myc, FLAG или Strep, или полипептиды, такие как ферменты (например, щелочная фосфатаза), которые обеспечивают возможность обнаружения указанного полипептид а/белка или полипептидов, которые можно использовать для нацеливания (таких как иммуноглобулины или их фрагменты) и/или в качестве эффекторных молекул.

Термин "полипептидный линкер" относится к аминокислотной последовательности, которая способна соединять, например, два белковых домена, полипептидную метку и белковый домен, белковый домен и небелковое соединение или полимер, такой как полиэтиленгликоль, или две метки последовательности. Такие дополнительные домены, метки, небелковые соединения или полимеры и линкеры известны специалисту в соответствующей области техники. Перечень примеров приведен в описании заявки на патент WO 2002/020565. Конкретными примерами таких линкеров являются глицин-сериновые линкеры и пролин-треониновые линкеры переменной длины. Примерами глицин-сериновых линкеров являются GS и аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 2-6, а примеры пролин-треониновых линкеров представлены в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 7-9.

Международная патентная публикация WO 2002/020565 и Forrer с соавт., 2003 (Forrer, P., Stumpp, М.Т., Binz, Н.K., , А., 2003. FEBS Letters 539, 2-6) содержат общее описание признаков белков с повторами и признаков доменов с повторами, техник и применений. Термин "белок с повторами" относится к белку, содержащему один или несколько доменов с повторами. Предпочтительно белок с повторами содержит вплоть до шести доменов с повторами. Более предпочтительно белок с повторами содержит вплоть до пяти доменов с повторами. Более предпочтительно белок с повторами содержит вплоть до четырех доменов с повторами. Более того, указанный белок с повторами может содержать дополнительные не содержащие повтор белковые домены, полипептидные метки и/или полипептидные линкеры. Домены с повторами могут представлять собой связывающие домены, как описано в настоящем документе ранее.

Термин "домен с повторами" относится к белковому домену, содержащему два или более следующих друг за другом модулей повтора в качестве структурных звеньев, причем указанные структурные звенья характеризуются одинаковой укладкой и плотно укладываются друг на друга, образуя сверхспиральную структуру, характеризующуюся наличием совместного гидрофобного ядра. Наряду со структурной гомологией такие модули повтора дополнительно характеризуются гомологией последовательностей. Предпочтительно домен с повторами дополнительно содержит N-концевой и/или С-концевой кэппирующий повтор. Для ясности, кэппирующий повтор может представлять собой модуль повтора. Такие домены с повторами, модули повтора и кэппирующие повторы, мотивы последовательностей, а также структурная гомология и гомология последовательностей хорошо известны специалисту в настоящей области техники из примеров доменов с анкириновыми повторами (международная патентная публикация WO 2002/020565), доменов с повторами, богатыми лейцином (международная патентная публикация WO 2002/020565), доменов с тетратрикопептидными повторами (Main, E.R., Xiong, Y., Соссо, M.J., D'Andrea, L., Regan, L., Structure 11(5), 497-508, 2003) и доменов с повторами armadillo (международная патентная публикация WO 2009/040338). Кроме того, специалисту в настоящей области техники хорошо известно, что такие домены с повторами отличаются от белков, содержащих повторяющиеся аминокислотные последовательности, где каждая повторяющаяся аминокислотная последовательность способна образовывать отдельный домен (например, домены FN3 фибронектина) или где повторяющиеся аминокислотные последовательности не являются структурными звеньями, т.е. указанные повторяющиеся аминокислотные последовательности не укладываются плотно друг на друга с образованием сверхспиральной структуры, характеризующейся наличием совместного гидрофобного ядра. Способы идентификации и определения модулей повторов или мотивов последовательностей повторов или идентификации семейств связанных белков, содержащих такие звенья или мотивы повторов, такие как поиск гомологии (BLAST® и т.д.), хорошо известны в области биоинформатики и хорошо известны специалисту в настоящей области техники.

Термины "сконструированные белок с повторами" и "сконструированный домен с повторами" относятся к белку с повторами или домену с повторами, соответственно, полученным в результате проведения процедуры согласно настоящему изобретению, например, как объясняется в международной патентной публикации WO 2002/020565. Термин "сконструированный" относится к тому свойству, что такие белки с повторами и домены с повторами, соответственно, являются искусственными, синтетическими и не являются природными. Сконструированные белки с повторами или сконструированные домены с повторами согласно международной патентной публикации WO 2002/020565 включают в себя сконструированные белки с анкириновыми повторами или сконструированные домены с анкириновыми повторами, соответственно. Соответственно, сконструированный белок с анкириновыми повторами в настоящем документе соответствует белку согласно настоящему изобретению, содержащему по меньшей мере один сконструированный домен с анкириновыми повторами. Кроме того, термин "не является природным" означает, что последовательность указанного связывающего белка или указанного связывающего домена не присутствует в виде значения не искусственной последовательности в базе данных последовательности, например в GenBank, EMBL-Bank или Swiss-Prot. Указанные базы данных и другие аналогичные базы данных последовательностей хорошо известны специалисту в настоящей области техники. Рекомбинантные связывающие белки или сконструированные домены с анкириновыми повторами согласно настоящему изобретению не встречаются в природе.

Термины "модуль повтора", "звено повтора", "кэппирующий повтор", "кэппирующий модуль" и дополнительные термины, относящиеся к белкам с повторами и доменам с повторами, определены в международной патентной публикации WO 2002/020565, и определения включены посредством ссылки.

Термин "характеризуется специфичность связывания в отношении мишени", "специфически связывается с мишенью", "связывается с мишенью с высокой специфичностью", "специфичен в отношении мишени" или "целевая специфичность" и тому подобное означает, что связывающий белок или связывающий домен связывается в PBS с мишенью с более низкой константой диссоциации (т.е. он связывается с более высокой аффинностью), чем он связывается с неродственным белком, таким как мальтозо-связывающий белок Е. coli (MBP). Предпочтительно константа диссоциации ("Kd") в PBS для мишени является по меньшей мере в 10²; более предпочтительно по меньшей мере в 10³; более предпочтительно по меньшей мере в 10⁴; или более предпочтительно по меньшей мере в 10⁵ раз ниже, чем соответствующая константа диссоциации для MBP. Способы определения констант диссоциации белок-белковых взаимодействий, такие как технологии на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (например, SPR-равновесный анализ) или калориметрия с изотермическим титрованием (ITC), хорошо известны специалисту в настоящей области техники. Измеренные значения Kd конкретного белок-белкового взаимодействия могут варьироваться, если их измерять в разных условиях (например, концентрация соли, рН). Таким образом, измерения значений Kd предпочтительно проводят с помощью стандартных растворов белка и стандартизированного буфера, такого как PBS.

Термин "PBS" означает водный раствор с фосфатным буфером, содержащий 137 мМ NaCl, 10 мМ фосфата и 2,7 мМ KCl и характеризующийся рН 7,4.

Термин "ингибировать клеточную пролиферацию" и тому подобное в контексте настоящего изобретения относится к способности указанного рекомбинантного связывающего белка ингибировать клеточную пролиферацию. Силу ингибирования, как правило, измеряют путем оценки концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀). Термин "ингибирование" и оценка значений IC₅₀ хорошо известны в настоящей области техники.

Термин "сывороточный альбумин мыши" относится к идентификационному номеру согласно UniProt Р07724, термин "сывороточный альбумин яванского макака" (т.е. Масаса fascicularis) относится к идентификационному номеру согласно UniProt A2V9Z4, и термин "сывороточный альбумин человека" относится к идентификационному номеру согласно UniProt Р02768.

Используемый в настоящем документе термин "HER2" относится к рецептору 2 эпидермального фактора роста человека, также известному как Neu, ErbB-2, CD340 (кластер дифференцировки 340) или р185. HER2 является представителем семейства рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR/ErbB). HER2 у человека кодируется ERBB2, известным протоонкогеном, расположенным в длинном плече человеческой хромосомы 17 (17q12). HER2 присвоен номер Р04626 согласно UniProtKB/Swiss-Prot. HER2 человека состоит из 1255 аминокислот с сигнальной последовательностью из 21 аминокислоты, внеклеточной области из 631 аминокислоты (например, эктодомена, содержащего домены с I по IV), трансмембранной области из 23 аминокислот и цитоплазматического домена из 580 аминокислот.

"Улучшенная стабильность при хранении" в контексте настоящего изобретения означает снижение количества полосы разложения, предпочтительно снижение количества продуктов разложения, как обнаружено с помощью окрашенного кумасси SDS-PAGE, происходящее после хранения при 40°С в течение 1 месяца в концентрации 10 мг/мл в PBS, по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или 50%. Способы оценки стабильности при хранении с помощью SDS-PAGE хорошо известны специалисту в настоящей области техники. Примеры сконструированных доменов с анкириновыми повторами и рекомбинантных связывающих белков с улучшенными свойствами стабильности при хранении приведены в примерах 2 и 3.

Выражение "рекомбинантный связывающий белок, содержащий только один сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина" означает рекомбинантное связывание, которое характеризуется составом рекомбинантного связывающего белка согласно настоящему изобретению, в котором число сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина сокращено до одного путем удаления всех сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, кроме одного, и соответствующих полипептидных линкеров.

Термин "бипаратопный связывающий белок" означает связывающий белок, направленный против двух различных эпитопов, расположенных на одном и том же целевом белке. Например, бипаратопный связывающий белок, нацеленный на HER2, содержит по меньшей мере первый связывающий домен, нацеленный на первый эпитоп на HER2, и второй связывающий домен, нацеленный на другой второй эпитоп на HER2. Белок, состоящий из SEQ ID NO: 32, представляет собой бипаратопный связывающий белок, содержащий два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, нацеленных на различные эпитопы на HER2. Рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, содержит SEQ ID NO: 32.

Выражение "проявляет улучшенные фармакокинетические свойства", "улучшенные фармакокинетические свойства" или "улучшение фармакокинетических свойств" согласно настоящему изобретению означает, что фармакокинетический параметр рекомбинантного связывающего белка улучшается по сравнению с соответствующим фармакокинетическим параметром белка, с которым его сравнивают. Соответствующие примеры показаны в примерах 8, 9, 10 и 11 (см. фигуры 5 и 6). Предпочтительно улучшенное фармакокинетическое свойство представляет собой сниженный клиренс, и/или увеличенное воздействие, и/или увеличенный конечный период полужизни. Более предпочтительно улучшенное фармакокинетическое свойство представляет собой увеличенный конечный период полужизни. Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок согласно настоящему изобретению, содержащий по меньшей мере два, более предпочтительно содержащий два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, проявляет увеличенный конечный период полужизни, и/или сниженный клиренс, и/или увеличенное воздействие по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250% или 250% по сравнению с соответствующим рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина. Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный связывающий белок согласно настоящему изобретению, содержащий по меньшей мере два, более предпочтительно содержащий два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, проявляет увеличенный конечный период полужизни, предпочтительно увеличенный конечный период полужизни по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250% или 250% по сравнению с соответствующим рекомбинантным связывающим белком, содержащим только один сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина.

Предпочтительно клиренс, и/или воздействие, и/или конечный период полужизни оценивают у млекопитающего, более предпочтительно мыши и/или яванского макака, более предпочтительно яванского макака. Предпочтительно при измерении клиренса, и/или воздействия, и/или конечного периода полужизни у мыши оценку проводили с учетом данных до 48 часов после инъекции. Более предпочтительно оценку конечного периода полужизни у мыши рассчитывают от 24 до 48 часов. Предпочтительно при измерении клиренса, и/или воздействия, и/или конечного периода полужизни у яванского макака оценку проводили с учетом данных до 7 дня после инъекции. Более предпочтительно оценку конечного периода полужизни у яванского макака рассчитывают от 1 дня до 5 дня. Кроме того, специалист в настоящей области техники может идентифицировать такие эффекты, как мишень-опосредованный клиренс, и учесть их при расчете конечного периода полужизни. Термин "конечный период полужизни" лекарственного средства, такого как рекомбинантный связывающий белок согласно настоящему изобретению, относится к периоду времени, необходимому для достижения половины концентрации лекарственного средства в плазме, применяемого к млекопитающему, после достижения псевдоравновесия (например, рассчитанного от 24 часов до 48 часов у мыши или рассчитанного с 1 дня по 5 день у яванского макака). Конечный период полужизни не определяют как время, необходимое для устранения половины дозы лекарственного средства, введенного млекопитающему. Термин "конечный период полужизни" хорошо известен специалисту в настоящей области техники. Предпочтительно фармакокинетическое сравнение проводят в любой дозе, более предпочтительно в эквивалентной дозе (т.е. такой же дозе в мг/кг) или эквимолярной дозе (т.е. такой же дозе в моль/кг), более предпочтительно эквимолярной дозе (т.е. такой же дозе в моль/кг). Специалисту в настоящей области техники понятно, что введение эквивалентных и/или эквимолярных доз у животных подвержено экспериментальным изменениям дозы по меньшей мере на 20%, более предпочтительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. Предпочтительно доза, используемая для фармакокинетического измерения, выбрана от 0,001 до 1000 мг/кг, более предпочтительно от 0,01 до 100 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 до 50 мг/кг, более предпочтительно от 0,5 до 10 мг/кг.

ПРИМЕРЫ

Общие материалы и методы. Все стандартные материалы и реагенты, раскрытые в настоящем документе, известны специалистам в настоящей области техники и являются коммерчески доступными или могут быть получены с использованием хорошо известных техник. Клеточные линии были приобретены у LGC/ATCC (Франция/США). Среды для культивирования клеток были от Invitrogen/Lubio (Швейцария). Если не указано иное, способы выполняют в соответствии с описанными установленными протоколами (например, Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis Т., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York), хорошо известными специалисту в настоящей области техники. Некоторые использованные способы ранее были описаны в международных патентных публикациях WO 2012/069654 и WO 2014/083208.

Сконструированные домены с анкириновыми повторами: Способы получения сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина описаны в международной патентной публикации WO 2012/069654. Способы получения сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 и примеры таких сконструированных доменов с анкириновыми повторами и способы получения бипаратопных связывающих белков описаны в международной патентной публикации WO 2014/083208. Сконструированные домены с анкириновыми повторами в целом подробно описаны в международной патентной публикации WO 2002/020565.

Пример 1: Рекомбинантная ДНК, экспрессия белка и очистка белка

ДНК, кодирующую сконструированные домены с анкириновыми повторами или рекомбинантные связывающие белки, получали с помощью генетических способов, хорошо известных специалисту в настоящей области техники. Рекомбинантные связывающие белки, выбранные из группы аминокислотных последовательностей согласно SEQ ID NO: 21-33, необязательно дополнительно содержащие SEQ ID NO: 1 на N-конце, или сконструированные домены с анкириновыми повторами, выбранные из группы аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 10-20, необязательно дополнительно содержащие SEQ ID NO: 1 на N-конце, экспрессировали в цитоплазме Escherichia coli с использованием стандартных техник с использованием, например, системы экспрессии pQE от Qiagen (Германия). В случае, когда аминокислоты GS находились на N-конце, остаток Met, дополнительно кодируемый экспрессионным вектором, успешно отщеплялся в цитоплазме Е. coli от экспрессированного полипептида, поскольку за начальным Met следует небольшой остаток Gly (т.е. аминокислота в положении 1, например, SEQ ID NO: 21). Клетки лизировали с использованием пресса Френча и белки очищали почти до гомогенности от сырого клеточного экстракта с использованием стандартных хроматографических техник, хорошо известных специалисту в настоящей области техники.

В следующем перечне определены белки, используемые в настоящем изобретении:

Белок #10-His: SEQ ID NO: 10 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #11-His: SEQ ID NO: 11 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #12-His: SEQ ID NO: 12 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #13-His: SEQ ID NO: 13 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #14-His: SEQ ID NO: 14 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #15-His: SEQ ID NO: 15 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #16-His: SEQ ID NO: 16 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #17-His: SEQ ID NO: 17 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #18-His: SEQ ID NO: 18 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #19-His: SEQ ID NO: 19 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #20-His: SEQ ID NO: 20 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #21: SEQ ID NO: 21

Белок #21-His: SEQ ID NO: 21 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #22: SEQ ID NO: 22

Белок #22-His: SEQ ID NO: 22 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #23: SEQ ID NO: 23

Белок #23-His: SEQ ID NO: 23 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #24: SEQ ID NO: 24

Белок #24-His: SEQ ID NO: 24 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #25: SEQ ID NO: 25

Белок #25-His: SEQ ID NO: 25 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #26: SEQ ID NO: 26

Белок #26-His: SEQ ID NO: 26 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #27: SEQ ID NO: 27

Белок #27-His: SEQ ID NO: 27 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #28: SEQ ID NO: 28

Белок #28-His: SEQ ID NO: 28 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #29: SEQ ID NO: 29

Белок #29-His: SEQ ID NO: 29 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #30: SEQ ID NO: 30

Белок #30-His: SEQ ID NO: 30 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #31-His: SEQ ID NO: 31 (включает в себя гистидиновую метку на своем N-конце)

Белок #32: SEQ ID NO: 32

Белок #32-His: SEQ ID NO: 32 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Белок #33: SEQ ID NO: 33

Белок #33-His: SEQ ID NO: 33 с гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 1), слитой с ее N-концом

Пример 2. Создание характеризующегося улучшенной стабильностью сконструированного домена анкиринового повтора со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина (SEQ ID NO: 14).

В отличие от общепринятых знаний об анкириновых повторах, авторы настоящего изобретения обнаружили, что белок #12-His, белок #13-His и белок #15-His (международная патентная публикация WO 2012/069654; см. пример 1) разлагаются при длительной инкубации в PBS в концентрации 10 мг/кг при 40°С, и, таким образом, не являются идеальными для использования в качестве компонентов в лекарственных средствах -кандидатах. Анализ аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 13 выявляет большое количество потенциальных сайтов разложения. Разложение может, например, происходить вблизи любого из 5 остатков аспарагина (включая в себя аспарагин-глициновые дипептиды), 13 остатков аспартата или 10 остатков глицина согласно SEQ ID NO: 13, в числе дополнительных потенциальных сайтов разложения. SEQ ID NO: 13 дополнительно содержит ряд потенциальных сайтов окисления. Таким образом, необходимо проанализировать большое количество мутантов и комбинированных мутантов, чтобы выделить вариант, который проявляет улучшенные свойства стабильности при хранении. Неожиданно авторы настоящего изобретения смогли создать функциональный вариант, который оказывает существенное влияние на стабильность при хранении, мутируя только положение 80 согласно SEQ ID NO: 13. При мутации аспартата в положении 80 согласно SEQ ID NO: 13 на глутамат создали функциональный сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, соответствующий SEQ ID NO: 14, который демонстрирует заметное улучшение стабильности при хранении (пример 3; фигура 2). Белок #14-His, как и белок #13-His, показал низкую наномолярную аффинность (константа диссоциации (Kd) ниже 100 нМ) по отношению к сывороточному альбумину человека, мыши и яванского макака при рН 7,4 в PBS (измерение поверхностного плазмонного резонанса ProteOn в соответствии с производителем (BioRad)). Неожиданно белок #14-His дополнительно проявил улучшенную среднюю точку термической денатурации по сравнению с белком #13-His, что было определено с помощью термического разворачивания с использованием хорошо известных техник (Niesen, F.H., Berglund, Н., Vedadi, M., Nature Protocols 2, 2212-2221, 2007; белок #13-His: Tm=86°C; белок #14-His, Tm=89,5°C; pH 6,0).

Пример 3. Улучшение стабильности белка при хранении при использовании SEQ ID NO: 14.

Белок #13-His, белок #14-His и белок #15-His получали, как описано в примере 1, и образцы концентрировали до 10 мг/мл в PBS. Белок #14-His и белок #15-His затем хранили в течение 1 месяца при -80°С или при 40°С в стеклянных флаконах с последующим анализом на SDS 15% PAGE. Наряду с тем, что белок #14-His и белок #15-His показали эквивалентную стабильность при хранении при -80°С, белок #14-His показал значимо сниженные количества продуктов разложения со снижением на >50% по сравнению с белком #15-His на SDS 15% PAGE после хранения в течение 1 месяца при 40°С. Аналогично, при хранении при 4°С, 25°С, 40°С и 60°С в течение одной недели в концентрации 10 мг/мл в PBS белок #14-His показал значимо сниженные количества продуктов разложения по сравнению с белком #13-His. В частности, белок #14-His показал снижение продуктов разложения на >50% по сравнению с белком #13-His на SDS 15% PAGE как при хранении при 40°С, так и или 60°С, соответственно (фигура 2). Указанные данные иллюстрируют, что белок #14-His характеризуется улучшенной стабильностью при хранении по сравнению с белками #13-His и белком #15-His. Аналогично, при сравнении стабильности при хранении белка #12-His, белка #13-His, белка #14-His и белка #15-His (см. пример 1) путем инкубации белков в концентрации 10 мг/мл в PBS в стеклянных флаконах в течение 1 месяца при 40°С белок #12-His, белок #13-His и белок #14-His проявляют снижение продуктов разложения на >30% по сравнению с белком #15-His.

Улучшение стабильности при хранении также наблюдают при исследовании стабильности при хранении белка #21 и белка #22 (рекомбинантные связывающие белки, состоящие из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 21 и 22, соответственно). Белок #21 и белок #22 получают, как описано в примере 1, образцы концентрируют до 10 мг/мл в PBS и хранят в течение 1 месяца при -80°С в или при 40°С в стеклянных флаконах с последующим анализом с помощью стандартной эксклюзионной хроматографии. Наряду с тем что белок #21 и белок #22 показывает эквивалентные профили элюирования при хранении при -80°С, белок #21 показывает значимо более мономерные формы по сравнению с белком #22 при хранении при 40°С. Это указывает на то, что наличие SEQ ID NO: 21 в рекомбинантном связывающем белке является более благоприятным с точки зрения стабильности при хранении, чем наличие SEQ ID NO: 22. Аналогично, белок #21 проявляет более низкие количества продуктов разложения, чем белок #22 при анализе с помощью SDS-PAGE после хранения в течение 1 месяца при 40°С в стеклянных флаконах в PBS в концентрации 10 мг/мл, что подтверждает более высокую стабильность при хранении рекомбинантного связывающего белка, содержащего SEQ ID NO: 21, по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим SEQ ID NO: 22. В свою очередь, это указывает на то, что наличие сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, состоящих из SEQ ID NO: 14, в рекомбинантном связывающем белке является более благоприятным с точки зрения стабильности при хранении, чем наличие в нем сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, состоящих из SEQ ID NO: 13.

Пример 4: Создание лекарственного средства - кандидата

Примеры сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 были раскрыты ранее (международные патентные публикации WO 2014/083208; WO 2014/060365; Steiner, D., Forrer, Р. и , A., J. Mol. Biol. 382, 1211-1227, 2008; Zahnd, C, Pecorari, F., Straumann, N., Wyler, E. and , A., J. Biol. Chem. 281(46), 35167-35175, 2006). В международных патентных публикациях WO 2014/083208 и WO 2014/060365 сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, связывающиеся с различными доменами, объединяли с получением бипаратопным связывающих белков, которые показывают усиленное ингибирование роста опухолевых клеток.

Рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, представляет собой лекарственное средство-кандидат, содержащий два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 (SEQ ID NO: 16 и 17, соответственно), а также два фланкирующих сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина (каждый SEQ ID NO: 14), соединенные с помощью полипептидных линкеров (каждый SEQ ID NO: 9) (см. фигуру 1). Этот рекомбинантный связывающий белок был идентифицирован с помощью сложной процедуры, включая в себя, среди прочего, стадии инженерии белка и оптимизации. На первой стадии сотни комбинаций сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 создавали в виде бипаратопных связывающих белков путем клонирования, экспрессии и очистки (см. пример 1). Бипаратопные связывающие белки затем подвергали скринингу в отношении аффинности по отношению к HER2, а также в отношении клеточной активности и ингибирования клеточной пролиферации, как описано в международной патентной публикации WO 2014/083208 и как описано ниже. Репрезентативные результаты бипаратопных связывающих белков, полученных в результате этих действий, представлены в примерах 5 и 6. Важно, что молекула должна являться бипаратопной, поскольку наличие только одного сконструированного домена анкиринового повтора со специфичностью связывания в отношении HER2 дает в результате молекулы без активности клеточного ингибирования. Рекомбинантные связывающие белки подвергали дополнительной инженерии. Эта стадия включала в себя (среди прочего) фармакокинетическую инженерию путем добавления сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина в различных форматах (т.е. добавление различных количеств сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина в различных положениях в молекуле) к бипаратопным связывающим белкам, и путем испытания различных полипептидных линкеров. Указанные белки испытывали в отношении in vivo эффективности (репрезентативный пример 7), фармакокинетики у мыши (репрезентативный пример 8) и фармакокинетики у яванского макака (репрезентативный пример 9), а также в отношении клеточной активности. Оптимизация полипептидного линкера включала в себя испытание эффекта линкера на фармакокинетический профиль (репрезентативный пример 10). Оптимизацию попытки фармакокинетической инженерии оценивали с помощью фармакокинетических измерений (репрезентативный пример 11) и измерений активность (репрезентативный пример 12). Более того, разнообразные кандидатные лекарственные средства испытывали в отношении их уровней рекомбинантной экспрессии в Е. coli (пример 13). Рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, представляет собой белок, являющийся результатом этих усилий. Он представляет собой лекарственное средство - кандидат для применения у человека.

Белок #31, рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 31, соответствует белку, состоящему из белка #21 и аминокислот согласно SEQ ID NO: 1 на N-конце.

Пример 5: Высокоаффинное связывание HER2 рекомбинантным связывающим белком, содержащим SEQ ID NO: 21.

Белок #21-His экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Его аффинность к HER2 оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса, как описано в международной патентной публикации WO 2014/083208. Константу диссоциации, составляющую 27 пМ, определяли с помощью глобального подбора значений резонансных единиц, полученных для разных концентраций, способа, хорошо известного специалисту в настоящей области техники. Для сравнения, белок #23-His (см. пример 1), содержащий другую комбинацию сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, проявлял константу диссоциации, составляющую 64 пМ. Аналогично, комбинация сконструированных доменов с анкириновыми повторами, соответствующих SEQ ID NO: 16 и 17, проявляла лучшую константу диссоциации, чем большинство комбинаций, созданных на основе сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, известных из международной патентной публикации WO 2014/083208.

Измерения поверхностного плазмонного резонанса дополнительно показали, что рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21, не взаимодействует с внеклеточными доменами HER3 или EGFR.

Измерения поверхностного плазмонного резонанса дополнительно показали, что сконструированные домены с анкириновыми повторами, состоящие из SEQ ID NO: 16 или 17 (причем каждый дополнительно содержал SEQ ID NO: 1 на N-конце), проявляют константу диссоциации, составляющую 9 пМ и 152 пМ, соответственно, в отношении связывания с HER2.

Эксперименты с применением поверхностного плазмонного резонанса дополнительно показали, что белок #21 может связываться с HER2 человека и сывороточным альбумином человека одновременно.

Эксперименты с применением поверхностного плазмонного резонанса дополнительно показали, что белок #21 в концентрации 100 нМ связывается с сывороточным альбумином человека с константой диссоциации (Kd), составляющей 21 нМ.

Пример 6: Высокая клеточная активность и индукция апоптоза рекомбинантного связывающего белка, содержащего SEQ ID NO: 21.

Белок #21-His и белок #23-His экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Эффекты рекомбинантных связывающих белков на пролиферацию клеток ВТ474 определяли путем измерения синтеза ДНК с использованием мечения BrdU (бромдезоксиуридин) (BrdU, Cell Proliferation ELISA, Roche). Вкратце, 10000 клеток BT474 высевали на каждую лунку в 96-луночный планшет в 100 мкл полной среды и инкубировали в течение 24 часов. Рекомбинантные связывающие белки или контроли добавляли на дополнительные 72 часа. BrdU для мечения клеток добавляли на последние 24 часа. Меченые (пролиферирующие) клетки обнаруживали в соответствии с протоколом производителей. Данные анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad prism, нанося на график зависимости log [с] по оси х и OD450-602 нм по оси у. Данные подбирали с использованием нелинейной регрессионной аппроксимации (кривая зависимости логарифма (антагонист) и ответа - модель переменного наклона (четыре параметра)), получая значения IC₅₀. Результаты показаны на фигуре 3. Белок #21-His ингибирует пролиферацию клеток ВТ474 с наблюдаемым значением IC₅₀, составляющим 1,5 нМ. На 60% более высокое значение IC₅₀ (т.е. более плохое), составляющее 2,4 нМ, наблюдают для белка #23-His, что указывает на то, что наличие SEQ ID NO: 16 и 17 в рекомбинантном связывающем белке является более благоприятным, чем наличие SEQ ID NO: 18 и 17. Аналогично, комбинация сконструированных доменов с анкириновыми повторами, соответствующих SEQ ID NO: 16 и 17, ингибировала клетки ВТ474 с более низким наблюдаемым значением IC₅₀, чем значение, наблюдаемое для большинства комбинаций, созданных на основе сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, известных из международной патентной публикации WO 2014/083208.

Рекомбинантный связывающий белок, состоящий из SEQ ID NO: 21 (белок #21), дополнительно проявлял сильное ингибирование пролиферации на разнообразных раковых клеточных линиях, включая в себя клеточные линии SKBR-3, SKOV-3, NCI-N87, ZR-75-30, НСС1419 или MDA-МВ175.

Индукцию апоптоза с помощью белка #21 определяли путем измерения активации каспазы 3/7 с использованием систем Caspase 3/7-Glo (Promega, Швейцария). Вкратце, 10000 клеток ВТ474 высевали на каждую лунку в 96-луночный планшет в 100 мкл полной среды и инкубировали в течение 24 часов. Белок #21 и эталоны сравнения добавляли на дополнительных 24 часа. Реагент Caspase Glo добавляли в соответствии с протоколом производителей на 1 час. Активацию каспазы 3/7 подвергали мониторингу путем измерения активности люциферазы. Альтернативно индукцию апоптоза определяли с использованием системы обнаружения клеточной смерти ELISAPLUS (Roche, Швейцария). Анализ проводили в соответствии с протоколом производителей. Количество клеток и время инкубации являлись аналогичными считыванию данных Caspase Glo. Данные анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad prism, нанося на график зависимости концентрацию на ось х и OD405/490 нм или относительный световые единицы (RLU; измеренные на считывающем устройстве Tecan М-1000) на ось у. Данные подбирали с использованием нелинейной регрессионной аппроксимации (кривая зависимости логарифма (агонист) и ответа - модель переменного наклона (четыре параметра)). Результаты показаны на фигуре 7. Для белка #21 наблюдали значение EC₅₀, составляющее 2,4 нМ. Белок #21 проявляет аналогично высокую активность в индукции апоптоза для клеточных линий SKBR-3, SKOV-3, NCI-N87, ZR-75-30, НСС1419 или MDA-МВ175. Напротив, антитела трастузумаб, пертузумаб или смесь трастузумаба и пертузумаба не индуцировала апоптоз в клетках ВТ474 (фигура 7).

Важно отметить, что указанные анализы показывают, что белок #21, в котором SEQ ID NO: 32 фланкирована SEQ ID NO: 14, проявляет высокую клеточную активность, аналогичную с ситуацией с использованием SEQ ID NO: 32 отдельно.

Пример 7: Высокая эффективность рекомбинантного связывающего белка, содержащего SEQ ID NO: 21, в ксенотрансплантатных моделях опухоли у мышей.

Белок #21-His, белок #23-His, белок #24-His, белок #25-His экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. В одном исследовании белок #21-His сравнивали с трастузумабом и PBS. Результаты показаны на фигуре 4а. Ксенотрансплантатные модели опухоли рака молочной железы ВТ474 у мышей по существу проводили следующим образом с использованием процедур, хорошо известных специалисту в настоящей области техники: клетки карциномы молочной железы человека ВТ474 культивировали, ресуспендировали и 2×10⁷ клеток в 200 мкл среды RPMI 1640, содержащей 50:50 матригель (Matrigel) (BD Biosciences) на каждую мышь вводили с помощью инъекции в правый бок самок бестимусных мышей Balb/c. При объемах опухоли, составляющих приблизительно 200-300 мм³, мышей рандомизировали в группы по 8 животных и начинали лечение опухоли с помощью в/в введения PBS, трастузумаба (10 мг/кг), трастузумаба (10 мг/кг) и пертузумаба (10 мг/кг) или белка #21-His (35 мг/кг) по 7 доз с 3-дневным интервалом (Q3Dx7). Объемы опухоли измеряли в течение 32 дней. Белок #21-His является более эффективным в ингибировании роста опухоли, чем трастузумаб.

В аналогичном исследовании с использованием клеток ВТ474 (идентичная постановка и процедура; все дозы - 35 мг/кг), белок #21-His сравнивали с белком #23-His, белком #24-His и белком #25-His. Результаты на 18-й день после лечения показаны на фигуре 4b. Важно, что белок #21-His является более эффективным в подавлении опухолей, чем белок #23-His, белок #24-His или белок #25-His.

Кроме того, белок #21 экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. PBS, белок #21 (60 мг/кг), трастузумаб (10 мг/кг), пертузумаб (10 мг/кг), а также комбинацию трастузумаба и пертузумаба (каждый в дозе 10 мг/кг) использовали в модели опухоли с использованием полученного от пациента ксенотранспланта рака желудка у мышей, хорошо известной специалисту в настоящей области техники. Всем группам вводили дозы каждые три дня 6 раз. Вкратце, фрагменты опухоли получали из ксенотрансплантатов в серийном пассаже у бестимусных мышей. После удаления из мышей-доноров опухоли разрезали на фрагменты (4-5 мм в диаметре) для подкожной имплантации. Мышей рандомизировали в группы, когда опухоли достигали объема, составляющего приблизительно 100-120 мм³. День рандомизации и начала лечения обозначали как 0 день в каждом эксперименте. Рост опухоли подвергали мониторингу с помощью двухмерного измерения с помощью штангенциркуля в день рандомизации и затем дважды в неделю. Относительные объемы отдельных опухолей (отдельные RTV) для дня х рассчитывали путем деления объема отдельной опухоли в день х (Тх) на отдельный объем той же опухоли в день 0 (Т0), умноженный на 100%. Ингибирование опухоли для конкретного дня (Т/С в %) рассчитывали из отношения медианных значений RTV в исследуемой и контрольной группах, умножая на 100%. На фигуре 4с показана эффективность белка #21 в модели GXA3039 рака желудка PDX по сравнению с трастузумабом и комбинацией трастузумаба и пертузумаба. Белок #21 проявляет сильное ингибирование роста опухоли, аналогичное комбинации трастузумаба и пертузумаба, тогда как трастузумаб отдельно является менее эффективным. На фигуре 4d показан второй эксперимент в той же модели, в котором сравнивают белок #21 с трастузумабом, пертузумабом и комбинацией трастузумаба и пертузумаба. Белок #21 проявляет сильное ингибирование роста опухоли, аналогичное комбинации трастузумаба и пертузумаба. Трастузумаб отдельно и пертузумаб отдельно значимо менее эффективны. Это указывает на то, что модель опухоли могла приобретать устойчивость к трастузумабу с течением времени. Это, в свою очередь, говорит о том, что белок #21 является эффективным даже при резистентном к трастузумабу раке.

В аналогичном эксперименте белок #21 дополнительно анализировали в модели GXA281 рака желудка PDX у мышей, хорошо известной специалисту в настоящей области техники, в сравнении со стандартной терапией - лапатинибом (фигура 4е). Вкратце, имплантацию опухоли и мониторинг роста опухоли проводили, как описано выше. Лапатиниб вводили в дозе 100 мг/кг/день в течение 21 дня ежедневно в/в и белок #21 в дозе 40 мг/кг каждые три дня 6 раз в/в.

Указанные эксперименты этого примера иллюстрируют применимость белков, содержащих SEQ ID NO: 21 для применения в качестве лекарственного средства в лечении заболевания.

Пример 8: Благоприятные фармакокинетические свойства рекомбинантного связывающего белка содержащего SEQ ID NO: 21, у мыши.

Измерения, показанные в этом примере, являются результатом попытки инженерии периода полужизни, как описано в примере 11. Белок #21-His и белок #23-His экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Фармакокинетические свойства меченных His белков оценивали у мыши, как описано в других публикациях (Zahnd, С., Kawe, М., Stumpp, М.Т., de Pasquale, С., Tamaskovic, R., Nagy-Davidescu, G., Dreier, В., Schibli, R., Binz, H.K., Waibel, R., , A., Cancer Res. 70, 1595-1605, 2010). Результаты показаны на фигуре 5. Белок #21-His проявляет конечный период полужизни, составляющий 30,4 часов с 19,5% ID (введенной с помощью инъекции дозы), оставшейся через 48 часов. Для сравнения, белок #23-His проявляет конечный период полужизни, составляющий 24,7 часов с 6,5% ID, оставшейся через 48 часов. Таким образом, наличие SEQ ID NO: 16 в рекомбинантном связывающем белке оказывается более благоприятным, чем наличие SEQ ID NO: 18.

Пример 9: Благоприятные фармакокинетические свойства рекомбинантного связывающего белка содержащего SEQ ID NO: 21, у яванского макака.

Измерения, показанные в этом примере, являются результатом попытки инженерии периода полужизни, как описано в примере 11. Белок #21-His, белок #23-His и белок #24-His экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Фармакокинетические свойства белков оценивали у яванского макака. Белки вводили яванским макакам путем внутривенной инфузии в течение 30 мин с уровнем целевой дозы, составляющим 1 мг/кг. Образцы крови собирали перед введением дозы и снова в выбранные временные точки, например 5 мин, 10 мин, 0,5 часов, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 120 часов, 144 часов, 168 часов, 192 часа, 216 часов и 240 часов после окончания инфузии (т.е. после инъекции). Образцы крови оставляли стоять при комнатной температуре и центрифугировали для получения сыворотки с последующим хранением при -80°С в ожидании анализов. Фармакокинетические параметры определяли с использованием процедур, хорошо известных специалисту в настоящей области техники. Концентрации белков в сыворотке определяли с помощью сэндвич-варианта ELISA с использованием моноклонального антитела кролика к сконструированному домену с анкириновым повтором в качестве реагента захвата и мышиного моноклонального антитела к сконструированному домену с анкириновым повтором в качестве реагента для обнаружения и с использованием стандартной кривой. Фармакокинетические параметры определяли с использованием стандартного программного обеспечения, такого как Phoenix WinNonLin (Certara, Принстон, США) или GraphPadPrism (GraphPad Software, Ла-Хойя, США), и стандартных анализов, таких как некомпартментные анализы. Результаты для белка #21-His и белка #23-His показаны на фигуре 6. Белок #21-His проявляет конечный период полужизни, составляющий 47 часов, наряду с тем, что белок #23-His проявлял конечный период полужизни, составляющий 35 часов, и белок #24-His проявлял конечный период полужизни, составляющий 45 часов. Белки также проявляют значительный мишень-опосредованный клиренс, как только концентрация падает ниже 100 нМ. Мишень-опосредованный клиренс хорошо известен специалисту в настоящей области техники и известен, например, из антител, нацеленных на HER2.

Аналогично, белок #21-His экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Фармакокинетические свойства белков оценивали у яванского макака, как описано выше в дозах 1 мг/кг, 5 мг/кг и 10 мг/кг. Фармакокинетические параметры оценивали, как описано выше, и результаты показаны на фигуре 6. Наблюдали зависимое от дозы увеличение конечного периода полужизни от 47 часов в дозе 1 мг/кг до 100 часов в дозе 5 мг/кг до больше чем 100 часов в дозе 10 мг/кг. Мишень-опосредованный клиренс наблюдают, как только концентрация падает ниже 100 нМ.

Аналогичные результаты наблюдают при исследовании белка #21 (экспрессированного и очищенного, как описано в примере 1). Фармакокинетические свойства белков оценивают у яванского макака, как описано выше в дозе 1 мг/кг, 10 мг/кг и 100 мг/кг. Фармакокинетические параметры оценивают, как описано выше. Наблюдают зависимое от дозы увеличение конечного периода полужизни. Для белка #21 конечный период полужизни, составляющий 109,5 часов или 130,6 часов, наблюдали в дозе, составляющей 100 мг/кг у яванского макака.

Пример 10: Улучшение свойств лекарственного средства за счет выбора полипептидных линкеров.

Полипептидные линкеры, которые соединяют белковые домены, хорошо известны специалисту в настоящей области техники. Богатые Gly-Ser линкеры хорошо известны из фрагментов одноцепочечных антител Fv, где они оказались наиболее подходящими для соединения двух полипептидных цепей Fv. Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что линкеры, богатые Pro-Thr, оказывают положительное влияние на фармакокинетические свойства рекомбинантного связывающего белка, содержащего два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 и два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина по сравнению с богатым Gly-Ser линкером. Белок #26-His и белок #27-His экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Фармакокинетические анализы на мышах проводили, как описано в примере 8. Белок #27-His характеризовался 7% введенной с помощью инъекции дозы, оставшейся через 48 часов после внутривенной инъекции, тогда как белок #26-His характеризовался лишь 5,3% оставшейся введенной дозы. Аналогично, белок #27-His проявлял более длительный конечный период полужизни, чем белок #26-His.

Пример 11: Инженерия фармакокинетических свойств

В настоящей области техники известно много вариантов фармакокинетической инженерии, включая в себя, среди прочего, пегилирование, удлинение полипептидов, Fc-слияние, слияние с сывороточным альбумином и связывание с сывороточным альбумином (Kontermann, R (Ed.) "Therapeutic proteins: strategies to modulate their plasma half-lives", Wiley-VCH Verlag GmbH, 2012, ISBN 978-3-527-32849-9). Начиная, например, с комбинации сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, содержащих SEQ ID NO: 16 и 17, существует сотни потенциальных вариантов лекарственного средства - кандидата (выбор техники фармакокинетической модификации, выбор полипептидного линкера (например, SEQ ID NO: 2-9 среди многих других), среди других аспектов). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что с использованием двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, состоящих из SEQ ID NO: 14 (см. примеры 2 и 3), и с использованием полипептидных линкеров, богатых Pro-Thr (SEQ ID NO: 9), получая в результате SEQ ID NO: 21, достигаются благоприятные фармакокинетические свойства, и этот формат характеризуется явными преимуществами перед другими протестированными форматами. Результаты эффекта выбора полипептидного линкера показаны, например, в примере 10. Сравнение фармакокинетических профилей белка #29-His и белка #30-His у мыши неожиданно выявило преимущество наличия двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина по сравнению с наличием только одного сконструированного белка с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина (см. фигуру 5), так как в литературе по альбуминсвязывающему домену показано, что наличие двух альбуминсвязывающих доменов, присутствующих в молекуле, не приводит в результате к какому-либо преимуществу в фармакокинетических свойствах по сравнению с наличием только одного альбуминсвязывающего домена (Норр et al., там же). Аналогично при сравнении белка #21 (рекомбинантные связывающие белки, состоящие из SEQ ID NO: 21) с вариантом белка #21, в котором С-концевой сконструированный домен с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина отсутствует (аминокислоты 1-422 согласно SEQ ID NO: 21, получая в результате белок #33), белок #21 проявляет заметно улучшенные фармакокинетические свойства, в частности более длительный конечный период полужизни. Сравнение фармакокинетического профиля у яванского макака белка #21 с пегилированным белком #28 (который содержит такие же сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 (SEQ ID NO: 16 и 17), но белок #28 содержит 40 кДа фрагмент ПЭГ вместо двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина) в дозах, составляющих 5 мг/кг, указывает на то, что белок, содержащий два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, проявляет заметно улучшенные фармакокинетические свойства. Как описано в примере 9, сравнение фармакокинетических профилей белка #21-His и белка #24-His выявило, что более благоприятным является наличие двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, фланкирующих SEQ ID NO: 16 и 17, вместо наличия их обоих на N-конце (см. фигуру 6).

Для исследований в этом примере белок #21-His, белок #24-His, белок #28-His, белок #29-His и белок #30-His получали согласно примеру 1. Белок #28-His дополнительно пегилировали с использованием 40 кДа фрагмента ПЭГ (NOF Sunbright GL2-400MA) путем присоединения с помощью малеимидного реагента фрагмента ПЭГ на свободный С-концевой остаток цистеина белка #28-His с последующей очисткой до гомогенности с использованием стандартных способов очистки, процедур, хорошо известных специалисту в настоящей области техники. Фармакокинетические анализы на мышах или яванских макаках проводили, как описано в примерах 8 и 9.

Пример 12: Рекомбинантный связывающий белок, содержащий SEQ ID NO: 21, проявляет лучшую in vivo активность по сравнению с рекомбинантным связывающим белком, содержащим SEQ ID NO: 24

Белок #21-His и белок #24-His экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Эксперименты с ксенотрансплантатом с использованием мышей проводили, как описано в примере 7. Результаты показаны на фигуре 4b. Через 32 дня лечения белок #21-His проявляет значимо лучшее подавление опухоли, чем белок #24-His. Это указывает на то, что наличие сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, фланкирующих сконструированные домены с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 (как обнаружено в SEQ ID NO: 21), является более благоприятным, чем наличие обоих сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина на N-конце сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 (как обнаружено в SEQ ID NO: 24).

Пример 13: Высокий выход рекомбинантной экспрессии в Е. coli.

Последовательности, кодирующие белок #21, белок #23 и белок #25, клонировали в стандартный вектор с промотором Т7 и белки экспрессировали в Е. coli HMS 174 (DE3). Для белка #21 достигались титры, составляющие 4,4 г/л, тогда как белок #23 показал титр, составляющий 1,9 г/л, и белок #25 показал титр, составляющий 2,1 г/л, указывая на наилучшую экспрессию белка #21. Неожиданным оказалось то, что расположение сконструированных доменов с анкириновыми повторами, используемое в белке #21, таким образом, приводит к более высокой рекомбинантной экспрессии, чем, например, наблюдаемая для другого расположения, используемого в белке #25, несмотря на одинаковые используемые компоненты (сконструированные домены с анкириновыми повторами и полипептидные линкеры). Интересно, что комбинация сконструированных доменов с анкириновыми повторами, соответствующих SEQ ID NO: 16 и 17, проявляла лучшую экспрессию рекомбинантного белка, чем большинство комбинаций, созданных на основе сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2, известных из международной патентной публикации WO 2014/083208.

Пример 14: Одновременное связывание двух молекул сывороточного альбумина белком #21.

Белок #21 экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Эксклюзионную хроматографию в сочетании со статическим светорассеиванием (Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare), Agilent 1200 (Life Technologies), Wyatt Optilab Trex (RI) и MiniDawnTreos (MALS)) проводили с использованием 30 мкМ белка #21, 60 мкМ сывороточного альбумина человека (20% раствор CSL Behring использовали для очистки мономерной фракции сывороточного альбумина человека с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке Superdex 200 26/60 (GE Healthcare)) или смеси 1:2 того и другого в PBS.

Белок #21 элюировал как мономерный пик, и молекулярную массу, составляющую 65,2 кДа, определяли с помощью MALS (многоугловое рассеяние лазерного света), который находится в пределах 1,2 кДа своей теоретической молекулярной массы (66437 Да). Сывороточный альбумин элюировал как мономерный пик, составляющий 55,1 кДа (теоретическая молекулярная масса 58917 Да). 1:2 смесь (молярное отношение) двух молекул давала в результате основной пик со средней молекулярной массой, составляющей 169,8 кДа (диапазон 186,2 кДа - 136,6 кДа), содержащий молекулы с молекулярной массой, соответствующей комплексу 1:2 (теоретическая молекулярная масса: 191,8 кДа), а также комплексу 1:1 (132,8 кДа). Кроме того, обнаруживали небольшой пик свободного сывороточного альбумина, соответствующий 6,5% сывороточного альбумина, используемого в эксперименте. Не обнаружили пик, содержащий молекулярную массу, соответствующую свободному белку #21. Эти результаты указывают на то, что белок #21 может связываться с двумя молекулами сывороточного альбумина одновременно.

Пример 15: Высокая термическая стабильность белка #21.

Белок #21 экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Термическую стабильность оценивали с использованием кругового дихроизма с использованием спектрометра Jasco J-815 CD в атмосфере азота (3 л/мин). Измеряли белок #21 в концентрации 0,4 мкМ в PBS в кюветах 117.100F-QS (Hellma, d=1 см) с использованием датчиков контроля температуры в растворе, нагревая от 20°С до 95°С (ниже 45°С: +3°С/мин; выше 45°С: +1°С/мин, регистрируя сигнал при 222 нм, с 1 мин задержкой при 95°С и последующей фазой охлаждения (обратная программа по сравнению с фазой нагревания). Сигнал CD нормировали к средней остаточной эллиптичности (MRE) в единицах градус × см²/дмоль. Кроме того, регистрировали спектр далекого ультрафиолетового излучения CD.

Белок #21 проявляет спектр CD типичный для альфа-спиральных белков с характеристическими минимумами при 208 нм и 222 нм. Белок #21 проявляет высокую термическую стабильность после стабильного исходного значения (без изменений в наклоне), потерю сигнала при 222 нм обнаруживают выше 78°С.

Пример 16: Влияние белка #21 на фосфопротеом.

Белок #21 экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Клетки ВТ474 или NCI-N87 обрабатывали в течение 18 часов с помощью любого из белка #21 (100 нМ), трастузумаба (100 нМ), пертузумаба (100 нМ), смеси трастузумаба (100 нМ) и пертузумаба (100 нМ) или PBS. Клетки затем подвергали масс-спектрометрическому анализу фосфопротеома, как описано Britton D. С соавт. (Britton, D., Zen, Y., Quaglia, A., Selzer, S., Mitra, Vl., , C, Jung, S., , G., Schmid, P., Prefot, P., Hoehle, C, Koncarevic, S., Gee, J., Nicholson, R., Ward, M., Castellano, L., Stebbing, J., Zucht, H.D., Sarker, D., Heaton, N., and Pike, I., 2014. PLOS One 9 (3), e90948). Анализ выявил, что обработка клеток с помощью белка #21 дифференциально регулирует многочисленные фосфорилированные пептиды по сравнению с трастузумабом, пертузумабом и их комбинацией. Результаты показаны в таблице 1. Важно, что белок #21 проявляет некоторые заметные отличия от трастузумаба, пертузумаба и смеси трастузумаба и пертузумаба в том, что он сильнее ингибирует фосфорилирование HER2 на сайтах 1073/1078/1083, 1139/1151, 1172/1174, 1174 и 1240. В других сайтах фосфорилирования фосфорилирование увеличивается (772). Находящиеся ниже HER2 специфические представители сигнального каскада mTOR, как было установлено, дифференциально регулируются после обработки белком #21; например, фосфопептид для киназы S6 (S441/T444/S447) подвергался отрицательной регуляции в 0,63 раза по отношению к РВ S по сравнению с другими группами, где отрицательная регуляция составляла только в 0,88 раз. Более того, фосфорилированные пептиды, которые относятся к MAPK1 и MAPK3, подверглись значительной отрицательной регуляции.

Анализ тех же образцов с помощью специфического в отношении сайтов фосфориливания ELISA для AKT-S473 (BioConcept: набор №7160 для сэндвич-ELISA PathScan® Phospho-Aktl (Ser473)) показал отрицательную регуляцию с помощью белка #21 в 0,16 раз по отношению к PBS по сравнению с другими группами, где отрицательная регуляция находилась в диапазоне, составляющем только 0,3-0,7 раз. Результаты ELISA показаны в таблице 2.

Эти результаты указывают на то, что белок #21 дифференциально регулирует передачу сигнала ниже HER2 по сравнению с трастузумабом, пертузумабом и комбинацией их обоих. Наибольшие различия обнаруживают в пути AKT-mTOR, критически важном пути для выживаемости клеток, что, в свою очередь, объясняет, почему белок #21 индуцирует апоптоз. Путь фосфоинозитид-3-киназы (PI3K/Akt) считают одним критически важных путей, который поддерживает выживаемость клеток путем блокирования апоптоза. Его патологическая активация, например, за счет гетеродимеризации HER2/HER3, таким образом, может привести к злокачественной пролиферации.

В этом эксперименте дополнительно обнаружили, что воздействие на клетки ВТ474 и NCI-N87 белка #21 увеличивало клеточные содержания белка Foxo3a в 1,88 и 2,8 раз, соответственно, по сравнению с воздействием только PBS. Соответствующее увеличение содержаний белка Foxo3a в клетках ВТ474 и NCI-N87 за счет воздействия трастузумаба составляло в 1,14 и 1,32 раз, соответственно; и за счет воздействия пертузумаба - в 1,21 и 1,25 раз, соответственно; и за счет воздействия трастузумаба и пертузумаба - в 1,28 и 1,19 раз, соответственно. Таким образом, белок #21 приводит к гораздо более высокому увеличению клеточных содержаний белка Foxo3a по сравнению с трастузумабом или пертузумабом или комбинацией их обоих. Специалисту в настоящей области техники известно, что Akt1 фосфорилирует Foxo3a, приводя в результате к разложению Foxo3a и стимуляции выживаемости клеток. Ингибирование фосфорилирования Akt приводит к стабилизации Foxo3a и, таким образом, увеличению содержаний Foxo3a. При увеличенных содержаниях Foxo3a может транслоцироваться в ядро и индуцировать апоптоз.

Пример 17: Введение сопутствующей терапии с использованием рекомбинантных связывающих белков, содержащих SEQ ID NO: 21, для улучшения терапии.

Белок #21 и белок #21-His экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Проводили стандартные анализы пролиферации клеток с использованием BrdU, хорошо известные специалисту в настоящей области техники. Вкратце, эффекты на клеточную пролиферацию белка #21-His, других соединений или белка #21-His в комбинации с другими соединениями, определяли путем измерения синтеза ДНК с использованием мечения с помощью BrdU (BrdU, Cell Proliferation ELISA, Roche). Вкратце, 10000 клеток высевали на каждую лунку в 96-луночном планшете в 100 мкл полной среды и инкубировали в течение 24 часов. Белок #21-His и/или соединения добавляли на дополнительные 72 часа. BrdU для мечения клеток добавляли на последние 24 часа. Меченые (пролиферирующие) клетки обнаруживали в соответствии с протоколом производителей. Данные анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad prism (график зависимости log [с] и OD450-602 нм). Данные подбирали с использованием нелинейной регрессионной аппроксимации (кривая зависимости логарифма (антагонист) и ответа - модель переменного наклона (четыре параметра)).

Комбинация белка #21-His с эрибулином, ингибитором микротрубочек: белок #21-His, эрибулин или комбинацию белка #21-His и эрибулина исследовали в отношении их способности ингибировать пролиферацию клеток ВТ474 и MDA-MB175. Дозу эрибулина подбирали, начиная с 1000 нМ, в добавление к субоптимальной концентрации белка #21-His (2 нМ в ВТ474 и 4 нМ в MDA-MB175). Комбинация обеих молекул превосходила эрибулин отдельно в обеих клеточных линиях. Эрибулин не являлся активным в отношении клеток ВТ474 в качестве отдельного средства, но показал сильное ингибирование в комбинации с белком #21-His. Эрибулин самостоятельно показал очень низкую активность на клетках MDA-MB175, но активность улучшалась в комбинации с белком #21-His. Значения IC₅₀ представлены в таблице 3. Указанные данные показывают, что белок #21-His можно комбинировать с эрибулином, и он потенцирует его активность.

Комбинация белка #21-His и GDC-0941, ингибитора pI3K: белок #21-His, GDC-0941 или комбинацию белка #21-His и GDC-0941 исследовали в отношении их способности ингибировать пролиферацию клеток ВТ474 и MDA-MB175. Дозу GDC-0941 подбирали, начиная с 20000 нМ, в добавление к субоптимальной концентрации белка #21-His (2 нМ в ВТ474 и 4 нМ в MDA-MB175). Комбинация обеих молекул превосходила GDC-0941 отдельно в обеих клеточных линиях. GDC-0941 самостоятельно показал активность, но активность увеличивалась в комбинации с белком #21-His. Активность GDC-0941 в ВТ474 сильно увеличивалась, указывая на синергический эффект. Аналогично белок #21-His увеличивал активность GDC-0941 в клетках MDA-MB175, где эффект оказался аддитивным. Значения IC₅₀ представлены в таблице 3. Указанные данные показывают, что белок #21-His можно комбинировать с GDC-0941, и он потенцирует его активность.

Комбинация белка #21-His и эверолимуса, ингибитора mTOR: белок #21-His, эверолимус или комбинацию белка #21-His и эверолимуса исследовали в отношении их способности ингибировать пролиферацию клеток ВТ474 и MDA-MB175. Дозу эверолимуса подбирали, начиная с 1 мМ, в добавление к субоптимальной концентрации белка #21-His (2 нМ в ВТ474 и 4 нМ в MDA-MB175). Комбинация обеих молекул превосходила эверолимус отдельно в обеих клеточных линиях. Эверолимус самостоятельно показал активность, но активность увеличивалась в комбинации с белком #21-His. Активность эверолимуса в клетках ВТ474 сильно увеличивалась, указывая на синергический эффект. Аналогично белок #21-His увеличивал активность эверолимуса в клетках MDA-MB175, где эффект оказался аддитивным. Значения IC₅₀ представлены в таблице 3. Указанные данные показывают, что белок #21-His можно комбинировать с эверолимусом, и он потенцирует его активность.

Комбинация белка #21-His и лапатиниба, ингибитора любого типа HER: белок #21-His, лапатиниб или комбинацию белка #21-His и лапатиниба исследовали в отношении их способности ингибировать пролиферацию клеток ВТ474 и MDA-MB175. Лапатиниб подбирали, начиная с 10000 нМ, в добавление к субоптимальной концентрации белка #21-His (2 нМ в ВТ474 и 4 нМ в MDA-MB175). Комбинация обеих молекул превосходила лапатиниб отдельно в обеих клеточных линиях. Лапатиниб самостоятельно показал активность, но активность увеличивалась в комбинации с белком #21-His. Активность лапатиниба в клетках ВТ474 сильно увеличивалась, указывая на синергический эффект. Аналогично белок #21-His увеличивал активность лапатиниба в клетках MDA-MB175, где эффект оказался аддитивным. Значения IC₅₀ представлены в таблице 3. Указанные данные показывают, что белок #21-His можно комбинировать с лапатинибом, и он потенцирует его активность.

Комбинация белка #21 с трастузумабом: белок #21, трастузумаб или комбинацию белка #21 и трастузумаба исследовали в отношении их способности ингибировать пролиферацию клеток ВТ474 и MDA-MB175. Трастузумаб подбирали, начиная с 100 нМ, в добавление к субоптимальной концентрации белка #21 (1 нМ в ВТ474 и 10 нМ в MDA-МВ175). Комбинация обеих молекул превосходила трастузумаб отдельно в обеих клеточных линиях. Трастузумаб показал только ограниченную активность самостоятельно и индуцировал только прекращение клеточной пролиферации, но не апоптоз, тогда как белок #21 индуцирует апоптоз. Комбинация субоптимальной концентрации белка #21 с трастузумабом приводила в результате к ингибированию пролиферации. Это показывает, что обе молекулы можно комбинировать и что белок #21 потенцирует активность трастузумаба. Эффект комбинации также можно подтвердить путем подбора дозы белка #21 в добавление к постоянной концентрации трастузумаба (50 нМ).

Аналогично, комбинация белка #21 с апитолисибом, таселисибом, алпелисибом, палбоциклибом, траметинибом, кобиметинибом или салиразибом являлась более эффективной в ингибировании пролиферации клеток ВТ474, чем либо белок #21 отдельно, либо апитолисиб, таселисиб, алпелисиб, палбоциклиб, траметиниб, кобиметиниб или салиразиб отдельно (см. таблицу 3). Для экспериментов с апитолисибом, таселисибом, алпелисибом или палбоциклибом белок #21 использовали в концентрации 2 нМ и концентрации апитолисиба, таселисиба, алпелисиба или палбоциклиба подбирали для определения значений IC₅₀. Для экспериментов с траметинибом (10^-5 М), кобиметинибом (10^-5 М) или салиразибом (3×10^-5 М) дозу белка #21 подбирали для определения значений IC₅₀.

Таким образом, белок #21 или белок #21-His можно комбинировать с несколькими классами лекарственных средств стандартной терапии рака молочной железы для потенцирования их эффектов ингибирования роста в отношении клеток с избыточной экспрессией HER2. Это указывает на клинические возможности усиленной эффективности и/или снижения дозы стандартной терапии для снижения токсичности.

--->

Перечень последовательностей

SEQUENCE LISTING

<110> Molecular Partners AG

<120> Recombinant Binding Proteins

<130> P015

<160> 33

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> His-tag

<400> 1

Met Arg Gly Ser His His His His His His

1 5 10

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GlySer linker

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GlySer linker

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GlySer linker

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GlySer linker

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GlySer linker

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ProThr linker

<400> 7

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr

1 5

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ProThr linker

<400> 8

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

1 5 10 15

<210> 9

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ProThr linker

<400> 9

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

1 5 10 15

Pro Thr Pro Thr Pro Thr

20

<210> 10

<211> 159

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 10

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Thr Asp Asn Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Asn Gly

35 40 45

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Ser Asp Leu Thr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Thr

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Tyr Asp Asn Asp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys

100 105 110

Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp

115 120 125

Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile

130 135 140

Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

145 150 155

<210> 11

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 11

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu Gly

35 40 45

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp

100 105 110

Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120 125

<210> 12

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 12

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120 125

<210> 13

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 13

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120 125

<210> 14

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 14

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120 125

<210> 15

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 15

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120 125

<210> 16

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 16

Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Ser Gly

35 40 45

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln His

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp

100 105 110

Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120 125

<210> 17

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 17

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly

35 40 45

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly

100 105 110

Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120 125

<210> 18

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 18

Gly Ser Asp Leu Gly Val Lys Leu Leu Trp Ala Ala Ala Arg Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Phe Gln Gly Ile Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Thr Asn Gly

35 40 45

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Ile Thr Gly Glu Thr Pro Leu His His Ala Ala Asp Ser

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Lys Ala Gly Val Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala

100 105 110

Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120 125

<210> 19

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 19

Gly Ser Asp Leu Gly Val Lys Leu Leu Trp Ala Ala Ala Arg Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Phe Gln Gly Ile Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Ser Gly

35 40 45

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln His

65 70 75 80

Gly His Leu Val Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp

100 105 110

Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

115 120 125

<210> 20

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Designed ankyrin repeat domain

<400> 20

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly

35 40 45

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Gly

100 105 110

Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120 125

<210> 21

<211> 570

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 21

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala

145 150 155 160

Ala Lys Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala

180 185 190

Ala Gln Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp

245 250 255

Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

260 265 270

Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

275 280 285

Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu

305 310 315 320

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro

325 330 335

Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

385 390 395 400

Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu

405 410 415

Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro

420 425 430

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu

435 440 445

Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val

450 455 460

Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe

465 470 475 480

Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile

485 490 495

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe

500 505 510

Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

530 535 540

Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu

545 550 555 560

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

565 570

<210> 22

<211> 570

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 22

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala

145 150 155 160

Ala Lys Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala

180 185 190

Ala Gln Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp

245 250 255

Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

260 265 270

Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

275 280 285

Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu

305 310 315 320

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro

325 330 335

Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

385 390 395 400

Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu

405 410 415

Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro

420 425 430

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu

435 440 445

Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val

450 455 460

Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe

465 470 475 480

Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile

485 490 495

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe

500 505 510

Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

530 535 540

Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu

545 550 555 560

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

565 570

<210> 23

<211> 570

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 23

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Val Lys Leu Leu Trp Ala Ala

145 150 155 160

Ala Arg Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Ile Thr Pro Leu His Ile Ala

180 185 190

Ala Thr Asn Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ile Thr Gly Glu Thr Pro Leu His His

210 215 220

Ala Ala Asp Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ala Gly Val Thr Pro Ala Asp

245 250 255

Leu Ala Ala Ala Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

260 265 270

Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

275 280 285

Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu

305 310 315 320

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro

325 330 335

Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

385 390 395 400

Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu

405 410 415

Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro

420 425 430

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu

435 440 445

Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val

450 455 460

Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe

465 470 475 480

Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile

485 490 495

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe

500 505 510

Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu

515 520 525

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

530 535 540

Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu

545 550 555 560

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

565 570

<210> 24

<211> 570

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 24

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp

245 250 255

Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

260 265 270

Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

275 280 285

Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu

290 295 300

Leu Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu

305 310 315 320

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro

325 330 335

Leu His Ile Ala Ala Gln Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp

385 390 395 400

Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu

405 410 415

Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro

420 425 430

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu

435 440 445

Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val

450 455 460

Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr

465 470 475 480

Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile

485 490 495

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala

500 505 510

Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu

515 520 525

Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

530 535 540

Lys Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu

545 550 555 560

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

565 570

<210> 25

<211> 570

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 25

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala

180 185 190

Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp

245 250 255

Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

260 265 270

Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

275 280 285

Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Val Lys Leu

290 295 300

Leu Trp Ala Ala Ala Arg Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu

305 310 315 320

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Ile Thr Pro

325 330 335

Leu His Ile Ala Ala Thr Asn Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ile Thr Gly Glu Thr

355 360 365

Pro Leu His His Ala Ala Asp Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ala Gly Val

385 390 395 400

Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu

405 410 415

Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro

420 425 430

Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu

435 440 445

Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val

450 455 460

Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr

465 470 475 480

Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile

485 490 495

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala

500 505 510

Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu

515 520 525

Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

530 535 540

Lys Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu

545 550 555 560

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

565 570

<210> 26

<211> 562

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 26

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Ala Lys Leu Leu Ser Asp Leu Gly Val

145 150 155 160

Lys Leu Leu Trp Ala Ala Ala Arg Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile

165 170 175

Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Ile

180 185 190

Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu

195 200 205

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly

210 215 220

Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln His Gly His Leu Val Ile Val

225 230 235 240

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg

245 250 255

Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile

260 265 270

Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

290 295 300

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

305 310 315 320

Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala

325 330 335

His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp

340 345 350

Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

355 360 365

Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala

370 375 380

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser

385 390 395 400

Ile Gly Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

405 410 415

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

420 425 430

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

435 440 445

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala

450 455 460

Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala

465 470 475 480

Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

485 490 495

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu

500 505 510

Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His

515 520 525

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp

530 535 540

Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

545 550 555 560

Ala Ala

<210> 27

<211> 578

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 27

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ala Lys Leu Leu Ser Asp Leu

145 150 155 160

Gly Val Lys Leu Leu Trp Ala Ala Ala Arg Gly Gln Asp Asp Glu Val

165 170 175

Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln

180 185 190

Gly Ile Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Ser Gly His Leu Glu Ile

195 200 205

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val

210 215 220

Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln His Gly His Leu Val

225 230 235 240

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

245 250 255

Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu

260 265 270

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr

275 280 285

Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

290 295 300

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

305 310 315 320

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

325 330 335

Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly

340 345 350

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn

355 360 365

Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile

370 375 380

Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val

385 390 395 400

Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Gly

405 410 415

Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

420 425 430

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

435 440 445

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

450 455 460

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala

465 470 475 480

Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala

485 490 495

Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

500 505 510

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu

515 520 525

Ala Ala Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His

530 535 540

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp

545 550 555 560

Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

565 570 575

Ala Ala

<210> 28

<211> 283

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 28

Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Ser Gly

35 40 45

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln His

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp

100 105 110

Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala

180 185 190

Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp

245 250 255

Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

260 265 270

Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Cys

275 280

<210> 29

<211> 414

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 29

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Arg Ser Asp Leu Gly Ala Lys Leu Leu Ser Asp Leu Gly Val Lys

145 150 155 160

Leu Leu Trp Ala Ala Ala Arg Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu

165 170 175

Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Ile Thr

180 185 190

Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val

195 200 205

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp

210 215 220

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln His Gly His Leu Val Ile Val Glu

225 230 235 240

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly

245 250 255

Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala

260 265 270

Glu Val Leu Gln Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

275 280 285

Arg Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

290 295 300

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

305 310 315 320

Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly

325 330 335

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn

340 345 350

Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile

355 360 365

Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val

370 375 380

Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Gly

385 390 395 400

Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn

405 410

<210> 30

<211> 562

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 30

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val

165 170 175

Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg

180 185 190

Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

195 200 205

Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

210 215 220

Asn Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala

225 230 235 240

Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala

245 250 255

Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

275 280 285

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Ala Lys Leu Leu Ser Asp Leu

290 295 300

Gly Val Lys Leu Leu Trp Ala Ala Ala Arg Gly Gln Asp Asp Glu Val

305 310 315 320

Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln

325 330 335

Gly Ile Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Ser Gly His Leu Glu Ile

340 345 350

Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val

355 360 365

Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln His Gly His Leu Val

370 375 380

Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp

385 390 395 400

Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu

405 410 415

Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly

420 425 430

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

435 440 445

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala

450 455 460

Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala

465 470 475 480

Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly

485 490 495

Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu

500 505 510

Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys His

515 520 525

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp

530 535 540

Ile Ser Ile Gly Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys

545 550 555 560

Ala Ala

<210> 31

<211> 580

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains

<400> 31

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys

1 5 10 15

Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu

20 25 30

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His

35 40 45

Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu

50 55 60

Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly

65 70 75 80

Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val

85 90 95

Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe

100 105 110

Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile

115 120 125

Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr

130 135 140

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser

145 150 155 160

Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln Asp Asp

165 170 175

Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp

180 185 190

Phe Gln Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Ser Gly His Leu

195 200 205

Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys

210 215 220

Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln His Gly His

225 230 235 240

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

245 250 255

Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Trp Gly

260 265 270

His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr

275 280 285

Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr

290 295 300

Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala

305 310 315 320

Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

325 330 335

Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala Thr Ala

340 345 350

His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp

355 360 365

Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala

370 375 380

Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala

385 390 395 400

Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala

405 410 415

Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala

420 425 430

Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr

435 440 445

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu

450 455 460

Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala

465 470 475 480

Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His

485 490 495

Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys

500 505 510

Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu

515 520 525

His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu

530 535 540

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro

545 550 555 560

Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu

565 570 575

Gln Lys Ala Ala

580

<210> 32

<211> 274

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising two designed ankyrin repeat domains

<400> 32

Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln Ser Gly

35 40 45

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln His

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp

100 105 110

Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala

180 185 190

Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp

245 250 255

Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

260 265 270

Ala Ala

<210> 33

<211> 422

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protein comprising three designed ankyrin repeat domains

<400> 33

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala

20 25 30

Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly

35 40 45

His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu

65 70 75 80

Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser

115 120 125

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr

130 135 140

Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala

145 150 155 160

Ala Lys Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala

165 170 175

Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala

180 185 190

Ala Gln Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu

210 215 220

Ala Ala Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala

225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp

245 250 255

Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys

260 265 270

Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro

275 280 285

Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu

290 295 300

Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu

305 310 315 320

Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro

325 330 335

Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr

355 360 365

Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val

370 375 380

Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

385 390 395 400

Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu

405 410 415

Val Leu Gln Lys Ala Ala

420

<---

1. Рекомбинантный связывающий белок для связывания рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) и сывороточного альбумина, содержащий аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 97% идентичности аминокислотных последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 21, причем указанный рекомбинантный связывающий белок содержит два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 и два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина.

2. Рекомбинантный связывающий белок по п. 1, причем указанный рекомбинантный связывающий белок содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 99% идентичности аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 21.

3. Рекомбинантный связывающий белок по п. 1, в котором каждый из указанных двух сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 14.

4. Рекомбинантный связывающий белок по п. 3, в котором каждый из указанных сконструированных доменов с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина проявляет улучшенную стабильность при хранении в PBS по сравнению со сконструированным доменом с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, содержащим аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 13.

5. Рекомбинантный связывающий белок по п. 1, причем указанный рекомбинантный связывающий белок содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 21.

6. Рекомбинантный связывающий белок по п. 1, причем указанный рекомбинантный связывающий белок состоит из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 21.

7. Рекомбинантный связывающий белок по п. 1, причем указанный рекомбинантный связывающий белок ингибирует пролиферацию клеток BT474 с константой ингибирования ниже 10^-7 M.

8. Рекомбинантный связывающий белок п. 1, причем указанный рекомбинантный связывающий белок в концентрации, составляющей 100 нM, проявляет более сильную отрицательную регуляцию фосфорилирования AKT-S473 в клетках BT474, чем трастузумаб в концентрации, составляющей 100 нM.

9. Рекомбинантный связывающий белок по п. 1, причем указанный рекомбинантный связывающий белок содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 98% идентичности аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 21.

10. Рекомбинантный связывающий белок по п.1, причем указанный связывающий белок связывается с HER2 человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-7 M и причем указанный связывающий белок связывается с сывороточным альбумином человека в PBS с константой диссоциации (Kd) ниже 10^-7 M.

11. Нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный связывающий белок по п. 1.

12. Фармацевтическая композиция для лечения рака с экспрессией HER2, содержащая терапевтически эффективное количество рекомбинантного связывающего белка по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

13. Способ лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 12, причем заболевание представляет собой рак с экспрессией HER2.

14. Способ лечения по п. 13, причем рак с экспрессией HER2 представляет собой рак с избыточной экспрессией HER2, рак с аддикцией к HER2, рак с частичной аддикцией к HER2 или рак с амплификацией HER2.

15. Способ лечения по п. 13, причем рак представляет собой рак молочной железы, рак яичника, рак желудочно-кишечного тракта или рака желудка.