Подкожное введение анти-cd38 антител

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ лечения заболевания с повышенной экспрессией CD38 у индивида. Способ включает подкожное введение индивиду стандартной лекарственной формы выделенного анти-CD38 антитела человека, где стандартная лекарственная форма находится в объеме 3 мл или менее в дозе от 0,03 до 0,6 мг на 1 кг массы тела. Изобретение обеспечивает эффективную терапию аутоиммунных и раковых заболеваний низкими дозами и объемами анти-CD38 антител, предотвращая побочные эффекты и неудобства, связанные с введением высоких доз препаратов для системной терапии анти-CD38 антителами. 14 з.п. ф-лы, 108 ил., 15 табл., 7 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] В данной заявке заявлен приоритет согласно § 119 (e) Раздела 35 Кодекса Законов США по предварительной заявке США, серийный номер 62/617146, поданной 12 января 2018 года, полное раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки.

Включение посредством ссылки материала, представленного в электронном виде

[0002] В данное описание посредством ссылки включен машинно-читаемый перечень нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, представленный одновременно с данной заявкой и идентифицированный следующим образом: ASCII (текстовый) файл размером 20 килобайт с именем «101588-5009-WO-Sequence-Listing.txt», созданный 4 декабря 2018 года.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Раскрыты способы введения изолированных анти-CD38 антител в низких дозах и в малых объемах посредством подкожного (ПК) введения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] CD38, также известный как циклическая АДФ рибозогидролаза, представляет собой трансмембранный гликопротеин типа II с длинным С-концевым внеклеточным доменом и коротким N-концевым цитоплазматическим доменом. CD38 является членом группы родственных мембраносвязанных или растворимых ферментов, которая включает в себя CD157 и АДФР-циклазу морской улитки (Aplysia). Данное семейство ферментов обладает уникальной способностью превращать НАД в циклическую АДФ рибозу или в адениндинуклеотидфосфат никотиновой кислоты. CD38 участвует в мобилизации Ca²⁺ и в передаче сигнала посредством фосфорилирования тирозина многочисленных сигнальных молекул, включая фосфолипазу Cγ, ZAP-70, syk и c-cbl. Основываясь на этих наблюдениях, CD38 является важной сигнальной молекулой в созревании и активации лимфоидных клеток при их нормальном развитии. Среди гемопоэтических клеток набор функциональных эффектов был приписан CD38-опосредованной передаче сигналов, включая пролиферацию лимфоцитов, высвобождение цитокинов, регуляцию развития и выживания B-лимфоцитов и миелоидных клеток, а также индукцию созревания дендритных клеток (ДК).

[0005] CD38 экспрессируется в незрелых гемопоэтических клетках, подавляется в зрелых гемопоэтических клетках и повторно экспрессируется в большом количестве в активированных лимфоцитах и плазматических клетках. Например, высокая экспрессия CD38 наблюдается в активированных В-клетках, плазматических клетках, активированных CD4+ Т-клетках, активированных CD8+ Т-клетках, NK-клетках, NKT-клетках, зрелых ДК и активированных моноцитах (Патент США № 8362211). Дефицит CD38 у мышей был связан со снижением уровней периферических T-регуляторных и инвариантных NKT-клеток, дефектами гуморальных B-клеточных ответов и направленной миграцией ДК, а также с ослабленной формой коллаген-индуцированного артрита (КИА) (Chiba et al. (2005) Arthrit. Rheum. 52: 1941-48).

[0006] Присутствие аутоантител к CD38 было связано с рядом заболеваний, включая диабет, хронический аутоиммунный тиреоидит и болезнь Грейвса (Antonelli et al. (2001) Clin. Exp. Immunol. 126: 426-431; Mallone et al. (2001) Diabetes 50: 752 and Antonelli et al. (2004) J. Endocrinol. Invest. 27: 695-707).

[0007] Повышенная экспрессия CD38 была задокументирована при различных заболеваниях, включая аутоиммунные заболевания и рак. Такие заболевания включают системную красную волчанку (СКВ), ревматоидный артрит (РА), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), язвенный колит (ЯК), миастению гравис (МГ) (Yilmaz et al. (2018) Ann. Clin. Transl. Neurol, 5 (11): 1408-1414), нейромиелит зрительного нерва (НЗН) (Chihara et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA108 (9): 3701-6) иммунная тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП) (Behzad et al. (2018) APMIS126 (6): 523-532) антифосфолипидный синдром (АФС) (Alvarez-Rodriguez et al. (2018) Int. J. Mol. Sci, 19 (2): pii), пузырчатка обыкновенная (ПО), пузырчатка листовидная (ПЛ), анти-NMDA-рецепторный энцефалит (АНРЭ), аутоиммунная гемолитическая анемия (АГА), болезнь Грейвса, мембранозная нефропатия, синдром Шегрена (СШ), АНЦА-ассоциированный васкулит, приобретенный буллезный эпидермолиз (ПБЭ), тиреоидит Хашимото, склеродермия и IgG₄-ассоциированная болезнь. У пациентов с РА количество плазматических клеток в суставной ткани увеличивается по сравнению с контролем. При СКВ повышаются плазменные бласты в периферической крови у пациентов с более активным заболеванием. Однако современные способы лечения, основанные на CD20-ассоциированном деплетировании популяции В-клеток, такие как ритуксимаб, эффективно деплетируют популяцию CD20+ B-лимфоцитов, но не могут напрямую и эффективно деплетировать популяции плазматических клеток или плазменных бластов, поскольку они не экспрессируют CD20. Таким образом, пациенты с РА или СКВ с высоким уровнем плазматических клеток или плазменных бластов вряд ли получат существенную клиническую пользу от терапии на основе CD20.

[0008] Терапевтические средства, нацеленные на CD38, который на высоком уровне экспрессируется в плазматических клетках, плазменных бластах, NK-клетках, активированных В-клетках, плазмоцитоидных дендритных клетках и активированных Т-клетках, могут обеспечить эффективное лечение РА и СКВ, а также других заболеваний, характеризующихся экспрессией CD38. Уровень CD38-экспрессирующих плазменных бластов в периферической крови взрослых пациентов с СКВ, получавших ритуксимаб и пероральные стероиды, был наилучшим фактором прогноза времени рецидива. Кроме того, циркулирующие иммуноглобулин (Ig)-секретирующие клетки, которые экспрессируют высокие уровни CD38, были идентифицированы в периферической крови пациентов с СКВ с активным заболеванием, и уровень этой субпопуляции был связан с вызванным лечением снижением уровней анти-двухцепочечной ДНК (анти-дцДНК) антител, протеинурии и активности заболевания (Grammer et al. (2003) J. Clin. Invest. 112: 1506-1520). Кроме того, плазматические клетки чувствительны к ингибированию протеасом и их количество понижено в периферической крови пациентов с рефрактерной СКВ, подвергшихся воздействию бортезомиба (Alexander et al. (2015) Ann. Rheum. Dis. 74 (7): 1474-1478). Это понижение количества соответствовало уменьшению количества анти-дцДНК антител и соответствующему улучшению активности заболевания у каждого пациента. К сожалению, терапия была связана с нежелательными явлениями, возникшими в ходе лечения (НЯВЛ; например, нейропатия, диарея), которые могли быть результатом ингибирования протеасом в нелимфоидных клетках (например, нейронах, эпителии). В совокупности эти данные указывают на то, что специфическое сокращение количества CD38-экспрессирующих плазматических клеток может обеспечить значительное улучшение в профиле риска для пациентов с рефрактерной СКВ. Поскольку современные способы лечения РА и СКВ вызывают хороший клинический ответ и устойчивую ремиссию только у небольшого числа пациентов, существует острая необходимость в изучении дополнительных механизмов лечения.

[0009] Повышенная экспрессия CD38 была задокументирована при различных заболеваниях гематопоэтического происхождения, а также у полученных из них клеточных линий, и была описана как отрицательный прогностический маркер при гематологических раковых заболеваниях. Такие заболевания включают, но не ограничиваются следующими: множественная миелома (MM), хронический лимфобластный лейкоз, B-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (B-ХЛЛ), включая B-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз, B- и Т-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ), острый лимфобластный лейкоз, макроглобулинемия Вальденстрема, мантийноклеточная лимфома, пролимфоцитарный/миелоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), фолликулярная лимфома, NK-клеточный лейкоз, плазмаклеточный лейкоз, неходжскинская лимфома (НХЛ), лимфома Беркитта (ЛБ), Т-клеточная лимфома (ТКЛ), ворсистоклеточный лейкоз (ВКЛ) и лимфома Ходжкина (ЛХ). Кроме того, экспрессия CD38 является прогностическим показателем для пациентов с такими состояниями, как, например, B-ХЛЛ (Dürig et al. (2002) Leukemia 16: 30-35; и Morabito et al. (2001) Leukemia Res. 25: 927-932) и острый миелогенный лейкоз (Keyhani et al. (1999) Leukemia Res. 24: 153-159). Поэтому CD38 обеспечивает полезную мишень для лечения заболеваний гематопоэтической системы.

[0010] Несколько анти-CD38 антител находятся в клинических испытаниях для лечения CD38-ассоциированных видов рака. Тем не менее, эти терапевтические анти-CD38 антитела известного уровня техники связываются с эритроцитами и тромбоцитами, что может объяснить, почему необходима более высокая требуемая дозировка для преодоления такого дефицита, вызванного связыванием с эритроцитами. Например, лечение даратумумабом (Дарзалекс® - анти-CD38 моноклональные антитела изотипа IgG1, одобренные FDA и коммерчески доступные от Janssen Oncology) требует очень высокой дозы (≥16 мг/кг) и интенсивного режима (8х еженедельно, 8х раз в две недели, затем ежемесячно) для оптимальной противоопухолевой активности (Xu et al. (2017) Clin. Pharmacol. Ther. 101 (6): 721-724). Связывание даратумумаба с CD38 на эритроцитах и тромбоцитах приводит к положительному тесту на антиглобулин (непрямой тест Кумбса), который может сохраняться до 6 месяцев после последней инфузии даратумумаба (Sullivan et al. (2017) Blood 129 (22): 3033-3037). Это важное свойство даратумумаба и других антител, которые связывают эритроциты. Несмотря на то, что CD38 экспрессируется на эритроцитах на уровне, который примерно в 1000 раз ниже, чем на миеломных клетках (deWeers et al. (2011) J. Immunol. 186 (3): 1840-1848), в крови пациента с ММ с активным заболеванием приходится приблизительно 36000 эритроцитов на каждую клетку миеломы (Witzig et al. (1993) Cancer 72 (1): 108-113). Поэтому существует в 36 раз больше молекул CD38, экспрессируемых популяцией эритроцитов, по сравнению с популяцией опухолевых клеток. Таким образом, было выдвинуто предположение, что эритроциты связывают значительное количество любого вводимого анти-CD38 антитела, что приводит к необходимости введения больших доз для того, чтобы получить достаточные уровни анти-CD38 антитела для достижения терапевтического эффекта на опухолевые клетки.

[0011] Соответственно, лечение с использованием анти-CD38 антител в настоящее время сосредоточено на внутривенном (в/в) введении из-за большого объема антитела, необходимого для достижения терапевтической эффективности, потому что такие большие объемы не подходят для подкожного введения, и существует предел тому, насколько концентрированными могут быть антитела в лекарственной форме. Например, доза 1200 мг даратумумаба, вводимая в/в течение не менее 2 часов, одобрена для лечения рецидивирующей и рефрактерной множественной миеломы (РРММ) и впервые выявленной множественной миеломы (ВВММ). Лекарственная форма даратумумаба для подкожного (п/к) введения состоит из 1800 мг в 15 мл, которые должны быть приготовлены вместе с Enhance™ (содержащим Halozyme для ускорения абсорбции) и вводится 8X еженедельно, 8X в две недели, а затем один раз в месяц, в настоящее время находится в фазе 3 клинических испытаний для РРММ.

[0012] Другое анти-CD38 антитело, изатуксимаб (коммерчески доступное от Sanofi Genzyme и в настоящее время находящееся в фазе 3 клинических испытаний), вводят в дозе 10 мг/кг и 20 мг/кг, что соответствует 700-1400 мг на пациента 70 кг, с прогнозируемым вводимым объемом в 3,5-14 мл.

[0013] Более высокие дозы и объемы, требуемые от анти-CD38 антител известного уровня техники в нынешней клинической практике, могут также вызывать серьезные побочные эффекты, такие как, например, гемолитическая анемия - состояние, при котором эритроциты разрушаются быстрее, чем они могут быть заменены. В открытом неконтролируемом исследовании изатуксимаб вводили внутривенно 97 пациентам в дозе 3 мг/кг раз в 2 недели (n=23); в дозе 10 мг/кг раз в 2 недели в течение 2 циклов с последующим введением раз в 4 недели (n=25); в дозе 10 мг/кг раз в 2 недели (n=24); и 20 мг/кг раз в неделю для 4 доз (1 цикл), с последующим введением раз в 2 недели (n=25). Наиболее частым тяжелым (3-й/4-й степени) побочным эффектом была анемия, которой страдали 24% пациентов (см. http://www.onclive.com/conference-coverage/asco-2016/isatuximab-monotherapy-effective-for-heavily-pretreated-myeloma, the 2016 ASCO Annual Meeting; Richter et al. (2016) J. Clin. Oncol. 34 (suppl): abstr 8005). В одном исследовании даратумумаба у 45% всех пациентов наблюдалась анемия (19% из которой были 3-й степени) и у 48% пациентов наблюдалась тромбоцитопения (10% из которой были 3-й степени и 8% из которой были 4-й степени) (см., например, https://www.rxlist.com/darzalex-side-effects-drug-center.htm; Costello (2017) Ther. Adv. Hematol. 8 (1): 28-37). Таким образом, пациенты, проходящие лечение изатуксимабом или даратумумабом, должны тщательно наблюдаться на предмет этих опасных для жизни и других серьезных побочных эффектов.

[0014] Физические проблемы при введении больших количеств моноклональных анти-CD38 антител пациентам подкожно иллюстрируют необходимость в данной области техники более сильных анти-CD38 антител, поскольку более сильное антитело могло бы достигать желаемых фармакологических эффектов в меньшем количестве/объеме и, таким образом, позволять более эффективные формы введения. Более сильное антитело может привести к созданию лекарственных форм меньших объемов, которые будут вводиться п/к более эффективно, чем даратумумаб (Дарзалекс), пациентам, у которых оправдано деплетирование популяции CD38-экспрессирующих клеток, например, для лечения аутоиммунных заболеваний и гематологических форм рака. Преимущества введения меньшего количества лекарственного препарата включают в себя введение, которое занимает секунды по сравнению с минутами для даратумумаба, вводимого п/к, и часами - для даратумумаба, изатуксимаба или MOR202, вводимых в/в, а также меньшее количество инфузионных реакций (как было продемонстрировано для п/к введения даратумумаба). Сокращение времени, которое пациент должен проводить в инфузионном центре, позволит выбрать вариант терапии на дому, повысит эффективность введения и производительность инфузионных центров; снизит расходы на здравоохранение на одного пациента в результате повышения институциональной эффективности; и расширит применение, если лекарственный препарат может быть использован пациентами без доступа к инфузионному центру.

[0015] AB79 является полностью человеческим моноклональным антителом - иммуноглобулином IgG1, которое специфически связывается с CD38 с высокой аффинностью (Kd=3,5 нМ) (патент США № US 8362211, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме). AB79 ингибирует рост опухолевых клеток, экспрессирующих CD38, путем деплетирования популяции клеток посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) и комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ). AB79 также снижает уровень плазматических клеток и плазменных бластов в крови, взятой у здоровых субъектов и пациентов с системной красной волчанкой (СКВ). В случае СКВ, 80% популяции плазматических клеток, включая короткоживущие и долгоживущие плазматические клетки, сокращается. Кроме того, количество клеток, продуцирующих патогенные аутоантитела, также было сокращено, включая VH4-34 9G4+ антитела (сокращение на 70%), анти-Ro антитело (сокращение на 70%) и анти-дцДНК антитело (сокращение на 80%). Даратумумаб - моноклональное антитело против CD38 человека - также деплетирует CD38-экспрессирующие плазменные бласты и плазматические клетки в образцах от пациентов с СКВ и РА дозозависимым образом in vitro. В отличие от даратумумаба, AB79 перекрестно реагирует с CD38, экспрессируемым яванской макакой, предоставляя уникальную возможность определить, будет ли снижение уровня клеток, экспрессирующих CD38, влиять на воспаление и повреждение тканей в модели аутоиммунных заболеваний на приматах, отличных от человека. У здоровых яванских макак эффективность деплетирования для В- и Т-клеток, а также NK-клеток положительно коррелировала с уровнем экспрессии CD38 и уровнем дозы AB79 (заявка PCT № PCT/US2017/042128; патент США № US 8362211).

[0016] Учитывая, что многие антитела против CD38 в клинической практике не подходят для подкожного введения в низких дозах или в малых объемах и обладают опасными побочными эффектами, в данной области техники остается потребность в лекарственных формах антител, которые являются более безопасными, более удобными и более эффективными для лечения заболеваний, для которых назначают связывание с CD38, таких как аутоиммунные заболевания и гематологические формы рака.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0017] В данном документе представлены способы лечения заболеваний, при которых назначают связывание с CD38, таких как, например, аутоиммунные заболевания и гематологические раковые заболевания, включающие подкожное введение изолированных анти-CD38 антител в неожиданно низких дозах и (или) малых объемах.

[0018] В одном аспекте данное изобретение относится к способу лечения заболевания, при котором субъекту назначают связывание с CD38, причем способ включает в себя стадию подкожного введения субъекту, страдающему заболеванием, при котором назначают связывание с CD38, терапевтически эффективного количества изолированного человеческого анти-CD38 антитела, достаточного для лечения заболевания, где анти-CD38 антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

[0019] В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения заболевания, при котором субъекту назначают связывание с CD38, причем способ включает в себя стадию подкожного введения субъекту, страдающему заболеванием, при котором назначают связывание с CD38, терапевтически эффективного количества изолированного человеческого анти-CD38 антитела, достаточного для лечения заболевания, где анти-CD38 антитело содержит участок VH цепь, содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и участок VL цепь, содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, где анти-CD38 антитело вводится в объеме 3 миллилитра или менее.

[0020] В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения заболевания, при котором субъекту назначают связывание с CD38, причем способ включает в себя стадию подкожного введения субъекту, страдающему заболеванием, при котором назначают связывание с CD38, терапевтически эффективного количества изолированного человеческого анти-CD38 антитела, достаточного для лечения заболевания, где анти-CD38 антитело содержит участок VH цепь, содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и участок VL цепь, содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, анти-CD38 антитело вводится в дозе от 0,03 до 0,6 миллиграмма на килограмм массы тела.

[0021] В одном аспекте анти-CD38 антитело не вызывает гемолитическую анемию или тромбоцитопению.

[0022] В одном аспекте введение анти-CD38 антитела приводит к менее чем 60%-му, менее чем 50%-му, менее чем 40%-му, менее чем 30%-му, менее чем 25%-му, менее чем 20%-му, менее чем 15%-му, менее чем 10%-му или менее чем 5%-му возникновению нежелательных явлений, возникших в ходе лечения (НЯВЛ), 3-й или 4-й степени, выбранных из группы, состоящей из анемии, гемолитической анемии, тромбоцитопении, утомляемости, инфузионных реакций (ИР), лейкопении, и лимфопении.

[0023] В одном аспекте анти-CD38 антитело приводит к менее чем 10%-му, менее чем 20%-му, менее чем 30%-му, менее чем 40%-му, менее чем 50%-му деплетированию популяции эритроцитов.

[0024] В одном аспекте анти-CD38 антитело приводит к менее чем 10%-му, менее чем 20%-му, менее чем 30%-му, менее чем 40%-му, менее чем 50%-му деплетированию тромбоцитов.

[0025] В одном аспекте заболевание выбрано из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания и рака.

[0026] В одном аспекте аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из системной красной волчанки (СКВ), ревматоидного артрита (РА), воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), язвенного колита, миастении гравис (МГ), нейромиелита зрительного нерва (НЗН), иммунной тромбоцитопенической пурпуры (ИТП), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТП), антифосфолипидного синдрома (АФС), пузырчатки обыкновенной (ПО), пузырчатки листовидной (ПЛ), анти-NMDA-рецепторного энцефалита (АНРЭ), аутоиммунной гемолитической анемии (АГА), болезни Грейвса, мембранозной нефропатии, синдрома Шегрена (СШ), АНЦА-ассоциированного васкулита, приобретенного буллезного эпидермолиза (ПБЭ), буллезного пемфигоида (БП), тиреоидита Хашимото, склеродермии, IgG₄-ассоциированной болезни, и болезни «трансплантат против хозяина». (Yilmaz V, et. al., Ann Clin Transl Neurol. 2018 Sep 22; 5 (11): 1408-1414; Chihara N, Aranami T, Sato W, Miyazaki Y, Miyake S, Okamoto T, Ogawa M, Toda T, Yamamura T. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Mar 1; 108 (9): 3701-6; Behzad MM, et al., APMIS. 2018 Jun; 126 (6): 523-532; or Alvarez-Rodriguez L., et al., Int J Mol Sci. 2018 Feb 16; 19(2).

[0027] В одном аспекте гематологический рак выбран из группы, состоящей из множественной миеломы, NK/T-клеточной лимфомы, хронического лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, плазмаклеточного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, B-клеточной лимфомы, и лимфомы Беркитта.

[0028] В одном аспекте гематологический рак представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления, множественная миелома выбрана из группы, состоящей из РРММ и ВВММ.

[0029] В одном аспекте участок VH цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и участок VL цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

[0030] В одном аспекте анти-CD38 антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 12.

[0031] В одном аспекте терапевтически эффективное количество представляет собой дозировку от 0,03 до 0,6 миллиграмма на килограмм массы тела.

[0032] В одном аспекте терапевтически эффективное количество находится в объеме 3 миллилитра или менее.

[0033] В одном аспекте терапевтически эффективное количество находится в объеме 2 миллилитра или менее.

[0034] В одном аспекте терапевтически эффективное количество находится в объеме 1 миллилитр или менее.

[0035] В одном аспекте человеческое анти-CD38 антитело вводится в форме фармацевтически приемлемой композиции.

[0036] В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения гематологического рака у субъекта, причем способ включает в себя стадию подкожного введения субъекту, имеющему гематологический рак, терапевтически эффективного количества изолированного человеческого анти-CD38 антитела, достаточного для лечения гематологического рака, где анти-CD38 антитело содержит участок VH цепь, содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и участок VL цепь, содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

[0037] В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения гематологического рака у субъекта, причем способ включает в себя стадию введения субъекту, имеющему гематологический рак, терапевтически эффективного количества изолированного человеческого анти-CD38 антитела, достаточного для лечения гематологического рака, где анти-CD38 антитело содержит участок VH цепь, содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и участок VL цепь, содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, где анти-CD38 антитело вводится в объеме 3 мл или менее, 2 мл или менее, или 1 мл или менее.

[0038] В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения гематологического рака у субъекта, причем способ включает в себя стадию подкожного введения субъекту, имеющему гематологический рак, терапевтически эффективного количества изолированного человеческого анти-CD38 антитела, достаточного для лечения гематологического рака, где анти-CD38 антитело содержит участок VH цепь, содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и участок VL цепь, содержащий CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 , где анти-CD38 антитело вводится в дозировке от 0,03 до 0,6 миллиграмма на килограмм массы тела.

[0039] В одном аспекте анти-CD38 антитело не вызывает гемолитическую анемию или тромбоцитопению.

[0040] В одном аспекте введение анти-CD38 антитела приводит к менее чем 60%-му, менее чем 50%-му, менее чем 40%-му, менее чем 30%-му, менее чем 25%-му, менее чем 20%-му, менее чем 15%-му, менее чем 10%-му или менее чем 5%-му возникновению одного или нескольких НЯВЛ 3-й или 4-й степени, выбранных из группы, состоящей из анемии, включая гемолитическую анемию, тромбоцитопении, утомляемости, инфузионных реакций (ИР), лейкопении, и лимфопении.

[0041] В одном аспекте анти-CD38 антитело приводит к менее чем 10%-му, менее чем 20%-му, менее чем 30%-му, менее чем 40%-му, менее чем 50%-му деплетированию эритроцитов.

[0042] В одном аспекте анти-CD38 антитело приводит к менее чем 10%-му, менее чем 20%-му, менее чем 30%-му, менее чем 40%-му, менее чем 50%-му деплетированию тромбоцитов.

[0043] В одном аспекте гематологический рак выбран из группы, состоящей из множественной миеломы, хронического лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, плазмаклеточного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, B-клеточной лимфомы, NK/T-клеточной лимфомы, и лимфомы Беркитта.

[0044] В одном аспекте гематологический рак представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления, множественная миелома выбрана из группы, состоящей из РРММ и ВВММ.

[0045] В одном аспекте участок VH цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, а участок VL цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

[0046] В одном аспекте анти-CD38 антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 12.

[0047] В одном аспекте терапевтически эффективное количество представляет собой дозировку от 0,03 до 0,6 миллиграмма на килограмм массы тела.

[0048] В одном аспекте терапевтически эффективное количество находится в объеме 3 миллилитра или менее.

[0049] В одном аспекте терапевтически эффективное количество находится в объеме 2 миллилитра или менее.

[0050] В одном аспекте терапевтически эффективное количество находится в объеме 1 миллилитр или менее.

[0051] В одном аспекте человеческое анти-CD38 антитело вводится в форме фармацевтически приемлемой композиции.

[0052] В другом аспекте данное изобретение относится к стандартной лекарственной форме, содержащей выделенное антитело, которое содержит аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO: 10, где выделенное антитело связывается с CD38, где стандартная лекарственная форма составлена для подкожного введения антитела в дозе от 0,03 до 0,6 миллиграмма на килограмм массы тела.

[0053] В одном аспекте тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

[0054] В одном аспекте стандартная лекарственная форма имеет объем 3 миллилитра или менее.

[0055] В одном аспекте стандартная лекарственная форма имеет объем 2 миллилитра или менее.

[0056] В одном аспекте стандартная лекарственная форма имеет объем 1 миллилитр или менее.

[0057] В одном аспекте стандартная лекарственная форма составлена для подкожного введения антитела при лечении гематологического рака, выбранного из группы, состоящей из множественной миеломы, хронического лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, плазмаклеточного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, В-клеточной лимфомы и лимфомы Беркитта.

[0058] В одном аспекте гематологический рак представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления, множественная миелома выбрана из группы, состоящей из РРММ и ВВММ.

[0059] В одном аспекте анти-CD38 антитело не вызывает гемолитическую анемию или тромбоцитопению.

[0060] В одном аспекте анти-CD38 антитело приводит к менее чем 10%-му, менее чем 20%-му, менее чем 30%-му, менее чем 40%-му, менее чем 50%-му деплетированию эритроцитов.

[0061] В одном аспекте анти-CD38 антитело приводит к менее чем 10%-му, менее чем 20%-му, менее чем 30%-му, менее чем 40%-му, менее чем 50%-му деплетированию тромбоцитов.

[0062] Эти и другие варианты осуществления, признаки и потенциальные преимущества станут очевидными, ссылаясь на следующее описание и графические материалы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0063] Задачи и признаки данного изобретения могут быть лучше поняты с учетом графических материалов, описанных ниже, на которых:

[0064] На Фиг. 1 представлены данные ФК яванской макаки (яванец) для групп п/к доз, описанных в Таблице 2. Антитела против лекарственного препарата (АПЛП, англ. «ADA») выявляли с помощью поверенного качественного электрохемилюминесцентного (ЭХЛ, англ. «ECL») анализа. Частота увеличилась с течением временем и повлияла на ФК при достижении определенного порогового титра, составляющего около 1000 (~log (7)).

[0065] На Фиг. 2 представлены данные ФК для яванца и ФК модели для AB79. Панели A и B демонстрируют первичные данные ФК относительно в/в введения из 8 исследований на макаках; панель A - первые 7 дней после первой дозы, и панель B - за весь период наблюдения. П/к данные были опущены (см. Фигуру 1 для п/к данных). Панель C отображает окончательную структуру модели ФК, включая мишень-опосредованное распределение препарата (МОРП), отмеченное синим прямоугольником. V_Ц обозначает объем центральной камеры модели, в которой наблюдаются концентрации AB79 (отмечены как «Конц.»). V_П обозначает объем периферической камеры модели. R_общ обозначает камеру модели для связанного с антителом и несвязанного CD38 рецептора. K_SYN и K_DEG обозначают константы скорости образования и деградации рецептора, а K_INT - константу скорости интернализации (комплексная константа скорости элиминации). K_SS - константа равновесного состояния, определяемая как K_SS = (K_OFF+K_INT) / K_ON, где K_OFF - константа скорости диссоциации, а K_ON - константа скорости связывания. Панели D-F демонстрируют наложения прогнозов линейной двухкамерной модели (медиана, интервал прогнозирования 95%) без компонента МОРП и данные наблюдений для 3-х самых низких доз (Исследование 8). Обратите внимание на различные временные шкалы между панелями D, E и F.

[0066] На Фиг. 3 представлены эффекты АПЛП и ФК в 13-недельном токсикологическом исследовании яванца. Данная оценка исходит из окончательной популяционной модели ФК (Фиг. 2, Таблица 2). Представлены следующие графики критериев адекватности модели (КАМ), стратифицированные по дозе и пути введения. (Keizer et al. (2013) CPT Pharmacometrics Syst. Pharmacol. 2: e50): (1) условные взвешенные остатки (УВО) в зависимости от времени; (2) прогнозируемая концентрация в зависимости от популяционной модели; (3) УВО в зависимости от популяционной модели; и (4) наблюдаемая концентрация в зависимости от прогноза индивидуальной модели.

[0067] На Фиг. 4 представлены графики КАМ для окончательной популяционной модели ФК, стратифицированной по дозе и пути введения (в/в - кресты, п/к - треугольники). Фиг. 4А - суммарные данные; Фиг. 4В - доза 0,03 мг/кг; Фиг. 4С - доза 0,1 мг/кг; Фиг. 4D - доза 0,3 мг/кг; Фиг. 4Е - доза 1,0 мг/кг; Фиг. 4F - доза 2,0 мг/кг; Фиг. 4G - доза 3,0 мг/кг; Фиг. 4Н - доза 30 мг/кг; Фиг. 4I - доза 80 мг/кг; и Фиг. 4J - доза 100 мг/кг.

[0068] На Фиг. 5 представлено сравнение экспрессии CD38 на поверхности NK-, B- и T-клеток человека и макаки. Параметры, измеренные проточной цитометрией, были стандартизированы, а сигналы - представлены в виде молекул эквивалентного растворимого флуорохрома (МЭРФ). Лимфоциты крови человека и макаки связывают сходные уровни AB79. Прямое сравнение уровней экспрессии CD38 на NK-клетках макаки (CD3-, CD159a+), B-клетках макаки (CD3-, CD20+) и T-клетках макаки (CD3+), и NK-клетках человека (CD3-, CD16/CD56+), B-клетках человека (CD3-, CD19+) и T-клетках человека (CD3+), проанализированных путем проточной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) для окрашивания AB79 для каждой клеточной популяции была преобразована в единицы МЭРФ с использованием стандартной кривой, полученной с использованием реактива «Rainbow Beads» (Spherotech; Лейк-Форест, Иллинойс). Показанные данные получены от 3 особей каждого вида и демонстрируют МЭРФ ± СО для каждого типа клеток. Существуют различия в экспрессии CD38 между лимфоцитами крови, с более высоким уровнем связывания AB79 на NK-клетках > B-клетках > T-клетках. Характер связывания AB79 аналогичен в клетках крови обезьян, но уровень связывания AB79/экспрессии CD38 ниже.

[0069] На Фиг. 6 представлена меж- и внутрисубъектная вариабельность данных для Т-клеток, В-клеток и NK-клеток животных, получавших плацебо, из исследования, указанного на Рис. 5. Фиг. 6А - NK-клетки; Фиг. 6В - В-клетки; и Фиг. 6С - Т-клетки.

[0070] На Фиг. 7 представлено количество NK-, B- и T-клеток до введения дозы (клеток на мкл), стратифицированных по исследованиям (верхний ряд) или по полу (нижний ряд). Фиг. 7А - NK-клетки относительно исследований; Фиг. 7В - В-клетки относительно исследований; Фиг. 7С - Т-клетки относительно исследований; Фиг. 7D - NK-клетки относительно мужского/женского пола; Фиг. 7E - В-клетки относительно мужского/женского пола; и Фиг. 7F - Т-клетки относительно мужского/женского пола.

[0071] На Фиг. 8 представлено AB79-зависимое деплетирование популяций NK-клеток, B-клеток и T-клеток. Графики сосредоточены на изменениях, которые произошли в течение первых 7 дней после обработки первой дозой AB79. Было возможно объединить данные одно- и многодозовых исследований с режимом дозирования раз в неделю или раз в две недели. Фиг. 8А - минимальное деплетирование популяции NK-клеток; Фиг. 8В - 1 неделя после 1^й дозы для NK-клеток; Фиг. 8С - средний профиль на дозовую группу для NK-клеток; 8D - минимальное деплетирование популяции В-клеток; 8E - 1 неделя после 1^й дозы для B-клеток; Фиг. 8F - средний профиль на дозовую группу для B-клеток; 8G - минимальное деплетирование популяции Т-клеток; Фиг. 8H - 1 неделя после 1^й дозы для Т-клеток; и Фиг. 8I - средний профиль на дозовую группу для Т-клеток. Графики A-C демонстрируют индивидуальные минимальные количества клеток (т.е. максимальный ФД эффект), индивидуальные количества клеток через 7 дней после первой дозы, средние профили деплетирования популяций клеток на дозу и структуру модели ФК-ФД для NK-клеток, соответственно. Графики D-F демонстрируют ту же информацию для B-клеток, а графики G-I демонстрируют ту же информацию для T-клеток.

[0072] На Фиг. 9 представлено влияние обработки антителом AB79 на эритроциты через два дня после введения дозы (Фиг. 9А) и общее число лимфоцитов в первые сутки после введения дозы в Исследовании 7 (Таблица 2) (Фиг. 9В).

[0073] На Фиг. 10 представлена смоделированная для человека ФК и профили деплетирования популяций NK-клеток, B-клеток и T-клеток для AB79. На основе масштабированных моделей ФК и ФК-ФД макаки была смоделирована ФК для 5 единичных в/в и п/к доз, и профили деплетирования популяций клеток (от 0,0003 до 1 мг/кг). Графики слева демонстрируют данные после в/в введения, а графики справа демонстрируют данные после п/к введения. В первом ряду графиков отображаются профили ФК. Нижний предел количественного определения (НПКО) в 0,05 мкг/мл обозначен горизонтальной пунктирной линией. ФК самой низкой дозы полностью перекрыта шумом, и только при дозах 0,03 мг/кг ФК достигла уровней выше НПКО. Фиг. 9А - в/в введение АВ79; Фиг. 9B - п/к введение AB79; Фиг. 9C - в/в введение для NK-клеток; Фиг. 9D - п/к введение для NK-клеток; Фиг. 9E - в/в введение для В-клеток; Фиг. 9F - п/к введение для В-клеток; Фиг. 9G - в/в введение для Т-клеток; Фиг. 9H - п/к введение для Т-клеток.

[0074] На Фиг. 11 представлен план исследования токсичности при однократном повышении дозы AB79 у здоровых добровольцев. В общей сложности 74 субъекта были рандомизированно распределены в 6 когорт с в/в и 4 когорты с п/к введением, и получали одну дозу AB79. Обширные заслепленные данные о безопасности, ФК и ФД были проанализированы после каждой когорты перед увеличением дозы. Критерии прекращения включали деплетирование популяции клеток-мишеней, чтобы избежать потенциальной иммуносупрессии у здоровых добровольцев. Каждый субъект наблюдался в течение 92 дней после введения дозы.

[0075] На Фиг. 12 представлены графики КАМ для моделей ФК-ФД, стратифицированных по пути введения (в/в - красный; п/к - синий); Фиг. 12А - NK-клетки; Фиг. 12В - В-клетки; и Фиг. 12С - Т-клетки.

[0076] Фиг. 13 демонстрирует, что AB79 обеспечивает деплетирование популяции лимфоцитов макаки. AB79 вызвал дозозависимое деплетирование популяции NK-клеток крови > B-клеток > T-клеток у самок яванской макаки (n=4 на дозовую группу) после однократного в/в введения дозы AB79; количественное определение проведено с помощью флуоросфер Flow-Count^TM (Beckman-Coulter) с использованием проточной цитометрии. Образцы собирали во время предварительной обработки (неделя -1), 1- сутки: перед введением дозы, через 15, 30 минут, 1, 4, 8, 24, 48, 96 и 168 часов после введения дозы, на 10, 15, 22, 29, 36 43, 50 и 57 сутки. Для ясности продемонстрированы данные только за 2 недели. Средние значения числа клеток рассчитывались в каждый момент времени и использовались для расчета % от базовых значений. Фиг. 13А - Т-клетки; Фиг. 13В - В-клетки; и Фиг. 13С - NK-клетки.

[0077] Фиг. 14 демонстрирует, что реакции вторичного иммунитета в ответ на анатоксин столбняка (АС) человека снижаются при введении антитела AB79. Мышам CB17/SCID вводили анти-асиало-GM1 для устранения NK-клеток, а затем вводили 25 × 10⁶ лимфоцитов периферической крови человека. Через 7-10 дней образцы сыворотки крови собирали для оценки человеческих Ig, и уровень Ig был основой для рандомизации. Мышам давали АС, чтобы вызвать реакцию вторичного иммунитета, и обрабатывали указанными антителами дважды в неделю в течение 10 дней. Через три дня после последней обработки сыворотку крови собирали и анализировали на анти-АС антитела. Антитело AB79 вызвало дозозависимую суппрессию реакции вторичного иммунитета в ответ на АС, в той же степени, что и ритуксан (Рткс) изотип-контроль (Изо), Рткс и AB79, все в дозе 10 мг/кг.

[0078] Фиг. 15 демонстрирует, что AB79 не усиливает индукцию цитокинов. Антитело AB79 не вызвало повышения уровней ИЛ-6 в МКПК, выделенных из крови 4 различных субъектов после 24-часовой инкубации, по сравнению с изотип-контролем IgG1. Положительные контроли ФГА и анти-CD3 повысили уровни цитокинов у всех субъектов, демонстрируя, что клетки обладали способностью вырабатывать ИЛ-6. Похожие результаты были получены с МКПК, стимулированными в течение 48 часов, когда анализировали уровни ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ГМ-КСФ, ИФН-γ и ФНО-α (данные не продемонстрированы). Столбцы отображают следующие условия для каждого субъекта: (i) без АТ; (ii) изотип-контроль; (iii) AB79; (iv) анти-CD3; (v) ФГА. Каждое значение представляет собой среднее значение в лунках-трипликатах ± СО, измеренное через 24 часа после инкубации.

[0079] На Фиг. 16А представлена схема эксперимента Фиг. 16В в условиях сухого связывания, жидкого связывания и связывания в растворе (модифицировано из Stebbings et al. (2007) J. Immunol. 179: 3325-3331).

[0080] Фиг. 16В демонстрирует, что АВ79 не обладает агонистической активностью. Антитело AB79 было высококонцентрированным, когда его раствор добавляли в лунки и жидкости давали испариться (сухое связывание), в сравнении с тем, когда AB79 позволяли связываться с лунками в растворе (жидкое связывание) или добавляли непосредственно к МКПК (связывание в растворе). Антитело AB79 не вызвало стимуляции ИЛ-6 или ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ГМ-КСФ, ИФН-γ или ФНО-α ни в одном из условий, проанализированных через 24 часа. ИЛ-8 конститутивно продуцировался МКПК и не был изменен никакой из обработок (данные не продемонстрированы). Каждое измерение представляет собой среднее значение в лунках-трипликатах, измеренное через 24 часа после инкубации для одного субъекта.

[0081] На Фиг. 17 представлена оценка связывания AB79 с эритроцитами человека. В данном исследовании не наблюдалось связывания AB79 (гистограмма со сплошной линией) или изотип-контроля (гистограмма с пунктирной линией) с эритроцитами в цельной крови тридцати человек-добровольцев. Представлены репрезентативные данные для 15 из 30 человек-добровольцев.

[0082] На Фиг. 18 представлена оценка связывания AB79 с эритроцитами яванской макаки. В данном исследовании не наблюдалось связывания AB79 (гистограмма со сплошной линией) или изотип-контроля (гистограмма с пунктирной линией) с эритроцитами в цельной крови тридцати яванских макак. Представлены репрезентативные данные для 15 из 30 яванских макак.

[0083] На Фиг. 19 представлена оценка связывания AB79 с тромбоцитами человека. В данном исследовании не наблюдалось связывания AB79 (гистограмма со сплошной линией) или изотип-контроля (гистограмма с пунктирной линией) с CD61+ тромбоцитами в цельной крови тридцати человек-добровольцев. Представлены репрезентативные данные для 15 из 30 человек-добровольцев.

[0084] На Фиг. 20 представлена оценка связывания AB79 с тромбоцитами яванской макаки. В данном исследовании не наблюдалось связывания AB79 (гистограмма со сплошной линией) или изотип-контроля (гистограмма с пунктирной линией) с CD61+ тромбоцитами в цельной крови тридцати яванских макак. Представлены репрезентативные данные для 15 из 30 яванских макак.

[0085] На Фиг. 21 представлена оценка связывания AB79 с CD45+ лимфоцитами яванской макаки. Связывание AB79 с CD45+ лимфоцитами в нелизированной цельной крови яванской макаки. Отмечались CD45+ лимфоциты, и затем для них проводилась оценка связывания с AB79 (гистограмма со сплошной линией) или с изотип-контролем (гистограмма с пунктирной линией). Было обнаружено связывание AB79 с субпопуляцией лимфоцитов, как продемонстрировано на фракции клеток справа от вертикальной пунктирной линии. Практически не наблюдается связывание изотип-контроля с лимфоцитами.

[0086] На Фиг. 22 представлена иерархия для отмеченных клеток с (A) идентификацией эритроцитов и (B) идентификацией лимфоцитов среди эритроцитов человека.

[0087] На Фиг. 23 представлена связывающая способность антитела для комплекса биотин-стрептавидин-BV421 AB79 и биотин-стрептавидин-BV421 даратумумаб. Столбцы отображают (i) пустые микрогранулы, (ii) только стрептавидин-BV421 (отрицательный контроль), (iii) AB79-биотин/Сав-BV421 (5 мкг/мл), (iv) даратумумаб-биотин/Сав-BV421 (5 мкг/мл), (v) AB79-биотин/Сав-BV421 (10 мкг/мл), (vi) даратумумаб-биотин/Сав-BV421 (10 мкг/мл). СИФ=средняя интенсивность флуоресценции, Сав=стрептавидин. Использовалось напряжение фотоумножительной трубки (ФЭУ) в 275 вольт.

[0088] На Фиг. 24 продемонстрировано связывание комплексов биотин-стрептавидин-BV421 AB79 и биотин-стрептавидин-BV421 даратумумаб с CD38+ лимфоцитами. Столбцы отображают (i) AB79-биотин-стреп-BV421 (0 мкг/мл), (ii) немеченый AB79 и AB79-биотин-стреп-BV421 (10 мкг/мл), (iii) AB79-биотин-стреп-BV421 (10 мкг/мл), (iv) даратумумаб-биотин-стреп-BV421 (0 мкг/мл), (v) немеченый даратумумаб и даратумумаб-биотин-стреп-BV421 (10 мкг/мл), (vi) даратумумаб-биотин-стреп-BV421 (10 мкг/мл). Вертикальные линии отображают стандартное отклонение; n=4 донора (3 донора для немеченых условий). СИФ=средняя интенсивность флуоресценции.

[0089] На Фиг. 25 продемонстрировано связывание AB79 и даратумумаба с эритроцитами человека (% положительных результатов для каждого донора). Периферическая кровь от четырех здоровых добровольцев, инкубированная с комплексом биотин-стрептавидин-BV421 AB79 (0; 0,1; 10; 100 мкг/мл) или биотин-стрептавидин-BV421 даратумумаб (0; 0,1; 1; 10; 100 мкг/мл) в течение 3 часов при комнатной температуре на мягком шейкере в присутствии или в отсутствие немеченого AB79 (500 мкг/мл) или немеченого даратумумаба (500 мкг/мл). Легенда: AB79-биотин-стреп-BV421; холодный (немеченный) AB79 и AB79-биотин-стреп-BV421; даратумумаб-биотин-стреп-BV421; холодный даратумумаб и даратумумаб-биотин-стрептавидин BV421.

[0090] На Фиг. 26 продемонстрировано связывание AB79 и даратумумаба с эритроцитами человека (суммарный % положительных данных). Периферическая кровь от четырех здоровых добровольцев, инкубированная с комплексом биотин-стрептавидин-BV421 AB79 (0; 0,1; 10; 100 мкг/мл) или биотин-стрептавидин-BV421 даратумумаб (0; 0,1; 1; 10; 100 мкг/мл) в течение 3 часов при комнатной температуре на мягком шейкере в присутствии или в отсутствие немеченого AB79 (500 мкг/мл) или немеченого даратумумаба (500 мкг/мл). Легенда: AB79-биотин-стреп-BV421; холодный AB79 и AB79-биотин-стреп-BV421; даратумумаб-биотин-стреп-BV421; холодный даратумумаб и даратумумаб-биотин-стреп-BV421.

[0091] На Фиг. 27 продемонстрировано связывание AB79 и даратумумаба с эритроцитами человека (средняя интенсивность флуоресценции для каждого донора). Периферическая кровь от четырех здоровых добровольцев, инкубированная с комплексом биотин-стрептавидин-BV421 AB79 (0; 0,1; 10; 100 мкг/мл) или биотин-стрептавидин-BV421 даратумумаб (0; 0,1; 1; 10; 100 мкг/мл) в течение 3 часов при комнатной температуре на мягком шейкере в присутствии или в отсутствие немеченого AB79 (500 мкг/мл) или немеченого даратумумаба (500 мкг/мл). Легенда: AB79-биотин-стреп-BV421; холодный AB79 и AB79-биотин-стреп-BV421; даратумумаб-биотин-стреп-BV421; холодный даратумумаб и даратумумаб-биотин-стрептавидин BV421.

[0092] На Фиг. 28 продемонстрировано связывание AB79 и даратумумаба с эритроцитами человека (суммарная средняя интенсивность флуоресценции). Периферическая кровь от четырех здоровых добровольцев, инкубированная с комплексом биотин-стрептавидин-BV421 AB79 (0; 0,1; 10; 100 мкг/мл) или биотин-стрептавидин-BV421 даратумумаб (0; 0,1; 1; 10; 100 мкг/мл) в течение 3 часов при комнатной температуре на мягком шейкере в присутствии или в отсутствие немеченого AB79 (500 мкг/мл) или немеченого даратумумаба (500 мкг/мл). Легенда: AB79-биотин-стреп-BV421; холодный AB79 и AB79-биотин-стреп-BV421; даратумумаб-биотин-стреп-BV421; холодный даратумумаб и даратумумаб-биотин-стреп-BV421.

[0093] На Фиг. 29 продемонстрирован гемолиз (нормализованный %) эритроцитов человека, вызванный: изотип-контролем человеческого IgG1, даратумумабом, AB79 и сапонин-контролем в мкг/мл. Каждый символ отображает среднее из 3-х репликат для человека (n=5 доноров).

[0094] На Фиг. 30 продемонстрирован гемолиз (нормализованный %) эритроцитов яванской макаки, вызванный: изотип-контролем человеческого IgG1, даратумумабом, AB79 и сапонин-контролем в мкг/мл. Каждый символ отображает среднее из 3-х репликат для яванской макаки (n=5 доноров).

[0095] На Фиг. 31 продемонстрирована (A) средняя концентрация AB79 в сыворотке крови макак, которым в/в ввели AB79, и процентное изменение по сравнению с базовым уровнем перед введением дозы в среднем абсолютном количестве (B) CD20^-/CD3^-/CD16⁺ NK-клеток; (C) CD3^-/CD20⁺ B-клеток; и (D) CD3⁺ Т-клеток в периферической крови макак после в/в инфузии AB79. Контроль - носитель препарата (незакрашенные квадраты); 0,1 мг/кг (незакрашенные ромбы); 0,3 мг/кг (незакрашенные треугольники); 1,0 мг/кг (незакрашенные круги); 3,0 мг/кг (закрашенные квадраты); 30,0 мг/кг (закрашенные ромбы) и 80,0 мг/кг (закрашенные треугольники) препарата AB79. Животным из когорт, обозначенных незакрашенными символами (n=7 животных), дозы вводились еженедельно, а закрашенными символами (n=5 животных) - раз в две недели в течение 3 месяцев. Столбцы ошибок обозначают стандартное отклонение.

[0096] Фиг. 32 демонстрирует зависимое от концентрации связывание AB79 (A) с клетками CHO, экспрессирующими рекомбинантный CD38 яванской макаки; и (B) с эндогенным CD38 яванской макаки, экспрессируемым на CD3+ T-лимфоцитах, CD3-CD20+ B-лимфоцитах и CD3-/CD20-/CD16+ NK-клетках. Уровни NK-клеток в цельной крови яванских макак (n=3) после инкубации с AB79 в течение 48 часов в культуре представлены на Фиг. 22C.

[0097] На Фиг. 33 представлен график стратегии дозирования для Примера 7.

[0098] На Фиг. 34 представлены (A) измерения массы тела, нормализованные относительно процентного изменения с момента включения в исследование: контрольное животное без артрита (незакрашенные круги); интактные животные с артритом (закрашенные круги); животные, получавшие профилактическое лечение антителом AB79 (незакрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение антителом AB79 (закрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение дексаметазоном (незакрашенные треугольники); (B) средняя оценка тяжести клинического артрита по показателям 16-ти суставов: интактные животные с артритом (закрашенные круги); животные, получавшие профилактическое лечение антителом AB79 (незакрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение антителом AB79 (закрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение дексаметазоном (незакрашенные треугольники); (C) число опухших проксимальных межфаланговых (ПМФ) суставов и (D) средняя овальная площадь 16-ти ПМФ суставов, рассчитанная и указанная как средний показатель опухлости суставов для каждого животного. Рентгенографическое исследование было выполнено путем рентгенографии каждого ПМФ сустава (E) и ПФ сустава (F). Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка для каждой группы. * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с интактной группой (однонаправленный дисперсионный анализ/критерий множественного сравнения Данна).

[0099] На Фиг. 35 представлены измерения массы тела (А), нормализованные относительно процентного изменения с момента включения в исследование: контрольное животное без артрита (незакрашенные круги); интактные животные с артритом (закрашенные круги); животные, получавшие профилактическое лечение антителом AB79 (незакрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение антителом AB79 (закрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение дексаметазоном (незакрашенные треугольники). Показатели биохимического анализа сыворотки: СРБ (B) и ЩФ (C) во времени: данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка для каждой группы. * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с интактной группой (однонаправленный дисперсионный анализ/критерий множественного сравнения Данна).

[00100] На Фиг. 36 представлена количественная гистоморфометрия суставной площади и поверхности ДМФ суставов, выполненная костным гистопатологом заслепленно, с использованием микропрепаратов, окрашенных толуидиновым синим (32 × 22 животных=704 микропрепаратов). Индивидуальные результаты для каждого животного отображены га графике в виде среднего значения ± стандартная ошибка для каждой группы. Статистический анализ был проведен так, как указано для графика выше. (А) общая площадь суставного хряща; (Б) толщина поврежденного суставного хряща; (C) процент поврежденной суставной поверхности; и (D) площадь остеофитов. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка для каждой группы. * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с интактной группой (однонаправленный дисперсионный анализ/критерий множественного сравнения Данна).

[00101] На Фиг. 37 представлены показатели биохимического анализа сыворотки: СРБ (А) и ЩФ (В) во времени. Контрольное животное без артрита (незакрашенные круги); интактные животные с артритом (закрашенные круги); животные, получавшие профилактическое лечение антителом AB79 (незакрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение антителом AB79 (закрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение дексаметазоном (незакрашенные треугольники). Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка для каждой группы. * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с интактной группой (однонаправленный дисперсионный анализ/критерий множественного сравнения Данна).

[00102] На Фиг. 38 представлены уровни (А) эритроцитов; (B) гематокрита; (C) ретикулоцитов, (D) тромбоцитов, (E) нейтрофилов и (F) лимфоцитов у животных с течением времени: контрольное животное без артрита (незакрашенные круги); интактные животные с артритом (закрашенные круги); животные, получавшие профилактическое лечение антителом AB79 (незакрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение антителом AB79 (закрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение дексаметазоном (незакрашенные треугольники). Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка для каждой группы. * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с интактной группой (однонаправленный дисперсионный анализ/критерий множественного сравнения Данна).

[00103] На Фиг. 39 представлены уровни (A) NK-клеток; (B) B-клеток; (С) Т-клеток и (D) моноцитов в периферической крови с течением времени: контрольное животное без артрита (незакрашенные круги); интактные животные с артритом (закрашенные круги); животные, получавшие профилактическое лечение антителом AB79 (незакрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение антителом AB79 (закрашенные квадраты); животные, получавшие терапевтическое лечение дексаметазоном (незакрашенные треугольники). Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка для каждой группы. * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с интактной группой (однонаправленный дисперсионный анализ/критерий множественного сравнения Данна).

[00104] На Фиг. 40 представлены сывороточные концентрации АВ79 у отдельных макак при профилактическом (А) или терапевтическом (В) введении. Сывороточные концентрации анти-АВ79 антител у отдельных макак при профилактическом (С) или терапевтическом (D) введении.

[00105] На Фиг. 41 представлены средние сывороточные профили концентрация-время для АВ79 после однократной 2-часовой в/в инфузии антитела АВ79 в дозах 0,03 (квадраты) и 0,06 (треугольники) мг или однократной п/к инъекции соединения АВ79 в дозе 0,6 мг·кг^-1 (круги) здоровым субъектам. Столбцы ошибок обозначают стандартное отклонение (n=6). в/в - внутривенно; п/к - подкожно.

[00106] На Фиг. 42A-42B представлены уровни NK-клеток в периферической крови здоровых субъектов после однократного в/в или п/к введения антитела AB79. в/в - внутривенно; п/к - подкожно.

[00107] На Фиг. 43 представлены уровни плазмобластов, моноцитов, В-, Т- и NK- клеток в периферической крови здоровых субъектов после однократной п/к инъекции плацебо-контроля, 0,1, 0,3 или 0,6 мг·кг^-1 антитела AB79. Абсолютное количество моноцитов (клетки/мкл), NK-клеток (клетки/мкл), Общее количество Т-клеток (клетки/мкл), В-клеток (клетки/мкл), плазмобластов (клетки/мкл). Центрированные кривые обозначают медиану. NK - естественный киллер (клетка); п/к - подкожно.

[00108] На Фиг. 44 продемонстрировано изменение по сравнению с базовым уровнем общего IgA, IgG и IgM в сыворотке здоровых субъектов после однократного в/в введения плацебо или 0,003 до 0,06 мг·кг^-1 антитела AB79, или однократного п/к введения плацебо или от 0,03 до 0,6 мг·кг^-1 соединения AB79. Символы обозначают среднее значение для когорты, а столбцы ошибок обозначают стандартную ошибку среднего. плацебо, AB79 0,0003 мг/кг AB79 0,001 мг/кг AB79 0,003 мг/кг AB79 0,01 мг/кг AB79 0,03 мг/кг AB79 0,06 мг/кг AB79 0,1 мг/кг AB79 0,3 мг/кг AB79 0,6 мг/кг. Ig - иммуноглобулин; в/в - внутривенно; п/к - подкожно.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[00109] Данное изобретение относится к способам лечения заболеваний, связанных с CD38, путем подкожного введения низких доз (≤600 мг) и объемов (≤3 мл) анти-CD38 антител.

[00110] AB79, даратумумаб, изатуксимаб и MOR202 являются IgG1, которые в основном убивают опухоли за счет антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). Этот механизм требует, чтобы эффекторные клетки, такие как NK-клетки, связывали антитела на клетках-мишенях и формировали литический синапс, чтобы выделять цитотоксические агенты направленным образом. Количество этих эффекторных клеток в крови - на порядки ниже, чем количество эритроцитов и тромбоцитов. Например, отношение количества эритроцитов к NK-клеткам в крови составляет 20000:1. Кроме того, на эритроцитах экспрессируется приблизительно в 36 раз больше молекул CD38, чем на клетках миеломы у пациентов с активным заболеванием. Было высказано предположение, что эффекторная активность даратумумаба, изатуксимаба и MOR202 отклоняется от опухолей, поскольку эффекторные клетки в основном связаны с анти-CD38 антителами, связанными с эритроцитами и тромбоцитами, предотвращая образование литического синапса с опухолями, что приводит к низкой эффективности АЗКЦ. Напротив, сниженное или более кратковременное связывание эритроцитов и тромбоцитов с AB79 по сравнению с даратумумабом может позволить эффекторным клеткам сосредоточиться на опухоли, что приводит к более эффективной АЗКЦ, более высокой противоопухолевой активности и более низкой эффективной дозе.

[00111] Лечение пациентов с помощью анти-CD38 антител, которые связываются с эритроцитами и тромбоцитами, может также привести к опасным для жизни побочным эффектам. Например, лечение РРММ с помощью MOR202 привело к нескольким опасным нежелательным явлениям, возникшим в ходе лечения (НЯВЛ) (см., например, Raab et al. (2015) Blood 126: 3035). Наиболее распространенными НЯВЛ в любой степени были анемия (15 пациентов, 34%), утомляемость (14 пациентов, 32%), инфузионные реакции (ИР) и лейкопения (13 пациентов, 30% каждый), лимфопения и тошнота (11 пациентов, 25% каждый). НЯВЛ 3-й степени или выше были зарегистрированы для 28 пациентов (64%); наиболее распространенными были лимфопения (8 пациентов, 18%), лейкопения (5 пациентов, 11%) и гипертензия (4 пациента, 9%). ИР возникали в основном во время первой инфузии; все были 1-2 степени, за исключением одного пациента (3-я степень). Часто регистрировались инфекции (26 пациентов, 59%), но в большинстве случаев они не считались связанными с лечением. MOR202 в клинической практике применяется только путем в/в инфузии. Это противоположно данному изобретению, которое позволяет подкожно вводить AB79 в низких дозах и в небольших объемах, как описано в данном документе.

[00112] Известны другие антитела от компании «Morphosys», нацеленные на CD38 (см., например, WO 2006/125640, где раскрываются четыре антитела человека: MOR03077, MOR03079, MOR03080 и MOR03100, и два мышиных антитела: OKT10 и IB4). Данные антитела предшествующего уровня техники уступают антителу AB79 по ряду причин. MOR03080 связывается с CD38 человека и CD38 яванской макаки, но с низкой аффинностью к CD38 человека (K_D=27,5 нМ; определено по технологии «Biacore»). ОКТ10 связывается с CD38 человека и CD38 яванской макаки, но с низкой/умеренной аффинностью к CD38 человека (K_D=8,28 нМ; определено по технологии «Biacore»). MOR03079 связывается с CD38 человека с высокой аффинностью (K_D=2,4 нМ; определено по технологии «Biacore»), но не связывается с CD38 яванской макаки. MOR03100 и MOR03077 связываются с CD38 человека с умеренной или низкой аффинностью (K_D=10 нМ и 56 нМ, соответственно; определено по технологии «Biacore»). Для сравнения, AB79 связывается с CD38 человека и яванской макаки с высокой аффинностью (для CD38 человека K_D=5,4 нм; определено по технологии «Biacore»). Кроме того, антитела предшествующего уровня техники имеют низкую АЗКЦ, также как и активность КЗЦ.

[00113] Преимуществом более эффективной АЗКЦ является возможность доставлять терапевтическое средство против CD38 в виде инъекции с низким объемом. Если препарат AB79 составлен в концентрации 135 мг/мл, эффективная доза для пациента с миеломой и массой 80 кг может быть введена однократной п/к инъекцией объемом <2,5 мл. Напротив, п/к доза даратумумаба, проходящая фазу 3 клинических испытаний, составляет 1800 мг, суспендированного в 15 мл вместе с «Enhance™» (Halozyme).

[00114] Безопасность, переносимость, фармакокинетика и фармакодинамика AB79, вводимого в/в и п/к, были первоначально охарактеризованы для макак. AB79 вводили в виде одной дозы в/в болюсно или п/к инъекцией яванским макакам в стерильном физиологическом растворе (в/в) или разбавляющем растворе (п/к) в дозах 0,03, 0,1 и 0,3 мг/кг (4 самки/группа). Для в/в пути введения Cmax была приблизительно пропорциональна дозе от 0,03 до 0,3 мг/кг AB79, и ППК(0-t) была больше, чем пропорциональная доза от 0,03 до 0,1 мг/кг AB79, но была приблизительно пропорциональна дозе от 0,1 до 0,3 мг/кг AB79. Для п/к пути введения Cmax и ППК(0-t) увеличивались с дозой, но ППК(0-t) увеличивалась больше, чем дозопропорционально, после п/к введения в диапазоне от 0,03 до 0,3 мг/кг. По расчетам, T_1/2 составлял от 120 до 144 часов. Средняя биодоступность для п/к пути введения составляла приблизительно 100% (120%, 73% и 120% для 0,03, 0,1 и 0,3 мг/кг, соответственно). Введение AB79 в дозе 0,03, 0,1 или 0,3 мг/кг посредством однократной внутривенной или подкожной инъекции самкам яванской макаки переносилось хорошо. Предполагаемые фармакологические эффекты - снижение лимфоцитов (Т-клеток, В-клеток) легкой или умеренной степени и дозозависимое снижение популяций NK-клеток - наблюдались на всех уровнях дозы и для обоих путей введения; максимальные эффекты деплетирования популяций клеток после п/к введения дозы были похожими или немного меньшими, чем наблюдаемые после в/в введения дозы при том же уровне дозы (Roepcke et al. (2018) Pharmacol. Res. Perspect. 6 (3): e00402). На основании результатов данного исследования уровень, при котором отсутствуют неблагоприятные эффекты (УПКОНЭ) считался равным 0,3 мг/кг как при внутривенном, так и при подкожном пути введения. Измененные показатели лимфоцитов и NK-клеток вернулись в норму при отсутствии AB79 после 56-дневного периода. ППК и Cmax в сыворотке, связанные с УПКОНЭ, составляли 574 ч*мкг/мл и 7,94 мкг/мл для в/в введения, и 698 ч*мкг/мл и 2,15 мкг/мл для п/к введения, соответственно.

[00115] Безопасность, переносимость, фармакокинетика и фармакодинамика препарата AB79 были затем клинически охарактеризованы в рандомизированном, двойном слепом, плацебо-контролируемом исследовании однократной внутривенной (в/в) инфузии или подкожной (п/к) инъекции объемом 1 мл в когортах здоровых людей с возрастающей дозировкой. Препарат AB79 переносился хорошо, все нежелательные явления (НЯ) были легкими или умеренными, и не было досрочных исключений из-за НЯ или инфузионных реакций (Fedyk et al. (2018) Blood 132: 3249). В когортах с более высокими дозами кратковременное, легкое или умеренное повышение уровня цитокинов совпало с уменьшением CD38-экспрессирующих клеток; клинические симптомы, прежде всего, включали пирексию, головную боль и постуральную гипотензию. Не сообщалось о каких-либо выявленных аномалиях лабораторных исследований, электрокардиограмм, показателей жизненно важных функций или физических осмотров, связанных с лечением антителом AB79. Антитело AB79 вызвало снижение уровней плазмобластов и естественных киллеров (NK-клеток) при аналогичных дозах, с полуэффективной дозой (ED₅₀) в 0,003 мг/кг для в/в пути введения и 0,1 мг/кг для р/к пути введения. Снижение общего количества иммуноглобулинов (Ig) M и A происходило без сопоставимых изменений в IgG. Общее количество лейкоцитов, гранулоцитов, лимфоцитов, эритроцитов и тромбоцитов оставалось в пределах нормы для всех уровней дозы. В целом, AB79 селективно снизил уровень плазмобластов и NK-клеток в периферической крови здоровых субъектов при в/в или п/к введении и был в целом безопасным и хорошо переносимым. Данный плазмоцитолитический профиль может быть полезен для лечения нарушений, вызванных плазмоцитами или NK-клетками, злокачественными аналогами (например, множественной миеломой и NK-клеточной лейкемией) и патогенными антителами или иммуноглобулинами.

[00116] AB79 может вызывать терапевтический ответ (например, ремиссию заболевания) при заболеваниях, опосредованных иммуноглобулинами или антителами, относительно быстро, поскольку он нацелен на плазматические клетки напрямую, в отличие от терапевтических средств, которые нацелены на B-клеточных предшественников плазматических клеток (например, анти-BAFF мАТ (например, белимумаб)), анти-CD20 мАТ (например, ритуксимаб) и ингибиторы тирозинкиназы Брутона (ТКБ) (например, барицитиниб)). Эти последние стратегии нацелены на плазматические клетки косвенно, по сути устраняя образование плазматических клеток de novo путем ингибирования дифференциации предшественников. Существующие пулы плазматических клеток остаются относительно незатронутыми и продолжают продуцировать патогенные антитела/иммуноглобулины в течение всей своей жизни. Таким образом, продолжительность жизни ранее существующих плазматических клеток, некоторые из которых выживают в течение десятилетий, может привести к потенциальному снижению количества патогенных антител/иммуноглобулинов, поэтому косвенные стратегии могут проявлять более медленное начало активности и эффективности по сравнению с AB79. Единственными другими терапевтическими средствами, которые продемонстрировали непосредственное снижение количества плазматических клеток, являются ингибиторы протеасом (например, бортезомиб), и этот класс препаратов относительно плохо переносится и включает ограничивающие дозу побочные эффекты (например, невропатию, диарею), которые связывают с ингибированием протеасом в клетках, отличных от плазматических (например, нейронах, эпителиальных клетках), поскольку протеасомы экспрессируется в этих тканях повсеместно. Таким образом, специфичность AB79 для CD38 в сочетании с ограниченным профилем экспрессии CD38 создает механизм действия, который непосредственно нацелен на плазматические клетки, минимизируя при этом эффекты на клетки, отличные от плазматических, и обладает потенциалом для обеспечения быстрой эффективности при заболеваниях, вызываемых плазматическими клетками, трансформированными аналогами и (или) патогенными антителами/иммуноглобулинами.

[00117] Способы, направленные против CD38, и стандартные дозировки согласно данному изобретению впервые обеспечивают подкожное введение терапевтически эффективных низких доз и объемов анти-CD38 антител, тем самым обеспечивая неожиданные преимущества и предотвращая побочные эффекты, неудобства и затраты, связанные с введением высоких доз препаратов для системной терапии анти-CD38 антителами.

[00118] В данном изобретении предложены способы и стандартные лекарственные формы для подкожного введения терапевтически эффективного количества изолированного анти-CD38 антитела пациенту, нуждающемуся в этом, для лечения заболеваний, при которых назначают связывание с CD38, включая гематологические раковые заболевания. В некоторых вариантах осуществления, антитело для подкожного введения содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 10. Анти-CD38 антитело, предложенное в данном документе, способно быть терапевтически эффективным при введении в неожиданно низких дозах и, как таковое, может вводиться в неожиданно малом объеме, облегчая подкожное введение.

[00119] Другое преимущество анти-CD38 антител согласно данному изобретению состоит в том, что в отличие от некоторых других анти-CD38 антител в клинической практике, анти-CD38 антитела согласно данному изобретению (например, AB79) способны связываться с CD38 яванской макаки (яванец), предоставляя полезную животную модель для доклинической оценки переносимости, токсичности и эффективности и т. д.

[00120] Другое преимущество анти-CD38-антител согласно данному изобретению состоит в том, что их можно использовать для скрининга других антител, которые конкурируют за связывание с CD38 по тому же эпитопу и могут быть полезны в способах и стандартных дозировках согласно данному изобретению.

[00121] Другое преимущество анти-CD38-антител согласно данному изобретению состоит в том, что они могут использоваться для скрининга других антител с пониженным или альтернативным (например, более кратковременным) связыванием с эритроцитами и (или) тромбоцитами по сравнению с даратумумабом, и могут быть полезны в способах и стандартных лекарственных формах согласно данному изобретению, например антитело, которое конкурирует или связывается с тем же эпитопом, что и АВ79.

[00122] Если в данном документе не определено иное, научные и технические термины, применяемые в связи с данным изобретением, будут иметь значения, которые в большинстве случаев понимают рядовые специалисты в данной области техники. Значение и объем терминов должны быть понятны. Однако в случае любой латентной неясности определения, представленные в данном документе, имеют преимущественную силу над любым словарным или лежащим вне документа определением. Более того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе будут включать множественное число, а термины во множественном числе будут включать единственное число. Термин «или» включает в себя «и (или)», если не указано иное. Кроме того, использование термина «включая», «включает» или «включено» не является ограничивающим. Термины, такие как «элемент» и «компонент», охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, которые содержат более одной субъединицы, если определенно не указано иное.

[00123] Способы и методики данного изобретения обычно выполняются в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в данном описании, если не указано иное. Номенклатура, используемая в связи с лабораторными методами и методиками, и собственно лабораторные методы и методики культуры клеток и тканей, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, химии и гибридизации белков и нуклеиновых кислот, аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, описанные в данном документе, хорошо известны и широко используются в данной области техники. Для химического синтеза, химического анализа, получения, составления, доставки фармацевтических препаратов и лечения пациентов применяются стандартные методики. Коммерческие ферментативные реакции и методики очистки выполняются в соответствии с инструкциями производителя, как обычно осуществляется в данной области техники или как описано в данном документе.

[00124] Все заголовки и обозначения разделов используются только для ясности и в справочных целях, и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие. Например, специалисты в данной области техники оценят полезность комбинирования различных аспектов раскрытия из разных заголовков и разделов, в зависимости от ситуации, в соответствии с духом и объемом изобретения, описанного в данном документе.

[00125] Отдельные термины определены ниже для того, чтобы данное изобретение было более понятным.

[00126] Термины «CD38 человека» и «антиген CD38 человека» относятся к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее функциональной фракции, такой как эпитоп, как определено в данном документе (Таблица 1). В целом, CD38 обладает коротким внутрицитоплазматическим хвостом, трансмембранным доменом и внеклеточным доменом. Термины «CD38 яванской макаки» и «антиген CD38 яванской макаки» относятся к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, которая на 92% идентична аминокислотной последовательности CD38 человека (Таблица 1). Синонимы для CD38 включают циклическую АДФ рибозогидролазу; циклическую АДФ рибозо-гидролазу 1; АДФ рибозилциклазу; АДФ-рибозилциклазу 1; цАДФр гидролазу 1; CD38-rs1; I-19; антиген NIM-R5; 2'-фосфоциклическую-АДФ-рибозо-трансферазу; 2'-фосфо-АДФ-рибозилциклазу; 2'-фосфоциклическую-АДФ-рибозотрансферазу; 2'-фосфо-АДФ-рибозилциклазу; и Т10.

Таблица 1. Аминокислотная последовательность CD38 человека и яванской макаки.
Вид	Аминокислотная последовательность 1234567890123456789012345678901234567890	SEQ ID NO
CD38 человека	MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVVVLAVVVPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI	1
CD38 яванской макаки	MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQVCLGVCLLVLLILVVVVAVVLPRWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI	2
CD157 человека	MAAQGCAASRLLQLLLQLLLLLLLLAAGGARARWRGEGTSAHLRDIFLGRCAEYRALLSPEQRNKNCTAIWEAFKVALDKDPCSVLPSDYDLFINLSRHSIPRDKSLFWENSHLLVNSFADNTRRFMPLSDVLYGRVADFLSWCRQKNDSGLDYQSCPTSEDCENNPVDSFWKRASIQYSKDSSGVIHVMLNGSEPTGAYPIKGFFADYEIPNLQKEKITRIEIWVMHEIGGPNVESCGEGSMKVLEKRLKDMGFQYSCINDYRPVKLLQCVDHSTHPDCALKSAAAATQRKAPSLYTEQRAGLIIPLFLVLASRTQL	13

[00127] Термины «терапевтически эффективное количество» и «терапевтически эффективная дозировка» обозначает количество терапевтического средства, которое является достаточным для снижения или облегчения тяжести и (или) периода протекания нарушения или одного или нескольких его симптомов; предупреждения прогрессирования нарушения; обеспечения обратного развития нарушения; предупреждения рецидива, развития, проявления или прогрессирования одного или нескольких симптомов, ассоциированных с нарушением; или усиления либо улучшения профилактического(-их) или терапевтического(-их) эффекта(-ов) другой терапии (например, профилактического или терапевтического средства), в дозировках и для периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от таких факторов, как течение заболевания, возраст, пол и масса тела индивидуума, а также способность лекарственных препаратов вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество антитела является таким количеством, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела компенсируются терапевтически полезными эффектами. Терапевтически эффективное количество антитела для терапии опухоли может быть измерено по его способности стабилизировать прогрессирование заболевания. Способность соединения ингибировать рак может быть оценена в животной модельной системе, прогнозирующей эффективность для раковых заболеваний человека.

[00128] Термины «пациент» и «субъект» включают как людей, так и других животных. Таким образом, композиции, дозировки и способы, раскрытые в данном документе, применимы как для лечения человека, так и для ветеринарии. В одном варианте осуществления, пациентом является млекопитающее, например, человек.

[00129] Термин «заболевание, при котором назначают связывание с CD38» означает заболевание, при котором связывание связывающего партнера (например, анти-CD38 антитела согласно данному изобретению) с CD38 обеспечивает профилактическое или лечебное действие, включая уменьшение одного или больше симптомов заболевания. Такое связывание может привести к блокированию других факторов или связывающих партнеров для CD38, нейтрализации CD38, АЗКЦ, КЗЦ, активации комплемента или некоторому другому механизму, с помощью которого заболевание предотвращается или лечится. Факторы и связывающие партнеры для CD38 включают аутоантитела к CD38, которые блокируются анти-CD38 антителами согласно данному изобретению. Такое связывание может быть обозначено как следствие экспрессии CD38 клетками или субпопуляцией клеток, например клетками MM, при котором предоставление субъекту связывающего партнера для CD38 приводит к удалению, например лизису этих клеток, посредством, например, гемолиза или апоптоза. Такая экспрессия CD38 может быть, например, нормальной, сверхэкспрессированной, ненадлежащим образом экспрессированной или следствием активации CD38 относительно нормальных клеток или относительно других типов клеток либо в состоянии без заболевания, либо в состоянии заболевания.

[00130] Термин «гематологический рак» обозначает злокачественные новообразования кроветворных тканей и охватывает лейкозы, лимфомы и множественные миеломы. Неограничивающие примеры состояний, связанных с аберрантной экспрессией CD38, включают, но не ограничиваются следующими: множественная миелома (MM) (Jackson et al. (1988) Clin. Exp. Immunol. 72: 351-356), включающая рецидивирующую рефрактерную ММ (РРММ) или впервые выявленную ММ (ВВММ); B-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (B-ХЛЛ) (Dürig et al. (2002) Leukemia 16: 30-35; Morabito et al. (2001) Leukemia Res. 25: 927-932; Marinov et al. (1993) Neoplasma 40(6): 355-358; and Jelinek et al. (2001) Br. J. Haematol. 115: 854-861); острый лимфобластный лейкоз (Keyhani et al. (1999) Leukemia Res. 24: 153-159; and Marinov et al. (1993) Neoplasma 40(6): 355-358); хронический миелоидный лейкоз (Marinov et al. (1993) Neoplasma 40(6): 355-358); острый миелоидный лейкоз (Keyhani et al. (1999) Leukemia Res. 24: 153-159); хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ); хронический миелогенный лейкоз или хронический миелолейкоз (ХМЛ); острый миелогенный лейкоз или острый миелолейкоз (ОМЛ); острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ); ворсистоклеточный лейкоз (ВКЛ); NK/T-клеточную лимфому, миелодиспластические синдромы (МДС) (Nurulhuda et al. (2017) Blood 130: 2814); и все подтипы и стадии (например, для ХМЛ: бластная фаза (БФ), хроническая фаза (ХФ) или ускоренная фаза (УФ)) этих лейкозов и других гематологических заболеваний, которые определяются морфологическими, гистохимическими и иммунологическими методиками, которые хорошо известны для специалистов в данной области техники.

[00131] Термины «неоплазия» и «неопластическое состояние» обозначают состояние, связанное с пролиферацией клеток, характеризующейся потерей нормального контроля, что приводит к одному или нескольким симптомам, включая нерегулируемый рост, отсутствие дифференциации, дедифференциацию, локальную инвазию тканей и метастазирование.

[00132] Термин «выделенное антитело» обозначает антитело, которое по сути не содержит других антител, имеющих иную антигенную специфичность. Например, выделенное антитело, которое специфически связывается с CD38, по сути не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от CD38. Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом CD38 человека или CD38 яванской макаки, может, тем не менее, иметь перекрестную реактивность с другими родственными антигенами, например от других видов, такими как видовые гомологи CD38. Более того, выделенное антитело может по сути не содержать других клеточных материалов и (или) химических веществ.

[00133] Термин «эритроциты» относится к гемоглобин-содержащим клеткам крови, происходящих из костного мозга, которые переносят кислород к клеткам и тканям, и переносят углекислый газ обратно в органы дыхания. Эритроциты также именуются красными клетками, красными кровяными тельцами, гематидами и эритроидными клетками.

[00134] Термины «специфическое связывание», «специфически связывается с» и «специфично в отношении» применительно к взаимодействию конкретного антитела, белка или пептида с антигеном, эпитопом или другим химическим веществом означают связывание, которое измеримо отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, например, путем определения связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая обычно представляет собой молекулу сходной структуры, не обладающую при этом активностью связывания. Например, специфическое связывание может быть определено путем конкуренции с контрольной молекулой, которая сходна с мишенью. Анти-CD38 антитела согласно данному изобретению специфически связывают лиганды CD38. Термины «специфическое связывание», «специфически связывается с» и «специфично в отношении» также означают, что взаимодействие зависит от наличия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) в химических веществах; например, антитело распознает и связывается с определенной структурой белка, а не с белками в целом. Если антитело является специфичным в отношении эпитопа «A», то присутствие молекулы, содержащей эпитоп «A» (или свободного, немеченного «A»), в реакции, в состав которой входят меченый «A» и антитело, будет снижать количество меченого «A», связанного с антителом. Специфическое связывание для конкретного антигена или эпитопа может проявляться, например, в показателе KD антитела относительно антигена или эпитопа, составляющем по меньшей мере около 10^-4 М, по меньшей мере около 10^-5 М, по меньшей мере около 10^-6 М, по меньшей мере около 10^-7 М, по меньшей мере около 10^-8 М, по меньшей мере около 10^-9 М, по меньшей мере около 10^-10 М, по меньшей мере около 10^-11 М, по меньшей мере около 10^-12 М, где KD означает скорость диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Как правило, антитело, которое специфически связывает антиген, будет иметь показатель KD, который в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 или более раз выше для контрольной молекулы относительно антигена или эпитопа. Кроме того, специфическое связывание для конкретного антигена или эпитопа может проявляться, например, в показателе KA или Ka антитела относительно антигена или эпитопа, являющемся по меньшей мере в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 или более раз большим для эпитопа по сравнению с контролем, где KA или Ka означает скорость ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

[00135] Термин «в течение периода времени» относится к любому периоду времени, например минутам, часам, дням, месяцам или годам. Например, «в течение определенного периода времени» может относиться к по меньшей мере 10 минутам, по меньшей мере 15 минутам, по меньшей мере 30 минутам, по меньшей мере 60 минутам, по меньшей мере 75 минутам, по меньшей мере 90 минутам, по меньшей мере 105 минутам, по меньшей мере 120 минутам, по меньшей мере 3 часам, по меньшей мере 4 часам, по меньшей мере 5 часам, по меньшей мере 6 часам, по меньшей мере 7 часам, по меньшей мере 8 часам, по меньшей мере 9 часам, по меньшей мере 10 часам, по меньшей мере 12 часам, по меньшей мере 14 часам, по меньшей мере 16 часам, по меньшей мере 18 часам, по меньшей мере 20 часам, по меньшей мере 22 часам, по меньшей мере одному дню, по меньшей мере двум дням, по меньшей мере трем дням, по меньшей мере 4 дням, по меньшей мере 5 дням, по меньшей мере 6 дням, по меньшей мере неделе, по меньшей мере месяцу, по меньшей мере одному году или любому промежуток времени между ними. Другими словами, антитело из композиции может абсорбироваться индивидуумом, которому его вводят, в течение периода времени по меньшей мере 10 минут, по меньшей мере 15 минут, по меньшей мере 30 минут, по меньшей мере 60 минут, по меньшей мере 75 минут, по меньшей мере 90 минут, по меньшей мере 105 минут, по меньшей мере 120 минут, по меньшей мере 3 часа, по меньшей мере 4 часа, по меньшей мере 5 часов, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 7 часов, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 9 часов, по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере одни сутки, по меньшей мере двое суток, по меньшей мере трое суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 6 суток, по меньшей мере неделя, по меньшей мере месяц, по меньшей мере один год, или промежутка времени между ними.

[00136] Композиция, которая «главным образом» состоит из компонента, означает, что композиция содержит более чем около 80%, в некоторых вариантах осуществления - более чем около 90%, в некоторых вариантах осуществления - более чем около 95%, в некоторых вариантах осуществления - более чем около 97%, в некоторых вариантах осуществления - более чем около 98%, в некоторых вариантах осуществления - более чем около 99% компонента по массе.

[00137] Термин «около» относится к величине, близкой к числу, степени, объему, времени и т.д., с только незначительными вариациями в размере до 10%.

[00138] Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к фармацевтически приемлемому материалу, композиции или носителю, подходящему для введения соединений по данному изобретению млекопитающим. Носители включают жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, участвующий в переносе или транспорте рассматриваемого соединения из одного органа или части тела в другой орган или часть тела. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в смысле совместимости с другими ингредиентами препарата и не причинять вреда пациенту. В одном варианте осуществления, фармацевтически приемлемый носитель является подходящим для внутривенного введения. В другом варианте осуществления, фармацевтически приемлемый носитель является подходящим для местно-регионарной инъекции. В другом варианте осуществления, фармацевтически приемлемый носитель является подходящим для подкожного введения. В другом варианте осуществления, фармацевтически приемлемый носитель является подходящим для подкожной инъекции.

[00139] Термин «фармацевтическая композиция» относится к препаратам, подходящим для введения субъекту и лечения заболевания. Когда анти-CD38 антитела по данному изобретению вводят в качестве лекарственных средств млекопитающим, например человеку, их можно вводить «как есть» или в виде фармацевтической композиции, содержащей анти-CD38 антитело в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и (или) другими эксципиентами. Фармацевтическая композиция может быть в форме стандартной лекарственной формы для введения определенной дозы анти-CD38 антитела в определенной концентрации, определенном количестве или определенном объеме. В данном документе предлагаются фармацевтические композиции, содержащие анти-CD38 антитела, отдельно или в комбинации с профилактическими агентами, терапевтическими агентами и (или) фармацевтически приемлемыми носителями.

[00140] Как правило, традиционные структурные единицы антитела содержат тетрамер. Как правило, каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну «легкую» (как правило, имеющую молекулярную массу около 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (как правило, имеющую молекулярную массу около 50-70 кДа). Легкие цепи человека классифицируются как легкие цепи каппа и лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. IgG имеет несколько подклассов, включая, но не ограничиваясь следующими: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, включая, но не ограничиваясь следующими: IgM1 и IgM2. Таким образом, «изотип» относится к любому из подклассов иммуноглобулинов, определяемых химическими и антигенными характеристиками их константных областей. Известными изотипами иммуноглобулинов человека являются IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD и IgE. Терапевтические антитела также могут содержать гибриды изотипов и (или) подклассов.

[00141] Каждая вариабельная тяжелая (VH) и вариабельная легкая (VL) область (длиной от 100 до 110 аминокислот) состоит из трех гипервариабельных областей, называемых «областями, определяющими комплементарность» (CDR), и четырех каркасных областей (FR) (длиной около 15-30 аминокислот), расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. «Вариабельный» относится к тому факту, что ООК сильно различаются по последовательности среди антител, и тем самым определяет уникальный участок связывания антигена.

[00142] Гипервариабельная область обычно охватывает аминокислотные остатки примерно из аминокислотных остатков 24-34 (LCDR1; «L» обозначает легкую цепь), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и примерно из 31-35B (HCDR1; «H» обозначает тяжелую цепь), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи (Kabat et al. (1991) Sequences Of Proteins Of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) и (или) из тех аминокислотных остатков, которые формируют гипервариабельную петлю, например остатки 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и остатки 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) и 96-101 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917).

[00143] Система нумерации по Кабату (Kabat) обычно используется для обозначения остатка в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 вариабельной области легкой цепи и остатки 1-113 вариабельной области тяжелой цепи) (например, Kabat et al. (1991) Sequences Of Proteins Of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) с системой нумерации ЕС, используемой для Fc-фрагмента.

[00144] Термин «домен иммуноглобулина (Ig)» относится к области иммуноглобулина, имеющей отчетливую третичную структуру. В дополнение к вариабельным доменам каждая тяжелая и легкая цепь имеет постоянные домены: константные тяжелые (СН) домены; константные легкие (CL) домены и шарнирные домены. Применительно к антителам IgG, каждый изотип IgG имеет три области СН. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константную область, в первую очередь ответственную за эффекторную функцию. Соответственно, «CH» домены применительно к IgG являются следующими: «CH1» относится к положениям 118-220 в соответствии с индексом ЕС, соответственно Кабату. «CH2» относится к положениям 237-340 в соответствии с индексом ЕС, соответственно Кабату, а «CH3» относится к положениям 341-447 в соответствии с индексом ЕС, соответственно Кабату.

[00145] Другим типом домена Ig тяжелой цепи является шарнирная область. Термин «шарнирная область» относится к гибкому полипептиду, содержащему аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. Структурно домен CH1 IgG заканчивается в ЕС положении 220, а домен CH2 IgG начинается с остатка в ЕС положении 237. Таким образом, для IgG, шарнир антитела в данном описании определен как включающий положения с 221 (D221 в IgG1) по 236 (G236 в IgG1), при этом нумерация соответствует индексу EC, соответственно Кабату. В некоторых вариантах осуществления, например, применительно к Fc-фрагменту, включен нижний шарнир, при этом «нижний шарнир» обычно относится к положениям 226 или 230.

[00146] Термин «Fc-фрагмент» относится к полипептиду, содержащему константную область антитела, исключая первую константную область иммуноглобулинового домена и, в некоторых случаях, часть шарнира. Таким образом, Fc относится к двум последним константным областям иммуноглобулиновых доменов IgA, IgD и IgG, к последним трем константным областям иммуноглобулиновых доменов IgE и IgM, и гибкому шарнирному N-концу этих доменов. В IgA и IgM Fc может включать J-цепь. В IgG домен Fc содержит иммуноглобулиновые домены Сγ2 и Cγ3 (Cγ2 и Cγ3) и нижнюю шарнирную область между Cγ1 (Cγ1) и Cγ2 (Cγ2). Несмотря на то, что границы Fc-фрагмента могут варьировать, Fc-фрагмент тяжелой цепи IgG человека обычно определяется как включающий остатки C226 или P230 к его карбоксильному концу, при этом нумерация соответствует индексу ЕС, соответственно Кабату. В некоторых вариантах осуществления, что более полно описано ниже, модификации аминокислот осуществляются в Fc-фрагменте, например, для изменения связывания с одним или большим количеством рецепторов FcγR или с рецептором FcRn.

CD38 антитела

[00147] Соответственно, данное изобретение относится к изолированным анти-CD38 антителам, которые специфически связывают белок CD38 человека и приматов, и которые имеют пониженную или менее чем 10%-ю, менее чем 20%-ю, менее чем 30%-ю, менее чем 40%-ю, менее чем 50%-ю способность к связыванию с эритроцитами человека по сравнению с даратумумабом и, таким образом, находят применение в способах подкожного введения и стандартных лекарственных формах. Особое применение в данном изобретении имеют антитела, которые связываются с белками CD38 как человека, так и приматов, особенно приматов, используемых в клинических испытаниях, таких как яванская макака (Macaca flavicularis, макака-крабоед, также упоминаемая в данном документе как «яванец»).

[00148] В некоторых вариантах осуществления, анти-CD38 антитела согласно данному изобретению взаимодействуют с CD38 по ряду аминокислотных остатков, включая K121, F135, Q139, D141, M142, D202, V203, H205, Q236, E239, W241, S274, C275, K276, F284, C287, V288, K289, N290, P291, E292 и D293 - эпитоп AB79. Любое антитело, которое взаимодействует с этими остатками, также находит применение в терапевтических способах и стандартных дозировках согласно данному изобретению.

[00149] В некоторых вариантах осуществления, анти-CD38 антитела согласно данному изобретению взаимодействуют с CD38 по ряду аминокислотных остатков, включая K121, F135, Q139, D141, M142, E239, W241, S274, C275, K276, F284, V288, K289, N290, P291, E292 и D293. Следует отметить, что эти остатки идентичны как у человека, так и у яванской макаки, за исключением того, что S274 в сущности является F274 у яванской макаки. Эти остатки могут представлять собой иммунодоминантный эпитоп и (или) остатки в зоне действия специфического антигенсвязывающего пептида.

[00150] В некоторых вариантах осуществления, анти-CD38 антитело содержит тяжелую цепь, содержащую следующие аминокислотные последовательности CDR: GFTFDDYG (SEQ ID NO: 3; HCDR1 AB79), ISWNGGKT (SEQ ID NO: 4; HCDR2 AB79) и ARGSLFHDSSGFYFGH (SEQ ID NO: 5; HCDR3 AB79). В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит легкую цепь, содержащую следующие аминокислотные последовательности CDR: SSNIGDNY (SEQ ID NO: 6; LCDR1 AB79), RDS (SEQ ID NO: 7; LCDR2 AB79) и QSYDSSLSGS (SEQ ID NO: 8; LCDR3 AB79). В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит тяжелую цепь, содержащую следующие аминокислотные последовательности CDR: GFTFDDYG (SEQ ID NO: 3; HCDR1 AB79), ISWNGGKT (SEQ ID NO: 4; HCDR2 AB79), ARGSLFHDSSGFYFGH (SEQ ID NO: 5; HCDR3 AB79) и легкую цепь, содержащую следующие аминокислотные последовательности CDR: SSNIGDNY (SEQ ID NO: 6; LCDR1 AB79), RDS (SEQ ID NO: 7; LCDR2 AB79) и QSYDSSLSGS (SEQ ID NO: 8; LCDR3 AB79). В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 9.

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSDISWNGGKTHYVDSVKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSLFHDSSGFYFGHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA (SEQ ID NO: 9).

[00151] В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 10.

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGDNYVSWYQQLPGTAPKLLIYRDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEEL (SEQ ID NO: 10).

[00152] В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность VH области SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность VL области SEQ ID NO: 10.

[00153] Как будет понятно специалистам в данной области, вариабельные тяжелые и легкие цепи могут быть присоединены к последовательностям константного домена человеческого IgG, обычно IgG1, IgG2 или IgG4.

[00154] В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи (HC) SEQ ID NO: 11.

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSDISWNGGKTHYVDSVKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSLFHDSSGFYFGHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).

[00155] В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит аминокислотную последовательность легкой цепи (LC) SEQ ID NO: 12.

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGDNYVSWYQQLPGTAPKLLIYRDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 12).

В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит аминокислотную последовательность HC SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность LC SEQ ID NO: 12.

[00156] Данное изобретение охватывает антитела, которые связываются с CD38 как человека, так и яванец, и взаимодействуют по меньшей мере с 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% данных аминокислотных остатков.

[00157] В некоторых вариантах осуществления, данные антитела являются полноразмерными. Под «полноразмерным антителом» в данном документе подразумевается структура, которая составляет природную биологическую форму антитела, включая вариабельные и константные области, включая одну или несколько модификаций, как описано в данном документе.

[00158] В другом варианте, антитела могут быть разнообразными структурами, включая, но не ограничиваясь следующими: фрагменты антител, моноклональные антитела, биспецифические антитела, миниантитела, доменные антитела, синтетические антитела (иногда именуемые в данном документе «миметиками антител»), химерные антитела, гуманизированные антитела, слияния антител (иногда именуемые «конъюгатами антител»), и фрагментами каждого, соответственно. Конкретные фрагменты антител включают, но не ограничиваются следующими: (i) Fab-фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iii) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного антитела; (iv) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из одного вариабельного домена; (v) изолированные CDR-области; (vi) F(ab')2-фрагменты - бивалентный фрагмент, содержащий два связанных Fab-фрагмента; (vii) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), где домен VH и домен VL связаны пептидным линкером, который позволяет двум доменам связываться, образуя участок связывания антигена (Bird et al. (1988) Science 242: 423-426, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883); (viii) биспецифичные одноцепочечные Fv (WO 03/11161) и (ix) «диатела» или «триотела» - мультивалентные или полиспецифичные фрагменты, сконструированные слиянием генов (Tomlinson et al. (2000) Methods Enzymol. 326: 461-479; WO94/13804; Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448).

Модификации антител

[00159] Данное изобретение также относится к вариантам анти-CD38 антител. То есть существует ряд модификаций, которые могут быть внесены в антитела согласно данному изобретению, включая, но не ограничиваясь следующими: аминокислотные модификации в CDR (созревание аффинности), аминокислотные модификации в Fc-фрагменте, варианты гликозилирования, ковалентные модификации других типов, и т.п.

[00160] Термин «вариант» означает полипептид, который отличается от родительского полипептида. Аминокислотные варианты могут включать замены, вставки и делеции аминокислот. В общем, варианты могут включать в себя любое количество модификаций, пока все еще присутствует функция белка, как описано в данном документе. То есть в случае аминокислотных вариантов, сгенерированных с помощью CDR от, например, AB79, антитело должно все так же специфически связываться с CD38 человека и яванской макаки, и не связываться с эритроцитами, или иметь пониженную или менее чем 10%-ю, менее чем 20%-ю, менее чем 30%-ю, менее чем 40%-ю, менее чем 50%-ю способность к связыванию с эритроцитами по сравнению с даратумумабом. Термин «вариант Fc-фрагмента» означает последовательность Fc, которая отличается от последовательности Fc дикого типа или родительской последовательности Fc благодаря по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Вариант Fc может относиться к самому полипептиду Fc, композициям, содержащим вариант полипептида Fc, или к аминокислотной последовательности. Если аминокислотные варианты генерируются, например, с Fc-фрагментом, антитела-варианты должны сохранять требуемые функции для конкретного применения или показания антитела. Например, можно использовать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен, например, замены 1-10, 1-5, 1-4, 1-3 и 1-2. Подходящие модификации могут быть осуществлены в одном или нескольких положениях, как это в общем описано, например, в патентах США № 6086875; 6737056; 7317091; 7670600; 8084582; 8188231; 8367805; 8937158; а также9040041; все из которых прямо включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме и, в частности, касаются конкретных аминокислотных замен, которые увеличивают связывание с Fc-рецепторами.

[00161] Например, может быть целесообразным иметь от 1 до 5 модификаций в Fc-фрагменте белков дикого типа или сконструированных белков, а также от 1 до 5 модификаций в Fv-фрагменте. Вариант полипептидной последовательности предпочтительно будет иметь идентичность с родительскими последовательностями по меньшей мере около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (например, вариабельные области, константные области и (или) последовательности тяжелой и легкой цепи для AB79).

[00162] Термин «замена аминокислоты» означает замену аминокислоты в определенном положении в родительской полипептидной последовательности другой аминокислотой. Например, замена S100A относится к варианту полипептида, в котором серин в положении 100 заменен аланином. Термин «вставка аминокислоты» означает добавление аминокислоты в определенном положении в родительской полипептидной последовательности. Термин «делеция аминокислоты» означает удаление аминокислоты в определенном положении в родительской полипептидной последовательности.

[00163] Термины «родительское антитело» и «антитело-предшественник» означают немодифицированное антитело, которое впоследствии модифицируют для получения варианта. В одном варианте осуществления, родительское антитело в данном документе представляет собой AB79. Родительский полипептид может означать сам полипептид, композиции, которые содержат родительский полипептид, или аминокислотную последовательность, которая его кодирует. Соответственно, термин «родительский полипептид Fc» означает полипептид Fc, который модифицирован для получения варианта.

[00164] Термины «дикий тип», «ДТ», и «нативный» означают аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая встречается в природе, включая аллельные вариации. Белок, полипептид, антитело, иммуноглобулин, IgG и т.д. дикого типа (ДТ) имеет аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая не была намеренно модифицирована.

[00165] В некоторых вариантах осуществления, одну или большее количество аминокислотных модификаций вносят в одну или большее количество CDR анти-CD38 антител. Как правило, только 1, 2 или 3 аминокислоты заменены в любой отдельной CDR и, как правило, не более чем 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 замен осуществлены в наборе CDR. Однако следует понимать, что любая комбинация без замен, с 1, 2 или 3 заменами в любой CDR может независимо и необязательно сочетаться с любой другой заменой.

[00166] Аминокислотные модификации в CDR иногда называют «созреванием аффинности». Антитело с «созревшей аффинностью» представляет собой антитело, имеющее одно или большее количество изменений в одной или большем количестве CDR, что приводит к улучшению аффинности антитела к антигену по сравнению с родительским антителом, которое не обладает этими изменениями. В некоторых случаях может быть целесообразным уменьшить аффинность антитела к его антигену.

[00167] Созревание аффинности можно осуществлять для увеличения аффинности связывания антитела с антигеном по меньшей мере на около 10% до 50%, 100%, 150% или более, или на от 1 до 5 раз по сравнению с «родительским» антителом. Предпочтительные антитела с созревшей аффинностью будут иметь наномолярную или даже пикомолярную аффинность к антигену. Антитела с созревшей аффинностью получают известными способами (например, Marks et al. (1992) Biotechnol. 10: 779-783; Barbas et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813; Shier et al. (1995) Gene 169: 147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154 (7): 3310-9; and Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896).

[00168] В другом варианте, аминокислотные модификации могут быть осуществлены в одной или большем количестве CDR в антителах согласно данному изобретению, которые являются «молчащими» - например, которые существенно не изменяют аффинность антитела к антигену. Это может быть сделано по ряду причин, включая оптимизацию экспрессии (как это может быть осуществлено для нуклеиновых кислот, кодирующих антитела согласно данному изобретению).

[00169] Таким образом, в определение CDR и антител согласно данному изобретению включены варианты CDR и антител; то есть антитела согласно данному изобретению могут включать модификации аминокислот в одной или большем количестве CDR в AB79. Кроме того, как указано ниже, модификации аминокислот также могут быть независимо и необязательно осуществлены в любой области за пределами CDR, включая каркасные и константные области.

[00170] В некоторых вариантах осуществления описаны варианты антител АВ79, которые специфичны для CD38 человека (SEQ ID NO: 1) и CD38 яванской макаки (SEQ ID NO: 2). Данное антитело состоит из шести CDR, где каждая CDR данного антитела может отличаться от SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и (или) SEQ ID NO: 8 заменой 0, 1, 2 или более аминокислот без существенного изменения или ингибирования функции.

[00171] В дополнение к описанным выше модификациям могут быть осуществлены другие модификации. Например, молекулы могут быть стабилизированы путем встраивания дисульфидных мостиков, соединяющих VH и VL домены (Reiter et al. (1996) Nature Biotech. 14: 1239-1245). Кроме того, существует множество ковалентных модификаций антител, которые могут быть осуществлены, как описано ниже.

[00172] Ковалентные модификации антител включены в объем данного изобретения и, как правило, но не всегда, осуществляются посттрансляционно. Например, несколько типов ковалентных модификаций антитела вводятся в молекулу путем взаимодействия специфических аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или N- либо C-концевыми остатками.

[00173] В некоторых вариантах осуществления, анти-CD38 антитело согласно данному изобретению специфически связывается с одним или несколькими остатками или областями в CD38, но также не реагирует перекрестно с другими белками, гомологичными CD38, такими как BST-1 (антиген стромальных клеток костного мозга 1) и Мо5, также именуемый CD157.

[00174] Как правило, отсутствие перекрестной реактивности означает менее чем около 5% относительного конкурентного ингибирования между молекулами при оценке с помощью твердофазного ИФА и (или) проточного цитометрического анализа с использованием достаточных количеств молекул в подходящих условиях анализа.

Ингибирование активности CD38 и снижение побочных эффектов

[00175] Раскрытые антитела могут найти применение для блокирования взаимодействия лиганд-рецептор или ингибирования взаимодействия рецепторного компонента. Анти-CD38 антитела согласно данному изобретению могут быть «блокирующими» или «нейтрализующими». Термин «нейтрализующее антитело» относится к антителу, связывание которого с CD38 приводит к ингибированию биологической активности CD38, например, его способности взаимодействовать с лигандами, ферментативной активности, сигнальной способности и, в частности, его способности вызывать активацию лимфоцитов. Ингибирование биологической активности CD38 можно оценить с помощью одного или нескольких стандартных анализов in vitro или in vivo, известных в данной области техники.

[00176] Термины «ингибирует связывание» и «блокирует связывание» (например, применительно к ингибированию/блокированию связывания CD38 антитела с CD38) охватывают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. Ингибирование/блокирование связывания CD38 антитела с CD38 может снижать или изменять нормальный уровень или тип клеточной передачи сигналов, происходящий, когда CD38 антитело связывается с CD38 без ингибирования или блокирования. Предполагается также, что ингибирование и блокирование включают любое измеримое снижение аффинности связывания CD38 антитела с CD38 при контакте с анти-CD38 антителом по сравнению с лигандом, не контактирующим с анти-CD38 антителом, например блокирование связывания CD38 антитела с CD38 по меньшей мере примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 100%.

[00177] Раскрытые анти-CD38 антитела также могут ингибировать рост клеток. Термин «ингибирует рост» относится к любому измеримому снижению роста клеток при контакте с анти-CD38 антителом по сравнению с ростом тех же клеток, которые не контактируют с анти-CD38 антителом, например, ингибирование роста культуры клеток по меньшей мере примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 100%.

[00178] В некоторых вариантах раскрытые анти-CD38 антитела способны деплетировать популяции активированных лимфоцитов и плазматических клеток. Термин «деплетирование популяции» в данном контексте означает измеримое снижение сывороточных уровней активированных лимфоцитов и (или) плазматических клеток у субъекта по сравнению с интактными субъектами. Как правило, наблюдаются деплетирования популяций по меньшей мере примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 100%. Как продемонстрировано ниже в Примерах, одним конкретным преимуществом, которым обладают антитела согласно данному изобретению, является восстанавливаемость этих клеток после дозирования; то есть, как известно для некоторых видов лечения (например, с использованием анти-CD20 антител), деплетирование популяции клеток может продолжаться в течение длительных периодов времени, вызывая нежелательные побочные эффекты. Как продемонстрировано в данном документе, эффекты на активированные лимфоциты и (или) плазматические клетки являются восстанавливаемыми.

[00179] Анти-CD38 антитела согласно данному изобретению позволяют снизить побочные эффекты по сравнению с анти-CD38 антителами предшествующего уровня техники. В некоторых вариантах AB79 не вызывает НЯВЛ. В некоторых вариантах осуществления, AB79 позволяет снизить НЯВЛ по сравнению с другими анти-CD38 антителами, такими как MOR202. НЯВЛ обычно обозначаются степенями 1, 2, 3, 4 и 5, причем степень 1 - наименее тяжелая, а степень 5 - наиболее тяжелая. На основе рекомендаций FDA и других рекомендаций касательно Общих терминологических критериев к нежелательным явлениям (ОТКНЯ, англ. «CTCAE») согласно стандартов для онкологических препаратов (см., например, https://evs.nci.nih.gov/ftp1/CTCAE/CTCAE_4.03_2010-06-14_QuickReference_5×7.pdf; а также https://ctep.cancer.gov/protocoldevelopment/electronic_applications/ctc.htm; и Nilsson and Koke (2001) Drug Inform. J. 35: 1289-1299), такие степени обычно определяются следующим образом. Степень 1 - легкая: бессимптомная или с легкими симптомами; только клинические или диагностические наблюдения; вмешательство не продемонстрировано. Степень 2 - умеренная: продемонстрировано минимальное, местное или неинвазивное вмешательство; соответствующие возрасту ограничения в инструментальной ежедневной активности. Степень 3 - тяжелая или существенная с медицинской точки зрения, но не угрожающая жизни: продемонстрирована госпитализация или продление срока госпитализации; потеря трудоспособности; ограничения в ежедневной активности по самообслуживанию. Степень 4 - угрожающее жизни последствие: продемонстрировано срочное вмешательство. Степень 5 - летальный исход, связанный с НЯ.

[00180] В некоторых вариантах осуществления, AB79 позволяет снизить степень НЯВЛ по сравнению с другими анти-CD38 антителами, такими как MOR202. В некоторых вариантах осуществления, AB79 позволяет снизить степень НЯВЛ по сравнению с другими анти-CD38 антителами со степени 5 до степени 4. В некоторых вариантах осуществления, AB79 позволяет снизить степень НЯВЛ по сравнению с другими анти-CD38 антителами со степени 4 до степени 3. В некоторых вариантах осуществления, AB79 позволяет снизить степень НЯВЛ по сравнению с другими анти-CD38 антителами со степени 3 до степени 2. В некоторых вариантах осуществления, AB79 позволяет снизить степень НЯВЛ по сравнению с другими анти-CD38 антителами со степени 2 до степени 1.

[00181] В некоторых вариантах осуществления, AB79 позволяет снизить степень одного или нескольких НЯВЛ, выбранных из группы, состоящей из анемии (включая гемолитическую анемию), тромбоцитопении, утомляемости, инфузионных реакций (ИР), лейкопении, лимфопении и тошноты. В некоторых вариантах осуществления, AB79 позволяет снизить частоту возникновения одного или нескольких НЯВЛ, выбранных из группы, состоящей из анемии (включая гемолитическую анемию), тромбоцитопении, утомляемости, инфузионных реакций (ИР), лейкопении, лимфопении и тошноты.

[00182] В некоторых вариантах осуществления используется диагностический тест для определения наличия и (или) степени анемии, включая гемолитическую анемию. Диагностические тесты на анемию, включая гемолитическую анемию, включают измерение уровня гемоглобина. Как правило, уровни гемоглобина интерпретируются следующим образом: (i) очень легкая/отсутствующая анемия: ≥12,0 г/дл; (ii) легкая: 10-12 г/дл; (iii) умеренная: 8-10 г/дл; (iv) тяжелая: 6-8 г/дл и (v) очень тяжелая: ≤6 г/дл. Другие диагностические тесты на анемию, включая гемолитическую анемию, включают измерение уровня гаптоглобина. Как правило, уровень гаптоглобина ≤25 мг/дл свидетельствует о наличии анемии, включая гемолитическую анемию. Другие диагностические тесты включают в себя прямой антиглобулиновый тест (ПАТ) (также называемый прямым тестом Кумбса), который используется для определения того, покрыты ли эритроциты in vivo иммуноглобулином, комплементом или и тем, и другим.

[00183] В некоторых вариантах осуществления используется диагностический тест для определения наличия и (или) степени тромбоцитопении. Как правило, диагностический тест на тромбоцитопению включает измерение количества тромбоцитов на микролитр (мкл) крови. Обычно на мкл крови приходится 150×10³-450×10³ тромбоцитов. Как правило, тромбоцитопения диагностируется при <150×10³ тромбоцитов на мкл крови. Легкая тромбоцитопения, как правило, диагностируется при 70-150×10³ тромбоцитов на мкл крови. Умеренная тромбоцитопения обычно диагностируется при 20-70×10³ тромбоцитов на мкл. Тяжелая тромбоцитопения обычно диагностируется при <20×10³ тромбоцитов на мкл крови.

Показания по заболеваниям

[00184] Антитела, способы и единицы дозировки согласно данному изобретению находят использование во множестве применений, включая лечение или уменьшение интенсивности заболеваний, связанных с CD38.

[00185] CD38 экспрессируется в незрелых гемопоэтических клетках, подавляется в зрелых клетках и повторно экспрессируется на высоком уровне в активированных лимфоцитах и плазматических клетках. Например, высокая экспрессия CD38 наблюдается в активированных B-клетках, плазматических клетках, активированных CD4+ T-клетках, активированных CD8+ T-клетках, NK-клетках, NKT-клетках, зрелых дендритных клетках (ДК) и активированных моноцитах. Определенные патологические состояния связаны с клетками, которые экспрессируют CD38, и определенные патологические состояния связаны с избыточной экспрессией, высокоплотной экспрессией или повышенной экспрессией CD38 на поверхностях клеток. Экспрессирует клеточная популяция CD38 или нет, можно определить способами, известными в данной области техники, например, определение методом проточной цитометрии процентного содержания в данной популяции клеток, меченных антителом, которое специфически связывает CD38, или иммуногистохимические анализы, как в общем описано ниже для диагностических применений. Например, популяция клеток, в которой экспрессия CD38 обнаруживается примерно в 10-30% клеток, может рассматриваться как имеющая слабую положительность к CD38; а популяция клеток, в которых экспрессия CD38 обнаруживается в более чем около 30% клеток, может рассматриваться как определенно положительная к CD38 (как в Jackson et al. (1988) Clin. Exp. Immunol. 72: 351-356), хотя другие критерии могут быть использованы для определения того, экспрессирует ли популяция клеток CD38. Плотность экспрессии на поверхностях клеток может быть определена с использованием методов, известных в данной области техники, таких как, например, проточно-цитометрическое измерение средней интенсивности флуоресценции клеток, которые были флуоресцентно мечены с использованием антител, специфически связывающих CD38.

[00186] Терапевтические анти-CD38 антитела согласно данному изобретению связываются с CD38-положительными клетками, что приводит к деплетированию популяции этих клеток посредством множества механизмов действия, включая как путь АЗКЦ, так и путь КЗЦ.

[00187] В данной области техники известно, что определенные патологические состояния связаны с клетками, которые экспрессируют CD38, и что определенные патологические состояния связаны с избыточной экспрессией, высокоплотной экспрессией или повышенной экспрессией CD38 на поверхностях клеток. Экспрессирует клеточная популяция CD38 или нет, можно определить способами, известными в данной области техники, например, определение методом проточной цитометрии процентного содержания в данной популяции клеток, меченных антителом, которое специфически связывает CD38, или иммуногистохимические анализы, как в общем описано ниже для диагностических применений. Например, популяция клеток, в которой экспрессия CD38 обнаруживается примерно в 10-30% клеток, может рассматриваться как имеющая слабую положительность к CD38; а популяция клеток, в которых экспрессия CD38 обнаруживается в более чем около 30% клеток, может рассматриваться как определенно положительная к CD38 (как в Jackson et al. (1988) Clin. Exp. Immunol. 72: 351-356), хотя другие критерии могут быть использованы для определения того, экспрессирует ли популяция клеток CD38. Плотность экспрессии на поверхностях клеток может быть определена с использованием методов, известных в данной области техники, таких как, например, проточно-цитометрическое измерение средней интенсивности флуоресценции клеток, которые были флуоресцентно мечены с использованием антител, специфически связывающих CD38.

[00188] В одном аспекте данное изобретение относится к способам лечения патологического состояния, связанного с пролиферацией клеток, экспрессирующих CD38, включающим введение пациенту фармацевтически эффективного количества раскрытого антитела. В некоторых вариантах осуществления, патологическое состояние представляет собой рак, и в конкретных вариантах осуществления рак представляет собой гематологический рак. В некоторых вариантах осуществления, патологическое состояние представляет собой множественную миелому, хронический лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, а также плазмаклеточный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, В-клеточную лимфому или лимфому Беркитта.

[00189] В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние представляет собой множественную миелому, и терапевтическое анти-CD38 антитело не связывается или имеет пониженное связывание с эритроцитами человека по сравнению с даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления, патологическое состояние представляет собой множественную миелому, и терапевтическое анти-CD38 антитело не связывается или имеет пониженное связывание с эритроцитами яванской макаки по сравнению с даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления, патологическое состояние представляет собой множественную миелому, и терапевтическое анти-CD38 антитело не связывается или имеет пониженное связывание с эритроцитами человека или яванской макаки.

[00190] ХЛЛ является наиболее распространенным лейкозом среди взрослых людей в западном мире. ХЛЛ заключается в клональной экспансии лимфоцитов, которые выглядят зрелыми, вовлекающей лимфатические узлы и другие лимфоидные ткани с прогрессирующей инфильтрацией костного мозга и присутствием в периферической крови. Большинство случаев представлены B-клеточной формой (B-ХЛЛ).

В-клеточная форма хронического лимфоцитарного лейкоза (B-ХЛЛ)

[00191] B-ХЛЛ является неизлечимым заболеванием, характеризующимся прогрессирующим увеличением количества анергических моноклональных клеток В-лимфоцитарного происхождения, которые продолжительно накапливаются в костном мозге и периферической крови в течение многих лет. Экспрессия CD38 рассматривается как независимый отрицательный прогностический фактор для B-ХЛЛ (Hamblin et al. (2002) Blood 99: 1023-9).

[00192] B-ХЛЛ характеризуется двумя подтипами - индолентным и агрессивным. Эти клинические фенотипы коррелируют с наличием или отсутствием соматических мутаций в гене вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (IgVH). В рамках данного документа индолентный B-ХЛЛ относится к патологическому нарушению у субъекта, имеющего мутированный ген IgVH и (или) имеющего один или несколько клинических фенотипов, связанных с индолентным B-ХЛЛ. В рамках данного документа выражение «агрессивный B-ХЛЛ» относится к патологическому нарушению у субъекта, имеющего немутированный ген IgVH (или) имеющего один или несколько клинических фенотипов, связанных с агрессивным B-ХЛЛ.

[00193] Существующая на сегодняшний день стандартная терапия B-ХЛЛ является паллиативной и в основном проводится с использованием цитостатического препарата хлорамбуцил или флударабин. Когда возникают рецидивы, часто предпринимается комбинированная терапия с использованием флударабина, циклофосфамида в сочетании с ритуксимабом (моноклональным антителом против CD20) или алемтузумабом (моноклональным антителом против CD52). В одном исследовании 35 пациентам с рецидивирующей или рефрактерной агрессивной В-клеточной НХЛ была проведена высокодозная химиотерапия (ВДХ) с последующим введением ритуксимаба - 375 мг/м² в неделю на протяжении 4-х доз, начиная с 40-го дня, и повторяли еще четыре дозы, начиная со 180-го дня. Инфузии ритуксимаба хорошо переносились, только с одним случаем инфузионной токсичности 3/4 степени. Неожиданным нежелательным явлением, отмеченным в этом исследовании, была отсроченная нейтропения более чем у половины пациентов (19/35 пациентов с 46 эпизодами нейтропении 3 или 4 степени; Kosmas et al. (2002) Leukemia 16: 2004-2015, который можно найти в Интернете по адресу: https://www.nature.com/articles/2402639). В другом исследовании шесть пациентов получали алемтузумаб путем внутривенной инфузии через день три раза в неделю в течение 12 недель. Доза постепенно увеличивалась ежедневно (3, 10, а затем 30 мг), пока пациент это переносил. Основными НЯВЛ были гематологические нежелательный явления - анемия, нейтропения (каждая у 6/6 пациентов) и тромбоцитопения (5/6 пациентов) (Ishizawa et al. (2017) Jpn. J. Clin. Oncol. 47(1): 54-60). Таким образом, существует критическая неудовлетворенная медицинская потребность в способах лечения B-ХЛЛ со сниженными гематологическими нежелательными явлениями. В некоторых вариантах осуществления предлагаются способы лечения B-ХЛЛ с использованием раскрытых анти-CD38 антител и, как продемонстрировано ниже, это может быть выполнено с использованием комбинированной терапии, включающей необязательно и независимо любое из вышеуказанных лекарственных средств.

Множественная миелома (ММ)

[00194] Множественная миелома представляет собой злокачественное заболевание клеток В-лимфоцитарного происхождения, характеризующееся неопластической пролиферацией плазматических клеток в костном мозге и (или) экстрамедуллярных участках. Пролиферация клеток миеломы вызывает различные эффекты, в том числе литические поражения кости (отверстия), повреждение органов, анемию (снижение числа эритроцитов), выработку аномальных белков (с сопутствующим повреждением почек, нервов и других органов), снижение функций иммунной системы, почечную недостаточность и повышенный уровень кальция в крови (гиперкальциемию). В настоящее время варианты лечения включают химиотерапию, предпочтительно связанную, когда это возможно, с трансплантацией аутологичных стволовых клеток (ТАСК). Эти схемы лечения имеют умеренные уровни клинического ответа на терапию. Однако наблюдаются только незначительные изменения в общей выживаемости, и медиана выживаемости составляет приблизительно 3 года. Таким образом, существует острая неудовлетворенная медицинская потребность в способах лечения множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления предлагаются способы лечения множественной миеломы с использованием раскрытых антител.

[00195] Впервые выявленная ММ (ВВММ) отличается от рецидивирующей ММ или рецидивирующий и рефрактерный ММ (РРММ). Рецидивирующая ММ рассматривается как повторное проявление заболевания после предшествующего клинического ответа на терапию и определяется на основании объективных лабораторных и рентгенологических критериев: увеличение уровня моноклонального белка сыворотки или мочи (М-белка) на ≥25% или разница в ≥25% между вовлеченными и невовлеченными свободными легкими цепями в сыворотке относительно их минимальных уровней, соответственно, либо развитие новых плазмоцитом или гиперкальциемии. У пациентов с несекреторным течением заболеванием рецидив определяется как увеличение количества плазматических клеток костного мозга. Как правило, показанием к лечению рецидива является либо появление, либо повторное появление одного или нескольких симптомов ММ, описанных выше, либо быстрый и последовательный биохимический рецидив. Рецидивирующая/рефрактерная ММ (РРММ) определяется как заболевание, которое становится невосприимчивым или прогрессирующим при терапии или в течение 60 дней после последнего лечения у пациентов, которые достигли минимального ответа (МО) или более значительного клинического ответа на предшествующую терапию (Sonneveld and Broijl (2016) Haematologica 101 (4): 396-406).

Моноклональная гаммапатия неясного генеза (МГНГ) и тлеющая множественная миелома (ТММ)

[00196] Моноклональная гаммапатия неясного генеза (МГНГ) и тлеющая множественная миелома (ТММ) представляют собой бессимптомные предзлокачественные нарушения, характеризующиеся пролиферацией моноклональных плазматических клеток в костном мозге и отсутствием повреждения органов-мишеней.

[00197] Тлеющая множественная миелома (ТММ) является бессимптомным пролиферативным нарушением плазматических клеток с высоким риском прогрессирования в симптоматическую или активную множественную миелому (Kyle et al. (2007) N. Engl. J. Med. 356(25): 2582-2590). Международные согласованные критерии, определяющие ТММ, были приняты в 2003 году и подразумевают уровень М-белка у пациента >30 г/л и (или) уровень клональных плазматических клеток костного мозга >10% (Internat. Myeloma Working Group (2003) Br. J. Haematol. 121: 749-757). У пациентов не должно быть никаких нарушений функции органов или сопутствующих тканей, таких как поражения или симптомы костной ткани. Недавние исследования выявили две подгруппы ТММ: i) пациенты с развивающейся болезнью и ii) пациенты с не развивающейся болезнью (Internat. Myeloma Working Group (2003) Br. J. Haematol. 121: 749-757).

[00198] ТММ напоминает моноклональную гаммапатию неясного генеза (МГНГ), поскольку повреждение органа-мишени отсутствует (Kyle et al. (2007) N. Engl. J. Med. 356(25): 2582-2590). Тем не менее, клинически ТММ с гораздо большей вероятностью прогрессирует в активную множественную миелому или амилоидоз через 20 лет (78% вероятности для ТММ против 21% для МГНГ) (Kyle et al. (2007) N. Engl. J. Med. 356(25): 2582-2590).

[00199] Международные согласованные критерии, определяющие МГНГ, подразумевают уровень М-белка у пациента <30 г/л, уровень плазматических клеток костного мозга <10% и отсутствие нарушения функции органов или сопутствующих тканей, включая поражения или симптомы костной ткани (Internat. Myeloma Working Group (2003) Br. J. Haematol. 121: 749-757).

Патологические состояния, связанные с CD38

[00200] Антитела, способы и единицы дозировки согласно данному изобретению находят использование во множестве применений, включая лечение или уменьшение интенсивности заболеваний, связанных с CD38, таких как заболевания и патологические состояния, связанные с воспалением и иммунопатологиями, в частности заболевания, связанные с активированными лимфоцитами. Анти-CD38 антитела согласно данному изобретению связываются с CD38-положительными клетками, что приводит к деплетированию популяции этих клеток, таких как активированные лимфоциты, посредством множества механизмов действия, включая как путь АЗКЦ, так и путь КЗЦ.

[00201] Таким образом, любое аутоиммунное заболевание, при котором проявляется либо повышенная экспрессия CD38, либо увеличенное количество клеток, экспрессирующих CD38, в качестве компонента заболевания, можно лечить с использованием антител согласно данному изобретению. Они включают, но не ограничиваются следующими: отторжение аллогенных островковых трансплантатов, круговая алопеция, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунная болезнь Аддисона, антинейтрофильные цитоплазматические аутоантитела (АНЦА), аутоиммунные заболевания надпочечников, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный миокардит, аутоиммунная нейтропения, аутоиммунные оофорит и орхит, аутоиммунная тромбоцитопения, аутоиммунная крапивница, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатия, синдром Каслмана, целиакийный дерматит, синдром хронической усталости (иммунная дисфункция), хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, синдром Черджа-Стросс, рубцовой пемфигоид, лимитированная склеродермия (CREST-синдром), болезнь холодовых агглютининов, болезнь Крона, дерматомиозит, дискоидная волчанка, первичная криоглобулинемия смешанного типа эссенциальная смешанная криоглобулинемия, дефицит фактора VIII, фибромиалгия, фибромиозит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, синдром Гудпасчера, болезнь «трансплантат против хозяина» (БТПХ), тиреоидит Хашимото, гемофилия А, идиопатический легочный фиброз, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), IgA-ассоциированная нейропатия, IgM-ассоциированная полинейропатия, иммуноопосредованная тромбоцитопения, ювенильный артрит, болезнь Кавасаки, лишай Вильсона, системная красная волчанка, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз, сахарный диабет 1-го типа, миастения гравис, пузырчатка обыкновенная, пернициозная анемия, узелковый полиартериит, полихондрия, полиэндокринные синдромы, ревматическая полимиалгия, полимиозит и дерматомиозит, первичная агаммаглобулинемия, первичный билиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, синдром Рейно, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермия, синдром Шегрена, отторжение трансплантата солидного органа, синдром мышечной скованности, системная красная волчанка, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, тромботическая тромбоцитопения пурпура, язвенный колит, увеит, васкулиты, такие как герпетиформный дерматит, витилиго и гранулематоз Вегенера.

[00202] Особое применение в некоторых вариантах осуществления представляет использование антител согласно данному изобретению для применения при диагностике и (или) лечении ряда заболеваний, включая, но не ограничиваясь аутоиммунными заболеваниями, которые включают, но не ограничиваются следующими: системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит (РА), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), язвенный колит и болезнь «трансплантат против хозяина».

[00203] Таким образом, например, можно лечить пациентов с высоким содержанием плазматических клеток, таких как пациенты с СКВ, у которых обнаруживаются высокие уровни плазматических клеток, а также пациенты с РА, которые, как продемонстрировано, не реагируют на терапию на основе CD20.

Композиции антител для введения in vivo

[00204] Лекарственные формы антител, используемые в соответствии с данным изобретением, готовят для хранения с помощью смешивания антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980) Osol, A. Ed.) в форме лиофилизатов или водных растворов.

[00205] Лекарственные формы согласно данному документу также могут содержать более одного активного соединения, которое необходимо для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно с комплементарными действиями, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Например, целесообразным может быть придание антителам других специфичностей. В другом варианте или в качестве дополнения, композиция может содержать цитотоксический агент, цитокин, ингибитор роста и (или) малую молекулу-антагонист. Такие молекулы подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемой цели.

Подкожное введение

[00206] Данное изобретение основано на неожиданном открытии того, что описанные в данном документе анти-CD38 антитела, такие как АВ79, можно вводить в достаточно низких дозах, которые являются терапевтически эффективными, что позволяет подкожно вводить небольшие объемы жидких лекарственных форм. Подкожное введение представляет собой минимально инвазивный способ введения и считается наиболее универсальным и, следовательно, более целесообразным способом введения, который можно использовать для краткосрочной и долгосрочной терапии. В некоторых вариантах осуществления, подкожное введение может быть выполнено путем инъекции. В некоторых вариантах осуществления, место инъекции или устройства можно поочередно менять, когда требуется несколько инъекций или устройств.

[00207] Соответственно, лекарственные формы для подкожного введения пациенту намного проще вводить самостоятельно, особенно потому, что может потребоваться принимать лекарственную форму регулярно в течение всей жизни пациента (например, начиная с первого года жизни ребенка). Кроме того, простота и скорость подкожного введения улучшают соблюдение больным режима и схемы лечения, и обеспечивают более быстрый доступ к лекарствам, когда это необходимо. Таким образом, лекарственные формы для подкожного введения анти-CD38 антител, представленные в данном документе, обеспечивают существенное преимущество по сравнению с предшествующим уровнем техники и удовлетворяют определенные неудовлетворенные ранее потребности.

[00208] В некоторых вариантах осуществления, антитела согласно данному изобретению вводят субъекту в соответствии с известными способами подкожным путем. В некоторых вариантах осуществления, антитела согласно данному изобретению можно вводить путем подкожной инъекции. В конкретных вариантах осуществления, лекарственную форму вводят подкожно в одно и то же место на теле пациента (например, вводят в плечо, переднюю поверхность бедра, нижнюю часть живота или верхнюю часть спины) для повторных или непрерывных инъекций. В других вариантах осуществления, лекарственную форму для подкожного введения вводят путем подкожной инъекции в другое место на теле пациента или поочередно меняют место введения. Может применяться однократное или многократное введение лекарственных форм.

[00209] В некоторых вариантах осуществления, описанные в данном документе стандартные лекарственные формы для подкожного введения могут быть использованы для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления, описанные в данном документе стандартные лекарственные формы для подкожного введения могут быть использованы для лечения гематологического рака. В некоторых вариантах осуществления, описанные в данном документе стандартные лекарственные формы для подкожного введения могут быть использованы для лечения множественной миеломы.

[00210] В некоторых вариантах осуществления, антитела согласно данному изобретению, которые временно связывают эритроциты человека, имеют повышенную биодоступность. В некоторых вариантах осуществления, биодоступность антител согласно данному изобретению, которые временно связывают эритроциты, повышается на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, или более. В некоторых вариантах осуществления, биодоступность антител согласно данному изобретению, которые временно связывают эритроциты человека, составляет 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250% или 300%, или более.

[00211] В некоторых вариантах осуществления, повышение биодоступности обеспечивает подкожное введение. В некоторых вариантах осуществления, повышение биодоступности связано с тем, что антитела согласно данному изобретению временно связываются с эритроцитами. В некоторых вариантах осуществления, повышение биодоступности у человека обусловлено тем, что антитела согласно данному изобретению по-разному связываются с эритроцитами человека.

[00212] В некоторых вариантах осуществления, антитела согласно данному изобретению приводят к деплетированию популяции NK-клеток, B-клеток и (или) T-клеток. В некоторых вариантах осуществления, антитела согласно данному изобретению позволяют повысить деплетирование популяции NK-клеток по сравнению с деплетированием популяций B-клеток или T-клеток. В некоторых вариантах осуществления, антитела согласно данному изобретению позволяют повысить деплетирование популяции NK-клеток по сравнению с B-клетками, а также повысить деплетирование популяции NK-клеток по сравнению с T-клетками. В некоторых вариантах осуществления, антитела согласно данному изобретению позволяют повысить деплетирование популяции NK-клеток по сравнению с B-клетками, а также повысить деплетирование популяции B-клеток по сравнению с T-клетками. В некоторых вариантах осуществления, антитела согласно данному изобретению позволяют повысить деплетирование популяции NK-клеток по сравнению с B-клетками и повысить деплетирование популяции B-клеток по сравнению с T-клетками.

[00213] В определенных вариантах осуществления, биодоступность анти-CD38 антител, описанных в данном документе, после подкожного введения составляет от не менее 50% до не менее 80% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы. В определенных вариантах осуществления, биодоступность анти-CD38 антител, описанных в данном документе, после подкожного введения составляет от не менее 60% до не менее 80% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы. В определенных вариантах осуществления, биодоступность анти-CD38 антител, описанных в данном документе, после подкожного введения составляет от не менее 50% до 70% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы. В определенных вариантах осуществления, биодоступность анти-CD38 антител, описанных в данном документе, после подкожного введения составляет от не менее 55% до 65% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы. В определенных вариантах осуществления, биодоступность анти-CD38 антител, описанных в данном документе, после подкожного введения составляет от не менее 55% до 70% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы.

[00214] В определенных вариантах осуществления, биодоступность анти-CD38 антител, описанных в данном документе, после подкожного введения составляет не менее 40%, не менее 45%, не менее 50%, не менее 51%, не менее 52%, не менее 53%, не менее 54%, не менее 55%, не менее 56%, не менее 57%, не менее 58%, не менее 59%, не менее 60%, не менее 61%, не менее 62%, не менее 63%, не менее 64%, не менее 65%, не менее 66%, не менее 67%, не менее 68%, не менее 69%, не менее 70%, не менее 71%, не менее 72%, не менее 73%, не менее 74%, не менее 75%, не менее 76%, не менее 77%, не менее 78%, не менее 79%, не менее 80%, не менее 81%, не менее 82%, не менее 83%, не менее 84% или не менее 85% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы.

[00215] В некоторых вариантах осуществления, данное раскрытие изобретения относится к способу, в котором биодоступность антител согласно данному изобретению, которые временно связывают эритроциты человека, после подкожного введения составляет 50-80% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы.

[00216] В некоторых вариантах осуществления, данное раскрытие изобретения относится к способу, в котором биодоступность антител согласно данному изобретению, которые временно связывают эритроциты человека, после подкожного введения составляет не менее 50% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы.

[00217] В некоторых вариантах осуществления, данное раскрытие изобретения относится к способу, в котором биодоступность антител согласно данному изобретению, которые временно связывают эритроциты человека, после подкожного введения составляет не менее 55% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы.

[00218] В некоторых вариантах осуществления, данное раскрытие изобретения относится к способу, в котором биодоступность антител согласно данному изобретению, которые временно связывают эритроциты человека, после подкожного введения составляет не менее 60% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы.

[00219] В некоторых вариантах осуществления, данное раскрытие изобретения относится к способу, в котором биодоступность антител согласно данному изобретению, которые временно связывают эритроциты человека, после подкожного введения составляет не менее 65% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы.

[00220] В некоторых вариантах осуществления, данное раскрытие изобретения относится к способу, в котором биодоступность антител согласно данному изобретению, которые временно связывают эритроциты человека, после подкожного введения составляет не менее 70% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы.

[00221] В некоторых вариантах осуществления, данное раскрытие изобретения относится к способу, в котором биодоступность антител согласно данному изобретению, которые временно связывают эритроциты человека, после подкожного введения составляет не менее 75% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы.

[00222] В некоторых вариантах осуществления, данное раскрытие изобретения относится к способу, в котором биодоступность антител согласно данному изобретению, которые временно связывают эритроциты человека, после подкожного введения составляет не менее 80% по сравнению с внутривенным введением, нормализованным для той же дозы.

[00223] В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно в виде одной болюсной инъекции. В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно ежемесячно. В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно один раз каждые три недели. В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно каждые две недели. В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно еженедельно. В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно два раза в неделю. В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно ежедневно. В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно каждые 12 часов. В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно каждые 8 часов. В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно каждые шесть часов. В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно каждые четыре часа. В определенных вариантах осуществления, анти-CD38 антитела, описанные в данном документе, вводятся подкожно каждые два часа.

[00224] В некоторых вариантах осуществления, стандартные лекарственные формы для подкожного введения вводятся в дозировке от примерно 0,01 мг на килограмм массы тела до примерно 0,8 мг на килограмм массы тела. В некоторых вариантах осуществления, стандартные лекарственные формы для подкожного введения содержат количество, достаточное для введения дозировки от примерно 0,02 мг на килограмм массы тела до примерно 0,75 мг на килограмм массы тела. В некоторых вариантах осуществления, стандартные лекарственные формы для подкожного введения содержат количество, достаточное для введения дозировки от примерно 0,02 мг на килограмм массы тела до примерно 0,7 мг на килограмм массы тела. В некоторых вариантах осуществления, стандартные лекарственные формы для подкожного введения содержат количество, достаточное для введения дозировки от примерно 0,03 мг на килограмм массы тела до примерно 0,6 мг на килограмм массы тела. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,25 миллилитра (мл) до примерно 3,5 миллилитра (мл). В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,5 мл до примерно 3 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,5 мл до примерно 2,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,5 мл до около 2 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 1 мл до примерно 2 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,25 мл до примерно 1,25 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,5 мл до примерно 1,25 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,75 мл до примерно 1,25 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,75 мл до примерно 1 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,9 мл до примерно 1,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,9 мл до примерно 1,1 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 1 мл до примерно 1,0 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,95 мл до примерно 1,05 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 3,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 3 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 2,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 2 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 1,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 1 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 0,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 0,25 мл.

Стандартные лекарственные формы

[00225] В некоторых вариантах осуществления, терапевтические анти-CD38 антитела составлены как часть стандартной лекарственной формы. В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит тяжелую цепь, содержащую следующие аминокислотные последовательности CDR: GFTFDDYG (SEQ ID NO: 3; HCDR1 AB79), ISWNGGKT (SEQ ID NO: 4; HCDR2 AB79), и ARGSLFHDSSGFYFGH (SEQ ID NO: 5; HCDR3 AB79). В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит легкую цепь, содержащую следующие аминокислотные последовательности CDR: SSNIGDNY (SEQ ID NO: 6; LCDR1 AB79), RDS (SEQ ID NO: 7; LCDR2 AB79) и QSYDSSLSGS (SEQ ID NO: 8; LCDR3 AB79). В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит тяжелую цепь, содержащую следующие аминокислотные последовательности CDR: GFTFDDYG (SEQ ID NO: 3; HCDR1 AB79), ISWNGGKT (SEQ ID NO: 4; HCDR2 AB79), ARGSLFHDSSGFYFGH (SEQ ID NO: 5; HCDR3 AB79) и легкую цепь, содержащую следующие аминокислотные последовательности CDR: SSNIGDNY (SEQ ID NO: 6; LCDR1 AB79), RDS (SEQ ID NO: 7; LCDR2 AB79) и QSYDSSLSGS (SEQ ID NO: 8; LCDR3 AB79). В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 9.

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSDISWNGGKTHYVDSVKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSLFHDSSGFYFGHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA (SEQ ID NO: 9).

[00226] В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 10.

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGDNYVSWYQQLPGTAPKLLIYRDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEEL (SEQ ID NO: 10).

[00227] В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность VH области SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность VL области SEQ ID NO: 10.

[00228] Как будет понятно специалистам в данной области, вариабельные тяжелые и легкие цепи могут быть присоединены к последовательностям константного домена человеческого IgG, обычно IgG1, IgG2 или IgG4.

В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи (HC) SEQ ID NO: 11.

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSDISWNGGKTHYVDSVKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSLFHDSSGFYFGHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).

[00229] В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит аминокислотную последовательность легкой цепи (LC) SEQ ID NO: 12.

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGDNYVSWYQQLPGTAPKLLIYRDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 12).

[00230] В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит аминокислотную последовательность HC SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность LC SEQ ID NO: 12.

[00231] В некоторых вариантах осуществления, лекарственная форма, содержащая анти-CD38 антитело, представляет собой стандартную лекарственную форму. В некоторых вариантах осуществления, стандартная лекарственная форма содержит количество, достаточное для введения дозировки от примерно 0,01 мг на килограмм массы тела до примерно 0,8 мг на килограмм массы тела. В некоторых вариантах осуществления, стандартная лекарственная форма содержит количество, достаточное для введения дозировки от примерно 0,02 мг на килограмм массы тела до примерно 0,75 мг на килограмм массы тела. В некоторых вариантах осуществления, стандартная лекарственная форма содержит количество, достаточное для введения дозировки от примерно 0,02 мг на килограмм массы тела до примерно 0,7 мг на килограмм массы тела. В некоторых вариантах осуществления, стандартная лекарственная форма содержит количество, достаточное для введения дозировки от примерно 0,03 мг на килограмм массы тела до примерно 0,6 мг на килограмм массы тела. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,25 миллилитра (мл) до примерно 3,5 миллилитра (мл). В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,5 мл до примерно 3 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,5 мл до примерно 2,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,5 мл до около 2 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 1 мл до примерно 2 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,25 мл до примерно 1,25 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,5 мл до примерно 1,25 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,75 мл до примерно 1,25 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,75 мл до примерно 1 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,9 мл до примерно 1,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,9 мл до примерно 1,1 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 1 мл до примерно 1,1 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом от примерно 0,95 мл до примерно 1,05 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 3,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 3 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 2,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 2 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 1,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 1 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 0,5 мл. В некоторых вариантах осуществления, количество содержится в лекарственной форме объемом примерно 0,25 мл.

[00232] В некоторых вариантах осуществления, стандартные лекарственные формы анти-CD38 антитела, представленные в данном документе, могут дополнительно включать один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов, носителей и (или) разбавителей.

[00233] Режимы дозировки корректируются для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, может вводиться однократная болюсная доза, могут вводиться несколько разделенных доз в течение некоторого времени или доза может быть пропорционально понижена или повышена сообразно потребностям терапевтической ситуации. Композиции могут быть составлены в виде стандартной лекарственной формы для простоты введения и единообразия дозировки. Используемое в данном документе выражение «стандартная лекарственная форма» обозначает физически раздельные единицы, подходящие в качестве однократных доз для субъектов, подлежащих лечению, причем каждая единица содержит заранее установленное количество активного соединения, рассчитанное на то, чтобы вызвать необходимый терапевтический эффект, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.

[00234] Спецификация для стандартной лекарственной формы согласно данному изобретению обусловлена и напрямую зависит от (a) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, которого необходимо достичь, и (b) ограничений, свойственных области техники составления такого активного соединения для лечения индивидуума.

[00235] Эффективные дозы и схемы дозировки для анти-CD38 антител, используемых в данном изобретении, зависят от типа и тяжести заболевания или патологического состояния, подлежащего лечению, и могут быть определены специалистами в данной области.

[00236] Лекарственные формы, представленные в данном документе, основаны на подкожном введении, которое достигается, по меньшей мере частично, на основе более низкой способности связываться или оставаться связанными с эритроцитами по сравнению с даратумумабом. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, такая связывающая активность может быть следствием кратковременной природы связывания AB79 с эритроцитами. В некоторых вариантах осуществления, терапевтические антитела связывают эритроциты человека кратковременно. В некоторых вариантах осуществления, терапевтические анти-CD38 антитела связывают эритроциты яванской макаки кратковременно. В некоторых вариантах осуществления, терапевтические анти-CD38 антитела связывают эритроциты человека или яванской макаки кратковременно. В некоторых вариантах осуществления, терапевтические анти-CD38 антитела связывают эритроциты человека и яванской макаки кратковременно.

[00237] В одном варианте осуществления, анти-CD38 антитело вводится путем подкожного введения в еженедельной дозировке от примерно 0,01 до примерно 1 мг/кг, например от примерно 0,02 до примерно 0,8 мг/кг. Такое введение может повторяться, например, от 1 до 14 раз, например от 3 до 5 раз. Иллюстративный неограничивающий диапазон для терапевтически эффективного количества анти-CD38 антитела, используемого в данном изобретении, составляет примерно 0,01-1 мг/кг, например, примерно 0,01-0,8 мг/кг, примерно 0,02-0,75 мг/кг. примерно 0,02-0,7 мг/кг или примерно 0,03-0,6 мг/кг.

[00238] В качестве неограничивающих примеров лечение согласно данному изобретению может быть обеспечено в виде суточной дозы антитела в количестве от примерно 0,01 до примерно 1 мг/кг, например 0,009; 0,01; 0,03; 0,05; 0,07; 0,09; 0,11; 0,13; 0,15; 0,17; 0,19; 0,21; 0,23; 0,25; 0,27; 0,29; 0,31; 0,33; 0,35; 0,37; 0,39; 0,41; 0,43; 0,45; 0,47; 0,49; 0,51; 0,53; 0,55; 0,57; 0,59; 0,61; 0,63; 0,65; 0,67; 0,69; 0,71; 0,72; 0,73; 0,75; 0,77; 0,79; 0,81; 0,83; 0,85; 0,87; 0,89; 0,91; 0,93; 0,95; 0,97 или 0,99; 1,0; или 1,1 мг/кг в день, по крайней мере, в один из дней 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40, либо, в другом варианте, по крайней мере в одну из недель 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 после начала лечения, или любая их комбинация, с использованием одной или разделенных доз каждые 24, 18, 12, 8, 6, 4 или 2 часа, или любая их комбинация.

[00239] В одном варианте осуществления, анти-CD38 антитело вводится еженедельно в дозировке от около 0,01 до около 1 мг/кг, например от около 0,02 до около 0,8 мг/кг. Такое введение может повторяться, например, от 1 до 14 раз, например от 3 до 5 раз. Введение может быть выполнено путем непрерывной инфузии в течение периода от 2 до 24 часов, например от 2 до 12 часов. Такой режим может быть повторен один или несколько раз по мере необходимости, например, через 6 месяцев или 12 месяцев. Дозировка может быть определена или скорректирована путем измерения количества соединения согласно данному изобретению в крови сразу после введения, например, путем взятия биологического образца и применения антиидиотипических антител, которые нацелены на антигенсвязывающую область анти-CD38 антитела.

[00240] В дополнительном варианте осуществления, анти-CD38 антитело вводится один раз в неделю в течение от 2 до 12 недель, например в течение от 3 до 10 недель, например в течение от 4 до 8 недель.

[00241] В одном варианте осуществления, анти-CD38 антитело вводится в качестве поддерживающей терапии, например, один раз в неделю в течение периода 6 месяцев или более.

[00242] В одном варианте осуществления, анти-CD38 антитело вводится по схеме, включающей одну инфузию анти-CD38 антитела с последующей инфузией анти-CD38 антитела, конъюгированного с радиоизотопом. Режим можно повторить, например, через 7-9 дней.

[00243] В некоторых вариантах осуществления, анти-CD38 антитело согласно данному изобретению используют в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, например химиотерапевтическим агентом. Неограничивающие примеры повреждающих ДНК химиотерапевтических агентов включают ингибиторы топоизомеразы I (например, иринотекан, топотекан, камптотецин и их аналоги или метаболиты, и доксорубицин); ингибиторы топоизомеразы II (например, этопозид, тенипозид и даунорубицин); алкилирующие агенты (например, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, тиотепа, ифосфамид, кармустин, ломустин, семустин, стрептозоцин, декарбазин, метотрексат, митомицин С и циклофосфамид); интеркаляторы ДНК (например, цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин); интеркаляторы ДНК и генераторы свободных радикалов, такие как блеомицин; и миметики нуклеозидов (например, 5-фторурацил, капецитабин, гемцитабин, флударабин, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин, пентостатин и гидроксимочевина).

[00244] Химиотерапевтические агенты, которые нарушают репликацию клеток, включают: паклитаксел, доцетаксел и родственные аналоги; винкристин, винбластин и родственные аналоги; талидомид, леналидомид и родственные аналоги (например, CC-5013 и CC-4047); ингибиторы протеин-тирозинкиназы (например, иматиниба мезилат и гефитиниб); ингибиторы протеасом (например, бортезомиб); ингибиторы NF-κB, включая ингибиторы киназы IκB; антитела, связывающиеся с белками, которые избыточно экспрессируются, неправильно экспрессируются или активируются при раке, и тем самым подавляют репликацию клеток (например, трастузумаб, ритуксимаб, цетуксимаб и бевацизумаб); и другие ингибиторы белков или ферментов, о которых известно, что они повышаются, избыточно экспрессируются, неправильно экспрессируются или активируются при раке, ингибирование которых подавляет репликацию клеток.

[00245] В некоторых вариантах осуществления, антитела согласно данному изобретению можно использовать до, одновременно с или после лечения препаратом Велкейд® (бортезомиб).

Методы лечения

[00246] В способах согласно данному изобретению терапевтические средства используются для обеспечения положительного терапевтического ответа в отношении заболевания или патологического состояния. Термин «положительный терапевтический ответ» означает положительную динамику заболевания или патологического состояния и (или) ослабление симптомов, связанных с заболеванием или патологическим состоянием. Например, положительный терапевтический ответ может относиться к одному или нескольким из следующих видов положительной динамики заболевания: (1) снижение количества неопластических клеток; (2) повышенная гибель неопластических клеток; (3) ингибирование выживания неопластических клеток; (5) ингибирование (т.е. замедление до некоторой степени, предпочтительно остановка) опухолевого роста; (6) повышенная выживаемость пациентов; и (7) некоторое ослабление одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или патологическим состоянием.

[00247] Положительные терапевтические ответы при любом заболевании или патологическом состоянии могут быть определены с помощью стандартизированных критериев ответа, специфичных в отношении данного заболевания или патологического состояния. Реакцию опухоли можно оценивать в отношении изменений морфологии опухоли (т.е. общей опухолевой нагрузки, размера опухоли и т.п.) с использованием методик скрининга, таких как магнитно-резонансная томография (МРТ), рентгенография, компьютерная томография (КТ), сканирование костей скелета, эндоскопия и биопсия опухоли, в том числе аспирация костного мозга (АКМ) и подсчет опухолевых клеток в кровотоке.

[00248] В дополнение к этим положительным терапевтическим ответам, субъект, проходящий лечение, может испытывать положительный эффект в виде ослабления симптомов, связанных с заболеванием. В случае В-клеточных опухолей субъект может испытывать ослабление так называемых В-симптомов - например, ночных приливов, лихорадки, потери массы тела и (или) крапивницы. В случае предзлокачественных патологических состояний лечение терапевтическим анти-CD38 антителом может блокировать и (или) продлевать время до развития связанного злокачественного состояния, например, развития множественной миеломы у субъектов, страдающих моноклональной гаммапатией неясного генеза (МГНГ).

[00249] Положительную динамику заболевания можно охарактеризовать как полный ответ. Термин «полный ответ» означает отсутствие клинически выявляемого заболевания с нормализацией любых ранее аномальных рентгенографических исследований, показателей костного мозга и спинномозговой жидкости (СМЖ) или уровня аномального моноклонального белка в случае миеломы.

[00250] Такой ответ может сохраняться в течение по меньшей мере 4-8 недель или иногда 6-8 недель после лечения в соответствии со способами согласно данному изобретению. В другом варианте, положительная динамика заболевания может быть классифицирована как частичный ответ. Термин «частичный ответ» означает по меньшей мере примерно 50%-е снижение всей измеримой опухолевой нагрузки (т.е. количества злокачественных клеток, присутствующих у субъекта, или измеренной суммарной величины опухолевых масс, или количества аномального моноклонального белка) при отсутствии новых поражений, которое может сохраняться в течение 4-8 недель или 6-8 недель.

[00251] Лечение включает в себя «терапевтически эффективное количество» используемых лекарственных препаратов. «Терапевтически эффективное количество» означает то количество, которое является эффективным для достижения необходимого терапевтического результата в дозировках и в течение требуемых периодов времени.

[00252] Термины «терапевтически эффективное количество» и «терапевтически эффективная дозировка» означает количество терапевтического средства, которое является достаточным для снижения или облегчения тяжести и (или) периода протекания нарушения или одного или нескольких его симптомов; предупреждения прогрессирования нарушения; обеспечения обратного развития нарушения; предупреждения рецидива, развития, проявления или прогрессирования одного или нескольких симптомов, связанных с нарушением; или усиления либо улучшения профилактического(-их) или терапевтического(-их) эффекта(-ов) другой терапии (например, профилактического или терапевтического средства), в дозировках и для периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от таких факторов, как течение заболевания, возраст, пол и масса тела индивидуума, а также способность лекарственных препаратов вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела компенсируются терапевтически полезными эффектами. Терапевтически эффективное количество антитела для терапии опухоли может быть измерено по его способности стабилизировать прогрессирование заболевания. Способность соединения ингибировать рак может быть оценена в животной модельной системе, прогнозирующей эффективность для раковых заболеваний человека.

[00253] В другом варианте, это свойство композиции может быть оценено путем исследования способности соединения ингибировать клеточный рост или индуцировать апоптоз при помощи in vitro анализов, известных специалисту в данной области техники. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может приводить к уменьшению размера опухоли или иным образом ослаблять симптомы у субъекта. Рядовой специалист в данной области техники сможет определить такие количества на основе таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов субъекта и конкретная композиция или выбранный способ введения.

Наборы анти-CD38 антител

[00254] В другом аспекте изобретения предлагаются наборы для лечения заболевания или патологического состояния, связанного с гематологическим раком. В одном варианте осуществления, набор содержит дозу анти-CD38 антитела, описанного в данном документе, такого как AB79. В некоторых вариантах осуществления наборы, предложенные в данном документе, могут содержать одну или несколько доз жидкой или лиофилизированной лекарственной формы, как предусмотрено в данном документе. Когда наборы содержат лиофилизированную лекарственную форму анти-CD38 антитела, описанного в данном документе, такого как AB79, обычно наборы также содержат подходящую жидкость для восстановления жидкой лекарственной формы, например, стерильную воду или фармацевтически приемлемый буфер. В некоторых вариантах осуществления, наборы могут содержать лекарственную форму анти-CD38 антитела, описанного в данном документе, предварительно упакованную в шприц для подкожного введения медицинским работником или для домашнего использования.

[00255] В определенных вариантах осуществления, набор будет предназначен для однократного введения дозы анти-CD38 антитела, описанного в данном документе, такого как AB79. В других вариантах осуществления, набор может содержать несколько доз анти-CD38 антитела, описанного в данном документе, такого как AB79, для подкожного введения. В одном варианте осуществления, набор может содержать лекарственную форму анти-CD38 антитела, описанного в данном документе, предварительно упакованную в шприц для подкожного введения медицинским работником или для домашнего использования.

Изделия

[00256] В других вариантах осуществления представлено изделие, содержащее материалы, полезные для лечения расстройств, описанных выше. Изделие содержит контейнер и этикетку. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая эффективна для лечения патологического состояния, и может иметь стерильное отверстие для доступа (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенного раствора или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). Активным агентом в композиции является антитело. Ярлык на контейнере или связанный с контейнером указывает на то, что композиция используется для лечения выбранного патологического состояния. Изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. Кроме того, он может включать другие материалы, целесообразные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Основанная на модели характеризация анти-CD38 антитела у яванской макаки

[00257] Анти-CD38 антитело AB79 связывает CD38 яванской макаки (яванец), что отличает его от даратумумаба (Дарзалекс^TM) - цитолитического моноклонального антитела к CD38, недавно одобренного для лечения множественной миеломы. Эта уникальная функция обосновала использование яванца в доклинических исследованиях для характеристики фармакокинетики (ФК), фармакодинамики (ФД) и безопасности AB79. С этой целью были разработаны анализы для измерения концентрации лекарственного средства, иммуногенности и количественной оценки Т-, В- и NK-клеток в крови яванских макак. Мы оценили эти параметры в 8 фармакологических и токсикологических доклинических исследованиях. Из протестированных клеточных популяций CD38 наиболее высоко экспрессируется на NK-клетках; следовательно, мы предполагаем, что действие препарата на NK-клетки наиболее близко к действию на рассматриваемые клетки-мишени - плазмобласты, плазматические клетки и другие активированные лимфоциты.

[00258] Данные были собраны из 8 исследований на здоровых макаках с использованием диапазона доз 0,03-100 мг/кг, и были разработаны математические модели, которые описывают фармакокинетику и зависимость экспозиция - эффект для каждого из типов клеток. Деплетирование популяции NK-клеток было идентифицировано как наиболее чувствительный фармакодинамический эффект AB79. Это деплетирование было описано с помощью модели оборота (ЕС50=34,8 мкг/мл по скорости деплетирования), и полное деплетирование было достигнуто при в/в дозе 0,3 мг/кг. Также наблюдались промежуточные эффекты на количество Т-клеток при использовании модели прямого ответа (ЕС50=9,43 мкг/мл) и на количество В-клеток при использовании 4-камерной транзитной модели (ЕС50=19,3 мкг/мл по скорости деплетирования). Эти анализы подтвердили результаты наблюдений, что антитело AB79 прошло через каждую из измеренных субпопуляций лимфоцитов с разной скоростью и требовало разных промежутков времени для деплетирования модельной камеры крови.

[00259] Математические модели, которые описывают ФК и ФД, являются полезными инструментами для получения механистического и количественного понимания взаимосвязи между экспозицией препарата и эффектом (Friberg et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20: 4713-4721; Mager et al. (2003) Drug Metab. Dispos. 31: 510-518; Han and Zhou (2011) Ther. Deliv. 2: 359-368). Типичные особенности ФК антител IgG, включая распределение и элиминацию, физиологическое и генетическое сходство между макакой и человеком, могут быть использованы для объяснения фармакологии AB79 (Glassman and Balthasar (2014) Cancer Biol. Med. 11: 20-33; Kamath (2016) Drug Discov. Today Technol. 21-22: 75-83). Кроме того, эти модели были успешно применены для прогнозирования концентраций ФК и эффектов ФД у здоровых субъектов (Han and Zhou (2011) Ther. Deliv. 2: 359-368).

Материалы и методы

[00260] Обобщенные результаты исследований на макаках продемонстрированы в Таблице 2 в хронологическом порядке. Исследования № 2, 7 и 8 с разовой дозой в основном проводились для оценки ФК и ФД для внутривенного (в/в) и подкожного (п/к) пути введения AB79 (Фиг. 1). Исследования с повторной дозой проводились для оценки безопасности, ФК и ФД, включая два 4-недельных исследования (исследования № 1 и 3) и три 13-недельных исследования, соответствующих принципам НЛП (исследования № 4, 5 и 6). В 13-недельном исследовании № 5 произошла ошибка дозирования. Животные из группы с наименьшей дозой получали 0,01 мг/кг вместо предполагаемых 0,1 мг/кг за один раз (вторая доза), а затем продолжали принимать 0,1 мг/кг. Эти данные были добавлены к набору данных с правильной информацией о фактически введенных дозировках. Исследование № 6 повторило низкую дозу в 0,1 мг/кг группы с еженедельным введением препарата исследования № 5. Все исследования на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, принятым и обнародованным Национальными институтами здравоохранения США.

Таблица 2. Исследования AB79 на макаках в хронологическом порядке
Иссле-дование №	Описание исследования	Количество животных (самок, самцов)	Дозы (мг/кг)	Количество образцов на одно животное (ФК/ФД)
1	День 1 (1 мг/кг) + День 28 (2 мг/кг), в/в, ФК, ФД	6 (0, 6)	плц; 1; 2	19/10
2	Разовая доза, в/в, ФК, ФД	9 (0, 9)	плц; 0,3; 3	14/9
3	Токс. 4 недели, раз в неделю, в/в, ФК, ФД	12 (4, 8)	плц; 1; 30; 100	15/8
4	Токс. 13 недель, раз в 2 недели, в/в, ФК, ФД	40 (20, 20)	плц; 3; 30; 80	47/29
5	Токс. 13 недель, раз в неделю, в/в, ФК, ФД	52 (26, 26)	плц; 0,1; 0,3; 1	31/9
6	Токс. 13 недель, раз в неделю, в/в, ФК, ФД	20 (20, 0)	плц; 0,1	31/10
7	Разовая доза, в/в/п/к, ФК, ФД	12 (12, 0)	0,1 (0,3; 1)	16/16
8	Разовая доза, в/в/п/к, ФК, ФД	24 (24, 0)	0,03 (0,1; 0,3)	19/19
в/в - внутривенная 30-минутная инфузия (исследования № 1-4) или болюс (исследования № 5-8); п/к - подкожная инъекция (группа 4 исследования № 7 и 3 группы исследования № 8); ФК - плотная выборка ФК; ФД - плотная выборка образцов цельной крови для проточной цитометрии, дающей данные о количестве Т-, В- и NK-клеток; плц - плацебо; «4 недели» или «13 недель» описывают продолжительность периода лечения; токс. - токсикологическое исследование.

Биоаналитическая методика

[00261] ФК анализировали с использованием поверенного метода, разработанного и осуществленного лабораторией Charles River Laboratories (Рино, Невада). Коротко, концентрацию АВ79 измеряли в сыворотке крови макаки с использованием непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). 96-луночный планшет для микротитрования был покрыт антиидиотипическим антителом против АВ79. Пустые пробы, стандарты и образцы для контроля качества (КК), содержащие AB79 в различных концентрациях, добавляли в планшет и инкубировали в течение 55-65 минут при комнатной температуре. После промывки планшета для микротитрования добавляли конъюгированное с пероксидазой мышиное антитело к IgG человека (реактив «Peroxidase AffiniPure Mouse Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific» компании Jackson ImmunoResearch) и инкубировали на планшете в течение дополнительных 55-65 минут. Планшет снова промывали и добавляли в лунки тетраметилбензидин (ТМБ) для образования хромофора, и развитие окраски останавливали добавлением стоп-раствора (двунормальная серная кислота). Абсорбцию при 450 нм измеряли с использованием микропланшетного анализатора SPECTRAmax® 190 (Molecular Devices), а концентрации AB79 были рассчитаны с использованием 4-параметрической экспоненциальной взвешенной (1/y²) стандартной калибровочной кривой. В исследовании № 1 (Таблица 2) нижний предел количественного определения (НПКО) антитела AB79 в сыворотке составил 0,061 мкг/мл, а во всех других исследованиях он составлял 0,05 мкг/мл.

Определение иммуногенности анти-АВ79 антител

[00262] Скрининг антител против лекарственного препарата (АПЛП) в сыворотке крови макак проводили с использованием качественного электрохемилюминесцентного (ЭХЛ) метода, поверенного и осуществленного лабораторией Charles River Laboratories (Рино, Невада). Коротко, неразбавленные образцы сыворотки инкубировали с 300 мМ уксусной кислоты. Диссоциированные кислотой образцы инкубировали в смеси биотинилированного AB79, AB79, меченного SULFO-TAG™ (Meso Scale Diagnostics, меченный в Charles River Laboratories), и 1,5М реактива «Trizma® base» для нейтрализации кислоты и образования иммунного комплекса. Этот комплекс затем добавляли в покрытый стрептавидином планшет MSD (Meso Scale Diagnostics) и оставляли для связывания. После промывки проводили детекцию комплекса путем добавления в планшет реактива «MSD read buffer T» (Meso Scale Diagnostics) и последующим возбуждением метки SULFO-TAG™ посредством электрохимической реакции комплекса [Ru(bpy)3]²⁺ с образованием люминесценции (света), которая была прочитана с использованием анализатора MSD Sector 6000 (Meso Scale Diagnostics). Интенсивность люминесценции количественно коррелировала с уровнем анти-AB79 антител макаки, присутствующих в сыворотке индивидуальных образцов.

Характеризация клеток крови

[00263] Чтобы оценить и сравнить уровень связывания AB79 у человека и макаки, образцы крови каждого из них собирали в пробирки с гепарином натрия. Аликвоту крови (100 мкл) смешивали с соответствующим объемом характеризующего антитела (Таблица 3) и инкубировали в течение 15-20 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации добавляли 1 мл реактива «BD FACS lyse» (однократной концентрации; BD Biosciences; Сан-Хосе, Калифорния) для лизиса эритроцитов и инкубировали клетки в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте, затем центрифугировали, декантировали и ресуспендировали в 1 мл окрашивающего буфера с бычьим сывороточным альбумином (BD Biosciences). Клетки центрифугировали во второй раз, декантировали и добавляли 250 мкл реактива «Flow Fix» (1% параформальдегид в фосфатно-солевом буфере Дульбекко без кальция и магния (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния)) и измеряли флуоресценцию методом проточной цитометрии с использованием проточного цитометра FACSCanto™ II (BD Biosciences). Были проанализированы NK-клетки (CD3-, CD159a+), B-клетки (CD3-, CD20+) и T-клетки (CD3+) макаки, и NK-клетки (CD3-, CD16/CD56+), B-клетки (CD3-, CD19+) и T-клетки (CD3+) человека. Средняя интенсивность флуоресценции окрашивания AB79 для каждой популяции клеток была преобразована в единицы молекул эквивалентного растворимого флуорохрома (МЭРФ) с использованием стандартной кривой, полученной с использованием реактива «Rainbow Beads» (Spherotech; Лейк-Форест, Иллинойс).

Таблица 3. Антитела, использованные для характеризации клеток крови
Антитело	Объем антитела на образец (мкл/100 мкл образца)	Источник
CD3-APCH7 (SK7)*	5	BD Biosciences
CD3-APC Cy7 (SP34-2)	1,25	BD Biosciences
CD3-PerCp Cy 5.5 (SP34-2)	5	BD Biosciences
AB19-AF647	1	Приготовлено в Takeda
AB79-AF488	2	Приготовлено в Takeda
AB19-AF488	0,42	Приготовлено в Takeda
CD19-PerCp Cy 5.5 (HIB19)*	5	BD Biosciences
CD20-PE (2H7)	10	BD Biosciences
CD20-APCH7 (2H7)	2,5	BD Biosciences
CD16-PE (B73.1)*	5	BD Biosciences
CD16-PerCP-Cy5.5 (3G8)	20	BD Biosciences
CD56-PE (B159)*	5	BD Biosciences
CD159a-PE (Z199)	5	Beckman Coulter (Брея, Калифорния)
CD45-PerCP TruCount (DO58-1283)	Н/Д	BD Biosciences
CD45-PeCy7 (HI30)*	2,5	BD Biosciences
CD45-PeCy7 (DO58-1283)	2,5	BD Biosciences
Мышиный IgG1 каппа -AF488 или -AF647 (MOPC-21)	2,5	BioLegend (Сан-Диего, Калифорния)
* использовалось для окрашивания только клеток человека

[00264] В исследованиях, приведенных в Таблице 2, клетки окрашивали и анализировали с использованием поверенного метода, разработанного и осуществленного лабораторией Charles River Laboratories (Рино, Невада). Образцы крови макак собирали в пробирки с гепарином натрия до и несколько раз после введения AB79, и анализировали определенные популяции лимфоцитов при помощи проточной цитометрии с использованием проточного цитометра FACSCanto™ II (BD Biosciences). Коммерческие антитела и антитело против CD38 (AB19; Таблица 3); Патент США № 8362111) были оттитрованы до оптимальных для окрашивания концентраций. Были идентифицированы CD38+/-, Т-клетки (CD3+), В-клетки (CD3-/CD20+) и естественные киллеры (NK-клетки) (CD3-/CD20-/CD16+) макаки и проведено количественное определение лимфоцитов с использованием пробирок CD45TruCount™ (BD Biosciences). Аликвоты приблизительно по 100 мкл из каждого образца крови помещали в соответствующую лунку 96-луночного планшета и добавляли антитела в указанном объеме, смешивали и инкубировали в течение минимум 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации эритроциты лизировали, образцы смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение дополнительных 10 минут в темноте. Планшет центрифугировали и супернатант декантировали. Затем осадок клеток ресуспендировали в 1800 мкл окрашивающего буфера, образцы перемешивали, центрифугировали и декантировали супернатант. Клеточный осадок ресуспендировали в 500 мкл окрашивающего буфера с фетальной бычьей сывороткой и приблизительно 300 мкл клеточной суспензии переносили для анализа в 96-луночный планшет с V-образным дном. Процентное содержание NK-клеток, а также общих Т-клеток и В-клеток было пересчитано с учетом количества клеток, полученного с помощью пробирок TruCount™ (BD Biosciences; Сан-Хосе, Калифорния), и использовалось для определения абсолютного количества клеток для каждой популяции. В исследованиях № 1-4 анализировали базовые уровни субпопуляций CD38+ NK-, B- и T-клеток при помощи меченых анти-CD38 антител - AB79 или AB19. Несмотря на то, что AB19 связывается с другим эпитопом, результаты были очень похожи и поэтому не представлены отдельно. Обработанные образцы были проанализированы немедленно.

Разработка модели ФК

[00265] При разработке модели ФК были исследованы структуры одно-, двух- и трехкамерной модели. Модель с двумя камерами явно превосходила модель с одной камерой, судя по графикам критериев адекватности модели (КАМ) и уменьшению значения целевой функции (ЗЦФ). На основании визуального осмотра диагностических графиков введение третьей камеры не являлось необходимым для достоверного описания данных. Биодоступность (F) моделировалась с использованием логит-преобразования F=exp(PAR)/(1+exp(PAR)), где PAR обозначает параметр модели, чтобы гарантировать ограничение диапазона оценок между 0 и 1. Нелинейная ФК при низких концентрациях моделировалась при помощи аппроксимативной модели квазистационарного состояния (КСС) мишень-опосредованного распределения препарата (МОРП) (Gibiansky and Gibiansky (2009) Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 5: 803-812).

[00266] Схематическое представление модели приведено на Фиг. 2С. Аппроксимирование КСС основывалось на предположении, что установившиеся концентрации свободного лекарственного средства C, мишени R и лекарственного целевого комплекса RC устанавливаются очень быстро по сравнению со всеми другими процессами. Это означает, что процесс связывания сбалансирован с процессами диссоциации и интернализации, и что в соответствующих единицах выполняется следующее уравнение: K_ON*C*R = (K_OFF+K_INT) RC, где K_ON обозначает константу скорости связывания, K_OFF - константа скорости диссоциации, а K_INT - константа скорости интернализации.

[00267] Межсубъектная вариабельность (МСВ) была исследована для всех параметров и смоделирована с помощью экспоненциальных моделей следующего типа: PAR_i=TVPAR*e^ETAPAR_i, где PAR_i - оценка значения индивидуального параметра, TVPAR - оценка значения типичного параметра, а ETAPAR_i - оценка отклонения индивидуального параметра i. Предполагалось, что значения ETAPAR_i подчиняются нормальному распределению со средним значением нуль. Остатки были описаны с помощью комбинированной аддитивной и пропорциональной модели ошибок (Beal and Sheiner (1992) NONMEM User Guides, in University of California CA).

[00268] Следующие параметры были исследованы для выявления потенциальных ковариационных эффектов на ФК AB79: масса тела, пол, доза, способ введения и исследование.

Разработка модели ФК-ФД

[00269] Для каждого из трех типов клеток разработку модели ФК-ФД проводили отдельно. Обратите внимание, что для разработки моделей не использовались измерения, близкие ко времени введения лекарственного средства (<8 часов после введения дозы), поскольку на них влиял неспецифический, независимый от лекарственного средства эффект, возможно из-за того, что за короткий промежуток времени брали несколько проб крови. Модель ФК и оценки параметров были фиксированы. Были протестированы модели оборота, транзитной камеры и модели прямого ответа различных форм (Friberg et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20: 4713-4721; Mager et al. (2003) Drug Metab. Dispos. 31: 510-518). В моделях оборота эффект лекарственного средства был введен в параметр скорости клеточной элиминации в виде типовой модели Emax с факторами Хилла или без них. В наших обозначениях модель Emax является функцией f от концентрации лекарственного средства c следующего вида: f(c)=EMAX*c^H/(c^H+C50^H), где EMAX обозначает максимальный эффект, C50 - концентрация, при которой достигается половина максимального эффекта, и H - фактор Хилла. В модели транзитной камеры (МТК) лекарственный эффект был введен и испытан в разных параметрах: в скорости пролиферации, в циркулирующих клетках и в третьей транзитной камере. Также были протестированы комбинации этих эффектов и то, подтверждают ли данные наличие механизма обратной связи от кровообращения к скорости пролиферации. Кроме того, были протестированы модели прямого ответа типа Emax с факторами Хилла и без них для описания кривой концентрация - эффект препарата.

[00270] Параметры случайного эффекта были введены для оценки межсубъектной вариабельности по следующим показателям: базовое число клеток, скорость клеточного продуцирования (KIN), среднее время прохождения (СВП) в транзитной камерной модели, C50 и EMAX. Индивидуальные средние базовые уровни клеток были представлены в наборе данных (столбец БУ). Эти значения использовались в модели в качестве типичных значений. Был добавлен параметр случайного эффекта, позволяющий корректировать оценку индивидуальных базовых уровней на основе всех показателей индивидуума. Остатки ФД были описаны с помощью модели пропорциональной ошибки.

[00271] Для валидации модели в ходе моделирования (ФК и ФК-ФД) применялись ЗЦФ, стандартные ошибки, графики КАМ и отдельные прогнозы в сравнении с графиками данных, чтобы оценить модели и сравнить их с альтернативными моделями.

[00272] Использовались следующие пакеты программного обеспечения: NONMEM (версия 7.2), KIWI (версия 1.6), Berkeley Madonna (версия 8.3.14), PSN (версия 4) и R (версия 3.3.0).

Подготовка набора данных

[00273] Наборы данных из 8 исследований на макаках были собраны, реорганизованы в одном формате и объединены в три отдельных набора данных ФК-ФД, сочетаемых с NONMEM. Каждый из трех наборов данных содержал индивидуальные характеристики макак (исследование, идентификатор, группа, масса тела, пол), информацию о дозировке, данные ФК и данные для NK-, B- или T-клеток. Для животных из контрольных групп в наборы данных были включены только количества клеток, но не были включены данные ФК, при условии явного отсутствия уровней AB79 в сыворотке. Информация с учетом временного параметра о статусе противолекарственной иммуногенности (АПЛП), а именно ТИТР, содержащая результат количественного измерения и переменную 0/1-flag АПЛП-F (АПЛП-F=1, если АПЛ влияет на концентрацию AB79, АПЛП-F=0, если нет), была добавлена для каждого результата наблюдения в отдельных столбцах. Титры АПЛП измерялись с использованием различных методических спецификаций в разных исследованиях, и поэтому между исследованиями значения количественно не сопоставимы напрямую. Чтобы последовательно использовать информацию об АПЛП во всех исследованиях, мы применяли следующую процедуру для каждого животного в отдельности: титры АПЛП, которые увеличивались в моменты времени позже 7 дней по сравнению с первоначально измеренными уровнями, считались АПЛП-положительными и помечались в наборе данных (АПЛП-F=1). Если образец в один момент времени был помечен как АПЛП-положительный, все образцы, взятые после этого момента времени, были также помечены как АПЛП-положительные у данного животного, независимо от измеренного титра. Положительные значения АПЛП не использовались для оценки параметров при разработке модели. Обратите внимание, что измерения ФД в моменты времени, когда АПЛП влияли на концентрации ФК, также были помечены как АПЛП-F=1.

[00274] Касательно данных о подсчете клеток, индивидуальные базовые значения для каждого типа клеток (NK-, B- и T-клетки) рассчитывали как среднее значение всех доступных измерений до введения препарата отдельно взятому животному. В большинстве исследований это было однократное измерение. Базовое значение параметра для каждого животного затем добавляли в качестве результата наблюдения во время первого дозирования (ВРЕМЯ=0) и в качестве постоянного значения в столбце БУ к каждому результату наблюдения соответствующего животного. На основании этого базового значения был рассчитан процент от базового уровня для каждого измеренного количества клеток, который был добавлен в набор данных.

Масштабирование параметров ФК, полученных из исследований на макаках

[00275] Конечные модели ФК и ФК-ФД были использованы в качестве отправной точки для моделирования профилей ФК и ФК-ФД для первого клинического испытания на человеке. Несмотря на то, что такой анализ не является неоспоримым, сравнительный анализ данных о терапевтических моноклональных антителах продемонстрировал, что параметры ФК, полученные из исследований на макаках, можно масштабировать для того, чтобы способствовать прогнозированию профилей ФК для человека с приемлемой точностью (Han and Zhou (2011) Ther. Deliv. 2: 359-368). В приведенной выше публикации указывалось, что при использовании фиксированного показателя степени в 0,85 можно достоверно спрогнозировать показатели клиренса моноклональных антител для человека. Соответственно, это соотношение было применено для расчета параметров клиренса для человека (CL, Q), тогда как параметры объема (V_Ц, V_П) были рассчитаны с использованием прямой зависимости между массой тела (BW):

Результаты

Фармакокинетика AB79

[00276] Данные всех 8 исследований на здоровых макаках (исключая группы плацебо) были объединены в набор данных о ФК (Таблица 2). Суммарно, эти данные были получены от 140 животных, 58 из которых были самцами и 82 - самками. Масса тела исследуемых животных составляла от 2,1 до 4,7 кг, а дозы варьировали от 0,03 до 100 мг на кг массы тела (мг/кг). В одной группе из исследования № 7 и в трех группах из исследования № 8 дозы в 0,03; 0,1; 0,3 и 1 мг/кг вводились подкожно (всего 15 животных). Объединенный набор данных содержал 2199 измеримых показателей ФК, превышающих НПКО (Фиг. 2А и 2В). Наиболее часто отбирали образцы для анализа ФК после первой дозы, и даже в долгосрочных токсикологических исследованиях большинство животных умертвили до 98-х суток. Только исследование № 4 включало в себя группы выздоровления, и мы могли собрать данные о ФК только у 4 животных - 2 из группы 80 мг/кг и по одному от каждой из групп 30 мг/кг и 3 мг/кг (Фиг. 2B). Параллельно с концентрациями AB79 измеряли АПЛП. АПЛП повлияли на 229 результатов наблюдений о ФК (Фиг. 3).

[00277] Первоначально для каждого из исследований на макаках проводили анализ ФК с использованием стандартных некамерных методов (НКМ). На основании исследований разовой дозы (болюсная инъекция в/в или 30-минутная инфузия в/в) был рассчитан объем распределения во время терминальной фазы (V_Т), который варьировал от 64 до 116 мл/кг, клиренс - от 6,04 до 14,7 мл/кг/сутки и период полувыведения в терминальной фазе (T1/2) - от 4,75 до 11,2 суток. Было обнаружено, что площадь под кривой (ППК) зависимости концентрации от времени и максимальная концентрация (Cmax) увеличиваются пропорционально дозе в широком диапазоне. Только профили ФК групп с наименьшей дозой (<1 мг/кг, Фиг. 2D-2F) представляют доказательство нелинейного увеличения клиренса при концентрациях ниже 0,5 мкг/мл, вероятно вызванного механизмами мишень-опосредованного распределения препарата (МОРП) (Kamath (2016) Drug Discov. Today Technol. 21-22: 75-83). На основании данных, полученных из всех исследований на макаках, исключая две группы с самыми низкими дозами (доза >0,3 мг/кг), была построена линейная 2-камерная модель. При моделировании ФК для групп с наименьшей дозой и наложении на нее измеренных концентраций стало очевидно, что линейная модель прогнозирует завышенные концентрации (Фиг. 2D-2F).

[00278] Имеющиеся данные о ФК после однократного п/к введения продемонстрировали, что Cmax была на 70-80% ниже в группах п/к по сравнению с группами в/в при той же дозе, и что их ППК были сопоставимы. Различий в параметрах ФК между самцами и самками макак не наблюдалось. Результаты этого предварительного анализа были использованы в качестве отправной точки для разработки модели.

Разработка модели ФК

[00279] Разработка модели началась с данных от однократной внутривенной дозы, а затем начальная модель была постепенно расширена с использованием более сложных данных. Подобно другим терапевтическим антителам, полученная ФК строго следует линейной 2-камерной модели (Kamath (2016) Drug Discov. Today Technol. 21-22: 75-83). Нелинейный компонент элиминации (МОРП), описывающий ускоренный клиренс при низких концентрациях, моделировался при помощи аппроксимативной модели квазистационарного состояния (КСС) (Gibiansky and Gibiansky (2009) Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 5: 803-812). Предположение о том, что процесс ассоциации между лекарственным средством и мишенью происходит намного быстрее, чем процессы диссоциации, распределения и элиминации лекарственного средства, а также намного быстрее элиминации мишени и комплекса лекарственное средство-мишень, приводит к упрощенной модели МОРП (Фиг. 2, Таблица 4). Объем данных для низких концентраций был относительно небольшим, потому не все параметры были рассчитаны при одной загрузке программного обеспечения. Поэтому, параметры модели МОРП были сначала рассчитаны на основании данных исследований с низкой разовой дозой - № 7 и 8. Полученные значения параметров МОРП затем оставались фиксированными во время окончательных расчетов для всего набора данных (Таблица 4).

Таблица 4. Результаты популяционного моделирования ФК, значения параметров и стандартные ошибки в процентах (%СОС)
	Конечные значения параметров	Межсубъектная вариабельность/ остаточная вариабельность
Параметр	Типовое значение	%СОС	Величина	%СОС
F	0,227	121	Н/Р	-
KA (л/сутки)	0,399	20,5	КВ: 42,1%	53,8
CL (л/сутки)	0,0187	5,17	КВ: 42,9%	20,1
VЦ (л)	0,141	3,23	КВ: 19,8%	22,5
Q (л/сутки)	0,127	14,7	Н/Р	-
VП (л)	0,127	6,45	КВ: 39,4%	20,8
KINT (1/сутки)	0,1	ФИКС.	КВ: 49,3%	36,7*
KSS (1/сутки)	5,68	38,7*	Н/Р	-
KSYN (ед/л/сутки)$	0,04	ФИКС.	Н/Р	-
KDEG (1/сутки)	0,00452	30,1*	Н/Р	-
ПУТЬ на VЦ	-0,697	6,51	Н/Р	-
RV add	3,17E-04	21,2	СО: 0,0178	-
RV prop	0,0677	1,58	КВ: 26,0%	-
Минимальное значение целевой функции=5748,412
$ KSYN - скорость синтеза рецептора CD38. Поскольку фактические измерения концентрации или информация о скорости синтеза или деградации CD38 in vivo не были доступны, в качестве единицы для некоторого неизвестного количества CD38 использовали «ед». * Значения параметров и стандартные ошибки для параметров МОРП были получены из одной загрузки программы, которая фокусировалась на данных от групп с низкой дозой, и затем были зафиксированы для конечной оценки других параметров ФК. Н/Р - не рассчитано; СОС - стандартная ошибка среднего; КВ - коэффициент вариации; ФИКС. - фиксированное значение; СО - стандартное отклонение.

[00280] Значения параметров абсорбции - K_A и F - были получены при добавлении данных, полученных от групп п/к. Все данные по п/к введению были получены от четырех групп с более низкой разовой дозой из исследований № 7 и 8. Эти более низкие дозы (≤1 мг/кг) охватывают клинически значимый диапазон, но могут ограничивать возможность обобщения значений параметров для более высоких доз.

[00281] Межсубъектная вариабельность (МСВ) для параметров ФК была описана с помощью экспоненциальных моделей. Коэффициент абсорбции (K_A), клиренс (CL) и периферический объем распределения (V_П) имеют значение МСВ около 40%, а центральный объем распределения (V_Ц) - около 20% (Таблица 4). Ковариационный анализ выявил влияние пути введения на V_Ц. Типовое значение для V_Ц составило 0,141 л при в/в введении, и 0,043 л (примерно на 70% меньше) при п/к введении. Других значимых ковариационных эффектов выявлено не было. Из-за ограниченного объема данных для низких концентраций межсубъектная вариабельность и индивидуальные прогнозы параметров МОРП были рассчитаны только для скорости интернализации K_INT (МСВ: 49%). Оценка модели на основе остаточной ошибки, ЗЦФ, стандартной ошибки, графиков КАМ и отдельных функций кривой подтвердила, что конечная модель достоверно описала ФК для AB79 у здоровых макак (Таблица 4, Фиг. 4A-4J).

Фармакодинамика

[00282] Уровень связывания AB79 NK-, Т- и В-клетками крови человека и макаки сравнивали с помощью проточной цитометрии. Как продемонстрировано на Фиг. 5, лимфоциты макаки имели уровни экспрессии CD38, судя по показателю МЭРФ (молекулы эквивалентного растворимого флуорохрома) для AB79, которые были немного ниже по сравнению с лимфоцитами человека, но с похожей взаимосвязью между типами клеток, например, экспрессия CD38 подчинялась следующей иерархии: NK-клетки > В-клетки > Т-клетки. Эти данные подтверждают использование данного вида приматов, отличных от человека, в качестве релевантной модели, чтобы помочь смоделировать потенциальную активность AB79 для человека.

[00283] Для углубленного количественного анализа взаимосвязей между экспозицией препарата (ФК) и степенью и продолжительностью деплетирования клеток (ФД) мы составили наборы данных по ФК концентрациям, количеству NK-клеток, B-клеток и T-клеток из всех 8 исследований на макаках, включая группы плацебо, где это возможно (Таблица 2). Первоначальная характеризация набора данных продемонстрировала, что на базовом уровне Т-клетки имели значение медианы в 3732 клеток на мкл (межквартильный интервал (МКИ): 2 881-5 176), и являлись наиболее распространенной субпопуляцией лимфоцитов по сравнению с В-клетками с показателем в 1279 клеток на мкл (МКИ: 860,8-1890) и NK-клетками с показателем в 685 клеток на мкл (МКИ: 482,8-970,1). Базовые уровни экспрессии CD38 в этих клеточных субпопуляциях были оценены в исследованиях № 1-4 (Таблица 2, n=67). 86,7% (СО: 11,3) NK-клеток экспрессировали CD38 с меньшей вариабельностью. Напротив, 58,7% (СО: 27,0) B-клеток и 34,5% (СО: 24,5) T-клеток экспрессировали CD38 с большей вариабельностью.

[00284] Данные от животных, получавших плацебо, продемонстрировали, что среднее количество клеток каждого типа варьировало во времени у каждого отдельного животного больше, чем можно было бы ожидать исходя из внутрисубъектной вариабельности (Фиг. 6). Например, средний коэффициент вариации для количества В-клеток на отдельных кривых плацебо составил 27%, но индивидуальные средние количества В-клеток варьировали от 436,6 до 4389. Кроме того, были также различия между средними базовыми уровнями лимфоцитов у самцов и самок, и у животных из разных исследований, что усиливает вариабельность (Фиг. 7). На основании этих результатов каждый подсчет клеток после введения препарата рассчитывали относительно ее индивидуального базового уровня в процентах, а не в виде абсолютных значений в каждый момент времени. Например, значение 33% означает, что количество клеток в образце составило 1/3 от базового количества клеток. Такой подход обеспечил получение стандартизированных значений, которые можно сравнивать по всему набору данных.

[00285] Быстрое начало деплетированияклеток, связывающих AB79, позволяет предположить, что снижение количества лимфоцитов связано с начальной концентрацией в крови (Фиг. 8). При внутривенных дозах AB79 в 0,3 мг/кг медиана максимального эффекта на NK-клетки составила 93,9% (т.е. оставалось 6,1% от базового количества клеток). При 0,1 мг/кг пик деплетированиясоставил 71% (осталось 29% от базового уровня). При дозах >0,3 мг/кг NK-клетки были почти полностью деплетированыдеплетированы в модельной камере крови (минимальное значение и диапазон составили, соответственно, 1,06% от базового уровня и 0,17-6,23; Фиг. 8А). После однократного введения дозы в 0,3 мг/кг NK-клеткам потребовалось приблизительно 7 суток для восстановления в среднем до 50% от базового уровня, хотя кинетика восстановления имела высокую межсубъектную вариабельность (Фиг. 8B и 8C). В соответствии с этими результатами, функция NK-клеток была также протестирована на подгруппе животных в исследовании № 7 (n=3/группа; Таблица 2). Этот эксперимент продемонстрировал дозозависимое снижение с минимальными изменениями активности NK-клеток в крови через 48 часов после введения препарата у животных, получавших 0,1 мг/кг AB79 (% лизиса ± СО при соотношении эффектор : целевое значение=100 : 1 составил 44,5% ± 23,6% по сравнению с 41,4% ± 25,8%) и почти полную потерю активности NK-клеток у животных, получавших 1,0 мг/кг (% лизиса ± СО при соотношении эффектор : целевое значение=100 : 1 составил 37,4% ± 10,3% по сравнению с 6,8% ± 12,5%). Функция NK-клеток восстановилась на 57-е сутки, и на следующий измеренный момент времени % лизиса ± СО при соотношении эффектор : целевое значение=100 : 1 составил 16,0% ± 11,9%.

[00286] Популяции В-клеток и Т-клеток были деплетированы в меньшей степени по сравнению с NK-клетками, что согласуется с их более низкими уровнями экспрессии CD38 (Фиг. 5). Например, при внутривенной дозе AB79 в 0,3 мг/кг медиана максимального уровня деплетирования для В-клеток составила 45% от базового уровня, а Т-клетки были деплетированы до 43% от базового уровня (Фиг. 8D и 8G). При этой дозе 50%-е снижение числа В-клеток по сравнению с базовым уровнем было достигнуто не у всех животных. Только при самых высоких дозах ≥30 мг/кг В-клетки были почти полностью деплетированы (Фиг. 8D). Т-клетки были деплетированы до такой же степени, что и В-клетки, но восстановление происходило быстрее (Фиг. 8G-8I).

[00287] В двух исследованиях, № 7 и 8, сравнивалось в/в и п/к введение дозы (Фиг. 8C, 8F и 8I). Очевидные различия в деплетировании клеток относительно путей введения отсутствовали. При более низких дозах (исследование № 8) устойчивое (>24 часа) деплетирование клеток на 50% ниже базовых значений наблюдалось только в популяции NK-клеток, но не у Т- и В-клеток; хотя у всех клеток наблюдалось специфическое деплетирование в ранние моменты времени. Время начала деплетирования NK-клеток оказалось одинаковым между группами доз независимо от пути введения, а продолжительность деплетирования зависела от дозы. Восстановление клеток во всех тестируемых группах наблюдалось на 57-е сутки.

Модели ФК-ФД

[00288] Были разработаны отдельные модели ФК-ФД для описания эффектов воздействия AB79 на NK-, B- и T-клетки. При моделировании ФК-ФД параметры ФК оставались фиксированными и равными значениям, полученным в конечной модели ФК, и были испробованы различные модели ФД. Популяция NK-клеток в периферической крови была достоверно описана с помощью модели оборота, а истощающий эффект лекарственного средства был связан через ФК концентрацию и типовую модель Emax со скоростью деплетирования. В этой модели EMAX обозначает максимальную скорость дополнительного деплетирования NK-клеток, а C50 - концентрацию, при которой скорость дополнительного деплетирования NK-клеток составляет половину от максимальной. Структурная модель ФК-ФД для NK-клеток имела следующую форму:

[00289] В данной формуле NK обозначает фактическое количество NK-клеток, K_IN - скорость продуцирования, а K_OUT - скорость элиминации при отсутствии лекарственного средства. Обратите внимание, что с данным базовым измерением BL K_OUT, определяемым уравнением K_OUT=K_IN/BL, с обозначает концентрацию AB79 в центральной камере модели. При одновременном расчете всех параметров программа не давала стабильных результатов. Индивидуальные параметры KIN, EMAX и C50 были высококоррелированными. Кроме того, из-за ограниченной дифференциации между максимальными эффектами различных доз (см. предыдущий раздел) и высокой межсубъектной вариабельностью, было невозможно ожидать точной оценки всех параметров. В ряде расчетов один или два из трех параметров KIN, EMAX и C50 приравнивали к разным значения и рассчитывали оставшиеся параметры. При фиксированных параметрах KIN=10000 и EMAX=322 была достигнута стабильная работа программы и приемлемое значение критериев адекватности модели. Типовое расчетное значение C50 составило 29,0 мкг/мл (Таблица 5). Кроме того, чувствительность выбранных значений KIN и EMAX была проверена путем выбора различных комбинаций более высоких и более низких значений. Межсубъектная вариабельность была высокой, и для NK-клеток составляла 113% для скорости продуцирования (K_IN) и 149% для C50, что соответствует большим индивидуальным различиям в базовых уровнях и между животными, которым вводили препарат. Оценка модели проводилась на основе остаточной ошибки, ЗЦФ, стандартной ошибки, графиков КАМ и отдельных функций кривой (Таблица 5, Фиг. 9).

Таблица 5. Результаты моделирования ФД, значения параметров и стандартные ошибки в процентах (%СОС)
	Конечные значения параметров	Межсубъектная вариабельность/остаточная вариабельность
Параметр	Типовое значение	%СОС	Величина	%СОС
NK-клетки
KIN (количество/сутки)	10000	ФИКС.	КВ: 113%	19,2
C50 (мкг/мл)	29,0	18,8	КВ: 149%	25,1
EMAX	322	ФИКС.	Н/Р	-
Базовый уровень (NK-клетки)*	Н/Р	-	КВ: 28,3%	20,8
Остаточные NK-клетки	0,291	2,42	КВ: 53,9%	-
B-клетки
СВП (сутки)	8,48	15,4	КВ: 135%	17,4
C50 (мкг/мл)	19,5	7,58	Н/Р	-
EMAX	2,37	ФИКС.	Н/Р	-
Базовый уровень (В-клетки)*	Н/Р	-	КВ: 24,1%	10,7
Остаточные В-клетки	0,136	2,20	КВ: 36,9%	-
Т-клетки
C50 (мкг/мл)	11,86	7,267	Н/Р	-
EMAX	0,4656	6,578	КВ: 69,46%	29,50
Базовый уровень (Т-клетки)*	Н/Р	-	КВ: 29,08%	15,50
Остаточные Т-клетки	0,1343	2,406	КВ: 36,65%	-
* Для каждого отдельного животного типичное базовое значение рассчитывали как среднее от всех измерений перед введением дозы. Н/Р - не рассчитано; СОС - стандартная ошибка среднего; КВ - коэффициент вариации; ФИКС. - фиксированное значение.

[00290] Транзитная камерная модель превосходила модели прямого ответа или оборота в описании деплетирования популяции В-клеток, вызванного антителом АВ79. Четыре транзитные камеры оказались подходящими для модели, и эффект лекарственного средства на скорость деплетирования был описан с помощью типовой модели Emax. Подобно модели деплетирования NK-клеток, EMAX обозначает максимальную скорость, а C50 - концентрацию, при которой скорость составляет половину от максимальной. Таким образом, структурная модель ФК-ФД для B-клеток определяется следующими пятью уравнениями:

[00291] TR_i (i=1-4) обозначает четыре транзитные камеры. K_TR, K_PROL и K_CIRC определяются следующими уравнениями: K_TR=K_PROL=K_CIRC=4/СВП, где СВП - среднее время прохождения (Friberg et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20: 4713-4721). B обозначает количество В-клеток в крови, а c - концентрацию AB79 в центральной камере.

[00292] При фиксированном EMAX=2,37 типовое значение C50 составило 19,5 мкг/мл, а типовое среднее время прохождения (СВП) составило 8,48 суток (Таблица 5). Задержка максимального эффекта относительно максимальной концентрации AB79 была зарегистрирована явно. Модель указывает, что AB79 в первую очередь влияет на циркулирующие В-клетки. Никаких дополнительных эффектов и никаких петель обратной связи к клеткам-предшественникам не требовалось для описания доступных данных по B-клеткам макаки. Межсубъектная вариабельность параметра СВП, составляющая 135%, и базового уровня (БУ) В-клеток, составляющая 24,1%, указывает на большие индивидуальные различия между животными.

[00293] Вызванное лекарственным средством деплетирование Т-клеток с быстрым восстановлением было достоверно описано с помощью модели прямого ответа: T(c) = БУ_T * (1 - EMAX*c/(c+C50)), где T обозначает фактическое количество T-клеток, БУ_T - базовый уровень Т-клеток, а c - концентрацию AB79 в центральной камере модели. Типовое значение C50 составило 11,86 мкг/мл, а типовое значение EMAX составило 0,47, что указывает на то, что в этом случае АВ79 может истощить только около половины популяции Т-клеток (Таблица 5). Обратите внимание, однако, что межсубъектная вариабельность для EMAX составила почти 70%. В этой модели, в отличие от моделей деплетирования NK- и B-клеток, C50 представляет собой концентрацию, при которой деплетирование T-клеток было наполовину максимальным.

[00294] Как и для NK-клеток, оценка окончательных моделей ФК-ФД для B- и T-клеток на основе остаточной ошибки, ЗЦФ, стандартной ошибки, графиков КАМ и отдельных функций кривой подтвердила, что они достоверно описали доступные данные, полученные на макаках (Таблица 5, Фиг. 9).

Моделирование ФК и деплетирования популяций клеток человека

[00295] Модели ФК и ФК-ФД, полученные на основании результатов исследований макак, были использованы в качестве отправной точки для основанной на модели симуляции ФК и данных о количестве клеток для человека, чтобы обосновать план и выбранные дозы для первого клинического испытания на людях (ПКИЛ) - здоровых добровольцах. С этой целью было выдвинуто предположение, что модельные структуры, включая МОРП, полученные на основании результатов исследований макак, также описывают основные особенности человеческой ФК и последующего деплетирования популяции лимфоцитов. Чтобы получить прогнозы для параметров ФК человека, мы масштабировали расчетные показатели следующих параметров ФК макаки: центральный и периферический объем распределения (V_Ц, V_П), а также клиренс (CL) и межкамерный клиренс (Q) с прямым подходом для моноклональных антител (Han and Zhou (2011) Ther. Deliv. 2: 359-368). AB79 является полностью человеческим моноклональным антителом, и поэтому мы ожидаем, что иммуногенность у людей будет меньшей, чем у макак. Следовательно, для моделирования и симуляции мы исключили из набора данных АПЛП-положительные образцы.

[00296] Используя масштабированную модель, была смоделирована экспозиция и профили деплетирования NK-, B- и T-клеток для однократных доз, вводимых посредством инфузии (в/в) в течение 2 часов или посредством подкожной инъекции (п/к), составляющих от 0,0003 до 1,0 мг/кг, как планировалось для исследования ПКИЛ (Фиг. 10). В соответствии с результатами моделирования, после в/в дозы в 0,0003 мг/кг какого-либо наблюдаемого лекарственного воздействия на количество лимфоцитов и даже измеримых концентраций ФК выше НПКО ожидать не следует. Из-за изменчивости и из-за ограниченного размера групп дозировок предполагалось, что минимально обнаруживаемым эффектом лекарственного средства на количество NK-клеток будет снижение по меньшей мере на 10%. При дозах 0,01 мг/кг в/в и 0,03 мг/кг п/к было спрогнозировано, что количество NK-клеток должно было истощиться до уровня, который ниже оставшихся 90% от базового уровня.

[00297] При в/в дозе в 0,3 мг/кг мы прогнозировали деплетирование популяции NK-клеток до оставшихся 17% от базового уровня в течение 3 часов после окончания инфузии и восстановление до более чем 50% через 11 суток (Фиг. 10). При той же дозе модель прогнозирует, что популяция В-клеток максимально истощается до 67% от базового уровня через 2,5 суток, а популяция Т-клеток немедленно истощается до 86% от базового уровня. Для подкожного введения той же дозы в 0,3 мг/кг модель спрогнозировала меньшее и более долгое максимальное деплетирование (минимумы относительно базового уровня: NK-клетки - 37%, B-клетки - 74%, T-клетки - 94%).

[00298] Эти доклинические исследования in vitro и in vivo демонстрируют, что макака является подходящей животной моделью для изучения фармакологии AB79. Данные о количестве NK-, B- и T-клеток, основанные на множестве отобранных образцов из восьми исследований на макаках с различными дозами и режимом дозирования, обеспечивают богатый источник данных для обширного и количественного понимания взаимосвязей между дозой AB79, экспозицией и деплетированием популяции клеток. Сгенерированные популяционные модели ФК и ФК-ФД достоверно описывают полученные данные и предоставляют мощный инструмент для прогнозирования экспозиции и деплетирования популяции лимфоцитов не только для будущих исследований на макаках, но и для клинических испытаний на людях.

[00299] Было проведено первое испытание на человека (ПКИЛ) с применением однократного повышения дозы на здоровых добровольцах (www.clinicaltrials.gov: NCT02219256) (Фиг. 11). Целевой фармакологический эффект AB79 - деплетирование популяции активированных лимфоцитов. Чрезмерное и длительное деплетирование популяции лимфоцитов (усиленная фармакология) может привести к нарушениям иммунной системы, что является неприемлемым для пациентов или здоровых участников исследования. Поэтому для ПКИЛ была выбрана безопасная начальная доза для в/в введения - 0,0003 мг/кг.

[00300] Полученные из исследований на макаках данные свидетельствуют о том, что деплетирование популяции NK-клеток было определено как наиболее чувствительный биологический эффект. Результаты моделирования ФК для NK-клеток помогли определить минимальный уровень дозы - 0,01 мг/кг в/в, при котором наиболее чувствительный фармакологический эффект (деплетирование популяции NK-клеток) можно было бы обнаружить у людей. Появившиеся данные исследования ПКИЛ продемонстрировали, что общий характер дозозависимых и специфических для типа клеток истощающих эффектов AB79 соответствует прогнозам, полученным на основе моделей (рукопись находится в стадии подготовки). Судя по всему, AB79 является даже более эффективным, чем прогнозировалось. Например, при в/в дозе в 0,03 мг/кг популяция NK-клеток у людей истощалась до уровня, составляющего менее 10% от базового уровня. Медиана минимального показателя деплетирования у макак при этой дозе составляла 20,0% (Фиг. 8).

[00301] Три цитолитических анти-CD38 моноклональных антитела (даратумумаб, SAR650984 и MOR202) находятся на стадии клинических испытаний для лечения множественной миеломы (van de Donk et al. (2016) Immunol. Rev. 270: 95-112). Даратумумаб (Дарзалекс™, вводимый в виде внутривенной инфузии) недавно был одобрен для лечения множественной миеломы в США и неходжкинской лимфомы в Европе. В отличие от AB79, даратумумаб не имеет перекрестной реактивности с CD38 макаки. Таким образом, сравнение наших результатов для AB79, полученных из исследований на макаках, с результатами для даратумумаба является невозможным. Кроме того, у пациентов с множественной миеломой присутствует большое количество CD38-положительных злокачественных клеток, что может потребовать более высоких эффективных концентраций антитела для терапии данного типа рака (de Weers et al. (2011) J. Immunol. 186: 1840-1848).

[00302] Примечательно, тем не менее, что даратумумаб в еженедельной в/в дозе 16 мг/кг одобрен для терапии множественной миеломы, хотя AB79 обеспечивает полное деплетирование популяции периферических NK-клеток в дозе около 1 мг/кг и В-клеток - в дозе около 3 мг/кг (Фиг. 8).

[00303] Несмотря на богатую базу данных, основанную на 8 проведенных на макаках исследованиях, был выявлен ряд ограничений. AB79 эффективно деплетирует популяцию NK-клеток даже при самой низкой изученной дозе в 0,03 мг/кг. При таких низких дозах параметры ФК быстро опускаются ниже предела количественного определения биоаналитического анализа, что препятствует определению зависимость экспозиция - эффект при более низких дозах. Кроме того, во время доклинических испытаний было выявлено, что максимальное деплетирование клеток происходит вскоре после достижения максимальной концентрации лекарственного средства, но определение ранней фазы деплетирования технически ограничено общим количеством образцов и, потенциально, неспецифическим деплетированием клеток из-за повторных заборов крови (эффект забора крови). Эффект забора крови наблюдался как транзиторная панцитопения, характеризующаяся деплетированием тех типов клеток, которые не связывают AB79 (например, эритроциты), и не зависел от дозы, указывая на то, что данный эффект связан с потерей объема крови в результате многочисленных заборов крови, а не с какими-либо AB79-специфическими эффектами (Фиг. 12). Следовательно, возможность точной оценки параметров модели, особенно для деплетирования популяции NK-клеток, была ограничена, и для достижения стабильных и достоверных результатов оценки типовые значения KIN и EMAX должны быть фиксированными.

[00304] Влияние AB79 на тканевые плазматические клетки или плазменные бласты не может быть измерено. Однако, подобно плазматическим клеткам и плазменным бластам, NK-клетки имеют высокие уровни CD38 на своей поверхности, и эффективность деплетирования клеток в конкретной субпопуляции лимфоцитов зависела, по крайней мере частично, от уровней экспрессии CD38. Следовательно, цитолитический эффект АВ79 на плазмобласты и плазматические клетки может быть сопоставим с эффектом на NK-клетки. В настоящее время информация о долгосрочных эффектах лечения макак антителом AB79 ограничена. Только небольшая подгруппа животных в 13-недельных токсикологических исследованиях была исследована в группе выздоровления в течение более длительного периода времени, и у большинства животных во всех группах дозы образовались АПЛП (Фиг. 3). Кроме того, базовые значения и профили деплетирования различных субпопуляций лимфоцитов имели высокую межсубъектную вариабельность. Следовательно, долгосрочные эффекты AB79 не могут быть исследованы на макаках и должны быть изучены на людях.

[00305] С появлением новых данных из исследований на человеке будет интересно детально сравнить данные ФК и ФД для человека и макаки. Построение модели ФК на основе данных из исследований на человеке и сравнение с моделью, основанной на данных из исследований на макаках, позволит усовершенствовать модель МОРП для AB79. Данные, полученные в исследованиях на пациентах, позволят понять, насколько АВ79-опосредованное деплетирование популяции клеток В-лимфоцитарного происхождения может быть сопоставимым между пациентами с РА и СКВ, а также между пациентами со множественной миеломой и здоровыми субъектами. Исследование факторов, связанных с субъектом или заболеванием, которые могут влиять на эффективность деплетирования клеток в дополнение к уровням экспрессии CD38, также является важным и может привести к персонализации лечения. Кроме того, тщательное непосредственное сравнение АВ79 с даратумумабом и (или) другими антителами к CD38 in vitro и in vivo позволит получить ценную информацию о фармакологии анти-CD38 антител и их оптимальном применении.

[00306] Богатые фармакологические данные и модели ФК и ФК-ФД позволили охарактеризовать зависимость экспозиция - эффект для яванской макаки. Основанный на модели анализ NK-, B- и T-клеток подтвердил и количественно определил наблюдение, что каждая из субпопуляций лимфоцитов крови истощается антителом с разной скоростью и требует разных временных интервалов для переполнения модельной камеры крови. Модели оказались отличным средством для моделирования данных ФК и ФД в различных сценариях дозирования при подготовке клинических испытаний.

Пример 2: Деплетирование популяции CD38-положительных клеток антителом AB79

[00307] Таблица 6 демонстрирует, что AB79 опосредует деплетирование клеток путем антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) и комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ). Клеточные линии с повышенной экспрессией CD38 были более восприимчивы к АЗКЦ. АЗКЦ не наблюдалась в клеточной линии лимфобластов человека, которая не экспрессировала CD38 (MV-4-11), или в клеточной линии яичника китайского хомяка, трансфицированной CD157 - молекулой, тесно связанной с CD38 (данные не продемонстрированы). В отличие от других В-клеточно-селективных методов лечения, которые нацелены на CD20 и напрямую не деплетируют плазменные бласты, которые имеют низкий или отрицательный уровень экспрессии CD20, CD38 экспрессируется на высоком уровне на плазменных бластах и плазматических клетках, что делает эти клетки прямой мишенью для AB79. Исследования in vitro с клетками крови человека и клеточными линиями продемонстрировали, что связывание AB79 с CD38 не приводит к активации цитокинов МКПК, демонстрируя то, что AB79 не является агонистом, как обсуждается ниже. Скорее, препарат АВ79 опосредовал деплетирование клеток человека В-лимфоцитарного происхождения путем АЗКЦ и КЗЦ, а клеточные линии с повышенной экспрессией CD38, в большинстве случаев, были более подвержены клеточному лизису.

Таблица 6. AB79 опосредует деплетирование клеточных линий человека В-лимфоцитарного происхождения путем АЗКЦ и КЗЦ
Клеточная линия	CD38 Число антигенных участков рецептора	АЗКЦ EC50 ± СО (нМ)	КЗЦ EC50 ± СО (нМ)
Molp8	623891	0,05 ± 0,04 n=9	1,1 ± 1,0 n=7
Daudi	417874	0,03 ± 0,04 n=4	1,6 ± 0,4 n=3
NCI-H929	82341	0,14 ± 0,11 n=6	Н/В
RPMI-8226	98080	0,46 ± 0,53 n=8	Н/В
OPM2	54556	0,65 ± 0,64 n=4	Н/В
ЕС50-50%-я эффективная концентрация; Н/В - не выполнено; СО - стандартное отклонение.

[00308] Это согласуется с результатами наблюдений, полученными из исследований на здоровых яванских макаках, где эффективность деплетирования коррелировала с уровнем экспрессии CD38 и уровнем дозы AB79. Популяция NK-клеток, которая экспрессируют высокие уровни CD38, была истощена в большей степени, чем CD20+ B-клетки и CD3+ T-клетки, которые экспрессируют меньше CD38 (Фиг. 13). AB79 эффективно подавлял реакции вторичного иммунитета B-клеток человека на антиген in vivo в мышиной модели адоптивного переноса (Фиг. 14). Вместе эти данные подтверждают необходимость дальнейшего изучения AB79 при аутоиммунных заболеваниях.

[00309] МКПК человека обрабатывали антителом AB79 в нескольких условиях и измеряли высвобождение воспалительных цитокинов. Яванская макака была использована для демонстрации взаимосвязи специфичного для типа клеток деплетирования и дозы AB79, потому что AB79 перекрестно реагирует с CD38 макаки, белок CD38 которой на 91% идентичен белку CD38 человека. Вторую животную - адоптивный перенос МКП человека в организм мыши - использовали для определения того, может ли AB79 нацеливаться на клетки, продуцирующие антитела человека.

AB79 связывает CD38 и опосредует АЗКЦ и КЗЦ

[00310] Число антигенных участков рецептора определяли с помощью набора реактивов «QIFIKIT®» (DAKO, кат. № K0078) с использованием мышиного антитела против CD38 человека (клон HIT2) и рассчитывали путем преобразования средней интенсивности флуоресценции (СИФ) окрашенных образцов в количественный результат по калибровочной кривой, сгенерированной из СИФ 5-ти популяций микрогранул, связанных с определенным количеством молекул антитела. Число антигенных участков рецептора рассчитывали путем вычитания СИФ изотип-контроля (мышиный IgG1) из СИФ анти-CD38 антитела.

[00311] КЗЦ оценивали путем посева клеточных линий по 10000 кл./лунка и добавления АВ79, IgG-контроля или среды. Выполнялась построение кривой доза-ответ по 5 концентрационным точкам (0,001-10 мг/мл) в соответствии со стандартной практикой. Комплемент кролика (2-15 мкл; CedarLane Laboratories; № по каталогу: CL 3441) добавляли в каждую лунку, кроме контрольных. Набор реактивов «CytoTox-Glo» (Promega, G7571/G7573) использовали для определения цитотоксичности по уровню люминесценции. Тестируемые группы: только клетки; клетки+комплемент; клетки+IgG-контроль+комплемент; клетки+AB79+комплемент. Уравнение расчета %КЗЦ: %КЗЦ=100 - ((ОЕЛ (тест) / ОЕЛ (только комплемент)) X 100), где ОЕЛ - относительные единицы люминесценции.

[00312] АЗКЦ исследовали путем посева целевых клеток («Ц», клеточные линии) по 5000 кл./лунка с 50 мл AB79, IgG-контроля, Тритона X-100 (1%; Sigma Chemical) или только среды, и с 50 мл эффекторных («Э») МКПК человека в соотношении клеток Ц:Э от 1:25 до 1:50. Выполнялась построение кривой доза-ответ по 9 концентрационным точкам антитела (0,000001-100 нМ) в соответствии со стандартной практикой. Экспериментальный лизис=МКПК+клеточная линия+антитело. Спонтанный лизис=МКПК+клеточная линия без антитела. Максимальный лизис=клеточная линия+Тритон Х-100. Цитотоксичность оценивали с использованием набора реактивов «CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Luminescence assay» (Promega).

AB79 не обладает агонистической активностью

[00313] Способность AB79 индуцировать выработку цитокинов в обработанных данным антителом МКПК человека сравнивали с отрицательным изотип-контролем IgG1 и положительным контролем, ФГА, анти-CD3 (клон OKT3) или анти-CD52 (Campath) антителами (Фиг. 15 и 16).

[00314] Растворимый препарат AB79 не привел к увеличению уровней ИЛ-6 (среднее значение ± стандартное отклонение) в МКПК, собранных у 4 различных субъектов после 24-часовой инкубации, по сравнению с изотип-контролем IgG1. ФГА привел к увеличению уровней цитокинов у всех субъектов, демонстрируя, что клетки обладают способностью вырабатывать ИЛ-6 (Фиг. 15). Похожие результаты наблюдались при стимуляции МКПК в течение 48 часов и при анализе на ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ГМ-КСФ, ИФН-γ и ФНО-α (данные не продемонстрированы).

[00315] Метод, с помощью которого антитело презентуется клетке, может влиять на эффект антитела - захват лиганда и клеточный ответ (Stebbings et al. (2007) J. Immunol. 179: 3325-3331). Стеббингс (Stebbings) и соавт. продемонстрировали, что максимальный клеточный ответ (высвобождение цитокинов) на агонистическое антитело наблюдается тогда, когда антитело является высоко концентрированным и связанным с поверхностью лунки - например, когда антитело добавляется в лунку в растворе и жидкости дают испариться (сухое связывание), по сравнению с антителом, которое связывается с поверхностью лунки в растворе (мокрое связывание) или с антителом, добавленными непосредственно в суспензию МКПК (связывание в растворе) (Фиг. 16А). Препарат AB79 не вызвал стимуляцию выработки цитокинов при использовании любого из этих подходов (Фиг. 16B).

[00316] AB79 (100 мг/мл) не вызвал стимуляцию выработки ИЛ-2, -4, -6, -8, -10, ГМ-КСФ, ИФН-γ или ФНО-α ни в одном из экспериментальных условий после 24 часов. AB79 не привел к индукции ИЛ-10 или ГМ-КСФ, но оба цитокина были индуцированы анти-CD3 антителом (не продемонстрировано; все значения, кроме анти-CD3, были ниже НПКО). ИЛ-8 вырабатывался в МКПК конститутивно, и не был изменен никакой из обработок (данные не продемонстрированы) (Таблица 7).

Таблица 7. AB79 и стимуляция выработки цитокинов
Презентация антител	Без стимуляции	Изотип-контроль	AB79	Анти-CD52	ФГА	Анти-CD3
ИЛ-2
Связывание в растворе	НПКО	НПКО	НПКО	НПКО	14953 ± 3117	Н/В
Мокрое связывание	НПКО	НПКО	НПКО	НПКО	Н/В	395,0 ± 64,8
Сухое связывание	НПКО	НПКО	НПКО	НПКО	Н/В	167,9 ± 90,1
ИЛ-4
Связывание в растворе	7,3 ± 1,4	4,1 ± 0,8	6,4 ± 3,2	6,9 ± 4,0	50,4 ± 8,9	Н/В
Мокрое связывание	5,3 ± 0,08	3,8 ± 1,5	6,4 ± 0,6	8,5 ± 3,7	Н/В	17,8 ± 2,4
Сухое связывание	4,4 ± 1,8	7,8 ± 2,7	9,1 ± 2,6	10,5 ± 2,1	Н/В	16,2 ± 3,1
ИЛ-6
Связывание в растворе	325,1 ± 65,3	236,0 ± 98,9	170,5	202,0 ± 48,0	18880 ± 0	Н/В
Мокрое связывание	216,8 ± 95,1	191,2 ± 47,0	194,6 ± 66,0	207,2 ± 60,2	Н/В	902,7 ± 114,1
Сухое связывание	165,0 ± 79,4	369 ± 143	465,8 ± 230	811,1 ± 473,7	Н/В	500 ± 17
ИФН-γ
Связывание в растворе	1190,2 ± 117,5	857,1 ± 311,7	770,1 ± 203,6	1116,9 ± 330,8	15857 ± 4614,8	Н/В
Мокрое связывание	1052,8 ± 385,8	657,2 ± 222,6	993,4 ± 198,1	1138,9 ± 339,1	Н/В	5674,6 ± 564,7
Сухое связывание	768,1 ± 110,0	1583,1 ± 418,6	1927,6 ± 517,6	1827,0 ± 281,5	Н/В	3513,2 ± 708,3
ФНО-α
Связывание в растворе	28,71 ± 8,1	11,6 ± 7,1	59,6 ± 90,1	79,9 ± 18,2	9270,0 ± 0	Н/В
Мокрое связывание	16,5 ± 3,4	16,1 ± 3,9	14,8 ± 8,8	166,1 ± 21,7	Н/В	2123,3 ± 239,7
Сухое связывание	16,2 ± 7,4	919,2 ± 77,4	745,1 ± 141	984,4 ± 317,0	Н/В	2231,6 ± 687

Для измерения концентраций ИЛ-2, -4, -6, -8, -10, ГМ-КСФ, ИФН-γ и ФНО-α проводился мультиплексный анализ цитокинов в соответствии с инструкциями производителя (набор реактивов «Bio-Plex ProTM Human Cytokine Standard 8-Plex»). Сокращения: НПКО - нижний предел количественного определения; Н/В - не выполнено; ФГА - фитогемагглютинин; МКПК - мононуклеарные клетки периферической крови.

AB79 деплетирует популяцию клеток CD38+

[00317] AB79 связывает CD38 с высокой аффинностью и опосредует КЗЦ и АЗКЦ. AB79 не является агонистом и не индуцирует высвобождение цитокинов из МКПК человека. AB79 связывает CD38 как человека, так и яванской макаки. Лимфоциты обоих видов имели сходные клеточно-специфические паттерны экспрессии CD38 с иерархией NK-клетки > В-клетки > T-клетки на основе средней интенсивности флуоресценции при окрашивании на AB79. Обработка антителом AB79 привела к деплетированию популяции лимфоцитов макаки обратимым, клеточноспецифическим и дозозависимым образом. AB79 эффективно подавлял реакции вторичного иммунитета в мышиной модели адоптивного переноса.

Пример 3: Оценка связывания AB79 с эритроцитами и тромбоцитами человека и яванской макаки

[00318] Было проведено исследование AB79 - полностью человеческого высокоаффинного неагонистического моноклонального антитела изотипа IgG1 против CD38 человека - для определения его связывания с эритроцитами или тромбоцитами человека или яванской макаки (яванец). Тридцать образцов крови от здоровых людей-добровольцев и тридцать образцов цельной крови от здоровых яванцев были исследованы на предмет связывания AB79 по сравнению с паливизумабом - контрольным моноклональным антителом того же изотипа, имеющим отличную от AB79 специфичность, и которое не связывается с эритроцитами или тромбоцитами.

Методы

[00319] Образцы крови от 30 здоровых людей-субъектов (15 мужчин и 15 женщин) для исследования тромбоцитов, от 25 мужчин и 5 женщин - для исследования эритроцитов и 30 образцов от яванских макак китайского происхождения (15 самцов и 15 самок) были приобретены у компании «Bioreclamation» (Лонг-Айленд, Нью-Йорк). Цельная кровь была собрана в пробирки с цитратом натрия и доставлена в течение ночи при температуре окружающей среды.

[00320] Для оценки связывания AB79 с тромбоцитами 50 мкл цельной крови окрашивали с перекрестно-реактивным моноклональным антителом макаки против CD61 человека, конъюгированным с ФИТЦ - флюоресцеин изотиоцианатом (англ. «FITC») (BD Biosciences; № по каталогу: 555753) для идентификации тромбоцитов, в сочетании с конъюгированным с Alexa Fluor 647 (AF647) антителом AB79 или изотип-контролем, и с конъюгированным с AF647 паливизумабом (MedImmune; № по каталогу: 60574-4113-1) - гуманизированным моноклональным антителом, которое специфично в отношении эпитопа А в антигенном участке белка F респираторного синцитиального вируса (РСВ), т.е. антигена, который отсутствует на эритроцитах или тромбоцитах. Лизис эритроцитов проводили после окрашивания, а образцы анализировали с помощью проточного цитометра BD Canto. CD61+ тромбоциты выделяли на графиках цитометрии для анализа.

[00321] Для оценки связывания AB79 с эритроцитами 50 мкл цельной крови окрашивали конъюгированным с AF647 антителом AB79 или изотип-контролем, и с конъюгированным с AF647 паливизумабом. В некоторых экспериментах для окрашивания лимфоцитов использовалось перекрестно-реактивное антитело против CD45 человека, конъюгированное с ПерХП - перидинин-хлорофилл протеином (англ. «PerCP») (BD Biosciences; № по каталогу: 552724) с целью доказательства связывания AB79 с субпопуляцией лимфоцитов, как это наблюдалось в предыдущих исследованиях. Образцы анализировали с использованием проточного цитометра BD Canto. Данные выражали в виде средней интенсивности флуоресценции (СИФ) антитела AB79 или изотип-контроля.

Результаты и обсуждение

[00322] Способность AB79 связываться с эритроцитами от тридцати здоровых людей-добровольцев и тридцати здоровых яванцев оценивали с помощью проточной цитометрии. Окрашивание эритроцитов по AB79 не превышало уровня окрашивания антителом изотип-контроля в любом из образцов крови человека (Фиг. 17 и Таблица 8) или в образцах крови яванца (Фиг. 18 и Таблица 8). Ни у одного из видов не наблюдалось измеримого связывания, а также не наблюдалось различий в соотношении СИФ для AB79/изотип-контроля между человеком и яванцем.

Таблица 8. Показатели средней интенсивности флуоресценции соотношения AB79/изотип-контроль для эритроцитов
Донор №	Человек	Яванская макака
1	1,047	1,025
2	1,018	0,904
3	1,006	0,912
4	0,867	0,878
5	0,800	0,805
6	0,937	0,980
7	0,900	0,893
8	0,920	0,861
9	0,896	0,839
10	0,958	0,868
11	0,896	0,863
12	0,950	0,866
13	1,016	1,027
14	0,946	0,989
15	0,985	0,969
16	0,829	0,990
11	0,861	0,985
18	0,903	1,022
19	0,914	0,915
20	0,914	0,911
21	0,813	0,882
22	0,859	0,888
23	0,947	0,960
24	0,917	0,940
25	0,976	0,948
26	0,933	0,931
27	0,889	0,967
28	0,938	0,949
29	0,976	0,941
30	0,934	0,951
Среднее	0,928	0,929
Ст. откл.	0,056	0,057

Способность АВ79 связываться с CD61+ тромбоцитами от тридцати здоровых людей-добровольцев и тридцати здоровых яванцев (доноры 1-15 были мужского пола; доноры 16-30 были женского пола) оценивали с помощью проточной цитометрии. Окрашивание тромбоцитов по AB79 не превышало уровня окрашивания антителом изотип-контроля в любом из образцов крови человека (Фиг. 19 и Таблица 9) или в образцах крови яванца (Фиг. 20 и Таблица 9). Ни у одного из видов не наблюдалось измеримого связывания, а также не наблюдалось различий в соотношении СИФ для AB79/изотип-контроля между человеком и яванцем.

Таблица 9. Показатели средней интенсивности флуоресценции соотношения AB79/изотип-контроль для тромбоцитов
Донор №	Человек	Яванская макака
1	1,46	0,96
2	1,10	0,88
3	1,76	0,90
4	1,16	0,88
5	1,21	1,28
6	1,53	1,19
7	2,14	0,85
8	1,14	0,78
9	1,14	0,97
10	0,53	1,37
11	0,38	0,63
12	0,60	0,98
13	1,06	0,71
14	1,33	0,93
15	0,78	1,06
16	1,06	1,03
17	0,95	0,83
18	1,25	0,80
19	1,09	1,55
20	0,89	1,28
21	0,95	1,61
22	1,24	1,24
23	0,36	0,99
24	1,34	1,40
25	0,53	1,04
26	0,91	1,29
27	0,85	1,14
28	0,68	1,05
29	1,03	1,46
30	1,13	2,28
Среднее	1,05	1,11
Ст. откл.	0,39	0,33

[00323] В качестве положительного контроля окрашивания по AB79 измеряли окрашивание по AB79 в части образцов крови. Из-за высокого преобладания эритроцитов в крови было проанализировано 200000 цитометрических событий, и для дальнейшей оценки была взята небольшая популяция CD45+ лимфоцитов. Для изотип-контроля связывание обнаружено не было; однако антитело AB79 связалось с небольшой популяцией CD45+ лимфоцитов (Фиг. 21). Данное наблюдение подтвердило, что AB79 обладает способностью окрашивать клетки крови в условиях, при которых отсутствует измеримое связывание AB79 с эритроцитами или тромбоцитами.

Пример 4: Оценка связывания AB79 с эритроцитами и тромбоцитами человека и яванской макаки с использованием высокочувствительной проточной цитометрии

[00324] Для дальнейшей оценки связывания AB79 с эритроцитами человека или яванской макаки (яванец) был разработан метод высокочувствительной проточной цитометрии для того, чтобы обнаружить низкий уровень экспрессии CD38 на эритроцитах в случае, если предыдущий анализ, возможно, не был достаточно чувствительным. Образцы крови от 4 здоровых людей-добровольцев инкубировали с флуоресцентно меченным AB79 или флуоресцентно меченным даратумумабом - другим анти-CD38 антителом, которое, как известно, связывается с CD38 на эритроцитах. Каждый образец преинкубировали с соответствующим немеченым лекарственным средством, чтобы блокировать связывание CD38 с флуоресцентно меченными лекарственными средствами; данные образцы служили в качестве отрицательного контроля для анализа. Антитела против CD45 и CD235a добавляли к образцам для идентификации эритроцитов и затем анализировали на проточном цитометре. В качестве положительного контроля использовали флуоресцентно меченный даратумумаб. Результаты продемонстрировали, что AB79 и даратумумаб связываются с эритроцитами человека, полученными от здоровых доноров.

Методы

[00325] Образцы крови человека от четырех здоровых доноров (программа доноров крови «Millennium») были собраны в соответствии с протоколом компании. Коротко, образцы периферической крови для определения связывания эритроцитов собирали в пробирки с гепарином натрия, а для окрашивания лимфоцитов отбирали образцы периферической крови в пробирки «BD Vacutainer® CPT™» (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). Отдельную пробирку использовали для сбора мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) для подтверждения связывания флуоресцентно меченного AB79 и флуоресцентно меченного даратумумаба с CD38+ лимфоцитами. В экспериментах как по связыванию эритроцитов, так и по окрашиванию лимфоцитов образцы периферической крови хранили при комнатной температуре и брали в эксперимент в течение 2 часов после забора для поддержания жизнеспособности клеток. Для связывания эритроцитов образцы периферической крови сначала разбавляли 1: 10000 в буфере для окрашивания (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США), чтобы уменьшить высокую концентрацию эритроцитов, присутствующих в образце. Поскольку показатель нормального содержания эритроцитов в образцах крови здорового человека составляет приблизительно 5 миллионов клеток на микролитр, образцы необходимо было существенно разбавить, чтобы получить приемлемое количество эритроцитов для окрашивания и анализа проточной цитометрией. Затем образцы переносили в 96-луночный планшет с V-образным дном и инкубировали в течение ночи при 4°C на мягком шейкере с немеченым AB79 (500 мкг/мл), немеченым даратумумабом (500 мкг/мл) или только буфером BD (без препарата), все по 25 мкл/лунка. Шейкер для планшетов использовали для предотвращения оседания эритроцитов во время инкубационного периода. Образцы периферической крови преинкубировали с немечеными лекарственными препаратами для того, чтобы блокировать антигенные участки CD38 на поверхности эритроцитов; данные образцы служили в качестве отрицательного контроля для анализа. После данного инкубационного периода клинически значимые концентрации биотин-стрептавидин-BV421 даратумумаба (0; 0,1; 1; 10 и 100 мкг/мл) или биотин-стрептавидин-BV421 AB79 (0; 0,1; 1; 10 и 100 мкг/мл) добавляли к образцам на 3 часа при комнатной температуре на мягком шейкере. Затем образцы несколько раз промывали буфером BD и окрашивали маркерами клеточной поверхности CD45 и CD235a для идентификации эритроцитов (эритроциты: CD45-CD235a+) и комплексом стрептавидин-BV421 для связывания биотинилированных антител. Использование биотин-стрептавидина позволяет усилить возможный сигнал от низкого уровня экспрессии CD38 на эритроцитах. Флуоресцентный краситель BV421 был выбран потому, что он является одним из самых ярких коммерчески доступных флуорофоров и использует фиолетовый лазер проточного цитометра, тем самым сводя к минимуму уровень спектрального перекрытия с другими каналами/маркерами из панели окрашивания. В целом данный подход к усилению сигнала дает возможность обнаруживать молекулы на поверхности клетки, которые в противном случае терялись бы в шумовых показателях прибора. Далее образцы промывали и анализировали на BD FACSCanto™ II (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). Целевой уровень сбора клеток был установлен на 10000 цитометрических событий CD235a+. Для связывания лимфоцитов периферическую кровь от тех же здоровых доноров, собранную в пробирки «BD Vacutainer® CPT™», центрифугировали и выделяли мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) с использованием стандартных методик. Клетки промывали, окрашивали и обрабатывали, как описано для экспериментов с эритроцитами.

[00326] Для получения биотинилированных антител AB79 (21,4 мг/мл, Takeda, Калифорния, США) и даратумумаб (20 мг/мл, Janssen Biotech, Хоршем, Пенсильвания, США) очищали одновременно в тот же день с использованием коммерческого набора «Protein A column kit» (Abcam, Кембридж, Великобритания) для удаления веществ, которые потенциально могут помешать процедуре биотинилирования. Концентрацию белка в очищенных продуктах определяли по соотношению A280/260, и равные количества белка каждого антитела конъюгировали с биотином с использованием набора «Lightning Link Rapid Biotin Conjugation kit» (Innova Biosciences, Кембридж, Великобритания). В конце процедуры снова измеряли концентрацию белка по соотношению A280/260. Оба антитела были конъюгированы с коммерческими полистирольными микросферами, которые обладают способностью связывать антитела любого изотипа, или с инертными микрогранулами (отрицательные микрогранулы). После смешивания микрогранул с комплексом биотин-стрепавидин-BV421-AB79 или биотин-стрепавидин-BV421-даратумумаб, каждый из двух полученных реактивов обеспечивает отчетливый положительный контроль с высоким сигналом для соответствующей негативной популяции, который можно использовать для оценки средней флуоресценции (СИФ) каждого анализируемого антитела методом проточной цитометрии. Образцы анализировали на приборе BD Biosciences FACSCANTO™ II с использованием программного обеспечения BD Biosciences FACSDiva™ (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). Файлы первичных данных перенесли на защищенный сервер, а затем проанализировали в режиме оффлайн с использованием программного обеспечения FlowJo® версии 10 (FlowJo, LLC; Ашленд, Орегон, США). Для идентификации эритроцитов сначала на графиках цитометрии выделили CD235a-положительные клетки. Затем определили геометрические показатели СИФ и процент положительных биотин-стрепавидин-BV421-AB79 и биотин-стрепавидин-BV421-даратумумаб цитометрических событий для выделенных клеток, и построили соответствующий график-гистограмму (Фиг. 22). Эти данные сравнили с изотип-контролем (образцы, преинкубировали с немеченым AB79 или немеченым даратумумабом, а затем инкубировали с соответствующими им меченными биотин-стрепавидином-BV421 лекарственными препаратами). Для идентификации лимфоцитов сначала исключили дебрис на основе прямого и бокового рассеяния (FSC-A против SSC-A). Затем на графике цитометрии выделили CD45-положительную популяцию и определили СИФ и процент положительных биотин-стрепавидин-BV421-AB79 и биотин-стрепавидин-BV421-даратумумаб событий для выделенных клеток, и построили соответствующий график-гистограмму (Фиг. 22). Эти данные сравнили с изотип-контролем (образцы, преинкубировали с немеченым AB79 или немеченым даратумумабом, а затем инкубировали с соответствующими им меченными биотин-стрепавидином-BV421 лекарственными препаратами).

Таблица 10. Обобщенные результаты исследований связывания эритроцитов с AB79 и даратумумабом (средняя геометрическая флуоресценция)
AB79 биотин-стрептавидин-BV421
Конц. (мкг/мл)	Донор 1	Донор 2	Донор 3	Донор 4	Среднее	СО
0	138	155	202	284	195	65,37
0,1	175	201	207	355	235	81,53
1	193	224	282	392	273	87,64
10	196	205	557	521	370	196,02
100	143	139	533	445	315	204,11
Немеченый AB79 и AB79 биотин-стрептавидин-BV421
Конц. (мкг/мл)	Донор 1	Донор 2	Донор 3	Донор 4	Среднее	СО
0	139	143	220	Н/О	167	45,65
0,1	133	137	198	Н/О	156	36,43
1	132	142	223	Н/О	166	49,90
10	136	148	421	Н/О	235	161,19
100	133	140	447	Н/О	240	179,30
Даратумумаб биотин-стрептавидин-BV421
Конц. (мкг/мл)	Донор 1	Донор 2	Донор 3	Донор 4	Среднее	СО
0	150	158	182	274	191	56,98
0,1	227	297	215	411	288	89,92
1	304	394	387	527	403	92,22
10	317	352	556	599	456	142,11
100	162	190	643	493	372	234,74
Немеченый даратумумаб и даратумумаб биотин-стрептавидин-BV421
Конц. (мкг/мл)	Донор 1	Донор 2	Донор 3	Донор 4	Среднее	СО
0	143	164	180	Н/О	162	18,56
0,1	133	146	191	Н/О	157	30,44
1	135	147	216	Н/О	166	43,71
10	155	170	431	Н/О	252	155,20
100	133	142	Н/О	Н/О	138	6,36

Н/О=не определено; СО=стандартное отклонение

Результаты и обсуждение

[00327] Количество биотина на AB79 и даратумумабе определяли с использованием высокочувствительной проточной цитометрии. Как демонстрируют результаты на Фиг. 23, биотин-стрепавидин-BV421 даратумумаб связывает в 1,6-2,0 раза больше связанных с антителом микрогранул, чем биотин-стрепавидин-BV421 AB79. Поэтому, биотин-стрепавидин-BV421 даратумумаб является «более ярким» антителом по сравнению с биотин-стрепавидин-BV421 AB79. Следовательно, сравнения показателей СИФ должны быть откалиброваны с учетом этой разницы в яркости окрашивания.

[00328] Подтверждение специфичности меченных биотином лекарственных препаратов было важным шагом для обеспечения того, чтобы наблюдаемые параметры были результатом специфического связывания с целевым белком. Конкурентный анализ является обычным способом проверки специфичности антител. Для данного конкурентного анализа был использован метод проточной цитометрии. Коротко, образцы периферической крови от здоровых добровольцев предварительно инкубировали с немеченым AB79 или немеченым даратумумабом, а затем окрашивали биотинилированным AB79 или биотинилированным даратумумабом, соответственно. Ожидалось, что в образцах, преинкубированных с немеченым лекарственным препаратом, будет блокировано связывание биотинилированных лекарственных препаратов. Как продемонстрировано на Фиг. 24, связывание биотинилированного AB79 и биотинилированного даратумумаба может быть заблокировано в лимфоцитах периферической крови, если использовать немеченые лекарственные препараты.

[00329] Процент связывания биотин-стрепавидин-BV421 AB79 и биотин-стрепавидин-BV421 даратумумаб с эритроцитами определяли по четырем образцам периферической крови здоровых добровольцев. Как продемонстрировано на Фиг. 25 и 26, AB79 связывал эритроциты, экспрессирующие CD38, дозозависимым образом у всех четырех исследованных доноров. Пиковые уровни связывания эритроцитов различались между здоровыми добровольцами и составляли между 1 и 10 мкг/мл для обоих лекарственных препаратов. При 10 и 100 мкг/мл как биотин-стрепавидин-BV421 AB79 антитела, так и биотин-стрептавидин-BV421 даратумумаба уровни эритроцитов были ниже у 3 из 4 исследованных доноров. Существует несколько факторов, которые могут объяснить снижение уровня связывания лекарственного средства с CD38, включая повышение гемолиза эритроцитов или переворачивание каталитического домена с наружной стороны клетки внутрь клетки (Yoshiga et al. (2008) Int. J. Mol. Med. 22: 369-374). Кроме того, даратумумаб снижал уровни экспрессии CD38, по крайней мере частично, через трогоцитоз (Cole et al. (2018) Arthritis Res. Ther. 20 (1): 85); комплексы CD38 и сопутствующая клеточная мембрана активно переносились из клеток множественной миеломы в моноциты и гранулоциты (Kraan et al. (1999) Rheumatology (Oxford) 38 (11): 1074-1080). У одного донора (донор 3) уровни эритроцитов увеличивались с увеличением количества лекарственного средства, возможно, в результате большей поверхностной экспрессии CD38 на поверхности эритроцитов. Необходимо провести дополнительные эксперименты, чтобы лучше понять снижение связывания лекарственного средства при самой высокой исследованной концентрации.

[00330] Сравнивали профили связывания эритроцитов с AB79 и даратумумабом. Как продемонстрировано в Таблице 10 и на Фиг. 27 и 28, по-видимому существует разница в величине связывания эритроцитов (т.е. в СИФ) между лекарственными препаратами у 3 из 4 исследованных доноров; однако это различие может объясняться различиями в уровнях биотина на каждом из антител, поскольку даратумумаб содержит в 1,6-2,0 раза больше биотина, чем AB79. Альтернативный анализ, при котором контролируется разность потенциалов при флуоресцентной маркировке антител, заключается в сравнении концентрации с профилем связывания каждого антитела, а полезным показателем является концентрация, при которой происходит максимальное связывание (т.е. максимальное специфическое связывание антигена (Bmax)). Показатель Bmax является одинаковым для обоих антител у 3-х доноров из 4-х (например, 1 мкг/мл для донора 1). В совокупности эти данные указывают на то, что оба антитела связываются с одинаковой аффинностью в рамках текущего предела разрешения анализа, который составляет коэффициент 10. В заключение, в данном анализе и АВ79, и даратумумаб связывались с эритроцитами с аффинностями, которые были в пределах 10 раз друг от друга; 10-кратного или большего различия в аффинности связывания этих антител с эритроцитами в данной аналитической системе не существовало.

Пример 5: Оценка гемолиза антителом AB79 эритроцитов человека или макаки in vitro

[00331] Свежая цельная кровь от здоровых людей-добровольцев и яванских макак, по пять (n=5) субъектов каждого вида, анализировалась на предмет гемолиза in vitro в ответ на in vitro обработку антителом AB79 (27,3 мг/мл; Takeda, Калифорния, США), изотип-контролем IgG1 человека (7,14 мг/мл; Bio X Cell) и даратумумабом (20 мг/мл; Janssen Biotech, Хоршем, Пенсильвания, США). Дозозависимый эффект для экспериментальных образцов исследовался при 0; 0,03; 0,08; 0,25; 0,74; 2,2; 6,6 и 20 мкг/мл. Полулогарифмическое разведение сапонина оценивали, начиная с раствора сапонина максимальной концентрации (1%), используемого в качестве технического положительного контроля на реактивность крови. Для измерения острого гемолиза обработку проводили в течение 1 часа при 37°С, 5% СО₂. Абсорбцию измеряли при длине волны 540 нм с использованием спектрофотометра и рассчитывали процент гемолиза следующим образом:

[00332] Гемолитический индекс оценивался следующим образом (гемолитический индекс=степень гемолиза): 0-2=без гемолиза; 2-5=слабый гемолиз; >5=гемолиз.

Результаты: эритроциты всех особей каждого вида, человека и яванца, реагировали острым гемолизом in vitro в ответ на серию разбавлений 1% раствора сапонина с гемолитическим индексом выше 5. AB79, даратумумаб и изотип-контроль IgG1 человека не вызвали измеримого гемолиза в каких-либо образцах эритроцитов от обоих видов, и гемолитический индекс был равен нулю (Фиг. 29 и 30).

Пример 6: Оценка AB79 в модели коллаген-индуцированного артрита яванской макаки

[00333] Экспрессия эктоэнзима CD38 увеличивается на лимфоцитах в ответ на антигенную стимуляцию, и предполагается, что нацеливание на эти активированные лимфоциты может ослабить патологическую активность при аутоиммунных заболеваниях. Яванская макака является подходящей моделью для оценки потенциальных эффектов нацеливания на CD38 у людей, поскольку этот вид демонстрирует сходные профили экспрессии CD38, а человеческое анти-CD38 антитело AB79 связывается с CD38 макаки с аффинностью (EC₅₀=4,5 нМ), которая позволяет проводить фармакологическое вмешательство. Поэтому была исследована потенциальная активность AB79 в модели коллаген-индуцированного артрита (КИА) яванской макаки. Профилактическое введение антитела AB79 (3 мг/кг внутривенно в неделю) хорошо переносилось и предотвращало развитие артрита, в отличие от контрольных животных, получавших носитель, у которых в течение исследования наблюдалось прогрессирующее заболевание с радиографически-подвержденным повреждением и ухудшением клинических показателей. Терапевтическое воздействие антителом AB79 (3 мг/кг внутривенно в неделю) на макак с артритом также хорошо переносилось и снижало прогрессирование заболевания и симптомы. Показатели клинической оценки артрита и опухлости суставов были значительно ниже, чем для контрольного носителя, и сопровождались снижением уровня СРБ, ЩФ, NK-, B- и T-клеток в крови. Гистопатологические, морфометрические и рентгенологические исследования выявили значительно меньшее повреждение суставов у животных, получавших профилактическое лечение антителом AB79, по сравнению с животными, получавшими носитель, и значительно (p <0,05) меньшее повреждение у животных, получавших терапевтическое лечение антителом AB79 или дексаметазоном (ежедневно по 0,1 мг/кг перорально), что иллюстрирует потенциальный эффект на прогрессирование заболевания. В заключение следует отметить, что эти данные указывают на то, что деплетирование популяции CD38-экспрессирующих клеток может быть терапевтической альтернативой при лечении аутоиммунных заболеваний без негативного воздействия стероидов.

Методы и материалы

Антитела

[00334] Препарат AB79 был доступен на месте. Конъюгированный с флуорохромом анти-мышиный IgG был приобретен в Jackson Immunoresearch Laboratories (Уэст-Гроув, Пенсильвания). Фармацевтический буфер был приобретен у BD Biosciences (Сан-Хосе, Калифорния). Конъюгированные с флуорохромом антитела к белкам макаки были приобретены из различных источников: CD20 - у BD Biosciences (Сан-Хосе, Калифорния); мышиное антитело к CD3 - у eBioscience (Сан-Диего, Калифорния); мышиное антитело к CD16 - у Miltenyi Biotech (Оберн, Калифорния); мышиные антитела к CD4 и CD8 - у R&D Systems. Неконъюгированные антитела к АВ79 и гуманизированное контрольное антитело с отличной от АВ79 антигенной специфичностью, но с тем же Fc-фрагментом IgG1 были доступны на месте, в дополнение к конъюгированному с Alexa Fluor 647 АВ79. Первичными антителами для исследования перекрестной реактивности тканей макаки были кроличьи анти-AB79 антитела (сгенерированные в нашей лаборатории) и отрицательный контроль к IgG1 человека (Millipore Bioscience Research Reagents, Темекула, Калифорния).

Иммуногистохимическое исследование тканей

[00335] Профиль экспрессии антигена CD38 сравнивали в 15 различных типах тканей, полученных от здоровых доноров человека и яванской макаки, с использованием иммуногистохимических методов. Пригодность каждой ткани для обнаружения CD38 была подтверждена с использованием антитела положительного контроля против родственного трансмембранного рецептора CD31 (Dako North America, Inc.). Срезы (5 мкм) вырезали из свежезамороженных образцов ткани, залитых в реагент «OCT Compound» (Sakura Finetek USA, Inc., Торранс, Калифорния), и фиксировали в ацетоне в течение 10 минут при комнатной температуре. Непосредственно перед окрашиванием микропрепараты фиксировали в течение 10 секунд в 10% нейтральном забуференном формалине. Криосекции, фиксированные ацетоном или формалином, дважды промывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и инкубировали в течение 20 минут с блокатором белков (ФСБ; 0,5% казеина; 5% гамма-глобулинов человека; 0,02% козьего IgG; 1 мг/мл агрегированного под действием нагревания IgG человека), предназначенного для снижения неспецифического связывания. Неконъюгированный AB79 или отрицательный контроль к человеческому IgG1 (Millipore Bioscience Research Reagents) наносили на срезы в концентрации 5 или 25 мкг/мл и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем микропрепараты дважды промывали в ФСБ и проводили обнаружение этих первичных реагентов путем непрямого иммунопероксидазного метода. Затем наносили вторичное антитело, кроличье анти-АВ79, в концентрации 5 мкг/мл на 30 минут и дважды промывали в ФСБ. Эндогенную пероксидазу блокировали инкубацией микропрепаратов с раствором пероксидазы, предоставленным в наборе «Dako EnVision+», в течение 5 минут, а затем дважды промывали в ФСБ. Затем микропрепараты обрабатывали в течение 30 минут меченным пероксидазой козьим анти-кроличьим IgG-полимером, поставляемым в наборе «Dako EnVision+», дважды промывали в ФСБ и обрабатывали в течение 8 минут раствором субстрат-хромоген (DAB+), поставляемым в наборе «Dako EnVision+». Все микропрепараты промывали водопроводной водой, окрашивали гематоксилином, промывали, окрашивали в синий цвет насыщенным литий карбонатом, промывали, дегидратировали пропусканием через спирты, очищали в ксилоле и накрывали покровным стеклом в соответствии со стандартными методиками. Интенсивность окрашивания оценивали полуколичественно в заслепленном анализе, который проводился патологоанатомом, сертифицированным Американским колледжем ветеринарных патологов (ACVP).

AB79 связывается с рекомбинантным CD38

[00336] Для исследований связывания анти-CD38 антител с клеточной поверхностью были сгенерированы клетки яичника китайского хомяка K1 (CHO-K1), стабильно экспрессирующие CD38 человека, мыши или макаки. В клетки CHO-K1 (Lonza, США) трансфицировали клоны кДНК полной длины, кодирующие CD38 человека, мыши или яванской макаки (Origene Technologies, Роквилл, Мэриленд). После отбора пулы сортировали с помощью проточной цитометрии и для исследований связывания использовали клоны, экспрессирующие наивысшие уровни CD38 человека, мыши или яванской макаки (клоны со средней интенсивностью флуоресценции (СИФ), составляющей 85-100% от максимальной). 200000 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет с круглым дном и окрашивали антителами, напрямую конъюгированными с Alexa Fluor® 488, с концентрацией 66,7 нМ в 50 мкл цитометрического буфера (1% АБС в ФСБ) на льду в течение от 30 минут до 1 часа. Клетки промывали 3-4 раза в конечном объеме от 200 до 250 мкл цитометрического буфера. Конечный осадок клеток ресуспендировали в 100 мкл цитометрического буфера, содержащего 1% параформальдегида. Образцы оценивали на FACS Canto II HTS (BD Biosciences) и анализировали с использованием программного обеспечения Flojo (Tree Star, США).

Проточная цитометрия клеточных линий и цельной крови

[00337] Для окрашивания клеточных линий клетки ресуспендировали в концентрации 2 × 10⁶/мл в цитометрическом буфере (5% фетальной бычьей сыворотки и 0,05% азида натрия в Д-ФСБ (фосфатный буфер Дульбекко в физиологическом растворе без кальция и магния)) (VWR, Уэст-Честер, штат Пенсильвания) и образцы объемом по 200 мкл окрашивали соответствующими моноклональными антителами при 4°C в течение 30 минут. Образцы промывали цитометрическим буфером и анализировали методом проточной цитометрии (FACSCalibur, BD). Для окрашивания цельной крови макак образцы объемом по 200 мкл образцов окрашивали соответствующим моноклональным антителом при 4°С в течение 30 минут. Эритроциты лизировали реактивом «BD FACS lysing solution», и затем образцы промывали цитометрическим буфером и анализировали методом проточной цитометрии. Во всех случаях применялись насыщающие концентрации антител, и во многих случаях использовалось до четырех антител на образец.

Активность AB79 в цельной крови яванской макаки

[00338] Цельная кровь яванских макак приобреталась у Charles River Laboratories (Уилмингтон, Массачусетс, США). Для исследований связывания периферическую цельную кровь яванских макак, смешанную с антикоагулянтом (общий объем каждого образца - 100 мкл) инкубировали с возрастающими концентрациями антитела АВ79 (43-690 нМ) в течение 30 минут при комнатной температуре. Связывание AB79 с клетками анализировали с использованием меченного фикоэритрином козьего антитела против Fc-фрагмента IgG человека (Thermo Fisher Scientific). После связывания антител эритроциты лизировали методом высокопродуктивного лизиса без фиксаторов (Thermo Fisher Scientific). Затем клетки дважды промывали буфером для активируемой магнитным полем сортировки клеток (MACS-буфером), содержащим 0,5% АБС (Miltenyi Biotec). Результаты окрашивания клеток анализировали методом проточной цитометрии (на цитометре Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer) с использованием программного обеспечения FlowJo.

[00339] Для анализа цитолиза высевали по 90 мкл цельной крови в каждую лунку 96-луночного планшета с U-образным дном. Сразу после посева цельную кровь стимулировали антителом AB79 в концентрациях 0,69; 2,06; 6,17; 18,52; 55,56; 166,67 и 500 нМ, или ФСБ-контролем в течение 6, 24 и 48 часов. В каждый контрольный момент времени кровь, стимулированную контрольной или тестируемой молекулой, из 96-луночного планшета с U-образным дном переносили в планшет с глубокими лунками для лизиса эритроцитов. После лизиса клетки ресуспендировали в окрашивающем буфере с антителами CD16-BV605, CD56-ФЭ и CD38-ФИТЦ для окрашивания поверхностных маркеров. Клетки защищали от света и инкубировали при 4^oC в течение 20 минут. После инкубации клетки центрифугировали при 350 х g при комнатной температуре в течение 5 минут и промывали буфером однократной концентрации для связывания аннексина V. Клетки ресуспендировали в буфере однократной концентрации для связывания аннексина V, содержащем аннексин V, конъюгированный с Alexa Fluor 647, при комнатной температуре в течение 15 минут. Окрашенные клетки анализировали с помощью проточного цитометра BD FACSCelesta, а данные регистрировали с помощью программного обеспечения BD FACSDiva, версия 8.0.1. Графики параметров жизнеспособности NK-клеток при каждой тестируемой концентрации и значения IC50 деплетирования популяции NK-клеток, вызванного антителом AB79 в каждый контрольный момент времени, строились и анализировались в программе GraphPad Prism 7.04.

Исследования по определению диапазона доз у здоровых макак

[00340] В серии исследований здоровые, специально выращенные, не бывшие ранее ни в каких экспериментах яванские макаки получали контрольный носитель, 0,03; 0,1; 0,3 и 1 мг/кг соединения AB79 еженедельно, либо 3; 30 или 80 мг/кг каждые две недели посредством 20-минутная внутривенной инфузии (Charles River Laboratories). Во всех исследованиях животных оценивали на предмет изменения клинических признаков (два раза в день проводили наблюдения у клетки с животными, наблюдения после введения дозы, еженедельные подробные осмотры, наблюдения за потреблением пищи и еженедельное взвешивание). Образцы крови собирали до и после введения дозы во всех исследованиях для оценки фармакокинетики, фармакодинамики и антител приматов против антигенов человека (АППАЧ, англ. «PAHA»). Исследования проводились на яванских макаках в соответствии со стандартными операционными процедурами (СОП, англ. «SOP») испытательного центра (Charles River Laboratories), которые придерживается норм, изложенных в Законе Министерства сельского хозяйства США «О благополучии животных» (Свод федеральных нормативных актов США, Раздел 9, Части 1, 2 и 3), и условий, указанных в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (ILAR publication, 1996, National Academy Press).

Методика биоаналитического определения концентраций AB79 в сыворотке крови

[00341] Концентрацию АВ79 в сыворотке крови яванской макаки измеряли с использованием метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Данный метод представляет собой непрямой ИФА, миниатюризированный для использования с 96-луночными планшетами. Планшет был покрыт мышиным антиидиотипическим антителом против АВ79. Пустые пробы, стандарты и образцы для контроля качества (КК), содержащие AB79 в различных концентрациях, а также образцы сыворотки крови макак добавляли в микротитрационный планшет и инкубировали в течение 55-65 минут при комнатной температуре. После промывки микротитрационного планшета добавляли детектирующее антитело (конъюгированное с пероксидазой высокоаффинное мышиное антитело против IgG человека) и планшет инкубировали в течение дополнительных 55-65 минут. Планшет снова промывали и добавляли в лунки тетраметилбензидин (ТМБ) для образования хромофора, и развитие окраски останавливали добавлением стоп-раствора (двунормальная серная кислота). Измерялась абсорбция при 450 нм и рассчитывались концентрации AB79 с использованием 4-параметрической экспоненциальной взвешенной (1/y²) стандартной калибровочной кривой.

Методика биоаналитического определения анти-АВ79 антител

[00342] Скрининг анти-AB79 антител в сыворотке крови яванской макаки проводили с использованием метода усиленной электрохемилюминесценции (ЭХЛ). План эксперимента с использованием данного качественного метода ЭХЛ заключался в следующем. Неразбавленные образцы сыворотки яванских макак инкубировали с 300 мМ уксусной кислоты. Диссоциированные кислотой образцы инкубировали в смеси биотинилированного AB79, AB79, меченного SULFO-TAG™, и 1,5М реактива «Trizma® base» для нейтрализации кислоты и образования иммунного комплекса. Этот комплекс затем добавляли в покрытый стрептавидином планшет производства компании MSD и оставляли для реакции связывания. После промывания комплекс детектировали добавлением в планшет реагента «MSD read buffer T» и последующим возбуждением метки SULFO-TAG™ посредством электрохимической реакции [Ru(bpy)3]²⁺ с образованием люминесценции, которая была измерена на анализаторе MSD Sector 6000. Интенсивность люминесценции коррелирует с уровнем анти-AB79 антител макаки, присутствующих в сыворотке индивидуальных образцов. Минимальное требуемое разведение (МТР, англ. «MRD») сыворотки яванской макаки для данного анализа было установлено на уровне 1/30. Для графического представления показатели всех животных наносили на график индивидуально как функцию зависимости от титра антител и продолжительности исследования в сутках (Фиг. 31). Данные для образцов сыворотки со значениями, равными или ниже специфического для планшетов предела определения, наносили на график с использованием номинального значения титра для облегчения построения графика.

Модель коллаген-индуцированного артрита яванской макаки

[00343] Этичное использование нечеловекообразных приматов было обеспечено путем моделирования фармакодинамических реакций яванской макаки на AB79 и последующей экстраполяции минимального количества животных на каждую на группу обработки, достаточного для получения статистически значимых различий в ФД реакциях. Тридцать четыре самки яванской макаки, ранее не использованных в экспериментах, в возрасте от 3 до 4 лет, массой от 2,5 до 3,3 кг, были приобретены у компании Biomedical Research (GZ) Ltd (SNBL, Китай). После их получения проводилось медицинское обследование каждого животного подрядной исследовательской организацией (PharmaLegacy Laboratories, Inc., Китай). Животные содержались по одному на клетку и акклимировались в течение минимум 14 дней до начала экспериментальных процедур. В помещении для клеток с животными поддерживалась температура 20-29°С, относительная влажность 40-70% и 12-часовой светотемновой цикл. До начала исследования животных приучали к получению внутривенных инфузий или введению перорального зонда. Макаки имели свободный доступ к овощам, фруктам, корму (Shanghai Shilin Biologic Science & Technology Co. Ltd., Китай) и воде в соответствии со стандартным протоколом. Клетки располагались ярусно внутри стеллажей для уменьшения влияния любых воздействий окружающей среды на исследование. Данный план эксперимента, все протоколы исследований и экспериментальные процедуры были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике принимающей стороны (PharmaLegacy Laboratories Inc) в соответствии с законодательством Китая об экспериментах на животных.

[00344] Макак для исследования отбирали в соответствии с критериями предварительного отбора. Одному животному, ранее не использованному ни в каких экспериментах, коллаген не вводился, и его содержали в качестве отрицательного контроля индукции заболевания. Остальным животным вводили бычий коллаген типа II (Сычуань, Китай) , растворенный в 0,01-нормальной уксусной кислоте (SPGC Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd; Шанхай, Китай) до конечной концентрации 4 мг/мл (Mihara M., et al., Clin Immunol. 2001; 98 (3): 319-26; Uchiyama Y., et al., Biol Pharm Bull. 2008; 31(6): 1159-63; Uchiyama Y, Koike N, Mihara M. Anemia in monkey collagen-induced arthritis is correlated with serum IL-6, but not TNFa. Rheumatol Int 2008 28: 879-883; Kato A., et al., Experimental and Molecular Pathology 2008 84:262-270), на 0-е и 21-е сутки подкожно (Mihara et al. (2001) Clin. Immunol. 98 (3): 319-26; Uchiyama et al. (2008) Biol. Pharm. Bull. 31 (6): 1159-63; Uchiyama et al. (2008) Rheumatol. Int. 28: 879-883; Kato et al. (2008) Experimental Mol. Path. 84: 262-270). Коллаген эмульгировали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда (ПАФ, англ. «CFA») (Sigma-Aldrich; Сент-Луис, США). На животных предварительно действовали кетамином (4 мг/кг в/м) для оказания снотворного эффекта, и при необходимости применяли дополнительную анестезию в виде 1,5-5% изофлурана (использовали ингаляционный анестезионный аппарат Matrix vip3000 isoflurane) с расходом кислорода 0,8-1,5 литра. Любые язвенные поражения кожи, развивающиеся в местах иммунизации, обрабатывали йодом каждый раз, когда животное подвергалось седации, для предотвращения инфекции.

[00345] Семь животных, получавших коллаген, были включены в профилактическую группу AB79 в день 0 (Фиг. 31А). Животные из профилактической группы AB79 получали еженедельные инфузии антитела AB79 в дозе 3 мг/кг начиная с 7-го дня, с введением последней дозы на 56-й день, всего 8 доз (Фиг. 31A). Животных этой группы умерщвляли на 63-й день. Оставшихся иммунизированных животных исследовали как одну группу и еженедельно вводили им носитель (физиологический раствор) путем 30-минутной внутривенной инфузии начиная с 7-го дня, пока животное не достигло или не превысило ≥15% от максимальной клинической оценки артрита (для КИА). С этого момента животное было включено в контрольную группу носителя, терапевтическую группу AB79 или терапевтическую группу дексаметазона, и включение в группы продолжалась по мере поступления из-за различий во времени начала заболевания (Фиг. 31А). Животным, включенным в контрольную группу носителя, еженедельные инфузии носителя выполнялись в течение 5 недель (Фиг. 31А). Животных этой группы умерщвляли через 7 дней после введения последней дозы. Для животных, включенных в терапевтическую группу AB79, еженедельные инфузии выполнялись в течение 5 недель (Фиг. 31А). Животных этой группы умерщвляли через 7 дней после введения последней дозы. Животным, включенным в терапевтическую группу дексаметазона, ежедневно вводили его путем перорального зонда в течение 5 недель (Фиг. 31А) и умерщвляли через 1 день после введения последней дозы. За животными ежедневно проводились наблюдения для выявления признаков плохого самочувствия и общей реакции на вводимые соединения. Все исключения из нормального здорового внешнего вида и поведения были зарегистрированы и детализированы в стандартных формах клинических наблюдений.

Оценка активности артрита

[00346] Массу тела макак измеряли один раз в течение периода акклимации (за 5 дней до начала эксперимента), за день до каждого цикла индукции заболевания, а затем один раз в неделю до конца исследования. Количество животных в группе с опуханием суставов регистрировали в день 0 и день 21, а затем ежедневно до конца исследования. Число проксимальных межфаланговых (ПМФ) суставов (на каждой кисти и стопе соответственно) с опуханием сустава регистрировали для каждого животного в день 0, день 21, а затем один раз в неделю до конца исследования. Продольные и поперечные оси ПМФ суставов передних и задних конечностей (без большого пальца) измеряли штангенциркулями в день 0, день 21, а затем один раз в неделю после начала заболевания до конца исследования для всех ПМФ суставов с артритом. Средняя овальная площадь 16-ти ПМФ суставов рассчитывалась и регистрировалась как индивидуальный параметр. Овальную площадь каждого ПМФ сустава рассчитывали по следующей формуле: овальная площадь=продольная ось × поперечная ось × 3,14 × 1/4. Процент изменения овальной площади и опухлости сустава рассчитывали по следующей формуле: % изменения овальной площади = (средняя овальная площадь в день X/средняя овальная площадь в день 1-й сенсибилизации) × 100. Опухлость сустава = (средняя овальная площадь в день X - средняя овальная площадь в день 1-й сенсибилизации).

Клиническая оценка артрита

[00347] Тяжесть артрита каждой конечности у макак оценивалась в день 0 и день 21, а затем один раз в неделю до конца исследования в соответствии со следующими критериями: (0) норма; (1) легкий артрит, едва уловимый, но определенный; (2) умеренная опухлость; (3) тяжелый артрит со значительной опухлостью и (или) заметной деформацией сустава. Были исследованы и оценены следующие суставы каждой лапы: всего 15 суставов, включая 5 пястно-фаланговых (ПФ) суставов, 4 проксимальных межфаланговых (ПМФ) сустава, 4 дистальных межфаланговых (ДМФ) сустава, 1 первый проксимальный межфаланговый сустав; каждое запястье или голеностоп оценивались как один сложный сустав. Колено/локоть каждой конечности также оценивали по степени тяжести заболевания. Оценка артрита каждого животного представляла собой общую оценку каждого отдельного сустава с максимальной оценкой 192 (16 × 3 × 4), где 16 - общее число суставов плюс колено/локоть для каждой конечности; 3 - максимальная оценка для каждого отдельного сустава; 4 - количество конечностей одной макаки.

Сбор и анализ крови

[00348] Образцы крови использовались для общего анализа крови, биохимического анализа крови и получения сыворотки для измерения антител, ФК и АПЛП, и брались у животных в моменты времени, указанные ниже. Животные из контрольной группы носителя и профилактической группы AB79: в течение 1-й и 5-й недель кровь собирали дважды, один раз до введения дозы и один раз на следующий день. В течение недель 2, 3, 4, 6, 7 и 8 образцы крови собирались непосредственно перед введением AB79. В течение 9-й недели собирались образцы крови непосредственно перед умерщвлением животного. У всех других животных еженедельный забор крови проводился до тех пор, пока заболевание не достигло порога в 15% от максимальной оценки артрита. После включения в группу носителя, терапевтическую группу AB79 или терапевтическую группу дексаметазона образцы крови собирались еженедельно непосредственно перед введением дозы и перед умерщвлением животного. Кроме того, образцы собирали на следующий день после введения первой дозы препарата и на следующий день после введения пятой дозы. Для контрольной группы носителя, профилактической группы AB79 и терапевтических групп AB79 и дексаметазона, образцы крови для проточной цитометрии собирались до введения первой дозы (в день инфузии), на следующий день после введения первой дозы, перед введением второй дозы (в день дозирования), перед введением пятой дозы (в день дозирования) и в день умерщвления животного. Для терапевтической группы AB79 образцы крови для проточной цитометрии собирались до введения первой дозы препарата, на следующий день после введения первой дозы, до введения 8-й дозы, до введения 29-й дозы и в день умерщвления животного.

Рентгенографическое исследование

[00349] Рентгенография проводилась для каждого сустава (ДМФ, ПМФ, 1-й МФ и ПФ - участки, которые зачастую поражаются у человека при РА) на передних и задних конечностях анестезированных животных в конце исследования. Рентгенографическая оценка проводилась заслепленным методом на основе системы оценок 0-4: (0) норма; (1) незначительная деформация в слоях суставного хряща и (или) в областях субхондральной кости; (2) сильная деформация в слоях суставного хряща и областях субхондральной кости, небольшое количество остеофитов, присутствующих на надкостных поверхностях и краях сустава, которые являются нечеткими, но все же видимыми; (3) изменения того же типа, что и при 2-й степени, но развиваются дальше и с большим количеством остеофитов, присутствующих на надкостных поверхностях, а полость сустава неразличима или не видна; (4) изменения того же типа, что и при 3-й степени, но развиваются дальше, полость сустава не обнаруживается, кости кажутся склеральными или анкилозированными, возникают существенные деформации.

Гистопатология и гистоморфометрия ткани у макак с артритом

[00350] В конце исследования животных умерщвляли путем обескровливания под наркозом. Лапы, селезенку, толстую кишку и лимфатические узлы (брыжеечные и паховые) собирали и фиксировали в нейтральном забуференном формалине. ПМФ и ДМФ суставы декальцинировали с помощью 15% ЭДТА, обезвоживали и заливали в парафин (8 блоков/лапа × 4 лапы × 22 животных=704 блока). Фронтальные и коронарные срезы суставов были получены с помощью роторного микротома. Оценка гистопатологии проводилась по окрашенным толуидиновым синим срезам (32 × 22 животных=704 микропрепарата) костным гистопатологом заслепленным способом. Гистологические срезы были качественно оценены по следующим признакам гистопатологии: клеточная инфильтрация, паннус, поражение хряща и резорбция кости. Количественная гистоморфометрия выполнялась с использованием программного обеспечения Osteomeasure (OsteoMetrics, Inc., Атланта, Джорджия), сопряженного со световым/флюоресцентным микроскопом и видеоподсистемой Nikon Eclipse E400. Гистоморфометрические измерения суставной области и поверхности проводились костным гистопатологом заслепленным способом по микропрепаратам, окрашенным толуидиновым синим (704 микропрепарата).

Статистический анализ

[00351] Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (СОС). Статистический анализ проводился с использованием программы GraphPad Prism по каждому параметру среди экспериментально-наивных, модельных и контрольных (дексаметазон) и испытуемых групп. Различия считались статистически достоверными при р <0,05.

Результаты

Профиль экспрессии CD38 у яванской макаки

[00352] Чтобы определить, может ли яванская макака быть достоверной моделью для оценки потенциальных эффектов нацеливания на CD38 у человека, профиль экспрессии антигена CD38 сравнивался в 15 различных типах тканей, собранных у здоровых доноров человека и яванской макаки. Иммуногистохимия продемонстрировала, что AB79 связывается с мононуклеарными лейкоцитами в толстой кишке, желудке, тонкой кишке, костном мозге и лимфатическом узле, а также с некоторыми участками эндотелия в собственной пластинке толстой кишки, желудка и тонкой кишки у обоих видов (Таблица 11).

Таблица 11. Сравнение профилей экспрессии CD38 в тканях человека и макаки.
	Человек	Макака
	Анти-CD38 мАТ	Контроль IgG1 человека		Анти-CD38 мАТ	Контроль IgG1 человека
Ткань	5 мкг/мл	25 мкг/мл	5 мкг/мл	25 мкг/мл	Клетки, окрашиваемые AB79	5 мкг/мл	25 мкг/мл	5 мкг/мл	25 мкг/мл	Клетки, окрашиваемые AB79
Костный мозг	3, C/M	2+, М	Отр.	Отр.	Клетки костного мозга, возможно лейкоциты	1+, С/М	1+, М	Отр.	Отр.	Незначительное число клеток костного мозга, возможно лейкоциты
Сердце	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.		Отр.	Отр.	Отр.	Отр.
Толстая кишка	3+, C/M	4+, C/M	Отр.	Отр.	Лейкоциты, в том числе лимфоциты, в собственной пластинке слизистой оболочки; некоторое число клеток эндотелия	2+, C/M	Отр.	Отр.	Отр.	Клетки в собственной пластинке слизистой оболочки, возможно, лимфоциты; некоторое число клеток эндотелия
Желудок	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.	Лейкоциты, в том числе лимфоциты, в собственной пластинке слизистой оболочки; некоторое число клеток эндотелия	1+, С/М	1+, C	Отр.	Отр.	Веретенообразные клетки в собственной пластинке слизистой оболочки; по-видимому, клетки эндотелия
Тонкая кишка	4+, C/M	4+, C/M	Отр.	Отр.	Лейкоциты, в том числе лимфоциты, в собственной пластинке слизистой оболочки; некоторое число клеток эндотелия	2+, C/M	1+, С/М	Отр.	Отр.	Клетки в собственной пластинке слизистой оболочки, возможно, лимфоциты; некоторое число клеток эндотелия
Почечный клубочек	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.	В собственной пластинке; небольшое число клеток эндотелия	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.
Почечные канальцы	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.		Отр.	Отр.	Отр.	Отр.
Печень	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.		Отр.	Отр.	Отр.	Отр.
Лимфатический узел	3+, C/M	4+, C/M	Отр.	Отр.	Клетки в медуллярных связках и синусах; возможно плазматические клетки; немного клеток в коре	4+, М	3+, С	Отр.	Отр.	Клетки в медуллярных связках и синусах, меньше в коре
Легкое	3+, C/M	3+, C/M	Отр.	Отр.	Интерстициальные и перибронхиолярные клетки	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.
Поджелудочная железа	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.		Отр.	Отр.	Отр.	Отр.
Предстательная железа	3+, С	3+, С	Отр.	Отр.	Ацинозный эпителий; некоторое количество интерстициальных лейкоцитов	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.
Кожа	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.		Отр.	Отр.	Отр.	Отр.
Шейка матки	2+, C/M	1+, С/М	Отр.	Отр.	Подслизистые лейкоциты, вероятно, лимфоциты	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.
Эндометрий матки	Отр.	Отр.	Отр.	Отр.		Отр.	Отр.	Отр.	Отр.
Интенсивность окрашивания: 1+ = минимальная, 2+ = слабая, 3+ = умеренная, 4+ = значительная, Отр. = отрицательная, О=отсутствует. Частота окрашивания определенного типа клеток: очень низкая (ОН: <25% клеток); низкая (Н: 25-50% клеток); средняя (С: >50-75% клеток); высокая (В: 76-100% клеток). Характер окрашивания включает в себя тип клеток или элемент ткани - особенности соответствующего типа клеток (например, эпителия) или элемента ткани (например, базальная мембрана) - субклеточную или внеклеточную локализацию (мембрана, цитоплазма, цитоплазматические филаменты, базальная мембрана).

[00353] В отличие от макак, у людей AB79 также связывается с мононуклеарными лейкоцитами в печени, легких, предстательной железе и шейке матки, а также с ацинозным эпителием простаты. Связывание с AB79 не наблюдалось в сердце, почках, поджелудочной железе, коже и эндометрии матки обоих видов. В общем, окрашивание AB79 имело интенсивность от умеренной до значительной (от 3+ до 4+) в тканях человека и от минимальной до слабой (от 1+ до 2+) - в тканях яванской макаки (Таблица 11), что может отражать разницу в аффинности AB79 к CD38 человека и макаки и (или) различия в величине экспрессии CD38. Характер окрашивания был в основном цитоплазматическим, а в некоторых клетках окрашивались клеточные мембраны (Таблица 11). В целом, был сделан вывод, что макака является достоверным модельным видом для оценки потенциального фармакологического эффекта (эффектов) нацеливания на CD38 в модели аутоиммунного заболевания.

AB79 связывается с CD38, экспрессируемым яванской макакой

[00354] Аминокислотная последовательность человеческого белка CD38 имеет 91%-ю идентичность аминокислот со своим белком-ортологом яванской макаки, 59%-ю идентичность с таковым у мыши и крысы, и 54%-ю - у кролика. Сравнение связывающего эпитопа АВ79 в CD38 человека с соответствующей последовательностью в CD38 макаки выявило одну аминокислотную замену - замещение лизина глютаматом в положении 274. Чтобы определить, можно ли использовать AB79 для оценки потенциальных эффектов нацеливания на CD38 у макак, CD38 макаки экспрессировали в клетках яичника китайского хомячка (CHO), и проводили связывание CD38 макаки с AB79 в полумаксимальной эффективной концентрации (EC₅₀), равной 4,5 нМ (Фиг. 32А). Это значение примерно в 10 раз ниже, чем аффинность связывания AB79 с CD38 человека, экспрессируемого клетками CHO (KD=0,7 нМ), что указывает на то, что AB79 связывает CD38 макаки с меньшей активностью, чем CD38 человека. AB79 также связывался с B-, NK- и T-клетками в цельной крови макаки, и NK-клетки имели более высокую среднюю интенсивность флуоресценции, чем B-клетки и T-клетки (Фиг. 32B), указывая на то, что NK-клетки макаки имеют более высокоплотную экспрессию CD38 на клетку. После инкубации с цельной кровью макаки in vitro антитело AB79 вызвало цитолиз NK-клеток дозозависимым образом (Фиг. 32C), демонстрируя среднее значение EC₅₀, равное 29,6 нМ, что отображает приблизительно в 30 раз меньшую активность, чем при цитолизе NK-клеток из периферической крови человека (данные не продемонстрированы). В совокупности эти данные указывают на то, что яванская макака может быть менее чувствительной к фармакологическим эффектам AB79, чем человек. Тем не менее, данный профиль перекрестной реактивности, а также сходство профилей экспрессии CD38 позволяют предположить, что яванская макака является подходящим модельным видом для исследования потенциального фармакологического (-их) эффекта (-ов) антитела AB79 in vivo.

Фармакологические эффекты AB79 у здоровых макак

[00355] Чтобы охарактеризовать фармакологические эффекты AB79 in vivo, здоровым яванским макакам вводили AB79 внутривенно в дозе 0,03; 0,1; 0,3 и 1 мг/кг еженедельно, и 3, 30 и 80 мг/кг раз в две недели в течение 3 месяцев, и наблюдали за подгруппой животных в течение 3 месяцев после введения последней дозы (Фиг. 31А). Пиковые концентрации AB79 обычно возникали в конце инфузии и были, как правило, пропорциональны дозе (Таблица 12).

Таблица 12. Средние показатели фармакокинетики AB79 в сыворотке крови самок яванской макаки после внутривенной инфузии
Доза (мг/кг)	График введения доз	Время забора образцов	Cmax (мкг/мл)	ППК366 (ч*мкг/мл)	Т1/2 (ч)
0,1	Еженедельно	1-я неделя	1,77	104	Н/Р
		13-я неделя	2,49	218	Н/Р
0,3	Еженедельно	1-я неделя	4,32	327	Н/Р
		13-я неделя	7,78	665	Н/Р
1,0	Еженедельно	1-я неделя	21,1	1630	Н/Р
		13-я неделя	28,6	2700	Н/Р
3	Раз в две недели	1-я неделя	62,1	7600	Н/Р
		13-я неделя	90,1	18400	237
30	Раз в две недели	1-я неделя	680	92800	Н/Р
		13-я неделя	962	228000	Н/Р
80	Раз в две недели	1-я неделя	1630	220000	Н/Р
		13-я неделя	3140	456000	415

[00356] Экспозиция препарата, как правило, возрастала пропорционально дозе в равновесном состоянии у животных, которые не имели анти-АВ79 антител, и увеличивалась в 1,7-2,4 раза к 13-й неделе (Таблица 12), что согласуется с пониженным клиренсом из-за опосредованного мишенью распределения препарата AB79. Период полувыведения после введения последней дозы у животных из когорт, получавших 3 и 80 мг/кг анти-АВ79 антител, составлял 237 и 415 часов, соответственно (Таблица 12). Половых различий в характеристиках ФК не наблюдалось.

[00357] Популяция NK-клеток экспрессировала CD38 с равномерно высокой плотностью (Фиг. 32B), которая снизилась в периферической крови после первой инфузии AB79, с показателем ED₅₀ в 0,3 мг/кг (Фиг. 31B), соответствующей C_max в 7,63 мкг/мл и суммарной средней экспозицией в 665 ч*мкг/мл на 13-й неделе (Таблица 12). Напротив, популяция B-клеток экспрессировала CD38 гетерогенно, с более низкими средними плотностями, чем NK-клетки (Фиг. 32B), и которые снизились в периферической крови после первой инфузии AB79, с показателем ED₅₀ в 1,0 мг/кг (Фиг. 31C), C_max в 21,1 мкг/мл и с суммарной средней экспозицией в 2700 ч*мкг/мл на 13 -й неделе (Таблица 12). Популяция Т-клеток также экспрессировала CD38 гетерогенно, с еще более низкой средней плотностью, чем В-клетки (данные не продемонстрированы), и которая снизилась в периферической крови после первой инфузии AB79, и имела показатель ED₅₀ в 30 мг/кг (Фиг. 31D), C_max в 62,1 мкг/мл и суммарную среднюю экспозицию в 18400 ч*мкг/мл на 13-й неделе (Таблица 12). В совокупности эти данные из исследования по определению диапазона доз указывают на то, что еженедельная доза в 3 мг/кг будет поддерживать общие популяции NK-, B- и T-клеток в периферической крови на уровнях, которые на 80%, 60% и 20% выше базовых уровней, соответственно.

Профиль действия AB79 при коллаген-индуцированном артрите

[00358] Потенциальная эффективность AB79 была исследована на модели КИА у яванской макаки (вида, чья иммунная система, анатомия суставов и скелета достаточно похожи на таковые у человека), чтобы обеспечить применение клинических показателей макаки. С целью индукции артрита макакам в 0-е и 21-сутки внутрикожно вводили коллаген типа II (Фиг. 33), а появление антител против коллагена подтвердило успешную иммунизацию каждого животного (данные не продемонстрированы). Одной группе животных вводили 3 мг/кг антитела AB79 согласно профилактической схеме воздействия, начиная с 7-го дня и продолжая в течение 8 недель. Макак из трех терапевтических групп, у которых было явное заболевание, рандомизировали и вводили им контрольный носитель, 3 мг/кг АВ79 или 0,1 мг/кг дексаметазона. Терапевтическое воздействие продолжалось в течение 5 недель после начала воздействия (Фиг. 33).

[00359] Препарат AB79 хорошо переносился как при профилактических, так и при терапевтических режимах воздействия. Здоровая контрольная макака со временем набрала в весе, в то время как иммунизированные коллагеном макаки из других четырех групп начали терять в весе с 7-го дня (Фиг. 34А), что указывает на системный эффект, связанный с развитием артрита. На основании процентного изменения массы тела относительно базовой массы тела на момент начала исследования было обнаружено, что животные в профилактической группе AB79, терапевтической группе AB79 и терапевтической группе дексаметазона восстанавливают потерянную массу тела начиная с 14-го дня после начала воздействия, предполагая терапевтическую пользу как от AB79, так и от лечения положительным контролем - дексаметазоном. Прибавка в весе приблизилась к нормальным уровням у макак, получавших AB79 и дексаметазон, по сравнению со здоровым интактным контролем; животные с артритом, получавшие носитель, потеряли в весе (Фиг. 34А). Тяжесть артрита оценивали с использованием показателя клинического артрита, который представляет собой совокупную оценку активности заболевания, которая учитывает каждый измеримый сустав у животного в течение исследования с использованием 192-балльной системы оценивания. У животных, получавших носитель, наблюдалось прогрессирование заболевания с возрастанием клинических показателей в течение исследования (Фиг. 34B). Профилактическое воздействие антителом AB79 предотвратило развитие артрита со статистически достоверной значимостью (p <0,01) по сравнению с контрольным носителем. Аналогичным образом, терапевтическое воздействие антителом AB79 или дексаметазоном подавляло развитие артрита со статистически достоверной значимостью (p <0,05) по сравнению с контрольным носителем, и снижало показатели артрита по сравнению с базовыми уровнями до воздействия (Фиг. 34B). Подобные эффекты наблюдались для подгруппы ПМФ суставов как в отношении количества воспаленных ПМФ суставов (Фиг. 34C), так и в отношении среднего показателя опухлости суставов для всех ПМФ суставов (Фиг. 34D). Для получения исчерпывающей оценки суставов с артритом и способности AB79 проявлять «модифицирующую болезнь» активность при артрите человека проводилось рентгенологическое исследование каждого МФ и ПФ сустава. Профилактическое воздействие антителом AB79 предотвратило повреждение ПМФ суставов (данные не продемонстрированы), ДМФ (Фиг. 34E) и ПФ суставов (Фиг. 34F) (p <0,01) по сравнению с контрольным носителем. Аналогичным образом, терапевтическое воздействие антителом AB79 или дексаметазоном приводило к значительному (p <0,05) снижению степени повреждений в ПМФ суставах (данные не продемонстрированы), ДМФ (Фиг. 34E) и ПФ суставах (Фиг. 34F) по сравнению с контрольным носителем. Чтобы охарактеризовать составляющие прогрессирующего артрита, был проведен гистологический анализ ДМФ и ПМФ суставов на предмет клеточной инфильтрации, тяжести паннуса, повреждения хряща, резорбции кости и образования остеофитов. Профилактическое воздействие препаратом AB79 приводило к комплексным показателям, которые были значительно ниже (p <0,01), чем контрольное значение носителя, и сопоставимы по величине с показателями не иммунизированных коллагеном животных (Фиг. 35A). AB79 оказывал аналогичное влияние на каждый компонент; их значения были значительно ниже (p <0,01), чем контрольное значение носителя для паннуса (Фиг. 35B), инфильтрации лейкоцитов (Фиг. 35C), повреждений хряща (Фиг. 35D), резорбции кости (Фиг. 35E) и образования остеофитов (Фиг. 35F). Подобные эффекты, пусть и меньшей силы, также наблюдались при терапевтическом воздействии антителом AB79 или дексаметазоном (Фиг. 35A-E), хотя не все различия достигли статистической значимости.

[00360] Количественная гистоморфометрия была выполнена на всех ДМФ и ПМФ суставах в слепых исследованиях сертифицированным ветеринарным патологом, и были измерены параметры, включающие площадь суставного хряща (Фиг. 36A), толщину поражения суставного хряща (Фиг. 36B), процент поражения поверхности суставного хряща (Фиг. 36C) и площадь остеофитов относительно общей надкостной поверхности (Фиг. 36D). Все эти параметры иллюстрируют, что профилактическое воздействие антителом AB79 предотвратило развитие повреждения суставов со статистически значимой вероятностью. Терапевтическое воздействие антителом AB79 уменьшило тяжесть заболевания, хотя некоторые гистоморфометрические показатели не достигли уровня статистической значимости. Терапевтические эффекты препарата АВ79 были аналогичны таковым при терапевтическом введении дексаметазона.

[00361] Уровни C-реактивного белка (СРБ) (Фиг. 37A), щелочной фосфатазы (ЩФ) (Фиг. 37B) и альбумина (АЛЬБ) (данные не продемонстрированы) коррелировали с тяжестью заболевания. Профилактическое воздействие антителом AB79 предотвратило связанное с воспалением увеличение уровня СРБ (Фиг. 37A) и ЩФ (Фиг. 37B), наблюдаемое у контрольного животного, получавшего носитель. Терапевтическое воздействие антителом AB79 вызвало быстрое снижение СРБ и ЩФ, тогда как при воздействии дексаметазоном требовалось продолжительное лечение для снижения уровней СРБ и ЩФ (Фиг. 37A и 37B, соответственно). В биохимических показателях сыворотки не было обнаружено никаких признаков повреждения печени (например, увеличение АЛТ или АСТ), что свидетельствует о том, что увеличение ЩФ было связано с развитием поражения костей у животных с КИА, и что снижение ЩФ у животных, получавших AB79, было связано со снижением степени поражения костей. Биохимические показатели сыворотки крови - креатинин, азот мочевины крови, глюкоза и общий белок - изменялись во времени, но не имели постоянной корреляции с тяжестью артрита или режимом лечения (данные не продемонстрированы).

[00362] Во время исследования были проведены общий и развернутый клинический анализ крови, а также подсчет лейкоцитарной формулы, и основные параметры были опубликованы. Изменений в количестве эритроцитов после воздействия AB79 или дексаметазоном не наблюдалось (Фиг. 38А). Кроме того, уровень гематокрита понизился после развития артрита и повысился обратно к исходным уровням наивного контроля после воздействия как антителом AB79, так и дексаметазоном (Фиг. 38B). Ретикулоциты были повышены после развития артрита, а воздействие как препаратом AB79, так и дексаметазоном понизило количество ретикулоцитов до нормального уровня, обнаруженного в наивном контроле (Фиг. 38C). Уровни тромбоцитов и нейтрофилов при артрите были повышены, а воздействие AB79 понизило уровни как тромбоцитов, так и нейтрофилов по сравнению с наивным контролем, тогда как дексаметазон эффекта не имел (Фиг. 38D и 38E, соответственно). Напротив, общее количество лимфоцитов снижались при заболевании по сравнению с наивным контролем, и воздействие антителом AB79, как и ожидалось, дополнительно понизило уровни лимфоцитов, тогда как лечение дексаметазоном не оказывало эффекта (Фиг. 38F).

[00363] Среди субпопуляций лимфоцитов периферической крови количество NK-клеток снизилось на >95% ниже базовых уровней (Фиг. 39A) в течение 24 часов после воздействия антителом AB79, тогда как базовые уровни B-клеток (Фиг. 39B), T-клеток (Фиг. 39C) и моноцитов (Фиг. 39D) снизились максимум на 60%, 55% и 50%, соответственно. Уменьшение количества NK- и B-клеток сохранялось на протяжении всего периода дозирования, тогда как снижение числа T-клеток и моноцитов было кратковременным и наблюдалось только после первой инфузии. Аналогичная картина снижения наблюдалась в каждой клеточной популяции после профилактического воздействия антителом АВ79, за исключением того, что у соответствующей группы животных были более низкие уровни моноцитов до воздействия, и уровни моноцитов не изменились в ответ на воздействие. Различий в количестве В-, NK-, Т-клеток или количества моноцитов между животными, получавшими носитель, и животными, получавшими дексаметазон, не наблюдалось (Фиг. 39A, 29D и 29F, соответственно).

Проводили биологический анализ сыворотки крови для измерения концентрации АВ79 и анти-АВ79 антител. У каждого животного, получавшего профилактическую (Фиг. 40А) или терапевтическую (Фиг. 40В) дозу АВ79 был достигнут значительный эффект с показателем C_max в диапазоне от 24 до 97 мкг/мл. Все животные, подвергшиеся воздействию AB79, имели минимальные концентрации, которые превышали ЕС₅₀ для сатурации CD38 (Фиг. 32А) и лизиса NK-клеток (Фиг. 32С) in vitro. Анти-AB79 антитела обнаруживались у 4 из 7 животных из профилактической группы (Фиг. 40С) через 14-30 дней после первого введения дозы и до конца исследования. У двух животных были высокие титры, которые соответствовали низким концентрациям АВ79 у этих животных к 31-му дню (Фиг. 40А), указывая на то, что эти анти-AB79 антитела могут влиять на клиренс. Анти-AB79 антитела также обнаруживались у 4 из 5 животных из терапевтической группы (Фиг. 40D) с 21 дня после первого введения дозы и до конца исследования, а у двух животных также наблюдались высокие титры, которые соответствовали низким концентрациям AB79 у этих животных к концу исследования (Фиг. 40B). Тем не менее, показатели всех животных были включены в анализ данных, потому что большинство клеток-мишеней оставалось сниженным по сравнению с базовыми уровнями на протяжении всей продолжительности исследования (Фиг. 39E и 39F), за исключением Т-клеток после введения второй терапевтической дозы (Фиг. 39G).

Обсуждение

[00364] Сообщалось, что дефицит CD38 у мышей приводит к аттенуированным формам КИА, что иллюстрирует незаменимую функцию (функции) данной молекулы в модели аутоиммунного заболевания, однако роль клеток, экспрессирующих CD38, в моделях приматов не изучалась. Кроме того, многочисленные исследования продемонстрировали, что общий уровень экспрессии CD38 на клетках периферической крови положительно коррелирует с активностью заболевания у людей - пациентов с РА и СКВ (Cole S., et al., Arthritis Res Ther. 2018 May 2; 20(1): 85; Kraan M.C., et al., Rheumatology (Oxford). 1999 Nov; 38 (11): 1074-80; Vital E.M., et al., Arthritis Rheum. 2011 Oct; 63 (10): 3038-47; или Banchereau R., et al., Cell. 2016 Apr 21; 165 (3): 551-65). Моноклональное анти-CD38 антитело AB79 вызывало деплетирование плазматических клеток в образцах крови или костного мозга пациентов с РА или СКВ in vitro (Smithson et al. (2017) J. Immunol. 198 (1 Supplement) 224.20; Cole et al. (2018) Arthrit. Res. Ther. 20 (1): 85; Wang et al. (2016) Arthrit. Rheumatol. 68 (suppl 10). 2016 ACR/ARHP Annual Meeting, 1085; Mihara M., et al., Clin Immunol. 2001; 98 (3): 319-26; and Uchiyama Y., et al., Biol Pharm Bull. 2008; 31 (6): 1159-63). В отличие от других анти-CD38 мАТ, находящихся на стадии разработки (например, даратумумаб, изатуксимаб и MOR202), AB79 связывается с CD38, экспрессируемым яванской макакой, и предоставил уникальную возможность определить, может ли снижение уровня CD38-экспрессирующих клеток предотвратить и (или) уменьшить воспаление и повреждение тканей в модели аутоиммунного заболевания у приматов, отличных от человека. AB79 представляет собой высокоаффинное моноклональное антитело, которое эффективно опосредует деплетирование популяции CD38+ клеток (Smithson, G., et al., J Immunol May 1, 2017, 198 (1 Supplement) 224.20). Интегративный анализ демонстрирует, что CD38 является терапевтической мишенью при предболезни с высоким уровнем плазматических клеток, при установленном ревматоидном артрите, а также при системной красной волчанке (Cole S., et al., Arthritis Res Ther. 2018 May 2; 20 (1): 85).

[00365] Было установлено, что яванская макака является подходящей моделью для оценки потенциальных эффектов AB79 при аутоиммунном заболевании, поскольку КИА у этих приматов характеризуется симметричным полиартритом мелких суставов, который напоминает РА человека (Mihara et al. (2001) Clin. Immunol. 98 (3): 319-26; Uchiyama et al. (2008) Biol. Pharm. Bull. 31 (6): 1159-63; Uchiyama et al. (2008) Rheumatol. Int. 28: 879-883; Kato et al. (2008) Experimental Mol. Path. 84: 262-270), профили экспрессии для CD38 сходны между этими видами (Таблица 11) и AB79 связывается с CD38 макаки с аффинностью, которая оказалась в 10 раз меньше, чем для CD38 человека (Фиг. 32). Мы пришли к выводу, что еженедельная доза AB79 в 3 мг/кг будет достаточной для оценки потенциальной роли CD38 в КИА, потому что исследования диапазона доз на здоровых макаках продемонстрировали, что введение еженедельной дозы AB79 в 3 мг/кг приводит к снижению общих популяций NK-, В- и Т-клеток более чем на 80%, 60% и 20% от базовых уровней в периферической крови, соответственно (Фиг. 31B, 31C и 31D). Подобные снижения уровней NK-, B- и T-клеток были достигнуты в модели КИА для профилактического введения препарата (Фиг. 37E, 37F и 37G), несмотря на появление у некоторых животных анти-AB79 антител (Фиг. 39C и 39D). Снижение концентрации AB79 с течением времени у 3 животных, подвергавшихся профилактическому воздействию (Фиг. 39A), указывает на то, что эти антитела могут обладать повышенным клиренсом, однако B-, NK- и T-клетки не восстановились до базовых уровней к концу исследования (Фиг. 37E, 37F и 37G), указывая на то, что воздействия AB79 было достаточно для поддержания ФД эффектов на протяжении всего исследования. Поэтому эти животные были включены во все анализы. Эта картина в целом также соответствует терапевтическому воздействию AB79. NK- и B-клетки не восстановились до базового уровня после завершения исследования (Фиг. 37E, 37F и 37G), что указывает на то, что воздействия AB79 было достаточно для поддержания ФД эффектов на протяжении всего исследования. Напротив, количество Т-клеток восстановилось до базового уровня к концу исследования (Фиг. 37G), что позволяет предположить, что анти-АВ79 антитела могут частично нарушать интерпретацию терапевтических данных (т.е. приводит к недооценке вклада Т-клеток, экспрессирующих CD38, в КИА макаки).

[00366] Профилактическое введение AB79 предотвращало развитие артрита, как последовательно продемонстрировано во всех показателях, тогда как терапевтическое воздействие антителом AB79 подавляло развитие артрита и повреждение суставов (Фиг. 34, 35 и 36). Гистологический анализ суставов продемонстрировал, что антитело AB79 имело относительно широкий эффект, предотвращая формирование паннуса (Фиг. 35B), инфильтрацию (Фиг. 35C), повреждения хряща (Фиг. 35D), эрозию кости (Фиг. 35E) и формирование остеофитов (Фиг. 35F). Следует отметить, что терапевтическое воздействие антителом AB79 и дексаметазоном также подавляло данные прогрессирующие гистологические изменения, хотя и в меньшей степени, чем профилактическое введение. С течением времени показатели артрита снижались при терапевтическом воздействии (Фиг. 34B, 34C и 34D), что указывает на потенциальную обратимость повреждений. В совокупности эти данные продемонстрировали последовательные модифицирующие болезнь эффекты при профилактическом и терапевтическом воздействии антителом AB79.

[00367] В рамках исследованных режимов эффект данного терапевтического воздействия, по-видимому, сопоставим для AB79 и дексаметазона. Терапевтическое использование стероидов, таких как дексаметазон, является высокоэффективным при лечении аутоиммунных заболеваний человека, включая РА и СКВ, однако отрицательные побочные эффекты (например, остеопороз, гипертония, диабет, увеличение массы тела, катаракта, глаукома, истончение кожи и кровоподтеки) ограничивают длительное применение данных лекарственных препаратов. Возможность целенаправленного деплетирования CD38-экспрессирующих клеток для обеспечения сопоставимой эффективности при аутоиммунных заболеваниях человека без отрицательных побочных эффектов стероидов требует дальнейших клинических исследований.

[00368] Профилактические и терапевтические эффекты AB79 были связаны с устойчивым снижением уровня общих лимфоцитов крови (Фиг. 38F), NK-, B- и T-клеток (Фиг. 37C-37E), кратковременным снижением числа моноцитов (Фиг. 37F) и отсутствием изменений в эритроцитах (Фиг. 38А), тромбоцитах (Фиг. 38D) и нейтрофилах (Фиг. 38Е). Эти фармакодинамические данные демонстрируют, что существуют различия в чувствительности клеток, экспрессирующих CD38, к AB79-опосредованному деплетированию. Снижение этих показателей в основном коррелировало с плотностью клеточной экспрессии CD38; популяция NK-клеток равномерно проявляла наивысшую медианную плотность CD38 среди всех исследованных типов клеток (Фиг. 32B) и была наиболее чувствительной к AB79 (Фиг. 31B и 37C). Самая высокая плотность CD38, экспрессируемая на B-клетках, была приблизительно в 3 раза ниже, чем на NK-клетках (Фиг. 32B), и популяция B-клеток была менее чувствительной к AB79, чем NK-клетки (Фиг. 31C и 37C). CD38 экспрессировался Т-клетками в основном с более низкими средними значениями плотности, чем на В-клетках (Фиг. 32В), и Т-клетки были менее чувствительны к AB79-опосредованному деплетированию, чем В- и NK-клетки (Фиг. 31D и 37D). Препарат AB79 не оказал влияния на клетки, которые экспрессируют низкие плотности CD38 (например эритроциты) или не экспрессируют CD38 (например нейтрофилы) (Фиг. 37A, 37D и 37E). Исключением являются моноциты, которые экспрессируют CD38 равномерно с промежуточной плотностью, и уровень которых был только кратковременно понижен антителом AB79 (Фиг. 37F). Кинетика кратковременного понижения уровня моноцитов отличается от устойчивого сокращения, наблюдаемого для B-, T- и NK-клеток, и указывает на различные механизмы. Для NK-клеток наблюдался прямой цитолиз антителом AB79 in vitro (Фиг. 32C), и после однократного введения AB79 in vivo происходило устойчивое снижение числа NK-, B- и T-клеток (данные не продемонстрированы), указывая на то, что это снижение опосредовано механизмом КЗЦ и (или) АЗКЦ in vivo. Напротив, цитолиза моноцитов in vitro не наблюдалось (данные не продемонстрированы), и не было устойчивого снижения их числа in vivo (Фиг. 37F), что указывает на альтернативный механизм (например, краевое стояние лейкоцитов), опосредующий кратковременные снижения числа клеток in vivo. Устойчивость человеческих моноцитов к цитолизу антителом AB79 также наблюдалась у здоровых субъектов (не опубликовано) и была описана для даратумумаба у пациентов с множественной миеломой (Nijhof et al. (2016) Blood 128 (7): 959-70). Экспрессия ингибиторов КЗЦ и АЗКЦ в моноцитах человека не коррелировала существенно с устойчивостью к цитолизу даратумумабом, и остается неизвестным, почему моноциты относительно нечувствительны к даратумумабу и AB79.

[00369] Хотя снижение количества NK-клеток, наблюдаемое при воздействии AB79, качественно согласуется со снижением числа NK-клеток при воздействии даратумумабом у пациентов с рефрактерной миеломой, существуют количественные различия. Доза в/в инфузии (0,3 мг/кг), максимальная концентрация (C_max=4,32 мкг/мл) и экспозиция (ППК₃₆₆=327 мкг·час/мл) AB79, необходимые для поддержания NK-клеток периферической крови на уровне 50% ниже базового у макаки (Фиг. 31B) были примерно в 80, 116 и 297 раз ниже, чем соответствующая доза в/в инфузии (24 мг/кг), максимальная концентрация (C_max ~ 573 мкг/мл) и экспозиция (ППК_inf ~ 97175 мкг·ч/мл), необходимые для сопоставимого сокращения количества NK-клеток даратумумабом у пациентов с рефрактерной миеломой (Casneuf et al. (2017) Blood Adv. 1 (23): 2105-2114; Clemens et al. (2017) Clin. Pharmacokinet. 56 (8): 915-924. Следует отметить, что AB79 связывается с лимфоцитами обезьяны с аффинностью (KD=4 нМ), которая аналогична связыванию даратумумаба с клетками, экспрессирующими CD38 человека (KD=4 нМ) (Center For Drug Evaluation And Research Application Number: 761036orig1s00 Pharmacology Review(s)), однако неизвестно, обусловлены ли эти различия потенциальными межвидовыми различиями, течением заболевания и (или) активностями соответствующих антител. Тем не менее, для более точного сравнения необходимы фармакокинетические и фармакодинамические данные для AB79 у пациентов с рефрактерной миеломой, поскольку даратумумаб не реагирует перекрестно с CD38 мыши, крысы, кролика, свиньи, яванской макаки и макаки-резуса (1 April 2016 EMA/278085/2016 Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) Assessment report Darzalex International non-proprietary name: daratumumab Procedure No. EMEA/H/C/004077/0000).

[00370] В заключение, снижение количества клеток, экспрессирующих CD38, цитолитическим антителом AB79 предотвращало развитие КИА у макак при профилактическом введении и вызывало обратное развитие заболевания при терапевтическом введении. Предыдущее исследование с использованием образцов крови и костного мозга пациентов с СКВ продемонстрировало, что AB79 деплетирует 80% популяции короткоживущих и долгоживущих плазматических клеток и снижает уровень аутоантител (например, VH4-34 9G4+, анти-Ro и анти-дцДНК) in vitro (Wang et al. (2016) Arthritis Rheumatol. 68 (suppl 10). 2016 ACR/ARHP Annual Meeting, 1085). Эти объединенные данные свидетельствуют о том, что данная терапевтическая стратегия может быть эффективной при лечении РА, СКВ человека, а также других аутоиммунных заболеваний.

Пример 7: Оценка профиля AB79 у здоровых людей-добровольцев

[00371] В данном исследовании были охарактеризованы безопасность, переносимость, фармакокинетика и фармакодинамика AB79 с помощью рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования однократной внутривенной (в/в) инфузии или подкожной (п/к) инъекции AB79 в возрастающих дозах у здоровых субъектов.

Результаты

[00372] Препарат AB79 переносился хорошо. Все нежелательные явления (НЯ) были слабыми или умеренными, и не было досрочных исключений участников из-за НЯ или развития реакций в месте инфузии или инъекции при в/в и п/к введении исследуемых доз до 0,06 и 0,6 мг·кг^-1, соответственно. При более высоких дозах кратковременное повышение уровня цитокинов, в основном после внутривенного введения, совпало с уменьшением количества клеток, экспрессирующих CD38; клинические симптомы в первую очередь включали легкую гипертермию, головную боль и постуральную гипотензию. Не сообщалось о каких-либо выявленных аномалиях лабораторных исследований, электрокардиограмм, показателей жизненно важных функций или физических осмотров, связанных с лечением антителом AB79. AB79 снижал уровни плазменных бластов и естественных киллеров (NK-клеток) при аналогичных дозах и с 50%-й максимальной эффективной дозой приблизительно в 0,003 и 0,1 мг·кг^-1 для внутривенного и подкожного введения, соответственно. Снижение уровня иммуноглобулина (Ig) M и IgA происходило без сопоставимых изменений в уровне IgG. Общее количество лейкоцитов, гранулоцитов, лимфоцитов, эритроцитов и тромбоцитов оставалось в пределах нормы для всех уровней дозы.

Заключение

[00373] AB79 снижал уровни плазменных бластов и NK-клеток в периферической крови здоровых субъектов при введении внутривенно или подкожно, и был в целом безопасным и хорошо переносимым. Подкожное дозирование переносилось лучше и вызывало более стойкое деплетирование популяций клеток-мишеней, чем внутривенное дозирование. Этот плазмоцитолитический профиль может быть полезен для лечения нарушений, вызванных плазмацитами или NK-клетками, их злокачественными аналогами (например, клетками множественной миеломы и NK-клеточного лейкоза) и патогенными иммуноглобулинами.

План и цели исследования

[00374] Данное исследование представляет собой первое рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование AB79 1-й фазы с однократным введением препарата для человека (ПКИЛ), проведенное на здоровых взрослых субъектах. Основной целью исследования была оценка безопасности и переносимость однократных возрастающих доз AB79 после внутривенной инфузии или подкожной инъекции. Вторичные задачи заключались в оценке ФК и ФД в популяциях клеток крови и иммуногенности. Всего в данном исследовании приняли участие 74 человека. После двух скрининговых визитов, между которыми прошло не менее пяти дней, в течение 28-дневного периода перед рандомизацией, субъекты были приняты в исследование (День -2) для базовой оценки перед введением дозы. AB79 вводили в День 1 посредством двухчасовой в/в инфузии с последовательно возрастающими дозами в 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01; 0,03 или 0,06 мг·кг^-1 в шести когортах, или посредством п/к инъекции с дозами в 0,03; 0,1; 0,3 или 0,6 мг·кг^-1 в четырех других когортах. Выбор дозы был основан на модели ФК/ФД, полученной из серии исследований на яванских макаках (Roepcke et al. (2018) Pharmacol Res Perspect. 6 (3): с00402). При каждом уровне дозы от шести до восьми субъектов были рандомизированно включены в группу AB79 (n=4-6) или соответствующую группу плацебо (n=2).

[00375] Для каждой когорты применяли сигнальное дозирование, и первые два субъекта получали либо AB79, либо плацебо (1:1). Перед введением дозы оставшимся субъектам каждой группы анализировались суточные данные по безопасности и переносимости после введения дозы этим двум субъектам. Участники были помещены в стационарный Центр клинических исследований (ЦКИ) до 8-го дня с последующими контрольными визитами раз или два раза в неделю, с последним запланированным визитом в клинику на 78-й день для общей оценки безопасности и анализа ФК, ФД и иммуногенности. Последний контрольный телефонный звонок состоялся на 92-й день.

[00376] Повышение дозы основывалось преимущественно на степени тяжести НЯ, которая оценивалась с использованием Общих терминологических критериев к нежелательным явлениям. Повышение дозы должно было быть остановлено, если по крайней мере у двух субъектов из одной когорты наблюдался синдром высвобождения цитокинов (СВЦ, англ. «CRS»), приводящий к умеренным клиническим синдромам или реакциям на введение препарата от умеренной до тяжелой степени. Учитывая, что AB79 является антителом, разрушающим клетки лимфоцитов, дальнейшее повышение дозы не допускалось, если клинически значимое снижение общего количества лимфоцитов или их субпопуляций (номинально: снижение на >50% от самого низкого значения у субъекта до введения дозы и меньше нижнего предела нормального референтного диапазона (НРД, англ. «NRR»)) наблюдались и сохранялись в течение ≥29 суток. Исследователь и спонсор анализировали все заслепленные данные по безопасности для всех участников на каждом уровне дозы, прежде чем перейти к введению следующей, более высокой дозы.

[00377] Исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами надлежащей клинической практики в ЦКИ «Parexel International Phase 1 CPU», расположенном в больнице «Northwick Park Hospital», Харроу, Великобритания. Протокол был рассмотрен и утвержден (номер официального утверждения: 16/LO/2067) местным независимым комитетом по этике - «London-Brent Research Ethics Committee» (Лондон, Великобритания). Все субъекты подписали форму информированного согласия до начала каких-либо процедур исследования.

Участники исследования

[00378] Приемлемыми участниками были здоровые мужчины или женщины (без детородного потенциала) в возрасте от 18 до 55 лет, весом от 50 до 100 кг и с индексом массы тела (ИМТ) от 18,5 до 30 кг·м^-2.

[00379] Требовалось, чтобы основанные на проточной цитометрии подсчеты CD45+ лимфоцитов, Т-клеток, CD4+ Т-клеток и В-клеток были выше нижнего предела НРД, и уровни NK-клеток были в пределах верхнего 50-го процентиля НРД, учитывая, что CD38 высоко экспрессируется на NK-клетках. НРД были определены компанией «Takeda», где и проводился анализ методом проточной цитометрии.

[00380] Участники исключались из исследования, если они соответствовали критериям исключения, определенным в протоколе, таким как диагностированный иммунодефицит, повышенный риск инфекции, злокачественные новообразования в анамнезе или прием другого экспериментального лекарственного препарата до данного исследования, который может повлиять на активность экспериментального препарата из данного исследования.

[00381] Для измерения концентраций антитела AB79 в сыворотке, серийные образцы крови собирали до введения дозы и до 168 часов после введения дозы, а дополнительные образцы крови собирали в промежуточные контрольные моменты времени после введения дозы или при досрочном прекращении (ДП). Концентрацию AB79 в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, поверенного в ICON (Уайтсборо, штат Нью-Йорк).

[00382] Чтобы оценить фармакодинамический ответ на AB79, образцы периферической крови были собраны во время скрининговых визитов, в дни -1, 1, 2 (только для п/к), 3 (только для п/к), 4 (только для в/в), 5 (только для п/к), 6, 8, 15, 22, 29, 50 и 78 после введения дозы или при ДП. Первичными и вторичными оцениваемыми показателями фармакодинамики были измеренные в крови количества плазменных бластов и NK-клеток, соответственно. Дополнительные оцениваемые показатели включали общее количество лейкоцитов и подсчет лейкограммы, общее количество Т-клеток и количество клеток в их субпопуляциях - CD4 и CD8 Т-клеток, количество В-клеток, моноцитов и гранулоцитов. Субпопуляции лимфоцитов, моноциты и плазмобласты анализировались путем проточной цитометрии в «Covance» (Брюссель, Бельгия). Электрохемилюминесцентный анализ был поверен в ICON для обнаружения антител против АВ79 в сыворотке крови человека.

[00383] Обычные параметры оценки безопасности препарата, такие как НЯ, клинико-лабораторные параметры, физические осмотры, показатели электрокардиограммы (ЭКГ) и показатели жизненно важных функций, контролировались при скрининге, перед введением дозы препарата, а также в течение всего периода пребывания в ЦКИ и при последующих визитах.

[00384] Инфузионные реакции были зарегистрированы в клинических исследованиях других анти-CD38 антител, вводимых пациентам с ММ после в/в инфузии (Voorhees et al. (2015) Blood 126: 1829). Несмотря на то, что эксперименты ex vivo не продемонстрировали признаков агонистической активности AB79 в клетках крови человека, а инфузия AB79 не вызывала измеримых эффектов, указывающих на инфузионную реакцию в доклинических исследованиях на макаках, осуществлялся тщательный контроль на предмет появления признаков инфузионной реакции или СВЦ (головная боль, лихорадка, озноб, гипотензия, тошнота, рвота). Уровни воспалительных медиаторов, включающих сывороточный С-реактивный белок (СРБ), фактор некроза опухоли (ФНО) α, и интерлейкины 1 (ИЛ-1) и 6 (ИЛ-6), измерялись в различные контрольные моменты времени в дни 1 и 2, а также 4 (только для когорт с п/к введением). Уменьшение скорости инфузии и (или) предварительный прием пероральных профилактических препаратов с парацетамолом (ацетаминофен) и антигистаминами (анти-Н1 и анти-Н2) позволяли минимизировать побочные эффекты, когда это было необходимо.

[00385] Когорты с п/к введением контролировались на предмет развития реакции в месте инъекции (РРМИ, англ. «ISR»), такие как боль, жжение, покраснение, зуд, припухлость или уплотнение в месте инъекции.

[00386] Расчет сводной статистики и анализ данных проводились с использованием программ SAS версии 9.2 и R версии 3.5.1. Фармакокинетические параметры рассчитывались посредством некамерного анализа. Проводилась оценка фармакодинамических переменных и их сравнение между группами активной дозы и между каждым уровнем дозы АВ79 и плацебо.

[00387]

Результаты

[00388] В исследование были взяты семьдесят четыре субъекта, которым вводили одну дозу AB79 (n=54) или плацебо (n=20). За шестью когортами с в/в введением, получавшими AB79 в дозах 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01; 0,03 или 0,06 мг·кг^-1 или плацебо, и четырьмя когортами с п/к введением, получавшими AB79 в дозах 0,03; 0,1; 0,3 или 0,6 мг·кг^-1 или соответствующее плацебо, наблюдали в течение 92 дней; все субъекты участвовали в исследовании до самого завершения. Все участники были мужчинами, кроме одной женщины в группе с п/к введением плацебо. Исследуемая популяция состояла из представителей европеоидной (n=51), монголоидной (n=13), негроидной (n=4) расы или межрасовой (n=6) принадлежности. Средний возраст (34,4 года, в диапазоне от 19 до 55 лет) и ИМТ (от 24 до 25 кг·м^-2) были аналогичными между когортами с в/в и п/к введением, а также между группами AB79 и плацебо.

[00389] Все дозы AB79 в данном исследовании переносились хорошо. Интенсивность НЯ была легкой или умеренной, при этом большинство НЯ были слабовыраженными и хорошо сбалансированными между группами, получавшими плацебо и AB79 (Таблица 13). Не было никаких серьезных НЯ (СНЯ, англ. «SAE») или смертельных случаев, и ни одно из НЯ не привело ни к прекращению исследования, ни к прекращению визитов. Каких-либо примечательных результатов лабораторных исследований, ЭКГ, показателей жизненно важных функций или физических осмотров, связанных с воздействием AB79, зафиксировано не было.

Таблица 13. Общая характеристика НЯВЛ и НЯ, зафиксированных у двух или более субъектов в любой группе воздействия
В/в инфузия	AB79 (мг·кг-1) Количество субъектов (%)
	Пул плацебо (n=12)	0,0003 (n=4)	0,001 (n=4)	0,003 (n=4)	0,01 (n=6)	0,03 (n=6)	0,06 (n=6)
Субъекты с любыми НЯВЛ	11 (91,7)	3 (75,0)	3 (75,0)	3 (75,0)	6 (100,0)	6 (100,0)	6 (100,0)
Пирексия	0	0	0	0	1 (16,7)	1 (16,7)	3 (50,0)
Озноб	0	0	0	0	0	0	2 (33,3)
Назофарингит	2 (16,7)	0	1 (25,0)	0	0	0	2 (33,3)
Головная боль	4 (33,3)	0	0	1 (25,0)	2 (33,3)	3 (50,0)	5 (83,3)
Постуральное головокружение	0	0	0	0	0	1 (16,7)	5 (83,3)
Сонливость	0	0	0	0	0	1 (16,7)	2 (33,3)

П/к инъекция	AB79 (мг·кг-1) Количество субъектов (%)
	Пул плацебо (n=8)	0,03 (n=6)	0,1 (n=6)	0,3 (n=6)	0,6 (n=6)
Субъекты с любыми НЯВЛ	6 (75,0)	6 (100,0)	6 (100,0)	5 (83,3)	5 (83,3)
Эритема в месте инъекции	1 (12,5)	5 (83,3)	0	1 (16,7)	1 (16,7)
Боль в месте инъекции	0	3 (50,0)	3 (50,0)	0	0
Чувство жара	0	0	1 (16,7)	1 (16,7)	2 (33,3)
Назофарингит	1 (12,5)	2 (33,3)	3 (50,0)	1 (16,7)	3 (50,0)
Головная боль	2 (25,0)	2 (33,3)	1 (16,7)	1 (16,7)	3 (50,0)
Боль в ротоглотке	1 (12,5)	0	2 (33,3)	0	1 (16,7)

НЯВЛ определялись как НЯ, которые возникают или ухудшаются после приема первой дозы исследуемого препарата и в течение 94 дней после приема последней дозы исследуемого препарата. Субъекты с одним или несколькими НЯ в группе воздействия и уровень термина согласно Медицинскому словарю нормативной деятельности (англ. «MedDRA») учитывались только один раз на соответствующем уровне. Процентные показатели основаны на количестве субъектов в группе безопасности относительно одного типа воздействия. Для кодирования НЯ использовался словарь MedDRA (версия 18.0). НЯ - неблагоприятное явление; в/в - внутривенно; MedDRA - Медицинский словарь нормативной деятельности; п/к - подкожно; НЯВЛ - нежелательное явление, возникшее в ходе лечения.

[00390] Как продемонстрировано в Таблице 13, большинство НЯ были спорадическими, без тенденции к дозовой зависимости, за исключением головной боли, головокружения и озноба, которые чаще наблюдались в группах с более высокой дозой АВ79, что соответствовало более высокой частоте возникновения СВЦ. Эти эффекты (Таблица 14) в основном наблюдались у субъектов, получавших высокие дозы (один субъект при в/в дозе в 0,03 мг·кг^-1 и шесть - при в/в дозе в 0,06 мг·кг^-1; один субъект при п/к дозе в 0,3 мг·кг^-1 и два - при п/к дозе в 0,6 мг·кг^-1). У этих субъектов наблюдалось снижение количества плазменных бластов и NK-клеток, что позволяет предположить, что эти симптомы являются результатом деплетирования популяций клеток, экспрессирующих CD38.

Таблица 14. Количество и процент субъектов с клиническим СВЦ
В/в инфузия	AB79 (мг·кг-1) Количество субъектов (%)
	Пул плацебо (n=12)	0,0003 (n=4)	0,001 (n=4)	0,003 (n=4)	0,01 (n=6)	0,03 (n=6)	0,06 (n=6)
СВЦ	0	0	0	0	0	1 (16,7)	6 (100)
Степень тяжести						Легкая	Все легкие
П/к инъекция	AB79 (мг·кг-1) Количество субъектов (%)
	Пул плацебо (n=8)	0,03 (n=6)	0,1 (n=6)	0,3 (n=6)	0,6 (n=6)
СВЦ	0	0	0	1 (16,7)	2 (33,3)
Степень тяжести				Легкая	Все легкие

[00391] После п/к инъекции наблюдались случаи только легкого, кратковременного СВЦ, большинство из которых прошли в течение 7 дней. Эти реакции имели обратную зависимость доза-эффект, поскольку реакции были у пяти из шести субъектов, получавших самую низкую дозу п/к, и только у одного субъекта в каждой из двух групп с самыми высокими дозами.

[00392] Концентрации антитела AB79 во всех образцах сыворотки крови, взятых в контрольные моменты времени, в когорте с в/в введением от № 1 (0,0003 мг·кг^-1) до № 4 (0,01 мг·кг^-1) были меньше нижнего предела количественного определения (НПКО) для данного метода обнаружения (т.е. 10 нг·мл^-1), предположительно из-за низких доз и отсутствия антител против лекарственного препарата (данные не продемонстрированы). После в/в инфузии 0,03 и 0,06 мг·кг^-1 AB79 максимальная наблюдаемая концентрация в сыворотке (C_max) составляла 21,4 и 100,4 нг·мл^-1, соответственно, и возникала через 5 минут после окончания инфузии (Таблица 15 и Фиг. 41). Впоследствии концентрации в сыворотке быстро снижались до уровня ниже НПКО в течение 1 или 4 часов после окончания инфузии, соответственно, и экспозиции не могли быть точно рассчитаны. Оказалось, что C_max возрастает приблизительно в пять раз при двукратном увеличении дозы от 0,03 до 0,06 мг·кг^-1. Из-за ограниченных данных о концентрациях AB79 в сыворотке крови (образцы были взяты в одном-трех контрольных моментах времени для каждого субъекта), доступных для когорт с в/в введением доз 0,03 и 0,06 мг·кг^-1, было невозможно точно рассчитать ФК параметры, кроме времени достижения максимальной концентрации в сыворотке крови (t_max) и C_max.

Таблица 15. Обобщение параметров фармакокинетики AB79 после однократной 2-часовой в/в инфузии AB79 в дозах 0,03 и 0,06 мг·кг^-1 или однократной п/к инъекции AB79 в дозе 0,6 мг·кг^-1 у здоровых субъектов

Путь введения	Доза	n	t max (ч) n=6	C max (нг·мл-1) n=6	ППКlast (нг·сут-1·мл-1) n=6
В/в	0,03 мг·кг-1	6	2,09 (2,07; 2,67)	21.4 (39)	Н/П
	0,06 мг·кг-1	6	2,09 (2,07; 2,13)	100.4 (52)	Н/П
П/к	0,6 мг·кг-1	6	23,87 (7,98; 96,02)а	23,0 (67)	90,4 (92)

^а n=5. Значения представляют собой среднее значение (%КВ), за исключением t_max, где представлены медианы (минимальная и максимальная). ППК_last - площадь под кривой сывороточная концентрация-время от времени 0 до времени последнего измерения концентрации; C_max - максимальная наблюдаемая концентрация в сыворотке крови; КВ - коэффициент вариации; в/в - внутривенно; Н/П - не применимо; п/к - подкожно; t_max - время до достижения максимальной концентрации в сыворотке.

[00393] Концентрации AB79 в сыворотке у всех субъектов в когортах п/к введения от № 1 (0,03 мг·кг^-1) до № 3 (0,3 мг·кг^-1) были ниже НПКО данного метода обнаружения во все моменты времени. После однократной п/к инъекции AB79 в 0,6 мг·кг^-1 у пяти субъектов из данной когорты наблюдалось медианное t_max примерно в 24 часа после инъекции. Среднее значение C_max у всех шести субъектов (включая одного субъекта с концентрациями в сыворотке ниже НПКО) в этой группе составляло 23,0 нг·мл^-1, что составляет приблизительно 23% от значения C_max после 2-часовой в/в инфузии в дозе 0,06 мг·кг^-1 (одна десятая п/к дозы в этой когорте). Сывороточные концентрации AB79 постепенно снижались до уровня ниже НПКО через 3-14 суток после инъекции (Фиг. 41). У одного субъекта из когорты с введением дозы 0,6 мг·кг^-1 уровень AB79 был ниже порога определения в течение всего периода забора образцов для ФК. По сравнению с параметрами ФК из когорт с в/в введением, после п/к инъекции в 0,6 мг·кг^-1 наблюдались более высокая межсубъектная вариабельность. Индивидуальное t_max варьировало от приблизительно 8 до 96 часов (от 0,33 до 4 суток) после инъекции пяти субъектам с измеримыми концентрациями в соответствующей когорте.

[00394] В когортах с введением AB79 путем внутривенной инфузии наблюдалось дозозависимое снижение уровня NK-клеток при дозах ≥0,003 мг·кг^-1, с ≥90%-м снижением у всех субъектов, получавших инфузии с дозировкой 0,06 мг·кг^-1 (Фиг. 42). Эффективная концентрация при полумаксимальном ответе (ЕС₅₀) была ниже НПКО метода анализа ФК (т.е. 10 нг·мл^-1), тем не менее, 75%-я максимально эффективная концентрация (ЕС₇₅) для снижения уровня NK-клеток при в/в введении AB79 составила 21,4 нг·мл^-1 (Таблица 15). В то время как уровень NK-клеток был неизменно ниже базового уровня к концу инфузии, продолжительность восстановления до базовых уровней (< -20%) была вариабельной и обычно связанной с дозой; для восстановления уровней NK-клеток до базовых значений для доз в 0,003; 0,01; 0,03 и 0,06 мг·кг^-1 требовалось в среднем 4, 4, 6 и 8 суток, соответственно (Фиг. 43). При внутривенном введении AB79 не наблюдалось клинически значимых снижений количества общих лимфоцитов, В- и Т-клеток, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, гранулоцитов, эритроцитов или тромбоцитов (данные не продемонстрированы).

[00395] В когортах с введением АВ79 путем п/к инъекции наблюдалось дозозависимое снижение количества NK-клеток (Фиг. 42) и плазменных бластов (Фиг. 43) при дозах ≥0,1 мг·кг^-1 с ≥90%-м снижением уровня плазменных бластов у всех субъектов, получавших инъекции дозой в 0,6 мг·кг^-1. 75%-е снижение количества NK-клеток происходило при 0,6 мг·кг^-1 (данные не продемонстрированы) с C_max, равной 23,0 нг·мл^-1 (Таблица 15). Уровни плазменных бластов и NK-клеток были понижены по сравнению с базовым уровнем в течение 8 часов после инъекции и имели t_max, равное 48 часов. Продолжительность восстановления до базовых уровней была вариабельной; на восстановление до базового уровня (т.е. в пределах -20% от базовых уровней) для доз в 0,1; 0,3 и 0,6 мг·кг^-1 требовалось в среднем 4, 78 и 50 дней, соответственно (данные не продемонстрированы). Снижение было минимальным или отсутствовало для показателей количества общих лимфоцитов, В- и Т-клеток, цитотоксических Т-клеток, Т-хелперов, моноцитов (Фиг. 43) и гранулоцитов, эритроцитов или тромбоцитов (данные не продемонстрированы).

[00396] В то время как уровни общих иммуноглобулинов оставались в пределах НРД, уровни общего IgM были понижены в когортах с в/в введением AB79 в дозах 0,03 и 0,06 мг·кг^-1, и в дни 15-64 были значительно (P <0,05) ниже, чем в соответствующей согласованной по времени контрольной группе плацебо (Фиг. 44, верхние панели). Значительное (P <0,01) снижение уровня общего IgM также наблюдалось в дни 15-64 для AB79, вводимого подкожно в дозах 0,3 и 0,6 мг·кг^-1 (Фиг. 44, нижние панели). Уровни IgM проявляли тенденцию к восстановлению до исходного уровня на 78-е сутки. Значительного влияния АВ79 на уровни IgA и IgG не наблюдалось как при в/в, так и при п/к введении (данные не продемонстрированы).

[00397] Из 54 субъектов, которые получали AB79, у одного субъекта из когорты с п/к введением дозы в 0,03 мг·кг^-1 наблюдался стойкий (а именно на 15-е, 29-е и 78-е сутки), высокий (а именно 160, 1280 и 320) титр анти-AB79 антитела (данные не продемонстрированы). Концентрации AB79 в сыворотке у этого субъекта были ниже НПКО в течение всего периода исследования, так же как и уровни AB79 у субъектов, отрицательных по антителам против лекарственных препаратов (АПЛП) из той же когорты, поэтому потенциальное влияние АПЛП на фармакокинетику AB79 не может быть определено. Необходимо также упомянуть, что АПЛП не совпадали с НЯ.

[00398] Одна из терапевтических стратегий лечения СКВ и РА заключается в снижении уровня CD38+ лимфоцитов, основываясь на нескольких публикациях, которые демонстрируют связь между уровнем CD38+ лимфоцитов и активностью заболевания (Cole et al. (2018) Arthritis Res. Ther. 20 (1): 85; Kraan et al. (1999) Rheumatology (Oxford) 38 (11): 1074-1080; Vital et al. (2011) Arthritis Rheum. 63 (10): 3038-3047; Banchereau et al. (2016) Cell 165 (3): 551-565; and Grammer et al. (2003) J. Clin. Invest. 112 (10): 1506-1520). Этого можно достичь с помощью антитела AB79, поскольку оно специфически связывается с CD38 и деплетирует клетки (Smithson et al. (2017) J. Immunol. 198 (1 Suppl): 224.20). Добавление АВ9 в образцы крови или костного мозга от пациентов с СКВ или РА приводило к сокращению популяции плазматических клеток и уменьшению продуцирования аутоантиген-специфических антител (Wang et al. (2016 ACR/ARHP Annual Meeting abstract 1085) Arthritis Rheum. 68 (suppl 10). Применение антитела AB79 также вызывало сокращение числа лимфоцитов, экспрессирующих высокие уровни CD38, у макак (Roepcke et al. (2018) Pharmacol Res Perspect. 6 (3): e00402), предотвращало развитие КИА при профилактическом введении и подавляло прогрессирование артрита при терапевтическом введении (Smithson et al. (2017) J. Immunol. 198 (1 Suppl): 127.17). Таким образом, цель данного исследования состояла в том, чтобы охарактеризовать безопасность, переносимость, ФК и ФД для однократной внутривенной инфузии и подкожной инъекции AB79 здоровым субъектам и определить, оправдано ли клиническое исследование у пациентов.

[00399] Данное исследование представляет собой первую характеризацию переносимости, ФК и ФД цитолитического антитела против CD38, вводимого здоровым субъектам. Все дозы AB79 в данном исследовании переносились хорошо. Интенсивность нежелательных явлений была от легкой до умеренной, но большинство из них были легкими (Таблица 13). Не было серьезных нежелательных явлений или смертельных случаев, и ни одно из нежелательных явлений не привело ни к прекращению исследования, ни к прекращению визитов. Каких-либо примечательных результатов лабораторных исследований, ЭКГ, показателей жизненно важных функций или физических осмотров, связанных с воздействием AB79, зафиксировано не было. В то время как связанные с инфузией реакции в данном исследовании не наблюдались, СВЦ наблюдался у семи субъектов из группы в/в инфузий AB79 и у трех субъектов из группы п/к введения AB79 (Таблица 14). Случаи СВЦ сопровождались уменьшением количества плазменных бластов и NK-клеток (Фиг. 42 и 43), умеренным увеличением уровня цитокинов (например, ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6; данные не продемонстрированы) и C-реактивного белка в крови (данные не продемонстрированы). Эти данные согласуются с исследованиями на макаках, иллюстрирующими, что деплетирование клеток совпадало с повышением сывороточных уровней ФНО-α (Roepcke et al. (2018) Pharmacol Res Perspect. 6 (3): e00402). По сравнению с группами внутривенного введения, в группах с подкожным введением наблюдалась более низкая частота возникновения СВЦ и минимальное повышение уровня цитокинов при сопоставимых концентрациях AB79 в периферической крови (например, 0,03 мг·кг^-1 внутривенно против 0,6 мг·кг^-1 подкожно). Эти результаты согласуются с более низкой частотой инфузионных реакций для подкожного введения даратумумаба по сравнению с его введением внутривенно у пациентов с рефрактерной миеломой. Для внутривенного и подкожного введения даратумумаба использовались лекарственные формы разного состава, тогда как для внутривенного и подкожного введения AB79 здоровым субъектам использовалась лекарственная форма одного и того же состава. Данные для AB79 демонстрируют, что более низкая частота возникновения СВЦ в первую очередь связана с подкожным путем введения, а не с различиями в составе лекарственной формы.

[00400] Доклиническая оценка AB79 у макак позволила предположить, что площадь под кривой зависимости концентрации от времени в сыворотке увеличивалась больше чем пропорционально дозе после однократного в/в и п/к введения AB79 (Roepcke et al. (2018) Pharmacol Res Perspect. 6 (3): e00402). Из-за ограниченного количества данных о концентрации в сыворотке у здоровых людей формальная оценка пропорциональности дозы или биодоступности при п/к введении AB79 не могла быть проведена. Тем не менее, C_max после в/в инфузии по-видимому увеличивалась больше чем пропорционально дозе (а именно, C_max возрастала приблизительно пятикратно при двукратном увеличении дозы от 0,03 до 0,06 мг·кг^-1), что сопоставимо с аналогичной тенденцией, наблюдаемой у макак при введении AB79, и с данными, опубликованными для других моноклональных антител с опосредованной мишенью элиминацией. Нормализованная относительно дозы C_max после п/к инъекции была существенно ниже, чем после 2-часовой в/в инфузии. После достижения C_max концентрации в сыворотке снижались намного медленнее после п/к инъекции и поддерживались выше НПКО намного дольше по сравнению с в/в инфузией.

[00401] Фармакодинамический ответ здоровых субъектов на внутривенное введение AB79 является наиболее убедительным примером деплетирования популяции NK-клеток моноклональным анти-CD38 антителом, описанным к настоящему времени. Антитело AB79 в дозе 0,06 мг·кг^-1 привело к возникновению средней C_max в 100,4 нг·мл^-1 и снижению NK-клеток периферической крови в каждом здоровом субъекте по меньшей мере на 90% ниже базовых уровней (Фиг. 42). Данная степень снижения количества NK-клеток не была достигнута у пациентов с рецидивирующей/рефрактерной ММ, которым внутривенно вводили даратумумаб в дозе до 24 мг·кг^-1, и у которых средняя C_max составляла до 573 мкг·мл^-1 (Clemens et al. (2017) Clin. Pharmacokinet. 56 (8): 915-924; Xu et al. (2017) Clin. Pharmacol. Ther. 101 (6): 721-724). Неизвестно, является ли данное различие в активности лекарственных препаратов результатом различий в исследуемых популяциях и (или) свойств соответствующих антител. В то время как у здоровых субъектов и пациентов с миеломой наблюдается одинаковое количество NK-клеток, и эти клетки экспрессируют сходную плотность CD38 (Krejcik et al. (2016) Blood 128 (3): 384-394), у пациентов с миеломой выявляются более высокие уровни других CD38+ клеток-мишеней (таких как клетки миеломы), которые могут вносить вклад в возникновение различий в активности деплетирования NK-клеток между этими популяциями. Более точный анализ требует данных ФК и ФД для AB79 в аналогичной популяции пациентов с рецидивирующей/рефрактерной миеломой.

[00402] Атрибутом более высокой активности является то, что для получения сопоставимых фармакодинамических эффектов требуется меньшее количество и объем терапевтического средства. Эффективность лечения пациентов при в/в инфузии анти-CD38 мАТ может быть повышена введением данного антитела путем п/к инъекции небольшого объема, поскольку ее можно осуществить в течение минуты, в отличие от 2-4 часов, обычно необходимых для получения внутривенной инфузии, и при хронической терапии п/к инъекцию потенциально может безопасно вводить сам пациент у себя дома с удобством и фармакоэкономическими преимуществами. Данное исследование представляет собой первую демонстрация уменьшения количества клеток после п/к инъекции цитолитического анти-CD38 антитела субъектам человека, и которое продемонстрировало, что п/к инъекция обладает лучшей переносимостью, чем в/в инфузия. Данное исследование является также первым отчетом о том, что п/к инъекция анти-CD38 антитела объемом 1 мл и дозой от 0,1 до 0,6 мг·кг^-1 вызывает максимальный фармакодинамический эффект (например, снижение уровня плазмобластов на >90%) в периферической крови. Антитело AB79 приводило к сокращению количества плазменных бластов и NK-клеток дозозависимым образом дозы при внутривенных дозах ≥0,1 мг·кг^-1 (Фиг. 42 и 43). Соответствующая концентрация EC₉₀ для снижения уровня плазмобластов составляла приблизительно 23,0 нг·мл^-1, тогда как для сокращения количества NK-клеток она составляла 100,4 нг·мл^-1 (Таблица 15). Данное потенциальное различие в чувствительности может быть связано с уровнем экспрессии CD38, характерной для данных клеточных популяций; плазмобласты экспрессируют приблизительно в пять раз более высокую плотность CD38, чем NK-клетки (Krejcik et al. (2016) Blood 128 (3): 384-394). Неизвестно, существует ли подобное различие у пациентов с СКВ, РА и (или) ММ, поскольку данные, описывающие уровень плазменных бластов и NK-клеток в этих популяциях пациентов, до настоящего времени не сообщались. Если у пациентов наблюдается сопоставимая активность, то эффективность п/к инъекции небольшого объема может потенциально обеспечить терапию для пациентов без доступа к инфузионному центру и снизить общие расходы на здравоохранение.

[00403] Циркулирующие моноциты, B- и T-клетки экспрессируют более низкие уровни CD38 у здоровых субъектов, и эти типы клеток не были снижены посредством AB79 до такой же степени, как плазмобласты и NK-клетки. Эти данные согласуются с данными, описанными для яванских макак после начальной дозы AB79, а также после хронического воздействия в течение 3 месяцев; NK-клетки равномерно экспрессировали высокие уровни CD38 и были более чувствительными к AB79, чем B- и T-лимфоциты, которые экспрессируют CD38 гетерогенно и обычно на более низких уровнях, чем NK-клетки (Roepcke et al. (2018) Pharmacol Res Perspect. 6 (3): e00402). Эти данные также согласуются с данными, описанными для пациентов с рецидивирующей/рефрактерной миеломой, подвергавшихся хронической терапии даратумумабом; влияния на моноциты не наблюдалось, а субпопуляции CD38+ B- и T-клеток были снижены в периферической крови (Krejcik et al. (2016) Blood 128 (3): 384-39).

[00404] Ig в основном продуцируются плазматическими клетками, находящимися в лимфоидных тканях (например, костный мозг, лимфатические узлы, селезенка и т. д.). Подобный эффект был описан у пациентов с СКВ, подвергавшихся многократным дозам ингибитора протеасом - бортезомиба; наблюдалось значительное снижение уровня общего IgM (34%), IgA (34%) и IgG (15%) в сыворотке крови, что соответствовало снижению уровня плазматических бластов крови (54%), плазматических клеток костного мозга (50%) и показателей активности заболевания баллы (Alexander et al. (2015) Ann. Rheum. Dis. 74 (7): 1474-1478). В совокупности эти данные указывают на то, что AB79 может быть эффективным для снижения уровней Ig и потенциально - для избирательного сокращения уровней что IgM и IgA по сравнению с IgG. Данный профиль активности может обеспечить терапевтическую пользу при IgM-, IgA- и IgG-ассоциированных нефропатиях, минимизируя подавление других компонентов иммунной системы.

[00405] В заключение, однократная доза АВ79, вводимая внутривенно или подкожно, хорошо переносилась здоровыми субъектами. AB79 вызывало деплетирование популяции плазмобластов и NK-клеток и снижение уровней сывороточных IgM и IgA. Данная плазмоцитолитическая активность может быть целесообразной для лечения различных гематологических злокачественных новообразований и (или) иммунологических нарушений, связанных с дисрегуляцией плазматических клеток, патогенных антител, иммуноглобулинов и (или) NK-клеток.

Включение посредством ссылки

[00406] Содержание всех цитируемых ссылок (включая ссылки на литературу, патенты, патентные заявки и веб-сайты), которые могут цитироваться в данной заявке, настоящим напрямую включается в качестве ссылки во всей полноте для любых целей, как и ссылки, приведенные в данном документе, в той же степени, как если бы каждая отдельная ссылка была специально и индивидуально указана для включения в качестве ссылки во всей ее полноте для любых целей.

Эквиваленты

Раскрытие данного изобретения может быть воплощено в других конкретных формах без отклонения от сущности или существенных характеристик данного изобретения. Таким образом, вышеизложенные варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не как ограничивающие раскрытие данного изобретения. Следовательно, объем раскрытия данного изобретения обозначен прилагаемой формулой изобретения, а не вышеизложенным описанием, и поэтому все изменения, которые входят в значение и диапазон эквивалентности формулы изобретения, рассматриваются как включенные в данный документ. Предполагается, что модификации для осуществления изобретения, очевидные для специалистов в данной области техники, находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ТАКЕДА ФАРМАСЬЮТИКАЛ КОМПАНИ ЛИМИТЕД

Даль, Мартин

Федик, Эрик

Эванс, Роберт

Жао, Линь

<120> ПОДКОЖНОЕ ВВЕДЕНИЕ АНТИ-CD38 АНТИТЕЛ

<130> 101588-5009-WO

<140> PCT/US19/13547

<141> 2019-01-14

<150> US 62/617,146

<151> 2018-01-12

<160> 13

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 300

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD38 человека

<400> 1

Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys

1 5 10 15

Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val

20 25 30

Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln

35 40 45

Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu

50 55 60

Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val

65 70 75 80

Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys

85 90 95

His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu

100 105 110

Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile

115 120 125

Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr

130 135 140

Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys

145 150 155 160

Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp

165 170 175

Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val

180 185 190

Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu

195 200 205

Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser

210 215 220

Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala

225 230 235 240

Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp

245 250 255

Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln

260 265 270

Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val

275 280 285

Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile

290 295 300

<210> 2

<211> 301

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD38 яванской макаки

<400> 2

Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys

1 5 10 15

Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Val Cys Leu Gly Val Cys Leu Leu Val

20 25 30

Leu Leu Ile Leu Val Val Val Val Ala Val Val Leu Pro Arg Trp Arg

35 40 45

Gln Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg Phe Pro Glu Thr Val

50 55 60

Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His Pro Glu Met Arg His

65 70 75 80

Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser

85 90 95

Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Val Lys

100 105 110

Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr Leu Leu Trp Ser Arg

115 120 125

Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe

130 135 140

Thr Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp

145 150 155 160

Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp

165 170 175

Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr

180 185 190

Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly Val Val His Val Met

195 200 205

Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly

210 215 220

Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Ala Leu Glu

225 230 235 240

Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln

245 250 255

Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile

260 265 270

Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys

275 280 285

Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser Gly Ile

290 295 300

<210> 3

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR1 AB79

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly

1. 5

<210> 4

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR2 AB79

<400> 4

Ile Ser Trp Asn Gly Gly Lys Thr

1 5

<210> 5

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR3 AB79

<400> 5

Ala Arg Gly Ser Leu Phe His Asp Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Gly His

1 5 10 15

<210> 6

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCDR1 AB79

<400> 6

Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn Tyr

1 5

<210> 7

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCDR2 AB79

<400> 7

Arg Asp Ser

1

<210> 8

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCDR3 AB79

<400> 8

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 135

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность участка цепи (VH)

<400> 9

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Ser Trp Asn Gly Gly Lys Thr His Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Leu Phe His Asp Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Gly His

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135

<210> 10

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность участка цепи (VL)

<400> 10

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu

<210> 11

<211> 453

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность участка цепи (HC)

<400> 11

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Ser Trp Asn Gly Gly Lys Thr His Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Leu Phe His Asp Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Gly His

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 12

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность участка цепи (LC)

<400> 12

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 13

<211> 318

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD157 человека

<400> 13

Met Ala Ala Gln Gly Cys Ala Ala Ser Arg Leu Leu Gln Leu Leu Leu

1 5 10 15

Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Gly Ala Arg Ala

20 25 30

Arg Trp Arg Gly Glu Gly Thr Ser Ala His Leu Arg Asp Ile Phe Leu

35 40 45

Gly Arg Cys Ala Glu Tyr Arg Ala Leu Leu Ser Pro Glu Gln Arg Asn

50 55 60

Lys Asn Cys Thr Ala Ile Trp Glu Ala Phe Lys Val Ala Leu Asp Lys

65 70 75 80

Asp Pro Cys Ser Val Leu Pro Ser Asp Tyr Asp Leu Phe Ile Asn Leu

85 90 95

Ser Arg His Ser Ile Pro Arg Asp Lys Ser Leu Phe Trp Glu Asn Ser

100 105 110

His Leu Leu Val Asn Ser Phe Ala Asp Asn Thr Arg Arg Phe Met Pro

115 120 125

Leu Ser Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Phe Leu Ser Trp Cys

130 135 140

Arg Gln Lys Asn Asp Ser Gly Leu Asp Tyr Gln Ser Cys Pro Thr Ser

145 150 155 160

Glu Asp Cys Glu Asn Asn Pro Val Asp Ser Phe Trp Lys Arg Ala Ser

165 170 175

Ile Gln Tyr Ser Lys Asp Ser Ser Gly Val Ile His Val Met Leu Asn

180 185 190

Gly Ser Glu Pro Thr Gly Ala Tyr Pro Ile Lys Gly Phe Phe Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Ile Pro Asn Leu Gln Lys Glu Lys Ile Thr Arg Ile Glu Ile

210 215 220

Trp Val Met His Glu Ile Gly Gly Pro Asn Val Glu Ser Cys Gly Glu

225 230 235 240

Gly Ser Met Lys Val Leu Glu Lys Arg Leu Lys Asp Met Gly Phe Gln

245 250 255

Tyr Ser Cys Ile Asn Asp Tyr Arg Pro Val Lys Leu Leu Gln Cys Val

260 265 270

Asp His Ser Thr His Pro Asp Cys Ala Leu Lys Ser Ala Ala Ala Ala

275 280 285

Thr Gln Arg Lys Ala Pro Ser Leu Tyr Thr Glu Gln Arg Ala Gly Leu

290 295 300

Ile Ile Pro Leu Phe Leu Val Leu Ala Ser Arg Thr Gln Leu

305 310 315

<---

1. Способ лечения заболевания с повышенной экспрессией CD38 у индивида,

где способ включает подкожное введение индивиду стандартной лекарственной формы выделенного анти-CD38 антитела человека,

где анти-CD38 антитело содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую

CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3,

CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4 и

CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую

CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6,

CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7 и

CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8,

где стандартная лекарственная форма находится в объеме 3 мл или менее в дозе от 0,03 до 0,6 мг на 1 кг массы тела.

2. Способ по п. 1, где

область VH имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и

область VL имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.

3. Способ по п. 1, где анти-CD38 антитело содержит

тяжелую цепь с аминокислотной последовательность SEQ ID NO:11 и

легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стандартная лекарственная форма находится в объеме 2 мл или менее.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стандартная лекарственная форма находится в объеме 1 мл или менее.

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где введение анти-CD38 антитела не вызывает гемолитическую анемию или тромбоцитопению.

7. Способ по любому из пп. 1-5, где введение анти-CD38 антитела приводит к менее чем 10%, менее чем 20%, менее чем 30%, менее чем 40% или менее чем 50% частоте возникновения нежелательных явлений, возникших в ходе лечения (НЯВЛ), 3-й или 4-й степени, выбранных из группы, состоящей из анемии, гемолитической анемии, тромбоцитопении, утомляемости, инфузионных реакций (ИР), лейкопении и лимфопении.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где введение анти-CD38 антитела приводит к менее чем 10%, менее чем 20%, менее чем 30%, менее чем 40%, менее чем 50% уменьшению количества популяции эритроцитов.

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где введение анти-CD38 антитела приводит к менее чем 10%, менее чем 20%, менее чем 30%, менее чем 40%, менее чем 50% уменьшению количества популяции тромбоцитов.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание или рак.

11. Способ по любому из пп. 1-9, где заболевание выбрано из группы, состоящей из системной красной волчанки (СКВ), ревматоидного артрита (РА), воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), язвенного колита (ЯК), миастении гравис (МГ), нейромиелита зрительного нерва (НЗН), иммунной тромбоцитопенической пурпуры (ИТП), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТП), антифосфолипидного синдрома (АФС), пузырчатки обыкновенной (ПО), пузырчатки листовидной (ПЛ), анти-NMDA-рецепторного энцефалита (АНРЭ), аутоиммунной гемолитической анемии (АГА), болезни Грейвса, мембранозной нефропатии, синдрома Шегрена (СШ), АНЦА-ассоциированного васкулита, приобретенного буллезного эпидермолиза (ПБЭ), буллезного пемфигоида (БП), тиреоидита Хашимото, склеродермии, IgG4-ассоциированной болезни и болезни «трансплантат против хозяина».

12. Способ по любому из пп. 1-9, где заболевание выбрано из группы, состоящей из множественной миеломы, хронического лимфобластного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, плазмоклеточного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, B-клеточной лимфомы и лимфомы Беркитта.

13. Способ по п. 12, где заболевание представляет собой множественную миелому.

14. Способ по п. 13, где заболевание представляет собой рецидивирующую множественную миелому (РММ), рецидивирующую и рефрактерную множественную миелому (РРММ) или впервые выявленную множественную миелому (ВВММ).

15. Способ по любому из предыдущих пунктов, где анти-CD38 антитело человека вводят в форме фармацевтически приемлемой композиции.