Способ количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах

Авторы патента:

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

G01N30/72 - масс-спектрометры

Владельцы патента RU 2780870:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к аналитической и фармацевтической отрасли, а именно к определению остаточных количеств 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических жидкостях при установлении фармакокинетических параметров и определении терапевтической дозы препарата. Способ количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах включает подготовку пробы, анализ и обработку результатов анализа, причем определение ведут с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, а в качестве детектора используют масс-спектрометрический детектор. Регистрируют масс-хроматограммы при отрицательной ионизации в режиме выбранных ионов при m/z=341, хроматографирование осуществляют на колонке Zorbax Plus CN, длиной 150 мм с внутренним диаметром 4,6 мм и размером частиц 5 мкм, при скорости потока подвижной фазы 0,3 мл/мин и объеме вводимой пробы 20 мкл. Подвижная фаза состоит из смеси ацетонитрила и 1,0%-ного раствора муравьиной кислоты в соотношении 30:70. Концентрацию 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия находят, используя калибровочный график. Способ позволяет определять 4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия в диапазоне концентраций от 2,00 до 100,00 нг/мл с высокой чувствительностью и стабильностью. 1 табл., 3 пр.

Известны способы определения родственных примесей в субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия, включающие анализ растворов субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия методами ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием и методом капиллярного электрофореза [Ю.Э. Генералова, В.Ф. Апраксин, Г.М. Алексеева. Определение чистоты новой фармацевтической субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия хроматографическими методами // Вопросы обеспечения качества лекарственных средств. №3 (29) 2020. С. 19-26 https://www.doi.org/10.34907/JPOAI.2020.49.35.001; Патент 2 721 908 RU. Способ определения родственных примесей в 4,4'-(пропандиамидо)дибензоате натрия методом капиллярного электрофореза].

Недостатком данных способов является то, что описываемые методики не позволяют проводить количественное определение 4,4'-(пропандиамидо)дибензоате натрия и пригодны только для определения родственных примесей в субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоате натрия.

Известен также способ количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в готовой лекарственной форме (таблетки), включающий анализ растворов таблеток, содержащих 4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия, методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием при 270 нм с использованием хроматографической колонки ProntoSIL 120-5-С18 AQ 75мм×2мм×5 мкм, при введении в хроматограф объема пробы - 2 мкл, со скорость потока подвижной фазы, состоящей из смеси метанола с 0,02%-ным водным раствором о-фосфорной кислоты, 100 мкл/мин и температурой термостата 40°С [Новожихорева В.О. Разработка и валидация методики количественного определения активной фармацевтической субстанции в новом лекарственном средстве методом ВЭЖХ / В.О. Новожихорева; науч. рук. Г.М. Алексеева // Химия и химическая технология в XXI веке: материалы XIX Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулева, 21-24 мая 2018 г., г. Томск. - Томск: Изд-во ТПУ, 2018. - С. 288-289].

Недостатком данного метода количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия является использование неорганической мало летучей кислоты и отсутствие данных об аналитическом диапазоне методики, что не позволяет судить о ее практической применимости.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является количественное определение основного вещества в субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия, которое заключается в растворении точной навески субстанции, добавлении 0,1 мл бромкрезолового зеленого (синего) и титровании 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты от синего до желтого окрашивания раствора [Г.М. Алексеева, В.Ф. Апраксин, Ю.Э. Генералова. Изучение кислотно-основных свойств, разработка и валидация методики количественного определения оригинальной фармацевтической субстанции // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2019. Т. 8, №1. С. 66-71. https://www.doi.org/10.33380/2305-2066-2019-8-1-66-71].

Недостатком данного метода количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия является невозможность количественного определения основного вещества в испытуемых растворах с концентрацией 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия менее 6,0 мг/мл из-за недостаточной чувствительности титриметрического метода и индикаторного способа детектирования точки эквивалентности, а также из-за низкой специфичности кислотно-основного титрования при анализе биологических жидкостей.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в диапазоне концентраций от 2,00 до 100,00 нг/мл, повышение чувствительности и производительности при количественном определении за счет использования метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

Технический результат достигается тем, способ определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включает отбор пробы, осаждение, центрифугирование, фильтрацию, введение образца в жидкостный хроматограф, хроматографирование и обработку результатов анализа, в качестве детектора используют масс-спектрометрический детектор, регистрируют масс-хроматограммы при отрицательной ионизации в режиме выбранных ионов при m/z=341, хроматографирование осуществляют на колонке Zorbax Plus CN, длиной 150 мм с внутренним диаметром 4,6 мм и размером частиц 5 мкм, при скорости потока подвижной фазы, состоящей из смеси ацетонитрила и 1,0%-ного раствора муравьиной кислоты, 0,3 мл/мин и объеме вводимой пробы 20 мкл.

При этом в качестве пробы берут аликвоту около 0,5 мл биологической жидкости. Осаждение проводят ацетонитрилом с последующим центрифугированием образца, надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Образец вводят в жидкостный хроматограф с масс-спектрометрическим детектором, регистрируют масс-хроматограммы при отрицательной ионизации в режиме выбранных ионов при m/z=341, используют хроматографическую колонку Zorbax Plus CN, 150 мм × 4,6 мм, 5,0 мкм, в качестве элюента используют ацетонитрил: 1,0%-ный раствор муравьиной кислоты в соотношении 30:70 при скорости потока подвижной фазы 0,3 мл/мин и объеме вводимой пробы 20 мкл.

Использование высокоэффективного жидкостного хроматографа с масс-спектрометрическим детектором и колонки Zorbax Plus CN, 150 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, а также элюента, состоящего из смеси ацетонитрил: 1,0%-ный раствор муравьиной кислоты в соотношении 30:70 при скорости потока подвижной фазы 0,3 мл/мин и объеме вводимой пробы 20 мкл, позволяет получить симметричный хроматографический пик аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата, коэффициент асимметрии которого близок к 1, что вместе с использованием масс-спектрометрического детектора позволяет определять 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в диапазоне концентраций от 2,0 нг/мл до 100,0 нг/мл при высокой чувствительности, стабильности и повторяемости получаемых данных.

Способ количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием осуществляют согласно методике.

Пример 1. Подготовка вспомогательных растворов

Растворитель пробы. Смешивают 70 мл 1,0%-ного раствора муравьиной кислоты и 30 мл ацетонитрила.

Основной раствор: 0,010 г 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, добавляют 5 мл воды для хроматографии, выдерживают в УЗВ 10 мин, доводят объем раствора водой для хроматографии до метки и перемешивают. 0,1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора водой для хроматографии до метки и перемешивают. 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора растворителем пробы до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Калибровочные растворы

Калибровочные растворы готовят последовательным разбавлением основного раствора, получая семь калибровочных растворов с концентрацией 2,0, 10,0, 20,0, 40,0, 60,0, 80,0 и 100,0 нг/мл. В качестве растворителя используют растворитель пробы.

Раствор для определения предела обнаружения (LOD): раствор LOD готовят двукратным разбавлением калибровочного раствора с концентрацией 2,0 нг/мл (С=1,0 нг/мл).

Пример 2. Подготовка испытуемых растворов

Около 0,5 мл (точная аликвота) плазмы крови (мочи) переносят в пробирку, порционно прибавляют ацетонитрил до конечного объема 5 мл при постоянном встряхивании. Затем пробирки центрифугируют 20 минут со скоростью 5000 об/мин. Надосадочную жидкость количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят до метки растворителем пробы и перемешивают. Полученные экстракты фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Срок годности растворов 72 часа при температуре 25°С.

Пример 3. Хроматографирование и обработка результатов

Хроматографические условия:

Хроматографируют калибровочные растворы, получая не менее 3 хроматограмм для каждого раствора в заданных условиях. Время удерживания аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата должно быть около 10,0 мин.

Хроматографическая система считается пригодной, если на хроматограмме калибровочных растворов выполняются следующие условия:

эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата не менее 5000 теоретических тарелок;

фактор асимметрии пика аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата от 0,8 до 1,5;

относительное стандартное отклонение (ОСО) времен удерживания и площадей пиков аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата, рассчитанные по 3 последовательным хроматограммам калибровочных растворов, не более 5,0%.

Строят график зависимости в координатах площадь пика аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата - концентрация (С, нг/мл). Определяют коэффициент корреляции (R), который должен быть не менее 0,990, и коэффициент Стьюдента свободного члена (t_a), который не должен превышать табличное значение.

Хроматографируют растворы для определения предела количественного определения и предела обнаружения не менее 10 раз. Рассчитывают среднее значение и относительное стандартное отклонение площадей пиков аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата, а также значение сигнал/шум для пика аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата. Относительное стандартное отклонение площадей пиков аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата, рассчитанное по хроматограммам раствора для определения предела количественного определения и предела обнаружения должно быть не более 5 и 20% соответственно. Значения сигнал/шум, рассчитанные по хроматограммам раствора для определения предела количественного определения и предела обнаружения должно быть не менее 10 и 3 соответственно.

Хроматографируют испытуемые растворы, получая не менее 3 хроматограмм в заданных условиях.

Концентрацию 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в испытуемых растворах в нг/мл находят, используя калибровочный график.

Анализ метрологических характеристик способа определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах (табл. 1) показывает высокую чувствительность, стабильность и повторяемость полученных результатов в диапазоне концентраций от 2,0 нг/мл до 100,0 нг/мл за счет высокой чувствительности масс-спектрометрического детектора, что приводит к возможности определения низких концентраций 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических жидкостях.

Способ определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием прост и экономичен в осуществлении.

Предлагаемый способ определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием может быть применен в испытательных лабораториях контроля качества лекарственных средств, лабораториях ОКК фармацевтических предприятий, а также в научно-исследовательских лабораториях.

Предлагаемый способ определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием апробирован в Центре Контроля Качества Лекарственных Средств федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Способ количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах, включающий подготовку пробы, анализ и обработку результатов анализа, отличающийся тем, что определение ведут с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, в качестве детектора используют масс-спектрометрический детектор, регистрируют масс-хроматограммы при отрицательной ионизации в режиме выбранных ионов при m/z=341, хроматографирование осуществляют на колонке Zorbax Plus CN, длиной 150 мм с внутренним диаметром 4,6 мм и размером частиц 5 мкм, при скорости потока подвижной фазы, состоящей из смеси ацетонитрила и 1,0%-ного раствора муравьиной кислоты в соотношении 30:70, 0,3 мл/мин и объеме вводимой пробы 20 мкл, а концентрацию 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия находят, используя калибровочный график.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике бактериемии, ассоциированной с грамотрицательными микроорганизмами, у реципиентов сердца или легких путем определения уровня экспрессии микроРНК-424 в плазме крови. 5 пр..

Способ диагностики инвазии blastocystis hominis по биоптатам // 2780603

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, гастроэнтерологии, паразитологии и медицинской микробиологии, и может быть использовано для диагностики бластоцистоза. Биоптаты слизистой оболочки тела и антрального отдела желудка, 12-перстной и толстой кишок фиксируют в 10% нейтральном забуференном растворе формалина в течение 3-х часов.

Способ прогнозирования риска госпитальной летальности у больных новой коронавирусной инфекцией covid-19 // 2780522

Изобретение относится к медицине, а именно к прогнозированию риска развития госпитальной летальности у пациентов с новой коронавирусной инфекцией COVID-19. У больных при госпитализации определяют количество нейтрофилов в сыворотке крови и осуществляют расчет степени риска Р по формуле.

Способ прогнозирования продуктивных качеств цыплят-бройлеров по элементному составу пера // 2780105

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Раскрыт способ прогнозирования продуктивных качеств цыплят-бройлеров по элементному составу пера, включающий отбор образцов пера, путём выщипывания маховых перьев крыла в возрасте 7 суток, с дальнейшей оценкой концентраций Al и Zn методами атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой, при этом в качестве критерия оценки при прогнозировании продуктивных качеств используется коэффициент токсической нагрузки, и при значении коэффициента токсической нагрузки ниже 1,43 ед., цыплят-бройлеров следует относить группе с высоким потенциалом весового роста, при значении коэффициента в границах 1,44-5,61 ед., к группе со средним и при значении выше 5,61 ед., к группе с низким потенциалом весового роста.

Способ прогнозирования продуктивных качеств цыплят-бройлеров по элементному составу пера // 2780105

Способ идентификации среды обитания осетровых рыб с помощью биохимических маркеров // 2779424

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Предложен способ идентификации среды обитания осетровых рыб с помощью биохимических маркеров, который включает подготовку проб из икры либо мышечной ткани осетровых рыб, содержащих жирные кислоты, применяющиеся как биохимические маркерные вещества, экстракцию липидов из вышеуказанных проб, приготовление метиловых эфиров жирных кислот, их последующий газохроматографический анализ с измерением процентного содержания от общей суммы всех идентифицированных жирных кислот.

Способ прогнозирования рецидива камнеобразования у больных мочекаменной болезнью // 2779371

Изобретение относится к медицине, в частности к урологии, и предназначено для прогнозирования риска рецидивирования камнеобразования у больных мочекаменной болезнью. Определяют наличие факторов: прием препаратов кальция продолжительностью не менее одного месяца в течение текущего года, прием препаратов витамина Д продолжительностью не менее одного месяца в течение текущего года, наличие перелома в анамнезе в течение последних пяти лет, выкуривание не менее одной пачки сигарет в день в течение последних пяти лет, наличие эпизода мочекаменной болезни в анамнезе.

Способ прогнозирования трехмесячной выживаемости у больных со злокачественным новообразованием поджелудочной железы iv стадии при использовании фотодинамической терапии // 2779088

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования трехмесячной выживаемости у больных со злокачественным новообразованием поджелудочной железы IV стадии при использовании фотодинамической терапии. Для этого у больных до начала лечения определяют уровень фибриногена.

Способ оценки и прогнозирования риска развития дисфункции малых дыхательных путей у пациентов с бронхиальной астмой, ассоциированной с ожирением // 2778070

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для оценки и прогнозирования риска развития дисфункции малых дыхательных путей (МДП) у пациентов с частично контролируемой бронхиальной астмой, легкой степени тяжести, ассоциированной с ожирением I и II степени. Для этого определяют индекс массы тела в кг/м2, показатель функции внешнего дыхания по данным спирометрии (ОФВ1/ФЖЕЛ) в %, показатель иммунного ответа - уровень цитокина ИЛ-17А в пг/мл.

Способ количественного определения анти-d-антител igg в препаратах иммуноглобулина человека антирезус rh0(d) // 2777845

Настоящее изобретение относится к области здравоохранения, фармации, биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для количественного определения анти-D-антител IgG в лекарственных препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh0(D) для контроля их качества. Способ включает подготовку иммуносорбента путем иммобилизации отмытых папаинизированных эритроцитов фенотипа резус-положительных эритроцитов (Rh(+))I(0) группы крови человека (далее - эритроциты фенотипа R1R1) на твердой фазе.

Способ уменьшения вклада технических факторов в суммарный сигнал данных масс-спектрометрии с помощью фильтрации по техническим образцам // 2769618

Изобретение относится к области медицины. Предложен компьютерно-реализуемый способ удаления липидных признаков со слабым сигналом.