Синбиотическое средство для повышения колонизационного потенциала нормофлоры желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота

Группа изобретений относится к области ветеринарной медицины, в частности к синбиотическому средству для повышения колонизационного потенциала нормофлоры желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота и способу его получения. Синбиотическое средство состоит из консорциума микроорганизмов и дополнительно содержит в качестве штаммов-продуцентов депонированные паспортизированные культуры микроорганизмов Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86, ресуспендированные фосфатным буфером, раствор деминерализованной молочной сыворотки, лактулозу и цеолит. Осуществление изобретения позволяет повысить метаболические процессы, физиологический и иммунный статусы организма; обеспечить антагонистический эффект в отношении широкого разнообразия условно-патогенных микроорганизмов; стимулировать неспецифическую резистентность организма и, как следствие, увеличить эффективность профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 4 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а именно, к средству для повышения колонизационного потенциала нормофлоры желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота при дисбиотических нарушениях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae, посредством положительного воздействия на развитие пробиотической индигенной микрофлоры, обеспечения антагонистического эффекта в отношении широкого спектра условно-патогенных микроорганизмов, стимулирования неспецифической резистентности и, как следствие, повышение иммунного статуса организма животного.

Уровень техники

Известен, способ получения пробиотического средства "Симбитер-2" [патент РФ №97108832]. В состав средства входят уксуснокислые бактерии и пропионовокислые бактерии, которые смешивают с предварительно полученным консорциумом молочнокислых бактерий в соотношении 4:1. Способ получения пробиотика предусматривает совместное культивирование в молочной среде бифидобактерий разных видов.

Недостатки данного способа следующие:

1. Во-первых, при совместном культивировании разных видов бифидобактерий, отличающихся динамикой развития, не всегда можно гарантировать получение стабильного субстрата.

2. Во-вторых, использование данного пробиотика ограничивается только его использованием для получения кисломолочных продуктов определенного состава и имеющих короткий срок годности.

Известен способ получения средства для обеспечения колонизационной резистентности микробиоценоза кишечника [патент РФ №2589818], включающий в качестве пробиотической составляющей стерилизованную высушенную культуральную жидкость, содержащую метаболиты пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335, в качестве сорбента-носителя выступает природный минерал цеолит, в качестве вспомогательной технологической добавки используют стеарат кальция или аэросил, стерилизованные высушенные культуральные жидкости, содержащие метаболиты Enterococcus faecium L-3, Lactobacillus delbrueckii TS1-06 и Lactobacillus fermentum TS3-06, в качестве пребиотической составляющей используют овсяные хлопья, выполнена при этом в твердой дозированной форме в виде капсул.

Недостатки данного способа следующие:

1. Во-первых, в сухих препаратах клетки микроорганизмов находятся в глубоком анабиозе, причем процесс перехода из анабиоза в активное состояние занимает 8-10 часов.

2. Во-вторых, лиофилизация нарушает структуры поверхностных белков-адгезинов, что снижает колонизационную способность бактерий.

3. В-третьих, в процессе сушки большая часть метаболитов разрушается, в частности, ценные органические кислоты.

Наиболее близким по способу получения и технической сущности, принятый авторами за прототип, является лечебно-профилактический препарат из живых штаммов микроорганизмов лакто- и бифидобатерий «LB-комплекс Л», защищенный патентом [патент РФ № 2441907], предусматривающий раздельное культивирование штаммов лакто- и бифидобактерий с последующим смешиванием биомасс культур и иммобилизацией на цеолите.

Недостатки данного способа следующие:

1. Во-первых, за счет отсутствия в формуле изобретения пребиотической составляющей, возникает вероятность снижения приживаемости микроорганизмов в толстом кишечнике и не обеспечивает дополнительный субстрат для их размножения.

2. Во-вторых, использование дистиллированной воды в основе средства, может снизить жизнеспособность используемых штаммов.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка синбиотического средства и способа его получения для обеспечения колонизационной резистентности желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота, в форме бактериального концентрата на основе консорциума депонированных паспортизированных культур микроорганизмов.

Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, заключается в повышении метаболических процессов, физиологического и иммунного статуса организма, обеспечении антагонистического эффекта в отношении широкого спектра условно-патогенных микроорганизмов, стимулировании неспецифической резистентности организма и, как следствие, повышении эффективности профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота.

Технический результат достигается с помощью синбиотического средства «SIN-S» для повышения колонизационного потенциала нормофлоры желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота состоящее из консорциума микроорганизмов, отличающееся тем, что дополнительно содержит в качестве штаммов-продуцентов - депонированные паспортизированные культуры микроорганизмов Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86, ресуспендированные фосфатным буфером, раствор деминерализованной молочной сыворотки, лактулозу и цеолит в следующем соотношении, мас./%:

Раствор деминерализованной
молочной сыворотки pH 4,5 (10 мл)	10,4 г/73,2%
Лактулоза	0,3 г/2,2%
Раствор консорциума культур микроорганизмов
Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и
Enterococcus faecium УДС 86 (1 мл)	1,5 г/10,5%
Цеолит	2 г/14,1%

Технический результат достигается с помощью способа получения синбиотического средства «SIN-S» для повышения колонизационного потенциала нормофлоры желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота включает депонированние лиафилизированной паспортизированной пробиотической культуры Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86 в условиях стерильной зоны с последующим ресуспендированием фосфатным буфером в отдельных пробирках на протяжении 20-30 минут и приведение к концентрации равной 1:100000000 (в 1 мл ~ 10⁹ КОЕ), после чего из полученных разведений отбирают по 0,5 мл каждой культуры микроорганизмов в отдельную стерильную пробирку и смешивают полученный консорциум в разведении 1:1, в результате получается 1 мл жидкости, который, вносят в приготовленную стабилизированную питательную основу, полученную из сухой деминерализованной молочной сыворотки разведенной теплой дистиллированной водой (32-37 °C) в соотношении 1:10 мл с последующим внесением Лактулозы в соотношении 0,3 г на 10 мл полученного раствора, перемешивают и при температуре 32 - 37°С вносят полученный раствор, раствор инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течении 4-5 часов и остужают до температуры 4±2°С, в полученный раствор добавляют порошкообразный Цеолит в количестве 2 г и последующей иммобилизацией метаболитов микроорганизмов в течении 18-24 часов.

Таким образом, разработан оптимальный комплекс, обеспечивающий получение более эффективного синбиотического средства с высоким содержанием метаболитов живых микробных колоний предложенных пробиотических культур в единице объема с длительным сроком хранения и биологической активности.

Штамм Lactobacillus acidophilus K-1-T, ВКПМ: B-4107 (1970 год) культивируют на среде MRS (ООО «НПЦ «БИОКОМПАС-С», Россия), в аэробных условиях при температуре 37°C в течение 24 часов. При культивировании на среде MRS (агаризованной) образуются мелкие слегка выпуклые, бесцветные колонии. При окраске по методу Грама наблюдают палочковидные грамположительные, не спорообразующие микроорганизмы. Биохимические свойства определяют на средах Гисса - «Цветной ряд» (среды с углеводами).

Штамм Enterococcus faecium УДС 86, ВКПМ: B-4054 (1984 год) культивируют на среде M 17 (ООО «НПЦ «БИОКОМПАС-С», Россия). Выращивают энтерококки в аэробных условиях при температуре 37°C в течение 24 часов. Наблюдают рост энтерококков на среде в виде мелких колоний округлой формы белого или полупрозрачного цвета. В мазках-отпечатках, окрашенных по методу Грама, клетки штаммов энтерококков представляют собой овальные кокки, располагающиеся одиночно, попарно или короткими цепочками.

Нарушение бактериального гомеостаза организма новорожденных животных при кишечном дисбактериозе находится в прямой зависимости с элиминацией бифидофлоры. Патологии, вызванные кишечной палочкой, чаще всего возникают в возрасте от 1 до 14 дней. При дисбактериозе характерно снижение уровня представителей полезной микрофлоры, количественные и качественные изменения кишечной палочки, понижение антагонистической активности к гнилостной флоре, а также снижение иммунного статуса организма животного, как следствие вышеперечисленные факторы приводят к массовым диареям.

Таким образом, диарея - одно из наиболее распространенных заболеваний молодняка, вызываемое за счет активной деятельности представителей бактерий семейства Enterobacteriaceae. В свою очередь данные обстоятельства приводят к существенным экономическим потерям, возникающим не только из-за смертности, но и из-за других затрат, включая лечение, диагностику и ветеринарное вмешательство. Одним из наиболее распространенных факторов синдрома диареи являются условно-патогенные (неинфекционные) факторы, связанные с физиологическим состоянием животного (иммунологический и пищевой статус), окружающей средой или ветеринарным обеспечением.

Чертежи и иные материалы

На фиг. 1 - Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта морских свинок по первому опыту, lgKOE/г

На фиг. 2 - Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта морских свинок по второму опыту, lgKOE/г

На фиг. 3 - Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта морских свинок по третьему опыту, lgKOE/г

Осуществление изобретения

Апробацию эффективности разработанного синбиотического средства, проводили на базе научно-испытательной лаборатории кафедры эпизоотологии и микробиологии факультета ветеринарной медицины (Санитарно-эпидемиологическое заключение № 26.01.06.000.M.000318.07.17 от 07.07.2017) ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет», а также СПК племзавод «Вторая Пятилетка» Ипатовского городского округа Ставропольского края.

Получение синбиотического средства, условно названного «SIN-S» осуществляют в три этапа:

Этап 1. Приготовление консорциума микроорганизмов.

Депонированные лиафилизированные паспортизированные пробиотические культуры Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86 в условиях стерильной зоны, ресуспендируют фосфатным буфером в отдельных пробирках на протяжении 20-30 минут и приводят к концентрации равной 1:100000000 (в 1 мл ~ 10⁹ КОЕ). Из полученных разведений отбирают по 0,5 мл каждой культуры микроорганизмов в отдельную стерильную пробирку и смешивают полученный консорциум в разведении 1:1, в результате получают 1 мл жидкости.

Этап 2. Приготовление питательной основы.

Для приготовления стабилизированной питательной основы раствора используют сухую деминерализованную молочную сыворотку с рН - 4,5. Сухую деминерализованную молочную сыворотку разводят теплой дистиллированной водой (примерно 32-37 °C) 1:10 мл. Далее в полученный раствор вносят пребиотик - Лактулозу в соотношении 0,3 г на 10 мл полученного раствора, перемешивают.

Этап 3. Получение синбиотического средства «SIN-S».

В 10 мл приготовленной стабилизированной питательной основы при температуре 32 - 37°С, вносят полученный раствор на основе консорциума микроорганизмов Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86 в размере 1 мл. Далее комбинированный раствор инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течении 4-5 часов. После инкубации раствор остужают до температуры 4±2°С. Далее в полученный раствор добавляют порошкообразный сорбент-носитель - Цеолит в количестве 2 г, реакция иммобилизации метаболитов микроорганизмов происходит в течении 18-24 часов.

Проведение апробации синбиотического средства «SIN-S», осуществляют методом группового сравнения. Было задействовано 20 клинически здоровых новорожденных телят, из которых сформировали четыре группы по 5 голов и 10 разнополых белых лабораторных крыс с массой тела 450-500 г, для выявления токсичности.

Оценку влияния образца синбиотического средства «SIN-S» на микрофлору желудочно-кишечного тракта телят контрольной и опытных групп осуществляли на 7-ой день опыта путем отбора образцов фекалий через 2-3 часа после утреннего кормления от всех особей из каждой группы. Полученные свежие образцы каловых масс исследовали путем посева последовательных 10-кратных разведений на агаризированные дифференциально-диагностические питательные среды поверхностным методом с последующим подсчетом количества общего микробного числа (ОМЧ) в КОЕ/г, после чего проводили пересчет данного показателя в lg KOE/г. Видовую идентификацию микроорганизмов проводили путем оценки их морфологических свойств при микроскопии бактериальных препаратов, изготовленных из колоний чистых культур, выращенных на питательных средах для дифференциальной диагностики микроорганизмов: MПА - ОМЧ, MRS - Lactobacillus spp., М-17 - Enterococcus spp., Эндо - БГКП.

Пример 1. В первом опыте телятам из контрольной группы задают физиологический раствор. В первой опытной группе особям согласно применяемой методике, задают образец синбиотического средства, полученного в следующем соотношении компонентов, мас./%:

Раствор деминерализованной
молочной сыворотки pH 4,5 (10 мл)	10,4 г/68,4%
Лактулоза	3 г/19,7%
Раствор консорциума культур микроорганизмов
Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и
Enterococcus faecium УДС 86 (0,5 мл)	0,8 г/5,3%
Цеолит	1 г/6,6%

Согласно полученным данным (фиг. 1), включение в кормление телятам опытного образца синбиотического средства согласно формуле по первому примеру, оказало неблагоприятное воздействие на качественный состав фекальной микрофлоры. На 7-ой день опыта бактерии группы БГКП в первой опытной группе увеличились на 6,3%. В содержании бактерий Lactobacillus spp. и Enterococcus spp. существенных изменений не наблюдалось и были в пределах 8,036±0,251 - 8,005±0,306 lgKOE/г и 7,684±0,040 - 7,732±0,581 lgKOE/г.

Согласно анализу полученных данных, было установлено, что заданный объем Лактулозы, необходимо корректировать, с целью понижения кислотности желудка и воздействия на представителей бактерий БГКП. Так же необходимо увеличить объем раствора консорциума культур микроорганизмов Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86, с целью повышения резистентности пробиотической микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Пример 2. Второй опыт осуществляют согласно применяемой методике по примеру 1, отличающийся тем, что телятам второй опытной группы, задавали заявленное синбиотическое средство в следующем соотношении компонентов, мас./%:

Раствор деминерализованной
молочной сыворотки pH 4,5 (10 мл)	10,4 г/78,7%
Лактулоза	0,3 г/2,3%
Раствор консорциума культур микроорганизмов
Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и
Enterococcus faecium УДС 86 (1,5 мл)	1,5 г/11,4%
Цеолит	1 г/7,6%

По результатам микробиологических исследований (фиг. 2), общее микробное число не превышало значения нормы и составило у телят второй опытной группы 9,114±0,293 lg KOE/г, а в контрольной группе - 8,837±0,226 lg KOE/г. Во второй опытной группе, количество Lactobacillus spp. составило 9,221±0,196* lg KOE/г (Р<0,05), а содержание Enterococcus spp. - 7,339±0,204 lg KOE/г, по сравнению с особями из контрольной группы количество лактобактерий было выше на 12,9%, а энтерококков - на 7,9%, соответственно. Содержание бактерий группы кишечной палочки у телят второй опытной группы было равно 3,050±0,185* lg KOE/г (Р<0,05), по сравнению с контрольной группой, где данное значение равно 3,816± 0,160, было ниже на 20,1%.

Для повышения активности разработанного синбиотического средства, необходимо повысить концентрацию сорбент-носителя - Цеолита, с целью повышения реакции иммобилизации метаболитов микроорганизмов.

Пример 3. Третий опыт осуществляют согласно применяемой методике по примеру 1, отличающийся тем, что телятам третьей опытной группы, задают заявленное синбиотическое средство в следующем соотношении компонентов, мас./%:

Раствор деминерализованной
молочной сыворотки pH 4,5 (10 мл)	10,4 г/73,2%
Лактулоза	0,3 г/ 2,2%
Раствор консорциума культур микроорганизмов
Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и
Enterococcus faecium УДС 86 (1 мл)	1,5 г/10,5%
Цеолит	2 г/14,1%

Согласно данным полученным в ходе 3 опыта (фиг. 3) уставлено, что включение в кормление телятам из третьей опытной группы, образца синбиотического средства «SIN-S» по заявленному соотношению компонентов, позволило снизить содержание бактерий группы БГКП на 37,6% и увеличить количество лактобактерий и энтерококков на 19% и 11,9%, что свидетельствует об увеличении колонизационного потенциала нормофлоры желудочно-кишечного тракта организма животного, способствующей снижению риска проявления желудочно-кишечных заболеваний бактериальной природы.

Пример 4. Средство для повышения колонизационного потенциала нормофлоры микробиоценоза желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота при дисбиотических нарушениях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae, было исследовано на токсичность. Токсичность средства определяют при однократном накожном нанесении раствора половозрелым, 10 разнополым белым лабораторным крысам с массой тела 450-500г. На кожу методом скарификации наносят разработанное средство. После повторных обработок, в течение 2 недель проводили наблюдения за общим состоянием животных. На кожных покровах изменений не выявлено. Ни одно животное не погибло.

В ходе проведения испытаний синбиотического средства «SIN-S» на клинически здоровых телятах, была доказана его высокая эффективность, в качестве новых профилактических средств. Синбиотическое средство «SIN-S» оказывает вспомогательную функцию организму в переваривании и усвоении кормов, повышает основные показатели неспецифического иммунитета стимулируя рост представителей полезной микрофлоры.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- Используемые ингредиенты выпускаются в промышленных условиях, тем самым легко доступны и недороги;

- Обеспечивает высокую антагонистическую активность;

- Сохраняет свои биологические свойства достаточно длительный срок.

- Избирательно повышает колонизационный потенциал нормофлоры микробиоценоза желудочно-кишечного тракта.

1. Синбиотическое средство для повышения колонизационного потенциала нормофлоры желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота, состоящее из консорциума микроорганизмов, отличающееся тем, что дополнительно содержит в качестве штаммов-продуцентов депонированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика, паспортизированные культуры микроорганизмов Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86, ресуспендированные фосфатным буфером, раствор деминерализованной молочной сыворотки, лактулозу и цеолит в следующем соотношении, мас.%:

Раствор деминерализованной
молочной сыворотки pH 4,5 (10 мл)	73,2,
Лактулоза	2,2,
Раствор консорциума культур микроорганизмов
Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и
Enterococcus faecium УДС 86 (1 мл)	10,5,
Цеолит	14,1.

2. Способ получения синбиотического средства для повышения колонизационного потенциала нормофлоры желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота включает ресуспендирование фосфатным буфером депонированных во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика, лиофилизированных паспортизированных, пробиотических культур Lactobacillus acidophilus (B-4107) K-1-T и Enterococcus faecium УДС 86 в условиях стерильной зоны в отдельных пробирках на протяжении 20-30 мин и приведение к концентрации, равной 1:100000000 (в 1 мл ~ 10⁹ КОЕ), после чего из полученных разведений отбирают по 0,5 мл каждой культуры микроорганизмов в отдельную стерильную пробирку и смешивают полученный консорциум в разведении 1:1, в результате получается 1 мл жидкости, который вносят в приготовленную стабилизированную питательную основу, полученную из сухой деминерализованной молочной сыворотки, разведённой теплой дистиллированной водой 32-37 °C в соотношении 1:10 мл, с последующим внесением Лактулозы в соотношении 0,3 г на 10 мл полученного раствора и перемешиванием; затем в этот раствор питательной основы при температуре 32-37 °C вносят полученный раствор консорциума, инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 4-5 ч и остужают до температуры 4±2 °С, в полученный комбинированный раствор добавляют порошкообразный Цеолит в количестве 2 г с последующей иммобилизацией метаболитов микроорганизмов в течение 18-24 ч.