Вето-клетки, полученные из т-клеток памяти

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины и раскрывает способы получения выделенной популяции не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GvHD) клеток, обладающих фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Тсm), а также популяцию, полученную такими способами, и способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации клеток или тканей. Для осуществления указанных способов получения популяции сначала обеспечивают популяцию Т-клеток, содержащую по меньшей мере 50% Т-клеток памяти. Затем приводят указанную популяцию в контакт с вирусным, бактериальным и/или опухолевым антигеном в присутствии IL-21 с целью обеспечения обогащения её антигенреактивными клетками. После чего культивируют указанные клетки, полученные выше, в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7 с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих фенотипом Тсm. Настоящее изобретение позволяет размножать функциональные антигенреактивные клетки, способные оказывать эффективное и специфическое, направленное против заболевания воздействие с целью устранения реактивных в отношении хозяина клонов, способных вызывать GvHD. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 26 ил., 2 табл., 6 пр.

 

Область техники и уровень техники

Настоящее изобретение, согласно некоторым вариантам его осуществления, относится к полученным из Т-клеток памяти вето-клеткам и, более конкретно, но не исключительно, способам их получения и применению их в трансплантации и лечении заболеваний.

На основе накопленных данных было показано, что у людей истощенные по CD45RA мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) характеризуются сниженной реакцией «трансплантат против хозяина» (GvH). Предпосылка такого подхода связана с подавлением экспрессии CD45RA на поверхности антиген-стимулированных Т-клеток, следовательно, за счет истощения CD45RA⁺ клеток, наивные Т-клетки подвергаются устранению, тогда как функциональные антиген-стимулированные клетки, включая Т-клетки памяти, остаются. Следовательно, риск развития реакции «трансплантат против хозяина» (GvHD) заметно снижается, а приживление, восстановление иммунитета и реакция «трансплантат против лейкоза/лимфомы» (GvL) усиливаются, в сравнении с подходами с применением только трансплантации стволовых клеток с истощением Т-клеток (TCD). Кроме того, регуляторные Т-клетки (Treg) также относятся к CD45RA^- популяции и, возможно, могут вносить вклад в толерогенные эффекты, демонстрируемые таким препаратом клеток. Такой подход основан на доклинических исследованиях, в которых продемонстрировано, что CD4 Т-клетки памяти мыши, а также эффекторные CD8 Т-клетки памяти, лишены реактивности «трансплантат против хозяина» (GvH) [Anderson BE et al. J Clin Invest (2003) 112(1): 101-8].

Однако, Zheng et al. [Zheng H. et al. Immunol. (2009) 182(10):5938-48] продемонстрировали, что центральные CD8⁺ Т-клетки памяти (T_cm) характеризовались значимой, хотя и несколько сниженной GvHD по сравнению с наивными Т-клетками. Учитывая, что такое снижение GvHD может быть ассоциировано со сниженной частотой встречаемости аллореактивных клонов в пуле антиген-стимулированных Т-клеток памяти, Juchem et al. дополнительно исследовали возможные внутренние различия между наивными Т-клетками и Т-клетками памяти, которые на одинаковых уровнях экспрессируют трансгенный TCR, направленный против антигенного пептида, который повсеместно экспрессируется в организме реципиента [Juchem KW et al. Blood. (2011) 118(23):6209-19]. В этом исследовании было продемонстрировано, что, хотя эффекторные Т-клетки памяти (T_em) проявляют низкую GvH-реактивность, возможно, из-за паттернов хоминга и/или различающейся способности этих клеток секретировать INFγ, T_cm проявляют высокую GvH-реактивность, по сравнению с таковой у наивных Т-клеток [Juchem KW. (2011), выше].

Недавно в двух крупных исследованиях были предприняты попытки применения трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) с истощением CD45RA⁺ у пациентов с лейкозом [Bleakley М. et al. J Clin Invest. (2015) 125(7):2677-89; Triplett, B.M. et al. Bone Marrow Transplant. (2015) 50(7):968-977], однако случаи GvHD не были полностью устранены. Это могло быть обусловлено большим числом введенных путем инфузии CD45RA⁺ Т-клеток и тем фактом, что CD45KA-истощенная фракция содержала как T_em, так и T_cm, без учета данных доклинических исследований, в которых было явно показано, что T_cm являются потенциальными индукторами GvHD.

Ранее было показано, что реактивные в отношении стороннего антигена происходящие от донора центральные CD8⁺ Т-клетки памяти (вето-Tcm) содействуют приживлению аллогенного истощенного в отношении Т-клеток трансплантата костного мозга (TDBMT) в условиях немиелоаблативного кондиционирования сниженной интенсивности, что обеспечивает в результате индукцию толерантности к трансплантатам органов донорского типа, не вызывая GvHD [Ophir, Е. et al. Blood. (2013) 121(7):1220-1228].

Кроме того, были рассмотрены различные подходы к получению индуцирующих толерантность клеток (например, вето-клеток), лишенных GvH-реактивности, и их применению в качестве адъювантной терапии для пересадки трансплантата, некоторые из которых приведены ниже.

В публикации согласно РСТ № WO 2001/49243 раскрыт способ пересадки реципиенту трансплантата, происходящего от донора, причем способ предусматривает стадии (а) пересадки трансплантата реципиенту; и (b) введения реципиенту дозы, включающей неаллореактивные реактивные в отношении стороннего антигена цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), где неаллореактивные реактивные в отношении стороннего антигена CTL получены путем нацеливания Т-лимфоцитов донора на сторонний антиген или антигены (в отсутствие экзогенного IL-2), при этом доза в значительной степени истощена в отношении Т-лимфоцитов (например, CD4⁺ Т-клеток и/или CD56⁺ естественных клеток-киллеров), способных к развитию в аллореактивные CTL, за счет чего обеспечивается предупреждение или ослабление как отторжения трансплантата реципиентом, так и реакции «трансплантат против хозяина».

В публикации согласно РСТ № WO 2007/023491 раскрыто применение толерогенных клеток для снижения или предупреждения отторжения трансплантата в случае не являющегося изогенным трансплантата у субъекта. Раскрытые толерогенные регуляторные Т-клетки (например, CD4⁺CD25⁺ клетки) могут происходить от любого донора, который не является изогенным по отношению как к субъекту, так и трансплантату («сторонние» толерогенные клетки). Трансплантат (например, костный мозг) может происходить от любого донора трансплантата, который является аллогенным или ксеногенным по отношению к субъекту.

В публикации согласно РСТ № WO 2010/049935 раскрыта выделенная популяция клеток, содержащая не индуцирующие GvHD клетки, реактивные в отношении стороннего антигена, с фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm), причем клетки являются индуцирующими толерантность клетками и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации. В соответствии с WO 2010/049935 клетки получают путем: (а) приведения не являющихся изогенными мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) в контакт со сторонними антигеном или антигенами в условиях, которые обеспечивают устранение GVH-реактивных клеток (например, культура, лишенная цитокинов); и (b) культивирования полученных на стадии (а) клеток в присутствии IL-15 в условиях, которые обеспечивают пролиферацию клеток, обладающих фенотипом Tcm (например, в присутствии IL-7 и/или IL-21).

В публикации согласно РСТ № WO 2012/032526 описан способ лечения заболевания у субъект, предусматривающий: (а) пересадку не являющегося изогенным трансплантата клеток или тканей субъекту; и (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции клеток, содержащей не индуцирующие реакцию «трансплантат против хозяина» (GvHD) клетки, реактивные в отношении стороннего антигена, с фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm), причем клетки являются индуцирующими толерантность клетками и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации. В соответствии с WO 2012/032526 клетки получают путем: (а) приведения РВМС в контакт со сторонними антигеном или антигенами в присутствии или в отсутствие IL-21 в условиях, которые обеспечивают устранение GVH-реактивных клеток (например, культивирование в течение 1-5 дней); и (b) культивирования полученных на стадии (а) клеток в присутствии IL-15 в не содержащем антигенов окружение в условиях, которые обеспечивают пролиферацию клеток, обладающих фенотипом Tcm (например, дополнительно в присутствии IL-7).

В публикации согласно РСТ № WO 2013/035099 раскрыты новые способы получения выделенной популяции клеток, содержащей клетки, реактивные в отношении стороннего антигена, с фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm), причем клетки являются индуцирующими толерантность клетками и/или наделены активностью в отношении заболевания и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации. В соответствии с WO 2013/035099 клетки получают путем: (а) приведения РВМС в контакт со сторонними антигеном или антигенами в присутствии IL-21 с целью обеспечения обогащения антигенреактивными клетками; и (b) культивирования полученных на стадии (а) клеток в присутствии IL-21, IL-15 и IL-7 в не содержащем антигенов окружении с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих фенотипом Tcm.

Сущность изобретения

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения представлен способ получения выделенной популяции не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GvHD) клеток, обладающих фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm), причем клетки являются индуцирующими толерантность клетками и/или наделены активностью в отношении заболевания и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации, причем способ предусматривает: (а) обеспечение популяция по меньшей мере из 70% Т-клеток памяти; (b) приведение популяции Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами с целью обеспечения обогащения ее антигенреактивными клетками; и (с) культивирование полученных на стадии (b) клеток в присутствии цитокинов с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих фенотипом Tcm, с получением тем самым выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения представлен способ получения выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток, обладающих фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm), причем клетки являются индуцирующими толерантность клетками и/или наделены активностью в отношении заболевания и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации, причем способ предусматривает: (а) обработку неадгезивных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) средством, способным обеспечивать истощение CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺ клеток, с целью получения популяции Т-клеток памяти, обладающих фенотипом CD45RA^-CD8⁺; (b) приведение популяции Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами в присутствии IL-21 с целью обеспечения обогащения ее антигенреактивными клетками; и (с) культивирование полученных на стадии (b) клеток в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7 с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих фенотипом Tcm, с получением тем самым выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения представлен способ получения выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток, обладающих фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm), причем клетки являются индуцирующими толерантность клетками и/или наделены активностью в отношении заболевания и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации, причем способ предусматривает: (а) обработку неадгезивных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) средством, способным обеспечивать истощение CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺ клеток, с целью получения популяции Т-клеток памяти, обладающих фенотипом CD45RA^-CD8⁺; (b) приведение популяции Т-клеток памяти в контакт с вирусными антигеном или антигенами в присутствии IL-21 с целью обеспечения обогащения ее антигенреактивными клетками; и (с) культивирование полученных на стадии (b) клеток в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7 с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих фенотипом Tcm, с получением тем самым выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения представлена выделенная популяция не индуцирующих GvHD клеток, содержащая клетки с фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm), причем клетки являются индуцирующими толерантность клетками и/или наделены активностью в отношении заболевания и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации, полученная в соответствии со способом согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента выделенную популяцию не индуцирующих GvHD клеток согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения представлен способ лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, за счет чего обеспечивается лечение заболевания у субъекта.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения представлено применение выделенной популяция не индуцирующих GvHD клеток согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения для изготовления лекарственного препарата, идентифицированного для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения представлен способ лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает: (а) анализ биологического образца от субъекта на присутствие ассоциированных с заболеванием антигена или антигенов; (b) получение выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток в соответствии со способом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения, направленных на ассоциированные с заболеванием антиген или антигены, с целью обеспечения обогащения ее антигенреактивными клетками; и (с) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток из (b), за счет чего обеспечивается лечение заболевания у субъекта.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения представлен способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации клеток или тканей, причем способ предусматривает: (а) пересадку трансплантата клеток или тканей субъекту; и (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, за счет чего обеспечивается лечение субъекта, нуждающегося в трансплантации клеток или тканей.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения представлено применение выделенной популяция не индуцирующих GvHD клеток согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения для изготовления лекарственного препарата, идентифицированного в качестве адъювантной терапии для трансплантации клеток или тканей субъекту, где субъект нуждается в трансплантации клеток или тканей.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения Т-клетки памяти лишены CD45RA⁺ клеток.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения Т-клетки памяти лишены CD4⁺ и/или CD56⁺ клеток.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения приведение популяции Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами осуществляют в присутствии IL-21.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения культивирование полученных на стадии (b) клеток в присутствии цитокинов предусматривает культивирование клеток в присутствии любого из IL-21, IL-15 и/или IL-7.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает проведение в отношении донора клеток обработки антигеном или антигенами до обеспечения популяции по меньшей мере из 70% Т-клеток памяти.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения популяция по меньшей мере из 70% Т-клеток памяти обогащена в отношении антигена или антигенов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения антиген или антигены выбраны из группы, состоящей из вирусного антигена, бактериального антигена, опухолевого антигена, антигена, связанного с аутоиммунным заболеванием, белкового экстракта, очищенного белка и синтетического пептида.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения антиген или антигены представлены аутологичными антиген-представляющими клетками, не являющимися аутологичными антиген-представляющими клетками, искусственными носителями или искусственными антиген-представляющими клетками.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения антиген или антигены представлены антиген-представляющими клетками того же происхождения, что и Т-клетки памяти.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения вирусные антиген или антигены представлены аутологичными антиген-представляющими клетками, не являющимися аутологичными антиген-представляющими клетками, искусственными носителями или искусственными антиген-представляющими клетками.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения антиген или антигены представлены антиген-представляющими клетками того же происхождения, что и РВМС.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения антиген-представляющие клетки представляют собой дендритные клетки.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения вирусный антиген или антигены включают два или более вирусных пептидов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения вирусные антиген или антигены включают пептид EBV, пептид CMV и/или пептид аденовируса (Adv).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения вирусные антиген или антигены включают три пептида EBV, два пептида CMV и два пептида аденовируса (Adv).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения вирусные антиген или антигены выбраны из группы, состоящей из EBV-LMP2, EBV-BZLF1, EBV-EBNA1, CMV-pp65, CMV-IE-1, Adv-пентон и Adv-гексон.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения вирусные антиген или антигены включают два или более из EBV-LMP2, EBV-BZLF1, EBV-EBNA1, CMV-pp65, CMV-IE-1, Adv-пентона и Adv-гексона.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения вирусные антиген или антигены дополнительно включают бактериальный антиген.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения контактирование популяции Т-клеток памяти с антигеном или антигенами в присутствии IL-21 осуществляют в течение от 12 часов до 5 дней.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения контактирование популяции Т-клеток памяти с антигеном или антигенами в присутствии IL-21 осуществляют в течение от 3 дней.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения культивирование полученных на стадии (b) клеток в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7 осуществляют в течение от 12 часов до 10 дней.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения культивирование полученных на стадии (b) клеток в присутствии IL-21, IL-15 и IL-7 осуществляют в течение от 4 дней до 8 дней.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения культивирование полученных на стадии (b) клеток в присутствии IL-21, IL-15 и IL-7 осуществляют в течение 6 дней.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения общая продолжительность получения не индуцирующих GvHD клеток составляет 10 дней.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает истощение аллореактивных клеток после осуществления стадии (с).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения истощение аллореактивных клеток осуществляют за счет истощения CD137+ и/или CD25+ клеток после приведения клеток, обладающих фенотипом Tcm, в контакт с антиген-представляющими клетками (АРС) хозяина.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения способ осуществляют ex-vivo.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения РВМС не являются изогенными по отношению к субъекту.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения РВМС являются аллогенными по отношению к субъекту.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения клетки с фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти обладают антигенным профилем CD3⁺, CD8⁺, CD62L⁺, CD45RA^-, CD45RO⁺.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения биологический образец выбран из группы, состоящей из крови, плазмы крови, сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, лимфатической жидкости и биоптата ткани.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения антиген или антигены выбраны из группы, состоящей из вирусного антигена, бактериального антигена, опухолевого антигена и антигена, связанного с аутоиммунным заболеванием.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает пересадку трансплантата клеток или тканей субъекту.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения лекарственный препарат дополнительно предусматривает трансплантат клеток или тканей.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения пересадку осуществляют одновременно с введением выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток, до него или после него.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения заболевание представляет собой злокачественное заболевание.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения заболевание представляет собой заболевание, не являющееся злокачественным.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения выделенная популяция не индуцирующих GvHD клеток предназначена для введения до трансплантации клеток или тканей, одновременно с ней или после нее.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения (b) осуществляют до (а) в способе согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения (а) и (b) осуществляют одновременно в способе согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает кондиционирование субъекта в сублетальных, летальных или сверхлетальных условиях перед пересадкой.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения применение выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток дополнительно предусматривает протокол кондиционирования в сублетальных, летальных или сверхлетальных условиях.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения кондиционирование в сублетальных, летальных или сверхлетальных условиях выбрано из группы, состоящей из тотального облучения организма (TBI), частичного облучения организма, миелоаблативного кондиционирования, немиелоаблативного кондиционирования, блокады костимуляции, химиотерапевтического средства и иммунотерапии антителами.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения трансплантат клеток или тканей не является изогенным по отношению к субъекту.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения трансплантат клеток или тканей и выделенная популяция не индуцирующих GvHD клеток получены от одного и того же донора.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения трансплантат клеток или тканей происходит от донора, выбранного из группы, состоящей из HLA-идентично го аллогенного донора, не являющегося HLA-идентичным аллогенного донора и ксеногенного донора.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения трансплантат клеток или тканей содержит незрелые гемопоэтические клетки.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения трансплантат клеток или тканей выбран из группы, состоящей из клетки или ткани печени, поджелудочной железы, селезенки, почки, сердца, легкого, кожи, кишечника, головного мозга, яичника и лимфоидной/гемопоэтической клетки или ткани.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения трансплантат клеток или тканей предусматривает котрансплантацию нескольких органов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения котрансплантация предусматривает трансплантацию незрелых гемопоэтических клеток и паренхиматозного органа.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения незрелые гемопоэтические клетки и паренхиматозный орган получены от одного и того же донора.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения незрелые гемопоэтические клетки трансплантируют до трансплантации паренхиматозного органа, одновременно с ней или после нее.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения у субъекта наблюдается злокачественное заболевание.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения злокачественное заболевание представляет собой солидную опухоль или метастаз опухоли.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения злокачественное заболевание представляет собой злокачественное новообразование кроветворной ткани.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения злокачественное заболевание выбрано из группы, состоящей из лейкоза, лимфомы, миеломы, меланомы, саркомы, нейробластомы, рака толстой кишки, рака толстой и прямой кишки, рака молочной железы, рака яичника, рака пищевода, рака из синовиальных клеток, рака печени и рака поджелудочной железы.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения у субъекта наблюдается заболевание, не являющееся злокачественным.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения заболевание, не являющееся злокачественным, выбрано из группы, состоящей из нарушения функции или функциональной недостаточности органа, заболевания крови, заболевания, связанного с трансплантацией, инфекционного заболевания, аутоиммунного заболевания, воспаления, аллергии, травмы и повреждения.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения инфекционное заболевание представляет собой вирусное заболевание или бактериальное заболевание.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения субъектом является субъект-чело век.

Если не указано иное, все применяемые в настоящем документе технические и/или научные термины имеют те же значения, которые обычно понятны рядовому специалисту в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя для реализации на практике или тестирования вариантов осуществления настоящего изобретения можно применять способы и материалы, подобные или эквивалентные таковым, описанным в настоящем документе, иллюстративные способы и/или материалы описаны ниже. В случае противоречий описание к патенту, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предназначены для обязательного ограничения.

Краткое описание чертежей

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения в настоящем документе описаны лишь в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи. При подробном обращении к чертежам подчеркивается, что представленные сведения приведены в качестве примера и для целей иллюстративного обсуждения вариантов осуществления настоящего изобретения. В этом отношении настоящее описание вместе с чертежами позволяют специалистам в данной области понять, как варианты осуществления настоящего изобретения могут быть выполнены на практике.

В чертежах:

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение модели трансплантации костного мозга с истощением Т-клеток (TDBMT) и кондиционированием сниженной интенсивности с применением вето-Tcm-клеток, происходящих из CD44⁺CD8⁺ Т-клеток памяти от OVA-иммунизированных мышей.

Фиг. 2А представляет собой график, на котором показано, что вето-Tcm-клетки, полученные из общей популяции антиген-стимулированных клеток (CD8⁺CD44⁺) после иммунизации мышей ОТ1 альбумином куриного яйца, индуцируют толерантность к истощенному в отношении Т-клеток (TCD) аллогенному трансплантату стволовых клеток (SCT). Облученным сублетальной дозой (5,25 Гр) мышам Balb/c (H-2^d) трансплантировали 20×10⁶ клеток ВМ C57BL/6-голых мышей (Н-2^b) с или без: 5×10⁶ аллогенных вето-Tcm-клеток C57BL/6 (Н-2^b) или 5×10⁶ CD8⁺CD44⁺ клеток, происходящих от OVA-иммунизированных мышей ОТ-1. Процентную долю клеток донора в периферической крови анализировали спустя 45 дней после трансплантации с помощью FACS с применением антител к антигенам хозяина (H-2D^d) антигенам донора (H-2K^b).

Фигуры 2В-С представляют собой графики, на которых показано, что CD8⁺CD44⁺ Tcm-клетки не индуцируют GvHD в мышиной модели со строгими критериями. Облученным сублетальной дозой (5 Гр) мышам Balb/c (H-2d) трансплантировали 5×10⁶ или 10×10⁶ происходящие от аллогенных OVA-иммунизированных C57BL/6 (Н-2b) CD8⁺CD44⁺ Tcm-клеток или свежих CD8⁺CD44⁺ клеток. CD8⁺CD44^- наивные клетки применяли в качестве положительного контроля для GvHD. (Фиг. 2В) среднее изменение веса в течение 62 дней после переноса клеток. (Фиг. 2С) На графике выживания показана продолжительность выживания мышей в конкретных группах.

Фиг. 2D представляет собой схематическое изображение модели кондиционирования сниженной интенсивности (RIC) для тестирования индукции толерантности Tcm-клетками, происходящими из встречающихся в природе клеток памяти (например, OVA-реактивных CD44⁺CD8⁺).

Фиг. 2Е представляет собой график, на котором показано, что вето-Tcm-клетки, полученные из популяции встречающихся в природе клеток памяти (CD8⁺CD44⁺), индуцируют толерантность к TCD alloSCT. Облученным сублетальной дозой (5 Гр) мышам Balb/c (H-2^d) трансплантировали 20×10⁶ клеток ВМ C57BL/6-голых мышей (Н-2^b) с или без: 5×10⁶ аллогенных вето-Tcm-клеток C57BL/6 (Н-2^b) или 5×10⁶ CD8⁺CD44⁺ клеток, происходящих от OVA-иммунизированных мышей, или 5×10⁶ аллогенных свежевыделенных CD8⁺CD44⁺ клеток C57BL/6. Процентную долю клеток донора в периферической крови анализировали спустя 55 дней после трансплантации с помощью FACS с применением антител к антигенам хозяина (H-2D^d) антигенам донора (H-2K^b).

Фигуры 3A-D представляют собой графики, на которых показано получение CD4^-CD56^- вето-Tcm-клеток, реактивных в отношении стороннего антигена, с применением вирусных пептидов. Отвечающие CD4^-CD56^- клетки человека, которые были получены после истощения CD4⁺ и CD56⁺ клеток из пула РВМС донора в день 0, культивировали совместно с облученными происходящими от донора DC, стимулированными вирусными пептидами EBV, CMV и аденовируса, с IL-21 до дня +3, с добавлением IL-21, IL-15 и IL-7 начиная с дня +3-+9. (Фигуры 3А-В) FACS-анализ фенотипа вето-Tcm у отвечающих CD4^-CD56^- клеток в день 0 (фиг. 3А) и полученных из них противовирусных Tcm-клеток в день 9 культивирования (фиг. 3В). (Фигуры 3C-D) В день +9 клетки собирали и культивировали с облученными РВМС хозяина в течение 5 дней (т.е. смешанная культура), а затем собирали и повторно стимулировали в течение 7 дней в отношении облученных РВМС в анализе с использованием предельного разведения (LDA) в присутствии IL-2 на предмет индукции эффекторного фенотипа. В день +21 осуществляли анализ цитотоксичности на основе высвобождения 358-метионина в отношении ConA-бластных клеток, происходящих от хозяина. Спустя 5 часов реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR) супернатант собирали из лунок и подвергали подсчету на основе радиоактивности на β-счетчике. (Фиг. 3С) Представляет собой график зависимости % отвечающих культур от числа клеток на культуру. (Фиг. 3D) Представляет собой график линейной регрессии, на котором представлена зависимость % неотвечающих культур от числа клеток на культуру. Частоту встречаемости (f) реактивных в отношении хозяина клонов в конкретной культуре рассчитывали из наклона кривой линейной регрессии.

На фиг. 4А показано схематическое представление протокола получения противовирусных CD4-CD56-CD45RA- вето-Tcm-клеток человека, полученных путем лейкафереза, и тестирования их реактивности в отношении хозяина.

На фиг. 4В показано схематическое представление получения зрелых дендритных клеток человека, нагруженные вирусным пептидом.

Фигуры 5А-В представляют собой графики, на которых показаны противовирусные вето-Tcm-клетки, полученные из отвечающих CD4^-CD56^-CD45RA^- клеток с применением аутологичных DC, нагруженных вирусными пептидами, в качестве сторонней стимуляции. (Фиг. 5А) Фенотип отвечающих CD4^-CD56^- клеток в день 0 и Tcm-клеток в день +9 (правая панель). (Фиг. 5В) Фенотип отвечающих CD4^-CD56^-CD45RA^- клеток в день 0 и Tcm-клеток в день +9 (правая панель)

Фиг. 5С представляет собой график, на котором показаны результаты анализа с использованием предельного разведения (LDA) в отношении частоты встречаемости реактивных в отношении хозяина предшественников CTL среди противовирусных Tcm-клеток, полученных из фракций CD4^-CD56^-CD45RA^- и CD4^-CD56^- клеток, в сравнении со свежими CD4^-CD56^-CD19^- Т-клетками. В день +9 контрольную популяцию свежих CD4^-CD56^-CD19^- клеток подвергали сортировке на гранулах из свежеразмороженных клеток донора. Все три типа препаратов клеток донора (т.е. противовирусные вето-Tcm CD4^-CD56^-, противовирусные вето-Tcm CD4^-CD56^-CD45RA^- и свежие CD4^-CD56^-CD19^- клетки) культивировали с облученными РВМС хозяина в течение 5 дней в день +9 (т.е. смешанная культура), а затем собирали и повторно стимулировали в течение 7 дней в отношении облученных РВМС хозяина в LDA в присутствии IL-2 на предмет индукции эффекторного фенотипа. В день +21 осуществляли анализ цитотоксичности на основе высвобождения 358-метионина в отношении ConA-бластных клеток, происходящих от хозяина. Спустя 5 часов MLR супернатант собирали из лунок и подвергали подсчету на основе радиоактивности на β-счетчике. Представлен график линейной регрессии, на котором представлена зависимость % неотвечающих культур от числа клеток на культуру. Частоту встречаемости (f) реактивных в отношении хозяина клонов в конкретной культуре рассчитывали из наклона кривой линейной регрессии.

Фиг. 6 представляет собой таблицу, в которой представлены результаты истощения реактивных в отношении хозяина Т-клеток до и после получения вето-Tcm-клеток, направленных против вирусных пептидов (которое осуществляли, как на фиг. 4А и фигурах 5А-С). Следует отметить, что низкая частота встречаемости реактивных в отношении хозяина CTL-p и общие уровни реактивных в отношении хозяина CTL-p основаны на LDA-анализе (обведено кругами на графике).

На фиг. 7 показано схематическое представление варианта осуществления протокола получения вето-Tcm-клеток человека, происходящих из Т-клеток памяти и культивированных с вирусными антигенами в контексте аутологичных антиген-представляющих клеток.

Фиг. 8 представляет собой таблицу, в которой представлены результаты 10 экспериментов, в которых вето-Tcm-клетки получали из Т-клеток памяти с применением протокола, представленного на фиг. 7. Следует отметить, что выделение и очистка клеток были вполне воспроизводимыми.

Фигуры 9А-Н представляют собой графики, на которых показаны результаты типичного FACS-анализа в рамках одного эксперимента, демонстрирующие чистоту вето-Tcm-клеток, полученных из Т-клеток памяти с применением протокола, представленного на фиг. 7. На фигурах показаны результаты FACS-анализа каждой стадии, представленной на фиг. 8, как указано далее: На фигурах 9А-В показаны результаты FACS-анализа мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) до очистки; на фигурах 9C-D показаны результаты FACS-анализа после очистки в отношении CD4^-CD56^-; на фигурах 9E-F показаны результаты FACS-анализа после очистки в отношении CD4^-CD56^-CD45RA^- (т.е. обогащение CD4-CD56-CD45RO+ клетками); на фигурах 9G-H показаны результаты FACS-анализа противовирусных Tcm-клеток.

Подробное описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение, согласно некоторым вариантам его осуществления, относится к полученным из Т-клеток памяти вето-клеткам и, более конкретно, но не исключительно, способам их получения и применению их в трансплантации и лечении заболеваний.

Принципы и осуществление на практике настоящего изобретения можно лучше понять со ссылкой на чертежи и прилагаемые описания.

Перед подробным объяснением по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что настоящее изобретение не является обязательно ограниченным в его применении подробностями, изложенными в нижеследующем описании, или проиллюстрированными в примерах. Настоящее изобретение допускает другие варианты осуществления или может быть применено на практике или осуществлено различными способами. Также следует понимать, что используемые в настоящем документе формулировки и терминология приведены в целях описания и не должны рассматриваться как ограничивающие.

Трансплантация костного мозга (ВМ) обеспечивает радикальное лечение для множества пациентов со злокачественными новообразованиями кроветворной ткани и другими нарушениями (например, заболеваниями кроветворной системы, функциональной недостаточностью органа). Кроме того, ВМ можно подвергать котрансплантации с различными другими органами (например, при пересадке почки или печени от одного и того же донора органов) с целью повышения успеха трансплантации за счет индукции химеризма. Однако трансплантат ВМ содержит Т-клетки донора, которые реагируют на антигены хозяина (Ag), и приводят к развитию генерализованной реакции «трансплантат против хозяина» (GvHD). Проблему GvHD, которая при таких условиях почти во всех случаях приводит к летальному исходу, можно предотвратить благодаря трансплантации истощенного в отношении Т-клеток костного мозга (TDBMT). Однако преимущество предотвращения GvHD может быть сведено на нет за счет значительно повышенного уровня отторжения трансплантата.

Один из подходов к преодолению отторжения аллогенного TDBMT заключался в применении различных препаратов на основе вето-клеток, как описано в публикациях согласно РСТ №№ WO 2001/49243, WO 2007/023491, WO 2010/049935, WO 2012/032526 и WO 2013/035099. Однако отторжение трансплантата и GvHD все еще остаются основной проблемой при терапии с использованием адоптивного переноса клеток, особенно в аллогенных системах.

В ходе воплощения настоящего изобретения на практике авторы настоящего изобретения обнаружили улучшенную популяцию вето-клеток, которые также обладают активностью в отношении заболевания (например, противовирусной активностью) без индуцирования реакции «трансплантат против хозяина» (GvH). Эти новые клетки получают путем истощения Т-клеток памяти в отношении аллореактивных клонов посредством антигенной активации.

Как показано в настоящем документе ниже и в нижеследующем разделе «Примеры», авторы настоящего изобретения представили новые способы получения вето-клеток для применений при несовпадениях по HLA (например, при аллогенной трансплантации), начиная с Т-клеток памяти. В частности, как показано на фиг. 1, авторы настоящего изобретения использовали мышиную модель для получения вето-Tcm-клеток из встречающихся в природе Т-клеток памяти. Tcm-клетки, полученные из Т-клеток памяти, индуцировали толерантность в модели трансплантации костного мозга с истощением Т-клеток (TDBMT) и кондиционированием сниженной интенсивности, без реактивности «трансплантат против хозяина» (фиг. 2А), и проявляли заметное усиление химеризма после выполнения протокола кондиционирования сниженной интенсивности (фиг. 2Е). Однако было показано, что свежие CD8⁺CD44⁺ клетки памяти (которые не подвергались антигенной активации), индуцировали значительный уровень смертности и потерю веса вследствие GvHD (фигуры 2В-С).

Затем вирусные антигены применяли для получения вето-Tcm-клеток человека из популяции CD4-CD56-клеток. Как проиллюстрировано на фигурах 3А-В, клетки, культивированные в присутствии вирусных антигенов, представленных на поверхности аутологичных дендритных клеток, предусматривали 93% фенотип Tcm (CD62⁺CD45RO⁺ клетки) через 9 дней после начала культивирования. Кроме того, эти Tcm-клетки обеспечивали двухкратное логарифмическое истощение аллореактивных в отношении хозяина клонов по сравнению со свежими CD4^-CD56^- клетками (фигуры 3C-D и таблица 2, ниже). Затем получали вето-клетки из популяции клеток памяти человека путем первого истощения мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных от донора клеток, в отношении CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺ клеток (фиг. 4А). Соответственно, остальная часть популяции клеток содержала CD8+ Т-клетки памяти донора. CD8+ Т-клетки памяти культивировали совместно с дендритными клетками (от того же донора клеток), где дендритные клетки были сконструированы для экспрессии антигена (например, коктейля вирусных антигенов, включающей EBV, CMV и аденовирус). На первые 3 дня клеточная культура была дополнена IL-21, а затем начиная с дня 3 и до дня 9 в культуру добавляли IL-21, IL-15 и IL-7. Полученная в результате популяция клеток предусматривала фенотип Tcm и не характеризовалась какой-либо реактивностью в отношении хозяина (как проиллюстрировано на фигурах 5А-С и 6).

В целом, с помощью истощения аллореактивных клонов в пуле Т-клеток памяти путем антигенной активации (например, с применением вирусных антигенов, опухолевых антигенов) можно решить проблему остаточной GvHD, обусловленной пулом Т-клеток памяти. Кроме того, эти результаты свидетельствуют о том, что новый препарат на основе вето-клеток, полученных из популяции клеток памяти, можно применять при клеточной терапии для индукции трансплантационной толерантности без связанных с GvHD осложнений, а также для лечения заболеваний (например, для противовирусных или противораковых применений).

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения представлен способ получения выделенной популяции не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GvHD) клеток, обладающих фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm), причем клетки являются индуцирующими толерантность клетками и/или наделены активностью в отношении заболевания и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации, причем способ предусматривает: (а) обеспечение популяция по меньшей мере из 70% Т-клеток памяти; (b) приведение популяции Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами с целью обеспечения обогащения ее антигенреактивными клетками; и (с) культивирование полученных на стадии (b) клеток в присутствии цитокинов с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Тcm), с получением тем самым выделенной популяции не индуцирующих GVHD клеток.

Фраза «выделенная популяция клеток» в контексте настоящего документа относится к клеткам, которые были выделены из их естественного окружения (например, организма человека).

Термин «не индуцирующий реакцию «трансплантат против хозяина» или «не индуцирующий GvHD» в контексте настоящего документа относится к обладанию в значительной степени сниженной реактивностью, индуцирующей реакцию «трансплантат против хозяина» (GvH), или ее отсутствию. Таким образом, клетки по настоящему изобретению получают как такие, которые практически не вызывают реакцию «трансплантат против хозяина» (GvHD), о чем свидетельствуют показатели выживаемости, веса и общее состояние перенесшего трансплантацию субъекта спустя 30-120 дней после трансплантации. Способы оценки у субъекта сниженной GvHD хорошо известны специалисту в данной области.

В соответствии с одним вариантом осуществления клетки по настоящему изобретению обладают реактивностью в отношении хозяина, сниженной на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или даже 100%, по сравнению с клетками, которые не были получены в соответствии с идеями настоящего изобретения.

Фраза «фенотип центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm)» в контексте настоящего документа относится к субпопуляции цитотоксических Т-клеток, которые возвращаются назад в лимфатические узлы. Клетки с фенотипом Tcm у людей обычно обладают антигенныым профилем CD3+/CD8+/CD62L+/CD45RO+/CD45RA. Понятно, что Tcm-клетки могут экспрессировать все из маркеров антигенного профиля на поверхности отдельной клетки или могут экспрессировать только часть маркеров антигенного профиля на поверхности отдельной клетки. Определение фенотипа клетки можно осуществлять с применением любого известного специалисту в данной области способа, такого как, например, сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS) или мечение с использованием ELISA с захватом.

В соответствии с одним вариантом осуществления по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или даже 100% выделенной популяции клеток характеризуются антигенным профилем Tcm.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления приблизительно 20-40%, приблизительно 30-50%, приблизительно 40-60%, приблизительно 50-70%, приблизительно 60-80%, приблизительно 70-90%, приблизительно 80-100% или приблизительно 90-100% выделенной популяции клеток характеризуются антигенным профилем Tcm.

Выделенную популяцию не индуцирующих GvHD клеток по настоящему изобретению также называют в настоящем документе «Tcm-клетками».

Как упоминалось, Tcm-клетки обычно возвращаются назад в лимфатические узлы после трансплантации. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенная популяция клеток по настоящему изобретению после трансплантации может возвращаются назад в любые лимфатические узлы, как, например, периферические лимфатические узлы и брыжеечные лимфатические узлы. Свойство хоминга этих клеток позволяет им проявлять их вето-эффект быстрым и эффективным образом.

Выделенная популяция Tcm-клеток по настоящему изобретению представляет собой индуцирующие толерантность клетки.

Фраза «индуцирующие толерантность клетки» в контексте настоящего документа относится к клеткам, которые вызывают сниженную реактивность клеток реципиента (например, Т-клеток реципиента), когда они вступают в контакт с клетками реципиента, по сравнению с реактивностью клеток реципиента в отсутствие введенных индуцирующих толерантность клеток. Индуцирующие толерантность клетки включают вето-клетки (т.е. Т-клетки, которые приводят к апоптозу Т-клеток хозяина при контакте с ними), как было описано ранее в публикациях согласно РСТ №№ WO 2001/049243 и WO 2002/102971.

Термин «вето-активность» относится к иммунным клеткам (например, полученным от донора Т-клеткам), которые приводят к инактивации Т-клеток реципиента, реактивных в отношении клеток донора, при распознавании и связывании с вето-клетками. В соответствии с одним вариантом осуществления инактивация приводит в результате к апоптозу Т-клеток реципиента, реактивных в отношении клеток донора.

Кроме того, или в качестве альтернативы, выделенная популяция Tcm-клеток по настоящему изобретению обладает активностью в отношении заболевания.

Термин «активность в отношении заболевания» относится к функции Tcm-клеток в отношении пораженной заболеванием клетки. Активность в отношении заболевания может быть направлена непосредственно на пораженную заболеванием клетку, например, в случае способности к уничтожению пораженной заболеванием клетки. Эта активность может быть связана с TCR-независимым уничтожением, опосредованным связыванием LFA1-I/CAM1 [Arditti et al., Blood (2005) 105(8):3365-71. Epub 2004 Jul 6]. Кроме того, или в качестве альтернативы, активность в отношении заболевания может быть опосредованной, например, при активации других типов клеток (например, CD4+ Т-клеток, В-клеток, моноцитов, макрофагов, NK-клеток), что приводит к гибели пораженной заболеванием клетки (например, в результате уничтожения, апоптоза или за счет секреции других факторов, например, антител, цитокинов и т.п.).

Пораженная заболеванием клетка может включать, например, инфицированную вирусами клетку, инфицированную бактериями клетку, раковую клетку [например, клетку солидной опухоли или лейкозную/лимфомную клетку, также в настоящем документе упоминается как обусловленная Tcm-клетками реакция «трансплантат против лейкоза» (GVL)], клетку, ассоциированную с аутоиммунным заболеванием, клетку, ассоциированную с аллергической реакцией, или клетку, измененную из-за стрессовых факторов, облучения или возраста.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления Tcm-клетки по настоящему изобретению могут представлять собой клетки, отличные от генетически модифицированных, или генетически модифицированные клетки (например, клетки, которые были созданы с помощью методов генной инженерии для экспрессии или подавления экспрессии конкретных генов, маркеров или пептидов или для секреции или подавления секреции конкретных цитокинов). В генетической инженерии клеток можно задействовать любой известный в данной области способ, как, например, предусматривающий инактивацию соответствующего гена/генов или вставку антисмысловой РНК, препятствующей экспрессии полипептида (см., например, WO/2000/039294, которая включена в настоящий документ посредством ссылки).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения представлен способ получения выделенной популяции клеток, причем способ предусматривает (а) обеспечение популяции Т-клеток памяти; (b) приведение популяции Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами с целью обеспечения обогащения ее антигенре активными клетками; и (с) культивирование полученных на стадии (b) клеток в присутствии цитокинов с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm).

Термин «Т-клетки памяти» в контексте настоящего документа относится к субпопуляции Т-лимфоцитов, которые возникли ранее и отвечали на антиген, также называемым антиген-стимулированными Т-клетками.

В соответствии с одним вариантом осуществления Т-клетки памяти составляют по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 99% или даже 100% популяции клеток.

В соответствии с одним вариантом осуществления Т-клетки памяти включают цитотоксические Т-клетки, экспрессирующие маркер CD8 (т.е. CD8⁺ Т-клетки).

В соответствии с другим вариантом осуществления Т-клетки памяти предусматривают CD8⁺CD45RO⁺ фенотип.

В соответствии с другим вариантом осуществления Т-клетки памяти предусматривают CD8⁺CD45RA^- фенотип.

В соответствии с другим вариантом осуществления Т-клетки памяти предусматривают CD8⁺CD45RO⁺CD45RA^- фенотип.

Отбор CD8+ Т-клеток памяти можно осуществлять путем отбора клеток, коэкспрессирующих CD8⁺ и CD45RA^-, и/или клеток, коэкспрессирующих CD8⁺ и CD45RO⁺, и может быть выполнен с применением любого известного в данной области способа, как, например, с помощью аффинной очистки (например, путем применения гранул для MACS, FACS-сортера и/или мечения с использованием ELISA с захватом).

Отбор CD8+ Т-клеток памяти дополнительно можно осуществлять путем отбора эффекторных Т-клеток и центральных Т-клеток памяти, причем последние экспрессируют, например, CD62L, CCR7, CD27 и/или CD28.

В соответствии с одним вариантом осуществления Т-клетки памяти получают из популяции мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС).

В соответствии с одним вариантом осуществления Т-клетки памяти получают из лимфоидной ткани, как, например, из лимфатических узлов или селезенки.

С целью получения клеточной популяции, предусматривающей высокую степень чистоты в отношении Т-клеток памяти (например, по меньшей мере приблизительно 50-70% Т-клеток памяти), или с целью повышения числа Т-клеток памяти, РВМС можно истощать в отношении наивных клеток, например, CD45RA⁺ клеток, адгезивных клеток (например, моноцитов, макрофагов), CD4⁺ клеток (например, хелперных Т-клеток), CD56⁺ клеток (например, NK-клеток) или любых других клеток, не обладающих фенотипом Т-клеток памяти.

Истощение наивных Т-клеток (например, экспрессирующих CD45RA⁺ клеток), CD4⁺ и/или CD56+ клеток может быть выполнено с применением любого известного в данной области способа, как, например, с помощью аффинной очистки (например, путем применения гранул для MACS, FACS-сортера и/или мечения с использованием ELISA с захватом).

Истощение адгезивных клеток может быть выполнено с применением любого известного в данной области способа, например, путем культивирования РВМС на чашке для клеточных культур (например, в течение 2-6 часов) и сбора неадгезивных клеток.

В соответствии с одним вариантом осуществления Т-клетки памяти лишены CD45RA⁺ клеток.

В соответствии с одним вариантом осуществления Т-клетки памяти лишены CD4⁺ и/или CD56⁺ клеток.

С целью истощения аллореактивных клонов из пула Т-клеток памяти, Т-клетки памяти приводят в контакт с антигеном или антигенами.

В контексте настоящего документа фраза «антиген или антигены» относится к растворимой или нерастворимой (как, например, мембраноассоциированной) молекуле, способной индуцировать иммунный ответ.

Например, антиген или антигены могут представлять собой целые клетки (например, живые или мертвые клетки), фракции клеток (например, лизированные клетки), клеточные антигены (например, антигены клеточной поверхности), белковый экстракт, очищенный белок или синтетический пептид. Например, антиген или антигены согласно определенному варианту осуществления настоящего изобретения включают антигены, ассоциированные со злокачественным заболеванием (например, опухолевые антигены), антигены, ассоциированные с аутоиммунным заболеванием (т.е. аутоиммунные антигены), антигены, ассоциированные с аллергической реакцией (т.е. аллергические антигены), антигены вирусов (т.е. вирусные антигены), антигены бактерий (т.е. бактериальные антигены) или антигены грибов (например, грибковые антигены).

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген или антигены происходят из возбудителя инфекции (например, организма вируса, бактерии, гриба), который обычно поражает субъектов с ослабленным иммунитетом, таких как подлежащие трансплантации пациенты. Иллюстративные возбудители инфекций, которые могут поражать пациентов с ослабленным иммунитетом, включают без ограничения вирусы, такие как парвовирус (например, парвовирус В19), ротавирус, вирус ветряной оспы (VZV), вирус простого герпеса (HSV), цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), полиомавирус (например, вирус ВК); бактерии, такие как S pneumoniae, Р aeruginosa, Legionella pneumophila, L monocytogenes, виды Nocardia, виды Mycobacterium, S aureus, виды Nocardia, P aeruginosa, виды Serratia, Chromobacterium, стрептококки, Burkholderia, Mycobacterium (например, Mycobacterium avium-intracellulare complex), инкапсулированные бактерии, такие как S pneumoniae, H influenzae и N meningitidis; грибы, такие как Р jiroveci, Candida, и Aspergillus; и паразитические организмы, такие как виды Toxoplasma, криптоспоридии и виды Strongyloides.

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген представляет собой вирусный антиген, такой как без ограничения антиген вируса Эпштейна-Барр (EBV), аденовируса (Adv), цитомегало вир уса (CMV), риновирусов, вирусов, вызывающих острое респираторное заболевание, вирусов гепатита А, В и С, вируса простого герпеса, ВИЧ, вируса гриппа, вируса японского энцефалита, вируса кори, полиовируса, вируса бешенства, респираторно-синцитиального вируса, вируса краснухи, вируса натуральной оспы, вируса ветряной оспы, ротавируса, вируса лихорадки Западного Нила, полиомавируса (например, вируса ВК) или вируса Зика.

В качестве дополнительных конкретных примеров вирусных антигенов, антигены аденовируса включают без ограничения Adv-пентон или Adv-гексон; антигены CMV включают без ограничения гликопротеин оболочки В, IE-1 CMV и рр65 CMV; антигены EBV включают без ограничения LMP2 EBV, BZLF1 EBV, EBNA1 EBV, Р18 EBV и Р23 EBV; антигены вирусов гепатита включают без ограничения белки S, М и L вируса гепатита В, пре-S антиген вируса гепатита В, HBCAG DELTA, НВЕ HBV, РНК вируса гепатита С, NS3 HCV и NS4 HCV; вирусные антигены вируса простого герпеса включают без ограничения предранние белки и гликопротеин D; антигены ВИЧ включают без ограничения генные продукты генов gag, pol и env, такие как gp32 ВИЧ, gp41 ВИЧ, gp120 ВИЧ, gp160 ВИЧ, Р17/24 ВИЧ, Р24 ВИЧ, Р55 GAG ВИЧ, Р66 POL ВИЧ, ТАТ ВИЧ, GP36 ВИЧ, белок Nef и обратную транскриптазу; антигены вируса гриппа включают без ограничения гемагглютинин и нейраминидазу; вирусные антигены вируса японского энцефалита включают без ограничения белки Е, М-Е, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A и 80% Е; антигены вируса кори включают без ограничения слитый белок вируса кори; антигены вируса бешенства включают без ограничения гликопротеин вируса бешенства и нуклеопротеин вируса бешенства; вирусные антигены респираторно-синцитиального вируса включают без ограничения слитый белок RSV и белок М2; ротавирусные антигены включают без ограничения VP7sc; антигены вируса краснухи включают без ограничения белки Е1 и Е2; и вирусные антигены вируса ветряной оспы включают без ограничения gpl и gpll.

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген представляет собой бактериальный антиген, такой как без ограничения антиген бактерии, вызывающей сибирскую язву; грамотрицательных бацилл, хламидий, бактерии, вызывающей дифтерию, гемофильной палочки, Helicobacter pylori, плазмодиев, вызывающих малярию, Mycobacterium tuberculosis, коклюшный токсин, пневмококка, риккетсий, стафилококка, стрептококка и бактерии, вызывающей столбняк.

В качестве дополнительных конкретных примеров бактериальных антигенов, антигены бактерии, вызывающей сибирскую язву, включают без ограничения протективный антиген бактерии, вызывающей сибирскую язву; антигены грамотрицательных бацилл включают без ограничения липополисахариды; антигены гемофильной палочки включают без ограничения капсульные полисахариды; антигены бактерии, вызывающей дифтерию, включают без ограничения дифтерийный токсин; антигены Mycobacterium tuberculosis включают без ограничения миколовую кислоту, белок теплового шока 65 (HSP65), основной секретируемый белок весом 30 кДа и антиген 85А; антигены бактерии, вызывающей коклюш, включают без ограничения гемагглютинин, пертактин, FIM2, FIM3 и аденилатциклазу; антигены пневмококка включают без ограничения пневмолизин и капсульные полисахариды пневмококка; антигены риккетсий включают без ограничения rompA; антигены стрептококка включают без ограничения белки М; и антигены бактерии, вызывающей столбняк, включают без ограничения столбнячный токсин.

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген представляет собой антиген супербактерий (например, мультирезистентных бактерий). Примеры супербактерий включают без ограничения Enterococcus faecium, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacteriaceae (включая Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp.).

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген представляет собой антиген грибов. Примеры грибов включают без ограничения представителей Candida, coccidiodes, cryptococcus, histoplasma, leishmania, plasmodium, простейших, паразитические организмы, шистосомы, вызывающие лишай организмы, токсоплазму и trypanosoma cruzi.

В качестве дополнительных конкретных примеров грибковых антигенов, антигены coccidiodes включают без ограничения антигены сферул; антигены криптококков включают без ограничения капсульные полисахариды; антигены histoplasma включают без ограничения белок теплового шока 60 (HSP60); антигены leishmania включают без ограничения gp63 и липофосфогликан; антигены plasmodium falciparum включают без ограничения поверхностные антигены мерозоитов, поверхностные антигены спорозоитов, антигены спорозонтов, поверхностные антигены гаметоцитов/гамет, антигены простейших и других паразитических организмов, включая гематостадийный антиген pf 155/RESA; антигены шистосом включают без ограничения глутатион-S-трансферазу и парамиозин; антигены вызывающих лишай грибов включают без ограничения трихофитии; антигены токсоплазмы включают без ограничения SAG-1 и p30; и антигены trypanosoma cruzi включают без ограничения антиген весом 75-77 кДа и антиген весом 56 кДа.

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген представляет собой антиген, экспрессируемый клетками, ассоциированными с нежелательным аутоиммунным или аллергическим состоянием. Иллюстративные аутоиммунные состояния включают без ограничения острую некротизирующую геморрагическую энцефалопатию, аллергическую астму, гнездную алопецию, анемию, афтозную язву, артрит (включая ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, псориатический артрит), астму, аутоиммунный тиреоидит, конъюнктивит, болезнь Крона, кожную красную волчанку, дерматит (включая атопический дерматит и зудящий дерматит), сахарный диабет, диабет, узловатую лепрозную эритему, кератоконъюнктивит, рассеянный склероз, тяжелую миастению, псориаз, склеродермию, синдром Шегрена, включая сухой кератоконъюнктивит, возникающий на фоне синдрома Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, системную красную волчанку, язвенный колит, вагинит и гранулематоз Вегенера.

Примеры аутоиммунных антигенов включают без ограничения де карбоксилазу глутаминовой кислоты 65 (GAD 65), нативную ДНК, основный белок миелина, протеолипидный белок миелина, компоненты ацетилхолинового рецептора, тиреоглобулин и рецептор тиреотропного гормона (TSH).

Примеры аллергических антигенов включают без ограничения антигены пыльцы, такие как антигены пыльцы криптомерии японской, антигены пыльцы амброзии, антигены пыльцы плевела, антигены животного происхождения (такие как антигены пылевых клещей и антигены кошек), антигены гисто совместимо ста и пенициллин и другие лекарственные средства.

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген представляет собой антиген (или его часть, например, эпитоп антигена), экспрессируемый опухолевыми клетками. В соответствии с одним вариантом осуществления антиген (или его часть) происходит из белка, экспрессируемого в кроветворной ткани (например, при злокачественном новообразовании кроветворной ткани, как, например, лейкозный антиген), или экспрессируемого в солидной опухоли (например, при меланоме, раке поджелудочной железы, раке печени, раке желудочно-кишечного тракта и т.п.).

Примеры опухолевых антигенов включают без ограничения A33, BAGE, Bcl-2, антиген созревания В-клеток (ВСМА), BCR-ABL, β-катенин, антигены рака/яичка (СТА, например, MAGE-1, MAGE-A2/A3 и NY-ESO-1), СА 125, СА 19-9, СА 50, СА 27.29 (BR 27.29), СА 15-3, CD5, CD19, CD20, CD21, CD22, CD33, CD37, CD45, CD123, СЕА, c-Met, CS-1, циклин B1, DAGE, EBNA, EGFR, ELA2, эфрин В2, рецептор эстрогенов, FAP, ферритин, фолат-связывающий белок, GAGE, G250/CA ГХ, GD-2, GM2, gp75, gp100 (Pmel 17), НА-1, НА-2, HER-2/neu, НМ1.24, HPV Е6, HPV Е7, hTERT, Ki-67, LRP, мезотелин, муциноподобный раковый антиген (MCA), MUC1, р53, PR1, PRAME, PRTN3, RHAMM (CD 168), WT-1. Дополнительные опухолевые антигены представлены в Molldrem J. Biology of Blood and Marrow Transplantation (2006) 12:13-18; Alatrash G. and Molldrem J., Expert Rev Hematol. (2011) 4(1): 37-50; Renkvist et al., Cancer Immunol Immunother (2001) 50:3-15; van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun (2013), www(dot)cancerimmunity(dot)org/peptide/; Rittenhouse, Manderino and Hass, Laboratory Medicine (1985) 16(9) 556-560; все из которых включены в настоящий документе посредством ссылки.

Ниже представлен перечень опухолевых антигенов, которые можно применять в соответствии с идеями некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения.

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген включает один антиген (например, вирусный, бактериальный или опухолевый антиген).

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген или антигены включают два или более антигенов (например, смесь антигенов одной группы антигенов, например, вирусных антигенов, опухолевых антигенов и т.п.; или смесь антигенов разных групп антигенов, например, вирусных и бактериальных антигенов, вирусных и опухолевых антигенов, вирусных и аутоиммунных антигенов, опухолевых и аутоиммунных антигенов или аутоиммунных и аллергических антигенов).

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген или антигены включают два, три, четыре, пять или более антигенов (например, в одном составе или в нескольких составах).

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген или антигены включают два, три, четыре, пять или более опухолевых антигенов (например, в одном составе или в нескольких составах).

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген или антигены включают два, три, четыре, пять или более вирусных антигенов (например, в одном составе или в нескольких составах).

В соответствии с конкретным вариантом осуществления антиген или антигены включают три вирусных антигена, например, пептид EBV, пептид CMV и пептид Adv.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления антиген или антигены включают два или более из EBV-LMP2, EBV-BZLF1, EBV-EBNA1, CMV-pp65, CMV-IE-1, Adv-пентона и Adv-гексона (например, два, три, четыре, пять, шесть или все семь антигенов).

В соответствии с конкретным вариантом осуществления антиген или антигены включают совокупность пептидных смесей, которые представляют собой библиотеки перекрывающихся пептидов (например, 15-меры, перекрывающиеся по 11 аминокислотам), охватывающие целую белковую последовательность трех вирусов: CMV, EBV и Adeno (такие пептидные смеси могут быть приобретены, например, у JPT Technologies, Берлин, Германия).

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления антиген или антигены включают совокупность семи пептидных смесей, охватывающих EBV-LMP2, EBV-BZLF1, EBV-EBNA1, CMV-pp65, CMV-IE-1, Adv-пентон и Adv-гексон, в концентрации, например, 100 нг/пептида или 700 нг/смеси семи пептидов.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления вирусные антигены дополнительно включают бактериальные антиген или антигены.

С целью стимуляции иммунного ответа Т-клеток памяти можно применять дополнительные стимулирующие антигены, такие как без ограничения альбумин куриного яйца, DNP (динитрофенил), KLH (гемоцианин моллюска Megathura crenulata).

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген или антигены являются «сторонними антигеном или антигенами», т.е. растворимыми или нерастворимыми (как, например, мембраноассоциированные) антигеном или антигенами, которые отсутствуют либо у донора, либо у реципиента. Например, сторонний антиген может представлять собой стороннюю клетку.

Сторонние клетки могут быть либо аллогенными, либо ксеногенными по отношению к донору и реципиенту (более подробно объясняется ниже в данном документе). В случае аллогенных сторонних клеток, такие клетки имеют HLA-антигены, отличные от таковых у донора, но которые не характеризуются перекрестной реактивностью с HLA-антигенами реципиента, так что сторонние клетки, образующиеся против таких клеток, не являются реактивными в отношении трансплантата или антигенов реципиента.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения аллогенные или ксеногенные сторонние клетки представляют собой стимулирующие клетки, выбранные из группы, состоящей из клеток, выделенных из популяции лимфоцитов периферической крови (PBL), селезенки или лимфатических узлов, цитокин-мобилизованных PBL, размноженных in vitro антиген-представляющих клеток (АРС), размноженных in vitro дендритных клеток (DC) и искусственных антиген-представляющих клеток.

Антигены по настоящему изобретению могут быть представлены на поверхности клеток, вирусов, грибов или бактерий, или могут происходить и/или быть очищенными из них. Кроме того, вирусный, грибковый или бактериальный антиген может быть представлен на поверхности инфицированной клетки или клеточный антиген может быть представлен в искусственном носителе (например, липосоме) или на поверхности искусственной антиген-представляющей клетки (например, клеточной линии, трансфицированной антигеном или антигенами). Таким образом, вирусные, бактериальные или грибковые антигены могут быть представлены клетками, инфицированными ими, или полученными иным образом с возможностью экспрессии вирусных/бактериальных/грибковых пептидов. Аналогичным образом, опухолевые антигены, аутоиммунные антигены или аллергические антигены могут быть представлены клетками, полученными с возможностью экспрессии таких белков.

Использование клеток, инфицированных вирусом клеток, инфицированных бактерией клеток, представляющих вирусные пептиды клеток или представляющих пептиды бактерий клеток в качестве антигенов является особенно перспективным ввиду того, что такие антигены включают разнообразное множество антигенных детерминант, и, таким образом, направляют образование Tcm-клеток разнородной популяции, которая может дополнительно обеспечивать более быстрое восстановление Т-клеток в тех случаях, когда такое восстановление является необходимым, например, после облучения летальными или сублетальными дозами или химиотерапевтической процедуры (как подробно обсуждается ниже), или для борьбы с заболеваниями (как подробно обсуждается ниже).

Таким образом, антиген-представляющие клетки (аутологичные или не являющиеся аутологичными, как обсуждается ниже), клеточные линии, искусственные носители (такие как липосома) или искусственные антиген-представляющие клетки (например, линия лейкозных клеток или фибробластов, трансфицированных антигеном или антигенами), можно применять для представления коротких синтетических пептидов, слитых с ними или нагруженных на них, или для представления белковых экстрактов или очищенных белков. Такие короткие пептиды, белковые экстракты или очищенные белки могут представлять собой пептиды, происходящие из вирусного, бактериального, грибкового, опухолевого, аутоиммунного или аллергического антигена, или пептиды, представляющие собой любой другой антиген.

Для анализа последовательностей вирусного, бактериального, грибкового, опухолевого, аутоиммунного или аллергического антигена с целью идентификации иммуногенных коротких пептидов, т.е. пептидов, представляемых в контексте главного комплекса гисто со вместимости (МНС) класса I или МНС класса II, можно применять специализированное программное обеспечение.

Кроме того, искусственные носители или искусственные АРС по настоящему изобретению могут быть сконструированы для экспонирования МНС без примирования экзогенным пептидом. Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления искусственная АРС включает опухолевые клетки K562, трансфицированные детерминантой МНС (например, аутологичные по отношению к Т-клетке памяти) и ко стимулирующей молекулой [как было описано ранее, например, Suhoski MM et al., Mol Ther. (2007) 15(5): 981-8], или фибробласты, трансфицированные ими же.

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген или антигены представлены антиген-представляющими клетками (например, DC), аутологичными по отношению к Т-клеткам памяти, например, одного и того же происхождения (например, от одного и того же донора), с целью обеспечения распознавания их Т-клетками памяти в контексте МНС класса I или МНС класса II.

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген или антигены представлены генетически модифицированными антиген-представляющими клетками или искусственными антиген-представляющими клетками, характеризующимися наличием антигенов МНС (также называемых антигенами лейкоцитов человека (HLA)), распознаваемыми Т-клетками памяти.

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген-представляющие клетки включают клетки человека.

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген-представляющие клетки включают дендритные клетки (DC).

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген-представляющие клетки включают зрелые дендритные клетки.

В соответствии с одним вариантом осуществления антиген-представляющие клетки включают облученные дендритные клетки.

Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления DC облучают приблизительно 5-10 Гр, приблизительно 10-20 Гр, приблизительно 20-30 Гр, приблизительно 20-40 Гр, приблизительно 20-50 Гр, приблизительно 10-50 Гр. В соответствии с конкретным вариантом осуществления DC облучают приблизительно 10-50 Гр (например, 30 Гр).

Способы использования дендритных клеток в качестве АРС известны в данной области. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) можно получать от донора клеток [например, от того же донора клеток, что и Т-клетки памяти]. РВМС высевают в культуральную чашку и инкубируют в течение 1-5 часов (например, 3 часов) при 37°С при 5% СО₂/О₂ с применением среды для DC-клеток (например, среды для DC Cellgro), дополненной сывороткой крови человека (например, 1% сывороткой крови человека) и пенициллином/стрептомицином (например, 1% пенициллином/стрептомицином). Супернатант клеток (содержащий Т-клетки) выбрасывают, и оставшиеся клетки (т.е. адгезивные клетки) дополнительно инкубируют в течение 48-96 (например, 72 часов) в тех же условиях культивирования с добавлением цитокинов GM-CSF (например, 800-1600 МЕ/мл) и IL-4 (например, 750 МЕ/мл) (доступно, например, от Peprotech, Гамбург, Германия). Спустя два-четыре дня (например, три дня) неприкрепившиеся клетки (т.е. включающие главным образом незрелые дендритные клетки) собирают и высевают с цитокинами для созревания DC, например, GM-CSF (например, 800 МЕ/мл), IL-4 (например, 750 МЕ/мл), LPS (например, из E. coli 055:В5 при, например, 40 нг/мл) и IFN-γ (например, 200 МЕ/мл) (доступно, например, от Peprotech, Гамбург, Германия) и инкубируют в течение ночи. На следующий день неадгезивные клетки можно выбрасывать, а адгезивные зрелые DC можно аккуратно выделять с применением, например, охлажденного PBS, содержащего, например, 2 мМ EDTA и 1% HS, после инкубации на льду в течение 10-60 минут (например, 30 минут), с получением тем самым крупных клеток, состоящих их зрелых DC.

С целью представления антигена или антигенов на поверхности АРС (например, зрелых DC), антиген или антигены культивируют совместно с АРС (например, DC) в течение от приблизительно 30 минут до 3 часов (например, 1 часа) при 37°С при 5% СО₂/О₂. К примеру, DC могут быть нагружены коктейлем пептидных смесей (вирусных пептидов) путем инкубации в течение приблизительно 1 часа при 37°С при 5% СО₂/О₂. Нагруженные антигеном АРС (например, DC) после этого готовы к применению для получения Tcm-клеток из популяции Т-клеток памяти в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.

Tcm-клетки по настоящему изобретению обычно получают путем первого приведения популяции Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами (такими как описанные выше) в культуре, дополненной IL-21 (например, в другой не содержащей цитокинов культуре, т.е. без добавления каких-либо дополнительных цитокинов). Эту стадию обычно осуществляют в течение приблизительно 12-24 часов, приблизительно 12-36 часов, приблизительно 12-72 часов, 12-96 часов, 12-120 часов, приблизительно 24-36 часов, приблизительно 24-48 часов, приблизительно 24-72 часов, приблизительно 36-48 часов, приблизительно 36-72 часов, приблизительно 48-72 часов, приблизительно 48-96 часов, приблизительно 48-120 часов, 0,5-1 дня, 0,5-2 дней, 0,5-3 дней, 0,5-5 дней, 1-2 дней, 1-3 дней, 1-5 дней, 1-7 дней, 1-10 дней, 2-3 дней, 2-4 дней, 2-5 дней, 2-6 дней, 2-8 дней, 3-4 дней, 3-5 дней, 3-7 дней, 4-5 дней, 4-8 дней, 5-7 дней, 6-8 дней или 8-10 дней, и она обеспечивает обогащение антигенреактивными клетками.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления контактирование популяции Т-клеток памяти с антигеном или антигенами (такими как описанные выше) в культуре, дополненной IL-21 (другой не содержащей цитокинов культуре), осуществляют в течение 1-5 дней (например, 3 дней).

Приведение популяции Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами (такими как описанные выше) в культуре, дополненной IL-21, обычно осуществляют в присутствии приблизительно 0,001-3000 МЕ/мл, 0,01-3000 МЕ/мл, 0,1-3000 МЕ/мл, 1-3000 МЕ/мл, 10-3000 МЕ/мл, 100-3000 МЕ/мл, 1000-3000 МЕ/мл, 0,001-1000 МЕ/мл, 0,01-1000 МЕ/мл, 0,1-1000 МЕ/мл, 1-1000 МЕ/мл, 10-1000 МЕ/мл, 100-1000 МЕ/мл, 250-1000 МЕ/мл, 500-1000 МЕ/мл, 750-1000 МЕ/мл, 10-500 МЕ/мл, 50-500 МЕ/мл, 100-500 МЕ/мл, 250-500 МЕ/мл, 100-250 МЕ/мл, 0,1-100 МЕ/мл, 1-100 МЕ/мл, 10-100 МЕ/мл, 30-100 МЕ/мл, 50-100 МЕ/мл, 1-50 МЕ/мл, 10-50 МЕ/мл, 20-50 МЕ/мл, 30-50 МЕ/мл, 1-30 МЕ/мл, 10-30 МЕ/мл, 20-30 МЕ/мл, 10-20 МЕ/мл, 0,1-10 МЕ/мл или 1-10 МЕ/мл IL-21. В соответствии с конкретным вариантом осуществления концентрация IL-21 составляет 50-500 МЕ/мл (например, 100 МЕ/мл).

В соответствии с конкретным вариантом осуществления приведение популяции Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами осуществляют в не содержащей цитокинов культуре (например, дополненной только IL-21), при этом такое условие культивирования обеспечивает выживание и обогащение только теми клетками, которые подвергаются стимуляции и активации антигеном или антигенами (т.е. антигенреактивными клетками), поскольку эти клетки секретируют цитокины (например, IL-2), которые обеспечивают их выживание (все остальные клетки погибают в таких условиях культивирования).

Соотношение антигена или антигенов (например, представленных на поверхности АРС, таких как дендритные клетки, примированные антигеном) и Т-клеток памяти обычно составляет от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:10, как, например, приблизительно 1:4, приблизительно 1:5, приблизительно 1:6, приблизительно 1:8 или приблизительно 1:10. В соответствии с конкретным вариантом осуществления соотношение антигена или антигенов (например, представленных на поверхности АРС) и Т-клеток памяти составляет от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:8 (например, 1:5).

Затем полученные в результате Т-клетки памяти (т.е. после культивирования с IL-21) культивируют в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7 в не содержащем антигенов окружении (т.е. без добавления антигена или антигенов) с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих фенотипом Tcm. Эту стадию обычно осуществляют в течение приблизительно 12-24 часов, приблизительно 12-36 часов, приблизительно 12-72 часов, приблизительно 12-96 часов, приблизительно 12-120 часов, приблизительно 12-240 часов, 24-36 часов, 24-48 часов, приблизительно 24-72 часов, 24-96 часов, 24-120 часов, 24-240 часов, приблизительно 48-72 часов, приблизительно 48-120 часов, приблизительно 48-240 часов, приблизительно 96-240 часов, приблизительно 120-144 часов, приблизительно 120-240 часов, приблизительно 144-240 часов, 0,5-1 дня, 0,5-2 дней, 0,5-3 дней, 0,5-5 дней, 0,5-10 дней, 1-2 дней, 1-3 дней, 1-4 дней, 1-6 дней, 1-8 дней, 1-10 дней, 1-15 дней, 2-3 дней, 2-4 дней, 2-5 дней, 2-6 дней, 2-8 дней, 2-10 дней, 4-5 дней, 4-6 дней, 4-8 дней, 4-10 дней, 5-6 дней, 5-7 дней, 5-8 дней, 5-10 дней, 5-15 дней, 6-7 дней, 6-8 дней, 6-10 дней, 7-8 дней, 7-9 дней, 7-10 дней, 7-13 дней, 7-15 дней, 8-10 дней, 10-12 дней, 10-14 дней, 12-14 дней, 14-16 дней, 14-18 дней, 16-18 дней или 18-20 дней. В соответствии с конкретным вариантом осуществления полученные в результате Т-клетки памяти (т.е. после культивирования с IL-21) культивируют в присутствии IL-21, IL-15 и IL-7 в не содержащем антигенов окружении в течение приблизительно 4-8 дней (например, 6 дней).

Эту стадию обычно осуществляют в присутствии IL-21 в концентрации приблизительно 0,001-3000 МЕ/мл, 0,01-3000 МЕ/мл, 0,1-3000 МЕ/мл, 1-3000 МЕ/мл, 10-3000 МЕ/мл, 100-3000 МЕ/мл, 1000-3000 МЕ/мл, 0,001-1000 МЕ/мл, 0,01-1000 МЕ/мл, 0,1-1000 МЕ/мл, 1-1000 МЕ/мл, 10-1000 МЕ/мл, 100-1000 МЕ/мл, 250-1000 МЕ/мл, 500-1000 МЕ/мл, 750-1000 МЕ/мл, 10-500 МЕ/мл, 50-500 МЕ/мл, 100-500 МЕ/мл, 250-500 МЕ/мл, 100-250 МЕ/мл, 0,1-100 МЕ/мл, 1-100 МЕ/мл, 10-100 МЕ/мл, 30-100 МЕ/мл, 50-100 МЕ/мл, 1-50 МЕ/мл, 10-50 МЕ/мл, 20-50 МЕ/мл, 30-50 МЕ/мл, 1-30 МЕ/мл, 10-30 МЕ/мл, 20-30 МЕ/мл, 10-20 МЕ/мл, 0,1-10 МЕ/мл или 1-10 МЕ/мл IL-21. В соответствии с конкретным вариантом осуществления концентрация IL-21 составляет 50-500 МЕ/мл (например, 100 МЕ/мл).

Эту стадию дополнительно осуществляют в присутствии IL-15 в концентрации приблизительно 0,001-3000 МЕ/мл, 0,01-3000 МЕ/мл, 0,1-3000 МЕ/мл, 1-3000 МЕ/мл, 10-3000 МЕ/мл, 100-3000 МЕ/мл, 125-3000 МЕ/мл, 1000-3000 МЕ/мл, 0,001-1000 МЕ/мл, 0,01-1000 МЕ/мл, 0,1-1000 МЕ/мл, 1-1000 МЕ/мл, 10-1000 МЕ/мл, 100-1000 МЕ/мл, 125-1000 МЕ/мл, 250-1000 МЕ/мл, 500-1000 МЕ/мл, 750-1000 МЕ/мл, 10-500 МЕ/мл, 50-500 МЕ/мл, 100-500 МЕ/мл, 125-500 МЕ/мл, 250-500 МЕ/мл, 250-500 МЕ/мл, 125-250 МЕ/мл, 100-250 МЕ/мл, 0,1-100 МЕ/мл, 1-100 МЕ/мл, 10-100 МЕ/мл, 30-100 МЕ/мл, 50-100 МЕ/мл, 1-50 МЕ/мл, 10-50 МЕ/мл, 20-50 МЕ/мл, 30-50 МЕ/мл, 1-30 МЕ/мл, 10-30 МЕ/мл, 20-30 МЕ/мл, 10-20 МЕ/мл, 0,1-10 МЕ/мл или 1-10 МЕ/мл IL-15. В соответствии с конкретным вариантом осуществления концентрация IL-15 составляет 50-500 МЕ/мл (например, 125 МЕ/мл).

Эту стадию дополнительно осуществляют в присутствии IL-7 в концентрации приблизительно 0,001-3000 МЕ/мл, 0,01-3000 МЕ/мл, 0,1-3000 МЕ/мл, 1-3000 МЕ/мл, 10-3000 МЕ/мл, 30-3000 МЕ/мл, 100-3000 МЕ/мл, 1000-3000 МЕ/мл, 0,001-1000 МЕ/мл, 0,01-1000 МЕ/мл, 0,1-1000 МЕ/мл, 1-1000 МЕ/мл, 10-1000 МЕ/мл, 30-1000 МЕ/мл, 100-1000 МЕ/мл, 250-1000 МЕ/мл, 500-1000 МЕ/мл, 750-1000 МЕ/мл, 10-500 МЕ/мл, 30-500 МЕ/мл, 50-500 МЕ/мл, 100-500 МЕ/мл, 250-500 МЕ/мл, 100-250 МЕ/мл, 0,1-100 МЕ/мл, 1-100 МЕ/мл, 10-100 МЕ/мл, 30-100 МЕ/мл, 50-100 МЕ/мл, 1-50 МЕ/мл, 10-50 МЕ/мл, 20-50 МЕ/мл, 30-50 МЕ/мл, 1-30 МЕ/мл, 10-30 МЕ/мл, 20-30 МЕ/мл, 10-20 МЕ/мл, 0,1-10 МЕ/мл или 1-10МЕ/мл IL-7. В соответствии с конкретным вариантом осуществления концентрация IL-7 составляет 1-100 МЕ/мл (30 МЕ/мл).

Понятно, что в клеточной культуре после культивирования с IL-21 (т.е. на стадии пролиферации Tcm, предусматривающей, например, добавление IL-21, IL-15 и IL-7) могут присутствовать остаточные антиген или антигены, и, таким образом, не содержащее антигенов окружение относится к клеточной культуре без добавления дополнительных антигена или антигенов.

Дополнительная стадия, которую можно осуществлять в соответствии с идеями настоящего изобретения, включает культивирование полученных в результате Т-клеток памяти (т.е. после культивирования с IL-21) с антигеном или антигенами в присутствии IL-21, IL-15 и IL-7 (т.е. перед созданием не содержащего антигенов окружения). Эту стадию обычно осуществляют в течение приблизительно 12-24 часов, приблизительно 12-36 часов, приблизительно 12-72 часов, 24-48 часов, 24-36 часов, приблизительно 24-72 часов, приблизительно 48-72 часов, 1-2 дней, 2-3 дней, 1-3 дней, 2-4 дней, 1-5 дней или 2-5 дней, и проводят при тех же дозах IL-21, IL-15 и IL-7, которые указаны выше. В соответствии с конкретным вариантом осуществления культивирование клеток памяти с антигеном или антигенами в присутствии IL-21, IL-15 и IL-7 осуществляют в течение от 12 часов до 4 дней (например, 1-2 дней). В соответствии с одним вариантом осуществления общая продолжительность получения Tcm-клеток составляет приблизительно 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней (например, 9 дней).

Дополнительная стадия, которую можно осуществлять в соответствии с идеями настоящего изобретения, включает отбор и удаление активированных клеток. Такая стадия отбора обеспечивает удаление потенциально реактивных в отношении хозяина Т-клеток.

Выделение активированных клеток можно осуществлять в рамках двустадийного подхода. На первой стадии активированные клетки отбирают перед культивированием клеток в присутствии IL-21, IL-15 и IL-7. Первую стадию обычно осуществляют после первичного приведения Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами в присутствии IL-21. Этот процесс отбора позволяет выбрать только те клетки, которые были активированы антигеном или антигенами (например, экспрессируют маркеры активации, как описано ниже), и его обычно проводят спустя приблизительно 12-24 часа, приблизительно 24-36 часов, приблизительно 12-36 часов, приблизительно 36-48 часов, приблизительно 12-48 часов, приблизительно 48-60 часов, приблизительно 12-60 часов, приблизительно 60-72 часа, приблизительно 12-72 часа, приблизительно 72-84 часа, приблизительно 12-84 часа, приблизительно 84-96 часов, приблизительно 12-96 часов после первичного приведения Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами. В соответствии с конкретным вариантом осуществления процесс отбора осуществляют спустя приблизительно 12-24 часа (например, 14 часов) после первичного приведения Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами.

Выделение активированных клеток можно осуществлять с помощью аффинной очистки (например, с помощью применения гранул для MACS, FACS-сортера и/или мечения с использованием ELISA с захватом) и можно осуществлять в отношении любых маркеров активации, включая маркеры клеточной поверхности, такие как без ограничения CD69, CD44, CD25, CFSE, CD137, или маркеры, отличные от маркеров клеточной поверхности, такие как без ограничения IFN-γ и IL-2. Выделение активированных клеток также можно осуществлять с помощью очистки на основе морфологических признаков (например, выделение крупных клеток) с применением любого известного в данной области способа (например, с помощью FACS). Обычно активированные клетки также отбирают в отношении экспрессии CD8⁺ клеток. Кроме того, для эффективного выделения активированных клеток можно использовать любую комбинацию вышеупомянутых способов.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения отбор активированных клеток осуществляют путем отбора CD137+ и/или CD25+ клеток.

Вторую стадию выделения активированных клеток обычно осуществляют в конце культивирования (т.е. после культивирования в не содержащем антигенов окружении с IL-21, IL-15 и IL-7). С помощью этой стадии обеспечивается истощение аллореактивных клеток путем истощения тех клеток, которые были активированы после приведения центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm) в контакт с облученными антиген-представляющими клетками хозяина (АРС, например, дендритными клетками). Как упоминалось выше, выделение активированных клеток можно осуществлять с помощью аффинной очистки (например, с помощью применения гранул для MACS, FACS-сортера и/или мечения с использованием ELISA с захватом) и можно осуществлять в отношении любых маркеров активации, включая маркеры клеточной поверхности, такие как без ограничения CD69, CD44, CD25, CFSE, CD137, или маркеры, отличные от маркеров клеточной поверхности, такие как без ограничения IFN-γ и IL-2.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения истощение аллореактивных клеток осуществляют за счет истощения CD137 +и/или CD25+ клеток.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения истощение аллореактивных клеток осуществляют путем культивирования Tcm-клеток с облученными антиген-представляющими клетками хозяина (АРС, например, дендритными клетками) в течение, например, 12-24 часов (например, 16 часов), приблизительно 6-9 дней (например, в день 8) от начала культивирования (т.е. день 0 является первым днем культивирования Т-клеток памяти с антигеном или антигенами).

В соответствии с одним вариантом осуществления выделение активированных клеток осуществляют с применением только первой стадии, как обсуждалось выше.

В соответствии с другим вариантом осуществления выделение активированных клеток осуществляют с применением только второй стадии, как обсуждалось выше.

В соответствии с одним вариантом осуществления не индуцирующие GvHD клетки с фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm) по настоящему изобретению не встречаются в природе и не являются естественным продуктом. Эти клетки обычно получают путем проведения ex-vivo манипуляций (т.е. подвергают воздействию антигена или антигенов в присутствии определенных цитокинов).

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения представлен способ получения выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток, обладающих фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm), причем клетки являются вето-клетками и/или наделены активностью в отношении заболевания и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации, причем способ предусматривает: (а) обработку неадгезивных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) средством, способным обеспечивать истощение CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺ клеток, с целью получения популяции Т-клеток памяти, обладающих фенотипом CD45RA^-CD8⁺; (b) приведение популяции Т-клеток памяти в контакт с антигеном или антигенами в присутствии IL-21 с целью обеспечения обогащения ее антигенреактивными клетками; и (с) культивирование полученных на стадии (b) клеток в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7 с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих фенотипом Tcm, с получением тем самым выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения представлен способ получения выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток, обладающих фенотипом центральных Т-лимфоцитов памяти (Tcm), причем клетки являются вето-клетками и/или наделены активностью в отношении заболевания и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации, причем способ предусматривает: (а) обработку неадгезивных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) средством, способным обеспечивать истощение CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺ клеток, с целью получения популяции Т-клеток памяти, обладающих фенотипом CD45RA^-CD8⁺; (b) приведение популяции Т-клеток памяти в контакт с вирусными антигеном или антигенами в присутствии IL-21 с целью обеспечения обогащения ее антигенреактивными клетками; и (с) культивирование полученных на стадии (b) клеток в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7 с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих фенотипом Tcm, с получением тем самым выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток.

В соответствии с одним вариантом осуществления с целью получения Т-клеток памяти, специфических в отношении антигена или антигенов, антиген/антигены (например, опухолевый антиген, вирусный антиген) вводят донору Т-клеток памяти до получения от него Т-клеток памяти (например, до обеспечения популяции по меньшей мере из 70% Т-клеток памяти). Можно использовать любой способ иммунизации донора клеток в отношении антигена с целью стимуляции иммунного ответа (например, выработки Т-клеток памяти).

Антиген можно вводить в виде композиции или как часть композиции, содержащей адъювант (например, полный адъювант Фрейнда (CFA) или неполный адъювант Фрейнда (IFA)). В соответствии с одним вариантом осуществления антиген вводят донору Т-клеток памяти один раз. В соответствии с одним вариантом осуществления донор Т-клеток памяти получает по меньшей мере одно дополнительное (например, в рамках вторичной иммунизации) введение антигена (например, 2, 3, 4 или более введений). Такое дополнительное введение можно осуществлять спустя 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 21, 30 дней или более после первого введения антигена.

Дополнительные способы иммунизации субъекта опухолевым антигеном, которые можно применять в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения (например, вакцины на основе клеток, такие как пептид-специфические вакцины на основе DC, вакцины на основе DC против неопределенных эпитопов, применение полученных при лейкозе DC для вакцинации, платформа GVAX^®), описаны в Alatrash G. and Molldrem J., Expert Rev Hematol. (2011) 4(1): 37-50, включенной в настоящий документ посредством ссылки.

С целью дополнительного обогащения Т-клеток памяти в отношении конкретного антигена/антигенов и с целью истощения аллореактивных клонов из пула Т-клеток памяти, Т-клетки памяти можно дополнительно приводить в контакт с теми же антигеном или антигенами (например, тем же антигеном, который вводили донору клеток), как описано в данном документе выше.

Вышеописанные протоколы обычно используют для применений, предусматривающих не являющиеся изогенными системы, и, следовательно, применяемые Т-клетки памяти или РВМС обычно являются аллогенными по отношению к субъекту (например, от аллогенного донора). Подобным образом, в случаях, в которых благоприятными могут быть применения, предусматривающие ксеногенные системы, применяемые Т-клетки памяти или РВМС могут иметь ксеногенное происхождение, как обсуждается ниже.

Однако, в случаях, в которых благоприятными могут быть применения, предусматривающие изогенные системы, применяемые Т-клетки памяти или РВМС могут быть аутологичными по отношению к субъекту (например, от субъекта). Такие определения находятся в пределах компетенции специалиста в данной области, особенно с учетом предоставленного раскрытия.

Таким образом, как упоминалось, Т-клетки памяти или РВМС могут быть изогенными или могут не являться изогенными по отношению к субъекту.

В контексте настоящего документа термин «изогенные» клетки относится к клеткам, которые в основном являются генетически идентичными по отношению к субъекту или практически всем лимфоцитам субъекта. Примеры изогенных клеток включают клетки, происходящие от субъекта (также называемые в данной области «аутологичными»), клона субъекта или однояйцевого близнеца субъекта.

В контексте настоящего документа термин «не являющиеся изогенными» клетки относится к клеткам, которые в основном не являются генетически идентичными по отношению к субъекту или практически всем лимфоцитам субъекта, таким как аллогенные клетки или ксеногенные клетки.

В контексте настоящего документа термин «аллогенный» относится к клеткам, которые происходят от донора, который относится к тому же виду, что и субъект, но которые в основном не являются клонами клеток субъекта. Обычно аутбредные млекопитающие, являющиеся разнояйцевыми близнецами, одного вида, являются аллогенными по отношению друг к другу. Понятно, что аллогенная клетка может быть HLA-идентичной, частично HLA-идентичной или может не быть HLA-идентичной (т.е. характеризоваться наличием одной или нескольких отличных детерминант HLA) по отношению к субъекту.

В соответствии с одним вариантом осуществления донором клеток является человек.

В контексте настоящего документа термин «ксеногенный» относится к клетке, которая, по сути, экспрессирует антигены вида, отличного от вида, к которому относится значительная доля лимфоцитов субъекта. Обычно аутбредные млекопитающие разных видов являются ксеногенными по отношению друг к другу.

Настоящее изобретение предусматривает, что ксеногенные клетки происходят от различных видов. Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления клетки могут происходить от любого млекопитающего. Подходящие виды происхождения клеток включают основных одомашненных животных или домашний скот и приматов. Такие животные включают без ограничения представителей семейства свиньих (например, свинью), представителей семейства бычьих (например, корову), представителей семейства лошадиных (например, лошадь), представителей подсемейства козлиных (например, козу, овцу), представителей семейства кошачьих (например, Felis domestica), представителей семейства псовых (например, Canis domestica), грызунов (например, мышь, крысу, кролика, морскую свинку, песчанку, хомяка) и приматов (например, шимпанзе, макака-резуса, представителя рода макак, мармозетку).

Клетки ксеногенного происхождения (например, свиного происхождения) предпочтительно получены от источника, о котором известно, что у него не наблюдаются зоонозы, например, вызванные эндогенными ретровирусами представителя семейства свиньих. Аналогичным образом, клетки или ткани человеческого происхождения предпочтительно получены от источников, практически не содержащих патогенных организмов.

Таким образом, источник Т-клеток памяти или РВМС будет определен в соответствии с предполагаемым применением клеток (см. более подробно ниже в данном документе) и не выходит за рамки компетентности специалиста в данной области, особенно в свете подробно раскрытия, приведенного в настоящем документе.

Применение вето-клеток является особенно благоприятным в ситуациях, в которых существует необходимость устранения отторжения трансплантата и преодоления реакции «трансплантат против хозяина» (GvHD), как, например, при трансплантации аллогенных или ксеногенных клеток или тканей.

Как упоминалось выше, вето-клетки по настоящему изобретению дополнительно наделены активностью в отношении заболевания и, следовательно, являются благоприятными в ситуациях, в которых у субъекта, например, перенесшего трансплантацию субъекта, наблюдается заболевание или состояние (например, злокачественное, вирусное, бактериальное, грибковое, аутоиммунное или аллергическое заболевание или состояние), перед трансплантацией или после нее (например, до проведения иммуновосстановительной терапии).

Таким образом, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения представлен способ лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения (т.е. Tcm-клеток), за счет чего обеспечивается лечение заболевания у субъекта.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения представлен способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации клеток или тканей, причем способ предусматривает: (а) пересадку трансплантата клеток или тканей субъекту; и (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения (т.е. Tcm-клеток), за счет чего обеспечивается лечение субъекта, нуждающегося в трансплантации клеток или тканей.

В контексте настоящего документа термин «лечение» включает устранение, существенное ингибирование, замедление или реверсию прогрессирования состояния, существенное ослабление клинических или визуальных симптомов состояния или существенное предотвращение появления клинических или визуальных симптомов состояния.

В контексте настоящего документа термин «субъект» или «нуждающийся в этом субъект» относится к млекопитающему, предпочтительно человеку, мужского или женского пола в любом возрасте, которые нуждаются в трансплантации клеток или тканей или страдают от заболевания, которое можно лечить с помощью Tcm-клеток. Обычно субъект нуждается в трансплантации клеток или тканей (также называемый в настоящем документе реципиентом) ввиду нарушения или патологического или нежелательного состояния, статуса или синдрома, или физического, морфологического или физиологического отклонения от нормы, которые поддаются лечению посредством трансплантации клеток или тканей. Примеры таких нарушений дополнительно представлены ниже.

В контексте настоящего документа термин «терапевтически эффективное количество» представляет собой количество Tcm-клеток, эффективное для толеризации (т.е. вето-эффекта), эффекта в отношении заболевания, противоопухолевого эффекта и/или восстановления иммунитета без индуцирования GvHD. Поскольку Tcm-клетки по настоящему изобретению возвращаются назад в лимфатические узлы после трансплантации, для достижения благоприятного эффекта/эффектов клеток (например, толеризации, эффекта в отношении заболевания, противоопухолевого эффекта и/или восстановления иммунитета) могут понадобиться более низкие количества клеток (по сравнению с ранее применяемой дозой клеток, см., например, WO 2001/049243). Понятно, что в сочетании с Tcm-клетками по настоящему изобретению могут понадобиться более низкие уровни иммуносупрессорных лекарственных средств (обсуждается ниже) (как, например, исключение из протокола терапии рапамицина).

Определение терапевтически эффективного количества не выходит за рамки компетентности специалистов в данной области, особенно в свете подробно раскрытия, приведенного в настоящем документе.

Для любого применяемого в способах по настоящему изобретению препарата терапевтически эффективное количество или доза могут быть первоначально установлены с помощью анализов in vitro и анализов на клеточных культурах. Например, необходимая для достижения требуемой концентрации или титра доза может быть определена в животных моделях. Такую информацию можно применять для более точного определения пригодных доз у людей.

Например, в случае трансплантации клеток число Tcm-клеток, вводимых реципиенту путем инфузии, должно превышать 1×10⁴/кг веса тела. Число Tcm-клеток, вводимых реципиенту путем инфузии, обычно должно находиться в диапазоне от 1×10³/кг веса тела до 1×10⁴/кг веса тела, в диапазоне от 1×10⁴/кг веса тела до 1×10⁵/кг веса тела, в диапазоне от 1×10⁴/кг веса тела до 1×10⁶/кг веса тела, в диапазоне от 1×10⁴/кг веса тела до 10×10⁷/кг веса тела, в диапазоне от 1×10⁴/кг веса тела до 1×10⁸/кг веса тела, в диапазоне от 1×10³/кг веса тела до 1×10⁵/кг веса тела, в диапазоне от 1×10⁴/кг веса тела до 1×10⁶/кг веса тела, в диапазоне от 1×10⁶/кг веса тела до 10×10⁷/кг веса тела, в диапазоне от 1×10⁵/кг веса тела до 10×10⁷/кг веса тела, в диапазоне от 1×10⁶/кг веса тела до 1×10⁸/кг веса тела. В соответствии с конкретным вариантом осуществления число Tcm-клеток, вводимых реципиенту путем инфузии, должно находиться в диапазоне от 1×10⁵/кг веса тела до 10×10⁷/кг веса тела.

Таким образом, способ по настоящему изобретению можно применять для лечения любого заболевания, такого как без ограничения злокачественное заболевание, заболевание, ассоциированное с пересадкой трансплантата (например, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат против хозяина»), инфекционное заболевание (например, вирусное заболевание, грибковое заболевание или бактериальное заболевание), воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание и/или аллергическое заболевание или состояние.

В соответствии с одним вариантом осуществления у субъекта наблюдается злокачественное заболевание.

Злокачественные заболевания (также называемые формами рака), которые можно лечить с помощью способа согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, могут представлять собой любую солидную или несолидную опухоль и/или метастаз опухоли.

Примеры рака включают без ограничения карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких форм рака включают плоскоклеточный рак, саркому мягких тканей, саркому Капоши, меланому, рак легкого (включая мелко клеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аде но карциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого), рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка или злокачественную опухоль желудка (включая рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак толстой и прямой кишки, рак прямой кишки, карциному эндометрия или матки, карциноидную опухоль, карциному слюнных желез, злокачественную опухоль или рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, мезотелиому, множественную миелому, посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD) и различные типы рака головы и шеи (например, опухоль головного мозга). Раковые состояния, поддающиеся лечению по настоящему изобретению, включают метастатические формы рака.

В соответствии с одним вариантом осуществления злокачественное заболевание представляет собой злокачественное новообразование кроветворной ткани. Иллюстративные злокачественные новообразования кроветворной ткани включают без ограничения лейкоз [например, острый лимфоцитарный, острый лимфобластный, острый лимфоцитарный лейкоз из предшественников В-клеток, острый лимфобластный Т-клеточный лейкоз, острый мегакариобластный, моноцитарный, острый миелогенный, острый миелоидный, острый миелоидный с эозинофилией, В-клеточный, базофильный, хронический миелоидный, хронический В-клеточный, эозинофильный лейкоз, лейкоз Фрейда, гранулоцитарный или миелоцитарный, волосато клеточный, лимфоцитарный, мегакариобластный, моноцитарный, моноцитарно-макрофагальный, миелобластный, миелоидный, миеломоноцитарный, плазмоклеточный лейкоз, лейкоз из предшественников В-клеток, промиелоцитарный, подострый, Т-клеточный лейкоз, опухоль лимфоидной ткани, предрасположенность к злокачественному новообразованию миелоидной ткани, острый нелимфоцитарный лейкоз, Т-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (T-ALL) и В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (B-CLL)] и лимфому [например, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, лимфому Беркитта, кожную Т-клеточную, гистиоцитарную, лимф областную, Т-клеточную, тимическую, В-клеточную лимфому, включая NHL низкой степени злокачественности/фолликулярную NHL; мелко клеточную лимфоцитарную (SL) NHL; NHL промежуточной степени злокачественности/фолликулярную NHL; диффузную NHL промежуточной степени злокачественности; иммунобластную NHL высокой степени злокачественности; лимфобластную NHL высокой степени злокачественности; NHL с клетками с нерасщепленным ядром высокой степени злокачественности; NHL с массивным поражением лимфатических узлов; лимфому из клеток маргинальной зоны; СПИД-ассоциированную лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрема].

В соответствии с конкретным вариантом осуществления злокачественное заболевание представляет собой лейкоз, лимфому, миелому, меланому, саркому, нейробластому, рак толстой кишки, рак толстой и прямой кишки, рак молочной железы, рак яичника, рак пищевода, рак из синовиальных клеток, рак печени и рак поджелудочной железы.

В соответствии с одним вариантом осуществления у субъекта наблюдается заболевание, не являющееся злокачественным.

В соответствии с одним вариантом осуществления заболевание, не являющееся злокачественным, представляет собой нарушение функции или функциональную недостаточность органа, заболевание крови, заболевание, связанное с трансплантацией, инфекционное заболевание, воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание, аллергическое заболевание, травму и повреждение.

Воспалительные заболевания - включают без ограничения хронические воспалительные заболевания и острые воспалительные заболевания.

Воспалительные заболевания, ассоциированные с гиперчувствительностью

Примеры гиперчувствительности включают без ограничения гиперчувствительность I типа, гиперчувствительность II типа, гиперчувствительность III типа, гиперчувствительность IV типа, гиперчувствительность немедленного типа, гиперчувствительность, опосредованную антителами, гиперчувствительность, опосредованную иммунными комплексами, гиперчувствительность, опосредованную Т-лимфоцитами, и DTH.

Гиперчувствительность I типа или гиперчувствительность немедленного типа, такая как астма.

Гиперчувствительность II типа включает без ограничения ревматоидные заболевания, ревматоидные аутоиммунные заболевания, ревматоидный артрит (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul;15 (3):791), спондилит, анкилозирующий спондилит (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189), системные заболевания, системные аутоиммунные заболевания, системную красную волчанку (Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17 (1-2):49), склероз, системный склероз (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar; 6 (2):156); Chan ОТ. et al., Immunol Rev 1999 Jun; 169:107), заболевания желез, аутоиммунные заболевания желез, аутоиммунные заболевания поджелудочной железы, сахарный диабет, сахарный диабет I типа (Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct; 34 Suppl:S125), заболевания щитовидной железы, аутоиммунные заболевания щитовидной железы, диффузный токсический зоб (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun; 29 (2):339), тиреоидит, спонтанный аутоиммунный тиреоидит (Braley-Mullen Н. and Yu S, J Immunol 2000 Dec 15;165 (12):7262), тиреоидит Хашимото (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug; 57 (8): 1810), микседему, идиопатическую микседему (Mitsuma Т. Nippon Rinsho. 1999 Aug; 57 (8): 1759); аутоиммунные заболевания репродуктивной системы, заболевания яичника, аутоиммунные нарушения яичников (Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb; 37 (2):87), аутоиммунное бесплодие, связанное с антиспермальными антителами (Diekman АВ. et al., Am J Reprod Immunol. 2000 Mar; 43 (3):134), повторяющуюся потерю плода (Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9), нейродегенеративные заболевания, неврологические заболевания, неврологические аутоиммунные заболевания, рассеянный склероз (Cross АН. et al., J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112 (1-2): 1), болезнь Альцгеймера (Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997;49:77), тяжелую миастению (Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1 -2):83), двигательные невропатии (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May; 7 (3):191), синдром Гийена-Барре, невропатии и аутоиммунные невропатии (Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319 (4):234), миастении, миастенический синдром Ламберта-Итона (Takamori М. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319 (4):204), паранеопластические неврологические заболевания, атрофию мозжечка, паранеопластическую атрофию мозжечка, непаранеопластический синдром мышечной скованности, атрофии мозжечка, прогрессирующие атрофии мозжечка, энцефалит, энцефалит Расмуссена, боковой амиотрофический склероз, хорею Сиденгама, болезнь Туретта, полиэндокринопатии, аутоиммунные полиэндокринопатии (Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan; 156 (1):23); невропатии, дисиммунные невропатии (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419); нейромиотонию, приобретенную нейромиотонию, врожденный множественный артрогрипоз (Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482), заболевания сердечно-сосудистой системы, аутоиммунные заболевания сердечнососудистой системы, атеросклероз (Matsuura Е. et al., Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135), инфаркт миокарда (Vaarala О. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132), тромбоз (Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2: S107-9), гранулематоз, гранулематоз Вегенера, воспаление артерии, синдром Такаясу и синдром Кавасаки (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25; 112 (15-16):660); аутоиммунное заболевание, связанное с антителами к фактору VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26 (2): 157); васкулит, некротизирующий васкулит малых сосудов, микроскопический полиангиит, синдром Черджа-Стросс, гло мер уло нефрит, малоиммунный фокальный некротизирующий гломерулонефрит, серповидный гломерулонефрит (Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May; 151 (3):178); антифосфолипидный синдром (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999;14 (4): 171); сердечную недостаточность, агонист-подобные антитела к β-адренорецептору при сердечной недостаточности (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17;83 (12A):75H), тромбоцитопеническую пурпуру (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun;14 (2): 114); гемолитическую анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan; 28 (3-4):285), заболевания желудочно-кишечного тракта, аутоиммунные заболевания желудочно-кишечного тракта, кишечные заболевания, хроническое воспалительное кишечное заболевание (Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan; 23 (1): 16), целиакию (Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16; 138 (2):122), аутоиммунные заболевания мускулатуры, миозит, аутоиммунный миозит, синдром Шегрена (Feist Е. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep; 123 (1):92); гладко мышечное аутоиммунное заболевание (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun; 53 (5-6):234), заболевания печени, аутоиммунные заболевания печени, аутоиммунный гепатит (Manns MP. J Hepatol 2000 Aug;33 (2):326) и первичный билиарный цирроз (Strassburg СР. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun; 11 (6):595).

Гиперчувствительность IV типа или гиперчувствительность, опосредованная Т-клетками, включают без ограничения ревматоидные заболевания, ревматоидный артрит (Tisch R, McDevitt НО. Proc Natl Acad Sci U S A 1994 Jan 18;91 (2):437), системные заболевания, системные аутоиммунные заболевания, системную красную волчанку (Datta SK., Lupus 1998;7 (9): 591), заболевания желез, аутоиммунные заболевания желез, заболевания поджелудочной железы, аутоиммунные заболевания поджелудочной железы, сахарный диабет 1 типа (Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647); заболевания щитовидной железы, аутоиммунные заболевания щитовидной железы, диффузный токсический зоб (Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar; 92 (1):77); заболевания яичника (Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2):87), простатит, аутоиммунный простатит (Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec;50 (6):893), полигландулярный синдром, аутоиммунный полигландулярный синдром, аутоиммунный полигландулярный синдром I типа (Нага Т. et al., Blood. 1991 Mar 1;77 (5): 1127), неврологические заболевания, аутоиммунные неврологические заболевания, рассеянный склероз, неврит, неврит зрительного нерва (Soderstrom М. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May;57 (5):544), тяжелую миастению (Oshima М. et al., Eur J Immunol 1990 Dec; 20 (12):2563), синдром мышечной скованности (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001 Mar 27;98 (7):3988), заболевания сердечно-сосудистой системы, кардиальную аутоиммунную реакцию при болезни Чагаса (Cunha-Neto Е. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15;98 (8): 1709), аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру (Semple JW. et al., Blood 1996 May 15;87 (10):4245), обусловленную антителами к хелперным Т-лимфоцитам аутоиммунную реакцию (Caporossi АР. et al., Viral Immunol 1998;11 (1):9), гемолитическую анемию (Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar; 74 (3):139), заболевания печени, аутоиммунные заболевания печени, гепатит, хронический активный гепатит (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar;54 (3):382), билиарный цирроз, первичный билиарный цирроз (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov;91 (5):551), заболевания почек, аутоиммунные заболевания почек, нефрит, интерстициальный нефрит (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug;1 (2):140), ревматические болезни, заболевания слуховой системы, аутоиммунные ревматические болезни, аутоиммунное заболевание слуховой системы (Yoo TJ. et al., Cell Immunol 1994 Aug;157 (1):249), заболевание внутреннего уха (Gloddek В. et al., Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29;830:266), заболевания кожи, кожные болезни, кожные заболевания, буллезные заболевания кожи, обыкновенную пузырчатку, буллезный пемфигоид и листовидную пузырчатку.

Примеры гиперчувствительности замедленного типа включают без ограничения контактный дерматит и медикаментозную сыпь.

Примеры типов гиперчувствительности, опосредованной Т-клетками, включают без ограничения гиперчувствительность, опосредованную хелперными Т-лимфоцитами и цитотоксическими Т-лимфоцитами.

Примеры гиперчувствительности, опосредованной хелперными Т-лимфоцитами, включают без ограничения гиперчувствительность, опосредованную T_h1-лимфоцитами, и гиперчувствительность, опосредованную T_h2-лимфоцитами.

Аутоиммунные заболевания

Аутоиммунные заболевания включают без ограничения заболевания сердечнососудистой системы, ревматоидные заболевания, заболевания желез, заболевания желудочно-кишечного тракта, кожные болезни, заболевания печени, неврологические заболевания, мышечные заболевания, заболевания почек, заболевания, связанные с репродуктивной функцией, ревматические заболевания и системные заболевания.

Примеры аутоиммунных заболеваний сердечно-сосудистой системы включают без ограничения атеросклероз (Matsuura Е. et al., Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135), инфаркт миокарда (Vaarala О. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132), тромбоз (Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9), гранулематоз Вегенера, синдром Такаясу, синдром Кавасаки (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25; 112 (15-16):660), аутоиммунное заболевание, связанное с антителами к фактору VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26 (2): 157); некротизирующий васкулит малых сосудов, микроскопический полиангиит, синдром Черджа-Стросс, малоиммунный фокальный некротизирующий и серповидный гломерулонефрит (Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May; 151 (3):178), антифосфолипидный синдром (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14 (4):171), антитело-индуцированную сердечную недостаточность (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17;83 (12A):75H), тромбоцитопеническую пурпуру (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun; 14 (2):114; Semple JW. et al., Blood 1996 May 15;87 (10):4245), аутоиммунную гемолитическую анемию (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan; 28 (3-4):285; Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar; 74 (3):139), кардиальную аутоиммунную реакцию при болезни Чагаса (Cunha-Neto Е. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15;98 (8):1709) и обусловленную антителами к хелперным Т-лимфоцитам аутоиммунную реакцию (Caporossi АР. et al., Viral Immunol 1998;11 (1):9).

Примеры аутоиммунных ревматоидных заболеваний включают без ограничения ревматоидный артрит (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul; 15 (3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units S A 1994 Jan 18;91 (2):437) и анкилозирующий спондилит (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189).

Примеры аутоиммунных заболеваний желез включают без ограничения заболевание поджелудочной железы, сахарный диабет I типа, заболевание щитовидной железы, диффузный токсический зоб, тиреоидит, спонтанный аутоиммунный тиреоидит, тиреоидит Хашимото, идиопатическую микседему, аутоиммунные нарушения яичников, аутоиммунное бесплодие, связанное с антиспермальными антителами, аутоиммунный простатит и аутоиммунный полигландулярный синдром I типа. Заболевания включают без ограничения аутоиммунные заболевания поджелудочной железы, сахарный диабет 1 типа (Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct; 34 Suppl:S125), аутоиммунные заболевания щитовидной железы, диффузный токсический зоб (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun; 29 (2):339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92 (1):77), спонтанный аутоиммунный тиреоидит (Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol 2000 Dec 15;165 (12):7262), тиреоидит Хашимото (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug; 57 (8):1810), идиопатическую микседему (Mitsuma Т. Nippon Rinsho. 1999 Aug;57 (8):1759), аутоиммунные нарушения яичников (Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2):87), аутоиммунное бесплодие, связанное с антиспермальными антителами (Diekman АВ. et al., Am J Reprod Immunol.

2000 Mar; 43 (3):134), аутоиммунный простатит (Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec; 50 (6):893) и аутоиммунный полигландулярный синдром I типа (Нага Т. et al., Blood. 1991 Mar 1;77 (5):1127).

Примеры аутоиммунных заболеваний желудочно-кишечного тракта включают без ограничения хронические воспалительные кишечные заболевания (Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1):16), целиакию (Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16;138 (2):122), колит, илеит и болезнь Крона.

Примеры аутоиммунных кожных болезней включают без ограничения аутоиммунные буллезные заболевания кожи, такие как без ограничения обыкновенная пузырчатка, буллезный пемфигоид и листовидная пузырчатка.

Примеры аутоиммунных заболеваний печени включают без ограничения гепатит, аутоиммунный хронический активный гепатит (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar;54 (3):382), первичный билиарный цирроз (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov;91 (5):551; Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun;11 (6):595) и аутоиммунный гепатит (Manns MP. J Hepatol 2000 Aug;33 (2):326).

Примеры аутоиммунных неврологических заболеваний включают без ограничения рассеянный склероз (Cross АН. et al., J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112 (1-2):1), болезнь Альцгеймера (Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997;49:77), тяжелую миастению (Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999;18 (l-2):83; Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 Dec;20 (12):2563), невропатии, двигательные невропатии (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191); синдром Гийена-Барре и аутоиммунные невропатии (Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):234), миастению, миастенический синдром Ламберта-Итона (Takamori М. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):204); пар ане о пластические неврологические заболевания, атрофию мозжечка, паранеопластическую атрофию мозжечка и синдром мышечной скованности (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci units S A 2001 Mar 27;98 (7):3988); непаранеопластический синдром мышечной скованности, прогрессирующие атрофии мозжечка, энцефалит, энцефалит Расмуссена, боковой амиотрофический склероз, хорею Сиденгама, болезнь Туретта и аутоиммунные полиэндокринопатии (Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan;156 (1):23); дисиммунные невропатии (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419); приобретенную нейромиотонию, врожденный множественный артрогрипоз (Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482), неврит, неврит зрительного нерва (Soderstrom М. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May;57 (5):544) и нейродегенеративные заболевания.

Примеры аутоиммунных мышечных заболеваний включают без ограничения миозит, аутоиммунный миозит и первичный синдром Шегрена (Feist Е. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep; 123 (1):92) и гладко мышечное аутоиммунное заболевание (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun; 53 (5-6):234).

Примеры аутоиммунных заболеваний почек включают без ограничения нефрит и аутоиммунный интерстициальный нефрит (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug;1 (2):140).

Примеры аутоиммунных заболеваний, связанных с репродуктивной функцией, включают без ограничения повторяющуюся потерю плода (Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9).

Примеры аутоиммунных ревматических болезней включают без ограничения заболевания слуховой системы, аутоиммунные заболевания слуховой системы (Yoo TJ. et al., Cell Immunol 1994 Aug;157 (1):249) и аутоиммунные заболевания внутреннего уха (Gloddek В. et al., Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29;830:266).

Примеры аутоиммунных системных заболеваний включают без ограничения системную красную волчанку (Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17 (1-2):49) и системный склероз (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar;6 (2):156); Chan ОТ. et al., Immunol Rev 1999 Jun;169:107).

Инфекционные заболевания

Примеры инфекционных заболеваний включают без ограничения хронические инфекционные заболевания, подострые инфекционные заболевания, острые инфекционные заболевания, вирусные заболевания, бактериальные заболевания, протозойные заболевания, паразитарные заболевания, грибковые заболевания, заболевания, вызываемые микоплазмой, и прионные заболевания.

Конкретные типы вирусных патогенов, вызывающих инфекционные заболевания, поддающиеся лечению в соответствии с идеями настоящего изобретения, включают без ограничения ретровирусы, цирковирусы, парвовирусы, паповавирусы, аденовирусы, герпесвирусы, иридовирусы, поксвирусы, гепаднавирусы, пикорнавирусы, калицивирусы, тогавирусы, флавивирусы, реовирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы рабдовирусы, буниавирусы, коронавирусы, аренавирусы и филовирусы.

Конкретные примеры вирусных инфекций, которые можно лечить в соответствии с идеями настоящего изобретения, включают без ограничения таковые, вызванные вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), индуцирующим синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), грипп, риновирусную инфекцию, вирусный менингит, вызванную вирусом Эпштейна-Барр (EBV) инфекцию, вызванную вирусом гепатита А, В или С инфекцию, корь, вызванную вирусом папилломы инфекцию/бородавки, вызванную цитомегаловирусом (CMV) инфекцию, вызванную вирусом простого герпеса инфекцию, желтую лихорадку, вызванную вирусом Эбола инфекцию, бешенство, вызванную аденовирусом (Adv) инфекцию, вызванную риновирусами инфекцию, острую респираторную вирусную инфекцию, японский энцефалит, полиомиелит, вызванную респираторно-синцитиальным вирусом инфекцию, краснуху, натуральную оспу, ветряную оспу, ротавирусную инфекцию, вызванную вирусом лихорадки Западного Нила инфекцию и вызванную вирусом Зика инфекцию.

Конкретные примеры бактериальных инфекций, которые можно лечить в соответствии с идеями настоящего изобретения, включают без ограничения таковые, вызванные бактерией, вызывающей сибирскую язву; грамотрицательными бациллами, хламидиями, бактерией, вызывающей дифтерию, гемофильной палочкой, Helicobacter pylori, плазмодиями, вызывающими малярию, Mycobacterium tuberculosis, коклюшным токсином, пневмококком, риккетсиями, стафилококком, стрептококком и бактерией, вызывающей столбняк.

Конкретные примеры вызванных супербактериями инфекций (например, мультирезистентными бактериями), которые можно лечить в соответствии с идеями настоящего изобретения, включают без ограничения таковые, вызванные Enterococcus faecium, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacteriaceae (включая Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp.).

Конкретные примеры грибковых инфекций, которые можно лечить в соответствии с идеями настоящего изобретения, включают без ограничения таковые, вызванные представителями Candida, coccidiodes, cryptococcus, histoplasma, leishmania, plasmodium, простейшими, паразитическими организмами, шистосомами, вызывающими лишай организмами, токсоплазмой и trypanosoma cruzi.

Заболевания, связанные с отторжением трансплантата

В соответствии с другим вариантом осуществления заболевание ассоциировано с пересадкой трансплантата. Примеры заболеваний, ассоциированных с пересадкой трансплантата, включают без ограничения отторжение трансплантата, хроническое отторжение трансплантата, подострое отторжение трансплантата, сверхострое отторжение трансплантата, острое отторжение трансплантата, отторжение аллотрансплантата, отторжение ксенотрансплантата и реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD).

Аллергические заболевания

Примеры аллергических заболеваний включают без ограничения астму, крапивницу, аллергическую сыпь, поллиноз, аллергию на пылевых клещей, аллергию на яд насекомых, аллергию на косметические изделия, аллергию на латекс, аллергию на химические вещества, аллергию на лекарственные средства, аллергию на укусы насекомых, аллергию на перхоть животных, аллергию на жалящие растения, аллергию на токсикодендрон укореняющийся и пищевую аллергию.

Заболевание крови, не являющееся злокачественным

Примеры заболеваний крови, не являющихся злокачественными, включают без ограничения анемию, нарушения со стороны костного мозга, тромбоз глубоких вен/тромбоэмболию легочной артерии, врожденную гипопластическую анемию, гемохроматоз, гемофилию, иммуно-опосредованные нарушения со стороны кроветворной системы, нарушения метаболизма железа, серповидноклеточную анемию, талассемию, тромбоцитопению и болезнь Виллебранда.

С целью усиления активности Tcm-клеток в отношении заболевания преимущественным является выбор антигена или антигенов, ассоциированных с подлежащим лечению заболеванием, и получение антигенспецифических Tcm-клеток для лечения.

Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления способ предусматривает: (а) анализ биологического образца от субъекта на присутствие ассоциированных с заболеванием антигена или антигенов; (b) получение выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток в соответствии со способом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения, направленных на ассоциированные с заболеванием антиген или антигены, с целью обеспечения обогащения ее антигенреактивными клетками; и (с) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции не индуцирующих GvHD клеток из (b), за счет чего обеспечивается лечение заболевания у субъекта.

В контексте настоящего документа «биологический образец» относится к образцу жидкости или образцу ткани, происходящим от субъекта. Примеры «биологических образцов» включают без ограничения цельную кровь, сыворотку крови, плазму крови, спинномозговую жидкость, мочу, лимфатическую жидкость, биоптат ткани и различные продукты внешней секреции дыхательных, желудочно-кишечных и мочеполовых путей, слезы, слюну, молоко, а также лейкоциты, ткани, клеточную культуру, например, первичную культуру.

Способы получения таких биологических образцов известны в данной области, включая без ограничения стандартные процедуры забора крови, сбор мочи и люмбальную пункцию.

Определение наличия антигена или антигенов в биологическом образце можно осуществлять с применением любого известного в данной области способа, например, с помощью серологического исследования (исследования на предмет наличия патогена), бактериального исследования, определения чувствительности бактерий к антимикробным препаратам, тестов на определение грибов, вирусов, микобактерий (AFB-тестирование) и/или паразитических организмов, электрофореза, ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), вестерн-блот-анализа и сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).

После выполнения анализа выбирают антиген или антигены, и из популяции Т-клеток памяти получают Tcm-клетки, как обсуждалось выше, с применением антигена или антигенов, специфических для заболевания (например, опухолевых антигенов, вирусных антигенов, бактериальных антигенов и т.П.), и вводят их субъекту для лечения.

Как обсуждалось выше, Tcm-клетки по настоящему изобретению наделены вето-активностью. Соответственно, Tcm-клетки по настоящему изобретению можно применять в качестве адъювантной терапии для трансплантации клеток или тканей. Поскольку Tcm-клетки по настоящему изобретению также наделены активностью в отношении заболевания, способ по настоящему изобретению дополнительно можно успешно применять для лечения заболевания у субъекта при одновременном содействии приживлению трансплантата клеток или тканей.

В контексте настоящего документа фраза «трансплантация клеток или тканей» относится к целой клетке (например, отдельной клетке или группе клеток) или ткани (например, солидным тканям/паренхиматозным органам или мягким тканям, которые могут быть трансплантированы целиком или частично). Иллюстративные ткани или органы, которые могут быть трансплантированы в соответствии с идеями настоящего изобретения, включают без ограничения печень, поджелудочную железу, селезенку, почку, сердце, легкое, кожу, кишечник и лимфоидные/гемопоэтические ткани (например, лимфатический узел, пейеровы бляшки, тимус или костный мозг). Иллюстративные клетки, которые могут быть трансплантированы в соответствии с идеями настоящего изобретения, включают без ограничения незрелые гемопоэтические клетки, включая стволовые клетки, кардиомиоциты, клетки печени, клетки поджелудочной железы, клетки селезенки, клетки легкого, клетки головного мозга, клетки почки, клетки кишечника/кишок, клетки яичника, клетки кожи (например, выделенную популяцию любых этих клеток). Кроме того, настоящее изобретение также предусматривает трансплантацию целых органов, таких как, например, почка, сердце, печень или кожа.

В зависимости от применения, способ можно осуществлять с применением клетки или ткани, которые являются изогенными или не являются изогенными по отношению к субъекту.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения как субъект, так и донор являются людьми.

В зависимости от применения и доступных источников, клетки или ткани по настоящему изобретению могут быть получены от пренатального организма, постнатального организма, взрослого или трупного донора. Более того, в зависимости от применения, нужные клетки или ткани могут быть интактными или генетически модифицированными. Такие определения не выходят за рамки компетентности специалиста в данной области.

Для получения клетки или ткани (например, для трансплантации) можно использовать любой известный в данной области способ.

Пересадку клетки или ткани субъекту можно осуществлять множеством путей, в зависимости от различных параметров, таких как, например, тип клеток или тканей; тип, стадия или степень тяжести заболевания реципиента (например, функциональной недостаточности органа); физические или физиологические параметры, специфические для субъекта; и/или требуемый терапевтический исход.

Пересадку трансплантата клеток или тканей по настоящему изобретению можно осуществлять путем пересадки трансплантата клеток или тканей в любую из различных анатомических локализаций, в зависимости от применения. Трансплантат клеток или тканей может быть пересажен в гомотопическую анатомическую локализацию (нормальная анатомическая локализация для трансплантата) или в эктопическую анатомическую локализацию (нетипичная анатомическая локализация для трансплантата). В зависимости от применения, трансплантат клеток или тканей может быть успешно имплантирован под почечную капсулу или в почку, тестикулярный жир, подкожный слой, сальник, воротную вену, печень, селезенку, полость сердца, сердце, грудную полость, легкое, кожу, поджелудочную железу и/или внутрибрюшинное пространство.

Например, ткань печени в соответствии с идеями настоящего изобретения может быть трансплантирована в печень, воротную вену, почечную капсулу, подкожный слой, сальник, селезенку и внутрибрюшинное пространство. Трансплантация печени в различные анатомические локализации, такие как указанные, широко практикуется в данной области для лечения заболеваний, поддающихся лечению посредством трансплантации печени (например, при печеночной недостаточности). Аналогичным образом, пересадка ткани поджелудочной железы в соответствии с настоящим изобретением может быть успешно осуществлена путем пересадки ткани в воротную вену, печень, поджелудочную железу, тестикулярный жир, подкожный слой, сальник, кишечную петлю (подсерозный слой U-петли тонкого кишечника) и/или внутри брюшинное пространство. Трансплантацию ткани поджелудочной железы можно применять для лечения заболеваний, поддающихся лечению посредством трансплантации поджелудочной железы (например, при сахарном диабете). Подобным образом, трансплантацию тканей, таких как ткань почки, сердца, легкого или кожи, можно осуществлять в любой описанной выше анатомической локализации в целях лечения реципиентов, страдающих, например, от почечной недостаточности, сердечной недостаточности, легочной недостаточности или повреждения кожи (например, ожогов). В случаях, в которых трансплантируют выделенные клетки, такие клетки можно вводить, например, внутривенным путем, интратрахеальным путем, внутрибрюшинным путем или интраназальным путем.

Способ по настоящему изобретению также можно применять, например, для лечения реципиента, страдающего от заболевания, при котором требуется трансплантация незрелых гемопоэтических клеток.

В последнем случае незрелые аутологичные, аллогенные или ксеногенные гемопоэтические клетки (включая стволовые клетки), которые могут происходить, например, из костного мозга, мобилизированной периферической крови (например, путем лейкафереза), эмбриональной печени, желточного мешка и/или пуповинной крови донора, могут быть трансплантированы реципиенту, страдающему от заболевания. В соответствии с одним вариантом осуществления незрелые гемопоэтические клетки представляют собой истощенные в отношении CD34+ Т-клеток незрелые гемопоэтические клетки. Такое заболевание включает без ограничения лейкоз [например, острый лимфоцитарный, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый лимфобластный лейкоз из предшественников В-клеток, острый лимфобластный Т-клеточный лейкоз, острый мегакариобластный, моноцитарный, острый миелогенный, острый миелоидный, острый миелоидный с эозинофилией, В-клеточный, базофильный, хронический миелоидный, хронический, В-клеточный, эозинофильный лейкоз, лейкоз Фрейда, гранулоцитарный или миелоцитарный, острый миелоцитарный лейкоз (AML) или хронический миелоцитарный лейкоз (CML), волосатоклеточный, лимфоцитарный, мегакариобластный, моноцитарный, моноцитарно-макрофагальный, миелобластный, миелоидный, миеломоноцитарный, плазмоклеточный лейкоз, лейкоз из предшественников В-клеток, промиелоцитарный, подострый, Т-клеточный, опухоль лимфоидной ткани, предрасположенность к злокачественному новообразованию миелоидной ткани, острый не лимф оцитарный лейкоз, острый нелимфобластный лейкоз (ANLL), Т-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (T-ALL) и В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (B-CLL)], лимфому (например, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, В-клеточную лимфому, лимфому Беркитта, кожную Т-клеточную, гистиоцитарную, лимф областную, Т-клеточную, тимическую лимфому), формы синдрома тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID), включая недостаточность аденозиндезаминазы (ADA), мраморную болезнь, апластическую анемию, болезнь Гоше, талассемии и другие наследственные или генетически обусловленные нарушения системы кроветворения.

Понятно, что незрелые аутологичные, аллогенные или ксеногенные гемопоэтические клетки по настоящему изобретению могут быть трансплантированы реципиенту с применением любого известного в данной области способа трансплантации клеток, такого как без ограничения инфузия клеток (например, I.V.) или внутри брюшинным путем.

Необязательно, при пересадке трансплантата клеток или тканей по настоящему изобретению субъекту с поврежденным органом преимущественным может быть проведение сперва по меньшей мере частичного удаления у субъекта органа с нарушенной функцией для обеспечения оптимального развития трансплантата и его структурной/функциональной интеграции с анатомией/физиологией субъекта.

В соответствии с одним вариантом осуществления трансплантат клеток или тканей происходит от аллогенного донора. В соответствии с одним вариантом осуществления трансплантат клеток или тканей происходит от HLA-идентично го аллогенного донора или от не являющегося HLA-идентичным аллогенного донора. В соответствии с одним вариантом осуществления трансплантат клеток или тканей происходит от ксеногенного донора.

В соответствии с одним вариантом осуществления трансплантат клеток или тканей и выделенная популяция Tcm-клеток происходят от одного и того же (например, не являющегося изогенным) донора.

В соответствии с одним вариантом осуществления трансплантат клеток или тканей и выделенная популяция Tcm-клеток происходят от разных (например, не являющихся изогенными) доноров. Соответственно, трансплантат клеток или тканей может не быть изогенным по отношению к Tcm-клеткам.

В соответствии с одним вариантом осуществления незрелые гемопоэтические клетки и выделенная популяция Tcm-клеток происходят от одного и того же (например, не являющегося изогенным) донора.

В соответствии с одним вариантом осуществления незрелые гемопоэтические клетки и выделенная популяция Tcm-клеток происходят от разных (например, не являющихся изогенными) доноров. Соответственно, незрелые гемопоэтические клетки могут не быть изогенными по отношению к Tcm-клеткам.

Способ по настоящему изобретению также предусматривает котрансплантацию нескольких органов (например, тканей сердца и легкого) в случае, если такая процедура может оказать благоприятное воздействие на субъекта.

В соответствии с одним вариантом осуществления котрансплантация предусматривает трансплантацию незрелых гемопоэтических клеток и солидной ткани/паренхиматозного органа или некоторого числа солидных тканей/паренхиматозных органов.

В соответствии с одним вариантом осуществления незрелые гемопоэтические клетки и паренхиматозный орган получены от одного и того же донора.

В соответствии с другим вариантом осуществления незрелые гемопоэтические клетки и паренхиматозный орган/солидная ткань или органы/ткань получены от разных (например, не являющихся изогенными) доноров.

В соответствии с одним вариантом осуществления незрелые гемопоэтические клетки трансплантируют до трансплантации паренхиматозного органа, одновременно с ней или после нее.

В соответствии с одним вариантом осуществления гемопоэтический химеризм в первую очередь индуцируют у субъекта путем трансплантации незрелых гемопоэтических клеток в сочетании с Tcm-клетками по настоящему изобретению, что приводит к толерантности других тканей/органов, трансплантированных от одного и того же донора.

В соответствии с одним вариантом осуществления Tcm-клетки по настоящему изобретению применяют per se для снижения отторжения трансплантированных тканей/органов, трансплантированных от одного и того же донора.

После пересадки трансплантата клеток или тканей субъекту в соответствии с идеями настоящего изобретения рекомендуется, в соответствии со стандартной медицинской практикой, отслеживать рост функциональных характеристик и иммуносовместимость органа в соответствии с любой из ряда стандартных в данной области методик. Например, функциональные характеристики трансплантата ткани поджелудочной железы можно отслеживать после трансплантации с помощью стандартных функциональных исследований поджелудочной железы (например, анализа уровней инсулина в сыворотке крови). Подобным образом, характеристики трансплантата ткани печени можно отслеживать после трансплантации с помощью стандартных функциональных исследований печени (например, анализа уровней альбумина, общего белка, ALT, AST и билирубина в сыворотке крови и анализа с определением времени свертывания крови). Структурное развитие клеток или тканей можно отслеживать посредством компьютерной томографии или ультразвуковой визуализации.

В зависимости от контекста трансплантации с целью содействия приживлению трансплантата клеток или тканей способ дополнительно может преимущественно предусматривать кондиционирование субъекта в сублетальных, летальных или сверхлетальных условиях перед пересадкой.

В контексте настоящего документа термины «сублетальный», «летальный» и «сверхлетальный» в отношении кондиционирования субъектов по настоящему изобретению относятся к миелотоксическим и/или лимфоцитотоксическим типам лечения, которые, при применении в отношении репрезентативной популяции субъектов, соответственно, обычно: нелетальны в основном для всех членов популяции; летальны для некоторых, но не всех членов популяции; или летальны в основном для всех членов популяции в нормальных условиях стерильности.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения кондиционирование в сублетальных, летальных или сверхлетальных условиях предусматривает тотальное облучение организма (TBI), тотальное облучение лимфоидной ткани (TLI, т.е. воздействие на все лимфатические узлы, тимус и селезенку), частичное облучение организма (например, специфическое воздействие на легкие, почку, головной мозг и т.п.), миелоаблативное кондиционирование и/или немиелоаблативное кондиционирование, например, с использованием разных комбинаций, включая без ограничения блокаду костимуляции, химиотерапевтическое средство и/или иммунотерапию антителами. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения кондиционирование предусматривает комбинацию любых вышеописанных протоколов кондиционирования (например, химиотерапевтическое средство и TBI, блокада костимуляции и химиотерапевтическое средство, иммунотерапия антителами и химиотерапевтическое средство и т.п.).

В соответствии с одним вариантом осуществления TBI предусматривает единую или разделенную дозу облучения в пределах диапазона 0,5-1 Гр, 0,5-1,5 Гр, 0,5-2,5 Гр, 0,5-5 Гр, 0,5-7,5 Гр, 0,5-10 Гр, 0,5-15 Гр, 1-1,5 Гр, 1-2 Гр, 1-2,5 Гр, 1-3 Гр, 1-3,5 Гр, 1-4 Гр, 1-4,5 Гр, 1-1,5 Гр, 1-7,5 Гр, 1-10 Гр, 2-3 Гр, 2-4 Гр, 2-5 Гр, 2-6 Гр, 2-7 Гр, 2-8 Гр, 2-9 Гр, 2-10 Гр, 3-4 Гр, 3-5 Гр, 3-6 Гр, 3-7 Гр, 3-8 Гр, 3-9 Гр, 3-10 Гр, 4-5 Гр, 4-6 Гр, 4-7 Гр, 4-8 Гр, 4-9 Гр, 4-10 Гр, 5-6 Гр, 5-7 Гр, 5-8 Гр, 5-9 Гр, 5-10 Гр, 6-7 Гр, 6-8 Гр, 6-9 Гр, 6-10 Гр, 7-8 Гр, 7-9 Гр, 7-10 Гр, 8-9 Гр, 8-10 Гр, 10-12 Гр или 10-15 Гр.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления TBI предусматривает единую или разделенную дозу облучения в пределах диапазона 1-7,5 Гр.

В соответствии с одним вариантом осуществления кондиционирование осуществляют путем кондиционирования субъекта в сверхлетальных условиях, таких как миелоаблативные условия.

В качестве альтернативы, кондиционирование можно осуществлять путем кондиционирования субъекта в летальных или сублетальных условиях, как, например, путем кондиционирования субъекта в миелоредукционных условиях или немиелоаблативных условиях.

В соответствии с одним вариантом осуществления кондиционирование осуществляют путем кондиционирования субъекта с использованием миелоаблативного лекарственного средства (например, бусульфана или мелфалана) или немиелоаблативного лекарственного средства (например, циклофосфамида и/или флударабина).

Примеры средств кондиционирования, которые можно применять для кондиционирования субъекта, включают без ограничения облучение, лекарственные средства и индуцирующие толерантность клетки (как описано в настоящем документе).

Примеры лекарственных средств включают миелотоксические лекарственные средства, лимфоцитотоксические лекарственные средства и иммунодепрессанты (подробно обсуждаются ниже).

Примеры миелотоксических лекарственных средств включают без ограничения бусульфан, диметилмилеран, мелфалан и тиотепу.

Кроме того, или в качестве альтернативы, способ дополнительно может предусматривать кондиционирование субъекта с использованием схемы иммуносупрессии до пересадки трансплантата клеток или тканей, одновременно с ней или после нее.

Примеры подходящих типов схем иммуносупрессии включают введение иммуносупре с сорных лекарственных средств, популяций индуцирующих толерантность клеток (например, Tcm-клеток, как подробно описано в данном документе выше) и/или применение иммуносупрессорного облучения.

Детальные руководства по выбору и применению подходящих схем иммуносупрессии для трансплантации представлены в литературе из уровня техники (см., например: Kirkpatrick СН. and Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. et al., 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. and Strom ТВ., 1996. New Engl. J. Med. 331, 365; Midthun DE. et al., 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. et al., 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. et al., 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. et al., 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. et al. 1998. Lancet 351, 623).

Предпочтительно схема иммуносупрессии состоит из введения по меньшей мере одного иммунодепрессанта субъекту.

Примеры иммуносупрессорных средств включают без ограничения такролимус (также называемый FK-506 или фуджимицином, торговые названия: Prograf, Advagraf, Protopic), микофенолата мофетил, микофенолат натрия, преднизон, метотрексат, циклофосфамид, циклоспорин, циклоспорин А, хлорохин, гидроксихлорохин, сульфасалазин (сульфасалазопирин), золото-хлористоводородный натрий, D-пеницилламин, лефлуномид, азатиоприн, анакинру, инфликсимаб (REMICADE), этанерцепт, блокаторы TNF-альфа, биологическое средство, нацеленное на воспалительный цитокин, и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID). Примеры NSAID включают без ограничения ацетилсалициловую кислоту, холин-магний салицилат, дифлунисал, салицилат магния, салсалат, салицилат натрия, диклофенак, этодолак, фенопрофен, флурбипрофен, индометацин, кетопрофен, кеторолак, меклофенамат, напроксен, набуметон, фенилбутазон, пироксикам, сулиндак, толметин, ацетаминофен, ибупрофен, ингибиторы Сох-2, трамадол, рапамицин (сиролимус) и аналоги рапамицина (такие как CCI-779, RAD001, АР23573). Эти средства можно вводить отдельно или в комбинации.

Независимо от типа трансплантации, во избежание отторжения трансплантата и реакции «трансплантат против хозяина» в способе по настоящему изобретению используются новые Tcm-клетки (как подробно описано в данном документе выше).

В соответствии со способом по настоящему изобретению такие Tcm-клетки вводят одновременно с пересадкой трансплантата клеток или тканей, до нее или после нее.

Tcm-клетки можно вводить посредством любого известного в данной области способа трансплантации клеток, такого как без ограничения инфузия клеток (например, внутривенно) или внутрибрюшинным путем.

Tcm-клетки согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения можно вводить в организм per se или в виде фармацевтической композиции, где они смешаны с подходящими носителями или инертными наполнителями.

В контексте настоящего документа «фармацевтическая композиция» относится к препарату одного или нескольких описанных в настоящем документе активных ингредиентов с другими химическими компонентами, такими как физиологически подходящие носители и инертные наполнители. Целью фармацевтической композиции является облегчение введения соединения в организм.

В настоящем документе термин «активный ингредиент» относится к Tcm-клеткам, ответственным за биологический эффект.

Далее в настоящем документе фразы «физиологически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемый носитель», которые можно применять взаимозаменяемо, относятся к носителю или разбавителю, который не вызывает значительное раздражение в организме и не нейтрализует биологическую активность и свойства вводимого соединения. Адъювант подразумевается под этими фразами.

В настоящем документе термин «инертный наполнитель» относится к инертному веществу, добавляемому в фармацевтическую композицию для дополнительного облегчения введения активного ингредиента. Примеры инертных наполнителей включают без ограничения карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.

Методики составления и введения лекарственных средств можно найти в "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Истон, Пенсильвания, последнее издание, которое включено в настоящий документ посредством ссылки.

Подходящие пути введения могут включать, например, пероральную, ректальную, трансмукозальную, особенно транс назальную, кишечную или парентеральную доставку, включая внутримышечные, подкожные и интрамедуллярные инъекции, а также интратекальные, прямые интравентрикулярные, интракардиальные, например, в полость правого или левого желудочка, в общую коронарную артерию, внутривенные, внутри брюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции.

Традиционные подходы доставки лекарственных средств в центральную нервную систему (ЦНС) включают: нейрохирургические стратегии (например, интрацеребральная инъекция или интрацеребровентрикулярная инфузия); манипуляции с молекулой средства (например, получение химерного слитого белка, который содержит транспортный пептид, который обладает аффинностью к молекуле клеточной поверхности эндотелиальной клетки, в комбинации со средством, которое само по себе неспособно проходить через ГЭБ) с целью использования одного из эндогенных транспортных путей ГЭБ; фармакологические стратегии, разработанные для повышения растворимости липидов средства (например, конъюгация водорастворимых средств с липидом или переносчиками холестерина); и временное нарушение целостности ГЭБ путем гиперосмотического разрушения (в результате инфузии раствора маннита в сонную артерию или применения биологически активного средства, такого как пептид ангиотензин). Однако каждая из этих стратегий имеет ограничения, такие как неотъемлемые риски, ассоциированные с инвазивной хирургической процедурой, ограничение по размеру, налагаемое ограничением, присущим эндогенным транспортным системам, потенциальные нежелательные биологические побочные эффекты, ассоциированные с системным введением химерной молекулы, состоящей из мотива-носителя, который может быть активным вне ЦНС, и возможный риск повреждения головного мозга в пределах участков головного мозга, где происходит нарушение ГЭБ, что делает его неоптимальным способом доставки.

В качестве альтернативы, фармацевтическую композицию можно вводить локально, а не системно, например, посредством инъекции фармацевтической композиции прямо в участок ткани пациент.

Фармацевтические композиции согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть изготовлены с помощью хорошо известных в данной области способов, например, посредством традиционного смешивания, растворения, гранулирования, дражирования, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, заключения в оболочку или процессов лиофилизации.

Фармацевтические композиции для применения в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, таким образом, могут быть составлены традиционным образом с применением одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включающих инертные наполнители и вспомогательные вещества, которые облегчают изготовление из активных ингредиентов препаратов, которые можно применять фармацевтически. Надлежащий состав зависит от выбранного пути введения.

Для инъекции активные ингредиенты фармацевтической композиции могут быть составлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Ханка, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для трансмукозального введения в составе применяют обеспечивающие проникновение вещества, соответствующие барьеру, для которого будет обеспечиваться проницаемость. Такие обеспечивающие проникновение вещества в целом известны в данной области.

Для перорального введения фармацевтическая композиция может быть без труда составлена путем объединения активных соединений с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области. Такие носители позволяют составлять фармацевтическую композицию в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, растворов, гелей, сиропов, паст, суспензий, и т.д. для перорального приема пациентом. Фармакологические препараты для перорального применения можно получать с применением твердого инертного наполнителя, необязательно путем измельчения полученной в результате смеси и обработки смеси гранул после добавления подходящих вспомогательных веществ, при необходимости, с получением таблеток или сердцевин драже. Подходящими инертными наполнителями являются, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; целлюлозные препараты, такие как, например, маисовый крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропил метил целлюлоза, натрий-карбоксиметилцеллюлоза; и/или физиологически приемлемые полимеры, такие как поливинилпирролидон (PVP). При необходимости, можно добавлять средства для улучшения распадаемости таблеток, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.

Сердцевины драже покрывают подходящими оболочками. С этой целью можно применять концентрированные растворы сахара, которые необязательно могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, карбополовый гель, полиэтилен гликоль, диоксид титана, растворы для лаковых оболочек и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В таблетки или оболочки для драже с целью идентификации или определения характеристик разных комбинаций доз активного соединения можно добавлять красители или пигменты.

Фармацевтические композиции, которые можно применять перорально, включают твердые капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие запаянные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Твердые капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связывающими веществами, такими как виды крахмала, смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные ингредиенты могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, вазелиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, можно добавлять стабилизаторы. Все составы для перорального введения должны быть в дозах, подходящих для выбранного пути введения.

Для буккального введения композиции могут иметь форму таблеток или пастилок, составленных традиционным образом.

Для введения путем назальной ингаляции активные ингредиенты для применения в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения в целях удобства доставляются в форме подачи распыляемого аэрозоля из упаковки под давлением или небулайзера с применением подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана или углекислого газа. В случае аэрозоля под давлением, единица дозирования может быть определена путем обеспечения клапана для доставки отмеренного количества. Капсулы и картриджи, например, из желатина, для применения в дозаторе могут быть составлены с содержанием порошковой смеси соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.

Описанная в настоящем документе фармацевтическая композиция может быть составлена для парентерального введения, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекции могут быть представлены в единичной лекарственной форме, например, в ампулах или многодозовых контейнерах, необязательно с добавленным консерванта. Композиции могут представлять собой суспензии, растворы или эмульсии в маслянистых или водных средах-носителях, и могут содержать вспомогательные средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активного препарата в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных ингредиентов могут быть получены в виде соответствующих инъекционных суспензий на масляной или водной основе. Подходящие липофильные растворители или среды-носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как карбоксиметил целлюлоза натрия, сорбит или декстран. Необязательно суспензия также может содержать подходящие стабилизаторы или средства, которые повышают растворимость активных ингредиентов, для обеспечения возможности получения высоко концентрированных растворов.

В качестве альтернативы, активный ингредиент может находиться в форме порошка для составления перед применением с подходящей средой-носителем, например, стерильным раствором на основе не содержащей пирогенов воды.

Фармацевтическая композиция согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения также может быть составлена в виде ректальных композиций, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, с применением, например, традиционных основ для суппозиториев, таких как кокосовое масло или другие глицериды.

Фармацевтические композиции, подходящие для применения в контексте некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения, включают композиции, где активные ингредиенты находятся в количестве, эффективном для достижения предполагаемой цели. Более конкретно, терапевтически эффективное количество означает количество активных ингредиентов (Tcm-клеток), эффективное для предупреждения, ослабления или облегчения симптомов нарушения (например, злокачественного заболевания или заболевания, не являющегося злокачественным) или продления выживания подлежащего лечению субъекта.

Определение терапевтически эффективного количества не выходит за рамки компетентности специалистов в данной области, особенно в свете подробно раскрытия, приведенного в настоящем документе.

Для любого применяемого в способах по настоящему изобретению препарата терапевтически эффективное количество или доза могут быть первоначально установлены с помощью анализов in vitro и анализов на клеточных культурах. Например, необходимая для достижения требуемой концентрации или титра доза может быть определена в животных моделях. Такую информацию можно применять для более точного определения пригодных доз у людей.

Токсичность и терапевтическую эффективность описанных в настоящем документе активных ингредиентов можно определять с помощью стандартных фармацевтических процедур in vitro, в клеточных культурах или с использованием экспериментальных животных. Данные, полученные на основе таких анализов in vitro и анализов на клеточных культурах и исследований на животных, можно применять при составлении дозировки для применения у человека. Дозировка может варьироваться в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Точный состав, путь введения и дозировка могут быть выбраны лечащим врачом с учетом состояния пациента. (См., например, Fingl, et al., 1975, в "The Pharmacological Basis of Therapeutics", глава 1, стр. 1).

Величина дозировки и интервал между приемами могут корректироваться индивидуально для обеспечения достаточных уровней активного ингредиента, которые являются достаточными для индукции или подавления биологического эффекта (минимальная эффективная концентрация, МЕС). МЕС будет варьироваться для каждого препарата, но может быть определена на основе данных in vitro. Дозировки, необходимые для достижения МЕС, будут зависеть от индивидуальных характеристик и пути введения. Для определения концентраций в плазме крови можно применять анализы выявления.

В зависимости от тяжести и отвечаемости подлежащего лечению состояния дозирование может также относится к однократным или многократным введениям, при этом курс лечения длится от нескольких дней до нескольких недель или до тех пор, пока не будет достигнуто излечение или облегчение течения заболевания.

В зависимости от тяжести и отвечаемости подлежащего лечению состояния дозирование может также относится к однократным или многократным введениям, при этом курс лечения длится от нескольких дней до нескольких недель или до тех пор, пока не будет достигнуто излечение или облегчение течения заболевания.

Количество вводимой композиции будет зависеть, как уже упоминалось, от подлежащего лечению субъекта, тяжести болезни, способа введения, мнения лечащего врача и т.п.

Композиции согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения при необходимости могут быть представлены в упаковке или устройстве с дозатором, как, например, в одобренном FDA наборе, который может содержать одну или несколько единичных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может предусматривать, например, металлическую фольгу или пластмассовую пленку, как, например, в случае блистерной упаковки. К упаковке или устройству с дозатором могут прилагаться инструкции по применению. Упаковка или дозатор могут быть обеспечены сведениями, ассоциированными с контейнером, в форме, предписанной государственный органом, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических препаратов, причем эти сведения отражают одобрение органом формы композиций или применения у человека или в ветеринарии. Такие сведения, например, могут находиться в форме информации о препарате, одобренной Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США для отпускаемых по рецепту лекарственных средств, или в форме одобренного листка-вкладыша. Составленные в совместимом фармацевтическом носителе композиции, содержащие препарат по настоящему изобретению, также могут быть получены, помещены в соответствующий контейнер и обеспечены информацией о препарате для лечения указанного состояния, как более подробно описано выше.

В контексте настоящего документа термин «приблизительно» относится к ± 10%.

Термины «предусматривает», «предусматривающий», «обладающий», «включает», «включая», «имеющий» и их родственные по корню и значению слова означают «включая без ограничения».

Термин «состоящий из» означает «включая и ограничиваясь».

Термин «состоящий главным образом из» означает, что композиция, способ или структура могут включать дополнительные ингредиенты, стадии и/или части, но только если дополнительные ингредиенты, стадии и/или части существенно не изменяют основные и новые характеристики заявленных композиции, способа или структуры.

В контексте настоящего документа формы единственного числа включают их множественное число, если контекстом явно не указано иное. Например, термин «соединение» или «по меньшей мере одно соединение» может включать множество соединений, включая их смеси.

По всему тексту заявки различные варианты осуществления настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона предназначено лишь для удобства и краткости и не должно истолковываться как негибкое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретно раскрывающее все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах диапазона. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, следует рассматривать как конкретно раскрывающее поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.п., а также отдельные числа в пределах такого диапазона, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Этот принцип применим независимо от ширины диапазона.

Какой бы числовой диапазон не был указан в настоящем документе, подразумевается, что он включает любое упоминаемое число (дробное или целое) в пределах указанного диапазона. Фразы «находящийся в диапазоне между/находится в диапазоне между» первым указанным числом и вторым указанным числом и «находящийся в диапазоне от/находится в диапазоне от» первого указанного числа «до» второго указанного числа в настоящем документе применяют взаимозаменяемо, и подразумевается, что они включают первое и второе указанные числа и все дробные и целые числа между ними.

В контексте настоящего документа термин «способ» относится к методам, средствам, методикам и процедурам осуществления данной задачи, включая без ограничения такие методы, средства, методики и процедуры, которые являются известными, или которые являются легко разработанными на основе известных методов, средств, методик и процедур практикующими специалистами в области химии, фармакологии, биологи, биохимии и медицины.

Понятно, что определенные признаки настоящего изобретения, которые, для ясности, описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, могут также предусматриваться в комбинации в рамках одного варианта осуществления. Наоборот, различные признаки настоящего изобретения, которые, для краткости, описаны в контексте одного варианта осуществления, могут также предусматриваться отдельно или в любой подходящей подкомбинации или как подходящие в любом другом описанном варианте осуществления настоящего изобретения. Определенные признаки, описанные в контексте различных вариантов осуществления, не должны рассматриваться как основные признаки таких вариантов осуществления, если вариант осуществления является нереализуемым без таких элементов.

Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, как описано в данном документе выше и как заявлено в разделе «Формула изобретения» ниже, находят экспериментальное подтверждение в следующих примерах.

Примеры

Ниже приведены следующие примеры, которые вместе с вышеприведенными описаниями иллюстрируют настоящее изобретение неограничивающим образом.

В общем случае терминология, применяемая в настоящем документе, и лабораторные процедуры, используемые в настоящем изобретении, предусматривают молекулярные, биохимические, микробиологические методики и методики рекомбинантных ДНК. Такие методики подробно описаны в литературе. См., например, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Балтимор, Мэриленд (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Нью-Йорк (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Нью-Йорк; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Нью-Йорк (1998); методологии, изложенные в патентах США №№4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8-е издание), Appleton & Lange, Норуолк, Коннектикут (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., Нью-Йорк (1980); доступные иммунологические анализы подробно описаны в патентах и научной литературе, см., например, патенты США №№3791932; 3839153; 3850752; 3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; 4098876; 4879219; 5011771 и 5281521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, М.J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B.D., and Higgins S.J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, В., (1984) и "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, Сан-Диего, Калифорния (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); все из которых включены посредством ссылки, как если бы они были полностью изложены в настоящем документе. Другие общие ссылки приведены в тексте настоящего документа. Предполагается, что процедуры в них хорошо известны в данной области и приводятся для удобства читателя. Вся содержащаяся в них информация включена в настоящий документ посредством ссылки.

Общие материалы и процедуры экспериментов

Животные

Самки мышей BALB/c, FVB, C57BL/6 и BALB/c-NUDE возрастом 6-12 недель были получены от Harlan Laboratories. Конгенные мыши B6.SJL, C57BL/6-Tg(CAG-OVA)916Jen/J (мыши, у которых экспрессируется OVA) и мыши ОТ1 (у которых экспрессируется трансгенный (Tg) TCR, сконструированный для распознавания остатков 257-264 альбумина куриного яйца (OVA) в контексте H2Kb MHC-I) и OT1/Rag-/CD45.1 были выведены в центре выведения лабораторных животных института Вейцмана (Weizmann Institute Animal Center). Всех мышей содержали в небольших клетках (5 животных в каждой клетке) и кормили стерильной пищей и поили подкисленной водой. Эти исследования были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Института Вейцмана (The Weizmann Institute of Science Institutional Animal Care and Use Committee).

Получение вето-клеток из I-клеток памяти мыши

Использовали мышей ОТ1, у которых экспрессируется трансгенный (Tg) TCR, сконструированный для распознавания остатков 257-264 альбумина куриного яйца в контексте H2Kb MHC-I. Эти мыши выступали в качестве доноров вето-Tcm-клеток. Перед сбором этих CD8 Т-клеток ОТ1, мышей иммунизировали OVA-пептидом, смешанным с полным адъювантом Фрейнда (CFA), и проводили вторичную иммунизацию спустя 14 дней после первичной стимуляции с применением OVA-пептида + неполный адъювант Фрейнда (IFA). Спустя семь-четырнадцать дней после иммунизации мышей умерщвляли, удаляли и измельчали их селезенки и лимфатические узлы, и использовали сортировку клеток с магнитными гранулами для выделения клеток памяти (CD8⁺CD44⁺) из общего пула CD8⁺ клеток. Полученную в результате популяцию подвергали «сторонней» стимуляции путем совместного культивирования с облученными спленоцитами, полученными из селезенок мыши, у которых экспрессируется OVA, в условиях недостаточности цитокинов. Спустя шесть часов после начала совместного культивирования в культуру добавляли hIL-15 (10 нг/мл) с целью стимуляции клеток к экспрессии Tcm-подобного фенотипа, как описано ниже для Tcm дикого типа (WT), т.е. ранее описанных вето-Tcm-клеток, которые получали из целой селезенки или мононуклеарных клеток периферической крови, как было подтверждено ранее [Ophir, E. (2013), выше]).

Получение дендритных клеток человека, нагруженных вирусным пептидом

Дендритные клетки (DC) человека, нагруженные вирусным пептидом, получали как проиллюстрировано на фиг. 4В. Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) донора высевали в культуральную чашку и инкубировали в течение 3 часов при 37°С при 5% СО₂/О₂. Супернатант клеток (содержащий Т-клетки) выбрасывали, и прикрепившиеся клетки дополнительно инкубировали в течение 72 часов с добавлением цитокинов IL-4 и GM-CSF (в тех же условиях культивирования). Три дня спустя неприкрепившиеся клетки собирали (незрелые дендритные клетки), высевали и инкубировали в течение ночи с последующим добавлением цитокинов INF-γ, IL-4, GM-CSF и LPS для созревания DC. В день 4 прикрепившиеся клетки (зрелые DC, т.е. mDC) открепляли, нагружали коктейлем вирусных пептидов и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Коктейль вирусных пептидов предусматривает 7 пептидных смесей EBV, CMV и аденовируса (Adv). Пептидные смеси представляют собой 15-меры, перекрывающиеся по 11 аминокислотам полной белковой последовательности представляющего интерес антигена, приобретенные у JPT Technologies (Берлин, Германия). Применяли пептидные смеси, охватывающие EBV (LMP2, BZLF1, EBNA1), Adv-(пентон, гексон) и CMV-(pp65, IE-1). Затем mDC человека, нагруженные вирусным пептидом, облучали 30 Гр и добавляли к фракции Т-клеток, как обсуждается ниже.

Получение Tcm-клеток человека, реактивных в отношении стороннего антигена, с применением вирусных пептидов

Вето-клетки человека, реактивные в отношении стороннего антигена, получали путем первого истощения мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных от донора клеток, в отношении CD4⁺ и CD56⁺ клеток (с применением магнитной сортировки клеток с применением магнитных гранул, полученных от Milteni Biotec.

Остальную часть популяции клеток культивировали совместно с облученными (30 Гр) дендритными клетками (от того же донора клеток), где дендритные клетки были стимулированы к экспрессии стороннего антигена (например, коктейля вирусных антигенов, включающего EBV, CMV и аденовирус). На первые 3 дня культивирования клетки дополняли только IL-21, затем начиная с дня +3 и до дня +9 в культуру добавляли IL-21, IL-15 hIL-7.

Получение вето-Tcm-клеток человека из I-клеток памяти с применением вирусных пептидов

Вето-клетки получали из клеток памяти человека путем первого истощения мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных от донора клеток, в отношении CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺ клеток (с применением магнитной сортировки клеток с применением магнитных гранул, полученных от Milteni Biotec). Остальная часть популяции клеток содержала CD8⁺CD45RO⁺ Т-клетки памяти. Затем, CD8⁺CD45RO⁺ Т-клетки памяти культивировали совместно с облученными (30 Гр) дендритными клетками (от того же донора клеток), где дендритные клетки были стимулированы к экспрессии антигена (например, коктейля вирусных антигенов, включающего EBV, CMV и аденовирус). На первые 3 дня культивирования клетки дополняли только IL-21, затем начиная с дня +3 и до дня +9 в культуру добавляли IL-21, IL-15 и IL-7.

Получение вето-Tcm-клеток человека из I-клеток памяти с применением опухолевых пептидов

Вето-клетки получали из клеток памяти человека путем первой иммунизации донора клеток опухолевым пептидом (например, BCR-ABL, ELA2, О250/карбоангидразой IX, НА-1, НА-2, hTERT, MAGE-1, MUC1, NY-ESO-1, PRAME, PR1, PRTN3, RHAMM и WT-1 или их комбинациями, как обсуждается в Molldrem J. Biology of Blood and Marrow Transplantation (2006) 12:13-18; Alatrash G. and Molldrem J., Expert Rev Hematol. (2011) 4(1): 37-50) с полным адъювантом Фрейнда (CFA) и проводили вторичную иммунизацию спустя 14 дней после первичной стимуляции с применением опухолевого пептида + неполный адъювант Фрейнда (IFA). Затем, получали мононукле арные клетки периферической крови (РВМС) и истощали их в отношении CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺ клеток (с применением магнитной сортировки клеток с применением магнитных гранул, полученных от Milteni Biotec). Остальная часть популяции клеток содержала CD8⁺CD45RO⁺ Т-клетки памяти. Затем, CD8⁺CD45RO⁺ Т-клетки памяти культивировали совместно с облученными (30 Гр) дендритными клетками (от того же донора клеток), где дендритные клетки были стимулированы к экспрессии опухолевого антигена. На первые 3 дня культивирования клетки дополняли только IL-21, а затем начиная с дня +3 и до дня +9 в культуру добавляли IL-21, IL-15 и IL-7.

Анализ с использованием проточной цитометрии

Анализ с использованием сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) осуществляли с применением Becton Dickinson FACScanto II для определения уровня чистоты и фенотипа полученных Tcm-клеток, т.е. CD8+CD45RO+CD62L+ и CD4-CD56-CD45RA-. Клеток окрашивали в двух панелях с использованием следующих меченных антител:

Панель 1: CD8- изотиоцианат флуоресцеина (FITC), CD45RO- фикоэритрин (РЕ), CD62L- аллофикоцианин (АРС), CD56- АРС-Су7, CD3- бриллиантовый фиолетовый 711, CD16- РЕ-Су7 и 7AAD-PerCp.

Панель 2: CD3- бриллиантовый фиолетовый 711, CD8-FITC, CD45RA- РЕ-Су7, CD45RO-APC- Су7, CD20-PE и 7AAD-PerCp.

Анализ с использованием предельного разведения (LDA) и анализ цитотоксичности на основе высвобождения ³⁵S-метионина

С целью оценки частоты встречаемости реактивных в отношении хозяина клеток в культурах Tcm, реактивных в отношении сторонних антигенов, полученных из РВМС на разных стадиях очистки, таких как CD4^-CD56^- (т.е. обогащенных CD8⁺ клетками) или CD4^-CD56^-CD45RA^- (т.е. клеток памяти) осуществляли анализ с использованием предельного разведения (LDA) в сравнении со свежими CD4^-CD56^-CD19^- клетками (выступающими в качестве аллогенного положительного контроля). Три тестируемых препарата клеток культивировали с облученными РВМС хозяина в MLR-культуре в течение 5 дней (т.е. смешанной культуре) для обеспечения индукции активности в отношении хозяина. Спустя 5 дней эффекторные клетки собирали из MLR-культуры и разделяли в градиенте Ficoll. Эффекторные клетки высевали в разных разведениях (диапазон 1-40000 клеток на лунку) в 96-луночные планшеты с лунками с круглым дном (16 повторностей на входное число). Облученные (30 Гр) клетки-стимуляторы хозяина, которые применяли в смешанной MLR, также добавляли в каждую лунку. Культуры в предельных разведениях применяли для обеспечения титрования конечной точки сигнала в отношении хозяина и поддерживали в течение 7 дней в присутствии IL-2 для амплификации сигнала эффекторов.

Спустя 7 дней цитотоксическую активность измеряли в стандартном 5-часовом анализе в отношении меченных ³⁵S-метионином клеток. Вкратце, полученные с конканавалином А бластные клетки (Sigma, Сент-Луис, Миссури) от хозяина, которые применяли в качестве целевых клеток, метили ³⁵S-метионином и высевали вместе с различными разведениями тестируемых индуцированных эффекторных клеток. После 5-часовой инкубации рассчитывали среднюю радиоактивность в супернатантах образцов в 16 повторностях, и процентную долю специфического лизиса рассчитывали с помощью следующего уравнения: 100 × (среднее высвобождение в эксперименте - среднее спонтанное высвобождение)/(среднее общее высвобождение - среднее спонтанное высвобождение). Уровень ³⁵S-метионина, высвобожденного целевыми клетками, соответствует уровню уничтожения, который соответствует уровню реактивности в отношении хозяина.

Чтобы рассчитать частоту встречаемости из показателей для культур в предельных разведениях, применяли следующее уравнение: (которое представляет собой член нулевого порядка распределения Пуассона), в котором у представляет собой процентную долю неотвечающих культур, х представляет собой число отвечающих клеток на культуру, ƒ представляет собой частоту встречаемости отвечающих клеток-предшественников и а представляет собой отрезок y, теоретически равный 100%. Среднее плюс 3 стандартных отклонения для 16 лунок, содержащих только целевые клетки, было определено как пороговое значение фоновой радиоактивности. Экспериментальные лунки были оценены как положительные в отношении лизиса в случае превышения порогового значения. Процент отвечающих культур определяли путем расчета процента положительных культур. Частоту встречаемости CTL-p (f) и стандартную ошибку (SE) определяли из наклона кривой, построенной на основе линейного регрессионного анализа данных.

IFN-γ-Elispot-анализ

Применяли анализ иммуноферментных пятен (ELISpot), высокочувствительный иммунологический анализ, который позволяет измерить частоту встречаемости цитокин-секретирующих клеток на уровне отдельных клеток. В частности, INF-γ-(интерферон гамма)-ELISpot-анализ применяли для оценки частоты встречаемости остаточных реактивных в отношении хозяина клеток в культурах Tcm, реактивных в отношении сторонних антигенов, поскольку IFN-γ вырабатывается преимущественно активированными Т-клетками и NK-клетками.

Вкратце, поверхности мембран 96-луночного микротитрациоиного планшета с PVDF-мембранами покрывали иммобилизованным антителом (очищенным антителом к INF-γчеловека), которое связывается со специфическим эпитопом цитокина (IFN-γ), подлежащего анализу. В ходе 16 часов MLR и стадии стимуляции различные разведения (в диапазоне 1-40000 клеток на лунку) тестируемых клеток высевали в лунки планшета вместе с облученными реактивными в отношении хозяина клеток-стимуляторов. Они образовывали монослой на поверхности мембраны лунки. После активации специфических реактивных в отношении хозяина клеток происходит высвобождение IFN-γ, который захватывается прямо на поверхности мембраны иммобилизованном антителом. IFN-γ, таким образом, «захватывался» в области, непосредственно окружающей секретирующую клетку, перед тем как диффундировать в культуральную среду или подвергнуться разрушению протеазами и связаться рецепторами на поверхности «фоновых» клеток. Последующие стадии выявления позволяют визуализировать иммобилизованный IFN-γ в виде ImmunoSpot. После промывки лунок с целью удаления клеток, дебриса и компонентов среды в лунки добавляли биотинилированное антитело, специфическое к IFN-γ человека. Это антитело является реактивным в отношении отдельного эпитопа цитокина IFN-γ и, таким образом, используется для выявления захваченного цитокина. После промывки с целью удаления какого-либо несвязавшегося биотинилированного антитела выявленный цитокин визуализировали с применением стрептавидина, конъюгированного с ферментом пероксидазой хрена (HRP), и осаждающего субстрата (например, АБС, BCIP/NBT). Окрашенный конечный продукт (красное пятно, (в случае HRP) обычно соответствует отдельной IFN-γ-вырабатывающей клетке. Пятна подсчитывали вручную (например, с использованием препаровального микроскопа) или с применением автоматизированного ридера для фиксации изображений с микролунок и анализа числа и размера пятен.

Пример 1

TCR-трансгенные CD8 T-клетки памяти, размноженные в ответ на их когнатный антиген, заметно усиливают приживление полностью аллогенного истощенного в отношении T-клеток ВМ

Возможность того, что Т-клетки памяти могут быть ассоциированы со сниженным риском развития GvHD, обсуждалась в течение последнего десятилетия. В целом, пул клеток памяти обогащен реактивными в отношении вирусов клонами, и, следовательно, может содержать сниженный уровень аллореактивных Т-клеток. Однако совсем недавно в двух крупных исследованиях, в которых были предприняты попытки применения HSCT с истощением CD45RA⁺ у пациентов с лейкозом, был подтвержден значительный уровень GvHD, даже при применении пост-трансплантационной профилактики GvHD [Bleakley М. et al. J Clin Invest. (2015) 125(7):2677-89; Triplett, B.M. et al. Bone Marrow Transplant. (2015) 50(7):968-977]. Таким образом, истощение аллоре активных клонов из пула Т-клеток памяти путем активации и размножения Т-клеток, реактивных в отношении стороннего антигена, может решить проблему остаточной GvHD, которая остается после истощения CD45RA клеток. Более того, применение распространенных пептидов вирусных антигенов в качестве сторонней стимуляции потенциально могло бы обеспечить создание вето-Tcm-клеток, которые одновременно истощены в отношении аллореактивности, и наделены противовирусной активностью.

С этой целью авторы настоящего изобретения модифицировали предшествующий протокол получения вето-Tcm-клеток, реактивных в отношении стороннего антигена, путем проведения стимуляции с применением конкретных пептидов, в отношении которых направлен TCR имеющегося пула Т-клеток памяти. Таким образом, осуществляли эксперименты по подтверждению концепции в мышиных моделях с применением мышей ОТ1, у которых экспрессируется трансгенный (Tg) TCR, сконструированный для распознавания остатков 257-264 альбумина куриного яйца в контексте H2Kb MHC-I. Эти мыши выступали в качестве доноров вето-Tcm-клеток. Перед сбором этих CD8 Т-клеток ОТ1, мышей иммунизировали OVA-пептидом, смешанным с полным адъювантом Фрейнда (CFA), и проводили вторичную иммунизацию спустя 14 дней после первичной стимуляции с применением OVA-пептида + неполный адъювант Фрейнда (IFA) (см. иллюстрацию на фиг. 1). Спустя семь-четырнадцать дней после иммунизации мышей умерщвляли, удаляли и измельчали их селезенки и лимфатические узлы, и использовали сортировку клеток с магнитными гранулами для выделения клеток памяти (CD8⁺CD44⁺) из общего пула CD8⁺ клеток. Полученную в результате популяцию подвергали «сторонней» стимуляции путем совместного культивирования с облученными спленоцитами, полученными из селезенок мыши, у которых экспрессируется OVA, в условиях недостаточности цитокинов. Спустя шесть часов после начала совместного культивирования в культуру добавляли hIL-15 (10 нг/мл) с целью стимуляции клеток к экспрессии Tcm-подобного фенотипа, как описано выше для Tcm WT (т.е. «обычных» Tcm-клеток, как обсуждается ниже).

Как показано на фиг. 2А, Tcm-клетки ОТ-1, полученные из исходной популяции клеток памяти (CD8⁺CD44⁺), были способны к усилению приживления аллогенного истощенного в отношении Т-клеток трансплантата костного мозга, подобно химеризму, индуцированному «обычными» Tcm-клетками, реактивными в отношении стороннего антигена (т.е. ранее описанными вето-Tcm-клетками, которые получали из целой селезенки или мононуклеарных клеток периферической крови, как было подтверждено ранее [Ophir,E. (2013), выше]). В совокупности эти результаты убедительно демонстрируют, что CD8⁺CD44⁺-происходящие Tcm-клетки, размноженные в ответ на их когнатные пептиды, действительно могут индуцировать толерантность, без проявления GvHD.

Пример 2

Вето-Tcm-клетки, полученные из CD8 Т-клеток памяти, обладают выраженной вето-активностью со сниженным риском развития GVHD

Затем, авторами настоящего изобретения были предприняты попытки получить Tcm-клетки из CD8 Т-клеток памяти B6-WT после иммунизации OVA. С этой целью после иммунизации мышей C57BL/6 CD8⁺CD44⁺ Т-клетки памяти подвергали магнитной сортировке и тому же протоколу для получения Tcm с применением всех стимуляторов OVA. Изначально авторы настоящего изобретения хотели протестировать способность этих CD8⁺CD44⁺ Tcm-клеток индуцировать GvHD в сравнении с таковой исходной популяции CD8⁺CD44⁺ клеток, которую применяли ранее в клинике. Ожидалось, что CD8⁺CD44⁺ Tcm-клетки будут истощены в отношении аллореактивных клонов путем антигенной стимуляции с применением пептида OVA, который избирательно активирует только те клоны Т-клеток, которые имеют соответствующий TCR.

Действительно, было показано, что CD8⁺CD44⁺ Tcm-клетки не индуцируют заметных симптомов GvHD в животных моделях, тогда как свежие CD8⁺CD44⁺ клетки памяти, которые не подвергались сторонней активации, индуцировали значительную степень летальности и потерю веса ввиду GvHD (фигуры 2В-С). Затем, авторы настоящего изобретения хотели оценить, были ли эти клетки способны к индукции толерантности в модели кондиционирования сниженной интенсивности (RIC) (проиллюстрировано на фиг. 2D). Как можно видеть на фиг. 2Е, CD8⁺CD44⁺ Tcm проявляли заметное усиление химеризма после трансплантации ВМ голых C57BL реципиентам Balb/c, подвергавшимся кондиционированию 5 Гр TBI.

Пример 3

Получение Tcm-клеток человека, реактивных в отношении стороннего антигена, с применением вирусных антигенов

Авторы настоящего изобретения ранее разработали протокол получения полученных от человека Tcm-клеток, реактивных в отношении стороннего антигена, из исходной популяции CD4^-CD56^- клеток с минимальным риском развития GvHD с применением двустадийного подхода с использованием магнитной сортировки для истощения аллоре активности. Этот протокол был разработан с применением трех доноров клеток, где сторонний донор был выбран для гарантии того, что ни один из его аллелей HLA класса I не является общим с аллелями HLA класса I хозяина, с целью предупреждения GvHD.

В рассматриваемых экспериментах, аналогично тому, что было описано выше для экспериментов по подтверждению концепции на мышах, авторы настоящего изобретения применяли встречающиеся в природе CD8 клетки памяти в качестве исходного материала для получения вето-Tcm-клеток, поскольку эти клетки, как сообщалось, обладают сниженной склонностью к индукции GvHD по сравнению с наивными клетками. Этот вариант недавно стал осуществимым благодаря выходу на рынок магнитных гранул с иммобилизованными антителами к CD45RA GMP-уровня для истощения наивных Т-клеток. Как описано выше и в разделе «Область техники и предшествующий уровень техники настоящего изобретения» в данном документе выше, подход с инфузией CD45RA^- клеток тестировали в двух клинических испытаниях с участием пациентов с лейкозом [Bleakley М. et al. (2015) выше; Triplett, В.М. et al. (2015) выше], однако предупреждение GvHD не происходило, при этом у некоторых пациентов проявлялись тяжелые формы GvHD, даже в случае лечения с применением подавления иммунитета после трансплантации. Эти данные побудили авторов настоящего изобретения оценить возможность того, что стимуляция CD45RA-истоощенных CD8 Т-клеток в ответ на специфические антигены может полностью истощить эти клетки в отношении GvH-реактивности. Поскольку TCR большинства клеток в этом пуле клеток памяти направлены против распространенных вирусных и бактериальных антигенов и поэтому, естественно, менее склонны к аллоре актив но ста по отношению к хозяину, авторы настоящего изобретения предположили, что пептиды вирусных антигенов (например, CMV, EBV и аденовируса), нагруженные на DC донора (т.е. того же донора клеток, что и в случае Tcm-клеток), можно было бы успешно применять в качестве стимуляторов. С применением такого подхода можно получить преимущество возможной противовирусной активности этих клеток в дополнение к их вето-активности, что является особенно перспективной характеристикой для проведения трансплантации, при которой повторная противовирусная активация является распространенным неблагоприятным явлением.

Чтобы подтвердить это предположение был инициирован предварительный эксперимент, в котором применяли те же условия культивирования вето-Tcm-клеток, за исключением того, что стимуляцию в отношении антигена осуществляли в отношении DC донора, стимулированных смесями вирусных пептидов трех распространенных вирусов (EBV, CMV и аденовируса), вместо третьего HLA-несовместимого донора для сторонних DC. Следует отметить, что этот эксперимент начинали с ранее описанной CD4^-CD56^- популяции (т.е. CD45RA⁺ клетки не были удалены). Как можно видеть на фигурах 3А-3В, вето-Tcm-клетки росли хорошо в ответ на такую противовирусную стимуляцию, при этом наблюдали 10-кратное размножение к дню +9 с высокой процентной долей (93,2%) клеток, проявляющих фенотип вето-Tcm.

Реактивность в отношении хозяина, проанализированная с помощью анализа с использованием предельного разведения (LDA), показана на фигурах 3C-D, и соответствующие параметры обобщены в таблице 2, ниже. Из результатов видно, что этот способ обеспечивал двухкратное логарифмическое истощение аллореактивных в отношении хозяина клонов, аналогично полученным ранее результатам с применением «обычной» сторонней активации в отношении HLA-несовместимого донора. Эти результаты были дополнительно подтверждены в IFNγ-Elispot-анализе (осуществляемом после смешанного культивирования), в котором после активации клеток хозяина свежие клетки (CD4^-CD56^-CD19^-) образовывали примерно 25000 пятен/на 10⁶ Т-клеток, не можно было выявить какие-либо пятна в культуре вето-Tcm клеток (данные не показаны).

Пример 4

Получение вето-клеток человека из Т-клеток памяти с применением вирусных антигенов

Затем, авторы настоящего изобретения тестировали реактивность Tcm-клеток, выращенных из CD45RA-истощенной популяции, активированной в отношении вирусных антигенов, представленных на поверхности DC донора (т.е. того же донора клеток, что и в случае Tcm-клеток) (как проиллюстрировано на фигурах 4А и 4В).

Реактивность вето-Tcm-клеток, выращенных из этой исходной популяции (CD4^-CD56^-CD45RA^- клеток), тестировали с применением LDA-анализа уничтожения. Как видно из результатов, очевидно, что вето-клетки, полученные из клеток памяти, не характеризуются какой-либо реактивностью в отношении хозяина (фигуры 5А-С и фиг. 6).

В совокупности эти результаты убедительно демонстрируют, что подход с использованием вирусных пептидов в качестве стимуляторов можно применять для исходной популяции реактивных клеток, которые являются CD45RA-истощенными (например, CD4^-CD56^-CD45RA^- клетки), о которых известно, что они обладают относительно низкой склонностью к индукции GvHD. Как показано, эта популяция клеток дополнительно может быть истощена в отношении предполагаемых реактивных в отношении хозяина клонов при противовирусной стимуляции, что может обеспечить получение, и при этом весьма безопасного, не индуцирующего GvHD препарата клеток.

Пример 5

Получение вето-клеток человека из Т-клеток памяти с применением антигенов, отличных от вирусных

Авторы настоящего изобретения получили вето-клетки из исходной популяции клеток памяти (CD45RA^- клеток), стимулированных в отношении пептидов, отличных от вирусных, включая пептиды, идентифицированные при раке (например, солидной опухоли или злокачественном новообразовании кроветворной ткани).

Как описано выше, вето-клетки получали подвергая Т-клетки памяти (т.е. CD45RA-истощенной популяции), полученные от донора, воздействию опухолевых антигенов, представленных на поверхности DC донора.

В качестве альтернативы, вето-клетки получали путем первой иммунизации донора клеток опухолевым пептидом (как обсуждается в разделе «Общие материалы и процедуры экспериментов» выше) с полным адъювантом Фрейнда (CFA) и проведения вторичной иммунизации спустя 14 дней после первичной стимуляции с применением опухолевого пептида + неполный адъювант Фрейнда (IFA). Затем, от субъекта получали мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и истощали их в отношении CD4⁺CD56⁺CD45RA⁺. Остальную часть популяции клеток (т.е. CD8⁺CD45RO⁺ Т-клеток памяти) культивировали совместно с опухолевыми антигенами, представленными на поверхности DC донора.

Эти клетки можно дополнительно применять для терапевтического устранения остаточных раковых клеток.

Пример 6

Протокол в соответствии с Надлежащей производственной практикой (Good manufacturing practice, GMP) для крупномасштабного производства противовирусных центральных CD8 вето-Т-клеток памяти (Tcm)

Авторы настоящего изобретения успешно повторили протокол получения вето-клеток человека из Т-клеток памяти с применением вирусных антигенов, представленных на поверхности аутологичных антиген-представляющих клеток, 10 раз (фиг. 7). Как можно видеть на фигурах 8 и 9А-Н, новый протокол выделения и очистки клеток был вполне воспроизводимым.

Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в сочетании с конкретными вариантами его осуществления, очевидно, что множество альтернатив, модификаций и вариаций будут понятны специалистам в данной области. Соответственно, подразумевается, что оно охватывает все такие альтернативы, модификации и вариации, которые соответствуют сущности и широкому объему прилагаемой формулы изобретения.

Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящий документе в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были конкретно и индивидуально указаны для включения в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, цитирование или указание любой ссылки в настоящей заявке не должно истолковываться как признание того, что такая ссылка существует в качестве прототипа настоящего изобретения. В том смысле, в котором применяются заголовки разделов, они не должны истолковываться обязательно как ограничивающие.

1. Способ получения выделенной популяции не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GvHD) противовирусных, антибактериальных и/или противоопухолевых клеток, обладающих фенотипом центральных T-лимфоцитов памяти (Tcm), причем указанные клетки являются индуцирующими толерантность и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации, причем способ предусматривает:

(a) обеспечение популяции Т-клеток, содержащей по меньшей мере 50% Т-клеток памяти;

(b) приведение указанной популяции Т-клеток в контакт с вирусным, бактериальным и/или опухолевым антигеном или антигенами в присутствии IL-21 с целью обеспечения обогащения ее антигенреактивными клетками; и

(c) культивирование указанных полученных на стадии (b) клеток в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7 с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих указанным фенотипом Tcm, с получением тем самым выделенной популяции не индуцирующих GvHD противовирусных, антибактериальных и/или противоопухолевых клеток.

2. Способ по п. 1, в котором указанные Т-клетки памяти

истощены в отношении CD45RA⁺ клеток и/или

истощены в отношении CD4⁺ и/или CD56⁺ клеток.

3. Способ по п. 1, в котором: указанная популяция Т-клеток, содержащая по меньшей мере 50% Т-клеток памяти, обогащена в отношении антигена или антигенов.

4. Способ по п. 1, дополнительно предусматривающий проведение в отношении донора клеток обработки указанным антигеном или антигенами до указанного обеспечения указанной популяции Т-клеток, содержащей по меньшей мере из 50% Т-клеток памяти.

5. Способ получения выделенной популяции не индуцирующих GvHD противовирусных, антибактериальных и/или противоопухолевых клеток, обладающих фенотипом центральных T-лимфоцитов памяти (Tcm), причем указанные клетки являются индуцирующими толерантность и/или наделены противовирусной, антибактериальной и/или протвоопухолевой активностью и способны к хомингу в лимфатические узлы после трансплантации, причем способ предусматривает:

(a) обработку мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) средством, способным обеспечивать истощение CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺ клеток, или средством, способным отбирать CD45RO⁺, CD8⁺ клетки, с целью получения популяции клеток, обогащенной Т-клетками памяти, обладающих фенотипом CD45RA-CD8⁺;

(b) приведение указанной популяции клеток, обогащенной Т-клетками памяти в контакт с вирусным, бактериальным и/или опухолевым антигеном или антигенами в присутствии IL-21 с целью обеспечения обогащения ее антигенреактивными клетками; и

(c) культивирование указанных полученных на стадии (b) клеток в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7 с целью обеспечения пролиферации клеток, обладающих указанным фенотипом Tcm, с получением тем самым выделенной популяции не индуцирующих GvHD противовирусных, антибактериальных и/или противоопухолевых клеток.

6. Способ по п. 1 или 5, в котором указанные вирусные, бактериальные и/или опухолевые антиген или антигены: представлены аутологичными антиген-представляющими клетками, не являющимися аутологичными антиген-представляющими клетками, искусственными носителями или искусственными антиген-представляющими клетками; и/или

представлены антиген-представляющими клетками того же происхождения, что и указанные Т-клетки памяти.

7. Способ по п. 1 или 5, в котором указанные вирусные, бактериальные и/или опухолевые антиген или антигены:

включают два или более вирусных пептида; и/или

включают пептид EBV, пептид CMV, пептид аденовируса (Adv) и/или пептид вируса BK; и/или

включают три пептида EBV, два пептида CMV и два пептида аденовируса (Adv); и/или

выбраны из группы, состоящей из EBV-LMP2, EBV-BZLF1, EBV-EBNA1, CMV-pp65, CMV-IE-1, Adv-пентона и Adv-гексона; и/или

включают два или более из EBV-LMP2, EBV-BZLF1, EBV-EBNA1, CMV-pp65, CMV-IE-1, Adv-пентона и Adv-гексона.

8. Способ по любому из п. 1 или 5, в котором указанное контактирование указанной популяции Т-клеток памяти с указанными вирусными, бактериальными и/или опухолевыми антигеном или антигенами в присутствии указанного IL-21

осуществляют в течение от 12 часов до 5 дней или осуществляют в течение 3 дней.

9. Способ по любому из п. 1 или 5, в котором указанное культивирование указанных полученных на стадии (b) клеток в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7:

осуществляют в течение от 12 часов до 15 дней; или

осуществляют в течение от 4 дней до 10 дней; или

осуществляют в течение от 6 до 9 дней.

10. Способ по любому из п. 1 или 5,

в котором указанная общая продолжительность получения не индуцирующих GvHD клеток составляет 9-12 дней; и/или где указанный способ осуществляют ex-vivo; и/или

дополнительно предусматривающий истощение аллореактивных клеток после осуществления стадии (c), и причем необязательно указанное истощение указанных аллореактивных клеток осуществляют за счет истощения CD137⁺ и/или CD25⁺ клеток после приведения указанных клеток, обладающих указанным фенотипом Tcm, в контакт с антиген-представляющими клетками (APC) хозяина.

11. Способ по п. 5, в котором указанные PBMC не являются изогенными по отношению к субъекту.

12. Способ по любому из п. 1 или 5, в котором указанные клетки с указанным фенотипом Tcm обладают антигенным профилем CD3⁺, CD8⁺, CD62L⁺, CD45RA^-, CD45RO⁺.

13. Выделенная популяция не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GvHD) противовирусных, антибактериальных и/или противоопухолевых клеток, содержащая клетки с фенотипом центральных T-лимфоцитов памяти (Tcm), причем указанные клетки получены из Т-клеток памяти в соответствии со способом по любому из пп. 1-12, для применения в индукции трансплантационной толерантности и/или для лечения бактериального заболевания, вирусного заболевания или рака в отсутствие GvHD.

14. Способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации клеток или тканей, причем способ предусматривает:

(a) пересадку трансплантата клеток или тканей субъекту; и

(b) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции не индуцирующих GvHD противовирусных, антибактериальных и/или противоопухолевых клеток, причем указанные клетки получены из Т-клеток памяти в соответствии со способом по любому из пп. 1-12, за счет чего обеспечивается лечение субъекта, нуждающегося в трансплантации клеток или тканей.

15. Способ по п. 14, в котором

(b) осуществляют до (a) или

(a) и (b) осуществляют одновременно.

16. Способ по п. 14, дополнительно предусматривающий кондиционирование субъекта в сублетальных, летальных или сверхлетальных условиях перед указанной пересадкой.

17. Способ по п. 14, в котором указанный трансплантат клеток или тканей не является изогенным по отношению к субъекту.

18. Способ по п. 14, в котором указанный трансплантат клеток или тканей и указанная выделенная популяция не индуцирующих GvHD клеток получены от одного и того же донора.

19. Способ по п. 14, в котором указанный трансплантат клеток или тканей:

выбран из группы, состоящей из клетки или ткани печени, поджелудочной железы, селезенки, почки, сердца, легкого, кожи, кишечника, головного мозга, яичника и лимфоидной/гемопоэтической клетки или ткани; или

предусматривает котрансплантацию нескольких органов, и причем необязательно указанная котрансплантация предусматривает трансплантацию незрелых гемопоэтических клеток и паренхиматозного органа.

20. Способ по п. 14, причем у указанного субъекта наблюдается злокачественное заболевание.

21. Способ по п. 20, причем указанное злокачественное заболевание представляет собой солидную опухоль или метастаз опухоли.

22. Способ по п. 20, причем указанное злокачественное заболевание представляет собой злокачественное новообразование кроветворной ткани.

23. Способ по п. 14, причем у указанного субъекта наблюдается заболевание, не являющееся злокачественным.

24. Способ по п. 23, причем указанное заболевание, не являющееся злокачественным, выбрано из группы, состоящей из нарушения функции или функциональной недостаточности органа, заболевания, связанного с трансплантацией, и заболевания крови.