Устойчивые мультиспецифические антитела

Изобретение относится к области биохимии, в частности к белковой конструкции, а также к способу ее получения. Указанная конструкция содержит по меньшей мере один мутированный Fab-фрагмент. Изобретение обеспечивает образование соответствующих пар тяжелой/легкой цепей и предотвращает образование их ошибочное спаривание. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 11 ил., 6 пр.

 

Изобретение имеет отношение к получению молекул мультиспецифических антител, которые могут использоваться в медицине.

Уровень техники

Биспецифические антитела (bsAb) совмещают специфичность двух антител и одновременно направлены на различные антигены или эпитопы. BsAb, обладающие «дву-целевой» функциональностью, могут воздействовать на разнообразные поверхностные рецепторы или лиганды, ассоциированные, например, с раковым заболеванием, пролиферацией или воспалительными процессами. BsAb также могут идентифицировать мишени в непосредственной близости или для того, чтобы способствовать формированию белкового комплекса на одной клетке, или для того, чтобы содействовать контактам между клетками. Примерами функциональных возможностей принудительного связывания являются bsAb, которые способствуют образованию комплексов белков в каскаде свертывания (крови) или «рекрутеры» и/или активаторы нацеленных на опухоль иммунных клеток. После проведения многолетних научно-исследовательских работ первое bsAb было одобрено в 2009.

Первоначально биспецифические антитела получали путем химического соединения или путем использования квадром, возникающих в результате слияния двух клеточных линий гибридом, продуцирующих два разных mAb. Однако, химическое соединение может в ряде случаев изменять антигенсвязывающие участки, приводя к ухудшению биологических свойств антитела. Подход с использованием квадромы имеет недостаток, заключающийся в том, что случайное спаривание тяжелой и легкой цепей от двух разных антител теоретически приводит к десяти равновозможным комбинациям, что порождает смесь молекул иммуноглобулина, только одна из которых является желаемым биспецифическим продуктом, который должен быть отделен от неправильно спаренных продуктов.

В настоящее время предпочтительным методом получения биспецифических антител становится генная инженерия, приводящая к созданию большого разнообразия различных форматов рекомбинантных биспецифических антител. Некоторые из этих биспецифических антител являются очень простыми и происходят от одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов от двух (или более) разных антител, соединенных при помощи подходящего пептидного линкера. Эти антитела относительно легко получать, при этом, поскольку они образуются на основе одной полипептидной цепи и содержат только Fv области исходных антител, не существует проблемы, связанной с ошибочным спариванием между цепями. Однако, они меньше, чем полноразмерные иммуноглобулины и лишены константных областей, в частности Fc-области. Хотя их использование может быть выгодно при некоторых вариантах использования, например, когда желательно избежать Fc-опосредованных эффектов, недостатки проявляются, когда желательной является Fc-опосредованная эффекторная функция. Также, вследствие их небольшого размера и отсутствия Fc-области, они обладают очень коротким временем полужизни in vivo.

Поэтому разрабатываются другие форматы биспецифических рекомбинантных антител, более близко имитирующих молекулу иммуноглобулина природного происхождения, и в частности, имеющие целую Fc-область. Эти форматы можно сгруппировать в две основные группы.

В первой группе форматов (IgG scFv) scFv фрагменты из антитела A соединяются с концами (в основном, C-концевыми областями) тяжелых цепей антитела B. В результате получается антитело, имеющее только один тип тяжелой цепи, которая содержит VH, CH1, CH2 и CH3 домены антитела B и VH и VL домены антитела A, и один тип легкой цепи, которая содержит VL и CL домены антитела B, при этом ошибочного спаривания между цепями не происходит. Такой формат описан, например, Qu et al. (Blood, 111, 2211-2219, 2008).

Во второй группе форматов тяжелая цепь и легкая цепь из антитела A спариваются с тяжелой цепью и легкой цепью из антитела B. Этот формат воспроизводит биспецифические антитела, продуцируемые квадромами, и, следовательно, вызывает аналогичные проблемы ошибочного спаривания. Для решения проблемы ошибочного спаривания тяжелых цепей предлагается видоизменить CH3 домены антител, для того чтобы способствовать их гетеродимеризации (т.е. спариванию тяжелой цепи A с тяжелой цепью B) и предотвратить их гомодимеризацию. Это было сделано с помощью, так называемого, подхода "выступ во впадину" (Ridgway et al, Protein Eng, 9, 617-21, 1996; патент США № 7,695,936). Мутация "выступ", заключающаяся в замене небольшой аминокислоты бóльшей аминокислотой, вносится на поверхности CH3 димера тяжелой цепи антитела A, приводя к стерическому несоответствию, которое предотвращает гомодимеризацию. В то же время, для того чтобы способствовать гетеродимеризации, комплементарная мутация "впадина", заключающаяся в замене большой аминокислоты меньшей аминокислотой, вносится в CH3 домен антитела B. Для решения проблемы неправильного спаривания тяжелой цепи/легкой цепи, предлагается использовать антитела разной специфичности, но совместно использующих общую легкую цепь, ранее установленную на основе scFv фаговой библиотеки (Merchant et al., Nat Biotechnol, 16, 677-81, 1998; патент США 7,183,076). Недостаток этого подхода заключается в трудности идентификации антител, имеющих общую легкую цепь.

Международная патентная заявка WO2013/005194 предполагает, что можно предотвратить неправильное спаривание тяжелой цепи /легкой цепи и таким образом обеспечить желаемое соответствие цепей путем изменения некоторых ключевых остатков на поверхности соприкосновения CH1 и CL доменов.

Раскрытие изобретения

В данной работе изобретатели обнаружили, что новый набор мутаций может дополнительно улучшить соответствие цепей в молекуле мультиспецифического антитела.

Изобретение имеет отношение к мультиспецифическим, например, биспецифическим конструкциям на основе антител, содержащим различные Fab-фрагменты, имеющие определенный набор мутаций на поверхности соприкосновения CH1 и CL доменов, указанные мутации способствуют родственному спариванию тяжелой цепи/легкой цепи и предотвращают их неправильное спаривание.

Нумерация положений в последовательности, используемая в этом документе в отношении CH1 и CL доменов, относится к нумерации согласно Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health и Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp 662,680,689, 1991).

В этом документе предлагается видоизмененный Fab-фрагмент, выбранный из:

a) Fab-фрагмента, состоящего из:

- VH и VL доменов антитела, представляющего интерес;

- CH1 домена, который получен из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка треонина в положении 192 указанного CH1 домена на аспарагиновую кислоту и

- CL домена, который получен из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка аспарагина в положении 137 указанного CL домена на остаток лизина и замены остатка серина в положении 114 указанного CL домена на остаток аланина; и

b) Fab-фрагмента, состоящего из:

- VH и VL доменов антитела, представляющего интерес;

- CH1 домена, который получен из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка лейцина в положении 124 указанного CH1 домена на глутамин и замены остатка серина в положении 188 указанного CH1 домена на остаток валина; и

- CL домена, который получен из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка валина в положении 133 указанного CL домена на остаток треонина и замены остатка серина в положении 176 указанного CL домена на остаток валина.

Любая конструкция, предпочтительно любая белковая конструкция, содержащая такой видоизмененный Fab фрагмент, является частью настоящего изобретения.

В частности, предоставляется мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент, содержащий, по меньшей мере, два Fab-фрагмента с разными CH1 и CL доменами, при этом каждый Fab-фрагмент распознает другой эпитоп, представляющий интерес, при этом указанные Fab-фрагменты последовательно располагаются в любом порядке, причем C-концевая область CH1 домена первого Fab-фрагмента соединяется с N-концевой областью VH домена следующего Fab-фрагмента с помощью полипептидного линкера,

при этом, по меньшей мере, один Fab-фрагмент, и более предпочтительно два фрагмента выбирают из группы, состоящей из

a) Fab-фрагмента, состоящего из

- VH и VL доменов антитела;

- CH1 домена, который получают из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка треонина в положении 192 указанного CH1 домена на аспарагиновую кислоту и

- CL домена, который получают из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка аспарагина в положении 137 указанного CL домена на остаток лизина и замены остатка серина в положении 114 указанного CL домена на остаток аланина; и

b) Fab-фрагмента, состоящего из

- VH и VL доменов антитела;

- CH1 домена, который получают из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка лейцина в положении 124 указанного CH1 домена на глутамин и замены остатка серина в положении 188 указанного CH1 домена на остаток валина; и

- CL домена, который получают из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка валина в положении 133 указанного CL домена на остаток треонина и замены остатка серина в положении 176 указанного CL домена на остаток валина.

Согласно предпочтительному варианту осуществления CH1 домен происходит от IgG иммуноглобулина, предпочтительно IgG1 подтипа. CL домен предпочтительно является доменом типа каппа. Предпочтительно, для использования при лечении человека, иммуноглобулин, от которого происходят измененный CH1 и измененный CL домены, является человеческим иммуноглобулином.

VH и VL домены могут происходить из любого антитела, природного или созданного генно-инженерным путем, распознающего эпитоп, нацеливание на который желательно.

Измененные Fab-фрагменты изобретения могут использоваться в любой конструкции мультиспецифического антитела, где необходимо способствовать родственному спариванию тяжелой цепи/легкой цепи и предотвратить их ошибочное спаривание.

Предпочтительно, измененные Fab-фрагменты могут использоваться в молекуле мультиспецифического антитела, содержащего антигенсвязывающие фрагменты, каждый из которых состоит в основном из последовательно расположенных Fab-фрагментов, разделенных линкерами.

Следовательно, другой целью изобретения является мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент, содержащий, по меньшей мере, два и до шести различных Fab-фрагментов, выбранных из числа:

- Fab-фрагмента (также определенного в описании как "Fab фрагмент дикого типа"), содержащего CH1 и CL домены иммуноглобулина дикого типа

- мутированного Fab-фрагмента (a) как определено выше;

- мутированного Fab-фрагмента (b) как определено выше;

каждый Fab-фрагмент распознает другой представляющий интерес эпитоп, и указанные Fab-фрагменты располагаются последовательно в любом порядке, C-концевые области CH1 домена первого Fab-фрагмента соединяются с N-концевой областью VH домена следующего Fab-фрагмента посредством пептидного линкера;

или один или два Fab-фрагмента располагаются последовательно в любом порядке и соединяются посредством пептидного линкера с C-концом CH3 домена или C-концом шарнирной последовательности, в то время как другой Fab или два Fabs, последовательно расположенных в любом порядке, соединяются с N-концом шарнирной последовательности.

Вышеупомянутая шарнирная последовательность в большинстве случаев является природной шарнирной последовательностью, полученной от IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 или IgD, и наиболее предпочтительно от IgG1, или может быть модифицированной последовательностью за счет использования точечных мутаций и/или добавлений аминокислот таким образом, что модифицированная шарнирная последовательность состоит менее чем из 80 аминокислот, предпочтительно менее чем из 60 аминокислот, еще более предпочтительно менее чем из 40 аминокислот.

"Антигенсвязывающий фрагмент" определяется в описании как молекула, имеющая два или более антигенсвязывающих участка, каждый из которых распознает иной эпитоп. Разные эпитопы могут порождаться одной и той же антигенной молекулой или разными антигенными молекулами.

В предпочтительном варианте осуществления также предоставляется мультиспецифическое антитело, имеющее два идентичных антигенсвязывающих плеча, каждый из которых состоит из мультиспецифического антигенсвязывающего фрагмента, т.е. антигенсвязывающего фрагмента, способного к связыванию нескольких (т.е. более чем одного) антигенов, как определено выше.

В отдельном варианте осуществления мультиспецифическое антитело имеет структуру, подобную иммуноглобулину, и содержит

- два идентичных антигенсвязывающих плеча, каждый из которых состоит из таких мультиспецифических антигенсвязывающих фрагментов, как описано выше;

- димеризованные CH2 и CH3 домены иммуноглобулина;

- шарнирную область IgA, IgG или IgD, связывающую C-концевые области CH1 доменов антигенсвязывающих плеч с N-концевыми областями CH2 доменов.

Конкретнее, предметом изобретения является мультиспецифическое, предпочтительно биспецифическое антитело, содержащее две тяжелые цепи и четыре легкие цепи, при этом каждая тяжелая цепь содержит

- Fc-область иммуноглобулина, содержащую шарнирный-CH2-CH3 домены,

- при этом Fc-область соединяется с Fab тяжелой цепи CH1-VH антитела 1 (Ab1) с помощью указанного шарнирного домена,

- который, в свою очередь, связывается с Fab тяжелой цепи CH1-VH антитела 2 (Ab2) при помощи последовательности полипептидного линкера, и полипептидная линкерная последовательность соединяет N-конец указанного Fab тяжелой цепи VH домена Ab1 с C-концом указанного CH1 домена Ab2,

и четыре легкие цепи содержат Fab легких цепей CL-VL Ab1 и Fab легких цепей CL-VL Ab2, связанные с их родственными доменами тяжелой цепи;

при этом Ab1 и Ab2 распознают разные эпитопы,

и при этом Fab CH1 домен одного из Ab1 или Ab2 является мутированным доменом, который происходит от CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка треонина в положении 192 указанного CH1 домена на аспарагиновую кислоту, и родственный CL домен является мутированным доменом, который происходит от CL домена иммуноглобулина путем замены остатка аспарагина в положении 137 указанного CL домена на остаток лизина и замены остатка серина в положении 114 указанного CL домена на остаток аланина, и/или

при этом Fab CH1 домен одного или другого из Ab1 или Ab2 является мутированным доменом, который происходит от CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка лейцина в положении 124 указанного CH1 домена на глутамин и замены остатка серина в положении 188 указанного CH1 домена на остаток валина, и родственный CL домен является мутированным доменом, который происходит от CL домена иммуноглобулина путем замены остатка валина в положении 133 указанного CL домена на остаток треонина и замены остатка серина в положении 176 указанного CL домена на остаток валина.

Также описывается любая белковая цепь, выбранная из:

- легкой цепи мутированного Fab-фрагмента изобретения;

- тяжелой цепи мутированного Fab-фрагмента изобретения;

- тяжелой цепи антигенсвязывающего фрагмента изобретения;

- тяжелой цепи иммуноглобулин-подобного мультиспецифического антитела изобретения.

Раскрытие дополнительно предоставляет полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую белковую цепь изобретения. Указанный полинуклеотид также может содержать дополнительные последовательности, в частности, он может предпочтительно содержать последовательность, кодирующую лидерную последовательность или сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию указанной белковой цепи.

Подписи к фигурам

Фиг. 1 показывает электрофорез BiXAb-6567 в SDS полиакриламидном геле при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Полоса 1: перемещение BiXAb-6567 при восстанавливающих условиях; полоса 2: маркеры молекулярной массы с указанной массой каждой полосы; полоса 3: перемещение BiXAb-6567 при невосстанавливающих условиях.

Фиг. 2 показывает анализ BiXAb-6567 при помощи эксклюзионной хроматографии.

Фиг. 3 показывает профили плавления двух исходных антител (анти-CD38 и анти-PD-L1) и BiXAb-6567, определенные при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии.

Фиг. 4A показывает профили связывания двух исходных антител (анти-CD38 и анти-PD-L1) и BiXAb-6567 в ELISA-анализе прямого связывания CD38 антигена. Фиг. 4B показывает профили связывания двух исходных антител (анти-CD38 и анти-PD-L1) и BiXAb-6567 в ELISA-анализе прямого связывания PD-L1 антигена. Фиг. 4C показывает профили связывания BiXAb-6567 в ELISA-анализе связывания двойного антигена (PD-L1 и CD38).

Фиг. 5A - 5C показывают профили сортировки флуоресцентно-активированных клеток двух исходных mAbs (анти-CD38 и анти-PD-L1) и BiXAb-6567 на трех разных клеточных линиях, 5A: множественная миелома RPMI-8226, 5B: CHO клетки, устойчиво трансфицированные полноразмерным CD38, и 5C: линия клеток рака яичника SKOV-3.

Фиг. 6 показывает профили титрования связывания на CHO-CD38 клеточной линии двух исходных антител (анти-CD38 и анти-PD-L1), BiXAb-6567 и отрицательного контрольного анти-CD20 антитела.

Фиг. 7 показывает профили цитотоксической активности двух исходных антител (анти-CD38 и анти-PD-L1), BiXAb-6567 и двух отрицательных контрольных антител, анти-CD20 и анти-HER2, в ADCC анализе с использованием клеточной линии множественной миеломы, RPMI-8226, в качестве клеток-мишеней и нефракционированных не активированных предварительно мононуклеарных клеток в качестве эффекторных клеток.

Фиг. 8 показывает профили цитотоксической активности двух исходных антител (анти-CD38 и анти-PD-L1), BiXAb-6567 и двух отрицательных контрольных антител, анти-CD20 и анти-HER2, в ADCC анализе с использованием CHO-CD38 клеточной линии в качестве клеток-мишеней и нефракционированных предварительно неактивированных мононуклеарных клеток в качестве эффекторных клеток.

Фиг. 9 показывает профили цитотоксической активности двух исходных антител (анти-CD38 и анти-PD-L1), BiXAb-6567 и двух отрицательных контрольных антител, анти-CD20 и анти-HER2, в ADCC анализе с использованием SKOV-3 клеточной линии в качестве клеток-мишеней и обогащенных предварительно IL-12-активированных NK клеток в качестве эффекторных клеток.

Фиг. 10 показывает профили цитотоксической активности двух исходных антител (анти-CD38 и анти-PD-L1), BiXAb-6567 и двух отрицательных контрольных антител, анти-CD20 и анти-HER2, в ADCC анализе с использованием SKOV-3 клеточной линии в качестве клеток-мишеней и обогащенных предварительно IL-15-активированных NK клеток в качестве эффекторных клеток.

Фиг. 11 – схематическое изображение биспецифического антитела изобретения, содержащего две тяжелые цепи и четыре легкие цепи, показывающее разные комбинации мутаций.

Подробное описание изобретения

Определения:

Базовая структура (каркас) молекулы природного антитела представляет собой Y-образную тетрамерную четвертичную структуру, состоящую из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, которые удерживаются вместе при помощи нековалентных взаимодействий и за счет дисульфидных связей между цепями.

У разных видов млекопитающих существует пять типов тяжелых цепей: α, δ, ε, γ и μ, которые определяют класс (изотип) иммуноглобулина: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно. За N-концевым вариабельным доменом (VH) тяжелой цепи следует константная область, содержащая три домена (пронумерованных CH1, CH2 и CH3 от N-конца к C-концу) в тяжелых цепях γ, α, и δ, тогда как константная область тяжелых цепей µ и ε состоит из четырех доменов (пронумерованных CH1, CH2, CH3 и CH4 от N-конца к C-концу). CH1 и CH2 домены IgA, IgG и IgD разделяются гибким шарнирным участком, длина которого варьирует между разными классами и в случае IgA и lgG между разными изотипами: lgG1, lgG2, IgG3 и IgG4 имеют соответственно шарниры из 15, 12, 62 (или 77), и 12 аминокислот, и IgA1 и IgA2 имеют соответственно шарниры из 20 и 7 аминокислот.

Существует два типа легких цепей: λ и κ, которые могут связываться с любыми изотипами тяжелых цепей, однако в конкретной молекуле антитела обе цепи являются цепями одного и того же изотипа. Обе легкие цепи, по-видимому, являются функционально идентичными. За их N-концевым вариабельным доменом (VL) следует константная область, состоящая из одного домена, называемого CL.

Тяжелые и легкие цепи соединяются по парам при помощи белок-белковых взаимодействий между CH1 и CL доменами и посредством VH /VL взаимодействий и две тяжелые цепи соединяются при помощи белок-белковых взаимодействий между их CH3 доменами. Структура молекулы иммуноглобулина в большинстве случаев стабилизируется межцепочечными дисульфидными связями между CH1 и CL доменами и между шарнирами.

Антигенсвязывающие участки соответствуют плечам Y-образной структуры, каждый из которых состоит из полной легкой цепи, спаренной с VH и CH1 доменами тяжелой цепи, и называются Fab-фрагментами (антигенсвязывающие фрагменты). Fab-фрагменты были сначала получены из нативных молекул иммуноглобулинов при помощи расщепления папаином, который расщепляет молекулу антитела в шарнирной области на амино-концевой стороне межцепочечных дисульфидных связей, таким образом, высвобождая два идентичных антигенсвязывающих плеча. Другие протеазы, такие как пепсин, также расщепляют молекулу антитела в шарнирной области, но на карбокси-концевой стороне межцепочечных дисульфидных связей, высвобождая фрагменты, состоящие из двух идентичных Fab-фрагментов и остающиеся связанными посредством дисульфидных связей; восстановление дисульфидных связей в F(ab')2 фрагментах дает Fab' фрагменты.

Часть антигенсвязывающего участка, соответствующая VH и VL доменам называется Fv фрагментом (вариабельный фрагмент); он содержит CDRs (участки, определяющие комплементарность), которые образуют антигенсвязывающий сайт антитела (также называемый паратопом).

Эффекторный участок антитела, который несет ответственность за его связывание с эффекторными молекулами или клетками, соответствует «стволу» Y-образной структуры, и содержит спаренные CH2 и CH3 домены тяжелой цепи (или CH2, CH3 и CH4 домены, в зависимости от класса антитела), и называется Fc (кристаллизующийся фрагмент) фрагментом.

Благодаря идентичности двух тяжелых цепей и двух легких цепей, молекулы природных антител имеют два идентичных антигенсвязывающих сайта и таким образом связываются одновременно с двумя идентичными эпитопами.

В контексте изобретения "мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент" определяется как молекула, имеющая два или более антигенсвязывающих участка, каждый из которых распознает иной эпитоп. Разные эпитопы могут быть порождены одной и той же антигенной молекулой или разными антигенными молекулами. Термин “распознавание” или “распознает” означает, что фрагмент специфически связывается с антигеном-мишенью.

“Мультиспецифическое антитело” состоит, по меньшей мере, из двух мультиспецифических антигенсвязывающих фрагментов/плеч и способно связывать два, три или более различных антигенов.

Антитело “специфически связывается” с антигеном-мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, легче и/или более продолжительно, чем оно связывается с другими субстанциями. “Специфическое связывание” или “предпочтительное связывание” не обязательно требует (хотя оно может включаться) эксклюзивного связывания. Как правило, но не обязательно, упоминание связывания означает предпочтительное связывание.

Термин “мутированное производное”, “мутант” или “функциональный вариант” обозначает последовательность, отличающуюся от исходной последовательности, к которой она имеет отношение, делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот. Предпочтительно мутированное производное предпочтительно показывает, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 85%, опять же предпочтительно, по меньшей мере, 90% гомологию последовательности с нативной последовательностью. В отдельном варианте осуществления мутации практически не влияют на функцию антитела.

Мутированные производные или функциональные варианты могут содержать VH цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 85% (например, на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичную с любой из эталонных последовательностей, описанных в этом документе, VL цепь, которая имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 85% (например, на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичную с любой из эталонных последовательностей, описанных в этом документе, или обе. Эти варианты способны к связыванию с антигенами-мишенями. В некоторых примерах варианты обладают сходной антигенсвязывающей аффинностью относительно эталонных антител, описанных выше (например, имеют KD менее чем 1 x 10^-7 M, 10^-8 M, предпочтительно менее чем 1 x 10^-9 или 1 x 10^-10 M).

Аффинность связывания определяется терминами ka (константа скорости ассоциации), kd (константа скорости диссоциации) или KD (равновесная диссоциация). Как правило, специфическое связывание при использовании в отношении антитела имеет отношение к антителу, которое специфически связывается с (“распознает”) его мишень(и) со значением аффинности (KD) менее чем 10^-7 M, предпочтительно менее чем 10^-8 M, например, менее чем 10^-9 M или 10^-10 M. Более низкое значение KD показывает более высокую аффинность связывания (т.е., более сильное связывание), так что значение KD 10^-9 показывает более высокую аффинность связывания, чем значение KD 10^-8.

“Процент идентичности” двух аминокислотных последовательностей определяется при помощи алгоритма Karlin и Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, модифицированного как в Karlin и Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Такой алгоритм является частью программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Белковый поиск BLAST может проводиться при помощи программы XBLAST, счет=50, длина слова=3 с целью получения аминокислотных последовательностей, гомологичных интересующим белковым молекулам. В том случае, когда между двумя последовательностями имеются пропуски, может использоваться Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. При применении программ BLAST и Gapped BLAST могут использоваться параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).

В других вариантах осуществления функциональные варианты, описанные в этом документе, могут содержать одну или более мутаций (например, консервативные замены), которые предпочтительно не происходят в остатках, которые предположительно взаимодействуют с одним или более из CDRs.

В данном документе описываются мутированные производные или функциональные варианты, являющиеся практически идентичными эталонному антителу.

Термин “в основном идентичный (практически идентичный)” или “несущественно (отличающийся)” означает, что соответствующие аминокислотные последовательности (например, в каркасных участках (FRs), CDRs, VH или VL домене) варианта отличаются несущественно (например, включая консервативные аминокислотные замены) по сравнению с эталонным антителом, так что вариант обладает практически сходной активностью связывания (например, аффинностью, специфичностью или и тем и другим) и биоактивностью относительно эталонного антитела.

Такой вариант может включать минимальные аминокислотные изменения, например, 1 или 2 замены в 5 аминокислотной последовательности определенной области. Обычно большее количество замен может быть сделано в FR областях, в противоположность CDR участкам, поскольку они не оказывают негативного влияния на функцию связывания антитела (например, уменьшение аффинности связывания более чем на 50% по сравнению с исходным антителом). В некотором варианте осуществления идентичность последовательности может составлять примерно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или выше между первоначальным и модифицированным антителом. В некоторых вариантах осуществления модифицированное антитело обладает той же самой специфичностью связывания и обладает аффинностью, составляющей, по меньшей мере, 50% от аффинности первоначального антитела.

Консервативные замены будут продуцировать молекулы, имеющие функциональные и химические характеристики, сходные с характеристиками молекулы, из которой такие модификации получены. Например, “консервативная аминокислотная замена” может включать замену нативного аминокислотного остатка другим остатком, так что отсутствует влияние или существует незначительное влияние на полярность или заряд аминокислотного остатка в таком положении. Желательные аминокислотные замены (или консервативные или неконсервативные) устанавливаются специалистами в данной области техники. Например, аминокислотные замены могут использоваться, чтобы идентифицировать важные остатки в последовательности молекулы, или чтобы увеличить или уменьшить аффинность молекул, описанных в этом документе. Варианты, содержащие одну или более консервативных аминокислотных замен, можно получить согласно методам изменения полипептидной последовательности, известным среднему специалисту в данной области техники, например, такие методы можно найти в следующих ссылках, например, молекулярное клонирование: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, или Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. Консервативные замены аминокислот включают замены, сделанные среди аминокислот в пределах следующих групп: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; и (g) E, D.

Варианты аминокислотных последовательностей антитела можно получить путем введения соответствующих изменений нуклеотидов в нуклеиновую кислоту антитела или посредством пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в пределах аминокислотных последовательностей антитела. Любая комбинация делеции, вставки и замены делается с целью получения окончательной конструкции, при условии, что окончательная конструкция обладает желательными характеристиками. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей антитела, можно получить с помощью ряда методов, известных в данной области техники. Эти методы включают, но без ограничения, олигонуклеотид-опосредованный (или сайт-направленный) мутагенез, PCR мутагенез и кассетный мутагенез ранее полученного варианта или невариантной (природной) версии антитела. В одном варианте осуществления значение равновесной константы диссоциации (KD) антител изобретения составляет меньше 10^-7 M, в частности меньше, чем 10^-8 M, 10^-9 M или 10^-10 M. Аффинность связывания может определяться с помощью известных в данной области техники методов, таких как ELISA или анализ биспецифического взаимодействия (например, с использованием поверхностного плазмонного резонанса), или других методов, известных в данной области.

Любая из описанных в этом документе молекул может быть исследована на предмет определения ее свойств, таких как антиген-связывающая активность, специфичность связывания с антигеном, и биологических функций при помощи стандартных методов.

Термины “субъект”, “индивидуум” и “пациент” используются в описании взаимозаменяемым образом и имеют отношение к млекопитающему, которого оценивают относительно лечения и/или лечат. Субъект может быть человеком, но также включаются другие млекопитающие, в частности, млекопитающие, пригодные в качестве лабораторных моделей болезней человека, например, мышь, крыса, кролик, собака и т.д.

Термин “лечение” имеет отношение к действию, применению или терапии, при которой субъект, включая человека, подвергается медицинскому воздействию с целью улучшения состояния субъекта, напрямую или опосредованно. В частности, термин имеет отношение к уменьшению числа случаев или облегчению симптомов, устранению рецидивов, предотвращению рецидивов, предотвращению заболеваемости, улучшению симптомов, улучшению прогноза или комбинации этого в некоторых вариантах осуществления. Квалифицированному специалисту понятно, что лечение необязательно приводит к полному отсутствию или устранению симптомов. Например, в отношении рака “лечение” может относиться к уменьшению роста, пролиферации или метастазирования неопластических или злокачественных клеток, предотвращению или задержке роста, пролиферации или метастазирования неопластических или злокачественных клеток или к какому-либо сочетанию этих процессов.

Дизайн предпочтительных мультиспецифических антител:

В описании предоставляются мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент(ы) и конструкции мультиспецифического антитела, содержащие указанные фрагменты, при этом каждый мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент состоит в основном из последовательно расположенных Fab-фрагментов, разделенных линкером изобретения.

Такие фрагменты и конструкции предпочтительно содержат цепи от человеческих иммуноглобулинов, предпочтительно IgG, опять же предпочтительно IgG1.

В случае, если мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент содержит больше, чем два разных Fab-фрагмента, полипептидные линкеры, разделяющие Fab-фрагменты, могут быть идентичными или разными.

Согласно предпочтительному варианту осуществления мультиспецифического антитела изобретения оно имеет два идентичных антигенсвязывающих плеча, каждое из которых состоит из антигенсвязывающих фрагментов, способных к связыванию некоторого количества (более чем одного) антигенов, как описано выше. Антигенсвязывающие плечи могут быть соединены вместе по-разному, в зависимости от предполагаемого использования антитела.

Если желательно получить антитело без Fc-опосредованных эффектов, антитело не должно содержать Fc-область. В этом случае два антигенсвязывающих плеча могут быть связаны вместе, например:

- путем гомодимеризации антигенсвязывающих плеч посредством межцепочечных дисульфидных связей, предоставленных полипептидным линкером(ами), разделяющим Fab-фрагменты, если указанный линкер(ы) содержит остатки цистеина; и/или

- путем добавления на C-концевой области каждого антигенсвязывающего плеча полипептидного удлинения, содержащего остатки цистеина, дающего возможность формирования межцепочечных дисульфидных связей, и гомодимеризации указанного полипептидного удлинения, что порождает шарнироподобную структуру; в порядке неограничивающих примеров, указанное полипептидное удлинение может быть, например, шарнирной последовательностью IgG1, IgG2, IgG3, IgA или IgD;

- посредством полужесткого линкера, соединяющего C-концевые области тяжелых цепей двух антигенсвязывающих плеч, с целью формирования одной полипептидной цепи и сохранения указанных антигенсвязывающих плеч на достаточном расстоянии друг от друга.

Альтернативно, если желательными являются такие эффекторные функции, как антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC), антителозависимый фагоцитоз (ADP) и комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), мультиспецифическое антитело изобретения может дополнительно содержать Fc домен, обеспечивающий эти эффекторные функции. Выбор Fc домена будет зависеть от типа желательных эффекторных функций.

В этом случае мультиспецифическое антитело изобретения имеет иммуноглобулин-подобную структуру, включающую:

- два идентичных мультиспецифических антигенсвязывающих плеча, описанных выше;

- димеризованные CH2 и CH3 домены иммуноглобулина;

- любую шарнирную область IgA, IgG или IgD, соединяющую C-концевые области CH1 доменов антигенсвязывающих плеч с N-концевыми областями CH2 доменов, или альтернативно, в том случае, когда CH4 домены, которые следуют за CH3 доменами, происходят от IgM или IgE, C-концевые области CH1 доменов антигенсвязывающих плеч могут связываться непосредственно с N-концевыми областями CH2 доменов.

Предпочтительно, CH2 и CH3 домены, шарнирная область и/или CH4 домены происходят от того же самого иммуноглобулина или от иммуноглобулинов того же самого изотипа и подкласса, как CH1 домены антигенсвязывающего плеча.

Могут использоваться CH2, CH3 и необязательно CH4 домены, а также шарнирные области нативных иммуноглобулинов. Также можно видоизменить (мутировать) их, при желании, например, для того чтобы модулировать эффекторную функцию антитела. В некоторых случаях весь или часть CH2 или CH3 домена может отсутствовать.

Конкретнее, изобретение предоставляет мультиспецифические, предпочтительно биспецифические четырехвалентные антитела, содержащие два сайта связывания с каждой из их мишеней, и функциональный Fc домен, обеспечивающий активацию эффекторных функций, таких как антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз и комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC).

Такие предпочтительные антитела изобретения являются полноразмерными антителами. Они предпочтительно содержат тяжелые цепи и легкие цепи от иммуноглобулинов человека, предпочтительно IgG, все еще предпочтительно IgG1.

Легкие цепи могут быть лямбда или каппа легкими цепями, предпочтительно они являются каппа легкими цепями.

В предпочтительном варианте осуществления полипептидный линкер, использованный в изобретении, соединяет две пары IgG Fab доменов в формат тетра-Fab мультиспецифического, предпочтительно биспецифического антитела, аминокислотная последовательность которого содержит последовательности тяжелых цепей, по меньшей мере, двух Fab, соединенных пептидным линкером, за которым следует шарнирная последовательность, за которой следует IgG Fc последовательность, совместно экспрессируемая с соответствующими последовательностями легкой цепи IgG.

Пример предпочтительных биспецифических антител изобретения, которые имеют IgG-подобную структуру, показан на фиг. 11.

В предпочтительном варианте осуществления биспецифические антитела изобретения, как правило, содержат

- непрерывную тяжелую цепь, сконструированную из Fc (шарнир-CH2-CH3),

- за которой следует Fab тяжелой цепи антитела 1 (CH1-VH) и последующий Fab тяжелой цепи (CH1-VH) антитела 2, последний соединяется при помощи полипептидной линкерной последовательности, происходящей из шарнирной области,

- и в ходе экспрессии белка полученная тяжелая цепь собирается в димеры, в то время как коэкспрессированные легкие цепи (VL-CL) антитела 1 и антитела 2 соединяются с их родственными тяжелыми цепями для того, чтобы сформировать конечную тандемную F(ab)’2-Fc молекулу,

антитело 1 (Ab1) и антитело 2 (Ab2) являются различными.

В предпочтительном варианте осуществления описываются биспецифические антитела, содержащие

- два Fab фрагмента с разными мутированными CH1 и мутированными CL доменами, состоящими из

a) Fab фрагмента, имеющего мутированный CH1 и мутированный C-каппа домены, происходящие от человеческого IgG1/каппа, и VH и VL домены Ab1,

b) Fab фрагмента, имеющего мутированный CH1 и мутированный C-каппа домены, происходящие от человеческого IgG1/каппа, и VH и VL домены Ab2,

c) мутированный константный домен легкой цепи, который происходит от человеческого каппа константного домена,

Fab фрагменты последовательно располагаются в следующем порядке

- C-концевая область мутированного CH1 домена Fab фрагмента Ab1 связывается с N-концевой областью VH домена Fab фрагмента Ab2 посредством пептидного линкера,

- шарнирная область человеческого IgG1 соединяет C-концевые области мутированного CH1 домена фрагмента Ab2 с N-концом CH2 домена,

- димеризованные CH2 и CH3 домены человеческого IgG1.

Ab1 и Ab2 могут быть любым антителом, представляющим интерес, в частности, любым антителом, интересным для терапевтической медицины.

В отдельном варианте осуществления Ab1 и Ab2, будучи разными, независимо выбирают из группы, состоящей из анти-CD38 антитела (такого, как даратумумаб) и анти-PD-L1 антитела (такого, как атезолизумаб).

В другом конкретном варианте осуществления Ab1 и Ab2, будучи разными, независимо выбирают из группы, состоящей из анти-EGFR антитела и анти-HER2/neu рецептора. В предпочтительном варианте осуществления Ab1 и Ab2, будучи разными, независимо выбирают из группы, состоящей из цетуксимаба или его видоизмененного производного, с одной стороны, и трастузумаба или его видоизмененного производного, с другой стороны.

Такие антитела пригодны в качестве медикамента, конкретнее при лечении рака.

В конкретном примере биспецифическая молекула является биспецифическим анти-CD38, анти-PD-L1 антителом, которое содержит, предпочтительно состоит из a) двух тяжелых цепей, каждая из которых содержит, предпочтительно состоит из SEQ ID NO:7 и b) четырех легких цепей, две из которых содержат, предпочтительно состоят из SEQ ID NO:15, а две другие содержат, предпочтительно состоят из SEQ ID NO: 18. Такое биспецифическое антитело обозначается BiXAb-6567.

SEQ ID NO:7 (тяжелая цепь) представляет собой:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPQAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVDVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Эта последовательность тяжелой цепи содержит

- VH даратумумаба (SEQ ID NO:8)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSS

- CH1 домен (человеческий IgG1 G1m(3) аллотипа с мутациями L124Q и S188V) Fab даратумумаба (SEQ ID NO:9)

ASTKGPSVFPQAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV

- AP линкер (SEQ ID NO:3)

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG

- VH атезолизумаба (SEQ ID NO: 10)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS

- CH1 домен (человеческий IgG1 G1m(3) аллотипа с мутациями T192D Fab атезолизумаба (SEQ ID NO:11)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVDVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV

- Шарнирную область человеческого IgG1 (SEQ ID NO:12)

EPKSCDKTHTCPPCP

- CH2 домен человеческого IgG1 (SEQ ID NO:13)

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

- CH3 домен человеческого IgG1 G1m(3) аллотипа (SEQ ID NO:14)

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Легкая цепь SEQ ID NO: 15 (даратумумаб) представляет собой

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Эта последовательность легкой цепи содержит

- VL даратумумаба (SEQ ID NO :16)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK

- CKappa домен даратумумаба с мутациями V133T и S176V (SEQ ID NO:17)

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Легкая цепь SEQ ID NO: 18 (атезолизумаб) представляет собой

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Эта последовательность легкой цепи содержит

- VL атезолизумаба (SEQ ID NO:19)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK

- Cкаппа домен атезолизумаба с мутациями S114A и N137K (SEQ ID NO:20)

RTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Третья пара Fab доменов (направленная против других антигенов-мишеней, чем первая и вторая пары Fab доменов) также может быть связана с идентичным или другим полипептидным линкером: i) или через C-концы тяжелых цепей указанной третьей пары Fab доменов с N-концами тяжелых цепей внешних (т.е. Fc-дистальных) Fab доменов, ii) или через C- или N-концы тяжелых цепей указанной третьей пары Fab доменов с C-концами обеих тяжелых цепей Fc-домена.

Любая из описанных в этом документе молекул может быть модифицирована, для того чтобы содержать дополнительные небелковые фрагменты, которые известны в данной области техники и легко доступны, например, путем пегилирования или гипергликозилирования. Также рассматриваются модификации, которые могут увеличить время полужизни в сыворотке или устойчивость в отношении протеолитического расщепления.

Антитела изобретения могут быть гликозилированы или нет, или могут демонстрировать ряд профилей гликозилирования. В предпочтительном варианте осуществления антитела являются негликозилированными в вариабельной области тяжелых цепей, но являются гликозилированными в Fc-области.

Могут использоваться гуманизированные формы исходного нечеловеческого антитела. В подходе с использованием гуманизации определяющие комплементарность области (CDRs) и некоторые другие аминокислоты из донорных вариабельных областей «пересаживаются» в человеческие вариабельные акцепторные области и затем соединяются с человеческими константными областями. Смотри, например, Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); патент США № 5,225,539.

Другим примером конструкций изобретения является биспецифический антигенсвязывающий фрагмент Fab-Fab, который не содержит Fc домен.

Такие Fab-Fab конструкции, как правило, содержат два разных Fab домена. Такие антитела имеют только один Fab домен, который связывается с антигеном 1 и с антигеном 2. Они обладают теми же самыми легкими цепями, как в соответствующих BiXAb антителах; однако, тяжелые цепи Fab-Fabs укорачиваются таким образом, что их самый C-концевой остаток представляет собой цистеин-220 (в EU нумерации).

Другим примером конструкций изобретения является димеризованная Fab-Fab конструкция (например, или посредством дисульфида в линкере или посредством природных дисульфидов шарнира на C конце C-концевого-проксимального Fab домена).

Дизайн линкеров

Полипептидный линкер, также называемый “происходящая из шарнирного участка последовательность полипептидного линкера” или “псевдо-шарнирный линкер”, содержит всю или часть последовательности шарнирной области одного или более иммуноглобулина(ов), выбранных из IgA, IgG и IgD, предпочтительно человеческого происхождения. Указанный полипептидный линкер может содержать всю или часть последовательности шарнирной области только одного иммуноглобулина. В этом случае указанный иммуноглобулин может принадлежать к тому же самому изотипу и подклассу, как иммуноглобулин, из которого получен смежный CH1 домен, или к другому изотипу или подклассу. Альтернативно, указанный полипептидный линкер может содержать все или часть последовательностей шарнирных областей, по меньшей мере, двух иммуноглобулинов разных изотипов или подклассов. В этом случае N-концевой участок полипептидного линкера, который непосредственно следует за CH1 доменом, предпочтительно состоит из всей или части шарнирного участка иммуноглобулина, принадлежащего к тому же самому изотипу и подклассу как иммуноглобулин, из которого получен указанный CH1 домен.

Необязательно, указанный полипептидный линкер может дополнительно содержать последовательность от 2 до 15, предпочтительно от 5 до 10 N-концевых аминокислот CH2 домена иммуноглобулина.

Последовательность полипептидного линкера в большинстве случаев состоит менее, чем из 80 аминокислот, предпочтительно менее чем из 60 аминокислот, все еще предпочтительно менее чем из 40 аминокислот.

В некоторых случаях могут использоваться последовательности из нативных шарнирных областей; в других случаях, точечные мутации могут быть привнесены в эти последовательности, в частности, замена одного или более остатков цистеина в нативных шарнирных областях IgG1, IgG2 или IgG3 на аланин или серин, для того, чтобы избежать нежелательных внутрицепочечных или межцепочечных дисульфидных связей.

В отдельном варианте осуществления последовательность полипептидного линкера содержит или состоит из аминокислотной последовательности EPKX₁CDKX₂HX₃X₄PPX₅PAPELLGGPX₆X₇PPX₈PX₉PX₁₀GG (SEQ ID NO:1), в которой X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X10, одинаковые или разные, представляют собой любую аминокислоту. В частности, последовательность полипептидного линкера может содержать или состоять из последовательности, выбранной из группы, состоящей из

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG (SEQ ID NO: 2);

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG (SEQ ID NO: 3);

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG (SEQ ID NO:4 );

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO:5) и EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO:6).

В отдельном варианте осуществления X₁, X₂ и X₃, одинаковые или разные, представляют собой треонин (T) или серин (S).

В другом конкретном варианте осуществления X₁, X₂ и X3, одинаковые или разные, выбирают из группы, состоящей из Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) и Ile (I), предпочтительно X₁, X2 и X₃, одинаковые или разные, могут представлять собой Ala (A) или Gly (G).

Альтернативно, X₁, X₂ и X₃, одинаковые или разные, могут представлять собой Leu (L), Glu (E), Gln (Q), Met (M), Lys (K), Arg (R), Phe (F), Tyr (T), His (H), Trp (W), предпочтительно Leu (L), Glu (E), или Gln (Q).

В отдельном варианте осуществления X₄ и X₅, одинаковые или разные, представляют собой любую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из серина (S), цистеина (C), аланина (A) и глицина (G).

В предпочтительном варианте осуществления X₄ представляет собой серин (S) или цистеин (C). В предпочтительном аспекте X₅ представляет собой аланин (A) или цистеин (C).

В отдельном варианте осуществления X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, одинаковые или разные, представляют собой любую аминокислоту, отличную от треонина (T) или серина (S). Предпочтительно X₆, X₇, X₈, X₉, X10, одинаковые или разные, выбирают из группы, состоящей из Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) и Ile (I).

Альтернативно, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, одинаковые или разные, могут представлять собой Leu (L), Glu (E), Gln (Q), Met (M), Lys (K), Arg (R), Phe (F), Tyr (T), His (H), Trp (W), предпочтительно Leu (L), Glu (E), или Gln (Q).

В предпочтительном варианте осуществления X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, одинаковые или разные, выбирают из группы, состоящей из Ala (A) и Gly (G).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления X6 и X7 являются одинаковыми и предпочтительно их выбирают из группы, состоящей из Ala (A) и Gly (G).

В предпочтительном варианте осуществления последовательность полипептидного линкера содержит или состоит из последовательности SEQ ID NO: 1, в которой

X₁, X₂ и X₃, одинаковые или разные, представляют собой треонин (T), серин (S);

X₄ представляет собой серин (S) или цистеин (C);

X₅ представляет собой аланин (A) или цистеин (C);

X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, одинаковые или разные, выбирают из группы, состоящей из Ala (A) и Gly (G).

В другом предпочтительном варианте осуществления последовательность полипептидного линкера содержит или состоит из последовательности SEQ ID NO: 1, в которой

X₁, X₂ и X₃, одинаковые или разные, представляют собой Ala (A) или Gly (G);

X₄ представляет собой серин (S) или цистеин (C);

X₅ представляет собой аланин (A) или цистеин (C);

X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, одинаковые или разные, выбирают из группы, состоящей из Ala (A) и Gly (G).

В случае, если мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент содержит больше, чем два разных Fab-фрагмента, полипептидные линкеры, разделяющие Fab-фрагменты, могут быть одинаковыми или разными.

Получение мультиспецифических антител:

Квалифицированный специалист может обратиться к международной патентной заявке WO2013/005194, включенной в данное описание путем отсылки, на предмет общих технических способов экспрессии мультиспецифических антител.

Кроме того, в этом документе описывается полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую белковую цепь молекулы или антитела изобретения. Указанный полинуклеотид также может содержать дополнительные последовательности: в частности, он может предпочтительно содержать последовательность, кодирующую лидерную последовательность или сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию указанной белковой цепи. Также раскрываются клетки-хозяева, трансформированные указанным полинуклеотидом.

В большинстве случаев аминокислотные последовательности разных моноклональных антител используются для создания ДНК-последовательностей, необязательно после оптимизации кодонов для экспрессии у млекопитающих. Для тяжелой цепи синтезируют ДНК, кодирующие сигнальные пептиды, вариабельную область и константный CH1 домен Fab1 с последующим шарнирным линкером и вариабельной областью, и константный CH1 домен Fab2 с фланкирующими последовательностями для расщепления рестрикционным ферментом. Для легкой цепи синтезируют ДНК, кодирующие сигнальные пептиды и вариабельную и константную каппа области.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелые и легкие цепи антител изобретения, встраиваются в векторы экспрессии. Легкие и тяжелые цепи могут быть клонированы в одни и те же или разные векторы экспрессии. Сегменты ДНК, кодирующие цепи иммуноглобулина, являются функционально связанными с контрольными последовательностями в векторе(ах) экспрессии, которые обеспечивают экспрессию полипептидов иммуноглобулина. Такие контрольные последовательности включают сигнальную последовательность, промотор, энхансер и последовательность терминации транскрипции. В большинстве случаев векторы экспрессии реплицируются в организмах-хозяевах или как эписомы или как неотъемлемая часть хромосомной ДНК хозяина. Обычно, векторы экспрессии содержат селективные маркеры, например, тетрациклин или неомицин, чтобы обеспечить возможность обнаружения клеток, трансформированных желательными последовательностями ДНК.

В одном примере обе последовательности, кодирующие тяжелые и легкие цепи (например, последовательности, кодирующие VH и VL, VH-CH1 и VL-CL, или полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь) включаются в один вектор экспрессии. В другом примере каждая из тяжелых и легких цепей антитела клонируется в отдельный вектор. В последнем случае векторы экспрессии, кодирующие тяжелые и легкие цепи, могут быть котрансфицированы в одну клетку-хозяина для экспрессии обеих цепей, которые могут объединяться, формируя интактные антитела или in vivo или in vitro. Альтернативно, вектор экспрессии, кодирующий тяжелую цепь, и вектор или векторы, кодирующие легкие цепи, могут быть введены в разные клетки-хозяева для экспрессии каждой из тяжелых и легких цепей, которые затем могут быть очищены и объединены с образованием интактных антител in vitro.

В отдельном варианте осуществления клетка-хозяин котрансфицируется тремя независимыми векторами экспрессии, такими как плазмиды, что приводит к совместному производству всех трех цепей (а именно, тяжелой цепи HC, и двух легких цепей LC1 и LC2, соответственно) и к секреции мультиспецифического, например, биспецифического антитела.

Конкретно, три вектора могут предпочтительно использоваться в следующем молекулярном отношении 2:1:1 (HC : LC1 : LC2).

Клетка-хозяин, трансфицированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, который кодирует тяжелую цепь, как определено в описании, может быть дополнительно трансформирована, по меньшей мере, двумя полинуклеотидами, кодирующими две разные легкие цепи: первую легкую цепь, которая специфически «спаривается» с первым VH/CH1 участком указанной тяжелой цепи; вторую легкую цепь, которая специфически «спаривается» со вторым VH/CH1 участком указанной тяжелой цепи.

В следующем варианте осуществления клетка-хозяин может быть дополнительно трансформирована полинуклеотидом, кодирующим третью легкую цепь, которая отличается от первой и второй легких цепей, и которая специфически спаривается с третьим VH/CH1 участком указанной тяжелой цепи.

Рекомбинантные векторы для экспрессии антител, описанных в этом документе, как правило, содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотные последовательности антитела, функционально связанные с промотором, или конститутивным или индуцибельным. Векторы могут быть пригодны для репликации и интеграции в клетки прокариот, эукариот или и те и другие. Типичные векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, инициирующие последовательности и промоторы, подходящие для регуляции экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело. Векторы необязательно содержат общие кассеты экспрессии, содержащие, по меньшей мере, одну независимую терминаторную последовательность, последовательности, обеспечивающие репликацию кассеты как в клетках прокариот, так и эукариот, т.е. шаттл-векторы, и маркеры селекции как для прокариотической, так и эукариотической систем.

Мультиспецифические, например, биспецифические антитела, описные в этом документе, могут продуцироваться в прокариотической или эукариотической системе экспрессии, такой как бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы, клетки растений, насекомых (например, с использованием бакуловирусного вектора) и клетки млекопитающих. Необязательно, чтобы рекомбинантные антитела изобретения были гликозилированными или экспрессировались в эукариотических клетках; однако экспресиия в клетках млекопитающих является, как правило, предпочтительной. Примерами подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих являются эмбриональные клетки почки человека (293 клетки), клетки почки новорожденного хомяка (BHK клетки), клетки яичников китайских хомячков /− или + DHFR (CHO, CHO-S, CHO-DG44, Flp-in CHO клетки), клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO клетки) и клетки печени человека (Hep G2 клетки).

Клеточные культуры тканей млекопитающих являются предпочтительными для экспрессии и продуцирования полипептидов, так как в данной области техники создано большое количество подходящих линий клеток-хозяев, способных секретировать интактные иммуноглобулины, включая CHO клеточные линии, различные Cos клеточные линии, клетки HeLa, предпочтительно линии клеток миеломы (такие как NS0) или трансформированные B-клетки или гибридомы.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления мультиспецифические, например, биспецифические антитела изобретения продуцируются путем использования CHO клеточной линии, наиболее предпочтительно CHO-S или CHO-DG-44 клеточных линий или их производных.

Векторы экспрессии для этих клеток могут включать последовательности контролирующие экспрессию, такие как точка начала репликации, промотор, энхансер и сайты, необходимые для обработки информации, такие как сайт связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательность, терминирующая транскрипцию. Предпочтительными последовательностями, контролирующими экспрессию, являются промоторы, полученные из генов иммуноглобулинов, SV40, аденовируса, вируса папилломы крупного рогатого скота, цитомегаловируса и тому подобного.

Векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, представляющие интерес (например, последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепь, и последовательности контролирующие экспрессию), могут быть перенесены в клетку-хозяина с помощью хорошо известных методов, варьирующих в зависимости от типа клеток-хозяев. Например, в отношении разных клеток-хозяев могут использоваться обработка фосфатом кальция или электропорация. (Смотри, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989). В том случае, когда тяжелые и легкие цепи клонированы в различные векторы экспрессии, чтобы получить экспрессию и сборку интактных иммуноглобулинов, векторы трансфицируются совместно.

Клетки-хозяева трансформируют или трансфицируют векторами (например, с помощью метода химической трансфекции или метода электропорации) и культивируют в стандартных питательных средах (или модифицированных подходящим образом) для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желательные последовательности.

Экспрессия антител может быть временной (транзиентной) или стабильной.

Предпочтительно, мультиспецифические, например, биспецифические антитела получают методами, обеспечивающими стабильную экспрессию, при этом клеточные линии стабильно трансфицированные ДНК, кодирующей все полипептидные цепи мультиспецифического, например, биспецифического антитела, такого как BiXAb-6567, способны к длительной экспрессии, обеспечивающей производство терапевтических средств. Например, стабильная экспрессия в клеточной линии CHO является особенно эффективной.

После того, как полные антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулинов настоящего изобретения экспрессированы, их можно изолировать или очистить с целью получения практически однородных препаратов для дальнейших анализов и применения. Могут использоваться стандартные методы очистки белков, хорошо известные в данной области техники. Например, подходящие методы очистки могут включать фракционирование на иммуноаффинных или ионообменных колонках, этаноловую преципитацию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC), электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), фракционирование сульфатом аммония и гель-фильтрацию (смотри, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982). Для фармацевтического использования предпочтительными являются практически чистые иммуноглобулины, однородные, по меньшей мере, примерно на 90 - 95%, и наиболее предпочтительными являются иммуноглобулины с однородностью 98 - 99%.

Продуцирование in vitro дает возможность масштабирования для получения больших количеств желательных мультиспецифических, например, биспецифических антител изобретения. Такие методы могут использовать однородную суспензионную культуру, например, в аэролифтном реакторе или в реакторе с непрерывным смешиванием, или иммобилизованную или инкапсулированную клеточную культуру, например, в пустотелых волокнах, микрокапсулах, на микрогранулах агарозы или керамических картриджах.

Применение

Белковые конструкции или мультиспецифические антитела изобретения могут использоваться во всех областях применения мультиспецифических антител. В частности, они могут использоваться для получения медикаментов, пригодных для применения в широком диапазоне терапевтических и диагностических методов у пациентов (конъюгированные с радиоактивными, флуоресцентными, хемилюминесцентными или любыми другими метками), или in vitro, (например, для окрашивания клеток или тканей при применении методов иммуногистохимии, иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции). Эти медицинские и диагностические продукты являются также частью предмета изобретения.

Следующим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая белковую конструкцию или антитело согласно изобретению. Другим аспектом изобретения является использование белковой конструкции или антитела согласно изобретению для производства фармацевтической композиции. Следующим аспектом изобретения является способ производства фармацевтической композиции, содержащей белковую конструкцию или антитело согласно изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет композицию, например, фармацевтическую композицию, содержащую белковую конструкцию или антитело как определено в этом документе, заключенное в состав вместе с фармацевтическим носителем.

Композиция настоящего изобретения может быть введена с помощью целого ряда способов, известных в данной области техники.

Следующие примеры предоставляются в качестве иллюстрации и не предназначаются для ограничения настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Получение биспецифического антитела изобретения BiXAb-6567

Синтез гена

Для создания ДНК последовательностей использовали аминокислотные последовательности анти-CD38 (даратумумаб) и анти-PDL1 (атезолизумаб), после оптимизации кодонов для экспрессии у млекопитающего при помощи программы GeneScript. Эти антитела называются “исходное” анти-CD38 и ”исходное” анти-PD-L1 mAbs.

ДНК-конструкция тяжелой цепи была создана в таком виде: сигнальный пептид, за которым следует последовательность SEQ ID NO:7 [состоящая из вариабельной области, с последующим константным CH1 доменом Fab1 (анти-CD38), в который были введены мутации Leu на Gln и Ser на Val согласно Kabat в положениях 124 и 188 согласно Kabat, соответственно, за которым следует линкер, а затем вариабельная область, за которой следует константный CH1 домен Fab2 (анти-PD-L1), в который введена мутация Thr на Asp в положении 192 согласно Kabat]; фланкирующие последовательности для расщепления рестрикционным ферментом были введены на обоих концах ДНК-конструкции тяжелой цепи. ДНК-конструкция для легкой цепи была создана в таком виде: сигнальный пептид (SEQ ID NO:21), за которым следует вариабельный участок, а затем константная каппа область. Для анти-CD38 легкой цепи (SEQ ID NO:15) мутации были введены в положениях 143 (Leu на Gln) и 188 (Ser на Val) согласно Kabat в константный каппа домен. Для анти-PDL1 легкой цепи (SEQ ID NO:18) мутации в положениях 133 (Val на Thr) и 176 (Ser на Val) согласно Kabat были введены в константный каппа домен. Все ДНК-конструкции были синтезированы компанией Gene Art.

PCR-реакции проводили с использованием PfuTurbo Hot Start, чтобы амплифицировать вставки, которые затем были обработаны NotI и ApaI, и NotI и HindIII для тяжелой и легкой цепей, соответственно. Расщепленные двойные фрагменты тяжелой цепи лигировали с NotI и ApaI, обработанными pcDNA3.1 вектором экспрессии (Invitrogen), в который уже были «вставлены» шарнир человеческого IgG1 с последующими CH2-CH3 доменами. Расщепленные двойные фрагменты легкой цепи лигировали с NotI и HindIII , обработанными pcDNA3.1 вектором экспрессии (Invitrogen). Плазмидные ДНК верифицировали секвенированием двухцепочечной ДНК.

Экспрессия и очистка

Биспецифическое антитело BiXAb-6567 было получено с использованием транзиентной экспрессии генов путем котрансфекции 3 генов, кодированных на отдельных векторах в молекулярном соотношении 2:1:1 = HC:LC1:LC2 (1 непрерывная тяжелая цепь (HC) и 2 легких цепи (LC)) в CHO-S клетках, адаптированных к бессывороточной среде, в суспензии (CHO SFM-II среда, Life Technologies™). Обычно, для экспрессии в масштабе 50 мл, всего 50 мкг плазмидной ДНК (25 мкг тяжелой цепи, 12,5 мкг анти-CD38 легкой цепи и 12,5 мкг анти-PD-L1 легкой цепи) смешали в 1,5 мл пробирке Эппендорф, затем добавили 1 мл CHO SFM среды, содержащей 25 мкл 3 мг/мл PEI реактива для трансфекции pH7,0 (Polyplus), затем реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем смесь DNA-PEI добавили к 49 мл CHO-S клеток (Life Technologies’ Invitrogen FreeStyle™) при 1~2x 10⁶/мл в 125мл встряхиваемую колбу. Клетки встряхивали в течение 6 дней. Супернатант собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут. Титр экспрессии BiXAb-6567 в супернатанте определяли с использованием ForteBio биосенсоров протеина А (Octet® Systems). Затем очищали BiXAb-6567 с помощью аффинной хроматографии на основе смолы с белком А (MabSelect SuRe, GE Healthcare Life Sciences). Антитело элюировали с белка А, используя 0,1 M глицин pH 3.5, и элюат нейтрализовали 1 M TRIS. Очищенное антитело в PBS по Дульбекко (Lonza) стерильно фильтровали (0,2 мкM стерильные фильтры, Techno Plastic Products AG) и определяли конечную концентрацию, измеряя оптическую плотность (OD) при 280 нм (Eppendorf BioSpectrometer®).

В большинстве случаев BiXAab-6567 демонстрировало хороший титр экспрессии (> 180 мг/литр) при транзиентной CHO экспрессии. Этот уровень экспрессии сравним с уровнем экспрессии, наблюдаемым с обычными моноклональными антителами.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS

Для оценки качества очищенного BiXAb-6567 мы провели SDS-PAGE (Experion™ автоматизированная электрофоретическая система, BioRad). В присутствии додецилсульфата натрия (SDS) в подвижном буфере скорость, с которой антитело перемещается в геле, зависит главным образом от его размера, что дает возможность определения молекулярной массы. Это анализ был проведен при невосстанавливающих условиях и при восстанавливающих условиях; последние допускают разрушение дисульфидных связей и, следовательно, визуализацию отдельных полипептидных цепей (легких цепей и тяжелой цепи).

Результаты SDS-PAGE представлены на фиг. 1. При невосстанавливающих условиях четвертичная структура антитела сохраняется, и наблюдаемая молекулярная масса должна представлять собой сумму молекулярных масс разных тяжелых и легких цепей. Биспецифическое антитело изобретения (BiXAb-6567) состоит из шести цепей: двух тяжелых цепей и четырех легких цепей. Теоретическая молекулярная масса BiXab-6567 составляет 244.40 kDa, если не учитывать пост-трансляционные модификации (PTM), например, N-гликозилирование в Fc на аспарагине 297. Гель калибровали при помощи смеси стандартов известной молекулярной массы. При невосстанавливающих условиях результатом является основная полоса, почти равная стандарту с молекулярной массой 250 kDa, что соответствует вычисленной молекулярной массе и предполагаемому гликозилированию двух аспарагинов в положении 297 в Fc домене. При восстанавливающих условиях дитиотреитол (DTT) дополнительно денатурирует BiXAb-6567 путем восстановления дисульфидных связей и разрушения четвертичной структуры, и таким образом шесть полипептидных цепей должны перемешаться по отдельности в геле в соответствии с их молекулярной массой. Две идентичные тяжелые цепи BiXAb-6567 совместно перемещаются в виде одной полосы, и две пары легких цепей, благодаря их почти одинаковой молекулярной массе, совместно перемещаются в виде второй полосы. Следовательно, результаты показали две основных полосы, приблизительно 75 kDa и 25 kDa, исходя из подвижности стандартов с известной молекулярной массой. Каждая тяжелая цепь имеет один сайт N-гликозилирования на аспарагине 297, который объясняет ширину полосы более высокой молекулярной массы, при этом наблюдаемая молекулярная масса немного выше, чем вычисленная (75.44 kDa); это увеличение является типичным для гликозилированных белков. Рассчитанные молекулярные массы легких цепей анти-CD38 (23.40 kDa) и анти-PD-L1 (23.36 kDa) очень близки, что приводит к их совместному перемещению.

В заключение, SDS-PAGE BiXAb-6567 продемонстрировал ожидаемые профили, как при невосстанавливающих, так и при восстанавливающих условиях, и согласовывался с рассчитанными теоретическими молекулярными массами, при принятии во внимание существования сайта N-гликозилирования в тяжелой цепи.

Анализ с помощью эксклюзионной хроматографии

В созданных инженерным путем белковых молекулах часто наблюдается белковая агрегация. Мы провели анализ с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC), чтобы количественно оценить содержание высокомолекулярных соединений в препарате аффинно-очищенного в одну стадию BiXAb-6567 (смотри раздел Экспрессия и Очистка вариантов). Мы использовали SEC-s3000 (300x 7,8 мм) колонку (BioSep) и систему Aktapurifier 10 (GE Healthcare); анализ проводили при скорости потока 1 мл/мин используя PBS буфер pH 7.4.

SEC хроматограмма, представленная на фиг. 2, показала, что главный пик соответствовал ожидаемому размеру мономерного BiXAb-6567; этот пик представлял 98,2% всего образца. В дополнение к этому, наблюдался небольшой пик, соответствующий молекулам более высокой молекулярной массы (возможно димерам); этот пик представлял 1,8% всего образца. Таким образом, мы смогли сделать вывод о том, что процентное содержание молекул с более высокой молекулярной массой является незначительным и сходным с обычными моноклональными антителами, продуцируемыми в CHO системах экспрессии. Узкая и симметричная форма мономерного пика дает основание считать, что BiXAb-6567 было правильно собрано и было представлено одной разновидностью (молекул).

Пример 2. Характеристика BiXAb-6567 при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC)

Для сравнения термической стабильности BiXAb-6567, исходного анти-CD38 mAb и исходного анти-PD-L1 mAb использовали дифференциальную сканирующую калориметрию (DSC). Для проведения экспериментов по дифференциальной сканирующей калориметрии использовали систему MicrocalTM VP-Capillary DSC (Malvern Instruments).

Все образцы центрифугировали (20,000x g, 5 мин, 4°C) и количественно определяли в них содержание белка до DSC анализа с использованием спектрофотометра Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific), применяя программу анализа IgG. Для исследования все образцы разбавили в PBS до конечной концентрации 1мг/мл.

Время до установления равновесия составляло 3 минуты, а термограммы были получены в интервале от 20 до 110°C при скорости сканирования 60°C/час, периоде фильтрования 25 секунд и средней обратной связи (medium feedback). Перед анализом образца было измерено 5 сканов буфер/буфер, для того чтобы стабилизировать прибор, при этом сканирование буфер/буфер проводили между каждым сканом белок/буфер. Результаты соответствовали non-2-state модели разворачивания с пре- и пост- переходом, скорректированным вычитанием базового.

DSC кривые, представленные на фиг. 3 (диапазон от 50 до 100°C), продемонстрировали способ, в котором отдельные Fv области могут привести к разным профилям разворачивания Fab; этот эксперимент также продемонстрировал, что Fv области обусловливают наблюдаемую стабильность Fabs. DSC профиль анти-CD38 mAb продемонстрировал два перехода: большой пик, имеющий Cp max 170 ккал/моль/°C и Tm1 70,9°C, соответствующий разворачиванию обоих и CH2 и Fab доменов, и маленький пик, имеющий Cp max 20 ккал/моль/°C и Tm2 81,5°C, соответствующий разворачиванию CH3 домена. DSC профиль анти-PD-L1 mAb продемонстрировал два перехода: маленький пик, имеющий Cp max 20 ккал/моль/°C и Tm1 69,9°C, соответствующий разворачиванию CH2 домена, и большой пик, имеющий Cp max 160 ккал/моль/°C и Tm2 83,4°C, соответствующий разворачиванию обоих и CH3 и Fab доменов.

DSC профиль BiXAb-6567 также продемонстрировал два перехода с двумя большими пиками. Первый пик имел Cp max 130 ккал/моль/°C и Tm1 71,5°C и соответствовал разворачиванию CH2 и Fab доменов анти-CD38 mAb; второй пик имел Cp max 170 ккал/моль/°C и Tm2 81,5°C и соответствовал разворачиванию CH3 и Fab доменов анти-PD-L1 mAb. Таким образом, DSC профиль BiXAb-6567 напоминал суперпозицию двух DSC профилей двух исходных mAbs и иллюстрировал отличную сборку и стабильность BiXAb-6567. Tonset BiXAb-6567 (63,3°C) был сходен с показанием исходного mAbs (анти-CD38 Tonset=63,5°C и анти-PD-L1 Tonset=63,2°C), демонстрируя, что BiXAb-6567 обладал параметрами стабильности, сходными с параметрами исходных антител. Вычисленный ΔH BiXAb-6567 составлял 1560 ккал/моль, отражая бóльший размер биспецифической молекулы относительно двух исходных антител (анти-CD38 ΔH =963 ккал/моль и анти-PD-L1 ΔH =820 ккал/моль).

Определения:

Tm или температура денатурации/плавления – это точка, в которой концентрация несвернутых и свернутых молекул является равной, и является срединной точкой конформационных переходов с разворачиванием. Как параметр он описывает чувствительность белка к термической денатурации и, таким образом, имеет отношение к стабильности белка. Чем выше Tm, тем более стабилен белок.

Tonset – это температура, при которой начинается конформационный переход с разворачиванием. Значения для этого параметра обычно составляют величину на 5-10°C ниже, чем Tm. Это также параметр, описывающий стабильность белка, но также применим в отношении устойчивости к термической денатурации.

ΔH – это калориметрическая энтальпия разворачивания, которая отражает разрушение внутримолекулярных взаимодействий в белке (т.е. разрушение внутри- и меж-доменных взаимодействий). Процесс термического разворачивания является эндотермическим и вследствие этого дает положительные величины энтальпии. Калориметрическая энтальпия (ΔH) представляет собой площадь под пиком термического конформационного перехода с разворачиванием.

Пример 3. Свойства бесклеточного связывания BiXAb-6567

Прямой планшетный ELISA-анализ связывания антигена CD38

100 мкл или исходного mAb, анти-CD38 или анти-PDL1, каждый в концентрации 3 мкг/мл, приготовленные разведением с PBS pH 7.4, использовали для покрытия Maxisorp планшетов при 4°C в течение ночи. Также, BiXAb-6567, в концентрации 5 мкг/мл, приготовленный путем разведения с PBS pH 7.4, использовали для покрытия Maxisorp планшетов при 4°C в течение ночи. Планшеты 5 раз промывали 1x PBS, содержащим 0,05% Твин-20 (PBST), а затем блокировали с использованием 200 мкл/лунку 1% BSA в 1x PBS при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем планшеты 5 раз промывали с 1x PBST. Была приготовлена семиточечная серия 3-кратного разведения рекомбинантного His/Flag-меченого CD38 (Creative Biomart) в 1x PBS, начиная при 1 мкг/мл; 100 мкл каждой стадии разведения добавили на лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа и 5 раз промывали с 1x PBST. Добавили 100 мкл/лунку анти-Flag-tag антитело-конъюгированной HRP (Abcam), разбавленной в 10,000 раз в 1x PBS, и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После 5 промывок с 1x PBST добавили 100 мкл/лунку TMB субстрата в 1x PBS для получения колориметрических данных, и планшеты инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре для появления цвета. Результаты анализа считывали с помощью ридера для микропланшетов Victor2 (Perkin Elmer) при 650нм.

BiXAb-6567 продемонстрировало дозозависимую кривую связывания, очень схожую с кривой исходного анти-CD38 антитела (фиг. 4A). Значение EC50 PD-L1 связывания для обоих антител были следующие: EC50[BiXAb-6567] = 171 нг/мл и EC50[анти-CD38] = 199 нг/мл. Этот результат дает основание полагать, что BiXAb-6567 имеет правильно собранные анти-CD38 Fab домены, поскольку оно демонстрировало связывание, сходное со связыванием исходного анти-CD38 mAb. Исходное анти-PDL1 mAb, использованное в качестве отрицательного контроля, не продемонстрировало какого-либо связывания, как ожидалось.

Прямой ELISA-анализ связывания антигена PDL1.

100 мкл биотинилированного человеческого PD-L1 белка (AcroBiosystems) при концентрации 1 мкг/мл, приготовленного путем разведения с 1x PBS pH7.4, использовали для покрытия Maxisorp планшетов при 4°C в течение ночи. Планшеты 5 раз промывали PBST, и затем блокировали с 200 мкл/лунку 1% BSA в 1x PBS при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем планшеты 5 раз промывали 1x PBST. Были приготовлены семиточечные серии 3-кратного разведения или анти-CD38 mAb (начиная с 0,3 мг/мл), или анти-PD-L1 mAb (начиная с 0,3 мг/мл), или BiXAb-6567 (начиная с 0,5 мг/мл) в 1x PBS; 100 мкл каждой стадии разведения добавили на лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа и промывали 5 раз с 1x PBST. Добавили 100 мкл/лунку анти-человек антитело (IgG H&L)-конъюгированной HRP (Abliance), разбавленной в 5,000 раз в 1x PBS, и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После 5 промывок 1x PBST добавили 100 мкл/лунку TMB субстрата в 1x PBS для получения колориметрических данных, и планшеты инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре для появления цвета. Результаты анализа считывали с помощью ридера для микропланшетов (Perkin Elmer) при 650 нм.

BiXAb-6567 продемонстрировало дозозависимую кривую связывания, очень схожую с кривой исходного анти-PD-L1 антитела (фиг. 4B). Значение EC50 PD-L1 связывания для обоих антител были следующие: EC50[BiXAb-6567] = 93 нг/мл и EC50[анти-PD-L1] = 72 нг/мл. Этот результат дает основание полагать, что BiXAb-6567 имеет правильно собранные анти-PD-L1 Fab домены, поскольку оно демонстрировало связывание, сходное со связыванием исходного анти-PD-L1 mAb. Исходное анти-CD38 mAb, использованное в качестве отрицательного контроля, не продемонстрировало какого-либо связывания, как ожидалось.

ELISA-анализ связывания двух антигенов

100 мкл рекомбинантного человеческого Fc-меченого CD38 (Creative BioMart) при 2 мкг/мл, приготовленного путем разведения с 1x PBS pH7.4, использовали для покрытия планшетов Maxisorp при 4°C в течение ночи. Планшеты промывали 5 раз 1x PBST, а затем блокировали 200 мкл/лунку 1% BSA в 1x PBS при комнатной температуре в течение 2 часов. Планшеты промывали 5 раз 1x PBST. Приготовили серии семиточечных трехкратных разведений в 1x PBS BiXAb-6567 (начиная с 1 мкг/мл) и добавили 100 мкл каждой стадии разведения на лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, потом промыли 5 раз 1x PBST. Затем добавили 100 мкл/лунку 1 мкг/мл биотинилированного человеческого PD-L1 (AcroBiosystems) в 1x PBS и инкубировали планшеты при комнатной температуре в течение 1 часа. После 5 промывок с 1x PBST добавили 100 мкл/лунку 0,1 мкг/мл конъюгированной со стрептавидином HRP (Biotechne), приготовленной путем разведения с использованием 1x PBS. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После 5 промывок с использованием 1x PBST добавили 100 мкл/лунку TMB субстрата в 1x PBS для получения колориметрических данных, и планшеты инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре для появления цвета. Результаты анализа считывали с помощью ридера для микропланшетов Victor2 (Perkin Elmer) при 650 нм.

BiXAb-6567 продемонстрировало дозозависимую кривую связывания в двойном формате ELISA, давая основание полагать, что оно имеет правильно собранные анти-CD38 и анти-PD-L1 Fab домены (фиг. 4C). Таким образом, было показано, что BiXAb-6567 является биспецифическим антителом, способным к одновременному связыванию CD38 и PD-L1 с EC50=144 нг/мл. Два исходных mAbs, анти-CD38 или анти-PDL1, не продемонстрировали какого-либо связывания в этом двойном формате ELISA, как ожидалось.

Пример 4. Определение относительной активности связывания при помощи сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS)

CHO-CD38 клетки (CHO клетки, стабильно трансфицированные полноразмерным человеческим CD38) культивировали в среде DMEM-Glutamax-I с добавлением 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 500 мкг/мл генетицина. SKOV-3 клетки и RPMI-8226 клетки культивировали в среде RPMI 1640-Glutamax-I 100 с добавлением 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки.

Использовали 3x10⁵ клеток (CHO-CD38, или SKOV-3, или RPMI-8226) на каждый образец. Клетки промывали 1x PBA раствором (PBS с добавлением 1% BSA и 0,05% Na-азида). Для определения FACS-профилей клетки окрашивали соответствующими антителами при концентрации 50мкг/мл в объеме 30 мкл. Для титрования BiXAb-6567 и исходного анти-CD38 антитела и последующего определения параметров связывания CHO-CD38 клетки окрашивали соответствующими антителами в указанных концентрациях в объеме 30 мкл. Клетки инкубировали в течение 30 минут на льду и затем промывали 2 раза 1 мл PBA раствора. Клетки инкубировали с флуоресцентно-мечеными анти-человек каппа или анти-человек IgG Fc гамма-специфическими вторичными антителами на льду в темноте в течение 30 минут и затем промывали 2 раза 1 мл PBA раствора; в конце клетки ресуспендировали в конечном объеме 500 мкл PBA раствора. Образцы исследовали с использованием проточного цитометра Epics-XL или Navios (Beckman Coulter). В каждом эксперименте набиралось 10000 событий.

Профили связывания BiXAb-6567 и исходного анти-CD38 и анти-PD-L1 исходного антител представлены на фиг. 5A-C. Мы выбрали для теста линию клеток множественной миеломы, RPMI-8226, которые экспрессируют высокие уровни CD38 и незначительные уровни PD-L1 (фиг. 5A); линию клеток CHO-CD38, которые экспрессировали очень высокий уровень CD38 вследствие стабильно трансфицированного полноразмерного CD38 (фиг. 5B); и линию клеток рака яичника SKOV-3, которые, как известно, экспрессируют PD-L1 (фиг. 5C). Эти профили демонстрировали один пик для BiXAb-6567, который был очень похож на профили обоих исходных антител на 3 клеточных линиях. Это дает основание полагать, что BiXAb-6567 является правильно свернутым и обладает свойствами связывания, сходными со свойствами исходных антител. Как и ожидалось, CHO-CD38 экспрессировали только CD38 и не экспрессировали PD-L1, тогда как SKOV-3 экспрессировали только PD-L1 и не экспрессировали CD38.

Для того, чтобы количественно подтвердить, что свойства связывания BiXAb-6567 сходны со свойствами исходного анти-CD38 антитела, титрование BiXAb-6567 и анти-CD38 исходного антитела проводили с использованием CHO-CD38 клеток, как показано на фиг. 6. Было установлено, что EC50 BiXAb-6567 составляет 17,1 нM, а исходного анти-CD38 составляло 8,5 нM, что подтверждает сходные свойства связывания анти-CD38 Fab доменов в BiXAb-6567 и в исходном анти-CD38 антителе. Отрицательные контроли в этом эксперименте, анти-PD-L1 и анти-CD20 антитела, продемонстрировали отсутствие связывания с CHO-CD38 клетками, как и ожидалось.

Пример 5. Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC) с нефракционированными не активированными предварительно мононуклеарными клетками (MNC)

Клетки CHO-CD38, SKOV-3 и RPMI-8226 культивировали, как описано в Примере 4 выше.

Для получения MNC использовали следующую процедуру. Только что извлеченную периферийную кровь обработали цитратом для предотвращения свертывания. Потом 5мл раствора Ficoll-Paque PLUS наслаивали с 6 мл цельной крови, обработанной антикоагулянтом. Образцы центрифугировали в течение 20 минут при 2500 об/мин при RT без последующего разрушения центрифугированием. MNC собирали с поверхности контакта плазма/фиколл. Суспензию MNC клеток разводили 1:10 в PBS и центрифугировали в течение 5 минут при 1800 об/мин при комнатной температуре. Супернатант удаляли, а эритроциты лизировали добавлением 45 мл охлажденной до температуры льда дистиллированной воды к клеточной суспензии на 30 секунд, после чего добавили 5 мл 10x PBS. Клетки центрифугировали в течение 5 минут при 1800 об/мин при комнатной температуре и промывали 1x PBS три раза, чтобы удалить тромбоциты. Наконец, клетки ресуспендировали в 5 мл среды для культивирования клеток. Количество клеток регулировали до достижения соотношения 40:1= эффекторные клетки: опухолевые клетки в ADCC анализе.

Для проведения теста ADCC с выведением радиоактивного ⁵¹хрома 1x10⁶ клеток-мишеней (RPMI 8226, SKOV-3 или CHO-CD38) инкубировали с 100микрокюри ⁵¹хрома в 200 мкл PBS в течение 2 часов при 37°C и 5% CO2. После 2 часов инкубации клетки три раза промывали 7 мл среды и, наконец, ресуспендировали при концентрации 0,1 x 10⁶ клеток/мл. Клетки-мишени (5,000 клеток/лунку) и MNC в присутствии антител инкубировали в 96-луночном микротитровальном планшете (объем пробы 200мкл) в течение 3 часов при 37°C и 5% CO2. Для определения максимального лизиса клеток-мишеней (= максимальное число импульсов в минуту (cpm)) добавляли Тритон X-100. Чтобы определить базовое высвобождение ⁵¹хрома (= базовое cpm), клетки-мишени не подвергались дальнейшим манипуляциям. После 4 часов инкубации микротитровальные планшеты центрифугировали в течение 5 минут при 2000 об/мин и 25 мкл супернатанта смешали с 125 мкл Optiphase Supermix (Perkin Elmer) и инкубировали в шейкере-инкубаторе в течение 1 минуты. Образцы анализировали при помощи счетчика бета-частиц MicroBeta TriLux (Perkin Elmer). Лизис клеток-мишеней вычисляли, используя следующую формулу:

% лизиса= (экспериментальное cpm – базовое cpm)/(максимальное cpm – базовое cpm) x 100.

Все измерения проводили по три раза.

ADCC анализ CD38+ клеток (RPMI-8226 и CHO-CD38) проводили с использованием не активированных предварительно MNC в качестве эффекторных клеток (фиг. 7 и 8) Анализ показал сильную цитотоксичность BiXAb-6567 и анти-CD38 антитела на RPMI-8226 клетках с EC50 0,8 нM и 0,3 нM, соответственно; на CHO-CD38 клетках цитотоксичность BiXAb-6567 и анти-CD38 антитела составляла EC50 0,2 нM и 0,07 нM, соответственно. Анти-PD-L1 продемонстрировали минимальную активность на обеих клеточных линиях; два отрицательных контрольных mAbs, анти-CD20 и анти-HER2, не способствовали лизису, как ожидалось. Эти результаты продемонстрировали сильную ADCC активность BMX-6567 против CD38+ клеток, которая сходна с активностью исходного анти-CD38 антитела.

Пример 6. ADCC с использованием обогащенных предварительно активированных NK клеток

Клетки SKOV3, RPMI 8226 и CHO-CD38 культивировали, как описано в Примере 4. MNC получали, как описано в Примере 5. NK-клетки отделяли от MNC с помощью негативной селекции, используя “набор для изолировании NK-клеток человека” (Miltenyi) согласно инструкциям производителя. NK-клетки культивировали в течение ночи при плотности посева 2x10⁶ клеток/мл в среде RPMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Добавили IL-12 или IL-15 до конечной концентрации 10 нг/мл. ADCC анализы проводили, как уже указано в Примере 5, за исключением того, что выдерживали отношение Эффекторная клетка : Опухолевая клетка 10:1, и продолжительность реакции была уменьшена до 3 часов.

ADCC свойства анти-PD-L1 фрагмента BiXAb-6567 были проанализированы на PD-L1+ клеточной линии SKOV-3 с использованием обогащенных NK-клеток, предварительно активированных или IL-12 или IL-15. Результаты представлены на фиг. 9 и 10. Этот эксперимент сравнил ADCC свойства BiXAb-6567 со свойствами исходного анти-PD-L1 антитела; в качестве положительного контроля использовали анти-HER2 антитело и в качестве отрицательных контролей анти-CD20 антитело и исходное анти-CD38 антитело, по той причине, что SKOV-3 клетки являются PD-L1+/HER2+/CD20-/CD38-. Фиг. 9 и 10 показывают сильную ADCC активность BiXAb-6567 и исходных анти-PD-L1 антител, независимо от того, применялся ли IL-12 или IL-15 при культивировании NK-клеток. Значения EC50 BiXAb-6567 и исходных анти-PD-L1 антител составляли 0,007 нM и 0,03 нM, соответственно, при использовании IL-12. Профили были даже более похожи при использовании IL-15; однако построенные по точкам кривые не сходились, таким образом, препятствуя вычислению значений EC50. Эти результаты демонстрируют сильную ADCC активность BMX-6567 против PD-L1+ клеток, которая сходна с активностью исходного анти-PD-L1 антитела.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> BIOMUNEX Pharmaceuticals

<120> Stable bispecific antibodies

<130> B2466

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker sequence 1

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 1

Glu Pro Lys Xaa Cys Asp Lys Xaa His Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa

20 25 30

Gly Gly

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker sequence 2

<400> 2

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Gly Pro Gly

20 25 30

Gly Gly

<210> 3

<211> 34

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker sequence 3

<400> 3

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala

20 25 30

Gly Gly

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker sequence 4

<400> 4

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Gly Pro Ala Pro Gly

20 25 30

Gly Gly

<210> 5

<211> 34

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker sequence 5

<400> 5

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser

20 25 30

Gly Gly

<210> 6

<211> 34

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker sequence 6

<400> 6

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser

20 25 30

Gly Gly

<210> 7

<211> 702

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Gln Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Val Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Glu Val

245 250 255

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

260 265 270

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile

275 280 285

His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp

290 295 300

Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

305 310 315 320

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

325 330 335

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

340 345 350

Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

355 360 365

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

370 375 380

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

405 410 415

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

420 425 430

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Asp Val Pro Ser Ser Ser Leu

435 440 445

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

450 455 460

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

465 470 475 480

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

485 490 495

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

500 505 510

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

515 520 525

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

530 535 540

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

545 550 555 560

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

565 570 575

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

580 585 590

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

595 600 605

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

610 615 620

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

625 630 635 640

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

645 650 655

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

660 665 670

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

675 680 685

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

690 695 700

<210> 8

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 98

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH1 of daratumumab

<400> 9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Gln Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Val Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH of atezolizumab

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 98

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH1 of atezolizumab

<400> 11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Asp Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 13

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 15

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LC daratumumab

<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Thr Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Val

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ckappa of daratumumab

<400> 17

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Thr Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Val Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LC atezolizumab

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL atezolizumab

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ckappa atezolizumab

<400> 20

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> signal peptide

<400> 21

Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<---

1. Белковая конструкция, которая обеспечивает образование соответствующих пар тяжелой/легкой цепей и предотвращает их ошибочное спаривание, которая содержит по меньшей мере один мутированный Fab-фрагмент, который выбирают из

a) Fab-фрагмента, состоящего из

VH и VL доменов представляющего интерес антитела;

CH1 домена, полученного из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка треонина в положении 192 указанного CH1 домена на аспарагиновую кислоту, и

CL домена, полученного из CL домена иммуноглобулина путем замены аспарагиновой кислоты в положении 137 указанного CL домена на остаток лизина и замены остатка серина в положении 114 указанного CL домена на остаток аланина; и

b) Fab-фрагмента, состоящего из

VH и VL доменов представляющего интерес антитела;

CH1 домена, полученного из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка лейцина в положении 124 указанного CH1 домена на глутамин и замены остатка серина в положении 188 указанного CH1 домена на остаток валина; и

CL домена, полученного из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка валина в положении 133 указанного CL домена на остаток треонина и замены остатка серина в положении 176 указанного CL домена на остаток валина.

2. Белковая конструкция по п. 1, которая содержит или состоит из мультиспецифического антигенсвязывающего фрагмента, содержащего по меньшей мере два Fab-фрагмента с разными CH1 и CL доменами, при этом каждый Fab-фрагмент распознает иной представляющий интерес эпитоп и указанные Fab-фрагменты располагаются последовательно в любом порядке, C-концевая область CH1 домена первого Fab-фрагмента соединяется с N-концевой областью VH домена следующего Fab-фрагмента посредством полипептидного линкера,

причем по меньшей мере один Fab-фрагмент состоит из указанного мутированного Fab-фрагмента, предпочтительно при этом два Fab-фрагмента являются мутированными Fab-фрагментами.

3. Белковая конструкция по п. 2, которая является мультиспецифическим антителом, имеющим два идентичных антигенсвязывающих плеча, каждое из которых состоит из указанного мультиспецифического антигенсвязывающего фрагмента.

4. Белковая конструкция по п. 3, которая имеет иммуноглобулинподобную структуру, содержащая

два идентичных антигенсвязывающих плеча, каждый из которых состоит из указанного мультиспецифического антигенсвязывающего фрагмента;

димеризованные CH2 и CH3 домены иммуноглобулина;

шарнирную область IgA, IgG или IgD, связывающую C-концевые области CH1 доменов антигенсвязывающих плеч с N-концевыми областями CH2 доменов.

5. Белковая конструкция по п. 4, которая предпочтительно является биспецифическим антителом и содержит по меньшей мере две тяжелые цепи и четыре легкие цепи,

причем каждая тяжелая цепь содержит

a) Fc-область иммуноглобулина, содержащую шарнирный-CH2-CH3 домен,

b) при этом Fc-область соединяется с Fab тяжелой цепи CH1-VH антитела 1 (Ab1) при помощи указанного шарнирного домена,

c) который в свою очередь соединяется с Fab тяжелой цепи CH1-VH антитела 2 (Ab2) при помощи последовательности полипептидного линкера, и последовательность полипептидного линкера соединяет N-конец указанного Fab тяжелой цепи VH домена Ab1 с C-концом указанного CH1 домена Ab2,

и четыре легкие цепи содержат Fab легких цепей CL-VL Ab1 и Fab легких цепей CL-VL Ab2, связанные с их родственными доменами тяжелой цепи;

причем Ab1 и Ab2 распознают разные эпитопы,

и при этом Fab CH1 домен одного из Ab1 или Ab2 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка треонина в положении 192 указанного CH1 домена на аспарагиновую кислоту, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка аспарагина в положении 137 указанного CL домена на остаток лизина и замены остатка серина в положении 114 указанного CL домена на остаток аланина, и/или

при этом Fab CH1 домен одного или другого из Ab1 или Ab2 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка лейцина в положении 124 указанного CH1 домена на глутамин и замены остатка серина в положении 188 указанного CH1 домена на остаток валина, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка валина в положении 133 указанного CL домена на остаток треонина и замены остатка серина в положении 176 указанного CL домена на остаток валина.

6. Белковая конструкция по п. 5, в которой Fab CH1 домен Ab1 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка треонина в положении 192 указанного CH1 домена на аспарагиновую кислоту, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка аспарагина в положении 137 указанного CL домена на остаток лизина и замены остатка серина в положении 114 указанного CL домена на остаток аланина, и в которой Fab CH1 домен Ab2 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка лейцина в положении 124 указанного CH1 домена на глутамин и замены остатка серина в положении 188 указанного CH1 домена на остаток валина, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка валина в положении 133 указанного CL домена на остаток треонина и замены остатка серина в положении 176 указанного CL домена на остаток валина.

7. Белковая конструкция по п. 5, в которой Fab CH1 домен Ab2 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка треонина в положении 192 указанного CH1 домена на аспарагиновую кислоту, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка аспарагина в положении 137 указанного CL домена на остаток лизина и замены остатка серина в положении 114 указанного CL домена на остаток аланина, и в которой Fab CH1 домен Ab1 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка лейцина в положении 124 указанного CH1 домена на глутамин и замены остатка серина в положении 188 указанного CH1 домена на остаток валина, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка валина в положении 133 указанного CL домена на остаток треонина и замены остатка серина в положении 176 указанного CL домена на остаток валина.

8. Белковая конструкция по любому из пп. 2-7, в которой последовательность полипептидного линкера содержит или состоит из аминокислотной последовательности EPKX₁CDKX₂HX₃X₄PPX₅PAPELLGGPX₆X₇PPX₈PX₉PX₁₀GG (SEQ ID NO:1), где X₁, X₂, X_3, X₄, X_5, X₆, X₇, X_8, X₉, X₁₀, одинаковые или разные, представляют собой любую аминокислоту.

9. Белковая конструкция по п. 8, в которой последовательность полипептидного линкера содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из

EPKSCDKTHTSPPAPAPE LLGGPGGPPGPGPGGG (SEQ ID NO: 2);

EPKSCDKTHTSPPAPAPE LLGGPAAPPAPAPAGG (SEQ ID NO: 3);

EPKSCDKTHTSPPAPAPE LLGGPAAPPGPAPGGG (SEQ ID NO: 4);

EPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO:5) и

EPKSCDKTHTSPPSPAPE LLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO:6).

10. Белковая конструкция по любому из пп. 1-9, распознающая и EGFR, и HER2/neu.

11. Белковая конструкция по п. 10, которая представляет собой мультиспецифическое антитело, предпочтительно биспецифическое антитело, при этом Ab1 и Ab2, являющиеся разными, независимо выбирают из группы, состоящей из цетуксимаба или его мутированного производного, с одной стороны, и трастузумаба или его мутированного производного, с другой стороны.

12. Белковая конструкция по любому из пп. 1-9, распознающая и CD38, и PD-L1.

13. Белковая конструкция по п. 12, которая представляет собой мультиспецифическое антитело, предпочтительно биспецифическое антитело, при этом Ab1 и Ab2, являющиеся разными, независимо выбирают из группы, состоящей из даратумумаба или его мутированного производного, с одной стороны, и атезолизумаба или его мутированного производного, с другой стороны.

14. Белковая конструкция по п. 12, которая представляет собой биспецифическое антитело, содержащее, предпочтительно состоящее из a) двух тяжелых цепей, каждая из которых содержит, предпочтительно состоит из SEQ ID NO:7 и b) четырех легких цепей, две из них содержат, предпочтительно состоят из SEQ ID NO:15, а две другие содержат, предпочтительно состоят из SEQ ID NO: 18.

15. Способ получения белковой конструкции по пп. 2-14, указанный способ включает следующие стадии: a) культивирование в подходящей среде и условиях культивирования клетки-хозяина, экспрессирующей тяжелую цепь антитела по любому из пп. 2-14 и легкую цепь антитела по любому из пп. 2-14; и b) восстановление указанных полученных антител из культуральной среды или из указанных культивируемых клеток.