Питательная минеральная среда на основе арабиногалактана для культивирования микроорганизмов и способ культивирования штаммов микроорганизмов, синтезирующих фермент для гидролиза арабиногалактана
Изобретение относится к области биотехнологии. Питательная минеральная среда на основе арабиногалактана для культивирования микроорганизмов, включающая калия гидрофосфат, магния сульфат, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что дополнительно включает: нитрат натрия, кальция хлорид, железа сульфат, агар, арабиногалактан при следующем соотношении компонентов, мас.ч.: нитрат натрия - 1.9-2.1, калия гидрофосфат - 0.9-1.1, магния сульфат - 0.45-0.55, кальция хлорид - 0.45-0.55, железа сульфат - 0.009-0.011, агар - 14-16, дистиллированная вода - 995-1000, арабиногалактан - 14-16. Изобретение позволяет упростить процесс культивирования микроорганизмов. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.
Изобретение относится к составам питательных минеральных сред на основе арабиногалактана и способам культивирования штаммов микроорганизмов, синтезирующих фермент β-галактозидаза, для гидролиза арабиногалактана. [C12N 1/00, C12N 9/00, C12N 15/00].
Поиск дешёвых субстратов для культивирования микроорганизмов в настоящее время является актуальной проблемой биотехнологии. В качестве недорого источника углерода для промышленного культивирования может быть использован водорастворимый полисахарид - арабиногалактан, в настоящее время - это отход при производстве целлюлозы из древесины лиственницы (40% от общего объёма древесины в результате распиловки на предприятиях). Не все микроорганизмы могут самостоятельно расщеплять арабиногалактан до простых моносахаридов и использовать в дальнейшем в качестве источника углерода, поэтому было бы нецелесообразно использовать его в таком виде в питательной среде. Однако у некоторых микроорганизмов есть фермент β-галактозидаза, который способен быстро расщеплять сложные углеводы, и превращать их в простые сахара, хорошо усваиваемые всеми микроорганизмами. Использованию арабиногалактана, как основы питательной минеральной среды для культивирования микроорганизмов и реализации способа культивирования штаммов микроорганизмов, синтезирующих фермент для гидролиза арабиногалактана посвящено заявляемое техническое решение.
В изобретении ЕР №1283876 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ β-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ [опубл. 24.01.2007), в качестве продуцента использована Bifidobacteria bifidum. Из клетки продуцента извлекают ген, кодирующий синтез β-галактозидазы, и трансплантируют его в клетку Е. coli.
В другом изобретении ЕР2725098 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ β-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ [опубл. 30.04.2014] в качестве продуцента применяются дрожжи K. lactis. В патенте для увеличения выхода и активности фермента клетки продуцента подвергают трансформации, концентрируя в них ген, отвечающий за синтез β-галактозидазы.
Также известен СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ β-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОДНОГО ИЗ ШТАММОВ ВИДА ДРОЖЖЕЙ KLUYVEROMYCES FRAGILIS [CN 102851220, опубл 16.10.2013]. Процесс получения фермента проходит в следующей последовательности: подготовка питательной среды, в составе которой дрожжевой экстракт 10 г/л, пептоны 20 г/л, глюкоза 20 г/л, культивирование дрожжей при pH 6,5 и температуре 30°C с аэрацией в течение 30 часов, далее происходит выделение клеток Kluyveromyces fragilis центрифугированием. После выделения клеток из культуральной жидкости суспензию клеток подвергают гомогенизации с добавлением фосфатного буфера, гомогенизация происходит при 55 МРа, после чего полученный гомогенизат подвергают ультрафильтрации.
Известен СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕКРЕТИРУЕМОЙ β-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ [SG11202104572P, опубл. 29.06.2021], характеризующийся интеграцией несекретируемого гена β-галактозидазы, полученного из базидиальных дрожжей, в Aspergillus oryzae с получением секретируемой β-галактозидазы.
Также из уровня техники известна НОВАЯ БЕТА - ГАЛАКТОЗИДАЗА [US2019119662, опубл. 25.04.2019]. Один из аспектов настоящего изобретения направлен на обеспечение способа получения фермента β-галактозидазы. В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению осуществляют следующие стадии: стадия культивирования клеток Cryptococcus terrestris; и этап сбора фермента β-галактозидазы из культивируемой среды и/или клеток. Среду культивируют в аэробных условиях таким образом, чтобы pH среды был доведен до примерно 3 до 8 (предпочтительно от 4 до 7), а температура культивирования обычно составляет от 20°С до 40°С (предпочтительно от 25°С до 35°С) в течение от 1 до 10 дней (предпочтительно от 3 до 6 дней). Пример метода культивирования может включать метод культивирования при встряхивании и метод аэробного культивирования в погруженном состоянии с использованием кувшинного ферментера.
Наиболее близким по технической сущности является СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕТА -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ ЖИДКОСТНОЙ ФЕРМЕНТАЦИЕЙ BACILLUS COAGULANS [CN109182307, опубл. 11.09.2019]. Изобретение относится к области техники ферментации, в частности к способу получения бета-галактозидазы путем жидкой ферментации Bacillus coagulans. Используется Bacillus coagulans BR-171, с депозитным номером CGMCC №14413. Штамм способен стабильно и эффективно продуцировать бета-галактозидазу. Выход составляет более 4000 ед/мл после погруженной ферментации в ферментере на 50 л и периодической ферментации с подпиткой в течение 84 часов. Бета-галактозидаза, продуцируемая штаммом, имеет оптимальное значение рН 5,0 и активность более 80% в диапазоне рН бета-галактозидазы 2,5-8,5. Толерантность галактозидазы к pH подходит для большинства молочных продуктов. Состав среды для посевной культуры (в процентах по массе): лактоза 3%, дрожжевой порошок 0,8%, мальтодекстрин 15%, пептон 0,5%, кукурузный экстракт 0,5%, гидрофосфат калия 1,5%, сульфат магния 0,1%. часть дополняют водой очищенной, рН 7,5, и стерилизуют при 121-123°С в течение 35 мин.
Основной технической проблемой аналогов и прототипа является высокая сложность культивирования микроорганизмов, продуцирующих фермент бета-галактозидазу. Приведенные выше решения аналогов и прототипа отличает технологическая и аппаратная сложность, а именно: использование сложных питательных сред (в том числе использование в качестве индуктора лактозы и галоктозы), наличие больших затрат на культивирование и извлечение необходимого фермента. Все вышеперечисленное приводит к увеличению стоимости готового продукта.
Задачей изобретения является устранение недостатков прототипа.
Техническим результатом изобретения является упрощение процесса культивирования микроорганизмов, продуцирующих фермент, бета-галактозидазу.
Указанный технический результат достигается за счет того, что питательная минеральная среда на основе арабиногалактана для культивирования микроорганизмов, включающая калия гидрофосфат, магния сульфат, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что дополнительно включает: нитрат натрия, кальция хлорид, железа сульфат, агар, арабиногалактан при следующем соотношении компонентов, мас. ч.:
| нитрат натрия | 1.9-2.1 |
| калия гидрофосфат | 0.9-1.1 |
| магния сульфат | 0.45-0.55 |
| кальция хлорид | 0.45-0.55 |
| железа сульфат | 0.009-0.011 |
| агар | 14-16 |
| дистиллированная вода | 995-1000 |
| арабиногалактан | 14-16 |
Способ культивирования штаммов микроорганизмов, синтезирующих фермент для гидролиза арабиногалактана, характеризующийся тем, что первоначально берут необходимый для культивирования штамм в лаборатории чистых культур, далее, производят поверхностное культивирование выбранного штамма на твёрдой питательной минеральной среде на основе арабиногалактана, с длительностью культивирования 3 суток при температуре 37°С для бактериальных штаммов, и 7 суток при температуре от 26 до 30°С для грибковых штаммов, далее, после проверки чистоты полученных культур производят учёт колоний и микроскопирование, переносят часть мицелия в колбу объёмом 50 мл со стерильной жидкой минеральной питательной средой на основе арабиногалактана, без добавления агара, помещают образец в шейкер-инкубатор на срок 5 суток с температурой 30°С, далее после чистки культуры, проводят глубинное культивирование в лабораторном биореакторе, для чего, заполняют биореактор питательной минеральной средой на основе арабиногалактана, производят автоклавирование, засеивают посевной материал из колб - в виде водной суспензии спор, культивирование осуществляют при следующих параметрах: длительность культивирования - 5 суток, значение pH поддерживают в пределах 4,0-4,5,температуру поддерживают в пределах 20-24°С, частоту вращения мешалки устанавливают 10 с-К.
В частности, в качестве штаммов для культивирования берут бактериальные штаммы семейства Enterobacteriaceae, а именно: Escherichia coli, Proteus mirabilis.
В частности, в качестве штаммов для культивирования берут бактериальные штаммы семейства Bacillaceae, а именно: Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus.
В частности, в качестве штаммов для культивирования берут бактериальные штаммы семейства Micrococcaceae, а именно: Micrococcus endophyticus, Micrococcus luteus.
В частности, в качестве штаммов для культивирования берут грибковые штаммы следующих видов: Mucor sp., Dothideomycetes sp., Penicillium chrysogenum., Aspergillus tubingensis.
В частности, в качестве шейкера-инкубатора используют Environmental Snaker-incubator ES-20/60.
На фото показаны эндофитные микроорганизмы под микроскопом, выделенные из лиственницы сибирской.
Осуществление изобретения.
Питательная минеральная среда на основе арабиногалактана для культивирования микроорганизмов, включающая нитрат натрия, калия гидрофосфат, магния сульфат, кальция хлорид, железа сульфат, агар, дистиллированную воду, арабиногалактан при следующем соотношении компонентов, мас. ч.:
| нитрат натрия | 1.9-2.1 |
| калия гидрофосфат | 0.9-1.1 |
| магния сульфат | 0.45-0.55 |
| кальция хлорид | 0.45-0.55 |
| железа сульфат | 0.009-0.011 |
| агар | 14-16 |
| дистиллированная вода | 995-1000 |
| арабиногалактан | 14-16 |
Нитрат натрия (NaNO2) - соль натрия и азотистой кислоты, представляет из себя белый или желтоватый кристаллический порошок, хорошо растворим в воде и гидроскопичен.
Калия гидрофосфат - неорганическое соединение, кислая соль щелочного металла калия и ортофосфорной кислоты с формулой K2HPO4.
Магния сульфат - неорганическое вещество, соль металла магния и серной кислоты с формулой MgSO4, белый порошок.
Кальция хлорид (CaCl2) - химическое неорганическое вещество; кальциевая соль соляной кислоты.
Железа сульфат - неорганическое соединение, железная соль серной кислоты с формулой FeSO4.
Агар - смесь полисахаридов агарозы и агаропектина, получаемая путем экстрагирования из красных водорослей.
Арабиногалактан - водорастворимый полисахарид, входящий в состав камедей покрытосеменных и некоторых голосеменных. Представляет собой твердое аморфное вещество, светло-коричневого света, без запаха, имеет сладковатый вкус, является побочным продуктом промышленной переработки лиственницы.
Питательная минеральная среда готовиться следующим образом: арабиногалактан стерилизуется отдельно (при давлении 0,5 атм, в течение 15 минут) затем добавляется в уже стерильную среду. Режим автоклавирования среды без арабиногалактана: 0,8 атм; 30 мин.
Способ культивирования штаммов микроорганизмов, синтезирующих фермент для гидролиза арабиногалактана, реализуется в несколько этапов:
Этап 1. Берут необходимый для культивирования штамм в лаборатории чистых культур. Исходная музейная чистая культура хранится в холодильнике при температуре от 2 до 4°С.
В качестве штаммов для культивирования могут быть использованы бактериальные штаммы семейств Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Proteus mirabilis), Bacillaceae (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus), и Micrococcaceae (Micrococcus endophyticus, Micrococcus luteus); а также грибковые штаммы, приведенные в таблице 1:
| Таблица 1. Варианты грибковых штаммов необходимых для культивирования | ||
| № штамма | Вид | № в GenBank |
| 1 | Mucor sp. | KX099678 |
| 2 | Dothideomycetes sp. | MH935006.1 |
| 3 | Penicillium chrysogenum. | MT277120.1 |
| 4 | Aspergillus tubingensis | MT729921.1 |
Этап 2. Производят поверхностное культивирование выбранного штамма на твёрдой питательной минеральной среде на основе арабиногалактана. При этом длительность культивирования составляет 3 суток - для бактериальных и 7 суток для грибных штаммов. Культивирование проводят при температуре: для бактерий 37°С; для грибов в диапазоне от 26 до 30°С.
Этап 3. После окончания поверхностного культивирования на твёрдых питательных средах визуально проверяют чистоту полученной культуры, производят учёт колоний и проводят микроскопирование.
Этап 4. Если выбранный штамм является грибковой культурой, переносят часть мицелия в колбу объёмом 50 мл с заранее приготовленной стерильной жидкой минеральной питательной средой на основе арабиногалактана, без добавления агара.
Этап 5. Если выбранный штамм является грибковой культурой, помещают образец в шейкер-инкубатор Environmental Snaker-incubator ES-20/60 на срок в 5 суток с установленной температурой в 30°С.
Завершение этапа 3 для бактериальной культуры и этапа 5 для грибковой культуры характеризуется, получением посевного материала.
Этап 6. Проводят чистку культуры.
Этап 7. Производят глубинное культивирование в лабораторном биореакторе, для чего, заполняют биореактор питательной минеральной средой на основе арабиногалактана, производят автоклавирование, засеивают посевной материал из колб - в виде водной суспензии спор. При этом культивирование осуществляют при следующих параметрах:
- длительность культивирования - 5 суток;
- значение pH поддерживают в пределах 4,0-4,5;
- температуру поддерживают в пределах 20-24°С;
- частота вращения мешалки 10 с-К.
Во время реализации процедуры глубинного культивирования производят ежедневный контроль чистоты культуры путём отбора проб и микроскопирования, параллельно измеряют ферментативную активность и содержание в питательной среде редуцирующих веществ.
Технический результат изобретения упрощение производства питательной минеральной среды для культивирования промышленных штаммов микроорганизмов достигается, за счет того, что в питательной среде в качестве источника углерода используют только сложный полисахарид - арабиногалактан, который под воздействием выделяемой эндофитами внеклеточной формы β-галактозидазы расщепляется на моносахара и используются микроорганизмами. Использование арабиногалактана в составе питательной минеральной среды, позволяет культивировать штаммы микроорганизмов, синтезирующих фермент для гидролиза арабиногалактана из отходов производства лиственницы на биотехнологических предприятиях, что существенно упрощает технологию производства и повышает безотходность производства и обработки лиственницы на предприятиях.
Также заявленный технический результат достигается благодаря тому, что в заявленном техническом решении для биосинтеза β-галактозидазы не используют лактозу и галактозу, что позволяет упростить способ культивирования и снизить стоимость готового продукта.
Заявленный технический результат подтверждается исследованиями, проведенными в центре коллективного пользования «Экология, биотехнологии и процессы получения экологически чистых энергоносителей» ФГБОУ ВО «ПГТУ».
Также заявленное техническое решение в перспективе может обеспечить:
- повышение доступности исходного сырья на 45%;
- продуцирование штаммом внеклеточного, стабильного фермента без внесения ионов металлов (штамм, продуцирующий стабильный фермент непосредственно в среду, расширит диапазон температурного и рН действия для эффективной биоконверсии арабиногалактана);
- увеличение диапазона температурного (вместо узкого варьирования температур между 70-80°C) и рН (4,2-7,6) действия для эффективной биоконверсии арабиногалактана;
- повышение до 70% уровня безотходного производства биомассы лиственницы сибирской.
Заявленный способ культивирования микроорганизмов, продуцирующих фермент, бета-галактозидазу, может быть использован:
- на существующих предприятиях занимающихся производством ферментов и биопрепаратов (например, Сиббиофарм);
- на вновь организованных малых инновационных предприятиях по производству дешёвых субстратов для выращивания микроорганизмов, на основе биотехнологической переработки арабиногалактана, образующегося при производстве целлюлозы из лиственницы или переработки низкосортной древесины лиственницы.
Пример достижения технического результата.
Заявленный способ, с использованием питательной минеральной среды на основе арабиногалактана был реализован в ходе исследований, проведенных в центре коллективного пользования «Экология, биотехнологии и процессы получения экологически чистых энергоносителей» ФГБОУ ВО «ПГТУ».
На предварительных этапах исследования, были приготовлены питательные среды разного состава (представленные в таблице 2).
| Таблица 2. Составы сложных питательных сред, используемых при культивировании микроорганизмов | ||
| Название питательной среды | Состав питательной среды | Примечания |
| Среда Эндо (фабричная) | 1) мясопептонный агар 2) лактоза 3)индикатор фуксин (в нейтральной среде - розовый, при сдвиге рН в кислую сторону - малиновый) 4) дистиллированная вода |
Готовится в соответствии с инструкцией на упаковке и разливается в чашки Петри. В дальнейшем используется для выделения чистой культуры энтеробактерий. |
| Среда с добавлением кукурузного экстракта | 1) кукурузный экстракт 2) картофельный крахмал 3) натрий азотнокислый 4) калия дигидрофосфат 5) кальция карбонат 6) 3% агар 7) дистиллированная вода |
Готовится после закипания воды в течение 5 минут. Режим автоклавирования: 0,8 атм; 30 мин |
| Среда Чапека (фабричная) | 1) нитрат натрия 2)фосфат калия двузамещённый 3) сульфит магния 4) хлорид калия 5) сульфит железа 6) 2% агар 7) дистиллированная вода |
Готовится в соответствии с инструкцией на упаковке и разливается в чашки Петри. |
| Минеральная питательная среда с арабиногалактаном (заявленное решение) |
1) нитрат натрия 2) калия гидрофосфат 3) магния сульфат 4) кальция хлорид 5) железа сульфат 6) 3% агар 7) дистиллированная вода 8) 1% арабиногалактан |
Арабиногалактан стерилизуется отдельно затем добавляется в уже стерильную среду, давление - 0,5 атм, время - 15 минут. Режим автоклавирования среды без арабиногалактана: 0,8 атм; 30 мин |
| Среда Сабуро (фабричная) | 1) глюкоза 2) пептон 3) агар 4) дистиллированная вода |
Готовится в соответствии с инструкцией на упаковке и разливается в чашки Петри. |
| Минеральная среда Петри | 1) нитрат кальция 2) сульфат магния 3) калий фосфатнокислый 4) хлорид кальция 5) дистиллированная вода |
Готовится после закипания воды в течение 5 минут. Режим автоклавирования: 0,8 атм; 30 мин |
| Среда Хью-Лейфсона | 1) пептон 2) хлорид натрия 3) дигидрофосфат калия 4) 1% арабиногалактан 5) бромтимоловый синий 6) 3% агар 7) дистиллированная вода |
Арабиногалактан стерилизуется отдельно затем добавляется в уже стерильную среду, давление - 0,5 атм, время - 15 минут. Готовится после закипания воды в течение 5 минут. Режим автоклавирования: 0,8 атм; 30 мин |
Далее, был проведен анализ роста микроорганизмов в зависимости от состава питательной среды (показано в таблице 3)
| Таблица 3. Подбор питательных сред для выделения микроорганизмов и дальнейшего поддержания их жизнедеятельности | |
| Наименование питательной среды | Рост микроорганизмов |
| Среда Чапека (фабричная) | Незначителен в 1, 2, 3 разведении без стерилизации. В образцах, прошедших стерилизацию рост незначителен в 1 разведении |
| Минеральная питательная среда с арабиногалактаном (заявленное решение) | Многочисленные бактериальные и грибковые колонии в образцах, прошедших стерилизацию |
| Среда Сабуро (фабричная) | Многочисленные бактериальные и грибные колонии в образцах без стерилизации; многочисленные бактериальные колонии в образцах, прошедших стерилизацию |
| Минеральная среда Петри | Незначителен или вовсе отсутствует |
| Среда с добавлением кукурузного экстракта | Многочисленные бактериальные и грибные колонии во всех образцах |
| МПА | Многочисленные бактериальные колонии во всех образцах |
В результате было получено 22 чистые культуры типичных эндофитов и эпифитов из древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.), из них 13 микроорганизмов - бактериальные штаммы, а 9 - грибные. Все полученные культуры были промаркированы и сохранены в музее чистых культур. На фиг. 1 показаны некоторые эндофитные микроорганизмы, выделенные из лиственницы сибирской.
Далее был осуществлен отбор из полученных микроорганизмов штаммов, способных к гидролизу арабиногалактана.
Было установлено, что наиболее часто среди полученных из лиственницы сибирской микроорганизмов, способных использовать полисахарид арабиногалактан для осуществления процессов своей жизнедеятельности, оказались эндофиты.
Способных к выделению фермента β-галактозидаза в питательную среду оказались в численном отношении 6 бактериальных и 4 грибных штамма микроорганизмов.
Контроль способности штаммов к синтезу нужного фермента и оценку питательной ценности сред проводили, анализируя содержание редуцирующих веществ и изменения ферментативной активности перспективных штаммов в жидкой питательной среде путём глубинного культивирования. В результате при оценке способности штаммов к синтезу фермента β - галактозидаза было выделено две группы микроорганизмов - бактериальные и грибковые. Большее количество фермента в культуральной среде отмечено у грибковых штаммов, что объясняется их одновременной способностью к синтезу вне- и внутриклеточной β - галактозидазы.
Далее была осуществлена идентификация штаммов, способных к гидролизу арабиногалактана.
На основе результатов роста микроорганизмов на дифференциально-диагностических средах и учитывая данные биохимического анализа выявили принадлежность двух бактериальных штаммов к семейству Enterobacteriaceae; двух штаммов - к семейству Micrococcaceae, двух штаммов - Bacillaceae (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus. Для определения видовой принадлежности грибных штаммов была выполнена молекулярная идентификация штамма на основе секвенирования фрагментов рибосомальной ДНК (ITS1 rDNA). Наибольшее сходство (99%) было найдено с представителями классов, представленных в таблице 1: Mucor sp., Dothideomycetes sp., Penicillium chrysogenum, Aspergillus tubingensis.
Далее был осуществлен процесс культивирования перспективных грибковых штаммов.
В результате реализации данного этапа, лучший рост грибковых культур при поверхностном культивировании, способных гидролизовать о-нитро-β-галактопиразид был отмечен на минеральной питательной среде с добавлением арабиногалактана, что говорит об успешной переработке микроорганизмами сложного полисахарида. Благоприятная концентрация арабиногалактана при приготовлении плотной питательной среды - 1,5%, для жидкой же среды при глубинном культивировании - 3-5%. Эффективная рН среды находилась в пределах 4,0-4,5. Наиболее благоприятная температура культивирования - 24-30°С.
Также был сделан вывод о том, что при добавлении в питательную среду ионов CaCl2 ускоряется процесс спорообразования штаммов.
Далее проводили глубинное культивирование микроорганизмов сначала в колбах, а затем в лабораторном биореакторе.
При глубинном культивировании микроорганизмы развиваются во всём объёме жидкой питательной среды. Так, в микроорганизмах протекают два связанных процесса - синтез биомассы и синтез ферментов. Был выбран периодический способ глубинного культивирования. Выбор данного способа обоснован тем, что в настоящее время на заводах в большинстве случаев до сих пор применяют периодическое культивирование микроорганизмов, так как способы непрерывного культивирования в производстве ферментных препаратов ещё находятся на стадии производственных испытаний. Для засева питательной среды при глубинном культивировании посевной материал готовили поверхностным способом. Вид посевного материала для грибов - это вегетативная мицелиальная масса, которую переносили в колбу с заранее приготовленным стерильным физиологическим раствором и подвергали интенсивному перемешиванию. Из колб посевной материал в виде водной суспензии спор пересеивался непосредственно в лабораторный биореактор. Спорового посевного материала вполне хватало для того, чтобы вырастить достаточно активную культуру при обычной продолжительности процесса. Подобные способы культивирования, обеспечивает более надёжную защиту от инфекций, и в 2 раза сокращается число операций и продолжительность выращивания посевного материала. Посевной материал, как на отдельных стадиях, так и готовый подвергали тщательному микробиологическому контролю для исключения инфицирования посторонней микрофлорой.
В ходе исследований:
- было получено 22 чистые культуры типичных эндофитов и эпифитов из древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.);
- отобрано 4 перспективных грибковых и 6 бактериальных штаммов эндофитных микроорганизмов, способных к выделению внеклеточной формы β-галактозидазы в культуральную среду;
- определена видовая принадлежность перспективных штаммов на основе секвенирования ITS rDNA;
- проведён эксперимент по длительному культивированию перспективных штаммов в жидкой питательной среде с использованием арабиногалактана в качестве единственного источника углерода;
- разработана технология культивирования микроорганизмов, синтезирующих фермент для гидролиза арабиногалактана, в частности опытным путем были подобраны такие параметры как: длительности и температура поверхностного культивирования для бактериальных и грибных штаммов (этап 2); объем колбы для части мицелия (этап 4); длительность нахождения грибковой культуры в шейкере-инкубаторе и установленная температура (этап 5); параметры культивирования (этап 7).
1. Питательная минеральная среда на основе арабиногалактана для культивирования микроорганизмов, включающая калия гидрофосфат, магния сульфат, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что дополнительно включает: нитрат натрия, кальция хлорид, железа сульфат, агар, арабиногалактан при следующем соотношении компонентов, мас.ч.:
| нитрат натрия | 1.9-2.1 |
| калия гидрофосфат | 0.9-1.1 |
| магния сульфат | 0.45-0.55 |
| кальция хлорид | 0.45-0.55 |
| железа сульфат | 0.009-0.011 |
| агар | 14-16 |
| дистиллированная вода | 995-1000 |
| арабиногалактан | 14-16 |
2. Способ культивирования штаммов микроорганизмов, синтезирующих фермент для гидролиза арабиногалактана, характеризующийся тем, что первоначально берут необходимый для культивирования штамм в лаборатории чистых культур, далее производят поверхностное культивирование выбранного штамма на твёрдой питательной минеральной среде на основе арабиногалактана по п.1, с длительностью культивирования 3 суток при температуре 37°С для бактериальных штаммов и 7 суток при температуре от 26 до 30°С для грибковых штаммов, далее, после проверки чистоты полученных культур, производят учёт колоний и микроскопирование, далее
если выбранный штамм является грибковой культурой, переносят часть мицелия в колбу объёмом 50 мл с заранее приготовленной стерильной жидкой минеральной питательной средой на основе арабиногалактана, без добавления агара, далее помещают образец в шейкер–инкубатор на срок 5 суток с температурой 30°С,
далее после чистки культуры, проводят глубинное культивирование в лабораторном биореакторе, для чего заполняют биореактор питательной минеральной средой на основе арабиногалактана, производят автоклавирование, засеивают посевной материал из колб - в виде водной суспензии спор, культивирование осуществляют при следующих параметрах: длительность культивирования – 5 суток, значение pH поддерживают в пределах 4,0-4,5, температуру поддерживают в пределах 20-24°С, частоту вращения мешалки устанавливают 10 с-К.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве штаммов для культивирования берут бактериальные штаммы семейства Enterobacteriaceae, а именно: Escherichia coli, Proteus mirabilis.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве штаммов для культивирования берут бактериальные штаммы семейства Bacillaceae, а именно: Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus.
5. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве штаммов для культивирования берут бактериальные штаммы семейства Micrococcaceae, а именно: Micrococcus endophyticus, Micrococcus luteus.
6. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве штаммов для культивирования берут грибковые штаммы следующих видов: Mucor sp., Dothideomycetes sp., Penicillium chrysogenum., Aspergillus tubingensis.
7. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве шейкера–инкубатора используют Environmental Snaker-incubator ES-20/60.
