Фармацевтическая композиция, содержащая пептид apl-типа

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены фармацевтическая композиция, содержащая пептид APL-типа, идентифицированный как SEQ ID No.1, натрий-ацетатный буферный раствор со значением рН 3,9-4,7 и стабилизирующий сахар, и ее применение, а также способ лечения воспалительного заболевания, связанного с увеличением нейтрофилов или цитруллинированием белков. Изобретение позволяет получить фармацевтическую композицию, которая может быть использована для получения лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний, связанных с увеличением нейтрофилов или цитруллинированием белков, таких как ревматоидный артрит (РА), ювенильный идиопатический артрит (ЮИА), анкилозирующий спондилит (АС), болезнь Альцгеймера, а также фиброз печени и легких. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 4 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности, к фармацевтической композиции, содержащей модифицированный пептид APL-типа (измененный пептидный лиганд, сокращенно APL). Введение этой композиции пациентам уменьшает явления, связанные с цитруллинированием белков. Эта композиция может быть использована для лечения воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (РА), анкилозирующий спондилит (АС), ювенильный идиопатический артрит (ЮИА), фиброз печени и болезнь Альцгеймера.

Предшествующий уровень техники

Цитруллинирование представляет собой посттрансляционную модификацию белков, которая превращает группу гуанидина (положительный заряд) из аргинина в цитруллинированную (нейтральную) группу уреидо. Ферменты пептидил-аргинин деиминаз (PAD) катализируют эту трансформацию (Bicker K. L., Thompson P. R. 2013, Biopolymers, 99: 155-163). При РА основными источниками цитруллинированных аутоантигенов являются воздействие агентов окружающей среды, вызывающих заболевание, и нетоз нейтрофилов. Нетоз представляет собой запрограммированную гибель клеток, при которой происходит разрыв плазматической мембраны, связанный с изменением ядерной морфологии нейтрофилов. При высвобождении из цитоплазматического содержимого нейтрофилов во внеклеточное пространство образуется матрица хроматина, обогащенная антимикробными белковыми гранулами и ферментами, так называемые внеклеточные ловушки нейтрофилов. В этом процессе высвобождаются ферменты PAD и цитруллинированные гистоны H3, которые становятся сильными аутоантигенами (Konig MF, Andrade F. 2016. Front Immunol 7: 461) и усиливают воспалительный ответ синовиальных фибробластов, которые проникают в хрящ. В то же время агенты окружающей среды, которые индуцируют РА, вызывают апоптоз и гибель вследствие некроза клеток, которые образуют внеклеточный матрикс. Некротические клетки выделяют свое цитоплазматическое содержимое во внеклеточное пространство. Во время данного процесса также высвобождаются ферменты PAD, которые активируются благодаря уровням кальция во внеклеточном пространстве и вызывают цитруллинирование собственных белков.

Нетоз нейтрофилов также связан с патогенезом АС и ЮИА (Giaglis S et al., 2016. Front, Pediatr, 4:97). В то же время нетоз может усугублять нейровоспалительные процессы, способствуя повреждению сосудов в паренхиме у пациентов с болезнью Альцгеймера (Pietronigro EC et al., 2017. Front Immunol 8: 211). Кроме того, нетоз представляет собой биологический процесс, который способствует развитию фиброза в различных тканях, таких как ткани легких и печени, связанных с цитруллинированием виментина (Branzk N, Papayannopoulos V. Seminars in Immunopathology, 2013; 35 (4): 513-530).

В частности, было описано несколько белков, при РА являющихся мишенями цитруллинирования, среди которых фибриноген, кератин, фибронектин, виментин, коллаген II типа и α-энолаза (McInnes IB, Schett G. 2011 N Engl J Med. 365 (23): 2205-2219). В то же время было обнаружено, что цитруллинирование виментина вносит значительный вклад в патогенез АС, ЮИА, печеночного и легочного фиброза и болезни Альцгеймера (S. Gudmann et al., 2015. Autoimmunity 48: 73-79).

На фоне прогрессии РА B-клетки пролиферируют и дифференцируются в клетки, секретирующие антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП), после взаимодействия с T-клетками-хелперами, активированными цитруллинированными пептидами. АЦЦП обнаруживаются у 50% пациентов, приблизительно за год до появления РА. Исследования на животных моделях предполагают, что миграция этих аутоантител из внесуставных участков к синовиальной оболочке вызывает воспаление суставов. Кроме того, присутствие АЦЦП в синовиальной оболочке является фактором риска развития для этого заболевания, поскольку эти аутоантитела распознают молекулы цитруллинированного виментина и индуцируют дифференцировку мононуклеарных клеток в остеокласты, которые способствуют рассасыванию и разрушению кости (Martin-Mola E. et al 2016. Rheumatol Int. 36 (8): 1043-1063).

Фактором, который вносит заметный вклад в патогенез РА, является активация нейтрофилов иммунными комплексами, откладывающимися в синовиальной жидкости или на поверхности хряща (Rollet-Labelle E. et al., 2013. J Inflamm (Lond). 1): 27). Нейтрофилы индуцируют синтез и высвобождение цитотоксических продуктов (простагландинов, протеаз и свободных кислородных радикалов), которые серьезно повреждают сустав. Нейтрофилы управляют воспалительным процессом с помощью четырех механизмов: (1) секреции цитокинов и хемокинов, включая IL-23, IL-12, RANKL (лиганд рецептора-активатора ядерного фактора-κB) и IL-18, которые вызывают активацию остеокластов и В-лимфоцитов; (2) повышенной экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости класса II; (3) межклеточных взаимодействий, которые вызывают активацию других типов клеток, которые разрушают сустав; и (4) высвобождения протеаз, которые активируют или инактивируют цитокины и хемокины, участвующие в повреждении суставов (Wright H. L et al. (2014. Nat Rev Rheumatol.10 (10): 593-601).

Нейтрофилы имеют короткий период полужизни, приблизительно от 30 мин до 8 ч. Белки S100A8/9 представляют 40% белков в цитозоле этих клеток; этот комплекс индуцирует запрограммированную клеточную гибель нейтрофилов (M Atallah, et al., 2012. PLoS ONE 7: 2 (e29333). S100A8 и S100A9 обычно находятся в комплексе, известном как кальпротектин; как S100A8, так и S100A9, и кальпротектин вызывают хемотаксис нейтрофилов в очень низких концентрациях (наномолярный диапазон). Кальпротектин (S100A8/9) обнаруживается в высоких концентрациях в очагах локального воспаления или в сыворотке пациентов с воспалительными заболеваниями, такими как РА, фиброз и болезнь Крона (Cerezo, L. et al. 2011. Arthritis Res. Ther. 13 (4): R122).

Cohen и Monsonego в заявке на патент No. WO2009090650 заявили о применении для лечения болезни Альцгеймера пептида, полученного из HSP60, в комбинации с β-амилоидным белком. Указанный пептид содержит последовательность аминокислот 458-474 HSP60. Другие авторы показали использование для лечения болезни Альцгеймера малых пептидов, которые также предотвращают агрегацию β-амилоидного белка (P Sundaram et al., Patents on Potential Drugs to Treat Alzheimer's Disease: Special Emphasis on Small Peptides, 2014. 9: 71-75). В заявке на патент No. PCT/IL2003/000132 для лечения различных заболеваний, хронических воспалений, среди которых упоминается легочный фиброз заявлено использование пептида p277, полученного из HSP60, который способен модулировать активность Т-клеток посредством TLR 2 типа. В заявке на патент WO2006032216 заявлен пептид APL-типа, идентифицированный в списке последовательностей как Seq ID No. 1; и его использование при лечении РА. В то же время в патенте EP2374468 раскрыто применение указанного пептида при лечении болезни Крона, язвенного колита и сахарного диабета I типа.

В настоящее время не существует эффективных методов лечения, вызывающих снижение уровней АЦЦП, нетоза и биологического процесса цитруллинирования белков. Также не существует эффективного лечения аутоиммунного артрита, например РА, ЮИА и АС, или других заболеваний, которые также характеризуются цитруллинированием собственных белков, таких как болезнь Альцгеймера и фиброз печени и легких. Таким образом, все еще представляет интерес получить лекарственные средства, которые обладают терапевтическими преимуществами по сравнению с лекарственными средствами, которые существуют при лечении этого типа заболеваний.

Объяснение изобретения

Настоящее изобретение решает вышеупомянутую проблему, поскольку оно относится к фармацевтической композиции, содержащей пептид APL-типа, идентифицированный как SEQ ID No. 1, натрий-ацетатный буферный раствор со значением рН 3,9-7,7; и по меньшей мере один стабилизирующий сахар, выбранный из: сахарозы или трегалозы. Пептид, идентифицированный как Seq ID No. 1, получают из участка человеческого HSP60, содержащего от 83 до 109 аминокислот. Пептиды APL-типа подобны аналогам иммуногенных пептидов, но с одной или несколькими заменами в положениях, существенных для контакта с Т-клеточным рецептором или с главным комплексом гистосовместимости класса II, который модифицирует каскад явлений, необходимых для активации Т-клеток. Концентрации этого пептида в фармацевтической композиции по настоящему изобретению обеспечивают эффективный иммунный ответ у хозяина.

Пептид Seq ID No. 1 получают путем химического синтеза. Уровень и качество вызванного им иммунного ответа можно оценить в экспериментах, подобных тем, которые описаны в настоящем изобретении. В примере этого изобретения пептид находится в концентрации от 0,5 мг/мл до 10 мг/мл в фармацевтической композиции, натрий-ацетатный буферный раствор имеет концентрацию от 30 до 70 мМ. В то время как концентрация стабилизирующего сахара в примере по этому изобретению находится в диапазоне от 10 до 40 мг/мл.

Фармацевтическая композиция по этому изобретению отличается своей высокой стабильностью и безопасностью. Это было подтверждено во время обследования пациентов. Фармацевтическая композиция хорошо переносилась. Ни у одного пациента не было выявлено серьезных нежелательных явлений, и не были изменены биохимические или гематологические параметры. Эти результаты были неожиданными, принимая во внимание, что значение рН состава составляет приблизительно 4,0; или далеко от физиологических значений рН. В аналогичных составах других соединений, где значения рН далеки от физиологических значений рН, наблюдались нежелательные явления в месте инъекции, такие как чувствительность и боль. В варианте осуществления этого изобретения композиция, которая вводится пациентам, представляет собой жидкость или лиофилизат.

В настоящем изобретении раскрыта способность фармацевтической композиции, содержащей пептид, идентифицированный как Seq ID No. 1, вспомогательное вещество сахарозу или трегалозу, и натрий-ацетатный буферный раствор со значением рН от 3,9 до 4,7, к снижению процентного содержания нейтрофилов, нетоза и уровней АЦЦП. Эти патогенные явления участвуют в развитии РА, ЮИА, АС, болезни Альцгеймера и фиброза. Фармацевтическая композиция, описанная выше, значительно снижала количество нейтрофилов в анализах ex vivo, проводимых с клетками, полученными от пациентов с этими заболеваниями.

Неожиданным образом, этот фармацевтический препарат также значительно снижал уровни антител к циклическому цитруллинированному пептиду (анти-ЦЦП) в группе пациентов с РА, которых лечили этим препаратом. Кроме того, пептид снижал уровни белков S100A9 и S100A8 в анализах ex vivo, проводимых с мононуклеарными клетками, полученными от пациентов с РА.

Следовательно, другим аспектом этого изобретения является применение указанной фармацевтической композиции для изготовления лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания, связанного с увеличением нейтрофилов или цитруллинированием белков. Использование антиген-специфических стратегий, которые регулируют усиленный иммунный ответ с последующим снижением процесса цитруллинирования, характерного для этих заболеваний, представляет собой совершенно новый терапевтический подход. В варианте осуществления изобретения, композицию используют для получения лекарственного средства против воспалительного заболевания, которое выбрано из группы, состоящей из РА, ЮИА, АС, болезни Альцгеймера и фиброза печени и легких.

Было высказано предположение, что пептид, идентифицированный как Seq ID No. 1, может быть использован для лечения РА (Dominguez MC et al., 2011. Autoimmunity 44 (6): 471-482; Barberá A. et al., 2016. Cell Stress and Chaperones 21: 735-744). Однако нет никаких данных, позволяющих предположить, что конкретный состав этого пептида может быть использован для лечения воспалительных заболеваний, при которых увеличивается цитруллинирование белка и присутствуют антитела к цитруллинированным белкам.

В другом аспекте, изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания, связанного с увеличением количества нейтрофилов или цитруллинированием белков. Этот способ включает введение нуждающемуся субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению. В варианте осуществления изобретения, воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из РА, ЮИА, болезни Альцгеймера (AD) и фиброза печени и легких.

Эффективным количеством композиции является то количество, которое при введении приводит к снижению уровней анти-ЦЦП, антител к нетозу и, как следствие, цитруллинированию белков у пациентов. В ходе лечения количество вводимого пептида может изменяться в соответствии с определенными факторами, такими как возраст, пол, общее состояние здоровья, а также уровень иммунного ответа в целом.

В другом варианте осуществления изобретения, как часть способа, пациентам также вводят противовоспалительные лекарственные средства или антагонисты цитокинов. В конкретном варианте осуществления, в способе лечения воспалительных заболеваний фармацевтическая композиция, содержащая пептид APL-типа, является жидкой или лиофилизированной, которая растворяется для введения.

В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят парентерально или через слизистую оболочку. В предпочтительном варианте осуществления, фармацевтическую композицию пептида вводят подкожно. В другом варианте осуществления, фармацевтическую композицию вводят перорально.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Хроматографический профиль пептида APL-типа, идентифицированного как Seq ID No. 1, растворенного в концентрации 50 мМ в натрий-фосфатном буферном растворе; значение рН 7,4. Профиль был получен с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), (А) время 0, (В) 15 сут хранения при температуре 37°С.

Фиг. 2. Оценка растворимости пептида, идентифицированного как Seq ID No. 1, в нескольких вспомогательных веществах, определенная с помощью ОФ-ВЭЖХ.

Фиг. 3. Молекулярная эксклюзионная хроматография - ВЭЖХ пептида Seq ID No. 1, растворенного в воде (A), в фосфатно-солевой буферном растворе (PBS) (B) и в сахарозе (C).

Фиг. 4. Влияние значений pH на концентрацию пептида, идентифицированного как Seq ID No. 1, в образцах, составленных и хранящихся при температурах 4°C (A) и 37°C (B).

Фиг. 5. Влияние значений pH на чистоту пептида, идентифицированного как Seq ID No. 1, в образцах, составленных и хранящихся при температуре 37°C.

Фиг. 6. Влияние фармацевтической композиции пептида на клеточную жизнеспособность нейтрофилов, полученных из периферической крови пациентов с АС. Клетки, культивируемые без стимуляции пептидом, являются отрицательным контролем.

Фиг. 7. Влияние введения фармацевтической композиции пептида на концентрацию анти-ЦЦП у пациентов с РА, получавших пептид. Звездочки указывают на статистически значимые различия между значениями, полученными в нулевой момент времени (без лечения) и в трех повторах.

Подробное описание примеров

Пример 1. Получение пептидного состава APL-типа для применения у людей

Пептид APL-типа получали путем химического синтеза. Было отмечено, что при растворении пептида, идентифицированного как Seq ID No. 1, в 50 мМ натрий-фосфатном буферном растворе; значение рН 7,4, пептид постепенно дестабилизируется. Для изучения причин такого эффекта пептид растворяли в этом буферном растворе и хранили при температуре 37°С в течение 15 сут. Затем несколько аликвот периодически анализировали с помощью ОФ-ВЭЖХ. Было проверено наличие загрязняющих молекул, они были очищены и проанализированы с помощью масс-спектрометрии, и было выявлено несколько фракций, которые могли бы соответствовать деградации.

Чтобы ускорить деградацию, пептид инкубировали в стрессовых условиях, которые позволяют быстро и в высоких пропорциях получать возможные деградированные молекулы пептида. Фракции, собранные после ОФ-ВЭЖХ, характеризовали с помощью масс-спектрометрии. Хроматографический профиль интактного пептида в нулевой момент времени показан на Фиг. 1А. На Фиг. 1В показан профиль того же пептида после инкубации в течение 15 сут при температуре 37°С в вышеупомянутых условиях. После анализа с помощью масс-спектрометрии фракций, наблюдаемых на Фиг. 1В, было установлено, что фракции 1, 2 и 4 соответствуют дезамидированным вариантам пептида, в то время как фракция 3 соответствует интактному пептиду.

Пептид содержит четыре аспарагина, что объясняет полученные деамидированные молекулы, которые влияют на его стабильность при растворении в 50 мМ натрий-фосфатном буферном растворе; значение рН 7,4. Кроме того, пептид очень плохо растворим в данном буферном растворе, что затрудняет приготовление фармацевтического состава, который можно вводить пациентам в эффективной дозе. С учетом данных результатов перед приготовлением препарата были проведены исследования для получения стабильного фармацевтического продукта, содержащего пептид. Для достижения общей растворимости пептида и высокой химической стабильности оценивали разные ионные вещества, значения pH и вспомогательные вещества. Растворимость пептида оценивали с использованием различных вспомогательных веществ, которые включали разные ионные соли, сахара, полиолы, аминокислоты и детергенты.

Первый этап разработки состава включал оценку влияния группы буферных растворов и значений рН на химическую и физическую стабильность пептида. Пептид плохо растворим в натрий-фосфатном буферном растворе и очень плохо растворим в других ионных веществах, таких как цитрат натрия, глутамат натрия и трис-HCl. На Фиг. 2 показана растворимость пептида в некоторых оцениваемых вспомогательных веществах. Натрий-ацетатный буферный раствор, приготовленный с использованием уксусной кислоты и гидроксида натрия, лучше всего растворял пептид в концентрации в диапазоне от 10 до 70 мМ.

В то же время в Табл. 1 приведены результаты оценки растворимости пептида, приготовленного в концентрациях от 1 до 10 мг/мл, с различными типами фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Отмечено, что наибольшая растворимость пептида была получена в растворах сахарозы или трегалозы, затем в натрий-ацетатном буферном растворе. Другие вспомогательные вещества не стабилизировали исследуемый пептид таким же образом.

Таблица 1. Влияние оцениваемых вспомогательных веществ на растворимость пептидов

Вспомогательное вещество	Концентрация	Растворимость
Сахар: сахароза, трегалоза	10-40 мг/мл	+++++a
Сахар: декстроза	30-50 мг/мл	+++
Полиолы: маннит, сорбит	5-15 мг/мл	+++
Полимеры: декстран, β-циклодекстрин	10-20 мг/мл	+++
Детергенты: Твин 80, Твин 20	0,005-0,05%	++
Ионные вещества: гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия	10 мМ - 50 мМ	+
Буферный раствор цитрата натрия	10 мМ - 50 мМ	+
Натрий-ацетатный буферный раствор	10 мМ - 70 мМ	++++
Глутамат натрия	10 мМ - 50 мМ	++
Трис-HCl буферный раствор	10 мМ - 50 мМ	++
Хлорид натрия	5-15 мг/мл	+
Аминокислота: глицин	10-20 мг/мл	++
а: +++++: максимальная растворимость, +: очень низкая растворимость

Анализ пептида, растворенного в воде, в сахарозе (20 мг/мл) и в PBS, также проводили с помощью ВЭЖХ, которая показала влияние сахара на физическую стабильность пептида. В PBS пептид элюировали в течение более короткого времени удерживания, по сравнению с образцом, растворенным в воде и в растворе сахарозы. Это указывает на то, что PBS может способствовать взаимодействиям между мономерами пептида, поэтому в хроматографии он элюируется как агрегированный. Тем не менее, сахароза ингибирует взаимодействие между молекулами пептида, и в большинстве случаев элюируется как группа веществ с более длительным временем удерживания, которая может соответствовать мономеру пептида. Данный результат, который показан на Фиг. 3, подтверждает наилучший профиль растворимости пептида, полученный с помощью раствора сахарозы. Пептид, растворенный в воде, который используется в качестве контроля, также достигает хорошей растворимости. Однако он не представляет собой буферный раствор, который необходим для составления пептида при его использовании в качестве лекарственного средства.

Исходя из этих результатов, для дальнейших исследований пептид составляли в концентрации 2,5 мг/мл в 50 мМ натрий-ацетатном буферном растворе и анализировали влияние значения рН на химическую и физическую стабильность пептида в составе. Были проанализированы три значения рН: 3,0; 4,0 и 5,0. Образцы фильтровали и хранили при температуре 4°С или при температуре 37°С в течение 15 дней. Оценку стабильности и концентрации пептида проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ. Результаты концентрации пептида, хранящегося при температурах 4°С или 37°С, показаны на Фиг. 4А и 4В соответственно. Пептид не растворяется полностью при значении рН 5,0, следовательно, его концентрация ниже, чем концентрации, полученные при значениях рН 3,0 или 4,0. При температуре 37°C процесс осаждения ускоряется. Со временем наблюдается снижение концентрации пептида при трех изученных значениях pH, причем этот эффект увеличивается в следующем порядке: pH 5,0 > pH 4,0 > pH 3,0. В этих анализируемых условиях физическая стабильность пептида была выше при значении рН 3,0.

Химическая сохранность структуры пептида (выраженная в % чистоты в ОФ-ВЭЖХ) была выше 95% для образцов, составленных при трех значениях pH, когда они хранились при температуре 4°C в течение 15 сут. Однако когда образцы инкубировали при температуре 37°С, наблюдалась тенденция к снижению чистоты, которая была выше для образцов, составленных при значении рН 3,0. Эти результаты показаны на Фиг. 5, которая показывает, что значение pH 3,0 способствует химической деградации пептида.

В соответствии с этими результатами был сделан вывод, что оптимальным составом является тот, где пептид находится в натрий-ацетатном буферном растворе с концентрацией в диапазоне от 30 до 70 мМ, со значением рН приблизительно 4,0. Кроме того, в соответствии с этими результатами исследования растворимости (Табл. 1) было решено использовать в качестве стабилизирующего сахара сахарозу или трегалозу в концентрации от 10 до 40 мг/мл для приготовления лиофилизированной композиции исследуемого пептида APL-типа. Эти стабилизирующие сахара были необходимы для полной растворимости пептида, и эти сахара также были важны для хранения в лиофилизированном состоянии, поскольку способствовали стабильности пептида.

В описанной композиции не было обнаружено никаких молекулярных частиц, соответствующих деградации пептида. Эта фармацевтическая композиция оказалась стабильным продуктом на протяжении всего производства нескольких партий. Это показало реальную стабильность в течение 24 месяцев хранения при температуре 4°C.

Пример 2. Уменьшение нейтрофилов в анализах ex vivo, выполненных с использованием клеток, полученных от пациентов, получавших лечение

Как упомянуто выше, нейтрофилы играют решающую роль в развитии и хронизации некоторых воспалительных заболеваний. Поэтому было изучено влияние на жизнеспособность нейтрофилов у пациентов фармацевтической композиции пептида APL-типа, идентифицированного как Seq ID No. 1, которая была выбрана в Примере 1.

Кровь пациентов разводили 3%-ным раствором декстрана T500 в соотношении 1:2, перемешивали путем многократного переворачивания пробирок и инкубировали в течение 18-20 мин при комнатной температуре для осаждения эритроцитов. Верхний слой, с высоким содержанием лейкоцитов, экстрагировали и переносили в центрифужные пробирки объемом 50 мл. Пробирки центрифугировали при 500 g в течение 10 мин при температуре 4°С. Клеточный осадок ресуспендировали в 10 мл не содержащего ионов PBS. Пять миллилитров этой клеточной суспензии переносили в центрифужные пробирки объемом 15 мл, которые содержали 3 мл раствора «Ficoll-Paque™ PLUS» (Amersham Biosciences AB, Sweden). Пробирки центрифугировали при 400 g в течение 40 мин при комнатной температуре. После центрифугирования наблюдали четыре слоя, соответствующих плазме плюс PBS, мононуклеарным клеткам периферической крови (PBMC), раствору фиколла-пак и слою гранулоцитов плюс эритроцитов. Забирали слой, соответствующий гранулоцитам. Оставшиеся эритроциты лизировали, добавляя стерильную дистиллированную воду. Центрифугировали при 500 g в течение 5 мин при температуре 4°C. Нейтрофилы ресуспендировали в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки крови плодов коров и дополненной гентамицином (100 ед./мл) и L-глутамином (2 мМ) (Gibco BRL, США).

Нейтрофилы высевали (1×10⁶ кл./лунка) в 96-луночные планшеты (Costar, США) в конечном объеме 100 мкл и стимулировали (в трех повторах) композицией, выбранной в Примере 1, при следующих концентрациях пептида: 10, 40, 80 и 160 мкг/мл. Стимуляцию проводили в течение 24 ч. Клетки, не стимулированные указанной композицией, использовали в качестве контроля роста базальных клеток. Влияние пептидного состава на жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа с 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромидом (сокращенно МТТ, Sigma, США), следуя протоколу, описанному производителем. Через 24 ч культивирования в количестве 20 мкл на лунку добавляли МТТ, приготовленный в концентрации 5 мг/мл в культуральной среде. Затем планшеты инкубировали в течение 4 ч при аналогичных условиях культивирования. По истечении этого времени добавляли 100 мкл диметилсульфоксида и содержимое лунок гомогенизировали. Среднее значение оптической плотности нестимулированных клеток считалось 100% жизнеспособности клеток. Исходя из этого значения, при использовании пептидного состава жизнеспособность культивируемых клеток рассчитывали в соответствии со средними оптическими плотностями в каждом конкретном случае.

Как видно из Фиг. 6, снижение жизнеспособности клеток нейтрофилов пациентов с АС было очень заметным по сравнению с клетками без стимуляции пептидом. Составленный пептид снижал жизнеспособность клеток до 35% по сравнению с клетками без стимуляции пептидом. Очень похожие результаты были получены в экспериментах, которые проводились с нейтрофилами, полученными от пациентов с другими воспалительными заболеваниями (Табл. 2). Эти результаты подтверждают использование выбранной композиции данного пептида для лечения указанных заболеваний, поскольку она уменьшает популяцию клеток, участвующих в патогенезе этих патологий.

Таблица 2. Влияние фармацевтической композиции пептида APL-типа на клеточную жизнеспособность нейтрофилов пациентов с воспалительными заболеваниями

Заболевание	Количество пациентов	% ингибирования
АР *	3	35
ЮИА **	2	35
Болезнь Крона	2	30
Легочный фиброз	2	25
Болезнь Альцгеймера	2	30

* Пациенты с выраженной активностью. ** Пациенты с полиартикулярным подтипом с выраженной активностью

Однако при анализе фармацевтических составов пептидов, приготовленных с вспомогательными веществами, было обнаружено, что эффект снижения клеточной жизнеспособности нейтрофилов заметно снижается. Это видно из Табл. 3. Данные клетки были выделены из периферической крови пациентов с воспалительными заболеваниями, характеризующимися повышением уровня цитруллинирования белков, из расчета по одному пациенту на каждое заболевание. Для выделения исследуемых клеток использовали протокол, описанный выше.

Таблица 3. Влияние вспомогательных веществ, присутствующих в составе пептида APL-типа, на жизнеспособность клеток нейтрофилов пациентов с воспалительными заболеваниями

		% ингибирования клеточной жизнеспособности нейтрофилов пациентов
Вспомогательное вещество	Концентрация	РА	АС	ЮИА	Болезнь Кронаa	Фиброзb	Болезнь Альцгеймерас
Сахароза или трегалоза в ацетате натрия *	10-40 мг/мл	35	35	35	30	30	35
Ионные вещества: гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия	10 мМ - 50 мМ	5	5	0	0	0	5
Лимонная кислота-цитрат натрия	10 мМ - 50 мМ	0	0	0	0	0	0
Глутамат натрия	10 мМ - 50 мМ	20	15	15	15	20	20
Трис-HCl	10 мМ - 50 мМ	20	15	20	20	15	20
Хлорид натрия	5-15 мг/мл	5	5	5	5	5	0
Аминокислоты: глицин	10-20 мг/мл	10	10	5	5	10	10
a: болезнь Крона, b: фиброз печени, c: болезнь Альцгеймера. *: Фармацевтическую композицию, выбранную в Примере 1, использовали в качестве контроля эксперимента.

Эти результаты подтверждают, что состав пептида в натрий-ацетатном буферном растворе (30-70 мМ), при значении рН 3,9-7,7; и сахароза или трегалоза (10-40 мг/мл), полезен для индуцирования снижения жизнеспособности клеток нейтрофилов, полученных от пациентов с РА, ЮИА, АС, фиброзом и болезнью Альцгеймера.

Пример 3. Снижение содержания S100A8 и S100a9 и белков нетоза в анализах ex vivo с клетками, полученными от пациентов с РА

Образцы были получены от трех пациенток с РА, с развитием заболевания в течение 5 лет, и в возрасте от 50 до 55 лет. Во время сбора крови пациенты имели умеренную активность заболевания согласно клиническому индексу DAS28 (оценка активности заболевания), который является показателем активности заболевания, известным специалистам в этой области медицины (PL Van Riel and J. Fransen, 2005. Arthritis Res Ther 7: 189-190).

Кровь пациентов разбавляли в соотношении 1 : 2 фосфатным буферным раствором. Выделение мононуклеарных клеток проводили в градиенте фиколла. Клетки повторно суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки крови плодов коров. Десять миллионов клеток культивировали с приготовленным как описано в Примере 1 пептидом (40 мкг/мл) при температуре 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО2 в течение 24 ч или 5 сут. Кроме того, нестимулированные клетки культивировали с пептидом, который представлял собой контроль в экспериментах.

После культивирования клетки обрабатывали раствором хлорида натрия с высоким содержанием детергентов, протеаз и с изотопом кислорода-18, чтобы вызвать разрыв плазматической мембраны и маркировку белков. Образцы анализировали в масс-спектрометре LC/MS/MS, выполняя 18 прогонов для каждого образца.

Впоследствии была проведена биологическая интерпретация результатов, для которых были определены белки, которые значительно изменились в каждой клеточной культуре, как через 24 ч, так и через 5 сут инкубации с фармацевтической композицией, содержащей пептид. Все белки были охарактеризованы с точки зрения их биологической функции, их возможных посттрансляционных модификаций и их связи с заболеваниями. Используя общий список белков, которые существенно изменились, были проведены анализы обогащения по метаболическим путям, молекулярным процессам, системам взаимодействия и болезням. Эту процедуру также применяли к образцам каждого пациента независимо друг от друга, сравнивая результаты с двумя другими исследованиями и с общим анализом.

В то же время были отобраны те идентифицированные белки, которые имели одинаковое поведение по крайней мере у двух исследуемых пациентов или в образцах в двух исследованиях у одного пациента. С помощью этого нового списка белков был проведен анализ текстовых данных для выявления тех белков, которые были непосредственно связаны с болезнью. Белки, которые были идентифицированы с помощью этой стратегии, были изучены с точки зрения их функций и их качества как биомаркеров заболевания.

Анализ обогащения проводили по картам, метаболическим путям и биологическим процессам, сравнивая все эксперименты между собой (клетки каждого пациента оценивали через 24 ч и через 5 сут). Среди карт или биологических путей наиболее представлены нетоз и карты, связанные с реакцией на повреждение в дезоксирибонуклеиновой кислоте. При анализе белков, идентифицированных у трех пациентов, в качестве релевантных белков были обнаружены S100A8 и S100A9.

Содержание этих белков в клетках у трех пациентов уменьшалось, когда клетки культивировались с фармацевтической композицией, содержащей пептид, как в течение 24 ч, так и в течение 5 сут, по сравнению с клетками без пептидной стимуляции.

Указанная фармацевтическая композиция также значительно уменьшила нетоз. Белки S100A8 и S100A9 присутствуют в нейтрофилах, где они составляют 40% цитозольных белков, но также присутствуют в моноцитах. Тем не менее, нетоз представляет собой процесс, в частности, связанный с нейтрофилами. Этот последний пункт можно объяснить тем, что существует вероятность того, что кольцо полученных от пациентов мононуклеарных клеток было загрязнено с нейтрофилами. Это весьма вероятный факт, учитывая, что у трех пациентов была обнаружена умеренная активность заболевания, при которой увеличивается количество нейтрофилов.

В то же время эти результаты свидетельствуют о том, что упомянутая фармацевтическая композиция, содержащая пептид APL-типа и выбранные вспомогательные вещества, может способствовать снижению цитруллинирования белков, характерных для некоторых заболеваний, таких как аутоиммунный артрит, фиброз и болезнь Альцгеймера. Цитруллинированием является процесс, который способствует развитию данных патологий, и именно продукты, которые выделяются во внеклеточную среду во время нетоза, являются предшественниками цитруллинирования.

Пример 4. Снижение уровня анти-ЦЦП у пациентов с РА, получавших композицию, содержащую пептид APL-типа.

Анализировали образцы крови, полученные от пациентов с РА, включенных в I фазу клинических исследований. Пациентам вводили композицию, содержащую пептид APL-типа, идентифицированный как Seq. ID No. 1, который был описан в Примере 1. На момент введения пациенты имели умеренную активность заболевания согласно клиническому индексу DAS28.

Клиническое исследование было построено на трех уровнях доз пептида: 1 мг, 2,5 мг и 5 мг. Пациентов лечили фармацевтической композицией пептида в течение шести месяцев. Они получали девять инъекций указанного состава подкожно, разделенных на недельную дозу в течение первого месяца и месячную дозу в течение пяти месяцев.

Пациенты находились под наблюдением для выявления нежелательных явлений. Фармацевтическая композиция вводимого пептида APL-типа хорошо переносилась всеми пациентами. Ни у одного пациента не было выявлено серьезных нежелательных явлений, и не были изменены биохимические или гематологические параметры. Данные результаты оказались непредвиденными, принимая во внимание, что значение рН композиции составляет приблизительно 4,0; что далеко от физиологических значений рН. В предыдущих исследованиях других авторов сообщалось о локальном повреждении в месте введения, когда значения рН введенного препарата были далеки от физиологических значений рН.

Кроме того, концентрацию анти-ЦЦП определяли количественно в плазме пациентов с помощью метода ИФА с использованием коммерческого набора. Данный метод ИФА позволяет определять антитела к четырем антигенам: виментину, коллагену II типа, фибриногену и α-энолазе. Результаты выражены в пг/мл и проанализированы с помощью статистической программы «Prism», компании «GraphPad». Для сравнения значений времени, оцениваемых по отношению к нулевому моменту времени, применяли t-критерий Стьюдента.

Однако как показано на Фиг. 7, обработка выбранным пептидным составом APL-типа индуцировала значительное снижение концентрации анти-ЦЦП в плазме у пациентов, получавших лечение, относительно нулевого момента времени (p<0,05). Образцы пациентов соответствовали 13, 25 и 48 неделям лечения. Эти результаты продемонстрировали терапевтический эффект данного состава, поскольку анти-ЦЦП вносят вклад в патогенез РА и других воспалительных заболеваний, таких как ЮИА, АС, болезнь Альцгеймера, а также фиброз печени и легких. В то же время результаты показывают, что указанная фармацевтическая композиция, которая содержит пептид APL-типа, может способствовать снижению процесса цитруллинирования собственных белков, характерного для упомянутых заболеваний.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЦЕНТР ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕХНИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

<120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПЕПТИД APL-ТИПА

<130> APL-цитруллинирование

<140> CU 2017-0176

<141> 29.12.2017

<160> 1

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 27

<212> белок

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Описание Искусственной Последовательности: Пептид

APL-типа

<400> 1

Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val

1 5 10 15

Gln Leu Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala

20 25

<---

1. Фармацевтическая композиция, содержащая пептид APL-типа, дентифицированный как SEQ ID No. 1, которая содержит:

- натрий-ацетатный буфер с рН 3,9-4,7;

- пептид находится в концентрации от 0,5 мг/мл до 10 мг/мл;

- натрий-ацетатный буфер имеет концентрацию от 30 мМ до 70 мМ;

- стабилизирующий сахар, выбранный из сахарозы и трегалозы, находится в диапазоне от 10 мг/мл до 40 мг/мл;

причем указанная композиция используется для лечения воспалительного заболевания, связанного с увеличением нейтрофилов или цитруллинированием белков.

2. Композиция по п. 1, которая находится в жидкой форме или является продуктом ресуспендирования лиофилизата.

3. Применение фармацевтической композиции по любому из пп. 1, 2 для получения лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания, связанного с увеличением нейтрофилов или цитруллинированием белков.

4. Применение по п. 3, в котором воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита (РА), ювенильного идиопатического артрита (ЮИА), анкилозирующего спондилита (АС), болезни Альцгеймера и фиброза печени или легких.

5. Способ лечения воспалительного заболевания, связанного с увеличением нейтрофилов или цитруллинированием белков, отличающийся тем, что он включает введение нуждающемуся пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 1.

6. Способ по п. 5, в котором воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из РА, ЮИА, АС, болезни Альцгеймера и фиброза печени или легких.

7. Способ по п. 5, в котором пациенту дополнительно вводят противовоспалительные лекарственные средства или антагонисты цитокинов.