Антисмысловые олигонуклеотиды тирозиназы

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая производное пептидной нуклеиновой кислоты, фармацевтическую композицию для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающую эффективное количество производного пептидной нуклеиновой кислоты, фармацевтическую композицию лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека, включающую эффективное количество производного пептидной, способ лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты, способ лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты, применение производного пептидной нуклеиновой кислоты при получении медикамента для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, и применение производного пептидной нуклеиновой кислоты при получении медикамента для лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека. Изобретение расширяет арсенал средств комплементарно целенаправленно воздействующих на пре-мРНК тирозиназы человека. 7 н. и 2 з.п. ф-лы, 22 ил., 3 табл., 6 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к производным пептидных нуклеиновых кислот, комплементарно целенаправленно воздействующим на пре-мРНК тирозиназы человека, для улучшения опосредованной тирозиназой пигментации кожи.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Меланин обобщенно относится к темным природным и полимерным пигментам, вырабатываемым в живых организмах. Существует три типа меланина, т.е. эумеланин, феомеланин и нейромеланин. Эумеланин и феомеланин синтезируются в коже. Одновременно нейромеланин является меланином, найденным в головном мозге, и его физиологические функции до сих пор не выяснены.

Меланин в коже эффективно поглощает УФ (ультрафиолетовое) излучение и защищает животных от УФ (ультрафиолетового) облучения при естественном солнечном свете. Таким образом, загар является естественным процессом, которым животные защищают себя от УФ облучения на солнце.

Аминокислота тирозин полимеризуется до эумеланина после ряда сложных реакций в присутствии тирозиназы. Эумеланин относится к полимерам 5,6-дигидроксииндола (dihydroxyindole, DHI) и 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновой кислоты (5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, DHICA). Феомеланин образуется при полимеризации тирозина с помощью тирозиназы в присутствии цистеина или глутатиона.

В схеме 1 обобщены реакции, включающие TYR (тирозиназа), TYRP-1 (тирозиназа-зависимый белок 1, т.е. DHICA оксидаза) и TYRP-2 (тирозиназа-зависимый белок 2, т.е. DОРАхром (допахром) таутомераза) во время биосинтеза эумеланина и феомеланина. [Int. J. Mol. Sci. vol 10,4066-4087 (2009)].

Схема 1

Принимая во внимание, что тирозиназа (TYR) играет центральные роли в биосинтезе меланина в коже, были использованы или разработаны ингибиторы TYR в качестве косметических ингредиентов для уменьшения чрезмерной пигментации кожи, т.е. гиперпигментации. В нескольких публикациях [Int. J. Cosmetic Sci. vol 33, 210-221 (2011); Int. J. Mol. Sci. vol 10, 2440-2475 (2009)] ингибиторы TYR были проверены на предмет их воздействия на меланогенез.

Гидрохинон (1,4-дигидроксибензол) был использован для местного лечения гиперпигментации в течение десятилетий. [JAMA vol 194(9), 965-967 (1965)] Гидрохинон, как известно, подавляет активность TYR путем связывания с активным центром тирозиназы. В 2006 году US FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США) отозвало предыдущую регистрацию всех безрецептурных (ОТС over-the-counter) продуктов, содержащих гидрохинон, из-за проблем с безопасностью, включая потенциальную канцерогенность. Гидрохинон индуцирует активные формы кислорода (reactive oxygen species, ROS), повреждая мембранные липиды и белки, включая тирозиназу. Окислительное повреждение мембранных липидов необратимо лишает меланоцитов.

Арбутин (гидрохинон-О-β-D-глюкопиранозид) представляет собой гликозилированный гидрохинон, извлеченный из растения толокнянки. Арбутин также содержится в шелухе пшеницы и кожице груши. Как и гидрохинон, арбутин ингибирует меланогенез путем конкурентного связывая с активным центром TYR. [J. Pharmacol. Exp. Ther. vol 276(2), 765-769 (1996)]. Арбутин менее цитотоксичен к меланоцитам, чем гидрохинон.

Дезоксиарбутин является синтетическим производным арбутина и сравним с гидрохиноном и арбутином по ингибирующей активности TYR. Дезоксиарбутин менее цитотоксичен к меланоцитам, чем арбутин, а также и гидрохинон. [J. Dermatol. Sci. vol 55(3), 179-184 (2009)]. Дезоксиарбутин значительно улучшил светлый цвет кожи человека при наружной обработке в течение 12 недель. [Exp. Dermatol, vol 14(8), 601-608 (2005)].

Койевая кислота является хелатирующим агентом, полученным во время грибкового брожения в производстве соевого соуса и саке, т.е. японского рисового вина. Койевая кислота была использована для сохранения или изменения цвета в пищевых и косметических продуктах. Койевая кислота связывается в хелатный комплекс к ионами меди в активном центре TYR для ингибирования меланогенеза. Также подавляется таутомеризация DОРАхрома в 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновую кислоту. [J. Pharm. Pharmacol, vol 46(12), 982-985 (1994)]. Койевая кислота была широко использована для лечения мелазмы, хотя она может вызвать контактный дерматит, сенсибилизацию и эритему. [J. Drugs Dermatol, vol 6(1), 32-39 (2007)].

Хотя существуют целый ряд ингибиторов TYR, их величины IC50 по сравнению с TYR в большинстве случаев являются микромолярными (мкМ). [J. Enzyme Inhibition Med. Chem. vol 32(1), 403-425 (2017)]. Считается, что такие величины IC₅₀ являются плохими, принимая во внимание их молекулярные размеры, и повышают вероятность перекрестной реактивности с другой(ими) молекулярной(ыми) мишенью(ями). Поскольку плохая ингибирующая активность транслируется в большую трансдермальную дозу, ингибирующую активность необходимо заметно улучшить, чтобы удовлетворить желаемую трансдермальную активность против пигментации кожи, а также безопасности.

Пре-мРНК: Генетическая информация осуществляется на ДНК (2-дезоксирибонуклеиновая кислота). ДНК транскрибируется для продуцирования пре-мРНК (пре-информационная (матричная) рибонуклеиновая кислота) в ядре. Пре-мРНК млекопитающих обычно состоит из экзонов и интронов, а экзон и интрон взаимосвязаны друг с другом, как схематично приведено ниже. Экзоны и интроны пронумерованы, как проиллюстрировано на рисунке ниже.

Схематическое описание структуры пре-мРНК

Сплайсинг пре-мРНК: Пре-мРНК подвергается процессингу в мРНК после удаления интронов серией сложных реакций в совокупности называемых "сплайсингом", который схематически обобщен ниже на диаграмме. [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)].

Сплайсинг инициируется образованием "сплайсомного Е комплекса" (т.е. ранний сплайсомный комплекс) между пре-мРНК и адапторными факторами сплайсинга. В "сплайсомном Е комплексе", U1 связывается с областью соединения экзона N и интрона N, и U2AF³⁵ связывает область соединения интрона N и экзона (N+1). Таким образом, области соединения экзон/интрон или интрон/экзон являются критическими для образования раннего сплайсомного комплекса. "Сплайсомный Е комплекс" превращается в "сплайсомный А комплекс " при дополнительном комплексообразовании с U2. "Сплайсомный А комплекс" претерпевает серию сложных реакций для удаления или сплайсирования интрона, чтобы присоединить соседние экзоны.

Синтез рибосомного белка: Белки кодируются ДНК (2-дезоксирибонуклеиновая кислота). В ответ на клеточную стимуляцию или спонтанно ДНК транскрибируется для продуцирования пре-мРНК (пре-матричная рибонуклеиновая кислота) в ядре. Интроны пре-мРНК ферментативным путем сплайсируются для получения мРНК (матричная рибонуклеиновая кислота), которая затем транслоцируется в цитоплазму. В цитоплазме комплекс трансляционного механизма, вызванный рибосомой, связывается с мРНК и осуществляется синтез белка, поскольку он сканирует генетическую информацию, кодируемую по мРНК. [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)].

Антисмысловой олигонуклеотид (Antisense Oligonucleotide, ASO): Связывание олигонуклеотида с нуклеиновой кислотой, включая ДНК, мРНК и пре-мРНК, в сиквенс-специфичном методе (т.е. комплементарно) называется антисмысловым олигонуклеотидом (ASO).

Если ASO прочно связывается с мРНК в цитоплазме, например, ASO может ингибировать синтез рибосомного белка по мРНК. Необходимо, чтобы ASO присутствовал внутри цитоплазмы для того, чтобы ингибировать синтез рибосомного белка его белка-мишени.

Антисмысловое ингибирование сплайсинга: Если ASO прочно связывается с пре-мРНК в ядре, ASO сможет ингибировать или модулировать сплайсинг пре-мРНК в мРНК. Необходимо, чтобы ASO присутствовал внутри ядра для того, чтобы ингибировать или модулировать сплайсинг пре-мРНК в мРНК. Такое антисмысловое ингибирование сплайсинга продуцирует мРНК или мРНКы, не содержащие экзона, нацеленного с помощью ASO. Такая(ие) мРНК(ы) называется(ются) "сплайс-вариантом(ами)", и кодирует(ют) белок(и) меньший(ие), чем белок, кодируемый полноразмерной мРНК.

В принципе, сплайсинг может быть нарушен при ингибировании образования «сплайсомного Е комплекса». Если ASO прочно связывается с областью соединения (5'→3') экзон-интрон, т.е. "5' сайт сплайсинга», то ASO блокирует образование комплекса между пре-мРНК и фактором U1, и, следовательно, образование «сплайсомного Е комплекса». Аналогичным образом, «сплайсомный Е комплекс» не может образоваться, если ASO прочно связывается с областью соединения (5'→3') интрон-экзон, т.е. «3' сайт сплайсинга».

3' сайт сплайсинга и 5' сайт сплайсинга схематически проиллюстрированы на рисунке, приведенном ниже.

Олигонуклеотиды не природного происхождения: ДНК- или РНК-олигонуклеотиды подвержены деградации эндогенными нуклеазами, ограничивая их терапевтическую ценность. В настоящее время были разработаны и интенсивно исследованы многие виды олигонуклеотидов не природного происхождения (не встречающиеся в природе). [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)]. Некоторые из них показывают длительную метаболическую стабильность по сравнению с ДНК и РНК. Ниже приведены химические структуры для нескольких типичных олигонуклеотидов не природного происхождения. Такие олигонуклеотиды предсказуемо связываются с комплементарной нуклеиновой кислотой, как это делает ДНК или РНК.

В: Нуклеиновое основание

Фосфоротиоатный олигонуклеотид: Фосфоротиоатный олигонуклеотид (ФТО) (Phosphorothioate oligonucleotide, РТО) является аналогом ДНК с одним остовом атомов фосфатного кислорода, замещенных атомом серы в мономере. Такое небольшое структурное изменение сделало ФТО сравнительно устойчивым к деградации нуклеазами. [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)].

Отражая структурное сходство в остове ФТО и ДНК, они оба плохо проникают в клеточную мембрану в большинстве типов клеток млекопитающих. При этом, для некоторых типов клеток, чрезмерно экспрессирующих транспортер(ы) ДНК, ДНК и ФТО показывают хорошее проникновение в клетки. Известно, что системно вводимые ФТО(ы) легко распределяются в печени и почках. [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)].

Для того, чтобы облегчить проникновение в клетки ФТО in vitro, обычно на практике применяют липофекцию. Однако, липофекция физически изменяет клеточную мембрану, вызывает цитотоксичность, и поэтому не будет идеальным для долгосрочного терапевтического применения in vivo.

За прошедшие 30 лет антисмысловые ФТО(ы) и варианты ФТО(ов) были клинически оценены для лечения рака, иммунологических расстройств, метаболических заболеваний и так далее. [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)]. Многие из таких кандидатов антисенс-препаратов не были успешно разработаны отчасти из-за плохого проникновения в клетки ФТО. Для того, чтобы преодолеть плохое проникновение в клетки, ФТО необходимо вводить в высокой дозе для терапевтической активности.

Однако, известно, что ФТО(ы) связаны с дозолимитирующей токсичностью, включающей увеличенное время свертывания, активацию комплемента, тубулярную нефропатию, активацию купферовых клеток и иммунную стимуляцию, включая спленомегалию, лимфоидную гиперплазию, мононуклеарную клеточную инфильтрацию. [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)].

Было найдено, что многие антисмысловые ФТО(ы) показывают надлежащую клиническую активность при заболеваниях со значительной ролью печени или почек. Мипомерсен является аналогом ФТО, который ингибирует синтез ароВ-100, белка, вовлеченного в транспорт холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL). Мипомерсен проявлял надлежащую клиническую активность у больных атеросклерозом, скорее всего, из-за его избирательного распределения в печени. [Circulation vol 118(7), 743-753 (2008)]. ISIS-113715 является антисмысловым аналогом ФТО, ингибирующего синтез протеинтирозинфосфатазы IB (РТР1В), и было установлено, что показывает терапевтическую активность у больных сахарным диабетом II типа. [Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)].

Запертая нуклеиновая кислота: В запертой нуклеиновой кислоте (ЗНК) (locked nucleic acid, LNA) рибозное кольцо остова РНК структурно затрудняет увеличить связывающую способность для РНК или ДНК. Таким образом, ЗНК можно рассматривать как аналог ДНК или РНК высокой аффинности. [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)].

Фосфородиамидат морфолино олигонуклеотид: В фосфородиамидат морфолино олигонуклеотиде (ФМО) (phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide, PMO) фосфатный остов и 2-дезоксирибоза ДНК заменяются фосфорамидатом и морфолином, соответственно. [Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)]. При этом остов ДНК отрицательно заряжен, ФМО остов не заряжен. Таким образом, связывание между ФМО и мРНК не имеет электростатического отталкивания между остовами и, как правило, сильнее, чем таковое между ДНК и мРНК. Так как ФМО структурно очень сильно отличается от ДНК, ФМО не будет распознаваться печеночным(и) транспортером(ами), распознающим(ими) ДНК или РНК. При этом ФМО не легко проникает в клеточную мембрану.

Пептидная нуклеиновая кислота: Пептидная нуклеиновая кислота (ПНК) (Peptide nucleic acid, PNA) является полипептидом с N-(2-аминоэтил)глицином в качестве остовного звена и была открыта Dr. Nielsen и коллегами. [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. Химическая структура и сокращенная номенклатура ПНК иллюстрируются на представленном ниже рисунке. Подобно ДНК и РНК, ПНК также селективно связывается с комплементарной нуклеиновой кислотой. [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. При связывании с комплементарной нуклеиновой кислотой N-конец ПНК рассматривается как эквивалент «5'-конца» ДНК или РНК и С-конец ПНК как эквивалент «3'-конца» ДНК или РНК.

Подобно ФМО, остов ПНК не заряжен. Таким образом, связывание между ПНК и РНК, как правило, сильнее, чем связывание между ДНК и РНК. Так как ПНК заметно отличается от ДНК по химической структуре, ПНК не будет распознаваться печеночным(ми) транспортером(ами), распознающим(ими) ДНК, и будет показывать профиль распределения в тканях, отличный от такого для ДНК или ФТО. Однако, ПНК также плохо проникает в мембрану клеток млекопитающих. (Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280,2003).

Модифицированные нуклеиновые основания для улучшения мембранной проницаемости ПНК: ПНК была получена высоко проницаемой для мембраны клеток млекопитающих путем введения модифицированных нуклеиновых оснований с катионным липидом или его эквивалентном ковалентно к нему присоединенным. Химические структуры таких модифицированных нуклеиновых оснований приведены ниже. Было найдено, что такие модифицированные нуклеиновые основания цитозина, аденина и гуанина предсказуемо и комплементарно гибридизируются с гуанином, тимином и цитозином, соответственно. [РСТ Appl. No. PCT/KR2009/001256; ЕР2268607; US8680253].

Включение таких модифицированных нуклеиновых оснований в ПНК имеет сходство с ситуациями липофекции. При липофекции молекулы олигонуклеотида с фосфатным остовом скрыты катионными липидными молекулами, такими как липофектамин, и такие липофектамин/олигонуклеотидные комплексы склонны проникать в мембрану довольно легко по сравнению с оголенными молекулами олигонуклеотида.

Было найдено, что в дополнение к хорошей мембранной проницаемости, эти производные ПНК обладают ультра-сильным сродством к комплементарной нуклеиновой кислоте. Например, введение от 4 до 5 модифицированных нуклеиновых оснований в 11-13-мерные производные ПНК легко дало прирост T_m в 20°С или выше при дуплексном образовании с комплементарной ДНК. Такие производные ПНК очень чувствительны к ошибочному спариванию пары оснований. Ошибочное спаривание пары оснований привело к потере T_m от 11 до 22°С в зависимости от типа модифицированного основания, а также последовательности ПНК.

Малая интерферирующая РНК (siPHК) (small Interfering RNA, siRNA): Малая интерферирующая РНК (siPHК) относится к двухцепочечной РНК из 20-25 пар оснований. [Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)]. Антисмысловая цепь siPHK каким-то образом взаимодействует с белками, образуя «индуцированный РНК комплекс сайленсинга» (RNA-induced Silencing Complex, RISC). Затем RISC связывается с определенной частью мРНК, комплементарной к антисмысловой цепи siPHК. мРНК, образовавшая комплекс с RISC, подвергается расщеплению. Таким образом, siPHК каталитически индуцирует расщепление своей мишени(целевой) мРНК, и, следовательно, подавляет экспрессию белка с помощью мРНК. RISC не всегда связывается с полной комплементарной последовательностью в пределах целевой мРНК, что вызывает опасения, связанные с ненаправленными действиями лекарственного действия siPHК. Как и другие классы олигонуклеотида с остовом ДНК или РНК, siPHК обладает плохой клеточной проницаемостью и, следовательно, имеет тенденцию показывать плохую терапевтическую активность in vitro или in vivo, если должным образом не подготовлена или химически не модифицирована для получения хорошей мембранной проницаемости.

siPHК(ы) тирозиназы: Было найдено, что siPHК TYR, направленная на 19-мерную РНК последовательность в мРНК TYR человека, ингибирует экспрессию мРНК TYR и белка в эпидермальных меланоцитах человека (human epidermal melanocytes, HEMs) после липофекции при 20 нМ. siPHК подавляла мРНК TYR и белок, но не влияла на экспрессию тирозиназа-зависимых белков 1 и 2. siPHК ингибировала меланогенез, индуцированный ультрафиолетовым излучением. [ВМВ Reports, vol 42(3), 178-183 (2009)].

siPHК(ы), направленные на мишень мРНК TYR мыши, подвергли скринингу на их способность подавлять экспрессию мРНК TYR и белка, и меланогенез в клетках В16 меланомы мыши после липофекции при 40 нМ. Наиболее эффективную siPHК вводили в глазное яблоко мыши C57BL/6 и было установлено ингибирование мРНК TYR в сетчатке на примерно 60%. [Mol. Biol. International, vol 2010, Article ID 240472 (2010)].

Описание изобретения

Решаемая проблема

Имеются другие общедоступные примеры для siPHК TYR. Например, в известном уровне техники раскрыты siPHК(ы), направленные на мРНК TYR человека для лечения гиперпигментации. [US 7504385]. Тем не менее, применимость таких siPHК(т) сомнительна для использования против гиперпигментации. siPHК(ы) слишком дороги для производства, и их косметическая полезность, как правило, ограничена. Также они должны быть доставлены в кожу с помощью трансдермального введения при надлежащем соблюдении пользователем. Следует предусмотреть, что трансдермальная доставка является огромной технической проблемой в области олигонуклеотида.

Решение проблемы

Данное изобретение предлагает производное пептидной нуклеиновой кислоты, представленное формулой I, или ее фармацевтически приемлемую соль:

[Формула I]

где

n - целое число от 10 до 21;

соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;

соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека или частично комплементарно пре-мРНК TYR человека с одним или двумя ошибочными спариваниями от всего соединения формулы I;

S₁, S₂, , S_n-1, S_n, Т₁, T₂, , T_n-1 и T_n независимо обозначают атом дейтерия, атом водорода, замещенную или незамещенную алкилгруппу или замещенную или незамещенную арилгруппу;

X и Y независимо обозначают атом дейтерия, атом водорода [Н], формилгруппу [Н-С(=O)-], аминокарбонилгруппу [NH₂-C(=O)-], аминотиокарбонилгруппу [NH₂-C(=S)-], замещенную или незамещенную алкилгруппу, замещенную или незамещенную арилгруппу, замещенную или незамещенную алкилацилгруппу, замещенную или незамещенную арилацилгруппу, замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу, замещенную или незамещенную арилоксикарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкиламинокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную ариламинокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкиламинотиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную ариламинотиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилокситиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную арилокситиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилсульфонилгруппу, замещенную или незамещенную арилсульфонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилфосфонилгруппу или замещенную или незамещенную арилфосфонилгруппу;

Z обозначает атом водорода, гидроксигруппу, замещенную или незамещенную алкилоксигруппу, замещенную или незамещенную арилоксигруппу, замещенную или незамещенную аминогруппу, замещенную или незамещенную алкилгруппу или замещенную или незамещенную арилгруппу;

B₁, B₂, , B_n-1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения; и

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, , B_n-1 и B_n независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения с замещенной или незамещенной аминогруппой, ковалентно связанной с остатком нуклеинового основания.

Соединение формулы I индуцирует пропуск «экзона 2» в пре-мРНК TYR человека, дает сплайс-вариант(ы) мРНК TYR человека, не содержащий(ие) «экзона 2», и, следовательно, пригодно для ингибирования функциональной активности гена, считывающего пре-мРНК TYR человека.

Условие, что «п представляет собой целое число от 10 до 21» буквально означает, что п является целым числом, выбираемым из группы целых чисел 11, 12, 13, 14,15, 16, 17,18, 19 и 20.

Химические структуры природных нуклеиновых оснований или нуклеиновых оснований не природного происхождения в производном ПНК формулы I подтверждаются примерами на Фиг. 1а-1с. Природные (т.е. встречающиеся в природе) нуклеиновые основания или нуклеиновые основания не природного происхождения (т.е. не встречающиеся в природе), описанные в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются нуклеиновыми основаниями, представленными на Фиг. 1а-1с. Обеспечение таких нуклеиновых оснований не природного происхождения является иллюстрацией разнообразия приемлемых нуклеиновых оснований, и поэтому не должно быть истолковано для ограничения объема настоящего изобретения.

Заместители, выбранные для описания производного ПНК формулы I, приведены на фиг. 2а-2е. Фиг. 2а приводит примеры для замещенных или незамещенных алкилгрупп. Замещенные или незамещенные алкилацилгруппы и замещенные или незамещенные арилацилгруппы приведены на фиг. 2b. Фиг. 2с иллюстрирует примеры для замещенной или незамещенной алкиламиногруппы, замещенной или незамещенной ариламиногруппы, замещенной или незамещенной арилгруппы, замещенной или незамещенной алкилсульфонилгруппы или арилсульфонилгруппы. Фиг. 2d приводит примеры для замещенной или незамещенной алкилоксикарбонилгруппы или арилоксикарбонилгруппы, замещенной или незамещенной алкиламинокарбонилгруппы или ариламинокарбонилгруппы. На фиг. 2е приведены примеры для замещенной или незамещенной алкиламинотиокарбонилгруппы, замещенной или незамещенной ариламинотиокарбонилгруппы, замещенной или незамещенной алкилокситиокарбонилгруппы и замещенной или незамещенной арилокситиокарбонилгруппы. Обеспечение таких типичных заместителей является иллюстрацией разнообразия приемлемых заместителей, и поэтому не должно быть истолковано для ограничения объема настоящего изобретения. Специалист в данной области может легко додумать, что олигонуклеотидная последовательность является ключевым фактором для сиквенс-специфичного связывания олигонуклеотида с целевой последовательностью пре-мРНК по сравнению с заместителями в N-конце или С-конце.

Соединение формулы 1 прочно связывается с комплементарной ДНК, пример которой приведен в предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256]. Дуплекс между производным ПНК формулы I и его полноразмерной комплементарной ДНК или РНК обладает значением T_m слишком высоким, чтобы достоверно определить в водном буфере. Соединение ПНК формулы I дает высокие значения T_m с комплементарными ДНКами более короткой длины.

Соединение формулы I комплементарно связывается с 3' сайтом сплайсинга "экзона 2" пре-мРНК TYR человека. [NCBI Reference Sequence: NG_0008748]. 14-мерная последовательность [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] охватывает область соединения «интрона 1» и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека, и состоит из 7-мерной от "интрона 1" и 7-мерной от "экзона 2". Таким образом, 14-мерная последовательность пре-мРНК может обычно обозначаться как [(5'→3') uguacag AUUGUCU], где последовательность интрона и экзона определяется соответственно "строчными" и "заглавными" буквами и область соединения интрона-экзона выражается "". Традиционное обозначение для пре-мРНК дополнительно иллюстрируется 30-мерной последовательностью [(5'→3') ggguguuuuguacag AUUGUCUGUAGCCGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека. Кроме того, 30-мерная последовательность пре-мРНК однозначно определяет 3' сайт сплайсинга, направленный соединением формулы I в пре-мРНК TYR человека, хотя нумерация экзонов TYR может описываться иным образом.

Соединение формулы I прочно связывается с целевым 3' сайтом сплайсинга пре-мРНК TYR человека, считанного из гена TYR человека, и препятствует образованию «раннего сплайсомного комплекса», включающего целевой экзон соединения. Так как соединение, описанное в настоящем изобретении, стерически тормозит образование «раннего сплайсомного комплекса», "экзон 2" TYR сплайсируется для получения сплайс-варианта(ов) мРНК TYR, не содержащего(их) "экзона 2". Следовательно, соединение настоящего изобретения индуцирует пропуск "экзона 2" TYR.

Сильное сродство РНК позволяет соединению формулы I вызвать пропуск "экзона 2" TYR, даже если производное ПНК имеет одно или два ошибочных спаривания с целевым 3' сайтом сплайсинга в пре-мРНК TYR. Подобным образом производное ПНК формулы I все еще может индуцировать пропуск "экзона 2" TYR в мутантной пре-мРНК TYR, обладающей одним или двумя однонуклеотидными полиморфизмами (single nucleotide polymorphism, SNPs) в целевом сайте сплайсинга.

Соединение формулы I обладает хорошей клеточной проницаемостью и может быть легко доставлено в клетку как «оголенный» олигонуклеотид, примером чего является предшествующий уровень техники [PCT/KR2009/001256]. Таким образом, соединение, описанное в настоящем изобретении, индуцирует пропуск "экзона 2" в пре-мРНК TYR и дает сплайс-вариант(ы) мРНК TYR, не содержащий(ие) "экзона 2" TYR в клетках, обработанных соединением формулы I как «оголенным» олигонуклеотидом. Соединение формулы I не требует каких-либо средств или составов для доставки в клетку, чтобы мощно индуцировать пропуск целевого экзона в клетках. Соединение формулы I легко индуцирует пропуск "экзона 2" TYR в клетках, обработанных соединением, описанным в настоящем изобретении, как «оголенным» олигонуклеотидом при субфемтомолярной концентрации.

Вследствие хорошей клеточной или мембранной проницаемости, производное ПНК формулы I может местно вводиться как «оголенный» олигонуклеотид для индуцирования пропуска "экзона 2" TYR в коже. Соединению формулы I не требуется лекарственная форма для увеличения трансдермальной доставки в ткань-мишень с точки зрения надлежащей терапевтической или биологической активности. Обычно соединение формулы I растворяют в воде и сорастворителе и наружно или трансдермально вводят при субпикомолярной концентрации, чтобы вызвать желаемую терапевтическую или биологическую активность в коже-мишени. Соединение, описанное в настоящем изобретении, не обязательно должно быть интенсивно или агрессивно вводиться, чтобы вызвать топическую терапевтическую активность. Тем не менее, производное ПНК формулы I может входить в состав с косметическими ингредиентами или адъювантами в качестве наружного крема или лосьона. Такой наружный косметический крем или лосьон может быть пригоден для лечения гиперпигментации лица.

Соединение формулы I может использоваться в сочетании с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием, включая, но не ограничиваясь, гидроксид натрия, гидроксид калия, соляную кислоту, метансульфоновую кислоту, лимонную кислоту, трифторуксусную кислоту и другие.

Производное ПНК формулы I или ее фармацевтически приемлемая соль может вводиться субъекту вместе с фармацевтически приемлемым адъювантом, включая, но не ограничиваясь, лимонную кислоту, соляную кислоту, винную кислоту, стеариновую кислоту, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, этанол, изопропанол, бикарбонат натрия, дистиллированную воду, консервант(ы) и другие.

Соединение, описанное в настоящем изобретении, может вводиться местно субъекту при терапевтически или биологически эффективной концентрации в диапазоне от 1 аМ до более чем 1 нМ, которая будет варьироваться в зависимости от схемы приема препарата, состояний или ситуаций субъекта, и так далее.

Предпочтительным является производное ПНК формулы I или ее фармацевтически премлемая соль:

где

n - целое число от 10 до 21;

соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;

соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека или частично комплементарно пре-мРНК TYR человека с одним или двумя ошибочными спариваниями от всего соединения формулы I;

S₁, S₂, , S_n-1, S_n, T₁, T₂, , T_n-1 и T_n независимо обозначают атом дейтерия или атом водорода;

X и Y независимо обозначают атом дейтерия, атом водорода, формилгруппу, аминокарбонилгруппу, аминотиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилгруппу, замещенную или незамещенную арилгруппу, замещенную или незамещенную алкилацилгруппу, замещенную или незамещенную арилацилгруппу, замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу, замещенную или незамещенную арилоксикарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкиламинокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную ариламинокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкиламинотиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную ариламинотиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилокситиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную арилокситиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилсульфонилгруппу, замещенную или незамещенную арилсульфонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилфосфонилгруппу или замещенную или незамещенную арилфосфонилгруппу;

Z обозначает атом водорода, гидроксигруппу, замещенную или незамещенную алкилоксигруппу, замещенную или незамещенную арилоксигруппу или замещенную или незамещенную аминогруппу;

B₁, B₂, , B_n-1, B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения;

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, , B_n-1, B_n, независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV:

где

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ независимо выбраны из атома водорода и замещенной или незамещенной алкилгруппы;

L₁, L₂ и L₃ являются ковалентным линкером, представленным формулой V, ковалентно соединяющий основную аминогруппу с остатком нуклеинового основания:

где

Q₁ и Q_m представляют собой замещенную или незамещенную метиленгруппу (-СН₂-) и Q_m непосредственно связывается с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, , Q_m-1, независимо выбраны из замещенной или незамещенной метиленгруппы, атома кислорода (-O-), атома серы (-S-) и замещенной или незамещенной аминогруппы [-N(H)- или -N(заместитель)-]; и

m - целое число от 1 до 15.

Представляет интерес олигомер ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемая соль:

где

n - целое число от 11 до 18;

соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;

соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека;

S₁, S₂, , S_n-1, S_n, T₁, T₂, , T_n-1 и T_n представляют собой атом водорода;

X и Y независимо обозначают атом водорода, замещенную или незамещенную алкилгруппу, замещенную или незамещенную арилруппу, замещенную или незамещенную алкилацилгруппу, замещенную или незамещенную арилацилгруппу,замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу или замещенную или незамещенную арилоксикарбонилгруппу;

Z обозначает замещенную или незамещенную аминогруппу;

B₁, B₂, , B_n-1, B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения;

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, , B_n-1, B_n независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ независимо выбраны из атома водорода и замещенной или незамещенной алкилгруппы;

Q₁ и Q_m представляют собой замещенную или незамещенную метиленгруппу и Q_m непосредственно связывается с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, и Q_m-1 независимо выбраны из замещенной или незамещенной метиленгруппы, атома кислорода и аминогруппы; и

m - целое число от 1 до 11.

Представляет интерес производное ПНК формулы I или ее фармацевтически приемлемая соль:

где

n - целое число от 11 до 16;

соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;

соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека;

S₁, S₂, , S_n-1, S_n, T₁, T₂, , , T_n-1 и T_n представляют собой атом водорода;

X и Y независимо выбраны из атома водорода, замещенной или незамещенной алкилацилгруппы или замещенной или незамещенной алкилоксикарбонилгруппы;

Z обозначает замещенную или незамещенную аминогруппу;

B₁, B₂, , B_n-1, B_n, независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения;

по меньшей мере четыре из B₁, B₂, , B_n-1, B_n, независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ независимо выбраны из атома водорода и замещенной или незамещенной алкилгруппы;

Q₁ и Q_m представляет собой метиленгруппу и Q_m непосредственно связана с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, и Q_m-1 независимо выбраны из метиленгруппы, атома кислорода и аминогруппы; и

m - целое число от 1 до 9.

Представляет интерес олигомер ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемая соль:

где

n - целое число от 11 до 16;

соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;

соединение формулы I полностью комплементарно TYR пре-мРНК человека;

S₁, S₂, , S_n-1, S_n, T₁, T₂, , T_n-1 и T_n представляют собой атом водорода;

X и Y независимо выбраны из атома водорода, замещенной или незамещенной алкилацилгруппы или замещенной или незамещенной алкилоксикарбонилгруппы;

Z обозначает замещенную или незамещенную аминогруппу;

B₁, В₂, , B_n-1 и B_n независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения;

по меньшей мере четыре из B₁, В₂, , B_n-1 и B_n независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₃ и R₅ представляют собой атом водорода и R₂, R₄ и R₆ независимо обозначают атом водорода или замещенную или незамещенную алкилгруппу;

Q₁ and Q_m представляют собой метиленгруппу и Q_m непосредственно связана с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, и Q_m-1 независимо выбраны из метиленгруппы, атома кислорода; и

m - целое число от 1 до 9.

Представляет интерес производное ПНК формулы I или ее фармацевтически приемлемая соль:

где

n - целое число от 11 до 16;

соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;

соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека;

S₁, S₂, , S_n-1, S_n, T₁, T₂, , T_n-1 и T_n представляют собой атом водорода;

X и Y независимо выбраны из атома водорода, замещенной или незамещенной алкилацилгруппы или замещенной или незамещенной алкилоксикарбонилгруппы;

Z обозначает замещенную или незамещенную аминогруппу;

B₁, В₂, , B_n-1 и B_n независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и нуклеиновых оснований не природного происхождения;

по меньшей мере пять из B₁, В₂, , B_n-1 и B_n независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ являются атомами водорода;

Q₁ and Q_m представляют собой метиленгруппу и Q_m непосредственно связана с основной аминогруппой;

Q₂, Q₃, и Q_m-1 независимо выбраны из метиленгруппы, атома кислорода; и

m - целое число от 1 до 9.

Представляет интерес производное ПНК формулы I или ее фармацевтически приемлемая соль:

где

n - целое число от 11 до 16;

соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;

соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека;

S₁, S₂, , S_n-1, S_n, T₁, T₂, , T_n-1 и T_n представляют собой атом водорода;

X является атомом водорода;

Y обозначает замещенную или незамещенную алкилацилгруппу или замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу;

Z обозначает замещенную или незамещенную аминогруппу;

B₁, B₂, , B_n-1 и B_n независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и нуклеиновых оснований не природного происхождения;

по меньшей мере пять из B₁, B₂, , B_n-1 и B_n независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ являются атомами водорода;

L₁ обозначает -(СН₂)₂-O-(СН₂)₂-группу, -СН₂-O-(СН₂)₂-группу, -СН₂-O-(СН₂)₃-группу, -СН₂-O-(СН₂)₄-группу или -СН₂-O-(СН₂)₅-группу с правым концом, непосредственно связанным с основной аминогруппой; и

L₂ и L₃ независимо выбраны из -(СН₂)₂-O-(СН₂)₂-группы, -(СН₂)₃-O-(СН₂)₂-группы, -(СН₂)₂-O-(СН₂)₃-группы, -(СН₂)₂-группы, -(СН₂)₃-группы, -(СН₂)₄-группы, -(СН₂)₅-группы, -(СН₂)₆-группы, -(СН₂)₇-группы и -(СН₂)₈-группы с правым концом, непосредственно связанным с основной аминогруппой.

Представляет интерес производное ПНК формулы I, которое выбрано из группы соединений, представленных ниже, или ее фармацевтически приемлемая соль:

(N→C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc-AC(1/2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1/2)C-NH₂;

(N→C) Ac-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Benzoyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Piv-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Methyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) n-Propyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Fmoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) H-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc-Lys-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Lys-NH₂;

(N→C) Fethoc-Val-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Ac-Arg-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Benzyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Phenyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Benzoyl-Leu-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Piv-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Val-NH₂;

(N→C) Fethoc -CA(7)G-AC(2O2)A-A(4)TC(1O2)-TG(6)T-A-NH₂;

(N→C) Fethoc -CTG(6)-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc -CA(5)G-ATA(5)-ATC(1O2)-TG(5)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc -TA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc -TCA(3)-GAC(1O5)-A(5)AT-C(1O2)TG(5)-TA(5)-NH₂;

(N→C) Fethoc -CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)C-NH₂;

(N→C) Fethoc -AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-C-NH₂;

(N→C) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(lO2)T-G(6)TA(5)-CA(2O2)A-NH₂;

(N→C) Fethoc -AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH₂;

(N→C) Fethoc -AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH₂;

(N→C) Fethoc-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH₂;

(N→C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O3)-A-NH₂;

(N→C) Fethoc-GC(1O4)T-AC(1O2)A-GA(4)C-AAT-CTG(6)-TA(6)C-NH₂;

(N→C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-AAT-C(1O2)TG-NH₂;

(N→C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-G(2O2)AC-A(5)AT-C(1O2)TG-NH₂; и

(N→C)Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-A(2O2)AT-C(1O2)TG-NH₂:

где

A, G, T и С представляют собой мономеры ПНК с природным нуклеиновым основанием аденином, гуанином, тимином и цитозином, соответственно;

C(pOq), А(р), A(pOq), G(p) и G(pOq) представляют собой мономеры ПНК с нуклеиновым основанием не природного происхождения, представленным формулой VI, формулой VII, формулой VIII, формулой IX и формулой X, соответственно;

где

р и q - целые числа; и

сокращения N- и С-концевых заместителей конкретно описаны как указано далее: "Fmoc-" представляет собой сокращение для "[(9-фторенил)метилокси]карбонилгруппы"; "Fethoc-" для "[2-(9-фторенил)этил-1-окси]карбонилгруппы"; "Ас-" для "ацетилгруппы"; "Benzoyl-" для "бензолкарбонилгруппы"; "Piv-" для "пивалилгруппы"; "Methyl-" для "метилгруппы"; "n-Propyl-" для "1-(н-пропил)группы"; "Н-" для " атома водорода"; "p-Toluenesulfonyl" для "(4-метилбензол)-1-сульфонилгруппы"; "-Lys-" для аминокислотного остатка "лизин"; "-Val-" для аминокислотного остатка "валин"; "-Leu-" для аминокислотного остатка "лейцин"; "-Arg-" для аминокислотного остатка "аргинин"; "-Gly-" для аминокислотного остатка "глицин"; "[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-" для "[N-1-(2-фенилэтил)амино]карбонилгруппы"; "Benzyl-" для "1-(фенил)метилгруппы"; "Phenyl-" для "фенилгруппы"; "Ме-"для "метилгруппы"; и "-NH₂" для незамещенной "аминогруппы".

Фиг. 3 в совокупности и недвусмысленно представляет химические структуры для мономеров ПНК, сокращенных как A, G, Т, С, C(pOq), А(р), A(pOq), G(p) и G(pOq). Как обсуждалось в предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256], C(pOq) рассматривается как мономер ПНК с "модифицированным цитозином" вследствие его гибридизации в "гуанин". А(р) и A(pOq) принимаются за мономеры ПНК с "модифицированным аденином" при их гибридизации в "тимин". Таким же образом G(p) и G(pOq) рассматриваются как мономеры ПНК с "модифицированным гуанином" при спаривания оснований их с "цитозином".

Фиг. 4 однозначно иллюстрирует химические структуры для различных сокращений для заместителей, используемых для разнообразия N-конца или С-конца производного ПНК формулы I в данном изобретении.

Для того, чтобы проиллюстрировать сокращения, применяемые для таких производных ПНК, химическая структура для 13-мерного производного ПНК, сокращенного как "(N→C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂", приведена на фиг.5 а. В качестве еще одной иллюстрации, химическая структура для 15-мерного производного ПНК, сокращенного как "(N→С)

Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH₂", приведена на фиг. 5b.

13-мерная последовательность ПНК "(N→С) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂", указанная на фиг. 5а, эквивалентна последовательности ДНК "(5'→3') CAG-ACA-ATC-TGT-A" для комплементарного связывания с пре-мРНК. 13-мерная ПНК имеет 13-мерное комплементарное перекрывание с 13-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') ggguguuuuguacag AUUGUCUGUAGCCGA1. охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека.

15-мерная последовательность ПНК "(N→С) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH₂", указанная на фиг. 5b, эквивалентна последовательности ДНК "(5'→3') AGA-CAA-TCT-GTA-CAA" для комплементарного связывания с пре-мРНК. 15-мерная ПНК имеет 15-мерное комплементарное перекрывание с 15-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') ggguguuuuguacag AUUGUCUGUAGCCGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека.

17-мерная последовательность ПНК "(N→С) Fethoc-AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH₂" эквивалентна последовательности ДНК "(5'→3') ACT-GAC-TAT-CTG-TAC-AA" для комплементарного связывания с пре-мРНК. 17-мерная ПНК имеет 15-мерное комплементарное перекрывание с 15-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') ggguguuuuguacag AU"U"GUC"U"GUAGCCGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека. Два ошибочных спаривания отмечены символом, заключенным в кавычки, т.е."".

Одним из аспектов настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающая производное пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением.

Одним из аспектов настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для лечения гиперпигментации, включающая производное пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. Примеры гиперпигментации, вызванной сверхсинтезом меланина, включают меланодермию, послеугревые рубцы, печеночные пятна, лентиго, возрастные пятна и актиническое повреждение.

Одним из аспектов настоящего изобретения является способ лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. Путь введения может быть, например, местным применением.

Одним из аспектов настоящего изобретения является способ лечения гиперпигментации, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. Путь введения может быть, например, местным применением.

Одним из аспектов настоящего изобретения является применение производного пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением при получении медикамента для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека.

Одним из аспектов настоящего изобретения является применение производного пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением при получении медикамента для лечения гиперпигментации. Краткая расшифровка фигур

Фиг. 1а-1с. Примеры природных нуклеиновых оснований или нуклеиновых оснований не природного происхождения (модифицированных), выбираемых для производного пептидной нуклеиновой кислоты формулы I.

Фиг. 2а-2е. Примеры заместителей, выбираемых для производного пептидной нуклеиновой кислоты формулы I.

Фиг. 3. Химические структуры мономеров ПНК с природным или модифицированным нуклеиновым основанием.

Фиг. 4. Химические структуры для сокращений N- или С-концевых заместителей.

Фиг. 5а. Химическая структура 13-мерного производного ПНК "(N→С) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂".

Фиг. 5b. Химические структуры 15-мерного производного ПНК "(N→С) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH₂".

Фиг. 6. Химические структуры мономеров Fmoc-ПНК, применяемых для синтеза производных ПНК данного изобретения.

Фиг. 7а-7b. С₁₈-обращенно-фазовые ВЭЖХ хроматограммы"ASO 1" до и после ВЭЖХ очистки, соответственно.

Фиг. 8. ESI-TOF масс-спектр "ASO 1", очищенного C₁₈-RP препаративной ВЭЖХ.

Фиг. 9а. Электрофоретический анализ продуктов вложенной ПЦР в клетках B16F10 меланомы мыши, обработанных 0 (негативный контроль), 1,10 или 1000 аМ "ASO 1М".

Фиг. 9b. Данные секвенирования по Сенгеру для продукта ПЦР, приписанного пропуску экзонов (2-3).

Фиг. 10а. Изменения в полноразмерном уровне мРНК TYR с помощью кПЦР в клетках B16F10 меланомы мыши, обработанных "ASO 1М" при 0 (негативный контроль), 1, 10, 100 или 1000 аМ (величина ошибки по стандартной погрешности).

Фиг. 10b. Данные вестерн-блота TYR в клетках B16F10 меланомы мыши, обработанных в течение 24 часов "ASO 1М" при 0 zM (негативный контроль), 10 zM, 100 zM, 1 аМ или 10 аМ (т.е. 10000 zM).

Фиг. 11. Изменения содержания меланина в клетках B16F10 меланомы мыши, обработанных или "ASO 1М" при 1, 10, 100 или 1000 аМ, или 10 мкг/мл, или 100 мкг/мл арбутина (величина ошибки по стандартной погрешности).

Фиг. 12. Изменения в полноразмерном уровне мРНК TYR с помощью кПЦР в первичных эпителиальных меланоцитах человека, обработанных "ASO 1" при 0 zM (негативный контроль), 1 zM, 100 zM или 10 аМ. (величина ошибки по стандартной погрешности).

Лучший вариант осуществления изобретения

Общие методики приготовления олигомеров ПНК

Олигомеры ПНК синтезировали с помощью твердофазного пептидного синтеза (solid phase peptide synthesis, SPPS), основанного на Fmoc-химии в соответствии со способом, раскрытым в предшествующем уровне техники [US6,133,444; WO96/40685] с незначительными, но требуемыми изменениями. Твердая подложка, применяемая в данном исследовании, представляла собой амидную смолу H-Rink Amide-ChemMatrix, закупленную в PCAS BioMatrix Inc. (Квебек, Канада). Мономеры Fmoc-ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием синтезировали, как описано в предшествующем уровне техники [PCT/KR 2009/001256] или с незначительными изменениями. Для синтеза производных ПНК настоящего изобретения использовались такие мономеры Fmoc-ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием и мономеры Fmoc-ПНК с нуклеиновым основанием природного происхождения. Олигомеры ПНК очищали с помощью С^-обращенно-фазовой ВЭЖХ (вода/ацетонитрил или вода/метанол с 0,1% TFA) и характеризовали масс-спектрометрией, включая ESI/TOF/MS.

Схема 2 иллюстрирует типичный цикл удлинения мономеров, принятый в SPPS данного исследования, и синтетические детали (тонкости) приведены ниже. Однако, для специалиста в данной области имеется много незначительных изменений, очевидно, возможных при эффективном проведении таких реакций SPPS на автоматическом пептидном синтезаторе или неавтоматическом пептидном синтезаторе. Каждая стадия реакции в схеме 2 кратко представлена, как изложено ниже.

Схема 2

[Активация смолы H-Rink-ChemMatrix] 0,01 ммоль (примерно 20 мг смолы) смолы ChemMatrix в 1,5 мл 20% пиперидина/DMF встряхивали в «libra» пробирке в течение 20 мин, и DeFmoc раствор отфильтровывали. Смолу промывали в течение 30 сек последовательно каждый раз 1,5 мл хлористого метилена (methylene chloride, МС), 1,5 мл диметилформамида (dimethylformamide, DMF), 1,5 мл МС, 1,5 мл DMF и 1,5 мл МС. Полученные свободные амины на твердой подложке подвергали взаимодействию или с мономером Fmoc-ПНК, или с производным Fmoc-защищенной аминокислоты.

[DeFmoc] Смолу встряхивали в 1,5 мл 20% пиперидина/DMF в течение 7 мин, и DeFmoc раствор отфильтровывали. Смолу промывали в течение 30 сек последовательно каждый раз 1,5 мл МС, 1,5 мл DMF, 1,5 мл МС, 1,5 мл DMF и 1,5 мл МС. Полученные свободные амины на твердой подложке тотчас подвергали взаимодействию с мономером Fmoc-ПНК.

[Взаимодействие с мономером Fmoc-ПНК] Свободные амины на твердой подложке взаимодействовали с мономером Fmoc-ПНК следующим образом. 0,04 ммолей мономера ПНК, 0,05 ммолей HBTU и 10 ммолей DIEA инкубировали в течение 2 мин в 1 мл безводного DMF и прибавляли к смоле со свободными аминами. Раствор смолы встряхивали в течение 1 часа и реакционную смесь фильтровали. Затем смолу промывали 30 сек последовательно каждый раз 1,5 мл МС, 1,5 мл DMF и 1,5 мл МС. Химические структуры мономеров Fmoc-ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием, используемом в данном изобретении, представлены на фиг. 6. Мономеры Fmoc-ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием, представленные на фиг. 6, должны быть приняты в качестве примеров и, следовательно, не должны рассматриваться для ограничения объема данного изобретения. Специалист в данной области может легко догадаться о целом ряде изменений в мономерах Fmoc-ПНК для синтеза производного ПНК формулы I.

[Кэпирование] После реакции связывания непрореагированные свободные амины кэпированы при встряхивании в течение 5 минут в 1,5 мл кэпированного раствора (5% уксусный ангидрид и 6% 2,6-лейтидин в DMF). Затем кэпированный раствор отфильтровывали и промывали в течение 30 сек последовательно каждый раз 1,5 мл МС, 1,5 мл DMF и 1,5 мл МС.

[Введение группы "Fethoc-" в N-конец] Группу "Fethoc-" вводили в N-конец при взаимодействии свободного амина на смоле с "Fethoc-OSu" при основных условиях связывания. Химическая структура "Fethoc-OSu" [CAS No. 179337-69-0, C₂₀H₁₇NO₅, М.В.351,36] приведена, как указано ниже.

[Отщепление смолы] Олигомеры ПНК, связанные со смолой, отщепляли от смолы встряхиванием в течение 3 часов в 1,5 мл отщепляющего раствора (2,5% три-изопропилсилана и 2,5% воды в трифторуксусной кислоте). Смолу отфильтровывали и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток растирали в порошок с помощью диэтилового эфира и полученный осадок собирали с помощью фильтрации для очистки обращенно-фазовой ВЭЖХ.

[Анализ ВЭЖХ и очистка] После отщепления смолы технический продукт производного ПНК очищали с помощью C₁₈-обращенно-фазовой ВЭЖХ, элюируя водой/ацетонитрилом или водой/метанолом (градиентный метод), содержащих 0,1% TFA. Фиг. 7а и 7b представляют типичные хроматограммы ВЭЖХ для "ASO 1" до и после очистки ВЭЖХ, соответственно. Последовательность олигомера "ASO 1" является такой, как представлено в таблице 1.

Синтетические примеры для производного ПНК формулы I

Для того, чтобы комплементарно целенаправленно воздействовать на 3' сайт сплайсинга "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека, производное ПНК данного изобретения получали согласно методам синтеза, приведенным выше, или с незначительными изменениями. Предоставление таких производных ПНК, целенаправленно воздействующих на пре-мРНК TYR человека, является примером производных ПНК формулы I, и не должно быть истолковано для ограничения объема данного изобретения.

Таблица 1 приводит производные ПНК, комплементарно целенаправленно воздействующие на 3' сайт сплайсинга "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека, считанной с гена TYR человека [Стандартная/эталонная последовательность NCBI (Национального центра биотехнологической информации): NG_0008748], а также данные по структурному исследованию с помощью масс-спектрометрии. Предоставление ASOs TYR в таблице 1 является примером производных ПНК формулы I, и не должно быть истолковано для ограничения объема данного изобретения.

"ASO 1" имеет 13-мерное комплементарное перекрывание с 13-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в пределах 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') ggguguuuuguacag AUUGU-CUGUAGCCGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека. Таким образом, "ASO 1" имеет 5-мерное перекрывание с "интроном 1" и 8-мерное перекрывание с "экзоном 2" в пределах пре-мРНК TYR человека.

Таблица 2 приводит "ASO 1М", комплементарно целенаправленно воздействующий на 3' сайт сплайсинга "экзона 2" в пре-мРНК TYR мыши, считанной с геномной ДНК мыши [обеспеченный доступ к Стандартной/эталонной последовательности NCBI: NC_000073], а также данные по структурному исследованию с помощью масс-спектрометрии. Предоставление "ASO 1М" состоит в том, чтобы оценить антисмысловую активность в клетках мышиного происхождения.

30-мерную последовательность РНК [(5'→3') aauuguuuuucacag AUCAUUUGUAGCAGA], охватывающую область соединения интрона 1 и экзона 2 в пре-мРНК TYR мыши, считывали с гена TYR мыши. [Номер доступа гена NCBI: NC_000073].

"ASO 1М" эквивалентна последовательности ДНК "(5'→3') CAA-ATG-ATC-TGT-G" для комплементарного связывания с пре-мРНК. "ASO 1М" имеет 13-мерное комплементарное перекрывание с 13-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в пределах 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') aauuguuuuucacag AUCAUUUGUAGCAGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR мыши.

Подобно "ASO 1" против пре-мРНК TYR человека, "ASO 1М" обладает 5-мерным перекрыванием с "интроном 1" и 8-мерным перекрыванием с "экзоном 2" в пределах пре-мРНК TYR мыши. "ASO 1М" может служить в качестве хорошего заместительного (имитирующего) соединения для антисмысловой активности "ASO 1" в клетках человеческого происхождения.

Фиг. 7а представляет собой ВЭЖХ хроматограмму, полученную для технического (неочищенного) продукта "ASO 1". Неочищенный продукт очищали C₁₈-RP препаративной ВЭЖХ. Фиг. 7b представляет собой хроматограмму ВЭЖХ для очищенного продукта "ASO 1". Чистота "ASO 1" заметно улучшилась после очистки препаративной ВЭЖХ. Фиг. 8 приводит масс-спектр ESI-TOF, полученный для очищенного продукта "ASO 1". Предоставление аналитических данных для "ASO 1" состоит в том, чтобы проиллюстрировать как производные ПНК формулы I были очищены и идентифицированы в настоящем изобретении, и не должно быть истолковано для ограничения объема данного изобретения.

Связывающая аффинность типичных производных ПНК для комплементарной ДНК

Производные ПНК в таблицах 1 и 2 оценивали по их связывающей аффинности для 10-мерных ДНК(т), комплементарно целенаправленно воздействующих или на N-конец или С-конец. Связывающую аффинность оценивали с помощью величины T_m для дуплекса между ПНК и 10-мерной комплементарной ДНК. Дуплекс между производными ПНК и полностью комплементарными ДНК(тами) показывают величины T_m слишком высокими, чтобы можно было надежно определить в водном буферном растворе, так как буферный раствор склонен кипеть во время измерения T_m.

Величины T_m определяли на спектрометре с УФ и видимой областями спектра следующим образом. Смешанный раствор 4 мкмоль олигомера ПНК и 4 мкмоль комплементарной 10-мерной ДНК в 4 мл водного буфера (рН 7, 16, 10 ммоль фосфата натрия, 100 ммоль NaCl) в 15 мл полипропиленовой пробирке фирмы Falcon инкубировали при 90°С в течение минуты и медленно охлаждали до обычной температуры. Затем раствор переносили в 3 мл кварцевую UV кювету, снабженную герметичной крышкой, и подвергали измерению T_m при 260 нм на спектрофотометре с УФ и видимой областями спектра, как описано в предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256] или с незначительными изменениями. 10-мерные комплементарные ДНК(ы) для измерения T_m приобретали от Bioneer (www.bioneer.com, Dajeon, Республика Корея) и использовали без дополнительной очистки.

Наблюдаемые величины T_m производных ПНК формулы I очень высоки для комплементарного связывания с 10-мерной ДНК и приведены в таблице 3. Например, "ASO 1" показал значение T_m, равную 78,0°С, для дуплекса с 10-мерной комплементарной ДНК, целенаправленно воздействующей на 10-мерный N-конец в ПНК, обозначенный "жирным шрифтом" и "подчеркнутый" в [(N→С) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂]. Одновременно, "ASO 1" показал T_m, равную 73,0°C, для дуплекса с 10-мерной комплементарной ДНК, целенаправленно воздействующей на 10-мерный С-конец в ПНК, обозначенный "жирным шрифтом" и "подчеркнутый" в [(N→С) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂].

Примеры биологических активностей производных ПНК формулы I

Производные ПНК в данном изобретении оценивали in vitro на антисмысловые активности TYR в клетках B16F10 меланомы мыши и меланоцитах человека. Биологические примеры предусмотрены в качестве примеров для иллюстрации биологических профилей производных ПНК формулы I, и поэтому не должны быть истолкованы для ограничения объема нынешнего изобретения.

Пример 1. Пропуск экзона, индуцируемый "ASO 1М".

"ASO 1М", точно определенный в таблице 2, имеет 13-мерное комплементарное перекрывание с 13-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в пределах 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') aauuguuuuucacag AUCAUUUGUAGCAGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR мыши. Одновременно, "ASO 1М" обладает 9-мерной комплементарностью наряду с 4 ошибочными спариваниями, обозначенными "жирным шрифтом" и "подчеркнутых" в пределах 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') ggguguuuug"u"acag AU"UG"U"C"UGUAGCCGA1. охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека. 4 ошибочные спаривания отмечены кавычками (" ").

"ASO 1М" оценивали на его способность индуцировать пропуск "экзона 2" TYR в клетках B16F10 меланомы мыши, несмотря на то, что "ASO 1М" обладает 4 ошибочными спариваниями с 3' сайтом сплайсинга "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека. "ASO 1М", который полностью комплементарен пре-мРНК TYR мыши, может служить в качестве хорошего заместительного (имитирующего) соединения для "ASO 1", который полностью комплементарен пре-мРНК TYR человека. [Культура клеток и обработка ASO] Клетки B16F10 меланомы мыши (Cat. Number CRL-6475, АТСС) поддерживали в DMEM (модифицированная по способу Дульбекко минимальная эссенциальная среда Игла), подкрепленная 10% FBS, 1% стрептомицина/пенициллина и 0,01 мг/мл бычьего инсулина. Клетки B16F10, выращенные в 60 мм чашке для культивирования, содержащей 5 мл DMEM, инкубировали в течение 5 часов с "ASO 1М" при 0 (негативный контроль), 1, 10, 100 или 1000 аМ.

[Экстракция РНК и синтез кДНК с помощью одностадийной ПЦР] После инкубирования в течение 5 часов, суммарную РНК экстрагировали с помощью "Универсального набора для экстракции РНК" (Cat. Number 9767, Takara) согласно инструкциям производителя. 200 нг матричной РНК использовали для 25 мкл реакции обратной транскрипции с помощью Super Script^® Набор одностадийной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией с Platinum^® ДНК-полимеразы Taq (Cat. No. 10928-042, Invitrogen) против набора экзон-специфичных праймеров [экзон 1_прямой: (5'→3') GTAAGTTTGGATTTGGGG; и экзон 4_обратный: (5'→3') AGAGC-GGTATGAAAGGAA] согласно следующим условиям цикла: 50°С в течение 30 мин и 94°С в течение 2 мин с последующими 15 циклами по 30 сек при 94°С, 30 сек при 52°С и 40 сек при 72°С.

[Вложенная ПЦР-амплификация] 1 мкл кДНК дополнительно амплифицировали в 20 мкл вложенной ПЦР (Cat. No. K2612, Bioneer) против набора праймеров [экзон 1n_прямой: (5'→3') GAGAACTAACTGGGGATGA; и экзон 4n_обратный: (5'→3') CGATAGGTGCATTGGCTT] согласно условиям цикла, точно определенного, как указано ниже: 95°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами по 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С и 40 сек при 72°С.

[Идентификация продуктов пропуска экзона] Продукты ПЦР подвергали электрофоретическому разделению на 2% агарозном геле. Полосы необходимого размера собирали и анализировали секвенированием по Сенгеру.

Фиг. 9а приводит электрофоретические данные продуктов ПЦР. Клетки без обработки "ASO 1М" давали две интенсивные ПЦР полосы, одна для полноразмерной мРНК TYR и другая для сплайс-варианта мРНК TYR, не содержащей экзоны 2 и 3. Таким образом, полагают, что пропуск экзонов 2-3 происходит спонтанно. Клетки, обработанные "ASO 1М" при 1 до 1000 аМ, однако, давали только вариант сплайсинга мРНК TYR, не содержащей экзоны 2 и 3. Таким образом, "ASO 1М" повышает склонность к пропуску экзонов 2-3 в клетках B16F10 меланомы. Продукт ПЦР пропуска экзонов секвенировали для пропуска экзонов 2-3, как показано на фиг. 9b.

Пример 2. кПЦР для мРНК TYR в клетках B16F10 меланомы мыши, обработанных "ASO 1М".

"ASO 1М" оценивали с помощью вложенной кПЦР TYR на его способность индуцировать изменения в уровне мРНК TYR мыши в клетках B16F10, как описано ниже.

[Культура клеток и обработка ASO] Клетки B16F10, выращенные в 60 мм чашке для культивирования, содержащей 5 мл DMEM, обрабатывали "ASO 1М" при 0 (негативный контроль), 1, 10,100 или 1000 аМ (2 чашки для культивирования на дозу).

[Экстракция РНК и синтез кДНК с помощью одностадийной ПЦР] После инкубирования с "ASO 1М" в течение 5 часов, суммарную РНК экстрагировали из клеток, используя "Универсальный набор для экстракции РНК " (Cat. No. 9767, Takara) согласно инструкциям производителя. 200 нг матричной РНК использовали для 25 мкл реакции обратной транскрипции с помощью Набора одностадийной RT-PCR (Invitrogen, США) против Набора экзон-специфичных праймеров [экзон 1 прямой: (5'→3') GTAAGTTTGGATTTGGGG; и экзон 4_обратный: (5'→3')

AGAGCGGTATGAAAGGAA] согласно следующим условиям цикла: 50°С в течение 30 мин и 94°С в течение 2 мин с последующими 15 циклами по 30 сек при 94°С, 30 сек при 52°С и 40 сек при 72°С.

[Вложенная кПЦР-амплификация] Растворы кДНК разбавляли в 100 раз и 1 мкл каждого разбавленного продукта ПЦР подвергали реакции 20 мкл ПЦР в режиме реального времени с набором зондов Taqman, охватывающих область соединения экзона 2 и экзона 3 (Cat. No. Mm00495818_m1, Thermo Fisher Scientific) согласно следующим условиям цикла: 95°С в течение 3 мин с последующими 30 циклами по 10 сек при 95°С и 30 сек при 60°С.

[Статистический анализ] Эксперимент вложенной кПЦР независимо повторяли 4 раза и индивидуальные уровни мДНК от каждого эксперимента нормализовали против уровня мДНК без обработки "ASO 1М". Уровни мДНК, полученные из всех 4 отдельных экспериментов объединяли для статистического анализа с помощью параметрического t-критерия Стьюдента. Таким образом, количество образцов РНК составляет 8 для каждой концентрации.

Фиг. 10а приводит объединенные данные кПЦР, в которых уровень полноразмерный мДНК существенно снизился на 40% в клетках, обработанных "ASO 1М" при от 1 до 1000 аМ.

Пример 3. Ингибирование экспрессии белка TYR в клетках B16F10 меланомы с помощью "ASO 1М".

"ASO 1М" оценивали по его способности подавлять экспрессию белка TYR в клетках B16F10 меланомы мыши, как описано ниже.

Клетки B16F10, выращенные в 60 мм чашке для культивирования, содержащей 5 мл DMEM, обрабатывали "ASO 1М" при 0 zM (негативный контроль), 10 zM, 100 zM, 1 аМ или 10 аМ. Через 24 часа клетки промывали 2 раза холодным фосфатно-солевым буферным раствором (phosphate buffered saline, PBS) и затем подвергали лизису с 200 мкл 1X буфера для лизиса клеток (Cat. No. 9803, Cell Signaling Tech), дополненного смесью ингибиторов 1X протеаз (Cat. No. Р8340, Sigma). 200 мкл каждого лизата в 1,5 мл е-трубке смешивали с 100 мкл 5Х буфера для образца и кипятили при 100°С в течение 5 минут. 20 мкл лизата подвергали электрофоретическому разделению на 4-15% градиентном геле TGX (Cat No. 456-1086, Bio-Rad) и белок переносили на 0,45 мкм PVDF мембрану. Мембрану испытывали анти-TYR антителом (Cat. No. 9319, Cell Signaling Tech) и анти-β-актиновым антителом (Cat. No. a3845, Sigma).

Фиг. 10b приводит данные вестерн-блота для экспрессии белка TYR в клетках B16F10. Интенсивность полосы экспрессии TYR была существенно слабее в лизатах с обработкой "ASO 1М", чем в лизатах без обработки "ASO 1М", т.е. негативный контроль. Белок TYR и уровень мРНК уменьшались соизмеримо при обработке ASO. (срав. "Пример 2").

Пример 4. Ингибирование меланогенеза в клетках B16F10 меланомы с помощью "ASO 1М"

"ASO 1М" оценивали на его способность ингибировать меланогенез в клетках B16F10 меланомы мыши, как описано ниже.

Клетки B16F10, субкультивированные в 60 мм чашке для культивирования, содержащей 5 мл DMEM, ничем не обработали (негативный контроль), и обработали "ASO 1М" при 1 до 1000 аМ или с 10 или 100 мкг/мл арбутина в качестве положительного контроля (2 чашки для культивирования на дозу). Через 24 часа клетки промывали 2 раза холодным фосфатно-солевым буферным раствором и подвергали лизису с 200 мкл 1N NaOH. Каждый лизат собирали в 1,5 мл е-трубку и выдерживали в течение ночи при комнатной температуре. Содержание меланина в каждом лизате определяли абсорбцией при 475 нм на ELISA ридере. Такой же эксперимент повторили четыре раза, используя клетки при различном пассировании. Четыре набора данных содержания меланина объединили для статистического анализа с помощью параметрического t-критерия Стьюдента против содержания меланина без обработки (негативный контроль).

Фиг. 11 обобщает изменения содержания меланина в клетках B16F10 после 24 часов инкубирования или с "ASO 1М", или с арбутином. Содержание меланина существенно уменьшилось на около 15% и 25%в клетках, обработанных 10 мкг/мл и 100 мкг/мл арбутина, соответственно. В случае клеток, обработанных "ASO 1М", содержание меланина значительно снизилось на около 15% без заметной зависимости от дозировки. Ингибирующая активность "ASO 1М" была сравнима с таковой для 10 мкг/мл арбутина.

Пример 5. Получение крема для топического применения, содержащего соединение формулы I

Соединение формулы I, например "ASO 2", входил в состав крема для топического применения субъектами. Крем для топического применения получали как описано ниже. Принимая во внимание то, что имеется немереное количество возможных вариантов кремов для топического применения, данный препарат должен быть принят в качестве примера и не должен быть истолкован для ограничения объема нынешнего изобретения.

[Получение раствора А] В химическом стакане смешивали дистиллированную воду (196 г), динатриевую EDTA (0,06 г), глицерин (15 г), дипропиленгликоль (30 г), феноксиэтанол (0,9 г), этилгексилглицерин (0,9 г), сополимер

гидроксиэтилакрилата/акрилоилдиметилтаурата натрия (2,4 г) и 1 нМ водный раствор "ASO 2" (0,3 мл). Смесь подвергают гомогенизации при 70 ~ 75°С, используя смеситель-гомогенизатор.

[Получение раствора В] В другом химическом стакане смешивали при 70 ~ 75°С цетеарил этилгексаноат (12 г), диметикон (6 г), стеариновую кислоту/ гидрогенизированное растительное масло/бегениловый спирт/цетеариловый спирт (15 г), масло каритэ (Shea) (9 г) и полиглицерил-3-метилглюкозы дистеарат/глицерил стеарат SE/сесквистеарат метилглюкозы (6 г).

[Получение крема для топического применения] "Раствор А" и "Раствор В" смешивали, подвергая гомогенизации при 7200 об/мин и 70 ~ 75°С в течение 3 мин с помощью смесителя-гомогенизатора. Смесь медленно охлаждали до комнатной температуры с получением крема для топического применения, содержащего 1 пМ "ASO 2".

Пример 6. кПЦР для мРНК TYR в меланоцитах человека, обработанных "ASO 1".

"ASO 1", указанный в таблице 1, представляет 13-мерный ASO TYR полностью комплементарный 3' сайту сплайсинга, охватывающего область соединения интрона 1 и экзона 2 в TYR человека, обозначенный "жирным шрифтом" и "подчеркнутый" в 30-мерной последовательности пре-мРНК TYR человека [(5'→3') ggguguuuuguacag AUUGUCUGUAGCCGA].

"ASO 1" оценивали с помощью вложенной кПЦР TYR на его способность индуцировать изменения в уровне мРНК TYR в первичных эпидермальных меланоцитах человека, как указано далее.

[Культура клеток и обработка ASO] Первичные клетки эпидермальных меланоцитов (Cat. Number PCS-200-013, АТСС) выдерживали в базальной среде для дермальных клеток (Cat Number PCS-200-030, АТСС), дополненной частью комплекта для роста зрелых меланоцитов (Cat. Number PCS-200-042, АТСС). Меланоциты, выращенные в 60 мм чашке для культивирования, содержащей 5 мл среды для культивирования, обрабатывали "ASO 1" при 0 zM (негативный контроль), 1 zM, 100 zM или 10 аМ. (3 чашки для культивирования для каждой концентрации).

[Экстракция РНК и синтез кДНК с помощью одностадийной ПЦР] После инкубирования с "ASO 1М" в течение 5 часов, суммарную РНК экстрагировали, используя "Мини-набор RNeasy " (Cat. Number 74106, Qiagen) согласно инструкциям производителя. 200 нг матричной РНК подвергали 25 мкл реакции обратной транскрипции с помощью Super Script^® Набора одностадийной RT-PCR с Platinum^® ДНК-полимеразы Taq (Cat. No. 10928-042, Invitrogen) против набора экзон-специфичных праймеров [экзон 1_прямой(2): (5'→3') CTCTTTGTCTGGATGCATT; и экзон 5_обратный: (5'→3') CTGTGGTAATCCTCTTTCT] согласно следующим указанным условиям цикла: 50°С в течение 30 мин и 94°С в течение 2 мин с последующими 15 циклами по 30 сек при 94°С, 30 сек при 50°С и 1 мин при 72°С.

[Вложенная ПЦР-амплификация] 1 мкл кДНК дополнительно амплифицировали в 20 мкл вложенной ПЦР-реакции (Cat. No. K2612, Bioneer) против набора экзон-специфичных праймеров [экзон 2n_прямой(2): (5'→3') GATAAAGCTGCCAATTTC; и экзон 3n_обратный: (5'→3') TTGTGCATGCTGCTTTGA] против зонда Taqman [(5'→3') 5,6-FAM-CACTGG-ZEN-AAGGATTTGCTAGTCCAC-3IABkFQ]. Условия цикла: 95°С в течение 3 мин с последующими 40 циклами по 10 сек при 95°С и 30 сек при 60°С.

Фиг. 12 приводит данные кПЦР, в которых уровень полноразмерной мДНК TYR снизился на около 30% в меланоцитах человека, обработанных "ASO 1" от 1 zM до 10 аМ. Наблюдаемые снижения были значительными (параметрический t-критерий Стьюдента) в клетках, обработанных "ASO 1" при 1 zM и 10 аМ.

1. Производное пептидной нуклеиновой кислоты, представленное формулой I:

где

n - целое число от 13 до 17;

соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК тирозиназы человека;

соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК тирозиназы человека или частично комплементарно пре-мРНК тирозиназы человека с одним или двумя ошибочными спариваниями от всего соединения формулы I;

S₁, S₂, …, S_n-1, S_n, T₁, T₂, …, T_n-1 и T_n обозначают атом водорода;

X обозначает атом водорода [Н];

Y обозначает замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу, в которой замещенная или незамещенная алкилоксикарбонилгруппа выбрана из:

Z обозначает аминогруппу;

B₁, В₂, …, B_n-1 и В_т независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения; и

по меньшей мере четыре из B₁, В₂, …, B_n-1 и В_т независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV:

где

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ являются атомами водорода;

L₁, L₂ и L₃ являются ковалентным линкером, представленным формулой V, ковалентно соединяющим основную аминогруппу с остатком нуклеинового основания:

где

Q₁ и Q_m представляют собой метиленгруппу (-СН₂-) и Q_m непосредственно связывает основную аминогруппу;

Q₂, Q₃, …, и Q_m-1 представляют собой метиленгруппу, в которой одна из Q₂, Q₃, … и Q_m-1 независимо выбрана из метиленгруппы и атома кислорода (-O-); и

m - целое число от 4 до 6.

2. Производное пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1, где

n - целое число от 13 до 15;

соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК тирозиназы человека;

соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК тирозиназы человека;

S₁, S₂, …, S_n-1, S_n, T₁, T₂, …, T_n-1 и T_n представляют собой атом водорода;

X является атомом водорода;

Y обозначает замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу, в которой замещенная или незамещенная алкилоксикарбонилгруппа выбрана из:

Z обозначает аминогруппу;

B₁, В₂, …, B_n-1 и B_n независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и нуклеиновых оснований не природного происхождения;

по меньшей мере пять из B₁, В₂, …, B_n-1 и B_n независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и R₆ являются атомами водорода;

L₁ обозначает -(СН₂)2-O-(СН₂)₂-, -СН₂-O-(СН₂)₂-, -СН₂-O-(СН₂)₃-, -СН₂-O-(СН₂)₄- или -СН₂-O-(СН₂)₅- с правым концом непосредственно связывается с основной аминогруппой; и

L₂ и L₃ независимо выбраны из -(СН₂)₂-O-(СН₂)₂-, -(СН₂)₃-O-(СН₂)₂-, -(СН₂)₂-O-(СН₂)₃-, -(СН₂)₂-, -(СН₂)₃-, -(СН₂)₄-, -(СН₂)₅-, -(СН₂)₆-, -(СН₂)₇- и -(СН₂)₈- с правым концом непосредственно связывается с основной аминогруппой.

3. Производное пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1, которое выбрано из группы производных пептидной нуклеиновой кислоты, приведенных ниже:

(N→C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH₂; и

(N→С) Fethoc-AC(1O2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1O2)C-NH₂;

где

A, G, T и С представляют собой мономеры ПНК с природным нуклеиновым основанием аденином, гуанином, тимином и цитозином, соответственно;

C(pOq), А(р), A(pOq), G(p) и G(pOq) представляют собой мономеры ПНК с нуклеиновым основанием не природного происхождения, представленного формулой VI, формулой VII, формулой VIII, формулой IX и формулой X, соответственно:

где

р и q - целые числа от 1 до 8; и

сокращения N- и С-концевых заместителей конкретно описаны, как указано далее: "Fethoc-" для "[2-(9-фторенил)этил-1-окси]карбонилгруппы"; и "-NH₂" для незамещенной "аминогруппы".

4. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающая эффективное количество производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1.

5. Фармацевтическая композиция для лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека, включающая эффективное количество производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1.

6. Способ лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1.

7. Способ лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1.

8. Применение производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1 при получении медикамента для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека.

9. Применение производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1 при получении медикамента для лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека.