Частицы pm21 для улучшения хоминга nk-клеток в костном мозге

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к способу переноса NK-клеток в костный мозг субъекта и способу лечения злокачественного новообразования костного мозга. Для осуществления указанных способов NK-клетки приводят в контакт с частицами PM21 и/или питающими клетками FC21 до переноса NK-клеток в организм указанного субъекта и затем вводят NK-клетки указанному субъекту. При этом перенос NK-клеток в костный мозг и, как следствие лечение, осуществляется благодаря тому, что указанный контакт NK-клеток с частицами PM21 и/или питающими клетками FC21 индуцирует в NK-клетках клеточный механизм, индуцирующий фукозилирование PSGL-1 на поверхности NK-клеток. Настоящее изобретение позволяет улучшить эффективность направленной миграции (хоминга) NK-клеток в костный мозг. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 34 ил., 2 пр.

 

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США №62/464747, поданной 28 февраля 2017 г. и полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.

I. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Терапия с применением адоптивных естественных киллеров (NK-клеток) является перспективным новым видом вмешательства при онкологических заболеваниях, в том числе злокачественных новообразованиях костного мозга. Поэтому большое значение имеет эффективность направленной миграции используемых адоптивных NK-клеток. Существует потребность в способах эффективной направленной миграции NK-клеток в костный мозг.

II. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. В настоящей заявке описаны способы и композиции, имеющие отношение к направленной миграции NK-клеток в костный мозг, включающие приведение NK-клеток в контакт с частицами РМ21 и/или питающими клетками FC21. В одном из аспектов указанные способы могут дополнительно включать стимуляцию NK-клеток с помощью ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-18 и/или ИЛ-18.

2. Кроме того, в настоящей заявке описаны способы лечения злокачественного новообразования костного мозга или врожденного злокачественного новообразования костного мозга и/или лечения вирусной инфекции (например, вирусной инфекции, ассоциированной с костным мозгом, в том числе вирусной инфекции, тропной по отношению к костному мозгу или вирусной инфекции, оказывающей отрицательное влияние на костный мозг), включающие приведение NK-клеток в контакт с частицами РМ21 и/или питающими клетками FC21, и адоптивный перенос NK-клеток в организм субъекта. В некоторых аспектах контакт частиц РМ21 и/или питающих клеток FC21 с NK-клетками может происходить до переноса NK-клеток в организм пациента. В еще одном аспекте контакт частиц РМ21 и/или питающих клеток FC21 с NK-клетками может происходить в организме пациента.

III. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

3. Прилагаемые чертежи, включенные в настоящий документ и составляющие часть настоящего описания, иллюстрируют некоторые варианты реализации и совместно с описанием иллюстрируют описанные в нем композиции и способы.

4. На фигуре 1 показано, что частицы РМ-21 эффективно и селективно способствуют размножению цитотоксических NK-клеток. Мононуклеары периферической крови (МПК) выделяли из источника лейкоцитов и высевали из расчета 0,1×10⁶ NK-клеток/мл в SCGM с добавлением 10% FBS, 2 мМ Glutamax и 50 ед/мл ИЛ-2. МПК стимулировали частицами РМ15 (, черные) или РМ21 (, синие) в количестве 200 мкг/мл в течение 27 дней, содержание клеток тестировали каждые 2-3 дня и продемонстрировали кратное увеличение количества NK-клеток (А) и процентного содержания клеток в суспензии (В). Частицы РМ21 (кратность 825±188, N=13, 4 донора) (синие) более эффективно стимулировали размножение NK-клеток по сравнению с частицами РМ15 (425±71, N=35, 9 доноров) (черные) на основании обобщенного анализа данных о размножении NK-клеток, полученных на 14 день (С). Мононуклеары периферической крови, выделенные от трех пациентов с ОМЛ на стадии ремиссии, культивировали в течение 14 дней с частицами РМ21 (200 мкг/мл), высевая из расчета 0,5×10⁶ NK-клеток/мл в SCGM с 10% FBS, 2 мМ Glutamax и 50 ед/мл ИЛ-2. Показана кратность увеличения количества NK-клеток по сравнению с первичными МПК (D) и содержания лимфоцитов (Е) (CD56⁺CD3^- NK-клетки (, красный), CD56^-CD3⁺ Т-клетки (, синий) и CD56 CD3⁺ NKT-клетки (, черный)). МПК пациента F021 культивировали в течение 16 дней, как описано выше, и анализировали аутологичную цитотоксичность по отношению к ОМЛ-опухолям того же пациента (F). Размноженные РМ21-NK-клетки метили TFL4, совместно инкубировали (2 часа) при указанном соотношении Е:Т с клетками ОМЛ того же пациента на стадии активного заболевания и анализировали с помощью проточной цитометрии. Количество спонтанно погибших клеток-мишеней определяли с помощью контроля "Только мишень". Данные для каждой точки определяли в двух повторностях.

5. На фигуре 2 показано, что предварительная активация неотобранных МПК с помощью частиц РМ21 индуцирует размножение NK-клеток in vivo. NSG-мышам в/б вводили 2×10⁶ клеток неактивированных МПК (А и В) или МПК, предварительно активированных ex vivo частицами РМ21 и 100 ед/мл ИЛ-2 в течение 2 дней (РМ21-МПК) (С и D). Мыши во всех группах получали 1000 ед ИЛ-2 в/б три раза в неделю. Группам мышей также в/б вводили 400 мкг частиц РМ21 два раза в неделю (В и D). Периферическую кровь отбирали путем последовательных кровопусканий из щеки и анализировали с помощью проточной цитометрии на предмет hCD45⁺ лимфоцитов человека два раза в неделю, начиная с 6 дня. Количество NK-, Т- и В-клеток определяли на основе окрашивания по hCD3, hCD56, hCD19. На левых графиках в каждой экспериментальной группе показаны концентрации hNK-клеток на мкл РВ. На правых графиках показано процентное количество hNK-клеток (, красный) и Т-клеток (, черный) в виде доли от общих пСВ45⁺-клеток.

6. На фигуре 3 показано, что анализ пролиферации подтверждает размножение NK-клеток in vivo из РМ21-МПК. МПК, свежеразмороженные или заранее активированные частицами РМ21 и 100 ед/мл ИЛ-2 в течение двух дней (РМ21-МПК) метили Cell Trace (СТ) Violet. 2×10⁶ неактивированных МПК (А и В) или РМ21-МПК (С и D) в/б вводили мышам NSG. Мыши во всех группах получали 1000 ед ИЛ-2 в/б три раза в неделю. Двум группам мышей также в/б вводили 400 мкг частиц РМ21 два раза в неделю (В и D). Двух мышей в каждой группе подвергали эвтаназии на 6 день и анализировали смывы с брюшины с помощью проточной цитометрии на предмет флуоресценции СТ Violet hCD45⁺, hCD3^-, hCD56⁺NK -клеток. Гистограммы флуоресценции СТ Violet анализировали посредством аппроксимации кривых с использованием пакета Proliferation analysis в программе FlowLogic.

7. На фигуре 4 показано, что применение РМ21 in vivo позволяет увеличить количество NK-клеток в периферической крови. МПК заранее активировали ex vivo с помощью частиц РМ21 и 100 ед/мл ИЛ-2 в течение 2 дней. РМ21-МПК в количестве, содержащем 0,2×10⁶ жизнеспособных NK-клеток, в/б вводили мышам NSG. Мыши во всех группах получали 1000 ед ИЛ-2 в/б три раза в неделю. Мышам также в/б вводили 0 (А), 400 (В), 800 (С), 1600 мкг (D) частиц РМ21 два раза в неделю. Периферическую кровь анализировали с помощью проточной цитометрии на предмет hCD45⁺-лимфоцитов два раза в неделю, начиная с 5 дня, и определяли количество hNK-, hT- и hB-клеток на основе окрашивания по hCD3, hCD56, hCD19. На левых графиках в каждой экспериментальной группе показаны концентрации hNK-клеток на мкл РВ. На правых графиках показано процентное количество hNK-клеток (, красный) и Т-клеток (, черный) в виде доли от общих hCD45⁺-клеток. Анализ образцов РВ с 12 дня после в/б инъекции РМ21-МПК продемонстрировал увеличение количества hNK-клеток в РВ в зависимости от дозы частиц РМ21 in vivo (Е, слева), в то время как значимого увеличения количества общих CD3⁺Т-клеток в зависимости от дозы не наблюдали (Е, справа).

8. На фигуре 5 показано, что NK-клетки, размноженные in vivo, демонстрируют биологическое распределение по важнейшим физиологическим областям, и биологическое распределение NK-клеток увеличивается за счет применения частиц РМ21 in vivo. NK-клетки (0,2×10⁶ клеток) в составе РМ21-МПК, предварительно активированных ex vivo с использованием частиц РМ21 и 100 ед/мл ИЛ-2 в течение 2 дней, в/б вводили мышам NSG. Мыши во всех группах получали 1000 ед ИЛ-2 в/б три раза в неделю. Мышам также в/б вводили 0 или 800 мкг частиц РМ21 два раза в неделю. Мышей умерщвляли через 16 дней после начальной в/б инъекции РМ21-МПК. В день эвтаназии собирали костный мозг (из бедренной кости), селезенку, легкие, головной мозг и печень, органы подвергали перфузии, а бедренную кость промывали для получения клеток. Клетки окрашивали антителами против hCD3, hCD45, hCD56, hCD19 для проточного цитометрического анализа. Показаны данные для костного мозга, селезенки, головного мозга, легких и печени (слева направо) с указанием количества hCD45⁺hCD56⁺hCD3^- NK -клеток (верхние графики для каждого органа) и процентного количества hCD45⁺hCD56⁺hCD3^- NK-клеток (, красный), hCD45⁺hCD3⁺Т-клеток (, синий) и hCD45⁺, hCD56^-hCD3^- других лимфоцитов (, черный) (нижние графики для каждого органа). Толстая линия для каждого параметра представляет собой среднее значение.

9. На фигуре 6 показано, что размножение NK-клеток из каждого органа in vivo стабильно воспроизводится. Согласованность размножения NK-клеток, стимулированных частицами РМ21 in vivo, проверяли с использованием трех различных МПК, полученных от здоровых доноров. МПК предварительно активировали ex vivo с помощью частиц РМ21 в течение 2 дней и 100 ед/мл ИЛ-2 в течение 2 дней (РМ21-МПК) ив/б вводили мышам NSG. Мыши во всех группах получали 1000 ед ИЛ-2 в/б три раза в неделю. Периферическую кровь анализировали с помощью проточной цитометрии на предмет hCD45⁺-лимфоцитов два раза в неделю, начиная с 5 дня, и определяли количество hNK-, hT- и hB-клеток на основе окрашивания по hCD3, hCD56, hCD19. Концентрация hNK-клеток в крови через 12 дней после в/б инъекции МПК (А) и количество NK-клеток, собранных при смыве из брюшной полости через 14 дней после в/б инъекции МПК (С) были аналогичны в различных группах, получивших инъекции NK-клеток из различных источников (р=0,84 для РВ и p=0,69). Содержание hNK-клеток (, красный), hT-клеток (, синий) и других hCD45⁺-клеток (, черный) также согласованно воспроизводилось в различных группах, получивших инъекции МПК из различных источников, в периферической крови (В) и в брюшной полости (D). Толстая линия для каждого параметра представляет собой среднее значение.

10. На фигуре 7 показано НЕСА-452-окрашивание NK-клеток, обработанных растворимыми цитокинами на 0, 1, 7 и 10 дни стимуляции.

11. На фигуре 8 показано НЕСА-452-окрашивание NK-клеток, культивированных с питающими клетками K562, через 10, 12 и 14 дней стимуляции.

12. На фигуре 9 показано сравнение НЕСА-452-окрашивания NK-клеток, стимулированных в различных условиях, через 10 дней стимуляции.

13. На фигуре 10 показано НЕСА-452-окрашивание NK-клеток, культивированных в различных условиях, через 10 дней стимуляции. NK-клетки культивировали в течение 10 дней в различных условиях, как показано. В качестве зонда для NK-клеток использовали мАт НЕСА 452, конъюгированное с FITC, которое обнаруживало фукозилированную форму SLex. Клетки культуры окрашивали HECA452-FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии с гейтированием по CD56+CD3-. (CSTX2 = CytoSen K562.mb21.41bbl; РС = клетки-фидеры; РМ21 = частицы плазматической мембраны, полученные из CSTX2).

14. На фигуре 11 показано НЕСА-452-окрашивание NK-клеток через три дня покоя после 10 дней стимуляции. NK-клетки культивировали в течение 10 дней с частицами CSTX2-PM21 (вверху) и затем "оставляли" в культуре на 3 дня после удаления частиц РМ21 (внизу). В качестве зонда для NK-клеток использовали мАт НЕСА452, конъюгированное с FITC, которое обнаруживало фукозилированную форму SLex. Клетки культуры окрашивали HECA452-FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии с гейтированием по CD56+CD3-. (CSTX2 = CytoSen K562.mb21.41bbl; РС = клетки-фидеры; РМ21 = частицы плазматической мембраны, полученные из CSTX2).

15. На фигуре 12 показано НЕСА-452-окрашивание перед замораживанием и размораживанием и после него через 14 дней размножения с частицами РМ21. NK-клетки выделяли из МПК (вверху), культивировали в течение 10 дней с частицами CSTX2-PM21 (в середине), а затем замораживали с криоконсервантом и размораживали (внизу). В качестве зонда для NK-клеток использовали мАт НЕСА452, конъюгированное с FITC, которое обнаруживало фукозилированную форму SLex. Клетки культуры окрашивали HECA452-FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии с гейтированием по CD56+CD3-. (CSTX2 = CytoSen K562.mb21.41bbl; РС = клетки-фидеры; РМ21 = частицы плазматической мембраны, полученные из CSTX2).

16. На фигуре 13 показано, что STAT3 вовлечен в ИЛ-21-опосредованную модуляцию экспрессии гена FUT7 в NK-клетках человека. (A) ChIP-seq выполняли для ИЛ-21-стимулированных наивных и размноженных NK-клеток человека с использованием антител против STAT3. Стрелками указано направление транскрипции. Масштаб одинаков для гена и островков; (В) RNA-seq выявило различную регуляцию экспрессии гена FUT7 в ответ на стимуляцию за счет ИЛ-21; (С) ИЛ-21 усиливает связывание STAT3 с геном FUT7 в размноженных NK-клетках, и (D) ИЛ-21 стимулирует экспрессию гена FUT7 в размноженных NK-клетках.

IV. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

17. Перед раскрытием и описанием соединений, композиций, изделий, устройств и/или способов следует понимать, что они не ограничиваются конкретными способами синтеза или конкретными рекомбинантно-биотехнологическими способами, если не указано иное, или определенными реагентами, если не указано иное, поскольку такие способы могут, разумеется, различаться. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая здесь, приведена исключительно с целью описания конкретных вариантов воплощения и не предназначена для ограничения.

А. Определения

18. В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если контекст не указывает на иное явным образом. Так, например, упоминание «фармацевтического носителя» включает смеси двух или более таких носителей и т.п.

19. В настоящем документе диапазоны могут быть выражены от «приблизительно» одного конкретного значения для «приблизительно» другого конкретного значения. Если диапазон выражают таким образом, другой вариант реализации включает величины от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Аналогичным образом, если значения выражают в виде приблизительных значений, используя предыдущий член логического отношения «приблизительно», следует понимать, что это конкретное значение образует еще один вариант реализации. Кроме того, следует понимать, что конечные значения каждого из диапазонов имеют значение как по отношению к другому конечному значению, так и независимо от другого конечного значения. Кроме того, следует понимать, что в настоящем документе описан ряд значений, и что каждое значение в настоящем документе также описано как «приблизительно» это конкретное значение в дополнение к самому значению. Например, если описано значение «10», то также описано «приблизительно 10». Кроме того, следует понимать, что при описании значения, которое «меньше или равно» значения, будет описано и значение, которое «больше или равно значения», а также возможные диапазоны между значениями, как понятно специалисту в данной области техники. Например, если значение «10» описано как "меньше или равно 10", также описано "больше или равно 10". Кроме того, следует понимать, что в настоящей заявке данные представлены в нескольких различных форматах, и что эти данные представляют конечные точки и начальные точки и диапазоны для любой комбинации точек данных. Например, если описаны конкретная точка данных «10» и конкретная точка данных «15», следует понимать, что также описаны значения, большие, большие или равные, меньшие, меньшие или равные и равные 10 и 15, а также между 10 и 15. Кроме того, следует понимать, что также описана каждая единица между двумя конкретными единицами. Например, если описаны 10 и 15, то также описаны 11, 12, 13 и 14.

20. В данном описании и прилагаемой формуле изобретения упоминается ряд терминов, которые определяются с использованием следующих значений:

21. «Необязательный" или "необязательно" означает, что описанное после данного термина событие или обстоятельство может иметь или не иметь место и что описание включает случаи, когда указанное событие или обстоятельство имеет место, и случаи, когда оно не имеет места.

В. Способы применения композиций

22. Адоптивная терапия с применением донорских естественных киллеров (NK-клеток) является перспективным новым видом вмешательства при злокачественных новообразованиях костного мозга и врожденных злокачественных новообразованиях костного мозга, в том числе для ветеринарного применения при таких новообразованиях. В еще одном аспекте адоптивные NK-клетки можно применять терапевтически для лечения резидентных вирусов костного мозга, в том числе, например, парвовирусов, вызывающих апластическую анемию. Поэтому большое значение имеет эффективность направленной миграции адоптивно используемых NK-клеток. В частности, крайне важно, как направить перенесенные клетки в костный мозг, где они могут эффективно использоваться в качестве лекарственного средства.

23. Детерминанты хоминга в костный мозг включают лиганды для связывания селектина. Ключевой детерминантой для связывания L-селектина является состояние фукозилирования углеводной цепи сиалил-Льюис-х (sLex), присоединенной к гликопротеиновому лиганду-1 Р-селектина (PSGL-1). В одном аспекте настоящего изобретения предполагается, что стимуляция NK-клеток частицами РМ21 и/или питающими клетками FC21, полученными из клеток K562, трансформированных в целях экспрессии сконструированной мембраносвязанной формы ИЛ-21 и/или 41bbl (K562.mb21.41bbl), индуцирует эффективное специфическое размножение NK-клеток и полное фукозилирование sLex.

24. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложены способы, связанные с переносом NK-клеток в костный мозг, и способы лечения злокачественного новообразования костного мозга или врожденного злокачественного новообразования костного мозга, включающие приведение NK-клеток в контакт с частицами РМ21 и/или питающими клетками FC21 и адоптивную передачу NK-клеток пациенту, нуждающемуся в этом. В одном из аспектов указанные способы могут дополнительно включать стимуляцию NK-клеток за счет ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, ИЛ-21 ех vivo или in vivo (в организме пациента).

25. В некоторых аспектах контакт частиц РМ21 и/или питающих клеток FC21 с NK-клетками может происходить до переноса NK-клеток в организм пациента. В еще одном аспекте контакт частиц РМ21 и/или питающих клеток FC21 с NK-клетками может происходить в организме пациента.

26. В одном аспекте настоящего изобретения предполагается, что эффективность иммунотерапии с применением NK-клеток зависит от дозы NK-клеток, вводимой пациенту или достигаемой после вливания посредством размножения in vivo. Доступные в настоящее время методики ограничены неспособностью достичь уровня размножения NK-клеток, необходимого для достижения терапевтического эффекта у пациента. Отсутствие упрощенного протокола клинического размножения является основным препятствием на пути прогресса и широкого распространения иммунотерапии на основе NK-клеток. В современных протоколах размножения ex vivo используют комбинацию высоких доз цитокинов с активирующими лигандами, экспрессируемыми на линиях питающих/стимулирующих клеток, полученных из клеток лейкоза, что является существенным недостатком для переноса в клинические условия в большинстве центров; кроме того, такие клетки не подлежат прямому размножению in vivo. Применение технологии на основе частиц, в том числе экзосом, описанной в настоящем документе, устраняет потребность в клетках-стимуляторах, тем самым упрощая методологию и обеспечивая размножение ex vivo для адоптивной терапии или селективное размножение in vivo. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения злокачественных новообразований костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга посредством адоптивного переноса NK-клеток и/или способы переноса NK-клеток в костный мозг, включающие приведение NK-клеток в контакт с одной или более везикулами, содержащими эффекторный агент NK-клеток. Кроме того, в одном аспекте описаны способы лечения злокачественных новообразований костного мозга, врожденных злокачественных новообразований костного мозга и/или вирусных инфекций (включая вирусы с тропизмом к костному мозгу), дополнительно включающие предварительную активацию или активацию NK-клеток in vivo путем контакта по меньшей мере одной NK-клетки с по меньшей мере одним или более стимулирующими цитокинами. Таким образом, в одном аспекте NK-клетки, размноженные ex vivo с использованием частиц РМ21 и/или питающих клеток FC21, или с использованием прямой стимуляции in vivo РМ21 или питающими клетками FC21, можно применять для лечения резидентных вирусных (например, парвовирусных) состояний или синдромов костного мозга, которые вызывают апластическую анемию.

27. В описанных способах осуществляют предварительную активацию или активацию NK-клеток путем приведения по меньшей мере одной NK-клетки в контакт по меньшей мере с одним или более стимулирующими цитокинами (например, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-21 и/или ИЛ-18). Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения злокачественных новообразований костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга путем адоптивного переноса NK-клеток и/или способы переноса NK-клеток в костный мозг, включающие предварительную активацию NK-клеток путем приведения одной или более NK-клеток в контакт с одним или более стимулирующими цитокинами, выбранными из группы, включающей ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21, ИЛ-15 и/или ИЛ-18 или любую их комбинацию, включая приведение одной или более NK-клеток в контакт с 2 или 3 стимулирующими цитокинами. Например, в настоящем документе конкретно описаны способы, в которых стадия предварительной активации или активации включает приведение NK-клеток в контакт с ИЛ-2; ИЛ-12; ИЛ-15, ИЛ-18, ИЛ-12 и ИЛ-15; ИЛ-12 и ИЛ-18; ИЛ-15 и ИЛ-18; или ИЛ-12, ИЛ-15 и ИЛ-18. В одном аспекте описанные способы лечения злокачественных новообразований костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга посредством адоптивного переноса NK-клеток и/или способы переноса NK-клеток в костный мозг могут дополнительно включать приведение NK-клетки в контакт с одним или более цитокинами, выбранными из группы, состоящей из 4-1BBL, ИЛ-2, ИЛ-21, MICA/B, ULBP2, ICAM-1, 2В4, BCM1/SLAMF2, CD155, CD112, CCR7, DAP12, лигандов Notch и/или DAP10 в растворимой форме или в форме частиц РМ21 или питающих клеток FC21.

28. Следует понимать, и в данном документе предполагается, что продолжительность предварительной активации или активации (т.е. продолжительность контакта между NK-клетками и стимулирующими цитокинами (например, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-21 и/или ИЛ-18) в растворимой форме или в форме частиц РМ21 или питающих клеток FC21 может составлять любой промежуток времени, необходимый для достижения желательной предварительной активации или активации NK-клеток. Например, контакт может составлять всего 1 минуту или 7 дней (например, культивирование NK-клеток в присутствии ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-21 и/или ИЛ-18 в течение 7 дней). В одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения злокачественных опухолей костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга посредством адоптивного переноса NK-клеток и/или способы переноса NK-клеток в костный мозг, включающие предварительную активацию или активацию NK-клеток путем контакта одной или более NK-клеток с ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15 и/или ИЛ-18 в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 36 или 48 часов. Следует понимать, и в данном документе предполагается, что период полужизни цитокина в культуре может быть меньше желательного времени контакта. Соответственно, в настоящем документе описаны способы, в которых одну или более NK-клеток приводят в контакт с ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15 и/или ИЛ-18 каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 часов в течение периода контакта (например, каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 часов в течение 24-часового периода контакта).

29. Применение частиц плазматической мембраны (РМ), экзосом (ЕХ) или питающих клеток (FC), содержащих один или более из эффекторных агентов NK-клеток (т.е. стимулирующих пептидов, цитокинов и/или молекул адгезии) для контакта и активации и/или размножения NK-клеток позволяет устранить многие препятствия, связанные с токсичностью цитокинов. Примеры агентов, активирующих NK-клетки, и стимулирующих пептидов включают 41BBL, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21, ИЛ-18, MICA, LFA-1, 2В4, BCM/SLAMF2, CCR7, лиганды Notch и/или другие сигнальные молекулы, индуцирующие хоминг, но не ограничиваются ими. Примеры цитокинов включают ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21 и ИЛ-18, но не ограничиваются ими. Примеры молекул адгезии включают LFA-1, MICA, BCM/SLAMF2, но не ограничиваются ими. Например, частица плазматической мембраны (РМ), питающие клетки (FC) или экзосомы (ЕХ) получают из питающих клеток, экспрессирующих мембраносвязанный ИЛ-21 (клетки FC21, частицы РМ21 и экзосомы ЕХ21, соответственно). Клетки FC21, экспрессирующие мембраносвязанный ИЛ-21, частицы РМ21 и экзосомы ЕХ21 могут дополнительно содержать один или более из активирующих агентов, стимулирующих пептидов, цитокинов и/или молекул адгезии, включая 41BBL, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, MICA, LFA-1, 2В4, BCM/SLAMF2, CCR7 (например, частица РМ21, экзосома ЕХ21 или клетка FC, экспрессирующая 41BBL и мембраносвязанный интерлейкин-21), но не ограничиваясь ими. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения злокачественных новообразований костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга посредством адоптивного переноса NK-клеток и/или способы переноса NK-клеток в костный мозг, включающие приведение указанных клеток в контакт по меньшей мере с одной везикулой, содержащей эффекторный агент NK-клеток; где везикула, содержащая эффекторный агент NK-клеток, представляет собой любую комбинацию одной или более частицы РМ21, частицы ЕХ21 и/или питающей клетки FC21. Например, в настоящем документе описаны способы лечения злокачественных новообразований костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга посредством адаптивного переноса NK-клеток и/или способы переноса NK-клеток в костный мозг, включающие, в числе прочего, приведение указанных клеток в контакт с по меньшей мере одной везикулой, содержащей эффекторный агент NK-клеток, где везирула, содержащая эффекторный агент NK-клеток, содержит частицы РМ21; экзосомы ЕХ21; питающие клетки FC21; частицы РМ21 и экзосомы ЕХ21; частицы РМ21 и питающие клетки FC21; экзосомы ЕХ21 и питающие клетки FC21; или частицы РМ21, экзосомы ЕХ21 и питающие клетки FC21.

30. В некоторых аспектах эффекторные агенты частиц РМ21, экзосом ЕХ21 или питающих клеток FC21 содержат один или более из стимулирующих пептидов, связанных с пептидом, встраивающимся в мембрану (например, Fc, GPI, трансмембранным Т-клеточным рецептором или pHLIP). Пептид, встраивающийся в мембрану, может представлять собой молекулу, которая стимулирует встраивание в мембрану. Пептиды, встраивающиеся в мембрану, могут содержать сегменты CD4 или IgG со сродством к липидному бислою. Кроме того, альтернативные пептиды, встраивающиеся в мембрану, могут содержать Fc человека, GPI, трансмембранный Т-клеточный рецептор или pHLIP. Пептид, встраивающийся в мембрану, может представлять собой любой пептид, заведомо встраивающийся в клеточную мембрану. В зависимости от варианта применения самовстраивающегося в мембрану конъюгата пептида, некоторые самовстраивающиеся в мембрану пептиды могут быть более предпочтительны по сравнению с другими. Специалист в данной области техники должен понимать, что самовстраивающийся в мембрану пептид является идеальным при различных обстоятельствах. Например, для применения in vivo может быть пригоден самовстраивающийся в мембрану пептид pHLIP. Самовстраивающиеся в мембрану пептиды pHLIP встраиваются в мембрану только при низком рН. Следовательно, конъюгаты pHLIP не будут встраиваться в клеточные мембраны при нормальных физиологических условиях. Однако при инъекции в опухолевое окружение конъюгат pHLIP может встраиваться в мембрану опухолевых клеток, потому что опухолевое окружение является более кислым, чем нормальные физиологические условия. Это встраивание в опухолевом окружении позволяет активировать NK-клетки в области опухоли. Таким образом, применение pHLIP предотвращает нежелательное встраивание в мембраны случайных клеток.

31. Пептиды, встраивающиеся в мембрану, могут быть связаны с одним или более стимулирующими пептидами различными способами, и способы связывания пептидов хорошо известны в данной области техники. Пептид, встраивающийся в мембрану, связанный со стимулирующим пептидом, также можно называть конъюгатом пептида, встраивающегося в мембрану. В некоторых аспектах один или более стимулирующих пептидов, связанных с пептидом, встраивающимся в мембрану, могут содержать гибридный белок, кодируемый рекомбинантной ДНК, и такие гибридные белки могут продуцироваться в бактериальных клетках. В некоторых вариантах реализации гибридные белки могут состоять из одного или нескольких стимулирующих пептидов, конъюгированных или связанных с липофильной молекулой, например, гидрофобным пептидом, GPI или Fc человека, с целью прикрепления к липосомам или клеточным мембранам. Векторы кДНК для этих гибридных белков можно лигировать в экспрессирующую плазмиду, которая обеспечивает экспрессию в клетках бактерий (E. coli), насекомых или млекопитающих. В некоторых вариантах реализации векторы кДНК могут содержать маркер FLAG или HIS. Клетки бактерий можно трансфицировать с использованием стандартных способов трансфекции с CaCl, например, описанных в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Кроме того, клетки бактерий также можно культивировать в среде LB и собирать и лизировать с использованием френч-пресса. Белки, представляющие интерес, можно очищать от лизата с помощью аффинной хроматографии. Гибридные белки, содержащие конъюгированный с пальмитатом белок А и очищенный Fc-фрагмент, можно конъюгировать, как описано в литературе, путем смешивания в соотношении 1:2 (масс/масс) при 4°С. Затем конъюгаты можно непосредственно ввести внутрь опухоли или включить в липосомы.

32. Типы и способы присоединения известны специалистам в данной области техники. В настоящем документе термин «сопряженный» относится к пептиду, самовстраивающемуся в мембрану, конъюгированному, связанному или иным образом присоединенному к другой молекуле, например, пептиду или белку. Например, пептиды, встраивающиеся в мембрану, сопряженные со стимулирующими пептидами, могут представлять собой гибридные белки, в которых пептид, встраивающийся в мембрану, присоединен к другому белку посредством дисульфидной связи. Присоединение или конъюгирование могут означать наличие химической связи между пептидом, самовстраивающимся в мембрану, и эффекторным агентом NK-клеток.

33. В некоторых аспектах один или несколько стимулирующих пептидов можно присоединить к пептидам, самовстраивающимся в мембрану, или якорным молекулам GPI для самосборки in situ. Например, 41-BBL и ИЛ-21 можно присоединить к пептиду pHLIP, самовстраивающемуся в мембраны клеток в кислых условиях, что позволяет фиксировать стимулирующие лиганды в клетках вблизи опухоли. Стимулирующие пептиды 41BBL, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21, BCM/SLAMF2, CCR7 и/или другие хоминг-рецепторы можно продуцировать в бактериальных клетках или приобрести из коммерчески доступных источников, а векторы кДНК для этих белков можно необязательно лигировать в экспрессирующую плазмиду pTriEX, которая обеспечивает экспрессию в клетках бактерий (Е. coli), насекомых или млекопитающих. Вектор кДНК может кодировать и экспрессировать маркер FLAG или HIS. Клетки бактерий можно трансфицировать с использованием стандартных способов трансфекции с CaCl и культивировать в среде LB. Клетки можно собирать и лизировать с использованием френч-пресса, а затем белки, представляющие интерес, можно очищать от лизата с помощью аффинной хроматографии.

34. В некоторых вариантах реализации pHLIP можно получать посредством твердофазного синтеза пептидов с использованием реакций на основе 9-флуоренилметилоксикарбонила, а продукт можно очищать на колонке С18 с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Затем pHLIP можно конъюгировать со стимулирующими белковыми лигандами человека путем инкубирования со сшивающим агентом, например, бензофенон-4-иодацетамидом. После нескольких промывок конъюгированный белок pHLIP можно ресуспендировать в среде (например, в физиологическом растворе) и вводить внутрь опухоли или внутривенно. На основе данных, описанных в ранее опубликованной литературе и представленных в экспериментальных результатах, взаимодействие NK-клеток со стимулирующими лигандами, например, ИЛ-21 и 41-BBL, на поверхности таких модифицированных опухолевых клеток может стимулировать размножение NK-клеток in situ и запускать их цитотоксический ответ по отношению к опухоли. Этот тип стимулирующего подхода можно применять для лечения солидных опухолей, например, рака яичников, при котором NK-стимулирующие лиганды, встраивающиеся in situ в опухолевые клетки при кислых значениях рН, можно вводить во внутрибрюшинное пространство пациентов с низкой дозой ИЛ-2 отдельно или вместе с NK-клетками. Существуют убедительные доказательства того, что цитотоксические лимфоциты, экспрессирующие высокие уровни FCγIIIR (CD16), например, NK-клетки, имеют решающее значение для эффективности лечения рака с применением терапевтических антител. Таким образом, данный подход также можно применять в комбинации с терапевтическими антителами.

35. Следует понимать, и в настоящем документе предполагается, что продолжительность контакта между NK-клетками и везикулой, содержащей эффекторный агент NK-клеток (например, частицами РМ21, экзосомами ЕХ21 и/или питающими клетками FC21) может составлять любой промежуток времени, необходимый для достижения желательного размножения NK-клеток памяти. Например, контакт может составлять всего 1 минуту или 60 дней (например, культивирование NK-клеток в присутствии частиц РМ21, экзосом ЕХ21 и/или питающих клеток FC21 в течение 7 дней). В одном аспекте контакт между NK-клетками и везикулой, содержащей эффекторный агент NK-клеток, может составлять от приблизительно 6 дней до приблизительно 60 дней, более предпочтительно указанный контакт может составлять от приблизительно 6 дней до приблизительно 40 дней. Кроме того, в настоящем документе описаны способы лечения злокачественных опухолей костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга посредством адоптивного переноса NK-клеток и/или способы переноса NK-клеток в костный мозг, включающие приведение NK-клеток в контакт с частицами РМ21, экзосомами ЕХ21 и/или питающими клетками FC21 на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 или 72 дня. Следует понимать, и в настоящем документе предполагается, что в некоторых случаях может быть желателен многократный контакт NK-клеток с частицами РМ21, экзосомами ЕХ21 и/или питающими клетками FC21. Например, NK-клетки можно приводить в контакт с частицами РМ21, экзосомами ЕХ21 и/или питающими клетками FC21 каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24 часа, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 0, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 день. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения злокачественных новообразований костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга посредством адоптивного переноса NK-клеток и/или способы переноса NK-клеток к NK-клеткам костного мозга, включающие более чем однократное приведение NK-клеток в контакт с частицами РМ21, экзосомами и/или питающими клетками FC21, причем указанный контакт происходит каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24 часа, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 0, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 день.

36. В одном аспекте частицы плазматической мембраны, питающие клетки или экзосомы можно очистить от питающих клеток, стимулирующих NK-клетки. Питающие клетки, стимулирующие NK-клетки, для применения в заявленном изобретении, для применения при изготовлении частиц плазматической мембраны или экзосом, описанные в настоящем документе, могут быть облученными аутологичными либо аллогенными мононуклеарами периферической крови (МПК), либо необлученными аутологичными клетками или МПК, клетками RPMI8866, HFWT, K562, SKOV3 или EBV-LCL, включая аутологичные или аллогенные мононуклеары периферической крови (МПК) или необлученные аутологичные клетки или МПК, клетки RPMI8866, HFWT, K562, SKOV3 или EBV-LCL, трансфицированные мембраносвязанным ИЛ-21 и 41BBL. В некоторых аспектах питающие клетки NK-клеток могут представлять собой клетки K562, трансфицированные мембраносвязанным ИЛ-21 и 41BBL.

37. Описанные композиции можно применять для лечения любого заболевания, при котором происходит неконтролируемая клеточная пролиферация, например, рака и, в частности, злокачественных новообразований, влияющих на костный мозг или локализующихся в костном мозге. Неограничивающий список различных типов рака выглядит следующим образом: лимфомы (Ходжкина и неходжкинские лимфомы), лейкозы, карциномы, карциномы плотных тканей, плоскоклеточные карциномы, аденокарциномы, саркомы, глиомы, низкодифференцированные глиомы, бластомы, нейробласты, нейробластомы, плазмоцитомы, гистиоцитомы, меланомы, аденомы, гипоксические опухоли, миеломы, лимфомы или саркомы, связанные со СПИД, метастатический рак или рак в целом.

38. Типичный, но не ограничивающий список раковых заболеваний, для лечения которых можно применять описанные композиции, выглядит следующим образом: лимфома, В-клеточная лимфома, Т-клеточная лимфома, фунгоидный микоз, болезнь Ходжкина, миелоидный лейкоз, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак нервной системы, рак головы и шеи, плоскоклеточная карцинома головы и шеи, рак почки, рак легких, например, мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого, нейробластома/глиобластома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак кожи, рак печени, меланома, плоскоклеточные карциномы полости рта, горла, гортани и легкого, рак ободочной кишки, рак шейки матки, карцинома шейки матки, рак молочной железы и рак эпителия, рак почки, рак мочеполовой системы, рак легких, карцинома пищевода, карцинома головы и шеи, рак толстой кишки, злокачественные новообразования кроветворных органов; рак яичек; рак ободочной и прямой кишки, рак предстательной железы или рак поджелудочной железы.

39. Описанные композиции также можно применять для лечения вирусных заболеваний, ассоциированных с костным мозгом. В настоящем документе термин «вирусное заболевание, ассоциированное с костным мозгом», относится к вирусному заболеванию, в котором костный мозг содержит вирусы (т.е. вирус заражает (включая хронические, острые, латентные и персистирующие инфекции) или иным образом обладает тропизмом к костному мозгу) или на костный мозг оказывают нежелательное влияние вирусы, например, вирусы, вызывающие апластическую анемию, например, парвовирус (в некоторых случаях заболевание или состояние, которое нежелательным образом влияет на костный мозг, представляет собой вирусную инфекцию костного мозга). Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения вирусной инфекции у субъекта, причем вирусная инфекция ассоциирована с костным мозгом (например, оказывает нежелательное влияние на костный мозг), включающие приведение NK-клеток в контакт с частицами РМ21 и/или питающими клетками FC21 и адоптивный перенос NK-клеток в организм субъекта с вирусной инфекцией. В одном аспекте вирус может вызывать апластическую анемию и/или являться инфекцией, обладающей тропизмом к костному мозгу, или вирусной инфекцией, приводящей к латентной или хронической инфекции костного мозга. Например, вирус может включать вирус денге, вирус гепатита (включая вирус гепатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус гепатита D, вирус гепатита Е и вирус гепатита G, но не ограничиваясь ими), вирус Эпштейна-Барр (также известный как вирус герпеса человека 4), цитомегаловирус (также известный как вирус герпеса человека 5), парвовирус (включая парвовирус В19, но не ограничиваясь им), вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и респираторно-синцитиальный вирус (RSV), но не ограничивается ими.

С. Композиции

40. Описаны компоненты, которые следует применять для получения описанных композиций, а также сами композиции, которые следует применять в способах, описанных в настоящем документе. Эти и другие материалы описаны в настоящем документе, и подразумевается, что при описании комбинаций, подмножеств, взаимодействий, групп и т.д. этих материалов, несмотря то, что конкретные ссылки на каждую отдельную и коллективную комбинации и перестановку этих соединений могут не описываться в явном виде, каждая из них специально рассматривается и описана в настоящем документе. Например, при описании и обсуждении конкретной частицы РМ21 или питающей клетки FC21 и возможности выполнения ряда модификаций для ряда молекул специфическим образом рассматривается каждая комбинация и перестановка этих возможных модификаций, если противоположное не указано явным образом. Так, если описаны классы молекул А, В и С, а также классы молекул D, Е и F и пример комбинированной молекулы A-D, то даже если каждая из по отдельности и коллективно рассмотренных значащих комбинаций А-Е, A-F, B-D, В-Е, B-F, C-D, С-Е и C-F не указаны по отдельности, они считаются описанными. Аналогичным образом, описано любое подмножество этих комбинаций. Так, например, подгруппу из А-Е, B-F и С-Е можно считать описанной. Это относится ко всем аспектам настоящей заявки, включая этапы способов получения и применения описанных композиций, но не ограничиваясь ими. Таким образом, если существует множество дополнительных этапов, которые можно выполнить, следует понимать, что каждый из этих дополнительных этапов можно выполнить с любым конкретным вариантом реализации или комбинацией вариантов реализации описанных способов.

41. Предложены способы лечения злокачественных новообразований костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга посредством адоптивного переноса NK-клеток и/или способы переноса NK-клеток в костный мозг, использующие один или более из цитокинов (например, ИЛ-12, ИЛ-15 и/или ИЛ-19) в комбинации с везикулой, содержащей эффекторный агент NK-клеток, например, частицами РМ21, питающими клетками FC21 и/или экзосомами ЕХ21. Следует понимать, и в настоящем документе предполагается, что выгодно представить компоненты, применяемые в описанных способах, в упаковке, которая позволила бы какому-либо лицу выполнять описанные способы.

Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предложены наборы для лечения злокачественных новообразований костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга с использованием NK-клеток, содержащие один или более цитокинов (например, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15 и/или ИЛ-18) и одну или более из везикул, содержащих эффекторный агент NK-клеток. В одном аспекте указанная везикула может представлять собой частицы РМ21, экзосомы ЕХ21 и/или питающие клетки FC21. Например, описанные наборы могут содержать ИЛ-12 и частицы РМ21; ИЛ-15 и частицы РМ21; ИЛ-18 и частицы РМ21; ИЛ-12 и экзосомы ЕХ21, ИЛ-15 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-18 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-12 и питающие клетки FC21; ИЛ-15 и питающие клетки FC21; ИЛ-18 и питающие клетки FC21; ИЛ-12, ИЛ15 и частицы РМ21; ИЛ-12, ИЛ-18 и частицы РМ21; ИЛ-15, ИЛ-18 и частицы РМ21; ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18 и частицы РМ21; ИЛ-12, ИЛ15 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-12, ИЛ-18 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-15, ИЛ-18 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-12, ИЛ15 и питающие клетки FC21; ИЛ-12, ИЛ-18 и питающие клетки FC21; ИЛ-15, ИЛ-18 и питающие клетки FC21; ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18 и питающие клетки FC21; ИЛ-12, экзосомы ЕХ21 и частицы РМ21; ИЛ-15, экзосомы ЕХ21 и частицы РМ21; ИЛ-18, экзосомы ЕХ21 и частицы РМ21; ИЛ-12, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-15, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-18, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-12, питающие клетки FC21 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-15, питающие клетки FC21 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-18, питающие клетки FC21 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-12, питающие клетки FC21, частицы РМ21 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-15, питающие клетки FC21, частицы РМ21 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-18, питающие клетки FC21, частицы РМ21 и экзосомы ЕХ21; ИЛ-12, ИЛ15, экзосомы ЕХ21 и частицы РМ21; ИЛ-12, ИЛ-18, экзосомы ЕХ21 и частицы РМ21; ИЛ-15, ИЛ-18, экзосомы ЕХ21 и частицы РМ21; ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, экзосомы ЕХ21 и частицы РМ21; ИЛ-12, ИЛ15, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-12, ИЛ-18, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-15, ИЛ-18, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-12, ИЛ15, экзосомы ЕХ21 и питающие клетки FC21; ИЛ-12, ИЛ-18, экзосомы ЕХ21 и питающие клетки FC21; ИЛ-15, ИЛ-18, экзосомы ЕХ21 и питающие клетки FC21; ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, экзосомы ЕХ21 и питающие клетки FC21; ИЛ-12, экзосомы ЕХ21, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-15, экзосомы ЕХ21, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-18, экзосомы ЕХ21, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-12, ИЛ15, экзосомы ЕХ21, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-12, ИЛ-18, экзосомы ЕХ21, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; ИЛ-15, ИЛ-18, экзосомы ЕХ21, питающие клетки FC21 и частицы РМ21; или ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, экзосомы ЕХ21, питающие клетки FC21 и частицы РМ21.

42. Следует понимать, и в настоящем документе предполагается, что эффекторные агенты NK-клеток, содержащиеся в везикулах (например, частицах РМ21, экзосомах ЕХ21 и/или питающих клетках FC21), можно выбрать из группы эффекторных агентов NK-клеток, состоящей из 4-1BBL, ИЛ-2, ИЛ-21, MICA/B, ULBP2, ICAM-1, 2В4, BCM1/SLAMF2, CD155, CD112, CCR7, DAP12, лигандов Notch и DAP10.

43. Следует понимать, и в настоящем документе предполагается, что описанные наборы или устройства могут содержать цитокины в дополнение к ИЛ-12, ИЛ-15 и/или ИЛ-18. Соответственно, в одном аспекте предложены наборы для способов лечения злокачественных новообразований костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга посредством адоптивного переноса NK-клеток и/или способов переноса NK-клеток в костный мозг, дополнительно содержащие 4-1BBL, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-18, ИЛ-21, MICA/B, ULBP2, ICAM-1, 2В4, BCM1/SLAMF2, CD155, CD112, CCR7, DAP12 и DAP10.

44. В одном аспекте настоящего изобретения предполагается, что описанные наборы или устройства можно применять с NK-клетками, полученными из донорского источника, включая NK-клетки, полученные из неотобранной популяции мононуклеаров периферической крови. В некоторых случаях донорский источник NK-клеток, применяемых в описанных наборах для лечения злокачественных новообразований костного мозга и врожденных злокачественных новообразований костного мозга, также может являться реципиентом для NK-клеток. Соответственно, NK-клетки могут происходить из аутологичного источника. В других случаях донорский источник NK-клеток может представлять собой гаплоидентичный или аллогенный донорский источник.

45. Кроме того, в настоящем документе предполагается, что существуют случаи, когда полезно представить NK-клетки в наборе или устройстве. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложены наборы для лечения злокачественных новообразований костного мозга, дополнительно содержащие NK-клетки или линию NK-клеток.

1. Фармацевтические носители/доставка фармацевтических продуктов

46. Как описано выше, композиции также можно вводить in vivo с фармацевтически приемлемым носителем. Под «фармацевтически приемлемым» подразумевают материал, который не является биологически или иным образом нежелательным, т.е. указанный материал можно вводить субъекту вместе с нуклеиновой кислотой или вектором без каких-либо нежелательных биологических эффектов или вредоносного взаимодействия с любым из других компонентов фармацевтической композиции, в которой он содержится. Носитель, естественно, следует выбирать таким образом, чтобы минимизировать разложение активного ингредиента и нежелательные побочные эффекты у субъекта, хорошо известные специалисту в данной области техники.

47. Композиции можно вводить перорально, парентерально (например, внутривенно), внутримышечно, внутрибрюшинно, чрескожно, экстракорпорально, наружно и т.п., включая местное интраназальное введение или введение в форме для ингаляции. В настоящем документе термин «местное интраназальное введение» означает доставку композиций в нос и носовые ходы через одну или обе ноздри и может включать доставку посредством распыления или капель, или распыления нуклеиновой кислоты или вектора в виде аэрозоля. Введение композиций в форме для ингаляции можно осуществлять через нос или рот посредством доставки с помощью распылительного или капельного механизма. Кроме того, доставку также можно выполнять непосредственно в любую область дыхательной системы (например, легкие) посредством интубирования. Точное требуемое количество композиций меняется от субъекта к субъекту в зависимости от вида, возраста, массы и общего состояния субъекта, тяжести аллергические расстройства, подвергаемого лечению, конкретной используемой нуклеиновой кислоты или вектора, способа его введения и т.п. Таким образом, невозможно указать точное количество каждой композиции. В то же время соответствующее количество может определить специалист в данной области техники, используя обычные эксперименты с учетом информации, представленной в настоящем документе.

48. При использовании парентерального введения композиции оно обычно характеризуется инъекцией. Препараты для инъекций можно получить в виде обычных форм, в виде жидких растворов или суспензий, в виде твердых форм, подходящих для растворения суспензии в жидкости перед инъекцией, либо в виде эмульсий. Недавно пересмотренный подход для парентерального введения включает применение системы с медленным или длительным высвобождением, позволяющее поддерживать постоянную дозу. См., например, патент США №3610795, включенный в настоящий документ посредством ссылки.

49. Материалы могут находиться в растворе, суспензии (например, могут быть включены в микрочастицы, липосомы или клетки). Их мишенью могут являться клетки конкретного типа за счет антител, рецепторов или лигандов рецепторов. Следующие источники являются примерами применения данной технологии для адресного воздействия специфических белков на опухолевую ткань (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); и Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). Сюда входят среды-носители, например, "малозаметные" носители и липосомы, конъюгированные с другими антителами (включая липид-опосредованное адресное воздействие лекарственного средства на карциному толстой кишки), рецептор-опосредованное адресное воздействие ДНК за счет клеточно-специфических лигандов, адресное воздействие на опухоль, опосредованное лимфоцитами, и высокоспецифичное терапевтическое адресное воздействие ретровирусов на клетки глиомы мыши in vivo. Следующие источники являются примерами применения данной технологии для адресного воздействия специфических белков на опухолевую ткань (Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); и Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). Как правило, в путях эндоцитоза участвуют рецепторы, как конститутивные, так и индуцируемые лигандами. Эти рецепторы группируются в ямках, окаймленных клатрином, проникают в клетку через везикулы, покрытые клатрином, проходят через подкисленную эндосому, в которой рецепторы сортируются, и затем возвращаются на поверхность клетки, хранятся внутри клетки или разлагаются в лизосомах. Пути интернализации используются для различных функций, например, поглощения питательных веществ, удаления активированных белков, клиренса макромолекул, оппортунистического проникновения вирусов и токсинов, диссоциации и разложения лиганда и регуляции на уровне рецепторов. Многие рецепторы используются в более чем одном внутриклеточном пути, в зависимости от типа клетки, концентрации рецептора, типа лиганда, валентности лиганда и концентрации лиганда. Рассмотрены молекулярные и клеточные механизмы рецептор-опосредованного эндоцитоза (Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).

а) Фармацевтически приемлемые носители

50. Композиции, содержащие антитела, можно применять в терапевтических целях в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

51. Такие носители и их составы описаны в Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Как правило, в составе для придания составу изотоничности используют подходящее количество фармацевтически приемлемой соли. Примеры фармацевтически приемлемого носителя включают физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы, но не ограничиваются ими. рН раствора предпочтительно составляет от приблизительно 5 до приблизительно 8, более предпочтительно - от приблизительно 7 до приблизительно 10. Следующие носители включают препараты замедленного высвобождения, например, полупроницаемые матриксы твердых гидрофобных полимеров в виде формованных изделий, например, пленок, липосом или микрочастиц. Специалистам в данной области техники очевидно, что определенные носители могут быть более предпочтительными в зависимости, например, от пути введения и концентрации вводимой композиции.

52. Фармацевтические носители известны специалистам в данной области техники. Обычно они представляют собой стандартные носители для введения лекарственных средств людям, включая такие растворы, как стерильная вода, физиологический раствор и забуференные растворы при физиологическом рН. Композиции можно вводить внутримышечно или подкожно. Другие соединения можно вводить в соответствии со стандартными процедурами, используемыми специалистами в данной области техники.

53. Фармацевтические композиции могут содержать носители, загустители, разбавители, буферы, консерванты, поверхностно-активные агенты и т.п. в дополнение к выбранной молекуле. Фармацевтические композиции могут также включать один или более из активных ингредиентов, например, противомикробные агенты, противовоспалительные агенты, анестетики и т.п.

54. Фармацевтические композиции можно вводить различными путями в зависимости от предпочтительности местного или системного применения и от обрабатываемой области. Введение может быть местным (включая офтальмологическое, вагинальное, ректальное, интраназальное), пероральным, ингаляционным или парентеральным, например, путем внутривенного капельного вливания, подкожным, внутрибрюшинным или внутримышечным. Описанные антитела можно вводить внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, в полость тела или трансдермально.

55. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, например, оливковое масло, и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, например, этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и буферные среды. Среды-носители для парентеральной доставки включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или жирные масла. Внутривенные носители включают жидкие и питательные добавки, электролитные добавки (например, добавки на основе декстрозы Рингера) и т.п. Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, например, противомикробные препараты, антиоксиданты, хелатообразующие агенты, инертные газы и т.п.

56. Составы для местного применения могут включать мази, примочки, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Использование стандартных фармацевтических носителей, водных, порошковых или жировых основ, загустителей и т.п. может быть необходимым или желательным.

57. Композиции для перорального введения включают порошки или гранулы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, саше или таблетки. При этом может быть желательно использование загустителей, вкусоароматических добавок, разбавителей, эмульгаторов, диспергирующих средств или связующих.

58. Некоторые из композиций можно вводить в виде фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты или основания, образованной путем взаимодействия с такими неорганическими кислотами, как соляная кислота, бромистоводородная кислота, хлорная кислота, азотная кислота, тиоциановая кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и такими органическими кислотами, как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота и фумаровая кислота, или путем реакции с неорганическим основанием, например, гидроксидом натрия, гидроксидом аммония, гидроксидом калия, и органическими основаниями, например, моно-, ди-, триалкил- и ариламинами и замещенными этанол аминами.

b) Терапевтическое применение

59. Эффективные дозировки и схемы введения композиций можно определить эмпирически, и выполнение таких определений могут выполнить специалисты в данной области техники. Диапазоны дозировок для введения композиций представляют собой диапазоны, достаточные для получения желательного эффекта, влияющего на симптомы расстройства. Дозировка не должна быть настолько большой, чтобы вызывать появление нежелательных побочных эффектов, например, нежелательных перекрестных реакций, анафилактических реакций и т.п. Как правило, дозировка зависит от возраста, состояния, пола и тяжести заболевания у пациента, пути введения и включения других лекарственных средств в схему; ее может определить специалист в данной области техники. В случае противопоказаний дозировку может регулировать лечащий врач. Дозировка может варьировать, и ее можно вводить в один или более приемов ежедневно в течение одного или более дней. В литературе можно найти указания по соответствующим дозировкам для данных классов фармацевтических продуктов. Например, указания по выбору соответствующих доз антител можно найти в литературе по терапевтическому применению антител, например, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389. Типичная ежедневная доза отдельно применяемого антитела может находиться в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в сутки в зависимости от вышеупомянутых факторов.

D. Примеры

60. Следующие примеры представлены с целью обеспечить специалистов в данной области техники полным описанием способов получения и оценки соединений, композиций, изделий, устройств и/или способов, представленных в настоящем документе, предназначены исключительно для использования в качестве примеров и не предназначены для ограничения изобретения. Были предприняты усилия для обеспечения точности численных значений (например, количеств, температуры и т.д.), однако следует учитывать возможность ошибок и отклонений. Если не указано иное, части представляют собой части по массе, температура выражена в °С или представляет собой комнатную температуру, а давление равно одной атмосфере или близко к этому значению.

1. Пример 1: Частицы РМ21 стимулируют размножение NK-клеток in vivo

61. Естественные киллеры (NK-клетки) являются компонентом врожденной иммунной системы, идентифицируются как CD56⁺CD3^-, и могут естественным образом распознавать и лизировать клетки, поврежденные вирусами или являющиеся злокачественными. Клеточная терапия с применением NK-клеток является перспективным способом лечения рака, и в настоящее время проводятся многочисленные клинические исследования для лечения различных видов рака (ОМЛ, лимфом, рака молочной железы, яичников, нейробластомы, немелкоклеточного рака легких). Для эффективной противораковой терапии с применением NK-клеток необходимо учитывать три общих аспекта: 1) необходима доставка достаточно большой дозы NK-клеток; 2) NK-клетки должны обладать высокой цитотоксичностью; и 3) NK-клетки должны достигать, возможно, локализоваться в месте заболевания, сохраняться и специфически воздействовать на опухолевые клетки.

62. Для клинической эффективности в условиях ОМЛ Miller и его коллеги рекомендовали достичь дозы, которая обеспечивала бы по меньшей мере 100 NK-клеток на мкл периферической крови (РВ) через две недели после вливания. В некоторых примерах, где применение адоптивной терапии с использованием NK-клеток было эффективным, наблюдали более 1000 NK-клеток на мкл РВ. Эти наблюдения подчеркивают важность эффективных способов размножения NK-клеток для доставки достаточной дозы, обеспечивающей общую эффективность лечения.

63. В настоящее время существует три различных клинически используемых стратегии размножения NK-клеток для адоптивной клеточной терапии. Во-первых, размножение in vivo с использованием цитокинов, например, ИЛ-15 и ИЛ-2, в сочетании с истощением лимфоцитов/облучением хозяина может стимулировать размножение in vivo при относительно небольшом количестве введенных донорских NK-клеток. Во-вторых, способы ex vivo с использованием цитокинов, в основном ИЛ-2 и ИЛ-15, могут активировать NK-клетки, хотя размножение осуществляется на относительно низком и переменном уровне. Кроме того, NK-клетки, активированные цитокинами ex vivo, не испытывают действия цитокинов после вливания и подвергаются апоптозу. В-третьих, в способах размножения NK-клеток ex vivo с использованием питающих клеток применяют совместное культивирование с другими клетками, оказывающими стимулирующее действие. Способы стимуляции NK-клеток с использованием питающих клеток включают применение клеток LCL, зараженных вирусом Эпштейна-Барр, или рекомбинантных опухолевых клеток. Совместное культивирование с клетками ХМЛ K562, экспрессирующими мембраносвязанный ИЛ-15 (mb15) и лиганд 4-1ВВ (41BBL) (K562-mb15-41BBL) может обеспечивать размножение NK-клеток в несколько сотен раз в течение примерно двух недель, однако NK-клетки, размножаемые с использованием этого способа, подвергаются старению. Кроме того, NK-клетки, активированные ИЛ-15, теряют поверхностный CD16 благодаря протеолитической активности ADAM17. Клетки K562, экспрессирующие mb21 вместо mb15, значительно улучшают размножение NK-клеток, избегая укорочения теломер и, как следствие, старения NK-клеток. Размножение NK-клеток с использованием K562-mb21-41BBL является очень эффективным и обычно позволяет достичь среднего 48000-кратного размножения с >85% обогащением за три недели. Все эти способы активно изучаются в клинических исследованиях.

64. Хотя способы размножения NK-клеток совершенствуются, в настоящее время еще сохраняются недостатки и проблемы. Для выживания вводимых NK-клеток требуется высокая токсическая доза ИЛ-2 независимо от способа размножения, хотя устойчивость NK-клеток ограничена. В то время как способы размножения ex vivo с использованием питающих клеток эффективно обеспечивают размножение с образованием большого количества NK-клеток, высказывались опасения, что длительное культивирование NK-клеток ex vivo вызывает потерю способности к хомингу в области заболевания, например, костном мозге. Таким образом, существует дискуссия общих преимуществ размножения in vivo или ex vivo. Оптимальной процедурой размножения NK-клеток мог бы являться способ, обладающий способностью к пролиферации, как в способе ex vivo на основе питающих клеток, который можно было бы выполнять как ex vivo, так и in vivo.

65. Новый способ быстрого и селективного размножения цитотоксических NK-клеток, начиная с мононуклеаров РВ (МПК), основан на частицах РМ21. Частицы, соответствующие везикулам с закрытой плазматической мембраной, получали из плазматической мембраны клеток K562-mb15-41BBL (частицы РМ15); эти частицы обеспечивали 250-кратное селективное размножение NK-клеток через 14 дней и 1265-кратное - через 17 дней, что сопоставимо с эффективностью размножения с использованием питающих клеток K562-mb15-41BBL в совместной культуре. NK-клетки, активированные частицами РМ15, аналогично NK-клеткам, размноженным с питающими клетками, обладали высокой цитотоксичностью по отношению к клеткам ХМЛ и ОМЛ ех vivo. Важно отметить, что эти частицы характеризуются многими преимуществами по сравнению со способами на основе питающих клеток. Во-первых, их можно получить заранее, протестировать и хранить в течение более года и применять в качестве «готового реагента», не ограничиваясь одной площадкой, соответствующей GMP, что значительно упрощает клиническую логистику адоптивной терапии с использованием NK-клеток. Во-вторых, использование частиц РМ вместо питающих клеток для стимуляции NK-клеток исключает действия, необходимые для безопасности при использовании питающих клеток опухолевого происхождения, например, облучение питающих клеток и проверку их присутствия и пролиферации в готовом продукте. В-третьих, питающие клетки опухолевого происхождения нельзя вводить в качестве адъювантной терапии, в то время как частицы РМ можно вводить для стимуляции размножения NK-клеток in vivo. Преимущества способа размножения NK-клеток на основе частиц РМ обуславливают значительные клинически благоприятные свойства.

66. В данной работе протестировали эффективность частиц РМ, полученных из K562-mb21-41BBL, по отношению к размножению in vivo адоптивно перенесенных NK-клеток, предварительно активированных с помощью относительно короткой и простой процедуры, легко реализуемой в клинических условиях. Этот способ позволяет преодолеть недостатки предыдущих исследований с в/в вливанием адоптивных NK-клеток, которые обеспечивали лишь минимальное размножение и ограниченную устойчивость NK-клеток in vivo. В данном исследовании показана эффективность размножения NK-клеток, стимулированных частицами РМ21 ex vivo, и размножение NK-клеток in vivo из неотобранных МПК, введенных в брюшную полость, используемую в качестве области инкубирования и стимуляции частицами РМ21 in situ. Ожидается, что этот способ будет пригоден для размножения NK-клеток in vivo в терапевтически значимых количествах и позволит расширить доступность иммунотерапии, опосредованной NK-клетками, для пациентов.

а) МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

(1) Образцы человека

67. Первичные лейкозные бласты получали во время активного заболевания от пациентов, подписавших информированное согласие, одобренное ЭСУ; от этих пациентов во время ремиссии получали сопоставимое количество РВ. В качестве нормальных образцов использовали источник лейкоцитов (One Blood, Орландо, штат Флорида, США) или свежую кровь, взятую у здоровых добровольцев, подписавших информированное согласие, одобренное ЭСУ. МПК выделяли с использованием Ficoll-Paque (GE Healthcare, Питсбург, штат Пенсильвания, США). Все образцы обезличивали и хранили в замороженном жизнеспособном состоянии.

(2) Реагенты и линии клеток

68. Линию клеток K562 получили из АТСС (Манассас, штат Виргиния, США). Набор для FITC с аннексином-V для анализа цитотоксичности и гранулы Enumeration Flow-Count приобрели в Beckman Coulter (Майами, штат Флорида, США). Следующие антитела, конъюгированные с красителями, использовали для фенотипирования: CD16-FITC, NKG2A-PE, NKp46-PE, CD3-APC (Beckman Coulter); CD4-APC-Cy7, CD8-РЕ, CD56-BV421, CD94-APC (BD Biosciences); CD3-Alexa488, NKG2D-APC, CD62L-PE-Cy7, CD45-eFluor450, CD45-APC (eBiosciences); CD56-PE, KIR2D-APC (Miltenyi); NKG2C-PE NKp44-APC, TRAIL-РЕ (R&D Systems).

(3) Получение и исследование зарактеристик частиц плазматической мембраны

69. Частицы РМ получали из клеток K562-mb21-41BBL. Клетки выращивали в среде RPMI-1640 с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки. Клетки собирали центрифугированием (1000 х g, 10 минут), промывали DPBS, содержащим 2 мМ ЭДТА. Клетки ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 50 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCb и AEBSF, апротинин, лейпептин и пепстатин А. Клетки разрушали кавитацией азота при давлении 300 фунтов на кв. дюйм в течение 30 минут при 4°С (Parr Instruments, Молине, штат Иллинойс, США). Лизат клеток центрифугировали (1000 х g, 10 минут), затем супернатант центрифугировали (100000 х g) для осаждения необработанных клеточных мембран. Затем необработанные мембраны очищали центрифугированием в градиенте концентраций сахарозы и собирали фракцию, соответствующую замкнутым везикулам плазматической мембраны. Все процедуры выполняли с соблюдением правил асептики, стерильность продукта проверяли в культуре. Получение частиц РМ количественно оценивали по концентрации белка при анализе ВСА и указывали в μг мембранного белка/мл. Присутствие ИЛ-21 и 41BBL в частицах РМ подтверждали твердофазным ИФА и вестерн-блоттингом.

(4) Размножение NK-клеток из МПК ex vivo

70. NK-клетки размножали из МПК с использованием частиц РМ21. Вкратце, МПК высевали из расчета 0.1×10⁶ NK-клеток/мл в SCGM (CellGenix, Портсмут, штат Нью-Гемпшир, США) с добавлением 10% FBS, 2 мМ Glutamax, 100 ед/мл ИЛ-2 (Peprotech, Роки-Хилл, штат Нью-Джерси, США) и 200 мкг/мл частиц РМ21. Среду с добавками меняли в рабочем порядке каждые 2-3 дня после 5 дня.

(5) Анализы цитотоксичности NK-клеток у аутологичного пациента

71. Анализ цитотоксичности NK-клеток, полученных от пациентов против аутологичных опухолевых ОМЛ-клеток, анализировали с помощью аннексина V (BD Bioscience). NK-клетки, размноженные в течение 16 дней (содержание NK-клеток >90%), окрашивали красителем TFL4. Опухолевые клетки-мишени совместно культивировали из расчета 0,5×10⁶ CD34⁺ клеток/мл с NK -клетками в соотношениях Е:Т 1:1, 2:1, 5:1 и 10:1 в течение 2 часов при 37°С, в атмосфере 5% СО₂. Затем клетки центрифугировали и ресуспендировали в буфере для мечения аннексином V, содержащем аннексии V-FITC, антитело против CD34-PE и антитело против CD56-PC7, и инкубировали в течение 15 минут при 4°С. Меченые клетки разбавляли до объема 250 мкл и анализировали проточной цитометрией на приборе Accuri (BD Bioscience).

(6) Размножение NK-клеток in vivo в организмах мышей NSG

72. МПК, свежеразмороженные или предварительно активированные в течение двух дней с использованием 200 мкг/мл РМ21 и 100 ед/мл ИЛ-2, дважды промывали и ресуспендировали в среде RPMI без фенолового красного. 1×10⁵ NK-клеток в клеточной суспензии общих МПК в/б вводили мышам NSG (NOD-ТКИН ИЛ-2R-гамма^null). Кроме того, в/б вводили частицы РМ21 (количества, указанные в обозначениях к фигуре, два раза в неделю) и ИЛ-2 (1000 ед., три раза в неделю) и отбирали РВ посредством кровопускания из щеки или пункции сердца. Органы собирали при вскрытии и подвергали перфузии для получения суспензий отдельных клеток для анализа.

b) РЕЗУЛЬТАТЫ

(1) Размножение NK-клеток, полученных от здоровых доноров и пациентов с лейкозом, ex vivo и in vivo.

73. Поскольку сообщалось, что клетки K562, сконструированные с целью экспрессии mbIL21, характеризовались лучшей эффективностью при размножении NK-клеток без старения, частицы РМ получали из клеток K562-mb21-41BBL и обозначали как частицы РМ21. Частицы РМ21 характеризовали по размеру и постоянству содержания mbIL21 (фигура S1) и тестировали на предмет способности к размножению NK-клеток.

74. МПК культивировали с частицами РМ21 (200 мкг/мл) в течение 28 дней. NK-клетки, стимулированные частицами РМ21, размножали, и к 14 дню содержание NK-клеток в культурах NK-клеток, стимулированных частицами РМ21, достигало >90% (фигура 1АВ). Обобщенный анализ размножения NK-клеток на 14±1 день культивирования показал, что частицы РМ21 (в среднем 825-кратное размножение, диапазон 163-2216, n=13) значительно (р=0,021) более эффективны по сравнению с частицами РМ15 (в среднем 424-кратное размножение, диапазон 290-570, n=30) (фигура 1С). Кроме того, NK-клетки, стимулированные частицами РМ21, экспоненциально размножались в течение 28 дней, достигая более чем 100000-кратного размножения, в отличие от размножения NK-клеток с частицами РМ15, которое прекращалось на 22 день культивирования из-за старения. Таким образом, частицы РМ21 обладают улучшенной эффективностью по отношению к размножению NK-клеток по сравнению с частицами РМ15, и размножение NK-клеток с частицами РМ21 было сопоставимо с размножением, описанным для питающих клеток K562-mb21-41BBL, из которых были получены частицы РМ21. Размноженные с РМ21 NK-клетки также обладали цитотоксичностью по отношению к лейкозным линиям клеток (фигура S2).

75. Способность частиц РМ21 стимулировать размножение NK-клеток дополнительно тестировали с МПК, полученными от пациентов с лейкозом в стадии ремиссии. Частицы РМ21 относительно эффективно индуцировали размножение NK-клеток во всех трех полученных от пациентов образцах в течение 14 дней культивирования (113±7-кратное размножение для F021, 810±81-кратное размножение для М038 и 352±86-кратное размножение для М050, фигура 1D). Размножение было специфичным по отношению к NK-клеткам, причем процентное содержание NK-клеток преимущественно повышалось по отношению к общему количеству hCD45⁺ клеток (фигура 1Е). Для образца F021 цитотоксичность размноженных NK-клеток тестировали в аутологичных условиях по отношению к опухолевым бластам, полученным от того же самого пациента во время активного заболевания (фигура 1F). При относительно низком соотношении эффекторов и мишеней (Е:Т) 1:1 78±3% опухолевых клеток подвергались апоптозу. Таким образом, данный способ можно применять в условиях аутологичной трансплантации.

76. Способность частиц РМ ускорять размножение in vivo при использовании в виде препарата для инъекций является беспрецедентной.. Для проверки способности частиц РМ21 стимулировать размножение NK-клеток in vivo и определения необходимости предварительной активации ex vivo мышам NSG в/б вводили 0,1×10⁶ NK-клеток в составе необработанных МПК или МПК, предварительно активированных частицами РМ21 (РМ21-МПК). У мышей, которым вводили неактивированные МПК, наблюдалось небольшое количество NK-клеток человека (hNK) в РВ, и только количество hT-клеток увеличивалось в процентном соотношении от общего числа hCD45⁺ клеток в течение 15 дней после инъекции (фигура 2АВ). В отличие от этого, обнаружено, что РВ мышей, которым вводили РМ21-МПК, содержала повышенное количество hNK-клеток, которое достигало пика через 12 дней после в/б инъекции (фигура 2CD). Содержание NK-клеток обогащалось до 53±8% от количества hCD45⁺-клеток. В этом же эксперименте тестировали эффективность в/б введения частиц РМ21 in vivo по отношению к стимуляции размножения NK-клеток in vivo. У мышей, которым вводили обычные МПК, дополнительные частицы РМ21 не стимулировали размножение hNK-клеток in vivo. Однако введение частиц РМ21 in vivo мышам, которым трансплантировали РМ21-МПК, оказывало эффект, когда количество клеток hNK было выше по сравнению с мышами с РМ21-МПК, которые не получали частицы РМ21 in vivo (фигура 2D).

77. Для подтверждения того, что частицы РМ21 индуцируют пролиферацию NK-клеток in vivo, выполняли анализ с hNK-клетками, меченными CTViolet и размножающимися in vivo через 6 дней после в/б инокуляции. Клетки мышей, которым вводили неактивированные РВМС, демонстрировали незначительное или крайне незначительное снижение флуоресценции CTViolet, что указывает на отсутствие деления или очень слабо выраженное деление NK-клеток (фигура 3АВ). hNK-клетки от мышей, которым вводили РМ21-МПК, демонстрировали значительное снижение интенсивности флуоресценции CTViolet (фигура 3CD). Аппроксимация интенсивности флуоресценции показала, что снижение интенсивности коррелирует с основной популяцией, в которой происходит 7 клеточных делений in vivo в течение 6 дней. Для hNK-клеток, полученных у мышей, получивших в/б инъекции частиц РМ21, наблюдали еще одно деление. Это дополнительное удвоение при введении частиц РМ21 in vivo коррелирует с более высоким количеством NK-клеток, наблюдаемым в РВ с частицами РМ21 in vivo.

78. Для дальнейшей проверки способности частиц РМ21 in vivo стимулировать размножение NK-клеток in vivo, изучали зависимость действия частиц РМ21 in vivo от дозы (фигура 4). Зависимое от дозы увеличение количества hNK-клеток в РВ наблюдали при дозах от 0 до 800 мкг частиц РМ21 на инъекцию (фигура 4Е). При дозе 800 мкг (что соответствует приблизительно 100 нг mbIL21) через 12 дней после в/б инъекции РМ21-МПК наблюдали 470±40 hNK-клеток на мкл РВ. Эта концентрация NK-клеток в РВ в 5 раз превышала концентрацию, которая обычно считается терапевтически эффективной в условиях ОМЛ. Влияние на размножение in vivo в зависимости от дозы было специфичным для hNK-клеток, причем значительного увеличения количества Т-клеток не наблюдали (фигура4Е). При более высоком количестве 1600 мкг на инъекцию количество hNK-клеток в РВ снижалось аналогично эффекту, наблюдаемому ex vivo, где доза ~200-400 мкг/мл являлась оптимальной для частиц РМ21 или РМ15, а более высокие количества ослабляли размножение NK-клеток.

79. Наблюдение значительного количества hNK-клеток в РВ показывает, что hNK-клетки, размножающиеся из РМ21-МПК, введенных посредством в/б инъекции, могут мигрировать из брюшной полости в РВ. Чтобы убедиться, что адоптивно перенесенные hNK-клетки могут мигрировать в потенциальные очаги заболевания, выполнили количественную оценку hNK-клеток в различных органах (фигура 5). NK-клетки человека обнаруживали в каждом обследуемом органе, и во всех органах мышей, получавших 800 мкг частиц РМ21 in vivo, за исключением печени, количество hNK-клеток было значительно повышено (р<0,05). Кроме того, в органах мышей, обработанных 800 мкг частиц РМ21, процент hNK-клеток был повышен как доля от общего количества hCD45⁺ клеток.

80. Исследования на мышах, описанные в настоящем документе, показали, что процедура, объединяющая краткую предварительную активацию с частицами РМ21 ех vivo и введение частиц РМ21 in vivo, индуцирует выраженное размножение NK-клеток in vivo, потенциально в терапевтически значимом диапазоне. Для демонстрации постоянства, необходимого для клинического применения, процедуру применяли к источникам лейкоцитов от трех различных доноров (не тех, которых использовали в других экспериментах) (фигура 6). Среднее количество hNK-клеток как в РВ, так и в брюшной полости было относительно одинаковым в различных источниках лейкоцитов. Процент hNK-, hT-клеток и других hCD45⁺ клеток также был постоянным для мышей в группе, получавшей РМ21-МПК из определенного источника лейкоцитов (n=3), а также между источниками лейкоцитов L8 и L10.

(2) Фенотип NK-клеток, размножающихся с помощью частиц РМ21.

81. Противоопухолевую цитолитическую активность NK-клеток определяли по равновесию стимулов от активирующих и ингибирующих сигналов. В настоящем документе выполнили подробное сравнительное обследование NK-клеток, стимулированных частицами РМ21: 1) размноженных ex vivo с помощью РМ21 в течение 12 дней, 2) размноженных in vivo и выделенных из РВ, и 3) размноженных in vivo и выделенных из смыва из брюшной полости (AW). Эти сравнения параллельно выполняли с использованием клеток от одного донора при всех условиях (фигура S3).

82. Присутствие CD 16 (рецептора Feγ) на NK-клетках необходимо для эффективной антитело-зависимой цитотоксичности (ADCC). Почти все NK-клетки, размноженные in vivo, демонстрировали экспрессию CD 16 (97% и 87% в РВ и AW, соответственно). CD94 представляет собой поверхностный рецептор, образующий гетеродимерные комплексы с NKG2C или NKG2A. Приблизительно половина NK-клеток, размноженных ex vivo, экспрессировала CD94. Для клеток NK, размноженных in vivo, клетки из AW (64±9%) характеризовались более высокой экспрессией, чем NK-клетки из РВ (38±13%). Оба рецептора семейства NKG2 связываются с CD94, причем NKG2C является активирующим рецептором, a NKG2A - ингибиторным рецептором. NK-клетки, размноженные ex vivo, характеризовались относительно низкой экспрессией NKG2C, однако экспрессия на NK-клетках из AW была выше (53±8%) и еще выше по сравнению с NK-клетками из РВ (61±2%). Доля NK-клеток, экспрессирующих NKG2A, была выше в AW (82±8%) по сравнению с РВ (67±12%) и в клетках, размноженных ex vivo (74%). NKG2D является еще одним важным активирующим рецептором, обнаруженным на NK-клетках, и его экспрессию обнаруживали на 61±6% NK-клетках из AW, 26±3% - из РВ и на приблизительно 75% NK-клеток, размноженных ex vivo. Экспрессия CD62L, которая, как известно, коррелирует с хомингом в костном мозге, была выше для NK-клеток в РВ (63±10%) и ниже для NK-клеток в AW (39±14), что согласуется с повышенной экспрессией в мобилизованных клетках. NKp44 и NKp46 являются членами семейства рецепторов естественной цитотоксичности и играют роль в цитолизе, опосредованном NK-клетками. NKp46 экспрессировался на NK-клетках как из РВ (76±9%), так и из AW (89±5%). NKp44 сравнительно слабо экспрессировался на этих NK-клетках изо всех источников. С другой стороны, NKp46 хорошо экспрессировался как в РВ (89±5), так и в AW (76±9). TRAIL представляет собой лиганд на NK-клетках, индуцирующий апоптоз мишеней за счет пути рецептора гибели клеток. TRAIL экспрессировался на 36±6% NK-клеток из AW, 20±4% из РВ и 26% клеток, размноженных ex vivo. KIR2D представляет собой иммуноглобулин-подобный рецептор киллеров (KIR) подтипа 2D; меньшая часть (приблизительно 1/3) NK-клеток, размноженных in vivo или ex vivo, экспрессировала KIR2D. Долю CD8 и CD4 Т-клеток проанализировали и обнаружили, что CD8 Т-клетки в образцах in vivo были более многочисленными, чем CD4 Т-клетки. Кроме того, исследовали присутствие NK-супрессивных Treg-клеток; их количество в образцах in vivo было очень низким (<0,1% от всех CD3⁺ клеток).

с) ОБСУЖДЕНИЕ

(1) Частицы РМ21 облегчают размножение NK-клеток ех vivo и in vivo до терапевтически значимого количества.

83. Адоптивная терапия с применением NK-клеток имеет большие перспективы как способ лечения рака при начальном лечении и поддержания ремиссии различных опухолей. Требование для терапевтического применения NK-клеток представляет собой способ быстрого и селективного размножения NK-клеток, который является безопасным, простым и в целом терапевтически эффективным. В настоящее время выполняются клинические исследования нескольких способов на основе цитокинов и питающих клеток, и методология, использующая линию клеток K562-mb21-41BBL, является одной из наиболее эффективных для размножения NK-клеток ex vivo. В то время как способы на основе питающих клеток эффективно обеспечивают высокую начальную дозу и могут позволять многократное введение, это может повлиять на способность размноженных ех vivo NK-клеток к хомингу в костном мозге, важную для лечения лейкоза, и устойчивость NK-клеток, введенных путем вливания in vivo, может быть неоптимальной. Описанный в настоящем документе комбинированный способ размножения NK-клеток ex vivo и in vivo на основе частиц РМ21 может значительно повысить эффективность адоптивной терапии с применением NK-клеток.

84. Важно, что частицы РМ21 можно использовать для стимуляции in vivo с целью индукции размножения и постоянства in vivo. Разработанная в настоящем документе методология использовала короткую предварительную активацию ex vivo в течение 2 дней с последующим введением частиц РМ21 in vivo. Применение частиц РМ21 in vivo вызывает усиленное размножение NK-клеток in vivo в зависимости от дозы частиц РМ21, применяемых in vivo. При текущей оптимизированной процедуре наблюдали в среднем 360-кратное увеличение количества NK-клеток in vivo в РВ с 5 по 12 день после в/б инъекции РМ21-МПК и, возможно, более высокую кратность размножения в брюшной полости. Для сравнения, в недавнем исследовании показано, что после в/в вливания 1-2×10⁶ NK-клеток на 14-й день после вливания наблюдали лишь 5-17 NK-клеток на мкл крови. Напротив, в данном исследовании с использованием стимуляции частицами РМ21 обнаруживали >400 NK-клеток/мкл крови на 12-й день после в/б вливания 2,0×10⁶ РМ21-МПК (11%, т.е. 0,2×10⁶ NK-клеток). Кроме того, в более раннем исследовании использовали 5 мкг (~ 50000 ед.) на инъекцию (трижды в неделю) ИЛ-2 либо ИЛ-15, тогда как в данном исследовании использовали относительно низкую дозу ИЛ-2 (1000 ед./инъекцию трижды в неделю). В другом исследовании 30×10⁶ NK-клеток, предпочтительно размноженных ex vivo с помощью питающих клеток K562-mb15-41BBL, в/в вводили с последующим отслеживанием введенных лимфоцитов человека с использованием антитела против CD45 (а не комбинации антитела против CD56 и антитела против CD3). При этом способе для поддержания количества лимфоцитов необходимо в/б введение высокой дозы ИЛ-2 (25000 ед/день), причем концентрацию NK-клеток не определяли, а скорее подразумевали. По сравнению с этими предыдущими способами, величина стимулированного частицами РМ21 размножения NK-клеток in vivo является беспрецедентной и представляет собой уникальную способность частиц РМ21.

85. В настоящем документе доставку РМ21-МПК мышам NSG выполняли путем в/б инъекции, аналогично предыдущим доклиническим исследованиям. По сравнению с этими предыдущими исследованиями способ на основе частиц РМ21 обладает преимуществами в отношении нескольких аспектов. Во-первых, комбинированная предварительная активация ex vivo и стимуляция in vivo частицами РМ21 позволяет использовать намного меньшее количество неотобранных МПК по сравнению с активацией выделенных NK-клеток цитокинами, что требует сбора большого количества лимфоцитов путем афереза с последующей обширной лабораторной обработкой для обогащения NK-клеток. Во-вторых, способ на основе частиц РМ21 требует только краткой предварительной активации в течение 2 дней вместо двухнедельного размножения в культуре, что может обеспечить лучшее сохранение физиологически значимой функциональности. В-третьих, текущий способ позволяет значительно усиливать размножение in vivo по сравнению с предыдущими способами, которые не обеспечивают размножение или поддержание количества клеток in vivo без использования высокой дозы ИЛ-2, ассоциированной с клинической токсичностью. При внутрибрюшинных опухолях преимущества текущего описанного способа могут значительно усиливать общий противоопухолевый эффект. В отсутствие внутрибрюшинных опухолей брюшная полость являться подходящей средой, удерживающей частицы РМ21 в своем объеме и способствующей успешному размножению in vivo, что ясно показано при анализе пролиферации с CTViolet, а затем NK-клетки могут мигрировать в значительных количествах в РВ и органы. При применении частиц РМ21 in vivo NK-клетки не только наблюдались в РВ, но и обнаруживались в органах, а также были более многочисленными. Количество NK-клеток в костном мозге было сопоставимо с таковым в исследовании с использованием NK-клеток, полученных из стволовых CD34⁺ клеток пуповинной крови, что указывает на то, что эти NK-клетки способны к хомингу в костном мозге.

86. Фенотипирование NK-клеток, параллельно размноженных ex vivo или in vivo (фигура S3) показало, что полученные клетки были аналогичны независимо от подхода. Интересные различия наблюдались в отношении размножения NKG2A^- и NKG2C⁺ субпопуляций, которые в основном наблюдались для NK-клеток, размноженных in vivo, но не ex vivo. Популяции NKG2C NK -клеток наблюдались во время реактивации вируса, связанной с иммунным ответом, подобным ответу, обусловленному клетками памяти; недавно показано, что они зависят от продукции ИЛ-12 моноцитами. Присутствие NKG2C⁺ NK-клеток у пациентов с реактивацией ЦМВ после трансплантации стволовых клеток для лечения ОМЛ также ассоциировалось с лучшим исходом и меньшей частотой рецидивов. Кроме того, существование значительной популяции NKG2A^- NK-клеток, устойчивых к HLA-E-индуцированному ингибированию, может быть важным при лечении пациентов с множественной миеломой, где клетки подавляют HLA I класса, но экспрессируют HLA-E для ускользания от ответа NK-клеток. Подходы, направленные на подавление NKG2A, предлагали в качестве средства улучшения цитотоксичности NK-клеток и, следовательно, их терапевтического потенциала. Поскольку клетки, размноженные ex vivo, в основном представляли собой NKG2A⁺, сокращение времени культивирования ex vivo с последующим размножением in vivo может обеспечить дополнительное преимущество в отношении образования NK-клеток с повышенным фенотипическим разнообразием и потенциально высокой цитотоксичностью по отношению к мишеням.

(2) Потенциальная клиническая ценность частиц РМ21.

87. Способность частиц РМ21 стимулировать размножение NK-клеток может обеспечить расширенное применение адоптивной терапии с использованием NK-клеток для лечения рака и, возможно, других заболеваний. Частицы РМ21 легко заменить питающими клетками, которые в настоящее время используются в клинических исследованиях для упрощения логистики и снижения рисков. В регуляторных областях, где использование питающих клеток опухолевого происхождения запрещено или затруднено из-за сложностей с получением разрешения, частицы РМ21 представляют собой готовое решение для размножения и активации ex vivo. Для использования частиц РМ21 для размножения ex vivo в аллогенных условиях можно вызвать истощение Т-клеток до размножения NK-клеток ex vivo. В текущих клинических исследованиях NK-клеток, выращенных с K562-mbIL21, используют истощение Т-клеток до размножения NK-клеток для устранения аллогенных Т-клеток, которые могут вызывать РТПХ. Более того, введение частиц РМ21 in vivo может дополнительно способствовать размножению NK-клеток in vivo, что является беспрецедентной способностью и, возможно, ослабляет размножение Т-клеток, смягчая риск РТПХ. Этот способ размножения NK-клеток можно клинически приспособить для лечения рака брюшины и других опухолей брюшной полости, например, персистирующего эпителиального рака яичников или десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли. В настоящее время проводятся эксперименты по оценке противоопухолевой эффективности при ликвидации опухоли в брюшной полости. Частицы РМ21-МПК и РМ21 можно применять для аутологичного лечения, и в настоящее время изучаются методологии по применению истощения Т-клеток в аллогенных условиях.

88. Важно отметить, что NK-клетки, размноженные этим способом, биологически распределяются из брюшной полости в периферическую кровь и различные органы, которые являются потенциальными очагами различных других видов рака. Хотя в/б путь инъекции является нетрадиционным при лечении гематологических злокачественных новообразований, доставка NK-клеток этим в/б путем приводит к концентрации NK-клеток в РВ, что важно для лечения ОМЛ.

89. Подход на основе частиц для регуляции сигнальных путей, специфичных для NK-клеток, может представлять собой платформу для включения других сигнальных молекул или даже носителя для доставки агентов в упакованном виде в целях дальнейшей направленной стимуляции NK-клеток для усиления хоминга, противоопухолевой цитотоксичности и поддержания количества клеток. Частицы РМ21 могут в высокой степени дополнять все разрабатываемые инновационные способы иммунотерапии, специфической по отношению к NK-клеткам (на основе ингибиторов ключевых компонентов иммунного ответа, CAR, биспецифичных активаторов (BiKE), ИЛ-2, присоединенного к DT для истощения Treg и т.д.), и полезные эффекты, усугубляемые при размножении NK-клеток in vivo с помощью стимуляции РМ21. Даже в качестве доклинического средства текущий способ может обеспечить беспрецедентный способ исследования таких комбинированных способов. Разумеется, существуют модели на основе мыши, однако других способов исследования NK-клеток человека, которые могут присутствовать in vivo в течение значительного периода времени, не существует.

90. Подводя итог, можно сказать, что данная процедура с использованием частиц РМ21 обеспечивает преимущественное размножение NK-клеток in vivo на уровнях, обычно достигаемых только при размножении ex vivo с помощью питающих клеток, но не требует культивирования клеток с питающими клетками или высокими дозами цитокинов, которые являются токсичными. Кроме того, РМ21-МПКс доставкой частиц РМ21 in vivo можно использовать в аутологичных условиях для использования преимуществ благоприятного синергического эффекта других иммунных клеток по отношению к функции NK-клеток и дополнительно комбинировать с другими стратегиями, например, применением антител против KIR или BiKE для максимизации цитотоксичности NK-клеток. Таким образом, данный способ соответствует критериям для получения NK-клеток, обладающих потенциальной терапевтической эффективностью, а также является простым, в большей степени подходит для клинической адаптации и может быть эффективным при лечении рака или других заболеваний.

2. Пример 2: Перенос NK-клеток в костный мозг за счет стимуляции фукозилирования с помощью частиц РМ21

91. Частицы РМ21, полученные из клеток K562, трансформированных с целью экспрессии сконструированной мембраносвязанной формы ИЛ-21 и 41bbl (K562.mb21.41bbl), эффективно индуцируют специфическое размножение NK-клеток. Стимуляция, обеспечиваемая частицами РМ21 или K562.mb21.41bbl, используемыми в качестве питающих клеток (FC21) в совместной культуре с NK-клетками, индуцирует полное фукозилирование sLex, наблюдаемое по связыванию мАт НЕСА-452 при проточной цитометрии.

92. NK-клетки размножали с помощью РМ21 или FC21 и окрашивали мАт НЕСА452 и анализировали проточной цитометрией. НЕСА452 специфически распознает фукозилированную форму PSGL-1, CD44 и других лигандов Е-селектина. NK-клетки, стимулированные РМ21 или FC21, характеризовались значительно более высокой MFI при проточно-цитометрическом анализе по сравнению с необработанными NK-клетками, NK-клетками, обработанными растворимыми цитокинами, или NK-клетками, обработанными питающими клетками, содержащими только mbIL21 (но не 41bbl). Это убедительно свидетельствует о том, что стимуляция частицами РМ21 и/или питающими клетками FC21 может стимулировать перенос NK-клеток в костный мозг, и что перенос в костный мозг терапевтических NK-клеток, полученных с помощью стимуляции за счет РМ21 или FC21, может быть благоприятен для костного мозга и улучшить лечение злокачественных новообразований костного мозга.

93. На фигуре 7 показано действие растворимых цитокинов на НЕСА-452-окрашивание NK-клеток через 0, 1, 7 и 10 дней стимуляции. Влияние стимуляции частицами или питающими клетками показано на фигуре 8, где NK-клетки стимулировали клетками K562 или клетками K562 с мембраносвязанным ИЛ-21 и 41BBL (клетками FC21 или частицами РМ21) в течение 10, 12 или 14 дней и окрашивали НЕСА452. NK-клетки, стимулированные питающими клетками FC21, происходящими от K562, или частицами РМ21 демонстрировали выраженную активацию по сравнению с NK-клетками, стимулированными питающими клетками K562 без ИЛ-21. На фигурах 9 и 10 показано действие 10 дней культивирования NK-клеток в различных условиях. NK-клетки культивировали в течение 10 дней в различных условиях, как показано. В качестве зонда для NK-клеток использовали мАт НЕСА 452, конъюгированное с FITC, которое обнаруживало фукозилированную форму SLex. Клетки культуры окрашивали НЕСА452-FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии с гейтированием по CD56+CD3-. (CSTX2 = CytoSen K562.mb21.41bbl; РС = питающие клетки; РМ21 = частицы плазматической мембраны, полученные из CSTX2).

94. Для просмотра влияния периода покоя на стимулированные NK-клетки (фигура 11) NK-клетки культивировали в течение 10 дней с частицами CSTX2-PM21 (вверху) и затем "оставляли" в культуре на 3 дня после удаления частиц РМ21 (внизу). В качестве зонда для NK-клеток использовали мАт НЕСА 452, конъюгированное с FITC, которое обнаруживало фукозилированную форму SLex. Клетки культуры окрашивали НЕСА452-FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии с гейтированием по CD56+CD3-. (CSTX2 = CytoSen K562.mb21.41bbl; РС = питающие клетки; РМ21 = частицы плазматической мембраны, полученные из CSTX2).

95. NK-клетки, стимулируемые частицами РМ21, были стабильны и выживали после замораживания/размораживания без различимого влияния на клетки (фигура 12). NK-клетки выделяли из МПК (вверху), культивировали в течение 10 дней с частицами CSTX2-PM21 (в середине), а затем замораживали с криоконсервантом и размораживали (внизу). В качестве зонда для NK-клеток использовали мАт НЕСА 452, конъюгированное с FITC, которое обнаруживало фукозилированную форму SLex. Клетки культуры окрашивали HECA452-FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии с гейтированием по CD56+CD3-. (CSTX2 = CytoSen K562.mb21.41bbl; РС = питающие клетки; РМ21 = частицы плазматической мембраны, полученные из CSTX2).

Е. Библиография

Altvater В, Landmeier S, Pscherer S, Temme J, Schweer K, Kailayangiri S, et al. 2B4 (CD244) signaling by recombinant antigen-specific chimeric receptors costimulates natural killer cell activation to leukemia and neuroblastoma cells. Clin Cancer Res 2009; 15:4857-66.

Bachanova V, Cooley S, Defor ТЕ, Verneris MR, Zhang B, McKenna DH, et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood 2014; 123:3855-63.

Berg M, Lundqvist A, McCoy P, Jr., Samsel L, Fan Y, Tawab A, et al. Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells. Cytotherapy 2009; 11:341-55.

Cany J, van der Waart AB, Tordoir M, Franssen GM, Hangalapura BN, de Vries J, et al. Natural killer cells generated from cord blood hematopoietic progenitor cells efficiently target bone marrow-residing human leukemia cells in NOD/SCro/IL2Rg(null) mice. PLoS One 2013; 8:e64384.

Carlsten M, Childs RW. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Front Immunol 2015; 6:266.

Chang YH, Connolly J, Shimasaki N, Mimura К, Kono K, Campana D. A chimeric receptor with NKG2D specificity enhances natural killer cell activation and killing of tumor cells. Cancer Res 2013; 73:1777-86.

Childs RW, Carlsten M. Therapeutic approaches to enhance natural killer cell cytotoxicity against cancer: the force awakens. Nat Rev Drug Discov 2015.

Davis ZB, Cooley SA, Cichocki F, Felices M, Wangen R, Luo X, et al. Adaptive Natural Killer Cell and Killer Cell Immunoglobulin-Like Receptor-Expressing T Cell Responses are Induced by Cytomegalovirus and Are Associated with Protection against Cytomegalovirus Reactivation after Allogeneic Donor Hematopoietic Cell Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2015.

Denman CJ, Senyukov VV, Somanchi SS, Phatarpekar PV, Kopp LM, Johnson JL, et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One 2012; 7:e30264.

Dijkers PF, Birkenkamp KU, Lam EW, Thomas NS, Lammers JW, Koenderman L, et al. FKHR-Ll can act as a critical effector of cell death induced by cytokine withdrawal: protein kinase B-enhanced cell survival through maintenance of mitochondrial integrity. J Cell Biol 2002; 156:531-42.

Fehniger ТА, Cooper MA, Nuovo GJ, Cella M, Facchetti F, Colonna M, et al. CD56bright natural killer cells are present in human lymph nodes and are activated by T cell-derived IL-2: a potential new link between adaptive and innate immunity. Blood 2003; 101:3052-7.

Foley B, Cooley S, Verneris MR, Curtsinger J, Luo X, Waller EK, et al. Human cytomegalovirus (CMV)-induced memory-like NKG2C(+) NK cells are transplantable and expand in vivo in response to recipient CMV antigen. J Immunol 2012; 189:5082-8.

Foley B, Cooley S, Verneris MR, Pitt M, Curtsinger J, Luo X, et al. Cytomegalovirus reactivation after allogeneic transplantation promotes a lasting increase in educated NKG2C+natural killer cells with potent function. Blood 2012; 119:2665-74.

Fujisaki H, Kakuda H, Shimasaki N, Imai C, Ma J, Lockey T, et al. Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy. Cancer Res 2009; 69:4010-7.

Geller MA, Knorr DA, Hermanson DA, Pribyl L, Bendzick L, McCullar V, et al. Intraperitoneal delivery of human natural killer cells for treatment of ovarian cancer in a mouse xenograft model. Cytotherapy 2013; 15:1297-306.

Gleason MK, Ross JA, Warlick ED, Lund TC, Verneris MR, Wiernik A, et al. CD16×CD33 bispecific killer cell engager (BiKE) activates NK cells against primary MDS and MDSC CD33⁺ targets. Blood 2014; 123:3016-26.

Glienke W, Esser R, Priesner C, Suerth JD, Schambach A, Wels WS, et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol 2015; 6:21.

Klingemann HG. Cellular therapy of cancer with natural killer cells-where do we stand? Cytotherapy 2013; 15:118 5 -94.

Knorr DA, Bachanova V, Verneris MR, Miller JS. Clinical utility of natural killer cells in cancer therapy and transplantation. Semin Immunol 2014; 26:161-72.

Kohrt HE, Thielens A, Marabelle A, Sagiv-Barfi I, Sola C, Chanuc F, et al. Anti-KIR antibody enhancement of anti-lymphoma activity of natural killer cells as monotherapy and in combination with anti-CD20 antibodies. Blood 2014; 123:678-86.

Leclercq G, Debacker V, de Smedt M, Plum J. Differential effects of interleukin-15 and interleukin-2 on differentiation of bipotential T/natural killer progenitor cells. J Exp Med 1996; 184:325-36.

Miller JS, Rooney CM, Curtsinger J, McElmurry R, McCullar V, Verneris MR, et al. Expansion and homing of adoptively transferred human natural killer cells in immunodeficient mice varies with product preparation and in vivo cytokine administration: implications for clinical therapy. Biol Blood Marrow Transplant 2014; 20:1252-7.

Miller JS, Soignier Y, Panoskaltsis-Mortari A, McNearney SA, Yun GH, Fautsch SK, et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood 2005; 105:3051-7.

Miller JS. Should natural killer cells be expanded in vivo or ex vivo to maximize their therapeutic potential? Cytotherapy 2009; 11:259-60.

Nguyen S, Kuentz M, Vernant JP, Dhedin N, Bories D, Debre P, et al. Involvement of mature donor T cells in the NK cell reconstitution after haploidentical hematopoietic stem-cell transplantation. Leukemia 2008; 22:344-52.

Oyer JL, Igarashi RY, Kulikowski AR, Colosimo DA, Solh MM, Zakari A, et al. Generation of highly cytotoxic natural killer cells for treatment of acute myelogenous leukemia using a feeder-free, particle-based approach. Biol Blood Marrow Transplant 2015; 21:632-9.

Park KU, Jin P, Sabatino M, Feng J, Civini S, Khuu H, et al. Gene expression analysis of ex vivo expanded and freshly isolated NK cells from cancer patients. J Immunother 2010; 33:945-55.

Phan TG, Long GV, Scolyer RA. Checkpoint inhibitors for cancer immunotherapy. Multiple checkpoints on the long road towards cancer immunotherapy. Immunol Cell Biol 2015;93:323-5.

Rodella L, Zamai L, Rezzani R, Artico M, Peri G, Falconi M, et al. Interleukin 2 and interleukin 15 differentially predispose natural killer cells to apoptosis mediated by endothelial and tumour cells. Br J Haematol 2001; 115:442-50.

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

Rolle A, Pollmann J, Ewen EM, Le VT, Halenius A, Hengel H, et al. IL-12-producing monocytes and HLA-E control HCMV-driven NKG2C⁺ NK cell expansion. J Clin Invest 2014; 124:5305-16.

Romagne F, Andre P, Spee P, Zahn S, Anfossi N, Gauthier L, et al. Preclinical characterization of 1-7F9, a novel human anti-KIR receptor therapeutic antibody that augments natural killer-mediated killing of tumor cells. Blood 2009; 114:2667-77.

Romee R, Foley B, Lenvik T, Wang Y, Zhang B, Ankarlo D, et al. NK cell CD 16 surface expression and function is regulated by a disintegrin and metalloprotease-17 (ADAM17). Blood 2013; 121:3599-608.

Ross ME, Caligiuri MA. Cytokine-induced apoptosis of human natural killer cells identifies a novel mechanism to regulate the innate immune response. Blood 1997; 89:910-8.

Sarkar S, van Gelder M, Noort W, Xu Y, Rouschop KM, Groen R, et al. Optimal selection of natural killer cells to kill myeloma: the role of HLA-E and NKG2A. Cancer Immunol Immunother 2015.

Shimasaki N, Fujisaki H, Cho D, Masselli M, Lockey T, Eldridge P, et al. A clinically adaptable method to enhance the cytotoxicity of natural killer cells against B-cell malignancies. Cytotherapy 2012; 14:830-40.

Somanchi SS, Senyukov VV, Denman С J, Lee DA. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp 2011.

West WH, Tauer KW, Yannelli JR, Marshall GD, Orr DW, Thurman GB, et al. Constant-infusion recombinant interleukin-2 in adoptive immunotherapy of advanced cancer. N Engl J Med 1987; 316:898-905.

Zhu EF, Gai SA, Opel CF, Kwan BH, Surana R, Mihm MC, et al. Synergistic innate and adaptive immune response to combination immunotherapy with anti-tumor antigen antibodies and extended serum half-life IL-2. Cancer Cell 2015; 27:489-501.

1. Способ переноса NK-клеток в костный мозг субъекта, включающий приведение NK-клеток в контакт с одной или более из частиц PM21 и/или питающих клеток FC21 до переноса NK-клеток в организм указанного субъекта и введение NK-клеток указанному субъекту, где указанный способ индуцирует в NK-клетках клеточный механизм, индуцирующий фукозилирование PSGL-1 на поверхности NK-клеток.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает стимуляцию NK-клеток ИЛ-2, ИЛ-12 и/или ИЛ-18.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает приведение в контакт одной или более из частиц PM21 и/или питающих клеток FC21 с NK-клетками после переноса NK-клеток в организм субъекта.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что указанный способ индуцирует в NK-клетках экспрессию FUT7, коррелирующую с фукозилированием PSGL-1 на поверхности NK-клеток.

5. Способ лечения злокачественного новообразования костного мозга у субъекта, включающий приведение NK-клеток в контакт с частицами PM21 и/или питающими клетками FC21 до переноса NK-клеток в организм указанного субъекта и адоптивный перенос NK-клеток в организм субъекта, где указанный способ индуцирует в NK-клетках клеточный механизм, индуцирующий фукозилирование PSGL-1 на поверхности NK-клеток.

6. Способ по п. 1 или 5, включающий приведение NK-клеток в контакт с частицами PM21 до переноса NK-клеток в организм субъекта.

7. Способ по п. 6, дополнительно включающий введение частиц PM21 субъекту после переноса NK-клеток в организм субъекта.

8. Способ по п. 7, дополнительно включающий введение одного или более из ИЛ-2, ИЛ-12 и/или ИЛ-18 субъекту после переноса NK-клеток в организм субъекта.

9. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что клетки FC21 представляют собой клетки K562, которые экспрессируют мембраносвязанный ИЛ-21 и/или 4-1ВВ лиганд.

10. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что частицы PM21 представляют собой частицы плазматической мембраны, полученные из клеток K562, которые экспрессируют мембраносвязанный ИЛ-21 и/или 4-1ВВ лиганд.

11. Способ по любому из пп. 1-8 и 10, отличающийся тем, что частицы PM21 представляют собой частицы плазматической мембраны, полученные из клеток K562, которые экспрессируют мембраносвязанный ИЛ-21 и 4-1ВВ лиганд.

12. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанный способ индуцирует в NK-клетках экспрессию FUT7, коррелирующую с фукозилированием PSGL-1 на поверхности NK-клеток.