Функционализированные эритроидные клетки

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и генетической инженерии, в частности к способам получения безъядерной эритроидной клетки, ковалентно связанной с экзогенным полипептидом, где указанная клетка и указанный полипептид связаны ковалентно посредством реакции клик-химии. Для осуществления способов согласно настоящему изобретению сначала получают безъядерную эритроидную клетку, ковалентно связанную с первым химическим фрагментом посредством реакции клик-химии. При этом клетка не получена способом, который включает приведение её или её предшественника в контакт с сахаром, а первый химический фрагмент способен образовывать ковалентную связь со вторым химическим фрагментом посредством реакции клик-химии. Затем получают активированное средство, содержащее экзогенный полипептид, ковалентно связанный со вторым химическим фрагментом. После чего приводят безъядерную эритроидную клетку в контакт с активированным средством. При этом безъядерная эритроидная клетка не имеет последовательности, созданной с помощью реакции с участием сортазы. А реакция клик-химии не требует катализатора в виде иона меди. Указанный экзогенный полипептид представляет собой фермент, антитело, антиген, хемокин или цитокин. Настоящее изобретение позволяет улучшить способы получения клеток, содержащих экзогенные полипептиды, которые могут быть использованы для лечения различных заболеваний. 2 н. и 40 з.п. ф-лы, 14 ил., 12 табл., 27 пр.

 

Настоящая заявка испрашивает приоритет по патентному документу США с порядковым № 62/460589, поданному 17 февраля 2017 года, и патентному документу США с порядковым № 62/542142, поданному 7 августа 2017 года, содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 15 февраля 2018 года, имеет название R2081-7021WO_SL.txt, и ее размер составляет 51103 байт.

ПРЕДПОСЫЛКИ

Эритроидные клетки, такие как красные кровяные клетки, можно сконструировать с возможностью экспрессии широкого разнообразия экзогенных терапевтических белков для лечения ряда разных заболеваний, как описано в WO 2015/073587 (Rubius Therapeutics, Inc.). Такое конструирование может включать введение трансгена в предшественников эритроидных клеток, а затем индукцию дифференцировки предшественников и экспрессии ими трансгена. Однако некоторые белки трудно экспрессировать, например, вследствие того, что они требуют посттрансляционной модификации, или вследствие того, что они нарушают рост или функцию клетки–хозяина. Существует потребность в улучшенных способах получения клеток, содержащих такие белки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описаны новые препараты функционализированных эритроидных клеток и связанные с ними композиции, реагенты и способы, которые обладают преимущественными и неожиданными качествами для применения в фармацевтике для человека и в ветеринарии. Например, способы и композиции, раскрытые в данном документе, обеспечивают получение функционализированных эритроидных клеток, характеризующихся оптимизированным выходом, чистотой, стабильностью, жизнеспособностью, иммуногенностью, функцией, целостностью и/или биологической функцией для применения в терапевтических путях применения. Функционализированные эритроидные клетки, описанные в данном документе, особенно хорошо подходят для доставки средств на поверхность клеток или для сложных или трудно экспрессируемых средств, например, полипептидов, например, мультимерных полипептидов; крупных полипептидов; средств, дериватизированных in vitro, например, полипептидов; средств, которые могут быть токсичными для эритроидных клеток или которые не могут эффективно экспрессироваться в них. Средство также может представлять собой липид, нуклеиновую кислоту, сахар, лекарственное средство или малую молекулу.

Способы и композиции, раскрытые в данном документе, обеспечивают получение оптимизированных эритроидных клеток, дериватизированных терапевтическими или диагностическими средствами, для применения при широком спектре показаний. Также предусмотрены оптимизированные реагенты, промежуточные соединения и способы синтеза.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к препарату, например, фармацевтическому препарату эритроидных клеток, например, гемопоэтических стволовых клеток, ретикулоцитов или эритроцитов, содержащему не более, по меньшей мере, более или приблизительно 5000, 10000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000 связывающих реагентов на клетку. Например, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится к препарату, например, фармацевтическому препарату эритроидных клеток, содержащему по меньшей мере 5000, 10000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000 связывающих реагентов на клетку. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический препарат, описанный в данном документе, содержит не более 10000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000 связывающих реагентов на клетку. В одном варианте осуществления по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 99,9% клеток в препарате имеют указанный уровень связывающего реагента, например, алкинового связывающего реагента (KR) на клетку или азидного связывающего реагента (AR) на клетку. В одном варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30 или 40% клеток в препарате имеют указанный уровень средства на клетку. В одном варианте осуществления препарат содержит не более, по меньшей мере, более или приблизительно 10000, 50000, 100000, 10⁶, 10⁷, 10⁸ или 10⁹ клеток. В одном варианте осуществления препарат содержит не более, по меньшей мере, более или приблизительно 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² клеток. В одном варианте осуществления клетка дополнительно содержит полипептид, экспрессированный экзогенной нуклеиновой кислотой, например, внутри клетки или на клеточной поверхности.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к препарату, например, фармацевтическому препарату эритроидных клеток, например, гемопоэтических стволовых клеток, ретикулоцитов или эритроцитов, содержащему не более, по меньшей мере, более или приблизительно 1000, 2000, 3000, 4000 или 5000 связывающих реагентов на клетку. Например, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится к препарату, например, фармацевтическому препарату эритроидных клеток, содержащему по меньшей мере 1000, 2000, 3000, 4000 или 5000 связывающих реагентов на клетку.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к препарату, например, фармацевтическому препарату эритроидных клеток, например, гемопоэтических стволовых клеток, ретикулоцитов или эритроцитов, содержащему не более, по меньшей мере, более или приблизительно 5000, 10000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000 копий средства, например, гетерологичного средства, связанных с клеткой с помощью остаточного линкера. В некоторых вариантах осуществления остаточный линкер содержит характерный признак клик-химии. Например, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится к препарату, например, фармацевтическому препарату эритроидных клеток, содержащему по меньшей мере 5000, 10000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000 копий гетерологичного средства, связанных с клеткой с помощью остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии.

В одном варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 99,9% клеток в препарате имеют указанный уровень средства на клетку. В одном варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 99,9% клеток в препарате содержат первое средство и второе средство, например, где клетка считается положительной в отношении средства, если уровень средства выше, чем уровень, измеренный в 99% других аналогичных немеченых клеток. В одном варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30 или 40% клеток в препарате имеют указанный уровень средства на клетку. В одном варианте осуществления препарат содержит не более, по меньшей мере, более или приблизительно 10000, 50000, 100000, 10⁶, 10⁷, 10⁸ или 10⁹ клеток. В одном варианте осуществления препарат содержит не более, по меньшей мере, более или приблизительно 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² клеток.

В одном варианте осуществления эритроидные клетки представляют собой ретикулоциты, например, из размноженных in vitro, дифференцированных и безъядерных HSC. В вариантах осуществления эритроидные клетки включают гемопоэтические клетки–предшественники, например, CD34+ клетки.

В одном варианте осуществления эритроидные клетки представляют собой эритроциты, например, полученные из крови.

В одном варианте осуществления эритроидные клетки являются генетически модифицированными, например, клетки содержат полипептид, экспрессированный экзогенной нуклеиновой кислотой (например, ДНК или РНК, например, мРНК).

В одном варианте осуществления в эритроидные клетки инкапсулирован, например, загружен посредством гипотонической загрузки, экзогенный белок.

В одном варианте осуществления препарат не содержит или практически не содержит свободного связывающего реагента, непрореагировавшего связывающего реагента, органического растворителя, металла (например, меди), катализатора или немеченых клеток или немодифицированных клеток.

В одном варианте осуществления средство представляет собой средство, описанное в WO 2015/15302 или в WO 2015/073587, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В одном варианте осуществления средство предусматривает пептидное средство, например, полипептид, фермент или антитело. В одном варианте осуществления пептидное средство предусматривает цитокин, рецептор, лиганд, гормон, фактор роста, фактор крови, фермент лизосомного накопления, аспарагиназу или фрагмент любого из вышеуказанных, содержащий внеклеточный домен, домен связывания контрлиганда или другой биологически активный домен, или его фрагмент или вариант. В одном варианте осуществления средство предусматривает антиген, например, опухолевый антиген, и антиген, вызывающий инфекционное заболевание, и аутоантиген.

В одном варианте осуществления средство предусматривает липид; нуклеиновую кислоту, например, РНК, ДНК, siRNA; сахар; лекарственное средство или малую молекулу.

В одном варианте осуществления средство предусматривает полипептид с массой более чем приблизительно 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 килодальтонов. В одном варианте осуществления средство предусматривает полипептид с массой приблизительно 1-2, 1-5, 2-5, 5-10, 10-20, 20-50, 50-100, 100-200 или 200-500 кДа. В одном варианте осуществления средство предусматривает полипептид из более чем 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 аминокислот.

В одном варианте осуществления средство, например, полипептид, содержит посттрансляционную модификацию, например, посттрансляционную модификацию, которая не осуществляется эритроидными клетками или неэффективно осуществляется эритроидными клетками. В вариантах осуществления полипептид, например, антитело, содержит один или несколько дисульфидных мостиков. В вариантах осуществления средство, например, полипептид, не имеет посттрансляционной модификации или содержит модификацию на более низком уровне, чем белок, вырабатываемый клеткой млекопитающего, например, клеткой СНО. В вариантах осуществления полипептид (например, антитело) подвергается дегликозилированию. В вариантах осуществления дегликозилирование приводит к более низкой индукции ADCC и/или более низкому взаимодействию с Fc–гамма–рецепторами.

В некоторых вариантах осуществления средство, например, полипептид, не содержит посттрансляционной модификации, которая обычно присутствует, если полипептид вырабатывается в клетке человека, например, в эритроидной клетке человека. В некоторых вариантах осуществления средство, например, полипептид, содержит посттрансляционную модификацию на более низком уровне, чем обычно присутствует, если полипептид вырабатывается в клетке человека, например, на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ниже.

В некоторых вариантах осуществления полипептидное средство содержит одну или несколько неканонических аминокислот. Неканонической аминокислотой может быть, например, п–метоксифенилаланин (pMpa); п–ацетилфенилаланин (pApa); п–бензоилфенилаланин (pBpa); п–йодфенилаланин (pIpa); п–азидофенилаланин (pAzpa); п–пропаргилоксифенилаланин (pPpa); α–аминокаприловая кислота; о–нитробензилцистеин (о–NBC); 1,5–дансилаланин и о–нитробензилсерин (о–NBS).

В одном варианте осуществления средство, например, полипептид, является токсичным для эритроидной клетки или нарушает ее рост, функцию, продолжительность жизни или развитие. В вариантах осуществления средство, которое является токсичным для клетки, представляет собой средство (например, фермент), с помощью которого вырабатывается метаболит, токсичный для клетки.

В одном варианте осуществления средство предусматривает мультимерный полипептид, например, димер, например гомодимер или гетеродимер, тример, например гомотример или гетеротример, или тетрамер, например гомотетрамер или гетеротетрамер, например, антитело или рецептор клеточной поверхности, например, рецептор к переносчику заболевания, например, вирусу, лекарственное средство или токсин.

В одном варианте осуществления средство предусматривает полипептид, например, мультимерный полипептид, содержащий множество цистеиновых мостиков. В одном варианте осуществления средство предусматривает полипептид, например, мультимерный полипептид, содержащий один или несколько цистеиновых мостиков.

В одном варианте осуществления средство предусматривает трудно экспрессируемый белок. В вариантах осуществления трудно экспрессируемый белок представляет собой белок, который содержит посттрансляционную модификацию, обычно не встречающуюся в эритроидных клетках. В вариантах осуществления посттрансляционная модификация предусматривает расщепление протеазой, которая обычно не экспрессируется в эритроидных клетках. В вариантах осуществления трудно экспрессируемый белок предусматривает активированный фактор свертывания крови, и протеаза, которая активирует фактор свертывания крови, обычно не экспрессируется в эритроидных клетках. Иллюстративные активированные факторы свертывания крови, которые активируются посредством расщепления, включают факторы Va, VIIa, VIIIa, IXa, Xa, XIa, XIIIa и тромбин.

В одном варианте осуществления средство предусматривает молекулу антитела, например, полипептид, содержащий одно или несколько из следующего: a) вариабельную область, достаточную для связывания родственного антигена, например, CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC; b) последовательность константной области тяжелой цепи, содержащей одно или несколько из СН1, СН2 и СН3; c) функциональную Fc-область и d) модифицированную или неактивную Fc-область, например, мутационно инактивированную Fc-область или Fc-область, имеющую уровень гликозилирования, который ухудшает активность Fc, например, дегликозилированную Fc-область. В одном варианте осуществления антитело представляет собой полиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Примеры антител включают без ограничения фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fv, фрагменты scFv-антител, связанные дисульфидной связью Fv (sdFv), фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1, линейные антитела, однодоменные антитела, такие как sdAb (либо VL, либо VH), домены VHH верблюдовых, полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, такие как двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области, выделенный эпитопсвязывающий фрагмент антитела, макситела, минитела, нанотела, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv. В вариантах осуществления CDR определяют в соответствии с Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации по "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (схема нумерации по "Chothia") или их комбинацией.

В одном варианте осуществления средство предусматривает антитело, например, IgA, IgG, IgG1, IgG2, IgM, IgE или IgD.

В одном варианте осуществления средство предусматривает молекулу антитела к PDL1, молекулу антитела к 4–1BB или молекулу антитела к α4β7. В одном варианте осуществления средство предусматривает антитело к PDL1, антитело к 4–1BB, антитело к α4β7 или белок A/G. В одном варианте осуществления средство предусматривает 4–1BBL, фактор VIIa, фактор Xa, аспарагиназу, IL–10 или пептид MOG. В одном варианте осуществления средство предусматривает аспарагиназу, и аспарагиназная активность клеток составляет приблизительно 1×10^{–12–1×10–9} Ед/клетка, 1×10^{–12–1×10–11} Ед/клетка, 1×10^{–11–1×10–10} Ед/клетка или 1×10^{–10–1×10–9} Ед/клетка.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к препарату, например, фармацевтическому препарату эритроидных клеток, например, гемопоэтических стволовых клеток, ретикулоцитов или эритроцитов, содержащему:

не более, по меньшей мере, более или приблизительно 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000 или 500000 копий первого средства, например, гетерологичного средства, связанных с клеткой с помощью остаточного линкера; и не более, по меньшей мере, более или приблизительно 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000 или 500000 копий второго средства, например, гетерологичного средства, связанных с клеткой с помощью второго остаточного линкера. Например, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится к препарату, например, фармацевтическому препарату эритроидных клеток, содержащему по меньшей мере 1000 копий первого гетерологичного средства, связанных с клеткой с помощью остаточного линкера, имеющего характерный признак клик–химии; и по меньшей мере 1000 копий второго гетерологичного средства, связанных с клеткой с помощью второго остаточного линкера, имеющего второй характерный признак клик–химии. В одном варианте осуществления первый и второй остаточные линкеры имеют разные структуры. В одном варианте осуществления первый и второй остаточные линкеры имеют одинаковую структуру. В одном варианте осуществления первый и второй остаточные линкеры имеют одинаковую структуру, но характеризуются противоположной ориентацией. В одном варианте осуществления первый характерный признак клик–химии отличается от второго характерного признака клик–химии. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит по меньшей мере 2000 копий первого гетерологичного средства и по меньшей мере 2000 копий второго гетерологичного средства. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит по меньшей мере 5000 копий первого гетерологичного средства и по меньшей мере 5000 копий второго гетерологичного средства. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит по меньшей мере 10000 копий первого гетерологичного средства и по меньшей мере 10000 копий второго гетерологичного средства. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит по меньшей мере 50000 копий первого гетерологичного средства и по меньшей мере 50000 копий второго гетерологичного средства. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит по меньшей мере 100000 копий первого гетерологичного средства и по меньшей мере 100000 копий второго гетерологичного средства.

В одном варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 99,9% клеток в препарате имеют указанный уровень средств на клетку. В одном варианте осуществления препарат содержит не более, по меньшей мере, более или приблизительно 10000, 50000, 100000, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² клеток. В одном варианте осуществления препарат содержит по меньшей мере 10000, 50000, 100000, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² клеток.

В одном варианте осуществления эритроидные клетки дополнительно содержат одно или несколько дополнительных средств, например, N средств, где N представляет собой по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100 или 200 средств, где в случае каждого дополнительного средства клетка содержит не более, по меньшей мере, более или приблизительно 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000 или 500000 копий дополнительного средства, например, гетерологичного средства, связанных с клеткой с помощью остаточного линкера.

В одном варианте осуществления препарат, например, фармацевтический препарат, раскрытый в данном документе, не содержит или практически не содержит свободного связывающего реагента, непрореагировавшего связывающего реагента, органического растворителя, металла (например, меди), катализатора или немеченых клеток или немодифицированных клеток.

В вариантах осуществления в клетке или препарате, например, фармацевтическом препарате, раскрытом в данном документе, менее 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% связывающего реагента на клетке является непрореагировавшим связывающим реагентом. В вариантах осуществления в клетке или препарате, например, фармацевтическом препарате, раскрытом в данном документе, менее чем 15%, 14%, 13%, 12%, 11% или 10% связывающего реагента на клетке является непрореагировавшим связывающим реагентом.

В одном варианте осуществления средство предусматривает пептидное средство, например, полипептид, белковое лекарственное средство, фермент, антитело (например, scFv), цитокин, рецептор цитокина, рецепторную молекулу, лиганд, гормон, фактор роста, фактор крови, фермент лизосомного накопления, аспарагиназу, антиген (например, опухолевый антиген, антиген, вызывающий инфекционное заболевание, или аутоантиген) или иммуностимулирующую молекулу (например, костимулирующую молекулу). В вариантах осуществления антитело предусматривает полное антитело, его фрагмент, одноцепочечное антитело, гуманизированное антитело; мышиное антитело; химерное моноклональное антитело мыши–человека, мыши–примата, примата–человека, антиидиотипическое антитело, фрагменты антитела, такие как, например, фрагменты scFv, (scFv)2, Fab, Fab' и F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb и Fd, диатела и родственный антителу полипептид.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтического препарата, продукта или промежуточного соединения, включающему а) связывание первого связывающего реагента, например, связывающего реагента класса GMP, с эритроидной клеткой с получением таким образом фармацевтического препарата, продукта или промежуточного соединения. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает b) приведение клетки в контакт со средством, связанным со вторым связывающим реагентом, например, со связывающим реагентом класса GMP, например, в условиях, подходящих для осуществления реакции первого связывающего реагента со вторым связывающим реагентом. В вариантах осуществления способ включает связывание второго связывающего реагента со средством, например, до или после стадии а). В вариантах осуществления промежуточное соединение из стадии а) хранят до приведения в контакт на стадии b). В вариантах осуществления средство, связанное со вторым связывающим реагентом, хранят до приведения в контакт на стадии b).

В одном варианте осуществления способ включает обеспечение популяции эритроидных клеток для связывания в а). В одном варианте осуществления способ включает уменьшение или сведение к минимуму объектов в препарате, которые вступают в реакцию с первым связывающим реагентом. В одном варианте осуществления способ включает обработку, например, промывку клетки с удалением несвязанного материала, например, белка, из клетки, например, способной вступать в реакцию с первым связывающим реагентом.

В одном варианте осуществления второе средство связывают с клеткой, при этом способ включает c) связывание второго связывающего реагента, например, связывающего реагента класса GMP, с эритроидной клеткой и d) приведение клетки в контакт со вторым средством, связанным со вторым связывающим реагентом, например, связывающим реагент класса GMP, например, в условиях, подходящих для осуществления реакции первого связывающего реагента со вторым связывающим реагентом.

В вариантах осуществления способ включает:

a) связывание первого связывающего реагента с клеткой,

b) приведение клетки в контакт с первым средством, связанным со вторым связывающим реагентом, который способен вступать в реакцию с первым связывающим реагентом,

c) связывание третьего связывающего реагента с клеткой и

d) приведение клетки в контакт со вторым средством, связанным с четвертым связывающим реагентом, который способен вступать в реакцию с третьим связывающим реагентом.

В вариантах осуществления стадии a), b), c) и d) выполняют в одном из следующих порядков:

a), затем b), затем c) и затем d);

a), затем c), затем b) и затем d);

a), затем c), затем d) и затем b);

a), затем c), затем b) и d) одновременно;

c), затем d), затем a) и затем b);

c), затем a), затем b) и затем d);

c), затем a), затем d) и затем b);

c), затем a), затем b) и d) одновременно;

a) и c) одновременно, затем b) и затем d);

а) и c) одновременно, затем d) и затем b) или

a) и c) одновременно, затем b) и d) одновременно.

В одном варианте осуществления эффективность конъюгирования в реакции присоединения составляет более 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 98%.

В одном варианте осуществления эритроидные клетки представляют собой ретикулоциты, например, из размноженных in vitro, дифференцированных и безъядерных HSC.

В одном варианте осуществления эритроидные клетки представляют собой эритроциты, например, полученные из крови.

В одном варианте осуществления эритроидные клетки являются генетически модифицированными, например, клетки содержат полипептид, экспрессированный экзогенной нуклеиновой кислотой (например, ДНК или РНК, например, мРНК).

В одном варианте осуществления в эритроидные клетки инкапсулирован, например, загружен посредством гипотонической загрузки, экзогенный белок, средство, которое связывается с клеточным белком, ДНК или РНК.

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе безъядерная клетка представляет собой ретикулоцит, эритроцит или тромбоцит.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу введения средства субъекту, например, лечения субъекта, включающему введение препарата, композиции или клеток, описанных в данном документе, субъекту с осуществлением таким образом введения средства субъекту, например, с осуществлением лечения субъекта. В одном варианте осуществления способ включает обеспечение, например, путем создания или получения из другого объекта, препарата, композиции или клеток. В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке (например, безъядерной эритроидной клетке), описанной в данном документе, для применения в лечении заболевания или нарушения, например, заболевания или нарушения, описанного в данном документе. В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке (например, безъядерной эритроидной клетке), описанной в данном документе, для изготовления лекарственного препарата для лечения заболевания или нарушения, например, заболевания или нарушения, описанного в данном документе.

В одном варианте осуществления клетки являются аллогенными для субъекта.

В одном варианте осуществления клетки являются аутологичными для субъекта.

В одном варианте осуществления средство связано с клетками. В одном варианте осуществления средство предусматривает пептидное средство, например, полипептид, фермент или антитело. В одном варианте осуществления средство предусматривает цитокин, рецептор, лиганд, гормон, фактор роста, фактор крови, фермент лизосомного накопления, аспарагиназу или фрагмент любого из вышеуказанных, содержащий внеклеточный домен, домен связывания контрлиганда или другой биологически активный домен.

В одном варианте осуществления между присоединением средства к клеткам и введением клеток субъекту проходит менее чем 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 день.

В одном варианте осуществления клетки являются аутологичными, и между извлечением клетки у субъекта и введением клеток субъекту проходит менее чем 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 день.

В одном варианте осуществления по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 или 28 дней проходит между извлечением клетки у субъекта и введением клеток субъекту (например, тому же или другому субъекту).

В одном варианте осуществления способ включает оценивание субъекта и осуществление выбора средства для связывания с клеткой в соответствии с оценкой.

В вариантах осуществления стадия связывания происходит in vivo или ex vivo. Например, в вариантах осуществления связывающее средство вводят субъекту в условиях, которые обеспечивают возможность связывания связывающего реагента с клеткой, например, эритроидной клеткой. В некоторых вариантах осуществления средство, связанное со вторым связывающим реагентом, вводят субъекту в условиях, которые обеспечивают возможность связывания средства с клеткой, например, эритроидной клеткой.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения препарата, композиции или клеток, включающему получение из объекта идентификационных характеристик средства, например, средства, подходящего для лечения субъекта, и связывание средства с клеткой с помощью способа, описанного в данном документе, с получением таким образом препарата, композиции или клеток.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему одно или несколько из следующего: a) необязательно эритроидная клетка; b) первый связывающий реагент; c) второй связывающий реагент; d) средство; e) необязательно эритроидная клетка, связанная со связывающим реагентом; f) средство, связанное со связывающим реагентом; или g) реагент для обнаружения присутствия любого из a–f.

В одном варианте осуществления набор содержит одно или несколько из b, c, d, f и g.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к набору, содержащему: a) активированную клетку (например, эритроидную клетку), b) первое активированное средство, c) второе активированное средство и d) необязательно третье или дополнительные активированные средства.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу получения функционализированной клетки (например, функционализированной клетки, описанной в данном документе), включающему: a) получение инструкций от третьей стороны (например, врача, кабинета врача или больницы) для предоставления функционализированной клетки, имеющей одно или несколько указанных средств, b) приведение активированной клетки в контакт со средством или множеством (например, 2, 3, 4, 5, 10, 20 или больше) различных средств с получением таким образом функционализированной клетки и c) предоставление функционализированной клетки третьей стороне.

В некотором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения функционализированной клетки (например, функционализированной клетки, описанной в данном документе), включающему: a) передачу инструкций третьей стороне (например, лаборатории) для предоставления функционализированной клетки, имеющей одно или несколько указанных средств, b) получение функционализированной клетки от третьей стороны и c) введение функционализированной клетки субъекту, нуждающемуся в этом.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к клетке (например, эритроидной клетке и/или безъядерной клетке, например, безъядерной эритроидной клетке), содержащей:

средство (например, экзогенный полипептид) на клеточной поверхности и

линкер, например, остаточный линкер, ковалентно связывающий средство с клеточной поверхностью (например, с полипептидом или углеводом на клеточной поверхности), где остаточный линкер содержит характерный признак клик–химии.

В некоторых вариантах осуществления характерный признак клик–химии был образован как продукт реакции клик–химии. В некоторых вариантах осуществления характерный признак клик–химии имеет структуру характерного признака клик–химии, описанного в данном документе.

В настоящем изобретении предусмотрена в некоторых аспектах клетка (например, эритроидная клетка и/или безъядерная клетка, например, безъядерная эритроидная клетка), содержащая экзогенное полипептидное средство, ковалентно соединенное с клеточной поверхностью с помощью остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии, посредством боковой цепи аминокислоты белка, содержащегося в клетке, например, белка на клеточной поверхности, где характерный признак клик–химии был образован как продукт реакции клик–химии или имеет структуру характерного признака клик–химии, например, характерного признака клик–химии, описанного в данном документе.

В настоящем изобретении предусмотрена в некоторых аспектах клетка (например, эритроидная клетка и/или безъядерная клетка, например, безъядерная эритроидная клетка), содержащая:

множество экзогенных полипептидных средств, причем каждое экзогенное полипептидное средство из множества ковалентно соединено с клеточной поверхностью с помощью остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии,

где по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% экзогенных полипептидных средств на клетке соединены посредством боковой цепи аминокислоты с белком, содержащимся в клетке, например, белком на клеточной поверхности,

где характерный признак клик–химии был образован как продукт реакции клик–химии или имеет структуру характерного признака клик–химии, например, характерного признака клик–химии, описанного в данном документе.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении предусмотрена безъядерная эритроидная клетка, содержащая множество копий экзогенного полипептидного средства, ковалентно соединенных с клеточной поверхностью с помощью остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии, где характерный признак клик–химии был образован как продукт реакции клик–химии или имеет структуру характерного признака клик–химии, где применяется одно или несколько из списка 1 из данного документа. В некоторых вариантах осуществления клетка не содержит характерного признака сортазного переноса. В некоторых вариантах осуществления клетка не содержит характерного признака сортазного переноса, ковалентно соединенного с характерным признаком клик–химии.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении предусмотрена безъядерная эритроидная клетка, содержащая множество копий экзогенного полипептидного средства, ковалентно соединенных с клеточной поверхностью с помощью остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии, где характерный признак клик–химии был образован как продукт реакции клик–химии или имеет структуру характерного признака клик–химии, где по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80% или 90% из множества экзогенных полипептидных средств имеют одинаковую ориентацию относительно клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления клетка не содержит характерного признака сортазного переноса. В некоторых вариантах осуществления клетка не содержит характерного признака сортазного переноса, ковалентно соединенного с характерным признаком клик–химии. В некоторых вариантах осуществления клетка не является созданной с помощью генетической инженерии, например, не содержит полипептид, который был экспрессирован экзогенной нуклеиновой кислотой. В других вариантах осуществления клетка является созданной с помощью генетической инженерии, например, содержит полипептид, который был экспрессирован экзогенной нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления клетка не содержит неприродной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления клетка не содержит трансмембранный белок, имеющий неприродную аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления экзогенное полипептидное средство содержит π–зажим. В некоторых вариантах осуществления экзогенное полипептидное средство ковалентно соединено с безъядерной эритроидной клеткой посредством π–зажима. В некоторых вариантах осуществления экзогенное полипептидное средство содержит ncAA. В некоторых вариантах осуществления экзогенное полипептидное средство ковалентно соединено с безъядерной эритроидной клеткой посредством ncAA. В некоторых вариантах осуществления экзогенное полипептидное средство содержит два или более цистеиновых остатков. В некоторых вариантах осуществления экзогенное полипептидное средство ковалентно соединено с безъядерной эритроидной клеткой посредством двух или более цистеиновых остатков, например, посредством ThioLinker.

В некоторых вариантах осуществления экзогенное полипептидное средство представляет собой пептидный лиганд, который связывает партнера по связыванию.

В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно содержит второе средство, например, второе экзогенное полипептидное средство, например, где второе экзогенное полипептидное средство ковалентно соединено с клеточной поверхностью с помощью второго остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно содержит третье средство, например, третье экзогенное полипептидное средство, например, где третье экзогенное полипептидное средство ковалентно соединено с клеточной поверхностью с помощью второго остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии.

В некоторых вариантах осуществления средство, например, экзогенное полипептидное средство, ковалентно соединено с эндогенной молекулой клетки, например, с эндогенным полипептидом на клеточной поверхности.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80% или 90% экзогенных полипептидных средств ковалентно соединены с клеточной поверхностью в предварительно выбранной ориентации, например, присоединены одним и тем же фрагментом или фрагментами экзогенных полипептидных средств (например, N–концом, C–концом или конкретным остатком, например, конкретной ncAA, или конкретным множеством остатков, например, двумя цистеиновыми остатками). В некоторых вариантах осуществления препаратов, описанных в данном документе, по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80% или 90% экзогенных полипептидных средств в препарате ковалентно соединены с поверхностью безъядерной эритроидной клетки в предварительно выбранной ориентации, например, присоединены одним и тем же фрагментом или фрагментами экзогенных полипептидных средств (например, N–концом, C–концом или конкретным остатком, например, конкретной ncAA, или конкретным множеством остатков, например, двумя цистеиновыми остатками).

В некоторых вариантах осуществления средство, например, экзогенное полипептидное средство, ковалентно соединено с эндогенной молекулой клетки, например, с эндогенным полипептидом на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления линкер соединяет средство с эндогенной молекулой клетки, например, с эндогенным полипептидом или сахаром на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления линкер соединяет средство с экзогенной молекулой клетки, например, с экзогенным полипептидом или сахаром на клеточной поверхности.

В некоторых вариантах осуществления характерный признак клик–химии предусматривает циклический фрагмент, например, гетероцикл, такой как триазол, например, дизамещенный триазол или циклоаддукт. В некоторых вариантах осуществления характерный признак клик–химии предусматривает циклоалкен, такой как циклогексен, алкилсульфид, дигидропиразин, такой как 1,2–дигидропиразин, диазол или серосодержащее кольцо, такое как тиопиран.

В некоторых вариантах осуществления характерный признак клик–химии образован или может быть образован путем циклоприсоединения (например, 1,3–диполярного циклоприсоединения или гетерореакции циклоприсоединения Дильса–Альдера), нуклеофильного раскрытия кольца (например, раскрытия напряженных гетероциклических электрофилов, таких как азиридины, эпоксиды, циклические сульфаты, ионы азиридиния и ионы эписульфония), в химических реакциях карбонилов не альдольного типа (например, образование мочевин, тиомочевин, гидразонов, простых эфиров оксимов, амидов или ароматических гетероциклов) или в реакции присоединения к углерод–углеродной кратной связи (например, эпоксидирование, азиридинирование, дигидроксилирование, присоединение сульфенилгалогенида, присоединение нитозилгалогенида или присоединение Михаэля).

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу получения (например, изготовления) клетки (например, эритроидной клетки, например, безъядерной эритроидной клетки), функционализированной средством, включающему:

(a) получение активированной клетки, включающей клетку, связанную, например, ковалентно связанную, с первым связывающим фрагментом, например, первым функциональным для клик–химии компонентом,

(b) получение активированного средства, предусматривающего средство (например, экзогенный полипептид), связанное, например, ковалентно связанное, со вторым связывающим фрагментом, способным вступать в реакцию с первым связывающим фрагментом, например, вторым функциональным для клик–химии компонентом, способным вступать в реакцию с первым функциональным для клик–химии компонентом, и

(c) приведение активированной клетки в контакт с активированным средством с получением таким образом клетки, функционализированной средством.

В вариантах осуществления способ включает приведение клетки в контакт с первым связывающим реагентом, который содержит первый связывающий фрагмент, например, первый функциональный для клик–химии компонент, с получением таким образом активированной клетки. В вариантах осуществления способ включает приведение средства в контакт со вторым связывающим реагентом, который содержит второй связывающий фрагмент, например, второй функциональный для клик–химии компонент, с получением таким образом активированного средства. В вариантах осуществления способ включает осуществление синтеза средства таким образом, чтобы оно содержало второй связывающий фрагмент, например, второй функциональный для клик–химии компонент, например, путем включения неканонической аминокислоты. В вариантах осуществления способ включает получение клетки, содержащей первый связывающий фрагмент, например, путем включения неканонической аминокислоты, содержащей первый связывающий фрагмент, или путем включения сахара (например, в углевод), содержащего первый связывающий фрагмент.

В вариантах осуществления приведение клетки в контакт с первым связывающим реагентом происходит до или после приведения средства в контакт со вторым связывающим реагентом. В вариантах осуществления приведение клетки в контакт с первым связывающим реагентом и приведение средства в контакт со вторым связывающим реагентом происходят одновременно, например, начинаются одновременно, заканчиваются одновременно или частично перекрываются.

В вариантах осуществления первый связывающий реагент является непроникающим через мембрану. В вариантах осуществления второй связывающий реагент является непроникающим через мембрану. В вариантах осуществления для первого связывающего реагента мембрана является проницаемой. В вариантах осуществления для второго связывающего реагента мембрана является проницаемой.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к клетке, например, эритроидной клетке, например, безъядерной эритроидной клетке, полученной описанным в данном документе способом. В некоторых вариантах осуществления способ включает: (a) получение активированной клетки, предусматривающей клетку, ковалентно связанную с первым функциональным для клик–химии компонентом, (b) получение активированного средства, предусматривающего средство (например, экзогенный полипептид), ковалентно связанное со вторым функциональным для клик–химии компонентом, способным вступать в реакцию с первым функциональным для клик–химии компонентом, и (c) приведение активированной клетки в контакт с активированным средством с получением таким образом клетки, функционализированной средством.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания, включающему введение функционализированной клетки, описанной в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом.

В некоторых вариантах осуществления первый связывающий реагент содержит первый реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент, который вступает в реакцию с одним из следующих фрагментов на средстве:

a) первичный амин (–NH₂), например, в лизине или N–конец,

b) карбоксил (–COOH), например, в аспарагиновой кислоте, глутаминовой кислоте или C–конец,

c) сульфгидрил (–SH), например, в цистеине, или

d) карбонил (–CHO), например, кетоновая или альдегидная группа, например, в гликопротеине, например, окисленном гликопротеине.

В некоторых вариантах осуществления второй связывающий реагент содержит первый реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент, который вступает в реакцию с одним из следующих фрагментов на клетке (например, фрагментом белка или углевода на клетке):

a) первичный амин (–NH₂), например, в лизине или N–конец,

b) карбоксил (–COOH), например, в аспарагиновой кислоте, глутаминовой кислоте или C–конец,

c) сульфгидрил (–SH), например, в цистеине, или

d) карбонил (–CHO), например, кетоновая или альдегидная группа, например, в гликопротеине, например, окисленном гликопротеине.

В некоторых вариантах осуществления первый реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент и второй реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент вступают в реакцию с одним и тем же типом фрагмента, например, первый реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент вступает в реакцию с первым первичным амином, а второй реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент вступает в реакцию со вторым первичным амином. В некоторых вариантах осуществления первый реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент и второй реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент вступают в реакцию с разными типами фрагментов.

В некоторых вариантах осуществления первый или второй связывающий реагент содержит сайт, распознаваемый сортазой, например, N–концевой GGG или C–концевой LPXTG (SEQ ID NO: 1).

В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент (например, первый или второй связывающий реагент) содержит функциональный для клик–химии компонент. В вариантах осуществления функциональный для клик–химии компонент предусматривает алкин, например, напряженный алкин, например, циклооктин, например, сложный DBCO–сульфо–NHS–эфир. В некоторых вариантах осуществления функциональный для клик–химии компонент предусматривает азид, например, сложный сульфо–NHS–эфир 3–азидопропионовой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления способ согласно данному документу дополнительно включает приведение функционализированной клетки в контакт с реагентом для завершения синтеза, который содержит только один связывающий фрагмент, например, один функциональный для клик–химии компонент. В вариантах осуществления реагент для завершения синтеза может вступать в реакцию с не вступившими в реакцию функциональными для клик–химии на клетке с уменьшением таким образом количества не вступивших в реакцию функциональных для клик–химии компонентов на клетке. В вариантах осуществления реагент для завершения синтеза может вступать в реакцию с не вступившими в реакцию функциональными для клик–химии компонентами на средстве с уменьшением таким образом количества не вступивших в реакцию функциональных для клик–химии компонентов на средстве. В вариантах осуществления способ включает последовательное, в любом порядке, приведение в контакт функционализированной клетки с реагентом для завершения синтеза, который может вступать в реакцию с не вступившими в реакцию функциональными для клик–химии компонентами на клетке, и приведение в контакт функционализированной клетки с реагентом для завершения синтеза, который может вступать в реакцию с не вступившими в реакцию функциональными для клик–химии компонентами на средстве. В вариантах осуществления не вступивший в реакцию реагент для завершения синтеза вымывают в промежутке между двумя стадиями приведения в контакт. В вариантах осуществления реагент для завершения синтеза характеризуется более низкой молекулярной массой и/или меньшим стерическим затруднением, чем средство. В вариантах осуществления реагент для завершения синтеза содержит выявляемую метку. В некоторых вариантах осуществления реагент для завершения синтеза с выявляемой меткой приводят в контакт с аликвотой партии функционализированных клеток. В некоторых вариантах осуществления, если количество выявляемой метки, которая вступает в реакцию с функционализированной клеткой, ниже предварительно определенного порога, то партию одобряют или выпускают. В некоторых вариантах осуществления, если количество выявляемой метки, которая вступает в реакцию с функционализированной клеткой, превышает предварительно определенный порог, то партию изымают или подвергают дополнительной обработке, например, приводят в контакт с реагентом для завершения синтеза. В вариантах осуществления реагент для завершения синтеза содержит азидную или алкиновую группу. В вариантах осуществления после того, как реагент для завершения синтеза вступил в реакцию со средством или клеткой, он становится практически нереакционноспособным, например, не более реакционноспособным, чем N–конец гликофорина А дикого типа человека.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,5%, 99,8% или 99,9% безъядерных эритроидных клеток являются мечеными, например, где клетка считается меченой, если уровень средства выше, чем измеренный у 99% других аналогичных немеченых клеток.

В некоторых вариантах осуществления безъядерные эритроидные клетки являются меченными в среднем (или безъядерная эритроидная клетка, описанная в данном документе, является меченной) 50–200000 копиями средства на клетку, например, 50–100, 100–200, 200–500, 500–1000, 1000–2000, 2000–5000, 5000–10000, 10000–20000, 20000–50000, 50000–100000 или 100000–200000 копиями средства на клетку, или по меньшей мере 50, 100, 200, 500 1000, 2000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000 или 200000 копиями средства на клетку, или не более 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000 или 200000 копиями средства на клетку.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10⁷, 10⁸ или 10⁹ безъядерных эритроидных клеток являются мечеными.

В некоторых вариантах осуществления популяцию безъядерных эритроидных клеток метят с использованием по меньшей мере 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 или 500 нг средства, например, экзогенного полипептида.

В некоторых вариантах осуществления присоединенное полипептидное средство предусматривает антитело к PD–L1, антитело к α4β7, антитело к m41BBL, 4–1BBL, фактор VIIa, фактор Xa, аспарагиназу или пептид MOG.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 95, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% меченых эритроидных клеток связывают лиганд, например, в анализе с помощью проточной цитометрии из примера 6. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 95, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% безъядерных эритроидных клеток содержат средство, которое связывает лиганд, например, в анализе с помощью проточной цитометрии из примера 6. В вариантах осуществления считается, что клетка связывает лиганд в анализе с помощью проточной цитометрии из примера 6, если ее сигнал превышает сигнал, измеренный у 99% других аналогичных клеток, в которых отсутствует средство.

В вариантах осуществления средство соединено (например, смежно соединено без промежуточных атомов, или между средством и эндогенным полипептидом имеется один или несколько атомов) с аминокислотой эндогенного полипептида. В вариантах осуществления линкер имеет длину, составляющую по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нм. В вариантах осуществления линкер имеет длину, составляющую приблизительно 30–100, 40–90, 50–80 или 60–70 нм. В вариантах осуществления линкер имеет такую длину, что средство находится за пределами гликокаликса эритроидной клетки. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит PEG, например, PEG, имеющий длину, составляющую приблизительно 3–20, например, 4–13, например, приблизительно 4, 5, 12 или 13. В некоторых вариантах осуществления длина PEG–компонента составляет приблизительно 30–60 ангстрем, например, 30–40, 40–50 или 50–60 ангстрем. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит PEG, имеющий длину, составляющую приблизительно 50–200, 200–400, 400–600, 600–800 или 800–1000 ангстрем.

В некоторых вариантах осуществления применяется одно или несколько из списка 1, где список 1 представляет собой:

a) средство соединено (например, посредством остаточного линкера) с аминокислотой, отличной от глицина эндогенного мембранного белка, например, соединено с по меньшей мере одним отличным от глицина остатком;

b) средство соединено (например, посредством остаточного линкера) с сайтом, отличным от N–конца или C–конца эндогенного мембранного белка;

c) средство соединено (например, посредством остаточного линкера) с сайтом, отличным от N–конца или C–конца мембранного белка;

d) средство соединено (например, посредством остаточного линкера) с полноразмерным эндогенным мембранным белком;

e) средство соединено с по меньшей мере 10, 20, 50 или 100 полипептидами, отличающимися по последовательности, например, эндогенными полипептидами;

f) клетка, функционализированная средством, не содержит характерного признака сортазного переноса (т. е. последовательности, которая может быть создана с помощью реакции с участием сортазы), такого как LPXTG (SEQ ID NO: 1);

g) средство не соединено с характерным признаком сортазного переноса,

h) по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% средств на клетке не соединены с характерным признаком сортазного переноса,

i) характерный признак клик–химии не соединен с характерным признаком сортазного переноса,

j) по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% характерных признаков клик–химии на клетке не соединены с характерным признаком сортазного переноса,

k) средство не соединено с характерным признаком внеклеточного сортазного переноса;

l) по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% средств на клетке не соединены с характерным признаком внеклеточного сортазного переноса,

m) характерный признак клик–химии не соединен с характерным признаком внеклеточного сортазного переноса,

n) по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% характерных признаков клик–химии на клетке не соединены с характерным признаком внеклеточного сортазного переноса,

o) средство не соединено с характерным признаком внеклеточного сортазного переноса, который находится в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 или 100 аминокислот от трансмембранного сегмента;

p) по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% средств на клетке не соединены с характерным признаком внеклеточного сортазного переноса, который находится в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 или 100 аминокислот от трансмембранного сегмента,

q) характерный признак клик–химии не соединен с характерным признаком внеклеточного сортазного переноса, который находится в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 или 100 аминокислот от трансмембранного сегмента;

r) по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% характерных признаков клик–химии на клетке не соединены с характерным признаком внеклеточного сортазного переноса, который находится в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 или 100 аминокислот от трансмембранного сегмента;

s) средство не соединено с характерным признаком сортазного переноса, который находится в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 или 100 аминокислот от средства,

t) по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% средств на клетке не соединены с характерным признаком сортазного переноса, который находится в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 или 100 аминокислот от средства,

u) характерный признак клик–химии не соединен с характерным признаком сортазного переноса, который находится в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 или 100 аминокислот от характерного признака клик–химии,

v) по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% характерных признаков клик–химии на клетке не соединены с характерным признаком сортазного переноса, который находится в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 или 100 аминокислот от характерного признака клик–химии,

w) полипептид, например, эндогенный полипептид, с которым соединено средство, не содержит характерного признака сортазного переноса в положении, соответствующем N– или С–концу;

x) по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% средств на клетке соединены посредством боковой цепи аминокислоты белка, содержащегося в клетке, например белка на клеточной поверхности, где в одном варианте осуществления боковая цепь представляет собой боковую цепь лизина, цистеина, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты, связанную так, что по меньшей мере один атом боковой цепи аминокислоты расположен между средством и остовом белка,

y) средство соединено с полипептидом (например, эндогенным белком) на клеточной поверхности,

z) функционализированная клетка не вступала в контакт с сортазой,

aa) функционализированная клетка не содержит характерного признака сортазного переноса, который предусматривает связь, образованную внеклеточно,

bb) по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% характерных признаков клик–химии на клетке были получены в результате реакции клетки со связывающим реагентом, или

cc) где клетка получена с помощью способа, который не включает приведения клетки в контакт с неприродным сахаром, например, сахаром, содержащим функциональный для клик–химии компонент, или их комбинацией.

В некоторых вариантах осуществления клетка содержит более 1000, 5000, 5000, 10000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000 или 500000 копий средства.

В некоторых вариантах осуществления:

i) средство характеризуется скоростью выведения, при которой по меньшей мере 20% средства остается в кровеносной системе субъекта в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней,

ii) популяция клеток характеризуется скоростью выведения, при которой по меньшей мере 20% средства остается в кровеносной системе субъекта в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней,

iii) популяция клеток характеризуется скоростью выведения, при которой по меньшей мере 20% функциональных эритроидных клеток остается в кровеносной системе субъекта в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней;

iv) средство характеризуется скоростью выведения, при которой по меньшей мере 20% средства, находящегося в кровеносной системе субъекта спустя 1 день, остается в кровеносной системе спустя еще 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14 или 21 день;

iv) популяция клеток характеризуется скоростью выведения, при которой по меньшей мере 20% средства, находящегося в кровеносной системе субъекта спустя 1 день, остается в кровеносной системе спустя еще 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14 или 21 день;

iv) популяция клеток характеризуется скоростью выведения, при которой по меньшей мере 20% популяции клеток, находящихся в кровеносной системе субъекта спустя 1 день, остается в кровеносной системе спустя еще 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14 или 21 день.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% эритроидных клеток в популяции являются безъядерными.

В некоторых вариантах осуществления клетки не являются клетками, подвергнутыми гипотонической загрузке.

В некоторых вариантах осуществления безъядерная эритроидная клетка обладает одной или несколькими из следующих характеристик:

a) осмотическая хрупкость, соответствующая лизису менее 50% клеток при 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45% или 0,5% NaCl;

b) объем клетки приблизительно 10–200 фл, или диаметр клетки от приблизительно 1 микрона до приблизительно 20 микронов, от приблизительно 2 микронов до приблизительно 20 микронов, от приблизительно 3 микронов до приблизительно 20 микронов, от приблизительно 4 микронов до приблизительно 20 микронов, от приблизительно 5 микронов до приблизительно 20 микронов, от приблизительно 6 микронов до приблизительно 20 микронов, от приблизительно 5 микронов до приблизительно 15 микронов или от приблизительно 10 микронов до приблизительно 30 микронов;

c) более чем 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10% фетального гемоглобина; или по меньшей мере приблизительно 20, 25 или 30 пг гемоглобина/клетка; или

d) содержание фосфатидилсерина в наружном слое составляет менее чем 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% при измерении с помощью окрашивания аннексином V.

В некоторых вариантах осуществления остаточный линкер или характерный признак клик–химии находятся в пределах 1, 2, 5, 10, 20 или 50 атомов от аминокислоты (например, канонической аминокислоты) полипептида на клетке. В некоторых вариантах осуществления остаточный линкер или характерный признак клик–химии не находятся в пределах 1, 2, 5, 10, 20 или 50 атомов от углеводного фрагмента клетки. В некоторых вариантах осуществления средство соединено с полипептидом, который не гликозилирован. В некоторых вариантах осуществления средство соединено с боковой цепью аминокислоты, N–концом или C–концом полипептида, который гликозилирован.

В некоторых вариантах осуществления остаточный линкер не находится в пределах 1, 2, 5, 10, 20 или 50 атомов от маннозного фрагмента на клетке. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% остаточных линкеров или характерных признаков клик–химии на клетке не находятся в пределах 1, 2, 5, 10, 20 или 50 атомов от маннозного фрагмента на клетке. В некоторых вариантах осуществления остаточный линкер соединен с по меньшей мере двумя (например, 3, 4, 5 или больше) типами сахара на клетке. Например, первый остаточный линкер может находиться в пределах 1, 2, 5, 10, 20 или 50 атомов от первого фрагмента сахара на клетке, а второй остаточный линкер может находиться в пределах 1, 2, 5, 10, 20, или 50 атомов от второго фрагмента сахара на клетке.

В некоторых вариантах осуществления клетка не является созданной с помощью генетической инженерии.

В некоторых вариантах осуществления клетка не содержит неканоническую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления менее 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% или 0,0001% аминокислот в клетке являются неканоническими аминокислотами.

В настоящем изобретении подразумеваются все комбинации любого одного или нескольких из вышеприведенных аспектов и/или вариантов осуществления, а также комбинации с любым одним или несколькими вариантами осуществления, изложенными в разделах "Подробное описание" и "Примеры".

Хотя при осуществлении настоящего изобретения на практике или его испытании можно применять способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все ссылки на публикации, заявки на патент, патенты и другие документы (например, регистрационные номера в базах данных последовательностей), упомянутые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. Например, все последовательности из GenBank, Unigene, NCBI и Entrez, упоминаемые в данном документе, например, в любой таблице в данном документе, включены посредством ссылки. Если не указано иное, номера доступа для последовательностей, указанные в данном документе, в том числе в любой таблице в данном документе, относятся к записям в базе данных, актуальным на 7 августа 2017 года. Если для одного гена или белка указаны ссылки на несколько номеров доступа последовательностей, то включены все варианты последовательности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

ФИГ. 1 представляет собой диаграмму, на которой показан способ присоединения средства к клетке с применением клик–химии. Активированное средство можно получить, например, путем приведения средства в контакт с первым связывающим реагентом, имеющим первый реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент и первый связывающий фрагмент, который является функциональным для клик–химии компонентом, и обеспечения возможности осуществления реакции первого реакционноспособного в отношении субстрата фрагмента со средством. Активированную клетку можно получить, например, путем приведения клетки в контакт со вторым связывающим реагентом, имеющим второй реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент и второй связывающий фрагмент, который является функциональным для клик–химии компонентом, и обеспечения возможности осуществления реакции второго реакционноспособного в отношении субстрата фрагмента с клеткой. Активированное средство и активированную клетку затем объединяют в условиях, обеспечивающих возможность осуществления реакции первого функционального для клик–химии компонента со вторым функциональным для клик–химии компонентом с получением остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии.

ФИГ. 2A–2C представляют собой изображения проточной цитометрии эритроидных клеток, которые были связаны с иллюстративным средством (антителом к α4β7) с применением связывающих реагентов, описанных в данном документе.

ФИГ. 3 представляет собой график, показывающий процентную долю опухолевых клеток, связанных с эритроидными клетками, функционализированными антителом к PD–L1, или контрольными клетками, функционализированными антителом изотипического контроля.

На ФИГ. 4 представлена временная динамика размера опухоли у мышей, обработанных RCT с 41BBL, и у необработанного контроля.

ФИГ. 5 представляет собой график, показывающий уровни аспарагина в сыворотке крови с течением времени у мышей C57BL/6, обработанных RCT с аспарагиназой.

ФИГ. 6 представляет собой график, показывающий уровни аспарагина в сыворотке крови с течением времени у мышей Rag1–/–, обработанных RCT с аспарагиназой.

ФИГ. 7A и 7B представляют собой графики, показывающие флуоресценцию во времени у мышей, обработанных Cy5–меченным RCT с аспарагиназой. ФИГ. 7A, высокая доза mRBC с ASN–азой; ФИГ. 7B, низкая доза mRBC с ASN–азой.

ФИГ. 8A и 8B представляют собой графики, показывающие, что ориентированное мечение 41BBL мыши с HIS6 с применением функционального для клик–химии компонента ThioLinker приводит к повышению функциональной активности связанных клеток. ФИГ. 8A, секреция IL–2; ФИГ. 8B, секреция интерферона–γ.

На ФИГ. 9A и 9B показано сайт–специфичное включение неканонической аминокислоты экзо(BCN)–лизина в 41BBL мыши для создания применимого в клик–химии 41BBL мыши. ФИГ. 9A, химическая структура экзо(BCN)–лизина; ФИГ. 9B, вестерн–блот, показывающий, что 41BBL мыши, подвергнутый клик–химии, получали при концентрациях экзо(BCN)–лизина, составляющих 1 мМ или выше.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описаны композиции и способы, которые включают функционализацию эритроидных клеток с применением селективных биосовместимых реакций для связывания клеток со средством (например, пептидным средством), представляющим интерес. В некоторых вариантах осуществления реакции представляют собой реакции циклоприсоединения (например, реакцию 1,3–диполярного циклоприсоединения Хьюсгена) с применением реагентов, которые являются водорастворимыми и непроникающим через мембрану.

Определения

Используемый в данном документе термин "характерный признак клик–химии" относится к множеству атомов, расположенных между объектом A и объектом B и ковалентно соединяющих их, где характерный признак клик–химии образован как продукт реакции клик–химии, который соединяет объект A и объект B. В варианте осуществления характерный признак клик–химии имеет структуру характерного признака клик–химии, который образован как продукт реакции клик–химии, который соединяет объект A и объект B, но без ограничения характерным признаком клик–химии, полученным любым конкретным способом, например, без ограничения характерным признаком клик–химии, образованным с помощью реакции клик–химии, но может быть образован или обеспечен другим способом. В одном варианте осуществления характерный признак клик–химии представляет собой характерный признак алкин/азидной реакции клик–химии, например, характерный признак клик–химии предусматривает триазол.

Используемый в данном документе термин "реакция клик–химии" относится к ряду реакций, используемых для ковалентного соединения первого и второго фрагментов для удобного получения соединенных продуктов. Обычно она обладает одной или несколькими из следующих характеристик: она быстрая, специфичная, с высоким выходом, эффективная, самопроизвольная, существенно не изменяет биосовместимость соединенных объектов, имеет высокую скорость реакции, дает стабильный продукт, способствует получению одного продукта реакции, имеет высокую атомную экономичность, является хемоселективной, модульной, стереоселективной, нечувствительной к кислороду, нечувствительной к воде, с высокой чистой, обеспечивает образование только безвредных или относительно нетоксичных побочных продуктов, которые можно удалить отличными от хроматографических способами (например, кристаллизацией или дистилляцией), не требует растворителя или может проводится в растворителе, который является неопасным или физиологически совместимым, например, в воде, стабильна в физиологических условиях. Примеры включают алкин/азидную реакцию, диен/диенофильную реакцию или тиол/алкеновую реакцию. Можно использовать другие реакции. В некоторых вариантах осуществления реакция клик–химии является быстрой, специфичной и с высоким выходом. Например, в вариантах осуществления быстрая реакция клик–химии характеризуется константой скорости прямой реакции второго порядка, составляющей 10–200 M^–1с^–1, 1–20 M^–1с^–1 или по меньшей мере 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50, 60, 100, 200, 500, 1E3, 2E3, 5E3, 1E4, 2E4, 5E4, 1E5, 2E5, 5E5 или 1E6 M^–1с^–1, например, при 20°C в PBS. В некоторых вариантах осуществления специфичной реакцией клик–химии является реакция, в которой при приведении немодифицированной клетки (например, красной кровяной клетки человека, выделенной из периферического кровотока) в контакт со средством, имеющим функциональный для клик–химии компонент, менее 10%, 5%, 4% 3%, 2% или 1% клеток выявляемым образом соединяются со средством, например, после осуществления реакции продолжительностью 1 час при 20°C в PBS, например, в анализе из примера 21. В некоторых вариантах осуществления реакция клик–химии с высоким выходом представляет собой реакцию, которая имеет выход по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, например, для реакции продолжительностью 1 час при 20°С в PBS.

Используемый в данном документе термин "функциональный для клик–химии компонент" относится к химическому фрагменту, который способен вступать в реакцию со вторым функциональным для клик–химии компонентом с получением характерного признака клик–химии. В вариантах осуществления функциональный для клик–химии компонент состоит из связывающего реагента, и при этом связывающий реагент может дополнительно содержать реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент.

Как используется в данном документе, "характерный признак сортазного переноса" представляет собой последовательность, которая может быть создана с помощью реакции с участием сортазы, которая обеспечивает соединение первого мотива, распознаваемого сортазой, со вторым мотивом, распознаваемым сортазой, где характерный признак сортазного переноса содержит аминокислотную последовательность первого мотива, распознаваемого сортазой, и аминокислотную последовательность второго мотива, распознаваемого сортазой, за исключением любых аминокислот (например, Gly–Gly), удаленных во время реакции с участием сортазы. Например, в результате опосредованной сортазой реакции LPXTGG (SEQ ID NO: 2) с (G)_n может быть получен характерный признак сортазного переноса LPXT(G)_n (SEQ ID NO: 1).

Клетки

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим функционализированные клетки, и способам их применения. В вариантах осуществления клетки предусматривают эритроидные клетки. В вариантах осуществления клетка является отличной от тромбоцита, предшественника тромбоцита или прогениторной клетки тромбоцита. В вариантах осуществления клетки являются ядросодержащими или безъядерными. В вариантах осуществления клетки представляют собой эукариотические клетки, например, клетки млекопитающего, например, клетки человека. В вариантах осуществления клетки включают T–клетки (например, CD4 T–клетки или CD8 T–клетки), B–клетки, естественные клетки–киллеры, естественные киллерные T–клетки, миелоидные клетки, дендритные клетки, тромбоциты или нейтрофилы. В вариантах осуществления клетки включают клетки, происходящие из эндодермы, клетки, происходящие из эктодермы, или клетки, происходящие из мезодермы. В вариантах осуществления клетки включают стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, нейральные стволовые клетки, кардиомиоциты, клетки для аллогенного трансплантата, клетки для ксеногенного трансплантата или панкреатические бета–клетки.

Эритроидные клетки

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим функционализированные эритроидные клетки, и способам их применения. "Эритроидные клетки", как используется в данном документе, представляют собой клетки эритроцитарного ряда, включая гемопоэтические стволовые клетки (HSC) и ядросодержащие и безъядерные предшественники красных кровяных клеток, безъядерные красные кровяные клетки и любые промежуточные варианты между HSC и безъядерными красными кровяными клетками. В одном варианте осуществления эритроидная клетка представляет собой проэритробласт, базофильный эритробласт, полихроматофильный эритробласт, ортохромный эритробласт, ретикулоцит и эритроцит. В одном варианте осуществления эритроидная клетка представляет собой стволовую клетку пуповинной крови, CD34+ клетку, гемопоэтическую стволовую клетку (HSC), колониеобразующую клетку селезенки (CFU–S), общую миелоидную прогениторную клетку (CMP), колониеобразующую клетку–бластоцит, эритроидную взрывообразующую единицу (BFU–E), эритро–мегакариоцитарную прогениторную клетку (MEP), эритроидную колониеобразующую единицу (CFU–E), ретикулоцит, эритроцит, индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), мезенхимальную стволовую клетку (MSC), полихромный нормобласт, ортохромный нормобласт или их комбинацию.

В вариантах осуществления эритроидные клетки представляют собой бессмертные или иммортализованные клетки или происходят от них. Например, иммортализованные клетки, представляющие собой эритробласты, можно получить с помощью ретровирусной трансдукции гемопоэтических CD34+ прогениторных клеток с обеспечением экспрессии Oct4, Sox2, Klf4, cMyc и супрессии TP53 (например, как описано в Huang et al. (2013) Mol Ther, предварительная электронная публикация 3 сентября).

В вариантах осуществления эритроидные клетки могут быть предназначены для аутологического применения или обеспечивать источник для аллогенного переливания. В некоторых вариантах осуществления эритроидные клетки культивируются. В одном варианте осуществления эритроидная клетка представляет собой безъядерную красную кровяную клетку.

В вариантах осуществления эритроидную клетку получают из биологического образца, например, эритроцитов из крови человека или HSC из костного мозга.

В вариантах осуществления эритроидную клетку получают в способе ex–vivo или in vitro, например, в ходе которого клетки–предшественники, например, гемопоэтические стволовые клетки (например, гемопоэтические стволовые клетки человека, выделенные из костного мозга, стимулированной цитокинами периферической крови или пуповинной крови) размножают и/или дифференцируют и лишают ядра ex vivo с получением, например, ретикулоцитов. Способы получения еx vivo безъядерных эритроидных клеток (например, ретикулоцитов) из стволовых клеток описаны, например, в Migliaccio and Palis (2011) Drug Discov Today Dis Mech. 8(1–2): e3–e8; WO2015/073587 и WO2015/153102, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Эритроидные клетки, например, ретикулоциты, полученные этим способом, можно функционализировать в соответствии со способами, описанными в данном документе.

В одном варианте осуществления безъядерная клетка представляет собой клетку, которая была лишена своего ядра в результате дифференцировки из клетки–предшественника, например, гемопоэтической стволовой клетки (например, CD34+ клетки), общей миелоидной прогениторной клетки (CMP), эритро–мегакариоцитарной прогениторной клетки (MEP), эритроцитарной взрывообразующей единицы (BFU–E), эритроцитарной колониеобразующей единицы (CFU–E), проэритробласта, раннего базофильного эритробласта, позднего базофильного эритробласта, полихромного эритробласта или ортохромного эритробласта или индуцированной плюрипотентной клетки, в ретикулоцит или зрелую красную кровяную клетку. В одном варианте осуществления безъядерная клетка представляет собой клетку, которая была лишена своего ядра в результате дифференцировки in vitro из клетки–предшественника, например, гемопоэтической стволовой клетки (например, CD34+ клетки), общей миелоидной прогениторной клетки (CMP), эритро–мегакариоцитарной прогениторной клетки (MEP), эритроцитарной взрывообразующей единицы (BFU–E), эритроцитарной колониеобразующей единицы (CFU–E), проэритробласта, раннего базофильного эритробласта, позднего базофильного эритробласта, полихромного эритробласта или ортохромного эритробласта или индуцированной плюрипотентной клетки, в ретикулоцит или зрелую красную кровяную клетку.

Эритроидная клетка, применяемая в описанных в данном документе способах функционализации, может быть немодифицированой или может быть модифицированой, например, созданной с помощью генетической инженерии (например, созданной с помощью генетической инженерии с возможностью экспрессии экзогенного белка); в нее может быть инкапсулирован, например, загружен посредством гипотонической загрузке, экзогенный белок. Эритроидная клетка, применяемая в описанных в данном документе способах лечения, может быть аутологической, аллогенной или ксеногенной.

Иллюстративные клетки для применения в препаратах, соединениях, способах и наборах, описанных в данном документе, описаны в данном документе. В одном варианте осуществления клетка, например, эритроидная клетка, например, эритроцит, обладает одним или несколькими из следующих свойств: а) она получена из крови, культуры in vitro или была дифференцирована из более примитивного типа клеток in vitro, например, гемопоэтической стволовой клетки; b) она была подвергнута гипотонической загрузке средством; или с) она представляет собой эритроидную клетку, созданную с помощью генетической инженерии, например, экспрессирующую экзогенное средство, например, полипептид.

В одном варианте осуществления клетка дифференцирована из более примитивного типа клеток in vitro, например, гематопоэтической стволовой клетки.

В одном варианте осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку, созданную с помощью генетической инженерии, например, экспрессирующую экзогенное средство, например, полипептид.

В одном варианте осуществления клетка представляет собой эритроцит, полученный из крови.

В одном варианте осуществления клетка была подвергнута гипотонической загрузке средством.

В одном варианте осуществления клетка получена из культуры in vitro.

В одном варианте осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку, созданную с помощью генетической инженерии, например, экспрессирующую экзогенное средство, например, полипептид.

Физические свойства безъядерных эритроидных клеток

В некоторых вариантах осуществления безъядерные эритроидные клетки, описанные в данном документе, характеризуются одним или несколькими (например, 2, 3, 4 или более) физическими свойствами, описанными в данном документе, например, осмотической хрупкостью, размером клетки, концентрацией гемоглобина или содержанием фосфатидилсерина. При этом, не желая ограничиваться теорией, в некоторых вариантах осуществления безъядерная эритроидная клетка, описанная в данном документе, характеризуется физическими свойствами, которые аналогичны физическим свойствам необработанной эритроидной клетки дикого типа. В противоположность этому, эритроидная клетка, подвергнутая гипотонической загрузке, иногда проявляет аберрантные физические свойства, такие как повышение осмотической хрупкости, изменение размера клетки, снижение концентрации гемоглобина или повышение уровней фосфатидилсерина на наружном слое клеточной мембраны.

В некоторых вариантах осуществления эритроидная клетка находится в композиции, в которой отсутствует стабилизатор.

Осмотическая хрупкость

В некоторых вариантах осуществления безъядерная эритроидная клетка проявляет фактически такую же осмотическую хрупкость мембраны, что и выделенная, не подвергаемая культивированию безъядерная эритроидная клетка. В некоторых вариантах осуществления популяция безъядерных эритроидных клеток, характеризуется осмотической хрупкостью, соответствующей лизису менее 50% клеток при 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45% или 0,5% NaCl. В некоторых вариантах осуществления осмотическую хрупкость определяют с применением способа из примера 59 в WO2015/073587.

Размер клетки

В некоторых вариантах осуществления безъядерная эритроидная клетка характеризуется примерно таким же диаметром или объемом, что и необработанная эритроидная клетка дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления популяция эритроидных клеток характеризуется средним диаметром, составляющим приблизительно 4, 5, 6, 7 или 8 микрон, и необязательно стандартное отклонение в популяции составляет менее 1, 2 или 3 микрон. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько эритроидных клеток характеризуются диаметром, составляющим приблизительно 4–8, 5–7 или приблизительно 6 микрон. В некоторых вариантах осуществления диаметр эритроидной клетки составляет менее чем приблизительно 1 микрон, более чем приблизительно 20 микрон, от приблизительно 1 микрона до приблизительно 20 микрон, от приблизительно 2 микрон до приблизительно 20 микрон, от приблизительно 3 микрон до приблизительно 20 микрон, от приблизительно 4 микрон до приблизительно 20 микрон, от приблизительно 5 микрон до приблизительно 20 микрон, от приблизительно 6 микрон до приблизительно 20 микрон, от приблизительно 5 микрон до приблизительно 15 микрон или от приблизительно 10 микрон до приблизительно 30 микрон. В некоторых вариантах осуществления диаметр клетки измеряют с применением гематологической системы Advia 120.

В некоторых вариантах осуществления показатель среднеклеточного объема у эритроидной клетки превышает 10 фл, 20 фл, 30 фл, 40 фл, 50 фл, 60 фл, 70 фл, 80 фл, 90 фл, 100 фл, 110 фл, 120 фл, 130 фл, 140 фл, 150 фл или превышает 150 фл. В одном варианте осуществления среднеклеточный объем у эритроидной клетки составляет менее 30 фл, 40 фл, 50 фл, 60 фл, 70 фл, 80 фл, 90 фл, 100 фл, 110 фл, 120 фл, 130 фл, 140 фл, 150 фл, 160 фл, 170 фл, 180 фл, 190 фл, 200 фл или менее 200 фл. В одном варианте осуществления среднеклеточный объем у эритроидных клеток составляет 80–100, 100–200, 200–300, 300–400 или 400–500 фемтолитров (фл). В некоторых вариантах осуществления популяция эритроидных клеток характеризуется среднеклеточным объемом, установленным в данном разделе, и стандартное отклонение в популяции составляет менее 50, 40, 30, 20, 10, 5 или 2 фл. В некоторых вариантах осуществления среднеклеточный объем измеряют с применением прибора для осуществления гематологических анализов, например, анализатора Coulter.

Концентрация гемоглобина

В некоторых вариантах осуществления безъядерная эритроидная клетка характеризуется содержанием гемоглобина, аналогичным содержанию гемоглобина в необработанной эритроидной клетке дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эритроидные клетки содержат более 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или более 10% фетального гемоглобина. В некоторых вариантах осуществления эритроидные клетки содержат по меньшей мере приблизительно 20, 22, 24, 26, 28 или 30 пг и необязательно не более чем приблизительно 30 пг общего гемоглобина. В некоторых вариантах осуществления уровни гемоглобина определяют с применением способа с использованием реактива Драбкина из примера 33 в WO2015/073587.

Содержание фосфатидилсерина

В некоторых вариантах осуществления безъядерная эритроидная клетка имеет примерно такое же содержание фосфатидилсерина на наружном слое своей клеточной мембраны, что и необработанная эритроидная клетка дикого типа. Фосфатидилсерин преимущественно находится на внутреннем слое клеточной мембраны необработанной эритроидной клетки дикого типа, а гипотоническая загрузка может приводить к перемещению фосфатидилсерина к наружному слою, где он может запускать иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления популяция эритроидных клеток содержит менее чем приблизительно 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% клеток, которые являются положительными по окрашиванию аннексином V. В некоторых вариантах осуществления появление фосфатидилсерина на поверхности оценивают с помощью окрашивания аннексином–V–FITC, который связывается предпочтительно с PS, и измерения флуоресценции FITC с помощью проточной цитометрии, например, с применением способа из примера 54 в WO2015/073587.

Другие свойства

В некоторых вариантах осуществления популяция эритроидных клеток содержит по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% (и необязательно не более 90 или 100%) клеток, которые являются положительными по GPA. В некоторых вариантах осуществления присутствие GPA выявляют с применением FACS.

В некоторых вариантах осуществления безъядерные эритроидные клетки характеризуются временем полужизни в организме субъекта, составляющим по меньшей мере 30, 45 или 90 дней.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, содержащая эритроидные клетки, содержит менее чем приблизительно 10, 5, 4, 3, 2 или 1% эхиноцитов.

В некоторых вариантах осуществления эритроидная клетка является безъядерной. В некоторых вариантах осуществления клетка, например, эритроидная клетка, содержит ядро, которое является нефункциональным, например, было инактивировано.

Универсальные донорные эритроидные клетки

В некоторых вариантах осуществления эритроидные клетки, описанные в данном документе, являются аутологическими или аллогенными для субъекта, которому эти клетки будут вводиться. Например, эритроидные клетки, аллогенные для субъекта, охватывают одну или несколько эритроидных клеток, специфических по группе крови (например, клетки могут принадлежать к той же группы крови, что и кровь субъекта) или одну или несколько универсальных донорных эритроидных клеток. В некоторых вариантах осуществления безъядерные эритроидные клетки, описанные в данном документе, характеризуются сниженной иммуногенностью по сравнению с эталонной клеткой, например, характеризуются меньшими уровнями одного или нескольких антигенов группы крови.

Если для переливания применяют аллогенные клетки, можно выбрать совместимую группу крови по системе ABO для предотвращения острой внутрисосудистой гемолитической трансфузионной реакции. Группы крови по системе ABO определяются на основании присутствия или отсутствия антигенов группы крови A и B, моносахаридных углеводных структур, которые находятся на концах олигосахаридных цепей, сопряженных с гликопротеинами и гликолипидами на поверхности эритроцитов (обзор в Liu et al., Nat. Biotech. 25:454–464 (2007)). Поскольку эритроциты группы O не содержат ни антиген A, ни антиген B, их можно безопасно переливать реципиентам с любой группой крови по системе ABO, например, реципиентам с группой A, B, AB или O. Эритроциты группы O считаются универсальными и их можно применять при всех случаях переливания крови. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления эритроидная клетка, описанная в данном документе, является клеткой группы O. В противоположность этому, эритроидные клетки группы A можно вводить реципиентам с группой A и AB, эритроидные клетки группы B можно вводить реципиентам с группой B и AB, а эритроидные клетки группы AB можно вводить реципиентам с группой AB.

В некоторых случаях целесообразным может быть превращение эритроидной клетки, не относящейся к группе O, в клетку универсальной группы крови. Ферментативное удаление иммунодоминантных моносахаридов с поверхности эритроцитов группы A и группы B можно применять для получения популяции эритроидных клеток, подобных клеткам группы O (см., например, Liu et al., Nat. Biotech. 25:454–464 (2007)). Эритроидные клетки группы B можно превращать с применением α–галактозидазы, полученной из необжаренных кофейных зерен. В качестве альтернативы или дополнительно ферментативную активность α–N–ацетилгалактозаминидазы и α–галактозидазы, полученных из бактерий E. meningosepticum, можно применять для удаления иммунодоминантных антигенов A и B соответственно (Liu et al., Nat. Biotech. 25:454–464 (2007)), если они присутствуют на эритроидных клетках. В одном примере массу эритроидных клеток, выделенных так, как описано в данном документе, инкубируют в 200 мМ глицине (pH 6,8) и 3 мМ NaCl в присутствии либо α–N–ацетилгалактозаминидазы, либо α–галактозидазы (плотность массы эритроидных клеток составляет приблизительно 300 мкг/мл) в течение 60 мин при 26°C. После обработки эритроидные клетки промывают 3–4 полосканиями в физиологическом растворе с центрифугированием и определяют группу крови по системы ABO в соответствии со стандартными методиками консервации крови.

Хотя система групп крови ABO является наиболее важной при переливании и трансплантации, в некоторых вариантах осуществления может быть полезным совпадение группы крови у эритроидных клеток, подлежащих введению, и у реципиента по другим системам, или отбор или получение эритроидных клеток, которые являются универсальными по одной или нескольким другим (например, минорным) системам групп крови. Второй системой групп крови является система Rh, в которой индивидуум может быть Rh+ или Rh–. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления эритроидная клетка, описанная в данном документе, является Rh–. В некоторых вариантах осуществления эритроидная клетка представляет собой эритроидную клетку группы O и Rh–.

В некоторых вариантах осуществления эритроидная клетка, описанная в данном документе, является отрицательной в отношении одного или нескольких антигенов минорных групп крови, например, Le(a−b−) (по системе антигенов Льюиса), Fy(a–b–) (по системе Даффи), Jk(a–b–) (по системе Кидд), M–N– (по системе MNS), K–k– (по системе Келл), Lu(a–b–) (по системе Лютера) и отрицательной по H–антигену (фенотип Бомбей) или их любой комбинации. В некоторых вариантах осуществления эритроидная клетка также представляет собой эритроидную клетку группы O и/или Rh–. Минорные системы групп крови описаны, например, в Agarwal et al "Blood group phenotype frequencies in blood donors from a tertiary care hospital in north India" Blood Res. 2013 Mar; 48(1): 51–54 и Mitra et al "Blood groups systems" Indian J Anaesth. 2014 Sep–Oct; 58(5): 524–528, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Композиции эритроидных клеток

В некоторых вариантах осуществления популяция эритроидных клеток содержит по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98% (и необязательно не более чем приблизительно 80, 90 или 100%) безъядерных эритроидных клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция эритроидных клеток содержит менее 1% живых ядросодержащих клеток, например, не содержит выявляемого количества живых ядросодержащих клеток. В некоторых вариантах осуществления количество безъядерных клеток измеряют с помощью FACS с применением окрашивания ядра. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80% (и необязательно не более чем приблизительно 70, 80, 90 или 100%) эритроидных клеток в популяции содержат одно или несколько (например, 2, 3, 4 или более) средств. Присутствие средства измеряют в некоторых вариантах осуществления с помощью FACS с применением меченого белка (например, антитела), который связывает средство. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80% (и необязательно не более чем приблизительно 70, 80, 90 или 100%) эритроидных клеток в популяции являются безъядерными и содержат одно или несколько средств. В некоторых вариантах осуществления популяция эритроидных клеток содержит приблизительно 1×109–2×109, 2×109–5×109, 5×109–1×1010, 1×1010–2×1010, 2×1010–5×1010, 5×1010–1×1011, 1×1011–2×1011, 2×1011–5×1011, 5×1011–1×1012, 1×1012–2×1012, 2×1012–5×1012, или 5×1012–1×1013 клеток.

Клетки применимого в клик–химии формата

В некоторых вариантах осуществления клетка содержит конъюгирующее средство без необходимости стадии осуществления химической реакции клетки с конъюгирующим средством. Например, клетку можно приводить в контакт с молекулой, которая содержит метаболит (например, аминокислоту или сахар) и связывающий фрагмент (например, функциональный для клик–химии компонент). Затем обеспечивают возможность включения клеткой метаболита, например, в белки или углеводы, например, на поверхности клетки. Метаболит может представлять собой, например, неканоническую аминокислоту. В вариантах осуществления включение метаболита осуществляют с применением пары tRNA/аминоацил–tRNA–синтетаза, которая направляет метаболит в конкретное положение, например, положение, кодируемое янтарным стоп–кодоном. Полученная в результате активированная клетка содержит связывающий фрагмент (например, функциональный для клик–химии компонент). Затем активированную клетку можно приводить в контакт с активированным средством, например, активированным средством, описанным в данном документе.

Можно применять множество молекул, которые содержат метаболит и связывающий фрагмент. Например, в вариантах осуществления молекула выбрана из следующего:

SCO–лизин, например, для применения в реакции облегченного напряжением алкин–азидного циклоприсоединения (SPAAC);

циклопропенлизин, например, для применения в реакции облегченного напряжением циклоприсоединения Дильса–Альдера с обращенными электронными требованиями (SPIEDAC);

TCO*A–лизин, например, для применения в реакции SPIEDAC;

экзо–BCN–лизин, например, для применения в реакции SPAAC;

NBO–лизин, например, для применения в реакции SPIEDAC;

рац.–BCN–лизин, например, для применения в реакции SPAAC;

TCO–лизин, например, для применения в реакции SPIEDAC;

эндо–BCN–лизин, например, для применения в реакции SPAAC;

PrK–HCL–соль, например, для применения в реакции SPAAC или SPIEDAC;

N3–лизин, например, для применения в реакции SPAAC или SPIEDAC;

п–ацетилфенилаланин, например, для применения при сайт–специфическом лигировании оксима (например, опосредованном DBCO–амином) с последующим SPAAC;

п–азидометилфенилаланин, например, для применения в реакции SPAAC или SPIEDAC; или

селеноцистеин, например, для реакции с малеимидом.

Связывающие реагенты

В данном документе описаны композиции эритроидных клеток, функционализированных средством, где клетки и средство соединены посредством набора биспецифических связывающих реагентов. В некоторых вариантах осуществления набор биспецифических связывающих реагентов содержит первый связывающий реагент и второй связывающий реагент. Первый связывающий реагент содержит связывающий фрагмент, например, алкиновый фрагмент, который вступает в специфическую реакцию со связывающий фрагментом, например, азидом, на втором связывающем реагенте. Связывающие фрагменты не являются самореактивными. В вариантах осуществления связывающий фрагмент представляет собой функциональный для клик–химии компонент. Функциональный для клик–химии компонент может предусматривать азид или алкин.

Каждый связывающий реагент также содержит реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент, подходящий, например, для связывания (например, ковалентно) с представляющим интерес субстратом, например, с эритроидной клеткой или средством для прикрепления к эритроидной клетке, например, с полипептидом, липидом, нуклеиновой кислотой, сахаром, лекарственным средством, малой молекулой. В вариантах осуществления реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент способен вступать в реакцию с субстратом без участия ферментов. В вариантах осуществления реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент способен вступать в реакцию с субстратом, которая отличается от реакции с участием сортазы.

В вариантах осуществления связывающий реагент способен ковалентно связывать первый объект (например, клетку) со вторым объектом (например, экзогенным полипептидом).

Первый связывающий реагент может быть соединен посредством своего реакционноспособного в отношении субстрата фрагмента с первым субстратом, например, эритроидной клеткой. Второй связывающий реагент может быть соединен посредством своего реакционноспособного в отношении субстрата фрагмента со вторым субстратом, например, полипептидом или лекарственным средством. Дериватизированные таким образом субстраты затем можно соединять друг с другом.

Связывание двух субстратов обычно приводит к образованию остаточного линкера между первым и вторым субстратом. Например, в случае связывающих реагентов, содержащих азид и алкин, может быть образован остаточный линкер, содержащий триазол (например, 1,2,3–триазол). Иллюстративные связывающие реагенты включают алкиновые связывающие реагенты (KR) и азидные связывающие реагенты (AR).

В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент предусматривает алкиновый связывающий реагент. В некоторых вариантах осуществления алкиновый связывающий реагент содержит пропаргильный фрагмент или циклооктинильный фрагмент. Иллюстративные алкиновые связывающие реагенты включают сложный диарилциклооктин (DBCO)–сульфо–NHS–эфир, сложный диарилциклооктин (DBCO)–PEG–NHS–эфир, сложный диарилциклооктин (DBCO)–C6–NHS–эфир, сложный диарилциклооктин (DBCO)–NHS–эфир, диарилциклооктин (DBCO)–амин, диарилциклооктин (DBCO)–кислоту, сульфодиарилциклооктин (DBCO)–малеимид, диарилциклооктин (DBCO)–малеимид, бис–сульфон–PEG–диарилциклооктин (DBCO), сложный пропаргил–NHS–эфир, пропаргил–малеимид, сложный алкин–PEG–NHS–эфир, алкин–PEG–малеимид или их производное.

В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент предусматривает азидный связывающий реагент. В некоторых вариантах осуществления азидный связывающий реагент содержит азидоалкильный фрагмент, азидоарильный фрагмент или азидогетероарильный фрагмент. Иллюстративные азидные связывающие реагенты включают сложный сульфо–NHS–эфир 3–азидопропионовой кислоты, сложный NHS–эфир азидоуксусной кислоты, сложный азидо–PEG–NHS–эфир, азидопропиламин, азидо–PEG–амин, азидо–PEG–малеимид, бис–сульфон–PEG–азид или их производное.

Связывающие реагенты также могут содержать алкеновый фрагмент, например, трансциклоалкеновый фрагмент, оксанорборнадиеновый фрагмент или тетразиновый фрагмент. Дополнительные связывающие реагенты можно найти в Click Chemistry Tools (https://clickchemistrytools.com/), Lahann, J (ed) (2009) Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science, McKay et al, "Click chemistry in complex mixtures: bioorthogonal bioconjugation" Chem Biol. 2014 Sep 18;21(9):1075–101, Becer et al. "Click chemistry beyond metal–catalyzed cycloaddition" Angew Chem Int Ed Engl. 2009;48(27):4900–8, и Hein et al. "Click chemistry, a powerful tool for pharmaceutical sciences" Pharm Res. 2008 Oct;25(10):2216–30, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В вариантах осуществления связывающий реагент содержит тетразиновый фрагмент, например, для реакции с алкеновым фрагментом. Например, в вариантах осуществления тетразин представляет собой 1,2,4,5–тетразин, а алкен представляет собой напряженный алкен. В вариантах осуществления алкеновый связывающий реагент содержит транс–циклооктен, (Е)–циклоокт–4–енол, (Е)–циклоокт–4–енил–2,5–диоксо–1–пирролидинилкарбонат, сложный сукцинимидиловый эфир 5–норборнен–2–уксусной кислоты, 5–норборнен–2–эндоуксусную кислоту, сукцинимидиловый эфир TCO PEG4, TCO–амин или TCO–PEG3–малеимид. В вариантах осуществления тетразиновый связывающий реагент содержит (4–(1,2,4,5–тетразин–3–ил)фенил)метанамин или 2,5–диоксо–1–пирролидинил–5–[4–(1,2,4,5–тетразин–3–ил)бензиламино]–5–оксопентаноат, 5–[4–(1,2,4,5–тетразин–3–ил)бензиламино]–5–оксопентановую кислоту. В вариантах осуществления тетразин и алкен вступают в реакцию циклоприсоединения Дильса–Альдера с образованием стабильной ковалентной связи. В вариантах осуществления катализатор не требуется. В вариантах осуществления единственным побочным продуктом является молекулярный азот. В вариантах осуществления реакция по меньшей мере на один порядок быстрее, чем клик–химия на основе азида–циклооктина. Не желая быть связанными какой–либо теорией, можно применять реакции с тетразином/алкеном с низкими концентрациями реагента (например, средства).

В некоторых вариантах осуществления связывающие фрагменты каждого связывающего реагента вступают в реакцию посредством азид–алкинового циклоприсоединения Хьюсгена. В некоторых вариантах осуществления азид–алкиновое циклоприсоединение Хьюсгена включает катализируемое медью(I) азид–алкиновое циклоприсоединение или облегченное напряжением азид–алкиновое циклоприсоединение.

В некоторых вариантах осуществления связывающие фрагменты каждого связывающего реагента вступают в реакцию с образованием гетероарила, например, триазола. В некоторых вариантах осуществления триазол включает 1,2,3–триазол, например, 1,4–дизамещенный 1,2,3–триазол или 1,5–дизамещенный 1,2,3–триазол.

В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент содержит реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент для связывания связывающего реагента со средством (например, средством, описанным в данном документе). В некоторых вариантах осуществления реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент вступает в реакцию с карбонильной, сложноэфирной группой, группой карбоновой кислоты, амино– или сульфгидрильной группой. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент включает сукцинимид (например, сложный NHS–эфир), малеимид, амин, гидразин, алкоксиамин, карбоновую кислоту, альдегид, кетон, дисульфид, ацилгалогенид, изотиоцианат или их производное.

В некоторых вариантах осуществления реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер включает фрагмент полиэтиленгликоля (PEG). В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой неразветвленную цепь. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой разветвленную цепь.

В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент содержит алкин и вступает в реакцию с амином. В некоторых вариантах осуществления связывающее средство содержит циклооктин и вступает в реакцию с амином. В некоторых вариантах связывающее средство представляет собой сложный диарилциклооктин (DBCO)–сульфо–NHS–эфир или сложный диарилциклооктин (DBCO)–PEG5–NHS–эфир.

В некоторых вариантах осуществления связывающее средство содержит азид и вступает в реакцию с амином. В некоторых вариантах осуществления связывающее средство представляет собой сложный сульфо–NHS–эфир 3–азидопропионовой кислоты или сложный азидо–PEG4–NHS–эфир.

В одном варианте осуществления связывающий реагент является водорастворимым. В одном варианте осуществления связывающий реагент является непроникающим через мембрану, например, характеризуется достаточным зарядом, чтобы сделать его непроникающим через мембрану. В одном варианте осуществления связывающий реагент заряжен, например, положительно заряжен или отрицательно заряжен. В одном варианте осуществления связывающий реагент содержит катионный фрагмент или анионный фрагмент, например фрагмент SO₃.

В некоторых вариантах осуществления связывающее средство содержит средство обнаружения, например, пригодное для обнаружения функционализированной эритроидной клетки. Иллюстративные средства обнаружения могут включать флуоресцентную молекулу (например, цианиновый краситель, например, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 или Cy7.5), хелат металла, контрастное вещество, радионуклид, средство визуализации позитронно–эмиссионной томографии (PET), средство визуализации в инфракрасном диапазоне, средство визуализации в ближней IR–области, средство для визуализации с помощью компьютерной томографии (CAT), средство для визуализации с помощью фотонно–эмиссионной компьютерной томографии (например, DIBO–DFO, где DFO хелатирует цирконий–89), средство рентгеновской визуализации или средство магнитно–резонансной визуализации (MRI).

В одном варианте осуществления связывающий реагент представляет собой материал класса GMP.

В некоторых вариантах осуществления реакция клик–химии представляет собой циклоприсоединение (например, 1,3–диполярное циклоприсоединение или гетерореакцию циклоприсоединения Дильса–Альдера), нуклеофильное раскрытие кольца (например, раскрытия напряженных гетероциклических электрофилов, таких как азиридины, эпоксиды, циклические сульфаты, ионы азиридиния и ионы эписульфония), химическую реакцию карбонилов не альдольного типа (например, образование мочевин, тиомочевин, гидразонов, простых эфиров оксимов, амидов или ароматических гетероциклов) или присоединение к углерод–углеродной кратной связи (например, эпоксидирование, азиридинирование, дигидроксилирование, присоединение сульфенилгалогенида, присоединение нитозилгалогенида или присоединение Михаэля). Примеры этих типов реакции клик–химии описаны более подробно в Hein et al., Pharm. Res. 2008 October; 25(10):2216–2230, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В вариантах осуществления реакция клик–химии представляет собой реакцию [3+2] циклоприсоединения без применения металла, реакцию Дильса–Альдера или тиол–алкеновую реакцию с участием свободных радикалов. Примеры этих типов реакции клик–химии описаны более подробно в Becer et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 4900–4908, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В одном варианте осуществления характерный признак клик–химии представляет собой характерный признак алкин/азидной реакции клик–химии (например, где алкин представляет собой циклооктин, активированный алкин или электронодефицитный алкин), например, характерный признак клик–химии предусматривает триазол, например, 1,2,3–триазол и/или дизамещенный триазол. В одном варианте осуществления характерный признак клик–химии представляет собой характерный признак диен/диенофильной реакции клик–химии (например, где диенофил предусматривает алкеновый фрагмент), например, характерный признак клик–химии предусматривает циклоалкен, например, дизамещенный алкен. В вариантах осуществления характерный признак клик–химии представляет собой характерный признак тетразин/алкеновой реакции клик–химии, например, характерный признак клик–химии предусматривает дигидропиразин, например, 1,2–дигидропиразин. В вариантах осуществления характерный признак клик–химии представляет собой характерный признак тетразол/алкеновой реакции клик–химии, например, характерный признак клик–химии предусматривает диазол. В вариантах осуществления характерный признак клик–химии представляет собой характерный признак дитиоэфир/диеновой реакции клик–химии, например, характерный признак клик–химии предусматривает серосодержащее кольцо, например, тетрагидротиофен, например, дизамещенный тетрагидротиофен. В вариантах осуществления характерный признак клик–химии представляет собой характерный признак реакции сложного дитиоэфира/диена, например, характерный признак клик–химии предусматривает серосодержащее кольцо, например, тиопиран. В вариантах осуществления характерный признак клик–химии представляет собой характерный признак тиол/алкеновой реакции клик–химии, например, характерный признак клик–химии предусматривает алкилсульфид.

В вариантах осуществления реакция клик–химии не требует катализатора. В вариантах осуществления реакция клик–химии не требует ионов меди, например, протекает практически с той же скоростью в отсутствие ионов меди, как и в присутствии ионов меди, например, в условиях, описанных в Tornoe, C. W. et al (2002). "Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]–Triazoles by Regiospecific Copper(I)–Catalyzed 1,3–Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides". В вариантах осуществления реакция клик–химии протекает эффективно при температуре приблизительно 10–40, 20–40, 20–30, 20–25, 30–40, или 35–40, или приблизительно 37°С. В вариантах осуществления реакция клик–химии протекает эффективно при температуре ниже 50, 45, 40, 35, 30, 25 или 20°С.

В вариантах осуществления активационный барьер для реакции клик–химии составляет 24–30, 25–29 или 26–28 ккал/моль, например, приблизительно 27,8 ккал/моль или 26 ккал/моль. В вариантах осуществления активационный барьер для реакции клик–химии является таким же или не менее чем на 50%, 40%, 30%, 20% или 10% отличается от активационного барьера катализируемой Cu реакции циклоприсоединения Хьюсгена между азидом и концевым алкеном, например, как описано в Hein et al. Click chemistry, a powerful tool for pharmaceutical sciences" Pharm Res. 2008 Oct; 25(10):2216–30.

В вариантах осуществления реакция клик–химии является экзергонической, например, имеющей ΔG° от –10 до –100, от –20 до –90, от –30 до –70, от –40 до –70, от –50 до –60 или приблизительно –61 ккал/моль. В вариантах осуществления ΔG° для реакции клик–химии является такой же или не менее чем на 50%, 40%, 30%, 20% или 10% отличается от ΔG° катализируемой Cu реакции циклоприсоединения Хьюсгена между азидом и концевым алкеном.

В вариантах осуществления реакция клик–химии характеризуется ΔG° от –30 до –140, от –40 до –130, от –50 до –120, от –60 до –110, от –70 до –100, от –80 до –90 или приблизительно 84 кДж/моль.

Одним примером реакции циклоприсоединения является 1,3–диполярное циклоприсоединение Хьюсгена для диполярофила с 1,3–диполярным компонентом, которые образуют пятичленные (гетеро)циклы. Примерами диполярофилов являются алкены, алкины и молекулы, которые обладают родственными гетероатомными функциональными группами, такими как карбонилы и нитрилы. В частности, другим примером является 2+3 циклоприсоединение алкилазидов и ацетиленов. Другие реакции циклоприсоединения включают реакции Дильса–Альдера для сопряженного диена и диенофила (такого как алкин или алкен). Примеры реакций циклоприсоединения описаны, например, в патенте США № 9517291, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Другие примеры реакций клик–химии включают реакцию гидросилилирования H––Si и простых неактивированных винильных соединений, образование уретана из спиртов и изоцианатов, реакции Меньшуткина для третичных аминов с алкилйодидами или алкилтрифторметансульфонатами, реакции присоединения Михаэля, например, очень эффективную малеимид–тиольную реакцию, реакции присоединения радикалов с переносом атома между ––SO₂Cl и олефином (R¹, R²–C=C–R³, R⁴), реакцию обмена, реакцию Штаудингера для фосфинов с алкилазидами, окислительное сочетание тиолов, нуклеофильное замещение, особенно в небольших напряженных кольцах, таких как эпоксидные и азиридиновые соединения, химическую реакцию карбонилов, такую как образование мочевин, и реакции присоединения к углерод–углеродным двойным связям, такие как дигидроксилирование. Следовательно, присоединенная функциональная группа может быть выбрана из ацетиленовой связи, азидогруппы, нитрильной группы, ацетиленовой, аминогруппы, фосфиногруппы. В результате реакции клик–химии может быть добавлена функциональная группа, выбранная из амино–, первичной амино–, гидроксильной, сульфонатной, бензотриазольной, бромидной, хлоридной, хлорформиатной, триметилсилановой, фосфоний бромидной или биочувствительной функциональной группы, включая полипептиды, белки и нуклеиновые кислоты.

Таким образом, подходящие связывающие реагенты могут включать, например, амин, сульфат, тиол, гидроксил, азид, алкин, алкен, карбоксильные группы, альдегидные группы, сульфоновые группы, винилсульфоновые группы, изоцианатные группы, группы ангидридов кислот, эпоксидные группы, азиридиновые группы, эписульфидные группы, такие группы, как ––CO₂N(COCH₂)2, ––CO₂N(COCH₂)₂, ––CO₂H, ––CHO, ––CHOCH₂, ––N.dbd.C.dbd.O, ––SO₂CH.dbd.CH₂, ––N(COCH)₂, ––S––S––(C₅H₄N) и группы следующих структур, где X представляет собой галоген, и R представляет собой водород или C₁–C₄алкил:

В некоторых вариантах осуществления в результате реакции клик–химии образуются очень энергоэффективные углерод–гетероатомные связи, в частности, в нуклеофильной реакции с раскрытием кольца или реакции циклоприсоединения. Тип реакции, который широко представлен в клик–химии, представляет собой вышеуказанное алкин–азидное циклоприсоединение, катализируемое Cu(I). Примеры реакций клик–химии также описаны, например, в патенте США № 9453843, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

С применением клик–химии можно быстро и надежно получать вещества путем объединения небольших модульных блоков (см., например, Kolb et al. (2001) Angewandte Chemie Intl. Ed. 40:2004–2011; Evans (2007) Australian J. Chem. 60:384–395; Carlmark et al. (2009) Chem. Soc. Rev. 38:352–362; каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Примеры реакций клик–химии описаны, например, в патенте США № 8912323, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Средства, например, экзогенные полипептидные средства

Настоящее изобретение относится к композициям эритроидных клеток, функционализированных средством, и к способам, препаратам и наборам, содержащим их. Иллюстративные средства для применения в настоящем изобретении описаны в данном документе.

В одном варианте осуществления средство представляет собой средство, описанное в WO2015/15302 или в WO2015/073587, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В одном варианте осуществления средство предусматривает пептидное средство, например, полипептид, фермент или антитело.

В одном варианте осуществления средство предусматривает экзогенный полипептид, например, полипептид, который не вырабатывается клеткой дикого типа такого типа или присутствует в клетке дикого типа на более низком уровне, чем в клетке, содержащей экзогенный полипептид. В некоторых вариантах осуществления экзогенный полипептид представляет собой полипептид, конъюгированный с поверхностью клетки химическим или ферментативным способом. В некоторых вариантах осуществления экзогенный полипептид представляет собой полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, которая была введена в клетку, при этом нуклеиновая кислота необязательно не сохраняется в клетке.

В одном варианте осуществления средство предусматривает цитокин, рецептор, лиганд, гормон, фактор роста, фактор крови, фермент лизосомного накопления, аспарагиназу или фрагмент любого из вышеуказанных, содержащий внеклеточный домен, домен связывания контрлиганда или другой биологически активный домен.

В одном варианте осуществления средство предусматривает антиген, например, опухолевый антиген, и антиген, вызывающий инфекционное заболевание, и аутоантиген.

В одном варианте осуществления средство предусматривает липид, нуклеиновую кислоту, например, РНК, ДНК, siRNA, сахар, лекарственное средство или малую молекулу.

В одном варианте осуществления средство предусматривает полипептид с массой более чем приблизительно 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 килодальтонов.

В одном варианте осуществления средство, например, полипептид, содержит посттрансляционную модификацию, например, посттрансляционную модификацию, которая не осуществляется эритроидными клетками или неэффективно осуществляется эритроидными клетками.

В одном варианте осуществления средство, например, полипептид, является токсичным для эритроидной клетки или нарушает ее рост, функцию, продолжительность жизни или развитие.

В одном варианте осуществления средство предусматривает мультимерный полипептид, например, димер, например гомодимер или гетеродимер, тример, например гомотример или гетеротример, или тетрамер, например гомотетрамер или гетеротетрамер, например, антитело или рецептор клеточной поверхности, например, рецептор к переносчику заболевания, например, вирусу, лекарственное средство или токсин.

В одном варианте осуществления средство предусматривает полипептид, например, мультимерный полипептид, содержащий множество цистеиновых мостиков. В одном варианте осуществления средство предусматривает полипептид, например, мультимерный полипептид, содержащий один или несколько цистеиновых мостиков.

В одном варианте осуществления средство предусматривает трудно экспрессируемый белок. Например, в вариантах осуществления полипептидное средство имеет аминокислотную последовательность, которая при генетической экспрессии в эритроидной клетке достигнет числа копий менее 1000, 500, 200 или 100 копий белка на клетку. В вариантах осуществления полипептидное средство имеет аминокислотную последовательность, которая при генетической экспрессии в эритроидной клетке характеризуется неэффективной трансляцией или транскрипцией, например, достигая уровня белка или мРНК менее чем 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1% от эталонного значения, например, экспрессии контрольного белка, такого как ADA, как описано в WO2015/073587. В одном варианте осуществления полипептидное средство предусматривает изоформу, например, сплайс–вариант, который при генетической экспрессии в эритроидной клетке не будет наиболее распространенной изоформой, например, будет присутствовать на уровне на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% ниже, чем уровень наиболее распространенной изоформы.

В одном варианте осуществления средство предусматривает молекулу антитела, например, полипептид, содержащий одно или несколько из следующего: a) вариабельную область, достаточную для связывания родственного антигена, например, CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC; b) последовательность константной области тяжелой цепи, содержащей одно или несколько из СН1, СН2 и СН3; c) функциональную Fc–область и d) модифицированную или неактивную Fc–область, например, мутационно инактивированную Fc–область или Fc–область, имеющую уровень гликозилирования, который ухудшает активность Fc, например, дегликозилированную Fc–область.

В одном варианте осуществления средство предусматривает антитело, например, IgA, IgG, IgG1, IgG2, IgM, IgE или IgD.

В одном варианте осуществления средство предусматривает антитело к PDL1, антитело к 4–1BB, антитело к α4β7 или белок A/G.

В некоторых вариантах осуществления средство является дегликозилированным. Например, гликозилированный предшественник можно обработать дегликозилирующим ферментом (например, EndoS) с получением средства.

В некоторых вариантах осуществления средство предусматривает полипептид, выбранный или происходящий из одного или нескольких следующих классов, включая без ограничения фермент, протеазу, нуклеазу, гликозидазу, липазу, ДНКазу, антиген, антителоподобную молекулу (например, нанотело, scFv, дуотело или полиспецифическое антитело),​лиганд антитела, фактор роста, транспортер, цитокин, хемокин, рецептор фактора роста, рецептор цитокина, рецептор хемокина, последовательность, распознаваемую ферментом, последовательность, распознаваемую транспептидазой, последовательность, распознаваемую протеазой, расщепляемый домен, интеин, ДНК–связывающий белок, РНК–связывающий белок, регуляторную молекулу комплемента, молекулу системы комплемента, молекулу системы свертывания крови, хелатор, регуляторный домен комплемента, SCR–домен, CCP–домен, иммуноглобулиновый или иммуноглобулиноподобный домен, повтор armadillo, лейциновую застежку, домен смерти, кадгериновый повтор, мотив EF, фосфотирозин–связывающий домен, плекстрин–гомологичный домен, домен SCR гомологии 2, цинк–пальцевый домен, циклический пептид, проникающий пептид, молекулу шаперона, интегрин, коллаген, белок–переносчик (например, альбумин), токсин–связывающий пептид (например, пептид, который связывается с токсином из бактерии, паразита, гриба или окружающей среды), молекулу миелинизации, молекулу, связывающую прионные белки, молекулу кластера дифференцировки (CD), иммуномодулирующую молекулу (например, костимулирующую молекулу, активатор костимулирующей молекулы, ингибитор костимулирующей молекулы, коингибирующую молекулу, ингибитор коингибирующей молекулы или активатор коингибирующей молекулы), раковый антиген или маркер раковой клетки, антигенпрезентирующую молекулу, проапоптотическую молекулу, нацеливающий фрагмент, Fc–рецептор–связывающую молекулу, фермент голодания опухоли, ингибитор повреждения ДНК, ингибитор клеточного цикла, гибкий линкер или эпитопную метку. Конкретные примеры средств, например, полипептидов, можно найти, например, в WO2015/073587, WO2015/153102 и WO2016/183482, каждая из которых включена посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых вариантах осуществления средство содержит одну или несколько неканонических аминокислот. Неканонические аминокислоты включают, например, п–метоксифенилаланин (pMpa); п–ацетилфенилаланин (pApa); п–бензоилфенилаланин (pBpa); п–йодфенилаланин (pIpa); п–азидофенилаланин (pAzpa); п–пропаргилоксифенилаланин (pPpa); α–аминокаприловую кислоту; о–нитробензилцистеин (о–NBC); 1,5–дансилаланин и о–нитробензилсерин (о–NBS) и другие, описанные в патенте США № 9624485, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых вариантах осуществления средство является отличным от полипептида. Например, средство может представлять собой углевод, малую молекулу, липид, нуклеиновую кислоту, терапевтическое средство, встречающееся в природе или синтетическое соединение или их комбинации.

Иллюстративный экзогенный полипептид, например, полипептидное средство из таблицы 1 или его вариант, включает:

a) встречающуюся в природе форму полипептида;

b) полипептид, имеющий последовательность, находящуюся в базе данных, например, базе данных GenBank, от 7 августа 2017 года;

c) полипептид, имеющий последовательность, которая отличается не более чем 1, 2, 3, 4, 5 или 10 аминокислотными остатками от последовательности из а) или b);

d) полипептид, имеющий последовательность, которая отличается не более чем 1, 2, 3, 4, 5 или 10% своих аминокислотных остатков от последовательности из а) или b);

e) полипептид, имеющий последовательность, которая практически не отличается от последовательности из а) или b); или

f) полипептид, имеющий последовательность из c), d) или e), который практически не отличается биологической активностью, например, ферментативной активностью (например, специфичностью или метаболизмом) или активностью связывания (например, специфичностью или аффинностью связывания) от белка с последовательностью из а) или b).

В вариантах осуществления полипептид предусматривает полипептид или его фрагмент, например, весь полипептид или его фрагмент согласно a), b), c), d), e) или f) из предыдущего абзаца.

В вариантах осуществления средство предусматривает полипептид из таблицы 1 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,5% идентичностью с ним или его функциональным фрагментом.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности иллюстративных средств

Средство	Последовательность
4–1BBL	ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE (SEQ ID NO: 3)
Антитело к CD20	Химерная тяжелая цепь ритуксимаба: QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4) Химерная легкая цепь ритуксимаба: QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5)
TRAIL	Растворимый TRAIL, вариант DR4–1 MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRRRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG (SEQ ID NO: 6) Растворимый TRAIL, вариант DR4–2 MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRRGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG (SEQ ID NO: 7) Растворимый TRAIL, вариант DR4–3 MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRRRSNTLSSPNSKNEKALGIKINSWESSRRGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTDYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG (SEQ ID NO: 8) Растворимый TRAIL, вариант DR5–1 MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMHHEASFFGAFLVG (SEQ ID NO: 9) Растворимый TRAIL, вариант DR5–2 MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQERIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMHHEASFFGAFLVG (SEQ ID NO: 10)
scFv–антитело к PD–L1	VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 11)
PAL	MKTLSQAQSKTSSQQFSFTGNSSANVIIGNQKLTINDVARVARNGTLVSLTNNTDILQGIQASCDYINNAVESGEPIYGVTSGFGGMANVAISREQASELQTNLVWFLKTGAGNKLPLADVRAAMLLRANSHMRGASGIRLELIKRMEIFLNAGVTPYVYEFGSIGASGDLVPLSYITGSLIGLDPSFKVDFNGKEMDAPTALRQLNLSPLTLLPKEGLAMMNGTSVMTGIAANCVYDTQILTAIAMGVHALDIQALNGTNQSFHPFIHNSKPHPGQLWAADQMISLLANSQLVRDELDGKHDYRDHELIQDRYSLRCLPQYLGPIVDGISQIAKQIEIEINSVTDNPLIDVDNQASYHGGNFLGQYVGMGMDHLRYYIGLLAKHLDVQIALLASPEFSNGLPPSLLGNRERKVNMGLKGLQICGNSIMPLLTFYGNSIADRFPTHAEQFNQNINSQGYTSATLARRSVDIFQNYVAIALMFGVQAVDLRTYKKTGHYDARACLSPATERLYSAVRHVVGQKPTSDRPYIWNDNEQGLDEHIARISADIAAGGVIVQAVQDILPCLH (SEQ ID NO: 12)
Аспарагиназа Y vb	MADKLPNIVILATGGTIAGSAATGTQTTGYKAGALGVDTLINAVPEVKKLANVKGEQFSNMASENMTGDVVLKLSQRVNELLARDDVDGVVITHGTDTVEESAYFLHLTVKSDKPVVFVAAMRPATAISADGPMNLLEAVRVAGDKQSRGRGVMVVLNDRIGSARYITKTNASTLDTFKANEEGYLGVIIGNRIYYQNRIDKLHTTRSVFDVRGLTSLPKVDILYGYQDDPEYLYDAAIQHGVKGIVYAGMGAGSVSVRGIAGMRKAMEKGVVVIRSTRTGNGIVPPDEELPGLVSDSLNPAHARILLMLALTRTSDPKVIQEYFHTY (SEQ ID NO: 13)
Антитело к a4b7	Вариабельная область тяжелой цепи: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEIDPSESNTNYNQKFKGRVTLTVDISASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDGWDYAIDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14) Вариабельная область легкой цепи: DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLAKSYGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 15)
IL10 человека	SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 16)
Фактор свертывания крови X	ANSFLEEMKKGHLERECMEETCSYEEAREVFEDSDKTNEFWNKYKDGDQCETSPCQNQGKCKDGLGEYTCTCLEGFEGKNCELFTRKLCSLDNGDCDQFCHEEQNSVVCSCARGYTLADNGKACIPTGPYPCGKQTLERRKRSVAQATSSSGEAPDSITWKPYDAADLDPTENPFDLLDFNQTQPERGDNNLTRIVGGQECKDGECPWQALLINEENEGFCGGTILSEFYILTAAHCLYQAKRFKVRVGDRNTEQEEGGEAVHEVEVVIKHNRFTKETYDFDIAVLRLKTPITFRMNVAPACLPERDWAESTLMTQKTGIVSGFGRTHEKGRQSTRLKMLEVPYVDRNSCKLSSSFIITQNMFCAGYDTKQEDACQGDSGGPHVTRFKDTYFVTGIVSWGEGCARKGKYGIYTKVTAFLKWIDRSMKTRGLPKAKSHAPEVITSSPLK (SEQ ID NO: 17)

В некоторых вариантах осуществления длина экзогенного полипептида, описанного в данном документе, составляет по меньшей мере 200, 300, 400, 500, 600, 700 или 800 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина экзогенного полипептида составляет 200–300, 300–400, 400–500, 500–600, 600–700 или 700–800 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления эритроидная клетка, например, безъядерная эритроидная клетка, содержит по меньшей мере 1000, 5000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 50000, 100000, 200000 или 500000 копий экзогенного полипептида, описанного в данном документе, например, из таблицы 1.

В вариантах осуществления средство содержит одну или несколько посттрансляционных модификаций. Посттрансляционные модификации включают расщепление (например, протеолитическое расщепление), циклизацию, гликозилирование, фосфорилирование, конъюгирование с гидрофобной группой (например, миристоилирование, пальмитоилирование, изопренилирование, пренилирование или глипиацию), конъюгирование с кофактором (например, липоилирование, конъюгирование с фрагментом флавина (например, FMN или FAD), присоединение гема С, фосфопантетеинилирование или образование основания Шиффа с ретинилиденом), образование дифтамида, присоединение этаноламинфосфоглицерина, образование гипузина, ацилирование (например, O–ацилирование, N–ацилирование или S–ацилирование), формилирование, ацетилирование, алкилирование (например, метилирование или этилирование), амидирование, бутирилирование, гамма–карбоксилирование, малонилирование, гидроксилирование, иодирование, добавление нуклеотидов, такое как ADP–рибозилирование, окисление, образование сложного эфира фосфорной кислоты (O–связанного) или фосфорамидата (N–связанного) (например, фосфорилирование или аденилирование), пропионилирование, образование пироглутамата, S–глутатионилирование, S–нитрозилирование, сукцинилирование, сульфатирование, конъюгирование с ISG, конъюгирование с SUMO, убиквитинирование, конъюгирование с Nedd или химическую модификацию аминокислоты (например, цитруллинирование, дезамидирование, удаление определенных групп аминокислот или карбамилирование), образование дисульфидного мостика, рацемизацию (например, пролина, серина, аланина или метионина) или любую их комбинацию. В вариантах осуществления гликозилирование охватывает добавление гликозильной группы к аргинину, аспарагину, цистеину, гидроксилизину, серину, треонину, тирозину или триптофану, что приводит к образованию гликопротеина. В вариантах осуществления гликозилирование предусматривает, например, O–связанное гликозилирование или N–связанное гликозилирование.

В вариантах осуществления клетка содержит множество средств, например, по меньшей мере 10, 20, 50, 100, 200, 500 или 1000 разных средств. В некоторых вариантах осуществления множество средств предусматривает множество вакцинных антигенов. В некоторых вариантах осуществления множество средств характеризуются сходством последовательностей друг с другом, но различаются между собой в по меньшей мере 1, 2, 5, 10, 20, 50 или 100 аминокислотных положениях. В некоторых вариантах осуществления каждое средство во множестве характеризуется по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с другим средством во множестве. В некоторых вариантах осуществления каждое средство во множестве характеризуется по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с по меньшей мере 1, 2, 5, 10, 20, 50 или 100 другими средствами во множестве.

Геометрические характеристики связывающих реагентов на средствах

Связывающее средство может быть присоединено к средству в ряде разных положений. Связывающее средство может содержать реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент, подходящий, например, для связывания (например, ковалентно) с субстратом, таким как средство (например, полипептид). Связывающее средство может дополнительно содержать связывающий фрагмент, например, связывающий фрагмент для клик–химии, подходящий, например, для связывания (например, ковалентно) со вторым связывающим средством. Подходящий реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент можно выбрать для направления присоединения связывающего средства к средству (например, полипептиду).

Например, в некоторых вариантах осуществления реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент способен вступать в реакцию с группой NH₂, например, на боковой цепи лизина или N–конце средства. Примером реакционноспособного в отношении субстрата фрагмента, способного вступать в реакцию с группой NH₂, является сложный NHS–эфир, сложный имидоэфир, сложный пентафторфениловый эфир или гидроксиметилфосфин. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент способен вступать в реакцию с карбоксилом средства, например, на боковой цепи аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты или С–конце средства. Примером реакционноспособного в отношении субстрата фрагмента, способного вступать в реакцию с карбоксилом, является карбодиимид. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент способен вступать в реакцию с сульфгидрилом средства, например, на боковой цепи цистеина. Примером реакционноспособного в отношении субстрата фрагмента, способного вступать в реакцию с сульфгидрилом, является малеимид, галоацетил (например, бром– или йодо–), пиридилдисульфид, тиосульфонат или винилсульфон. Средство, содержащее дисульфидный мостик, можно поместить в восстанавливающие условия с обеспечением превращения дисульфидного мостика в сульфгидрилы. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент способен вступать в реакцию с карбонилом средства. Например, кетоновую или альдегидную группу можно создать в гликопротеинах, например, путем окисления полисахаридов с посттрансляционными модификациями, например, мета–периодатом натрия. Примером реакционноспособного в отношении субстрата фрагмента, способного вступать в реакцию с карбонилом, является гидразид или алкоксиамин.

Фрагмент на средстве может быть соединен с предварительно выбранным фрагментом на клетке. Например, в некоторых вариантах осуществления группу NH₂ на средстве соединяют с группой NH₂, карбоксилом, сульфгидрилом или карбонилом на клетке. В вариантах осуществления карбоксильную группу на средстве соединяют с группой NH₂, карбоксилом, сульфгидрилом или карбонилом на клетке. В вариантах осуществления сульфгидрильную группу на средстве соединяют с группой NH₂, карбоксилом, сульфгидрилом или карбонилом на клетке. В вариантах осуществления карбонильную группу на средстве соединяют с группой NH₂, карбоксилом, сульфгидрилом или карбонилом на клетке.

Средства применимого в клик–химии формата

В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой полипептид со связывающим средством, соединенным с предварительно определенной аминокислотой. Вкратце, полипептидное средство можно получить в первой клетке ("клетке–фабрике"), таким образом, чтобы неканоническая аминокислота (ncAA), предусматривающая первый связывающий реагент, присутствовала в одном или нескольких аминокислотных положениях полипептидного средства. Затем средство можно связать со второй клеткой, которая имеет второй связывающий реагент на клеточной поверхности, с обеспечением таким образом связывания полипептидного средства со второй клеткой. В этой технологии может применяться сайт–специфическое включение ncAA, вследствие чего контролируется ориентация средства на клеточной поверхности.

Например, ncAA можно вводить в полипептидное средство путем генетического включения янтарного стоп–кодона (TAG) в представляющий интерес сайт в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептидное средство, например, как описано в Nikic et al. Nature Protocols 2015, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Янтарный стоп–кодон можно включить, например, на N–конце, С–конце или внутри белка. Эту плазмиду, кодирующую полипептидное средство, можно вводить в клетку–фабрику (например, клетку HEK293 или CHO) путем совместной трансфекции с другой плазмидой, кодирующей пару аминоацил–tRNA–синтаза/tRNA, которая не зависит от трансляционного механизма хозяина. В присутствии ncAA происходит считывание янтарного кодона и включение ncAA. Например, можно применять пирролизинаминоацил–tRNA–синтетазу/tRNA (PylRS/tRNAPyl) из M. mazei с мутациями Y306A и Y384F и ncAA: циклооктин–лизином (SCO), эндобицикло [6.1.0] нонин–лизином (эндоBCN), экзобицикло [6.1.0] нонин–лизином (экзоBCN) или рац. бицикло [6.1.0] нонин–лизином (рац. BCN). Другие подходящие ncAA описаны в данном документе в разделе, озаглавленном "Клетки применимого в клик–химии формата". Плазмида может дополнительно кодировать последовательность, которая управляет секрецией белка. Можно применять временную трансфекцию или стабильную клеточную линию.

После получения белка применимого в клик–химии формата его можно вводить в реакцию с клеткой, имеющей второе связывающее средство. Например, клетка может быть эритроидной клеткой, имеющей характерный для клик–химии линкер, например, характерный для клик–химии линкер, содержащий азид.

Геометрические характеристики связывающих реагентов на клетках

Связывающее средство может быть присоединено к клетке в ряде разных положений. Связывающее средство может содержать реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент, подходящий, например, для связывания (например, ковалентно) с субстратом, таким как клетка (например, полипептидный или углеводный фрагмент на клетке). Связывающее средство может дополнительно содержать связывающий фрагмент, например, связывающий фрагмент для клик–химии, подходящий, например, для связывания (например, ковалентно) со вторым связывающим средством. Подходящий реакционноспособный в отношении субстрата фрагмент можно выбрать для направления присоединения связывающего средства к клетке.

Подходящие реакционноспособные в отношении субстрата фрагменты описаны в данном документе, например, в разделе, озаглавленном "Геометрические характеристики связывающих реагентов на средствах".

Фрагмент на клетке может быть соединен с предварительно выбранным фрагментом на средстве. Например, в некоторых вариантах осуществления группу NH₂ на клетке соединяют с группой NH₂, карбоксилом, сульфгидрилом или карбонилом на средстве. В вариантах осуществления карбоксильную группу на клетке соединяют с группой NH₂, карбоксилом, сульфгидрилом или карбонилом на средстве. В вариантах осуществления сульфгидрильную группу на клетке соединяют с группой NH₂, карбоксилом, сульфгидрилом или карбонилом на средстве. В вариантах осуществления карбонильную группу на клетке соединяют с группой NH₂, карбоксилом, сульфгидрилом или карбонилом на средстве.

Сортаза и клик–химия

В некоторых вариантах осуществления реакцию с участием транспептидазы, такую как реакция с участием сортазы, применяют для присоединения линкера к средству или клетке.

Например, в некоторых вариантах осуществления полипептидное средство содержит последовательность, распознаваемую транспептидазой, например, последовательность, распознаваемую сортазой. Полипептидное средство можно приводить в контакт с сортазой и связывающим реагентом, который имеет совместимую последовательность, распознаваемую сортазой, с осуществлением таким образом опосредованной сортазой транспептидации (sortagging) связывающего реагента на полипептидное средство. Затем полипептидное средство можно вводить в реакцию с клеткой, имеющей второе связывающее средство. Второе связывающее средство может находиться, например, при группе NH₂, карбоксиле, сульфгидриле или карбониле на клетке.

В некоторых вариантах осуществления клетка (например, полипептид или углевод на клетке) содержит последовательность, распознаваемую транспептидазой, например, последовательность, распознаваемая сортазой. Например, клетка может генетически экспрессировать трансмембранный белок, содержащий последовательность, распознаваемую сортазой, на клеточной поверхности. Клетку можно приводить в контакт с сортазой и связывающим реагентом, который имеет совместимую последовательность, распознаваемую сортазой, с осуществлением таким образом опосредованной сортазой транспептидации связывающего реагента на клетку. Затем клетку можно вводить в реакцию с полипептидным средством, имеющим второе связывающее средство. Второе связывающее средство может находиться, например, при группе NH₂, карбоксиле, сульфгидриле или карбониле на полипептидном средстве.

В некоторых вариантах осуществления полипептидное средство не содержит последовательности, распознаваемой транспептидазой, например, последовательности, распознаваемой сортазой. В вариантах осуществления клетка не содержит экзогенной последовательности, распознаваемой транспептидазой, например, последовательности, распознаваемой сортазой. В вариантах осуществления способ не включает стадии опосредованной сортазой транспептидации. В вариантах осуществления функционализированная эритроидная клетка не содержит характерного признака сортазного переноса.

Сортаза может ферментативным образом конъюгировать вместе два мотива, распознаваемых сортазой. Первый мотив, распознаваемый сортазой, может представлять собой донорный мотив для сортазы, а второй мотив, распознаваемый сортазой, может представлять собой акцепторный мотив для сортазы.

Мотивы, распознаваемые сортазой, включают LPXTA (SEQ ID NO: 18) и LPXTG (SEQ ID NO: 1), в которых Х представляет собой любой аминокислотный остаток. Одним иллюстративным мотивом, распознаваемым сортазой, является LPXTG (SEQ ID NO: 1), в котором Х может представлять собой любой аминокислотный остаток (встречающийся в природе или неканонический), например, любой из 20 стандартных аминокислот, которые чаще всего встречаются в белках, обнаруживаемых в живых организмах. В некоторых примерах мотив, распознаваемый сортазой, представляет собой LPXTG (SEQ ID NO: 19) или LPXT, в которых X представляет собой D, E, A, N, Q, K или R. В других примерах X в мотиве LPXTG (SEQ ID NO: 20) или LPXT, которые распознаются сортазой A, выбран из K, E, N, Q или A. В других примерах X в мотиве LPXTG (SEQ ID NO: 21) или LPXT, которые распознаются сортазой класса C, выбран из K, S, E, L, A или N. Иллюстративные мотивы, распознаваемые сортазой, включают без ограничения LPKTG (SEQ ID NO: 22), LPITG (SEQ ID NO: 23), LPDTA (SEQ ID NO: 24), SPKTG (SEQ ID NO: 25), LAETG (SEQ ID NO: 26), LAATG (SEQ ID NO: 27), LAHTG (SEQ ID NO: 28), LASTG (SEQ ID NO: 29), LPLTG (SEQ ID NO: 30), LSRTG (SEQ ID NO: 31), LPETG (SEQ ID NO: 32), VPDTG (SEQ ID NO: 33), IPQTG (SEQ ID NO: 34), YPRRG (SEQ ID NO: 35), LPMTG (SEQ ID NO: 36), LAFTG (SEQ ID NO: 37), LPQTS (SEQ ID NO: 38), LPXT, LAXT, LPXA, LGXT, IPXT, NPXT, NPQS (SEQ ID NO: 39), LPST (SEQ ID NO: 40), NSKT (SEQ ID NO: 41), NPQT (SEQ ID NO: 42), NAKT (SEQ ID NO: 43), LPIT (SEQ ID NO: 44), LAET (SEQ ID NO: 45), LPXAG (SEQ ID NO: 46), LPNAG (SEQ ID NO: 47), LPXTA (SEQ ID NO: 18), LPNTA (SEQ ID NO: 48), LGXTG (SEQ ID NO: 49), LGATG (SEQ ID NO: 50), IPXTG (SEQ ID NO: 51), IPNTG (SEQ ID NO: 52), IPETG (SEQ ID NO: 53), NPXTX, NP[Q/K]–[T/s]–[N/G/s], NPQTN (SEQ ID NO: 54), NPKTG (SEQ ID NO: 55), NSKTA (SEQ ID NO: 56), NPQTG (SEQ ID NO: 57), NAKTN (SEQ ID NO: 58), NPQSS (SEQ ID NO: 59), NA–[E/A/S/H]–TG (SEQ ID NO: 60), LAXTG (SEQ ID NO: 61), QVPTGV (SEQ ID NO: 62), LPXTX, LP[Q/K]T[A/S]T (SEQ ID NO: 63) или LPXT[A/S].

Акцепторные мотивы для сортазы включают олигопептиды из глициновых остатков или олигопептиды из аланиновых остатков, такие как фрагмент из 1–5 глициновых остатков или фрагмент из 1–5 аланиновых остатков. В некоторых примерах олигопептид из глициновых остатков состоит из 3 или 5 глициновых остатков. В других примерах олигопептид из аланиновых остатков состоит из 3 или 5 аланиновых остатков.

Характерный признак сортазного переноса может быть создан с помощью реакции с участием сортазы. Например, в результате опосредованной сортазой реакции LPXTGG (SEQ ID NO: 2) с (G)_n может быть получен характерный признак сортазного переноса LPXT(G)_n (SEQ ID NO: 1). В вариантах осуществления характерный признак сортазного переноса содержит последовательность мотива, распознаваемого сортазой, описанную в данном документе, например, в этом разделе. В вариантах осуществления характерный признак сортазного переноса дополнительно содержит одну или несколько аминокислот, представляющих собой аланин или глицин, например, на С–конце последовательности мотива, распознаваемого сортазой.

Различные виды сортаз описаны, например, в WO2014/183071 (например, на страницах 33–37 этого документа), причем эта заявка включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Второе средство, добавляемое различными способами

В некоторых вариантах осуществления клетка (например, безъядерная эритроидная клетка), описанная в данном документе, содержит (в дополнение к своему первому средству) второе средство, например, экзогенное полипептидное средство. В некоторых вариантах осуществления второе средство конъюгировано с клеткой, например, с помощью клик–химии. В некоторых вариантах осуществления второе средство предусматривает белок, экспрессированный экзогенной нуклеиновой кислотой (например, ДНК или РНК), введенной в клетку или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления второе средство предусматривает белок, прикрепленный с помощью опосредованной сортазой транспептидации к клетке. В некоторых вариантах осуществления второе средство введено в клетку с помощью гипотонической загрузки. В некоторых вариантах осуществления второе средство нековалентно соединено с характерным признаком клик–химии или остаточным линкером.

Отличные от конъюгирования способы добавления средства к клетке

Хотя во многих вариантах осуществления средство конъюгируют с клеткой, например, с помощью клик–химии, подразумевается, что любое средство, описанное в данном документе, также можно добавить к клетке с помощью различных способов. Соответственно, в некоторых аспектах в настоящем изобретении предусмотрена клетка (например, эритроидная клетка, например, безъядерная эритроидная клетка), содержащая средство, например, экзогенное полипептидное средство, описанное в данном документе, например, полипептид из таблицы 1 или его фрагмент или вариант. Клетку можно получить, например, путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, в клетку или ее предшественника, с помощью опосредованной сортазой транспептидации, с помощью гипотонической загрузки или с помощью химического конъюгирования.

Способы лечения с помощью композиций, описанных в данном документе, например, эритроидных клеток

Способы введения сконструированных эритроидных клеток описаны, например, в WO2015/153102 и WO2015/073587, каждая из которых включена посредством ссылки во всей своей полноте.

В вариантах осуществления эритроидные клетки, описанные в данном документе, вводят субъекту, например, млекопитающему, например, человеку. Иллюстративные млекопитающие, которых можно подвергать лечению, включают без ограничения людей, домашних животных (например, собак, кошек и т. п.), сельскохозяйственных животных (например, коров, овец, свиней, лошадей и т. п.) и лабораторных животных (например, обезьян, крыс, мышей, кроликов, морских свинок и т. п.). Способы, описанные в данном документе, применимы как для терапии человека, так и для применений в ветеринарии.

В некоторых вариантах осуществления эритроидные клетки, описанные в данном документе, вводят субъекту для лечения или предупреждения воспаления и заболеваний, связанных с воспалением, включая сепсис, аутоиммунное заболевание, рак и инфекции, вызываемые микроорганизмами. В некоторых вариантах осуществления эритроидные клетки, описанные в данном документе, вводят субъекту с аутоиммунным заболеванием, например, рассеянным склерозом, сахарным диабетом 1 типа, ревматоидным артритом, мембранозным нефритом или любым из заболеваний, перечисленных в таблице F в WO2015/153102, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых аспектах настоящего изобретения представлен способ лечения заболевания или состояния, описанных в данном документе, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, описанной в данном документе композиции, например, описанной в данном документе эритроидной клетки. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак, например, рак, описанный в данном документе. В некоторых аспектах настоящего изобретения представлено применение эритроидной клетки, описанной в данном документе, для лечения заболевания или состояния, описанных в данном документе, например, рака. В некоторых аспектах настоящего изобретения представлено применение эритроидной клетки, описанной в данном документе, для изготовления лекарственного препарата для лечения заболевания или состояния, описанных в данном документе, например, рака. Иллюстративные виды рака описаны в WO2015/073587, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых вариантах осуществления эритроидные клетки вводят внутривенно, например, путем внутривенной инфузии.

Все ссылки, цитируемые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПРИМЕРЫ

Для более полного понимания настоящего изобретения, описанного в данном документе, приведены следующие примеры. Примеры, описанные в настоящей заявке, предлагаются для иллюстрации композиций, препаратов и способов, представленных в данном документе, и их никоим образом не следует истолковывать как ограничивающие их объем.

Пример 1. Получение эритроидной клетки, содержащей функциональный для клик–химии компонент

Популяцию эритроидных клеток готовили для мечения связывающим реагентом. Эритроциты, полученные из цельной крови, фильтровали и концентрировали до плотности 3,31×10⁹ клеток/мл. Клетки дважды промывали охлажденным на льду фосфатно–солевым буферным раствором (PBS, 2×1 мл) и остаточный объем удаляли пипеткой. Затем к клеткам добавляли PBS при pH 8 (100 мкл).

Исходные растворы следующих связывающих реагентов получали в концентрации 1 мМ (сложный DBCO–сульфо–NHS–эфир, сложный DBCO–PEG5–NHS–эфир, сложный сульфо–NHS–эфир 3–азидопропионовой кислоты и сложный азидо–PEG4–NHS–эфир) и каждый раствор добавляли к образцу клеток до конечной концентрации связывающего реагента 0,1 мМ или 0,04 мМ. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут с легким перемешиванием каждые 10 минут.

Реакцию мечения гасили путем добавления 1 мл PBSA (PBS с 0,1% BSA) к каждой реакционной смеси с обеспечением возможности инкубирования каждой реакционной смеси в течение 5 минут при комнатной температуре. Клетки осаждали центрифугированием (5 минут при 2500 об./мин.) и надосадочную жидкость удаляли путем аспирации. Затем клеточный осадок промывали с помощью PBS (1 мл) и снова осаждали (5 минут при 2500 об./мин.) и надосадочную жидкость удаляли путем аспирации.

Для определения уровня мечения получали исходный раствор реагента для обнаружения, содержащий либо Cy5–биотин–азид, либо Cy5–DBCO в концентрации 100 нМ. Реагент для обнаружения (100 мкл) добавляли к каждой реакционной смеси, и реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Эффективность мечения определяли с помощью проточной цитометрии, и она кратко описана в таблице 2 ниже.

Таблица 2. Эффективность конъюгирования в реакциях клик–химии

№ образца	Реагент для клик–химии	Реагент для обнаружения	Эффективность конъюгирования (%)
1	Сложный DBCO–сульфо–NHS–эфир, 0,1 мM	Cy5–биотин–азид	88,5
2	Сложный DBCO–сульфо–NHS–эфир, 0,04 мM	Cy5–биотин–азид	38,3
3	Сложный сульфо–DBCO–NHS–эфир, 0,1 мM	Cy5–азид	74,4
4	Сложный сульфо–DBCO–NHS–эфир, 0,04 мM	Cy5–азид	55,1
5	Сложный DBCO–PEG4–NHS–эфир, 0,1 мM	Cy5–азид	97,4
6	Сложный DBCO–PEG4–NHS–эфир, 0,04 мM	Cy5–азид	96,1
7	Сложный DBCO–PEG5–NHS–эфир, 0,1 мM	Cy5–биотин–азид	83,1
8	Сложный DBCO–PEG5–NHS–эфир, 0,04 мM	Cy5–биотин–азид	29,7
9	Сложный DBCO–PEG13–NHS–эфир, 0,1 мM	Cy5–азид	98,0
10	Сложный DBCO–PEG13–NHS–эфир, 0,04 мM	Cy5–азид	95,5
11	Сложный сульфо–NHS–эфир 3–азидопропионовой кислоты, 0,1 мM	Cy5–DBCO	99,8
12	Сложный сульфо–NHS–эфир 3–азидопропионовой кислоты, 0,04 мM	Cy5–DBCO	97,9
13	Сложный сульфо–NHS–эфир 6–азидокапроновой кислоты, 0,1 мM	Cy5–DBCO	98,9
14	Сложный сульфо–NHS–эфир 6–азидокапроновой кислоты, 0,04 мM	Cy5–DBCO	99,3
15	Сложный азидо–PEG4–NHS–эфир, 0,1 мM	Cy5–DBCO	99,1
16	Сложный азидо–PEG4–NHS–эфир, 0,04 мM	Cy5–DBCO	67,0
17	Сложный TCO–PEG4–NHS–эфир, 0,1 мM	Cy5–метилтетразин	1,4
18	Сложный TCO–PEG4–NHS–эфир, 0,04 мM	Cy5–метилтетразин	3,0
19	Сложный TCO–PEG12–NHS–эфир, 0,1 мM	Cy5–метилтетразин	96,7
20	Сложный TCO–PEG12–NHS–эфир, 0,04 мM	Cy5–метилтетразин	80,5
21	Сложный метилтетразин–сульфо–NHS–эфир, 0,1 мM	Cy5–TCO	97,6
22	Сложный метилтетразин–сульфо–NHS–эфир, 0,04 мM	Cy5–TCO	95,1
23	Сложный метилтетразин–PEG4–NHS–эфир, 0,1 мM	Cy5–TCO	97,5
24	Сложный метилтетразин–PEG4–NHS–эфир, 0,04 мM	Cy5–TCO	98,7
25	Контроль (н.о.)	Cy5–биотин–азид	0,74
26	Контроль (н.о.)	Cy5–DBCO	0,43

Пример 2. Получение средства, содержащего функциональный для клик–химии компонент

Представляющие интерес белки готовили для связывания с эритроидными клетками путем мечения связывающим реагентом. Иллюстративные белки для мечения включали антитела (например, антитело к PDL1 (антитело крысы к PDL1 мыши) и антитело к α4β7 (антитело крысы к α4β7 мыши)), лиганд 4–1BB и белок A/G. Белки обычно обессоливали, подвергали замене буфера на PBS и концентрировали до ≥1 мг/мл перед мечением, и значение рН регулировали до рН 7–8. Антитела обычно дегликозилировали с помощью эндогликозидазы (например, EndoS) для предотвращения ADCC; эндогликозидазу удаляли с помощью аффинной очистки перед добавлением связывающего реагента.

Исходные растворы связывающих реагентов получали, как описано в примере 1. Для растворов белка с концентрацией, превышающей 5 мг/мл, связывающий реагент добавляли в 10–кратном молярном избытке относительно концентрации белка. Для растворов белка с концентрацией менее 5 мг/мл связывающий реагент добавляли в 20–50–кратном молярном избытке относительно концентрации белка. Реакционную смесь для мечения белком инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут с легким перемешиванием каждые 10 минут.

Для определения уровня мечения получали исходный раствор реагента для обнаружения, содержащий либо Cy5–биотин–азид, либо WS–DBCO–биотин, и добавляли в каждую реакционную смесь, и реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Эффективность мечения определяли с помощью вестерн–блоттинга с применением антитела к биотину для обнаружения.

В альтернативном способе определения степени мечения применяли программу Nanodrop UV–Vis для считывания примерно 1–3 мкл меченого белка с поглощением при 280 нм и 309 нм с поправкой на фон при 750 нм.

Пример 3. Получение безъядерных эритроидных клеток, содержащих средство, ковалентно соединенное с клеточной поверхностью с помощью остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии

Белки связывали с эритроидными клетками в соответствии с общей процедурой, описанной ниже. Эритроидные клетки, меченные сложным сульфо–NHS–эфиром 3–азидопропионовой кислоты (образец № 11 в таблице 2), как описано в примере 1, инкубировали с 1,5–3 молярными эквивалентами антитела к α4β7 (мыши), меченного сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром или сложным DBCO–PEG5–NHS–эфиром, и реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение не более 12 часов либо при комнатной температуре, либо при 4°C. Затем клетки промывали с помощью PBS или PBSA и окрашивали антителом к антителу мыши, соединенным со средством обнаружения. Затем клетки анализировали с помощью проточной цитометрии с определением эффективности мечения белком. Как показано на ФИГ. 2A–2C, эффективность мечения белком была определена как составляющая 98,4% для антитела к α4β7, соединенного со сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром (ФИГ. 2B), и 94,4% для антитела к α4β7, соединенного со сложным DBCO–PEG5–NHS–эфиром (ФИГ. 2C).

В другом эксперименте белки связывали с эритроидными клетками в небольших объемах реакционной смеси с использованием высоких концентраций белка. Для проведения реакции эритроидные клетки метили сложным сульфо–NHS–эфиром 3–азидопропионовой кислоты (AS). Антитело к α4β7 (крысы) метили сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром (DS) или сложным DBCO–PEG5–NHS–эфиром (DP). Меченые клетки инкубировали с 1–20E6 молярными эквивалентами на клетку антитела к α4β7 в неразбавленном объеме 5–10 мкл в течение 1 часа при 23°C. Затем клетки промывали фосфатно–солевым буферным раствором с 0,1% бычьим сывороточным альбумином и окрашивали антителом к антителу к крысы, соединенным с флуорофором (изотиоцианатом флуоресцеина). Затем клетки анализировали посредством проточной цитометрии с определением эффективности прикрепления белка с помощью клик–химии. Как показано в таблице 3, было определено, что эффективность прикрепления белка с помощью клик–химии находится в диапазоне 98,9–99,8%. Клетка считается положительной по флуоресценции, если ее флуоресценция больше, чем у 99% других аналогичных немеченых клеток. Этот эксперимент указывает на то, что можно пометить очень высокий процент клеток белком, например, с использованием небольшого объема реакционной смеси и большого количества белка. Этот эксперимент также указывает на то, что можно связать мультимер с клеткой, поскольку антитело имеет две тяжелые цепи и две легкие цепи. Этот пример также указывает на то, что можно связать большие фрагменты с клеткой, поскольку антитело имеет молекулярную массу приблизительно 150 кДа.

Таблица 3. Эффективность мечения клеток антителом к α4β7

Количество AS–меченых клеток	Концентрация AS	Объем реакционной смеси для клик–химии	Молярный избыток DBCO: белок	Реагент DBCO	Процент клеток, положительных по флуоресценции
1E7	0,1mM	5ul	10	DS	99,8%
1E7	0,1mM	10ul	10	DP	98,9%
1E7	0,1mM	10ul	50	DS	99,6%
1E8	0,1mM	10ul	10	DP	99,7%
1E8	0,1mM	10ul	50	DS	99,7%

Пример 4. Связывание средства, представляющего собой антитело, с эритроидными клетками посредством остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии

Иногда желательно конъюгировать белок, содержащий несколько субъединиц и/или посттрансляционных модификаций, с клеткой. В этом примере описано конъюгирование антитела с клеточной поверхностью.

Антитело к PD–L1 (aPD–L1) (IgG2b крысы) связывали с эритроидными клетками в разных условиях реакции, описанных в таблице 4. Для проведения реакции эритроидные клетки метили с помощью 0,1 мМ сложного сульфо–NHS–эфира 3–азидопропионовой кислоты (AS) (ресуспендированного в DMSO) для обеспечения концентрации при мечении 0,1 мМ AS. aPD–L1 метили 10–кратным избытком сложного DBCO–сульфо–NHS–эфира (DS) (20 мкл 10 мМ DS). Меченые клетки инкубировали с меченым aPD–L1 в концентрации, объеме и количестве, указанных в таблице 4, в течение 1 часа при 25°C. Затем клетки промывали с помощью PBS и окрашивали антителом к легкой каппа–цепи антитела крысы, соединенным с флуорофором (РЕ). Затем клетки анализировали с помощью проточной цитометрии с определением эффективности мечения белком. Как показано в таблице 4, было определено, что эффективность мечения белком находится в диапазоне 99,7–99,9%. Клетка считается положительной по флуоресценции, если ее флуоресценция больше, чем у 99% других аналогичных немеченых клеток. Определяли количество молекул aPD–L1, присутствующих в расчете на клетку, и оно составило 7000–15000 молекул aPD–L1 на клетку. Также определяли количество белка (в нг), прикрепленного с помощью клик–химии, в расчете на клетку, и оно показано в таблице 4. В целом, добавление более высоких концентраций белка приводило к более высокому проценту модифицированных клеток и большему количеству конъюгированных молекул в расчете на клетку. В этом эксперименте продемонстрировано получение популяции клеток, характеризующихся очень высокой эффективностью мечения белком, например, с достижением среднего количества молекул на клетку в диапазоне от 7000 до 14000 молекул на клетку. В этом эксперименте также продемонстрировано, что мультимер можно соединить с клеткой, поскольку антитело имеет две тяжелые цепи и две легкие цепи. Данный эксперимент также указывает на то, что можно пометить большие популяции клеток, например, содержащие 1E8 или 1E9 эритроидных клеток, с достижением высокого процента меченых клеток и требуемого количества белка на клетку.

Таблица 4. Эффективность мечения клеток aPD–L1

Количество клеток	Объем белка	Концентрация белка (мг/мл)	% клеток, подвергнутых прикреплению с помощью клик–химии	Молекулы/клетка	Белок (нг)
1E7	10ul	4,5	99,9	6,955	2,88
1E7	10ul	2	99,8	7,014
1E7	10ul	0,5	99,7	6,728	2,78
1E8	50ul	4,5	99,9	13,892	57,61
1E8	50ul	2	99,8	10,934	45,30
1E8	50ul	0,5	99,7	9,797	40,55
1E9	100ul	4,5	99,9	14,916	618,61
1E9	100ul	2	99,8	12,126	502,40
1E9	100ul	0,5	99,7	7,476	309,43

Пример 5. Связывание средства, представляющего собой белковый лиганд, с эритроидными клетками посредством остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии

Лиганд 41BB (m41BBL) связывали с эритроидными клетками. Для проведения реакции эритроидные клетки метили сложным сульфо–NHS–эфиром 3–азидопропионовой кислоты (AS), а m41BBL метили сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром (DS). Меченые клетки инкубировали с 1–5 мг/мл меченого m41BBL в объеме 10–30 мкл в течение 1 часа при 23°C. Затем клетки промывали фосфатно–солевым буферным раствором с 0,1% бычьим сывороточным альбумином и окрашивали флуоресцентным реагентом для обнаружения (антителом к m41BBL с PE). Затем клетки анализировали посредством проточной цитометрии с определением эффективности прикрепления белка с помощью клик–химии. Как показано в таблице 5, было определено, что эффективность прикрепления белка с помощью клик–химии находится в диапазоне 1,14–99,9%. Клетка считается положительной по флуоресценции, если ее флуоресценция больше, чем у 99% других аналогичных немеченых клеток. В этом эксперименте продемонстрировано получение популяции клеток, характеризующихся очень высокой эффективностью мечения белковым лигандом.

Таблица 5. Эффективность мечения клеток m41BBL

Количество клеток	Концентрация m41BBL (мг/мл)	Молекулы m41BBL/клетка	Процент клеток, положительных по флуоресценции
1E7	1,024	44,158	88,7%
1E8	1,024	40,926	86,5%
1E8	5	94,874	99,9%

Пример 6. Белковый лиганд, связанный с эритроидными клетками, обладает связывающей активностью

Зачастую желательно получить популяцию клеток, характеризующуюся высокой процентной долей меченых клеток и высоким уровнем белка, прикрепленного с помощью клик–химии, в расчете на клетку. В то же время обычно желательно избегать "чрезмерного мечения", например, разрушения функциональных групп белка путем конъюгирования линкеров со слишком большим количеством сайтов на белке. Следовательно, функционализированные эритроидные клетки, содержащие прикрепленные с помощью клик–химии белки, тестировали в отношении способности связывать физиологический лиганд.

Лиганд 41BB (m41BBL) связывали с эритроидными клетками, как описано в примере 5. Затем клетки приводили в контакт с 41BB (родственным партнером по связыванию 41BBL), антителом, меченным фикоэритрином, которое связывает 41BB, и антителом, меченным аллофикоцианином (APC), которое связывает 41BB. Связывание 41BB с клетками указывает на то, что 41BBL не только присутствует на клетках, но и что его сайт связывания функционален и ориентирован для обеспечения связывания. Связывание антитела к 41BBL подтверждает, что 41BBL присутствует на клетках. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии с определением эффективности мечения белком. Как показано в таблице 6, было определено, что связывание 41BB находится в диапазоне 71,4–97,0%. Клетка считается положительной по флуоресценции, если ее флуоресценция больше, чем у 99% других аналогичных немеченых клеток. В этом эксперименте продемонстрировано получение клеток с очень высокой эффективностью мечения, при этом без "чрезмерного мечения", например, без разрушения сайта связывания лиганда.

Таблица 6. Связывание комплекса эритроидная клетка–m41BBL с 41BB

Количество клеток	Степень мечения m41BBL вес/DS	Процент клеток, положительных по флуоресценции
1E7	~2,64	71,4%
1E8	~2,64	72,4%
1E8	~1,74	97,0%

Пример 7. Антитело, связанное с эритроидными клетками, обладает связывающей активностью

Зачастую желательно получить популяцию клеток, характеризующуюся высокой процентной долей меченых клеток и высоким уровнем белка, прикрепленного с помощью клик–химии, в расчете на клетку без "чрезмерного мечения". Следовательно, прикрепленное с помощью клик–химии антитело тестировали в отношении способности связывать его антиген.

Антитело к PD–L1 связывали с эритроидными клетками. Для проведения реакции эритроидные клетки метили сложным сульфо–NHS–эфиром 3–азидопропионовой кислоты (AS), а aPD–L1 метили сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром (DS). Меченые клетки инкубировали с 2 мг/мл меченого антитела к PD–L1 в объеме 20 мкл в течение 1 часа при 20°C. Затем клетки приводили в контакт с рекомбинантным PD–L1 мыши, имеющим Fc–химерную метку. Ее можно обнаружить с помощью антитела к Fc. Связывание эритроидных клеток мыши, к которым было прикреплено с помощью клик–химии aPD–L1, с рекомбинантным белком демонстрировалось полным переключением популяции, так что все клетки были дважды положительными по антителу крысы (что указывает на присутствие антитела), а также Fc–метке (что указывает на связывание с рекомбинантным белком).

Кроме того, оценивали способность эритроидных клеток, меченных aPD–L1, связываться с линиями опухолевых клеток мыши, которые экспрессируют PD–L1. Первоначально экспрессию PD–L1 оценивали в трех линиях клеток: CT–26, B16F.10 и A20 со стимуляцией IFNg в течение 24 часов (что вызывает экспрессию PD–L1 на опухолевых клетках) или без нее. Экспрессию PD–L1 оценивали путем окрашивания антителом аPD–L1 со сравнением с антителом изотипического контроля. Связывание эритроидных клеток, к которым было прикреплено с помощью клик–химии aPD–L1, с клетками, экспрессирующими PD–L1, оценивали путем инкубирования раковых клеток, которые предварительно метили с помощью CellTrace Far Red, и эритроидных клеток при 4°С в течение 2 часов. Суспензию клеток окрашивали антителом к каппа–цепи и оценивали в проточном цитометре. Популяция, которая дважды положительна по Far Red и каппа, указала бы на то, что эритроидные клетки связаны с опухолевыми клетками. В этом эксперименте оценивали условия с предварительным инкубированием с IFNg или без него и сравнивали эритроидные клетки, к которым было прикреплено с помощью клик–химии aPD–L1, с клетками, к которым было прикреплено с помощью клик–химии антитело изотипического контроля. Процентная доля опухолевых клеток, которые связывались с комплексом эритроидных клеток мыши и aPD–L1, находилась в диапазоне 60–99% в зависимости от уровня экспрессии PD–L1 в линии опухолевых клеток (ФИГ. 3). Процентная доля опухолевых клеток, которые связывались с эритроидными клетками мыши, к которым был прикреплен с помощью клик–химии изотипический контроль, не коррелировала с уровнем экспрессии PD–L1, как и ожидалось. В целом, связывание комплекса эритроидных клеток мыши и aPD–L1 с опухолевыми клетками значительно повышалось с увеличением экспрессии PD–L1. Связывание эритроидных клеток, экспрессирующих aPD–L1, с рекомбинантным PD–L1 и опухолевыми клетками, экспрессирующими PD–L1, указывает на то, что антитело к PD–L1 не только присутствует на клетках, но и что его сайт связывания функционален и ориентирован для обеспечения связывания.

Пример 8. Количественная оценка непрореагировавшего связывающего реагента на клетках и белках

В некоторых вариантах осуществления желательно, чтобы непрореагироваший линкер для клик–химии на клетке и на белке, с которыми его соединяют, отсутствовал или присутствовал на очень низких уровнях. Не желая ограничиваться какой–либо теорией, в некоторых вариантах осуществления более низкие уровни непрореагировавшего линкера для клик–химии связаны с более низкой иммуногенностью функционализированной клетки. В этом примере описана количественная оценка непрореагировавшего линкера для клик–химии, присутствующего на клетке и белке.

Клетки метили путем осуществления реакции со сложным сульфо–NHS–эфиром 3–азидопропионовой кислоты (AS), а белок m41BBL метили путем осуществления реакции со сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром (DS). Затем клетки и белок объединяли с обеспечением конъюгирования белка с клеточной поверхностью. Затем остаточный непрореагировавший линкер обнаруживали путем добавления флуоресцентно меченного линкера, где добавление Cy5–DBCO давало реакцию с остаточным линкером на клетке и обеспечивало его идентификацию, а добавление Cy5–биотин–азида давало реакцию с остаточным линкером на белке и обеспечивало его идентификацию. В эксперименте показаны низкие уровни непрореагировавшего линкера на белках, конкретно 11,2%. В этом примере продемонстрирована возможность обнаружения ранее непрореагировавших линкерных сайтов на изготовленных клетке и белке, например, в качестве теста контроля качества. В нем также продемонстрирована возможность уменьшения количества непрореагировавших линкерных сайтов на изготовленных клетке и белке путем введения их в реакцию с линкером, например, линкером с низким стерическим затруднением.

Пример 9. Конъюгирование экзогенных полипептидных средств с различными типами клеток

Смесь клеток получали из селезенки мыши путем механического разрушения и лизирования красных кровяных клеток. Оставшиеся клетки метили с помощью 0,1 мМ сложного сульфо–NHS–эфира 3–азидопропионовой кислоты (AS). Очищенную аспарагиназу E. coli метили с помощью DBCO. Затем меченые клетки и белок объединяли с обеспечением возможности конъюгирования. Аспарагиназу на поверхности обнаруживали с помощью кроличьего антитела к аспарагиназе и вторичного антитела к кроличьему антителу, меченного Alexa Fluor 657. Подлинность каждого типа клеток выявляли с помощью маркеров, описанных в таблице 7. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. В эксперименте показано значительное мечение у всех протестированных типов клеток, как указано в таблице 7, с применением стратегии гейтирования, разработанной для различения разных типов клеток в популяции.

Таблица 7. Эффективность мечения у разных типов клеток

Маркеры	Тип клеток	Процент подвергнутых прикреплению с помощью клик–химии согласно обнаружению белков
CD3+ CD4+	CD4 T–клетки	99,1%
CD3+ CD8+	CD8 T–клетки	99,2%
CD3– NK1,1+	Естественные клетки–киллеры	99,4%
CD3+ NK1,1+	Естественные киллерные T–клетки	99,3%
CD11b+	Миелоидные клетки	89,4%
CD11c+	Дендритные клетки	88,5%
CD19+CD61–	B–клетки	95,0%
CD61+ CD19– CD11b–	Тромбоциты	96,7%
Ly6G++	Нейтрофилы	84,1%

В данном эксперименте также продемонстрировано конъюгирование фермента с поверхностью многочисленных клеток, включая иммунные клетки, ядросодержащие клетки и безъядерные клетки.

Пример 10. Эритроидные клетки, конъюгированные с экзогенным полипептидным средством, замедляют рост опухоли in vivo

Для тестирования эффектов функционализированных эритроидных клеток на рост опухоли применяли модельную систему рака толстой кишки на основе MC38 мыши. Не вдаваясь в теорию, считается, что 41BBL замедляет рост опухоли, вызывая ответы разнообразных иммунных эффекторов, как со стороны ветви врожденного, так и адаптивного иммунитета. Наиболее сильные ответы стимулируют пролиферацию цитотоксических CD8+ T–клеток и повышение их эффекторного потенциала посредством увеличения выработки гамма–интерферона и экспрессии множества гранзимов. В противоположность этому, в опубликованных данных доклинических испытаний с применением множества агонистов 4–1BB показано, что в MC38 или других моделях отдельное средство характеризовалось незначительной противоопухолевой активностью или ее отсутствием (Chen, et al, 2014; Kudo–Saito, et al, 2006; Kocak, et al, Canc Res 2006; Tirapu, et al, Int J Cancer 2004; John, et al, Canc Res 2012). Эти различия в активности позволяют предположить, что воспроизведение межклеточного связывания эффекторных клеток 4–1BB (например, T–клеток, NK–клеток) с помощью клеточной презентации эритроидными клетками, экспрессирующими 4–1BB–L, более эффективно для стимуляции противоопухолевых ответов, чем подходы, основанные на применении агонистических антител.

Клетки конъюгировали с 41BBL, как описано в примере 5. В этом исследовании 94,7% клеток являлись меченными m4–1BB–L. Количество молекул, присоединенных в качестве метки на клетку, количественно определяли с применением проточной цитометрии. Что касается введения доз животным, то в среднем в виде одной дозы вводили 1,1e9 mRBC с m4–1BB–L, при этом в среднем на клетку приходилось по 36200 молекул m4–1BB–L, что соответствует 0,084 мг/кг m4–1BB–L на дозу.

Четырнадцати самкам мышей C57/B6 6–8–недельного возраста инокулировали подкожно в левый бок 5×10⁵ клеток MC–38. Значения веса и состояние животных регистрировали ежедневно, и размеры опухоли измеряли 3 раза в неделю.

Опухоли измеряли три раза в неделю путем измерения каждой опухоли в 2 плоскостях. Объемы опухолей рассчитывали с применением стандартной формулы: (L × W²)/2. Средний вес опухоли и стандартную погрешность среднего значения рассчитывали для каждой группы в каждый момент времени.

Наблюдаемая противоопухолевая активность mRBC с m4–1BB–L по сравнению с активностью необработанных контролей показана на ФИГ. 4, и она демонстрирует снижение роста опухоли у мышей, обработанных с помощью mRBC с m4–1BB–L. Распределения значений объема опухоли демонстрировали статистически значимые отличия между группами, начиная с 5 дня исследования и вплоть до 9 дня (P < 0,05, Т–критерий).

Вес тела регистрировали ежедневно. Для каждой мыши изменения веса тела рассчитывали относительно веса тела, зарегистрированного в день 1. Обработка характеризовалась хорошей переносимостью, что видно из общего повышения веса тела у большинства мышей. Мыши, у которых отмечали некоторое снижение веса тела, на протяжении исследования теряли не более 5% от общего веса тела.

Эти данные подтверждают значительное преимущество в эффективности и активности клеточной презентации 4–1BB–L посредством эритроидных клеток над подходами с применением агонистических антител. Значимую противоопухолевую активность наблюдали с применением mRBC с m4–1BB–L в модели MC38, не наблюдаемую ранее с агонистическим антителом к 4–1BB, вводимым на 10–кратно более высоком уровне, чем m4–1BB–L, в той же модели (Chen, et al, 2014). Повышенная эффективность и активность mRBC с m4–1BB–L по сравнению с подходами с применением агонических антител согласуется с клеточной презентацией 4–1BB–L и соответствующей мультимеризацией рецептора 4–1BB, которая необходима для индукции эффективной передачи сигналов с участием 4–1BB (Bremer, 2013), как это обычно происходит в иммунном синапсе.

Пример 11. Эритроидные клетки, содержащие три экзогенных полипептидных средства, ковалентно соединенных с клеточной поверхностью с помощью остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии

Для тестирования возможности мечения клеток множеством средств, эритроидные клетки функционализировали тремя разными средствами. Три средства (фактор VIIa, фактор Xa и Cy5) метили сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром (DS) или приобретали в виде помеченных DBCO (т. е. Cy5). Клетки метили с помощью сложного сульфо–NHS–эфира 3–азидопропионовой кислоты (AS). Меченые клетки объединяли с мечеными средствами с обеспечением возможности конъюгирования. Присутствие трех средств на клетках обнаруживали с помощью проточной цитометрии. Эксперимент указывает на то, что 33,6% клеток были положительными по всем трем средствам.

Пример 12. Средства, соединенные с сахарами

Средства можно соединить непосредственно с белками на клеточной поверхности, например, как описано выше. Однако средства также можно соединять с сахарами на клеточной поверхности, например, с гликановыми цепями гликопротеинов, как описано в этом примере. Клетки, содержащие гликаны на клеточной поверхности, метили бифункциональным линкером, имеющим один функциональный для клик–химии компонент и одну группу, которая вступает в реакцию с гликаном.

В одном подходе функциональный для клик–химии компонент добавляют к гликану с применением адаптированного коммерчески доступного набора, разработанного для мечения гликанов на антителах. В этой адаптации клетки, а не антитело, сначала обрабатывают эндогликозидазой с обеспечением гидролиза гликанов после корового GlcNAc. Затем клетки промывают и обрабатывают сконструированной галактозилтрансферазой GalT (Y289L) и GalNазидом. GalT обеспечивает присоединение остатка GalNазида к экспонированному GlcNAc, что приводит к образованию азида, доступного для биосовместимой стимулированной напряжением азид–алкиновой химической реакции с алкин–модифицированным белком.

В другом подходе фрагменты сахаров в гликанах сначала модифицируют с образованием альдегидов и кетонов посредством мягкого опосредованного периодатом окисления вицинальных диолов с применением методики, описанной в de Bank et al. Biotechnol Bioeng 81: 800–808, 2003. Затем к полученным альдегидным и кетоновым группам можно добавить алкинсодержащий или азидсодержащий функциональный для клик–химии компонент с применением алкингидразида или этимилгидразида соответственно. Затем средство можно пометить соответствующим азидом или алкином, как описано в других примерах выше. Затем меченое средство инкубируют с мечеными клетками с обеспечением возможности конъюгирования. Связывание средства с клеткой можно обнаружить с помощью проточной цитометрии, например, как описано выше.

Связь также может включать сахар на средстве. Например, средство (например, экзогенный белок или антитело), содержащее сахар, можно пометить бифункциональным линкером, имеющим один функциональный для клик–химии компонент и одну группу, которая вступает в реакцию с гликаном, например, одним из линкеров, описанных выше. Клетку можно пометить вторым линкером, например, линкером, который вступает в реакцию с белком или сахаром на клеточной поверхности. Затем меченую клетку и меченое средство смешивают вместе с обеспечением возможности конъюгирования. Связывание средства с клеткой можно обнаружить с помощью проточной цитометрии, например, как описано выше.

Пример 13. Измерение иммуногенности функционализированных эритроидных клеток

В некоторых вариантах осуществления функционализированные эритроидные клетки обладают низкой иммуногенностью. Иммуногенность можно тестировать путем измерения антител, выработанных к белку, экспрессированному на эритроидной или другой клетке. Одним стандартным способом измерения этих антител является применение прямого ELISA. Иммуногенность в отношении белка или средства, соединенных с эритроидной клеткой, можно измерить путем введения функционализированной эритроидной клетки животному или пациенту и затем получения образцов плазмы или сыворотки крови в течение периода, составляющего несколько дней или недель. Получают серийные разведения образцов и затем инкубируют в течение 10–120 минут в лунках планшета для ELISA, которые предварительно покрыты белком или средством, применяемыми для функционализации эритроидной клетки, так что можно связать любые антитела, выработанные к белку или средству. Затем планшеты промывают и инкубируют с меченными ферментом (например, пероксидазой хрена) поликлональными антителами, которые связываются с любыми антителами, которые были связаны с белком или средством. Затем лунки промывают и уровень ферментативной активности, оставшейся в лунке, измеряют с оцениванием уровня антител, полученных к белку или средству, применяемым для функционализации эритроидной клетки.

Пример 14. Функционализация эритроидных клеток цитотоксическим для эритроидных клеток средством

В этом примере описано, как можно функционализировать клетку токсичным средством, например, средством, которое при экспрессии в эритроидной клетке будет токсичным для нее, например, средством, которое снижает скорость роста, жизнеспособность, продолжительность жизни клетки или функцию (цитотоксическое для эритроидной клетки). Цитотоксические средства включают, например, ферментные белки, которые разрушают аминокислоты и нарушают рост и размножение клетки, ферменты, которые участвуют в модификации или разрушении ключевых метаболических молекул или молекулярных промежуточных соединений, или белки или молекулы, такие как рицин, которые препятствуют осуществлению критически важных клеточных процессов.

Одним примером цитотоксического для эритроидных клеток средства является аспарагиназа, которую применяют в клинике для обеспечения голодания раковых клеток. Сверхэкспрессия аспарагиназы в созревающих эритроидных клетках препятствует клеточному росту и созреванию клеток.

Клетки, например, красные кровяные клетки мыши от B6.129S7–Rag1^tm1MomIJ (нокаутные по Rag1 мыши), метили in vivo путем введения мышам с помощью инъекции 2 мг сложного сульфо–NHS–эфира 3–азидопропионовой кислоты и затем собирали клетки через 2 дня.

Цитотоксическое для эритроидных клеток средство, например, аспарагиназу, метили с помощью 5x и 2,5x молярного избытка сложного DBCO–сульфо–NHS–эфира в течение 30 минут при 25°C. 5x молярный избыток сложного DBCO–сульфо–NHS–эфира приводит к получению ~ 2 меток на мономер аспарагиназы, а 2,5x молярный избыток сложного DBCO–сульфо–NHS–эфира приводит к получению ~ 1,2 меток на мономер аспарагиназы.

Затем меченые клетки объединяли с аспарагиназой с разной степенью мечения DBCO в 2 разных концентрациях в течение 60 минут с обеспечением возможности конъюгирования и получения клеток с разной степенью мечения. Присутствие средства на поверхности клетки можно обнаружить с помощью анализа аспарагиназной активности с применением проточной цитометрии с антителом к аспарагиназе.

Таблица 8. Аспарагиназная активность меченых клеток

	Реакция мечения клетки	Аспарагиназная активность меченых клеток
Более высокая степень мечения	1e9 клеток+1,6 мг аспарагиназы, модифицированной с помощью ~ 2 меток/тетрамер	2,16e–10 единиц/клетка
Более низкая степень мечения	1e9 клеток+0,2 мг аспарагиназы, модифицированной с помощью ~ 1,2 меток/тетрамер	4,32e–11 единиц/клетка

У мышей можно протестировать относительную способность конъюгированной с красной кровяной клеткой аспарагиназы по сравнению с неконъюгированной аспарагиназой истощать уровень аспарагина в сыворотке крови с течением времени. Мышам вводили с помощью инъекции контрольные красные кровяные клетки, RBC, меченые высокими или низкими количествами аспарагиназы вместе или низкими, средними или высокими количествами неконъюгированной рекомбинантной аспарагиназы, как указано в таблице 9. Контрольные и конъюгированные с аспарагиназой RBC дополнительно метили флуоресцентной меткой Cy5 для определения фармакокинетики RBC после инъекции. Затем отбирали образцы крови в разные моменты времени после инъекции для определения уровней аспарагина и уровней меченых RBC.

Таблица 9. План проведения инъекции меченных аспарагиназой клеток у мышей

	Мышь–реципиент	Количество животных	Описание	Количество введенных с помощью инъекции клеток	Общее количество введенных единиц аспарагиназы
Группа 1	C57BL/6	3	Клетки, не меченные аспарагиназой	1e9	–
Группа 2	C57BL/6	3	Клетки, меченные аспарагиназой в высокой дозе	1e9	0,22
Группа 3	C57BL/6	3	Клетки, меченные аспарагиназой в низкой дозе	1e9	0,043
Группа 4	C57BL/6	3	2,8 мкг рекомбинантной аспарагиназы	–	0,19
Группа 5	C57BL/6	3	0,39 мкг рекомбинантной аспарагиназы	–	0,025
Группа 6	C57BL/6	3	15 мкг рекомбинантной аспарагиназы	–	0,97
Группа 7	B6.129S7–Rag1tm1MomIJ	3	Клетки, не меченные аспарагиназой	1e9	–
Группа 8	B6.129S7–Rag1tm1MomIJ	3	Клетки, меченные аспарагиназой в высокой дозе	1e9	0,22
Группа 9	B6.129S7–Rag1tm1MomIJ	3	Клетки, меченные аспарагиназой в низкой дозе	1e9	0,043
Группа 10	B6.129S7–Rag1tm1MomIJ	3	2,83 мкг рекомбинантной аспарагиназы	–	0,19
Группа 11	B6.129S7–Rag1tm1MomIJ	3	0,385 мкг рекомбинантной аспарагиназы	–	0,025

При введении мышам C557BL/6 с помощью инъекции 0,39, 2,8 или 15 микрограммов рекомбинантной аспарагиназы аспарагин в сыворотке крови снижался практически до нуля через 6 часов после инъекции (ФИГ. 5). Однако для группы с 0,39 мкг уровни аспарагина в сыворотке крови возрастали практически до нормальных уровней через 1 день после инъекции, тогда как в группах с дозой 2,8 и 15 мкг они возрастали практически или приблизительно до нормальных уровней через 4 дня. В отличие от этого, уровни аспарагина снижались практически до нуля в период от 6 часов до 8 дней у мышей C57BL/6, которым вводили низкие или высокие количества аспарагиназы, связанной с красными кровяными клетками, при этом уровни начинали снова возрастать к 11 дню (ФИГ. 5). Аналогичные результаты получали у мышей Rag1 (ФИГ. 6); однако в отличие от мышей C57BL/6, уровни аспарагина оставались практически нулевыми вплоть до 29 дня (ФИГ. 6). Фармакокинетику клеток, конъюгированных с ASN–азой, также измеряли путем определения процентной доли Cy5–положительных клеток в различные моменты времени после инъекции с применением проточной цитометрии. Через день после инъекции выведение оставшихся клеток, конъюгированных с ASN–азой, было аналогичным таковому у Cy5–меченых клеток (ФИГ. 7A и 7B). Примерно 20% RBC, присутствующих в кровотоке в 1 день, оставались в крови к 18 дню. Для клеток с более высоким уровнем ASN–азы изначальное быстрое выведение клеток было большим, чем в случае клеток с более низкими уровнями ASN–азы. Несмотря на изначальное быстрое выведение, клетки, остающиеся в кровотоке после первого дня, продолжали обнаруживаться в кровотоке к по меньшей мере 22 дню. Этот эксперимент демонстрирует, что конъюгирование аспарагиназы с красными кровяными клетками существенно улучшает время циркуляции аспарагиназы в крови. Это увеличенное воздействие связано с существенным улучшением способности снижать уровни аспарагина в сыворотке крови в течение нескольких дней и недель с применением однократной дозы.

Кроме того, фармакокинетический профиль для меченных аспарагиназой RBC также не изменялся при повторном введении доз, указывая на отсутствие иммуногенного ответа на меченные аспарагиназой RBC для всех трех уровней аспарагиназы, как можно обнаружить с помощью данного анализа.

Пример 15. Связывание средства, представляющего собой фермент, с эритроидными клетками посредством остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии

Фактор Xa (FXa) связывали с эритроидными клетками. Для проведения реакции эритроидные клетки в количестве 1e9-1,36e10 клеток/мл метили сложным сульфо–NHS–эфиром 3–азидопропионовой кислоты (AS), а FXa метили сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром (DS). Меченые клетки инкубировали с 0,5–1,7 мг/мл меченого FXa в объеме 10 мкл - 3 мл в течение 1 часа при 23°C. Затем клетки промывали фосфатно-солевым буферным раствором с 0,1% бычьим сывороточным альбумином и окрашивали флуоресцентным реагентом для обнаружения (антителом к FXa с PE). Затем клетки анализировали посредством проточной цитометрии с определением эффективности прикрепления белка с помощью клик-химии. Было определено, что эффективность прикрепления белка с помощью клик-химии находится в диапазоне 99%. В этом эксперименте продемонстрировано получение популяции клеток, характеризующихся очень высокой эффективностью мечения ферментом.

Количество молекул белка, представляющего собой фактор Xa, на клетку количественно определяли по антителосвязывающей емкости, которая составляла 1000–250000 молекул на клетку. Количество белка на клетку можно отрегулировать, например, используя концентрацию белка, количество клеток и объем реакционной смеси, например, описанные в примере 4.

Активность фактора Xa количественно определяли по активности TGA как составляющую не более 14000 активных молекул на клетку.

Пример 16. Связывание белковых средств с эритроидными клетками человека посредством остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии

Фактор Xa (FXa) и аспарагиназу (ASN–аза) связывали с эритроидными клетками человека. Для проведения реакции эритроидные клетки метили сложным сульфо–NHS–эфиром 3–азидопропионовой кислоты (AS), а FXa и ASN–азу метили соответственно сложным DBCO–PEG5–NHS–эфиром (DP) и сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром (DS). Меченые клетки инкубировали с 1,03 мг/мл меченого FXa и 4,535 мг/мл ASN–азы в объеме 10 мкл в течение 1 часа при 23°C. Затем клетки промывали фосфатно–солевым буферным раствором с 0,1% бычьим сывороточным альбумином и окрашивали флуоресцентным реагентом для обнаружения (антителом к FX с PE и антителом к ASN–азе с AlexaFluor 488). Затем клетки анализировали посредством проточной цитометрии с определением эффективности прикрепления белка с помощью клик–химии. Было определено, что эффективность прикрепления белка с помощью клик–химии находится в диапазоне 99,9% для FXa и 71,1% для ASN–азы. В этом эксперименте продемонстрировано получение популяции эритроидных клеток человека, характеризующихся очень высокой эффективностью мечения разными белками.

Пример 17. Связывание пептидного средства с эритроидными клетками посредством остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии

Биотинилированный пептид миелин–олигодендроцитарный гликопротеин 35–55 (MOG), связывали с эритроидными клетками. Для проведения реакции эритроидные клетки метили различными количествами (высоким и низким) сложного сульфо–NHS–эфира 3–азидопропионовой кислоты (AS), а пептид MOG метили сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром (DS). Меченые клетки инкубировали с 2,7 мг/мл меченого MOG–DBCO в объеме 10 мкл в течение 1 часа при 23°C. Затем клетки промывали фосфатно–солевым буферным раствором с 0,1% бычьим сывороточным альбумином и окрашивали флуоресцентным реагентом для обнаружения (антителом к биотину с PE). Затем клетки анализировали посредством проточной цитометрии с определением эффективности прикрепления пептида с помощью клик–химии. Было определено, что эффективность прикрепления пептида с помощью клик–химии находится в диапазоне от 67,4% до 91,8% для MOG. В этом эксперименте продемонстрировано получение популяции клеток, характеризующихся регулируемой степенью эффективности мечения пептидом. В этом эксперименте также продемонстрировано, что короткий пептид (приблизительно 20 аминокислот) может быть эффективно прикреплен с помощью клик–химии к эритроидным клеткам.

Пример 18. Связывание средства, представляющего собой цитокин, с эритроидными клетками посредством остаточного линкера, содержащего характерный признак клик–химии

IL10 человека (hIL10) связывали с эритроидными клетками. Для проведения реакции эритроидные клетки метили сложным сульфо–NHS–эфиром 3–азидопропионовой кислоты (AS), а hIL10 метили сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром (DS). Меченые клетки инкубировали с 0,24–0,79 мг/мл меченого hIL10 в объеме 2 мкл в течение 1–3 часов при 23°C или 16 часов при 4°C. Затем клетки промывали фосфатно–солевым буферным раствором с 0,1% бычьим сывороточным альбумином и окрашивали флуоресцентным реагентом для обнаружения (антителом к hIL10 с PE). Затем клетки анализировали посредством проточной цитометрии с определением эффективности прикрепления белка с помощью клик–химии. Как показано в таблице 10, было определено, что эффективность прикрепления белка с помощью клик–химии находится в диапазоне 76,7–100%. Клетка считается положительной по флуоресценции, если ее флуоресценция больше, чем у 99% других аналогичных немеченых клеток. В этом эксперименте продемонстрировано получение популяции клеток, характеризующихся очень высокой эффективностью мечения, например, более 200000 молекул на клетку.

Таблица 10. Эффективность мечения клеток hIL10

Количество клеток	Концентрация hIL10 (мг/мл)	Продолжительность реакции клик–химии (часы)	Молекулы hIL10/клетка	Процент клеток, положительных по флуоресценции
4E7	0,79	1	69,964	76,7%
4E7	0,79	3	128,766	99,9%
4E7	0,24	16	158,572	99,9%
4E7	0,583	1	208,519	100%

Пример 19. Цитокин, связанный с эритроидными клетками, обладает связывающей активностью

Функционализированные эритроидные клетки, содержащие прикрепленные с помощью клик–химии белки, тестировали в отношении способности связывать физиологический лиганд. Как обсуждалось выше, зачастую желательно обеспечивать высокую процентную долю меченых клеток и высокий уровень прикрепленных с помощью клик–химии белков на клетку с одновременным сохранением связывающей активности белка.

IL10 человека (hIL10) связывали с эритроидными клетками, как описано в примере 18. Затем клетки приводили в контакт с продуктом слияния альфа–рецептора IL10 человека и Fc (родственный партнер по связыванию для hIL10), меченное аллофикоцианином (APC) антитело, которое связывает Fc, применяли для обнаружения взаимодействия hIL10, прикрепленного с помощью клик–химии к клеткам, и его связывания с альфа–рецептором IL10 человека. Связывание альфа–рецептора hIL10 с клетками указывает на то, что hIL10 не только присутствует на эритроидных клетках, но и что его сайт связывания функционален и ориентирован для обеспечения связывания. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии с определением эффективности мечения белком. Как показано в таблице 11, было определено, что связывание hIL10 находится в диапазоне 90,0–95,0%. Клетка считается положительной по флуоресценции, если ее флуоресценция больше, чем у 99% других аналогичных немеченых клеток. В этом эксперименте продемонстрировано получение клеток с очень высокой эффективностью мечения, при этом без "чрезмерного мечения", например, без разрушения сайта связывания лиганда.

Таблица 11. Связывание комплекса эритроидная клетка–hIL10 с альфа–рецептором hIL10

Количество клеток	Степень мечения hIL10 вес/DS	Процент клеток, положительных по флуоресценции
5E6	~0,63	93,3%
5E6	~1,39	95,0%
1E7	~0,43	90,0%

Пример 20. Связывание цитокина в комбинации с нацеливающим фрагментом с эритроидными клетками

IL10 человека (hIL10) в комбинации с Fab к α4β7 связывали с эритроидными клетками. Для проведения реакции эритроидные клетки метили сложным сульфо–NHS–эфиром 3–азидопропионовой кислоты (AS), hIL10 и Fab к α4β7 отдельно метили сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром (DS). Меченые клетки инкубировали с 0,583 мг/мл меченого hIL10 в объеме 30 мкл и с 2,434 мг/мл меченого Fab к α4β7 в объеме 19,35 мкл в течение 2 часов при 23°C. Затем клетки промывали фосфатно–солевым буферным раствором с 0,1% бычьим сывороточным альбумином и окрашивали флуоресцентными реагентами для обнаружения (антителом к hIL10 с BV421 и антителом к легкой каппа–цепи крысы с PE). Затем клетки анализировали посредством проточной цитометрии с определением эффективности прикрепления белка с помощью клик–химии. Было определено, что эффективность прикрепления двух белков с помощью клик–химии составляет примерно 98,3%. Клетка считается положительной по флуоресценции, если ее флуоресценция больше, чем у 99% других аналогичных немеченых клеток. В этом эксперименте продемонстрировано получение популяции клеток, характеризующихся очень высокой эффективностью мечения цитокином и нацеливающим фрагментом.

Пример 21. Специфичность клик–химии

В данном примере продемонстрирована специфичность мечения с помощью клик–химии. Оценивали три образца. Первый, необработанные красные кровяные клетки мыши (без функционального для клик–химии компонента) смешивали с белковым средством (Fab к a4b7), содержащим функциональный для клик–химии компонент DBCO. Второй, красные кровяные клетки мыши, содержащие азидный функциональный для клик–химии компонент, смешивали с Fab к a4b7 без функционального для клик–химии компонента. Третий, красные кровяные клетки мыши, содержащие азидный функциональный для клик–химии компонент, смешивали с Fab к a4b7, содержащим совместимый функциональный для клик–химии компонент DBCO. Обеспечивали возможность протекания реакции в течение 1 часа при комнатной температуре в PBS. Затем клетки анализировали в отношении присутствия Fab к a4b7 путем приведения их в контакт с антителом к каппа–цепи IgG крысы, конъюгированным с PE (фикоэритрином), и выполнения проточной цитометрии. Клетки считали положительными по флуоресценции, если их сигнал был больше, чем сигнал у 99% необработанных аналогичных клеток в присутствии реагента для обнаружения, но в отсутствие белка Fab к a4b7. Как и ожидалось, первый и второй образцы характеризовались низкой флуоресценцией (флуоресцировало 1,81% и 1,53% клеток соответственно), тогда как третий образец характеризовался высокой флуоресценцией (флуоресцировало 95,2% клеток). Этот пример демонстрирует, что мечение с помощью клик–химии является высоко специфичным.

Пример 22. Конъюгирование функционального для клик–химии компонента с N–концом средства

Часто желательно предотвратить нарушение биологических свойств белка, например, путем смещения меток к N–концу представляющего интерес белка, например, с обеспечением лучшего сохранения функциональности С–концевого домена. Представляющие интерес белки готовили для связывания с эритроидными клетками путем мечения связывающим реагентом. Для лучшего сохранения функциональности IL10 человека химическую реакцию с применением сложного NHS–эфира ориентировали в отношении N–концевого мечения. Белки обессоливали, и буфер заменяли на PBS, а затем концентрировали до ≥1 мг/мл перед мечением. Значение рH поддерживали на уровне, соответствующем нейтральному pH, составляющему примерно 7–7,4.

Исходные растворы связывающих реагентов получали, как описано в примере 1. Связывающий реагент добавляли в молярном соотношении 1:1 относительно концентрации белка. Реакционную смесь для мечения белком инкубировали при комнатной температуре в течение периода от 1 часа до 1 часа и 30 минут с легким перемешиванием каждые 10 минут. С целью определения уровня мечения применяли программу Nanodrop UV–Vis для считывания примерно 1–3 мкл меченого белка с поглощением при 280 нм и 309 нм с поправкой на фон при 750 нм. Степень мечения находилась в диапазоне 0,63–1,39 молекул функционального для клик–химии компонента DBCO на белок.

Пример 23. Конъюгирование функционального для клик–химии компонента со средством, содержащим свободный цистеиновый остаток, например, расположенный в π–зажиме, с помощью химической реакции с применением малеимида

Может быть желательным лучшее сохранение биологических свойств белка, например, путем введения свободного цистеина в представляющий интерес белок для сайт–специфического конъюгирования с помощью химической реакции с применением малеимида. Представляющие интерес белки (например, 41BBL мыши) готовили для связывания с эритроидными клетками путем мечения связывающим реагентом. Для лучшего сохранения функциональности белка в рекомбинантный белок 41BBL вводили свободный цистеин в виде последовательности из четырех аминокислот (FCPF, SEQ ID NO: 64), известной как "π–зажим", для сайт–специфического конъюгирования с помощью химической реакции с применением малеимида. Хотя в этом примере используется π–зажим, предполагается, что любой свободный цистеиновый остаток можно применять для сайт–специфического конъюгирования, например, как описано в данном документе. Белки обессоливали, подвергали замене буфера на PBS и концентрировали до ≥1 мг/мл перед мечением. Белки восстанавливали с помощью 1 мМ DTT, инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и обессоливали на колонке NAP5.

Малеимидный связывающий реагент добавляли в 5–кратном молярном избытке относительно концентрации белка. Реакционную смесь для мечения белком инкубировали при комнатной температуре в течение 4 часов и обессоливали с применением колонки NAP10. С целью определения уровня мечения применяли программу Nanodrop UV–Vis для считывания примерно 1–3 мкл меченого белка с поглощением при 280 нм и 309 нм с поправкой на фон при 750 нм. Степень мечения находилась в диапазоне 6–7,6 молекул функционального для клик–химии компонента DBCO на белок.

Пример 24. Конъюгирование функционального для клик–химии компонента со средством, содержащим два цистеиновых остатка, с помощью химической реакции с применением ThioLinker

Может быть желательно ввести функциональный для клик–химии компонент в конкретный сайт в представляющем интерес белке и/или в определенной ориентации. Представляющие интерес белки готовили для связывания с эритроидными клетками путем мечения связывающим реагентом. В одном способе вводили химический ThioLinker в рекомбинантный белок Fab к CTLA4 для сайт–специфического конъюгирования функционального для клик–химии компонента посредством образования мостика дисульфидной связи. Fab обессоливали, подвергали замене буфера на PBS и концентрировали до ≥1 мг/мл перед мечением. Затем Fab восстанавливали с помощью 5 мМ DTT, инкубировали в течение 1 часа при 37°C и затем подвергали замене буфера на PBS. Связывающий реагент ThioLinker добавляли в 15–кратном молярном избытке относительно концентрации белка с обеспечением мечения восстановленной дисульфидной связи. Реакционную смесь для мечения белком инкубировали при 4°С в течение 16–18 часов и обессоливали с применением колонки Zeba. С целью определения уровня мечения применяли программу Nanodrop UV–Vis для считывания примерно 1–3 мкл меченого белка с поглощением при 280 нм и 309 нм с поправкой на фон при 750 нм. Степень мечения составляла 8,3 молекул функционального для клик–химии компонента DBCO на белок. Ориентированное с помощью функционального для клик–химии компонента ThioLinker мечение Fab к CTLA–4 сравнивали с другими реагентами–функциональными для клик–химии компонентами, и было обнаружено, что он приводит к значимому мечению клеток. Было также обнаружено, что меченное с помощью ThioLinker антитело к CTLA–4 значительно увеличивает функциональное связывание с рекомбинантным CTLA4.

В другом способе химический ThioLinker применяли для сайт–специфичного мечения рекомбинантного белка (41BBL мыши с HIS6) посредством метки очистки HIS6. Белки обычно обессоливали, подвергали замене буфера на PBS и концентрировали до ≥1 мг/мл перед мечением. Затем связывающий реагент ThioLinker добавляли в 20–кратном молярном избытке относительно концентрации белка для прикрепления метки к метке HIS6 белка (не восстановленной). Реакционную смесь для мечения белком инкубировали при комнатной температуре в течение 3 часов и подвергали замене буфера на PBS с применением обессоливающей колонки Zeba. Мечение с помощью ThioLinker 41BBL мыши с HIS6, прикрепленного с помощью клик–химии к RBC, меченной AS, приводило к повышенной функциональной способности клеток, к которым был прикреплен с помощью клик–химии 41BBL, в отношении активации иммунных клеток, как показано по выработке IL–2 (ФИГ. 8A) и выработке интерферона–γ (IFN–γ) (ФИГ. 8B) соответственно. Было отмечено, что ориентированное связывание 41BBL мыши с HIS6 приводило к существенно большей секреции IL–2 и IFN–γ по сравнению с произвольным связыванием, хотя последнее индуцировало значительно более высокую секрецию цитокинов, чем CTL–контроль, полученный с помощью клик–химии (меченные только с помощью AS RBC).

Пример 25. Получение средства, содержащего неканоническую аминокислоту (ncAA)

Может быть желательным ввести связывающий реагент в конкретный представляющий интерес сайт в белке, представляющем интерес, например, путем включения неканонических аминокислот (ncAA) в белок, представляющий интерес, сайт–специфическим образом. В этом примере представляющие интерес белки получали путем совместной трансфекции клеток Expi293 плазмидой, содержащей пару tRNA/аминоацил–tRNA–синтаза, и плазмидой, кодирующей представляющий интерес белок (mIg–41BBL мыши) с янтарным стоп–кодоном (TAG), включенным в представляющий интерес сайт. Клетки высевали и осуществляли трансфекцию плазмидами при концентрации каждой плазмиды 1,5 мкг/мл с применением набора ExpiFectamine в день 1. В тот же день различные концентрации (2 мМ, 1,3 мМ, 1 мМ, 250 мкМ) ncAA (экзо(BCN)–Lys; ФИГ. 9A) добавляли к трансфицированным клеткам для сайт–специфического включения вместо янтарного стоп–кодона. На 3–й день после трансфекции среду собирали для получения секретированных белков. То, содержат ли секретированные белки сайт–специфическое включение ncAA, подтверждали посредством инкубирования с азид–биотин–Cy5 в течение 30 мин. при комнатной температуре и последующим анализом с помощью вестерн–блоттинга. Белки обнаруживали с помощью антитела к 41BBL и вторичного антитела с HRP, а включение функционального для клик–химии компонента обнаруживали с помощью антитела к биотину с HRP.

Таблица 12. Прикрепленные с помощью клик–химии белки

Белок	Химический реагент для мечения
Овальбумин	Сложный DBCO–сульфо–NHS–эфир
Эрвиназа (аспарагиназа из Erwinia)	Сложный DBCO–сульфо–NHS–эфир
Уриказа	Сложный DBCO–сульфо–NHS–эфир
Лизоцим	Сложный DBCO–сульфо–NHS–эфир
Fab к CTLA4	ThioLinker–DBCO
Fab к CD3	ThioLinker–DBCO
Fab к PDL1	ThioLinker–DBCO

Как показано на ФИГ. 9B, сайт–специфическое включение ncAA экзо(BCN)–лизина приводило к получению применимого в клик–химии 41BBL мыши.

Пример 26. Связывание уратоксидазы с эритроидными клетками посредством линкера, содержащего характерный признак клик–химии

Рекомбинантную уратоксидазу с His₆ из Candida utilis экспрессировали и очищали из E. coli и метили сложным DBCO–сульфо–NHS–эфиром с получением уратоксидазы с соотношением примерно 1 метка на мономер. Красные кровяные клетки (RBC) мыши метили сложным сульфо–NHS–эфиром 6–азидокапроновой кислоты. Проводили реакции связывания, при которых 1e9 меченых RBC мыши инкубировали в присутствии 0 мкM или 75 мкM DBCO–меченной уратоксидазы в течение 2 часов при комнатной температуре. Степень конъюгирования уратоксидазы оценивали путем окрашивания RBC мыши в отношении His₆–уратоксидазы с помощью меченного DyLight 488 антитела к His₆ с последующим анализом с помощью проточной цитометрии. 100% RBC, инкубированных с 75 мкМ уратоксидазы, были помечены ферментом; в отличие от этого, только 0,16% клеток отрицательного контроля, обработанных 0 мкМ уратоксидазы, демонстрировали положительную флуоресценцию в этом анализе. RBC, связанные с уратоксидазой, были способны обеспечивать эффективное истощение мочевой кислоты, демонстрируя уратоксидазную активность, составляющую приблизительно 4,6e–12 единиц/клетка.

Пример 27. Эритроидные клетки, содержащие экзогенное полипептидное средство, являются активными in vivo

Безъядерные эритроидные клетки со стороны их поверхности конъюгировали с антителом к PD–L1 и тестировали в отношении способности инфильтрировать опухоли у мышей.

Мышам инокулировали подкожно клетки B16F10. Опухолям давали вырасти до размера 400 кубических мм перед введением доз. Мышиные RBC конъюгировали с фрагментами антител (Fab) из мышиного антитела к PD–L1 и антитела изотипического контроля. Конъюгированные мышиные RBC метили с помощью CTFR в соответствии с протоколом производителя. Клетки вводили животным путем инфузии. Опухоли отбирали через один день после инфузии. Срезы опухолей получали и окрашивали с помощью антитела к CD31 для визуализации сосудистой сети опухоли и с помощью DAPI для визуализации ядер. Окрашенные срезы сканировали и делали их снимки. Зоны опухоли и зоны сосудистой сети идентифицировали с применением программного обеспечения Halo. Общее количество меченых клеток RBC в этих двух зонах определяли как для клеток, меченных антителом изотипического контроля, так и для клеток, меченных антителом к PD–L1. Рассчитывали соотношение RBC, выявленных в опухоли, и RBC, выявленных в сосудах. Соотношение RBC в сосудах и RBC в опухоли составляет 1 (средний показатель для опухолей от 8 мышей) для RBC, конъюгированных с антителом изотипического контроля, что указывает на аналогичные количества в опухоли и сосудистой сети. Соотношение RBC в сосудах и RBC в опухоли составляло 1,7 для мышей, обработанных антителом к PD–L1, указывая на накопление RBC в опухоли в группе с антителом к PD–L1 по сравнению с мышами с антителом изотипического контроля. Разница в соотношении между 2–я группами являлась статистически значимой с P < 0,01 (Т–критерий Стьюдента).

Не ограничиваясь теорией, опухоли, экспрессирующие более высокие уровни PD–L1, могут лучше отвечать на RCT, содержащие антитело к PD–L1, чем опухоли, которые экспрессируют более низкие уровни PD–L1. Клетки B16F10 экспрессировали приблизительно 300000 копий PD–L1 на клетку при стимулировании с использованием IFN–гамма при 10 нг/мкл. В противоположность этому, клетки CT26 экспрессировали приблизительно 150000 копий PD–L1 на клетку, а клетки A20 экспрессировали приблизительно 100000 копий PD–L1 на клетку при тех же условиях. Количество копий PD–L1 измеряли с применением набора Quantum Simply Cellular (Bangs Laboratories). Эритроидные клетки, содержащие антитело к PD–L1 на своей поверхности, демонстрировали более высокий уровень связывания с клетками B16F10, обработанными IFN–гамма, и CT26, чем с клетками A20, что согласуется с тем, что более высокие уровни экспрессии PD–L1 на опухолевых клетках обуславливают повышение уровня связывания эритроидных клеток с опухолевыми клетками.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> RUBIUS THERAPEUTICS, INC.

<120> ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫЕ ЭРИТРОИДНЫЕ КЛЕТКИ

<130> R2081-7021WO

<140>

<141>

<150> 62/542,142

<151> 2017-08-07

<150> 62/460,589

<151> 2017-02-17

<160> 64

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> источник

<223> /примечание="См. поданное описание для подробного описания замен и

предпочтительных вариантов осуществления"

<400> 1

Leu Pro Xaa Thr Gly

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Любая аминокислота

<400> 2

Leu Pro Xaa Thr Gly Gly

1 5

<210> 3

<211> 205

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность 4-1BBL"

<400> 3

Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala

35 40 45

Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro

50 55 60

Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp

65 70 75 80

Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe

85 90 95

Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val

100 105 110

Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala

115 120 125

Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg

130 135 140

Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly

145 150 155 160

Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala

165 170 175

Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr

180 185 190

Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

195 200 205

<210> 4

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 5

<211> 213

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 5

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 6

<211> 281

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 6

Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys

1 5 10 15

Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala

20 25 30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys

35 40 45

Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

50 55 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val

65 70 75 80

Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser

85 90 95

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

100 105 110

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

115 120 125

Thr Arg Arg Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

130 135 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly

145 150 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

180 185 190

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

195 200 205

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

210 215 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

245 250 255

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala

260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

275 280

<210> 7

<211> 281

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 7

Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys

1 5 10 15

Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala

20 25 30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys

35 40 45

Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

50 55 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val

65 70 75 80

Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser

85 90 95

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

100 105 110

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

115 120 125

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

130 135 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Arg Gly

145 150 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

180 185 190

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

195 200 205

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

210 215 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

245 250 255

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala

260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

275 280

<210> 8

<211> 281

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 8

Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys

1 5 10 15

Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala

20 25 30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys

35 40 45

Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

50 55 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val

65 70 75 80

Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser

85 90 95

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

100 105 110

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

115 120 125

Thr Arg Arg Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

130 135 140

Lys Ala Leu Gly Ile Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Arg Gly

145 150 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

180 185 190

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

195 200 205

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Asp Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

210 215 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

245 250 255

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala

260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

275 280

<210> 9

<211> 281

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 9

Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys

1 5 10 15

Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala

20 25 30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys

35 40 45

Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

50 55 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val

65 70 75 80

Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser

85 90 95

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

100 105 110

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

115 120 125

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

130 135 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly

145 150 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

180 185 190

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

195 200 205

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

210 215 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

245 250 255

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met His His Glu Ala

260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

275 280

<210> 10

<211> 281

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 10

Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys

1 5 10 15

Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala

20 25 30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys

35 40 45

Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

50 55 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val

65 70 75 80

Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser

85 90 95

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

100 105 110

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

115 120 125

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

130 135 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly

145 150 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

180 185 190

Gln Glu Arg Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

195 200 205

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

210 215 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

245 250 255

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met His His Glu Ala

260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

275 280

<210> 11

<211> 238

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 11

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp

20 25 30

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

35 40 45

Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

130 135 140

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val

145 150 155 160

Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

165 170 175

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

195 200 205

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr

210 215 220

His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 12

<211> 567

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность PAL"

<400> 12

Met Lys Thr Leu Ser Gln Ala Gln Ser Lys Thr Ser Ser Gln Gln Phe

1 5 10 15

Ser Phe Thr Gly Asn Ser Ser Ala Asn Val Ile Ile Gly Asn Gln Lys

20 25 30

Leu Thr Ile Asn Asp Val Ala Arg Val Ala Arg Asn Gly Thr Leu Val

35 40 45

Ser Leu Thr Asn Asn Thr Asp Ile Leu Gln Gly Ile Gln Ala Ser Cys

50 55 60

Asp Tyr Ile Asn Asn Ala Val Glu Ser Gly Glu Pro Ile Tyr Gly Val

65 70 75 80

Thr Ser Gly Phe Gly Gly Met Ala Asn Val Ala Ile Ser Arg Glu Gln

85 90 95

Ala Ser Glu Leu Gln Thr Asn Leu Val Trp Phe Leu Lys Thr Gly Ala

100 105 110

Gly Asn Lys Leu Pro Leu Ala Asp Val Arg Ala Ala Met Leu Leu Arg

115 120 125

Ala Asn Ser His Met Arg Gly Ala Ser Gly Ile Arg Leu Glu Leu Ile

130 135 140

Lys Arg Met Glu Ile Phe Leu Asn Ala Gly Val Thr Pro Tyr Val Tyr

145 150 155 160

Glu Phe Gly Ser Ile Gly Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr

165 170 175

Ile Thr Gly Ser Leu Ile Gly Leu Asp Pro Ser Phe Lys Val Asp Phe

180 185 190

Asn Gly Lys Glu Met Asp Ala Pro Thr Ala Leu Arg Gln Leu Asn Leu

195 200 205

Ser Pro Leu Thr Leu Leu Pro Lys Glu Gly Leu Ala Met Met Asn Gly

210 215 220

Thr Ser Val Met Thr Gly Ile Ala Ala Asn Cys Val Tyr Asp Thr Gln

225 230 235 240

Ile Leu Thr Ala Ile Ala Met Gly Val His Ala Leu Asp Ile Gln Ala

245 250 255

Leu Asn Gly Thr Asn Gln Ser Phe His Pro Phe Ile His Asn Ser Lys

260 265 270

Pro His Pro Gly Gln Leu Trp Ala Ala Asp Gln Met Ile Ser Leu Leu

275 280 285

Ala Asn Ser Gln Leu Val Arg Asp Glu Leu Asp Gly Lys His Asp Tyr

290 295 300

Arg Asp His Glu Leu Ile Gln Asp Arg Tyr Ser Leu Arg Cys Leu Pro

305 310 315 320

Gln Tyr Leu Gly Pro Ile Val Asp Gly Ile Ser Gln Ile Ala Lys Gln

325 330 335

Ile Glu Ile Glu Ile Asn Ser Val Thr Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val

340 345 350

Asp Asn Gln Ala Ser Tyr His Gly Gly Asn Phe Leu Gly Gln Tyr Val

355 360 365

Gly Met Gly Met Asp His Leu Arg Tyr Tyr Ile Gly Leu Leu Ala Lys

370 375 380

His Leu Asp Val Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Pro Glu Phe Ser Asn

385 390 395 400

Gly Leu Pro Pro Ser Leu Leu Gly Asn Arg Glu Arg Lys Val Asn Met

405 410 415

Gly Leu Lys Gly Leu Gln Ile Cys Gly Asn Ser Ile Met Pro Leu Leu

420 425 430

Thr Phe Tyr Gly Asn Ser Ile Ala Asp Arg Phe Pro Thr His Ala Glu

435 440 445

Gln Phe Asn Gln Asn Ile Asn Ser Gln Gly Tyr Thr Ser Ala Thr Leu

450 455 460

Ala Arg Arg Ser Val Asp Ile Phe Gln Asn Tyr Val Ala Ile Ala Leu

465 470 475 480

Met Phe Gly Val Gln Ala Val Asp Leu Arg Thr Tyr Lys Lys Thr Gly

485 490 495

His Tyr Asp Ala Arg Ala Cys Leu Ser Pro Ala Thr Glu Arg Leu Tyr

500 505 510

Ser Ala Val Arg His Val Val Gly Gln Lys Pro Thr Ser Asp Arg Pro

515 520 525

Tyr Ile Trp Asn Asp Asn Glu Gln Gly Leu Asp Glu His Ile Ala Arg

530 535 540

Ile Ser Ala Asp Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Val Gln Ala Val Gln

545 550 555 560

Asp Ile Leu Pro Cys Leu His

565

<210> 13

<211> 328

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность аспарагиназы Y vb"

<400> 13

Met Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala

20 25 30

Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys

35 40 45

Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu

50 55 60

Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu

65 70 75 80

Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr

85 90 95

Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser

100 105 110

Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile

115 120 125

Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly

130 135 140

Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Leu Asn Asp Arg

145 150 155 160

Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp

165 170 175

Thr Phe Lys Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn

180 185 190

Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser

195 200 205

Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu

210 215 220

Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln

225 230 235 240

His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val

245 250 255

Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Met Glu Lys Gly Val

260 265 270

Val Val Ile Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp

275 280 285

Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala

290 295 300

Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val

305 310 315 320

Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr

325

<210> 14

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala Ile Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 15

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Lys Ser

20 25 30

Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly

85 90 95

Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 16

<211> 160

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 16

Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro

1 5 10 15

Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

20 25 30

Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu

35 40 45

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

50 55 60

Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu

85 90 95

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

100 105 110

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe

115 120 125

Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

130 135 140

Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn

145 150 155 160

<210> 17

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность фактора

свертывания крови X"

<400> 17

Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu

20 25 30

Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp

35 40 45

Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly

50 55 60

Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn

65 70 75 80

Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys

85 90 95

Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala

100 105 110

Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly

115 120 125

Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val

130 135 140

Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp

145 150 155 160

Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp

165 170 175

Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu

180 185 190

Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp

195 200 205

Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr

210 215 220

Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln

225 230 235 240

Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu

245 250 255

Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn

260 265 270

Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu

275 280 285

Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro

290 295 300

Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile

305 310 315 320

Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg

325 330 335

Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu

340 345 350

Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp

355 360 365

Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val

370 375 380

Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly

385 390 395 400

Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr

405 410 415

Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro

420 425 430

Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys

435 440 445

<210> 18

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Любая аминокислота

<400> 18

Leu Pro Xaa Thr Ala

1 5

<210> 19

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> /замена="Glu", или "Ala", или "Asn", или "Gln", или "Lys", или "Arg"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях для

положений вариантов"

<400> 19

Leu Pro Asp Thr Gly

1 5

<210> 20

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> /замена="Glu", или "Asn", или "Gln", или "Ala"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях для

положений вариантов"

<400> 20

Leu Pro Lys Thr Gly

1 5

<210> 21

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> /замена="Ser", или "Glu", или "Leu", или "Ala", или "Asn"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях для

положений вариантов"

<400> 21

Leu Pro Lys Thr Gly

1 5

<210> 22

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 22

Leu Pro Lys Thr Gly

1 5

<210> 23

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 23

Leu Pro Ile Thr Gly

1 5

<210> 24

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 24

Leu Pro Asp Thr Ala

1 5

<210> 25

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 25

Ser Pro Lys Thr Gly

1 5

<210> 26

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 26

Leu Ala Glu Thr Gly

1 5

<210> 27

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 27

Leu Ala Ala Thr Gly

1 5

<210> 28

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 28

Leu Ala His Thr Gly

1 5

<210> 29

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 29

Leu Ala Ser Thr Gly

1 5

<210> 30

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 30

Leu Pro Leu Thr Gly

1 5

<210> 31

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 31

Leu Ser Arg Thr Gly

1 5

<210> 32

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 32

Leu Pro Glu Thr Gly

1 5

<210> 33

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 33

Val Pro Asp Thr Gly

1 5

<210> 34

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 34

Ile Pro Gln Thr Gly

1 5

<210> 35

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 35

Tyr Pro Arg Arg Gly

1 5

<210> 36

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 36

Leu Pro Met Thr Gly

1 5

<210> 37

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 37

Leu Ala Phe Thr Gly

1 5

<210> 38

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 38

Leu Pro Gln Thr Ser

1 5

<210> 39

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 39

Asn Pro Gln Ser

1

<210> 40

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 40

Leu Pro Ser Thr

1

<210> 41

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 41

Asn Ser Lys Thr

1

<210> 42

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 42

Asn Pro Gln Thr

1

<210> 43

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 43

Asn Ala Lys Thr

1

<210> 44

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 44

Leu Pro Ile Thr

1

<210> 45

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 45

Leu Ala Glu Thr

1

<210> 46

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Любая аминокислота

<400> 46

Leu Pro Xaa Ala Gly

1 5

<210> 47

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 47

Leu Pro Asn Ala Gly

1 5

<210> 48

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 48

Leu Pro Asn Thr Ala

1 5

<210> 49

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Любая аминокислота

<400> 49

Leu Gly Xaa Thr Gly

1 5

<210> 50

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 50

Leu Gly Ala Thr Gly

1 5

<210> 51

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Любая аминокислота

<400> 51

Ile Pro Xaa Thr Gly

1 5

<210> 52

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 52

Ile Pro Asn Thr Gly

1 5

<210> 53

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 53

Ile Pro Glu Thr Gly

1 5

<210> 54

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 54

Asn Pro Gln Thr Asn

1 5

<210> 55

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 55

Asn Pro Lys Thr Gly

1 5

<210> 56

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 56

Asn Ser Lys Thr Ala

1 5

<210> 57

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 57

Asn Pro Gln Thr Gly

1 5

<210> 58

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 58

Asn Ala Lys Thr Asn

1 5

<210> 59

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 59

Asn Pro Gln Ser Ser

1 5

<210> 60

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> /замена="Ala", или "Ser", или "His"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях для

положений вариантов"

<400> 60

Asn Ala Glu Thr Gly

1 5

<210> 61

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Любая аминокислота

<400> 61

Leu Ala Xaa Thr Gly

1 5

<210> 62

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<400> 62

Gln Val Pro Thr Gly Val

1 5

<210> 63

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: последовательность сайта,

распознаваемого сортазой"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> /замена="Lys"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> /замена="Ser"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(6)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях для

положений вариантов"

<400> 63

Leu Pro Gln Thr Ala Thr

1 5

<210> 64

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 64

Phe Cys Pro Phe

1

<---

1. Способ получения безъядерной эритроидной клетки, ковалентно связанной с экзогенным полипептидом, где безъядерная эритроидная клетка и экзогенный полипептид ковалентно связаны посредством реакции клик-химии, где указанный способ включает:

(a) получение безъядерной эритроидной клетки, ковалентно связанной с первым химическим фрагментом, способным образовывать ковалентную связь со вторым химическим фрагментом посредством реакции клик-химии, где указанная безъядерная эритроидная клетка была получена способом, который не включает приведение безъядерной эритроидной клетки или ее предшественника в контакт с сахаром, содержащим указанный первый химический фрагмент,

(b) получение активированного средства, содержащего экзогенный полипептид, ковалентно связанный с указанным вторым химическим фрагментом, и

(c) приведение указанной безъядерной эритроидной клетки в контакт с активированным средством с получением таким образом указанной безъядерной эритроидной клетки, ковалентно связанной с указанным экзогенным полипептидом,

где одна или обе из указанной безъядерной эритроидной клетки и указанной безъядерной эритроидной клетки, ковалентно связанной с указанным экзогенным полипептидом, не имеют последовательности, созданной с помощью реакции с участием сортазы; и

где указанная реакция клик-химии между указанным первым химическим фрагментом и указанным вторым химическим фрагментом на стадии (c) не требует катализатора в виде иона меди, и

указанный экзогенный полипептид представляет собой фермент, антитело, антителоподобную молекулу, антиген, хемокин или цитокин.

2. Способ по п.1, где указанный экзогенный полипептид имеет массу более чем приблизительно 30 килодальтон.

3. Способ по п.1, где указанный экзогенный полипептид имеет длину более чем приблизительно 500 аминокислот.

4. Способ по п.1, где указанный способ приводит к ковалентному связыванию указанного активированного средства с боковой цепью аминокислоты эндогенного белка на поверхности указанной безъядерной эритроидной клетки.

5. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно включает приведение указанной безъядерной эритроидной клетки в контакт с первым связывающим реагентом, содержащим указанный первый химический фрагмент, посредством чего получают указанную безъядерную эритроидную клетку, ковалентно связанную с указанным первым химическим фрагментом.

6. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно включает приведение указанной безъядерной эритроидной клетки в контакт с активированным средством, содержащим второй экзогенный полипептид, ковалентно связанный с указанным вторым химическим фрагментом.

7. Способ по п.5, где указанный способ дополнительно включает:

(d) приведение указанной безъядерной эритроидной клетки в контакт со вторым связывающим реагентом, содержащим третий химический фрагмент, способный образовывать ковалентную связь со четвертым химическим фрагментом посредством реакции клик-химии, и

(e) приведение указанной безъядерной эритроидной клетки в контакт со вторым экзогенным полипептидом, ковалентно связанным с указанным четвертым химическим фрагментом.

8. Способ по п.1, где указанная безъядерная эритроидная клетка ковалентно связана по меньшей мере с 5000 копий указанного экзогенного полипептида.

9. Способ по п.5, где указанный первый химический фрагмент содержит азид или алкин.

10. Способ по п.9, где указанный первый химический фрагмент представляет собой азид, и где указанный азид содержит сложный сульфо–NHS–эфир 3–азидопропионовой кислоты или сложный сульфо–NHS–эфир 6–азидокапроновой кислоты.

11. Способ по п.9, где указанный первый химический фрагмент представляет собой алкин, и где указанный алкин содержит сложный DBCO–сульфо–NHS–эфир или сложный DBCO–PEG–NHS–эфир.

12. Способ по п.11, где указанный алкин содержит сложный DBCO–PEG–NHS–эфир, и указанный сложный DBCO–PEG–NHS–эфир представляет собой или сложный DBCO–PEG4–NHS–эфир или сложный DBCO–PEG5–NHS–эфир.

13. Способ по п.5, где указанный первый химический фрагмент содержит линкер.

14. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно включает приведение указанного экзогенного полипептида в контакт со вторым связывающим реагентом, содержащим указанный второй химический фрагмент, посредством чего получают указанное активированное средство.

15. Способ по п.14, где указанный второй химический фрагмент содержит азид или алкин.

16. Способ по п.15, где указанный второй химический фрагмент представляет собой азид, и где указанный азид содержит сложный сульфо–NHS–эфир 3–азидопропионовой кислоты или сложный сульфо–NHS–эфир 6–азидокапроновой кислоты.

17. Способ по п.15, где указанный второй химический фрагмент содержит алкин, и где указанный алкин содержит сложный DBCO–сульфо–NHS–эфир или сложный DBCO–PEG–NHS–эфир.

18. Способ по п.17, где указанный алкин содержит сложный DBCO–PEG–NHS–эфир, и указанный сложный DBCO–PEG–NHS–эфир представляет собой или сложный DBCO–PEG4–NHS–эфир или сложный DBCO–PEG5–NHS–эфир.

19. Способ по п.14, где указанный второй связывающий реагент содержит линкер.

20. Способ по п.1, где указанная безъядерная эритроидная клетка не имеет последовательности, созданной с помощью реакции с участием сортазы.

21. Способ по п.1, где указанная безъядерная эритроидная клетка, ковалентно связанная с указанным экзогенным полипептидом, не имеет последовательности, созданной с помощью реакции с участием сортазы.

22. Способ по п.1, где как указанная безъядерная эритроидная клетка, так и указанная безъядерная эритроидная клетка, ковалентно связанная с указанным экзогенным полипептидом, не имеют последовательности, созданной с помощью реакции с участием сортазы.

23. Способ по п.1, где указанный способ не включает стадии опосредованной сортазой транспептидации.

24. Способ получения безъядерной эритроидной клетки, ковалентно связанной с экзогенным полипептидом, где указанный способ включает:

(a) получение безъядерной эритроидной клетки, ковалентно связанной с первым химическим фрагментом, способным образовывать ковалентную связь со вторым химическим фрагментом посредством реакции клик-химиим, где указанная безъядерная эритроидная клетка была получена способом, который не включает приведение безъядерной эритроидной клетки или ее предшественника в контакт с сахаром, содержащим указанный первый химический фрагмент,

(b) получение активированного средства, содержащего указанный экзогенный полипептид, ковалентно связанный с указанным вторым химическим фрагментом, и

(c) приведение указанной безъядерной эритроидной клетки в контакт с активированным средством с получением таким образом указанной безъядерной эритроидной клетки, ковалентно связанной с указанным экзогенным полипептидом,

где одна или обе из указанной безъядерной эритроидной клетки и указанной безъядерной эритроидной клетки, ковалентно связанной с указанным экзогенным полипептидом, не имеют последовательности, созданной с помощью реакции с участием сортазы, и

указанный экзогенный полипептид представляет собой фермент, антитело, антителоподобную молекулу, антиген, хемокин или цитокин; и

где:

(i) указанный первый химический фрагмент содержит циклооктин, и указанный второй химический фрагмент содержит азид;

(ii) указанный первый химический фрагмент содержит азид, и указанный второй химический фрагмент содержит циклооктин;

(iii) указанный первый химический фрагмент содержит трансциклоалкен, и указанный второй химический фрагмент содержит тетразин; или

(iv) указанный первый химический фрагмент содержит тетразин, и указанный второй химический фрагмент содержит трансциклоалкен.

25. Способ по п.24, где указанный экзогенный полипептид имеет массу более чем приблизительно 30 килодальтон.

26. Способ по п.24, где указанный экзогенный полипептид имеет длину более чем приблизительно 500 аминокислот.

27. Способ по п.24, где указанный способ приводит к ковалентному связыванию указанного активированного средства с боковой цепью аминокислоты эндогенного белка на поверхности указанной безъядерной эритроидной клетки.

28. Способ по п.24, где указанный способ дополнительно включает приведение безъядерной эритроидной клетки в контакт с первым связывающим реагентом, содержащим указанный первый химический фрагмент, посредством чего получают указанную безъядерную эритроидную клетку.

29. Способ по п.24, где указанный способ дополнительно включает приведение указанной безъядерной эритроидной клетки в контакт с активированным средством, содержащим второй экзогенный полипептид, ковалентно связанный с указанным вторым химическим фрагментом.

30. Способ по п.28, где указанный способ дополнительно включает:

(d) приведение указанной безъядерной эритроидной клетки в контакт со вторым связывающим реагентом, содержащим третий химический фрагмент, способный образовывать ковалентную связь со четвертым химическим фрагментом посредством реакции клик-химии, и

(e) приведение указанной безъядерной эритроидной клетки в контакт со вторым активированным средством, содержащим второй экзогенный полипептид, ковалентно связанный с указанным четвертым химическим фрагментом.

31. Способ по п.24, где указанная безъядерная эритроидная клетка ковалентно связана по меньшей мере с 5000 копий указанного экзогенного полипептида.

32. Способ по п.28, где указанный первый связывающий реагент содержит линкер.

33. Способ по п.24, где указанный способ дополнительно включает приведение указанного экзогенного полипептида в контакт со вторым связывающим реагентом, содержащим указанный второй химический фрагмент, посредством чего получают указанное активированное средство.

34. Способ по п.33, где указанный второй связывающий реагент содержит линкер.

35. Способ по п.24, где указанная безъядерная эритроидная клетка не имеет последовательности, созданной с помощью реакции с участием сортазы.

36. Способ по п.24, где указанная безъядерная эритроидная клетка, ковалентно связанная с указанным экзогенным полипептидом, не имеет последовательности, созданной с помощью реакции с участием сортазы.

37. Способ по п.24, где как указанная безъядерная эритроидная клетка, так и указанная безъядерная эритроидная клетка, ковалентно связанная с указанным экзогенным полипептидом, не имеют последовательности, созданной с помощью реакции с участием сортазы.

38. Способ по п.24, где указанный способ не включает стадии опосредованной сортазой транспептидации.

39. Способ по п.24, где указанный первый химический фрагмент содержит циклооктин, и указанный второй химический фрагмент содержит азид.

40. Способ по п.24, где указанный первый химический фрагмент содержит азид, и указанный второй химический фрагмент содержит циклооктин.

41. Способ по п.24, где указанный первый химический фрагмент содержит трансциклоалкен, и указанный второй химический фрагмент содержит тетразин.

42. Способ по п.24, где указанный первый химический фрагмент содержит тетразин, и указанный второй химический фрагмент содержит трансциклоалкен.