Композиции и соответствующие способы для сельского хозяйства

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу снижения приспособленности тли, включающему доставку тле композиции, содержащей противомикробный пептид и проникающий в клетку пептид. Также раскрыта композиция, содержащая эффективное количество противомикробного пептида и проникающего в клетку пептида. Изобретение эффективно для снижения приспособленности тли. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 65 ил., 12 табл., 25 пр.

 

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/450045, поданной 24 января 2017 г., и предварительной заявке на патент США № 62/583763, поданной 9 ноября 2017 г., содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Членистоногие насекомые повсеместно распространены в среде, окружающей человека, и было использовано множество средств в попытке контроля заражения этими вредителями. Потребность в стратегиях контроля вредителей возрастает. Таким образом, в данной области техники имеется необходимость в новых способах и композициях для контроля насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе раскрыты композиции и способы для модулирования приспособленности насекомых для сельского хозяйства. Композиция содержит средство, которое изменяет уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина, при этом изменение приводит к модулированию приспособленности хозяина.

В одном аспекте в данном документе предусмотрен способ снижения приспособленности насекомого, являющегося сельскохозяйственным вредителем, при этом способ предусматривает доставку противомикробного пептида, характеризующегося по меньшей мере 90% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или 100% идентичностью последовательности) с одним или несколькими из следующих: цекропина (SEQ ID NO: 82), мелиттина, копсина, дрозомицина (SEQ ID NO: 93), дермсидина (SEQ ID NO: 81), андропина (SEQ ID NO: 83), морицина (SEQ ID NO: 84), цератотоксина (SEQ ID NO: 85), абецина (SEQ ID NO: 86), апидецина (SEQ ID NO: 87), профенина (SEQ ID NO: 88), индолицидина (SEQ ID NO: 89), протегрина (SEQ ID NO: 90), тахиплезина (SEQ ID NO: 91) или дефензина (SEQ ID NO: 92), насекомому, являющемуся сельскохозяйственным вредителем.

В некоторых вариантах осуществления доставка может включать доставку противомикробного пептида в по меньшей мере одну среду обитания, в которой насекомое, являющееся сельскохозяйственным вредителем, растет, живет, размножается, питается или осуществляет заражение.

В любом из вышеуказанных вариантов осуществления доставка может включать распыление противомикробного пептида на сельскохозяйственную культуру.

В любом из вышеуказанных вариантов осуществления противомикробный пептид может быть доставлен в виде композиции, съедобной для насекомого, для поглощения насекомым, являющимся сельскохозяйственным вредителем.

В любом из вышеуказанных вариантов осуществления противомикробный пептид может быть составлен с приемлемым с точки зрения сельского хозяйства носителем в виде жидкой, твердой, аэрозольной, пастообразной, гелеобразной или газообразной композиции.

В любом из вышеуказанных вариантов осуществления насекомое, являющееся сельскохозяйственным вредителем, может представлять собой тлю.

В другом аспекте в данном документе предусмотрена композиция, содержащая противомикробный пептид, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или 100% идентичностью последовательности) с одним или несколькими из следующих: цекропина (SEQ ID NO: 82), мелиттина, копсина, дрозомицина (SEQ ID NO: 93), дермсидина (SEQ ID NO: 81), андропина (SEQ ID NO: 83), морицина (SEQ ID NO: 84), цератотоксина (SEQ ID NO: 85), абецина (SEQ ID NO: 86), апидецина (SEQ ID NO: 87), профенина (SEQ ID NO: 88), индолицидина (SEQ ID NO: 89), протегрина (SEQ ID NO: 90), тахиплезина (SEQ ID NO: 91) или дефензина (SEQ ID NO: 92), составленная для целенаправленного воздействия на микроорганизм в организме насекомого.

В некоторых вариантах осуществления второго аспекта противомикробный пептид может находиться в композиции в концентрации от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 100 мг/г (от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 1 нг/г, от приблизительно 1 нг/г до приблизительно 10 нг/г, от приблизительно 10 нг/г до приблизительно 100 нг/г, от приблизительно 100 нг/г до приблизительно 1000 нг/г, от приблизительно 1 мг/г до приблизительно 10 мг/г, от приблизительно 10 мг/г до приблизительно 100 мг/г) или от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл (от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 1 нг/мл, от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 10 нг/мл, от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, от приблизительно 100 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл, от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл, от приблизительно 10 мл/мл до приблизительно 100 мг/мл).

В некоторых вариантах осуществления второго аспекта противомикробный пептид может дополнительно содержать нацеливающий домен.

В некоторых вариантах осуществления второго аспекта противомикробный пептид может дополнительно содержать пептид, проникающий в клетку.

В другом аспекте композиция содержит средство, которое изменяет уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме насекомого–хозяина, при этом изменение приводит к снижению приспособленности насекомого–хозяина.

В некоторых вариантах осуществления любой из вышеуказанных композиций один или несколько микроорганизмов могут представлять собой бактерию или гриб, обитающие в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления бактерия, обитающая в организме хозяина, представляет собой по меньшей мере одну бактерию, выбранную из группы, состоящей из Candidatus spp, Buchenera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp и Escherichia spp. В некоторых вариантах осуществления гриб, обитающий в организме хозяина, представляет собой по меньшей мере один гриб, выбранный из группы, состоящей из Candida, Metschnikowia, Debaromyces, Starmerella, Pichia, Cryptococcus, Pseudozyma, Symbiotaphrina bucneri, Symbiotaphrina kochii, Scheffersomyces shehatae, Scheffersomyces stipites, Cryptococcus, Trichosporon, Amylostereum areolatum, Epichloe spp, Pichia pinus, Hansenula capsulate, Daldinia decipien, Ceratocytis spp, Ophiostoma spp и Attamyces bromatificus. В определенных вариантах осуществления бактерия представляет собой Buchnera spp. (например, Buchnera aphidicola, эндосимбионта тлей).

В любой из вышеуказанных композиций средство, которое далее в данном документе также может называться модулирующим средством, может изменять рост, деление, жизнеспособность, метаболизм и/или продолжительность жизни микроорганизма, обитающего в организме хозяина. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления модулирующее средство может снижать жизнеспособность одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство повышает темпы роста или жизнеспособность одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина.

В любом из вышеуказанных вариантов осуществления модулирующее средство представляет собой фаг, полипептид, малую молекулу, антибиотик, бактерию или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления фаг связывается с белком клеточной поверхности в бактерии, обитающей в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления фаг является вирулентным по отношению к бактерии, обитающей в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления фаг представляет собой по меньшей мере один фаг, выбранный из группы, состоящей из Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Ampullaviridae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fuselloviridae, Gluboloviridae, Guttaviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae и Tectiviridae.

В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой по меньшей мере одно из бактериоцина, бактериоцина R–типа, C–богатого пептида клубеньков, противомикробного пептида, лизина или регуляторного пептида бактериоцитов.

В некоторых вариантах осуществления малая молекула представляет собой метаболит.

В некоторых вариантах осуществления антибиотик представляет собой антибиотик широкого спектра действия. В альтернативных вариантах осуществления антибиотик представляет собой антибиотик узкого спектра действия (например, рифампицин).

В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство представляет собой встречающуюся в природе бактерию. В некоторых вариантах осуществления бактерия представляет собой по меньшей мере одну бактерию, выбранную из группы, состоящей из Bartonella apis, Parasaccharibacter apium, Frischella perrara, Snodgrassella alvi, Gilliamela apicola, Bifidobacterium spp и Lactobacillus spp. В некоторых вариантах осуществления бактерия представляет собой по меньшей мере одну бактерию, выбранную из группы, состоящей из Candidatus spp, Buchenera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp и Escherichia spp.

В любой из вышеуказанных композиций приспособленность хозяина может быть измерена по выживаемости, размножению или метаболизму хозяина. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления модулирующее средство может модулировать приспособленность хозяина посредством повышения восприимчивости хозяина к пестицидам (например, восприимчивости к пестициду, приведенному в таблице 12). В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство модулирует приспособленность хозяина посредством повышения восприимчивости хозяина к пестицидам. В некоторых вариантах осуществления восприимчивость к пестицидам представляет собой восприимчивость к бактерицидам или фунгицидам. В некоторых вариантах осуществления восприимчивость к пестицидам представляет собой восприимчивость к инсектицидам.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может содержать множество различных модулирующих средств. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит модулирующее средство и пестицидное средство (например, пестицид, приведенный в таблице 12). В некоторых вариантах осуществления пестицидное средство представляет собой бактерицидное или фунгицидное средство. В некоторых вариантах осуществления пестицидное средство представляет собой инсектицидное средство.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может содержать модулирующее средство и средство, повышающее темпы роста сельскохозяйственной культуры.

В любой из вышеуказанных композиций модулирующее средство может быть связано со вторым фрагментом. В некоторых вариантах осуществления второй фрагмент представляет собой модулирующее средство.

В любой из вышеуказанных композиций модулирующее средство может быть связано с нацеливающим доменом. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий домен нацеливает модулирующее средство на участок–мишень в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий домен нацеливает модулирующее средство на один или несколько микроорганизмов, обитающих в организме хозяина.

В любой из вышеуказанных композиций модулирующее средство может содержать инактивирующую пре– или пропоследовательность с образованием тем самым модулирующего средства–предшественника. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство–предшественник превращается в активную форму в организме хозяина.

В любой из вышеуказанных композиций модулирующее средство может содержать линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый линкер.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может дополнительно содержать носитель. В некоторых случаях носитель может представлять собой приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может дополнительно содержать приманку для хозяина, липкое средство или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления приманка для хозяина представляет собой съедобное средство и/или хемоаттрактант.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может содержаться в дозе, эффективной для модулирования приспособленности хозяина.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может быть составлена для доставки в микроорганизм, обитающий в кишке хозяина.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может быть составлена для доставки в микроорганизм, обитающий в бактериоците хозяина и/или кишке хозяина. В некоторых вариантах осуществления композиция может быть составлена для доставки в растение. В некоторых вариантах осуществления композиция может быть составлена для применения в кормушке для хозяина.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может быть составлена в виде жидкости, порошка, гранул или наночастиц. В некоторых вариантах осуществления композицию составляют в виде композиции, выбранной из группы, состоящей из липосомы, полимера, бактерии, секретирующей пептид, и синтетической нанокапсулы. В некоторых вариантах осуществления синтетическая нанокапсула доставляет композицию в участок–мишень в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления участок–мишень представляет собой кишку хозяина. В некоторых вариантах осуществления участок–мишень представляет собой бактериоцит в организме хозяина.

В еще одном аспекте в данном документе также предусмотрены хозяева, которые содержат любую из вышеуказанных композиций. В некоторых вариантах осуществления хозяин представляет собой насекомое. В некоторых вариантах осуществления насекомое представляет собой вид, принадлежащий к Coleoptera, Diptera, Hemiptera, Lepidoptera, Orthoptera, Thysanoptera или Acarina. В некоторых вариантах осуществления насекомое представляет собой жука, долгоносика, муху, тлю, белокрылку, цикадку, червеца, моль, бабочку, кузнечика, сверчка, трипса или микроскопического клеща. В определенных вариантах осуществления насекомое представляет собой тлю.

В дополнительном аспекте в данном документе также предусмотрена система для модулирования приспособленности хозяина, содержащая модулирующее средство, которое целенаправленно воздействует на микроорганизм, требуемый для приспособленности хозяина, при этом система является эффективной для модулирования приспособленности хозяина, и при этом хозяин представляет собой насекомое. Модулирующее средство может включать в себя любую из композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство составляют в виде порошка. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство составляют в виде растворителя. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство составляют в виде концентрата. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство составляют в виде разбавителя. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство готовят для доставки посредством объединения любой из предыдущих композиций с носителем.

В еще одном дополнительном аспекте также предусмотрены способы модулирования приспособленности насекомого с помощью любой из композиций, описанных в данном документе. В одном случае способ модулирования приспособленности насекомого–хозяина предусматривает доставку композиции по любому из предыдущих пунктов хозяину, при этом модулирующее средство целенаправленно воздействует на один или несколько микроорганизмов, обитающих в организме хозяина, и тем самым модулирует приспособленность хозяина. В другом случае способ модулирования разнообразия микроорганизмов в организме насекомого–хозяина предусматривает доставку композиции по любому из предыдущих пунктов хозяину, при этом модулирующее средство целенаправленно воздействует на один или несколько микроорганизмов, обитающих в организме хозяина, и тем самым модулирует разнообразие микроорганизмов в организме хозяина.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов модулирующее средство может изменять уровни одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов модулирующее средство может изменять функцию одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления один или несколько микроорганизмов может представлять собой бактерию и/или гриб. В некоторых вариантах осуществления один или несколько микроорганизмов требуются для приспособленности хозяина. В некоторых вариантах осуществления один или несколько микроорганизмов требуются для выживаемости хозяина.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов этап доставки может включать предоставление модулирующего средства в дозе и в течение времени, достаточных для воздействия на один или несколько микроорганизмов с модулированием тем самым разнообразия микроорганизмов в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления этап доставки включает местное применение любой из предыдущих композиций в отношении растения. В некоторых вариантах осуществления этап доставки включает предоставление модулирующего средства через генетически модифицированное растение. В некоторых вариантах осуществления этап доставки включает предоставление модулирующего средства хозяину в виде съедобного средства. В некоторых вариантах осуществления этап доставки включает получение хозяина, несущего модулирующее средство. В некоторых вариантах осуществления хозяин, несущий модулирующее средство, может переносить модулирующее средство одному или нескольким дополнительным хозяевам.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов композиция может быть эффективной для повышения восприимчивости хозяина к пестицидному средству (например, пестициду, приведенному в таблице 12). В некоторых вариантах осуществления хозяин является устойчивым к пестицидному средству до доставки модулирующего средства. В некоторых вариантах осуществления пестицидное средство представляет собой аллелохимическое средство. В некоторых вариантах осуществления аллелохимическое средство представляет собой кофеин, цистатин N сои, монотерпены, дитерпеновые кислоты или фенольные соединения. В некоторых вариантах осуществления композиция является эффективной для избирательного уничтожения хозяина. В некоторых вариантах осуществления композиция является эффективной для снижения приспособленности хозяина. В некоторых вариантах осуществления композиция является эффективной для снижения продуцирования незаменимых аминокислот и/или витаминов в организме хозяина.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов хозяин представляет собой насекомое. В некоторых вариантах осуществления насекомое представляет собой вид, принадлежащий к Coleoptera, Diptera, Hemiptera, Lepidoptera, Orthoptera, Thysanoptera или Acarina. В некоторых вариантах осуществления насекомое представляет собой жука, долгоносика, муху, тлю, белокрылку, цикадку, червеца, моль, бабочку, кузнечика, сверчка, трипса или микроскопического клеща. В определенных вариантах осуществления насекомое представляет собой тлю.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов этап доставки включает доставку любой из ранее полученных композиций в растение. В некоторых вариантах осуществления растение представляет собой сельскохозяйственную культуру. В некоторых вариантах осуществления сельскохозяйственная культура представляет собой несобранную сельскохозяйственную культуру на момент доставки. В некоторых вариантах осуществления сельскохозяйственная культура представляет собой собранную сельскохозяйственную культуру на момент доставки. В некоторых вариантах осуществления сельскохозяйственная культура включает в себя собранные фрукты или овощи. В некоторых вариантах осуществления композицию доставляют в количестве и в течение периода времени, эффективных для повышения темпов роста сельскохозяйственной культуры. В некоторых вариантах осуществления сельскохозяйственная культура включает в себя растения кукурузы, сои или пшеницы.

В дополнительном аспекте в данном документе также предусмотрены скрининговые анализы для идентификации модулирующего средства, которое модулирует приспособленность хозяина. В одном случае скрининговый анализ для идентификации модулирующего средства, которое модулирует приспособленность хозяина, включает этапы (a) воздействия на микроорганизм, который может обитать в организме хозяина, одного или нескольких кандидатных модулирующих средств и (b) идентификации модулирующего средства, которое снижает приспособленность хозяина.

В некоторых вариантах осуществления скринингового анализа модулирующее средство представляет собой микроорганизм, обитающий в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления микроорганизм представляет собой бактерию. В некоторых вариантах осуществления бактерия, обитая в организме хозяина, снижает приспособленность хозяина. В некоторых вариантах осуществления скринингового анализа модулирующее средство отрицательно влияет на микроорганизм, расщепляющий аллелохимикат. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство представляет собой фаг, антибиотик или исследуемое соединение. В некоторых вариантах осуществления антибиотик представляет собой тиментин, рифампицин или азитромицин.

В некоторых вариантах осуществления скринингового анализа хозяин может представлять собой беспозвоночное. В некоторых вариантах осуществления беспозвоночное представляет собой насекомое. В некоторых вариантах осуществления насекомое представляет собой тлю. В некоторых вариантах осуществления насекомое представляет собой комара. В некоторых вариантах осуществления насекомое представляет собой сверчка.

В любом из вышеуказанных вариантов осуществления скринингового анализа приспособленность хозяина может быть модулирована путем модулирования микробиоты хозяина.

Определения

Используемый в данном документе термин "бактериоцин" относится к пептиду или полипептиду, который обладает противомикробными свойствами. Встречающиеся в природе бактериоцины продуцируются определенными прокариотами и действуют против организмов, родственных штамму–продуценту, но не против самого штамма–продуцента. Бактериоцины, предусмотренные в данном документе, включают в себя без ограничения встречающиеся в природе бактериоцины, такие как бактериоцины, продуцируемые бактериями, и их производные, такие как сконструированные бактериоцины, рекомбинантно экспрессируемые бактериоцины и химически синтезируемые бактериоцины. В некоторых случаях бактериоцин представляет собой функционально активный вариант бактериоцинов, описанных в данном документе. В некоторых случаях вариант бактериоцина является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности бактериоцина, описанного в данном документе, или встречающегося в природе бактериоцина.

Используемый в данном документе термин "бактериоцит" относится к специализированной клетке, встречающейся в определенных насекомых, в которой обитают внутриклеточные бактерии со свойствами симбиотических бактерий.

Используемый в данном документе термин "эффективное количество" относится к количеству модулирующего средства (например, фага, лизина, бактериоцина, малой молекулы или антибиотика) или композиции, содержащей указанное средство, достаточному для получения указанного результата, например, для снижения или ослабления приспособленности организма–хозяина (например, насекомого); для достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации модулирующего средства в организме хозяина–мишени; для достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации модулирующего средства в кишке хозяина–мишени; для достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации модулирующего средства в бактериоците хозяина–мишени; для модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина–мишени.

Используемый в данном документе термин "приспособленность" относится к способности организма–хозяина выживать, расти и/или давать жизнеспособное потомство. Приспособленность организма может быть измерена с помощью одного или нескольких параметров, в том числе без ограничения продолжительности жизни, скорости размножения, подвижности, массы тела и скорости метаболизма. Приспособленность может быть дополнительно измерена на основании показателей активности (например, у животных, наносящих укусы, или людей) или переноса заболевания (например, переноса от переносчика переносчику или переноса от переносчика животному).

Используемый в данном документе термин "кишка" относится к любой части кишки хозяина, в том числе передней кишке, средней кишке или задней кишке хозяина.

Используемый в данном документе термин "хозяин" относится к организму (например, насекомому), несущему обитающие в нем микроорганизмы (например, эндогенные микроорганизмы, эндосимбиотические микроорганизмы (например, первичных или вторичных эндосимбионтов), организмы–комменсалы и/или патогенные микроорганизмы).

Используемый в данном документе термин "снижение приспособленности хозяина" относится к любому нарушению физиологических процессов хозяина или любой активности, осуществляемой указанным хозяином, вследствие введения модулирующего средства, в том числе без ограничения любому одному или нескольким из следующих желаемых эффектов: (1) уменьшению популяции хозяина на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (2) снижению скорости размножения хозяина (например, насекомого) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (3) снижению подвижности хозяина (например, насекомого) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (4) снижению массы тела хозяина (например, насекомого) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (5) снижению скорости метаболизма или активности хозяина (например, насекомого) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше или (6) уменьшению заражения растения хозяином (например, насекомым) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше. Снижение приспособленности хозяина может быть определено по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

Термин "насекомое" включает любой организм, принадлежащий к типу Arthropoda и классу Insecta или классу Arachnida, на любой стадии развития, т. е. неполовозрелых и взрослых насекомых.

Используемый в данном документе термин "лизин", также известный как эндолизин, аутолизин, муреингидролаза, пептидогликангидролаза или гидролаза клеточной стенки, относится к гидролитическому ферменту, который может лизировать бактерию посредством расщепления пептидогликана в клеточной стенке бактерии. Лизины, предусмотренные в данном документе, включают в себя без ограничения встречающиеся в природе лизины, такие как лизины, продуцируемые фагами, лизины, продуцируемые бактериями, и их производные, такие как сконструированные лизины, рекомбинантно экспрессируемые лизины и химически синтезируемые лизины. Функционально активный вариант бактериоцина может являться на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности синтетического, рекомбинантного или встречающегося в природе бактериоцина, в том числе любого описанного в данном документе.

Используемый в данном документе термин "микроорганизм" относится к бактериям или грибам. Микроорганизмы могут относиться к микроорганизмам, обитающим в организме–хозяине (например, эндогенным микроорганизмам, эндосимбиотическим микроорганизмам (например, первичным или вторичным эндосимбионтам)), или микроорганизмам, экзогенным для хозяина, в том числе микроорганизмам, которые могут выступать в качестве модулирующих средств. Используемый в данном документе термин "микроорганизм–мишень" относится к микроорганизму, который обитает в организме хозяина и подвергается воздействию модулирующего средства прямо или косвенно.

Используемый в данном документе термин "средство" или "модулирующее средство" относится к средству, которое способно изменять уровни и/или функционирование микроорганизмов, обитающих в организме–хозяине (например, насекомом), и тем самым модулировать (например, снижать) приспособленность организма–хозяина (например, насекомого).

Используемый в данном документе термин "пестицид" или "пестицидное средство" относится к веществу, которое можно применять для контроля вредителей, значимых для сельского хозяйства, окружающей среды и домашнего хозяйства/быта, таких как насекомые, грибы, бактерии и вирусы. Термин "пестицид" понимают как охватывающий встречающиеся в природе или синтетические инсектициды (ларвициды или адультициды), регуляторы роста насекомых, акарициды (майтициды), нематоциды, эктопаразитициды, бактерициды, фунгициды или гербициды (вещества, которые можно применять в сельском хозяйстве для контроля или модификации роста растений). Дополнительные примеры пестицидов или пестицидных средств приведены в таблице 12. В некоторых случаях пестицид представляет собой аллелохимикат. Используемый в данном документе термин "аллелохимикат" или "аллелохимическое средство" означает вещество, продуцируемое организмом, который может воздействовать на физиологическую функцию (например, зарождение, рост, выживаемость или размножение) другого организма (например, насекомого–хозяина).

Используемый в данном документе термин "пептид", "белок" или "полипептид" охватывает любую цепь из встречающихся в природе или не встречающихся в природе аминокислот (как D–, так и L–аминокислот), независимо от длины (например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 100 или больше аминокислот), наличия или отсутствия посттрансляционных модификаций (например, гликозилирования или фосфорилирования) или наличия, например, одной или нескольких не являющихся аминоацильными групп (например, углеводных, липидных и т. д.), ковалентно связанных с пептидом, и включает, например, природные белки, синтетические или рекомбинантные полипептиды и пептиды, гибридные молекулы, пептоиды или пептидомиметики.

Как используется в данном документе, "процент идентичности" между двумя последовательностями определяют с помощью алгоритма BLAST 2.0, который описан в Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403–410. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно благодаря Национальному центру биотехнологической информации.

Используемый в данном документе термин "бактериофаг" или "фаг" относится к вирусу, который инфицирует бактерии и реплицируется в них. Бактериофаги реплицируются в бактериях после введения их генома в цитоплазму и осуществляют это с помощью литического цикла, который приводит к лизису бактериальной клетки, или лизогенного (не являющегося литическим) цикла, при котором бактериальная клетка остается интактной. Фаг может представлять собой изолят встречающегося в природе фага или сконструированный фаг, в том числе векторы или нуклеиновые кислоты, которые кодируют частичный геном фага (например, в том числе по меньшей мере все важнейшие гены, необходимые для осуществления жизненного цикла фага в бактерии–хозяине) или полный геном фага.

Используемый в данном документе термин "растение" относится к целым растениям, органам растений, растительным тканям, растительным клеткам, семенам и их потомству. Растительные клетки включают в себя без ограничения клетки из семян, суспензионных культур, зародышей, участков меристемы, каллюсной ткани, листьев, корней, побегов, гаметофитов, спорофитов, пыльцы и микроспор. Части растений включают в себя дифференцированные и недифференцированные ткани, в том числе без ограничения: корни, стебли, побеги, листья, пыльцу, семена, опухолевую ткань и различные формы клеток и культуры (например, отдельные клетки, протопласты, зародыши и каллюсную ткань). Растительная ткань может находиться в растении или в органе, ткани или культуре клеток растения. Кроме того, растение может быть генетически модифицированным таким образом, что в нем продуцируется гетерологичный белок или РНК, например, любого из модулирующих средств в способах и композициях, описанных в данном документе.

Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигуры предусмотрены для иллюстрации одной или нескольких характеристик, аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения и не предполагаются как ограничивающие.

На фиг. 1A–1G показаны изображения различных систем доставки антибиотиков. Тлей LSR–1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали различными терапевтическими растворами путем доставки через растения (фиг. 1A), покрытия листьев (фиг. 1B), микроинъекции (фиг. 1C), местной доставки (фиг. 1D), заливания в листья и разрезания листьев (фиг. 1E), заливания в листья и через растение (фиг. 1F) и комбинированной обработки посредством распыления как на растение, так и на тлю и доставки через растение (фиг. 1G).

На фиг. 2A–2C показана задержка развития тлей во время обработки рифампицином тлей LSR–1 на стадии личинок первого возраста с использованием трех различных условий: искусственного рациона без незаменимых аминокислот (только AD), искусственного рациона без незаменимых аминокислот со 100 мкг/мл рифампицина (AD+Rif) и искусственного рациона со 100 мкг/мл рифампицина и незаменимыми аминокислотами (AD+Rif+EAA). На фиг. 2A представлена серия графиков, на которых показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=33 тлей/группа). На фиг. 2B показаны иллюстративные изображения после каждой обработки, полученные через 12 дней. Масштабные метки соответствуют 2,5 мм. На фиг. 2C показаны измерения площади тела тлей, демонстрирующие существенный эффект обработки рифампицином. Добавление незаменимых аминокислот обратно частично устраняло дефекты развития.

На фиг. 3 показано, что обработка рифампицином приводила к гибели тлей. Выживаемость отслеживали ежедневно в случае тлей LSR–1, обработанных путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (только AD), искусственного рациона без незаменимых аминокислот со 100 мкг/мл рифампицина (AD+Rif) и искусственного рациона со 100 мкг/мл рифампицина и (AD+Rif+EAA). Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе. Статистическую значимость определяли с помощью логарифмического рангового критерия, и определяли следующие статистически значимые различия: только AD по сравнению с AD+Rif, p<0,0001 и AD+Rif по сравнению с AD+Rif+EAA, p=0,017.

На фиг. 4 представлен график, на котором показано, что обработка рифампицином приводила к утрате способности к размножению у тлей. Тлей LSR–1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (только AD), искусственного рациона без незаменимых аминокислот со 100 мкг/мл рифампицина (AD+Rif) и искусственного рациона со 100 мкг/мл рифампицина и (AD+Rif+EAA), и измеряли число потомков, образующихся в каждый день после того, как тли достигали зрелого возраста. Показано среднее число потомков, образующихся за день, ± S.D. после того, как тли достигали зрелого возраста.

На фиг. 5 представлен график, на котором показано, что обработка рифампицином приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли для различных условий через 7 дней после обработки. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 3 тлей на группу. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки; *, p<0,05.

На фиг. 6A и 6B показано, что обработка рифампицином, доставляемым посредством покрытия листьев, приводила к задержке развития тлей. Тлей eNASCO на стадии личинок первого возраста обрабатывали путем покрытия листьев 100 мкл двух различных растворов: контрольного растворителя (0,025% Silwet L–77) и 50 мкг/мл рифампицина. На фиг. 6A представлена серия графиков, на которых показана динамика стадий развития для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=20 тлей/группа). На фиг. 6B представлен график, на котором показаны измерения площади тела тлей, демонстрирующие существенный эффект листьев, покрытых рифампицином, в отношении размера тлей. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки; *, p<0,05.

На фиг. 7 показано, что обработка рифампицином, доставляемым посредством покрытия листьев, приводила к гибели тлей. Выживаемость отслеживали ежедневно в случае тлей eNASCO, обработанных путем покрытия листьев 100 мкл двух различных растворов: контрольного растворителя (Silwet L–77) и 50 мкг/мл рифампицина. Обработка отрицательно влияла на показатель выживаемости тлей.

На фиг. 8 показано, что обработка рифампицином, доставляемым посредством покрытия листьев, приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли для двух условий через 6 дней после обработки. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки; *, p<0,05.

На фиг. 9 представлен график, на котором показано, что обработка рифампицином путем микроинъекции приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли через 4 дня после инъекции при указанных условиях. Контрольный образец представлял собой растворитель, 0,025% Silwet L–77, описанный выше. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки; *, p<0,05.

На фиг. 10 представлен график, показывающий, что обработка рифампицином, доставляемым посредством местного применения, приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли через 3 дня после распыления растворителя (Silwet L–77) или раствора рифампицина, разведенного в растворителе. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки; *, p<0,05.

На фиг. 11 представлена панель графиков, на которых показано, что тлей LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста помещали на листья, залитые водой с пищевым красителем или 50 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем. Определяли динамику стадий развития для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=74–81 тля/группа).

На фиг. 12 представлен график, на котором показана выживаемость тлей LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста, помещенных на листья, залитые водой с пищевым красителем или 50 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе. Статистическую значимость определяли с помощью логарифмического рангового критерия.

На фиг. 13 представлен график, на котором показан титр симбионтов, определенный через 8 дней после обработки листьев, залитых водой с пищевым красителем или рифампицином с водой и пищевым красителем. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Число в прямоугольнике обозначает медиану для экспериментальной группы.

На фиг. 14 представлена панель графиков, на которых показано, что тлей LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста обрабатывали посредством инъекции в листья и через растение воды с пищевым красителем или 100 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем. Определяли динамику стадий развития для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=49–50 тлей/группа).

На фиг. 15 представлен график, на котором показана выживаемость тлей LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста, помещенных на листья, залитые и обработанные водой с пищевым красителем или 100 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе. Рассчитывали логарифмический ранговый критерий и определяли, что статистически значимые различия между группами отсутствовали.

На фиг. 16А и 16В представлены графики, на которых показан титр симбионтов, определенный через 6 (16А) и 8 (16В) дней после обработки у тлей, вскармливаемых на листьях, залитых и обработанных водой и пищевым красителем или рифампицином с водой и пищевым красителем. ДНК экстрагировали из тлей, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Число в прямоугольнике обозначает медиану для экспериментальной группы.

На фиг. 17 представлена панель графиков, на которых показано, что тлей LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста обрабатывали контрольными растворами (водой и Silwet L–77) или комбинацией средств обработки со 100 мкг/мл рифампицина. Определяли динамику стадий развития для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=76–80 тлей/группа).

На фиг. 18 представлен график, показывающий, что тлей LSR–1 на стадии личинок 1–го и 2–го возраста обрабатывали контрольными растворами или комбинацией средств обработки, включающей рифампицин. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе. Рассчитывали логарифмический ранговый критерий и определяли, что статистически значимые различия между группами отсутствовали.

На фиг. 19 представлен график, на котором показан титр симбионтов, определенный через 7 дней после обработки контрольными растворами или растворами рифампицина. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Число в прямоугольнике обозначает медиану для экспериментальной группы. Статистически значимые различия определяли с помощью t–критерия.

На фиг. 20 представлено изображение, на котором показана система доставки хитозана. Тлей A. pisum обрабатывали терапевтическим раствором путем доставки с помощью заливания в листья и через растения, как показано.

На фиг. 21 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка хитозаном приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья контрольного раствора (воды), а также 300 мкг/мл хитозана в воде. Стадии развития отслеживали в ходе всего эксперимента. Показан процент тлей на каждой стадии развития (личинка 1–го возраста, личинка 2–го возраста, личинка 3–го возраста, личинка 4–го возраста, личинка 5–го возраста или личинка 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5–го возраста) на группу обработки.

На фиг. 22 представлен график, на котором показано снижение выживаемости насекомых при обработке хитозаном. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья только воды или раствора хитозана, и выживаемость отслеживали ежедневно в течение эксперимента. Число в скобках обозначает общее число тлей в группе обработки.

На фиг. 23 представлен график, на котором показано, что обработка хитозаном приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья воды или 300 мкг/мл хитозана в воде. Через 8 дней после обработки ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 6 тлей/группа. Медианное значение для каждой группы показано в прямоугольнике.

На фиг. 24 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка низином приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum LSR–2 на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 1,6 или 7 мг/мл низина путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и определяли динамику развития. Показан процент тлей на каждой стадии развития (стадия личинок 1–го возраста, 2–го возраста, 3–го возраста, 4–го возраста, 5–го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5–го возраста)) в указанный момент времени. N=56–59 тлей/группа.

На фиг. 25 представлен график, на котором показано дозозависимое снижение выживаемости насекомых при обработке низином. Тлей A. pisum LSR–1 на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 1,6 или 7 мг/мл низина путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и выживаемость отслеживали в динамике. Число в скобках обозначает число тлей/группа. Статистически значимые различия определяли с помощью логарифмического рангового критерия (Кокса–Мантеля).

На фиг. 26 представлен график, на котором показано, что обработка низином приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum LSR–1 на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 1,6 мг/мл низина путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и ДНК экстрагировали из некоторых тлей через восемь дней после обработки и использовали в qPCR для определения числа копий Buchnera. Показаны средние соотношения Buchnera/тля для каждой обработки +/– SEM. Число в прямоугольнике над каждой экспериментальной группой обозначает медианное значение для этой группы. Каждая точка данных обозначает одну тлю.

На фиг. 27 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка левулиновой кислотой приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 0,03 или 0,3% левулиновой кислотой путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и определяли динамику развития. Показан процент тлей на каждой стадии развития (стадия личинок 1^–го возраста, 2^–го возраста, 3^–го возраста, 4^–го возраста и 5^–го возраста) в указанный момент времени. N=57–59 тлей/группа.

На фиг. 28 представлен график, на котором показано снижение выживаемости насекомых при обработке левулиновой кислотой. Тлей A. pisum eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 0,03 или 0,3% левулиновой кислотой путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и выживаемость отслеживали в динамике. N=57–59 тлей/группа. Статистически значимые различия определяли с помощью логарифмического рангового критерия (Кокса–Мантеля); **, p<0,01.

На фиг. 29 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка левулиновой кислотой приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 0,03 или 0,3% левулиновой кислотой путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и ДНК экстрагировали из некоторых тлей через семь и одиннадцать дней после обработки и использовали в qPCR для определения числа копий Buchnera. Показаны средние соотношения Buchnera/тля для каждой обработки +/– SEM. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA и критерия множественных сравнений Даннетта; *, p<0,05. Каждая точка данных обозначает одну тлю.

На фиг. 30A и 30B представлены графики, на которых показано, что обработка госсиполом приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (только AD) и искусственного рациона без незаменимых аминокислот с различными концентрациями госсипола (0,05%, 0,25% и 0,5%). Стадии развития отслеживали в ходе всего эксперимента. На фиг. 30А представлена серия графиков, на которых показано среднее число тлей на каждой стадии развития (личинка 1–го возраста, личинка 2–го возраста, личинка 3–го возраста, личинка 4–го возраста, личинка 5–го возраста или личинка 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5–го возраста) на группу обработки. В указанное время тлей визуализировали, и их размер определяли с использованием Image J. На фиг. 30B представлен график, на котором показана средняя площадь тлей ± SD для тлей, обработанных искусственным рационом (контроль) или обработанных госсиполом. Статистическую значимость определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки. *, p<0,05. **, p<0,01.

На фиг. 31 представлен график, на котором показано дозозависимое снижение выживаемости тлей при обработке аллелохимикатом госсиполом. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (AD без EAA), искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,5% госсиполуксусной кислотой (0,5% госсиполом), искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,25% госсиполуксусной кислотой (0,25% госсиполом) и искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,05% госсиполуксусной кислотой (0,05% госсиполом), и выживаемость отслеживали ежедневно в течение эксперимента. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе применения среды без незаменимых аминокислот. Статистически значимые различия определяли с помощью логарифмического рангового критерия, и группы AD без EAA и 0,5% госсипола статистически значимо различаются, p=0,0002.

На фиг. 32A и 32B представлены два графика, на которых показано, что обработка 0,25% госсиполом приводила к снижению плодовитости. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали с помощью доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (AD5–2 без EAA) или искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,25% госсиполуксусной кислотой (AD5–2 без EAA+0,25% госсипол), и плодовитость определяли на протяжении всего эксперимента. На фиг. 32A показано, что определяли средний день ± SD, на который тли начинают давать потомство, и обработка госсиполом приводила к задержке образования потомства. На фиг. 32B показано, что определяли среднее число потомков ± SD, образуемых после того, как тля становилась взрослой размножающейся особью, и обработка госсиполом приводила к снижению числа образуемых потомков. Каждая точка данных обозначает одну тлю.

На фиг. 33 представлен график, на котором показано, что обработка госсиполом в различных концентрациях приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (контроль) или искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,5%, 0,25% и 0,05% госсиполом. Через 5 или 13 дней после обработки ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 2–6 тлей/группа. Статистически значимые различия определяли с помощью непарного t–критерия; *, p<0,05.

На фиг. 34 представлен график, на котором показано, что микроинъекция госсипола приводила к снижению уровней Buchnera у тлей. Тлям A. pisum LSR–1 на стадии личинок < 3–го возраста (нимфам) инъецировали 20 нл искусственного рациона без незаменимых аминокислот (AD) или искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,05% госсиполом (госсипол (0,05%)). Через три дня после инъекции ДНК экстрагировали из тлей, и уровни Buchnera определяли с помощью qPCR. Показаны средние соотношения количества ДНК Buchnera/тлей ± SD. Каждая точка данных обозначает одну тлю.

На фиг. 35 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка транс–коричным альдегидом приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum на стадии личинок первого или второго возраста обрабатывали путем доставки через растения воды и воды с различными концентрациями транс–коричного альдегида (TC, 0,05%, 0,5% и 5%). Стадии развития отслеживали в ходе всего эксперимента. Показано среднее число тлей на каждой стадии развития (личинка 1–го возраста, личинка 2–го возраста, личинка 3–го возраста, личинка 4–го возраста, личинка 5–го возраста или личинка 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5–го возраста) на группу обработки. N=40–49 тлей/экспериментальная группа.

На фиг. 36 представлен график, на котором показано, что имело место дозозависимое снижение выживаемости при обработке природным противомикробным средством транс–коричным альдегидом. Тлей A. pisum на стадии личинок первого или второго возраста обрабатывали путем доставки через растения воды и воды с различными концентрациями транс–коричного альдегида (TC, 0,05%, 0,5% и 5%). Выживаемость отслеживали на протяжении всей обработки. Статистически значимые различия определяли с помощью логарифмического рангового критерия. N=40–49 тлей/группа.

На фиг. 37 представлен график, на котором показано, что обработка транс–коричным альдегидом в различных концентрациях приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum на стадии личинок первого или второго возраста обрабатывали путем доставки через растения воды и воды с различными концентрациями транс–коричного альдегида (0,05%, 0,5% и 5%). Через 3 дней после обработки ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 2–11 тлей/группа. Медиана для каждой группы обработки показана в прямоугольнике над точками данных. Статистически значимые различия определяли с помощью непарного t–критерия; *, p<0,05. Имело место статистически значимое различие между группой контроля c водой и 0,5% транс–коричного альдегида.

На фиг. 38 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка пептидом скорпиона Uy192 приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья контрольного раствора (воды), а также 100 мкг/мл Uy192 в воде. Стадии развития отслеживали в ходе всего эксперимента. Показан процент тлей на каждой стадии развития (личинка 1–го возраста, личинка 2–го возраста, личинка 3–го возраста, личинка 4–го возраста, личинка 5–го возраста или личинка 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5–го возраста) на группу обработки.

На фиг. 39 представлен график, на котором показано снижение выживаемости насекомых при обработке с помощью AMP скорпиона Uy192. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья только воды или раствора Uy192, и выживаемость отслеживали ежедневно в течение эксперимента. Число в скобках обозначает общее число тлей в группе обработки.

На фиг. 40 представлен график, на котором показано, что обработка с помощью Uy192 приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья воды или 100 мкг/мл Uy192 в воде, через 8 дней после обработки ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 2–6 тлей/группа. Медианное значение для каждой группы показано в прямоугольнике.

На фиг. 41 представлен график, на котором показано снижение выживаемости тлей, которым вводили микроинъекцию пептидов скорпиона D10 и D3. Тлям A. pisum LSR–1 вводили микроинъекцию воды (контроль) или 100 нг пептида скорпиона D3 или D10. После инъекции тлей выпускали на листья конских бобов, и выживаемость отслеживали на протяжении всего эксперимента. Число в скобках обозначает число тлей в каждой экспериментальной группе обработки.

На фиг. 42 представлен график, на котором показано снижение титров эндосимбионтов при инъекции пептидов скорпиона D3 и D10. Тлям A. pisum LSR–1 вводили микроинъекцию воды (контроль) или 100 нг пептида скорпиона D3 или D10. После инъекции тлей выпускали на листья конских бобов, и через 5 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся живых тлей, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera/тлей проводили qPCR. Показано среднее значение ± SD для каждой группы обработки. N=2–9 тлей/группа. Число над каждой группой обработки в прямоугольнике обозначает медиану для совокупности данных.

На фиг. 43 представлен график, на котором показано снижение выживаемости насекомых при обработке коктейлем AMP скорпиона. Тлей eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки с помощью заливания в листья и через растения коктейля пептидов скорпиона (40 мкг/мл каждого из Uy17, D3, UyCt3 и D10), и выживаемость отслеживали в течение эксперимента. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе обработки.

На фиг. 44 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum LSR–2 на стадии личинок первого возраста обрабатывали водой (контроль) или 100 мкг/мл Uy192+CPP+FAM путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и определяли динамику развития. Показан процент тлей на каждой стадии развития (стадия личинок 1–го возраста, 2–го возраста, 3–го возраста, 4–го возраста, 5–го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5–го возраста)) в указанный момент времени. N=90 тлей/группа.

На фиг. 45 представлен график, на котором показано, что обработка тлей пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, повышала смертность. Тлей A. pisum LSR–1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали водой или 100 мкг/мл UY192+CPP+FAM (пептида) в воде, доставляемых путем инъекции в листья и через растение. Выживаемость отслеживали в динамике. Число в скобках обозначает число тлей/группа. Статистически значимые различия определяли с помощью логарифмического рангового критерия (Кокса–Мантеля), и имело место статистически значимое различие между двумя экспериментальными группами (p=0,0036).

На фиг. 46 представлен график, на котором показано, что обработка с помощью Uy192+CPP+FAM приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum LSR–1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали водой или 100 мкг/мл Uy192+CPP+FAM (пептида) в воде, доставляемых путем инъекции в листья и через растение. ДНК экстрагировали из некоторых тлей через пять дней после обработки и использовали в qPCR для определения числа копий Buchnera. Показаны средние соотношения Buchnera/тля для каждой обработки +/– SEM. Число в прямоугольнике над каждой экспериментальной группой обозначает медианное значение для этой группы. Каждая точка данных обозначает одну тлю. Статистически значимые различия определяли с помощью t–критерия Стьюдента; ****, p<0,0001.

На фиг. 47 представлена панель изображений, на которых показано, что Uy192+CPP+FAM проникали через мембраны бактериоцитов. Бактериоциты извлекали из тлей и инкубировали с 250 мкг/мл пептида Uy192+CPP+FAM в течение 30 минут. После промывания и визуализации Uy192+CPP+FAM можно наблюдать в больших количествах внутри бактериоцитов.

На фиг. 48A и фиг. 48B представлена панель графиков, на которых показано, что обработка пантотенолом приводила к задержке развития тлей. Тлей eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения трех различных условий: искусственного рациона без незаменимых аминокислот (AD без EAA), искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 10 мкM пантотенола (10 мкМ пантотенола) и искусственного рациона без незаменимых аминокислот со 100 мкM пантотенола (100 мкM пантотенола), искусственного рациона без незаменимых аминокислот со 100 мкM пантотенола и искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 10 мкM пантотенола. На фиг. 48A показаны стадии развития, динамика которых отслеживается для каждого условия. На фиг. 48B представлены измерения относительной площади тела тлей, демонстрирующие существенный эффект обработки пантотенола.

На фиг. 49 представлен график, на котором показано, что обработка пантотенолом приводила к повышению смертности тлей. Выживаемость отслеживали ежедневно в случае тлей eNASCO, обработанных путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот или искусственного рациона без незаменимых аминокислот, содержащего 10 или 100 мкМ пантотенола. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе.

На фиг. 50A, 50B и 50C представлена панель графиков, на которых показано, что обработка пантотенолом приводила к утрате способности к размножению. Тлей eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот или искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 10 или 100 мкМ пантотенола. На фиг. 50A показана доля тлей, доживших до зрелого возраста и появления способности к размножению. На фиг. 50B показан средний день, в который тли в каждой группе начинали размножаться. Показан средний день ± SD, в который тли начинали размножаться. На фиг. 50C показано среднее число потомков, образующихся за день, после того, как тля начинала размножаться. Показано среднее число потомков/день ± SD.

На фиг. 51 представлен график, на котором показано, что обработка пантотенолом не влияла отрицательно на эндосимбиотические Buchnera. Титр симбионтов определяли для различных условий через 8 дней после обработки. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 6 тлей на группу.

На фиг. 52 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка пантотенолом, доставляемым через растения, не влияла отрицательно на развитие тлей. Тлей eNASCO на стадии личинок первого возраста обрабатывали путем покрытия листьев 100 мкл двух различных растворов: контрольного растворителя (0,025% Silwet L–77) и 10 мкМ пантотенола, и определяли динамику стадий развития для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=20 тлей/группа).

На фиг. 53 представлен график, на котором показано, что обработка пантотенолом, доставляемым посредством покрытия листьев, приводила к гибели тлей. Выживаемость отслеживали ежедневно в случае тлей eNASCO, обработанных путем покрытия листьев 100 мкл двух различных растворов: контрольного растворителя (Silwet L–77) и 10 мкМ пантотенола. Обработка отрицательно влияла на показатель выживаемости тлей. Размер выборки=20 тлей/группа. Логарифмический ранговый критерий Кокса–Мантеля использовали для определения наличия статистически значимых различий между группами и выявления того, что две группы статистически значимо различаются (p=0,0019).

На фиг. 54A и 54B представлена панель графиков, на которых показано, что обработка коктейлем аналогов аминокислот приводила к задержке развития тлей. Тлей LSR–1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали путем доставки с помощью заливания в листья и через растения воды или коктейля аналогов аминокислот в воде (коктейля AA). На фиг. 54A показаны стадии развития, динамика которых определяется для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития. На фиг. 54B показаны измерения площади тела тлей, демонстрирующие существенный эффект обработки коктейлем аналогов аминокислот (коктейлем AA). Статистически значимые различия определяли с помощью t–критерия Стьюдента; ****, p<0,0001.

На фиг. 55 представлен график, на котором показано, что обработка коктейлем аналогов аминокислот приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли для различных условий через 6 дней после обработки. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показаны средние соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 19–20 тлей на группу. Каждая точка данных обозначает отдельную тлю. Статистически значимые различия определяли с помощью t–критерия Стьюдента; *, p<0,05.

На фиг. 56A и 56B представлена панель графиков, на которых показано, что обработка комбинацией трех средств приводила к задержке развития тлей. Тлей LSR–1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали путем доставки с помощью заливания в листья и через растения воды или комбинации трех средств в воде (пептид–рифампицин–хитозан). На фиг. 56A показаны стадии развития, динамика которых определяется для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития. На фиг. 56B показаны измерения площади тела тлей, демонстрирующие существенный эффект обработки комбинацией трех средств обработки (пептид–рифампицин–хитозан). Статистически значимые различия определяли с помощью t–критерия Стьюдента; ****, p<0,0001.

На фиг. 57 представлен график, на котором показано, что обработка комбинацией пептида, антибиотика и природного противомикробного средства приводила к повышению смертности тлей. Тлей LSR–1 обрабатывали водой или комбинацией трех средств обработки (пептид–рифампицин–хитозан), и после обработки ежедневно отслеживали выживаемость.

На фиг. 58 представлен график, на котором показано, что обработка комбинацией пептида, антибиотика и природного противомикробного средства приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли для различных условий через 6 дней после обработки. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показаны средние соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 20–21 тли на группу. Каждая точка данных обозначает отдельную тлю.

На фиг. 59A и 59B представлена панель изображений, на которых показаны зерна кукурузы, которые были покрыты ципрофлоксацином и в которые проник ципрофлоксацин. Зерна кукурузы замачивали в воде (без антибиотика) или указанной концентрации ципрофлоксацина в воде, и целые зерна или зерно исследовали с целью обнаружения того, могут ли они ингибировать рост DH5α E. coli. На фиг. 59A показан рост бактерий в присутствии зерна кукурузы, замоченного в воде без антибиотиков, а на фиг. 59B показано ингибирование роста бактерий в случае, если целые зерна или половинки зерен кукурузы, которые замачивали в антибиотиках, помещали на чашку, по которой была распределена E. coli.

На фиг. 60 представлен график, на котором показано, что зрелых долгоносиков S. zeamais обрабатывали ципрофлоксацином (250 мкг/мл или 2,5 мг/мл) или подвергали ложной обработке водой. Через 18 дней после обработки геномную ДНК выделяли из долгоносиков, и количество первичного эндосимбионта Sitophilus определяли с помощью qPCR. Показано среднее значение ± SEM для каждой группы. Каждая точка данных обозначает одного долгоносика. Медиана для каждой группы указана над совокупностью данных.

На фиг. 61A и 61B представлены графики, на которых показано развитие долгоносиков после обработки ципрофлоксацином. На фиг. 61A показаны отдельные зерна кукурузы, вскрытые через 25 дней после того, как зрелые особи были удалены, из одной повторности каждой из групп исходных зерен кукурузы, замоченных в воде/покрытых водой (контролем) или ципрофлоксацином (250 мкг/мл или 2,5 мг/мл) и исследованные на наличие личинок, куколок или почти полностью развившихся (зрелых) долгоносиков. Показана процентная доля каждой стадии жизненного цикла, обнаруженная в зернах из каждой группы обработки. Общее число потомков, обнаруженных в зернах из каждой группы обработки, указано над каждой совокупностью данных. На фиг. 61B показана геномная ДНК, выделенная из потомков, извлеченных из зерен кукурузы из контрольной группы (вода) и группы обработки 2,5 мг/мл ципрофлоксацина; для измерения количества присутствующего первичного эндосимбионта Sitophilus проводили qPCR. Показано среднее значение ± SD для каждой группы. Статистически значимые различия определяли с помощью непарного t–критерия; *, p<0,001.

На фиг. 62A и 62B представлены графики, на которых показаны две оставшиеся повторности зерен кукурузы, подвергнутых ложной обработке (водой) или обработанных 250 мкг/мл или 2,5 мг/мл ципрофлоксацина, в которых отслеживалось появление потомства после того, как спаривающиеся пары были удалены (через 7 дней после обработки). На фиг. 62A показано среднее число ± SD вновь появившихся долгоносиков в динамике для каждой группы обработки. На фиг. 62B показано среднее число ± SEM появившихся долгоносиков для каждой группы обработки через 43 дня после того, как спаривающиеся пары были удалены.

На фиг. 63 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка рифампицином и доксициклином приводила к смертности микроскопических клещей. Выживаемость отслеживали ежедневно в случае необработанных двупятнистых паутинных клещиков и микроскопических клещей, обработанных 250 мкг/мл рифампицина и 500 мкг/мл доксициклина в 0,025% Silwet L–77.

На фиг. 64 представлена панель графиков, на которых показаны результаты анализа внеклеточного потока Seahorse в отношении дыхания бактерий. Бактерии выращивали до логарифмической фазы и загружали в планшеты Seahorse XFe96 для временных измерений скорости потребления кислорода (OCR) и скорости закисления внеклеточной среды (ECAR), как описано в способах. Средства обработки вводили в лунки примерно через 20 минут, и бактерии отслеживали для выявления изменений роста. Рифампицин=100 мкг/мл; хлорамфеникол=25 мкг/мл; фаги (T7 в случае E. coli и ΦSmVL–C1 в случае S. marcescens) представляли собой лизаты, разведенные 1:2 или 1:100 в буфере SM. Отметки на каждой линии предусмотрены исключительно в качестве индикаторов состояния, которым каждая линия соответствует, и не указывают на точки данных.

На фиг. 65 представлен график, на котором показано, что фаг, противодействующий S. marcescens, приводил к снижению смертности мух. Все мухи, которым вводили путем прокола S. marcescens, погибали в течение дня, в том время как значительная часть мух, которым вводили путем прокола как S. marcescens, так и фаг, выживали в течение пяти дней после обработки. Почти все из контрольных мух, которых никак не обрабатывали, выживали до конца эксперимента. Логарифмический ранговый критерий использовали для сравнения кривых для определения статистической значимости, звездочка обозначает p<0,0001.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе предусмотрены способы и композиции для контроля сельскохозяйственных вредителей, например, для изменения уровня, активности или метаболизма одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме насекомого–хозяина (например, сельскохозяйственного вредителя), при этом данное изменение приводит к снижению приспособленности хозяина. В настоящем изобретении описана композиция, содержащая модулирующее средство (например, фаг, пептид, малую молекулу, антибиотик или их комбинации), которое может изменять микробиоту хозяина таким образом, что это является пагубным для хозяина. Модулирующее средство, описанное в данном документе, может снижать приспособленность ряда насекомых, которые считаются сельскохозяйственными вредителями, посредством нарушения уровней микроорганизмов, активности микроорганизмов, метаболизма микроорганизмов и/или разнообразия микроорганизмов.

Способы и композиции, описанные в данном документе, основаны отчасти на примерах, которые иллюстрируют то, как различные средства, например, выделенные природные фаги, антибиотики (например, рифампицин, окситетрациклин, ципрофлоксацин, доксициклин или их комбинацию), противомикробные пептиды (AMP, например, полимиксин B, мелиттин, цекропин A, дрозоцин или пептиды скорпиона), аллелохимикаты (например, госсиполуксусную кислоту) или природные противомикробные соединения (например, транс–коричный альдегид, хитозан, пропионовую кислоту, левулиновую кислоту или низин) можно применять для целенаправленного воздействия на симбиотические микроорганизмы у насекомых–хозяев (например, эндосимбиотическую Buchnera у тлей) для снижения приспособленности этих хозяев путем изменения уровня, активности или метаболизма микроорганизмов у этих хозяев. Рифампицин, окситетрациклин, ципрофлоксацин и доксициклин являются иллюстративными примерами антибиотиков, и другие антибиотики могут быть применимыми в настоящем изобретении. Аналогичным образом, полимиксин B, мелиттин, цекропин A, дрозоцин или пептиды скорпиона являются иллюстративными примерами AMP, применимых в настоящем изобретении. Кроме того, госсиполуксусная кислота является иллюстративным примером малых молекул, применимых в настоящем изобретении. Дополнительно, транс–коричный альдегид, хитозан, пропионовая кислота, левулиновая кислота или низин являются иллюстративными примерами применимых природных противомикробных соединений. На основании этого в настоящем изобретении описан ряд различных подходов к применению средств, которые изменяют уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина, при этом изменение приводит к снижению приспособленности хозяина.

Хозяева

Насекомые

Хозяином согласно любым способам и композициям, предусмотренным в данном документе, может являться любой организм, принадлежащий к типу Arthropoda, который считается вредителем, например, сельскохозяйственным вредителем, в том числе любые членистоногие, описанные в данном документе. Используемый в данном документе термин "вредитель" относится к насекомым, которые причиняют вред растениям или другим организмам или в иных отношениях являются пагубными для людей, например, для способов или продуктов сельского хозяйства людей. Используемый в данном документе термин "насекомое" описывает любое насекомое и означает любой организм, принадлежащий к царству животных, более конкретно к типу Arthropoda и к классу Insecta или классу Arachnida.

В некоторых случаях насекомое может принадлежать к следующим отрядам: Acari, Araneae, Anoplura, Coleoptera, Collembola, Dermaptera, Dictyoptera, Diplura, Diptera (например, пестрокрылая Drosophila), Embioptera, Ephemeroptera, Grylloblatodea, Hemiptera (например, тли, тепличная белокрылка), Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Mecoptera, Neuroptera, Odonata, Orthoptera, Phasmida, Plecoptera, Protura, Psocoptera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Strepsiptera, Thysanoptera, Trichoptera или Zoraptera.

В некоторых случаях насекомое относится к классу Arachnida, например, Acarus spp., Aceria sheldoni, Aculops spp., Aculus spp., Amblyomma spp., Amphitetranychus viennensis, Argas spp., Boophilus spp., Brevipalpus spp., Bryobia graminum, Bryobia praetiosa, Centruroides spp., Chorioptes spp., Dermanyssus gallinae, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Dermacentor spp., Eotetranychus spp., Epitrimerus pyri, Eutetranychus spp., Eriophyes spp., Glycyphagus domesticus, Halotydeus destructor, Hemitarsonemus spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Latrodectus spp., Loxosceles spp., Metatetranychus spp., Neotrombicula autumnalis, Nuphersa spp., Oligonychus spp., Ornithodorus spp., Ornithonyssus spp., Panonychus spp., Phyllocoptruta oleivora, Polyphagotarsonemus latus, Psoroptes spp., Rhipicephalus spp., Rhizoglyphus spp., Sarcoptes spp., Scorpio maurus, Steneotarsonemus spp., Steneotarsonemus spinki, Tarsonemus spp., Tetranychus spp., Trombicula alfreddugesi, Vaejovis spp., Vasates lycopersici.

В некоторых случаях насекомое относится к классу Chilopoda, например, Geophilus spp., Scutigera spp.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Collembola, например, Onychiurus armatus.

В некоторых случаях насекомое относится к классу Diplopoda, например, Blaniulus guttulatus; к классу Insecta, например, к отряду Blattodea, например, Blattella asahinai, Blattella germanica, Blatta orientalis, Leucophaea maderae, Panchlora spp., Parcoblatta spp., Periplaneta spp., Supella longipalpa.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Coleoptera, например, Acalymma vittatum, Acanthoscelides obtectus, Adoretus spp., Agelastica alni, Agriotes spp., Alphitobius diaperinus, Amphimallon solstitialis, Anobium punctatum, Anoplophora spp., Anthonomus spp., Anthrenus spp., Apion spp., Apogonia spp., Atomaria spp., Attagenus spp., Bruchidius obtectus, Bruchus spp., Cassida spp., Cerotoma trifurcata, Ceutorhynchus spp., Chaetocnema spp., Cleonus mendicus, Conoderus spp., Cosmopolites spp., Costelytra zealandica, Ctenicera spp., Curculio spp., Cryptolestes ferrugineus, Cryptorhynchus lapathi, Cylindrocopturus spp., Dermestes spp., Diabrotica spp. (например, злаковый корневой червь), Dichocrocis spp., Dicladispa armigera, Diloboderus spp., Epilachna spp., Epitrix spp., Faustinus spp., Gibbium psylloides, Gnathocerus cornutus, Hellula undalis, Heteronychus arator, Heteronyx spp., Hylamorpha elegans, Hylotrupes bajulus, Hypera postica, Hypomeces squamosus, Hypothenemus spp., Lachnosterna consanguinea, Lasioderma serricorne, Latheticus oryzae, Lathridius spp., Lema spp., Leptinotarsa decemlineata, Leucoptera spp., Lissorhoptrus oryzophilus, Lixus spp., Luperodes spp., Lyctus spp., Megascelis spp., Melanotus spp., Meligethes aeneus, Melolontha spp., Migdolus spp., Monochamus spp., Naupactus xanthographus, Necrobia spp., Niptus hololeucus, Oryctes rhinoceros, Oryzaephilus surinamensis, Oryzaphagus oryzae, Otiorhynchus spp., Oxycetonia jucunda, Phaedon cochleariae, Phyllophaga spp., Phyllophaga helleri, Phyllotreta spp., Popillia japonica, Premnotrypes spp., Prostephanus truncatus, Psylliodes spp., Ptinus spp., Rhyzobius ventralis, Rhyzopertha dominica, Sitophilus spp., Sitophilus oryzae, Sphenophorus spp., Stegobium paniceum, Sternechus spp., Symphyletes spp., Tanymecus spp., Tenebrio molitor, Tenebrioides mauretanicus, Tribolium spp., Trogoderma spp., Tychius spp., Xylotrechus spp., Zabrus spp.; к отряду Diptera, например, Aedes spp., Agromyza spp., Anastrepha spp., Anopheles spp., Asphondylia spp., Bactrocera spp., Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus spp., Chrysomyia spp., Chrysops spp., Chrysozona pluvialis, Cochliomyia spp., Contarinia spp., Cordylobia anthropophaga, Cricotopus sylvestris, Culex spp., Culicoides spp., Culiseta spp., Cuterebra spp., Dacus oleae, Dasyneura spp., Delia spp., Dermatobia hominis, Drosophila spp., Echinocnemus spp., Fannia spp., Gasterophilus spp., Glossina spp., Haematopota spp., Hydrellia spp., Hydrellia griseola, Hylemya spp., Hippobosca spp., Hypoderma spp., Liriomyza spp., Lucilia spp., Lutzomyia spp., Mansonia spp., Musca spp. (например, Musca domestica), Oestrus spp., Oscinella frit, Paratanytarsus spp., Paralauterborniella subcincta, Pegomyia spp., Phlebotomus spp., Phorbia spp., Phormia spp., Piophila casei, Prodiplosis spp., Psila rosae, Rhagoletis spp., Sarcophaga spp., Simulium spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tetanops spp., Tipula spp.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Heteroptera, например, Anasa tristis, Antestiopsis spp., Boisea spp., Blissus spp., Calocoris spp., Campylomma livida, Cavelerius spp., Cimex spp., Collaria spp., Creontiades dilutus, Dasynus piperis, Dichelops furcatus, Diconocoris hewetti, Dysdercus spp., Euschistus spp., Eurygaster spp., Heliopeltis spp., Horcias nobilellus, Leptocorisa spp., Leptocorisa varicornis, Leptoglossus phyllopus, Lygus spp., Macropes excavatus, Miridae, Monalonion atratum, Nezara spp., Oebalus spp., Pentatomidae, Piesma quadratum, Piezodorus spp., Psallus spp., Pseudacysta perseae, Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scaptocoris castanea, Scotinophora spp., Stephanitis nashi, Tibraca spp., Triatoma spp.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Homoptera, например, Acizzia acaciaebaileyanae, Acizzia dodonaeae, Acizzia uncatoides, Acrida turrita, Acyrthosiphon spp., Acrogonia spp., Aeneolamia spp., Agonoscena spp., Aleyrodes proletella, Aleurolobus barodensis, Aleurothrixus floccosus, Allocaridara malayensis, Amrasca spp., Anuraphis cardui, Aonidiella spp., Aphanostigma pini, Aphis spp. (например, Apis gossypii), Arboridia apicalis, Arytainilla spp., Aspidiella spp., Aspidiotus spp., Atanus spp., Aulacorthum solani, Bemisia tabaci, Blastopsylla occidentalis, Boreioglycaspis melaleucae, Brachycaudus helichrysi, Brachycolus spp., Brevicoryne brassicae, Cacopsylla spp., Calligypona marginata, Carneocephala fulgida, Ceratovacuna lanigera, Cercopidae, Ceroplastes spp., Chaetosiphon fragaefolii, Chionaspis tegalensis, Chlorita onukii, Chondracris rosea, Chromaphis juglandicola, Chrysomphalus ficus, Cicadulina mbila, Coccomytilus halli, Coccus spp., Cryptomyzus ribis, Cryptoneossa spp., Ctenarytaina spp., Dalbulus spp., Dialeurodes citri, Diaphorina citri, Diaspis spp., Drosicha spp., Dysaphis spp., Dysmicoccus spp., Empoasca spp., Eriosoma spp., Erythroneura spp., Eucalyptolyma spp., Euphyllura spp., Euscelis bilobatus, Ferrisia spp., Geococcus coffeae, Glycaspis spp., Heteropsylla cubana, Heteropsylla spinulosa, Homalodisca coagulata, Homalodisca vitripennis, Hyalopterus arundinis, Icerya spp., Idiocerus spp., Idioscopus spp., Laodelphax striatellus, Lecanium spp., Lepidosaphes spp., Lipaphis erysimi, Macrosiphum spp., Macrosteles facifrons, Mahanarva spp., Melanaphis sacchari, Metcalfiella spp., Metopolophium dirhodum, Monellia costalis, Monelliopsis pecanis, Myzus spp., Nasonovia ribisnigri, Nephotettix spp., Nettigoniclla spectra, Nilaparvata lugens, Oncometopia spp., Orthezia praelonga, Oxya chinensis, Pachypsylla spp., Parabemisia myricae, Paratrioza spp., Parlatoria spp., Pemphigus spp., Peregrinus maidis, Phenacoccus spp., Phloeomyzus passerini, Phorodon humuli, Phylloxera spp., Pinnaspis aspidistrae, Planococcus spp., Prosopidopsylla flava, Protopulvinaria pyriformis, Pseudaulacaspis pentagona, Pseudococcus spp., Psyllopsis spp., Psylla spp., Pteromalus spp., Pyrilla spp., Quadraspidiotus spp., Quesada gigas, Rastrococcus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus titanus, Schizaphis graminum, Selenaspidus articulatus, Sogata spp., Sogatella furcifera, Sogatodes spp., Stictocephala festina, Siphoninus phillyreae, Tenalaphara malayensis, Tetragonocephela spp., Tinocallis caryaefoliae, Tomaspis spp., Toxoptera spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza spp., Typhlocyba spp., Unaspis spp., Viteus vitifolii, Zygina spp.; к отряду Hymenoptera, например, Acromyrmex spp., Athalia spp., Atta spp., Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Sirex spp., Solenopsis invicta, Tapinoma spp., Urocerus spp., Vespa spp., Xeris spp.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Isopoda, например, Armadillidium vulgare, Oniscus asellus, Porcellio scaber.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Isoptera, например, Coptotermes spp., Cornitermes cumulans, Cryptotermes spp., Incisitermes spp., Microtermes obesi, Odontotermes spp., Reticulitermes spp.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Lepidoptera, например, Achroia grisella, Acronicta major, Adoxophyes spp., Aedia leucomelas, Agrotis spp., Alabama spp., Amyelois transitella, Anarsia spp., Anticarsia spp., Argyroploce spp., Barathra brassicae, Borbo cinnara, Bucculatrix thurberiella, Bupalus piniarius, Busseola spp., Cacoecia spp., Caloptilia theivora, Capua reticulana, Carpocapsa pomonella, Carposina niponensis, Cheimatobia brumata, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocerus spp., Cnaphalocrocis medinalis, Cnephasia spp., Conopomorpha spp., Conotrachelus spp., Copitarsia spp., Cydia spp., Dalaca noctuides, Diaphania spp., Diatraea saccharalis, Earias spp., Ecdytolopha aurantium, Elasmopalpus lignosellus, Eldana saccharina, Ephestia spp., Epinotia spp., Epiphyas postvittana, Etiella spp., Eulia spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Feltia spp., Galleria mellonella, Gracillaria spp., Grapholitha spp., Hedylepta spp., Helicoverpa spp., Heliothis spp., Hofmannophila pseudospretella, Homoeosoma spp., Homona spp., Hyponomeuta padella, Kakivoria flavofasciata, Laphygma spp., Laspeyresia molesta, Leucinodes orbonalis, Leucoptera spp., Lithocolletis spp., Lithophane antennata, Lobesia spp., Loxagrotis albicosta, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma neustria, Maruca testulalis, Mamestra brassicae, Melanitis leda, Mocis spp., Monopis obviella, Mythimna separata, Nemapogon cloacellus, Nymphula spp., Oiketicus spp., Oria spp., Orthaga spp., Ostrinia spp., Oulema oryzae, Panolis flammea, Parnara spp., Pectinophora spp., Perileucoptera spp., Phthorimaea spp., Phyllocnistis citrella, Phyllonorycter spp., Pieris spp., Platynota stultana, Plodia interpunctella, Plusia spp., Plutella xylostella, Prays spp., Prodenia spp., Protoparce spp., Pseudaletia spp., Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Pyrausta nubilalis, Rachiplusia nu, Schoenobius spp., Scirpophaga spp., Scirpophaga innotata, Scotia segetum, Sesamia spp., Sesamia inferens, Sparganothis spp., Spodoptera spp., Spodoptera praefica, Stathmopoda spp., Stomopteryx subsecivella, Synanthedon spp., Tecia solanivora, Thermesia gemmatalis, Tinea cloacella, Tinea pellionella, Tineola bisselliella, Tortrix spp., Trichophaga tapetzella, Trichoplusia spp., Tryporyza incertulas, Tuta absoluta, Virachola spp.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Orthoptera или Saltatoria, например, Acheta domesticus, Dichroplus spp., Gryllotalpa spp., Hieroglyphus spp., Locusta spp., Melanoplus spp., Schistocerca gregaria.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Phthiraptera, например, Damalinia spp., Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Phthirus pubis, Trichodectes spp.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Psocoptera, например, Lepinatus spp., Liposcelis spp.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Siphonaptera, например, Ceratophyllus spp., Ctenocephalides spp., Pulex irritans, Tunga penetrans, Xenopsylla cheopis.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Thysanoptera, например, Anaphothrips obscurus, Baliothrips biformis, Drepanothrips reuteri, Enneothrips flavens, Frankliniella spp., Heliothrips spp., Hercinothrips femoralis, Rhipiphorothrips cruentatus, Scirtothrips spp., Taeniothrips cardamomi, Thrips spp.

В некоторых случаях насекомое относится к отряду Zygentoma (=Thysanura), например, Ctenolepisma spp., Lepisma saccharina, Lepismodes inquilinus, Thermobia domestica.

В некоторых случаях насекомое относится к классу Symphyla, например, Scutigerella spp.

В некоторых случаях насекомое представляет собой микроскопического клеща, включая без ограничения микроскопических клещей из семейства Tarsonemidae, таких как Phytonemus pallidus, Polyphagotarsonemus latus, Tarsonemus bilobatus и т. п.; микроскопических клещей из семейства Eupodidae, таких как Penthaleus erythrocephalus, Penthaleus major и т. п.; паутинных клещиков, таких как Oligonychus shinkajii, Panonychus citri, Panonychus mori, Panonychus ulmi, Tetranychus kanzawai, Tetranychus urticae и т. п.; микроскопических клещей из семейства Eriophyidae, таких как Acaphylla theavagrans, Aceria tulipae, Aculops lycopersici, Aculops pelekassi, Aculus schlechtendali, Eriophyes chibaensis, Phyllocoptruta oleivora и т. п.; микроскопических клещей из семейства Acaridae, таких как Rhizoglyphus robini, Tyrophagus putrescentiae, Tyrophagus similis и т. п.; микроскопических клещей, поражающих расплод пчел, таких как Varroa jacobsoni, Varroa destructor и т. п.; иксодовых клещей, таких как Boophilus microplus, Rhipicephalus sanguineus, Haemaphysalis longicornis, Haemophysalis flava, Haemophysalis campanulata, Ixodes ovatus, Ixodes persulcatus, Amblyomma spp., Dermacentor spp. и т. п.; Cheyletidae, таких как Cheyletiella yasguri, Cheyletiella blakei и т. п.; Demodicidae, таких как Demodex canis, Demodex cati и т. п.; Psoroptidae, таких как Psoroptes ovis и т. п.; Sarcoptidae, таких как Sarcoptes scabiei, Notoedres cati, Knemidocoptes spp. и т. п.

В некоторых случаях насекомое представляет собой тлю. В некоторых случаях насекомое представляет собой долгоносика. В определенных случаях насекомое представляет собой двупятнистого паутинного клещика. В некоторых случаях насекомое представляет собой травяную совку. В некоторых случаях насекомое представляет собой микроскопического клеща из рода Varroa (например, микроскопического клеща из рода Varroa, который заражает пчел).

Приспособленность хозяев

Способы и композиции, предусмотренные в данном документе, можно применять для снижения приспособленности любого из хозяев, описанных в данном документе. Снижение приспособленности может возникать в результате любых изменений в микроорганизмах, обитающих в организме хозяина, при этом изменения представляют собой следствие введения модулирующего средства и оказывают пагубные воздействия на хозяина.

В некоторых случаях снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде нарушения или ухудшения физиологических процессов хозяина (например, ослабления здоровья или выживаемости) вследствие введения модулирующего средства. В некоторых случаях приспособленность организма может быть измерена с помощью одного или нескольких параметров, в том числе без ограничения скорости размножения, продолжительности жизни, подвижности, плодовитости, массы тела, скорости метаболизма или активности или выживаемости по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. Например, способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения общего состояния здоровья хозяина или для снижения общей выживаемости хозяина. В некоторых случаях снижение выживаемости хозяина составляет приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровнем, обнаруживаемым у хозяина, который не получает модулирующее средство). В некоторых случаях способы и композиции являются эффективными для снижения интенсивности размножения хозяина (например, скорости размножения) по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях способы и композиции являются эффективными для снижения других физиологических параметров, таких как подвижность, масса тела, продолжительность жизни, плодовитость или скорость метаболизма, на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем на 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровнем, обнаруживаемым у хозяина, который не получает модулирующее средство).

В некоторых случаях снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде снижения продуцирования одного или нескольких питательных веществ в организме хозяина (например, витаминов, углеводов, аминокислот или полипептидов) по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения продуцирования питательных веществ в организме хозяина (например, витаминов, углеводов, аминокислот или полипептидов) на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем на 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровнем, обнаруживаемым у хозяина, который не получает модулирующее средство). В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут снижать содержание питательных веществ в организме хозяина путем снижения продуцирования питательных веществ одним или несколькими микроорганизмами (например, эндосимбионтами) в организме хозяина по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде повышения восприимчивости хозяина к пестицидному средству (например, пестициду, приведенному в таблице 12) и/или снижения устойчивости хозяина к пестицидному средству (например, пестициду, приведенному в таблице 12) по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для повышения восприимчивости хозяина к пестицидному средству (например, пестициду, приведенному в таблице 12) на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем на 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровнем, обнаруживаемым у хозяина, который не получает модулирующее средство). Пестицидное средство может представлять собой любое пестицидное средство, известное в данной области техники, в том числе инсектицидные средства. В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут повышать восприимчивость хозяина к пестицидному средству (например, пестициду, приведенному в таблице 12) посредством снижения способности хозяина метаболизировать пестицидное средство или расщеплять его на пригодные к использованию субстраты.

В некоторых случаях снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде повышения восприимчивости хозяина к аллелохимическому средству и/или снижения устойчивости хозяина к аллелохимическому средству по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения устойчивости хозяина к аллелохимическому средству на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем на 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровнем, обнаруживаемым у хозяина, который не получает модулирующее средство). В некоторых случаях аллелохимическое средство представляет собой кофеин, цистатин N сои, монотерпены, дитерпеновые кислоты или фенольные соединения. В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут повышать восприимчивость хозяина к аллелохимическому средству посредством снижения способности хозяина метаболизировать аллелохимическое средство или расщеплять его на пригодные к использованию субстраты по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения устойчивости хозяина к паразитам или патогенам (например, грибным, бактериальным или вирусным патогенам или паразитам) по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения устойчивости хозяина к патогену или паразиту (например, грибным, бактериальным или вирусным патогенам или паразитическим микроскопическим клещам) на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем на 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровнем, обнаруживаемым у хозяина, который не получает модулирующее средство).

В некоторых случаях снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде других недостатков приспособленности, таких как сниженная переносимость определенных факторов окружающей среды (например, переносимость высокой или низкой температуры), сниженная способность к выживанию в определенных средах обитания или сниженная способность к поддержанию определенного рациона по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения приспособленности хозяина множеством способов, описанных в данном документе. Кроме того, модулирующее средство может снижать приспособленность хозяина в любом количестве классов, отрядов, семейств, родов или видов хозяев (например, у 1 вида хозяев, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500 или больше видов хозяев). В некоторых случаях модулирующее средство действует на один класс, отряд, семейство, род или вид хозяев.

Приспособленность хозяина может быть оценена с помощью любых стандартных способов в данной области техники. В некоторых случаях приспособленность хозяина может быть оценена посредством оценки отдельного хозяина. В качестве альтернативы, приспособленность хозяина может быть оценена посредством оценки популяции хозяев. Например, снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде снижения степени успешного конкурирования по сравнению с другими насекомыми, что тем самым приводит к уменьшению размера популяции хозяев.

Насекомые–хозяева в сельском хозяйстве

Благодаря ослаблению приспособленности вредоносных насекомых модулирующие средства, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для способствования росту растений, которые обычно повреждаются указанными хозяевами. Модулирующее средство может быть доставлено в растение с помощью любых составов и способов доставки, описанных в данном документе, в количестве и в течение периода времени, эффективных для снижения приспособленности хозяина, что тем самым производит благоприятный эффект на растение, например, в виде повышения темпов роста сельскохозяйственной культуры, повышения урожайности сельскохозяйственной культуры, снижения заражения вредителями и/или уменьшения вреда, причиняемого растениям. Это может предусматривать или не предусматривать непосредственное применение модулирующего средства в отношении растения. Например, в случаях, когда первоначальная среда обитания хозяина отличается от региона, в котором растет растение, модулирующее средство может применяться в отношении одного из первоначальной среды обитания хозяина либо растений, представляющих интерес, или комбинации того и другого.

В некоторых случаях растение может представлять собой продовольственную сельскохозяйственную культуру, такую как злаковая, зерновая, бобовая, фруктовая или овощная сельскохозяйственная культура, или непродовольственную сельскохозяйственную культуру, например, травянистые растения, цветочные растения, хлопчатник, сенокосные культуры, коноплю. Композиции, описанные в данном документе, могут быть доставлены в сельскохозяйственную культуру в любое время до или после сбора урожая злаковой, зерновой, бобовой, фруктовой, овощной или другой сельскохозяйственной культуры. Урожайность сельскохозяйственной культуры представляет собой количественный показатель, часто используемый в отношении культурных растений, и обычно измеряется в метрических тоннах с гектара (или килограммах с гектара). Урожайность сельскохозяйственной культуры также может относиться к фактическому образованию семян растением. В некоторых случаях модулирующее средство может быть эффективным для повышения урожайности сельскохозяйственной культуры (например, увеличения количества метрических тонн злаковой, зерновой, бобовой, фруктовой или овощной культуры, собираемых с гектара, и/или увеличения образования семян) на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или больше по сравнению с эталонным уровнем (например, у сельскохозяйственной культуры, в которую модулирующее средство не было введено).

В некоторых случаях растение (например, сельскохозяйственная культура) может иметь риск развития заражения вредителем (например, насекомым), или у него уже может развиться заражение вредителем. Способы и композиции, описанные в данном документе, можно применять для снижения или предупреждения заражения вредителями таких сельскохозяйственных культур путем ослабления приспособленности насекомых, заражающих растения. В некоторых случаях модулирующее средство может быть эффективным для снижения заражения сельскохозяйственной культуры (например, уменьшения количества зараженных растений, уменьшения размера популяции вредителя, уменьшения вреда, причиняемого растениям) на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или больше по сравнению с эталонным уровнем (например, у сельскохозяйственной культуры, в которую модулирующее средство не было введено). В других случаях модулирующее средство может быть эффективным для предупреждения или снижения вероятности заражения сельскохозяйственной культуры на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или больше по сравнению с эталонным уровнем (например, у сельскохозяйственной культуры, в которую модулирующее средство не было введено).

Композиции и способы, описанные в данном документе, могут производить благоприятный эффект на любые подходящие растительные ткани, в том числе без ограничения на соматические зародыши, пыльцу, листья, стебли, каллюсы, столоны, микроклубни и побеги. Способы, описанные в данном документе, могут включать обработку покрытосеменных и голосеменных растений, таких как акация, люцерна, яблоня, абрикос, артишок, ясень, спаржа, авокадо, банан, ячмень, разновидности фасоли, свекла, береза, бук, ежевика, черника, брокколи, разновидности брюссельской капусты, кочанная капуста, канола, дыня мускусная, морковь, маниок съедобный, цветная капуста, кедр, злаковое растение, сельдерей, каштан, вишня, пекинская капуста, цитрусовое растение, клементин, клевер, кофейное дерево, кукуруза, хлопчатник, хвойные деревья, вигна китайская, огурец, кипарис, баклажан, вяз, цикорий салатный, эвкалипт, разновидности конских бобов, фенхель, разновидности инжира, пихта, фруктовые и орехоплодные деревья, герань, виноград, грейпфрут, разновидности земляного ореха, физалис, тсуга канадская, конопля, гикори, кудрявая капуста, актинидия, кольраби, лиственница, латук, лук–порей, лимон, лайм, робиния, сосна, курчавый папоротник, маис, манго, клен, дыня обыкновенная, просо, шампиньон, горчица, орехоплодные растения, дуб, разновидности овса, абельмош съедобный, лук репчатый, апельсин, декоративное растение или цветочное растение или дерево, папайя, пальма, петрушка, пастернак посевной, горох, персик, арахис, груша, торфообразующее растение, перец, хурма, голубиный горох, сосна, ананас, плантан, слива, гранат, картофель, тыква, итальянский цикорий, редька, рапс, малина, рис, рожь посевная, сорго, ива, соя, шпинат, ель, кабачок, земляника, сахарная свекла, сахарный тростник, подсолнечник, сладкий картофель, сахарная кукуруза, танжерин, чайный куст, табак, томат, древесные растения, тритикале, дернообразующие травянистые растения, разновидности турнепса, виноград культурный, грецкий орех, жеруха лекарственная, арбуз обыкновенный, пшеница, разновидности ямса, тис и цукини.

Микроорганизмы–мишени

Микроорганизмы, на которые целенаправленно воздействует модулирующее средство, описанное в данном документе, могут включать в себя любой микроорганизм, обитающий в организме хозяина или на нем, в том числе без ограничения любые бактерии и/или грибы, описанные в данном документе. Микроорганизмы, обитающие в организме хозяина, могут включать в себя, например, симбиотические микроорганизмы (например, эндосимбиотические микроорганизмы, которые предоставляют полезные питательные вещества или ферменты хозяину), микроорганизмы–комменсалы, патогенные или паразитические микроорганизмы. Эндосимбиотический микроорганизм может являться первичным эндосимбионтом или вторичным эндосимбионтом. Симбиотический микроорганизм (например, бактерия или гриб) может являться облигатным симбионтом хозяина или факультативным симбионтом хозяина. Микроорганизмы, обитающие в организме хозяина, могут быть приобретены с помощью любого пути переноса, в том числе вертикального, горизонтального переноса или переноса множественного происхождения.

Бактерии

Иллюстративные бактерии, на которые можно целенаправленно воздействовать в соответствии со способами и композициями, предусмотренными в данном документе, включают без ограничения Xenorhabdus spp, Photorhabdus spp, Candidatus spp, Buchnera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Sinorhizobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp (например, Xylella fastidiosa), Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Commensalibacter spp. (например, Commensalibacter intestine), Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp (например, Acetobacter pomorum), Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp (например, Lactobacillus plantarum), Lysobacter spp., Herbaspirillum spp., Enterococcus spp, Gluconobacter spp. (например, Gluconobacter morbifer), Alcaligenes spp, Hamiltonella spp., Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Serratia spp., Arthrobacter spp, Azotobacter spp., Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Regiella spp. (например, Regiella insecticola), Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp, Mortierella spp. (например, Mortierella elongata) и Escherichia spp. В некоторых случаях бактерии, на которые целенаправленно воздействуют с помощью модулирующего средства, могут представлять собой бактерии, которые могут переноситься от насекомого в растение, в том числе без ограничения бактериальные патогены растений (например, Agrobacterium spp.). Неограничивающие примеры бактерий, на которые можно целенаправленно воздействовать с помощью способов и композиций, предусмотренных в данном документе, показаны в таблице 1. В некоторых случаях последовательность 16S рРНК бактерий, на которые целенаправленно воздействуют с помощью модулирующего средства, на по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99,9% или 100% идентична последовательности, приведенной в таблице 1.

Таблица 1. Примеры бактерий–мишеней и насекомых–хозяев

Первичный эндосимбионт	Хозяин	Местополо жение	16S рРНК
Гамма–протеобактерии
Carsonella ruddii	Листоблошки (Psylloidea)	Бактериоциты	TATCCAGCCACAGGTTCCCCTACAGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTTACAAATCATACCGTTGTAATAGTAAAATTACTTATGATACAATTTACTTCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCTCGAGAACGTATTCACCGTAACATTCTGATTTACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGAAATCGAGTTACAGATTTCAATCCGAACTAAGAATATTTTTTAAGATTAGCATTATGTTGCCATATAGCATATAACTTTTTGTAATACTCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTTATAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCTCACCTTCCTCCAATTTATCATTGGCAGTTTCTTATTAGTTCTAATATATTTTTAGTAAAATAAGATAAGGGTTGCGCTCGTTATAGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAAAGCTAAAAAAGCTTTATTATTTCTAATAAATTCTTTGGATGTCAAAAGTAGGTAAGATTTTTCGTGTTGTATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGAGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGTCGTAATCCCCAGGCGGTCAACTTAACGCGTTAGCTTTTTCACTAAAAATATATAACTTTTTTTCATAAAACAAAATTACAATTATAATATTTAATAAATAGTTGACATCGTTTACTGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGTGTATTAGTGTCAGTATTAAAATAGAAATACGCCTTCGCCACTAGTATTCTTTCAGATATCTAAGCATTTCACTGCTACTCCTGAAATTCTAATTTCTTCTTTTATACTCAAGTTTATAAGTATTAATTTCAATATTAAATTACTTTAATAAATTTAAAAATTAATTTTTAAAAACAACCTGCACACCCTTTACGCCCAATAATTCCGATTAACGCTTGCACCCCTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGTGCTTCTTTTACAAATAACGTCAAAGATAATATTTTTTTATTATAAAATCTCTTCTTACTTTGTTGAAAGTGTTTTACAACCCTAAGGCCTTCTTCACACACGCGATATAGCTGGATCAAGCTTTCGCTCATTGTCCAATATCCCCCACTGCTGCCTTCCGTAAAAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGTTGTTCATCCTCTAAGATCAACTACGAATCATAGTCTTGTTAAGCTTTTACTTTAACAACTAACTAATTCGATATAAGCTCTTCTATTAGCGAACGACATTCTCGTTCTTTATCCATTAGGATACATATTGAATTACTATACATTTCTATATACTTTTCTAATACTAATAGGTAGATTCTTATATATTACTCACCCGTTCGCTGCTAATTATTTTTTTAATAATTCGCACAACTTGCATGTGTTAAGCTTATCGCTAGCGTTCAATCTGAGCTATGATCAAACTCA (SEQ ID NO: 1)
Portiera aleyrodidarum BT–B	Белокрылки (Aleyrodoidea)	Бактериоциты	AAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGCAGACATAACACATGCAAGTCGAGCGGCATCATACAGGTTGGCAAGCGGCGCACGGGTGAGTAATACATGTAAATATACCTAAAAGTGGGGAATAACGTACGGAAACGTACGCTAATACCGCATAATTATTACGAGATAAAGCAGGGGCTTGATAAAAAAAATCAACCTTGCGCTTTTAGAAAATTACATGCCGGATTAGCTAGTTGGTAGAGTAAAAGCCTACCAAGGTAACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGAAAAGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGTCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAAGAAGAAAAGTTAGAAAATAAAAAGTTATAACTATGACGGTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCAGAATTACTGGGCGTAAAGGGCATGTAGGTGGTTTGTTAAGCTTTATGTGAAAGCCCTATGCTTAACATAGGAACGGAATAAAGAACTGACAAACTAGAGTGCAGAAGAGGAAGGTAGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCAGTTGCGAAGGCGACCTTCTGGGCTGACACTGACACTGAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATATCAACTAGCCGTTGGATTCTTAAAGAATTTTGTGGCGTAGCTAACGCGATAAGTTGATCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAAAACCTTACCTACTCTTGACATCCAAAGTACTTTCCAGAGATGGAAGGGTGCCTTAGGGAACTTTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAACGCATAAGGCGGGAACTTTAAGGAGACTGCTGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTAAGAGTAGGGCAACACACGTGCTACAATGGCAAAAACAAAGGGTCGCAAAATGGTAACATGAAGCTAATCCCAAAAAAATTGTCTTAGTTCGGATTGGAGTCTGAAACTCGACTCCATAAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCTCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTGAAATGCACCAGAAGTGGCAAGTTTAACCAAAAAACAGGAGAACAGTCACTACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCTGTAGGGGAACCTGTGGCTGGATCACCTCCTTAA (SEQ ID NO: 2)
Buchnera aphidicola, штамм APS (Acyrthosiphon pisum)	Тли (Aphidoidea)	Бактериоциты	AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAAGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCGAGAAGAGAGCTTGCTCTCTTTGTCGGCAAGCGGCAAACGGGTGAGTAATATCTGGGGATCTACCCAAAAGAGGGGGATAACTACTAGAAATGGTAGCTAATACCGCATAATGTTGAAAAACCAAAGTGGGGGACCTTTTGGCCTCATGCTTTTGGATGAACCCAGACGAGATTAGCTTGTTGGTAGAGTAATAGCCTACCAAGGCAACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATAACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCTATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAAAAAATAAAACTAATAATTTTATTTCGTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCAGAATTACTGGGCGTAAAGAGCGCGTAGGTGGTTTTTTAAGTCAGGTGTGAAATCCCTAGGCTCAACCTAGGAACTGCATTTGAAACTGGAAAACTAGAGTTTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCCGTGGCGAAAGCGGCCTCCTAAACGAAAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTTCCAAGAGAAGTGACTTCCGAAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAATTCTTTAGAAATAAAGAAGTGCCTTCGGGAGCTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCCCTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAGAGGAGACTGCCGGTTATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTTATACAAAGAGAAGCAAATCTGCAAAGACAAGCAAACCTCATAAAGTAAATCGTAGTCCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGCAGGTATCCTAACCCTTTAAAAGGAAGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTT (SEQ ID NO: 3)
Buchnera aphidicola, штамм Sg (Schizaphis graminum)	Тли (Aphidoidea)	Бактериоциты	AAACTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAAGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCGAAAAGAAAGCTTGCTTTCTTGTCGGCGAGCGGCAAACGGGTGAGTAATATCTGGGGATCTGCCCAAAAGAGGGGGATAACTACTAGAAATGGTAGCTAATACCGCATAAAGTTGAAAAACCAAAGTGGGGGACCTTTTTTAAAGGCCTCATGCTTTTGGATGAACCCAGACGAGATTAGCTTGTTGGTAAGGTAAAAGCTTACCAAGGCAACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATAACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCTATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAAAAATTAAAACTAATAATTTTATTTTGTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCAGAATTACTGGGCGTAAAGAGCACGTAGGTGGTTTTTTAAGTCAGATGTGAAATCCCTAGGCTTAACCTAGGAACTGCATTTGAAACTGAAATGCTAGAGTATCGTAGAGGGAGGTAGAATTCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCCGTGGCGAAAGCGGCCTCCTAAACGAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTTCCAAGAGAAGTGACTTCCGAAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAATTTTTTAGAAATAAAAAAGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCCCTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAGAGGAGACTGCCGGTTATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTTATACAAAGAGAAGCAAATCTGTAAAGACAAGCAAACCTCATAAAGTAAATCGTAGTCCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGCAGATTTCCTAACCACGAAAGTGGAAGGCGTCTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTA (SEQ ID NO: 4)
Buchnera aphidicola, штамм Bp (Baizongia pistaciae)	Тли (Aphidoidea)	Бактериоциты	ACTTAAAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAAGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGCATCGAAGAAAAGTTTACTTTTCTGGCGGCGAGCGGCAAACGGGTGAGTAACATCTGGGGATCTACCTAAAAGAGGGGGACAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATGTTTTTAAATAAACCAAAGTAGGGGACTAAAATTTTTAGCCTTATGCTTTTAGATGAACCCAGACGAGATTAGCTTGATGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATAACCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCTAAAGCCTGATGCAGCTATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAAGAATTATGTCTAATATACATATTTTGTGACGTTACCCGAAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCAGAATTACTGGGCGTAAAGAGCACGTAGGCGGTTTATTAAGTCAGATGTGAAATCCCTAGGCTTAACTTAGGAACTGCATTTGAAACTAATAGACTAGAGTCTCATAGAGGGAGGTAGAATTCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTAGAGGAATACCCGTGGCGAAAGCGACCTCCTAAATGAAAACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTTCCTAGAGAAGTGGCTTCCGAAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCATAGAATTTTTTAGAGATAAAAGAGTGCCTTAGGGAACTATGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTTGTTGCCATCAGGTTATGCTGGGAACTCAGAGGAGACTGCCGGTTATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGATGCAACTCTGCGAAGATAAGCAAACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGCAGGTAGCTTAACCAGATTATTTTATTGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTA (SEQ ID NO: 5)
Buchnera aphidicola BCc	Тли (Aphidoidea)	Бактериоциты	ATGAGATCATTAATATATAAAAATCATGTTCCAATTAAAAAATTAGGACAAAATTTTTTACAGAATAAAGAAATTATTAATCAGATAATTAATTTAATAAATATTAATAAAAATGATAATATTATTGAAATAGGATCAGGATTAGGAGCGTTAACTTTTCCTATTTGTAGAATCATTAAAAAAATGATAGTATTAGAAATTGATGAAGATCTTGTGTTTTTTTTAACTCAAAGTTTATTTATTAAAAAATTACAAATTATAATTGCTGATATTATAAAATTTGATTTTTGTTGTTTTTTTTCTTTACAGAAATATAAAAAATATAGGTTTATTGGTAATTTACCATATAATATTGCTACTATATTTTTTTTAAAAACAATTAAATTTCTTTATAATATAATTGATATGCATTTTATGTTTCAAAAAGAAGTAGCAAAGAGATTATTAGCTACTCCTGGTACTAAAGAATATGGTAGATTAAGTATTATTGCACAATATTTTTATAAGATAGAAACTGTTATTAATGTTAATAAATTTAATTTTTTTCCTACTCCTAAAGTAGATTCTACTTTTTTACGATTTACTCCTAAATATTTTAATAGTAAATATAAAATAGATAAACATTTTTCTGTTTTAGAATTAATTACTAGATTTTCTTTTCAACATAGAAGAAAATTTTTAAATAATAATTTAATATCTTTATTTTCTACAAAAGAATTAATTTCTTTAGATATTGATCCATATTCAAGAGCAGAAAATGTTTCTTTAATTCAATATTGTAAATTAATGAAATATTATTTGAAAAGAAAAATTTTATGTTTAGATTAA (SEQ ID NO: 6)
Buchnera aphidicola (Cinara tujafilina)	Тли (Aphidoidea)	Бактериоциты	TTATCTTATTTCACATATACGTAATATTGCGCTGCGTGCACGAGGATTTTTTTGAATTTCAGATATATTTGGTTTAATACGTTTAATAAAACGTATTTTTTTTTTTATTTTTCTTATTTGCAATTCAGTAATAGGAAGTTTTTTAGGTATATTTGGATAATTACTGTAATTCTTAATAAAGTTTTTTACAATCCTATCTTCAATAGAATGAAAACTAATAATAGCAATTTTTGATCCGGAATGTAATATGTTAATAATAATTTTTAATATTTTATGTAATTCATTTATTTCTTGGTTAATATATATTCGAAAAGCTTGAAATGTTCTCGTAGCTGGATGTTTAAATTTGTCATATTTTGGGATTGATTTTTTTATGATTTGAACTAACTCTAACGTGCTTGTTATGGTTTTTTTTTTTATTTGTAATATGATGGCTCGGGATATTTTTTTTGCGTATTTTTCTTCGCCAAAATTTTTTATTACCTGTTCTATTGTTTTTTGGTTTGTTTTTTTTAACCATTGACTAACTGATATTCCAGATTTAGGGTTCATACGCATATCTAAAGGTCCATCATTCATAAATGAAAATCCTCGGATACTAGAATTTAACTGTATTGAAGAAATACCTAAATCTAATAATATTCCATCTATTTTATCTCTATTTTTTTCTTTTTTTAATATTTTTTCAATATTAGAAAATTTACCTAAAAATATTTTAAATCGCGAATCTTTTATTTTTTTTCCGATTTTTATAGATTGTGGGTCTTGATCAATACTATATAACTTTCCATTAACCCCTAATTCTTGAAGAATTGCTTTTGAATGACCACCACCTCCAAATGTACAATCAACATATGTACCGTCTTTTTTTATTTTTAAGTATTGTATGATTTCTTTTGTTAAAACAGGTTTATGAATCAT (SEQ ID NO: 7)
Buchnera aphidicola, штамм G002 (Myzus persicae)	Тли (Aphidoidea)	Бактериоциты	ATGAAAAGTATAAAAACTTTTAAAAAACACTTTCCTGTGAAAAAATATGGACAAAATTTTCTTATTAATAAAGAGATCATAAAAAATATTGTTAAAAAAATTAATCCAAATATAGAACAAACATTAGTAGAAATCGGACCAGGATTAGCTGCATTAACTGAGCCCATATCTCAGTTATTAAAAGAGTTAATAGTTATTGAAATAGACTGTAATCTATTATATTTTTTAAAAAAACAACCATTTTATTCAAAATTAATAGTTTTTTGTCAAGATGCTTTAAACTTTAATTATACAAATTTATTTTATAAAAAAAATAAATTAATTCGTATTTTTGGTAATTTACCATATAATATCTCTACATCTTTAATTATTTTTTTATTTCAACACATTAGAGTAATTCAAGATATGAATTTTATGCTTCAAAAAGAAGTTGCTGCAAGATTAATTGCATTACCTGGAAATAAATATTACGGTCGTTTGAGCATTATATCTCAATATTATTGTGATATCAAAATTTTATTAAATGTTGCTCCTGAAGATTTTTGGCCTATTCCGAGAGTTCATTCTATATTTGTAAATTTAACACCTCATCATAATTCTCCTTATTTTGTTTATGATATTAATATTTTAAGCCTTATTACAAATAAGGCTTTCCAAAATAGAAGAAAAATATTACGTCATAGTTTAAAAAATTTATTTTCTGAAACAACTTTATTAAATTTAGATATTAATCCCAGATTAAGAGCTGAAAATATTTCTGTTTTTCAGTATTGTCAATTAGCTAATTATTTGTATAAAAAAAATTATACTAAAAAAAATTAA (SEQ ID NO: 8)
Buchnera aphidicola, штамм Ak (Acyrthosiphon kondoi)	Тли (Aphidoidea)	Бактериоциты	ATTATAAAAAATTTTAAAAAACATTTTCCTTTAAAAAGGTATGGACAAAATTTTCTTGTCAATACAAAAACTATTCAAAAGATAATTAATATAATTAATCCAAACACCAAACAAACATTAGTGGAAATTGGACCTGGATTAGCTGCATTAACAAAACCAATTTGTCAATTATTAGAAGAATTAATTGTTATTGAAATAGATCCTAATTTATTGTTTTTATTAAAAAAACGTTCATTTTATTCAAAATTAACAGTTTTTTATCAAGACGCTTTAAATTTCAATTATACAGATTTGTTTTATAAGAAAAATCAATTAATTCGTGTTTTTGGAAACTTGCCATATAATATTTCTACATCTTTAATTATTTCTTTATTCAATCATATTAAAGTTATTCAAGATATGAATTTTATGTTACAGAAAGAGGTTGCTGAAAGATTAATTTCTATTCCTGGAAATAAATCTTATGGCCGTTTAAGCATTATTTCTCAGTATTATTGTAAAATTAAAATATTATTAAATGTTGTACCTGAAGATTTTCGACCTATACCGAAAGTGCATTCTGTTTTTATCAATTTAACTCCTCATACCAATTCTCCATATTTTGTTTATGATACAAATATCCTCAGTTCTATCACAAGAAATGCTTTTCAAAATAGAAGGAAAATTTTGCGTCATAGTTTAAAAAATTTATTTTCTGAAAAAGAACTAATTCAATTAGAAATTAATCCAAATTTACGAGCTGAAAATATTTCTATCTTTCAGTATTGTCAATTAGCTGATTATTTATATAAAAAATTAAATAATCTTGTAAAAATCAATTAA (SEQ ID NO: 9)
Buchnera aphidicola, штамм Ua (Uroleucon ambrosiae)	Тли (Aphidoidea)	Бактериоциты	ATGATACTAAATAAATATAAAAAATTTATTCCTTTAAAAAGATACGGACAAAATTTTCTTGTAAATAGAGAAATAATCAAAAATATTATCAAAATAATTAATCCTAAAAAAACGCAAACATTATTAGAAATTGGACCGGGTTTAGGTGCGTTAACAAAACCTATTTGTGAATTTTTAAATGAACTTATCGTCATTGAAATAGATCCTAATATATTATCTTTTTTAAAGAAATGTATATTTTTTGATAAATTAAAAATATATTGTCATAATGCTTTAGATTTTAATTATAAAAATATATTCTATAAAAAAAGTCAATTAATTCGTATTTTTGGAAATTTACCATATAATATTTCTACATCTTTAATAATATATTTATTTCGGAATATTGATATTATTCAAGATATGAATTTTATGTTACAACAAGAAGTGGCTAAAAGATTAGTTGCTATTCCTGGTGAAAAACTTTATGGTCGTTTAAGTATTATATCTCAATATTATTGTAATATTAAAATATTATTACATATTCGACCTGAAAATTTTCAACCTATTCCTAAAGTTAATTCAATGTTTGTAAATTTAACTCCGCATATTCATTCTCCTTATTTTGTTTATGATATTAATTTATTAACTAGTATTACAAAACATGCTTTTCAACATAGAAGAAAAATATTGCGTCATAGTTTAAGAAATTTTTTTTCTGAGCAAGATTTAATTCATTTAGAAATTAATCCAAATTTAAGAGCTGAAAATGTTTCTATTATTCAATATTGTCAATTGGCTAATAATTTATATAAAAAACATAAACAGTTTATTAATAATTAA (SEQ ID NO: 10)
Buchnera aphidicola (Aphis glycines)	Тли (Aphidoidea)	Бактериоциты	ATGAAAAAGCATATTCCTATAAAAAAATTTAGTCAAAATTTTCTTGTAGATTTGAGTGTGATTAAAAAAATAATTAAATTTATTAATCCGCAGTTAAATGAAATATTGGTTGAAATTGGACCGGGATTAGCTGCTATCACTCGACCTATTTGTGATTTGATAGATCATTTAATTGTGATTGAAATTGATAAAATTTTATTAGATAGATTAAAACAGTTCTCATTTTATTCAAAATTAACAGTATATCATCAAGATGCTTTAGCATTTGATTACATAAAGTTATTTAATAAAAAAAATAAATTAGTTCGAATTTTTGGTAATTTACCATATCATGTTTCTACGTCTTTAATATTGCATTTATTTAAAAGAATTAATATTATTAAAGATATGAATTTTATGCTACAAAAAGAAGTTGCTGAACGTTTAATTGCAACTCCAGGTAGTAAATTATATGGTCGTTTAAGTATTATTTCTCAATATTATTGTAATATAAAAGTTTTATTGCATGTGTCTTCAAAATGTTTTAAACCAGTTCCTAAAGTAGAATCAATTTTTCTTAATTTGACACCTTATACTGATTATTTCCCTTATTTTACTTATAATGTAAACGTTCTTAGTTATATTACAAATTTAGCTTTTCAAAAAAGAAGAAAAATATTACGTCATAGTTTAGGTAAAATATTTTCTGAAAAAGTTTTTATAAAATTAAATATTAATCCCAAATTAAGACCTGAGAATATTTCTATATTACAATATTGTCAGTTATCTAATTATATGATAGAAAATAATATTCATCAGGAACATGTTTGTATTTAA (SEQ ID NO: 11)
Annandia pinicola	(Phylloxeroidea)	Бактериоциты	AGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGTCTTCGGACGCTGACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCAGTCGTGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTAGCTAATACCGCATACGATCTGAGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCGATTGGAGCGGCCGATGGCAGATTAGGTAGTTGGTGGGATAAAAGCTTACCAAGCCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCTTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCTATGTCGCGTGTATGAAGAAGACCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCGATAGCATAAGAAGATAATGAGACTAATAATTTTATTGTCTGACGTTAGCTATAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGGTGCTAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCATGTAGGTGGTTTATTAAGTCAGATGTGAAATCCCTGGACTTAATCTAGGAACTGCATTTGAAACTAATAGGCTAGAGTTTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATCTAGAGGAATATCAGTGGCGAAGGCGACCTTCTGGACGATAACTGACGCTAAAATGCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCTGTAAACGATGTCGACTAAGAGGTTGGAGGTATAACTTTTAATCTCTGTAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGTAAAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAATTTTACAGAAATGTAGAAGTGCAATTTGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTTGTTACCATAAGATTTAAGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTATGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGATGCAATATTGCGAAATAAAGCCAATCTTATAAAATATGTCCTAGTTCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATATGTTTCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTGGATTGCAAAAGAAGTAAGAAAATTAACCTTCTTAACAAGGAAATAACTTACCACTTTGTGACTCATAACTGGGGTGA (SEQ ID NO: 12)
Moranella endobia	(Coccoidea)	Бактериоциты	TCTTTTTGGTAAGGAGGTGATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATGAATCACAAAGTGGTAAGCGCCCTCCTAAAAGGTTAGGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTTCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATTCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCTACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACGCACTTTATGAGGTCCGCTAACTCTCGCGAGCTTGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAAAAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGTACCAAAACATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAACTACGAAAGCCACAGTTCAAGACCACAGCTTTCAAATCGACATAGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTACCTGAGCGTCAGTATTCGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACTGGTATTCCTCCAGATATCTACACATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACGAGACTCTAGCCTATCAGTTTCAAATGCAGTTCCTAGGTTAAGCCCAGGGATTTCACATCTGACTTAATAAACCGCCTACGTACTCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGTAGGTAACGTCAATCAATAACCGTATTAAGGATATTGCCTTCCTCCCTACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTAAGCTATTACCTCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGTTCATCTGAAGGTGTGAGGCCAAAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTACGACATTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGCAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGATCCCCAGACTTTACTCACCCGTTCGCTGCTCGCCGGCAAAAAAGTAAACTTTTTTCCGTTGCCGCTCAACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAATTAAA (SEQ ID NO: 13)
Ishikawaella capsulata Mpkobe	(Heteroptera)	Бактериоциты	AAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGCAAGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGAAAAAAGCTTGCTTTTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTACCTAATGGCGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAATGTTGTAAAACCAAAGTGGGGGACCTTATGGCCTCACACCATTAGATGAACCTAGATGGGATTAGCTTGTAGGTGGGGTAAAGGCTCACCTAGGCAACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCTATGTCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCATCGGGGAAGAAGGATATGAGCCTAATATTCTCATATATTGACGTTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAACACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCACGTAGGTGGTTTATTAAGTCATATGTGAAATCCCTGGGCTTAACCTAGGAACTGCATGTGAAACTGATAAACTAGAGTTTCGTAGAGGGAGGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATATCAGAGGCGAAGGCGACCTTCTGGACGAAAACTGACACTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACAATGTCGACTAAAAAACTGTGAGCTTGACTTGTGGTTTTTGTAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGTCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTGGTCTTGACATCCAGCGAATTATATAGAAATATATAAGTGCCTTTCGGGGAACTCTGAGACGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCCCTTATCCTCTGTTGCCAGCGGCATGGCCGGGAACTCAGAGGAGACTGCCAGTATTAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTATGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGTATACAAAGAGAAGCAATCTCGCAAGAGTAAGCAAAACTCAAAAAGTACATCGTAGTTCGGATTAGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCTCTGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTAAGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTTATAGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTTATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACTGTAGGGGAACCTGTGGTTGGATTACCTCCTTA (SEQ ID NO: 14)
Baumannia cicadellinicola	Цикадки (Cicadellinae)	Бактериоциты	TTCAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGTAAGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGCATCGGAAAGTAAATTAATTACTTTGCCGGCAAGCGGCGAACGGGTGAGTAATATCTGGGGATCTACCTTATGGAGAGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAACACCGCATAATGTCGTCAGACCAAAATGGGGGACCTAATTTAGGCCTCATGCCATAAGATGAACCCAGATGAGATTAGCTAGTAGGTGAGATAATAGCTCACCTAGGCAACGATCTCTAGTTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCTATACCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAAGAAAATGAAGTTACTAATAATAATTGTCAATTGACGTTACCCGCAAAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTATGTAGGCGGTTTATTTAGTCAGGTGTGAAAGCCCTAGGCTTAACCTAGGAATTGCATTTGAAACTGGTAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGGAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGCCCCCCTGGACGAAAACTGACGCTCAAGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGAAGGTTGTAGCCTTGAGCTATAGCTTTCGAAGCTAACGCATTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATACAACGCGAAAAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGTATAAAGCAGAAAAGCTTTAGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAACGATTAAGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGAGGATAACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGCATACAAAGAGAAGCAATCTCGTAAGAGTTAGCAAACCTCATAAAGTGCATCGTAGTCCGGATTAGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGTATTGCAAAAGAAGTTAGTAGCTTAACTCATAATACGAGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATAACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTACACTAAA (SEQ ID NO: 15)
Sodalis–подобные симбионты	Rhopalus sapporensis	Более широкий тропизм к тканям	ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCGGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCCGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCCGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCACACCATCGGATGAACCCAGGTGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATGGCGTTAATAGCGCTATCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGAAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGTGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTGGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTATTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGATCTCGCGAGAGTCAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTG (SEQ ID NO: 16)
Hartigia pinicola	Хермес сосновой древесины	Бактериоциты	AGATTTAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTACCAGAAGAAGCTTGCTTCTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTATGGGGATCTGCCCGACAGAGGGGGATAACTATTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAATCTCTGAGGAGCAAAGCAGGGGAACTTCGGTCCTTGCGCTATCGGATGAACCCATATGGGATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCCCCTAGGCAACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCTTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGAGAGGAAAACATTGATGCTAATATCATCAATTATTGACGTTTCCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTAATTAAGTTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTTAACCCAGGAATAGCATATAAAACTGGTCAACTAGAGTATTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAAACTGACGCTCAAATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTAGCTTCCGTAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGGAGTACGACTGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGATAATTTAGCAGAAATGCTTTAGTACCTTCGGGAAATCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTAGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGGGAAGCAACCTCGCGAGAGCAAGCGAAACTCATAAATTATGTCGTAGTTCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAACTTAACCTTATGGAAAGCGCTTACCACTTTGTGATTCATAACTGGGGTG (SEQ ID NO: 17)
Wigglesworthia glossinidia	Муха цеце (Diptera: Glossinidae)	Бактериоциты
Бета–протеобактерии
Tremblaya phenacola	Phenacoccus avenae (TPPAVE).	Бактериомы	AGGTAATCCAGCCACACCTTCCAGTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCACAACCCTTACCTTCGGAACTGCCCTCCTCACAACTCAAACCACCAAACACTTTTAAATCAGGTTGAGAGAGGTTAGGCCTGTTACTTCTGGCAAGAATTATTTCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGAGAACATATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCAATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTTCAGAGTACAATCCGAACTGAGGCCGGCTTTGTGAGATTAGCTCCCTTTTGCAAGTTGGCAACTCTTTGGTCCGGCCATTGTATGATGTGTGAAGCCCCACCCATAAAGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAACTTATCGCTGGCAGTCTCTTTAAGGTAACTGACTAATCCAGTAGCAATTAAAGACAGGGGTTGCGCTCGTTACAGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGCACTAATTCTCTTTCAAGCACTCCCGCTTCTCAACAGGATCTTAGCCATATCAAAGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTGTGCGTTAGCTGCACCACTGAAAAGGAAAACTGCCCAATGGTTAGTCAACATCGTTTAGGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTAGTGTCTGAGCGTCAGTAACGAACCAGGAGGCTGCCTACGCTTTCGGTATTCCTCCACATCTCTACACATTTCACTGCTACATGCGGAATTCTACCTCCCCCTCTCGTACTCCAGCCTGCCAGTAACTGCCGCATTCTGAGGTTAAGCCTCAGCCTTTCACAGCAATCTTAACAGGCAGCCTGCACACCCTTTACGCCCAATAAATCTGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTTGCCGGTGCTTATTCTTTCGGTACAGTCACACCACCAAATTGTTAGTTGGGTGGCTTTCTTTCCGAACAAAAGTGCTTTACAACCCAAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTCCGCCCATTGTCCAAGATTCCTCACTGCTGCCTTCCTCAGAAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGCCGTCCTCTCAGACCAGCTACCGATCATTGCCTTGGGAAGCCATTACCTTTCCAACAAGCTAATCAGACATCAGCCAATCTCAGAGCGCAAGGCAATTGGTCCCCTGCTTTCATTCTGCTTGGTAGAGAACTTTATGCGGTATTAATTAGGCTTTCACCTAGCTGTCCCCCACTCTGAGGCATGTTCTGATGCATTACTCACCCGTTTGCCACTTGCCACCAAGCCTAAGCCCGTGTTGCCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCTAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCT (SEQ ID NO: 18)
Tremblaya princeps	Мучнистый червец виноградный Planococcus citri	Бактериомы	AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGCATGCATTACACATGCAAGTCGTACGGCAGCACGGGCTTAGGCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACGCCTCGGAACGTGCCTTGTAGTGGGGGATAGCCTGGCGAAAGCCAGATTAATACCGCATGAAGCCGCACAGCATGCGCGGTGAAAGTGGGGGATTCTAGCCTCACGCTACTGGATCGGCCGGGGTCTGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAATGGCCCACCAAGGCTTAGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCACTTTTGTTCGGGATGAAGGGGGGCGTGCAAACACCATGCCCTCTTGACGATACCGAAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGTGCGCGGGTGGTTTGCCAAGACCCCTGTAAAATCCTACGGCCCAACCGTAGTGCTGCGGAGGTTACTGGTAAGCTTGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCGAAGGCGAAGGCAACCCCCTGGGCCATCACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACCATGTCGACTAGTTGTCGGGGGGAGCCCTTTTTCCTCGGTGACGAAGCTAACGCATGAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGCGGAGATTCTGCCGAGAGGCGGAAGTGCTCGAAAGAGAATCCGTGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCATAACGAGCGCAACCCCCGTCTTTAGTTGCTACCACTGGGGCACTCTATAGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCTTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGCTGGAGCAAAGGGTCGCCAACTCGAGAGAGGGAGCTAATCCCACAAACCCAGCCCCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTAAGCCGCATCAGAAGCAGCCTCCCTAACCCTATGCTGGGAAGGAGGCTGCGAAGGTGGGGTCTATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATTACCT (SEQ ID NO: 19)
Vidania		Бактериомы
Nasuia deltocephalinicola	Вредоносное насекомое–хозяин Macrosteles quadripunctulatus (Hemiptera: Cicadellidae)	Бактериомы	AGTTTAATCCTGGCTCAGATTTAACGCTTGCGACATGCCTAACACATGCAAGTTGAACGTTGAAAATATTTCAAAGTAGCGTATAGGTGAGTATAACATTTAAACATACCTTAAAGTTCGGAATACCCCGATGAAAATCGGTATAATACCGTATAAAAGTATTTAAGAATTAAAGCGGGGAAAACCTCGTGCTATAAGATTGTTAAATGCCTGATTAGTTTGTTGGTTTTTAAGGTAAAAGCTTACCAAGACTTTGATCAGTAGCTATTCTGTGAGGATGTATAGCCACATTGGGATTGAAATAATGCCCAAACCTCTACGGAGGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGAGCGAAAGCTTGATCCAGCAATGTCGCGTGTGCGATTAAGGGAAACTGTAAAGCACTTTTTTTTAAGAATAAGAAATTTTAATTAATAATTAAAATTTTTGAATGTATTAAAAGAATAAGTACCGACTAATCACGTGCCAGCAGTCGCGGTAATACGTGGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTATTGGGCGTAAAGTGTATTCAGGCTGCTTAAAAAGATTTATATTAAATATTTAAATTAAATTTAAAAAATGTATAAATTACTATTAAGCTAGAGTTTAGTATAAGAAAAAAGAATTTTATGTGTAGCAGTGAAATGCGTTGATATATAAAGGAACGCCGAAAGCGAAAGCATTTTTCTGTAATAGAACTGACGCTTATATACGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACTATGTCAATTAACTATTAGAATTTTTTTTAGTGGTGTAGCTAACGCGTTAAATTGACCGCCTGGGTATTACGATCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCAGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGATACGCGAAAAACCTTACCTGCCCTTGACATGGTTAGAATTTTATTGAAAAATAAAAGTGCTTGGAAAAGAGCTAACACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTACTCTTAGTTGCTAATTAAAGAACTTTAAGAGAACAGCTAACAATAAGTTTAGAGGAAGGAGGGGATGACTTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGCAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTTAATACAAAAAGTTGCAATATCGTAAGATTGAGCTAATCTTTAAAATTAATCTTAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATAGTTTAACTGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAATAAATCTTGTTTTAAATGAAGTAATATATTTTATCAAAACAGGTTTTGTAACCGGGGTGAAGTCGTAACA (SEQ ID NO: 20)
Zinderia insecticola CARI	Пенница Clastoptera arizonana	Бактериоциты	ATATAAATAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGTATGCTTTACACATGCAAGTCGAACGACAATATTAAAGCTTGCTTTAATATAAAGTGGCGAACGGGTGAGTAATATATCAAAACGTACCTTAAAGTGGGGGATAACTAATTGAAAAATTAGATAATACCGCATATTAATCTTAGGATGAAAATAGGAATAATATCTTATGCTTTTAGATCGGTTGATATCTGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAATGCTTACCAAGGCAATGATCAGTAGCTGGTTTTAGCGAATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTTCTACGGAAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGAGAAATCCTGATCCAGCAATACCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTCGTAAAACTCTTTTGTTAGGAAAGAAATAATTTTAAATAATATTTAAAATTGATGACGGTACCTAAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGTGCGTAGGCTGTTATATAAGATAGATGTGAAATACTTAAGCTTAACTTAAGAACTGCATTTATTACTGTTTAACTAGAGTTTATTAGAGAGAAGTGGAATTTTATGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATATAAAGGAATATCGATGGCGAAGGCAGCTTCTTGGAATAATACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACTATGTCTACTAGTTATTAAATTAAAAATAAAATTTAGTAACGTAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGATCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACACGAAAAACCTTACCTACTCTTGACATGTTTGGAATTTTAAAGAAATTTAAAAGTGCTTGAAAAAGAACCAAAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTATTTGCTAATAAAAAGAACTTTAATAAGACTGCCAATGACAAATTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGAGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGATATATACAATGGGTAGCAAATTTGTGAAAATGAGCCAATCCTTAAAGTATATCTTAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTGATTTTTACCAGAAATTATTTGTTTAACCTTTATTGGAAAAAAATAATTAAGGTAGAATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCAGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATTACATTTTAAAT (SEQ ID NO: 21)
Profftella armatura	Diaphorina citri, азиатская цитрусовая листоблошка	Бактериомы
Альфа–протеобактерии
Hodgkinia	Цикада Diceroprocta semicincta	Бактериом	AATGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGACAACGTTCAAACGTTGTTAGCGGCGAACGGGTGAGTAATACGTGAGAATCTACCCATCCCAACGTGATAACATAGTCAACACCATGTCAATAACGTATGATTCCTGCAACAGGTAAAGATTTTATCGGGGATGGATGAGCTCACGCTAGATTAGCTAGTTGGTGAGATAAAAGCCCACCAAGGCCAAGATCTATAGCTGGTCTGGAAGGATGGACAGCCACATTGGGACTGAGACAAGGCCCAACCCTCTAAGGAGGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGCGTAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTGATTGAAGGTCCAACGGACTGTAAAACTCTTTTCTCCAGAGATCATAAATGATAGTATCTGGTGATATAAGCTCCGGCCAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGAGCGAGTATTGTTCGGTTTTATTGGGCGTAAAGGGTGTCCAGGTTGCTAAGTAAGTTAACAACAAAATCTTGAGATTCAACCTCATAACGTTCGGTTAATACTACTAAGCTCGAGCTTGGATAGAGACAAACGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTTGATACTTGGAGGAACACCAGAGGCGAAGGCGGTTTGTCATACCAAGCTGACACTGAAGACACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCCTAAACGTTGAGTGCTAACAGTTCGATCAAGCCACATGCTATGATCCAGGATTGTACAGCTAACGCGTTAAGCACTCCGCCTGGGTATTACGACCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGAGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACACGAAGAACCTTACCAGCCCTTGACATACCATGGCCAACCATCCTGGAAACAGGATGTTGTTCAAGTTAAACCCTTGAAATGCCAGGAACAGGTGCTGCATGGCTGTTGTCAGTTCGTGTCGTGAGATGTATGGTTAAGTCCCAAAACGAACACAACCCTCACCCATAGTTGCCATAAACACAATTGGGTTCTCTATGGGTACTGCTAACGTAAGTTAGAGGAAGGTGAGGACCACAACAAGTCATCATGGCCCTTATGGGCTGGGCCACACACATGCTACAATGGTGGTTACAAAGAGCCGCAACGTTGTGAGACCGAGCAAATCTCCAAAGACCATCTCAGTCCGGATTGTACTCTGCAACCCGAGTACATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACGCCGCCCGTCACACCATGGGAGCTTCGCTCCGATCGAAGTCAAGTTACCCTTGACCACATCTTGGCAAGTGACCGA (SEQ ID NO: 22)
Wolbachia sp. wPip	Комар Culex quinquefasciatus	Бактериом	AAATTTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAATGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGAGTTATATTGTAGCTTGCTATGGTATAACTTAGTGGCAGACGGGTGAGTAATGTATAGGAATCTACCTAGTAGTACGGAATAATTGTTGGAAACGACAACTAATACCGTATACGCCCTACGGGGGAAAAATTTATTGCTATTAGATGAGCCTATATTAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATAGCCTACCAAGGTAATGATCTATAGCTGATCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTGAAGAAGGCCTTTGGGTTGTAAAGCTCTTTTAGTGAGGAAGATAATGACGGTACTCACAGAAGAAGTCCTGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGAGGGCTAGCGTTATTCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCTGGTTAATAAGTTAAAAGTGAAATCCCGAGGCTTAACCTTGGAATTGCTTTTAAAACTATTAATCTAGAGATTGAAAGAGGATAGAGGAATTCCTGATGTAGAGGTAAAATTCGTAAATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGTCTATCTGGTTCAAATCTGACGCTGAAGCGCGAAGGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAATGTTAAATATGGGGAGTTTACTTTCTGTATTACAGCTAACGCGTTAAACATTCCGCCTGGGGACTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCACTTCTTGACATGAAAATCATACCTATTCGAAGGGATAGGGTCGGTTCGGCCGGATTTTACACAAGTGTTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCATCCTTAGTTGCCATCAGGTAATGCTGAGTACTTTAAGGAAACTGCCAGTGATAAGCTGGAGGAAGGTGGGGATGATGTCAAGTCATCATGGCCTTTATGGAGTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGTCTACAATGGGCTGCAAGGTGCGCAAGCCTAAGCTAATCCCTAAAAGACATCTCAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACTGCCCGTCACGCCATGGGAATTGGTTTCACTCGAAGCTAATGGCCTAACCGCAAGGAAGGAGTTATTTAAAGTGGGATCAGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCAGTAGGGGAATCTGCAGCTGGATTACCTCCTTA (SEQ ID NO: 23)
Bacteroidetes
Uzinura diaspidicola	Щитовки	Бактериоциты	AAAGGAGATATTCCAACCACACCTTCCGGTACGGTTACCTTGTTACGACTTAGCCCTAGTCATCAAGTTTACCTTAGGCAGACCACTGAAGGATTACTGACTTCAGGTACCCCCGACTCCCATGGCTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGTTCGAGAACATATTCACCGCGCCATTGCTGATGCGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATAGAGTCGAATTGCAGACTCCAATCCGAACTGAGACTGGTTTTAGAGATTAGCTCCTGATCACCCAGTGGCTGCCCTTTGTAACCAGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAAGGCATAGAGGCCATGATGATTTGACATCATCCCCACCTTCCTCACAGTTTACACCGGCAGTTTTGTTAGAGTCCCCGGCTTTACCCGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTATAGGACTTAACCAAACACTTCACAGCACGAACTGAAGACAACCATGCAGCACCTTGTAATACGTCGTATAGACTAAGCTGTTTCCAGCTTATTCGTAATACATTTAAGCCTTGGTAAGGTTCCTCGCGTATCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGAACCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAATCTTGCGACTGTACTTCCCAGGTGGATCACTTATCGCTTTCGCTAAGCCACTGAATATCGTTTTTCCAATAGCTAGTGATCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCACTGAGCGTCAGTAAAGATTTAGCAACCTGCCTTCGCTATCGGTGTTCTGTATGATATCTATGCATTTCACCGCTACACCATACATTCCAGATGCTCCAATCTTACTCAAGTTTACCAGTATCAATAGCAATTTTACAGTTAAGCTGTAAGCTTTCACTACTGACTTAATAAACAGCCTACACACCCTTTAAACCCAATAAATCCGAATAACGCTTGTGTCATCCGTATTGCCGCGGCTGCTGGCACGGAATTAGCCGACACTTATTCGTATAGTACCTTCAATCTCCTATCACGTAAGATATTTTATTTCTATACAAAAGCAGTTTACAACCTAAAAGACCTTCATCCTGCACGCGACGTAGCTGGTTCAGAGTTTCCTCCATTGACCAATATTCCTCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGTCCGTGTCTCAGTACCAGTGTGGAGGTACACCCTCTTAGGCCCCCTACTGATCATAGTCTTGGTAGAGCCATTACCTCACCAACTAACTAATCAAACGCAGGCTCATCTTTTGCCACCTAAGTTTTAATAAAGGCTCCATGCAGAAACTTTATATTATGGGGGATTAATCAGAATTTCTTCTGGCTATACCCCAGCAAAAGGTAGATTGCATACGTGTTACTCACCCATTCGCCGGTCGCCGACAAATTAAAAATTTTTCGATGCCCCTCGACTTGCATGTGTTAAGCTCGCCGCTAGCGTTAATTCTGAGCCAGGATCAAACTCTTCGTTGTAG (SEQ ID NO: 24)
Sulcia muelleri	Сине–зеленые цикадки и несколько других видов цикадок	Бактериоциты	CTCAGGATAAACGCTAGCGGAGGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCAAAAATAATTATTTTTGGCGACCGGCAAACGGGTGAGTAATACATACGTAACTTTCCTTATGCTGAGGAATAGCCTGAGGAAACTTGGATTAATACCTCATAATACAATTTTTTAGAAAGAAAAATTGTTAAAGTTTTATTATGGCATAAGATAGGCGTATGTCCAATTAGTTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGACGATGATTGGTAGGGGGCCTGAGAGGGGCGTTCCCCCACATTGGTACTGAGACACGGACCAAACTTCTACGGAAGGCTGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGAAACTCTGAACCAGCCACTCCGCGTGCAGGATGAAAGAAAGCCTTATTGGTTGTAAACTGCTTTTGTATATGAATAAAAAATTCTAATTATAGAAATAATTGAAGGTAATATACGAATAAGTATCGACTAACTCTGTGCCAGCAGTCGCGGTAAGACAGAGGATACAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTTTTAAAGTCAGTAGTGAAATCTTAAAGCTTAACTTTAAAAGTGCTATTGATACTGAAAAACTAGAGTAAGGTTGGAGTAACTGGAATGTGTGGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATCACACAGAACACCGATAGCGAAAGCAAGTTACTAACCCTATACTGACGCTGAGTCACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATCACTAACTATTGGGTTTTATACGTTGTAATTCAGTGGTGAAGCGAAAGTGTTAAGTGATCCACCTGAGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAATCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACACGAGGAACCTTACCAAGACTTAAATGTACTACGAATAAATTGGAAACAATTTAGTCAAGCGACGGAGTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTAAGGTTAAGTCCTTTAAACGAGCGCAACCCTTATTATTAGTTGCCATCGAGTAATGTCAGGGGACTCTAATAAGACTGCCGGCGCAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCTTGGGCCACACACGTGCTACAATGATCGGTACAAAAGGGAGCGACTGGGTGACCAGGAGCAAATCCAGAAAGCCGATCTAAGTTCGGATTGGAGTCTGAAACTCGACTCCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTGCATCAGCCATGGCACGGTGAATATGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGTTGGAAGTACCTAAAGTTGGTTCGCTACCTAAGGTAAGTCTAATAACTGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTA (SEQ ID NO: 25)
Дрожжеподобные симбионты
Symbiotaphrina buchneri, контрольный штамм JCM9740	Жуки–точильщики Stegobium paniceum	Мицетома между передней и средней кишкой	AGATTAAGCCATGCAAGTCTAAGTATAAGNAATCTATACNGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGATTCATGATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTTTTAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTAACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCTTCTGGGGAGCCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGTGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGATGTTATTATTTTGACTCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACATTAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTATGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGGTCCGCTTTGGCGGGCCGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACAGAGCCAACGAGTAAATCACCTTGGCCGGAAGGTCTGGGTAATCTTGTTAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGCTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCCTTCGGACTGGCACAGGGACGTTGGCAACGACGACCCAGTGCCGGAAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTA (SEQ ID NO: 26)
Symbiotaphrina kochii, контрольный штамм CBS 589.63	Жуки–точильщики Lasioderma serricorne	Мицетома	TACCTGGTTGATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCAAGTCTAAGTATAAGCAATCTATACGGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCTCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGATTCATGATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTAACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCTTCTGGGGAGCCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGTGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGATGTTATTATTTTGACTCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACATTAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTATGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGGTCCGCTTTGGCGGGCCGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACAGAGCCAACGAGTACATCACCTTGGCCGGAAGGTCTGGGTAATCTTGTTAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGCTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCCTTCGGACTGGCACAGGGACGTTGGCAACGACGACCCAGTGCCGGAAAGTTCGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGNNNAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTA (SEQ ID NO: 27)
Первичный внеклеточный симбионт	Хозяин	Местоположение	16S рРНК
Бактерии, расщепляющие фенитротион
Burkholderia sp. SFA1	Riptortus pedestris	Кишка	AGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGGGGCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGACCTAAGGGAGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATAGGGGCGGCCGATGGCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAAACTTCGTCCCTAATATGGATGGAGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTCTGTTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTTTGAGTGTGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAACTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAACCCTGCTGAAAGGTGGGGGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTACCACGGTGGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGC (SEQ ID NO: 28)
Burkholderia sp. KM–A	Riptortus pedestris	Кишка	GCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCTACGGAAGAAAGCGGGGGATCCTTCGGGACCTCGCGCTATAGGGGCGGCCGATGGCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAAACGTCTTGGTTAATACCTGAGGCGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTCTGTTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTTTGAGTGTGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAAGTCTGCTGAGAGGTGGACGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTACCACGGTGGGATTCATGACTGGGGTGAAGT (SEQ ID NO: 29)
Burkholderia sp. KM–G	Riptortus pedestris	Кишка	GCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGACCTAAGGGAGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATAGGGGCGGCCGATGGCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAAACTTCGAGGTTAATACCCTTGGAGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTCTGTTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTTTGAGTGTGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAAGTCTGCTGAGAGGTGGACGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACCTGCAAAGGAGGGCGCTTACCACG (SEQ ID NO: 30)
Snodgrassella alvi	Пчела медоносная (Apis mellifera) и Bombus spp.	Подвздошная кишка	GAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGAGAGCTTGCTCTCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCATCGGAACGTACCGAGTAATGGGGGATAACTGTCCGAAAGGATGGCTAATACCGCATACGCCCTGAGGGGGAAAGCGGGGGATCGAAAGACCTCGCGTTATTTGAGCGGCCGATGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTCTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGGACTTTTGTTAGGGAAGAAAAGCCGGGTGTTAATACCATCTGGTGCTGACGGTACCTAAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGACGGTTAATTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGAGCTCAACTTGGGACGTGCATTTGAAACTGGTTAACTAGAGTGTGTCAGAGGGAGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGTTCATGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGACAATTAGCTGTTGGGACACTAGATGTCTTAGTAGCGAAGCTAACGCGTGAAATTGTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATGTACGGAATCTCTTAGAGATAGGAGAGTGCCTTCGGGAACCGTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGACCAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGTACAGAGGGTAGCGAAGCCGCGAGGTGAAGCCAATCTCAGAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGGGATACCAGAATTGGGTAGACTAACCGCAAGGAGGTCGCTTAACACGGTATGCTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAG (SEQ ID NO: 33)
Gilliamella apicola	Пчела медоносная (Apis mellifera) и Bombus spp.	Подвздошная кишка	TTAAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACATGAGTGCTTGCACTTGATGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAAGTATGGGGATCTGCCGAATGGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAAAGTTGAGAGACCAAAGCATGGGACCTTCGGGCCATGCGCCATTTGATGAACCCATATGGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCGGTGATGAGGAAGGTGGTGTATCTAATAGGTGCATCAATTGACGTTAATTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATGACTGGGCGTAAAGGGCATGTAGGCGGATAATTAAGTTAGGTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTAGGAATTGCACTTAAAACTGGTTAACTAGAGTATTGTAGAGGAAGGTAGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCTTCTGGACAGATACTGACGCTGAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGTTTGTTGCCTAGAGTGATGGGCTCCGAAGCTAACGCGATAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAATCTTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCATCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGTTGATAAAGCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGGGAGGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCTAAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGATAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGTTTACCACGGTGTGGTCCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTAC (SEQ ID NO: 34)
Bartonella apis	Пчела медоносная (Apis mellifera)	Кишка	AAGCCAAAATCAAATTTTCAACTTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAACGCACTTTTCGGAGTGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCTATTTCTACGGAATAACGCAGAGAAATTTGTGCTAATACCGTATACGTCCTTCGGGAGAAAGATTTATCGGAGATAGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGATATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAATGTTAGCCGTTGGACAGTTTACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGATCGCGGATGGTGGAGACACCGTCTTTCAGTTCGGCTGGATCGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACCGCGAGGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTGCTGTGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCAACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAAGATGAAGAATTGGAA (SEQ ID NO: 35)
Parasaccharibacter apium	Пчела медоносная (Apis mellifera)	Кишка	CTACCATGCAAGTCGCACGAAACCTTTCGGGGTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTTAGGAACCTATCTGGAGGTGGGGGATAACATCGGGAAACTGGTGCTAATACCGCATGATGCCTGAGGGCCAAAGGAGAGATCCGCCATTGGAGGGGCCTGCGTTCGATTAGCTAGTTGGTTGGGTAAAGGCTGACCAAGGCGATGATCGATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTCACTAGGGAAGATGATGACGGTACCTAGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATGACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCTGTTTGTACAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGATACGTGCAGACTAGAGTCCGAGAGAGGGTTGTGGAATTCCCAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTGGGAAGAACACCGGTTGCGAAGGCGGCAACCTGGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTAACGCGTTAAGCACACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGGGCTTGCATGGGGAGGCTGTATTCAGAGATGGATATTTCTTCGGACCTCCCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCCATCACGTCTGGGTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGAGGGATGCTACATGGTGACATGGTGCTGATCTCAAAAAACCGTCTCAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGGTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTGACCTTAAGCCGGTGAGCGAACCGCAAGGAACGCAGCCGACCACCGGTTCGGGTTCAGCGACTGGGGGA (SEQ ID NO: 36)
Lactobacillus kunkeei	Пчела медоносная (Apis mellifera)	Кишка	TTCCTTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGGTTCTCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCTAATCATCTGTCCCACCTTAGACGACTAGCTCCTAAAAGGTTACCCCATCGTCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGTGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCCAATCTCTTGGGTTGGCAGAAGATGTCAAGAGCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCACTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGTATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTAACAGACCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTTTCCTCTTCTGTACTCAAGTTTTGTAGTTTCCACTGCACTTCCTCAGTTGAGCTGAGGGCTTTCACAGCAGACTTACAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAAAGTGTTAACAGTTACTCTAACACTTGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATCGTCTTGGTGGGCTTTTATCTCACCAACTAACTAATACGGCGCGGGTCCATCCCAAAGTGATAGCAAAGCCATCTTTCAAGTTGGAACCATGCGGTTCCAACTAATTATGCGGTATTAGCACTTGTTTCCAAATGTTATCCCCCGCTTCGGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGCTCCGAATCCAAAAATCATTTATGCAAGCATAAAATCAATTTGGGAGAACTCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCTCATCTTAA (SEQ ID NO: 37)
Lactobacillus Firm–4	Пчела медоносная (Apis mellifera)	Кишка	ACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGCGGGAAGTCAGGGAAGCCTTCGGGTGGAACTGGTGGAACGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCTAAAGCGGGGGATACCATCTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAAACCCAGCAGTCACATGAGTGCTGGTTGAAAGACGGCTTCGGCTGTCACTTTAGGATGGACCTGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGGAGTAACGGTTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGGATGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAATCCTGTTGTTGAAGAAGAACGGTTGTGAGAGTAACTGCTCATAACGTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGAATGTGAAAGCCCTCAGCTTAACTGAGGAAGAGCATCGGAAACTGAGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTTACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTCCTGCAAGCCTAAGAGATTAGGGGTTCCCTTCGGGGACAGGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAATGAGAAGCGAACTCGCGAGGGGAAGCTGATCTCTGAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC (SEQ ID NO: 38)
Шелкопряд
Энтерококк	Bombyx mori	Кишка	AGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTATCCCACCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAGAAGCTTTAAGAGATTTGCATGACCTCGCGGTCTAGCGACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGTCCCCGAAGGGAAAGCTCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGATACCGTCAGGGGACGTTCAGTTACTAACGTCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGACTTTCGTCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTGGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGTCCATCCATCAGCGACACCCGAAAGCGCCTTTCACTCTTATGCCATGCGGCATAAACTGTTATGCGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCCTCTGATGGGTAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCCTCTTTCCAATTGAGTGCAAGCACTCGGGAGGAAAGAAGCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCT (SEQ ID NO: 39)
Delftia	Bombyx mori	Кишка	CAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCACGAACCCCGCCGTGGTAAGCGCCCTCCTTGCGGTTAGGCTACCTACTTCTGGCGAGACCCGCTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGACTGGTTTTATGGGATTAGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCAACCCTCTGTACCAGCCATTGTATGACGTGTGTAGCCCCACCTATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCTCAACTGAATGTAGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTGCAGGTTCTCTTTCGAGCACGAATCCATCTCTGGAAACTTCCTGCCATGTCAAAGGTGGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTTCGTTACTGAGAAAACTAATTCCCAACAACCAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTACAGGTCCAGGGGATTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCGCATATCTACGCATTTCACTGCTACACGCGGAATTCCATCCCCCTCTACCGTACTCTAGCCATGCAGTCACAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCTGTCTTACATAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTACGGTACCGTCATGGGCCCCCTGTATTAGAAGGAGCTTTTTCGTTCCGTACAAAAGCAGTTTACAACCCGAAGGCCTTCATCCTGCACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGTCGTCCTCTCAGACCAGCTACAGATCGTCGGCTTGGTAAGCTTTTATCCCACCAACTACCTAATCTGCCATCGGCCGCTCCAATCGCGCGAGGCCCGAAGGGCCCCCGCTTTCATCCTCAGATCGTATGCGGTATTAGCTACTCTTTCGAGTAGTTATCCCCCACGACTGGGCACGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGTCAGCGTCCGAAGACCTGTTACCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCTACAGTTCGATCT (SEQ ID NO: 40)
Pelomonas	Bombyx mori	Кишка	ATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGTTAAGCTGACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATATATCGGAACGTGCCCAGTCGTGGGGGATAACTGCTCGAAAGAGCAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGATCGCAAGACCTCGCNNGATTGGAGCGGCCGATATCAGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGCCAACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCGGGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTCAGGGAAGAAAAGGTTCTGGTTAATACCTGGGACTCATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTATGCAAGACAGAGGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCCTTTGTGACTGCATAGCTAGAGTACGGTAGAGGGGGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAATCCCCTGGACCTGTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTTGGGAGGGTTTCTTCTCAGTAACGTANNTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCAGGAATCCTGAAGAGATTTGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCTGGACACAGGTGCTGCATGGCCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGGTCATCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTACACACGTCATACAATGGCCGGGACAGAGGGCTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAACCCGGTCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCTTGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCGGGTTCTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATTACCACGGCAGGGTTCGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCAC (SEQ ID NO: 41)

На любое количество видов бактерий можно целенаправленно воздействовать с помощью композиций или способов, описанных в данном документе. Например, в некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на один вид бактерий. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на по меньшей мере приблизительно любой из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500 или больше различных видов бактерий. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на любой из от приблизительно 1 до приблизительно 5, от приблизительно 5 до приблизительно 10, от приблизительно 10 до приблизительно 20, от приблизительно 20 до приблизительно 50, от приблизительно 50 до приблизительно 100, от приблизительно 100 до приблизительно 200, от приблизительно 200 до приблизительно 500, от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 5 до приблизительно 20 или от приблизительно 10 до приблизительно 100 различных видов бактерий. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на по меньшей мере приблизительно любые из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или больше типов, классов, порядков, семейств или родов бактерий.

В некоторых случаях модулирующее средство может увеличивать популяцию одной или нескольких бактерий (например, патогенных бактерий, бактерий, продуцирующих токсин) на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может уменьшать популяцию одной или нескольких бактерий (например, симбиотических бактерий, бактерий, расщепляющих пестициды, например, бактерии, которая расщепляет пестицид, приведенный в таблице 12) на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может уничтожать популяцию бактерии (например, симбиотической бактерии, бактерии, расщепляющей пестициды) в организме хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство может повышать уровень одной или нескольких патогенных бактерий на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина и/или может снижать уровень одной или нескольких симбиотических бактерий на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях модулирующее средство может изменять разнообразие бактерий и/или состав бактерий хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство может увеличивать разнообразие бактерий в организме хозяина относительно исходного разнообразия на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может уменьшать разнообразие бактерий в организме хозяина относительно исходного разнообразия на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию, активность, рост и/или деление одной или нескольких бактериальных клеток. Например, модулирующее средство может изменять экспрессию одного или нескольких генов в бактерии. В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию одного или нескольких белков в бактерии. В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию одной или нескольких клеточных структур (например, клеточной стенки, внешней или внутренней мембраны) в бактерии. В некоторых случаях модулирующее средство может уничтожать (например, лизировать) бактерию.

Бактерия–мишень может обитать в одной или нескольких частях организма насекомого. Кроме того, бактерия–мишень может быть внутриклеточной или внеклеточной. В некоторых случаях бактерии обитают в одной или нескольких частях кишки хозяина, в том числе, например, в передней кишке, средней кишке и/или задней кишке. В некоторых случаях бактерии обитают в виде внутриклеточных бактерий в клетке насекомого–хозяина. В некоторых случаях бактерии обитают в бактериоците насекомого–хозяина.

Изменения в отношении популяций бактерий в организме хозяина могут быть определены с помощью любых способов, известных в данной области техники, таких как микроматричный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в реальном времени, проточная цитометрия, флуоресцентная микроскопия, трансмиссионная электронная микроскопия, флуоресцентная гибридизация in situ (например, FISH), спектрофотометрия, масс–спектрометрия с матрично–активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI–MS) и секвенирование ДНК. В некоторых случаях образец от хозяина, обработанного модулирующим средством, секвенируют (например, с помощью метагеномного секвенирования 16S рРНК или рДНК) для определения микробиоты хозяина после доставки или введения модулирующего средства. В некоторых случаях образец от хозяина, который не получал модулирующее средство, также секвенируют для получения эталона.

Грибы

Иллюстративные грибы, на которые можно целенаправленно воздействовать в соответствии со способами и композициями, предусмотренными в данном документе, включают в себя без ограничения Amylostereum areolatum, Epichloe spp, Pichia pinus, Hansenula capsulate, Daldinia decipien, Ceratocytis spp, Ophiostoma spp и Attamyces bromatificus. Неограничивающие примеры дрожжевых и дрожжеподобных симбионтов, обнаруживаемых в организмах насекомых, включают в себя Candida, Metschnikowia, Debaryomyces, Scheffersomyces shehatae и Scheffersomyces stipites, Starmerella, Pichia, Trichosporon, Cryptococcus, Pseudozyma, а также дрожжеподобные симбионты из подтипа Pezizomycotina (например, Symbiotaphrina bucneri и Symbiotaphrina kochii). Неограничивающие примеры дрожжевых грибов, на которые можно целенаправленно воздействовать с помощью способов и композиций согласно данному документу, приведены в таблице 2.

Таблица 2. Примеры дрожжевых грибов в организмах насекомых

Вид насекомого	Отряд: семейство	Местоположение дрожжевых грибов (вид)
Stegobium paniceum	Coleoptera: Anobiidae	Мицетомы
(= Sitodrepa panicea)		(Saccharomyces)
		Слепая кишка (Torulopsis buchnerii)
		Мицетома между передней и средней кишкой
		Мицетомы (Symbiotaphrina buchnerii)
		Мицетомы и пищеварительная трубка (Torulopsis buchnerii)
		Слепая кишка (Symbiotaphrina buchnerii)
Lasioderma serricorne	Coleoptera: Anobiidae	Мицетома между передней и средней кишкой
		(Symbiotaphrina kochii)
Ernobius abietis	Coleoptera: Anobiidae	Мицетомы (Torulopsis karawaiewii)
		(Candida karawaiewii)
Ernobius mollis	Coleoptera: Anobiidae	Мицетомы (Torulopsis ernobii)
		(Candida ernobii)
Hemicoelus gibbicollis	Coleoptera: Anobiidae	Мицетомы личинок
Xestobium plumbeum	Coleoptera: Anobiidae	Мицетомы (Torulopsis xestobii)
		(Candida xestobii)
Criocephalus rusticus	Coleoptera: Cerambycidae	Мицетомы
Phoracantha semipunctata	Coleoptera: Cerambycidae	Пищеварительный канал (Candida guilliermondii, C. tenuis)
		Слепая кишка около средней кишки (Candida guilliermondii)
Harpium inquisitor	Coleoptera: Cerambycidae	Мицетомы (Candida rhagii)
Harpium mordax H. sycophanta	Coleoptera: Cerambycidae	Слепая кишка около средней кишки (Candida tenuis)
Gaurotes virginea	Coleoptera: Cerambycidae	Слепая кишка около средней кишки (Candida rhagii)
Leptura rubra	Coleoptera: Cerambycidae	Слепая кишка около средней кишки (Candida tenuis)
		Слепая кишка около средней кишки (Candida parapsilosis)
Leptura maculicornis	Coleoptera: Cerambycidae	Слепая кишка около средней кишки (Candida parapsilosis)
L. cerambyciformis
Leptura sanguinolenta	Coleoptera: Cerambycidae	Слепая кишка около средней кишки (Candida sp.)
Rhagium bifasciatum	Coleoptera: Cerambycidae	Слепая кишка около средней кишки (Candida tenuis)
Rhagium inquisitor	Coleoptera: Cerambycidae	Слепая кишка около средней кишки (Candida guilliermondii)
Rhagium mordax	Coleoptera: Cerambycidae	Слепая кишка около средней кишки (Candida)
Carpophilus hemipterus	Coleoptera: Nitidulidae	Кишечный тракт (10 видов дрожжевых грибов)
Odontotaenius disjunctus	Coleoptera: Passalidae	Задняя кишка (Enteroramus dimorphus)
Odontotaenius disjunctus	Coleoptera: Passalidae	Кишка (Pichia stipitis, P. segobiensis, Candida shehatae)
Verres sternbergianus		(C. ergatensis)
Scarabaeus semipunctatus	Coleoptera: Scarabaeidae	Пищеварительный тракт (10 видов дрожжевых грибов)
Chironitis furcifer
Неизвестный вид	Coleoptera: Scarabaeidae	Кишка (Trichosporon cutaneum)
Dendroctonus и Ips spp.	Coleoptera: Scolytidae	Пищеварительный канал (13 видов дрожжевых грибов)
Dendroctonus frontalis	Coleoptera: Scolytidae	Средняя кишка (Candida sp.)
Ips sexdentatus	Coleoptera: Scolytidae	Пищеварительный тракт (Pichia bovis, P. rhodanensis)
		Hansenula holstii (Candida rhagii)
		Пищеварительный тракт
		(Candida pulcherina)
Ips typographus	Coleoptera: Scolytidae	Пищеварительный канал
		Пищеварительный тракт (Hansenula capsulata, Candida parapsilosis)
		Кишка и гомогенаты жуков (Hansenula holstii, H. capsulata, Candida diddensii, C. mohschtana, C. nitratophila, Cryptococcus albidus, C. laurentii)
Trypodendron lineatum	Coleoptera: Scolytidae	Не определено
Xyloterinus politus	Coleoptera: Scolytidae	Голова, грудь, брюшко (Candida, Pichia, Saccharomycopsis)
Periplaneta americana	Dictyoptera: Blattidae	Гемоцель (Candida sp. nov.)
Blatta orientalis	Dictyoptera: Blattidae	Кишечный тракт (Kluyveromyces blattae)
Blatella germanica	Dictyoptera: Blattellidae	Гемоцель
Cryptocercus punctulatus	Dictyoptera: Cryptocercidae	Задняя кишка (1 вид дрожжевых грибов)
Philophylla heraclei	Diptera: Tephritidae	Гемоцель
Aedes (4 вида)	Diptera: Culicidae	Внутренняя микрофлора (9 родов дрожжевых грибов)
Drosophila pseudoobscura	Diptera: Drosophilidae	Пищеварительный канал (24 вида дрожжевых грибов)
Drosophila (5 видов)	Diptera: Drosophilidae	Зоб (42 вида дрожжевых грибов)
Drosophila melanogaster	Diptera: Drosophilidae	Зоб (8 видов дрожжевых грибов)
Drosophila (4 вида)	Diptera: Drosophilidae	Зоб (7 видов дрожжевых грибов)
Drosophila (6 видов)	Diptera: Drosophilidae	Кишка личинок (17 видов дрожжевых грибов)
Drosophila (20 видов)	Diptera: Drosophilidae	Зоб (20 видов дрожжевых грибов)
Drosophila (8 групп видов)	Diptera: Drosophilidae	Зоб (Kloeckera, Candida, Kluyveromyces)
Drosophila serido	Diptera: Drosophilidae	Зоб (18 видов дрожжевых грибов)
Drosophila (6 видов)	Diptera: Drosophilidae	Эпителий кишечника (Coccidiascus legeri)
Protaxymia melanoptera	Diptera	Неизвестно (Candida, Cryptococcus, Sporoblomyces)
Astegopteryx styraci	Homoptera: Aphididae	Гемоцель и жировое тело
Tuberaphis sp.	Homoptera: Aphididae	Срезы тканей
Hamiltonaphis styraci
Glyphinaphis bambusae
Cerataphis sp.
Hamiltonaphis styraci	Homoptera: Aphididae	Гемоцель брюшка
Cofana unimaculata	Homoptera: Cicadellidae	Жировое тело
Leofa unicolor	Homoptera: Cicadellidae	Жировое тело
Lecaniines и т.д.	Homoptera: Coccoidea	Гемолимфа, жировая ткань и т.д.
Lecanium sp.	Homoptera: Coccidae	Гемолимфа, жировая ткань
Ceroplastes (4 вида)	Homoptera: Coccidae	Мазки крови
Laodelphax striatellus	Homoptera: Delphacidae	Жировое тело
		Яйца
		Яйца (Candida)
Nilaparvata lugens	Homoptera: Delphacidae	Жировое тело
		Яйца (2 неидентифицированных вида дрожжевых грибов)
		Яйца, нимфы (Candida)
		Яйца (7 неидентифицированных видов дрожжевых грибов)
		Яйца (Candida)
Nisia nervosa	Homoptera: Delphacidae	Жировое тело
Nisia grandiceps
Perkinsiella spp.
Sardia rostrata
Sogatella furcifera
Sogatodes orizicola	Homoptera: Delphacidae	Жировое тело
Amrasca devastans	Homoptera: Jassidae	Яйца, мицетомы, гемолимфа
Tachardina lobata	Homoptera: Kerriidae	Мазки крови (Torulopsis)
Laccifer (=Lakshadia) sp.	Homoptera: Kerriidae	Мазки крови (Torula variabilis)
Comperia merceti	Hymenoptera: Encyrtidae	Гемолимфа, кишка, ядовитая железа
Solenopsis invicta	Hymenoptera: Formicidae	Гемолимфа (Myrmecomyces annellisae)
S. quinquecuspis
Solenopsis invicta	Hymenoptera: Formicidae	Личинки на стадии четвертого возраста (Candida parapsilosis, Yarrowia lipolytica)
		Кишка и гемолимфа (Candida parapsilosis, C. lipolytica, C. guillermondii, C. rugosa, Debaryomyces hansenii)
Apis mellifera	Hymenoptera: Apidae	Пищеварительный тракт (Torulopsis sp.)
		Кишечный тракт (Torulopsis apicola)
		Пищеварительный тракт (8 видов дрожжевых грибов)
		Содержимое кишечника (12 видов дрожжевых грибов)
		Содержимое кишечника (7 видов дрожжевых грибов)
		Кишечник (14 видов дрожжевых грибов)
		Кишечный тракт (Pichia melissophila)
		Кишечный тракт (7 видов дрожжевых грибов)
		Пищеварительный канал (Hansenula silvicola)
		Зоб и кишка (13 видов дрожжевых грибов)
Apis mellifera	Hymenoptera: Apidae	Средняя кишка (9 родов дрожжевых грибов)
Anthophora occidentalis	Hymenoptera: Anthophoridae
Nomia melanderi	Hymenoptera: Halictidae
Halictus rubicundus	Hymenoptera: Halictidae
Megachile rotundata	Hymenoptera: Megachilidae

На любое количество видов грибов можно целенаправленно воздействовать с помощью композиций или способов, описанных в данном документе. Например, в некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на один вид грибов. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на по меньшей мере приблизительно любой из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500 или больше различных видов грибов. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на любой из от приблизительно 1 до приблизительно 5, от приблизительно 5 до приблизительно 10, от приблизительно 10 до приблизительно 20, от приблизительно 20 до приблизительно 50, от приблизительно 50 до приблизительно 100, от приблизительно 100 до приблизительно 200, от приблизительно 200 до приблизительно 500, от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 5 до приблизительно 20 или от приблизительно 10 до приблизительно 100 различных видов грибов. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на по меньшей мере приблизительно любые из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или больше типов, классов, порядков, семейств или родов грибов.

В некоторых случаях модулирующее средство может увеличивать популяцию одного или нескольких грибов (например, патогенных или паразитических грибов) на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может уменьшать популяцию одного или нескольких грибов (например, симбиотических грибов) на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может уничтожать популяцию грибов (например, симбиотических грибов) в организме хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство может повышать уровень одного или нескольких симбиотических грибов на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина и/или может снижать уровень одного или нескольких симбиотических грибов на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях модулирующее средство может изменять разнообразие грибов и/или состав грибов хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство может повышать разнообразие грибов в организме хозяина относительно исходного разнообразия на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может снижать разнообразие грибов в организме хозяина относительно исходного разнообразия на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше по сравнению с организмом–хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию, активность, рост и/или деление одного или нескольких грибов. Например, модулирующее средство может изменять экспрессию одного или нескольких генов в грибе. В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию одного или нескольких белков в грибе. В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию одного или нескольких клеточных компонентов в грибе. В некоторых случаях модулирующее средство может уничтожать гриб.

Кроме того, гриб–мишень может обитать в одной или нескольких частях организма насекомого. В некоторых случаях гриб обитает в одной или нескольких частях кишки хозяина, в том числе, например, в передней кишке, средней кишке и/или задней кишке. В некоторых случаях гриб живет внеклеточно в гемолимфе, жировых телах или в специализированных структурах в организме хозяина.

Изменения в отношении популяции грибов в организме хозяина могут быть определены с помощью любых способов, известных в данной области техники, таких как микроматричный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в реальном времени, проточная цитометрия, флуоресцентная микроскопия, трансмиссионная электронная микроскопия, флуоресцентная гибридизация in situ (например, FISH), спектрофотометрия, масс–спектрометрия с матрично–активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI–MS) и секвенирование ДНК. В некоторых случаях образец от хозяина, обработанного модулирующим средством, секвенируют (например, с помощью метагеномного секвенирования) для определения микробиоты хозяина после доставки или введения модулирующего средства. В некоторых случаях образец от хозяина, который не получал модулирующее средство, также секвенируют для получения эталона.

Модулирующие средства

Модулирующее средство из способов и композиций, предусмотренных в данном документе, может включать в себя фаг, полипептид, малую молекулу, антибиотик, вторичный метаболит, бактерию, гриб или любую их комбинацию.

Фаг

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя фаг (например, литический фаг или нелитический фаг). В некоторых случаях эффективная концентрация любого фага, описанного в данном документе, может изменять уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов (описанных в данном документе, например, Buchnera spp.), обитающих в организме хозяина, описанного в данном документе (например, тли), при этом модулирование приводит к снижению приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе). В некоторых случаях модулирующее средство включает в себя по меньшей мере один фаг, выбранный из порядков Tectiviridae, Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Caudovirales, Lipothrixviridae, Rudiviridae или Ligamenvirales. В некоторых случаях композиция содержит по меньшей мере один фаг, выбранный из семейства Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Ampullaviridae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fuselloviridae, Gluboloviridae, Guttaviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae и Tectiviridae. Дополнительные неограничивающие примеры фагов, пригодных в способах и композициях, приведены в таблице 3.

Таблица 3. Примеры фагов и бактерий–мишеней

Фаг и № доступа	Бактерия–мишень	Хозяин–мишень
SA1 (NC_027991), phiP68 (NC_004679)	Staphylococcus sp.	Семейство Apidae
WO (AB036666.1)	Wolbachia sp.	Aedes aegypti; Drosophila melanogaster; Plasmodium sp; Teleogryllus taiwanemma; Bombyx mori
KL1 (NC_018278), BcepNazgul (NC_005091) PhiE125 (NC_003309)	Burkholderia sp.	Riptortus sp.; Pyrrhocoris apterus.
Fern (NC_028851), Xenia (NC_028837), HB10c2 (NC_028758)	Paenibacillus larvae	Шмели: Bombus sp.; медоносные пчелы: A. mellifera
CP2 (NC_020205), XP10 (NC_004902), XP15 (NC_007024), phiL7 (NC_012742)	Xanthomonas sp.	Plebeina denoiti; семейство Apidae; Apis mellifera; семейство Drosophilidae и семейство Chloropidae
PP1 (NC_019542), PM1 (NC_023865)	Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum	Семейство Apidae
ΦRSA1 (NC_009382), ΦRSB1 (NC_011201), ΦRSL1 (NC_010811), RSM1 (NC_008574)	Ralstonia solanacearum	Bombyx mori
SF1 (NC_028807)	Streptomyces scabies	Philantus sp.; Trachypus sp
ECML–4 (NC_025446), ECML–117 (NC_025441), ECML–134 (NC_025449)	Escherichia coli	Семейство Apidae; Varroa destructor
SSP5 (JX274646.1), SSP6 (NC_004831), SFP10 (NC_016073), F18SE (NC_028698)	Salmonella sp.	Семейство Drosophilidae
(NC_001416), Bcp1 (NC_024137)	Bacillus sp.	Непарный шелкопряд; Lymantria dispar; Varroa destructor
Phi1 (NC_009821)	Enterococcus sp.	Schistocerca gragaria
ΦKMV (NC_005045), ΦEL(AJ697969.1), ΦKZ (NC_004629)	Pseudomonas sp.	Lymantria dispar; семейство Apidae
A2 (NC_004112), phig1e (NC_004305)	Lactobacillus sp.	Семейство Apidae; семейство Drosophila; Varroa destructor
KLPN1 (NC_028760)	Klebsiella sp.	C. capitata
vB_AbaM_Acibel004 (NC_025462), vB_AbaP_Acibel007 (NC_025457)	Acinetobacter sp.	Schistocerca gragaria

В некоторых случаях модулирующее средство включает в себя литический фаг. Таким образом, после доставки литического фага в бактериальную клетку, обитающую в организме хозяина, фаг вызывает лизис в бактериальной клетке–мишени. В некоторых случаях литический фаг целенаправленно воздействует на бактерию, обитающую в организме насекомого–хозяина, и уничтожает ее со снижением приспособленности хозяина. В качестве альтернативы или дополнительно, фаг модулирующего средства может представлять собой нелитический фаг (также называемый лизогенным или умеренным фагом). Таким образом, после доставки нелитического фага в бактериальную клетку, обитающую в организме хозяина, бактериальная клетка может оставаться жизнеспособной и способной стабильно поддерживать экспрессию генов, кодируемых в геноме фага. В некоторых случаях нелитический фаг применяют для изменения экспрессии генов в бактерии, обитающей в организме насекомого–хозяина, со снижением приспособленности хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство включает в себя смесь литического и нелитического фага.

В определенных случаях фаг представляет собой встречающийся в природе фаг. Например, встречающийся в природе фаг может быть выделен из образца окружающей среды со смесью различных фагов. Встречающийся в природе фаг может быть выделен с помощью способов, известных в данной области техники для выделения, очистки и идентификации фага, который целенаправленно воздействует на определенный микроорганизм (например, бактериальный эндосимбионт в организме насекомого–хозяина, например, Buchnera spp. у тлей). В качестве альтернативы, в определенных случаях фаг может быть сконструирован на основе встречающегося в природе фага.

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя фаг с узким или широким спектром бактерий–мишеней. В некоторых случаях фаг имеет узкий спектр бактерий–мишеней. В некоторых случаях фаг представляет собой промискуитетный фаг с широким спектром бактерий–мишеней. Например, промискуитетный фаг может целенаправленно воздействовать на по меньшей мере приблизительно любую из 5, 10, 20, 30, 40, 50 или больше бактерий, обитающих в организме хозяина. Фаг с узким спектром бактерий–мишеней может целенаправленно воздействовать на конкретный штамм бактерий в организме хозяина без отрицательного влияния на другую, например, не являющуюся мишенью, бактерию в организме хозяина. Например, фаг может целенаправленно воздействовать на не более чем приблизительно любую из 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 2 или 1 бактерии, обитающей в организме хозяина.

Композиции, описанные в данном документе, могут содержать любое количество фагов, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 или больше фагов. В некоторых случаях композиция содержит фаг из одного или нескольких семейств (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше фагов), одного или нескольких порядков (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше фагов) или одного или нескольких видов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 или больше фагов). Композиции, содержащие один или несколько фагов, также называются в данном документе "коктейлями фагов". Коктейли фагов являются пригодными, поскольку они обеспечивают целенаправленное воздействие на более широкий спектр хозяев бактерий. Кроме того, они обеспечивают целенаправленное воздействие на каждый штамм (т. е. подвид) бактерий многочисленных ортогональных фагов, тем самым предупреждая или значительно задерживая появление устойчивости. В некоторых случаях коктейль содержит несколько фагов, целенаправленно воздействующих на один вид бактерий. В некоторых случаях коктейль содержит несколько фагов, целенаправленно воздействующих на несколько видов бактерий. В некоторых случаях в однофаговом "коктейле" содержится один промискуитетный фаг (т. е. фаг с широким спектром хозяев), целенаправленно воздействующий на многие штаммы в пределах вида.

Подходящие концентрации фага в модулирующем средстве, описанном в данном документе, зависят от таких факторов, как эффективность, показатель выживаемости, переносимость фага, количество различных фагов и/или типы лизина в композициях, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях фаг находится в жидком или твердом составе. В некоторых случаях концентрация каждого фага в любой из композиций, описанных в данном документе, имеет по меньшей мере приблизительно любое значение из 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰ или больше БОЕ/мл. В некоторых случаях концентрация каждого фага в любой из композиций, описанных в данном документе, имеет не более чем приблизительно любое значение из 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ БОЕ/мл. В некоторых случаях концентрация каждого фага в композиции имеет любое значение из от приблизительно 10² до приблизительно 10³, от приблизительно 10³ до приблизительно 10⁴, от приблизительно 10⁴ до приблизительно 10⁵, от приблизительно 10⁵ до приблизительно 10⁶, от приблизительно 10⁷ до приблизительно 10⁸, от приблизительно 10⁸ до приблизительно 10⁹, от приблизительно 10² до приблизительно 10⁴, от приблизительно 10⁴ до приблизительно 10⁶, от приблизительно 10⁶ до приблизительно 10⁹ или от приблизительно 10³ до приблизительно 10⁸ БОЕ/мл. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа фагов, то концентрация каждого типа фагов может быть одной и той же или разной. Например, в некоторых случаях концентрация одного фага в коктейле составляет приблизительно 10⁸ БОЕ/мл, и концентрация второго фага в коктейле составляет приблизительно 10⁶ БОЕ/мл.

Модулирующее средство, включающее в себя фаг, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином–мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации фага внутри хозяина–мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации фага внутри кишки хозяина–мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации фага внутри бактериоцита хозяина–мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина–мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина–мишени.

Как проиллюстрировано в примерах 1–3 и 25, фаги (например, один или несколько встречающихся в природе фагов) можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию, такую как Buchnera spp., в организме насекомого–хозяина, как, например, тлей, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе).

Полипептиды

Многочисленные полипептиды (например, бактериоцин, бактериоцин R–типа, C–богатый пептид клубеньков, противомикробный пептид, лизин или регуляторный пептид бактериоцитов) можно применять в композициях и способах, описанных в данном документе. В некоторых случаях эффективная концентрация любого пептида или полипептида, описанного в данном документе, может изменять уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов (описанных в данном документе, например, Buchnera spp.), обитающих в организме хозяина (например, тли), при этом изменение приводит к снижению приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе). Полипептиды, включенные в данный документ, могут включать в себя встречающиеся в природе полипептиды или рекомбинантно получаемые варианты. Например, полипептид может представлять собой функционально активный вариант любого из полипептидов, описанных в данном документе, на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичный, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности полипептида, описанного в данном документе, или встречающегося в природе полипептида.

Модулирующее средство, включающее в себя полипептид, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином–мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации внутри хозяина–мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации внутри кишки хозяина–мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации внутри бактериоцита хозяина–мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина–мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина–мишени.

Полипептидные модулирующие средства, обсуждаемые далее в данном документе, а именно бактериоцины, лизины, противомикробные пептиды, C–богатые пептиды клубеньков и регуляторные пептиды бактериоцитов, можно применять для изменения уровня, активности или метаболизма микроорганизмов–мишеней (например, Buchnera), как указано в разделе касательно снижения приспособленности насекомых (например, тлей).

Бактериоцины

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя бактериоцин. В некоторых случаях бактериоцин продуцируется естественным образом грамположительными бактериями, такими как Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, Staphylococcus или молочнокислые бактерии (LAB, такие как Lactococcus lactis). В некоторых случаях бактериоцин продуцируется естественным образом грамотрицательными бактериями, такими как Hafnia alvei, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonia, Enterobacter cloacae, Serratia plymithicum, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum или Escherichia coli. Иллюстративные бактериоцины включают в себя без ограничения антибиотики LAB I–IV класса (такие как лантибиотики), колицины, микроцины и пиоцины. Неограничивающие примеры бактериоцинов приведены в таблице 4.

Таблица 4. Примеры бактериоцинов

Класс	Название	Продуцент	Мишени	Последовательность
Класс I	Низин	Lactococcus lactis	Активный в отношении грамположительных бактерий: Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Listeria, Clostridium	ITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSK (SEQ ID NO: 42)
	Эпидермин	Staphylococcus epidermis	Грамположительные бактерии	IASKFICTPGCAKTGSFNSYCC (SEQ ID NO: 43)
Класс II
Класс II a	Педиоцин PA–1	Pediococcus acidilactici	Pediococci, Lactobacilli, Leuconostoc, Brochothrix thermosphacta, Propionibacteria, Bacilli, Enterococci, Staphylococci, Listeria clostridia, Listeria monocytogenes, Listeria innocua	KYYGNGVTCG KHSCSVDWGK ATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC (SEQ ID NO: 44)
Класс II b	Энтероцин P	Enterococcus faecium	Lactobacillus sakei, Enterococcus faecium	ATRSYGNGVYCNNSKCWVNWGEAKENIAGIVISGWASGLAGMGH (SEQ ID NO: 45)
Класс II c	Лактококцин G	Streptococcus lactis	Грамположительные бактерии	GTWDDIGQGIGRVAYWVGKAMGNMSDVNQASRINRKKKH (SEQ ID NO: 46)
Класс II d	Лактацин–F	Lactobacillus johnsonii	Lactobacilli, Enterococcus faecalis	NRWGDTVLSAASGAGTGIKACKSFGPWGMAICGVGGAAIGGYFGYTHN (SEQ ID NO: 47)
Класс III
Класс III a	Энтероцин AS–48	Enterococcus faecalis	Широкий спектр: грамположительные и грамотрицательные бактерии	MAKEFGIPAAVAGTVLNVVEAGGWVTTIVSILTAVGSGGLSLLAAAGRESIKAYLKKEIKKKGKRAVIAW (SEQ ID NO: 48)
Класс III b	Ауреоцин A70	Staphylococcus aureus	Широкий спектр: грамположительные и грамотрицательные бактерии	MSWLNFLKYIAKYGKKAVSAAWKYKGKVLEWLNVGPTLEWVWQKLKKIAGL (SEQ ID NO: 49)
Класс IV	Гарвицин A	Lactococcus garvieae	Широкий спектр: грамположительные и грамотрицательные бактерии	IGGALGNALNGLGTWANMMNGGGFVNQWQVYANKGKINQYRPY (SEQ ID NO: 50)
Неклассифицированные	Колицин V	Escherichia coli	Активный в отношении Escherichia coli (а также близкородственных бактерий), Enterobacteriaceae	MRTLTLNELDSVSGGASGRDIAMAIGTLSGQFVAGGIGAAAGGVAGGAIYDYASTHKPNPAMSPSGLGGTIKQKPEGIPSEAWNYAAGRLCNWSPNNLSDVCL (SEQ ID NO: 51)

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой колицин, пиоцин или микроцин, продуцируемые грамотрицательными бактериями. В некоторых случаях бактериоцин представляет собой колицин. Колицин может представлять собой колицин группы A (например, использует систему Tol для проникновения через внешнюю мембрану бактерии–мишени) или колицин группы B (например, использует систему Ton для проникновения через внешнюю мембрану бактерии–мишени). В некоторых случаях бактериоцин представляет собой микроцин. Микроцин может представлять собой микроцин класса I (например, < 5 кДа, имеет посттрансляционные модификации) или микроцин класса II (например, 5–10 кДа, с посттрансляционными модификациями или без них). В некоторых случаях микроцин класса II представляет собой микроцин класса IIa (например, требует более одного гена для синтеза и сборки функциональных пептидов) или микроцин класса IIb (например, линейные пептиды с посттрансляционными модификациями на С–конце или без них). В некоторых случаях бактериоцин представляет собой пиоцин. В некоторых случаях пиоцин представляет собой R–пиоцин, F–пиоцин или S–пиоцин.

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой бактериоцин класса I, класса II, класса III или класса IV, продуцируемый грамположительными бактериями. В некоторых случаях модулирующее средство включает в себя бактериоцин класса I (например, антибиотики, содержащие лантионин (лантибиотики), продуцируемые грамположительными бактериями). Бактериоцины класса I или лантибиотики могут представлять собой пептид с низкой молекулярной массой (например, менее чем приблизительно 5 кДа) и могут иметь аминокислотные остатки с посттрансляционными модификациями (например, лантионин, β–метиллантионин или дегидрированные аминокислоты).

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой бактериоцин класса II (например, соединения, не являющиеся лантибиотиками, продуцируемые грамположительными бактериями). Многие из них являются положительно заряженными не содержащими лантионина пептидами, которые, в отличие от лантибиотиков, не подвергаются обширной посттрансляционной модификации. Бактериоцин класса II может принадлежать к одному из следующих подклассов: "педиоциноподобные" бактериоцины (например, педиоцин PA–1 и карнобактериоцин X (класс IIa)); двухпептидные бактериоцины (например, лактацин F и ABP–118 (класс IIb)); круговые бактериоцины (например, карноциклин А и энтероцин AS–48 (класс IIc)) или немодифицированные линейные непедиоциноподобные бактериоцины (например, эпидермицин NI01 и лактококцин A (класс IId)).

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой бактериоцин класса III (например, продуцируемый грамположительными бактериями). Бактериоцины класса III могут иметь молекулярную массу более 10 кДа и могут представлять собой термонестабильные белки. Бактериоцины класса III могут быть дополнительно подразделены на бактериоцины группы IIIA и группы IIIB. Бактериоцины группы IIIA включают в себя бактериолитические ферменты, которые уничтожают восприимчивые штаммы посредством лизиса клеточной стенки, такие как энтеролизин А. Бактериоцины группы IIIB включают в себя нелитические белки, такие как казеицин 80, гельветицин J и лактацин B.

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой бактериоцин класса IV (например, продуцируемый грамположительными бактериями). Бактериоцины класса IV представляют собой группу сложных белков, ассоциированных с другими липидными или углеводными фрагментами, которые, по–видимому, требуются для активности. Они являются относительно гидрофобными и термостабильными. Примерами бактериоцинов класса IV являются лейконоцин S, лактоцин 27 и лактоцин S.

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой бактериоцин R–типа. Бактериоцины R–типа представляют собой сократительные бактериоцидные белковые комплексы. Некоторые бактериоцины R–типа имеют сократительную структуру, подобную отростку фага. C–концевая область белка нити отростка фага определяет специфичность связывания с мишенью. Они могут прикрепляться к клеткам–мишеням посредством белка, связывающегося с рецептором, например, нити отростка. За прикреплением следует сокращение наружного чехла и введение сердцевины через оболочку бактерии–мишени. Проникновение сердцевины приводит к быстрой деполяризации потенциала клеточной мембраны и мгновенной гибели клетки. Контакт с одной частицей бактериоцина R–типа может приводить к гибели клетки. Бактериоцин R–типа, например, может быть термолабильным, умеренно кислотостойким, устойчивым к трипсину, способным осаждаться в результате центрифугирования, быть различимым при использовании электронной микроскопии или обладать комбинацией этих свойств. Другие бактериоцины R–типа могут представлять собой сложные молекулы, включающие в себя многочисленные белки, полипептиды или субъединицы, и могут напоминать структуру отростка бактериофагов семейства Myoviridae. У встречающихся в природе бактериоцинов R–типа структуры субъединиц могут кодироваться бактериальным геномом, таким как геном C. difficile или P. aeruginosa, и образовывать бактериоцины R–типа, которые выступают в качестве природной защиты против других бактерий. В некоторых случаях бактериоцин R–типа представляет собой пиоцин. В некоторых случаях пиоцин представляет собой R–пиоцин, F–пиоцин или S–пиоцин.

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой функционально активный вариант бактериоцинов, описанных в данном документе. В некоторых случаях вариант бактериоцина является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности бактериоцина, описанного в данном документе, или встречающегося в природе бактериоцина.

В некоторых случаях бактериоцин можно создавать с помощью биоинженерии в соответствии со стандартными способами для модулирования его биологической активности, например, повышения, или снижения, или регулирования, или для определения его микроорганизмов–мишеней. В других случаях бактериоцин продуцируется трансляционным аппаратом (например, рибосомой и т. д.) микробной клетки. В некоторых случаях бактериоцин синтезируют химическим путем. Некоторые бактериоцины могут образовываться из полипептидного предшественника. Полипептидный предшественник может подвергаться расщеплению (например, процессингу под действием протеазы) с образованием самого полипептида бактериоцина. Таким образом, в некоторых случаях бактериоцин продуцируется из полипептида–предшественника. В некоторых других случаях бактериоцин включает в себя полипептид, который подвергся посттрансляционным модификациям, например, расщеплению или добавлению одной или нескольких функциональных групп.

Бактериоцины, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) бактериоцинов, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 бактериоцина, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 или больше бактериоцинов. Подходящие концентрации каждого бактериоцина в композициях, описанных в данном документе, зависят от таких факторов, как эффективность, стабильность бактериоцина, количество различных типов бактериоцина в композициях, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях концентрация каждого бактериоцина в жидкой композиции составляет от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых случаях концентрация каждого бактериоцина в твердой композиции составляет от приблизительно 0,01 нг/г до приблизительно 100 мг/г. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа бактериоцинов, то концентрация каждого типа бактериоцинов может быть одной и той же или разной. В некоторых случаях бактериоцин предусмотрен в композиции, содержащей бактериальную клетку, которая секретирует бактериоцин. В некоторых случаях бактериоцин предусмотрен в композиции, содержащей полипептид (например, полипептид, выделенный из бактериальной клетки).

Бактериоцины могут нейтрализовать (например, уничтожать) по меньшей мере один микроорганизм, отличный от отдельной бактериальной клетки, в которой полипептид образуется, в том числе клетки, клонально родственные бактериальной клетке, и другие микробные клетки. Таким образом, бактериальная клетка может проявлять цитотоксические или ингибирующие рост эффекты в отношении множества микроорганизмов посредством секреции бактериоцинов. В некоторых случаях бактериоцин целенаправленно воздействует на один или несколько видов бактерий, обитающих в организме хозяина, и уничтожает их посредством образования пор в цитоплазматической мембране, разрушения клеточной стенки (например, активности пептидогликаназы) или активности нуклеазы (например, активности ДНКазы, активности 16S рРНКазы или активности тРНКазы).

В некоторых случаях бактериоцин характеризуется нейтрализующей активностью. Нейтрализующая активность бактериоцинов может включать в себя без ограничения остановку размножения микроорганизмов или цитотоксичность. Некоторые бактериоцины характеризуются цитотоксической активностью, и, таким образом, могут уничтожать микроорганизмы, например, бактерии, дрожжевые грибы, водоросли и т. п. Некоторые бактериоцины могут ингибировать размножение микроорганизмов, например, бактерий, дрожжевых грибов, водорослей и т. п., например, посредством остановки клеточного цикла.

В некоторых случаях бактериоцин характеризуется уничтожающей активностью. Механизм уничтожения у бактериоцинов является специфичным для каждой группы бактериоцинов. В некоторых случаях бактериоцин характеризуется биологической активностью узкого спектра. Бактериоцины известны своей очень высокой активностью в отношении своих штаммов–мишеней. Активность некоторых бактериоцинов ограничена штаммами, которые являются близкородственными по отношению к штамму–продуценту бактериоцина (биологическая активность узкого спектра). В некоторых случаях бактериоцин характеризуется биологической активностью широкого спектра в отношении широкого круга родов.

В некоторых случаях бактериоцины взаимодействуют с рецепторной молекулой или стыковочной молекулой на клеточной мембране бактерии–мишени. Например, низин является крайне активным в отношении своих штаммов бактерий–мишеней, демонстрируя противомикробную активность даже в одноразрядной наномолярной концентрации. Было показано, что молекула низина связывается с липидом II, который является основным переносчиком субъединиц пептидогликанов из цитоплазмы в клеточную стенку.

В некоторых случаях бактериоцин характеризуется противогрибковой активностью. Был идентифицирован ряд бактериоцинов с противодрожжевой или противогрибковой активностью. Например, было показано, что бактериоцины из Bacillus характеризуются нейтрализующей активностью в отношении некоторых штаммов дрожжевых грибов (см., например, Adetunji and Olaoye, Malaysian Journal of Microbiology 9:130–13, 2013). В другом примере было показано, что пептид Enterococcus faecalis характеризуется нейтрализующей активностью в отношении видов Candida (см., например, Shekh and Roy, BMC Microbiology 12:132, 2012). В другом примере было показано, что бактериоцины из Pseudomonas характеризуются нейтрализующей активностью в отношении грибов, таких как Curvularia lunata, виды Fusarium, виды Helminthosporium и виды Biopolaris (см., например, Shalani and Srivastava, The Internet Journal of Microbiology Volume 5 Number 2, 2008). В другом примере было показано, что ботрицидин AJ1316 и алирин B1 из B. subtilis характеризуются противогрибковой активностью.

Модулирующее средство, включающее в себя бактериоцин, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином–мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации бактериоцина внутри хозяина–мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации бактериоцина внутри кишки хозяина–мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации бактериоцина внутри бактериоцита хозяина–мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина–мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина–мишени.

Как проиллюстрировано в примерах 4, 5 и 13, бактериоцины (например, colA или низин) можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию, такую как Buchnera spp., в организме насекомого–хозяина, как, например, тлей, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе).

Лизины

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя лизин (например, также известный как муреингидролаза или аутолизин пептидогликанов). Можно применять любой лизин, подходящий для ингибирования бактерии, обитающей в организме хозяина. В некоторых случаях лизин представляет собой лизин, который может продуцироваться естественным путем бактериальной клеткой. В некоторых случаях лизин представляет собой лизин, который может продуцироваться естественным путем бактериофагом. В некоторых случаях лизин получают из фага, который ингибирует бактерию, обитающую в организме хозяина. В некоторых случаях лизин конструируют на основе встречающегося в природе лизина. В некоторых случаях лизин конструируют для секреции бактерией–хозяином, например, посредством введения сигнального пептида в лизин. В некоторых случаях лизин применяют в комбинации с холином фага. В некоторых случаях лизин экспрессируется рекомбинантным бактериальным хозяином, который не является восприимчивым к лизину. В некоторых случаях лизин применяют для ингибирования грамположительной или грамотрицательной бактерии, обитающей в организме хозяина.

Лизин может представлять собой лизин любого класса и может иметь один или несколько видов субстратной специфичности. Например, лизин может представлять собой гликозидазу, эндопептидазу, карбопептидазу или их комбинацию. В некоторых случаях лизин расщепляет β–1–4–гликозидную связь в сахарном фрагменте клеточной стенки, амидную связь, соединяющую сахарные и пептидные фрагменты бактериальной клеточной стенки, и/или пептидные связи между пептидными фрагментами клеточной стенки. Лизин может принадлежать к одной или нескольким специфическим группам лизина в зависимости от участка расщепления в пептидогликане. В некоторых случаях лизин представляет собой N–ацетил–β–D–мурамидазу (например, лизоцим), литическую трансгликозилазу, N–ацетил–β–D–глюкозаминидазу, N–ацетилмурамил–L–аланинамидазу, L,D–эндопептидазу, D,D–эндопептидазу, D,D–карбоксипептидазу, L,D–карбоксипептидазу или L,D–транспептидазу. Неограничивающие примеры лизинов и форм их активности приведены в таблице 5.

Таблица 5. Примеры лизинов

Бактерия–мишень	Продуцент	Лизины	Активность	Последовательность
S. pneumoniae	Cp1	Cpl–1	Мурамидаза	MVKKNDLFVDVSSHNGYDITGILEQMGTTNTIIKISESTTYLNPCLSAQVEQSNPIGFYHFARFGGDVAEAEREAQFFLDNVPMQVKYLVLDYEDDPSGDAQANTNACLRFMQMIADAGYKPIYYSYKPFTHDNVDYQQILAQFPNSLWIAGYGLNDGTANFEYFPSMDGIRWWQYSSNPFDKNIVLLDDEEDDKPKTAGTWKQDSKGWWFRRNNGSFPYNKWEKIGGVWYYFDSKGYCLTSEWLKDNEKWYYLKDNGAMATGWVLVGSEWYYMDDSGAMVTGWVKYKNNWYYMTNERGNMVSNEFIKSGKGWYFMNTNGELADNPSFTKEPDGLITVA (SEQ ID NO: 52)
S. pneumoniae	Dp–1	Pal	Амидаза	MGVDIEKGVAWMQARKGRVSYSMDFRDGPDSYDCSSSMYYALRSAGASSAGWAVNTEYMHAWLIENGYELISENAPWDAKRGDIFIWGRKGASAGAGGHTGMFIDSDNIIHCNYAYDGISVNDHDERWYYAGQPYYYVYRLTNANAQPAEKKLGWQKDATGFWYARANGTYPKDEFEYIEENKSWFYFDDQGYMLAEKWLKHTDGNWYWFDRDGYMATSWKRIGESWYYFNRDGSMVTGWIKYYDNWYYCDATNGDMKSNAFIRYNDGWYLLLPDGRLADKPQFTVEPDGLITAKV (SEQ ID NO: 53)
S. pyogenes	C1	C1	Амидаза	Н. о.
B. anthracis		PlyG	Амидаза	MEIQKKLVDPSKYGTKCPYTMKPKYITVHNTYNDAPAENEVSYMISNNNEVSFHIAVDDKKAIQGIPLERNAWACGDGNGSGNRQSISVEICYSKSGGDRYYKAEDNAVDVVRQLMSMYNIPIENVRTHQSWSGKYCPHRMLAEGRWGAFIQKVKNGNVATTSPTKQNIIQSGAFSPYETPDVMGALTSLKMTADFILQSDGLTYFISKPTSDAQLKAMKEYLDRKGWWYEVK (SEQ ID NO: 54)
B. anthracis	Профаг Эймса	PlyPH	Амидаза	Н. о.
E. faecalis и E. faecium	Phi1	PlyV12	Амидаза	Н. о.
S. aureus	ΦMR11	MV–L	Эндопептидаза и амидаза	MQAKLTKKEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFGLLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMVVFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDRIEQPGWGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSIQSPTQASKKETAKPQPKAVELKIIKDVVKGYDLPKRGGNPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQLGNKYYYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKQLQLKDYFIKQIRVYMDGKIPVATVSNESSASSNTVKPVASAWKRNKYGTYYMEENARFTNGNQPITVRKIGPFLSCPVAYQFQPGGYCDYTEVMLQDGHVWVGYTWEGQRYYLPIRTWNGSAPPNQILGDLWGEIS (SEQ ID NO: 55)
S. pyogenes	C1	PlyC	Амидаза	Н. о.
S. agalactiae	B30	Лизин GBS	Мурамидаза и эндопептидаза	MVINIEQAIAWMASRKGKVTYSMDYRNGPSSYDCSSSVYFALRSAGASDNGWAVNTEYEHDWLIKNGYVLIAENTNWNAQRGDIFIWGKRGASAGAFGHTGMFVDPDNIIHCNYGYNSITVNNHDEIWGYNGQPYVYAYRYSGKQSNAKVDNKSVVSKFEKELDVNTPLSNSNMPYYEATISEDYYVESKPDVNSTDKELLVAGTRVRVYEKVKGWARIGAPQSNQWVEDAYLIDATDM (SEQ ID NO: 56)
S. aureus	P68	Lys16	Эндопептидаза	Н. о.
S. aureus	K	LysK	Амидаза и эндопептидаза	MAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRVKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYEQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKKSASKTPAPKKKATLKVSKNHINYTMDKRGKKPEGMVIHNDAGRSSGQQYENSLANAGYARYANGIAHYYGSEGYVWEAIDAKNQIAWHTGDGTGANSGNFRFAGIEVCQSMSASDAQFLKNEQAVFQFTAEKFKEWGLTPNRKTVRLHMEFVPTACPHRSMVLHTGFNPVTQGRPSQAIMNKLKDYFIKQIKNYMDKGTSSSTVVKDGKTSSASTPATRPVTGSWKKNQYGTWYKPENATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATIVYDEVCIQAGHIWIGYNAYNGNRVYCPVRTCQGVPPNQIPGVAWGVFK (SEQ ID NO: 57)
L. monocytogenes	A118	Ply118	Амидаза	MTSYYYSRSLANVNKLADNTKAAARKLLDWSESNGIEVLIYETIRTKEQQAANVNSGASQTMRSYHLVGQALDFVMAKGKTVDWGAYRSDKGKKFVAKAKSLGFEWGGDWSGFVDNPHLQFNYKGYGTDTFGKGASTSNSSKPSADTNTNSLGLVDYMNLNKLDSSFANRKKLATSYGIKNYSGTATQNTTLLAKLKAGKPHTPASKNTYYTENPRKVKTLVQCDLYKSVDFTTKNQTGGTFPPGTVFTISGMGKTKGGTPRLKTKSGYYLTANTKFVKKI (SEQ ID NO: 58)
L. monocytogenes	A511	Ply511	Амидаза	MVKYTVENKIIAGLPKGKLKGANFVIAHETANSKSTIDNEVSYMTRNWKNAFVTHFVGGGGRVVQVANVNYVSWGAGQYANSYSYAQVELCRTSNATTFKKDYEVYCQLLVDLAKKAGIPITLDSGSKTSDKGIKSHKWVADKLGGTTHQDPYAYLSSWGISKAQFASDLAKVSGGGNTGTAPAKPSTPAPKPSTPSTNLDKLGLVDYMNAKKMDSSYSNRDKLAKQYGIANYSGTASQNTTLLSKIKGGAPKPSTPAPKPSTSTAKKIYFPPNKGNWSVYPTNKAPVKANAIGAINPTKFGGLTYTIQKDRGNGVYEIQTDQFGRVQVYGAPSTGAVIKK (SEQ ID NO: 59)
L. monocytogenes	A500	Ply500	Эндопептидаза	MALTEAWLIEKANRKLNAGGMYKITSDKTRNVIKKMAKEGIYLCVAQGYRSTAEQNALYAQGRTKPGAIVTNAKGGQSNHNYGVAVDLCLYTNDGKDVIWESTTSRWKKVVAAMKAEGFKWGGDWKSFKDYPHFELCDAVSGEKIPAATQNTNTNSNRYEGKVIDSAPLLPKMDFKSSPFRMYKVGTEFLVYDHNQYWYKTYIDDKLYYMYKSFCDVVAKKDAKGRIKVRIKSAKDLRIPVWNNIKLNSGKIKWYAPNVKLAWYNYRRGYLELWYPNDGWYYTAEYFLK (SEQ ID NO: 60)
S. pneumoniae	ΦDp–1	Pal, S	Эндопептидаза и амидаза	Н. о.
S. agalactiae	Профаг LambdaSa1	LambdaSa1	Гликозидаза	MVINIEQAIAWMASRKGKVTYSMDYRNGPSSYDCSSSVYFALRSAGASDNGWAVNTEYEHDWLIKNGYVLIAENTNWNAQRGDIFIWGKRGASAGAFGHTGMFVDPDNIIHCNYGYNSITVNNHDEIWGYNGQPYVYAYRYARKQSNAKVDNQSVVSKFEKELDVNTPLSNSNMPYYEATISEDYYVESKPDVNSTDKELLVAGTRVRVYEKVKGWARIGAPQSNQWVEDAYLIDATDM (SEQ ID NO: 61)
S. agalactiae	Профаг LambdaSa2	LambdaSa2	Гликозидаза и эндопептидаза	MEINTEIAIAWMSARQGKVSYSMDYRDGPNSYDCSSSVYYALRSAGASSAGWAVNTEYMHDWLIKNGYELIAENVDWNAVRGDIAIWGMRGHSSGAGGHVVMFIDPENIIHCNWANNGITVNNYNQTAAASGWMYCYVYRLKSGASTQGKSLDTLVKETLAGNYGNGEARKAVLGNQYEAVMSVINGKTTTNQKTVDQLVQEVIAGKHGNGEARKKSLGSQYDAVQKRVTELLKKQPSEPFKAQEVNKPTETKTSQTELTGQATATKEEGDLSFNGTILKKAVLDKILGNCKKHDILPSYALTILHYEGLWGTSAVGKADNNWGGMTWTGQGNRPSGVTVTQGSARPSNEGGHYMHYASVDDFLTDWFYLLRAGGSYKVSGAKTFSEAIKGMFKVGGAVYDYAASGFDSYIVGASSRLKAIEAENGSLDKFDKATDIGDGSKDKIDITIEGIEVTINGITYELTKKPV (SEQ ID NO: 62)
S. uberis	Профаг (ATCC700407)	Ply700	Амидаза	MTDSIQEMRKLQSIPVRYDMGDRYGNDADRDGRIEMDCSSAVSKALGISMTNNTETLQQALPAIGYGKIHDAVDGTFDMQAYDVIIWAPRDGSSSLGAFGHVLIATSPTTAIHCNYGSDGITENDYNYIWEINGRPREIVFRKGVTQTQATVTSQFERELDVNARLTVSDKPYYEATLSEDYYVEAGPRIDSQDKELIKAGTRVRVYEKLNGWSRINHPESAQWVEDSYLVDATEM (SEQ ID NO: 63)
S. suis	SMP	LySMP	Гликозидаза и эндопептидаза	Н. о.
B. anthracis	Bcp1	PlyB	Мурамидаза	Н. о.
S. aureus	Phi11 и Phi12	Лизин Phi11	Амидаза и эндопептидаза	MQAKLTKNEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFGLLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMVVFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGIEQPGWGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSVQSPTQAPKKETAKPQPKAVELKIIKDVVKGYDLPKRGSNPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYYYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMDGKIPVATVSNESSASSNTVKPVASAWKRNKYGTYYMEESARFTNGNQPITVRKVGPFLSCPVGYQFQPGGYCDYTEVMLQDGHVWVGYTWEGQRYYLPIRTWNGSAPPNQILGDLWGEIS (SEQ ID NO: 64)
S. aureus	ΦH5	LysH5	Амидаза и эндопептидаза	MQAKLTKKEFIEWLKTSEGKQYNADGWYGFQCFDYANAGWKALFGLLLKGVGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMVVFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGVQQPGSGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSVQSPTQASKKETAKPQPKAVELKIIKDVVKGYDLPKRGSNPNFIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYGYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMDGKIPVATVSNDSSASSNTVKPVASAWKRNKYGTYYMEESARFTNGNQPITVRKVGPFLSCPVGYQFQPGGYCDYTEVMLQDGHVWVGYTWEGQRYYLPIRTWNGSAPPNQILGDLWGEIS (SEQ ID NO: 65)
S. warneri	ΦWMY	LysWMY	Амидаза и эндопептидаза	MKTKAQAKSWINSKIGKGIDWDGMYGYQCMDEAVDYIHHVTDGKVTMWGNAIDAPKNNFQGLCTVYTNTPEFRPAYGDVIVWSYGTFATYGHIAIVVNPDPYGDLQYITVLEQNWNGNGIYKTEFATIRTHDYTGVSHFIRPKFADEVKETAKTVNKLSVQKKIVTPKNSVERIKNYVKTSGYINGEHYELYNRGHKPKGVVIHNTAGTASATQEGQRLTNMTFQQLANGVAHVYIDKNTIYETLPEDRIAWHVAQQYGNTEFYGIEVCGSRNTDKEQFLANEQVAFQEAARRLKSWGMRANRNTVRLHHTFSSTECPDMSMLLHTGYSMKNGKPTQDITNKCADYFMKQINAYIDGKQPTSTVVGSSSSNKLKAKNKDKSTGWNTNEYGTLWKKEHATFTCGVRQGIVTRTTGPFTSCPQAGVLYYGQSVNYDTVCKQDGYVWISWTTSDGYDVWMPIRTWDRSTDKVSEIWGTIS (SEQ ID NO: 66)
Streptococci (GBS)	ΦNCTC 11261	PlyGBS	Мурамидаза и эндопептидаза	MATYQEYKSRSNGNAYDIDGSFGAQCWDGYADYCKYLGLPYANCTNTGYARDIWEQRHENGILNYFDEVEVMQAGDVAIFMVVDGVTPYSHVAIFDSDAGGGYGWFLGQNQGGANGAYNIVKIPYSATYPTAFRPKVFKNAVTVTGNIGLNKGDYFIDVSAYQQADLTTTCQQAGTTKTIIKVSESIAWLSDRHQQQANTSDPIGYYHFGRFGGDSALAQREADLFLSNLPSKKVSYLVIDYEDSASADKQANTNAVIAFMDKIASAGYKPIYYSYKPFTLNNIDYQKIIAKYPNSIWIAGYPDYEVRTEPLWEFFPSMDGVRWWQFTSVGVAGGLDKNIVLLADDSSKMDIPKVDKPQELTFYQKLATNTKLDNSNVPYYEATLSTDYYVESKPNASSADKEFIKAGTRVRVYEKVNGWSRINHPESAQWVEDSYLVNATDM (SEQ ID NO: 67)
C. perfringens	Φ3626	Ply3626	Амидаза	Н. о.
C. difficile	ΦCD27	Лизин CD27	Амидаза	Н. о.
E. faecalis	Φ1	PlyV12	Амидаза	Н. о.
A. naeslundii	ΦAv–1–	Лизин Av–1	Предполагаемая амидаза/ мурамидаза	Н. о.
L. gasseri	ΦgaY	LysgaY	Мурамидаза	Н. о.
S. aureus	ΦSA4	LysSA4	Амидаза и эндопептидаза	Н. о.
S. haemolyticus	ΦSH2	SH2	Амидаза и эндопептидаза	Н. о.
B. thuringiensis	ΦBtCS33	PlyBt33	Амидаза	Н. о.
L. monocytogenes	ΦP40	PlyP40	Амидаза	Н. о.
L. monocytogenes	ΦFWLLm3	LysZ5	Амидаза	MVKYTVENKIIAGLPKGKLKGANFVIAHETANSKSTIDNEVSYMTRNWQNAFVTHFVGGGGRVVQVANVNYVSWGAGQYANSYSYAQVELCRTSNATTFKKDYEVYCQLLVDLAKKAGIPITLDSGSKTSDKGIKSHKWVADKLGGTTHQDPYAYLSSWGISKAQFASDLAKVSGGGNTGTAPAKPSTPSTNLDKLGLVDYMNAKKMDSSYSNRAKLAKQYGIANYSGTASQNTTLLSKIKGGAPKPSTPAPKPSTSTAKKIYFPPNKGNWSVYPTNKAPVKANAIGAINPTKFGGLTYTIQKDRGNGVYEIQTDQFGRVQVYGAPSTGAVIKK (SEQ ID NO: 68)
B. cereus	ΦBPS13	LysBPS13	Амидаза	MAKREKYIFDVEAEVGKAAKSIKSLEAELSKLQKLNKEIDATGGDRTEKEMLATLKAAKEVNAEYQKMQRILKDLSKYSGKVSRKEFNDSKVINNAKTSVQGGKVTDSFGQMLKNMERQINSVNKQFDNHRKAMVDRGQQYTPHLKTNRKDSQGNSNPSMMGRNKSTTQDMEKAVDKFLNGQNEATTGLNQALYQLKEISKLNRRSESLSRRASASGYMSFQQYSNFTGDRRTVQQTYGGLKTANRERVLELSGQATGISKELDRLNSKKGLTAREGEERKKLMRQLEGIDAELTARKKLNSSLDETTSNMEKFNQSLVDAQVSVKPERGTMRGMMYERAPAIALAIGGAITATIGKLYSEGGNHSKAMRPDEMYVGQQTGAVGANWRPNRTATMRSGLGNHLGFTGQEMMEFQSNYLSANGYHGAEDMKAATTGQATFARATGLGSDEVKDFFNTAYRSGGIDGNQTKQFQNAFLGAMKQSGAVGREKDQLKALNGILSSMSQNRTVSNQDMMRTVGLQSAISSSGVASLQGTKGGALMEQLDNGIREGFNDPQMRVLFGQGTKYQGMGGRAALRKQMEKGISDPDNLNTLIDASKASAGQDPAEQAEVLATLASKMGVNMSSDQARGLIDLQPSGKLTKENIDKVMKEGLKEGSIESAKRDKAYSESKASIDNSSEAATAKQATELNDMGSKLRQANAALGGLPAPLYTAIAAVVAFTAAVAGSALMFKGASWLKGGMASKYGGKGGKGGKGGGTGGGGGAGGAAATGAGAAAGAGGVGAAAAGEVGAGVAAGGAAAGAAAGGSKLAGVGKGFMKGAGKLMLPLGILMGASEIMQAPEEAKGSAIGSAVGGIGGGIAGGAATGAIAGSFLGPIGTAVGGIAGGIAGGFAGSSLGETIGGWFDSGPKEDASAADKAKADASAAALAAAAGTSGAVGSSALQSQMAQGITGAPNMSQVGSMASALGISSGAMASALGISSGQENQIQTMTDKENTNTKKANEAKKGDNLSYERENISMYERVLTRAEQILAQARAQNGIMGVGGGGTAGAGGGINGFTGGGKLQFLAAGQKWSSSNLQQHDLGFTDQNLTAEDLDKWIDSKAPQGSMMRGMGATFLKAGQEYGLDPRYLIAHAAEESGWGTSKIARDKGNFFGIGAFDDSPYSSAYEFKDGTGSAAERGIMGGAKWISEKYYGKGNTTLDKMKAAGYATNASWAPNIASIMAGAPTGSGSGNVTATINVNVKGDEKVSDKLKNSSDMKKAGKDIGSLLGFYSREMTIA (SEQ ID NO: 69)
S. aureus	ΦGH15	LysGH15	Амидаза и эндопептидаза	MAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRIKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYQQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKKSASKTPAPKKKATLKVSKNHINYTMDKRGKKPEGMVIHNDAGRSSGQQYENSLANAGYARYANGIAHYYGSEGYVWEAIDAKNQIAWHTGDGTGANSGNFRFAGIEVCQSMSASDAQFLKNEQAVFQFTAEKFKEWGLTPNRKTVRLHMEFVPTACPHRSMVLHTGFNPVTQGRPSQAIMNKLKDYFIKQIKNYMDKGTSSSTVVKDGKTSSASTPATRPVTGSWKKNQYGTWYKPENATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATIVYDEVCIQAGHIWIGYNAYNGDRVYCPVRTCQGVPPNHIPGVAWGVFK (SEQ ID NO: 70)
S. aureus	ΦvB SauS–PLA88	HydH5	Эндопептидаза и гликозидаза	Н. о.
E. faecalis	ΦF168/08	Lys168	Эндопептидаза	Н. о.
E. faecalis	ΦF170/08	Lys170	Амидаза	Н. о.
S. aureus	ΦP–27/HP	P–27/HP	Неопределенные	Н. о.
C. perfringens	ΦSM101	Psm	Мурамидаза	Н. о.
C. sporogenes	Φ8074–B1	CS74L	Амидаза	MKIGIDMGHTLSGADYGVVGLRPESVLTREVGTKVIYKLQKLGHVVVNCTVDKASSVSESLYTRYYRANQANVDLFISIHFNATPGGTGTEVYTYAGRQLGEATRIRQEFKSLGLRDRGTKDGSGLAVIRNTKAKAMLVECCFCDNPNDMKLYNSESFSNAIVKGITGKLPNGESGNNNQGGNKVKAVVIYNEGADRRGAEYLADYLNCPTISNSRTFDYSCVEHVYAVGGKKEQYTKYLKTLLSGANRYDTMQQILNFINGGK (SEQ ID NO: 71)
S. typhimurium	ΦSPN1S	SPN1S	Гликозидаза	MDINQFRRASGINEQLAARWFPHITTAMNEFGITKPDDQAMFIAQVGHESGGFTRLQENFNYSVNGLSGFIRAGRITPDQANALGRKTYEKSLPLERQRAIANLVYSKRMGNNGPGDGWNYRGRGLIQITGLNNYRDCGNGLKVDLVAQPELLAQDEYAARSAAWFFSSKGCMKYTGDLVRVTQIINGGQNGIDDRRTRYAAARKVLAL (SEQ ID NO: 72)
C. michiganensis	ΦCMP1	CMP1	Пептидаза	Н. о.
C. michiganensis	ΦCN77	CN77	Пептидаза	MGYWGYPNGQIPNDKMALYRGCLLRADAAAQAYALQDAYTRATGKPLVILEGYRDLTRQKYLRNLYLSGRGNIAAVPGLSNHGWGLACDFAAPLNSSGSEEHRWMRQNAPLFGFDWARGKADNEPWHWEYGNVPVSRWASLDVTPIDRNDMADITEGQMQRIAVILLDTEIQTPLGPRLVKHALGDALLLGQANANSIAEVPDKTWDVLVDHPLAKNEDGTPLKVRLGDVAKYEPLEHQNTRDAIAKLGTLQFTDKQLATIGAGVKPIDEASLVKKIVDGVRALFGRAAA (SEQ ID NO: 73)
A. baumannii	ΦAB2	LysAB2	Гликозидаза	MILTKDGFSIIRNELFGGKLDQTQVDAINFIVAKATESGLTYPEAAYLLATIYHETGLPSGYRTMQPIKEAGSDSYLRSKKYYPYIGYGYVQLTWKENYERIGKLIGVDLIKNPEKALEPLIAIQIAIKGMLNGWFTGVGFRRKRPVSKYNKQQYVAARNIINGKDKAELIAKYAIIFERALRSL (SEQ ID NO: 74)
B. cereus	ΦB4	LysB4	Эндопептидаза	MAMALQTLIDKANRKLNVSGMRKDVADRTRAVITQMHAQGIYICVAQGFRSFAEQNALYAQGRTKPGSIVTNARGGQSNHNYGVAVDLCLYTQDGSDVIWTVEGNFRKVIAAMKAQGFKWGGDWVSFKDYPHFELYDVVGGQKPPADNGGAVDNGGGSGSTGGSGGGSTGGGSTGGGYDSSWFTKETGTFVTNTSIKLRTAPFTSADVIATLPAGSPVNYNGFGIEYDGYVWIRQPRSNGYGYLATGESKGGKRQNYWGTFK (SEQ ID NO: 75)
P. aeruginosa	ΦKMV	KMV45	Неопределенные	Н. о.
C. tyrobutyricum	ΦCTP1	Ctp1l	Гликозидаза	MKKIADISNLNGNVDVKLLFNLGYIGIIAKASEGGTFVDKYYKQNYTNTKAQGKITGAYHFANFSTIAKAQQEANFFLNCIAGTTPDFVVLDLEQQCTGDITDACLAFLNIVAKKFKCVVYCNSSFIKEHLNSKICAYPLWIANYGVATPAFTLWTKYAMWQFTEKGQVSGISGYIDFSYITDEFIKYIKGEDEVENLVVYNDGADQRAAEYLADRLACPTINNARKFDYSNVKNVYAVGGNKEQYTSYLTTLIAGSTRYTTMQAVLDYIKNLK (SEQ ID NO: 76)
P. aeruginosa	ΦEL	EL188	Трансгликозилаза	Н. о.
P. aeruginosa	ΦKZ	KZ144	Трансгликозилаза	Н. о.
S. aureus	Вирус стафилококков 187	Ply187	Гидролаза клеточной стенки	MALPKTGKPTAKQVVDWAINLIGSGVDVDGYYGRQCWDLPNYIFNRYWNFKTPGNARDMAWYRYPEGFKVFRNTSDFVPKPGDIAVWTGGNYNWNTWGHTGIVVGPSTKSYFYSVDQNWNNSNSYVGSPAAKIKHSYFGVTHFVRPAYKAEPKPTPPAQNNPAPKDPEPSKKPESNKPIYKVVTKILFTTAHIEHVKANRFVHYITKSDNHNNKPNKIVIKNTNTALSTIDVYRYRDELDKDEIPHFFVDRLNVWACRPIEDSINGYHDSVVLSITETRTALSDNFKMNEIECLSLAESILKANNKKMSASNIIVDNKAWRTFKLHTGKDSLKSSSFTSKDYQKAVNELIKLFNDKDKLLNNKPKDVVERIRIRTIVKENTKFVPSELKPRNNIRDKQDSKIDRVINNYTLKQALNIQYKLNPKPQTSNGVSWYNASVNQIKSAMDTTKIFNNNVQVYQFLKLNQYQGIPVDKLNKLLVGKGTLANQGHAFADGCKKYNINEIYLIAHRFLESANGTSFFASGKTGVYNYFGIGAFDNNPNNAMAFARSHGWTSPTKAIIGGAEFVGKGYFNVGQNTLYRMRWNPQKPGTHQYATDISWAKVQAQMISAMYKEIGLTGDYFIYDQYKK (SEQ ID NO: 77)
P. fluorescens	ΦOBP	OBPgp279	Гликозидаза	Н. о.
L. monocytogenes	ΦP35	PlyP35	Амидаза	MARKFTKAELVAKAEKKVGGLKPDVKKAVLSAVKEAYDRYGIGIIVSQGYRSIAEQNGLYAQGRTKPGNIVTNAKGGQSNHNFGVAVDFAIDLIDDGKIDSWQPSATIVNMMKRRGFKWGGDWKSFTDLPHFEACDWYRGERKYKVDTSEWKKKENINIVIKDVGYFQDKPQFLNSKSVRQWKHGTKVKLTKHNSHWYTGVVKDGNKSVRGYIYHSMAKVTSKNSDGSVNATINAHAFCWDNKKLNGGDFINLKRGFKGITHPASDGFYPLYFASRKKTFYIPRYMFDIKK (SEQ ID NO: 78)
L. fermentum	ΦPYB5	Lyb5	Мурамидаза	Н. о.
S. pneumoniae	ΦCP–7	Cpl–7	Мурамидаза	MVKKNDLFVDVASHQGYDISGILEEAGTTNTIIKVSESTSYLNPCLSAQVSQSNPIGFYHFAWFGGNEEEAEAEARYFLDNVPTQVKYLVLDYEDHASASVQRNTTACLRFMQIIAEAGYTPIYYSYKPFTLDNVDYQQILAQFPNSLWIAGYGLNDGTANFEYFPSMDGIRWWQYSSNPFDKNIVLLDDEKEDNINNENTLKSLTTVANEVIQGLWGNGQERYDSLANAGYDPQAVQDKVNEILNAREIADLTTVANEVIQGLWGNGQERYDSLANAGYDPQAVQDKVNEILNAREIADLTTVANEVIQGLWGNGQERYDSLANAGYDPQAVQDKVNELLS (SEQ ID NO: 79)
P. chlororaphis 201	Φ2–1	2012–1gp229	Гликозидаза	Н. о.
S. enterica	ΦPVP–SE1	PVP–SE1gp146	Гликозидаза	Н. о.
Corynebacterium	ΦBFK20	BKF20	Амидаза	Н. о.
E. faecalis	ΦEFAP–1	EFAL–1	Амидаза	MKLKGILLSVVTTFGLLFGATNVQAYEVNNEFNLQPWEGSQQLAYPNKIILHETANPRATGRNEATYMKNNWFNAHTTAIVGDGGIVYKVAPEGNVSWGAGNANPYAPVQIELQHTNDPELFKANYKAYVDYTRDMGKKFGIPMTLDQGGSLWEKGVVSHQWVTDFVWGDHTDPYGYLAKMGISKAQLAHDLANGVSGNTATPTPKPDKPKPTQPSKPSNKKRFNYRVDGLEYVNGMWQIYNEHLGKIDFNWTENGIPVEVVDKVNPATGQPTKDQVLKVGDYFNFQENSTGVVQEQTPYMGYTLSHVQLPNEFIWLFTDSKQALMYQ (SEQ ID NO: 80)
Lactobacilli	lambdaSA2	LysA, LysA2 и Lysga Y	Неопределенные	Н. о.
S. aureus		SAL–1	Неопределенные	Н. о.

В некоторых случаях лизин представляет собой функционально активный вариант лизинов, описанных в данном документе. В некоторых случаях вариант лизина является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности лизина, описанного в данном документе, или встречающегося в природе лизина.

В некоторых случаях лизин можно создавать с помощью биоинженерии для модулирования его биологической активности, например, повышения, или снижения, или регулирования, или для определения его микроорганизма–мишени. В некоторых случаях лизин продуцируется трансляционным аппаратом (например, рибосомой и т. д.) микробной клетки. В некоторых случаях лизин синтезируют химическим путем. В некоторых случаях лизин образуется из полипептидного предшественника. Полипептидный предшественник может подвергаться расщеплению (например, процессингу под действием протеазы) с образованием самого полипептида лизина. Таким образом, в некоторых случаях лизин продуцируется из полипептида–предшественника. В некоторых случаях лизин включает в себя полипептид, который подвергся посттрансляционным модификациям, например, расщеплению или добавлению одной или нескольких функциональных групп.

Лизины, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) лизинов, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 лизина, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или больше лизинов. Подходящая концентрация каждого лизина в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность лизина, количество различных лизинов, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях концентрация каждого лизина в жидкой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых случаях концентрация каждого лизина в твердой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 100 мг/г. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа лизинов, то концентрация каждого типа лизинов может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя лизин, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином–мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации лизина внутри хозяина–мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации лизина внутри кишки хозяина–мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации лизина внутри бактериоцита хозяина–мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина–мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина–мишени.

Противомикробные пептиды

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя противомикробный пептид (AMP). Можно применять любой AMP, подходящий для ингибирования микроорганизма, обитающего в организме хозяина. AMP представляют собой разнообразную группу молекул, которые разделяются на подгруппы на основании их аминокислотного состава и структуры. AMP могут быть получены из любого организма или продуцироваться в любом организме, который естественным образом продуцирует AMP, в том числе AMP, получаемые из растений (например, копсин), насекомых (например, дрозоцин, пептид скорпиона (например, Uy192, UyCT3, D3, D10, Uy17, Uy192), мастопаран, понератоксин, цекропин, морицин, меллитин), лягушек (например, магаинин, дермасептин, ауреин) и млекопитающих (например, кателицидины, дефензины и протегрины). В некоторых случаях AMP может представлять собой пептид скорпиона, такой как Uy192 (5’–FLSTIWNGIKGLL–3’; SEQ ID NO: 232), UyCT3 (5’–LSAIWSGIKSLF–3’; SEQ ID NO: 233), D3 (5’–LWGKLWEGVKSLI–3’; SEQ ID NO: 234) и D10 (5’–FPFLKLSLKIPKSAIKSAIKRL–3’; SEQ ID NO: 235), Uy17 (5’–ILSAIWSGIKGLL–3’; SEQ ID NO: 236) или их комбинацию. В некоторых случаях противомикробный пептид может представлять собой пептид, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или 100% идентичностью последовательности) с одним или несколькими из следующих: цекропина (SEQ ID NO: 82), мелиттина, копсина, дрозомицина (SEQ ID NO: 93), дермсидина (SEQ ID NO: 81), андропина (SEQ ID NO: 83), морицина (SEQ ID NO: 84), цератотоксина (SEQ ID NO: 85), абецина (SEQ ID NO: 86), апидецина (SEQ ID NO: 87), профенина (SEQ ID NO: 88), индолицидина (SEQ ID NO: 89), протегрина (SEQ ID NO: 90), тахиплезина (SEQ ID NO: 91) или дефензина (SEQ ID NO: 92), насекомому, являющемуся сельскохозяйственным вредителем. Неограничивающие примеры AMP приведены в таблице 6.

Таблица 6. Примеры противомикробных пептидов

Тип	Характеристика	Иллюстративный AMP	Последовательность
Анионные пептиды	Богатые глутаминовой и аспарагиновой кислотой	Дермсидин	SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSVL (SEQ ID NO: 81)
Линейные катионные α–спиральные пептиды	Не имеют цистеина	Цекропин A	KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK (SEQ ID NO: 82)
		Андропин	MKYFSVLVVLTLILAIVDQSDAFINLLDKVEDALHTGAQAGFKLIRPVERGATPKKSEKPEK (SEQ ID NO: 83)
		Морицин	MNILKFFFVFIVAMSLVSCSTAAPAKIPIKAIKTVGKAVGKGLRAINIASTANDVFNFLKPKKRKH (SEQ ID NO: 84)
		Цератотоксин	MANLKAVFLICIVAFIALQCVVAEPAAEDSVVVKRSIGSALKKALPVAKKIGKIALPIAKAALPVAAGLVG (SEQ ID NO: 85)
Катионные пептиды, обогащенные конкретными аминокислотами	Богатые пролином, аргинином, фенилаланином, глицином, триптофаном	Абецин	MKVVIFIFALLATICAAFAYVPLPNVPQPGRRPFPTFPGQGPFNPKIKWPQGY (SEQ ID NO: 86)
		Апидецины	KNFALAILVVTFVVAVFGNTNLDPPTRPTRLRREAKPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAELEAEPGNNRPVYISQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAELEAEPGNNRPVYISQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAKPEAKPGNNRPVYIPQPRPPHPRI (SEQ ID NO: 87)
		Профенин	METQRASLCLGRWSLWLLLLALVVPSASAQALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANLYRLLELDQPPKADEDPGTPKPVSFTVKETVCPRPTRRPPELCDFKENGRVKQCVGTVTLDQIKDPLDITCNEGVRRFPWWWPFLRRPRLRRQAFPPPNVPGPRFPPPNVPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPPFPPPIFPGPWFPPPPPFRPPPFGPPRFPGRR (SEQ ID NO: 88)
		Индолицидин	MQTQRASLSLGRWSLWLLLLGLVVPSASAQALSYREAVLRAVDQLNELSSEANLYRLLELDPPPKDNEDLGTRKPVSFTVKETVCPRTIQQPAEQCDFKEKGRVKQCVGTVTLDPSNDQFDLNCNELQSVILPWKWPWWPWRRG (SEQ ID NO: 89)
Анионные и катионные пептиды, которые содержат цистеин и образуют дисульфидные связи	Содержат 1–3 дисульфидные связи	Протегрин	METQRASLCLGRWSLWLLLLALVVPSASAQALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANLYRLLELDQPPKADEDPGTPKPVSFTVKETVCPRPTRQPPELCDFKENGRVKQCVGTVTLDQIKDPLDITCNEVQGVRGGRLCYCRRRFCVCVGRG (SEQ ID NO: 90)
		Тахиплезины	KWCFRVCYRGICYRRCR (SEQ ID NO: 91)
		Дефензины	MKCATIVCTIAVVLAATLLNGSVQAAPQEEAALSGGANLNTLLDELPEETHHAALENYRAKRATCDLASGFGVGSSLCAAHCIARRYRGGYCNSKAVCVCRN (SEQ ID NO: 92)
		Дрозомицин	MMQIKYLFALFAVLMLVVLGANEADADCLSGRYKGPCAVWDNETCRRVCKEEGRSSGHCSPSLKCWCEGC (SEQ ID NO: 93)

AMP может быть активным в отношении любого количества микроорганизмов–мишеней. В некоторых случаях AMP может характеризоваться формами антибактериальной и/или противогрибковой активности. В некоторых случаях AMP может характеризоваться биологической активностью узкого спектра или биологической активностью широкого спектра. Например, некоторые AMP целенаправленно воздействуют только на несколько видов бактерий или грибов и уничтожают их, тогда как другие являются активными в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, а также грибов.

Кроме того, AMP может функционировать посредством ряда известных механизмов действия. Например, цитоплазматическая мембрана представляет собой частую мишень для AMP, однако AMP могут также нарушать синтез ДНК и белка, сворачивание белка и синтез клеточной стенки. В некоторых случаях AMP с суммарным катионным зарядом и амфипатической природой разрушают мембраны бактерий, приводя к лизису клеток. В некоторых случаях AMP могут проникать в клетки и взаимодействовать с внутриклеточной мишенью с нарушением синтеза ДНК, РНК, белка или клеточной стенки. Помимо уничтожения микроорганизмов, AMP продемонстрировали ряд иммуномодулирующих функций, которые вовлечены в устранение инфекции, в том числе способность изменять экспрессию генов хозяев, выступать в роли хемокинов и/или индуцировать продуцирование хемокинов, ингибировать продуцирование провоспалительных цитокинов, индуцированное липополисахаридами, способствовать заживлению ран и модулировать ответы дендритных клеток и клеток, участвующих в адаптивном иммунном ответе.

В некоторых случаях AMP представляет собой функционально активный вариант AMP, описанных в данном документе. В некоторых случаях вариант AMP является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности AMP, описанного в данном документе, или AMP природного происхождения.

В некоторых случаях AMP можно создавать с помощью биоинженерии для модулирования его биологической активности, например, повышения, или снижения, или регулирования, или для определения его микроорганизма–мишени. В некоторых случаях AMP продуцируется трансляционным аппаратом (например, рибосомой и т. д.) клетки. В некоторых случаях AMP синтезируют химическим путем. В некоторых случаях AMP образуется из полипептидного предшественника. Полипептидный предшественник может подвергаться расщеплению (например, процессингу под действием протеазы) с образованием самого полипептида AMP. Таким образом, в некоторых случаях AMP продуцируется из полипептида–предшественника. В некоторых случаях AMP включает в себя полипептид, который подвергся посттрансляционным модификациям, например, расщеплению или добавлению одной или нескольких функциональных групп.

AMP, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) AMP, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 AMP, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или больше AMP. Например, композиции могут содержать коктейль AMP (например, коктейль пептидов скорпиона, например, UyCT3, D3, D10 и Uy17). Подходящая концентрация каждого AMP в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность AMP, количество различных AMP в композиции, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях концентрация каждого AMP в жидкой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл (от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 1 нг/мл, от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 10 нг/мл, от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, от приблизительно 100 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл, от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл, от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл). В некоторых случаях концентрация каждого AMP в твердой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 100 мг/г (от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 1 нг/г, от приблизительно 1 нг/г до приблизительно 10 нг/г, от приблизительно 10 нг/г до приблизительно 100 нг/г, от приблизительно 100 нг/г до приблизительно 1000 нг/г, от приблизительно 1 мг/г до приблизительно 10 мг/г, от приблизительно 10 мг/г до приблизительно 100 мг/г). В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа AMP, то концентрация каждого типа AMP может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя AMP, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином–мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации AMP внутри хозяина–мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации AMP внутри кишки хозяина–мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации AMP внутри бактериоцита хозяина–мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина–мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина–мишени.

Как проиллюстрировано в примерах 17–19, AMP, такие как пептиды скорпиона, можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию, такую как Buchnera spp., в организме насекомого–хозяина, как, например, тлей, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе).

C–богатые пептиды клубеньков

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя C–богатый пептид клубеньков (пептид NCR). Пептиды NCR продуцируются в определенных видах бобовых растений и играют важную роль в мутуалистическом азотфиксирующем симбиозе растений с бактериями из семейства Rhizobiaceae (клубеньковыми бактериями), который приводит к образованию корневых клубеньков, в которых растительные клетки содержат тысячи внутриклеточных эндосимбионтов. Пептиды NCR обладают противомикробными свойствами, управляя необратимым процессом терминальной дифференцировки бактерий, например, с пермеабилизацией мембраны бактерий, нарушением клеточного деления или ингибированием синтеза белка. Например, в клетках клубеньков Medicago truncatula, инфицированных Sinorhizobium meliloti, продуцируются сотни пептидов NCR, которые управляют необратимым процессом дифференцировки бактерий в крупные полиплоидные азотфиксирующие бактероиды. Неограничивающие примеры NCR приведены в таблице 7.

Таблица 7. Примеры пептидов NCR

Название	Пептидная последовательность	Продуцент
>gi|152218086|gb|ABS31477.1| NCR 340	MTKIVVFIYVVILLLTIFHVSAKKKRYIECETHEDCSQVFMPPFVMRCVIHECKIFNGEHLRY (SEQ ID NO: 94)	Medicago truncatula
>gi|152218084|gb|ABS31476.1| NCR 339	MAKIMKFVYNMIPFLSIFIITLQVNVVVCEIDADCPQICMPPYEVRCVNHRCGWVNTDDSLFLTQEFTRSKQYIIS (SEQ ID NO: 95)	Medicago truncatula
>gi|152218082|gb|ABS31475.1| NCR 338	MYKVVESIFIRYMHRKPNMTKFFKFVYTMFILISLFLVVTNANAHNCTDISDCSSNHCSYEGVSLCMNGQCICIYE (SEQ ID NO: 96)	Medicago truncatula
>gi|152218080|gb|ABS31474.1| NCR 337	MVETLRLFYIMILFVSLCLVVVDGESKLEQTCSEDFECYIKNPHVPFGHLRCFEGFCQQLNGPA (SEQ ID NO: 97)	Medicago truncatula
>gi|152218078|gb|ABS31473.1| NCR 336	MAKIVNFVYSMIVFLFLFLVATKAARGYLCVTDSHCPPHMCPPGMEPRCVRRMCKCLPIGWRKYFVP (SEQ ID NO: 98)	Medicago truncatula
>gi|152218076|gb|ABS31472.1| NCR 335	MQIGKNMVETPKLDYVIIFFFLYFFFRQMIILRLNTTFRPLNFKMLRFWGQNRNIMKHRGQKVHFSLILSDCKTNKDCPKLRRANVRCRKSYCVPI (SEQ ID NO: 99)	Medicago truncatula
>gi|152218074|gb|ABS31471.1| NCR 334	MLRLYLVSYFLLKRTLLVSYFSYFSTYIIECKTDNDCPISQLKIYAWKCVKNGCHLFDVIPMMYE (SEQ ID NO: 100)	Medicago truncatula
>gi|152218072|gb|ABS31470.1| NCR 333	MAEILKFVYIVILFVSLLLIVVASERECVTDDDCEKLYPTNEYRMMCDSGYCMNLLNGKIIYLLCLKKKKFLIIISVLL (SEQ ID NO: 101)	Medicago truncatula
>gi|152218070|gb|ABS31469.1| NCR 332	MAEIIKFVYIMILCVSLLLIEVAGEECVTDADCDKLYPDIRKPLMCSIGECYSLYKGKFSLSIISKTSFSLMVYNVVTLVICLRLAYISLLLKFL (SEQ ID NO: 102)	Medicago truncatula
>gi|152218068|gb|ABS31468.1| NCR 331	MAEILKDFYAMNLFIFLIILPAKIRGETLSLTHPKCHHIMLPSLFITEVFQRVTDDGCPKPVNHLRVVKCIEHICEYGYNYRPDFASQIPESTKMPRKRE (SEQ ID NO: 103)	Medicago truncatula
>gi|152218066|gb|ABS31467.1| NCR 330	MVEILKNFYAMNLFIFLIILAVKIRGAHFPCVTDDDCPKPVNKLRVIKCIDHICQYARNLPDFASEISESTKMPCKGE (SEQ ID NO: 104)	Medicago truncatula
>gi|152218064|gb|ABS31466.1| NCR 329	MFHAQAENMAKVSNFVCIMILFLALFFITMNDAARFECREDSHCVTRIKCVLPRKPECRNYACGCYDSNKYR (SEQ ID NO: 105)	Medicago truncatula
>gi|152218062|gb|ABS31465.1| NCR 328	MQMRQNMATILNFVFVIILFISLLLVVTKGYREPFSSFTEGPTCKEDIDCPSISCVNPQVPKCIMFECHCKYIPTTLK (SEQ ID NO: 106)	Medicago truncatula
>gi|152218060|gb|ABS31464.1| NCR 327	MATILMYVYITILFISILTVLTEGLYEPLYNFRRDPDCRRNIDCPSYLCVAPKVPRCIMFECHCKDIPSDH (SEQ ID NO: 107)	Medicago truncatula
>gi|152218058|gb|ABS31463.1| NCR 326	MTTSLKFVYVAILFLSLLLVVMGGIRRFECRQDSDCPSYFCEKLTVPKCFWSKCYCK (SEQ ID NO: 108)	Medicago truncatula
>gi|152218056|gb|ABS31462.1| NCR 325	MTTSLKFVYVAILFLSLLLVVMGGIRKKECRQDSDCPSYFCEKLTIAKCIHSTCLCK (SEQ ID NO: 109)	Medicago truncatula
>gi|152218054|gb|ABS31461.1| NCR 324	MQIGKNMVETPKLVYFIILFLSIFLCITVSNSSFSQIFNSACKTDKDCPKFGRVNVRCRKGNCVPI (SEQ ID NO: 110)	Medicago truncatula
>gi|152218046|gb|ABS31457.1| NCR 320	MTAILKKFINAVFLFIVLFLATTNVEDFVGGSNDECVYPDVFQCINNICKCVSHHRT (SEQ ID NO: 111)	Medicago truncatula
>gi|152218044|gb|ABS31456.1| NCR 319	MQKRKNMAQIIFYVYALIILFSPFLAARLVFVNPEKPCVTDADCDRYRHESAIYSDMFCKDGYCFIDYHHDPYP (SEQ ID NO: 112)	Medicago truncatula
>gi|152218042|gb|ABS31455.1| NCR 318	MQMRKNMAQILFYVYALLILFTPFLVARIMVVNPNNPCVTDADCQRYRHKLATRMICNQGFCLMDFTHDPYAPSLP (SEQ ID NO: 113)	Medicago truncatula
>gi|152218040|gb|ABS31454.1| NCR 317	MNHISKFVYALIIFLSIYLVVLDGLPISCKDHFECRRKINILRCIYRQEKPMCINSICTCVKLL (SEQ ID NO: 114)	Medicago truncatula
>gi|152218038|gb|ABS31453.1| NCR 316	MQREKNMAKIFEFVYAMIIFILLFLVEKNVVAYLKFECKTDDDCQKSLLKTYVWKCVKNECYFFAKK (SEQ ID NO: 115)	Medicago truncatula
>gi|152218036|gb|ABS31452.1| NCR 315	MAGIIKFVHVLIIFLSLFHVVKNDDGSFCFKDSDCPDEMCPSPLKEMCYFLQCKCGVDTIA (SEQ ID NO: 116)	Medicago truncatula
>gi|152218034|gb|ABS31451.1| NCR 314	MANTHKLVSMILFIFLFLASNNVEGYVNCETDADCPPSTRVKRFKCVKGECRWTRMSYA (SEQ ID NO: 117)	Medicago truncatula
>gi|152218032|gb|ABS31450.1| NCR 313	MQRRKKKAQVVMFVHDLIICIYLFIVITTRKTDIRCRFYYDCPRLEYHFCECIEDFCAYIRLN (SEQ ID NO: 118)	Medicago truncatula
>gi|152218030|gb|ABS31449.1| NCR 312	MAKVYMFVYALIIFVSPFLLATFRTRLPCEKDDDCPEAFLPPVMKCVNRFCQYEILE (SEQ ID NO: 119)	Medicago truncatula
>gi|152218028|gb|ABS31448.1| NCR 310	MIKQFSVCYIQMRRNMTTILKFPYIMVICLLLLHVAAYEDFEKEIFDCKKDGDCDHMCVTPGIPKCTGYVCFCFENL (SEQ ID NO: 120)	Medicago truncatula
>gi|152218026|gb|ABS31447.1| NCR 309	MQRSRNMTTIFKFAYIMIICVFLLNIAAQEIENGIHPCKKNEDCNHMCVMPGLPWCHENNLCFCYENAYGNTR (SEQ ID NO: 121)	Medicago truncatula
>gi|152218024|gb|ABS31446.1| NCR 304	MTIIIKFVNVLIIFLSLFHVAKNDDNKLLLSFIEEGFLCFKDSDCPYNMCPSPLKEMCYFIKCVCGVYGPIRERRLYQSHNPMIQ (SEQ ID NO: 122)	Medicago truncatula
>gi|152218022|gb|ABS31445.1| NCR 303	MRKNMTKILMIGYALMIFIFLSIAVSITGNLARASRKKPVDVIPCIYDHDCPRKLYFLERCVGRVCKYL (SEQ ID NO: 123)	Medicago truncatula
>gi|152218020|gb|ABS31444.1| NCR 301	MAHKLVYAITLFIFLFLIANNIEDDIFCITDNDCPPNTLVQRYRCINGKCNLSFVSYG (SEQ ID NO: 124)	Medicago truncatula
>gi|152218018|gb|ABS31443.1| NCR 300	MDETLKFVYILILFVSLCLVVADGVKNINRECTQTSDCYKKYPFIPWGKVRCVKGRCRLDM (SEQ ID NO: 125)	Medicago truncatula
>gi|152218016|gb|ABS31442.1| NCR 290	MAKIIKFVYVLAIFFSLFLVAKNVNGWTCVEDSDCPANICQPPMQRMCFYGECACVRSKFCT (SEQ ID NO: 126)	Medicago truncatula
>gi|152218014|gb|ABS31441.1| NCR 289	MVKIIKFVYFMTLFLSMLLVTTKEDGSVECIANIDCPQIFMLPFVMRCINFRCQIVNSEDT (SEQ ID NO: 127)	Medicago truncatula
>gi|152218012|gb|ABS31440.1| NCR 286	MDEILKFVYTLIIFFSLFFAANNVDANIMNCQSTFDCPRDMCSHIRDVICIFKKCKCAGGRYMPQVP (SEQ ID NO: 128)	Medicago truncatula
>gi|152218008|gb|ABS31438.1| NCR 278	MQRRKNMANNHMLIYAMIICLFPYLVVTFKTAITCDCNEDCLNFFTPLDNLKCIDNVCEVFM (SEQ ID NO: 129)	Medicago truncatula
>gi|152218006|gb|ABS31437.1| NCR 266	MVNILKFIYVIIFFILMFFVLIDVDGHVLVECIENRDCEKGMCKFPFIVRCLMDQCKCVRIHNLI (SEQ ID NO: 130)	Medicago truncatula
>gi|152218004|gb|ABS31436.1| NCR 265	MIIQFSIYYMQRRKLNMVEILKFSHALIIFLFLSALVTNANIFFCSTDEDCTWNLCRQPWVQKCRLHMCSCEKN (SEQ ID NO: 131)	Medicago truncatula
>gi|152218002|gb|ABS31435.1| NCR 263	MDEVFKFVYVMIIFPFLILDVATNAEKIRRCFNDAHCPPDMCTLGVIPKCSRFTICIC (SEQ ID NO: 132)	Medicago truncatula
>gi|152218000|gb|ABS31434.1| NCR 244	MHRKPNMTKFFKFVYTMFILISLFLVVTNANANNCTDTSDCSSNHCSYEGVSLCMNGQCICIYE (SEQ ID NO: 133)	Medicago truncatula
>gi|152217998|gb|ABS31433.1| NCR 239	MQMKKMATILKFVYLIILLIYPLLVVTEESHYMKFSICKDDTDCPTLFCVLPNVPKCIGSKCHCKLMVN (SEQ ID NO: 134)	Medicago truncatula
>gi|152217996|gb|ABS31432.1| NCR 237	MVETLRLFYIMILFVSLYLVVVDGVSKLAQSCSEDFECYIKNPHAPFGQLRCFEGYCQRLDKPT (SEQ ID NO: 135)	Medicago truncatula
>gi|152217994|gb|ABS31431.1| NCR 228	MTTFLKVAYIMIICVFVLHLAAQVDSQKRLHGCKEDRDCDNICSVHAVTKCIGNMCRCLANVK (SEQ ID NO: 136)	Medicago truncatula
>gi|152217992|gb|ABS31430.1| NCR 224	MRINRTPAIFKFVYTIIIYLFLLRVVAKDLPFNICEKDEDCLEFCAHDKVAKCMLNICFCF (SEQ ID NO: 137)	Medicago truncatula
>gi|152217990|gb|ABS31429.1| NCR 221	MAEILKILYVFIIFLSLILAVISQHPFTPCETNADCKCRNHKRPDCLWHKCYCY (SEQ ID NO: 138)	Medicago truncatula
>gi|152217988|gb|ABS31428.1| NCR 217	MRKSMATILKFVYVIMLFIYSLFVIESFGHRFLIYNNCKNDTECPNDCGPHEQAKCILYACYCVE (SEQ ID NO: 139)	Medicago truncatula
>gi|152217986|gb|ABS31427.1| NCR 209	MNTILKFIFVVFLFLSIFLSAGNSKSYGPCTTLQDCETHNWFEVCSCIDFECKCWSLL (SEQ ID NO: 140)	Medicago truncatula
>gi|152217984|gb|ABS31426.1| NCR 206	MAEIIKFVYIMILCVSLLLIAEASGKECVTDADCENLYPGNKKPMFCNNTGYCMSLYKEPSRYM (SEQ ID NO: 141)	Medicago truncatula
>gi|152217982|gb|ABS31425.1| NCR 201	MAKIIKFVYIMILCVSLLLIVEAGGKECVTDVDCEKIYPGNKKPLICSTGYCYSLYEEPPRYHK (SEQ ID NO: 142)	Medicago truncatula
>gi|152217980|gb|ABS31424.1| NCR 200	MAKVTKFGYIIIHFLSLFFLAMNVAGGRECHANSHCVGKITCVLPQKPECWNYACVCYDSNKYR (SEQ ID NO: 143)	Medicago truncatula
>gi|152217978|gb|ABS31423.1| NCR 192	MAKIFNYVYALIMFLSLFLMGTSGMKNGCKHTGHCPRKMCGAKTTKCRNNKCQCV (SEQ ID NO: 144)	Medicago truncatula
>gi|152217976|gb|ABS31422.1| NCR 189	MTEILKFVCVMIIFISSFIVSKSLNGGGKDKCFRDSDCPKHMCPSSLVAKCINRLCRCRRPELQVQLNP (SEQ ID NO: 145)	Medicago truncatula
>gi|152217974|gb|ABS31421.1| NCR 187	MAHIIMFVYALIYALIIFSSLFVRDGIPCLSDDECPEMSHYSFKCNNKICEYDLGEMSDDDYYLEMSRE (SEQ ID NO: 146)	Medicago truncatula
>gi|152217972|gb|ABS31420.1| NCR 181	MYREKNMAKTLKFVYVIVLFLSLFLAAKNIDGRVSYNSFIALPVCQTAADCPEGTRGRTYKCINNKCRYPKLLKPIQ (SEQ ID NO: 147)	Medicago truncatula
>gi|152217970|gb|ABS31419.1| NCR 176	MAHIFNYVYALLVFLSLFLMVTNGIHIGCDKDRDCPKQMCHLNQTPKCLKNICKCV (SEQ ID NO: 148)	Medicago truncatula
>gi|152217968|gb|ABS31418.1| NCR 175	MAEILKCFYTMNLFIFLIILPAKIREHIQCVIDDDCPKSLNKLLIIKCINHVCQYVGNLPDFASQIPKSTKMPYKGE (SEQ ID NO: 149)	Medicago truncatula
>gi|152217966|gb|ABS31417.1| NCR 173	MAYISRIFYVLIIFLSLFFVVINGVKSLLLIKVRSFIPCQRSDDCPRNLCVDQIIPTCVWAKCKCKNYND (SEQ ID NO: 150)	Medicago truncatula
>gi|152217964|gb|ABS31416.1| NCR 172	MANVTKFVYIAIYFLSLFFIAKNDATATFCHDDSHCVTKIKCVLPRTPQCRNEACGCYHSNKFR (SEQ ID NO: 151)	Medicago truncatula
>gi|152217962|gb|ABS31415.1| NCR 171	MGEIMKFVYVMIIYLFMFNVATGSEFIFTKKLTSCDSSKDCRSFLCYSPKFPVCKRGICECI (SEQ ID NO: 152)	Medicago truncatula
>gi|152217960|gb|ABS31414.1| NCR 169	MGEMFKFIYTFILFVHLFLVVIFEDIGHIKYCGIVDDCYKSKKPLFKIWKCVENVCVLWYK (SEQ ID NO: 153)	Medicago truncatula
>gi|152217958|gb|ABS31413.1| NCR 165	MARTLKFVYSMILFLSLFLVANGLKIFCIDVADCPKDLYPLLYKCIYNKCIVFTRIPFPFDWI (SEQ ID NO: 154)	Medicago truncatula
>gi|152217956|gb|ABS31412.1| NCR 159	MANITKFVYIAILFLSLFFIGMNDAAILECREDSHCVTKIKCVLPRKPECRNNACTCYKGGFSFHH (SEQ ID NO: 155)	Medicago truncatula
>gi|152217954|gb|ABS31411.1| NCR 147	MQRVKKMSETLKFVYVLILFISIFHVVIVCDSIYFPVSRPCITDKDCPNMKHYKAKCRKGFCISSRVR (SEQ ID NO: 156)	Medicago truncatula
>gi|152217952|gb|ABS31410.1| NCR 146	MQIRKIMSGVLKFVYAIILFLFLFLVAREVGGLETIECETDGDCPRSMIKMWNKNYRHKCIDGKCEWIKKLP (SEQ ID NO: 157)	Medicago truncatula
>gi|152217950|gb|ABS31409.1| NCR 145	MFVYDLILFISLILVVTGINAEADTSCHSFDDCPWVAHHYRECIEGLCAYRILY (SEQ ID NO: 158)	Medicago truncatula
>gi|152217948|gb|ABS31408.1| NCR 144	MQRRKKSMAKMLKFFFAIILLLSLFLVATEVGGAYIECEVDDDCPKPMKNSHPDTYYKCVKHRCQWAWK (SEQ ID NO: 159)	Medicago truncatula
>gi|152217946|gb|ABS31407.1| NCR 140	MFVYTLIIFLFPSHVITNKIAIYCVSDDDCLKTFTPLDLKCVDNVCEFNLRCKGKCGERDEKFVFLKALKKMDQKLVLEEQGNAREVKIPKKLLFDRIQVPTPATKDQVEEDDYDDDDEEEEEEEDDVDMWFHLPDVVCH (SEQ ID NO: 160)	Medicago truncatula
>gi|152217944|gb|ABS31406.1| NCR 138	MAKFSMFVYALINFLSLFLVETAITNIRCVSDDDCPKVIKPLVMKCIGNYCYFFMIYEGP (SEQ ID NO: 161)	Medicago truncatula
>gi|152217942|gb|ABS31405.1| NCR 136	MAHKFVYAIILFIFLFLVAKNVKGYVVCRTVDDCPPDTRDLRYRCLNGKCKSYRLSYG (SEQ ID NO: 162)	Medicago truncatula
>gi|152217940|gb|ABS31404.1| NCR 129	MQRKKNMGQILIFVFALINFLSPILVEMTTTTIPCTFIDDCPKMPLVVKCIDNFCNYFEIK (SEQ ID NO: 163)	Medicago truncatula
>gi|152217938|gb|ABS31403.1| NCR 128	MAQTLMLVYALIIFTSLFLVVISRQTDIPCKSDDACPRVSSHHIECVKGFCTYWKLD (SEQ ID NO: 164)	Medicago truncatula
>gi|152217936|gb|ABS31402.1| NCR 127	MLRRKNTVQILMFVSALLIYIFLFLVITSSANIPCNSDSDCPWKIYYTYRCNDGFCVYKSIDPSTIPQYMTDLIFPR (SEQ ID NO: 165)	Medicago truncatula
>gi|152217934|gb|ABS31401.1| NCR 122	MAVILKFVYIMIIFLFLLYVVNGTRCNRDEDCPFICTGPQIPKCVSHICFCLSSGKEAY (SEQ ID NO: 166)	Medicago truncatula
>gi|152217932|gb|ABS31400.1| NCR 121	MDAILKFIYAMFLFLFLFVTTRNVEALFECNRDFVCGNDDECVYPYAVQCIHRYCKCLKSRN (SEQ ID NO: 167)	Medicago truncatula
>gi|152217930|gb|ABS31399.1| NCR 119	MQIGRKKMGETPKLVYVIILFLSIFLCTNSSFSQMINFRGCKRDKDCPQFRGVNIRCRSGFCTPIDS (SEQ ID NO: 168)	Medicago truncatula
>gi|152217928|gb|ABS31398.1| NCR 118	MQMRKNMAQILFYVYALLILFSPFLVARIMVVNPNNPCVTDADCQRYRHKLATRMVCNIGFCLMDFTHDPYAPSLP (SEQ ID NO: 169)	Medicago truncatula
>gi|152217926|gb|ABS31397.1| NCR 111	MYVYYIQMGKNMAQRFMFIYALIIFLSQFFVVINTSDIPNNSNRNSPKEDVFCNSNDDCPTILYYVSKCVYNFCEYW (SEQ ID NO: 170)	Medicago truncatula
>gi|152217924|gb|ABS31396.1| NCR 103	MAKIVNFVYSMIIFVSLFLVATKGGSKPFLTRPYPCNTGSDCPQNMCPPGYKPGCEDGYCNHCYKRW (SEQ ID NO: 171)	Medicago truncatula
>gi|152217922|gb|ABS31395.1| NCR 101	MVRTLKFVYVIILILSLFLVAKGGGKKIYCENAASCPRLMYPLVYKCLDNKCVKFMMKSRFV (SEQ ID NO: 172)	Medicago truncatula
>gi|152217920|gb|ABS31394.1| NCR 96	MARTLKFVYAVILFLSLFLVAKGDDVKIKCVVAANCPDLMYPLVYKCLNGICVQFTLTFPFV (SEQ ID NO: 173)	Medicago truncatula
>gi|152217918|gb|ABS31393.1| NCR 94	MSNTLMFVITFIVLVTLFLGPKNVYAFQPCVTTADCMKTLKTDENIWYECINDFCIPFPIPKGRK (SEQ ID NO: 174)	Medicago truncatula
>gi|152217916|gb|ABS31392.1| NCR 93	MKRVVNMAKIVKYVYVIIIFLSLFLVATKIEGYYYKCFKDSDCVKLLCRIPLRPKCMYRHICKCKVVLTQNNYVLT (SEQ ID NO: 175)	Medicago truncatula
>gi|152217914|gb|ABS31391.1| NCR 90	MKRGKNMSKILKFIYATLVLYLFLVVTKASDDECKIDGDCPISWQKFHTYKCINQKCKWVLRFHEY (SEQ ID NO: 176)	Medicago truncatula
>gi|152217912|gb|ABS31390.1| NCR 88	MAKTLNFMFALILFISLFLVSKNVAIDIFVCQTDADCPKSELSMYTWKCIDNECNLFKVMQQMV (SEQ ID NO: 177)	Medicago truncatula
>gi|152217910|gb|ABS31389.1| NCR 86	MANTHKLVSMILFIFLFLVANNVEGYVNCETDADCPPSTRVKRFKCVKGECRWTRMSYA (SEQ ID NO: 178)	Medicago truncatula
>gi|152217908|gb|ABS31388.1| NCR 77	MAHFLMFVYALITCLSLFLVEMGHLSIHCVSVDDCPKVEKPITMKCINNYCKYFVDHKL (SEQ ID NO: 179)	Medicago truncatula
>gi|152217906|gb|ABS31387.1| NCR 76	MNQIPMFGYTLIIFFSLFPVITNGDRIPCVTNGDCPVMRLPLYMRCITYSCELFFDGPNLCAVERI (SEQ ID NO: 180)	Medicago truncatula
>gi|152217904|gb|ABS31386.1| NCR 74	MRKDMARISLFVYALIIFFSLFFVLTNGELEIRCVSDADCPLFPLPLHNRCIDDVCHLFTS (SEQ ID NO: 181)	Medicago truncatula
>gi|152217902|gb|ABS31385.1| NCR 68	MAQILMFVYFLIIFLSLFLVESIKIFTEHRCRTDADCPARELPEYLKCQGGMCRLLIKKD (SEQ ID NO: 182)	Medicago truncatula
>gi|152217900|gb|ABS31384.1| NCR 65	MARVISLFYALIIFLFLFLVATNGDLSPCLRSGDCSKDECPSHLVPKCIGLTCYCI (SEQ ID NO: 183)	Medicago truncatula
>gi|152217898|gb|ABS31383.1| NCR 62	MQRRKNMAQILLFAYVFIISISLFLVVTNGVKIPCVKDTDCPTLPCPLYSKCVDGFCKMLSI (SEQ ID NO: 184)	Medicago truncatula
>gi|152217896|gb|ABS31382.1| NCR 57	MNHISKFVYALIIFLSVYLVVLDGRPVSCKDHYDCRRKVKIVGCIFPQEKPMCINSMCTCIREIVP (SEQ ID NO: 185)	Medicago truncatula
>gi|152217894|gb|ABS31381.1| NCR 56	MKSQNHAKFISFYKNDLFKIFQNNDSHFKVFFALIIFLYTYLHVTNGVFVSCNSHIHCRVNNHKIGCNIPEQYLLCVNLFCLWLDY (SEQ ID NO: 186)	Medicago truncatula
>gi|152217892|gb|ABS31380.1| NCR 54	MTYISKVVYALIIFLSIYVGVNDCMLVTCEDHFDCRQNVQQVGCSFREIPQCINSICKCMKG (SEQ ID NO: 187)	Medicago truncatula
>gi|152217890|gb|ABS31379.1| NCR 53	MTHISKFVFALIIFLSIYVGVNDCKRIPCKDNNDCNNNWQLLACRFEREVPRCINSICKCMPM (SEQ ID NO: 188)	Medicago truncatula
>gi|152217888|gb|ABS31378.1| NCR 43	MVQTPKLVYVIVLLLSIFLGMTICNSSFSHFFEGACKSDKDCPKLHRSNVRCRKGQCVQI (SEQ ID NO: 189)	Medicago truncatula
>gi|152217886|gb|ABS31377.1| NCR 28	MTKILMLFYAMIVFHSIFLVASYTDECSTDADCEYILCLFPIIKRCIHNHCKCVPMGSIEPMSTIPNGVHKFHIINN (SEQ ID NO: 190)	Medicago truncatula
>gi|152217884|gb|ABS31376.1| NCR 26	MAKTLNFVCAMILFISLFLVSKNVALYIIECKTDADCPISKLNMYNWRCIKSSCHLYKVIQFMV (SEQ ID NO: 191)	Medicago truncatula
>gi|152217882|gb|ABS31375.1| NCR 24	MQKEKNMAKTFEFVYAMIIFILLFLVENNFAAYIIECQTDDDCPKSQLEMFAWKCVKNGCHLFGMYEDDDDP (SEQ ID NO: 192)	Medicago truncatula
>gi|152217880|gb|ABS31374.1| NCR 21	MAATRKFIYVLSHFLFLFLVTKITDARVCKSDKDCKDIIIYRYILKCRNGECVKIKI (SEQ ID NO: 193)	Medicago truncatula
>gi|152217878|gb|ABS31373.1| NCR 20	MQRLDNMAKNVKFIYVIILLLFIFLVIIVCDSAFVPNSGPCTTDKDCKQVKGYIARCRKGYCMQSVKRTWSSYSR (SEQ ID NO: 194)	Medicago truncatula
>gi|152217876|gb|ABS31372.1| NCR 19	MKFIYIMILFLSLFLVQFLTCKGLTVPCENPTTCPEDFCTPPMITRCINFICLCDGPEYAEPEYDGPEPEYDHKGDFLSVKPKIINENMMMRERHMMKEIEV (SEQ ID NO: 195)	Medicago truncatula
>gi|152217874|gb|ABS31371.1| NCR 12	MAQFLMFIYVLIIFLYLFYVEAAMFELTKSTIRCVTDADCPNVVKPLKPKCVDGFCEYT (SEQ ID NO: 196)	Medicago truncatula
>gi|152217872|gb|ABS31370.1| NCR 10	MKMRIHMAQIIMFFYALIIFLSPFLVDRRSFPSSFVSPKSYTSEIPCKATRDCPYELYYETKCVDSLCTY (SEQ ID NO: 197)	Medicago truncatula

Любой пептид NCR, известный в данной области техники, является подходящим для применения в способах или композициях, описанных в данном документе. Растения, продуцирующие пептиды NCR, включают в себя без ограничения Pisum sativum (горох), Astragalus sinicus (бобовые IRLC), Phaseolus vulgaris (фасоль), Vigna unguiculata (коровий горох), Medicago truncatula (люцерну усеченную) и Lotus japonicus. Например, на основании геномной последовательности M. truncatula прогнозируют свыше 600 потенциальных пептидов NCR, и почти 150 различных пептидов NCR были выявлены в клетках, выделенных из корневых клубеньков, с помощью масс–спектрометрии.

Пептиды NCR, описанные в данном документе, могут быть зрелыми или незрелыми пептидами NCR. Незрелые пептиды NCR имеют C–концевой сигнальный пептид, который требуется для транслокации в эндоплазматический ретикулум и отщепляется после транслокации. N–конец пептида NCR содержит сигнальный пептид, который может быть отщепляемым, для нацеливания на секреторный путь. Пептиды NCR, как правило, представляют собой малые пептиды с дисульфидными мостиками, которые стабилизируют их структуры. Зрелые пептиды NCR имеют длину в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 60 аминокислот, от приблизительно 25 до приблизительно 55 аминокислот, от приблизительно 30 до приблизительно 50 аминокислот, от приблизительно 35 до приблизительно 45 аминокислот или в любом диапазоне в промежутке между этими значениями. Пептиды NCR могут содержать консервативную последовательность из цистеиновых остатков, при этом остальная часть пептидной последовательности является высоковариабельной. Пептиды NCR, как правило, имеют от четырех до восьми молекул цистеина.

Пептиды NCR могут быть анионными, нейтральными или катионными. В некоторых случаях синтетические катионные пептиды NCR, имеющие pI, превышающую приблизительно восемь, обладают формами противомикробной активности. Например, как NCR247 (pI=10,15) (RNGCIVDPRCPYQQCRRPLYCRRR; SEQ ID NO: 198), так и NCR335 (pI=11,22) являются эффективными в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также грибов. В некоторых случаях нейтральные и/или анионные пептиды NCR, такие как NCR001 (MAQFLLFVYSLIIFLSLFFGEAAFERTETRMLTIPCTSDDNCPKVISPCHTKCFDGFCGWYIEGSYEGP; SEQ ID NO: 199), не обладают формами противомикробной активности при pI, превышающей приблизительно 8.

В некоторых случаях пептид NCR является эффективным в уничтожении бактерий. В некоторых случаях пептид NCR является эффективным в уничтожении S. meliloti, Xenorhabdus spp, Photorhabdus spp, Candidatus spp, Buchnera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp или Escherichia spp.

В некоторых случаях пептид NCR представляет собой функционально активный вариант пептида NCR, описанного в данном документе. В некоторых случаях вариант пептида NCR является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности пептида NCR, описанного в данном документе, или пептида NCR природного происхождения.

В некоторых случаях пептид NCR можно создавать с помощью биоинженерии для модулирования его биологической активности, например, повышения, или снижения, или регулирования, или для определения его микроорганизма–мишени. В некоторых случаях пептид NCR продуцируется трансляционным аппаратом (например, рибосомой и т. д.) клетки. В некоторых случаях пептид NCR синтезируют химическим путем. В некоторых случаях пептид NCR образуется из полипептидного предшественника. Полипептидный предшественник может подвергаться расщеплению (например, процессингу под действием протеазы) с образованием самого пептида NCR. Таким образом, в некоторых случаях пептид NCR продуцируется из полипептида–предшественника. В некоторых случаях пептид NCR включает в себя полипептид, который подвергся посттрансляционным модификациям, например, расщеплению или добавлению одной или нескольких функциональных групп.

Пептид NCR, описанный в данном документе, может быть составлен в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип пептидов NCR, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 пептида NCR, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 или больше пептидов NCR. Подходящая концентрация каждого пептида NCR в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность пептида NCR, количество различных пептидов NCR, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях концентрация каждого пептида NCR в жидкой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых случаях концентрация каждого пептида NCR в твердой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 100 мг/г. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа пептидов NCR, то концентрация каждого типа пептида NCR может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя пептид NCR, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином–мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации пептида NCR внутри хозяина–мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации пептида NCR внутри кишки хозяина–мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации пептида NCR внутри бактериоцита хозяина–мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина–мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина–мишени.

Регуляторные пептиды бактериоцитов

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя регуляторный пептид бактериоцитов (BRP). BRP представляют собой пептиды, экспрессируемые в бактериоцитах насекомых. Эти гены впервые экспрессируются в момент времени развития, совпадающий с включением симбионтов, а их специфичная для бактериоцитов экспрессия поддерживается в течение всей жизни насекомого. В некоторых случаях BRP имеет гидрофобный аминоконцевой домен, который, как предполагается, представляет собой сигнальный пептид. Помимо этого, некоторые BRP имеют домен, богатый цистеином. В некоторых случаях регуляторный пептид бактериоцитов представляет собой специфичный для бактериоцитов белок, богатый цистеином (BCR). Регуляторные пептиды бактериоцитов имеют длину от приблизительно 40 до 150 аминокислот. В некоторых случаях регуляторный пептид бактериоцитов имеет длину в диапазоне от приблизительно 45 до приблизительно 145, от приблизительно 50 до приблизительно 140, от приблизительно 55 до приблизительно 135, от приблизительно 60 до приблизительно 130, от приблизительно 65 до приблизительно 125, от приблизительно 70 до приблизительно 120, от приблизительно 75 до приблизительно 115, от приблизительно 80 до приблизительно 110, от приблизительно 85 до приблизительно 105 или в любом диапазоне в промежутке между этими значениями. Неограничивающие примеры BRP и форм их активности приведены в таблице 8.

Таблица 8. Примеры регуляторных пептидов бактериоцитов

Название	Пептидная последовательность
Семейство специфичных для бактериоцитов белков BCR, богатых цистеином, пептид BCR1	MKLLHGFLIIMLTMHLSIQYAYGGPFLTKYLCDRVCHKLCGDEFVCSCIQYKSLKGLWFPHCPTGKASVVLHNFLTSP (SEQ ID NO: 200)
Семейство специфичных для бактериоцитов белков BCR, богатых цистеином, пептид BCR2	MKLLYGFLIIMLTIHLSVQYFESPFETKYNCDTHCNKLCGKIDHCSCIQYHSMEGLWFPHCRTGSAAQMLHDFLSNP (SEQ ID NO: 201)
Семейство специфичных для бактериоцитов белков BCR, богатых цистеином, пептид BCR3	MSVRKNVLPTMFVVLLIMSPVTPTSVFISAVCYSGCGSLALVCFVSNGITNGLDYFKSSAPLSTSETSCGEAFDTCTDHCLANFKF (SEQ ID NO: 202)
Семейство специфичных для бактериоцитов белков BCR, богатых цистеином, пептид BCR4	MRLLYGFLIIMLTIYLSVQDFDPTEFKGPFPTIEICSKYCAVVCNYTSRPCYCVEAAKERDQWFPYCYD (SEQ ID NO: 203)
Семейство специфичных для бактериоцитов белков BCR, богатых цистеином, пептид BCR5	MRLLYGFLIIMLTIHLSVQDIDPNTLRGPYPTKEICSKYCEYNVVCGASLPCICVQDARQLDHWFACCYDGGPEMLM (SEQ ID NO: 204)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP1	MKLFVVVVLVAVGIMFVFASDTAAAPTDYEDTNDMISLSSLVGDNSPYVRVSSADSGGSSKTSSKNPILGLLKSVIKLLTKIFGTYSDAAPAMPPIPPALRKNRGMLA (SEQ ID NO: 205)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP2	MVACKVILAVAVVFVAAVQGRPGGEPEWAAPIFAELKSVSDNITNLVGLDNAGEYATAAKNNLNAFAESLKTEAAVFSKSFEGKASASDVFKESTKNFQAVVDTYIKNLPKDLTLKDFTEKSEQALKYMVEHGTEITKKAQGNTETEKEIKEFFKKQIENLIGQGKALQAKIAEAKKA (SEQ ID NO: 206)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP3	MKTSSSKVFASCVAIVCLASVANALPVQKSVAATTENPIVEKHGCRAHKNLVRQNVVDLKTYDSMLITNEVVQKQSNEVQSSEQSNEGQNSEQSNEGQNSEQSNEVQSSEHSNEGQNSKQSNEGQNSEQSNEVQSSEHSNEGQNSEQSNEVQSSEHSNEGQNSKQSNEGQNSKQSNEVQSSEHWNEGQNSKQSNEDQNSEQSNEGQNSKQSNEGQNSKQSNEDQNSEQSNEGQNSKQSNEVQSSEQSNEGQNSKQSNEGQSSEQSNEGQNSKQSNEVQSPEEHYDLPDPESSYESEETKGSHESGDDSEHR (SEQ ID NO: 207)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP4	MKTIILGLCLFGALFWSTQSMPVGEVAPAVPAVPSEAVPQKQVEAKPETNAASPVSDAKPESDSKPVDAEVKPTVSEVKAESEQKPSGEPKPESDAKPVVASESKPESDPKPAAVVESKPENDAVAPETNNDAKPENAAAPVSENKPATDAKAETELIAQAKPESKPASDLKAEPEAAKPNSEVPVALPLNPTETKATQQSVETNQVEQAAPAAAQADPAAAPAADPAPAPAAAPVAAEEAKLSESAPSTENKAAEEPSKPAEQQSAKPVEDAVPAASEISETKVSPAVPAVPEVPASPSAPAVADPVSAPEAEKNAEPAKAANSAEPAVQSEAKPAEDIQKSGAVVSAENPKPVEEQKPAEVAKPAEQSKSEAPAEAPKPTEQSAAEEPKKPESANDEKKEQHSVNKRDATKEKKPTDSIMKKQKQKKAN (SEQ ID NO: 208)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP5a	MNGKIVLCFAVVFIGQAMSAATGTTPEVEDIKKVAEQMSQTFMSVANHLVGITPNSADAQKSIEKIRTIMNKGFTDMETEANKMKDIVRKNADPKLVEKYDELEKELKKHLSTAKDMFEDKVVKPIGEKVELKKITENVIKTTKDMEATMNKAIDGFKKQ (SEQ ID NO: 209)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP6	MHLFLALGLFIVCGMVDATFYNPRSQTFNQLMERRQRSIPIPYSYGYHYNPIEPSINVLDSLSEGLDSRINTFKPIYQNVKMSTQDVNSVPRTQYQPKNSLYDSEYISAKDIPSLFPEEDSYDYKYLGSPLNKYLTRPSTQESGIAINLVAIKETSVFDYGFPTYKSPYSSDSVWNFGSKIPNTVFEDPQSVESDPNTFKVSSPTIKIVKLLPETPEQESIITTTKNYELNYKTTQETPTEAELYPITSEEFQTEDEWHPMVPKENTTKDESSFITTEEPLTEDKSNSITIEKTQTEDESNSIEFNSIRTEEKSNSITTEENQKEDDESMSTTSQETTTAFNLNDTFDTNRYSSSHESLMLRIRELMKNIADQQNKSQFRTVDNIPAKSQSNLSSDESTNQQFEPQLVNGADTYK (SEQ ID NO: 210)
Колеоптерицин A, пептид ColA	MTRTMLFLACVAALYVCISATAGKPEEFAKLSDEAPSNDQAMYESIQRYRRFVDGNRYNGGQQQQQQPKQWEVRPDLSRDQRGNTKAQVEINKKGDNHDINAGWGKNINGPDSHKDTWHVGGSVRW (SEQ ID NO: 211)
RlpA I типа	MKETTVVWAKLFLILIILAKPLGLKAVNECKRLGNNSCRSHGECCSGFCFIEPGWALGVCKRLGTPKKSDDSNNGKNIEKNNGVHERIDDVFERGVCSYYKGPSITANGDVFDENEMTAAHRTLPFNTMVKVEGMGTSVVVKINDRKTAADGKVMLLSRAAAESLNIDENTGPVQCQLKFVLDGSGCTPDYGDTCVLHHECCSQNCFREMFSDKGFCLPK (SEQ ID NO: 212)

В некоторых случаях BRP изменяет рост и/или активность одной или нескольких бактерий, обитающих в бактериоците хозяина. В некоторых случаях BRP можно создавать с помощью биоинженерии для модулирования его биологической активности (например, повышения, снижения или регулирования) или для определения его микроорганизма–мишени. В некоторых случаях BRP продуцируется трансляционным аппаратом (например, рибосомой и т. д.) клетки. В некоторых случаях BRP синтезируют химическим путем. В некоторых случаях BRP образуется из полипептидного предшественника. Полипептидный предшественник может подвергаться расщеплению (например, процессингу под действием протеазы) с образованием самого полипептида BRP. Таким образом, в некоторых случаях BRP продуцируется из полипептида–предшественника. В некоторых случаях BRP включает в себя полипептид, который подвергся посттрансляционным модификациям, например, расщеплению или добавлению одной или нескольких функциональных групп.

Функционально активные варианты BRP, описанные в данном документе, также пригодны в композициях и способах, описанных в данном документе. В некоторых случаях вариант BRP является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности BRP, описанного в данном документе, или BRP природного происхождения.

BRP, описанный в данном документе, может быть составлен в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) BRP, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 BRP, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или больше BRP. Подходящая концентрация каждого BRP в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность BRP, количество различных BRP, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях концентрация каждого BRP в жидкой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых случаях концентрация каждого BRP в твердой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 100 мг/г. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа BRP, то концентрация каждого типа BRP может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя BRP, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином–мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации BRP внутри хозяина–мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации BRP внутри кишки хозяина–мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации BRP внутри бактериоцита хозяина–мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина–мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина–мишени.

Малые молекулы

Многочисленные малые молекулы (например, антибиотик или метаболит) можно применять в композициях и способах, описанных в данном документе. В некоторых случаях эффективная концентрация любой малой молекулы, описанной в данном документе, может изменять уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов (описанных выше), обитающих в организме хозяина, при этом изменение приводит к снижению приспособленности хозяина.

Модулирующее средство, включающее в себя малую молекулу, описанную в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином–мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации малой молекулы внутри хозяина–мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации малой молекулы внутри кишки хозяина–мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации малой молекулы внутри бактериоцита хозяина–мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина–мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина–мишени.

Малые молекулы, обсуждаемые далее в данном документе, а именно антибиотики и вторичные метаболиты, можно применять для изменения уровня, активности или метаболизма микроорганизмов–мишеней, как указано в разделах касательно снижения приспособленности насекомых, таких как тли.

Антибиотики

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя антибиотик. Можно применять любой антибиотик, известный в данной области техники. Антибиотики обычно классифицируются на основании их механизма действия, химической структуры или спектра активности.

Антибиотик, описанный в данном документе, может целенаправленно воздействовать на любую функцию или процессы роста бактерий и может быть как бактериостатическим (например, замедлять или предупреждать рост бактерий), так и бактерицидным (например, уничтожать бактерии). В некоторых случаях антибиотик представляет собой бактерицидный антибиотик. В некоторых случаях бактерицидный антибиотик представляет собой антибиотик, который целенаправленно воздействует на клеточную стенку бактерий (например, пенициллины и цефалоспорины); антибиотик, который целенаправленно воздействует на клеточную мембрану (например, полимиксины); или антибиотик, который ингибирует важнейшие ферменты бактерий (например, рифамицины, липиармицины, хинолоны и сульфонамиды). В некоторых случаях бактерицидный антибиотик представляет собой аминогликозид. В некоторых случаях антибиотик представляет собой бактериостатический антибиотик. В некоторых случаях бактериостатический антибиотик целенаправленно воздействует на синтез белка (например, макролиды, линкозамиды и тетрациклины). Дополнительные классы антибиотиков, которые можно применять в данном документе, включают в себя циклические липопептиды (такие как даптомицин), глицилциклины (такие как тигециклин), оксазолидиноны (такие как линезолид) или липиармицины (такие как фидаксомицин). Примеры антибиотиков включают в себя рифампицин, ципрофлоксацин, доксициклин, ампициллин и полимиксин B. Другие неограничивающие примеры антибиотиков находятся в таблице 9.

Таблица 9. Примеры антибиотиков

Антибиотики	Действие
Пенициллины, цефалоспорины, ванкомицин	Синтез клеточной стенки
Полимиксин, грамицидин	Мембраноактивное средство, разрушает клеточную мембрану
Тетрациклины, макролиды, хлорамфеникол, клиндамицин, спектиномицин	Ингибируют синтез белка
Сульфонамиды	Ингибируют фолат–зависимые пути
Ципрофлоксацин	Ингибируют ДНК–гиразу
Изониазид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол, (миамбутол), стрептомицин	Антимикобактериальные средства

Антибиотик, описанный в данном документе, может характеризоваться любым уровнем специфичности к мишеням (например, узким или широким спектром действия). В некоторых случаях антибиотик представляет собой антибиотик узкого спектра действия и, таким образом, целенаправленно воздействует на конкретные типы бактерий, такие как грамотрицательные или грамположительные бактерии. В качестве альтернативы, антибиотик может представлять собой антибиотик широкого спектра действия, который целенаправленно воздействует на широкий круг бактерий.

Антибиотики, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) антибиотиков, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 антибиотика, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или больше антибиотиков (например, комбинацию рифампицина и доксициклина или комбинацию ампициллина и рифампицина). Подходящая концентрация каждого антибиотика в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность антибиотика, количество различных антибиотиков, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа антибиотиков, то концентрация каждого типа антибиотика может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя антибиотик, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином–мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации антибиотика внутри хозяина–мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации антибиотика внутри кишки хозяина–мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации антибиотика внутри бактериоцита хозяина–мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина–мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина–мишени.

Как проиллюстрировано в примерах 6 и 11, антибиотики (например, рифампицин) можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию, такую как Buchnera spp., в организме насекомого–хозяина, как, например, тлей, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе). Как дополнительно проиллюстрировано в примере 7, антибиотики, такие как окситетрациклин, можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию, такую как Bacillus spp., в организме насекомого–хозяина, как, например, микроскопических клещей Varroa, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе). Кроме того, как дополнительно проиллюстрировано в примере 23, антибиотики (например, ципрофлоксацин) можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию, такую как Sitophilus spp., в организме насекомого–хозяина, как, например, долгоносиков, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе). Как также проиллюстрировано в примере 24, антибиотики (например, рифампицин или доксициклин) можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию в организме насекомого–хозяина, как, например, микроскопических клещей, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе).

Вторичные метаболиты

В некоторых случаях модулирующее средство в композициях и способах, описанных в данном документе, включает в себя вторичный метаболит. Вторичные метаболиты образуются из органических молекул, продуцируемых организмом. Вторичные метаболиты могут выступать (i) в качестве конкурентных средств, применяемых в отношении бактерий, грибов, амеб, растений, насекомых и крупных животных; (ii) в качестве средств, транспортирующих металлы; (iii) в качестве средств симбиоза между микроорганизмами и растениями, насекомыми и более крупными животными; (iv) в качестве половых гормонов и (v) в качестве эффекторов дифференцировки. Неограничивающие примеры вторичных метаболитов находятся в таблице 10.

Таблица 10. Примеры вторичных метаболитов

Фенилпропаноиды	Алкалоиды	Терпеноиды	Хиноны	Стероиды	Поликетиды
Антоцианы	Акридины	Каротины	Антрохиноны	Сердечные	Эритромицин
Кумарины	Беталаины	Монотерпены	Бензохиноны	гликозиды	Ловастатин и другие статины
Флавоноиды	Хинолизидины	Сесквитерпены	Нафтохиноны	Производные	Дискодермолид
Производные	Фуронохиноны	Дитерпены		прегненолона	Афлатоксин B1
гидроксициннамоила	Харрингтонины	Тритерпены			Авермектины
Изофлавоноиды	Изохинолины				Нистатин
Лигнаны	Индолы				Рифамицин
Феноленоны	Пурины
Проантоцианидины	Пиридины
Стильбены	Тропановые
Таннины	алкалоиды

Вторичный метаболит, применяемый в данном документе, может включать в себя метаболит из любой известной группы вторичных метаболитов. Например, вторичные метаболиты можно классифицировать на следующие группы: алкалоиды, терпеноиды, флавоноиды, гликозиды, природные фенолы (например, госсиполуксусная кислота), енали (например, транс–коричный альдегид), феназины, бифенолы и дибензофураны, поликетиды, пептиды синтазы жирных кислот, нерибосомальные пептиды, пептиды, синтезируемые в рибосомах и подвергающиеся посттрансляционным модификациям, полифенолы, полисахариды (например, хитозан) и биополимеры. Углубленный обзор вторичных метаболитов см., например, в Vining, Annu. Rev. Microbiol. 44:395–427, 1990.

Вторичные метаболиты, пригодные для композиций и способов, описанных в данном документе, включают в себя метаболиты, которые изменяют природную функцию эндосимбионта (например, первичного или вторичного эндосимбионта), бактериоцита или внеклеточного симбионта. В некоторых случаях один или несколько вторичных метаболитов, описанных в данном документе, выделяют в результате высокопроизводительного скрининга (HTS) противомикробных соединений. Например, скрининг HTS выявил 49 антибактериальных экстрактов, которые характеризуются специфичностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, из свыше 39000 неочищенных экстрактов из организмов, растущих в различных экосистемах одного конкретного региона. В некоторых случаях вторичный метаболит транспортируется внутрь бактериоцита.

В некоторых случаях малая молекула представляет собой ингибитор синтеза витаминов. В некоторых случаях ингибитор синтеза витаминов представляет собой аналог предшественника витамина. В определенных случаях аналог предшественника витамина представляет собой пантотенол. Например, пантотенол можно применять для ингибирования синтеза витамина B5 у Buchnera в организмах тлей.

В некоторых случаях малая молекула представляет собой аналог аминокислоты. В определенных случаях аналог аминокислоты представляет собой L–канаванин, D–аргинин, D–валин, D–метионин, D–фенилаланин, D–гистидин, D–триптофан, D–треонин, D–лейцин, L–NG–нитроаргинин или их комбинацию.

В некоторых случаях малая молекула представляет собой природное противомикробное соединение, такое как пропионовая кислота, левулиновая кислота, транс–коричный альдегид или низкомолекулярный хитозан. Вторичный метаболит, описанный в данном документе, может быть составлен в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) вторичных метаболитов, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 вторичного метаболита, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или больше вторичных метаболитов. Подходящая концентрация каждого вторичного метаболита в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность вторичного метаболита, количество различных вторичных метаболитов, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа вторичных метаболитов, то концентрация каждого типа вторичного метаболита может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя вторичный метаболит, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином–мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации вторичного метаболита внутри хозяина–мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации вторичного метаболита внутри кишки хозяина–мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации вторичного метаболита внутри бактериоцита хозяина–мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина–мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина–мишени.

Как проиллюстрировано в примере 15, вторичные метаболиты (например, госсипол) можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию, такую как Buchnera spp., в организме насекомого–хозяина, как, например, тлей, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе). Как дополнительно проиллюстрировано в примерах 8–10, 12–14, 16, 20 и 21, малые молекулы, такие как транс–коричный альдегид, левулиновая кислота, хитозан, аналоги витаминов или ингибиторы транспорта аминокислот, можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию, такую как Buchnera spp., в организме насекомого–хозяина, как, например, тлей, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе).

Бактерии в качестве модулирующих средств

В некоторых случаях модулирующее средство, описанное в данном документе, включает в себя одну или несколько бактерий. Многочисленные бактерии являются пригодными в композициях и способах, описанных в данном документе. В некоторых случаях средство представляет собой вид бактерий, обнаруживаемый эндогенно в организме хозяина. В некоторых случаях бактериальное модулирующее средство представляет собой вид эндосимбиотических бактерий. В некоторых случаях бактериальное модулирующее средство представляет собой патоген в организме хозяина. Неограничивающие примеры бактерий, которые можно применять в качестве модулирующих средств, включают в себя все виды бактерий, описанные в данном документе в разделе II подробного описания, и виды бактерий, приведенные в таблице 1. Например, модулирующее средство может представлять собой вид бактерий из любого типа бактерий, присутствующего в кишках насекомых, в том числе Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes (например, Lactobacillus и Bacillus spp.), Clostridia, Actinomycetes, Spirochetes, Verrucomicrobia и Actinobacteria.

В некоторых случаях модулирующее средство представляет собой бактерию, которая нарушает разнообразие микроорганизмов или иным образом изменяет микробиоту хозяина таким образом, что это является пагубным для хозяина. В одном случае бактерии могут быть предусмотрены для нарушения микробиоты насекомых. Например, бактериальное модулирующее средство может конкурировать с популяцией симбиотических бактерий в организме насекомого, вытеснять и/или уменьшать ее. Например, бактерия может снижать приспособленность хозяина путем конкуренции с симбиотическими бактериями в организме хозяина, которые придают устойчивость к пестициду (например, пестициду, приведенному в таблице 12). В других случаях бактерия может представлять собой патоген, который снижает приспособленность хозяина, вызывая заболевание у хозяина.

Бактериальные модулирующие средства, обсуждаемые в данном документе, можно применять для изменения уровня, активности или метаболизма микроорганизмов–мишеней, как указано в разделах касательно снижения приспособленности насекомых, таких как тли.

Модификации в отношении модулирующих средств

Продукты слияния

Любое из модулирующих средств, описанных в данном документе, может быть слито или связано с дополнительным фрагментом. В некоторых случаях модулирующее средство включает в себя продукт слияния одного или нескольких дополнительных фрагментов (например, 1 дополнительного фрагмента, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше дополнительных фрагментов). В некоторых случаях дополнительное средство представляет собой любое из модулирующих средств, описанных в данном документе (например, пептид, полипептид, малую молекулу или антибиотик). В качестве альтернативы, дополнительный фрагмент может сам по себе не выступать в качестве модулирующего средства, однако вместо этого может выполнять вторичную функцию. Например, дополнительный фрагмент может облегчать доступ, связывание или активирование модулирующего средства в участке–мишени в организме хозяина (например, в кишке хозяина или бактериоците хозяина) или в микроорганизме–мишени, обитающем в организме хозяина (например, тли).

В некоторых случаях дополнительный фрагмент может облегчать проникновение модулирующего средства в клетку хозяина–мишени или микроорганизм–мишень, обитающий в организме хозяина. Например, дополнительный фрагмент может включать в себя пептид, проникающий в клетку. Пептиды, проникающие в клетку (CPP), могут представлять собой природные последовательности, полученные из белков; химерные пептиды, которые образуются в результате слияния двух природных последовательностей; или синтетические CPP, которые представляют собой последовательности, сконструированные синтетическим путем на основании исследований взаимосвязи структуры и активности. В некоторых случаях CPP характеризуются способностью повсеместно проникать через клеточные мембраны (например, клеточные мембраны прокариот и эукариот) с ограниченной токсичностью. Кроме того, CPP могут характеризоваться способностью проникать через клеточные мембраны посредством энергозависимых и/или энергонезависимых механизмов без необходимости хирального распознавания специфическими рецепторами. CPP могут связываться с любыми из модулирующих средств, описанных в данном документе. Например, CPP может связываться с противомикробным пептидом (AMP), например, пептидом скорпиона, например, UY192, слитым с пептидом, проникающим в клетку (например, YGRKKRRQRRRFLSTIWNGIKGLLFAM; SEQ ID NO: 237). Неограничивающие примеры CPP приведены в таблице 11.

Таблица 11. Примеры пептидов, проникающих в клетку (CPP)

Пептид	Происхождение	Последовательность
Полученные из белков
Пенетратин	Antennapedia	RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 213)
Пептид Tat	Tat	GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 214)
pVEC	Кадгерин	LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 215)
Химерные
Транспортан	Галанин/Мастопаран	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 216)
MPG	HIV–gp41/T–антиген SV40	GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 217)
Pep–1	Обратная транскриптаза HIV/T–антиген SV40	KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 218)
Синтетические
Полиаргинины	На основе пептида Tat	(R)n ; 6 < n < 12
MAP	de novo	KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 219)
R6W3	На основе пенетратина	RRWWRRWRR (SEQ ID NO: 220)

В других случаях дополнительный фрагмент облегчает связывание модулирующего средства с микроорганизмом–мишенью (например, грибом или бактерией), обитающим в организме хозяина. Дополнительный фрагмент может включать в себя один или несколько нацеливающих доменов. В некоторых случаях нацеливающий домен может нацеливать модулирующее средство на один или несколько микроорганизмов (например, бактерию или гриб), обитающих в кишке хозяина. В некоторых случаях нацеливающий домен может нацеливать модулирующее средство на конкретную область в организме хозяина (например, кишку или бактериоцит хозяина) для доступа к микроорганизмам, которые обычно присутствуют в указанной области организма хозяина. Например, нацеливающий домен может нацеливать модулирующее средство на переднюю кишку, среднюю кишку или заднюю кишку хозяина. В других случаях нацеливающий домен может нацеливать модулирующее средство на бактериоцит в организме хозяина и/или одну или несколько конкретных бактерий, обитающих в бактериоците хозяина. Например, нацеливающий домен может представлять собой лектин или агглютинин Galanthus nivalis (GNA), связанный с модулирующим средством, описанным в данном документе, например, AMP, например, пептидом скорпиона, например, Uy192.

Пре– или продомены

В некоторых случаях модулирующее средство может включать в себя аминокислотную пре– или пропоследовательность. Например, модулирующее средство может представлять собой неактивный белок или пептид, которые могут быть активированы посредством расщепления или посттрансляционной модификации пре– или пропоследовательности. В некоторых случаях модулирующее средство конструируют с инактивирующей пре– или пропоследовательностью. Например, пре– или пропоследовательность может закрывать сайт активации на модулирующем средстве, например, сайт связывания с рецептором, или может индуцировать конформационное изменение в модулирующем средстве. Таким образом, при отщеплении пре– или пропоследовательности модулирующее средство активируется.

В качестве альтернативы, модулирующее средство может включать в себя малую пре– или промолекулу, например, антибиотик. Модулирующее средство может представлять собой неактивную малую молекулу, описанную в данном документе, которая может быть активирована в среде–мишени внутри хозяина. Например, малая молекула может быть активирована при достижении определенного значения pH в кишке хозяина.

Линкеры

В случаях, если модулирующее средство связано с дополнительным фрагментом, модулирующее средство может дополнительно содержать линкер. Например, линкер может представлять собой химическую связь, например, одну или несколько ковалентных связей или нековалентных связей. В некоторых случаях линкер может представлять собой пептидный линкер (например, длиной 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 25, 30, 35, 40 или больше аминокислот). Линкер может включать в себя любые гибкие, жесткие или расщепляемые линкеры, описанные в данном документе.

Гибкий пептидный линкер может включать в себя любой из линкеров, широко применяемых в данной области техники, в том числе линкеры, имеющие последовательности, содержащие главным образом остатки Gly и Ser (линкер "GS"). Гибкие линкеры могут быть пригодны для соединения доменов, которые требуют определенной степени подвижности или взаимодействия, и могут содержать небольшие, неполярные (например, Gly) или полярные (например, Ser или Thr) аминокислоты.

В качестве альтернативы, пептидный линкер может представлять собой жесткий линкер. Жесткие линкеры пригодны для сохранения фиксированного расстояния между фрагментами и поддержания их независимых функций. Жесткие линкеры также могут быть пригодны, если пространственное разделение доменов является важным для сохранения стабильности или биологической активности одного или нескольких компонентов в продукте слияния. Жесткие линкеры, например, могут иметь альфа–спиральную структуру или Pro–богатую последовательность, (XP)_n, при этом X обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Ala, Lys или Glu.

В еще нескольких случаях пептидный линкер может представлять собой расщепляемый линкер. В некоторых случаях линкеры могут расщепляться в специфических условиях, таких как присутствие восстанавливающих реагентов или протеаз. Расщепляемые in vivo линкеры могут использовать обратимую природу дисульфидной связи. Один пример включает в себя чувствительную к тромбину последовательность (например, PRS) между двумя остатками Cys. Обработка тромбином CPRSC in vitro приводит к расщеплению чувствительной к тромбину последовательности, тогда как обратимая дисульфидная связь остается интактной. Такие линкеры известны и описаны, например, в Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10):1357–1369, 2013. Расщепление линкеров в продуктах слияния также может осуществляться протеазами, которые экспрессируются в условиях in vivo в конкретных клетках или тканях хозяина или микроорганизмах, обитающих в организме хозяина. В некоторых случаях при достижении участка– или клетки–мишени в результате расщепления линкера может высвобождаться свободное функциональное модулирующее средство.

Продукты слияния, описанные в данном документе, в качестве альтернативы могут быть связаны со связывающей молекулой, в том числе гидрофобным линкером, таким как отрицательно заряженная сульфонатная группа; липидами, такими как поли(––CH2––)углеводородные цепи, такие как полиэтиленгликолевая (PEG) группа, их ненасыщенными вариантами, их гидроксилированными вариантами, их амидированными или в других отношениях N–содержащими вариантами, неуглеродными линкерами; углеводными линкерами; фосфодиэфирными линкерами или другими молекулами, способными ковалентно связывать две или более молекул, например, два модулирующих средства. Можно применять нековалентные линкеры, такие как гидрофобные липидные глобулы, с которыми связывается модулирующее средство, например, посредством гидрофобной области модулирующего средства или гидрофобного удлинения модулирующего средства, такого как ряд остатков, богатый лейцином, изолейцином, валином или, возможно, также аланином, фенилаланином или даже тирозином, метионином, глицином или другим гидрофобным остатком. Модулирующее средство может быть связано с помощью химического взаимодействия зарядов таким образом, что положительно заряженный фрагмент модулирующего средства связывается с отрицательно заряженным другим модулирующим средством или дополнительным фрагментом.

Составы и композиции

Композиции, описанные в данном документе, могут быть составлены в чистой форме (например, композиция содержит только модулирующее средство) либо совместно с одним или несколькими дополнительными средствами (такими как наполнитель, средство доставки, носитель, разбавитель, стабилизатор и т. д.) для облегчения применения или доставки композиций. Примеры подходящих наполнителей и разбавителей включают в себя без ограничения лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмалы, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, солевой раствор, сироп, метилцеллюлозу, метил– и пропилгидроксибензоаты, тальк, стеарат магния и минеральное масло.

В некоторых случаях композиция содержит средство доставки или носитель. В некоторых случаях средство доставки включает в себя наполнитель. Иллюстративные наполнители включают в себя без ограничения твердые или жидкие материалы–носители, растворители, стабилизаторы, наполнители для составов с замедленным высвобождением, красители и поверхностно–активные вещества (поверхностно–активные средства). В некоторых случаях средство доставки представляет собой стабилизирующее средство доставки. В некоторых случаях стабилизирующее средство доставки включает в себя стабилизирующий наполнитель. Иллюстративные стабилизирующие наполнители включают в себя без ограничения эпоксидированные растительные масла, противовспенивающие средства, например, силиконовое масло, консерванты, регуляторы вязкости, связующие средства и средства, придающие липкость. В некоторых случаях стабилизирующее средство доставки представляет собой буфер, подходящий для модулирующего средства. В некоторых случаях композиция является микроинкапсулированной в средство доставки на основе полимерных гранул. В некоторых случаях стабилизирующее средство доставки защищает модулирующее средство от УФ и/или кислых условий. В некоторых случаях средство доставки содержит pH–буфер. В некоторых случаях композиция составлена таким образом, что она имеет pH в диапазоне от приблизительно 4,5 до приблизительно 9,0, включая, например, любой из диапазонов pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5 или от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,0.

В зависимости от предполагаемых целей и преобладающих обстоятельств композиция может быть составлена в виде концентратов эмульсий, концентратов суспензий, непосредственно распыляемых или разбавляемых растворов, паст, наносимых в виде покрытия, разбавленных эмульсий, распыляемых порошков, растворимых порошков, диспергируемых порошков, смачиваемых порошков, пылевидных препаратов, гранул, форм, инкапсулированных в полимерные вещества, микрокапсул, пен, аэрозолей, препаратов на основе газообразного диоксида углерода, таблеток, препаратов на основе смол, препаратов на основе бумаги, препаратов на основе нетканого полотна или препаратов на основе трикотажного или тканого полотна. В некоторых случаях композиция представляет собой жидкость. В некоторых случаях композиция представляет собой твердое вещество. В некоторых случаях композиция представляет собой аэрозоль, как, например, в находящемся под давлением аэрозольном баллончике. В некоторых случаях композиция присутствует в отходах (таких как экскременты) вредителя. В некоторых случаях композиция присутствует внутри или на поверхности тела живого вредителя.

В некоторых случаях средство доставки представляет собой пищу или воду для хозяина. В других случаях средство доставки представляет собой источник пищи для хозяина. В некоторых случаях средство доставки представляет собой пищевую приманку для хозяина. В некоторых случаях композиция представляет собой съедобное средство, поглощаемое хозяином. В некоторых случаях композиция доставляется хозяином второму хозяину и поглощается вторым хозяином. В некоторых случаях композиция поглощается хозяином или вторым хозяином, и композиция высвобождается в окружение хозяина или второго хозяина с отходами (такими как экскременты) хозяина или второго хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство включено в пищевую приманку, предназначенную для поглощения хозяином или переноса назад в его колонию.

В некоторых случаях модулирующее средство может составлять от приблизительно 0,1% до приблизительно 100% композиции, как, например, любое количество из от приблизительно 0,01% до приблизительно 100%, от приблизительно 1% до приблизительно 99,9%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10%, от приблизительно 1% до приблизительно 25%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 50% до приблизительно 99% или от приблизительно 0,1% до приблизительно 90% активных ингредиентов (таких как фаг, лизин или бактериоцин). В некоторых случаях композиция содержит по меньшей мере любое количество из 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или больше активных ингредиентов (таких как фаг, лизин и бактериоцин). В некоторых случаях концентрированные средства являются предпочтительными в качестве коммерческих продуктов, а конечный потребитель, как правило, использует разведенные средства, которые имеют значительно более низкую концентрацию активного ингредиента.

Любой из составов, описанных в данном документе, можно применять в форме приманки, спирали, электрического коврика, дымящегося препарата, фумиганта или листа.

Жидкие составы

Композиции, предусмотренные в данном документе, могут находиться в форме жидкого состава. Жидкие составы, как правило, смешивают с водой, однако в некоторых случаях их можно применять с растительным маслом, дизельным топливом, керосином или другим легким маслом в качестве носителя. Количество активного ингредиента часто находится в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 80 процентов по весу.

Состав в виде концентрата эмульсии может содержать жидкий активный ингредиент, один или несколько растворителей на нефтяной основе и средство, которое способствует смешиванию состава с водой с образованием эмульсии. Такие концентраты можно применять в составах для сельского хозяйства, декоративных и газонных растений, лесного хозяйства, обработки зданий, обработки пищевых продуктов, сельскохозяйственных животных и вредителей, значимых для общественного здравоохранения. Их можно адаптировать для эксплуатационного оборудования от небольших переносных опрыскивателей до гидравлических опрыскивателей, малообъемных наземных опрыскивателей, вентиляторных туманообразователей и малообъемных авиационных опрыскивателей. Некоторые активные ингредиенты легко растворяются в жидком носителе. При смешивании с носителем они образуют раствор, в котором не происходит осаждение или разделение, например, гомогенный раствор. Составы этого типа могут содержать активный ингредиент, носитель и один или несколько других ингредиентов. Растворы можно применять в любом типе распылителя, в закрытом помещении и на свежем воздухе.

В некоторых случаях композиция может быть составлена в виде обратной эмульсии. Обратная эмульсия представляет собой водорастворимый активный ингредиент, диспергированный в масляном носителе. Обратные эмульсии требуют эмульгатора, который способствует смешиванию активного ингредиента с большим объемом носителя на нефтяной основе, обычно топливного масла. Обратные эмульсии способствуют снижению сноса. В случае других составов некоторый снос при распылении происходит, когда капли воды начинают испаряться до достижения целевых поверхностей; в результате этого капли могут стать очень маленькими и легковесными. Поскольку масло испаряется более медленно, чем вода, капли обратной эмульсии сжимаются меньше, и большее количество активного ингредиента достигает цели. Масло дополнительно способствует снижению поверхностного стока и повышает устойчивость к дождю. Оно дополнительно выступает в качестве адгезивного средства, улучшая степень покрытия поверхности и всасывание. Поскольку капли являются сравнительно большими и тяжелыми, то им сложно пройти насквозь покрытие нижней стороны листьев. Обратные эмульсии наиболее широко применяются в полосах отчуждения, где снос на восприимчивые нецелевые площади может быть проблемой.

Текучий или жидкий состав объединяет многие из характеристик концентратов эмульсий и смачиваемых порошков. Изготовители используют эти составы, если активный ингредиент представляет собой твердое вещество, которое не растворяется ни в воде, ни в масле. Активный ингредиент, пропитанный веществом, таким как глина, измельчают до очень мелкого порошка. Затем порошок суспендируют в небольшом количестве жидкости. Образующийся в результате жидкий продукт является достаточно плотным. Текучие и жидкие составы имеют многие из характеристик концентратов эмульсий, а также они имеют аналогичные недостатки. Они требуют умеренного взбалтывания для поддержания их в виде суспензии и оставляют видимые остатки, аналогичные таковым у смачиваемых порошков.

Текучие/жидкие составы являются легкими в обращении и применении. Поскольку они представляют собой жидкости, то они подлежат разбрызгиванию и расплескиванию. Они содержат твердые частицы, поэтому они способствуют абразивному износу насадок и насосов. Текучие и жидкие суспензии осаждаются в своих контейнерах. Поскольку текучие и жидкие составы склонны к осаждению, упаковка в контейнеры по пять галлонов или меньше облегчает повторное смешивание.

Аэрозольные составы содержат один или несколько активных ингредиентов и растворитель. Большинство аэрозолей имеют низкое процентное содержание активных ингредиентов. Существует два типа аэрозольных составов – готовый к применению тип, широко доступный в находящихся под давлением запечатанных контейнерах, и продукты, используемые в электрических или работающих на бензине аэрозольных генераторах, которые высвобождают состав в виде дыма или тумана.

Готовые к применению аэрозольные составы обычно представляют собой небольшие автономные блоки, которые высвобождают состав, когда клапан насадки приводится в движение. Состав пропускается через тонкое отверстие с помощью инертного газа под давлением с образованием мелкодисперсных капель. Эти продукты используются в теплицах, на небольших площадях внутри зданий или на ограниченных площадях на открытом воздухе. Коммерческие модели, которые удерживают до 5 фунтов активного ингредиента, обычно являются многоразовыми.

Дымообразующие или туманообразующие аэрозольные составы не находятся под давлением. Они используются в машинах, которые разбивают жидкий состав на мелкодисперсный туман или густой туман (аэрозоль) с помощью быстро вращающегося диска или нагреваемой поверхности.

Сухие или твердые составы

Сухие составы могут быть разделены на два типа: готовые к применению и концентраты, которые должны быть смешаны с водой для применения в качестве спрея. Большинство пылевидных составов являются готовыми к применению и имеют низкое процентное содержание активных ингредиентов (меньше чем приблизительно 10 процентов по весу) наряду с очень тонкодисперсным сухим инертным носителем, изготовленным из талька, мела, глины, ореховой скорлупы или вулканического пепла. Размер отдельных пылевидных частиц варьируется. Некоторые пылевидные составы представляют собой концентраты и имеют высокое процентное содержание активных ингредиентов. Перед применением их смешивают с сухими инертными носителями. Порошки всегда используются сухими и могут легко сноситься на нецелевые участки.

Гранулированные или пеллетированные составы

В некоторых случаях композиция составлена в виде гранул. Гранулированные составы аналогичны пылевидным составам, за исключением того, что гранулированные частицы являются более крупными и тяжелыми. Крупнодисперсные частицы могут быть получены из таких материалов, как глина, кукурузные початки или скорлупа грецких орехов. Активный ингредиент покрывает наружную поверхность гранул или всасывается в них. Количество активного ингредиента может быть относительно малым, обычно находясь в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 процентов по весу. Гранулированные составы наиболее часто используются для применения в отношении почвы, насекомых, живущих в почве, или всасывания растениями через корни. Гранулированные составы иногда применяют с использованием самолета или вертолета с целью сведения к минимуму сноса или проникновения в густые заросли. После применения гранулы могут медленно высвобождать активный ингредиент. Некоторые гранулы требуют почвенной влаги для высвобождения активного ингредиента. Гранулированные составы также используются для контроля личинок комаров и других водных вредителей. Гранулы используются в операциях контроля вредителей в сельском хозяйстве, при обработке зданий, на декоративных и газонных растениях, в водной среде, в полосах отчуждения, а также в общественном здравоохранении (в отношении жалящих насекомых).

В некоторых случаях композиция составлена в виде пеллет. Большинство пеллетированных составов являются весьма сходными с гранулированными составами; эти термины используются взаимозаменяемо. Однако в пеллетированном составе все частицы имеют одну и ту же массу и форму. Однородность частиц облегчает применение с использованием точного эксплуатационного оборудования.

Порошки

В некоторых случаях композиция составлена в виде порошка. В некоторых случаях композиция составлена в виде смачиваемого порошка. Смачиваемые порошки представляют собой сухие тонкоизмельченные составы, которые выглядят как пылевидные препараты. Обычно они должны смешиваться с водой для применения в качестве спрея. Однако, немного продуктов можно применять в качестве пылевидного препарата или в качестве смачиваемого порошка – выбор остается за потребителем. Смачиваемые порошки имеют от приблизительно 1 до приблизительно 95 процентов по весу активного ингредиента; в некоторых случаях более чем приблизительно 50 процентов. Частицы не растворяются в воде. Они быстро осаждаются, если их постоянно не взбалтывать для поддержания в суспендированном состоянии. Их можно применять для решения большинства проблем, связанных с вредителями, и в большинстве типов распылительного оборудования, в которых возможно взбалтывание. Смачиваемые порошки обладают превосходной остаточной активностью. В связи с их физическими свойствами большинство состава остается на поверхности обработанных пористых материалов, таких как бетон, штукатурка и необработанная древесина. В таких случаях только вода проникает в материал.

В некоторых случаях композиция составлена в виде растворимого порошка. Растворимые порошковые составы выглядят как смачиваемые порошки. В то же время при смешивании с водой растворимые порошки легко растворяются и образуют истинный раствор. После их тщательного смешивания дополнительное взбалтывание не требуется. Количество активного ингредиента в растворимых порошках находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 95 процентов по весу; в некоторых случаях более чем приблизительно 50 процентов. Растворимые порошки имеют все преимущества смачиваемых порошков и ни одного из недостатков, за исключением опасности вдыхания во время смешивания.

В некоторых случаях композиция составлена в виде гранул, диспергируемых в воде. Гранулы, диспергируемые в воде, также известные как сухие текучие составы, подобны смачиваемым порошкам за исключением того, что являются пылевидными, и их составляют в виде небольших легко определяемых гранул. Гранулы, диспергируемые в воде, должны быть смешаны с водой перед применением. Оказавшись в воде, гранулы распадаются на мелкодисперсные частицы, аналогичные смачиваемым порошкам. Состав требует непрерывного взбалтывания для поддержания его в суспендированном состоянии в воде. Процентное содержание активного ингредиента является высоким, часто не менее 90 процентов по весу. Гранулы, диспергируемые в воде, имеют многие из тех же самых преимуществ и недостатков смачиваемых порошков, за исключением того, что они являются более легко определяемыми и смешиваемыми. В связи с низким содержанием пылевидных частиц они обуславливают меньшую опасность вдыхания для потребителя во время использования.

Приманка

В некоторых случаях композиция включает в себя приманку. Приманка может находиться в любой подходящей форме, такой как твердое вещество, паста, пеллетированная или порошкообразная форма. Приманка также может переноситься хозяином назад в популяцию указанного хозяина (например, колонию или улей). Приманка может затем выступать в качестве источника пищи для других членов колонии, тем самым предоставляя эффективное модулирующее средство большому числу хозяев и потенциально всей колонии хозяина.

Приманки могут быть предоставлены в подходящем "домике" или "ловушке". Такие домики и ловушки являются коммерчески доступными, и существующие ловушки могут быть адаптированы для включения композиций, описанных в данном документе. Домик или ловушка могут быть предусмотрены, например, в форме коробки, и могут быть предусмотрены в готовом виде или могут быть изготовлены, например, из складывающегося картона. Подходящие материалы для домика или ловушки включают в себя пластмассу и картон, в частности, гофрированный картон. Внутренние поверхности ловушек могут быть выстланы липким веществом с целью ограничения движения хозяина при попадании в ловушку. Домик или ловушка могут содержать подходящую бороздку внутри, которая может удерживать приманку на месте. Ловушка отличается от домика, поскольку хозяин не может легко покинуть ловушку после попадания, тогда как домик выступает в качестве "кормушки", которая обеспечивает хозяина предпочтительной средой, в которой они могут кормиться и чувствовать себя в безопасности от хищников.

Аттрактанты

В некоторых случаях композиция содержит аттрактант (например, хемоаттрактант). Аттрактант может привлекать взрослого хозяина или неполовозрелого хозяина (например, личинку) к месту поблизости композиции. Аттрактанты включают в себя феромоны – химические вещества, которые секретируются животным, в частности насекомым, которые влияют на поведение или развитие других особей этого же вида. Другие аттрактанты включают в себя сахарные сиропы и сиропы на основе гидролизатов белков, дрожжевые грибы и гниющее мясо. Аттрактанты также можно объединять с активным ингредиентом и распылять на листья или другие предметы в обрабатываемой области.

Известны различные аттрактанты, которые влияют на поведение хозяина, например, поиск хозяином пищи, мест для откладывания яиц или спаривания или партнеров для спаривания. Аттрактанты, пригодные в способах и композициях, описанных в данном документе, включают в себя, например, эвгенол, фенэтилпропионат, этилдиметилизобутилциклопропанкарбоксилат, пропилбензодиоксанкарбоксилат, цис–7,8–эпокси–2–метилоктадекан, транс–8,транс–0–додекадиенол, цис–9–тетрадеценаль (и цис–11–гексадеценаль), транс–11–тетрадеценаль, цис–11–гексадеценаль, (Z)–11,12–гексадекадиеналь, цис–7–додеценилацетат, цис–8–додеценилацетат, цис–9–додеценилацетат, цис–9–тетрадеценилацетат, цис–11–тетрадеценилацетат, транс–11–тетрадеценилацетат (и цис–11), цис–9,транс–11–тетрадекадиенилацетат (и цис–9,транс–12), цис–9,транс–12–тетрадекадиенилацетат, цис–7,цис–11–гексадекадиенилацетат (и цис–7,транс–11), цис–3,цис–13–октадекадиенилацетат, транс–3,цис–13–октадекадиенилацетат, анетол и изоамилсалицилат.

Для привлечения насекомых также можно применять средства, отличные от хемоаттрактантов, в том числе осветительные устройства с различными длинами волн или цветами излучения.

Нанокапсулы/микроинкапсулирование/липосомы

В некоторых случаях композиция предусмотрена в виде микроинкапсулированного состава. Микроинкапсулированные составы смешивают с водой и распыляют таким же образом, как и другие распыляемые составы. После распыления пластмассовые покрытия разрушаются и медленно высвобождают активный ингредиент.

Носители

Любая из композиций, описанных в данном документе, может быть составлена с включением модулирующего средства, описанного в данном документе, и инертного носителя. Такой носитель может представлять собой твердый носитель, жидкий носитель, гелеобразный носитель и/или газообразный носитель. В определенных вариантах осуществления носитель может представлять собой покрытие для семян. Покрытие для семян представляет собой любой не встречающийся в природе состав, который прилипает, целиком или частично, к поверхности семени. Состав может дополнительно содержать вспомогательное вещество или поверхностно–активное вещество. Состав может также содержать одно или несколько модулирующих средств для расширения спектра действия.

Твердый носитель, используемый для состава, включает в себя мелкодисперсный порошок или гранулы глины (например, каолиновой глины, диатомовой земли, бентонитовой глины, глины Фубасами, кислой глины и т. д.), синтетический гидратированный диоксид кремния, тальк, керамические материалы, другие неорганические материалы (например, серицит, кварц, серу, активированный уголь, карбонат кальция, гидратированный диоксид кремния и т. д.), вещество, которое может быть сублимировано и находится в твердой форме при комнатной температуре (например, 2,4,6–триизопропил–1,3,5–триоксан, нафталин, п–дихлорбензол, камфору, адамантан и т. д.); шерсть; шелк; хлопок; пеньку; жом; синтетические смолы (например, полиэтиленовые смолы, такие как полиэтилен низкой плотности, немодифицированный полиэтилен низкой плотности и полиэтилен высокой плотности; сополимеры этилена и винилового сложного эфира, такие как сополимеры этилена и винилацетата; сополимеры этилена и сложного эфира метакриловой кислоты, такие как сополимеры этилена и метилметакрилата и сополимеры этилена и этилметакрилата; сополимеры этилена и сложного эфира акриловой кислоты, такие как сополимеры этилена и метилакрилата и сополимеры этилена и этилакрилата; сополимеры этилена и винилкарбоновой кислоты, такие как сополимеры этилена и акриловой кислоты; сополимеры этилена и тетрациклододецена; полипропиленовые смолы, такие как гомополимеры пропилена и сополимеры пропилена и этилена; поли–4–метилпентен–1, полибутен–1, полибутадиен, полистирол; смолы на основе сополимера акрилонитрила и стирола; стирольные эластомеры, такие как смолы на основе сополимера акрилонитрила, бутадиена и стирола, блок–сополимеры диенов с сопряженными двойными связями и стирола и гидриды блок–сополимеров диенов с сопряженными двойными связями и стирола; фторкаучуки; акриловые смолы, такие как поли(метилметакрилат); полиамидные смолы, такие как нейлон 6 и нейлон 66; полиэфирные смолы, такие как полиэтилентерефталат, полиэтиленнафталат, полибутилентерефталат и полициклогексилендиметилентерефталат, поликарбонаты, полиацетали, полиакрилсульфоны, полиарилаты, полиэфиры гидроксибензойной кислоты, полиэфиримиды, полиэфиркарбонаты, полифениленэфирные смолы, поливинилхлорид, поливинилиденхлорид, полиуретан и пористые смолы, такие как пенополиуретан, пенополипропилен или пеноэтилен и т. д.), стекла, металлы, керамические материалы, волокнистые материалы, ткани, трикотажные полотна, листы, бумагу, пряжу, пену, пористые вещества и мультифиламенты.

Жидкий носитель может включать в себя, например, ароматические или алифатические углеводороды (например, ксилол, толуол, алкилнафталин, фенилксилилэтан, керосин, газойль, гексан, циклогексан и т. д.), галогензамещенные углеводороды (например, хлорбензол, дихлорметан, дихлорэтан, трихлорэтан и т. д.), спирты (например, метанол, этанол, изопропиловый спирт, бутанол, гексанол, бензиловый спирт, этиленгликоль и т. д.), эфиры (например, диэтиловый эфир, диметиловый эфир этиленгликоля, монометиловый эфир диэтиленгликоля, моноэтиловый эфир диэтиленгликоля, монометиловый эфир пропиленгликоля, тетрагидрофуран, диоксан и т. д.), сложные эфиры (например, этилацетат, бутилацетат и т. д.), кетоны (например, ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, циклогексанон и т. д.), нитрилы (например, ацетонитрил, изобутиронитрил и т. д.), сульфоксиды (например, диметилсульфоксид и т. д.), амиды (например, N,N–диметилформамид, N,N–диметилацетамид, циклические имиды (например, N–метилпирролидон), алкилиденкарбонаты (например, пропиленкарбонат и т. д.), растительное масло (например, соевое масло, хлопковое масло и т. д.), растительные эфирные масла (например, апельсиновое масло, масло иссопа, лимонное масло и т. д.) или воду.

Газообразный носитель может включать в себя, например, газообразный бутан, газообразный политетрафторэтилен, сжиженный нефтяной газ (LPG), диметиловый эфир и газообразный диоксид углерода.

Вспомогательные вещества

В некоторых случаях композиция, предусмотренная в данном документе, может содержать вспомогательное вещество. Вспомогательные вещества представляют собой химические вещества, которые не обладают активностью. Вспомогательные вещества предварительно смешивают в составе или добавляют в распылительный резервуар для улучшения смешивания или применения или для усиления функциональных характеристик. Они широко используются в продуктах, предназначенных для применения в отношении листьев. Вспомогательные вещества можно использовать для придания индивидуальных свойств составу в соответствии с конкретными нуждами и введения поправки на местные условия. Вспомогательные вещества могут быть предназначены для осуществления конкретных функций, в том числе смачивания, распределения, прилипания, снижения испарения, снижения улетучивания, буферизации, эмульгирования, диспергирования, снижения сноса при распылении и снижения пенообразования. Ни одно вспомогательное вещество не может осуществлять все эти функции само по себе, однако совместимые вспомогательные вещества часто можно объединять для осуществления нескольких функций одновременно.

Среди неограничивающих примеров вспомогательных веществ, включенных в состав, присутствуют связующие вещества, диспергирующие вещества и стабилизаторы, в частности, например, казеин, желатин, полисахариды (например, крахмал, аравийская камедь, производные целлюлозы, альгиновая кислота и т. д.), производные лигнина, бентонит, сахара, синтетические водорастворимые полимеры (например, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полиакриловая кислота и т. д.), PAP (кислый изопропилфосфат), BHT (2,6–ди–трет–бутил–4–метилфенол), BHA (смесь 2–трет–бутил–4–метоксифенола и 3–трет–бутил–4–метоксифенола), растительные масла, минеральные масла, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот.

Поверхностно–активные вещества

В некоторых случаях композиция, предусмотренная в данном документе, содержит поверхностно–активное вещество. Поверхностно–активные вещества, также называемые смачивающими средствами и распределителями, физически изменяют поверхностное натяжение капли спрея. Для того, чтобы состав надлежащим образом выполнял свою функцию, капля спрея должна быть способной смачивать листья и распределяться равномерно по листу. Поверхностно–активные вещества увеличивают площадь, покрываемую составом, тем самым усиливая воздействие химического вещества на вредителя. Поверхностно–активные вещества особенно важны при применении состава в отношении листьев, покрытых воском, или волосистых листьев. Без надлежащего смачивания и распределения капли спрея часто стекают или не могут покрыть поверхности листьев надлежащим образом. В то же время слишком большое количество поверхностно–активного вещества может вызвать избыточный поверхностный сток и снизить эффективность.

Поверхностно–активные вещества классифицируются на основе способа их ионизации или расщепления на электрически заряженные атомы или молекулы, называемые ионами. Поверхностно–активное вещество с отрицательным зарядом является анионным. Поверхностно–активное вещество с положительным зарядом является катионным, и поверхностно–активное вещество без электрического заряда является неионогенным. Активность состава в присутствии неионогенного поверхностно–активного вещества может значительно отличаться от активности в присутствии катионного или анионного поверхностно–активного вещества. Выбор неправильного поверхностно–активного вещества может снижать эффективность пестицидного продукта и наносить вред растению–мишени. Анионные поверхностно–активные вещества являются наиболее эффективными при использовании с контактными пестицидами (пестициды, которые контролируют вредителя путем непосредственного контакта, а не системного всасывания). Катионные поверхностно–активные вещества никогда не должны применяться в качестве самостоятельных поверхностно–активных веществ, поскольку они обычно являются фитотоксичными.

Неионогенные поверхностно–активные вещества, часто применяемые с системными пестицидами, облегчают проникновение пестицидных спреев через кутикулы растений. Неионогенные поверхностно–активные вещества совместимы с большинством пестицидов, и для большинства пестицидов, зарегистрированных EPA, которым необходимо поверхностно–активное вещество, рекомендуется неионогенный тип. Вспомогательные вещества включают в себя без ограничения клеящие вещества, сухие разбавители, вещества, обеспечивающие проникновение в растения, факторы совместимости, буферы или модификаторы pH, дополнительные компоненты для контроля сноса, противовспенивающие средства и загустители.

Среди неограничивающих примеров поверхностно–активных веществ, включенных в композиции, описанные в данном документе, присутствуют соли алкилсульфатных сложных эфиров, алкилсульфонаты, аклиларилсульфонаты, алкилариловые эфиры и их полиоксиэтиленированные продукты, простые эфиры полиэтиленгликоля, сложные эфиры многоатомных спиртов и производные сахарных спиртов.

Комбинации

В составах и в применяемых формах, полученных из этих составов, модулирующее средство может находиться в смеси с другими активными соединениями, такими как пестицидные средства (например, инсектициды, стерилизаторы, акарициды, нематоциды, моллюскоциды или фунгициды; см., например, пестициды, приведенные в таблице 12), аттрактанты, вещества, регулирующие рост, или гербициды. Используемый в данном документе термин "пестицидное средство" относится к любому веществу или смеси веществ, предусмотренных для предупреждения воздействия, нарушения воздействия, отпугивания или ослабления воздействия любого вредителя. Пестицид может представлять собой химическое вещество или биологическое средство, применяемое против вредителей, в том числе насекомых, патогенов, сорняков и микроорганизмов, которые конкурируют с человеком за пищу, разрушают имущество, распространяют заболевания или представляют собой негативный раздражитель. Термин "пестицидное средство" может дополнительно охватывать другие биологически активные молекулы, такие как антибиотики, противовирусные пестициды, противогрибковые средства, антигельминтные средства, питательные вещества, пыльцу, сахарозу и/или средства, которые останавливают или замедляют движение насекомых.

В случаях, когда модулирующее средство применяют в отношении растений, смесь с другими известными соединениями, такими как гербициды, удобрения, регуляторы роста, антидоты, химические сигнальные вещества или другие средства для улучшения свойств растения, также является возможной.

Доставка

Хозяин, описанный в данном документе, может подвергаться воздействию любой из композиций, описанных в данном документе, любым подходящим образом, который обеспечивает доставку или введение композиции насекомому. Модулирующее средство может быть доставлено в отдельности или в комбинации с другими активными или неактивными веществами и может применяться, например, посредством распыления, микроинъекции, через растения, посредством полива, погружения, в форме концентрированных жидкостей, гелей, растворов, суспензий, спреев, порошков, пеллет, брикетов, плиток и т. п., составленных для доставки эффективной концентрации модулирующего средства. Количества и места для применения композиций, описанных в данном документе, как правило, определяются условиями обитания хозяина, стадией жизненного цикла, на которой на микроорганизмы хозяина можно целенаправленно воздействовать с помощью модулирующего средства, участком, в котором применение должно выполняться, а также физическими и функциональными характеристиками модулирующего средства. Модулирующие средства, описанные в данном документе, можно вводить насекомому путем перорального заглатывания, однако также можно вводить с помощью средств, которые обеспечивают проникновение через кутикулу или проникновение в дыхательную систему насекомого.

В некоторых случаях насекомое может быть просто "намочено" или "опрыскано" раствором, содержащим модулирующее средство. В качестве альтернативы, модулирующее средство может быть связано с пищевым компонентом (например, съедобным) для насекомого для облегчения доставки и/или в целях повышения поглощения модулирующего средства насекомым. Способы перорального введения включают в себя, например, непосредственное смешивание модулирующего средства с пищей для насекомого, распыление модулирующего средства в среде обитания насекомого или поле, а также подходы на основе конструирования, в которых вид, который применяется в качестве пищи, конструируется с целью экспрессии модулирующего средства, после чего скармливается насекомому, подлежащему отрицательному влиянию. В некоторых случаях, например, композиция на основе модулирующего средства может быть включена в состав рациона насекомого или покрывать его сверху. Например, композицию на основе модулирующего средства можно распылять на поле с сельскохозяйственными культурами, на которых насекомое обитает.

В некоторых случаях композицию распыляют непосредственно на растение, например, сельскохозяйственные культуры, например, путем распыления из рюкзака, распыления с воздуха, опрыскивания/опыления растительных культур и т. д. В случаях, когда модулирующее средство доставляют в растение, растение, получающее модулирующее средство, может находиться на любой стадии роста растения. Например, составленные модулирующие средства можно применять в виде покрытия для семян или средства для обработки корней на ранних стадиях роста растения или в виде средства для полной обработки растения на более поздних стадиях цикла урожая. В некоторых случаях модулирующее средство можно применять в отношении растения в качестве местного средства, так чтобы насекомое–хозяин заглатывало или иным образом приходило в контакт с растением при взаимодействии с растением.

Кроме того, модулирующее средство можно применять (например, в отношении почвы, в которой растение растет, или в отношении воды, которую используют для полива растения) в качестве системного средства, которое поглощается и распределяется по тканям (например, стеблям или листьям) растения–хозяина или животного–хозяина таким образом, что насекомое, питающееся на нем, будет получать эффективную дозу модулирующего средства. В некоторых случаях растения или организмы, используемые в качестве пищи, могут быть генетически трансформированы для экспрессии модулирующего средства, так чтобы хозяин, питающийся на растении или организме, используемом в качестве пищи, заглатывал модулирующее средство.

Замедленное или непрерывное высвобождение также может достигаться посредством покрытия модулирующего средства или композиции с модулирующим(модулирующими) средством(средствами) растворимым или биоразрушаемым слоем покрытия, таким так желатин, при этом данное покрытие растворяется или разрушается в среде применения, что таким образом делает модулирующее средство доступным, или посредством диспергирования средства в растворимой или разрушаемой матрице. Такое непрерывное высвобождение и/или распределение означает, что устройства могут быть предпочтительно использованы для устойчивого поддержания эффективной концентрации одного или нескольких модулирующих средств, описанных в данном документе, в конкретной среде обитания хозяина.

Модулирующее средство также может быть включено в среду, в которой насекомое растет, живет, размножается, питается или осуществляет заражение. Например, модулирующее средство может быть включено в контейнер для пищи, кормушку, защитную обертку или улей. В некоторых путях применения модулирующее средство может быть связано с твердой подложкой для применения в порошкообразной форме или в "ловушке" или "кормушке". В качестве примера, в путях применения, в которых композиция подлежит применению в ловушке или в виде приманки для определенного насекомого–хозяина, композиции также могут быть связаны с твердой подложкой или инкапсулированы в материал с медленным высвобождением. Например, композиции, описанные в данном документе, можно вводить посредством доставки композиции в по меньшей мере одну среду обитания, в которой сельскохозяйственный вредитель (например, тля) растет, живет, размножается или питается.

Скрининг

В данный документ включены способы скрининга модулирующих средств, которые являются эффективными для изменения микробиоты хозяина (например, насекомого) и тем самым снижают приспособленность хозяина. Скрининговые анализы, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для идентификации одного или нескольких модулирующих средств (например, фага), которые целенаправленно воздействуют на симбиотические микроорганизмы, обитающие в организме хозяина, и тем самым снижают приспособленность хозяина. Например, идентифицированное модулирующее средство (например, фаг) может быть эффективным для снижения жизнеспособности микроорганизмов, которые расщепляют пестициды или аллелохимикаты (например, бактерий, например, бактерии, которая расщепляет пестицид, приведенный в таблице 12), с повышением тем самым восприимчивости хозяев к пестициду (например, восприимчивости к пестициду, приведенному в таблице 12) или аллелохимическому средству.

Например, библиотека фагов может быть подвергнута скринингу для идентификации фага, который целенаправленно воздействует на конкретный эндосимбиотический микроорганизм, обитающий в организме хозяина. В некоторых случаях библиотека фагов может быть предусмотрена в форме одного или нескольких образцов окружающей среды (например, почвы, прудовых донных отложений или сточной воды). В качестве альтернативы, библиотека фагов может быть создана из лабораторных изолятов. Библиотеку фагов можно совместно культивировать со штаммом бактерий–мишеней. После инкубирования со штаммом бактерий популяцию фага, который успешно инфицирует и лизирует бактерии–мишени, обогащают в культуральной среде. Культуру, обогащенную фагами, можно субкультивировать с дополнительными бактериями любое число раз для дальнейшего обогащения популяции фага, представляющего интерес. Фаг может быть выделен для применения в качестве модулирующего средства в любых из способов или композиций, описанных в данном документе, при этом фаг изменяет микробиоту хозяина таким образом, что снижается приспособленность хозяина.

Таблица 12. Пестициды
Аклонифен	Фенхлоразол–этил	Пендиметалин
Ацетамиприд	Фенотиокарб	Пенфлуфен
Аланикарб	Фенитротион	Пенфлуфен
Амидосульфурон	Фенпропидин	Пентахлорбензол
Аминоциклопирахлор	Флуазолат	Пентиопирад
Амиcулбром	Флуфеноксурон	Пентиопирад
Антрахинон	Флуметралин	Пиримифос–метил
Асулам, натриевая соль	Флуксапироксад	Праллетрин
Бенфуракарб	Фуберидазол	Профенофос
Бенсулид	Глюфосинат аммония	Проквиназид
Бета–HCH; бета–BCH	Глифосат	Протиофос
Биоресметрин	Группа: Бура, боратные соли (см.	Пираклофос
Бластицидин–S	Группа: Парафиновые масла, минеральные	Пиразахлор
Бура; тетраборат динатрия	Галфенпрокс	Пиразофос
Борная кислота	Имипротрин	Пиридабен
Гептаноат бромоксинила	Имидаклоприд	Пиридалил
Октаноат бромоксинила	Ипконазол	Пиридифентион
Карбосульфан	Изопиразам	Пирифенокс
Хлорантранилипрол	Изопиразам	Квинмерак
Хлордимеформ	Ленацил	Ротенон
Хлорфлуазурон	Фосфид магния	Седаксан
Хлорпрофам	Метафлумизон	Седаксан
Климбазол	Метазахлор	Силафлуофен
Клопиралид	Метазахлор	Синтофен
Гидроксид меди (II)	Метобромурон	Спинеторам
Цифлуфенамид	Метоксурон	Сульфоксафлор
Цигалотрин	Метсульфурон–метил	Темефос
Цигалотрин, гамма	Милбемектин	Тиаклоприд
Декагидрат	Налед	Тиаметоксам
Диафентиурон	Напропамид	Толфенпирад
Димефурон	Никосульфурон	Тралометрин
Димоксистробин	Нитенпирам	Соединения трибутилолова
Динотефуран	Нитробензол	Тридифан
Дикват–дихлорид	o–фенилфенол	Трифлумизол
Дитианон	Масла	Валидамицин
E–фосфамидон	Оксадиаргил	Фосфид цинка
EPTC	Оксикарбоксин
Этабоксам	Парафиновое масло
Этиримол	Пенконазол

ПРИМЕРЫ

Далее представлен пример способов по настоящему изобретению. Следует понимать, что на практике могут осуществляться различные другие варианты осуществления c учетом общего описания, приведенного выше.

Пример 1. Получение библиотеки фагов

Данный пример демонстрирует получение коллекции фагов из образцов окружающей среды.

Схема терапии. Сбор библиотеки фагов, имеющей следующие семейства фагов: Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Ampullaviridae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fuselloviridae, Gluboloviridae, Guttaviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae, Tectiviridae.

Схема эксперимента

Несколько образцов окружающей среды (почва, прудовые донные отложения, сточная вода) собирали в стерильные колбы на 1 л в течение периода 2 недель и незамедлительно обрабатывали, как описано ниже, после сбора и затем хранили при 4°C. Твердые образцы гомогенизировали в стерильном бульоне Лурия (LB) или триптическом соевом бульоне (TSB) двойной концентрации от Difco с добавлением 2 мM CaCl2 до конечного объема 100 мл. Значения pH и уровни фосфата измеряли с помощью индикаторных полос для фосфата. Для очистки все образцы центрифугировали при 3000–6000 g в Megafuge 1.0R Heraeus или центрифуге Eppendorf 5702 R в течение 10–15 минут при +4°C и фильтровали через фильтры с размером пор 0,2 мкм с низким связыванием белка для удаления всех оставшихся бактериальных клеток. Надосадочную жидкость хранили при 4°C в присутствии хлороформа в стеклянном флаконе.

Пример 2. Идентификация фагов, специфичных в отношении мишени

Данный пример демонстрирует выделение, очистку и идентификацию отдельных фагов, специфичных в отношении мишени, из неоднородной библиотеки фагов.

Схема эксперимента

20–30 мл библиотеки фагов, описанной в примере 1, разбавляли до объема 30–40 мл бульоном LB. Штамм бактерий–мишеней, например, Buchnera, добавляли (50–200 мкл культуры, выращенной в течение ночи в бульоне LB) для обогащения популяции фагов, которые целенаправленно воздействуют на этот конкретный штамм бактерий в культуре. Эту культуру инкубировали в течение ночи при +37°C, встряхивая при 230 об./мин. Бактерии из этой обогатительной культуры удаляли центрифугированием (3000–6000 g в Megafuge 1.0R Heraeus или центрифуге Eppendorf 5702 R, 15–20 минут, +4°C) и фильтровали (фильтр с размером пор 0,2 или 0,45 мкм). 2,5 мл культуры, не содержащей бактерий, добавляли к 2,5 мл бульона LB и 50–100 мкл бактерий–мишеней для обогащения фагами. Обогатительную культуру выращивали в течение ночи, как описано выше. Образец из этой обогатительной культуры центрифугировали при 13000 g в течение 15 мин. при комнатной температуре, и 10 мкл надосадочной жидкости помещали на чашку Петри, содержащую агар LB, совместно с 100–300 мкл бактерий–мишеней и 3 мл расплавленного 0,7% мягкого агара. Планшеты инкубировали в течение ночи при +37°C. Каждую из бляшек, наблюдаемых на бактериальном газоне, собирали и переносили в 500 мкл бульона LB. Образец из этой исходной культуры бляшек дополнительно высевали на бактерии–мишени. Очистку бляшек выполняли три раза для всех обнаруженных фагов с целью выделения одного однородного фага из неоднородной смеси фагов.

Лизаты из чашек с фагами с высокими титрами (> 1x 10^10 БОЕ/мл) получали путем сбора верхних слоев с планшетов, содержащих штамм бактерий–хозяев, демонстрирующий сливной лизис. После добавления 5 мл буфера верхний мягкий слой агара мацерировали, очищали центрифугированием и стерилизовали фильтрацией. Полученные лизаты хранили при 4°C. Фаговые лизаты с высоким титром дополнительно очищали с помощью изопикнического центрифугирования с использованием CsCl, как описано в (Summer et al., J. Bacteriol. 192:179–190, 2010).

ДНК выделяли из очищенных с помощью CsCl фаговых суспензий, как описано в (Summer, Methods Mol. Biol. 502:27–46, 2009). Отдельный выделенный фаг секвенировали в виде части двух пулов геномов фагов с помощью способа пиросеквенирования 454. Геномную ДНК фагов смешивали в эквимолярных количествах до конечной концентрации приблизительно 100 нг/л. Объединенную ДНК фрагментировали, лигировали с помощью мультиплексной идентификационной метки (MID), специфичной для каждого из пулов, и секвенировали с помощью пиросеквенирования с использованием полнопланшетной реакции на секвенаторе FLX Titanium Roche в соответствии с протоколами производителя. Объединенная ДНК фагов присутствовала в двух реакциях секвенирования. Урезанные выходные данные потоковых диаграмм FLX Titanium, соответствующие каждому из пулов, собирали отдельно с использованием сборщика Newbler версии 2.5.3 (454 Life Sciences), регулируя настройки таким образом, чтобы были включены только риды, содержащие одну MID на сборку. Идентичность отдельных контигов определяли с помощью ПЦР с использованием праймеров, образованных для последовательностей контигов и отдельных препаратов геномной ДНК фагов, в качестве матрицы. Sequencher 4.8 (Gene Codes Corporation) использовали для сборки и редактирования последовательностей. Хромосомные концевые структуры фагов определяли экспериментально. Липкие концы (cos) для фагов определяли посредством секвенирования концов фагового генома и секвенирования продуктов ПЦР, полученных путем амплификации посредством лигирующего соединения циркуляризованной геномной ДНК, как описано в Summer, Methods Mol. Biol. 502:27–46, 2009). Области, кодирующие белки, изначально прогнозировали с использованием GeneMark.hmm (Lukashin et al. Nucleic Acids Res. 26:1107–1115, 1998), очищали посредством ручного анализа в Artemis (Rutherford et al., Bioinformatics 16:944–945, 2000) и анализировали путем применения BLAST (пороговое E–значение 0,005) (Camacho et al., BMC Bioinformatics 10:421, 2009). Белки, представляющие особый интерес, дополнительно анализировали с помощью InterProScan (Hunter et al., Nucleic Acids Res. 40:D306–D312, 2012).

Электронную микроскопию очищенного с помощью CsCl фага (>1 x10^11 БОЕ/мл), который лизировал эндосимбиотические бактерии Buchnera, выполняли путем разведения исходного раствора буфером на основе триптического соевого бульона. Фаги наносили на тонкие сетки Formvar на 400 меш с углеродным покрытием, окрашивали 2% (вес./об.) уранилацетатом и сушили на воздухе. Образцы наблюдали в трансмиссионном электронном микроскопе JEOL 1200EX, функционирующем при ускоряющем напряжении 100 кВ. Пять вирионов каждого фага измеряли для расчета средних значений и стандартных отклонений размеров капсида и отростка при необходимости.

Пример 3. Обработка тлей раствором очищенных фагов

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность тлей посредством их обработки раствором фагов. Данный пример демонстрирует, что влияние фага на тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к фагам. Один штамм бактерий–мишеней представляет собой Buchnera, при этом фаг был идентифицирован в примере 2.

Тли представляют собой одних из наиболее важных насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями. Они причиняют непосредственный вред растению в результате кормления и выступают в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии. Растворы фагов составляли при 0 (отрицательный контроль), 10², 10⁵ или 10⁸ бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл фага из примера 2 в 10 мл стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами.

Схема эксперимента

Для подготовки к обработке тлей выращивали в лабораторных условиях и среде. В комнате с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света; 60±5% RH; 20±2°C) растения конских бобов выращивали в смеси вермикулита и перлита при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок второго и третьего возраста собирали из здоровых растений и разделяли по видам обработки таким образом, что для каждого вида обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Растворы фагов получали, как описано в данном документе. Лунки 96–луночного планшета заполняли 200 мкл искусственного рациона для тлей (Febvay et al., Canadian Journal of Zoology 66(11):2449–2453, 1988), и планшет закрывали парафильмом для получения съедобного саше. Искусственный рацион смешивали со стерильной водой и 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами в качестве отрицательного контроля либо растворами фагов с различными концентрациями фагов. Растворы фагов смешивали с искусственным рационом с получением конечных концентраций фагов от 10² до 10⁸ (БОЕ)/мл.

Для каждой повторности обработки 30–50 тлей на стадии личинок второго и третьего возраста помещали отдельно в лунки 96–луночного планшета, и планшет со съедобным саше переворачивали над ними, что позволяло насекомым питаться через парафильм и оставаться ограниченными отдельными лунками. Экспериментальных тлей содержали при тех же самых условиях окружающей среды, что и колонии тлей. После того, как тлей вскармливали в течение 24 часов, съедобное саше заменяли новым, содержащим стерильный искусственный рацион, и новое стерильное саше предоставляли каждые 24 часа в течение 4 дней. Когда саше заменяли, тлей также проверяли в отношении смертности. Тлю считали мертвой, если она становилась коричневой или располагалась на дне лунки и не двигалась во время наблюдения. Если тля находилась на парафильме съедобного саше, но не двигалась, она считалась кормящейся и живой.

Статус Buchnera в образцах от тлей оценивали с помощью ПЦР. Взрослых тлей из группы отрицательного контроля (не обработанных фагом) и группы, обработанной фагом, вначале подвергали поверхностной стерилизации 70% этанолом в течение 1 минуты, 10% отбеливателем в течение 1 минуты и тремя промывками сверхчистой водой в течение 1 минуты. Общую ДНК экстрагировали из каждой особи (всего тела) с помощью набора для выделения ДНК насекомых (OMEGA, Bio–tek) в соответствии с протоколом производителя. Праймеры для Buchnera, прямой праймер 5′–GTCGGCTCATCACATCC–3′ (SEQ ID NO: 221) и обратный праймер 5′–TTCCGTCTGTATTATCTCCT–3′ (SEQ ID NO: 222), разрабатывали на основе последовательностей 23S–5S рРНК, полученных из генома Buchnera (номер доступа: GCA_000009605.1) (Shigenobu et al., Nature 407:81–86, 2000) с использованием программного обеспечения Primer 5.0 (Primer–E Ltd., Плимут, Великобритания). Циклы ПЦР–амплификации включали в себя начальный этап денатурации при 95°C в течение 5 минут, 35 циклов при 95°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 60 секунд и конечный этап элонгации в течение 10 минут при 72°C. Продукты амплификации из обработанных рифампицином и контрольных образцов анализировали на 1% агарозных гелях, окрашивали с помощью SYBR Safe и визуализировали с использованием системы визуализации. Тли, обработанные фагами, демонстрировали снижение экспрессии специфичных для Buchnera генов.

Показатели выживаемости тлей, обработанных специфичными в отношении Buchnera фагами, сравнивали с тлями, обработанными отрицательным контролем. Показатели выживаемости тлей, обработанных специфичными в отношении Buchnera фагами, снижались по сравнению с тлями, обработанными контролем.

Пример 4. Получение раствора бактериоцина colA

Данный пример демонстрирует получение и очистку бактериоцина colA.

Последовательность конструкции catatgatgacccgcaccatgctgtttctggcgtgcgtggcggcgctgtatgtgtgcattagcgcgaccgcgggcaaaccggaagaatttgcgaaactgagcgatgaagcgccgagcaacgatcaggcgatgtatgaaagcattcagcgctatcgccgctttgtggatggcaaccgctataacggcggccagcagcagcagcagcagccgaaacagtgggaagtgcgcccggatctgagccgcgatcagcgcggcaacaccaaagcgcaggtggaaattaacaaaaaaggcgataaccatgatattaacgcgggctggggcaaaaacattaacggcccggatagccataaagatacctggcatgtgggcggcagcgtgcgctggctcgag (SEQ ID NO: 223)

Схема эксперимента

ДНК получали с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров с вышерасположенными (NdeI) и нижерасположенными (XhoI) сайтами рестрикции. Прямой праймер GTATCTATTCCCGTCTACGAACATATGGAATTCC (SEQ ID NO: 224)

и обратный праймер CCGCTCGAGCCATCTGACACTTCCTCCAA (SEQ ID NO: 225). Очищенные ПЦР–фрагменты (NucleoSpin® Extract II – Macherey Nagel) расщепляли с помощью NdeI или XhoI, и затем фрагменты лигировали. В случае клонирования colA лигируемый фрагмент ДНК клонировали в вектор pcr2.1 (номер доступа в базе данных GenBank EY122872) (Anselme et al., BMC Biol. 6:43, 2008). Нуклеотидную последовательность систематически проверяли (Cogenics).

Плазмиду с последовательностью colA экспрессировали в BL21 (DE3)/pLys. Бактерии выращивали в бульоне LB при 30°C. При OD600 0,9 добавляли изопропил–β–D–1–тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мM, и клетки выращивали в течение 6 часов. Бактерии лизировали путем ультразвуковой обработки в 100 мM NaCl, 1% Triton X–100, 100 мM Tris–основания с pH 9,5, и белки загружали в колонку HisTrap HP (GE Healthcare). Колонку последовательно промывали с помощью 100 мM NaCl, 100 мM Tris–HCl с pH 6,8 и PBS. Элюирование проводили 0,3M имидазолом в PBS. Обессоливающие колонки PD–10 (GE Healthcare) применяли для удаления имидазола, и солюбилизированные в PBS пептиды концентрировали на центрифужных фильтрующих элементах (Millipore).

Последовательность белка ColA:

MTRTMLFLAC VAALYVCISA TAGKPEEFAK LSDEAPSNDQ AMYESIQRYR RFVDGNRYNG GQQQQQQPKQ WEVRPDLSRD QRGNTKAQVE INKKGDNHDI NAGWGKNING PDSHKDTWHV GGSVRW (SEQ ID NO: 211)

Пример 5. Обработка тлей раствором бактериоцина colA

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность тлей посредством их обработки раствором бактериоцина. Данный пример демонстрирует, что влияние бактериоцинов на тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к бактериоцину ColA. Один штамм бактерий–мишеней представляет собой Buchnera, при этом бактериоцин был получен в примере 1.

Тли представляют собой одних из наиболее важных насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями. Они причиняют непосредственный вред растению в результате кормления и выступают в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии. Растворы ColA составляли при 0 (отрицательный контроль), 0,6, 1, 50 или 100 мг/мл ColA из примера 4 в 10 мл стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами.

Схема эксперимента

Для подготовки к обработке тлей выращивали в лабораторных условиях и среде. В комнате с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света; 60±5% RH; 20±2°C) растения выращивали в смеси вермикулита и перлита и заражали тлями. В тех же самых климатических условиях личинки E. balteatus получали в результате массового производства; журчалок выкармливали с использованием сахара, пыльцы и воды; и откладку яиц индуцировали путем помещения зараженных растений–хозяев в садок для насекомых на 3 ч. Полный жизненный цикл происходил на растениях–хозяевах, которые ежедневно повторно заражали тлями.

Лунки 96–луночного планшета заполняли 200 мкл искусственного рациона для тлей (Febvay et al., Canadian Journal of Zoology 66(11):2449–2453, 1988), и планшет закрывали парафильмом для получения съедобного саше. Искусственный рацион смешивали с раствором стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами в качестве отрицательного контроля или растворами ColA с различными концентрациями ColA. Растворы ColA смешивали с искусственным рационом с получением конечных концентраций от 0,6 до 100 мг/мл.

Для каждой повторности обработки 30–50 тлей на стадии личинок второго и третьего возраста помещали отдельно в лунки 96–луночного планшета, и планшет со съедобным саше переворачивали над ними, что позволяло насекомым питаться через парафильм и оставаться ограниченными отдельными лунками. Экспериментальных тлей содержали при тех же самых условиях окружающей среды, что и колонии тлей. После того, как тлей вскармливали в течение 24 часов, съедобное саше заменяли новым, содержащим стерильный искусственный рацион, и новое стерильное саше предоставляли каждые 24 часа в течение 4 дней. Когда саше заменяли, тлей также проверяли в отношении смертности. Тлю считали мертвой, если она становилась коричневой или располагалась на дне лунки и не двигалась во время наблюдения. Если тля находилась на парафильме съедобного саше, но не двигалась, она считалась кормящейся и живой.

Статус Buchnera в образцах от тлей оценивали с помощью ПЦР. Взрослых тлей из групп отрицательного контроля и обработки фагом вначале подвергали поверхностной стерилизации 70% этанолом в течение 1 минуты, 10% отбеливателем в течение 1 минуты и тремя промывками сверхчистой водой в течение 1 минуты. Общую ДНК экстрагировали из каждой особи (всего тела) с помощью набора для выделения ДНК насекомых (OMEGA, Bio–tek) в соответствии с протоколом производителя. Праймеры для Buchnera, прямой праймер 5′–GTCGGCTCATCACATCC–3′ (SEQ ID NO: 221) и обратный праймер 5′–TTCCGTCTGTATTATCTCCT–3′ (SEQ ID NO: 222), разрабатывали на основе последовательностей 23S–5S рРНК, полученных из генома Buchnera (номер доступа: GCA_000009605.1) (Shigenobu et al., Nature 200:407, 81–86) с использованием программного обеспечения Primer 5.0 (Primer–E Ltd., Плимут, Великобритания). Циклы ПЦР–амплификации включали в себя начальный этап денатурации при 95°C в течение 5 минут, 35 циклов при 95°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 60 секунд и конечный этап элонгации в течение 10 минут при 72°C. Продукты амплификации из обработанных рифампицином и контрольных образцов анализировали на 1% агарозных гелях, окрашивали с помощью SYBR Safe и визуализировали с использованием системы визуализации. Тли, обработанные ColA, демонстрировали снижение экспрессии специфичных для Buchnera генов.

Показатели выживаемости тлей, обработанных специфичным в отношении Buchnera бактериоцином ColA, сравнивали с тлями, обработанными отрицательным контролем. Показатели выживаемости тлей, обработанных специфичным в отношении Buchnera бактериоцином ColA, снижались по сравнению с тлями, обработанными контролем.

Пример 6. Обработка тлей растворами рифампицина

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность тлей посредством их обработки рифампицином, антибиотиком узкого спектра действия, который ингибирует ДНК–зависимый синтез РНК путем ингибирования бактериальной РНК–полимеразы. Данный пример демонстрирует, что влияние рифампицина на тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к рифампицину. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera.

Тли представляют собой одних из наиболее важных насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями. Они причиняют непосредственный вред растению в результате кормления и выступают в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии.

Растворы антибиотика составляли при 0 (отрицательный контроль), 1, 10 или 50 мкг/мл рифампицина в 10 мл стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами.

Схема эксперимента

Для подготовки к обработке тлей выращивали в лабораторных условиях и среде. В комнате с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света; 60±5% RH; 20±2°C) растения конских бобов выращивали в смеси вермикулита и перлита при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок второго и третьего возраста собирали из здоровых растений и разделяли по видам обработки таким образом, что для каждого вида обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Растворы рифампицина получали путем растворения рифампицина (SIGMA–ALDRICH, 557303) в стерильной воде с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами. Лунки 96–луночного планшета заполняли 200 мкл искусственного рациона для тлей (Febvay et al., Canadian Journal of Zoology 66(11):2449–2453, 1988), и планшет закрывали парафильмом для получения съедобного саше. Искусственный рацион смешивали со стерильной водой и 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами в качестве отрицательного контроля или раствором рифампицина с одной из концентраций рифампицина. Растворы рифампицина смешивали с искусственным рационом с получением конечных концентраций антибиотика от 1 до 50 мкг/мл.

Для каждой повторности обработки 30–50 тлей на стадии личинок второго и третьего возраста помещали отдельно в лунки 96–луночного планшета, и планшет со съедобным саше переворачивали над ними, что позволяло насекомым питаться через парафильм и оставаться ограниченными отдельными лунками. Экспериментальных тлей содержали при тех же самых условиях окружающей среды, что и колонии тлей. После того, как тлей вскармливали в течение 24 часов, съедобное саше заменяли новым, содержащим стерильный искусственный рацион, и новое стерильное саше предоставляли каждые 24 часа в течение четырех дней. Когда саше заменяли, тлей также проверяли в отношении смертности. Тлю считали мертвой, если она становилась коричневой или располагалась на дне лунки и не двигалась во время наблюдения. Если тля находилась на парафильме съедобного саше, но не двигалась, она считалась кормящейся и живой.

Статус Buchnera в образцах от тлей оценивали с помощью ПЦР. Общую ДНК выделяли из контрольных (не обработанных рифампицином) и обработанных рифампицином особей с помощью набора для выделения ДНК насекомых (OMEGA, Bio–tek) в соответствии с протоколом производителя. Праймеры для Buchnera, прямой праймер 5′–GTCGGCTCATCACATCC–3′ (SEQ ID NO: 221) и обратный праймер 5′–TTCCGTCTGTATTATCTCCT–3′ (SEQ ID NO: 222), разрабатывали на основе последовательностей 23S–5S рРНК, полученных из генома Buchnera (номер доступа: GCA_000009605.1) (Shigenobu et al., Nature 407:81–86, 2000) с использованием программного обеспечения Primer 5.0 (Primer–E Ltd., Плимут, Великобритания). Циклы ПЦР–амплификации включали в себя начальный этап денатурации при 95°C в течение 5 минут, 35 циклов при 95°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 60 секунд и конечный этап элонгации в течение 10 минут при 72°C. Продукты амплификации из обработанных рифампицином и контрольных образцов анализировали на 1% агарозных гелях, окрашивали с помощью SYBR Safe и визуализировали с использованием системы визуализации. Тли, обработанные рифампицином, демонстрировали снижение экспрессии специфичных для Buchnera генов.

Показатели выживаемости тлей, обработанных раствором рифампицина, сравнивали с тлями, обработанными отрицательным контролем. Показатели выживаемости тлей, обработанных раствором рифампицина, снижались по сравнению с контролем.

Пример 7. Обработка микроскопических клещей из рода Varroa, которые инфицируют пчел, растворами рифампицина

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность микроскопических клещей из рода Varroa посредством их обработки раствором антибиотика. Данный пример демонстрирует, что влияние окситетрациклина на микроскопических клещей из рода Varroa опосредовано модулированием популяций бактерий, таких как Bacillus, эндогенных по отношению к микроскопическим клещам из рода Varroa, которые являются восприимчивыми к окситетрациклину.

Микроскопические клещи из рода Varroa считаются основной причиной широко распространенного синдрома разрушения колоний (CCD), который приводит к массовому снижению численности колоний домашних медоносных пчел Apis mellifera во всем мире. Они прикрепляются к брюшку пчел и высасывают их кровь, лишая их питательных веществ и в конечном счете уничтожая их. Хотя микроскопических клещей из рода Varroa можно уничтожить с помощью химически синтезируемых майтицидов, эти типы химических веществ следует держать в отдалении от съедобного меда.

Схема терапии. Раствор окситетрациклина составляли при 0 (отрицательный контроль), 1, 10 или 50 мкг/мл в 10 мл стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами.

Схема эксперимента

Для определения того, имеют ли взрослые микроскопические клещи из рода Varroa на стадии размножения другую восприимчивость по сравнению с форетическими микроскопическими клещами или их потомством, поскольку их кутикула не является завтердевшей, собирали микроскопических клещей из рода Varroa, живущих на взрослых пчелах Apis mellifera, и микроскопических клещей, ассоциированных с личинками и куколками. В этом анализе исследовали влияние растворов антибиотика на различные типы микроскопических клещей и определяли, как их приспособленность изменяется в результате целенаправленного воздействия на эндогенные микроорганизмы, такие как Bacillus.

Микроскопических клещей, поражающих расплод, собирали из сот (или кусочков сот) в колониях пчел, зараженных микроскопическими клещами из рода Varroa. Микроскопических клещей собирали из ячеек, в которых развиваются личинки пчел.

Микроскопических клещей из рода Varroa разделяли на группы по возрасту их хозяев в расплоде и анализировали по отдельности. Возраст расплода определяли на основании морфологических характеристик и пигментации личинок или куколок следующим образом: микроскопических клещей из рода Varroa, собранных из закрученных личинок, которые были достаточно маленькими для того, чтобы передвигаться по своей ячейке, помещали в группу 1; микроскопических клещей из рода Varroa, собранных из выпрямленных личинок, которые были слишком большими, чтобы лежать в ячейке, и начинали вытягиваться прямо с помощью своего ротового аппарата в направлении отверстия ячейки, помещали в группу 2; и микроскопических клещей из рода Varroa, собранных из куколок, помещали в группу 3. Микроскопических клещей хранили на личинках или куколках их хозяев в стеклянных чашках Петри до тех пор, пока не собирали 50 единиц. Это обеспечивало сохранение неизменным их стандартных условий питания и физиологического состояния. Чтобы предупредить отделение микроскопических клещей от личинок или куколок их хозяев или заползание друг на друга, в одной и той же чашке содержали только хозяев на одной и той же стадии развития.

Устройство – кольцо из нержавеющей стали (внутренний диаметр 56 мм, высота 2–3 мм) и 2 стеклянных круга (диаметр 62 мм) – очищали ацетоном и гексаном или пентаном с образованием испытательной арены. Растворы окситетрациклина и контрольный раствор наносили на устройство путем однородного распыления на стеклянные диски и кольцо арены. Для этого в резервуар загружали 1 мл растворов; устанавливали расстояние от опрыскиваемой поверхности до дна пробирки на 11 мм, и использовали форсунку на 0,0275 дюйма. Давление регулировали (обычно в диапазоне 350–500 гПа) до тех пор, пока количество отложенного раствора не составляло 1 ± 0,05 мг/см². Растворы антибиотика выливали в соответствующие чашки, покрывая все дно чашек, а остаточную жидкость выпаривали под вытяжным устройством. Кольцо помещали между стеклянными кругами, образуя камеру. Камеры использовали в течение 60 часов после приготовления не более чем для трех анализов в целях контроля воздействия растворов антибиотика на микроскопических клещей. В эту камеру вводили от 10 до 15 микроскопических клещей из рода Varroa, и части устройства соединяли вместе каплями расплавленного воска. Использовали микроскопических клещей, собранных из закрученных личинок, выпрямленных личинок, белоглазых куколок и темноглазых куколок с белыми и бледными тельцами.

Через 4 часа микроскопических клещей переносили на чистую стеклянную чашку Петри (диаметр 60 мм) с двумя или тремя белоглазыми куколками (через 45 дней после покрытия оболочкой) для вскармливания. Микроскопических клещей наблюдали под препаровальной лупой через 4 часа, 24 часа и 48 часов после обработки антибиотиком или контрольными растворами и классифицировали в соответствии со следующими категориями:

Подвижные: они передвигались на своих конечностях, вне зависимости от того, тыкали ли в них иглой.

Парализованные: они двигали одним или несколькими придатками, без стимуляции или после стимуляции, однако они не могли передвигаться.

Мертвые: неподвижные и не реагировали на 3 последовательные стимуляции.

Стерильную зубочистку или иглу использовали для стимуляции микроскопических клещей путем прикасания к их конечностям. Новые зубочистки или стерильные иглы использовали для стимуляции каждой группы для избежания контаминации между группами микроскопических клещей.

Анализы проводили при 32,5°C и относительной влажности 6070%. Если смертность контрольных особей превышала 30%, то повторность исключали. Каждый эксперимент повторяли с использованием четырех серий камер.

Статус Bacillus в группах микроскопических клещей из рода Varroa оценивали с помощью ПЦР. Общую ДНК выделяли из контрольных (не обработанных окситетрациклином) и обработанных окситетрациклином особей (целого тела) с помощью набора для выделения ДНК (OMEGA, Bio–tek) в соответствии с протоколом производителя. Праймеры для Bacillus, прямой праймер 5′–GAGGTAGACGAAGCGACCTG–3′ (SEQ ID NO: 226) и обратный праймер 5′–TTCCCTCACGGTACTGGTTC–3′ (SEQ ID NO: 227), разрабатывали на основе последовательностей 23S–5S рРНК, полученных из генома Bacillus (номер доступа: AP007209.1) (Takeno et al., J. Bacteriol. 194(17):4767–4768, 2012) с использованием программного обеспечения Primer 5.0 (Primer–E Ltd., Плимут, Великобритания). Циклы ПЦР–амплификации включали в себя начальный этап денатурации при 95°C в течение 5 минут, 35 циклов при 95°C в течение 1 минуты, при 59°C в течение 1 минуты и при 72°C в течение 2 минут и конечный этап элонгации в течение 5 минут при 72°C. Продукты амплификации из обработанных окситетрациклином и контрольных образцов анализировали на 1% агарозных гелях, окрашивали с помощью SYBR Safe и визуализировали с использованием системы визуализации.

Показатели выживаемости микроскопических клещей из рода Varroa, обработанных раствором окситетрациклина, сравнивали с микроскопическими клещами из рода Varroa, обработанными отрицательным контролем.

Предполагается, что показатели выживаемости и подвижность микроскопических клещей из рода Varroa, обработанных раствором окситетрациклина, снижаются по сравнению с контролем.

Пример 8. Высокопроизводительный скрининг (HTS) в отношении молекул, целенаправленно воздействующих на Buchnera

Данный пример демонстрирует идентификацию молекул, которые целенаправленно воздействуют на Buchnera.

Схема эксперимента. Для HTS в целях идентификации ингибиторов штаммов бактерий–мишеней Buchnera использовали сбраживание сахарозы в среде pH–MMSuc (Ymele–Leki et al., PLoS ONE 7(2):e31307, 2012) для снижения pH среды. Индикаторы pH в среде обеспечивали спектрофотометрический контроль подкисления среды по изменению поглощения при 615 нм (A615). Штамм бактерий–мишеней Buchnera, полученный из исходной культуры в глицерине, высевали на чашку с агаром LB и инкубировали в течение ночи при 37°C. Петлю для посева с клетками собирали, промывали три раза с помощью PBS и затем ресуспендировали в PBS при оптической плотности 0,015.

Для HTS 10 мкл суспензий этих бактериальных клеток разделяли на аликвоты в лунки 384–луночного планшета, содержащего 30 мкг среды pH–MMSuc и 100 нл фракции исследуемого соединения из библиотеки природных продуктов, содержащей предварительно фракционированные экстракты (39314 экстрактов, размещенных в 384–луночных планшетах) из источников–микроорганизмов, таких как эндофиты грибов, эндофиты бактерий, почвенные бактерии и морские бактерии, описанные в (Ymele–Leki et al., PLoS ONE 7(2):e31307, 2012). Для каждого анализа A615 измеряли после инкубирования при комнатной температуре через 6 часов и 20 часов. Этот этап является автоматизированным и валидированным в формате 384–луночного планшета с использованием спектрофотометра для многолуночных планшетов EnVisionTM для исследования всех фракций из библиотеки. Фракции, которые демонстрировали замедленное подкисление среды при сбраживании сахарозы и ингибируемый клеточный рост, выбирали для дальнейшей очистки и идентификации.

Пример 9. Выделение и идентификация молекул, специфичных в отношении Buchnera

Данный пример демонстрирует выделение и идентификацию изолята из фракции, описанной в примере 8, который блокирует сбраживание сахарозы и ингибирует клеточный рост Buchnera.

Схема эксперимента. Фракцию, описанную в примере 8, ресуспендировали в 90% смеси вода/метанол и пропускали через колонку C18 SPE с получением фракции I. Затем колонку промывали метанолом с получением фракции II. Фракцию II отделяли с помощью системы для HPLC серии Agilent 1100 на колонке для препаративной хроматографии с фенилгексилом (Phenomenex, Luna, 25 см, 610 мм, размер частиц 5 мм) с использованием буфера для элюирования со смесью 20% ацетонитрил/вода с 0,1% муравьиной кислотой при скорости потока 2 мл/мин. в течение 50 минут. Это приводило к образованию многочисленных соединений с различными значениями времени элюирования. Спектры для каждого соединения получали на масс–спектрометре Alpha FT–IR (Bruker), спектрофотометре для УФ/видимой области спектра UltrospecTM 5300 pro (Amersham Biosciences) и ядерно–магнитном резонансном спектрометре INOVA на 600 МГц (Varian).

Пример 10. Обработка тлей раствором молекулы, специфичной в отношении Buchnera

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность тлей посредством обработки их одним из соединений, идентифицированных в примере 9, благодаря модулированию популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к этому соединению. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera.

Схема терапии. Каждое из соединений из примера 9 составляли при 0 (отрицательный контроль), 0,6, 1, 20 или 80 мкг/мл в 10 мл стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами.

Схема эксперимента

Для подготовки к обработке тлей выращивали в лабораторных условиях и среде. В комнате с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света; 60±5% RH; 20±2°C) растения конских бобов выращивали в смеси вермикулита и перлита при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок второго и третьего возраста собирали из здоровых растений и разделяли по видам обработки таким образом, что для каждого вида обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Лунки 96–луночного планшета заполняли 200 мкл искусственного рациона для тлей (Febvay et al., Canadian Journal of Zoology 66(11):2449–2453, 1988), и планшет закрывали парафильмом для получения съедобного саше. Искусственный рацион смешивали со стерильной водой с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами в качестве отрицательного контроля или растворами с различными концентрациями соединения.

Для каждой повторности обработки 30–50 тлей на стадии личинок второго и третьего возраста помещали отдельно в лунки 96–луночного планшета, и планшет со съедобным саше переворачивали над ними, что позволяло насекомым питаться через парафильм и оставаться ограниченными отдельными лунками. Экспериментальных тлей содержали при тех же самых условиях окружающей среды, что и колонии тлей. После того, как тлей вскармливали в течение 24 часов, съедобное саше заменяли новым, содержащим стерильный искусственный рацион, и новое стерильное саше предоставляли каждые 24 часа в течение 4 дней. Когда саше заменяли, тлей также проверяли в отношении смертности. Тлю считали мертвой, если она становилась коричневой или располагалась на дне лунки и не двигалась во время наблюдения. Если тля находилась на парафильме съедобного саше, но не двигалась, она считалась кормящейся и живой.

Статус Buchnera в образцах от тлей оценивали с помощью ПЦР. Тлей из групп отрицательного контроля и обработки соединением 1 вначале подвергали поверхностной стерилизации 70% этанолом в течение 1 минуты, 10% отбеливателем в течение 1 минуты и тремя промывками сверхчистой водой в течение 1 минуты. Общую ДНК экстрагировали из каждой особи (всего тела) с помощью набора для выделения ДНК насекомых (OMEGA, Bio–tek) в соответствии с протоколом производителя. Праймеры для Buchnera, прямой праймер 5′–GTCGGCTCATCACATCC–3′ (SEQ ID NO: 221) и обратный праймер 5′–TTCCGTCTGTATTATCTCCT–3′ (SEQ ID NO: 222), разрабатывали на основе последовательностей 23S–5S рРНК, полученных из генома Buchnera (номер доступа: GCA_000009605.1) (Shigenobu et al., Nature 407:81–86, 2000) с использованием программного обеспечения Primer 5.0 (Primer–E Ltd., Плимут, Великобритания). Циклы ПЦР–амплификации включали в себя начальный этап денатурации при 95°C в течение 5 минут, 35 циклов при 95°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 60 секунд и конечный этап элонгации в течение 10 минут при 72°C. Продукты амплификации из обработанных соединением 1 и контрольных образцов анализировали на 1% агарозных гелях, окрашивали с помощью SYBR Safe и визуализировали с использованием системы визуализации. Снижение экспрессии генов, специфичных для Buchnera, указывало на противомикробную активность соединения 1.

Показатель выживаемости тлей, обработанных соединением, сравнивали с тлями, обработанными отрицательным контролем. Предполагается, что снижение показателя выживаемости тлей, обработанных соединением, указывало на противомикробную активность соединения.

Пример 11. Тли, обработанные раствором антибиотика

Данный пример демонстрирует обработку тлей рифампицином, антибиотиком узкого спектра действия, который ингибирует ДНК–зависимый синтез РНК путем ингибирования бактериальной РНК–полимеразы. Данный пример демонстрирует, что влияние рифампицина на тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к рифампицину. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Раствор антибиотика составляли в соответствии со способом доставки следующим образом (фиг. 1A–1G).

1) Через растения: с 0 (отрицательный контроль) или 100 мкг/мл рифампицина, составленного в искусственном рационе (согласно Akey and Beck, 1971; см. раздел Схема эксперимента) с незаменимыми аминокислотами и без них (2 мг/мл гистидина, 2 мг/мл изолейцина, 2 мг/мл лейцина, 2 мг/мл лизина, 1 мг/мл метионина, 1,62 мг/мл фенилаланина, 2 мг/мл треонина, 1 мг/мл триптофана и 2 мг/мл валина).

2) Покрытие листьев: 100 мкл 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно–активного растворителя Silwet L–77 в воде (отрицательный контроль) или 100 мкл 50 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя, применяли непосредственно в отношении поверхности листьев и оставляли высыхать.

3) Микроинъекция: растворы для инъекций представляли собой 0,025% неионогенный кремнийорганический поверхностно–активный растворитель Silwet L–77 в воде (отрицательный контроль) или 50 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя.

4) Местная доставка: 100 мкл 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно–активного растворителя Silwet L–77 (отрицательный контроль) или 50 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя, распыляли с помощью аэрозольного флакончика на 30 мл.

5) Способ А инъекции в листья – заливание в листья и разрезание листьев: в листья инъецировали примерно 1 мл 50 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем или примерно 1 мл отрицательного контроля с водой и пищевым красителем. Листья нарезали на квадратные кусочки размером 2×2 см, и тлей помещали на кусочки листьев.

6) Заливание в листья и доставка через растение: в листья инъецировали примерно 1 мл 100 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем или примерно 1 мл отрицательного контроля с водой и пищевым красителем. Черешок листа, в который была произведена инъекция, затем помещали в пробирку Eppendorf с 1 мл 100 мкг/мл рифампицина с водой и пищевым красителем или 1 мл отрицательного контроля, содержащего только воду и пищевой краситель.

7) Комбинированный способ доставки: a) местная доставка тлям и растениям: путем распыления как на тлей, так и на растения 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно–активного растворителя Silwet L–77 в воде (отрицательный контроль) или 100 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя, с помощью аэрозольного флакончика на 30 мл, b) доставка через растение: только вода (отрицательный контроль) или 100 мкг/мл рифампицина, составленного в воде.

Доставка через растения – схема эксперимента

Тлей (линии LSR–1, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 3 различные группы обработки: 1) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот, 2) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 100 мкг/мл рифампицина и 3) искусственный рацион с незаменимыми аминокислотами и 100 мкг/мл рифампицина. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Используемый искусственный рацион готовили, как описано ранее (Akey and Beck, 1971 Continuous Rearing of the Pea Aphid, Acyrthosiphon pisum, on a Holidic Diet), с незаменимыми аминокислотами и без них (2 мг/мл гистидина, 2 мг/мл изолейцина, 2 мг/мл лейцина, 2 мг/мл лизина, 1 мг/мл метионина, 1,62 мг/мл фенилаланина, 2 мг/мл треонина, 1 мг/мл триптофана и 2 мг/мл валина), за исключением того, что ни в одном случае рацион не включал гомосерин или бета–аланилтирозин. Значение pH рационов доводили до 7,5 с помощью KOH, и рационы стерилизовали фильтрацией с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C в течение короткого срока (<7 дней) или при –80°C в течение длительного срока.

Исходные растворы рифампицина (Tokyo Chemical Industry, LTD) готовили в концентрации 25 мг/мл в метаноле, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при –20°C. Для обработок (см. раздел Схема терапии) подходящее количество исходного раствора добавляли к искусственному рациону с незаменимыми аминокислотами или без них с получением конечной концентрации 100 мкг/мл рифампицина. Рацион затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком и листом конских бобов, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания искусственным рационом затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 33 тли. Системы вскармливания искусственным рационом заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри, в которой содержалась система вскармливания искусственным рационом, в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1^–го, 2^–го, 3^–го, 4^–го, 5^–го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента. При достижении тлями стадии личинок 4^–го возраста им предоставляли их собственные искусственные системы вскармливания в глубокой чашке Петри для того, чтобы можно было контролировать плодовитость, как только они достигали зрелого возраста.

В случае взрослых тлей новых нимф считали ежедневно и затем исключали. В конце экспериментов плодовитость определяли в виде среднего числа потомков, образуемых ежедневно после достижения тлей зрелого возраста. Снимки тлей получали на протяжении всего эксперимента для оценивания различий в размерах между группами обработки.

Через 7 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Обработка антибиотиками задерживает и останавливает прогрессирование развития тлей

Тлей LSR–1 на стадии личинок 1^–го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5^–го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 2A). Развитие задерживалось у тлей, обработанных рифампицином, и через 6 дней после обработки большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 3^–го возраста, и даже через 12 дней их размер подвергался существенному отрицательному влиянию (фиг. 2A–2C).

В отличие от этого, тли, обработанные искусственным рационом с рифампицином с добавлением незаменимых аминокислот, развивались быстрее и достигали стадий личинок более позднего возраста по сравнению с тлями, обработанными только рифампицином, однако не так быстро, как тли, обработанные искусственным рационом без незаменимых аминокислот (фиг. 2A–2C). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином ухудшала развитие тлей. Добавление незаменимых аминокислот обратно частично устраняло этот дефект развития.

Обработка антибиотиками повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Большинство тлей, обработанных только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, были живыми через 5 дней после обработки (фиг. 3). Через 5 дней тли начинали постепенно погибать, а некоторые выживали по истечении 13 дней после обработки.

В отличие от этого, тли, обработанные рифампицином без незаменимых аминокислот, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, обработанные только искусственным рационом (p<0,00001). Тли, обработанные рифампицином, начинали погибать через 1 день после обработки, и все тли погибали вследствие обработки через 9 дней. Тли, обработанные как рифампицином, так и незаменимыми аминокислотами, выживали дольше, чем тли, обработанные только рифампицином (p=0,017). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Обработка антибиотиками снижала интенсивность размножения тлей

В ходе обработок также отслеживали плодовитость тлей. Через 7 и 8 дней после обработки большинство взрослых тлей, обработанных искусственным рационом без незаменимых аминокислот, начинали размножаться. Среднее число потомков, образуемых ежедневно после достижения зрелого возраста тлями, обработанными искусственным рационом без добавления незаменимых аминокислот, составляло примерно 4 (фиг. 4). В отличие от этого, тли, обработанные рифампицином с незаменимыми аминокислотами или без них, были неспособны достигать зрелого возраста и образовывать потомство. Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином приводила к утрате способности к размножению у тлей.

Обработка антибиотиками снижала количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводил ли рифампицин к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 7 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные рифампицином, имели в ~4 раза меньше копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 5), что указывало на то, что обработка рифампицином снижала уровни Buchnera.

Доставка путем покрытия листьев – схема эксперимента

Исходный раствор рифампицина добавляли к 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно–активного растворителя Silwet L–77 с получением конечной концентрации 50 мкг/мл рифампицина. Тлей (линии eNASCO, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов, как описано в предыдущем примере. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: листья опрыскивали 1) отрицательным контролем (только раствором растворителя), 2) 50 мкг/мл рифампицина в растворителе. Растворы поглощались кусочком листа конских бобов размером 2×2 см.

Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Для каждой обработки на каждый лист помещали 20 тлей. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли в случае их обнаружения. Помимо этого, стадию развития (личинки 1^–го, 2^–го, 3^–го, 4^–го, 5^–го возраста и 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5^–го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента. Снимки тлей получали на протяжении всего эксперимента для оценивания различий в размерах между группами обработки.

Через 6 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки, и qPCR для количественной оценки уровней Buchnera проводили, как описано в предыдущем примере.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством покрытия листьев, задерживает и останавливает прогрессирование развития тлей

Тлей LSR–1 на стадии личинок 1^–го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента, что описано в данном документе. Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, помещенные на покрытые листья, обработанные контролем, начинали достигать зрелого возраста (стадии размножающихся личинок 5^–го возраста; 5R) примерно через 6 дней (фиг. 6A). Развитие задерживалось у тлей, помещенных на листья, покрытые рифампицином, и через 6 дней после обработки большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 3^–го возраста, и даже через 12 дней их размер подвергался существенному отрицательному влиянию (фиг. 6A и 6B).

Эти данные указывают на то, что покрытие листьев рифампицином ухудшало развитие тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством покрытия листьев, повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок путем покрытия листьев. Тли, помещенные на листья, покрытые рифампицином, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, помещенные на листья, покрытые контролем (фиг. 7). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством покрытия листьев, отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством покрытия листьев, снижала количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством покрытия листьев, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 6 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, помещенные на листья, обработанные контролем, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, помещенные на листья, обработанные рифампицином, характеризовались существенным снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 8), что указывало на то, что обработка путем покрытия листьев рифампицином устраняла эндосимбиотические Buchnera.

Доставка путем микроинъекции – схема эксперимента

Микроинъекцию осуществляли с помощью автоматического нанолитрового инъектора NanoJet III с выдвижной иглой из боросиликатного стекла собственного изготовления (Drummond Scientific; № по кат. 3–000–203–G/XL). Тлей (линии eNASCO, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов, как описано в предыдущем примере. Тлей переносили с помощью малярной кисти в трубную систему, подсоединенную к вакууму (фиг. 1C). Место инъекции находилось в вентральной части груди тли. Растворы для инъекций представляли собой 0,025% неионогенный кремнийорганический поверхностно–активный растворитель Silwet L–77 (Lehle Seeds, № по кат. VIS–01) в воде (отрицательный контроль) или 50 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя. Объем инъекции составлял 10 нл для нимфы и 20 нл для взрослой особи (в обоих случаях при скорости 2 нл/с). В каждой группе обработки было примерно одно и то же число получивших инъекцию особей с каждого из растений коллекции. После инъекции тлей выпускали в чашку Петри с листьями конских бобов, черешки которых находились в 2% агаре.

Обработка антибиотиками путем микроинъекции снижала количество Buchnera у тлей

Для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством микроинъекции, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 4 дня после обработки, и проводили qPCR, как описано в предыдущем примере, для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, получившие микроинъекцию отрицательного контроля, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, нимфы и взрослые особи тлей, получившие микроинъекцию рифампицина, характеризовались существенным снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 9), что указывало на то, что обработка путем микроинъекции рифампицина уменьшала присутствие эндосимбиотических Buchnera.

Местная доставка – схема эксперимента

Тлей (линии LSR–1, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов, как описано в предыдущем примере. Аэрозольные флакончики наполняли 2 мл контроля (0,025% Silwet L–77) или растворами рифампицина (50 мкг/мл в растворе растворителя). Тлей (число=10) переносили на дно чистой чашки Петри и собирали на краю чашки Петри с помощью малярной кисти. Затем тлей разделяли на две когорты и опрыскивали ~100 мкл контрольного раствора или раствора рифампицина. Непосредственно после распыления чашку Петри закрывали крышкой. Через пять минут после распыления тлей выпускали в чашку Петри с листьями конских бобов, при этом черешки находились в 2% агаре.

Обработка антибиотиками путем местной доставки снижала количество Buchnera у тлей

Для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством местной доставки, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 3 дня после обработки, и проводили qPCR, как описано в предыдущем примере, для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, опрысканные контрольным раствором, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, опрысканные рифампицином, характеризовались существенным снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 10), что указывало на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством местной обработки, снижала присутствие эндосимбиотических Buchnera.

Способ А инъекции в листья – заливание в листья и разрезание листьев

Схема эксперимента

Тлей LSR–1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (лист, в который была произведена инъекция воды с синим пищевым красителем) и 2) лист, в который была произведена инъекция 50 мкг/мл рифампицина в воде с синим пищевым красителем. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Для обработки исходный раствор рифампицина (25 мг/мл в 100% метаноле) разбавляли до 50 мкг/мл в воде с синим пищевым красителем. Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, залитым растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения. Для каждой обработки на каждый лист помещали 74–81 тлю. Системы вскармливания заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения. Помимо этого, стадию развития (личинки 1^–го, 2^–го, 3^–го, 4^–го, 5^–го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5^–го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством способа А инъекции в листья, задерживает и останавливает прогрессирование развития тлей

Тлей LSR–1 на стадии личинок 1–го и 2–го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Способ А инъекции в листья – Заливание в листья и разрезание листьев: схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные водой с пищевым красителем, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5–го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 11). Развитие задерживалось у тлей, вскармливаемых на листьях, в которые была произведена инъекция рифампицина, а через 6 дней после обработки большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 4–го возраста. Даже через 8 дней развитие тлей, вскармливаемых на листьях, в которые была произведена инъекция рифампицина, существенно задерживалось (фиг. 11). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином путем заливания в листья ухудшала развитие тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством способа А инъекции в листья, повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе экспериментов по заливанию в листья. Тли, помещенные на листья, в которые была произведена инъекция рифампицина, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, помещенные на листья, в которые была произведена инъекция контрольного раствора (фиг. 12). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством инъекции в листья, отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством способа А инъекции в листья, приводит к сниженным уровням Buchnera

Для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством заливания в листья, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 8 дней после обработки, и проводили qPCR, как описано в предыдущем примере, для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, вскармливаемые на листьях, в которые была произведена инъекция контрольного раствора, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, вскармливаемые на листьях, в которые была произведена инъекция рифампицина, характеризовались снижением числа копий Buchnera/тлей (фиг. 13), что указывало на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством инъекции в листья, уменьшала присутствие эндосимбиотических Buchnera, как показано в предыдущих примерах, и приводила к снижению приспособленности.

Заливание в листья и доставка через растение

Схема эксперимента

Тлей LSR–1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 20±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты.

Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) тли, помещенные на листья, в которые была произведена инъекция раствора отрицательного контроля (вода и пищевой краситель), и помещенные в пробирку Eppendorf с раствором отрицательного контроля, или 2) тли, помещенные на листья, в которые была произведена инъекция 100 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем, и помещенные в пробирку Eppendorf со 100 мкг/мл рифампицина в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Для обработки исходный раствор рифампицина (25 мг/мл в 100% метаноле) разбавляли до 100 мкг/мл в воде с синим пищевым красителем. Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, лист на котором также был залит растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 49–50 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1^–го, 2^–го, 3^–го, 4^–го, 5^–го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5^–го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством инъекции в листья и доставки через растение, задерживает и останавливает прогрессирование развития тлей

Тлей LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Заливание в листья и доставка через растение – схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные контрольным раствором (только водой с пищевым красителем), начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5^–го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 14).

Развитие задерживалось у тлей, обработанных рифампицином, а через 6 дней после обработки большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 3–го возраста. Даже через 8 дней их развитие существенно задерживалось (фиг. 14). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином путем заливания в листья ухудшала развитие тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством инъекции в листья и доставки через растение, повышала смертность тлей

Показатели выживаемости тлей также измеряли в ходе экспериментов, в которых тлей обрабатывали контрольным раствором или рифампицином, доставляемым посредством заливания в листья и через растение. Тли, вскармливаемые на листьях, залитых и обработанных рифампицином, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, вскармливаемые на листьях, залитых и обработанных контрольным раствором (фиг. 15). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством заливания в листья и через растение, отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством инъекции в листья и через растение, приводит к сниженным уровням Buchnera

Для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством заливания в листья и через растение, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 6 и 8 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей, как описано в предыдущих примерах.

Тли, вскармливаемые на листьях, в которые была произведена инъекция контрольного раствора и которые были им обработаны, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, вскармливаемые на листьях, залитых и обработанных рифампицином, характеризовались статистически значимым снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей в оба момента времени (p=0,0037 и p=0,0025, в дни 6 и 8 соответственно) (фиг. 16A и 16B), что указывало на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством заливания в листья и через растение, уменьшала присутствие эндосимбиотических Buchnera и, как показано в предыдущих примерах, приводила к снижению приспособленности.

Комбинированный способ доставки

Схема эксперимента

Тлей LSR–1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 20±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней.

Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) обработка раствором Silwet–L77 или контрольным раствором воды или 2) обработка рифампицином, разбавленным в Silwet L–77 или воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Комбинация способов доставки была следующей: a) местная доставка тлям и растениям путем распыления 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно–активного растворителя Silwet L–77 (отрицательный контроль) или 100 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя, с помощью аэрозольного флакончика на 30 мл и b) доставка через растение воды (отрицательного контроля) или 100 мкг/мл рифампицина, составленного в воде. Для обработки исходный раствор рифампицина (25 мг/мл в 100% метаноле) разбавляли до 100 мкг/мл в Silwet L–77 (для местной обработки тлей и покрытия листа) или воде (для доставки через растение). Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, лист на котором также был залит растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 76–80 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1^–го, 2^–го, 3^–го, 4^–го, 5^–го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5^–го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Комбинированная обработка антибиотиками задерживает развитие тлей

Тлей LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Комбинированный способ доставки – схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные контролем, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5^–го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 17). Развитие задерживалось у тлей, обработанных рифампицином, и через 6 дней после обработки большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 3^–го возраста, и даже через 7 дней их развитие существенно задерживалось (фиг. 17). Эти данные указывают на то, что комбинация обработок рифампицином ухудшала развитие тлей.

Комбинированная обработка антибиотиками приводит к повышенной смертности тлей

Показатели выживаемости тлей также измеряли во время экспериментов, когда тлей обрабатывали с помощью комбинации обработок рифампицином. Тли, обработанные рифампицином, характеризовались немного более низкими показателями выживаемости, чем тли, обработанные контрольными растворами (фиг. 18). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством комбинации обработок, отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Комбинированная обработка антибиотиками снижала уровни Buchnera

Для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством комбинации способов, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 7 дней после обработки, и проводили qPCR, как описано в предыдущем примере, для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, обработанные контрольными растворами, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные рифампицином, характеризовались статистически значимым и существенным снижением числа копий Buchnera/тлей (p=0,227; фиг. 19), что указывало на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством комбинации способов, уменьшала присутствие эндосимбиотических Buchnera, и, как показано в предыдущих примерах, это приводило к снижению приспособленности.

В совокупности эти данные, описанные в предыдущих примерах, демонстрируют способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, способность к размножению, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки антибиотиком с помощью нескольких способов доставки.

Пример 12. Тли, обработанные природным противомикробным полисахаридом

Данный пример демонстрирует обработку тлей хитозаном, природным катионным линейным полисахаридом, состоящим из звеньев деацетилированного бета–1,4–D–глюкозамина, который является производным хитина. Хитин представляет собой структурный элемент экзоскелета насекомых, ракообразных (главным образом креветок и крабов) и клеточных стенок грибов, а также вторым наиболее распространенным полисахаридом после целлюлозы. Данный пример демонстрирует, что влияние хитозана на тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к хитозану. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera aphidicola.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими непосредственный вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Раствор хитозана составляли для использования в комбинации заливания в листья и доставки через растения (фиг. 20). Контрольный раствор инъецировали в листья с использованием воды+синего пищевого красителя и воды в пробирке. Раствор для обработки с 300 мкг/мл хитозана в воде (низкомолекулярного) вводили путем инъекции в листья (с синим пищевым красителем) и через растение (в пробирке Eppendorf).

Заливание в листья и доставка через растения – схема эксперимента

Тлей LSR–1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) раствор для обработки, содержащий 300 мкг/мл хитозана в воде (низкомолекулярного). Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Исходный раствор хитозана (Sigma, № по каталогу 448869–50G) готовили в концентрации 1% в уксусной кислоте, стерилизовали автоклавированием и хранили при 4°C. Для обработки (см. раздел Схема терапии) подходящее количество исходного раствора разбавляли водой с получением конечной концентрации хитозана для обработки. Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, лист на котором также был залит растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 50–51 тлю. Системы вскармливания заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1^–го, 2^–го, 3^–го, 4^–го, 5^–го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5^–го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 8 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке природным противомикробным полисахаридом

Тлей A. pisum LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только отрицательным контролем, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5^–го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 21). Развитие задерживалось у тлей, обработанных раствором хитозана, а через 6 дней после обработки хитозаном большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 4^–го возраста. Эти данные указывают на то, что обработка хитозаном задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей.

Обработка хитозаном повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Большинство тлей, обработанных только контролем, были живыми через 3 дня после обработки (фиг. 22). Через 4 дня тли начинали постепенно погибать, а некоторые выживали по истечении 7 дней после обработки.

В отличие от этого, тли, обработанные раствором хитозана, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, обработанные контролем. Эти данные указывают на то, что имело место снижение выживаемости при обработке природным противомикробным полисахаридом.

Обработка хитозаном снижала количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка раствором хитозана к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 8 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только контролем, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные 300 мкг/мл хитозана в воде, имели в ~5 раз меньше копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 23), что указывало на то, что обработка хитозаном снижала уровни Buchnera.

В совокупности эти данные, описанные ранее, демонстрировали способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки природным противомикробным полисахаридом.

Пример 13. Тли, обработанные низином, природным противомикробным пептидом

Данный пример демонстрирует обработку тлей природным полициклическим антибактериальным пептидом "широкого спектра действия", продуцируемым бактерией Lactococcus lactis, который широко используется в качестве пищевого консерванта. Антибактериальная активность низина опосредована его способностью создавать поры в клеточной мембране бактерий и прерывать биосинтез бактериальной клеточной стенки путем специфического взаимодействия с липидом II. Данный пример демонстрирует, что отрицательное влияние низина на приспособленность тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к низину. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera aphidicola.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими непосредственный вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Низин составляли для использования в комбинации заливания в листья и доставки через растения. Контрольный раствор (воду) или раствор для обработки (низин) инъецировали в лист и помещали в пробирку Eppendorf. Растворы для обработки состояли из 1,6 или 7 мг/мл низина в воде.

Заливание в листья и доставка через растения – схема эксперимента

Тлей Acyrthosiphon pisum LSR–1 выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) обработка низином в концентрации 1,6 или 7 мг/мл низина в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Для обработки (см. раздел Схема терапии) раствор низина (Sigma, № продукта: N5764) готовили в концентрации 1,6 или 7 мг/мл (вес./об.) в воде и стерилизовали фильтрацией с помощью шприцевого фильтра с размером пор 0,22 мкм. Затем раствор инъецировали в лист растения, и черешок растения помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл. Отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 56–59 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1–го, 2–го, 3–го, 4–го, 5–го возраста и 5R (размножающиеся личинки тлей 5–го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 8 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место дозозависимая отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке низином

Тлей A. pisum LSR–1 на стадии личинок 1–го и 2–го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные раствором отрицательного контроля (водой), начинали достигать зрелости (стадии личинок 5–го возраста) примерно через 6 дней и способности к размножению (стадии 5R) через 7 дней (фиг. 24). Развитие значительно задерживалось у тлей, обработанных 7 мг/мл низина. Тли, обработанные 7 мг/мл низина, развивались только до стадии личинок 2–го возраста через 3 дня, а через 6 дней все тли в группе погибали (фиг. 24). Развитие немного задерживалось у тлей, обработанных более низкой концентрацией низина (1,6 мг/мл), и в каждый оцениваемый момент времени было больше менее развитых тлей по сравнению с контрольными особями, обработанными водой (фиг. 24). Эти данные указывают на то, что обработка низином задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей, и эта задержка в развитии зависела от дозы вводимого низина.

В то же время важно отметить, что обработка с помощью 7 мг/мл низина также оказывала отрицательное влияние на состояние листьев, используемых в анализе. Вскоре после заливания в лист 7 мг/мл низина он начинал буреть. Через два дня листья, залитые 7 мг/мл, чернели. Значимого различия в состоянии у листьев, обработанных 1,6 мг/мл низина, не наблюдалось.

Обработка низином приводила к повышенной смертности тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Примерно 50% тлей, обработанных только контролем, выживали после 8–дневного эксперимента (фиг. 25). В отличие от этого, выживаемость была значимо меньшей для тлей, обработанных 7 мг/мл низина (p<0,0001, согласно логарифмическому ранговому критерию Кокса–Мантеля), и все тли в этой группе погибали вследствие обработки через 6 дней (фиг. 25). Тли, обработанные более низкой дозой низина (1,6 мг/мл), имели более высокую смертность по сравнению с тлями, обработанными контролем, несмотря на то, что различие не достигало статистической значимости (p=0,0501, согласно логарифмическому ранговому критерию Кокса–Мантеля). Эти данные указывают на то, что имело место дозозависимое снижение выживаемости при обработке низином.

Обработка низином приводила к снижению количества Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка низином к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 8 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только контролем, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные 1,6 мг/мл низина, имели в ~1,4 раза меньше копий ДНК Buchnera/тлей через 8 дней после обработки (фиг. 26). В группе, обработанной 7 мг/мл низина, не оставалось живых тлей, и, таким образом, в этой группе не оценивали число копий ДНК Buchnera/тлей. Эти данные указывают на то, что обработка низином снижала уровни Buchnera.

В совокупности эти данные, описанные ранее, демонстрируют способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки противомикробным пептидом низином.

Пример 14. У тлей, обработанных левулиновой кислотой, снижается приспособленность насекомых

Данный пример демонстрирует, что обработка тлей левулиновой кислотой, кетокислотой, продуцируемой в результате нагревания углевода, содержащего гексозу (например, древесины, крахмала, пшеницы, соломы или тростникового сахара), с добавлением разбавленной минеральной кислоты, снижает приспособленность насекомых. Левулиновую кислоту ранее исследовали в качестве противомикробного средства против Escherichia coli и Salmonella при производстве мяса (Carpenter et al., 2010, Meat Science; Savannah G. Hawkins, 2014, University of Tennessee Honors Thesis). Данный пример демонстрирует, что влияние левулиновой кислоты на тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к левулиновой кислоте. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera aphidicola.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими непосредственный вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Левулиновую кислоту составляли для использования в комбинации заливания в листья и доставки через растения. Контрольный раствор инъецировали в листья с использованием воды, и воду помещали в пробирку Eppendorf. Растворы для обработки, содержащие 0,03 или 0,3% левулиновой кислоты в воде, вводили посредством инъекции в листья и через растение (в пробирке Eppendorf).

Заливание в листья и доставка через растения – схема эксперимента

Тлей Acyrthosiphon pisum eNASCO выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) раствор для обработки, содержащий 0,03 или 0,3% левулиновую кислоту в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Для обработки (см. раздел Схема терапии) левулиновую кислоту (Sigma, № продукта: W262706) разбавляли до 0,03 или 0,3% в воде. Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, лист на котором также был залит растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 57–59 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1^–го, 2^–го, 3^–го, 4^–го и 5^–го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 7 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место дозозависимая отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке левулиновой кислотой

Тлей A. pisum eNASCO на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только отрицательным контролем, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5^–го возраста) примерно через 7 дней (фиг. 27). Развитие задерживалось у тлей, обработанных левулиновой кислотой, а через 11 дней после обработки практически все тли, обработанные контролем, достигали зрелого возраста, тогда как ~23 и 63% тлей, обработанных 0,03 и 0,3% левулиновой кислотой соответственно, не дозревали дальше чем до стадии личинок 4^–го возраста. Эти данные указывают на то, что обработка левулиновой кислотой задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей, и эта задержка в развитии зависела от дозы вводимой левулиновой кислоты.

Обработка левулиновой кислотой приводит к повышенной смертности тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Примерно 50% тлей, обработанных только контролем, выживали после 11–дневного эксперимента (фиг. 28). В отличие от этого, выживаемость была значимо меньшей у тлей, обработанных 0,3% левулиновой кислотой (p<0,01). Тли, обработанные низкой дозой левулиновой кислоты (0,03%), имели более высокую смертность по сравнению с тлями, обработанными контролем, несмотря на то, что различие не достигало статистической значимости. Эти данные указывают на то, что имело место дозозависимое снижение выживаемости при обработке левулиновой кислотой.

Обработка левулиновой кислотой приводит к снижению количества Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка левулиновой кислотой к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 7 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только контролем, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные 0,03 или 0,3% левулиновой кислотой в воде, имели в ~6 раз меньше копий ДНК Buchnera/тлей через 7 дней после обработки (фиг. 29, левая панель). Эти данные указывают на то, что обработка левулиновой кислотой снижала уровни Buchnera.

В совокупности эти данные, описанные ранее, демонстрировали способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки левулиновой кислотой.

Пример 15. Тли, обработанные раствором вторичного метаболита растительного происхождения

Данный пример демонстрирует обработку тлей госсиполуксусной кислотой, природным фенолом, получаемым из хлопчатника (род Gossypium), который проникает в клетку и выступает в качестве ингибитора для нескольких ферментов дегидрогеназ. Данный пример демонстрирует, что влияние госсипола на тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к госсиполу. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera aphidicola.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими непосредственный вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии. Раствор госсипола составляли в зависимости от способа доставки.

1) Через растения: с 0 (отрицательный контроль) или 0,5%, 0,25% и 0,05% госсиполом, составленным в искусственном рационе (согласно Akey and Beck, 1971; см. раздел Схема эксперимента) без незаменимых аминокислот (гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, треонина, триптофана и валина).

2) Микроинъекция: растворы для инъекций представляли собой 0,5% госсипол или только искусственный рацион (отрицательный контроль).

Доставка через растения – схема эксперимента

Тлей (линии eNASCO (в которых содержатся как первичные, так и вторичные симбионты Buchnera и Serratia соответственно) или LSR–1 (в которых содержатся только Buchnera), Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 4 различные группы обработки: 1) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот, 2) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 0,05% госсипол, 3) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 0,25% госсипол и 4) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 0,5% госсипол. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Используемый искусственный рацион готовили, как описано ранее (Akey and Beck, 1971 Continuous Rearing of the Pea Aphid, Acyrthosiphon pisum, on a Holidic Diet), с незаменимыми аминокислотами и без них (2 мг/мл гистидина, 2 мг/мл изолейцина, 2 мг/мл лейцина, 2 мг/мл лизина, 1 мг/мл метионина, 1,62 мг/мл фенилаланина, 2 мг/мл треонина, 1 мг/мл триптофана и 2 мг/мл валина), за исключением того, что ни в одном случае рацион не включал гомосерин или бета–аланилтирозин. Значение pH рационов доводили до 7,5 с помощью KOH, и рационы стерилизовали фильтрацией с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C в течение короткого срока (<7 дней) или при –80°C в течение длительного срока.

Исходный раствор госсиполуксусной кислоты (Sigma, № по кат. G4382–250MG) готовили в концентрации 5% в метаноле и стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Для обработок (см. раздел Схема терапии) подходящее количество исходного раствора добавляли к искусственному рациону с получением различных конечных концентраций госсипола. Рацион затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком и листом конских бобов, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 15–87 тлей. Системы вскармливания искусственным рационом заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри, в которой содержалась система вскармливания искусственным рационом, в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1^–го, 2^–го, 3^–го, 4^–го, 5^–го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5^–го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента. При достижении тлями стадии личинок 4^–го возраста им предоставляли их собственные искусственные системы вскармливания в глубокой чашке Петри для того, чтобы можно было контролировать плодовитость, как только они достигали зрелого возраста.

В случае взрослых тлей новых нимф считали ежедневно и затем исключали. В конце экспериментов плодовитость измеряли двумя способами: 1) средний день, в который был определен первый потомок в группе обработки, и 2) среднее число потомков, образуемых ежедневно после достижения тлей зрелого возраста. Снимки тлей получали на протяжении всего эксперимента для оценивания различий в размерах между группами обработки.

Через 5 или 13 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место дозозависимая отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке аллелохимикатом госсиполом

Тлей A. pisum eNASCO и LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста разделяли на четыре отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только искусственным рационом, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5^–го возраста) примерно через 3 дня (фиг. 30A). Развитие задерживалось у тлей, обработанных госсиполом, и через 5 дней после обработки с помощью 0,5% госсипола большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 3^–го возраста, и их размер также подвергался отрицательному влиянию (фиг. 30A и 30B). Эти данные указывают на то, что обработка госсиполом задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей, и эта реакция была дозозависимой.

Обработка госсиполом повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Большинство тлей, обработанных только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, были живыми через 2 дня после обработки (фиг. 31). Через 4 дня тли начинали постепенно погибать, а некоторые выживали по истечении 7 дней после обработки.

В отличие от этого, тли, обработанные 0,25 (отсутствие значимых различий по сравнению с контролем, p=0,2794) и 0,5% госсиполом, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, обработанные только искусственным рационом, при этом при обработке 0,5% госсиполом наблюдались значимые различия по сравнению с контролем AD без EAA (p=0,002). Тли, обработанные 0,5% госсиполом, начинали погибать через 2 дня после обработки, и все тли погибали вследствие обработки через 4 дня. Тли, обработанные 0,25%, выживали немного дольше, чем тли, обработанные 0,5%, однако также подвергались существенному отрицательному влиянию. Эти данные указывают на то, что имело место дозозависимое снижение выживаемости при обработке аллелохимикатом госсиполом.

Обработка госсиполом снижала интенсивность размножения тлей

В ходе обработок также отслеживали плодовитость тлей. Через 7 и 8 дней после обработки большинство взрослых тлей, обработанных искусственным рационом без незаменимых аминокислот, начинали размножаться. Среднее число потомков, образуемых ежедневно после достижения зрелого возраста тлями, обработанными искусственным рационом без добавления незаменимых аминокислот, составляло примерно 5 (фиг. 32A и 32B).

В отличие от этого, тли, обработанные 0,25% госсиполом, демонстрировали снижение темпов достижения зрелого возраста и образования потомков. Эти данные указывают на то, что обработка госсиполом приводила к уменьшению интенсивности размножения тлей.

Обработка госсиполом снижала количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводили ли различные концентрации госсипола к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 5 или 13 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот (контролем), имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные 0,25 и 0,5% госсиполом, имели в ~4 раза меньше копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 33), что указывало на то, что обработка госсиполом снижала уровни Buchnera, и что это снижение было зависимым от концентрации.

Доставка путем микроинъекции – схема эксперимента

Микроинъекцию осуществляли с помощью автоматического нанолитрового инъектора NanoJet III с выдвижной иглой из боросиликатного стекла собственного изготовления (Drummond Scientific; № по кат. 3–000–203–G/XL). Тлей (линии LSR–1, A. pisum) выращивали на растениях конских бобов, как описано в предыдущем примере. В каждой группе обработки было примерно одно и то же число получивших инъекцию особей с каждого из растений коллекции. Нимфы тлей (на стадии личинок < 3^–го возраста) переносили с помощью малярной кисти в трубную систему, подсоединенную к вакууму, и им в брюшную часть груди вводили микроинъекцию 20 нл искусственного рациона без незаменимых аминокислот (отрицательный контроль) или 0,05% раствора госсипола в искусственном рационе без незаменимых аминокислот. После инъекции тлей помещали в глубокую чашку Петри с листом конских бобов, черешок которого находился в 2% агаре.

Обработка антибиотиками путем микроинъекции снижала количество Buchnera у тлей

Для исследования того, приводил ли госсипол, доставляемый посредством микроинъекции, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 4 дня после обработки, и проводили qPCR, как описано в предыдущем примере, для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, получившие микроинъекцию отрицательного контроля, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, нимфы и взрослые особи тлей, получившие микроинъекцию госсипола, характеризовались существенным снижением числа копий Buchnera/тлей (фиг. 34), что указывало на то, что обработка путем микроинъекции госсипола уменьшала присутствие эндосимбиотических Buchnera, и, как показано в предыдущих примерах, это приводило к снижению приспособленности.

В совокупности эти данные, описанные в предыдущих примерах, демонстрировали способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, способность к размножению, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки раствором вторичного метаболита растений с помощью нескольких способов доставки.

Пример 16. Тли, обработанные природным противомикробным соединением растительного происхождения транс–коричным альдегидом

Этот пример демонстрирует, что обработка тлей транс–коричным альдегидом, природным ароматическим альдегидом, который представляет собой основной компонент экстракта коры коричного дерева (Cinnamomum zeylanicum), приводит к снижению приспособленности. Было показано, что транс–коричный альдегид характеризуется противомикробной активностью в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных организмов, несмотря на то, что точный механизм осуществления его противомикробной активности остается неясным. Транс–коричный альдегид может разрушать клеточные мембраны бактерий и ингибировать специфические клеточные процессы или ферменты (Gill and Holley, 2004 Applied Environmental Microbiology). Данный пример демонстрирует, что влияние транс–коричного альдегида на тлей было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к транс–коричному альдегиду. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera aphidicola.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими непосредственный вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Транс–коричный альдегид разбавляли до 0,05%, 0,5% или 5% в воде и доставляли посредством заливания в листья (~1 мл инъецировали в листья) и через растения.

Схема эксперимента

Тлей (линии LSR–1 (в которых содержатся только Buchnera), Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на четыре различные группы обработки: 1) контроли, обработанные водой, 2) 0,05% транс–коричный альдегид в воде, 3) 0,5% транс–коричный альдегид в воде и 4) 5% транс–коричный альдегид в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Транс–коричный альдегид (Sigma, № по кат. C80687) разбавляли до соответствующей концентрации в воде (см. раздел Схема терапии), стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. В листья конских бобов инъецировали примерно 1 мл средства для обработки, и затем лист помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл, содержащую тот же самый раствор для обработки. Отверстие пробирки, в которую помещали черешок конских бобов, закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания для обработки затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 40–49 тлей. Системы вскармливания для обработки заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри, в которой содержалась система вскармливания для обработки, в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1^–го, 2^–го, 3^–го, 4^–го, 5^–го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5^–го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 3 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся живых тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место дозозависимая отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке природным противомикробным транс–коричным альдегидом

Тлей A. pisum LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста разделяли на четыре отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только водой, начинали достигать стадии личинок 3^–го возраста через 3 дня после обработки (фиг. 35). Развитие задерживалось у тлей, обработанных транс–коричным альдегидом, и через 3 дня после обработки каждой из трех концентраций транс–коричного альдегида ни одна из тлей не дозревала до стадии личинок более чем второго возраста (фиг. 35). Кроме того, все тли, обработанные наиболее высокой концентрацией транс–коричного альдегида (5%), оставались на стадии личинок 1^–го возраста на протяжении всего эксперимента. Эти данные указывают на то, что обработка транс–коричным альдегидом задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей, и эта реакция была дозозависимой.

Обработка транс–коричным альдегидом повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Примерно 75 процентов тлей, обработанных только водой, были живыми через 3 дня после обработки (фиг. 36). В отличие от этого, тли, обработанные 0,05%, 0,5% и 5% транс–коричным альдегидом, имели значимо более низкие (p<0,0001 в каждой группе обработки по сравнению с контролем, обработанным водой) показатели выживаемости, чем тли, обработанные только водой. Эти данные указывают на то, что имело место дозозависимое снижение выживаемости при обработке природным противомикробным транс–коричным альдегидом.

Обработка транс–коричным альдегидом снижала количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводили ли различные концентрации транс–коричного альдегида к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 3 дня после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только водой (контролем), имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. Аналогичным образом, тли, обработанные наиболее низкой концентрацией транс–коричного альдегида (0,5%), имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей.

В отличие от этого, тли, обработанные 0,5 и 5% транс–коричным альдегидом, имели в ~870 раз меньше копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 37), что указывало на то, что обработка транс–коричным альдегидом снижала уровни Buchnera, и что это снижение было зависимым от концентрации.

В совокупности эти данные, описанные в предыдущих примерах, демонстрируют способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, способность к размножению, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки раствором вторичного метаболита растений с помощью нескольких способов доставки.

Пример 17. Тли, обработанные противомикробными пептидами скорпиона

Этот пример демонстрирует обработку тлей несколькими противомикробными пептидами скорпиона (AMP), из которых несколько AMP были идентифицированы в транскриптоме ядовитой железы скорпиона Urodacus yaschenkoi (Luna–Ramirez et al., 2017, Toxins). AMP в типичном случае имеют суммарный положительный заряд и, таким образом, высокое сродство к мембранам бактерий. Данный пример демонстрирует, что влияние AMP на тлей было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые были восприимчивыми к пептидам AMP. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera aphidicola, облигатный симбионт тлей.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими непосредственный вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Раствор Uy192 составляли для использования в комбинации заливания в листья и доставки через растения. Контрольный раствор инъецировали в листья с использованием воды+синего пищевого красителя и воды в пробирке. Раствор для обработки состоял из 100 мкг/мл Uy192 в воде для инъекции в листья (с синим пищевым красителем) и доставки через растение (в пробирке Eppendorf).

Заливание в листья и доставка через растения – схема эксперимента

Тлей LSR–1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 20±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) раствор для обработки, содержащий 100 мкг/мл AMP в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Uy192 синтезировали в Bio–Synthesis с чистотой >75%. 1 мг лиофилизированного пептида разводили в 500 мкл 80% ацетонитрила, 20% воды и 0,1% TFA, 100 мкл (100 мкг) разделяли на аликвоты в 10 отдельных пробирок Eppendorf и оставляли высыхать. Для обработки (см. раздел Схема терапии) 1 мл воды добавляли к 100 мкг аликвоты пептида с получением конечной концентрации Uy192 (100 мкг/мл). Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, лист на котором также был залит растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 50 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1^–го, 2^–го, 3^–го, 4^–го, 5^–го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5^–го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 8 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке с помощью AMP скорпиона

Тлей A. pisum LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только отрицательным контролем, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5^–го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 38). Развитие задерживалось у тлей, обработанных с помощью Uy192, а через 8 дней после обработки тли не дозревали дальше чем до стадии личинок 4^–го возраста. Эти данные указывают на то, что обработка с помощью Uy192 задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей.

Обработка с помощью AMP скорпиона приводит к повышенной смертности тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Большинство тлей, обработанных только контролем, были живыми через 3 дня после обработки (фиг. 39). Через 4 дня тли начинали постепенно погибать, а некоторые выживали по истечении 7 дней после обработки.

В отличие от этого, тли, обработанные с помощью Uy192, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, обработанные контролем. Эти данные указывают на то, что имело место снижение выживаемости при обработке с помощью АМР скорпиона Uy192.

Обработка с помощью АМР скорпиона Uy192 приводит к снижению количества Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка с помощью Uy192 к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 8 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только контролем, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные с помощью 100 мкг/мл Uy192 в воде, имели в ~7 раз меньше копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 40), что указывало на то, что обработка с помощью Uy192 снижала уровни Buchnera.

В совокупности эти данные, описанные ранее, демонстрировали способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки природным противомикробным пептидом скорпиона.

Пример 18. Тли, обработанные противомикробными пептидами скорпиона

Этот пример демонстрирует обработку тлей несколькими противомикробными пептидами скорпиона (AMP) D10, D3, Uyct3 и Uy17 – AMP, которые недавно были идентифицированы в транскриптоме ядовитой железы скорпиона Urodacus yaschenkoi (Luna–Ramirez et al., 2017, Toxins). AMP в типичном случае имеют суммарный положительный заряд и, таким образом, высокое сродство к мембранам бактерий. Данный пример демонстрирует, что влияние AMP на тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к пептидам AMP. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera aphidicola, облигатный симбионт тлей.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими непосредственный вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Указанный пептид или коктейль пептидов (более подробно см. нижеприведенные разделы Микроинъекция тлям – схема эксперимента и Заливание в листья и доставка через растения – схема эксперимента) вводили путем прямой микроинъекции тлям или доставляли посредством комбинации заливания в листья и доставки через растения. В качестве отрицательного контроля тлям вводили путем микроинъекции воду (в экспериментах по микроинъекции), или их помещали на листья, в которые была произведена инъекция воды, и в воду в пробирке (для экспериментов по заливанию в листья и доставке через растение). Растворы для обработки состояли из 20 нл 5 мкг/мл D3 или D10, растворенных в воде (для микроинъекций тлям), или 40 мкг/мл коктейля из D10, Uy17, D3 и UyCt3 в воде для инъекции в листья и доставки через растение (в пробирке Eppendorf).

Микроинъекция тлям – схема эксперимента

Микроинъекцию осуществляли с помощью автоматического нанолитрового инъектора NanoJet III с выдвижной иглой из боросиликатного стекла собственного изготовления (Drummond Scientific; № по кат. 3–000–203–G/XL). Тлей (линии LSR–1, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. В каждой группе обработки было примерно одно и то же число получивших инъекцию особей с каждого из растений коллекции. Взрослым тлям вводили микроинъекцию 20 нл воды или 100 нг (20 мкл 5 мкг/мл раствора) пептида D3 или D10 в брюшную часть груди. Скорость микроинъекции составляла 5 нл/сек. После инъекции тлей помещали в глубокую чашку Петри, содержащую лист конских бобов, черешок которого находился в 2% агаре.

Пептиды синтезировали в Bio–Synthesis с чистотой >75%. 1 мг лиофилизированного пептида разводили в 500 мкл 80% ацетонитрила, 20% воды и 0,1% TFA, 100 мкл (100 мкг) разделяли на аликвоты в 10 отдельных пробирок Eppendorf и оставляли высыхать.

Через 5 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Микроинъекция тлям пептидов скорпиона D3 и D10 приводит к снижению выживаемости насекомых

Тлей A. pisum LSR–1 на стадии личинок 1^–го и 2^–го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли показатель выживаемости. Через 5 дней после обработки тли, которым инъецировали пептиды скорпиона, имели более низкие показатели выживаемости по сравнению с контрольными особями, которым инъецировали воду (9, 35 и 45% выживаемость в случае инъекции D3, D10 и воды соответственно) (фиг. 41). Эти данные указывают на то, что имело место снижение выживаемости при обработке с помощью АМР скорпиона D3 и D10.

Микроинъекция тлям пептидов скорпиона D3 и D10 приводит к снижению количества эндосимбионтов Buchnera

В частности, для исследования того, приводила ли инъекция AMP скорпиона D3 и D10 к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 5 дней после инъекции, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, которым инъецировали только воду, имели высокие соотношения количества ДНК Buchnera/тлей (47,4), тогда как тли, которым инъецировали D3 и D10, имели более низкие соотношения количества ДНК Buchnera/тлей (25,3 и 30,9 соответственно) (фиг. 42). Эти данные указывают на то, что обработка пептидами скорпиона D3 и D10 приводила к снижению уровней бактерий–симбионтов Buchnera.

Заливание в листья и доставка через растения – схема эксперимента

Тлей Acyrthosiphon pisum eNASCO (в которых содержатся Buchnera и Serratia) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds), как описано выше. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) раствор для обработки, состоящий из 40 мкг/мл каждого из D10, Uy17, D3 и UyCt3 в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Пептиды синтезировали, растворяли и разделяли на аликвоты, как описано выше. Для обработки (см. раздел Схема терапии) воду добавляли к 100 мкг аликвоты пептида с получением необходимой конечной концентрации (40 мкг/мл). Четыре пептида объединяли с получением раствора коктейля пептидов. Этот раствор применяли для заливания в листья путем инъекции. После инъекции черешки листьев, в которые была произведена инъекция, помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл, которую затем запечатывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 41–49 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Обработка коктейлем пептидов скорпиона приводит к повышенной смертности тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Через 6 дней после обработки тли, обработанные коктейлем пептидов, имели более низкие показатели выживаемости по сравнению с тлями, обработанными водой, а через 9 дней эффект был более очевидным (16 и 29% выживаемость в случае обработки коктейлем пептидов и водой соответственно) (фиг. 43). Эти данные указывают на то, что имело место снижение выживаемости при обработке коктейлем AMP скорпиона, и, как показано в предыдущих примерах, эти AMP снижали уровни эндосимбионтов у тлей.

В совокупности эти данные, описанные ранее, демонстрировали способность уничтожать тлей и уменьшать их продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки отдельным природным противомикробным пептидом скорпиона или коктейлем пептидов.

Пример 19. Тли, обработанные противомикробным пептидом, слитым с пептидом, проникающим в клетку

Данный пример демонстрирует обработку тлей противомикробным пептидом скорпиона (AMP) (Uy192), слитым с пептидом, проникающим в клетку, полученным из вируса. AMP Uy192 представляет собой один из нескольких недавно идентифицированных AMP в транскриптоме ядовитой железы скорпиона Urodacus yaschenkoi (Luna–Ramirez et al., 2017, Toxins). AMP в типичном случае имеют суммарный положительный заряд и, таким образом, высокое сродство к мембранам бактерий. Для усиления доставки пептида скорпиона Uy192 в клетки тлей пептид синтезировали слитым с частью белка–трансактиватора транскрипции (TAT) вируса иммунодефицита человека I (HIV–1). Предыдущие исследования показали, что конъюгирование этого белка, проникающего в клетку (CPP), с другими молекулами увеличивало их поглощение клетками путем трансдукции (Zhou et al., 2015 Journal of Insect Science and Cermenati et al., 2011 Journal of Insect Physiology). Данный пример демонстрирует, что влияние слитого пептида на тлей было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые были восприимчивыми к противомикробному пептиду. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими непосредственный вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Пептид скорпиона, конъюгированный с пептидом, проникающим в клетку, и флуоресцентно меченный с помощью 6FAM (Uy192+CPP+FAM), составляли для использования в комбинации заливания в листья и доставки через растения. Контрольный раствор (воду) или раствор для обработки (Uy192+CPP+FAM) инъецировали в лист и помещали в пробирку Eppendorf. Раствор для обработки содержал 100 мкг/мл Uy192+CPP+FAM в воде.

Заливание в листья и доставка через растения – схема эксперимента

Тлей Acyrthosiphon pisum LSR–1 выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) обработка с помощью Uy192+CPP+FAM со 100 мкг/мл Uy192+CPP+FAM в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Для обработки (см. раздел Схема терапии) Uy192+CPP+FAM (аминокислотная последовательность: YGRKKRRQRRRFLSTIWNGIKGLL–FAM) синтезировали в Bio–Synthesis с чистотой >75%. 5 мг лиофилизированного пептида разводили в 1 мл 80% ацетонитрила, 20% воды и 0,1% TFA, 50 мкл (100 мкг) разделяли на аликвоты в отдельные пробирки Eppendorf и оставляли высыхать. Для обработки (см. раздел Схема терапии) 1 мл стерильной воды добавляли к 100 мкг аликвоты пептида с получением конечной концентрации Uy192+CPP+FAM (100 мкг/мл). Затем раствор инъецировали в лист растения, и черешок растения помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл. Отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения. Эпифлуоресцентная визуализация листа подтверждала, что листья содержали пептид с зеленой флуоресцентной меткой в своей сосудистой системе.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 30 тлей в трех повторностях. Системы вскармливания заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения. Помимо этого, стадию развития (личинки 1–го, 2–го, 3–го, 4–го, 5–го возраста и 5R (размножающиеся личинки тлей 5–го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 5 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Обработка пептидом скорпиона Uy192, слитым с пептидом, проникающим в клетку, задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей

Тлей A. pisum LSR–1 на стадии личинок 1–го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Развитие как тлей, обработанных водой, так и тлей, обработанных пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, было аналогичным в дни 0 и 1 (фиг. 44). Однако в день 2 тли, обработанные контролем, развивались до стадии личинок второго или третьего возраста, в то время как некоторые тли, обработанные пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, оставались на стадии личинок первого возраста (фиг. 44). Даже через 3 дня после обработки некоторые тли, обработанные пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, оставались на стадии личинок первого возраста (фиг. 44). Через 7 дней после обработки большинство тлей, обработанных водой, развивались до стадии личинок 5–го возраста или стадии размножающихся личинок 5–го возраста. В отличие от этого, только 50 процентов тлей, обработанных пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, развивались до стадии личинок 5–го возраста, тогда как ~42 и ~8 процентов тлей оставались на стадии личинок 3–го или 4–го возраста соответственно (фиг. 44). Эти данные указывают на то, что обработка пептидом скорпиона Uy192, слитым с пептидом, проникающим в клетку, задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей.

Обработка пептидом скорпиона Uy192, слитым с пептидом, проникающим в клетку, приводила к повышенной смертности тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Примерно 40% тлей, обработанных только контролем, выживали после 7–дневного эксперимента (фиг. 45). В отличие от этого, выживаемость была значимо меньшей у тлей, обработанных с помощью 100 мг/мл Uy192+CPP+FAM (p=0,0036, согласно логарифмическому ранговому критерию Кокса–Мантеля), при этом только 16% тлей доживали до дня 7 (фиг. 45). Эти данные указывают на то, что имело место снижение выживаемости при обработке пептидом скорпиона Uy192, слитым с пептидом, проникающим в клетку.

Обработка пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, приводила к снижению соотношений количества ДНК Buchnera/тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка с помощью Uy192+CPP+FAM к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе через 5 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только водой, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей (~134). В отличие от этого, тли, обработанные пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, имели в ~1,8 раза меньше копий ДНК Buchnera/тлей через 5 дней после обработки (фиг. 46). Эти данные указывают на то, что обработка пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, снижала уровни эндосимбионтов.

Пептид скорпиона, слитый с пептидом, проникающим в клетку, свободно проникал в бактериоциты с оказанием противодействия Buchnera

Для исследования того, способствовал ли непосредственно пептид, проникающий в клетку, доставке пептида скорпиона в бактериоциты, выделенные бактериоциты подвергали прямому воздействию слитого белка и визуализировали. Бактериоциты извлекали из тлей в среде Шнайдера с добавлением 1% вес./об. BSA (среде Шнайдера с BSA) и помещали в лунку для визуализации, содержащую 20 мкл среды Шнайдера. 100 мкг аликвоты лиофилизированного пептида скорпиона ресуспендировали в 100 мкл среды Шнайдера с получением 1 мг/мл раствора, и 5 мкл этого раствора примешивали в лунку, содержащую бактериоциты. Спустя 30 минут инкубирования при комнатной температуре бактериоциты тщательно промывали для удаления любого избытка свободного пептида в растворе. Изображения бактериоцитов получали до и после инкубирования (фиг. 47). Слитый пептид проникал через мембраны бактериоцита и был непосредственно доступен для Buchnera.

В совокупности эти данные демонстрируют способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки противомикробным пептидом скорпиона Uy192, слитым с пептидом, проникающим в клетку.

Пример 20. Тли, обработанные аналогами витаминов

Данный пример демонстрирует обработку тлей провитамином пантотенолом, который представляет собой спиртовой аналог пантотеновой кислоты (витамин B5). Тли имеют облигатных бактерий–эндосимбионтов Buchnera, которые способствуют образованию ими незаменимых аминокислот и витаминов, в том числе витамина B5. Предыдущее исследование показало, что пантотенол ингибирует рост Plasmodium falciparum путем ингибирования специфических киназ паразита (Saliba et al., 2005). Была выдвинута гипотеза, что обработка тлей пантотенолом была бы пагубной для симбиоза бактерия–насекомое, отрицательно влияя таким образом на приспособленность тлей. Данный пример демонстрирует, что обработка пантотенолом снижает приспособленность тлей.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими непосредственный вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Растворы пантотенола составляли в зависимости от способа доставки.

1) В искусственном рационе через растения: с 0 (отрицательный контроль) или 10 или 100 мкМ пантотенола, составленного в искусственном рационе (согласно Akey and Beck, 1971; см. раздел Схема эксперимента) без незаменимых аминокислот (2 мг/мл гистидина, 2 мг/мл изолейцина, 2 мг/мл лейцина, 2 мг/мл лизина, 1 мг/мл метионина, 1,62 мг/мл фенилаланина, 2 мг/мл треонина, 1 мг/мл триптофана и 2 мг/мл валина).

2) Покрытие листьев: 100 мкл 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно–активного растворителя Silwet L–77 в воде (отрицательный контроль) или 100 мкл 50 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя, применяли непосредственно в отношении поверхности листьев и оставляли высыхать.

Доставка через растения – схема эксперимента

Тлей (eNASCO, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 3 различные группы обработки: 1) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот, 2) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 10 мкМ пантотенола и 3) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 100 мкМ пантотенола. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Используемый искусственный рацион готовили, как описано ранее (Akey and Beck, 1971 Continuous Rearing of the Pea Aphid, Acyrthosiphon pisum, on a Holidic Diet), с незаменимыми аминокислотами и без них (2 мг/мл гистидина, 2 мг/мл изолейцина, 2 мг/мл лейцина, 2 мг/мл лизина, 1 мг/мл метионина, 1,62 мг/мл фенилаланина, 2 мг/мл треонина, 1 мг/мл триптофана и 2 мг/мл валина), за исключением того, что ни в одном случае рацион не включал гомосерин или бета–аланилтирозин. Значение pH рационов доводили до 7,5 с помощью KOH, и рационы стерилизовали фильтрацией с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C в течение короткого срока (<7 дней) или при –80°C в течение длительного срока.

Растворы пантотенола (Sigma, № по кат. 295787) готовили в концентрации 10 мкМ и 100 мкМ в искусственном рационе без незаменимых аминокислот, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при –20°C. Для обработок (см. раздел Схема терапии) подходящее количество исходного раствора добавляли к искусственному рациону без незаменимых аминокислот с получением конечной концентрации 10 или 100 мкМ пантотенола. Рацион затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком и листом конских бобов, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания искусственным рационом затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 16–20 тлей. Системы вскармливания искусственным рационом заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри, в которой содержалась система вскармливания искусственным рационом, в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1–го, 2–го, 3–го, 4–го, 5–го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента. При достижении тлями стадии личинок 4–го возраста им предоставляли их собственные искусственные системы вскармливания в глубокой чашке Петри для того, чтобы можно было контролировать плодовитость, как только они достигали зрелого возраста.

В случае взрослых тлей новых нимф считали ежедневно и затем исключали. В конце экспериментов плодовитость определяли в виде среднего числа потомков, образуемых ежедневно после достижения тлей зрелого возраста. Снимки тлей получали на протяжении всего эксперимента для оценивания различий в размерах между группами обработки.

Через 8 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Обработка аналогами витаминов задерживает развитие тлей

Тлей eNASCO на стадии личинок 1–го и 2–го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Доставка через растения – схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5–го возраста) примерно через 5 дней (фиг. 48A). Развитие задерживалось у тлей, обработанных пантотенолом, особенно во второй и третий дни после обработки (фиг. 48A), что указывало на то, что обработка пантотенолом ухудшает развитие тлей. В конечном счете большинство тлей из каждой группы обработки достигали зрелого возраста и начинали размножаться. Помимо отслеживания динамики стадий развития тлей, тлей также визуализировали, и определяли площадь тела тлей. Все тли имели одинаковый размер через 1 день после обработки, однако через 3 дня после обработки тли, обработанные пантотенолом, имели меньшую площадь тела, чем необработанные контрольные особи. Кроме того, тли, обработанные пантотенолом, имели намного меньший прирост размера тела (определенный, исходя из площади тела) в течение эксперимента по сравнению с тлями, обработанными только искусственным рационом без незаменимых аминокислот (фиг. 48B).

Обработка аналогами витаминов повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Тли, выкармливаемые только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, имели более высокие показатели выживаемости по сравнению с тлями, обработанными 10 или 100 мкM пантотенола (фиг. 49), что указывало на то, что обработка пантотенолом отрицательно влияла на приспособленность тлей.

Обработка пантотенолом снижает плодовитость тлей

В ходе обработок также отслеживали плодовитость тлей. Определяли долю тлей, доживших до зрелого возраста и появления способности к размножению. Примерно одна четверть тлей, обработанных искусственным рационом без незаменимых аминокислот, доживала до достижения зрелого возраста через 8 дней после обработки (фиг. 50A). В отличие от этого, только немного более 1/10 тлей, обработанных 10 или 100 мкМ пантотенола, доживали до достижения зрелого возраста и размножались через 8 дней после обработки. Также измеряли средний день, на который тли в каждой группе обработки начинали размножаться, и для всех групп обработки средним днем, на который тли начинали размножаться, был 7–й день (фиг. 50B). Кроме того, также отслеживали среднее число потомков, образуемых за день зрелыми размножающимися тлями. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, образовывали примерно 7 потомков/день. В отличие от этого, тли, обработанные 10 и 100 мкМ пантотенола, образовывали только соответственно примерно 4 и 5 потомков/день, как показано на фиг. 50C. В совокупности эти данные указывают на то, что обработка пантотенолом приводила к утрате способности к размножению у тлей.

Обработка пантотенолом не влияет отрицательно на количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка пантотенолом к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 8 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей, как и тли, обработанные каждой из двух концентраций пантотенола (фиг. 51). Эти данные указывают на то, что обработка пантотенолом непосредственно не влияла отрицательно на число копий ДНК Buchnera/тлей.

Доставка путем покрытия листьев – схема эксперимента

Порошок пантотенола добавляли к 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно–активного растворителя Silwet L–77 с получением конечной концентрации 10 мкМ пантотенола. Средство обработки стерилизовали фильтрацией с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4 градусах C. Тлей (линии eNASCO, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов, как описано в предыдущем примере. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (только раствор растворителя) и 2) 10 мкM пантотенола в растворителе. 100 мкл раствора поглощалось кусочком листа конских бобов размером 2×2 см.

Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Для каждой обработки на каждый лист помещали 20 тлей. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли в случае их обнаружения. Помимо этого, стадию развития (личинки 1–го, 2–го, 3–го, 4–го, 5–го возраста и 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5–го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Обработка пантотенолом, доставляемым посредством покрытия листьев, не влияет отрицательно на развитие тлей

Тлей eNASCO на стадии личинок 1–го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента, что описано в данном документе. Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, помещенные на покрытые листья, обработанные контрольным раствором или раствором пантотенола, созревали при аналогичных скоростях в течение двух дней после обработки (фиг. 52). Эти данные указывают на то, что покрытие листьев пантотенолом не влияло отрицательно на развитие тлей.

Обработка пантотенолом, доставляемым посредством покрытия листьев, повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок путем покрытия листьев. Тли, помещенные на листья, покрытые пантотенолом, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, помещенные на листья, покрытые контрольным раствором (фиг. 53). Эти данные указывают на то, что обработка пантотенолом, доставляемым посредством покрытия листьев, значимо (p=0,0019) отрицательно влияла на выживаемость тлей. Все тли погибали в данном эксперименте, и никаких оставшихся тлей не оставалось для экстрагирования из них ДНК и определения соотношения количества ДНК Buchnera/тлей.

В совокупности эти данные, описанные в предыдущих примерах, демонстрируют способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, способность к размножению, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки пантотенолом с помощью нескольких путей доставки.

Пример 21. Тли, обработанные коктейлем ингибиторов переносчиков аминокислот

Данный пример демонстрирует обработку тлей коктейлем аналогов аминокислот. Целью данной обработки было ингибирование захвата глутамина бактериоцитами с помощью переносчика глутамина ApGLNT1. Ранее было показано, что аргинин ингибирует захват глутамина с помощью переносчика глутамина (Price et al., 2014 PNAS), и была выдвинута гипотеза, что обработка аналогами аргинина или другими аналогами аминокислот также будет ингибировать захват незаменимых аминокислот бактериоцитами тлей. Данный пример демонстрирует, что снижение приспособленности при обработке было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые были восприимчивыми к аналогам аминокислот. Одним штаммом бактерий–мишеней является Buchnera.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими непосредственный вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Коктейль аминокислот составляли для доставки посредством заливания в листья и через растение. Этот способ доставки заключался в инъекции в листья примерно 1 мл коктейля аминокислот в воде (см. ниже перечень компонентов коктейля) или 1 мл раствора отрицательного контроля, содержащего только воду.

Заливание в листья и доставка через растения – схема эксперимента

Тлей LSR–1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой) и 2) обработка коктейлем аминокислот. Коктейль аминокислот содержал каждое из следующих средств в указанных конечных концентрациях: 330 мкM L–NNA (N–нитро–L–аргинина; Sigma), 0,1 мг/мл L–канаванина (Sigma), 0,5 мг/мл D–аргинина (Sigma), 0,5 мг/мл D–фенилаланина (Sigma), 0,5 мг/мл D–гистидина (Sigma), 0,5 мг/мл D–триптофана (Sigma), 0,5 мг/мл D–треонина (Sigma), 0,5 мг/мл D–валина (Sigma), 0,5 мг/мл D–метионина (Sigma), 0,5 мг/мл D–лейцина и 6 мкM L–NMMA (цитрата) (Cayman Chemical). В лист конских бобов заливали ~1 мл раствора для обработки путем инъекции, и черешок растения помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл, содержащую раствор для обработки. Отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения. Для каждой обработки в общей сложности 56–58 тлей помещали на каждый лист (каждая обработка состояла из двух повторностей по 28–31 тле). Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Системы вскармливания заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения. Стадию развития тлей (стадию личинок 1–го, 2–го, 3–го, 4–го и 5–го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента, и микроскопические изображения тлей получали в день 5 с целью выполнения измерений площади тела тлей.

Исходные растворы L–NNA готовили в концентрации 5 мM в воде, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при –20°C. Исходные растворы L–канаванина готовили в концентрации 100 мг/мл в воде, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы D–аргинина и D–треонина готовили в концентрации 50 мг/мл в воде, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы D–валина и D–метионина готовили в концентрации 25 мг/мл в воде, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы D–лейцина готовили в концентрации 12 мг/мл в воде, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы D–фенилаланина и D–гистидина готовили в концентрации 50 мг/мл в 1M HCl, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы D–триптофана готовили в концентрации 50 мг/мл в 0,5M HCl, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы L–NMMA готовили в концентрации 6 мг/мл в стерильном PBS, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при –20°C. Для обработок (см. раздел Схема терапии) соответствующее количество исходного раствора добавляли к воде с получением конечной концентрации средства в коктейле, как указано выше.

Через 6 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Обработка коктейлем аналогов аминокислот задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей

Тлей LSR–1 на стадии личинок 1–го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Заливание в листья и доставка через растения – схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные водой, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5–го возраста) в день 5 после обработки (фиг. 54A). Через 6 дней после обработки ~20 процентов тлей, обработанных водой, достигали стадии личинок 5–го возраста. В отличие от этого, менее чем 3 процента тлей, обработанных коктейлем аминокислот, достигали стадии личинок 5–го возраста даже через 6 дней (фиг. 54A). Эта задержка в развитии при обработке коктейлем аминокислот была дополнительно представлена на примере путем измерений размера тлей, выполненных через 5 дней после обработки. Тли, обработанные только водой, имели площадь тела примерно 0,45 мм2, тогда как тли, обработанные коктейлем аминокислот, имели площадь тела примерно 0,33 мм2 (фиг. 54B). Эти данные указывают на то, что обработка коктейлем аминокислот задерживала развитие тлей, отрицательно влияя на приспособленность тлей.

Обработка коктейлем аналогов аминокислот приводила к снижению количества Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка коктейлем аналогов аминокислот к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 6 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, помещенные на контрольный раствор, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, помещенные на коктейль AA для обработки, характеризовались существенным снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 55), что указывало на то, что обработка коктейлем аналогов AA устраняла эндосимбиотические Buchnera.

В совокупности эти данные демонстрируют способность уменьшать интенсивность развития и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, у тлей посредством их обработки коктейлем аналогов аминокислот.

Пример 22. Тли, обработанные комбинацией средств (антибиотиком, пептидом и природным противомикробным средством)

Данный пример демонстрирует обработку тлей комбинацией из трех противомикробных средств – антибиотика (рифампицина), пептида (пептида скорпиона Uy192) и природного противомикробного средства (низкомолекулярного хитозана). В других примерах каждое из этих средств, введенное отдельно, приводило к уменьшению приспособленности тлей и снижению уровней эндосимбионтов. Данный пример демонстрирует, что посредством доставки комбинации средств обработки приспособленность тлей и уровни эндосимбионтов снижались так же, как и при обработке каждым отдельным средством в отдельности, или в лучшей степени.

Тли представляют собой насекомых, являющихся сельскохозяйственными вредителями, причиняющими непосредственный вред растению в результате кормления и выступающими в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по–прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Комбинацию средств обработки составляли для доставки посредством заливания в листья и через растение. Этот способ доставки заключался в инъекции в листья примерно 1 мл комбинации средств обработки в воде (с конечными концентрациями 100 мкг/мл рифампицина, 100 мкг/мл Uy192 и 300 мкг/мл хитозана) или 1 мл раствора отрицательного контроля, содержащего только воду.

Заливание в листья и доставка через растения – схема эксперимента

Тлей LSR–1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5–10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5–7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой) и 2) обработка комбинацией из 100 мкг/мл рифампицина, 100 мкг/мл Uy192 и 300 мкг/мл хитозана. В лист конских бобов заливали ~1 мл раствора для обработки путем инъекции, и черешок растения помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл, содержащую раствор для обработки. Отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему для обработки затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения. Для каждой обработки в общей сложности 56 тлей помещали на каждый лист (каждая обработка состояла из двух повторностей по 28 тлей). Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Системы вскармливания заменяли каждые 2–3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения. Стадию развития тлей (стадию личинок 1^–го, 2^–го, 3^–го, 4^–го и 5^–го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента, и микроскопические изображения тлей получали в день 5 с целью выполнения измерений площади тела тлей.

Исходный раствор рифампицина (Tokyo Chemical Industry, LTD) готовили в концентрации 25 мг/мл в метаноле, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при –20°C. Для обработки подходящее количество исходного раствора добавляли к воде с получением конечной концентрации 100 мкг/мл рифампицина. Uy192 синтезировали в Bio–Synthesis с чистотой >75%. 1 мг лиофилизированного пептида разбавляли в 500 мкл 80% ацетонитрила, 20% воды и 0,1% TFA. 100 мкл (100 мкг) разделяли на аликвоты в 10 отдельных пробирок Eppendorf и оставляли высыхать. Для обработки 1 мл воды добавляли к 100 мкг аликвоты пептида с получением конечной концентрации 100 мкг/мл Uy192. Исходный раствор хитозана (Sigma, № по кат. 448869–50G) готовили в концентрации 1% в уксусной кислоте, стерилизовали автоклавированием и хранили при 4°C. Для обработок подходящее количество исходного раствора добавляли к воде с получением конечной концентрации хитозана 300 мкг/мл.

Через 6 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Обработка комбинацией из трех противомикробных средств задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей

Тлей LSR–1 на стадии личинок 1^–го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Заливание в листья и доставка через растения – схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные водой, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5^–го возраста) в день 5 после обработки (фиг. 56A). Через 6 дней после обработки ~20 процентов тлей, обработанных водой, достигали стадии личинок 5^–го возраста. В отличие от этого, тли, обработанные комбинацией из трех средств, не достигали стадии личинок 5^–го возраста даже через 6 дней (фиг. 56A). Эта задержка в развитии при комбинированной обработке была дополнительно представлена на примере путем измерений размера тлей, выполненных через 5 дней после обработки. Тли, обработанные только водой, имели площадь тела примерно 0,45 мм², тогда как тли, обработанные комбинацией из 3 средств, имели площадь тела примерно 0,26 мм² (фиг. 56B). Эти данные указывают на то, что обработка комбинацией средств задерживала развитие тлей, отрицательно влияя на приспособленность тлей.

Обработка комбинацией из трех противомикробных средств повышала смертность тлей

Выживаемость также отслеживали ежедневно после обработки. Через 2 дня после обработки примерно 75 процентов тлей, обработанных водой, были живыми, тогда как только 62 процента тлей, обработанных комбинацией средств, были живыми. Эта тенденция к большему количеству тлей, переживших обработку, в контрольной группе (обработанных водой) сохранялась в течение всего эксперимента. Через 6 дней после обработки выживали 64 процента контрольных (обработанных водой) тлей, тогда как среди тлей, обработанных комбинацией рифампицина, Uy192 и хитозана, выживали 58 процентов (фиг. 57). Эти данные указывают на то, что комбинация средств обработки отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Обработка комбинацией из трех средств приводила к снижению количества Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка комбинацией пептида, антибиотика и природного противомикробного средства к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 6 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только водой, имели соотношения количества ДНК Buchnera/тлей, составляющие примерно 2,3 (фиг. 58). В отличие от этого, тли, обработанные комбинацией пептида, антибиотика и природного противомикробного средства, имели примерно в 2 раза более низкие соотношения количества ДНК Buchnera/тлей (фиг. 58). Эти данные указывают на то, что комбинированная обработка снижала уровни эндосимбионтов, что приводило к снижению приспособленности тлей.

В совокупности эти данные демонстрируют способность уменьшать интенсивность развития и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, у тлей посредством их обработки комбинацией пептида, антибиотика и природного противомикробного средства.

Пример 23. Долгоносики, обработанные раствором антибиотика

Данный пример демонстрирует влияние обработки долгоносиков ципрофлоксацином, бактерицидным антибиотиком, который ингибирует активность ДНК–гиразы и топоизомеразы, двух ферментов, необходимых для репликации ДНК. Данный пример демонстрирует, что фенотипическое влияние ципрофлоксацина на долгоносиков опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к долгоносикам, которые являются восприимчивыми к ципрофлоксацину. Одним штаммом бактерий–мишеней является первичный эндосимбионт Sitophilus (SPE, Candidatus Sodalis pierantonius).

Род Sitophilus включает три вида долгоносиков, известных как амбарные вредители (Sitophilus zemais, кукурузный долгоносик; Sitophilus oryzae, рисовый долгоносик; и Sitophilus granarius, зерновой слоник). Во всех трех этих видах долгоносиков содержится внутриклеточный симбионт SPE, который обеспечивает долгоносика питательными веществами, такими как витамины и аминокислоты, и улучшает его митохондриальный энергетический метаболизм. Амбарных вредителей контролируют главным образом с помощью синтетических инсектицидов, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема эксперимента

Кукурузных долгоносиков Sitophilus (Sitophilus zeamais) выкармливали на органической кукурузе при 27,5°C и 70% относительной влажности. Перед использованием для выкармливания долгоносиков кукурузу замораживали в течение 7 дней и затем доводили до 10% влажности стерильной водой. Спаривающиеся пары взрослых самцов и самок разделяли на 3 различные группы обработки для экспериментов, которые выполняли в трех повторностях: 1) контроль c водой, 2) 250 мкг/мл ципрофлоксацина и 3) 2,5 мг/мл ципрофлоксацина. Исходные растворы ципрофлоксацина (Sigma) готовили в концентрации 25 мг/мл в 0,1 н. HCl, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при –20°C. Для обработок подходящее количество исходного раствора разбавляли в стерильной воде.

Долгоносиков подвергали трем последовательным обработкам.

1. Первая обработка включала в себя замачивание 25 г кукурузы с каждым из средств для трех групп обработки, приведенных выше: 1) контроль c водой, 2) 250 мкг/мл ципрофлоксацина и 3) 2,5 мг/мл ципрофлоксацина. Вкратце, 25 г кукурузы помещали в коническую пробирку на 50 мл, и каждое из средств обработки добавляли до полного заполнения пробирки. Пробирку помещали на шейкер на 1,5 часа, после чего кукурузу удаляли и помещали в глубокую чашку Петри и сушили на воздухе. Спаривающиеся пары самцов и самок затем добавляли в каждую группу обработки и оставляли вскармливаться в течение 4 дней.

2. Через 4 дня спаривающиеся пары удаляли и подвергали второй обработке, помещая их на 25 г новой кукурузы, обработанной 1) контролем c водой, 2) 250 мкг/мл ципрофлоксацина и 3) 2,5 мг/мл ципрофлоксацина. Спаривающиеся пары вскармливались и откладывали яйца на этой кукурузе в течение 7 дней. Кукурузу после второй обработки оценивали в отношении появления потомства (см. раздел Оценка потомства ниже)

3. Спаривающиеся пары подвергали заключительной обработке, которая включала комбинацию из погружения их в средство обработки (1) контроль c водой, 2) 250 мкг/мл ципрофлоксацина и 3) 2,5 мг/мл ципрофлоксацина на 5 секунд и затем помещения их в пузырек с 10 зернами кукурузы, которые были покрыты 1 мл 1) контроля c водой, 2) 250 мкг/мл ципрофлоксацина и 3) 2,5 мг/мл ципрофлоксацина.

Выживаемость долгоносиков отслеживали ежедневно в течение 18 дней, после чего ДНК экстрагировали из оставшихся долгоносиков в каждой группе. Вкратце, тело долгоносиков подвергали поверхностной стерилизации путем погружения долгоносика в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем долгоносиков промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждого отдельного долгоносика с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК SPE и долгоносиков измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для SPE, были qPCR_Sod_F (ATAGCTGTCCAGACGCTTCG; SEQ ID NO: 238) и qPCR_Sod_R (ATGTCGTCGAGGCGATTACC; SEQ ID NO: 239). Праймерами, используемыми для долгоносиков (β–актин), были SACT144_FOR (GGTGTTGGCGTACAAGTCCT; SEQ ID NO: 240) и SACT314_REV (GAATTGCCTGATGGACAGGT; SEQ ID NO: 241) (Login et al., 2011). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR–амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 57°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2–3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Оценка потомства

Через 25 дней одну повторность зерен кукурузы после второй обработки взрослых спаривающихся пар вскрывали (см. раздел Схема эксперимента, выше) для проверки наличия любых из развивающихся личинок, куколок или взрослых долгоносиков. Большая часть развития долгоносиков Sitophilus происходит в зерновых культурах/рисе/кукурузе, и взрослые особи появляются из зерен после того, как их развитие завершается. Зерна кукурузы осторожно вскрывали скальпелем, и любых развивающихся долгоносиков собирали и определяли процент взрослых особей, куколок и личинок. Долгоносиков, полученных в результате вскрытия, затем подвергали поверхностной стерилизации, и уровни SPE определяли с помощью qPCR. Зерна кукурузы из оставшихся двух повторностей каждой из групп после второй обработки не вскрывали, но проверяли ежедневно в отношении появления взрослых долгоносиков.

Оценка проникновения антибиотика в кукурузу

25 мг зерен кукурузы помещали в коническую пробирку на 50 мл, и воду или 2,5 мг/мл или 0,25 мг/мл ципрофлоксацина в воде добавляли до заполнения пробирки. Зерна замачивали в течение 1,5 часов, как описано выше. После замачивания зерна высушивали на воздухе и анализировали для определения того, был ли способен антибиотик покрывать зерно и проникать в него. Для исследования этого концентрированный образец DH5α Escherichia coli в воде распределяли по 5 чашкам с бульоном Лурия (LB). В отношении каждой чашки было выполнено следующее: 1) добавляли зерно кукурузы, замоченное в воде, 2) добавляли целое зерно кукурузы, которое было замочено в 2,5 или 0,25 мг/мл ципрофлоксацина, и 3) добавляли половинку зерна кукурузы, которое было замочено в 2,5 или 0,25 мг/мл ципрофлоксацина, и помещали вглубь чашки. Чашки инкубировали в течение ночи при 37 градусах C, и на следующий день оценивали рост бактерий и/или зону(зоны) ингибирования.

Замачивание зерен кукурузы в антибиотиках позволяло антибиотикам покрывать поверхность и проникать в зерна кукурузы

Для исследования того, мог ли ципрофлоксацин покрывать поверхность зерна кукурузы, зерна кукурузы замачивали в воде без антибиотиков или в воде с 2,5 или 0,25 мг/мл ципрофлоксацина (как описано выше). Затем концентрированную культуру E. coli распределяли по чашкам с LB, и одно из покрытых зерен затем помещали в центр чашки. Чашки инкубировали в течение ночи, а на следующий день оценивали рост бактерий.

Газон из бактерий рос на всей чашке с зерном кукурузы, которое было покрыто водой без каких–либо антибиотиков (фиг. 59A). В отличие от этого, бактерии не росли на чашках с целыми зернами кукурузы, которые были замочены в ципрофлоксацине в любой из двух концентраций (фиг. 59B, левые панели). Эти данные показывают, что способ покрытия, используемый в этих экспериментах, способствовал успешному покрытию ципрофлоксацином поверхности зерен кукурузы и ингибированию роста бактерий.

Для исследования того, мог ли ципрофлоксацин проникать в зерно кукурузы, зерна кукурузы, замоченные в 2,5 или 0,25 мг/мл ципрофлоксацина, разрезали пополам и помещали разрезанной стороной вниз на чашку с LB с концентрированной культурой E. coli. Чашки инкубировали в течение ночи, и на следующий день оценивали рост бактерий. Рост бактерий отсутствовал в чашках с зернами, замоченными антибиотиком в любой концентрации, что указывало на то, что ципрофлоксацин проникал в зерно кукурузы (фиг. 59B, правые панели). В совокупности эти данные указывают на то, что способ замачивания зерен кукурузы, применяемый в этих экспериментах, приводил к успешному покрытию зерен кукурузы антибиотиком и его проникновению в них.

Обработка антибиотиками снижает уровни SPE в поколении F0

Спаривающиеся пары S. zeamais разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Долгоносиков отслеживали ежедневно, и все долгоносики оставались живыми в течение эксперимента. Через 18 дней после обработки долгоносиков подвергали поверхностной стерилизации, геномную ДНК экстрагировали, и уровни SPE измеряли с помощью qPCR. Долгоносики, обработанные только водой, имели примерно в 4 и 8 раз большие количества SPE по сравнению с долгоносиками, обработанными соответственно 250 мкг/мл и 2,5 мг/мл ципрофлоксацина (фиг. 60). Эти данные указывают на то, что обработка долгоносиков ципрофлоксацином приводила к снижению уровней SPE.

Обработка антибиотиками задерживает развитие и снижает уровни SPE у долгоносиков поколения F1

Развитие долгоносиков поколения F1 оценивали при вскрытии зерен кукурузы, в которые спаривающиеся пары F0 откладывали яйца в течение 7 дней и которых затем удаляли. Через 25 дней 12 потомков обнаруживали в кукурузе, обработанной водой/контролем, при этом большинство (~67%) потомства находилось в форме куколок (фиг. 61A). 13 и 20 потомков обнаружили у долгоносиков, обработанных соответственно 250 мкг/мл и 2,5 мг/мл ципрофлоксацина. Интересно отметить, что долгоносики, обработанные антибиотиком, демонстрировали задержку развития по сравнению с долгоносиками, обработанными контролем, при этом большинство (38 и 65% в случае 250 мкг/мл и 2,5 мг/мл ципрофлоксацина соответственно) потомков находилось в форме личинок (фиг. 61A).

Геномную ДНК экстрагировали из долгоносиков, извлеченных из зерен кукурузы, и qPCR проводили для измерения уровней SPE. Долгоносики F1, обработанные водой, имели примерно в 4 раза более высокие уровни SPE по сравнению с долгоносиками, обработанными 2,5 мг/мл ципрофлоксацина (фиг. 61B). Эти данные указывают на то, что обработка ципрофлоксацином снижала уровни SPE у долгоносиков, что приводило к задержке развития.

Обработка антибиотиками снижала интенсивность размножения долгоносиков

Число долгоносиков, которые появлялись в течение 43 дней после того, как исходные спаривающиеся пары удаляли после второй обработки, использовали в качестве показателя плодовитости (фиг. 62A и 62B). Появление первых долгоносиков происходило в день 29, и подсчитывали общее количество долгоносиков, которые появлялись до дня 43. Несмотря на то, что долгоносики, обработанные водой и 250 мкг/мл, имели аналогичное число потомков F1, в группе обработки 2,5 мг/мл появлялось намного меньшее число потомков, что указывало на то, что обработка антибиотиками снижала уровни SPE, отрицательно влияя на плодовитость долгоносиков.

Вместе с предыдущими примерами эти данные демонстрируют способность уничтожать долгоносиков и уменьшать их интенсивность развития, способность к размножению, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки антибиотиком с помощью нескольких путей доставки.

Пример 24. Микроскопические клещи, обработанные раствором антибиотика

Данный пример демонстрирует способность уничтожать, снижать приспособленность двупятнистых паутинных клещиков посредством их обработки рифампицином, антибиотиком узкого спектра действия, который ингибирует ДНК–зависимый синтез РНК путем ингибирования бактериальной РНК–полимеразы, и доксициклином, антибиотиком широкого спектра действия, который предупреждает размножение бактерий путем ингибирования синтеза белка. Влияние рифампицина и доксициклина на микроскопических клещей было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к микроскопическим клещам, которые были восприимчивыми к антибиотикам.

Насекомые, такие как комары, и паукообразные, такие как иксодовые клещи, могут выступать в роли переносчиков патогенов, вызывающих серьезные заболевания у человека и животных, такие как болезнь Лайма, лихорадка денге, трипаносомоз и малярия. Заболевания, передаваемые переносчиками, вызывают миллионы человеческих смертей ежегодно. Кроме того, заболевания, передаваемые переносчиками, которые инфицируют животных, таких как домашний скот, представляют большую нагрузку для системы здравоохранения во всем мире. Таким образом, имеется потребность в способах и композициях для контроля насекомых и паукообразных, которые переносят заболевания, передаваемые переносчиками. Двупятнистые паутинные клещики являются паукообразными из того же подкласса, что и иксодовые клещи. Таким образом, способы и композиции, применяемые для снижения приспособленности двупятнистых паутинных клещиков, могут давать углубленное понимание снижения приспособленности иксодовых клещей.

Схема терапии

Для этих экспериментов использовали две обработки: 1) 0,025% Silwet L–77 (отрицательный контроль) или 2) коктейль антибиотиков, содержащий 250 мкг/мл рифампицина и 500 мкг/мл доксициклина. Исходные растворы рифампицина (Tokyo Chemical Industry, LTD) готовили в концентрации 25 мг/мл в метаноле, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при –20°C. Исходные растворы доксициклина (от производителя) готовили в концентрации 50 мг/мл в воде, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при –20°C.

Схема эксперимента

В этом анализе исследовали влияние раствора антибиотика на двупятнистых паутинных клещиков и определяли, как их приспособленность изменялась в результате целенаправленного воздействия на эндогенные микроорганизмы.

Растения фасоли Кидни выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Микроскопических клещей выкармливали на растениях фасоли Кидни при 26°C и относительной влажности 15–20%. Для обработок листовые диски диаметром один дюйм нарезали из листьев конских бобов и опрыскивали 0,025% Silwet L–77 (отрицательный контроль) или коктейлем антибиотиков (250 мкг/мл рифампицина и 500 мкг/мл доксициклина в 0,025% Silwet L–77) с использованием распылительного воздушного компрессора Master Airbrush Brand Compressor модели C–16–B Black Mini. Компрессор очищали этанолом до обработок, после них и между ними. Жидкость подавали в компрессор с помощью трубки диаметром четверть дюйма. Для каждой обработки использовали новую трубку.

После того, как листовые диски высыхали, четыре из каждой группы обработки помещали в чашку сверху влажного ватного шарика, покрытого кусочком салфетки Kimwipe. Каждое условие обработки выполняли в двух повторностях. Затем 25 взрослых самок микроскопических клещей помещали в чашку. В день 4 самок удаляли из чашки, а яйца и личинки оставляли на листовых дисках.

В день 11 микроскопических клещей на стадии протонимфы и дейтонимфы извлекали из чашек и помещали в их собственную пробирку для того, чтобы можно было измерять выживаемость. Каждая пробирка содержала влажный ватный шарик, покрытый кусочком салфетки Kimwipe, с листовым диском диаметром полдюйма, обработанным отрицательным контролем или коктейлем.

Микроскопических клещей наблюдали под препаровальной лупой ежедневно после вскармливания на листе, обработанном растворами антибиотиков или контрольными растворами, и классифицировали в соответствии со следующими категориями:

Живые: они передвигались на своих конечностях или двигались после того, как в них тыкали малярной кистью.

Мертвые: неподвижные и не реагировали на стимуляцию малярной кистью.

Стерильную малярную кисть использовали для стимуляции микроскопических клещей путем прикасания к их конечностям. Микроскопических клещей, классифицированных как мертвых, сохраняли на протяжении всего анализа и повторно проверяли на подвижность ежедневно. Анализы проводили при 26°C и относительной влажности 1520%.

Обработка антибиотиками повышала смертность микроскопических клещей

Показатели выживаемости двупятнистых паутинных клещиков, обработанных коктейлем антибиотиков, сравнивали с микроскопическими клещами, обработанными отрицательным контролем. Показатели выживаемости микроскопических клещей, обработанных коктейлем, снижались по сравнению с контролем (фиг. 60).

Эти данные демонстрируют способность снижать приспособленность микроскопических клещей посредством их обработки раствором антибиотиков.

Пример 25. Насекомые, обработанные раствором очищенных фагов

Данный пример демонстрирует выделение и очистку из образцов окружающей среды фагов, которые целенаправленно воздействовали на специфические бактерии насекомых. Данный пример также демонстрирует эффективность выделенных фагов в отношении бактерий–мишеней в анализах бляшкообразования in vitro, измеренную по их скорости потребления кислорода и скорости закисления внеклеточной среды. Наконец, данный пример демонстрирует эффективность фагов in vivo, измеренную по способности фага целенаправленно воздействовать на бактерии мух посредством их обработки выделенным фагом, противодействующим бактериям. Данный пример демонстрирует, что патогенная бактерия, которая снижала приспособленность насекомого, могла быть устранена с помощью фага, целенаправленно воздействующего на бактерию. В частности, Serratia marcescens, которая представляет собой патогенную бактерию мух, может быть устранена с помощью фага, который был выделен из садового компоста.

Схема эксперимента

Выделение специфических бактериофагов из природных источников

Бактериофаги, противодействующие бактериям–мишеням, выделяли из исходного материала среды. Вкратце, насыщенную культуру Serratia marcescens разбавляли в свежем триптическом соевом бульоне двойной концентрации (TSB) и выращивали в течение ~120 минут до ранней лог–фазы при 24–26°C или в бульоне Лурия–Бертани двойной концентрации (LB) и выращивали в течение ~90 минут при 37°C. Садовый компост готовили путем гомогенизации в PBS и стерилизовали путем фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Неочищенные сточные воды стерилизовали путем фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Один объем фильтрованного исходного материала добавляли к культурам бактерий в лог–фазе, и инкубирование продолжали в течение 24 ч. Обогащенный исходный материал готовили путем осаждения культур центрифугированием и фильтрования надосадочной жидкости через мембраны с размером пор 0,45 мкм.

Фаги выделяли путем высевания образцов на бактериальные газоны в двойном слое агара. Стационарные культуры бактерий объединяли с LB или TSB c расплавленным 0,6% агаром и наливали в чашки c LB или TSB с 1,5% агаром. После затвердения 2,5 мкл разведенных образцов фагов наносили на чашки с двойным слоем агара и оставляли для поглощения. Затем чашки заворачивали в обертку и инкубировали в течение ночи при 25°C (TSA) или 37°C (LB), после этого оценивали в отношении образования видимых бляшек. Свежевыделенные бляшки очищали посредством последовательного пассирования отдельных бляшек на штамме–мишени путем отбора бляшек в буфере SM (50 мM Tris–HCl [pH 7,4], 10 мM MgSO4, 100 мM NaCl) и инкубирования в течение 15 минут при 55°C, затем повторения способа нанесения на двойной слой агара, как указано выше, с использованием суспензии бляшек.

Бактериофаги успешно выделяли как из сточных вод, так и из компоста, как подробно описано выше. Образование бляшек было отчетливо заметно после нанесения образцов на газоны из бактерий S. marcescens, используемые для обогащений.

Пассирование, количественная оценка и размножение бактериофагов

Размножение и образование фаговых лизатов для применения в последующих экспериментах осуществляли с помощью бактериофагов, выделенных и очищенных, как описано выше. Вкратце, насыщенные культуры бактерий разбавляли в 100 раз в свежей среде и выращивали в течение 60–120 минут для достижения состояния ранней логарифмической фазы роста с целью эффективного инфицирования фагами. Суспензии фагов или фаговые лизаты добавляли к культурам в ранней логарифмической фазе роста, и инкубирование продолжали до тех пор, пока не наблюдали очищение бульона, что указывало на размножение фагов и лизис бактерий, или до прохождения 24 ч. после инфицирования. Лизаты собирали путем осаждения клеток центрифугированием при 7197 x g в течение 20 мин. с последующим фильтрованием надосадочной жидкости через мембраны с размером пор 0,45 или 0,2 мкм. Отфильтрованные лизаты хранили при 4°C.

Подсчет инфекционных фаговых частиц осуществляли с помощью способа нанесения на двойной слой агара. Вкратце, в PBS выполняли серийное разведение образцов 1:10, и разведения наносили на чашки с затвердевшим двойным слоем агара, полученными с бактериями хозяина, как описано выше. Бляшкообразующие единицы (БОЕ) подсчитывали после инкубирования в течение ночи с определением примерного титра образцов.

Анализ выделенных фагов in vitro путем измерения дыхания бактерий

Анализатор Seahorse XFe96 (Agilent) использовали для измерения влияния фагов на бактерии путем отслеживания скорости потребления кислорода (OCR) и скорости закисления внеклеточной среды (ECAR) в ходе инфицирования. Планшеты XFe96 покрывали за день до экспериментов с помощью 15 мкл 1 мг/мл исходного раствора поли–L–лизина на лунку и высушивали в течение ночи при 28°C, и зонды XFe96 уравновешивали путем помещения в лунки, содержащие 200 мкл калибрующего вещества XF, и инкубирования в темноте при комнатной температуре. На следующий день планшеты, покрытые поли–L–лизином, промывали дважды с помощью ddH2O. Насыщенные ночные культуры E. coli BL21 (LB, 37°C) или S. marcescens (TSB, 25°C) субкультивировали при 1:100 в той же самой среде и выращивали при вентиляции в течение ~2,5 ч. при 30°C. Затем культуры разбавляли до O.D. 600 нм ~ 0,02 с помощью той же самой среды. Средства обработки получали путем разведения исходных растворов в буфере SM при 10x конечной концентрации и загрузки 20 мкл 10x растворов в подходящие отверстия для ввода проб планшета с зондами. Хотя зонды уравновешивали в анализаторе XFe96 Flux, планшеты с бактериями готовили путем добавления 90 мкл бактериальных суспензий или контролей со средой и центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 минут. После центрифугирования дополнительные 90 мкл соответствующей среды осторожно добавляли в лунки так, чтобы не нарушить прилипание бактерий, доводя общий объем до 180 мкл на лунку.

Анализатор XFe96 прогоняли при ~30°C в соответствии с циклами смешивания, ожидания, считывания продолжительностью 1:00, 0:30, 3:00. Выполняли четыре цикла, чтобы обеспечить уравновешивание/нормализацию бактерий, затем вводили 20 мкл средств обработки, и циклы продолжали, как описано выше, в течение общего времени примерно 6 ч. Данные анализировали с помощью пакета компьютерных программ Seahorse XFe96 Wave.

Влияние выделенных бактериофагов анализировали путем измерения скорости потребления кислорода (OCR) и скорости закисления внеклеточной среды (ECAR) у бактерий в анализаторе Seahorse XFe96. Когда E. coli инфицировали фагом T7, а S. marcescens инфицировали свежевыделенным фагом ΦSmVL–C1, наблюдались существенные снижения OCR после кратковременных пиков этой скорости (фиг. 64). Для обоих фагов с обоими организмами–хозяевами анализ Seahorse способствовал выявлению успешного инфицирования фагами без необходимости в анализах бляшкообразования. Таким образом, данный способ применим для выявления инфицирования фагами организма–хозяина, не поддающегося традиционным способам выявления фагов.

Анализ трансдукции с использованием SYBR Gold для идентификации инфекции

Препараты бактериофагов готовили для окрашивания путем предварительной обработки нуклеазами для удаления вневирусных нуклеиновых кислот, которые могли нарушать интерпретацию флуоресцентного сигнала. Вкратце, MgCl2 добавляли к 10 мл фагового лизата при конечной концентрации 10 мM, и как РНКазу A (Qiagen), так и ДНКазу I (Sigma) добавляли до конечных концентраций 10 мкг/мл. Образцы инкубировали в течение 1 ч. при комнатной температуре. После обработки нуклеазами 5 мл лизатов объединяли с 1 мкл SYBR Gold (Thermo, 10000x) и инкубировали при комнатной температуре в течение ~1,5 ч. Избыточный краситель затем удаляли из образцов с помощью ультрафильтрационных колонок Amicon. Вкратце, колонки Amicon (15 мл, MWCO 10 кДа) промывали путем добавления 10 мл буфера SM и центрифугировали при 5000 x g, 4°C в течение 5 минут. Меченые образцы фагов затем центрифугировали в колонках при 5000 x g, 4°C до тех пор, пока объем не снижался примерно в 10 раз (15–30 мин.). Для промывания образцов 5 мл буфера SM добавляли в каждый резервуар, и центрифугирование повторяли с последующими двумя дополнительными промывками. После третьей промывки оставшиеся образцы отбирали пипеткой из резервуаров Amicon и доводили до примерно 1 мл с помощью буфера SM. Для удаления более крупных контаминантов промытые и меченые образцы фагов центрифугировали при 10000 x g в течение 2 минут, и образцы надосадочной жидкости затем фильтровали через мембраны с размером пор 0,2 мкм в черные микропробирки и хранили при 4°C.

Насыщенные культуры бактерий (E. coli MG1655, выращенная в LB при 37°C, S. marcescens и S. symbiotica, выращенные в TSB при 26°C) получали путем центрифугирования 1 мл аликвот и однократного промывания с помощью 1 мл PBS перед заключительным ресуспендированием с помощью 1 мл PBS. Меченые положительным контролем бактерии окрашивали путем объединения 500 мкл промытых бактерий и 1 мкл SYBR Gold и инкубирования в течение 1 ч. в темноте при комнатной температуре. Бактерии осаждали путем центрифугирования при 8000 x g в течение 5 мин. и промывали дважды равным объемом PBS с последующим ресуспендированием в конечном объеме 500 мкл PBS. Объем 25 мкл окрашенных бактерий объединяли с 25 мкл буфера SM в черной микропробирке, к которой добавляли 50 мкл 10% формалина (5% конечный объем, ~2% формальдегид) и смешивали путем пощелкивания. Образцы фиксировали при комнатной температуре в течение ~3 ч. и затем промывали с помощью ультрафильтрационных колонок Amicon. Вкратце, 500 мкл воды РicoРure добавляли в колонки Amicon (0,5 мл, MWCO 100 кДа) и центрифугировали при 14000 x g в течение 5 мин. для промывания мембран. Фиксированные образцы разбавляли путем добавления 400 мкл PBS и затем переносили в предварительно промытые микроцентрифужные колонки и центрифугировали при 14000 x g в течение 10 мин. Колонки переносили в свежие пробирки для сбора образцов, и 500 мкл PBS добавляли для разбавления фиксатора, остающегося в ретентате. Затем проводили два дополнительных разбавления с помощью PBS, в общей сложности в количестве трех промывок. Конечные ретентаты разбавляли до около 100 мкл, затем колонки помещали вверх дном в свежие пробирки для сбора образцов и центрифугировали при 1000 x g в течение 2 мин. для сбора образцов. Промытые образцы переносили в черные микропробирки и хранили при 4°C.

Для экспериментов по трансдукции и контролей 25 мкл бактерий (или PBS) и 25 мкл меченого SYBR Gold фага (или буфера SM) объединяли в черных микропробирках и инкубировали в неподвижном состоянии в течение 15–20 мин. при комнатной температуре для обеспечения адсорбции фагов и впрыскивания в получающие их бактерии. Сразу после инкубирования 50 мкл 10% формалина добавляли к образцам, и фиксацию осуществляли при комнатной температуре в течение ~4 ч. Образцы промывали с помощью PBS с использованием колонок Amicon, как указано выше.

Для успешного инфицирования фагом бактериальной клетки–хозяина требовалось впрыскивание нуклеиновой кислоты бактериофагов. Колифаг P1kc, меченный SYBR Gold и инкубированный совместно с S. marcescens, выявил присутствие флуоресцирующих бактерий с помощью микроскопии, подтверждая применение данного анализа в процессе выделения фагов. Как и в случае анализа Seahorse, данный подход предусматривал альтернативу традиционным способам анализа фагов для обеспечения распространения на организмы, не поддающиеся анализу бляшкообразования. Кроме того, анализ трансдукции с использованием SYBR Gold не требовал роста бактерий, поэтому был применим для анализа фагов, целенаправленно воздействующих на сложные в культивировании или даже не поддающиеся культивированию организмы, в том числе эндосимбионты, такие как Buchnera.

Исследование эффективности фагов in vivo в отношении S. marcescens у мух Drosophila melanogaster

Культуры S. marcescens выращивали в триптическом соевом бульоне (TSB) при 30°C при постоянном встряхивании при 200 об./мин.

Среда, используемая для выкармливания исходных популяций мух, представляла собой среду, содержащую кукурузную муку, мелассу и дрожжи (11 г/л дрожжей, 54 г/л желтой кукурузной муки, 5 г/л агара, 66 мл/л мелассы и 4,8 мл/л пропионовой кислоты). Все компоненты этого рациона, за исключением пропионовой кислоты, нагревали совместно до 80°C в деионизированной воде при постоянном перемешивании в течение 30 минут, и им давали охладиться до 60°C. Затем примешивали пропионовую кислоту, и 50 мл рациона разделяли на аликвоты в отдельные флаконы и оставляли охлаждаться и затвердевать. Мух выращивали при 26°C, цикле свет:темнота 16:8 часов, при влажности около 60%.

Для инфицирования мух S. marcescens тонкую иглу (с кончиком шириной прибл