Изготовление и хранение липосомальных рнк-составов, подходящих для терапии
Настоящее раскрытие относится к медицине, в частности к способу получения РНК-липоплексных частиц для доставки РНК в ткани-мишени после парентерального введения и композиции, содержащей такие частицы. Для осуществления указанного способа смешивают раствор, содержащий РНК и имеющий ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от около 50 мМ до около 300 мМ, и раствор, содержащий катионные липосомы в контролируемых условиях смешивания. При этом объединенный поток первого раствора и второго раствора характеризуется числом Рейнольдса более 300. В результате получают РНК-липоплексные частицы, имеющие средний диаметр, который находится в диапазоне от около 300 нм до около 500 нм, и имеющие индекс полидисперсности менее чем 0,2. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность трансляции РНК в пептид или белок, который она кодирует при доставке РНК в клетку-мишень, а также повысить стабильность композиций при хранении без существенной потери качества продукта, в частности, биологической активности РНК. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 45 ил., 10 табл., 27 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее раскрытие относится к способам получения РНК-липоплексных частиц для доставки РНК в ткани-мишени после парентерального введения, в частности, после внутривенного введения, и к композициям, содержащим такие РНК-липоплексные частицы. Настоящее раскрытие также относится к способам, которые позволяют получать РНК-липоплексные частицы промышленным GMP-совместимым образом. Кроме того, настоящее раскрытие относится к способам и композициям для хранения РНК-липоплексных частиц без существенной потери качества продукта и, в частности, без существенной потери активности РНК. Составы РНК-липоплексных частиц, описанные в данном документе, могут быть заморожены или обезвожены с помощью лиофильной сушки, распылительной сушки или схожих способов, позволяющих получать продукты с удлиненным сроком хранения по сравнению с их хранением в жидком состоянии. РНК-липоплексные частицы в одном варианте осуществления содержат одноцепочечную РНК, такую как мРНК, которая кодирует представляющий интерес пептид или белок, такой как фармацевтически активный пептид или белок. РНК поглощается клетками ткани-мишени, и РНК транслируется в кодируемый пептид или белок, который может проявлять свою физиологическую активность. Представляющий интерес пептид или белок может представлять собой пептид или белок, содержащий один или несколько эпитопов для индукции или усиления иммунного ответа, направленного против одного или нескольких эпитопов. Способы и композиции, описанные в данном документе, пригодны для применения с использованием подхода, который соответствует требованиям к фармацевтическим продуктам, более конкретно, который соответствует требованиям для изготовления в соответствии со стандартами надлежащей производственной практики (good manufacturing practice, GMP) и требованиям к качеству фармацевтических продуктов для парентерального применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Применение РНК для доставки чужеродной генетической информации в клетки-мишени предлагает привлекательную альтернативу ДНК. Преимущества применения РНК включают кратковременную экспрессию и нетрансформирующий характер. РНК не должна входить в ядро для экспрессии и, кроме того, не может интегрироваться в геном хозяина, тем самым устраняя риск онкогенеза.
РНК может доставляться с помощью так называемых липоплексных составов, в которых РНК связана с липосомами, состоящими из смеси катионного липида и вспомогательного липида, с образованием инъекционных составов наночастиц. Однако разработка составов для доставки биологически активной РНК в ткань-мишень, даже после хранения составов, является неудовлетворенной необходимостью. Кроме того, разработка способов GMP-совместимого изготовления инъекционных составов РНК-липоплексных частиц, при которых обеспечивается длительный срок хранения, все еще остается неудовлетворенной необходимостью.
Таким образом, существует необходимость в создании составов для доставки биологически активной РНК в ткань-мишень, где доставленная РНК эффективно транслируется в пептид или белок, который она кодирует. Кроме того, существует необходимость в создании таких составов, которые были бы стабильными при хранении без существенной потери качества продукта и, в частности, без существенной потери биологической активности РНК. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что составы РНК-липоплексных частиц, описанные в данном документе, удовлетворяют вышеупомянутым требованиям.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Способы получения РНК-липоплексных частиц, РНК-липоплексные частицы и составы, содержащие РНК-липоплексные частицы
В первом аспекте настоящее раскрытие относится к способам получения РНК-липоплексных частиц с улучшенной биологической активностью, РНК-липоплексным частицам, полученным в соответствии с настоящим изобретением, и композициям, содержащим такие РНК-липоплексные частицы. РНК-липоплексные частицы и композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, применимы для доставки РНК в ткань-мишень после парентерального введения, в частности, после внутривенного введения. РНК-липоплексные частицы получают с использованием липосом, которые получают путем впрыскивания высококонцентрированного липидного раствора в этаноле в воду или подходящую водную фазу. В одном варианте осуществления РНК-липоплексный продукт характеризуется специфической диаграммой рассеяния рентгеновских лучей, где наблюдается один брегговский пик при около 1 нм-1 с шириной пика менее 0,2 нм-1.
В одном варианте осуществления липосомы и РНК-липоплексные частицы содержат 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE). Концентрация DOPE в липидной смеси выше, чем равновесная растворимость одного только DOPE в этаноле. При комнатной температуре DOPE сам по себе имеет растворимость около 50 мМ, вместе с DOTMA он имеет растворимость 100 мМ или выше. Липидные растворы для образования липосом, из которых получают высокоактивные липоплексы, могут иметь общую липидную концентрацию, равную 270 мМ или выше (например, DOPE при 90 мМ или выше). Растворы еще более высокой концентрации в этаноле могут быть получены путем повышения температуры. Липосомы, полученные из липидных растворов, где концентрация DOPE выше величины равновесной растворимости, значительно больше, чем липосомы из липидных растворов, где концентрация DOPE равна величине равновесной растворимости и ниже. Размер липосом монотонно увеличивается с увеличением концентрации в этаноле.
Липосомы, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы для получения РНК-липоплексных частиц путем смешивания липосом с РНК. В одном варианте осуществления РНК инкубируют с NaCl перед смешиванием, чтобы добиться определенной ионной силы, которая требуется для повышенной активности липоплексов. Липоплексы, которые образуются из таких более крупных липосом, имеют значительно более высокую биологическую активность, что продемонстрировано в экспериментах in vitro и in vivo. Данные липоплексы с более высокой активностью можно четко отличить от липоплексов с более низкой активностью по определенным физико-химическим параметрам, например, (i) меньшей ширине брегговского пика и (ii) другому профилю разделения при использовании дисперсионных аналитических способов измерения размера, таких как проточное фракционирование в силовом поле. Липоплексы с более низкой активностью, в среднем, имеют меньший размер. Кроме того, они также имеют другой профиль элюирования, который, вероятно, связан с такими параметрами, как молекулярная конформация, форма и взаимодействия с объемной фазой.
Соответственно, в данном аспекте раскрытие относится к способу получения липосомного коллоида, включающему инжекцию липидного раствора в этаноле в водную фазу для получения липосомного коллоида, где концентрация по меньшей мере одного из липидов в липидном растворе соответствует равновесной растворимости по меньшей мере одного липида в этаноле или превышает равновесную растворимость по меньшей мере одного липида в этаноле.
В одном варианте осуществления способ включает нагревание липидного раствора для увеличения концентрации липидов в липидном растворе. В одном варианте осуществления липидный раствор нагревают до температуры, составляющей по меньшей мере около 40°С или по меньшей мере около 60°С.
В одном варианте осуществления липидный раствор представляет собой раствор смеси двух или более разных липидов.
В одном варианте осуществления концентрация одного липида в липидном растворе соответствует или превышает равновесную растворимость липида в этаноле. В одном варианте осуществления общая концентрация липидов в липидном растворе составляет от около 180 мМ до около 600 мМ, от около 300 мМ до около 600 мМ или около 330 мМ.
В одном варианте осуществления липидный раствор содержит по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном варианте осуществления концентрация дополнительного липида в липидном растворе соответствует или превышает равновесную растворимость дополнительного липида в этаноле.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP).
В одном варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
В одном варианте осуществления молярное соотношение по меньшей мере одного катионного липида и по меньшей мере одного дополнительного липида составляет от около 10:0 до около 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1. В одном варианте осуществления липидный раствор содержит DOTMA и DOPE в молярном соотношении от около 10:0 до около 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1.
В одном варианте осуществления концентрация DOPE в липидном растворе составляет по меньшей мере около 60 мМ или по меньшей мере около 90 мМ.
В одном варианте осуществления липидный раствор инжектируется в водную фазу при скорости перемешивания водной фазы от около 50 об/мин до около 150 об/мин.
В одном варианте осуществления водная фаза представляет собой воду.
В одном варианте осуществления водная фаза имеет кислый рН. В одном варианте осуществления водная фаза содержит уксусную кислоту, например, в количестве около 5 мМ.
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает перемешивание липосомного коллоида.
В одном варианте осуществления липосомный коллоид перемешивают в течение от около 15 минут до около 60 минут или в течение около 30 минут.
Изобретение дополнительно относится к способу получения липосомного коллоида, включающему инжекцию липидного раствора, содержащего DOTMA и DOPE в молярном соотношении около 2:1 в этаноле, в воду, перемешиваемую со скоростью перемешивания около 150 об/мин, для получения липосомного коллоида, где концентрация DOTMA и DOPE в липидном растворе составляет около 330 мМ.
В одном варианте осуществления способ получения липосомы не включает стадию экструдирования липосом.
Изобретение дополнительно относится к липосомному коллоиду, который можно получить способом получения липосомы.
В одном варианте осуществления липосомы имеют средний диаметр, составляющий по меньшей мере около 250 нм.
В одном варианте осуществления липосомы имеют средний диаметр, который находится в диапазоне от около 250 нм до около 800 нм.
В одном варианте осуществления липосомы имеют индекс полидисперсности менее чем около 0,5, менее чем около 0,4 или менее чем около 0,3.
В одном варианте осуществления липосомы представляют собой катионные липосомы.
В одном варианте осуществления липосомы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP).
В одном варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
В одном варианте осуществления молярное соотношение по меньшей мере одного катионного липида и по меньшей мере одного дополнительного липида составляет от около 10:0 до около 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1.
В одном варианте осуществления липосомы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от около 10:0 до около 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1.
Изобретение дополнительно относится к способу получения РНК-липоплексных частиц, включающему добавление вышеуказанного липосомного коллоида к раствору, содержащему РНК.
В одном варианте осуществления на паттерне рассеяния рентгеновских лучей РНК-липоплексы характеризуются одним брегговским пиком при около 1 нм-1 с шириной пика менее 0,2 нм-1.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который находится в диапазоне от около 200 до около 800 нм, от около 250 до около 700 нм, от около 400 до около 600 нм, от около 300 нм до около 500 нм или от около 350 до около 400 нм.
Изобретение дополнительно относится к композиции, включающей РНК-липоплексные частицы, которые могут быть получены, как описано выше.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном варианте осуществления РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0.
Изобретение дополнительно относится к композиции, включающей:
РНК-липоплексные частицы, содержащие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, и
по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0, и
причем РНК-липоплексные частицы характеризуются одним брегговским пиком при около 1 нм-1 с шириной пика менее 0,2 нм-1.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит хлорид натрия в концентрации от около 10 мМ до около 300 мМ, от около 45 мМ до около 300 мМ, от около 10 мМ до около 50 мМ или от около 80 мМ до около 150 мМ.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит буфер.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит хелатирующий агент.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы, описанные в данном аспекте в разделе I., имеют средний диаметр, который находится в диапазоне от около 200 до около 800 нм, от около 250 до около 700 нм, от около 400 до около 600 нм, от около 300 нм до около 500 нм или от около 350 нм до около 400 нм.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы имеют индекс полидисперсности менее чем около 0,5, менее чем около 0,4 или менее чем около 0,3.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP).
В одном варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
В одном варианте осуществления молярное соотношение по меньшей мере одного катионного липида и по меньшей мере одного дополнительного липида составляет от около 10:0 до около 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от около 10:0 до 1:9, от около 4:1 до 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1, причем соотношение зарядов для положительных зарядов в DOTMA и отрицательных зарядов в РНК составляет от 1:2 до 1,9:2.
В одном варианте осуществления хелатирующий агент представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).
В одном варианте осуществления EDTA имеет концентрацию от около 0,25 мМ до около 5 мМ или около 2,5 мМ.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит адъювант.
В одном варианте осуществления композиция составлена для системного введения.
В одном варианте осуществления системное введение представляет собой внутривенное введение.
Изобретение дополнительно относится к композиции, как описано для терапевтического применения.
II. Способы получения РНК-липоплексных частиц промышленным GMP-совместимым способом
Во втором аспекте настоящее раскрытие относится к способам, которые позволяют получать РНК-липоплексные частицы промышленным GMP-совместимым образом.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения для GMP-изготовления фармацевтического продукта РНК-липоплексных частиц используется система жидкостных каналов (fluid paths system), которая обеспечивает точный контроль соотношения компонентов при смешивании РНК и липосом, что важно для качества продукта. В одном варианте осуществления путь прохождения жидкости включает смешивание раствора липосом и раствора РНК в соотношении 1:1 (объем/объем), где концентрации компонентов выбраны для точного поддержания желаемого соотношения зарядов. В одном варианте осуществления РНК инкубируют с NaCl перед смешиванием, чтобы добиться определенной ионной силы, которая необходима для активности липоплексов. В одном варианте осуществления реализована установка смешивания Y-типа, которая полностью основана на материалах одноразового использования. Жидкостная динамика оптимизирована для поддержания характеристик частиц и предотвращения закупоривания. Напротив, при использовании коммерчески доступных микрофлюидных устройств через некоторое время происходит закупоривание, что делает невозможным применение GMP. В одном варианте осуществления липоплексы производят путем инкубации РНК с катионными липосомами, где соотношение компонентов при смешивании и условия смешивания точно контролируются с помощью шприцевого насоса (перфузорного насоса), где два шприца, причем один содержит липосомы и другой содержит РНК, вставлены в шприцевые насосы, преимущественно, параллельно в один и тот же насос. Поршни обоих насосов перемещаются вперед одним и тем же приводом, таким образом, точно регулируя относительные объемы, которые смешиваются. В условиях выбранного способа для обоих растворов используются одинаковые шприцы, что позволяет обеспечить точное смешивание в соотношении один к одному (по объему). Соотношение между РНК и липосомами (катионный липид) затем точно контролируется посредством корректировки концентрации двух растворов перед смешиванием.
Соответственно, в данном аспекте раскрытие относится к способу непрерывного поточного изготовления РНК-липоплексных частиц, включающему смешивание раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, в контролируемых условиях смешивания РНК и катионных липосом.
В одном варианте осуществления раствор, содержащий катионные липосомы, представляет собой липосомный коллоид, как описано выше.
В одном варианте осуществления раствор, содержащий РНК, и раствор, содержащий катионные липосомы, являются водными растворами.
В одном варианте осуществления используется скорость потока, которая позволяет смешивать раствор, содержащий РНК, и раствор, содержащий катионные липосомы.
В одном варианте осуществления поток характеризуется числом Рейнольдса, превышающим 300 или от около 500 до около 2100.
В одном варианте осуществления контролируемые условия смешивания включают контролирование соотношения компонентов при смешивании раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы.
В одном варианте осуществления контролируемые условия смешивания включают контролирование относительного объема раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, которые должны быть смешаны.
В одном варианте осуществления соотношение компонентов при смешивании РНК и катионных липосом контролируется путем использования для смешивания идентичных объемов (объем/объем) раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, и корректировки концентраций РНК и катионных липосом в соответствующих растворах.
В одном варианте осуществления контролируемые условия смешивания выбраны так, чтобы поддерживать характеристики РНК-липоплексных частиц, избегая при этом закупоривания.
В одном варианте осуществления способ включает использование смесительного элемента Y-типа или Т-типа.
В одном варианте осуществления смесительный элемент Y-типа или Т-типа имеет диаметр от около 1,2 мм до около 50 мм.
В одном варианте осуществления способ включает использование смесительного элемента, например, смесительного элемента Y-типа или Т-типа, где жидкости из двух трубок или шлангов объединяются и где отсутствуют внутренние статические смесительные элементы, например, щель со смесителем, смещенная «елочка», зигзагообразные или витые каналы, или трехмерный серпантин. Смесительные элементы могут иметь диаметр от 1,2 до 50,0 мм. В одном варианте осуществления способ включает использование устройства, где два шприца, причем один содержит раствор, содержащий катионные липосомы, и другой содержит раствор, содержащий РНК, вставлены параллельно в тот же самый или два держателя и поршни устройства выступают на один или два прецизионный привод(а). В одном варианте осуществления способ включает использование шприцевого насоса, где два шприца, причем один содержит раствор, содержащий катионные липосомы, и другой содержит раствор, содержащий РНК, вставлены параллельно в один и тот же насос.
В одном варианте осуществления способ включает использование сосуда под давлением, мембранного насоса, шестеренного насоса, насоса с магнитной левитацией, перистальтического насоса, насосов HPLC/FPLC или любого другого поршневого насоса, необязательно в сочетании с датчиками расхода, необязательно с петлей обратной связиью для контроля в режиме онлайн и регулирования скорости потока в реальном времени. В одном варианте осуществления смесь раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего липосомы, содержит хлорид натрия в концентрации от около 45 мМ до около 300 мМ или имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от около 45 мМ до около 300 мМ.
В одном варианте осуществления раствор РНК содержит хлорид натрия в концентрации от около 90 мМ до около 600 мМ или имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от около 90 мМ до около 600 мМ.
В одном варианте осуществления смесь раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего липосомы, имеет ионную силу, составляющую по меньшей мере около 50 мМ. В одном варианте осуществления на паттерне рассеяния рентгеновских лучей РНК-липоплексы характеризуются одним брегговским пиком при около 1 нм-1 с шириной пика менее 0,2 нм-1.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который находится в диапазоне от около 200 до около 800 нм, от около 250 до около 700 нм, от около 400 до около 600 нм, от около 300 нм до около 500 нм или от около 350 нм до 400 нм.
Изобретение дополнительно относится к композиции, включающей РНК-липоплексные частицы, которые могут быть получены, как описано выше.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном варианте осуществления РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0.
Изобретение дополнительно относится к композиции, включающей:
РНК-липоплексные частицы, содержащие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, и
по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0 и
где РНК-липоплексные частицы характеризуются одним брегговским пиком при около 1 нм-1 с шириной пика менее 0,2 нм-1.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит хлорид натрия в концентрации от около 10 мМ до около 300 мМ, от около 45 мМ до около 300 мМ, от около 10 мМ до около 50 мМ или от около 80 мМ до около 150 мМ.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит буфер.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит хелатирующий агент.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы, описанные в данном аспекте в разделе II., имеют средний диаметр, который составляет от около 200 до около 800 нм, от около 250 до около 700 нм, от около 400 до около 600 нм, от около 300 нм до около 500 нм или от около 350 нм до около 400 нм.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы имеют индекс полидисперсности менее чем около 0,5, менее чем около 0,4 или менее чем около 0,3. В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP).
В одном варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
В одном варианте осуществления молярное соотношение по меньшей мере одного катионного липида и по меньшей мере одного дополнительного липида составляет от около 10:0 до 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от около 10:0 до 1:9, от около 4:1 до 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1, причем соотношение зарядов для положительных зарядов в DOTMA и отрицательных зарядов в РНК составляет от 1:2 до 1,9:2.
В одном варианте осуществления хелатирующий агент представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).
В одном варианте осуществления EDTA имеет концентрацию от около 0,25 мМ до около 5 мМ или около 2,5 мМ.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит адъювант.
В одном варианте осуществления композиция составлена для системного введения.
В одном варианте осуществления системное введение представляет собой внутривенное введение.
Изобретение дополнительно относится к композиции, как описано для терапевтического применения.
III. Способы и композиции для хранения РНК-липоплексных частиц
В третьем аспекте настоящее раскрытие относится к способам и композициям для хранения РНК-липоплексных частиц без существенной потери качества продукта и, в частности, без существенной потери активности РНК. В частности, настоящее раскрытие относится к составам, которые допускают замораживание, лиофилизацию или распылительную сушку РНК-липоплексных частиц без существенной потери качества РНК-липоплексных частиц и, в частности, без существенной потери активности РНК.
Составы РНК-липоплексных частиц, описанные в данном документе, могут быть заморожены или обезвожены с помощью лиофильной сушки, распылительной сушки или схожих способов, позволяющих получать продукты с удлиненным сроком хранения по сравнению с их хранением в жидком состоянии.
Для того чтобы сделать возможным замораживание, добавляется стабилизатор (криопротектор). В одном варианте осуществления липоплексы разбавляются стабилизатором (криопротектором) после изготовления, что позволяет регулировать ионную силу преимущественно для уменьшения ионной силы и регулировать подходящую концентрацию стабилизатора. Для замораживания продукта концентрация стабилизатора может быть выше, чем величина для получения физиологической осмоляльности. В данном случае, для введения продукт разбавляют подходящей водной фазой (например, водой для инъекций, физиологическим раствором), чтобы отрегулировать желаемую осмоляльность и ионную силу. В качестве стабилизатора можно использовать сахара, такие как глюкоза, сахароза или трегалоза, и также другие соединения, такие как декстраны. Неожиданно, в соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что РНК-липоплексный состав, содержащий стабилизатор, как описано в настоящем документе, также может быть лиофилизирован. Для лиофилизации, необходимая концентрация стабилизатора (лиопротектанта) может быть ниже, чем для замораживания, и допустимая концентрация NaCl (ионная сила) может быть выше, чем для замораживания. Продукт также может быть высушен распылением, если требуется экономичное обезвоживание в больших масштабах.
Величина рН некоторых РНК-липоплексных составов доводится до значения, которое ниже, чем обычный физиологический диапазон и обычный рН-оптимум для хранения РНК в объемной (bulk) фазе. Оптимальный рН составляет около 6,2, подходящий диапазон составляет от около 5,7 до около 6,7. Для других составов идеальный рН может быть даже ниже. Предполагается, что локальный рН внутри РНК-липоплексов выше, чем рН объемной фазы из-за положительных зарядов катионного липида.
В тех вариантах осуществления изобретения, в которых РНК-липоплексные композиции замораживаются для хранения, композиции могут оттаиваться и, необязательно, осмоляльность, ионная сила и/или рН композиции могут подводиться путем добавления водной жидкости. Полученная композиция может быть введена субъекту. В тех вариантах осуществления изобретения, в которых РНК-липоплексные композиции лиофилизируются или лиофильно высушиваются для хранения, композиции могут быть восстановлены путем добавления водной жидкости и, необязательно, осмоляльность, ионная сила и/или рН композиции могут быть скорректированы путем добавления водной жидкости. Полученная композиция может быть введена субъекту.
Соответственно, в данном аспекте раскрытие относится к способу приготовления замороженной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, включающему (i) получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, и (ii) замораживание композиции.
В одном варианте осуществления замораживание осуществляется при температуре от около -15°С до около -40°С или при около -30°С.
В одном варианте осуществления композиция хранится, например, при температуре хранения от около -15°С до около -40°С или при -20°С.
В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой углевод, выбранный из моносахарида, дисахарида, трисахарида, сахарного спирта, олигосахарида или его соответствующего сахарного спирта и полиспирта с линейной цепью.
В одном варианте осуществления обеспечение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, включает обеспечение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, и добавление стабилизатора к водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы. Соответственно, способ приготовления композиции для замораживания включает обеспечение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, и добавление стабилизатора к водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы.
В одном варианте осуществления добавление стабилизатора к водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, снижает ионную силу водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы
В одном варианте осуществления концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, выше, чем величина, необходимая для физиологической осмоляльности.
В одном варианте осуществления концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, является достаточной для поддержания качества РНК-липоплексных частиц и, в частности, для предотвращения существенной потери активности РНК после хранения композиции при температуре от около -15°С до около -40°С в течение по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев. В одном варианте осуществления концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, составляет от около 5% до около 35,0% (масс./об.), от около 10% до около 30,0% (масс./об.), от около 12,5% до около 25,0% (масс./об.) или около 22,0% (масс./об.).
В одном варианте осуществления величина рН в водной композиции, содержащей РНК липоплексы и стабилизатор, ниже, чем обычный рН-оптимум для хранения РНК.
В одном варианте осуществления водная композиция, содержащая РНК-липоплексы и стабилизатор, содержит хлорид натрия в концентрации от около 10 мМ до около 50 мМ или имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от около 10 мМ до около 50 мМ.
В одном варианте осуществления водная композиция, содержащая РНК-липоплексы и стабилизатор, имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации около 20 мМ.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы могут быть получены с помощью способа, как описано выше в разделах I и II.
В одном варианте осуществления способ получения замороженной композиции дополнительно включает хранение замороженной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы. Композиция может храниться при температуре, которая соответствует или по существу соответствует температуре замерзания или температуре, которая выше или ниже температуры замерзания. Как правило, композицию хранят при температуре от около -15°С до около -40°С, например, при около -20°С.
Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, включающей РНК-липоплексные частицы, которую можно получить указанным выше способом получения замороженной композиции. Раскрытие также относится к композиции, включающей РНК-липоплексные частицы, которую можно получить указанным выше способом приготовления композиции для замораживания.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном варианте осуществления РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит хлорид натрия в концентрации от около 10 мМ до около 50 мМ.
Изобретение дополнительно относится к композиции, включающей:
РНК-липоплексные частицы, содержащие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп,
по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0, хлорид натрия в концентрации от 0 до 40 мМ и стабилизатор.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит буфер.
В одном варианте осуществления количество РНК в композиции составляет от около 0,01 мг/мл до около 1 мг/мл, от около 0,05 мг/мл до около 0,5 мг/мл или около 0,05 мг/мл.
В одном варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию от около 20 мМ до около 30 мМ.
В одном варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию около 20 мМ.
В одном варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию около 30 мМ.
В одном варианте концентрация стабилизатора в композиции выше, чем величина, необходимая для физиологической осмоляльности.
В одном варианте осуществления концентрация стабилизатора в композиции составляет от около 5 до около 35 массовых процентов по объему (% масс./об.) или от около 12,5 до около 25 массовых процентов по объему (% масс./об.).
В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой углевод, выбранный из моносахарида, дисахарида, трисахарида, сахарного спирта, олигосахарида или его соответствующего сахарного спирта и полиспирта с линейной цепью.
В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой сахарозу в концентрации от около 5 до около 25 массовых процентов по объему (% масс./об.).
В одном варианте осуществления сахароза имеет концентрацию от около 15% (масс./об.) до около 25% (масс./об.).
В одном варианте осуществления сахароза имеет концентрацию от около 20% (масс./об.) до около 25% (масс./об.).
В одном варианте осуществления сахароза имеет концентрацию около 22% (масс./об.).
В одном варианте осуществления сахароза имеет концентрацию около 20% (масс./об.).
В одном варианте осуществления композиция имеет рН, который ниже, чем обычный рН-оптимум для хранения РНК.
В одном варианте осуществления композиция имеет рН от около 5,7 до около 6,7 или рН около 6,2.
В одном варианте осуществления буфер представляет собой 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновую кислоту (HEPES).
В одном варианте осуществления HEPES имеет концентрацию от около 2,5 мМ до около 10 мМ, или около 7,5 мМ.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит хелатирующий агент.
Изобретение дополнительно относится к композиции, включающей:
РНК-липоплексные частицы, содержащие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп в концентрации около 0,05 мг/мл, и
DOTMA и DOPE в молярном соотношении около 2:1,
где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет около 1,3:2,0,
хлорид натрия в концентрации около 20 мМ,
сахарозу в концентрации около 22% (масс./об.),
HEPES в концентрации около 7,5 мМ с рН около 6,2 и
EDTA в концентрации около 2,5 мМ.
В одном варианте осуществления композиция находится в жидком или замороженном состоянии.
В одном варианте осуществления замороженная композиция является стабильной при температуре от около -15°С до около -40°С в течение по меньшей мере одного месяца, в течение по меньшей мере 6 месяцев, в течение по меньшей мере 12 месяцев, в течение по меньшей мере 24 месяцев или в течение по меньшей мере 36 месяцев.
В одном варианте осуществления замороженная композиция является стабильной при температуре около -15°С в течение по меньшей мере одного месяца, в течение по меньшей мере 6 месяцев, в течение по меньшей мере 12 месяцев, в течение по меньшей мере 24 месяцев или в течение по меньшей мере 36 месяцев.
В одном варианте осуществления замороженная композиция является стабильной при температуре около -15°С в течение по меньшей мере двух месяцев.
В одном варианте осуществления замороженная композиция является стабильной при температуре около -20°С в течение по меньшей мере одного месяца, в течение по меньшей мере 6 месяцев, в течение по меньшей мере 12 месяцев, в течение по меньшей мере 24 месяцев или в течение по меньшей мере 36 месяцев.
В одном варианте осуществления замороженная композиция является стабильной при температуре около -20°С в течение по меньшей мере двух месяцев.
В одном варианте осуществления замороженная композиция является стабильной при температуре около -30°С в течение по меньшей мере одного месяца, в течение по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, в течение по меньшей мере 24 месяцев или в течение по меньшей мере 36 месяцев.
В одном варианте осуществления замороженная композиция является стабильной при температуре около -30°С в течение по меньшей мере двух месяцев.
Изобретение дополнительно относится к водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, которые можно получить путем размораживания вышеуказанной замороженной композиции и, необязательно, регулирования осмоляльности и ионной силы путем добавления водной жидкости.
В одном варианте осуществления осмоляльность композиции составляет от около 200 мОсмол до около 450 мОсмол.
В одном варианте осуществления композиция содержит хлорид натрия в концентрации от около 80 мМ до около 150 мМ.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы могут быть получены с помощью способа, как описано выше в разделах I и II.
Изобретение дополнительно относится к способу получения дегидратированной, например, лиофилизированной или высушенной распылением композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, включающему (i) обеспечение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, и (ii) дегидратацию, например, лиофилизирование или распылительную сушку, композиции.
В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой углевод, выбранный из моносахарида, дисахарида, трисахарида, сахарного спирта, олигосахарида или его соответствующего сахарного спирта и полиспирта с линейной цепью.
В одном варианте осуществления обеспечение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатора, включает обеспечение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, и добавление стабилизатора к водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы. Соответственно, способ приготовления композиции для дегидратации, например, лиофилизации или распылительной сушки, включает обеспечение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, и добавление стабилизатора к водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы.
В одном варианте осуществления добавление стабилизатора к водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, снижает ионную силу водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы
В одном варианте концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, выше, чем величина, необходимая для физиологической осмоляльности.
В одном варианте осуществления концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, является достаточной для поддержания качества РНК-липоплексных частиц и, в частности, для предотвращения существенной потери активности РНК после хранения композиции в течение по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев.
В одном варианте осуществления концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, составляет от около 5% до около 35,0% (масс./об.), от около 10% до около 30,0% (масс./об.), от около 12,5% до около 25,0% (масс./об.) или около 22,0% (масс./об.).
В одном варианте осуществления рН в водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, ниже, чем обычный рН-оптимум для хранения РНК.
В одном варианте осуществления водная композиция, содержащая РНК-липоплексы и стабилизатор, содержит хлорид натрия в концентрации от около 10 мМ до около 80 мМ или от около 10 мМ до около 50 мМ, или имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от около 10 мМ до около 80 мМ или от около 10 мМ до около 50 мМ.
В одном варианте осуществления водная композиция, содержащая РНК-липоплексы и стабилизатор, имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации около 20 мМ, около 40 мМ, около 60 мМ или около 80 мМ.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы могут быть получены с помощью способа, как описано выше в разделах I и II.
В одном варианте осуществления способ приготовления дегидратированной, например, лиофилизированной или высушенной распылением композиции дополнительно включает хранение лиофилизированной или высушенной распылением композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы. Обычно, композицию хранят при температуре от около -15°С до около -40°С, например, при температуре около -20°С. В определенных вариантах осуществления композицию хранят при температуре выше 0°С, например, при температуре около 25°С или около 4°С, или, например, при комнатной температуре.
Изобретение дополнительно относится к композиции, включающей РНК-липоплексные частицы, которую можно получить указанным выше способом приготовления дегидратированной, например, лиофилизированной или высушенной распылением композиции. Раскрытие также относится к композиции, включающей РНК-липоплексные частицы, которую можно получить указанным выше способом приготовления композиции для дегидратации, например, лиофилизации или распылительной сушки.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
В одном варианте осуществления РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит хлорид натрия в концентрации от около 10 мМ до около 80 мМ или от около 10 мМ до около 50 мМ.
Изобретение дополнительно относится к композиции, включающей:
РНК-липоплексные частицы, содержащие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид,
где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0, хлорид натрия в концентрации от 10 мМ до около 80 мМ и стабилизатор.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит буфер.
В одном варианте осуществления количество РНК композиции составляет от около 0,01 мг/мл до около 1 мг/мл, от около 0,05 мг/мл до около 0,5 мг/мл или около 0,05 мг/мл. В одном варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию от около 20 мМ до около 30 мМ.
В одном варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию около 20 мМ.
В одном варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию около 30 мМ.
В одном варианте концентрация стабилизатора в композиции выше, чем величина, необходимая для физиологической осмоляльности.
В одном варианте осуществления концентрация стабилизатора в композиции составляет от около 5 до около 35 массовых процентов по объему (% масс./об.) или от около 10 до около 25 массовых процентов по объему (% масс./об.).
В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой углевод, выбранный из моносахарида, дисахарида, трисахарида, сахарного спирта, олигосахарида или его соответствующего сахарного спирта и полиспирта с линейной цепью.
В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой трегалозу в концентрации от около 5 до около 35 массовых процентов по объему (% масс./об.).
В одном варианте осуществления трегалоза имеет концентрацию от около 5% (масс./об.) до около 25% (масс./об.).
В одном варианте осуществления трегалоза имеет концентрацию от около 10% (масс./об.) до около 25% (масс./об.).
В одном варианте осуществления трегалоза имеет концентрацию около 10% (масс./об.).
В одном варианте осуществления трегалоза имеет концентрацию около 15% (масс./об.).
В одном варианте осуществления композиция имеет рН, который ниже, чем обычный рН-оптимум для хранения РНК.
В одном варианте осуществления композиция имеет рН от около 5,7 до около 6,7, или около 6,2.
В одном варианте осуществления буфер представляет собой 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновую кислоту (HEPES).
В одном варианте осуществления HEPES имеет концентрацию от около 2,5 мМ до около 10 мМ или около 7,5 мМ.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит хелатирующий агент.
Изобретение дополнительно относится к композиции, включающей:
РНК-липоплексные частицы, содержащие:
РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп в концентрации около 0,05 мг/мл, и
DOTMA и DOPE в молярном соотношении около 2:1,
где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет около 1,3:2,0,
хлорид натрия в концентрации около 20 мМ,
трегалозу в концентрации около 10% (масс./об.),
HEPES в концентрации около 7,5 мМ с рН около 6,2 и
EDTA в концентрации около 2,5 мМ.
В одном варианте осуществления композиция находится в жидком или дегидратированном, например, лиофилизированном или лиофильно высушенном состоянии.
В одном варианте осуществления дегидратированная, например, лиофилизированная или лиофильно высушенная композиция является стабильной в течение по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев. В одном варианте осуществления композиция хранится при температуре выше 0°С, например, при температуре около 25°С или около 4°С, или, например, при комнатной температуре.
В одном варианте осуществления дегидратированная, например, лиофилизированная или лиофильно высушенная композиция является стабильной в течение по меньшей мере одного месяца.
В одном варианте осуществления дегидратированная, например, лиофилизированная или лиофильно высушенная композиция является стабильной в течение по меньшей мере двух месяцев.
Изобретение дополнительно относится к водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, которые можно получить путем восстановления вышеуказанной дегидратированной, например, лиофилизированной или лиофильно высушенной композиции и, необязательно, регулирования осмоляльности и ионной силы путем добавления водной жидкости.
В одном варианте осуществления осмоляльность композиции составляет от около 150 мОсмол до около 450 мОсмол.
В одном варианте осуществления композиция содержит хлорид натрия в концентрации от около 80 мМ до около 150 мМ.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы могут быть получены с помощью способа, как описано выше в разделах I и II.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы, описанные в данном аспекте в разделе III., характеризуются одним брегговским пиком при около 1 нм-1 с шириной пика менее 0,2 нм-1.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы, описанные в данном аспекте в разделе III., имеют средний диаметр, который составляет от около 200 до около 800 нм, от около 250 до около 700 нм, от около 400 до около 600 нм, от около 300 нм до около 500 нм, или от около 350 нм до около 400 нм.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы имеют индекс полидисперсности менее чем около 0,5, менее чем около 0,4 или менее чем около 0,3.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP).
В одном варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(92-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
В одном варианте осуществления молярное соотношение по меньшей мере одного катионного липида и по меньшей мере одного дополнительного липида составляет от около 10:0 до 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1.
В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от около 10:0 до 1:9, от около 4:1 до 1:2, от около 3:1 до около 1:1, или около 2:1, причем соотношение зарядов для положительных зарядов в DOTMA и отрицательных зарядов в РНК составляет от 1:2 до 1,9:2.
В одном варианте осуществления хелатирующий агент представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).
В одном варианте осуществления EDTA имеет концентрацию от около 0,25 мМ до около 5 мМ или около 2,5 мМ.
В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит адъювант.
В одном варианте осуществления композиция составлена для системного введения.
В одном варианте осуществления системное введение представляет собой внутривенное введение.
Изобретение дополнительно относится к композиции, как описано для терапевтического применения.
Изобретение дополнительно относится к способу получения водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, включающему оттаивание замороженной композиции, описанной выше, или восстановление лиофилизированной или высушенной распылением композиции, описанной выше, и, возможно, корректировка осмоляльности и ионной силы путем добавления водной жидкости.
В одном варианте осуществления водную жидкость добавляют для получения осмоляльности композиции от около 200 мОсмол до около 450 мОсмол.
В одном варианте осуществления водную жидкость добавляют для получения хлорида натрия в концентрации от около 80 мМ до около 150 мМ.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1 показывает корреляцию между концентрацией липидов в исходном липидном растворе и размером липосом. Липосомы готовили путем этанольной инжекции в воду (после этанольной инжекции процесс фильтрации не проводился). Размер липосом увеличивается с увеличением концентрации липидов в этаноле. Данный пример: липидная смесь DOTMA/DOPE с % молярным соотношением, равным 66:33.
Фиг. 2 показывает количество частиц, присутствующих в DOTMA/DOPE-липосомных составах, приготовленных с различными липидными растворами в различных концентрациях.
Фиг. 3 показывает влияние размера предшественника липосом (используется нефильтрованный липосомный коллоид) на размер РНК-липоплексов. Небольшие РНК-липоплексы были получены, когда для их образования использовались небольшие липосомы. Во всех РНК-липоплексах, полученных с более крупными липосомами, не было обнаружено четкой корреляции между размером липосом и размером РНК-липоплексов. Фиг. 4 показывает количество частиц, присутствующих в РНК-липоплексных составах, приготовленных с различными прекурсорами липосом (нефильтрованные липосомы). Количество частиц с размером 0,5 мкм увеличивается в РНК-липоплексных составах, приготовленных с более крупными липосомами. Липосомы готовили путем этанольной инжекции с использованием различных исходных липидных растворов в различных концентрациях.
Фиг. 5 показывает дифракционные кривые, полученные из измерений методом малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) для РНК-липоплекса, образованного с липосомами, приготовленными при соотношении зарядов 4/1 (вверху) и при соотношении зарядов 1,3/2, где липосомы для образования липоплекса были получены с мМ липидным исходным раствором в этаноле с концентрациями в 400, 300 и 100 мМ.
Фиг. 6 показывает длину корреляции и эффективность трансфекции in vitro (человеческие дендритные клетки) для различных РНК-липоплексов, приготовленных с различными прекурсорами липосом. Биологическая активность (РНК-трансфекция in vitro) монотонно возрастает с длиной корреляции для РНК-липоплекса. Липосомы готовили с помощью этанольной инжекции и различных исходных липидных растворов, приготовленных с различными концентрациями липидов.
Фиг. 7 показывает результаты измерения методом AF4 липоплексов из двух различных типов липосом, изготовленных либо из 150 мМ исходного раствора в этаноле, либо из 400 мМ исходного раствора в этаноле.
Фиг. 8 показывает эффективность in-vitro трансфекции различных РНК-липоплексов в дендритных клетках. Сигнал люциферазы монотонно увеличивается с размером липосом, используемых для образования РНК-липоплексов.
Фиг. 9 показывает эффективность in-vitro трансфекции различных РНК-липоплексов в дендритных клетках. Сигнал люциферазы увеличивается монотонно с размером липосом.
Фиг. 10 показывает эффективность in-vivo трансфекции РНК-липоплексных составов через 6 часов после применения. РНК-липоплексы получали с небольшими и крупными липосомами (нефильтрованные липосомы). РНК-липоплексы, полученные с более крупными липосомами, приводят к более высокому уровню экспрессии люциферазы.
Фиг. 11 показывает in-vivo визуализацию РНК-липоплексов через 6 часов после применения. РНК-липоплексы были приготовлены с небольшими и крупными липосомами. А) РНК-липоплекс, полученный с небольшими липосомами из исходного коллоида. В) РНК-липоплекс, приготовленный с более крупными липосомами из исходного коллоида. С) РНК-липоплекс, приготовленный с небольшими отфильтрованными липосомами. D) РНК-липоплекс, приготовленный с крупными отфильтрованными липосомами. Более высокие сигналы биолюминесценции, полученные с РНК-липоплексом, приготовленным с более крупными липосомами.
Фиг. 12 показывает общую процедуру автоматизированного серийного изготовления РНК-липоплексов.
Фиг. 13 показывает Z-среднее значение и полидисперсность для РНК-липоплексов, полученных с использованием смесительного элемента Y-типа с внутренним диаметром 3,2 мм при различных скоростях потока.
Фиг. 14: показывает Z-среднее значение и полидисперсность для РНК-липоплексов, полученных с использованием смесительного элемента Y-типа с внутренним диаметром 2,4 мм при различных скоростях потока.
Фиг. 15 показывает корреляцию размера частиц и концентрации РНК при образовании липоплексов. Измерение PCS проводили до замораживания.
Фиг. 16 показывает корреляцию характеристик частиц и концентрации РНК при образовании липоплексов после трех циклов замораживания-оттаивания.
Фиг. 17 показывает корреляцию характеристик частиц и соотношения зарядов (положительный:отрицательный) в диапазоне от 1,0:2,0 до 2,1:2,0.
Фиг. 18 показывает соотношение характеристик частиц и соотношения зарядов (положительный:отрицательный) в диапазоне от 2,0:1,0 до 5,0:1,0.
Фиг. 19 показывает корреляцию характеристик частиц и концентрации NaCl при образовании липоплексов.
Фиг. 20 показывает корреляцию биологической активности и концентрации NaCl при образовании липоплексов.
Фиг. 21 показывает измерения целостности РНК в композициях РНК(LIP) без криопротектора с использованием различных буферных веществ (HEPES; Na-ацетат; Na-фосфат; Na-карбонат) при нескольких значениях рН после ускоренного хранения при +40°С. Различные столбики указывают на увеличение сроков хранения слева (3 дня) направо (21 день).
Фиг. 22 показывает измерения целостности РНК в РНК-липоплексных составах с сахарозой в качестве крио протектора с использованием HEPES в качестве буферного вещества при нескольких значениях рН после ускоренного хранения при +40°С. Различные столбики указывают на увеличение сроков хранения слева (1 день) направо (21 день).
Фиг. 23 показывает целостность РНК в липоплексах, хранившихся при 40°С, с различным содержанием EDTA.
На фиг. 24 представлена общая диаграмма, показывающая, что концентрация NaCl и крио протектора была оптимизирована на каждой стадии.
Фиг. 25 показывает Z-среднее значение и полидисперсность для РНК-липоплексов, замороженных в присутствии возрастающих количеств альтернативных криопротекторов.
Фиг. 26 показывает количество субвидимых частиц ≥10 мкм в РНК-липоплексных составах, замороженных в присутствии возрастающих количеств альтернативных крио протекторов.
Фиг. 27 показывает измерения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих от 5 до 20% масс./об. сахарозы (ось X) и различные низкие концентрации NaCl, до и после замораживания при -30°С.
Фиг. 28 показывает измерения размеров частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих от 5 до 20% масс/об. дигидрата трегалозы (ось х) и различные низкие концентрации NaCl, до и после замораживания при -30°С.
Фиг. 29 показывает измерения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих 50 мМ NaCl и различные количества (% масс./об.) дигидрата трегалозы, после нескольких циклов замораживания-оттаивания.
Фиг. 30 показывает измерения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих 70 мМ NaCl и различные количества (% масс./об.) дигидрата трегалозы, после нескольких циклов замораживания-оттаивания.
Фиг. 31 показывает измерения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих 90 мМ NaCl и различные количества (% масс./об.) дигидрата трегалозы, после нескольких циклов замораживания-оттаивания.
Фиг. 32 показывает измерения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих от 5 до 20% масс./об. сахарозы и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -15°С в течение 8 месяцев. Различные столбики указывают на удлинение сроков хранения слева (0 месяцев) направо (8 месяцев). В случаях комбинаций сахароза/NaCl с менее чем 8 столбиками размер частиц превышал значения спецификации в двух следующих друг за другом временных точках, и анализ останавливали.
Фиг. 33 показывает измерения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих от 5 до 20% масс./об. сахарозы и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -30°С в течение 8 месяцев. Различные столбики указывают на увеличение сроков хранения слева (0 месяцев) направо (8 месяцев). В случаях комбинаций сахароза/NaCl с менее чем 8 столбиками размер частиц превышал значения спецификации в двух следующих друг за другом временных точках, и анализ останавливали.
Фиг. 34 показывает изменения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих от 5 до 20% масс./об. дигидрата трегалозы и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -15°С в течение 8 месяцев. Различные столбики указывают на увеличение сроков хранения слева (0 месяцев) направо (8 месяцев). В случаях комбинаций трегалоза/NaCl с менее чем 8 столбиками размер частиц превышал значения спецификации в двух следующих друг за другом временных точках, и анализ останавливали.
Фиг. 35 показывает изменения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих от 5 до 20% масс./об. дигидрата трегалозы и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -30°С в течение 8 месяцев. Различные столбики указывают на увеличение сроков хранения слева (0 месяцев) направо (8 месяцев). В случаях комбинаций трегалоза/NaCl с менее чем 8 столбиками размер частиц превышал значения спецификации в двух следующих друг за другом временных точках, и анализ останавливали.
Фиг. 36 показывает измерения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих 22% масс./об. сахарозы и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -20°С.
Фиг. 37 показывает измерения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих 22% масс/об. дигидрата трегалозы и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -20°С.
Фиг. 38 показывает измерения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих 22% масс./об. глюкозы и различные низкие концентрации NaCl, после хранения при -20°С.
Фиг. 39 показывает измерения размера частиц в РНК-липоплексных составах, содержащих 22% масс./об. глюкозы и 20 мМ NaCl, замороженных и хранящихся при температуре от -15 до -40°С.
Фиг. 40 показывает измерения размера частиц РНК-липоплексов, замороженных в композициях, содержащих комбинации криопротекторов, перечисленных в таблице 10, после хранения при -20°С.
Фиг. 41 показывает влияние концентрации трегалозы в РНК-липоплексных составах [РНК (лип)] составе после замораживания-оттаивания или после лиофильной сушки и восстановления.
Фиг. 42 показывает изменение размера частиц в лиофильно высушенных РНК (лип) составах, приготовленных в 22%-ной трегалозе после восстановления 0,9%-ным раствором NaCl или WFI (вода для инъекции).
Фиг. 43 показывает Luc-РНК in-vitro трансфекцию лиофильно высушенных РНК-липоплексных составов [РНК (лип)], приготовленных в 22%-ной трегалозе при различных концентрациях NaCl. Лиофильно высушенные образцы восстанавливали 0,9%-ным раствором NaCl (текстурированная колонка: контроль жидкости).
Фиг. 44 показывает Z-средний диаметр лиофильно высушенных РНК-липоплексных составов [РНК (лип)], приготовленных при различных соотношениях трегалоза/NaCl, хранившихся при от 2 до 8°С или при 25°С после восстановления 0,9%-ным раствором NaCl. Составы восстанавливали в первоначальном объеме после лиофильной сушки.
Фиг. 45 показывает целостность РНК (% полноразмерной РНК) лиофильно высушенного [РНК (лип)], приготовленного при различных соотношениях трегалоза/NaCl после восстановления 0,9%-ным раствором NaCl и хранения при от 2 до 8°С или при 25°С. Составы восстанавливали в первоначальном объеме после лиофильной сушки и разбавляли 1:1 0,9%-ным раствором NaCl для экспериментов с клеточными культурами (0,01 мг/мл РНК).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Хотя настоящее раскрытие подробно описано ниже, следует понимать, что данное раскрытие не ограничено конкретными описанными в данном документе методиками, протоколами и реагентами, поскольку они могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в данном документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего раскрытия, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области.
Предпочтительно, используемые в данном документе термины определены, как описано в «А multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. 
Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).
Практика настоящего раскрытия будет использовать, если не указано иное, обычные способы химии, биохимии, клеточной биологии, иммунологии и способы рекомбинантной ДНК, которые описаны в литературе в данной области (см., например, Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989).
Далее будут описаны элементы настоящего раскрытия. Данные элементы перечислены с конкретными вариантами осуществления, однако, следует понимать, что они могут комбинироваться любым образом и в любом количестве для создания дополнительных вариантов осуществления. Описанные по-разному примеры и варианты осуществления не должны рассматриваться как ограничение настоящего раскрытия только явно описанными вариантами осуществления. Следует понимать, что данное описание раскрывает и охватывает варианты осуществления, которые объединяют явно описанные варианты осуществления с любым количеством раскрытых элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов должны рассматриваться как раскрытые данным описанием, если контекст не указывает на иное.
Термин «около» означает около или почти, и в контексте числового значения или диапазона, изложенного в данном документе в одном варианте осуществления, означает ±20%, ±10%, ±5% или ±3% от указанного числового значения или утверждаемого диапазона.
Термины «a» и «an» и «the» и аналогичные ссылки, используемые в контексте описания раскрытия (особенно в контексте формулы изобретения), следует истолковывать как охватывающие как единственное, так и множественное число, если иное не указано в настоящем документе или явно противоречит контексту. Перечисление диапазонов значений в данном документе просто предназначено для того, чтобы служить кратким способом индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в диапазон. Если в данном документе не указано иное, каждое отдельное значение включается в описание, как если бы оно было отдельно указано в данном документе. Все способы, описанные в данном документе, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в данном документе или иное явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или выражений для обозначения примеров (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшей иллюстрации раскрытия и не ограничивает объем формулы изобретения. Ни один из языковых оборотов в данной спецификации не должен быть истолкован как указывающий на любой незаявленный элемент, существенный для практики раскрытия.
Если явно не указано иное, термин «содержащий» используется в контексте настоящего документа, чтобы указать, что дополнительные члены могут необязательно присутствовать в дополнение к членам списка, введенного посредством «содержащий». Однако, в качестве конкретного варианта осуществления настоящего раскрытия предполагается, что термин «содержащий» охватывает возможность отсутствия дополнительных элементов, то есть для целей данного варианта осуществления «содержащий» следует понимать как имеющий значение «состоящий из».
Несколько документов цитируются по всему тексту данной спецификации. Каждый из документов, процитированных в данном документе (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), будь то выше или ниже, настоящим полностью включен посредством ссылки. Ничто в настоящем документе не должно быть истолковано как признание того, что настоящее раскрытие не имело права предшествовать такому раскрытию.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Далее будут предоставлены определения, которые применяются ко всем аспектам настоящего раскрытия. Следующие термины имеют следующие значения, если не указано иное. Любые неопределенные термины имеют свои признанные в уровне техники значения. Термины, такие как «уменьшить» или «ингибировать», как они используются в данном документе, означают способность вызывать общее снижение уровня, например, на около 5% или более, около 10% или более, около 20% или более, около 50% или более, или около 75% или более. Термин «ингибировать» или подобные фразы подразумевают полное или по существу полное ингибирование, то есть снижение до нуля или по существу до нуля. Такие термины, как «увеличение» или «усиление» в одном варианте осуществления относятся к увеличению или усилению по меньшей мере на около 10%, по меньшей мере на около 20%, по меньшей мере на около 30%, по меньшей мере на около 40%, по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 80% или по меньшей мере на около 100%. Термин «физиологический рН», используемый в данном документе, относится к рН около 7,5.
Как используется в настоящем раскрытии, «% масс./об.» относится к массовому проценту по объему, который представляет собой единицу концентрации, измеряющей количество растворенного вещества в граммах (г), выраженное в процентах от общего объема раствора в миллилитрах (мл).
Термин «ионная сила» относится к математической зависимости между количеством различных видов ионных частиц в конкретном растворе и их соответствующими зарядами. Таким образом, ионная сила I математически представлена формулой
,
в которой с представляет собой молярную концентрацию конкретного ионного компонента и z представляет собой абсолютную величину его заряда. Сумма Σ берется по всем различным видам ионов (i) в растворе.
Согласно раскрытию, термин «ионная сила» в одном варианте осуществления относится к присутствию одновалентных ионов. Что касается присутствия двухвалентных ионов, в частности, двухвалентных катионов, их концентрация или эффективная концентрация (присутствие свободных ионов) из-за присутствия хелатирующих средств в одном варианте осуществления является достаточно низкой, чтобы предотвратить деградацию РНК. В одном варианте осуществления концентрация или эффективная концентрация двухвалентных ионов ниже каталитического уровня для гидролиза фосфодиэфирных связей между нуклеотидами РНК. В одном варианте осуществления концентрация свободных двухвалентных ионов составляет 20 мкМ или менее. В одном варианте осуществления свободные двухвалентные ионы отсутствуют или практически отсутствуют.
«Осмолялыюсть» относится к концентрации конкретного растворенного вещества, выраженной как количество осмолей растворенного вещества на килограмм растворителя. Число Рейнольдса представляет собой безразмерное число, которое можно вычислить, используя следующий формализм:
,
где ρ представляет собой плотность жидкости, ν представляет собой скорость жидкости, 1 представляет собой характерную длину (в данном документе внутренний диаметр смесительного элемента) и η представляет собой вязкость.
Термин «замораживание» относится к затвердеванию жидкости, обычно с отводом тепла. Термин «лиофилизирование» или «лиофилизация» относится к лиофильной сушке вещества путем его замораживания и последующего снижения окружающего давления, чтобы позволить замерзшей среде в веществе сублимироваться непосредственно из твердой фазы в газовую фазу.
Термин «распылительная сушка» относится к распылительной сушке вещества путем смешивания (нагретого) газа с жидкостью, которая разбрызгивается (распыляется) в сосуде (распылительная сушилка), где растворитель испаряется из образовавшихся капель, что приводит к сухому порошку.
Термин «криопротектор» относится к веществу, которое добавляют к составу для защиты активных ингредиентов на стадиях замораживания.
Термин «лиопротектор» относится к веществу, которое добавляют к составу для защиты активных ингредиентов на стадиях сушки.
Термин «восстановление» относится к добавлению растворителя, такого как вода, к высушенному продукту, чтобы вернуть его в жидкое состояние, такое как исходное жидкое состояние.
Термин «рекомбинантный» в контексте настоящего раскрытия означает «полученный посредством генной инженерии». В одном варианте осуществления «рекомбинантный объект» в контексте настоящего раскрытия не возникает естественным образом. Используемый в данном документе термин «встречающийся в природе» относится к тому факту, что объект можно найти в природе. Например, пептид или нуклеиновую кислоту, который присутствует в организме (включая вирусы) и может быть выделен из источника в природе и который не был преднамеренно изменен человеком в лаборатории, встречается в природе. Термин «найденный в природе» означает «присутствующий в природе» и включает известные объекты, а также объекты, которые еще не были обнаружены и/или изолированы от природы, но которые могут быть обнаружены и/или выделены в будущем из природного источника.
Термин «равновесная растворимость» относится к концентрации растворенного вещества, при которой скорость растворения растворенного вещества и скорость осаждения растворенного вещества из раствора одинаковы. В одном варианте осуществления термин относится к соответствующей концентрации при комнатной температуре.
Используемый в данном документе термин «комнатная температура» относится к температурам, превышающим 4°С, предпочтительно от около 15°С до около 40°С, от около 15°С до около 30°С, от около 15°С до около 24°С или от около 16°С до около 21°С. Такие температуры будут включать 14°С, 15°С, 16°С, 17°С, 18°С, 19°С, 20°C, 21°С и 22°С.
В контексте настоящего раскрытия термин «частица» относится к структурированному объекту, образованному молекулами или комплексами молекул. В одном варианте осуществления термин «частица» относится к микро- или наноразмерной структуре, такой как микро- или наноразмерная компактная структура.
В контексте настоящего раскрытия термин «РНК-липоплексная частица» относится к частице, которая содержит липид, в частности, катионный липид, и РНК. Электростатические взаимодействия между положительно заряженными липосомами и отрицательно заряженной РНК приводят к комплексообразованию и самопроизвольному образованию РНК-липоплексных частиц. Положительно заряженные липосомы обычно можно синтезировать с использованием катионного липида, такого как DOTMA, и дополнительных липидов, таких как DOPE. В одном варианте осуществления РНК-липоплексная частица представляет собой наночастицу.
Как используется в настоящем раскрытии, «наночастица» относится к частице, содержащей РНК и по меньшей мере один катионный липид и имеющей средний диаметр, подходящий для внутривенного введения.
Термин «средний диаметр» относится к среднему гидродинамическому диаметру частиц, измеренному способом динамического рассеяния света (dynamic light scattering, DLS) с анализом данных с использованием так называемого кумулянтного алгоритма, который в качестве результата дает так называемое Zсреднее с размерностью длины и индекс полидисперсности (PI), который является безразмерным (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp. 4814-4820, ISO 13321). В данном документе «средний диаметр», «диаметр» или «размер» для частиц используется синонимично с данным значением Zсреднее.
Термин «индекс полидисперсности» используется в данном документе как мера распределения по размерам ансамбля частиц, например, наночастиц. Индекс полидисперсности рассчитывают на основе измерений динамического рассеяния света с помощью так называемого кумулянтного анализа.
Используемый в данном документе термин «субвидимые частицы» относится к частицам, имеющим средний диаметр менее 100 микрометров (мкм). Количество субвидимых частиц может быть измерено с использованием затемнения светом, чтобы указать степень агрегации РНК-липоплексных частиц в настоящем раскрытии. В некоторых вариантах осуществления измеряется количество субвидимых частиц, имеющих средний диаметр, больше чем или равный 10 мкм. В других вариантах осуществления измеряется количество субвидимых частиц, имеющих средний диаметр, больше чем или равный 25 мкм.
Термин «способ этанольной инжекции» относится к способу, в котором этанольный раствор, содержащий липиды, быстро вводится в водный раствор через иглу. Данное действие диспергирует липиды по всему раствору и способствует образованию липидной структуры, например, образованию липидных пузырьков, такому как образование липосом. Как правило, РНК-липоплексные частицы, описанные в данном документе, можно получить путем добавления РНК к коллоидной дисперсии липосом. Используя способ этанольной инжекции, такая коллоидная дисперсия липосом в одном варианте осуществления получается следующим образом: этанольный раствор, содержащий липиды, такие как катионные липиды, такие как DOTMA, и дополнительные липиды, впрыскивают в водный раствор при перемешивании. В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы, описанные в данном документе, могут быть получены без стадии экструзии.
Термин «экструдирование» или «экструзия» относится к созданию частиц, имеющих фиксированный профиль поперечного сечения. В частности, данный термин относится к уменьшению размера частицы, посредством чего частица проталкивается через фильтры с определенными порами.
Диаметр РНК-липоплексных частиц
РНК-липоплексные частицы, описанные в данном документе, имеют средний диаметр, который в одном варианте осуществления составляет от около 200 нм до около 1000 нм, от около 200 нм до около 800 нм, от около 250 до около 700 нм, от около 400 до около 600 нм, от около 300 нм до около 500 нм или от около 350 нм до около 400 нм. В конкретных вариантах осуществления РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр около 200 нм, около 225 нм, около 250 нм, около 275 нм, около 300 нм, около 325 нм, около 350 нм, около 375 нм, около 400 нм, около 425 нм, около 450 нм, около 475 нм, около 500 нм, около 525 нм, около 550 нм, около 575 нм, около 600 нм, около 625 нм, около 650 нм, около 700 нм, около 725 нм, около 750 нм, около 775 нм, около 800 нм, около 825 нм, около 850 нм, около 875 нм, около 900 нм, около 925 нм, около 950 нм, около 975 нм или около 1000 нм. В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который находится в диапазоне от около 250 нм до около 700 нм. В другом варианте осуществления РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который находится в диапазоне от около 300 нм до около 500 нм. В типичном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр около 400 нм.
РНК-липоплексные частицы, описанные в данном документе, например, полученные способами, описанными в данном документе, проявляют индекс полидисперсности менее чем около 0,5, менее чем около 0,4 или менее чем около 0,3. Например, РНК-липоплексные частицы могут проявлять индекс полидисперсности в диапазоне от около 0,1 до около 0,3.
Липид
В одном варианте осуществления растворы липидов, липосомы и РНК-липоплексные частицы, описанные в данном документе, включают катионный липид. Используемый в данном документе термин «катионный липид» относится к липиду, имеющему суммарный положительный заряд. Катионные липиды связывают отрицательно заряженную РНК путем электростатического взаимодействия с липидной матрицей. Как правило, катионные липиды обладают липофильной частью, такой как стерол, ацильная или диацильная цепь, и головная группа липида обычно несет положительный заряд. Примеры катионных липидов включают, но не ограничиваются ими, 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA), диметилдиоктадециламмоний (DDAB); 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP); 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропан (DODAP); 1,2-диацилокси-3-диметиламмоний-пропаны; 1,2-диалкилокси-3-диметиламмоний-пропаны; диоктадецилдиметиламмонийхлорид (DODAC), 2,3-ди(тетрадекокси)пропил-(2-гидроксиэтил)диметилазан (DMRIE), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (DMEPC), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропан (DMTAP), 1,2-диолилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмонийбромид (DORIE) и 2,3-диолеоилокси-N-[2(спермин-карбоксамид)этил]-N,N-диметил-трифторацетат-1-пропанамиум трифторацетат (DOSPA). Предпочтительными являются DOTMA, DOTAP, DODAC и DOSPA. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один катионный липид представляет собой DOTMA и/или DOTAP.
Дополнительный липид может быть включен в состав для регулирования общего соотношения положительных и отрицательных зарядов и физической стабильности РНК-липоплексных частиц. В определенных вариантах осуществления дополнительный липид представляет собой нейтральный липид. Используемый в данном документе термин «нейтральный липид» относится к липиду с суммарным нулевым зарядом. Примеры нейтральных липидов включают, но не ограничиваются ими, 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, церамид, сфингомиелин, цефалин, холестерин и цереброзид. В конкретных вариантах осуществления второй липид представляет собой DOPE, холестерин и/или DOPC.
В некоторых вариантах осуществления РНК-липоплексные частицы включают как катионный липид, так и дополнительный липид. В типичном варианте осуществления катионный липид представляет собой DOTMA и дополнительный липид представляет собой DOPE. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, количество по меньшей мере одного катионного липида по сравнению с количеством по меньшей мере одного дополнительного липида может влиять на важные характеристики РНК-липоплексных частиц, такие как заряд, размер частиц, стабильность, тканевая селективность и биоактивность РНК. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления молярное соотношение по меньшей мере одного катионного липида и по меньшей мере одного дополнительного липида составляет от около 10:0 до около 1:9, от около 4:1 до около 1:2 или около 3:1 до 1:1. В конкретных вариантах осуществления молярное соотношение может составлять около 3:1, около 2,75:1, около 2,5:1, около 2,25:1, около 2:1, около 1,75:1, около 1,5:1, около 1,25:1 или около 1:1. В околом варианте осуществления молярное соотношение по меньшей мере одного катионного липида и по меньшей мере одного дополнительного липида составляет около 2:1.
РНК
В настоящем раскрытии термин «РНК» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая включает рибонуклеотидные остатки. В предпочтительных вариантах осуществления РНК содержит все рибонуклеотидные остатки или большинство рибонуклеотидных остатков. Используемый в данном документе термин «рибонуклеотид» относится к нуклеотиду с гидроксильной группой во 2'-положении β-D-рибофуранозильной группы. РНК включает, без ограничения, двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, выделенную РНК, такую как частично очищенная РНК, по существу чистая РНК, синтетическая РНК, рекомбинантно продуцируемая РНК, а также модифицированная РНК, которая отличается от встречающейся в природе РНК добавлением, делецией, заменой и/или изменением одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут относиться к добавлению ненуклеотидного материала к внутренним нуклеотидам РНК или к концу(ам) РНК. В данном документе также предполагается, что нуклеотиды в РНК могут быть нестандартными нуклеотидами, такими как химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Для настоящего раскрытия такие измененные РНК считаются аналогами встречающихся в природе РНК.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения РНК представляет собой РНК-мессенджер (мРНК), которая относится к РНК-транскрипту, который кодирует пептид или белок. Как установлено в данной области техники, мРНК обычно содержит 5'-нетранслируемый участок (5'-UTR), пептидную кодирующую область и 3'-нетранслируемый участок (3'-UTR). В некоторых вариантах осуществления РНК получают путем транскрипции in vitro или химического синтеза. В одном варианте осуществления мРНК получают путем транскрипции in vitro с использованием матрицы ДНК, где ДНК относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит дезоксирибонуклеотиды.
В одном варианте осуществления РНК представляет собой in vitro транскрибированную РНК (IVT-PHK) и может быть получена путем in vitro транскрипции соответствующей матрицы ДНК. Промотор для контроля транскрипции может быть любым промотором для любой РНК-полимеразы. ДНК-матрица для in vitro транскрипции может быть получена путем клонирования нуклеиновой кислоты, в частности, кДНК, и введения ее в подходящий вектор для транскрипции in vitro. кДНК может быть получена путем обратной транскрипции РНК.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения РНК в РНК-липоплексных композициях, описанных в данном документе, имеет концентрацию от около 0,01 мг/мл до около 1 мг/мл или от около 0,05 мг/мл до около 0,5 мг/мл. В конкретных вариантах осуществления РНК имеет концентрацию около 0,05 мг/мл, около 0,06 мг/мл, около 0,07 мг/мл, около 0,08 мг/мл, около 0,09 мг/мл, около 0,10 мг/мл, около 0,11 мг/мл, около 0,12 мг/мл, около 0,13 мг/мл, около 0,14 мг/мл, около 0,15 мг/мл, около 0,16 мг/мл, около 0,17 мг/мл, около 0,18 мг/мл, около 0,19 мг/мл, около 0,20 мг/мл, около 0,21 мг/мл, около 0,22 мг/мл, около 0,23 мг/мл, около 0,24 мг/мл, около 0,25 мг/мл, около 0,26 мг/мл, около 0,27 мг/мл, около 0,28 мг/мл, около 0,29 мг/мл, около 0,30 мг/мл, около 0,31 мг/мл, около 0,32 мг/мл, около 0,33 мг/мл, около 0,34 мг/мл, около 0,35 мг/мл, около 0,36 мг/мл, около 0,37 мг/мл, около 0,38 мг/мл, около 0,39 мг/мл, около 0,40 мг/мл, около 0,41 мг/мл, около 0,42 мг/мл, около 0,43 мг/мл, около 0,44 мг/мл, около 0,45 мг/мл, около 0,46 мг/мл, около 0,47 мг/мл, около 0,48 мг/мл, около 0,49 мг/мл или около 0,50 мг/мл. В типичном варианте осуществления РНК имеет концентрацию 0,05 мг/мл.
В одном варианте осуществления РНК может иметь модифицированные рибонуклеотиды. Примеры модифицированных рибонуклеотидов включают, без ограничения, 5-метилцитидин и псевдоуридин.
В некоторых вариантах осуществления РНК согласно настоящему раскрытию содержит 5'-кэп.В одном варианте осуществления РНК по настоящему изобретению не имеет 5'-кэпированных трифосфатов. В одном варианте осуществления РНК может быть модифицирована аналогом 5'-кэпа. Термин «5'-кэп» относится к структуре, обнаруженной на 5'-конце молекулы мРНК, и обычно состоит из гуанозинового нуклеотида, соединенного с мРНК через 5'-5'-трифосфатную связь. В одном варианте осуществления данный гуанозин метилируется в положении 7. Получение РНК, содержащей 5'-кэп или аналог 5'-кэпа, может быть достигнуто с помощью in vitro транскрипции, где 5'-кэп котранскрипционно экспрессируется в цепь РНК или может быть присоединен к РНК посттранскрипционно с использованием кэппирующих ферментов.
В некоторых вариантах осуществления РНК согласно настоящему раскрытию содержит 5'-UTR и/или 3'-UTR. Термин «нетранслируемая область» или «UTR» относится к области в молекуле ДНК, которая транскрибируется, но не транслируется в аминокислотную последовательность, или к соответствующей области в молекуле РНК, такой как молекула мРНК. Нетранслируемая область (UTR) может присутствовать 5' (в восходящем направлении) от открытой рамки считывания (5'-UTR) и/или 3' (в нисходящем направлении) от открытой рамки считывания (3'-UTR). 5'-UTR, если присутствует, расположена на 5'-конце, в восходящем направлении от стартового кодона кодирующей белок области. 5'-UTR находится в нисходящем направлении от 5'-кэпа (если имеется), например, непосредственно рядом с 5'-кэпом. 3'-UTR, если присутствует, расположена на 3'-конце, в нисходящем направлении от терминирующего кодона кодирующей белок области, но термин "3'-UTR" предпочтительно не включает хвостовую поли(А) последовательность. Таким образом, 3'-UTR находится перед поли(А) последовательностью (если присутствует), например, непосредственно примыкает к поли(А) последовательности.
В некоторых вариантах осуществления РНК согласно настоящему раскрытию содержит 3'-поли(А) последовательность. Термин «поли(А) последовательность» относится к последовательности остатков аденила (А), которая, как правило, локализована на 3'-конце молекулы РНК. Согласно раскрытию, в одном варианте осуществления поли (А) последовательность содержит по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 80 или по меньшей мере около 100 и до около 500, до около 400, до около 300, до около 200 или до около 150 нуклеотидов и, в частности, около 120 нуклеотидов.
В контексте настоящего раскрытия термин «транскрипция» относится к процессу, когда генетический код в последовательности ДНК транскрибируется в РНК. Впоследствии РНК может быть транслирована в пептид или белок.
Что касается РНК, термин «экспрессия» или «трансляция» относится к процессу в рибосомах клетки, посредством которого цепь мРНК направляет сборку последовательности аминокислот для получения пептида или белка.
В одном варианте осуществления после введения РНК-липоплексных частиц, описанных в данном документе, по меньшей мере часть РНК доставляется в клетку-мишень. В одном варианте осуществления по меньшей мере часть РНК доставляется в цитозоль клетки-мишени. В одном варианте осуществления РНК представляет собой РНК, кодирующую пептид или белок, и РНК транслируется клеткой-мишенью для получения пептида или белка. В одном варианте осуществления клетка-мишень представляет собой клетку селезенки. В одном варианте осуществления клетка-мишень представляет собой антигенпрезентирующую клетку, такую как профессиональная антигенпрезентирующая клетка в селезенке. В одном варианте осуществления клетка-мишень представляет собой дендритную клетку в селезенке. Таким образом, описанные в данном документе РНК-липоплексные частицы могут быть использованы для доставки РНК в такую клетку-мишень. Соответственно, настоящее раскрытие также относится к способу доставки РНК в клетку-мишень у субъекта, включающему введение РНК-липоплексных частиц, описанных в данном документе, субъекту. В одном варианте осуществления РНК доставляется в цитозоль клетки-мишени. В одном варианте осуществления РНК представляет собой РНК, кодирующую пептид или белок, и РНК транслируется клеткой-мишенью для получения пептида или белка.
В одном варианте осуществления РНК кодирует фармацевтически активный пептид или белок.
Согласно раскрытию термин «РНК кодирует» означает, что РНК, если она присутствует в соответствующей среде, например, в клетках ткани-мишени, может направлять сборку аминокислот для получения пептида или белка, который она кодирует во время процесса, трансляции. В одном варианте осуществления РНК способна взаимодействовать с механизмом клеточной трансляции, позволяющим трансляцию пептида или белка. Клетка может продуцировать кодированный пептид или белок внутриклеточно (например, в цитоплазме и/или в ядре), может секретировать кодированный пептид или белок, или может продуцировать его на поверхности.
Согласно раскрытию термин «пептид» включает олиго- и полипептиды и относится к веществам, которые включают около двух или более, около 3 или более, около 4 или более, около 6 или более, около 8 или более, около 10 или более около 13 или более, около 16 или более, около 20 или более и до около 50, около 100 или около 150 последовательных аминокислот, связанных друг с другом посредством пептидных связей. Термин «белок» относится к крупным пептидам, в частности, к пептидам, имеющим по меньшей мере около 151 аминокислот, но термины «пептид» и «белок» используются в данном документе обычно в качестве синонимов.
«Фармацевтически активный пептид или белок» оказывает положительное или преимущественное воздействие на состояние или болезненное состояние субъекта, когда предоставляется субъекту в терапевтически эффективном количестве. В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок обладает лечебными или паллиативными свойствами и может быть введен для улучшения, облегчения, смягчения, изменения хода, замедления наступления или уменьшения тяжести одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства. Фармацевтически активный пептид или белок может обладать профилактическими свойствами и может быть использован для отсрочки возникновения заболевания или для уменьшения тяжести такого заболевания или патологического состояния. Термин «фармацевтически активный пептид или белок» включает в себя целые белки или полипептиды и может также относиться к их фармацевтически активным фрагментам. Он также может включать фармацевтически активные аналоги пептида или белка.
Примеры фармацевтически активных белков включают, но не ограничиваются ими, цитокины и белки иммунной системы, такие как иммунологически активные соединения (например, интерлейкины, колонне стимулирующий фактор (CSF), грану лоцитарный колон иестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), эритропоэтин, фактор некроза опухоли (TNF), интерфероны, интегрины, адрессины, селетины, хоминг-рецепторы, рецепторы Т-клеток, иммуноглобулины, растворимые антигены главного комплекса гистосовместимости, иммунологически активные антигены, такие как бактериальные, паразитарные или вирусные антигены, аллергены, аутоантигены, антитела), гормоны (инсулин, гормон щитовидной железы, катехоламины, гонадотропины, трофические гормоны, пролактин, окситоцин, дофамин, бычий соматотропин, лептины и тому подобное), гормоны роста (например, человеческий гормон роста), факторы роста (например, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, инсулиноподобный фактор роста и тому подобное), рецепторы факторов роста, ферменты (тканевой активатор плазминогена, стрептокиназа, холестерин биосинтетический или деградирующий, стериодогенные ферменты, киназы, фосфодиэстеразы, метилазы, деметилазы, дегидрогеназы, целлюлазы, протеазы, липазы, фосфолипазы, ароматазы, цитохромы, аденилат- или гуанилатциклазы, нейрамидазы и тому подобное), рецепторы (рецепторы стероидных гормонов, пептидные рецепторы), связывающие белки (белки, связывающие гормон роста или факторы роста, и тому подобное), факторы транскрипции и трансляции, белки, подавляющие рост опухоли (например, белки, которые ингибируют ангиогенез), структурные белки (такие как коллаген, фиброин, фибриноген, эластин, тубулин, актин и миозин), белки крови (тромбин, сывороточный альбумин, фактор VII, фактор VIII, инсулин, фактор IХ, фактор X, активатор тканевого плазминогена, белок С, фактор фон Вилебранда, антитромбин III, глюкоцереброзидаза, эритропоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GCSF) или модифицированный фактор VIII, антикоагулянты и тому подобное. Термин «иммунологически активное соединение» относится к любому соединению, изменяющему иммунный ответ, например, путем индукции и/или подавления созревания иммунных клеток, индукции и/или подавления биосинтеза цитокинов и/или изменения гуморального иммунитета путем стимуляции выработки антител В-клетками. Иммунологически активные соединения обладают мощной иммуностимулирующей активностью, включая, но не ограничиваясь этим, противовирусную и противоопухолевую активность, а также могут подавлять другие аспекты иммунного ответа, например, смещая иммунный ответ от ТН2 иммунного ответа, что применимо для лечения широкого спектра заболеваний, опосредованных ТН2. Иммунологически активные соединения могут применяться в качестве вакцинных адъювантов.
В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок содержит один или несколько антигенов или один или несколько эпитопов, то есть введение пептида или белка субъекту вызывает иммунный ответ против одного или нескольких антигенов или одного или нескольких эпитопов у субъекта, который может быть терапевтическим или частично или полностью защитным.
Термин «антиген» относится к средству, содержащему эпитоп, против которого может генерироваться иммунный ответ. Термин «антиген» включает, в частности, белки и пептиды. В одном варианте осуществления антиген представлен клетками иммунной системы, такими как антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки или макрофаги. Антиген или его продукт процессинга, такой как эпитоп Т-клеток, в одном варианте осуществления связан с рецептором Т- или В-клеток или молекулой иммуноглобулина, такой как антитело. Соответственно, антиген или его продукт процессинга могут специфически реагировать с антителами или Т-лимфоцитами (Т-клетками). В одном варианте осуществления антиген представляет собой связанный с заболеванием антиген, такой как опухолевый антиген, вирусный антиген или бактериальный антиген, и эпитоп получают из такого антигена.
Термин «ассоциированный с заболеванием антиген» используется в самом широком смысле для обозначения любого антигена, связанного с заболеванием. Ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой молекулу, которая содержит эпитопы, которые будут стимулировать иммунную систему хозяина к выработке клеточного антигенспецифического иммунного ответа и/или гуморального ответа антител против заболевания. Следовательно, ассоциированный с заболеванием антиген или его эпитоп могут быть использованы в терапевтических целях. Ассоциированные с заболеванием антигены могут быть ассоциированы с инфекцией микробами, обычно микробными антигенами, или связаны с раком, обычно опухолями.
Термин «опухолевый антиген» относится к составляющей раковых клеток, которая может быть получена из цитоплазмы, поверхности клетки и ядра клетки. В частности, он относится к тем антигенам, которые продуцируются внутриклеточно или в качестве поверхностных антигенов на опухолевых клетках.
Термин «вирусный антиген» относится к любому вирусному компоненту, обладающему антигенными свойствами, т.е. способному вызывать иммунный ответ у индивидуума. Вирусный антиген может представлять собой вирусный рибонуклеопротеин или белок оболочки.
Термин «бактериальный антиген» относится к любому бактериальному компоненту, обладающему антигенными свойствами, т.е. способному вызывать иммунный ответ у индивидуума. Бактериальный антиген может быть получен из клеточной стенки или цитоплазматической мембраны бактерии.
Термин «эпитоп» относится к части или фрагменту молекулы, такой как антиген, который распознается иммунной системой. Например, эпитоп может распознаваться Т-клетками, В-клетками или антителами. Эпитоп антигена может включать непрерывную или прерывистую часть антигена и может иметь длину от около 5 до около 100 аминокислот. В одном варианте осуществления длина эпитопа составляет от около 10 до около 25 аминокислот. Термин «эпитоп» включает эпитопы Т-клеток.
Термин «эпитоп Т-клеток» относится к части или фрагменту белка, который распознается Т-клеткой, когда он представлен в контексте молекул МНС. Термин «главный комплекс гистосовместимости» и аббревиатура «МНС» включает молекулы МНС класса I и МНС класса II и относится к комплексу генов, который присутствует у всех позвоночных. Белки или молекулы МНС важны для передачи сигналов между лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками или больными клетками в иммунных реакциях, где белки или молекулы МНС связывают пептидные эпитопы и презентируют их для распознавания рецепторами Т-клеток на Т-клетках. Белки, кодируемые МНС, экспрессируются на поверхности клеток и отображают как Т-клетки, так и собственные антигены (пептидные фрагменты самой клетки) и несобственные антигены (например, фрагменты вторгающихся микроорганизмов). В случае комплексов МНС/пептид класса I связывающие пептиды обычно имеют длину от около 8 до 10 аминокислот, хотя более эффективными могут быть более длинные или более короткие пептиды. В случае комплексов МНС/пептид класса II связывающие пептиды обычно имеют длину от около 10 до около 25 аминокислот и, в частности, от около 13 до около 18 аминокислот, тогда как более длинные и короткие пептиды могут быть эффективными.
В определенных вариантах осуществления настоящего раскрытия РНК кодирует по меньшей мере один эпитоп. В определенных вариантах осуществления эпитоп происходит от опухолевого антигена. Опухолевый антиген может быть «стандартным» антигеном, который, как известно, экспрессируется при различных онкогенных заболеваниях. Опухолевый антиген также может представлять собой «неоантиген», который специфичен для опухоли индивидуума и ранее не распознавался иммунной системой. Неоантиген или неоэпитоп могут возникать в результате одной или нескольких специфичных для рака мутаций в геноме раковых клеток, приводящих к аминокислотным изменениям. Примеры опухолевых антигенов включают, без ограничения, р53, АРТ-4, BAGE, бета-катенин/m, Bcr-abL CAMEL, САР-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, СЕА, белки клеточной поверхности семейства клаудинов, такие как CLAUD FN-6, CLAUDIN-18.2 и CLAUDIN-12, c-MYC, СТ, Сур-В, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (или hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, предпочтительно MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE -A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A 10, MAGE-A 11 или MAGE-A 12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, протеиназу 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 или RU2, SAGE, SART-1 или SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPLm, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE, WT и WT-1.
Онкогенные мутации варьируются в зависимости от каждого человека. Таким образом, онкогенные мутации, которые кодируют новые эпитопы (неоэпитопы), представляют собой привлекательные мишени при разработке вакцинных композиций и иммунотерапии. Эффективность противоопухолевой иммунотерапии зависит от выбора специфичных для рака антигенов и эпитопов, способных индуцировать мощный иммунный ответ у хозяина. РНК может использоваться для доставки пациенту специфических для пациента опухолевых эпитопов. Дендритные клетки (DC), находящиеся в селезенке, представляют антигенпрезентирующие клетки, представляющие особый интерес для РНК-экспрессии иммуногенных эпитопов или антигенов, таких как опухолевые эпитопы. Было показано, что использование нескольких эпитопов способствует терапевтической эффективности в композициях противоопухолевой вакцины. Быстрое секвенирование опухолевого мутанома может обеспечить множественные эпитопы для индивидуализированных вакцин, которые могут кодироваться описанной в данном документе РНК, например, в виде одного полипептида, где эпитопы необязательно разделены линкерами. В определенных вариантах осуществления настоящего раскрытия РНК кодирует по меньшей мере один эпитоп, по меньшей мере два эпитопа, по меньшей мере три эпитопа, по меньшей мере четыре эпитопа, по меньшей мере пять эпитопов, по меньшей мере шесть эпитопов, по меньшей мере семь эпитопов, по меньшей мере восемь эпитопов, по меньшей мере девять эпитопов или по меньшей мере десять эпитопов. Иллюстративные варианты осуществления включают РНК, которая кодирует по меньшей мере пять эпитопов (называемых «пентатоп»), и РНК, которая кодирует по меньшей мере десять эпитопов (называемых «декатоп»).
Соотношение зарядов
Электрический заряд РНК-липоплексных частиц по настоящему изобретению представляет собой сумму электрических зарядов, присутствующих в по меньшей мере одном катионном липиде, и электрических зарядов, присутствующих в РНК. Соотношение зарядов представляет собой соотношение положительных зарядов, присутствующих в по меньшей мере одном катионном липиде, и отрицательных зарядов, присутствующих в РНК. Соотношение зарядов для положительных зарядов, присутствующих в по меньшей мере одном катионном липиде, и отрицательных зарядов, присутствующих в РНК, рассчитывается по следующему уравнению: соотношение зарядов = [(концентрация катионного липида (моль)) * (общее количество положительных зарядов в катионном липиде)] / [(концентрация РНК (моль)) * (общее количество отрицательных зарядов в РНК)]. Специалист в данной области может определить концентрацию РНК и количество по меньшей мере одного катионного липида обычными способами.
В первом варианте осуществления соотношение зарядов для положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах при физиологическом рН составляет от около 1,9:2 до около 1:2. В конкретных вариантах осуществления соотношение зарядов для положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах при физиологическом рН составляет около 1,9:2,0, около 1,8:2,0, около 1,7:2,0, около 1,6:2,0, около 1,5:2,0, около 1,4:2,0, около 1,3:2,0, около 1,2:2,0, около 1,1:2,0 или около 1:2,0. В одном варианте осуществления соотношение зарядов для положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах при физиологическом рН составляет 1,3:2,0. В другом варианте осуществления РНК-липоплексные частицы, описанные в настоящем документе, могут иметь равное количество положительных и отрицательных зарядов при физиологическом рН, давая РНК-липоплексные частицы с конечным нейтральным соотношением зарядов.
Во втором варианте осуществления при физиологическом рН соотношение зарядов для положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 6:1 до около 1,5:1. В конкретных вариантах осуществления соотношение зарядов для положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах при физиологическом рН составляет около 6,0:1,0, около 5,9:1,0, около 5,8:1,0, около 5,7:1,0, около 5,6:1,0, около 5,5:1,0, около 5,4:1,0, около 5,3:1,0, около 5,2:1,0, около 5,1:1,0, около 5,0:1,0, около 4,9:1,0, около 4,8:1,0, около 4,7:1,0, около 4,6:1,0, около 4,5:1,0, около 4,4:1,0, около 4,3:1,0, около 4,2:1,0, около 4,1:1,0, около 4,0:1,0, около 3,9:1,0, около 3,8:1,0, около 3,7:1,0, около 3,6:1,0, около 3,5:1,0, около 3,4:1,0, около 3,3:1,0, около 3,2:1,0, около 3,1:1,0, около 3,0:1,0, около 2,9:1,0, около 2,8:1,0, около 2,7:1,0, около 2,6:1,0, около 2,5:1,0, около 2,4:1,0, около 2,3:1,0, около 2,2:1,0, около 2,1:1,0, около 2,0:1,0, около 1,9:1,0, около 1,8:1,0, около 1,7:1,0, около 1,6:1,0 или около 1,5:1,0. Для иммунотерапии на основе РНК точное нацеливание на органы, такие как селезенка, необходимо, чтобы избежать аутоиммунного ответа в других органах и потенциальной токсичности. Согласно раскрытию, РНК может быть нацелена на разные клетки, ткани или органы.
Было обнаружено, что РНК-липоплексные частицы, имеющие соотношение зарядов согласно первому варианту осуществления, могут быть использованы для предпочтительного нацеливания на ткань селезенки или клетки селезенки, такие как антигенпрезентирующие клетки, в частности, дендритные клетки. Соответственно, в одном варианте осуществления после введения РНК-липоплексных частиц происходит накопление РНК и/или экспрессия РНК в селезенке. Таким образом, РНК-липоплексные частицы по изобретению могут быть использованы для экспрессии РНК в селезенке. В одном варианте осуществления после введения РНК-липоплексных частиц не происходит или по существу не происходит накопления РНК и/или экспрессии РНК в легких и/или печени. В одном варианте осуществления после введения РНК-липоплексных частиц происходит накопление РНК и/или экспрессия РНК в антигенпрезентирующих клетках, таких как профессиональные антигенпрезентирующие клетки в селезенке. Таким образом, РНК-липоплексные частицы по изобретению могут быть использованы для экспрессии РНК в таких антигенпрезентирующих клетках. В одном варианте осуществления антигенпрезентирующие клетки представляют собой дендритные клетки и/или макрофаги. Было обнаружено, что РНК-липоплексные частицы, имеющие соотношение зарядов согласно второму варианту осуществления, могут быть использованы для предпочтительного воздействия на легочную ткань или легочные клетки. Соответственно, в одном варианте осуществления после введения РНК-липоплексных частиц происходит накопление РНК и/или экспрессия РНК в легких. Таким образом, РНК-липоплексные частицы по изобретению могут быть использованы для экспрессии РНК в легких. Соответственно, если желательна экспрессия РНК в ткани, отличной от селезенки, в вариантах осуществления, описанных в данном документе в связи с соотношением зарядов согласно первому варианту осуществления, например, соотношением зарядов от около 1:2 до около 1,9:2, вместо соотношения зарядов согласно первому варианту осуществления может использоваться соотношение зарядов согласно второму варианту осуществления, например, соотношение заряда от около 6:1 до около 1,5:1. В данных и других вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, может использоваться РНК, отличная от РНК, кодирующей пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, например, РНК, кодирующая фармацевтически активный пептид или белок, как описано в настоящем документе. В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок представляет собой цитокин и/или предназначен для лечения рака легких.
Композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы
А. Соль и ионная сила
Согласно настоящему раскрытию, композиции, описанные в данном документе, могут содержать соли, такие как хлорид натрия. Не желая быть связанными какой-либо теорией, хлорид натрия функционирует в качестве агента ионной осмоляльности для предварительной подготовки РНК перед смешиванием по меньшей мере с одним катионным липидом. Некоторые варианты осуществления предусматривают в настоящем раскрытии органические или неорганические соли, альтернативные хлориду натрия. Альтернативные соли включают, без ограничения, хлорид калия, дикалийфосфат, монокалийфосфат, ацетат калия, бикарбонат калия, сульфат калия, ацетат калия, динатрийфосфат, фосфат натрия, ацетат натрия, бикарбонат натрия, сульфат натрия, ацетат натрия, хлорид лития, магний хлорид, фосфат магния, хлорид кальция и натриевые соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA).
Как правило, композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, описанные в данном документе, включают хлорид натрия в концентрации, которая предпочтительно находится в диапазоне от 0 мМ до 500 мМ, от около 5 мМ до около 400 мМ или от около 10 мМ до около 300 мМ. В одном варианте осуществления композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, включают ионную силу, соответствующую таким концентрациям хлорида натрия.
Как правило, композиции для РНК-липоплексных частиц и получаемые в результате образования РНК-липоплексных частиц из РНК и липосом, такие как описанные в данном документе, включают высокие концентрации хлорида натрия или включают высокую ионную силу. В одном варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию по меньшей мере 45 мМ. В одном варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию от около 45 мМ до около 300 мМ или от около 50 мМ до около 150 мМ. В одном варианте осуществления композиции включают ионную силу, соответствующую таким концентрациям хлорида натрия.
Как правило, композиции для хранения РНК-липоплексных частиц, например, для замораживания РНК-липоплексных частиц, такие как те, которые описаны в данном документе, включают низкие концентрации хлорида натрия или включают низкую ионную силу. В одном варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию от 0 мМ до около 50 мМ, от 0 мМ до около 40 мМ или от около 10 мМ до около 50 мМ. В конкретных вариантах осуществления хлорид натрия имеет концентрацию около 1 мМ, около 2 мМ, около 3 мМ, около 4 мМ, около 5 мМ, около 6 мМ, около 7 мМ, около 8 мМ, около 9 мМ, около 10 мМ, около 11 мМ, около 12 мМ, около 13 мМ, около 14 мМ, около 15 мМ, около 16 мМ, около 17 мМ, около 18 мМ, около 19 мМ, около 20 мМ, около 21 мМ, около 22 мМ, около 23 мМ, около 24 мМ, около 25 мМ, около 26 мМ, около 27 мМ, около 28 мМ, около 29 мМ, около 30 мМ, около 31 мМ, около 32 мМ, около 33 мМ, около 34 мМ, около 35 мМ, около 36 мМ, около 37 мМ, около 38 мМ, около 39 мМ, около 40 мМ, около 41 мМ, около 42 мМ, около 43 мМ, около 44 мМ, около 45 мМ, около 45 мМ, около 46 мМ, около 47 мМ, около 48 мМ, около 49 мМ или около 50 мМ. В предпочтительных вариантах осуществления хлорид натрия имеет концентрацию около 20 мМ, около 30 мМ или около 40 мМ. В одном околом варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию 20 мМ. В другом типичном варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию 30 мМ. В одном варианте осуществления композиции содержат ионную силу, соответствующую таким концентрациям хлорида натрия.
Как правило, композиции, полученные в результате оттаивания замороженных композиций РНК-липоплексных частиц и, при необходимости, регулирования осмоляльности и ионной силы путем добавления водной жидкости, включают высокие концентрации хлорида натрия или включают высокую ионную силу. В одном варианте осуществления хлорид натрия имеет концентрацию от около 50 мМ до около 300 мМ или от около 80 мМ до около 150 мМ. В одном варианте осуществления композиции включают ионную силу, соответствующую таким концентрациям хлорида натрия.
В. Стабилизатор
Композиции, описанные в данном документе, могут содержать стабилизатор, чтобы избежать существенной потери качества продукта и, в частности, существенной потери активности РНК во время замораживания, лиофилизации или распылительной сушки и хранения замороженной, лиофилизированной или высушенной распылением композиции. Такая композиция также упоминается как стабильная в настоящем документе. Обычно стабилизатор присутствует перед процессом замораживания, лиофилизации или распылительной сушки и сохраняется в полученном замороженном, лиофилизированной или лиофильно высушенном препарате. Его можно использовать для защиты РНК-липоплексных частиц во время замораживания, лиофилизации или распылительной сушки и хранения замороженного, лиофилизированного или лиофильно высушенного препарата, например, для уменьшения или предотвращения агрегации, коллапса частиц, деградации РНК и/или других типов повреждений.
В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой углевод. Термин «углевод» в том виде, как он используется в данном документе, относится к моносахаридам, дисахаридам, трисахаридам, олигосахаридам и полисахаридам и охватывает их. В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой моносахарид. Используемый в данном документе термин «моносахарид» относится к одной углеводной единице (например, простому сахару), которая не может быть гидролизована до более простых углеводных единиц. Типичные моносахаридные стабилизаторы включают глюкозу, фруктозу, галактозу, ксилозу, рибозу и тому подобное.
В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой дисахарид. Термин «дисахарид», используемый в данном документе, относится к соединению или химическому фрагменту, образованному 2 моносахаридными звеньями, которые связаны вместе через гликозидную связь, например, через 1-4 связи или 1-6 связи. Дисахарид может быть гидролизован до двух моносахаридов. Типичные дисахаридные стабилизаторы включают сахарозу, трегалозу, лактозу, мальтозу и тому подобное.
Термин «трисахарид» означает три сахара, связанные вместе для образования одной молекулы. Примеры трисахаридов включают рафинозу и мелезитозу.
В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой олигосахарид. Используемый в данном документе термин «олигосахарид» относится к соединению или химическому фрагменту, образованному от 3 до около 15, предпочтительно от 3 до около 10 моносахаридными звеньями, которые связаны вместе через гликозидные связи, например, через 1-4 связи или 1-6 связи, с образованием линейной, разветвленной или циклической структуры. Типичные стабилизаторы олигосахаридов включают циклодекстрины, рафинозу, мелезитозу, мальтотриозу, стахиозу, акарбозу и тому подобное. Олигосахарид может быть окисленным или восстановленным.
В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой циклический олигосахарид. Используемый в данном документе термин «циклический олигосахарид» относится к соединению или химическому фрагменту, образованному от 3 до 15, предпочтительно 6, 7, 8, 9 или 10 моносахаридными звеньями, которые связаны друг с другом через гликозидные связи, например, через 1-4 связи или 1-6 связи, с образованием циклической структуры. Типичные циклические олигосахаридные стабилизаторы включают циклические олигосахариды, которые представляют собой отдельные соединения, такие как α-циклодекстрин, β-циклодекстрин или γ-циклодекстрин. Другие типичные циклические олигосахаридные стабилизаторы включают соединения, которые включают циклодекстриновый фрагмент в более крупной молекулярной структуре, такой как полимер, который содержит циклический олигосахаридный фрагмент. Циклический олигосахарид может быть окисленным или восстановленным, например, окисленным до дикарбонильных форм. Используемый в данном документе термин «циклодекстриновый фрагмент» относится к радикалу циклодекстрина (например, α-, β- или γ-циклодекстрина), который включен или входит в состав более крупной молекулярной структуры, такой как полимер. Циклодекстриновый фрагмент может быть связан с одним или несколькими другими фрагментами напрямую или через необязательный линкер. Циклодекстриновый фрагмент может быть окислен или восстановлен, например, окислен до дикарбонильных форм.
Углеводные стабилизаторы, например, циклические олигосахаридные стабилизаторы, могут быть дериватизированными углеводами. Например, в одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой дериватизированный циклический олигосахарид, например, дериватизированный циклодекстрин, например, 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин, например, частично этерифицированные циклодекстрины (например, частично этерифицированные β-циклодекстрины).
Типичным стабилизатором является полисахарид. Используемый в данном документе термин «полисахарид» относится к соединению или химическому фрагменту, образованному по меньшей мере 16 моносахаридными звеньями, которые связаны друг с другом через гликозидные связи, например, через 1-4 связи или 1-6 связи, с образованием линейной разветвленной или циклической структуры, и включает полимеры, которые содержат полисахариды как часть их основной структуры. В основных цепях полисахарид может быть линейным или циклическим. Типичные полисахаридные стабилизаторы включают гликоген, амилазу, целлюлозу, декстран, мальтодекстрин и тому подобное. В одном варианте осуществления стабилизатор представляет собой сахарный спирт. Используемый в данном документе термин «сахарный спирт» относится к продуктам восстановления «сахаров» и указывает, что все атомы кислорода в простой молекуле сахарного спирта присутствуют в форме гидроксильных групп. Сахарные спирты являются «полиолами». Данный термин относится к химическим соединениям, содержащим три или более гидроксильных группы, и является синонимом другого обычного термина, многоатомного спирта. Примеры сахарных спиртов включают, но не ограничиваются ими, сорбит, маннит, мальтит, лактит, эритрит, глицерин, ксилит или инозит.
Согласно настоящему раскрытию обеспечиваются фармацевтические композиции, которые включают сахарозу в качестве стабилизатора. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, сахароза функционирует, способствуя криопротекции композиции, предотвращая тем самым агрегацию РНК-липоплексных частиц и поддерживая химическую и физическую стабильность композиции. Некоторые варианты осуществления предусматривают альтернативные стабилизаторы сахарозы в настоящем раскрытии. Альтернативные стабилизаторы включают, без ограничения, трегалозу, глюкозу, фруктозу, аргинин, глицерин, маннит, пролин, сорбит, глицин-бетаин и декстран. В конкретном варианте альтернативным стабилизатором сахарозы является трегалоза.
В одном варианте осуществления стабилизатор имеет концентрацию от около 5% (масс./об.) до около 35% (масс./об.) или от около 10% (масс./об.) до около 25% (масс./об.). В конкретных вариантах осуществления стабилизатор имеет концентрацию около 10% (масс./об.), около 11% (масс./об.), около 12% (масс./об.), около 13% (масс./об.), около 14% (масс./об.), около 15% (масс./об.), около 16% (масс./об.), около 17% (масс./об.), около 18% (масс./об.), около 19% (масс./об.) около 20% (масс./об.), около 21% (масс./об.), около 22% (масс./об.), около 23% (масс./об.), около 24% (масс./об.) или около 25% (масс./об.). В одном предпочтительном варианте осуществления стабилизатор имеет концентрацию от около 15% (масс./об.) до около 25% (масс./об.). В другом предпочтительном варианте осуществления стабилизатор имеет концентрацию от около 20% (масс./об.) до около 25% (масс./об.). В одном иллюстративном варианте осуществления концентрация стабилизатора составляет около 25% (масс./об.). В другом иллюстративном варианте осуществления концентрация стабилизатора составляет около 22% (масс./об.). В вариантах осуществления изобретения стабилизатором является сахароза или трегалоза. В варианте осуществления изобретения стабилизатором является сахароза. В варианте осуществления изобретения стабилизатором является трегалоза.
Согласно настоящему раскрытию, композиции РНК-липоплексных частиц, описанные в данном документе, имеют концентрацию стабилизатора, подходящую для стабильности композиции, в частности, для стабильности РНК-липоплексных частиц и для стабильности РНК.
С.рН и буфер
В соответствии с настоящим изобретением, композиции РНК-липоплексных частиц, описанные в настоящем документе, имеют рН, подходящий для стабильности РНК-липоплексных частиц и, в частности, для стабильности РНК. В одном варианте осуществления композиции РНК-липоплексных частиц, описанные в настоящем документе, имеют рН от около 5,7 до около 6,7. В конкретных вариантах осуществления композиции имеют рН около 5,7, около 5,8, около 5,9, около 6,0, около 6,1, около 6,2, около 6,3, около 6,4, около 6,5, около 6,6 или около 6,7.
Согласно настоящему раскрытию обеспечены композиции, которые включают буфер. Не желая быть связанными какой-либо теорией, использование буфера поддерживает рН композиции во время изготовления, хранения и применения композиции. В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия буфер может представлять собой бикарбонат натрия, мононатрийфосфат, динатрийфосфат, монокалийфосфат, дикалийфосфат, [трис(гидроксиметил)метиламино]пропансульфоновую кислоту (TAPS), 2-(бис(2-гидроксиэтил)амино)уксусную кислоту (Bicine), 2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол (Tris), N-(2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметил)этил)глицин (Tricine), 3-[[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино]-2-гидроксипропан-1-сульфоновую кислоту (TAPSO), 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновую кислоту (HEPES), 2-[[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино]этансульфоновую кислоту (TES), 1,4-пиперазиндиэтансульфоновую кислоту (PIPES), диметиларсиновую кислоту, 2-морфолин-4-илтансульфокислоту (MES), 3-морфолино-2-гидроксипропансульфокислоту (MOPSO) или фосфатно-солевой буфер (PBS). Другие подходящие буферы могут представлять собой уксусную кислоту в соли, лимонную кислоту в соли, борную кислоту в соли и фосфорную кислоту в соли.
В некоторых вариантах осуществления буфер имеет рН от около 5,7 до около 6,7. В конкретных вариантах осуществления буфер имеет рН около 5,7, около 5,8, около 5,9, около 6,0, около 6,1, около 6,2, около 6,3, около 6,4, около 6,5, около 6,6 или около 6,7. В одном варианте осуществления буфер представляет собой HEPES. В предпочтительном варианте осуществления HEPES имеет рН от около 5,7 до около 6,7. В конкретных вариантах осуществления HEPES имеет рН около 5,7, около 5,8, около 5,9, около 6,0, около 6,1, около 6,2, около 6,3, около 6,4, около 6,5, около 6,6 или около 6,7. В одном варианте осуществления HEPES имеет рН около 6,2.
В еще одном варианте осуществления буфер имеет концентрацию от около 2,5 мМ до около 10 мМ. В конкретных вариантах осуществления, где HEPES является буфером, концентрация HEPES составляет около 2,5 мМ, около 2,75 мМ, 3,0 мМ, около 3,25 мМ, около 3,5 мМ, около 3,75 мМ, около 4,0 мМ, около 4,25 мМ, около 4,5 мМ, около 4,75 мМ, около 5,0 мМ, около 5,25 мМ, около 5,5 мМ, около 5,75 мМ, около 6,0 мМ, около 6,25 мМ, около 6,5 мМ, около 6,75 мМ, около 7,0 мМ, около 7,25 мМ, около 7,5 мМ, около 7,75 мМ около 8,0 мМ, около 8,25 мМ, около 8,5 мМ, около 8,75 мМ, около 9,0 мМ, около 9,25 мМ, около 9,5 мМ, около 9,75 мМ или около 10,0 мМ. В предпочтительном варианте осуществления HEPES имеет концентрацию около 7,5 мМ.
D. Хелатирующий агент
Определенные варианты осуществления настоящего раскрытия предусматривают использование хелатирующего агента. Хелатирующие агенты относятся к химическим соединениям, которые способны образовывать по меньшей мере две координатные ковалентные связи с ионом металла, тем самым образуя стабильный водорастворимый комплекс. Не желая быть связанными какой-либо теорией, хелатирующие агенты снижают концентрацию свободных двухвалентных ионов, что, в противном случае, может вызвать ускоренное разложение РНК в настоящем раскрытии. Примеры подходящих хелатирующих агентов включают, без ограничения, этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), соль EDTA, десферриоксамин В, дефероксамин, дитиокарбат натрия, пеницилламин, пентетат кальция, натриевую соль пентетиновой кислоты, сукцимер, триентин, нитрилотриуксусную кислоту, транс-диаминоциклогексантетрауксусную кислоту (DCTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), бис(аминоэтил)гликольэфир-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту, иминодиуксусную кислоту, лимонную кислоту, винную кислоту, фумаровую кислоту или их соли. В определенных вариантах осуществления хелатирующий агент представляет собой EDTA или соль EDTA. В типичном варианте осуществления хелатирующий агент представляет собой динатрийгидрат EDTA.
В некоторых вариантах осуществления EDTA имеет концентрацию от около 0,25 мМ до около 5 мМ. В конкретных вариантах осуществления EDTA имеет концентрацию около 0,25 мМ, около 0,3 мМ, около 0,4 мМ, около 0,5 мМ, около 0,6 мМ, около 0,7 мМ, около 0,8 мМ, около 0,9 мМ, около 1,0 мМ, около 1,1 мМ, около 1,2 мМ, около 1,3 мМ, около 1,4 мМ, около 1,5 мМ, около 1,6 мМ, около 1,7 мМ, около 1,8 мМ, около 1,9 мМ, около 2,0 мМ, около 2,1 мМ, около 2,2 мМ, около 2,3 мМ. около 2,4 мМ, около 2,5 мМ, около 2,6 мМ, около 2,7 мМ, около 2,8 мМ, около 2,9 мМ, около 3,0 мМ, около 3,1 мМ, около 3,2 мМ, около 3,3 мМ, около 3,4 мМ, около 3,5 мМ, около 3,5 мМ, около 3,6 мМ, около 3,7 мМ, около 3,8 мМ, около 3,9 мМ, около 4,0 мМ, около 4,1 мМ, около 4,2 мМ, около 4,3 мМ, около 4,4 мМ, около 4,5 мМ, около 4,6 мМ, около 4,7 мМ, около 4,8 мМ, около 4,9 мМ или около 5,0 мМ. В предпочтительном варианте осуществления EDTA имеет концентрацию около 2,5 мМ.
E. Примерные композиции по изобретению
В одном типичном варианте осуществления композиция РНК-липоплексных частиц содержит DOTMA и DOPE в молярном соотношении от около 2:1 до около 1:1 и РНК в концентрации около 0,05 мг/мл, которая кодирует по меньшей мере один эпитоп, где при физиологическом рН соотношение зарядов для положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет около 1,3:2,0; хлорид натрия в концентрации около 20 мМ; сахарозу в концентрации около 22% (масс./об.); HEPES в концентрации около 7,5 мМ с рН около 6,2; и EDTA в концентрации около 2,5 мМ. В дополнительных конкретных вариантах осуществления РНК кодирует пять эпитопов или десять эпитопов.
В другом типичном варианте осуществления композиция РНК-липоплексных частиц содержит DOTMA и DOPE в молярном соотношении от около 2:1 до около 1:1 и РНК в концентрации около 0,05 мг/мл, которая кодирует по меньшей мере один эпитоп, где при физиологическом рН соотношение зарядов для положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет около 1,3:2,0; хлорид натрия в концентрации около 30 мМ; сахарозу в концентрации около 20% (масс./об.); HEPES в концентрации около 7,5 мМ с рН около 6,2; и EDTA в концентрации около 2,5 мМ. В дополнительных конкретных вариантах осуществления РНК кодирует пять эпитопов или десять эпитопов.
F. Стабильность композиций по изобретению
Используемый в данном документе термин «стабильный» относится к композиции, в которой измеренные значения для различных физико-химических параметров находятся в определенном диапазоне. В одном варианте осуществления композицию анализируют для оценки стабильности согласно различным параметрам. Согласно настоящему раскрытию, параметры стабильности включают, без ограничения, средний диаметр РНК-липоплексных частиц, индекс полидисперсности, целостность РНК, содержание РНК, рН, осмоляльность и количество субвидимых частиц. Специалист в данной области техники сможет измерить такие параметры, используя обычные лабораторные способы и инструменты. Например, параметры стабильности могут быть оценены с использованием динамического рассеяния света (DLS), затемнения света, спектрометрии, электрофореза в агарозном геле, биоанализатора или любого другого подходящего способа. В одном варианте осуществления биоанализатор представляет собой биоанализатор Agilent 2100 (Agilent Technologies), способный измерять как целостность РНК, так и содержание РНК. В одном варианте осуществления биоанализатор представляет собой Fragment Analyzer фирмы Advanced Analytical.
Не желая быть связанными теорией, измерения DLS применимы для анализа параметров, связанных с РНК-липоплексными частицами по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления DLS можно использовать для определения среднего диаметра РНК-липоплексных частиц, который выражается в единицах Z-avg (показатель для среднего размера частиц). В другом варианте осуществления DLS можно использовать для определения индекса полидисперсности РНК-липоплексных частиц, который указывает на размер и распределение массы РНК-липоплексных частиц.
В определенных вариантах осуществления композиция является стабильной, когда измерения параметров стабильности находятся в пределах определенного диапазона. В одном варианте осуществления стабильной композиции РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который отличается от исходного среднего диаметра (то есть среднего диаметра до замораживания, лиофильной сушки или распылительной сушки и оттаивания или восстановления) не более чем на ±20%, ±10%, ±5% или ±3% после хранения, например, после хранения при температуре от около -15°С до около -40°С. В одном варианте осуществления стабильной композиции РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который не превышает 20%, 10%, 5% или 3% по сравнению с исходным средним диаметром (то есть средним диаметром до замораживания, лиофильной сушки или распылительной сушки и оттаивания или восстановления) после хранения, например, после хранения при температуре от около -15°С до около -40°С. В другом варианте осуществления стабильной композиции РНК-липоплексные частицы имеют индекс полидисперсности, который отличается от исходного индекса полидисперсности (то есть индекса полидисперсности до замораживания, лиофильной сушки или распылительной сушки и оттаивания или восстановления) не более чем на ±20%, ±10%, ±5% или ±3% после хранения, например, после хранения при температуре от около -15°С до около -40°С. В одном варианте осуществления стабильная композиция имеет не более 6000 субвидимых частиц с диаметром, превышающим или равным 10 мкм, после хранения, например, после хранения при температуре от около -15°С до около -40°С. В одном варианте осуществления стабильная композиция имеет не более 600 субвидимых частиц с диаметром, превышающим или равным 25 мкм, после хранения, например, после хранения при температуре от около -15°С до около -40°С.
В одном варианте осуществления стабильной композиции целостность РНК составляет по меньшей мере 80 процентов после хранения, например, после хранения при температуре от около -15°С до около -40°С.
В одном варианте осуществления композиция является стабильной при температуре хранения от около -15°С до около -40°С. В конкретных вариантах осуществления композиция является стабильной при температуре около -15°С, около -16°С, около -17°С, около -18°С, около -19°С, около -20°С, около - 21°С, около -22°С, около -23°С, около -24°С, около -25°С, около -26°С, около -27°С, около -28°С, около -29°С С, около -30°С, около -31°С, около -32°С, около -33°С, около -34°С, около -35°С, около -36°С, около -37°С, около -38°С, около -39°С или около -40°С. В предпочтительном варианте осуществления композиция является стабильной при температуре около -15°С, около -20°С, около -30°С или около -40°С.
В одном варианте осуществления композиция является стабильной при температуре от около -15°С до около -40°С, когда фармацевтическая композиция защищена от света. В предпочтительном варианте осуществления композиция является стабильной при температуре от около -15 до около -25°С, когда композиция защищена от света. В одном варианте осуществления композиция является стабильной при температуре от около -15°С до около -40°С в течение по меньшей мере от 1 месяца до около 24 месяцев. В конкретных вариантах осуществления композиция является стабильной при температуре от около -15°С до около -40°С в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 13 месяцев, по меньшей мере 14 месяцев, по меньшей мере 15 месяцев, в по меньшей мере 16 месяцев, по меньшей мере 17 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 19 месяцев, по меньшей мере 20 месяцев, по меньшей мере 21 месяца, по меньшей мере 22 месяцев, по меньшей мере 23 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев, по меньшей мере 25 месяцев, по меньшей мере 26 месяцев, по меньшей мере 27 месяцев, по меньшей мере 28 месяцев, по меньшей мере 29 месяцев, по меньшей мере 30 месяцев, по меньшей мере 31 месяца, по меньшей мере 32 месяцев, по меньшей мере 33 месяцев, по меньшей мере 34 месяцев, по меньшей мере 35 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев.
В предпочтительном варианте осуществления композиция является стабильной при температуре около -15°С в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев или по меньшей мере 6 месяцев.
В другом предпочтительном варианте осуществления композиция является стабильной при температуре около -20°С в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев или по меньшей мере 6 месяцев.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления композиция является стабильной при температуре около -30°С в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев или по меньшей мере 6 месяцев.
В одном варианте осуществления композиция является стабильной после замораживания при температуре от около -15°С до около -40°С и оттаивания до температуры от около 4°С до около 25°С (температура окружающей среды). В другом варианте осуществления композиция является стабильной после замораживания при температуре от около -15°С до около -40°С и оттаивания до температуры от около 4°С до около 25°С (температура окружающей среды) в многочисленных циклах замораживания-оттаивания.
G. Физическое состояние композиций по изобретению
В вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению представляет собой жидкость или твердое вещество. Неограничивающие примеры твердого вещества включают замороженную форму или лиофилизированную форму. В предпочтительном варианте осуществления композиция представляет собой жидкость.
Фармацевтические композиции по изобретению
Композиции, содержащие РНК-липоплексные частицы, описанные в данном документе, применимы в качестве или для приготовления фармацевтических композиций или лекарственных средств для терапевтического или профилактического лечения. Частицы по настоящему изобретению могут быть введены в виде любой подходящей фармацевтической композиции.
Термин «фармацевтическая композиция» относится к составу, содержащему терапевтически эффективное средство, предпочтительно, вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или вспомогательными веществами. Указанная фармацевтическая композиция применима для лечения, предотвращения или уменьшения тяжести заболевания или расстройства путем введения указанной фармацевтической композиции субъекту. Фармацевтическая композиция также известна в данной области техники как фармацевтический состав. В контексте настоящего раскрытия фармацевтическая композиция содержит РНК-липоплексные частицы, как описано в данном документе.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно содержат один или несколько адъювантов или могут вводиться с одним или несколькими адъювантами. Термин «адъювант» относится к соединению, которое продлевает, усиливает или ускоряет иммунный ответ. Адъюванты включают гетерогенную группу соединений, таких как масляные эмульсии (например, адъюванты Фрейнда), минеральные соединения (такие как квасцы), бактериальные продукты (такие как токсин Bordetella pertussis) или иммуностимулирующие комплексы. Примеры адъювантов включают, без ограничения, LPS, GP96, CpG-олигодезоксинуклеотиды, факторы роста и цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины, хемокины. Хемокины могут представлять собой IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INFa, INF-γ, GM-CSF, LT-a. Другими известными адъювантами являются гидроксид алюминия, адъювант Фрейнда или масло, такое как Montanide® ISA51. Другие подходящие адъюванты для применения в настоящем раскрытии включают липопептиды, такие как Pam3Cys.
Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением обычно применяются в «фармацевтически эффективном количестве» и в «фармацевтически приемлемом препарате».
Термин «фармацевтически приемлемый» относится к нетоксичности материала, который не взаимодействует с действием активного компонента фармацевтической композиции. Термин «фармацевтически эффективное количество» относится к количеству, которое достигает желаемой реакции или желаемого эффекта отдельно или вместе с дополнительными дозами. В случае лечения конкретного заболевания желаемая реакция предпочтительно относится к ингибированию течения заболевания. Это включает в себя замедление развития заболевания и, в частности, прерывание или изменение хода заболевания. Желаемой реакцией при лечении заболевания может быть также задержка начала или предотвращение начала указанного заболевания или указанного состояния. Эффективное количество частиц или композиций, описанных в данном документе, будет зависеть от состояния, подлежащего лечению, степени тяжести заболевания, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физиологическое состояние, размер и вес, продолжительность лечения, тип сопутствующей терапии (если имеется), конкретный путь введения и подобные факторы. Соответственно, дозы, вводимые частицами или композициями, описанными в данном документе, могут зависеть от различных таких параметров. В случае, когда реакция у пациента недостаточна с начальной дозой, могут использоваться более высокие дозы (или эффективно более высокие дозы, достигаемые другим, более локализованным путем введения).
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать соли, буферы, консерванты и, необязательно, другие терапевтические средства. В одном варианте осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или вспомогательных веществ.
Подходящие консерванты для применения в фармацевтических композициях по настоящему изобретению включают, без ограничения, бензалконийхлорид, хлорбутанол, парабен и тимеросал.
Используемый в данном документе термин «вспомогательное вещество» относится к веществу, которое может присутствовать в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, но не является активным ингредиентом. Примеры вспомогательных веществ включают, без ограничения, носители, связующие, разбавители, смазывающие вещества, загустители, поверхностно-активные вещества, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферы, ароматизаторы или красители.
Термин «разбавитель» относится к разбавителю и/или разбавителю. Кроме того, термин «разбавитель» включает любую одну или несколько жидких, жидких или твердых суспензий и/или смесительных сред. Примеры подходящих разбавителей включают этанол, глицерин и воду.
Термин «носитель» относится к компоненту, который может быть природным, синтетическим, органическим, неорганическим, с которым активный компонент объединен для облегчения, улучшения или обеспечения возможности введения фармацевтической композиции. Используемый в данном документе носитель может представлять собой один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые подходят для введения субъекту. Подходящий носитель включает, без ограничения, стерильную воду, раствор Рингера, лактат Рингера, стерильный раствор хлорида натрия, изотонический солевой раствор, полиалкиленгликоли, гидрированные нафталины и, в частности, биосовместимые лактидные полимеры, лактид/гликолидные сополимеры или полиоксиэтилен/полиоксипропиленовые сополимеры. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает изотонический солевой раствор.
Фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985).
Фармацевтические носители, вспомогательные вещества или разбавители могут быть выбраны с учетом предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практики.
Пути введения фармацевтических композиций по изобретению
В одном варианте осуществления фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут вводиться внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутрикожно или внутримышечно. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция составлена для местного введения или системного введения. Системное введение может включать энтеральное введение, которое включает всасывание через желудочно-кишечный тракт или парентеральное введение. Используемый в данном документе термин «парентеральное введение» относится к введению любым способом, отличным от способа через желудочно-кишечный тракт, например, путем внутривенной инъекции. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции составлены для системного введения. В другом предпочтительном варианте осуществления системное введение представляет собой внутривенное введение.
Изготовляемые изделия
В одном аспекте РНК-липоплексные частицы, описанные в данном документе, присутствуют в фармацевтической композиции. В другом аспекте композиция, описанная в настоящем документе, представляет собой фармацевтическую композицию. В одном аспекте раскрытие относится к флакону, содержащему фармацевтическую композицию, описанную в данном документе. В другом аспекте раскрытие относится к шприцу, содержащему фармацевтическую композицию, описанную в данном документе.
Применение фармацевтических композиций по изобретению
Описанные в данном документе РНК-липоплексные частицы могут применяться в терапевтическом или профилактическом лечении различных заболеваний, в частности, заболеваний, когда предоставление пептида или белка субъекту приводит к терапевтическому или профилактическому эффекту. Например, предоставление антигена или эпитопа, который получен из вируса, может быть применимым в лечении вирусного заболевания, вызванного указанным вирусом. Предоставление опухолевого антигена или эпитопа может быть применимым в лечении ракового заболевания, при котором раковые клетки экспрессируют указанный опухолевый антиген.
Термин «заболевание» относится к анормальному состоянию, которое влияет на организм человека. Заболевание часто рассматривается как медицинское состояние, связанное с конкретными симптомами и признаками. Заболевание может быть вызвано факторами, происходящими из внешнего источника, такими как инфекционные заболевания, или оно может быть вызвано внутренними дисфункциями, такими как аутоиммунные заболевания. У людей «заболевание» часто используется более широко для обозначения любого состояния, которое вызывает боль, дисфункцию, дистресс, социальные проблемы или смерть для пострадавшего человека, или аналогичные проблемы для тех, кто находится в контакте с человеком. В данном более широком смысле оно иногда включает травмы, инвалидность, расстройства, синдромы, инфекции, отдельные симптомы, отклоняющееся поведение и нетипичные изменения структуры и функции, в то время как в других контекстах и для других целей они могут считаться различимыми категориями. Заболевания, как правило, поражают людей не только физически, но и эмоционально, так как заражение и жизнь со многими заболеваниями могут изменить взгляд на жизнь и личность человека.
В настоящем контексте термин «лечение», «лечить» или «терапевтическое вмешательство» относится к ведению и уходу за субъектом с целью борьбы с таким состоянием, как заболевание или нарушение. Предполагается, что данный термин включает в себя полный спектр способов лечения данного состояния, от которого страдает субъект, например, введение терапевтически эффективного соединения для ослабления симптомов или осложнений, для отсрочки прогрессирования заболевания, нарушения или состояния, для облегчения или ослабления симптомов и осложнений и/или лечения или устранения заболевания, нарушения или состояния, а также предотвращения состояния, при этом предотвращение должно пониматься как ведение и уход за человеком с целью борьбы с заболеванием, состоянием или нарушением и включает введение активных соединений для предотвращения появления симптомов или осложнений.
Термин «терапевтическое лечение» относится к любому лечению, которое улучшает состояние здоровья и/или продлевает (увеличивает) продолжительность жизни индивидуума. Указанное лечение может устранить заболевание у индивидуума, остановить или замедлить развитие заболевания у индивидуума, тормозить или замедлить развитие заболевания у индивидуума, уменьшить частоту или тяжесть симптомов у индивидуума и/или уменьшить рецидив у индивидуума, который в настоящее время имеет или который ранее имел заболевание.
Термины «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» относятся к любому лечению, которое предназначено для предотвращения возникновения заболевания у индивидуума. Термины «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» используются в данном документе взаимозаменяемо.
Термины «индивидуум» и «субъект» используются в данном документе взаимозаменяемо. Они относятся к человеку или другому млекопитающему (например, мыши, крысе, кролику, собаке, кошке, крупному рогатому скоту, свинье, овце, лошади или примату), которые могут быть поражены или подвержены заболеванию или нарушению (например, раку), но могут иметь или могут не иметь заболевания или нарушения. Во многих вариантах осуществления индивидуум представляет собой человека. Если не указано иное, термины «индивидуум» и «субъект» не обозначают конкретный возраст и, следовательно, охватывают взрослых, пожилых людей, детей и новорожденных. В вариантах осуществления настоящего раскрытия «индивидуум» или «субъект» является «пациентом».
Термин «пациент» означает индивидуума или субъекта для лечения, в частности, больного индивидуума или субъекта.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения цель состоит в том, чтобы обеспечить иммунный ответ против больных клеток, экспрессирующих антиген, такой как раковые клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, и лечить заболевание, такое как заболевание раком, вовлекающее клетки, экспрессирующие антиген, такой как опухолевый антиген.
Фармацевтическая композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы, как описано в данном документе, включающая РНК, кодирующую пептид или белок, который содержит один или несколько антигенов или один или несколько эпитопов, может быть введена субъекту для вызывания иммунного ответа против одного или нескольких антигенов или одного или нескольких эпитопов у субъекта, который может быть терапевтическим или частично или полностью защитным. Специалист в данной области техники должен знать, что один из принципов иммунотерапии и вакцинации основан на том факте, что иммунопротективная реакция на заболевание возникает путем иммунизации субъекта антигеном или эпитопом, который иммунологически релевантен в отношении заболевания, подлежащего лечению. Соответственно, фармацевтические композиции, описанные в данном документе, применимы для индукции или усиления иммунного ответа. Таким образом, описанные в данном документе фармацевтические композиции применимы для профилактического и/или терапевтического лечения заболевания, включающего антиген или эпитоп.
Используемый в данном документе термин «иммунный ответ» относится к интегрированному ответу тела на антиген или клетку, экспрессирующую антиген, и относится к клеточному иммунному ответу и/или гуморальному иммунному ответу. Клеточный иммунный ответ включает, без ограничения, клеточный ответ, направленный на клетки, экспрессирующие антиген и характеризующиеся презентацией антигена с молекулой МНС класса I или класса II. Клеточный ответ относится к Т-лимфоцитам, которые могут быть классифицированы как вспомогательные Т-клетки (также называемые CD4+ Т-клетками), которые играют центральную роль, регулируя иммунный ответ, или клетки-киллеры (также называемые цитотоксическими Т-клетками, CD8+ Т-клетками или CTL), которые вызывают апоптоз в инфицированных клетках или раковых клетках. В одном варианте осуществления введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению включает стимуляцию противоопухолевого ответа CD8+ Т-клеток против раковых клеток, экспрессирующих один или несколько опухолевых антигенов. В конкретном варианте осуществления опухолевые антигены представлены молекулой МНС класса I.
Настоящее раскрытие предусматривает иммунный ответ, который может быть защитным, профилактическим, профилактическим и/или терапевтическим. Используемый в данном документе термин «индуцирует [или индуцирующий] иммунный ответ» может указывать на то, что до индукции не было никакого иммунного ответа против конкретного антигена, или может указывать на то, что до индукции был базовый уровень иммунного ответа против конкретного антигена, который был усиливается после индукции. Следовательно, «индуцирует [или индуцирующий] иммунный ответ» включает «усиливает [или усиливающий] иммунный ответ».
Термин «иммунотерапия» относится к лечению заболевания или состояния путем индукции или усиления иммунного ответа. Термин «иммунотерапия» включает антигенную иммунизацию или антигенную вакцинацию.
Термины «иммунизация» или «вакцинация» описывают процесс введения антигена индивидууму с целью индукции иммунного ответа, например, по терапевтическим или профилактическим причинам.
В одном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает варианты осуществления, в которых вводятся РНК-липоплексные частицы, как описано в настоящем документе, нацеленные на ткань селезенки. РНК кодирует пептид или белок, содержащий антиген или эпитоп, как описано, например, в данном документе. РНК поглощается антигенпрезентирующими клетками селезенки, такими как дендритные клетки, для экспрессии пептида или белка. После необязательного процессинга и презентации антигенпрезентирующими клетками может быть выработан иммунный ответ против антигена или эпитопа, что приводит к профилактическому и/или терапевтическому лечению заболевания с участием антигена или эпитопа. В одном варианте осуществления иммунный ответ, индуцированный РНК-липоплексными частицами, описанными в данном документе, включает презентацию антигена или его фрагмента, такого как эпитоп, антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки и/или макрофаги, и активацию цитотоксических Т-клеток вследствие данной презентации. Например, пептиды или белки, кодируемые РНК или их продуктами процессинга, могут быть презентированы белками основного комплекса гистосовместимости (МНС), экспрессируемыми на антигенпрезентирующих клетках. Пептидный комплекс МНС может затем распознаваться иммунными клетками, такими как Т-клетки или В-клетки, что приводит к их активации. Таким образом, в одном варианте осуществления РНК в РНК-липоплексных частицах, описанных в настоящем документе, после введения доставляется в селезенку и/или экспрессируется в селезенке. В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы доставляются в селезенку для активации антигенпрезентирующих клеток селезенки. Таким образом, в одном варианте осуществления после введения РНК-липоплексных частиц происходит доставка РНК и/или экспрессия РНК в антигенпрезентирующих клетках. Антигенпрезентирующие клетки могут быть профессиональными антигенпрезентирующими клетками или непрофессиональными антигенпрезентирующими клетками. Профессиональные антигенпрезентирующие клетки могут представлять собой дендритные клетки и/или макрофаги, еще более предпочтительно дендритные клетки селезенки и/или макрофаги селезенки.
Соответственно, настоящее раскрытие относится к РНК-липоплексным частицам или фармацевтической композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, как описано в данном документе, для индукции или усиления иммунного ответа, предпочтительно, иммунного ответа против рака.
В дополнительном варианте осуществления настоящее раскрытие относится к РНК-липоплексным частицам или фармацевтической композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, как описано в настоящем документе, для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении заболевания, включающего антиген, предпочтительно онкологического заболевания.
В дополнительном варианте осуществления настоящее раскрытие относится к способу доставки антигена или эпитопа антигена антигенпрезентирующим клеткам, таким как профессиональные антигенпрезентирующие клетки, в селезенку или к экспрессии антигена или эпитопа антигена в антигенпрезентирующих клетках, таких как профессиональные антигенпрезентирующие клетки, в селезенке, включающему введение субъекту РНК-липоплексных частиц или фармацевтической композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, как описано в настоящем документе. В одном варианте осуществления антиген представляет собой опухолевый антиген. В данном аспекте антиген или эпитоп антигена предпочтительно кодируется РНК в РНК-липоплексных частицах.
В одном варианте осуществления системное введение РНК-липоплексных частиц или фармацевтической композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, как описано в настоящем документе, приводит к нацеливанию и/или накоплению РНК-липоплексных частиц или РНК в селезенке, а не в легких и/или печени. В одном варианте осуществления РНК-липоплексные частицы высвобождают РНК в селезенке и/или попадают в клетки селезенки. В одном варианте осуществления системное введение РНК-липоплексных частиц или фармацевтической композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, как описано в настоящем документе, доставляет РНК в антигенпрезентирующие клетки в селезенке. В конкретном варианте осуществления антигенпрезентирующие клетки в селезенке представляют собой дендритные клетки или макрофаги.
В дополнительном варианте осуществления настоящее раскрытие относится к способу индукции или усиления иммунного ответа у субъекта, включающему введение субъекту РНК-липоплексных частиц или фармацевтической композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, как описано в данном документе. В типичном варианте осуществления иммунный ответ направлен против рака.
Термин «макрофаг» относится к подгруппе фагоцитарных клеток, продуцируемых дифференцировкой моноцитов. Макрофаги, которые активируются воспалением, иммунными цитокинами или микробными продуктами, неспецифически поглощают и уничтожают чужеродные патогены внутри макрофага в результате гидролитической и окислительной атаки, приводящей к деградации патогена. Пептиды из деградированных белков выводятся на поверхность клеток макрофагов, где они могут распознаваться Т-клетками, и они могут напрямую взаимодействовать с антителами на поверхности В-клеток, что приводит к активации Т- и В-клеток и дальнейшей стимуляции иммунного ответа. Макрофаги относятся к классу антигенпрезентирующих клеток. В одном варианте осуществления макрофаги представляют собой макрофаги селезенки.
Термин «дендритная клетка» (DC) относится к другому подтипу фагоцитарных клеток, относящихся к классу антигенпрезентирующих клеток. В одном варианте осуществления дендритные клетки получены из клеток-предшественников кроветворного костного мозга. Данные клетки-предшественники первоначально превращаются в незрелые дендритные клетки. Такие незрелые клетки характеризуются высокой фагоцитарной активностью и низким потенциалом активации Т-клеток. Незрелые дендритные клетки постоянно отбирают в окружающей среде патогенные микроорганизмы, такие как вирусы и бактерии. Как только они вступают в контакт с презентабельным антигеном, они активируются в зрелые дендритные клетки и начинают мигрировать в селезенку или лимфатический узел. Незрелые дендритные клетки осуществляют фагоцитоз патогенов и разлагают их белки на мелкие кусочки и при созревании презентируют данные фрагменты на своей клеточной поверхности с помощью молекул МНС. Одновременно, они активируют рецепторы клеточной поверхности, которые действуют как корецепторы при активации Т-клеток, такие как CD80, CD86 и CD40, значительно повышая их способность активировать Т-клетки. Они также активируют CCR7, хемотаксический рецептор, который заставляет дендритную клетку перемещаться через кровоток в селезенку или через лимфатическую систему в лимфатический узел. В данном документе они выступают в качестве антигенпрезентирующих клеток и активируют хелперные Т-клетки и киллерные Т-клетки, а также В-клетки, презентируя им антигены, наряду с неантигенспецифичными кости муляторными сигналами. Таким образом, дендритные клетки могут активно индуцировать иммунный ответ, связанный с Т-клетками или В-клетками. В одном варианте осуществления дендритные клетки представляют собой дендритные клетки селезенки. Термин «антигенпрезентирующая клетка» (antigen presenting cell, АРС) представляет собой клетку из множества клеток, способных отображать, приобретать и/или презентировать по меньшей мере один антиген или антигенный фрагмент на (или в) своей клеточной поверхности. Антигенпрезентирующие клетки можно разделить на профессиональные антигенпрезентирующие клетки и непрофессиональные антигенпрезентирующие клетки. Термин «профессиональные антигенпрезентирующие клетки» относится к антигенпрезентирующим клеткам, которые конститутивно экспрессируют молекулы большого комплекса гистосовместимости класса II (МНС класса II), необходимые для взаимодействия с наивными Т-клетками. Если Т-клетка взаимодействует с комплексом молекул МНС класса II на мембране антигенпрезентирующей клетки, антигенпрезентирующая клетка продуцирует костимулирующую молекулу, индуцирующую активацию Т-клетки. Профессиональные антигенпрезентирующие клетки включают дендритные клетки и макрофаги.
Термин «непрофессиональные антигенпрезентирующие клетки» относится к антигенпрезентирующим клеткам, которые не экспрессируют конститутивно молекулы МНС класса II, но экспрессируют их при стимуляции некоторыми цитокинами, такими как интерферон-гамма. Типичные непрофессиональные антигенпрезентирующие клетки включают фибробласты, эпителиальные клетки тимуса, эпителиальные клетки щитовидной железы, глиальные клетки, бета-клетки поджелудочной железы или эндотелиальные клетки сосудов.
«Процессинг антигена» относится к деградации антигена в продукты процессинга, которые являются фрагментами указанного антигена (например, деградация белка в пептиды) и ассоциации одного или нескольких из данных фрагментов (например, посредством связывания) с молекулами МНС для презентации клетками, такими как антигенпрезентирующие клетки, специфическим Т-клеткам.
Термин «заболевание с участием антигена» или «заболевание с участием эпитопа» относится к любому заболеванию, которое включает антиген или эпитоп, например, заболеванию, которое характеризуется наличием антигена или эпитопа. Заболевание с участием антигена или эпитопа может представлять собой инфекционное заболевание или онкологическое заболевание или просто рак. Как упомянуто выше, антиген может представлять собой ассоциированный с заболеванием антиген, такой как ассоциированный с опухолью антиген, вирусный антиген или бактериальный антиген, и эпитоп может быть получен из такого антигена.
Термин «инфекционное заболевание» относится к любому заболеванию, которое может передаваться от человека к человеку или от организма к организму и вызывается микробным агентом (например, простуда). Инфекционные заболевания известны в данной области техники и включают, например, вирусное заболевание, бактериальное заболевание или паразитарное заболевание, причем данные заболевания вызваны вирусом, бактерией и паразитом, соответственно. В связи с этим, инфекционное заболевание может представлять собой, например, гепатит, заболевания, передаваемые половым путем (например, хламидиоз или гонорея), туберкулез, синдром ВИЧ/приобретенного иммунодефицита (СПИД), дифтерию, гепатит В, гепатит С, холеру, тяжелые острые респираторные заболевания, синдром (ОРВИ), птичий грипп и грипп.
Термины «онкологическое заболевание» или «рак» обозначают или описывают физиологическое состояние индивидуума, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры онкологических заболеваний включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретно, примеры таких видов онкологических заболеваний включают рак костей, рак крови, рак легкого, рак печени, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак простаты, рак матки, рак половых и репродуктивных органов, заболевание Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягких тканей, рак мочевого пузыря, рак почки, почечно-клеточный рак, рак почечной лоханки, новообразования центральной нервной системы (ЦНС), нейроэктодермальный рак опухоли позвоночника, глиому, менингиому и аденому гипофиза. Термин «рак» в соответствии с изобретением также включает метастазы рака. Комбинированные стратегии в лечении рака могут быть желательны из-за возникающего синергетического эффекта, который может быть значительно сильнее, чем эффект монотерапевтического подхода. В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят с иммунотерапевтическим средством. Используемый в данном документе термин «иммунотерапевтическое средство» относится к любому средству, которое может быть вовлечено в активацию специфического иммунного ответа и/или иммунной эффекторной функции (функций). Настоящее раскрытие предусматривает применение антитела в качестве иммунотерапевтического средства. Не желая быть связанными какой-либо теорией, антитела способны достигать терапевтического эффекта против раковых клеток посредством различных механизмов, включая индукцию апоптоза, блокирование компонентов путей передачи сигнала или ингибирование пролиферации опухолевых клеток. В определенных вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. Моноклональное антитело может вызывать гибель клеток посредством антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC)) или связывать белки комплемента, приводя к прямой токсичности для клеток, известной как комплемент-зависимая цитотоксичность (complement dependent cytotoxicity (CDC)). Неограничивающие примеры противораковых антител и потенциальных антител-мишеней (в скобках), которые можно использовать в сочетании с настоящим раскрытием, включают: абаговомаб (СА-125), абциксимаб (CD41), адекатумумаб (ЕрСАМ), афутузумаб (CD20), алацизумаб пегол (VEGFR2), алтумомаб пентетат (СЕА), аматуксимаб (MORAb-009), анатумомаб мафенатокс (TAG-72), аполизумаб (HLA-DR), арцитумомаб (CEA), атезолизумаб (PD-L1), бавитуксимаб (фосфатидилсерин), бектумомаб (CD22), белимумаб (BAFF), бевацизумаб (VEGF-A), биватузумаб мертанзин (CD44 v6), блинатумомаб (CD 19), брентуксимаб ведотин (CD30 TNFRSF8), кантузумаб мертансин (муцин CanAg), капромаб пандетид (клетки карциномы предстательной железы), карлумаб (CNT0888), катумаксомаб (ЕрСАМ, CD3), цетуксимаб (EGFR), цитатузумаб богатокс (ЕрСАМ), циксутумумаб (IGF-1 рецептор), клаудиксимаб (Claudin), кливатузумаб тетраксетан (MUC1), конатумумаб (TRAIL-R2), дацетузумаб (CD40), далотузумаб (инсулиноподобный рецептор фактора роста I), деносумаб (RANKL), детумомаб (клетка В-лимфомы), дрозитумаб (DR5), экромексимаб (GD3 ганглиозид), эдреколомаб (ЕрСАМ), элотузумаб (SLAMF7), энаватузумаб (PDL192), энситуксимаб (эпкузумабум (NPC-1C)) (HER2/neu, CD3), этарацизумаб (интегрин αvβ3), фарлетузумаб (фолатный рецептор 1), FBTA05 (CD20), фиклатузумаб (SCH 900105), фигитумумаб (IGF-1 рецептор), фланвотумаб (гликопротеин 75), фрезолимумаб (TGF-β), галиксимаб (CD80), ганитумаб (IGF-I), гемтузумаб озогамицин (CD33), гевокизумаб (IL-Iβ), гирентуксимаб (карбоангидраза 9 (СА-IX)), глембатумумаб ведотин (CDNMB), ибритумомаб тиуксетан, икрукумаб (VE GFR-1), иговома (СА-125), индатуксимаб равтансин (SDC1), интетумумаб (CD51), инотузумаб озогамицин (CD22), ипилимумаб (CD152), иратумумаб (CD30), лабетузумаб (СЕА), лексатумумаб (TRAIL-R2), либивирумаб (поверхностный антиген гепатита В), линтузумаб (CD33), лорвотузумаб мертанзин (CD56), лукатумумаб (CD40), люмиксимаб (CD23), мапатумумаб (TRAIL-R1), матузумаб (EGFR), меполизумаб (FL-5), милатузумаб (CD74), митумомаб (ганглиозид GD3), могамулизумаб (CCR4), моксетумомаб пасудотокс (CD22), наколомаб тафенатокс (антиген С242), наптумомаб эстафенатокс (5Т4), наматумаб (RON), неситумумаб (EGFR), нимотузумаб (EGFR), ниволумаб (IgG4), офатумумаб (CD20), оларатумаб (PDGF-R а), онартузумаб (киназа рецептора фактора роста гепатоцитов человека), опортузумаб монатокс (ЕрСАМ), ореговомаб (СА-125), окселумаб (ОХ-40), панитумумаб (EGFR), патритумаб (HER3), пемтумома (MUC1), пертузумаб (HER2/neu), пинтумомаб (антиген аденокарциномы), притумумаб (вименин), ракотумомаб (N-гликолилнейраминовая кислота), радретумаб (экстра домен В фибронектина), рафивирумаб (гликопротеин вируса бешенства), рамуципумаб (VEGFR2), рилотумумаб (HGF), ритуксимаб (CD20), робатумумаб (рецептор IGF-1), самализумаб (CD200), сибротузумаб (FAP), силтуксимаб (IL-6), табалумаб (BAFF), такатузумаб тетраксетан (альфа-фетопротеин), таплитумомаб паптокс (CD 19), тенатумомаб (тенасцин С), тепротумумаб (CD221), тицилимумаб (CTLA-4), титатузумаб (TRAIL-R2), TNX-650 (IL-13), тозитумомаб (CD20), трастузумаб (HER2/neu), TRBS07 (GD2), тремелимумаб (CTLA-4), тукотузумаб целмолейкин (ЕрСАМ), ублитуксимаб (MS4A1), урелумаб (4-IBB), волоциксимаб (интегрин α5β1), вотумумаб (опухолевый антиген СТАА16.88), залутумумаб (EGFR), занолимумаб (CD4).
В одном варианте осуществления иммунотерапевтическое средство представляет собой антагонист связывания оси PD-1. Антагонист связывания оси PD-1 включает, но не ограничивается ими, антагонист связывания PD-1, антагонист связывания PD-L1 и антагонист связывания PD-L2. Альтернативные названия для «PD-1» включают CD279 и SLEB2. Альтернативные названия для «PD-L1» включают В7-Н1, В7-4, CD274 и В7-Н. Альтернативные названия для «PD-L2» включают B7-DC, Btdc и CD273. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-1 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-1 с его партнерами по связыванию лиганда. В конкретном аспекте партнерами по связыванию лиганда PD-1 являются PD-L1 и/или PD-L2. В другом варианте осуществления антагонист связывания PD-L1 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по связыванию. В конкретном варианте осуществления партнерами по связыванию PD-L1 являются PD-1 и/или В7-1. В другом варианте осуществления антагонистом связывания PD-L2 является молекула, которая ингибирует связывание PD-L2 с его партнерами по связыванию. В конкретном варианте осуществления партнер по связыванию PD-L2 представляет собой PD-1. Связывающий антагонист PD-1 может представлять собой антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, белок слияния или олигопептид. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывания PD-1 представляет собой антитело против PD-1 (например, человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело). Примеры антитела против PD-1 включают, без ограничения, MDX-1106 (ниволумаб, OPDIVO), Merck 3475 (МК-3475, пембролизумаб, KEYTRUDA), MEDI-0680 (АМР-514), PDR001, REGN2810, BGB-108 и BGB-A317.
В одном варианте осуществления антагонист связывания PD-1 представляет собой иммуноадгезин, который включает внеклеточную или PD-1-связывающую часть PD-L1 или PD-L2, слитую с константной областью. В одном варианте осуществления антагонистом связывания PD-1 является АМР-224 (также известный KaKB7-DCIg, представляет собой PD-L2-Fc), который представляет собой растворимый слитый рецептор, описанный в WO2010/027827 и WO201 1/066342.
В одном варианте осуществления антагонист связывания PD-1 представляет собой антитело против PD-L1, включая, без ограничения, YW243.55.S70, MPDL3280A (атезолизумаб), MEDI4736 (дурвалумаб), MDX-1105 и MSB0010718C (авелумаб).
В одном варианте осуществления иммунотерапевтическое средство представляет собой антагонист связывания PD-1. В другом варианте осуществления антагонист связывания PD-1 представляет собой антитело против PD-L1. В типичном варианте осуществления антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб.
Цитирование документов и исследований, на которые есть ссылки в настоящем документе, не является признанием того, что что-либо из вышеизложенного относится к предшествующему уровню техники. Все заявления в отношении содержания данных документов основаны на информации, доступной заявителям, и не являются признанием правильности содержания этих документов.
Следующее описание представлено, чтобы дать возможность специалисту в данной области техники создавать и применять различные варианты осуществления. Описания конкретных устройств, способов и приложений приведены только в качестве примеров. Различные модификации описанных в данном документе примеров будут очевидны для специалистов в данной области техники, и общие принципы, определенные в данном документе, могут быть применены к другим примерам и приложениям, не выходя за пределы сущности и объема различных вариантов осуществления. Таким образом, различные варианты осуществления не предназначены для ограничения примерами, описанными и показанными в данном документе, но должны соответствовать объему, соответствующему формуле изобретения.
Примеры
Пример 1: Материалы
Заслуживающими упоминания материалами, использованными для экспериментов, описанных ниже, были:
Пример 2: Приготовление смесей липидов
Смесь липидов DOTMA/DOPE готовили с разными концентрациями липидов в этаноле с молярным соотношением липидов 2:1, соответственно. Раствор готовится следующим образом:
- Взвесьте липид DOPE.
- Рассчитайте количество DOTMA, чтобы сохранить % молярное соотношение
DOTMA/DOPE, равное 2:1.
- Взвесьте липид DOTMA.
- Рассчитайте количество абсолютного этанола, требуемое для растворения липидов.
- Взвесьте абс. Этанол.
- Растворите липиды в этаноле с помощью водяной бани при 37°С.
Растворимость DOPE и DOPE/DOTMA в этаноле исследовали путем приготовления растворов 300 мМ DOPE или 330 мМ DOPE/DOTMA (66:33) в этаноле. Липиды растворяли путем инкубации растворов липидов при 37°С в течение 20 минут. Растворы DOPE центрифугировали при 17000 G в течение 1 часа, и концентрацию DOPE измеряли в надосадочной жидкости с помощью ВЭЖХ. Растворы DOTMA/DOPE фильтровали через 0,22 мкм PES-шприцевой фильтр, и концентрацию липидов измеряли в фильтрате с помощью ВЭЖХ.
Дополнительные липидные смеси могут быть получены аналогичным образом, следуя основным стадиям, описанным в данном примере, при условии, что в качестве исходных материалов используются другие липиды и/или рассчитаны другие молярные соотношения.
Пример 3: Приготовление липосом
Липосомы готовили путем этанольной инжекции следующим образом: 0,2 мл DOTM/DOPE или (другого липидного раствора) в этаноле инъецировали с помощью 1 мл-шприца, снабженного иглой 0,9 × 40 мм, в 9,8 мл воды при перемешивании при 120 об/мин. Липосомный коллоид перемешивали в течение 30 минут. Липосомы фильтровали или не фильтровали через шприц-фильтры СА 0,45 или 1,2 или 5 мкм. Липосомные коллоиды хранили при от 4 до 8°С. Растворы липидов DOTMA/DOPE готовили в % молярном соотношении 66:33 при различных общих концентрациях липидов, от 100 до 400 мМ, с промежуточными стадиями в 50 мМ.
Пример 4: Приготовление РНК-липоплексов
РНК-липоплексные составы готовили следующим образом, сначала смешивая раствор РНК (например, раствор luc-PHK) с раствором NaCl для предварительной конденсации luc-PHK. После этого липосомный коллоид и раствор luc-PHK-NaCl смешивали с образованием РНК-липоплексов. РНК-липоплексный состав инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и хранили при от 4 до 8°С. Различные РНК-липоплексные составы готовили, например, с соотношением N/P 0,65. Концентрация РНК в данных различных РНК-липоплексных составах составляла 0,1 мг/мл, и концентрация NaCl составляла 50 мМ. Различные предшественники липосом (разных размеров) были использованы для приготовления РНК-липоплексов.
Пример 5: Динамическое рассеяние света
Размеры липосом и размеры РНК-липоплексов измеряли известным способом динамического рассеяния света (DLS) с использованием прибора Nicomp (PSS. Santa Barbara. USA). Образцы липосом разбавляли водой до общей концентрации липидов 1 мМ. Образцы РНК-липоплекса разбавляли 1:5 0,9% раствором NaCl. Образцы измеряли в 5×50 мм культуральных пробирках (Kimble. USA).
Пример 6: Затемнение света - динамическое рассеяние света
Подсчет/измерение частиц в различных липосомах и РНК-липоплексных составах в диапазоне размеров от 0,5 до 5 мкм проводили с использованием прибора Accusizer А7000 (PSS. Santa Barbara, USA). Было выполнено три измерения объема 5 мл (2,5 мкл образца/20 мл воды со свободными частицами). Полученные результаты представляли собой среднее значение количества частиц из трех измерений.
Пример 7: Малоугловое рентгеновское рассеяние
Параметры внутренней структуры различных РНК-липоплексных составов, полученных с различными прекурсорами липосом, измеряли с помощью малоуглового рентгеновского рассеяния (Small Angel X-ray Scattering, SAXS). SAXS представляет собой способ, с помощью которого можно измерять различия в наноразмерной плотности в образце, анализируя поведение упругого рассеяния рентгеновских лучей при прохождении через материал, регистрируя их рассеяние под малыми углами. Длина корреляции и параметры d-интервала были рассчитаны для каждой протестированной РНК-композиции. РНК-липоплексные составы получали с отношением N/P, равным 0,65, 0,1 мг/мл РНК и 112 мМ NaCl.
Пример 8: Электрофорез в агарозном геле
Количество свободной РНК в различных РНК-липоплексных образцах измеряли гель-электрофорезом. Для выполнения измерений использовали 1% агарозный гель, содержащий гипохлорит натрия. Образцы РНК-липоплексов разбавляли 1:6 красителем для загрузки ДНК. 12 мкл разведенных РНК-липоплексных образцов аккуратно загружали в агарозный гель. Электрофорез проводили при 80 В, время прогона 40 мин.
Пример 9: ВЭЖХ
Концентрацию липидов в различных составах липосом измеряли с помощью ВЭЖХ (Agilent technologies. Santa Clara. USA), используя колонку Sunfire C18 2,5 мкм 4,6 × 75 мм (Waters. Massachusetts. USA) и длину волны 205 нм. Подвижная фаза А представляла собой смесь 70% метанола / 30% изопропанола / 0,1% TFA, подвижная фаза В представляла собой смесь 55% метанола / 15% изопропанола / 30% воды /0,1% TFA. Образцы липосом разбавляли или не разбавляли водой до общей концентрации липидов 3 мМ.
Пример 10: Культура клеток: РНК-трансфекция в дендритных клетках in vitro
РНК-липоплексные составы получали с различными прекурсорами липосом и luc-PHК. РНК-липоплексы разбавляли до 0,01 мг/мл РНК с помощью 0,9% раствора NaCl для экспериментов на клеточных культурах. Эффективность РНК-трансфекции различных РНК-липоплексных составов исследовали на человеческих дендритных клетках, высеянных в среде или цельной крови.
Пример 11: Животная модель: нацеливание на селезенку и РНК-трансфекция в дендритных клетках
Эффективность трансфекции различных РНК-липоплексных составов исследовали на мышах BALB/c. 20 мкг составленных РНК-липоплексов вводили ретроорбитально и через 6 часов измеряли экспрессию люциферазы в дендритных клетках (селезенка-мишень). РНК-липоплексы готовили с использованием luc-РНК и различных предшественников липосом, небольших или крупных липосом, полученных из необработанных коллоидов и небольших и крупных липосом после фильтрации через фильтр 0,45 мкм, соотношение N/P 0,65 и 112 мМ NaCl.
Пример 12: Тестирование растворимости
Было проверено, можно ли приготовить DOPE-содержащие растворы более высокой концентрации (в пересыщенном состоянии) и использовать для этанольной инжекции для изготовления липосом (следующий раздел). Результаты, полученные в данной серии испытаний на растворимость, показаны в таблицах 1 и 2:
Согласно данным результатам, DOPE, приобретенный у разных поставщиков, имеет равновесную растворимость в этаноле от около 50 до 60 мМ (комнатная температура). Однако, если готовится совместный раствор с катионным липидом DOTMA, равновесная растворимость значительно возрастает, например, до от около 90 до 100 мМ, если используется совместный раствор DOTMA/DOPE с молярным соотношением 66:33.
Пример 13: Изготовление липосом разных размеров
Липосомы изготавливали путем этанольной инжекции с использованием протокола, описанного в примере 3. После этанольной инжекции процесс фильтрации не проводился. Концентрацию липидов в этаноле варьировали, сохраняя все остальные параметры фиксированными. Размеры липосом измеряли, как описано способом динамического рассеяния света (DLS) в примерах 5 и 6.
В качестве примера, результаты, относящиеся к липосомам, полученным из смеси DOTMA/DOPE с % молярным соотношением 66:33, показаны в таблице 3 (ниже) и на фигурах 1 и 2.
Как можно видеть, полученные размеры (Z-среднее) липосом увеличиваются с увеличением концентрации липидов в этанольном растворе, используемом для этанольной инжекции. Таким образом, концентрация липидов в этаноле может быть эффективно использована для регулирования размера липосом. Интересно, что изменение размера было наиболее заметным, если концентрация DOPE была ниже и выше равновесной собственной растворимости DOPE в этаноле. Если концентрация DOPE была выше 50 мМ (общая концентрация липидов 150 мМ), размер полученных липосом резко увеличивался, от <50 нм до более 500 нм (фигура 1). Однако, также выше предела растворимости размер липосом дополнительно монотонно увеличивался с увеличением концентрации липидов.
Фракция липосом размером 0,5 мкм присутствовала во всех липосомных составах, данная фракция липосом была больше в липосомах, приготовленных с 300 мМ раствором липидов, и уменьшалась в липосомах, полученных при более низких и более высоких концентрациях липидов. Кроме того, фракции липосом размером 0,6 мкм и 0,7 мкм были измерены в составах липосом, полученных при более высоких концентрациях липидов (фигура 2). После этанольной инжекции высококонцентрированного липидного раствора образуются более крупные липосомы. Общее количество образовавшихся липосом было меньше по сравнению с липосомными составами, приготовленными при низкой концентрации липидов в липидном растворе. Полученные результаты представляли собой среднее значение количества частиц из трех измерений.
Пример 14: Изготовление РНК-липоплексов из липосом разных размеров
РНК-липоплексы изготавливали, как описано в примере 4, с использованием различных предшественников липосом, где размер липосом для их образования варьировали, сохраняя все остальные параметры фиксированными. Размеры липосом (z-среднее) и индексы полидисперсности (PDI) определяли в ходе экспериментов по динамическому рассеянию света (DLS), как описано в примерах 5 и 6.
Результаты, касающиеся влияния концентраций липидов для приготовления липосом (и, следовательно, на размер предшественника липосом) на размеры РНК-липоплексов (Z-среднее), показаны в таблице 4 (ниже) и на соответствующих фигурах 3 и 4.
Согласно данной серии испытаний, РНК-липоплексы, полученные из небольших липосом, были менее чем из крупных липосом. РНК-липоплексы, полученные из липосом, которые были изготовлены с использованием раствора с концентрацией 300 мМ и выше, были приблизительно в два раза больше, чем таковые из липосом, которые были получены из исходного раствора с концентрацией 150 мМ. Никакой корреляции между размером липосом и размером РНК-липоплексов не было обнаружено во всех РНК-липоплексах, полученных с более крупными липосомами (фигура 3).
Полученное количество РНК-липоплексов увеличивалось с размером липосомы, используемой для их образования. Более высокие количества более крупных РНК-липоплексных частиц были измерены в составах, приготовленных с более крупными липосомами, что подтверждает данные, полученные из измерений динамического рассеяния света (фигура 4). Полученные результаты представляли среднее значение количества частиц из трех измерений.
Пример 15: Малоугловое рентгеновское рассеяние (SAXS) от различных липоплексов
Эксперименты по малоугловому рентгеновскому рассеянию проводили, как описано для РНК-липоплексов, полученных из липосом из исходных растворов с различной концентрацией. Например, РНК-липоплексы образовывались из липосом DOTMA/DOPE 2/1 (моль/моль) и РНК с соотношением зарядов от 1,3 до 2. Липосомы изготавливались путем этанольной инжекции, как описано для концентраций липидов 100 мМ, 300 мМ и 400 мМ в этаноле.
Дифракционные кривые, полученные из измерений малоуглового рентгеновского рассеяния на РНК-липоплексах, образованных с липосомами, приготовленными при соотношении зарядов 4/1 (вверху) и при соотношении зарядов 1,3/2, где липосомы для образования липоплексов были получены с миллимолярным исходным раствором липида в этаноле с концентрациями в 400, 300 и 100 мМ, показаны на фигуре 5.
Паттерны рассеяния содержат один брегговский пик при около 1 нм-1. Это типичная дифракционная диаграмма для липоплексов, направляемых в селезенку, где избыток (отрицательно заряженной) РНК был использован для образования липоплекса. Если липоплексы не заряжены отрицательно, профиль рассеяния совершенно другой. В качестве примера были измерены РНК-липоплексы при соотношении зарядов +/- 4/1, где были обнаружены гораздо менее выраженные пики. Также заметен пик второго порядка (хотя и с малой интенсивностью). Фактически, общий признак профилей рассеяния рентгеновского излучения липоплексов заключается в том, что существуют несколько пиков, которые могут быть равноудалены или могут находиться на других расстояниях друг от друга, в зависимости от фазового состояния. Здесь, напротив, определяется только один пик. Кроме того, ширина пика изменяется в зависимости от концентрации исходного раствора, который первоначально использовался для изготовления липосом. Если концентрация в этаноле была выше, ширина пика была меньше. Брегговский пик указывает на то, что липоплексы регулярно упорядочены, где повторяющееся расстояние (расстояние d) как функция положения пика дается как:
Здесь q представляет собой передачу импульса, причем 
где n представляет собой порядок и qmax представляет собой позицию максимума соответствующего брегговского пика, λ представляет собой длину волны и θ представляет собой угол. Интервал d, получаемый из брегговских пиков, составляет порядка 6,5 нм.
Ширина пика, Δq, уменьшается с увеличением количества повторяющихся единиц в стопке. Для жидкокристаллической матрицы длина корреляции может быть задана как:
Для липоплексного продукта в данном документе может быть получена четкая корреляция паттерна рассеяния с вышеупомянутой концентрацией липидов в этаноле для приготовления липосом и биологической активностью. Хотя положение пика является инвариантным, ширина пика монотонно изменяется в зависимости от применяемой липидной концентрации в этаноле. Увеличение липидной концентрации в этаноле (что приводит к увеличению размера липосом) соответствует уменьшению ширины пика и, следовательно, увеличению длины корреляции. В то же время, биологическая активность увеличивается с увеличением длины корреляции. Таким образом, описанные липоплексы с улучшенной активностью, которые изготавливают из липосом, для изготовления которых использовали высококонцентрированный исходный липидный раствор в этаноле, можно различить по четкой структурной особенности. Кроме того, также с помощью других способов, таких как фракционирование в поле асимметричного потока (asymmetric field flow fractionation, AF4), описанные липоплексы с улучшенной активностью можно отличить от таковых с более низкой активностью.
Пример 16. Эффективность трансфекции РНК-липоплексов в дендритных клетках человека
Luc-РНК-липоплексы были изготовлены, как описано с использованием различных предшественников липосом, где размер липосом для их образования варьировался (путем варьирования исходной концентрации липидов для их образования), сохраняя все другие параметры фиксированными. После этого эффективность РНК-трансфекции различных РНК-липоплексных составов была исследована в человеческих дендритных клетках, высеянных в среде или цельной крови.
Результаты, иллюстрирующие эффективность трансфекции in vitro (человеческие дендритные клетки), определенные путем измерения экспрессии люциферазы и соответствующей биологической активности различных РНК-липоплексов, полученных с различными прекурсорами липосом, показаны на фигуре 6.
Биологическая активность (трансфекция РНК in vitro) монотонно возрастает с длиной корреляции РНК-липоплексов. Более высокая длина корреляции указывает на более однородную популяцию липидных бислоев в РНК-липоплексе.
Пример 17: Фракционирование различных липоплексов в асимметричном потоке под действием поля внешних сил
Фракционирование в поле асимметричного потока (Asymmetrical flow field flow fractionation, AF4), в настоящее время общепринятый и современный способ фракционирования и разделения частиц в суспензии, использовали для определения дополнительных различий РНК-липоплексов. Согласно теории AF4, частицы с аналогичными свойствами и одинаковым размером должны элюироваться одновременно. Некоторые результаты, относящиеся к AF4-измерениям липоплексов из двух различных типов липосом, изготовленных либо из 150 мМ исходного раствора в этаноле, либо из 400 мМ исходного раствора в этаноле, показаны на фигуре 7.
Таким образом, измерения фракционирования в потоке под действием поля внешних сил (Field-Flow Fractionation, FFF) показывают, что липоплексы из липосом с концентрацией липидов 150 мМ в этаноле качественно и количественно отличаются от таковых с концентрацией липидов 400 мМ. Полученные из 150 мМ липоплексы меньше, но, напротив, элюируются позже, следовательно, между данными двумя частицами должно существовать качественное различие (форма, взаимодействие среды, заряд). РНК-липоплексы из 150 мМ этанольного раствора элюируются позже, хотя они меньше по размеру. Это указывает на то, что РНК-липоплексы из липосом, которые изготовлены из липосом, для которых использовался 150 мМ липидный раствор в этаноле, в среднем, менее чем таковые из 400 мМ липидов в этаноле. Даже будучи одного и того же размера, полученные из 150 мМ липоплексы имеют физико-химические свойства, отличные от тех, которыми обладают липоплексы, полученные из 400 мМ. Данные различия в размере и физико-химических свойствах коррелируют с более высокой биологической активностью РНК-липоплексов, полученных из 400 мМ.
Пример 18: Биологическая активность РНК-липоплексов in vitro
Как определено в экспериментах по трансфекции клеточной культуры (дендритные клетки) с кодирующими люциферазу РНК-липоплексами различных размеров, приготовленными из липосом, различных исходных липидных растворов и/или различных концентраций липидов, как описано, сигналы люциферазы и, следовательно, биологическая активность монотонно возрастают с начальными концентрациями липидов и, следовательно, с размерами липосом, используемых для образования РНК-липоплексов. Соответствующие результаты показаны на фигурах 6, 8 и 9.
Таким образом, РНК-липоплексы, полученные из более высоких концентраций липидов для изготовления липосом, проявляют значительно более высокую активность in vitro.
Пример 19: Биологическая активность РНК-липоплексов in vivo
Как определено в экспериментах по трансфекции клеточной культуры (дендритные клетки) с кодирующими люциферазу РНК-липоплексами, приготовленными из липосом различных размеров, РНК-липоплексы, полученные с более крупными липосомами, приводят к значительно более высокой экспрессии люциферазы и соответствующей биологической активности.
Неограничивающий пример данной серии тестов показан на фигурах 10 и 11. РНК-липоплексы, полученные с более крупными липосомами из 360 мМ исходного коллоида, приводят к значительному сигналу экспрессии in vivo, по сравнению с небольшими РНК-липоплексами из 200 мМ исходного коллоида.
Пример 20: Автоматизированное изготовление РНК-липоплексов
Для автоматизированного серийного изготовления РНК-липоплексов была разработана общеприменимая процедура, которая показана на фигуре 12. Все стадии выполняются с использованием предварительно стерилизованного одноразового жидкостного тракта, обеспечивающего безопасную асептическую обработку материалов. Сначала концентрацию РНК доводят до концентрации липосом и добавляют NaCl для конденсации РНК. Таким образом, раствор РНК доводится до концентрации РНК, позволяющей смешивать идентичные объемы РНК и липосом. Как РНК, так и раствор липосом переносятся в шприцы большого объема, и оба шприца устанавливаются на один шприцевой насос, одновременно приводящий в движение два поршня шприца. После образования РНК-липоплекса добавляют раствор криопротектора и подводят конечную концентрацию лекарственного продукта. После заливания лекарственного продукта в стеклянные бутылки лекарственный продукт замораживают в виде концентрата для длительного хранения.
Критическим признаком качества РНК-липоплексов является соотношение зарядов, регулируемое соотношением компонентов при смешивании между РНК и липосомами. Был разработан автоматизируемый и масштабируемый промышленный производственный процесс для РНК-липоплексов, позволяющий эффективно контролировать соотношение компонентов при смешивании. В процессе изготовления небольших масштабов (≤10 литров) контроль смешивания идентичных объемов двух водных растворов, содержащих липосомы и РНК, достигается с помощью одного перфузорного насоса, одновременно приводящего в движение два шприца большого объема, заполненных РНК или липосомами. Для эквивалентной перекачки больших объемов (≥10 литров) используются насосные системы в виде сосудов под давлением, мембранные насосы, шестеренные насосы, насосы с магнитной левитацией или перистальтические насосы в сочетании с датчиками расхода с петлей обратной связью для контроля в режиме онлайн и регулирования скорости потока в реальном времени.
Для автоматизированного изготовления РНК-липоплексов требуется статический смесительный элемент, обеспечивающий эффективное смешивание водных растворов, содержащих РНК и липосомы. Было обнаружено, что коммерчески доступные микрожидкостные смесительные элементы, содержащие серпантины и встроенные структуры для улучшения смешивания, а также прототипные смесительные элементы с сопоставимой архитектурой, блокировались во время изготовления. Поэтому данные смесительные элементы не подходят для автоматизированного изготовления РНК-липоплексов. Было обнаружено, что смесительные элементы Y-типа и Т-типа с диаметрами от 1,2 до 50,0 мм подходят для автоматизированного изготовления РНК-липоплексов.
Способ: РНК-липоплексы готовили с использованием различных смесительных элементов (таблица 1). Во время изготовления липоплексов операторы наблюдали за смесительными элементами, и осаждение материала или закупоривание документировалось.
Результаты: С коммерчески доступным микрофлюидным чипом (NanoAssemblr™, Precision Nanosystems, Vancouver, Canada) наблюдалось закупоривание после приготовления 3 мл РНК-липоплексов. Аналогичные наблюдения были сделаны в ходе испытаний других прототипов микрожидкостных смесительных элементов (таблица 5). В то время как для всех (микро) жидкостных смесительных элементов, имеющих архитектуру, сравнимую с коммерчески доступными смесительными элементами, можно было наблюдать осаждение и частичное блокирование элементов, при использовании смесительных элементов Y-типа или Т-типа подобных наблюдений не было сделано. Помимо описанного смесительного элемента Y-типа диаметром 2,4 мм, были испытаны смесительные элементы большего диаметра. Поскольку не было обнаружено никаких ограничений для диаметра смесительного элемента Y-типа, считается, что описанный способ подходит для приготовления РНК-липоплексов с диаметрами до 50 мм у смешивающих элементов Y-типа.
При использовании смесительных элементов Y-типа или Т-типа для достижения достаточного перемешивания требуется минимальная скорость потока. Приготовление РНК-липоплекса может быть осуществлено путем смешивания двух водных растворов, содержащих РНК и липосомы, с использованием смесительного элемента Y-типа или Т-типа с внутренним диаметром от 1,6 до 50 мм. Число Рейнольдса, полученное из скорости потока для смешивания, не должно быть ниже, чем около 300, чтобы обеспечить эффективное перемешивание. Отношение скорости потока к диаметру смесительного элемента не должно быть ниже, чем около 150, чтобы обеспечить эффективное перемешивание. Числа Рейнольдса до около 2100 были экспериментально проверены и признаны подходящими для автоматизированного изготовления. Из данных следует, что также возможны более высокие скорости потока. Это вытекает из того факта, что при числе Рейнольдса, равном 2100, условия уже достигали турбулентного режима, и, следовательно, при еще более высоких скоростях потока следует ожидать аналогичных условий перемешивания.
Способ: РНК-липоплексы готовили путем откачки раствора РНК и раствора липосом с помощью одного перфузорного насоса. Образование РНК-липоплексов проводили с типичными смесительными элементами Y-типа, имеющими внутренний диаметр 2,4 и 3,2 мм. Размеры частиц и полидисперсность РНК-липоплексов анализировали с помощью измерений фотонной корреляционной спектроскопии (photon correlation spectroscopy, PCS). Числа Рейнольдса, полученные в результате исследуемой комбинации скорости потока и диаметра смесительных элементов, были теоретически рассчитаны с использованием уравнения (фигура 13). Соотношение скорости потока и диаметра смесительного элемента рассчитывали путем деления скорости потока (см3/мин) на диаметр смесительного элемента (см). Коэффициент указан в виде безразмерного числа.
Результаты: При производстве РНК-липоплексов с комбинациями скорости потока и смесительных элементов, приводящими к теоретически рассчитанным числам Рейнольдса ниже около 300, образуются РНК-липоплексы с увеличенным размером частиц и полидисперсностью (фигура 13 и таблица 6). Чтобы обеспечить воспроизводимость образования РНК-липоплексов с желаемыми характеристиками частиц, теоретически число Рейнольдса должно быть по меньшей мере около 300 (фигуры 13 и 14 и таблица 6) и соотношение скорости потока и диаметра смесительного элемента должно быть по меньшей мере около 150. Было обнаружено, что смесительный элемент диаметром 2,4 мм обеспечивает эффективное и воспроизводимое смешивание РНК и липосом в широком диапазоне скоростей потока (от 60 до 240 мл/мин). Поскольку во время данных исследований не было обнаружено верхнего предела, не ожидается никакого верхнего ограничения числа Рейнольдса или соотношения скорости потока и диаметра смесительных элементов.
а Вязкость (0,001 Па с) и плотность (1000 кг/м3) воды использовали для расчета числа Рейнольдса;
b Коэффициент рассчитывали путем деления скорости потока (см3/мин) на диаметр смесительного элемента (см). Коэффициент указан в виде безразмерного числа.
Пример 21: Влияние концентраций РНК
РНК-липоплексы готовили с помощью смесительного элемента y-типа с типичными размерами (2,4 мм). Чтобы определить диапазон концентраций, в котором могут быть приготовлены РНК-липоплексы в данной установке, концентрацию РНК систематически варьировали от 0,05 до 0,5 мг/мл. Чтобы исследовать стабильность образовавшихся липоплексов, конечный состав доводили до 0,05 мг/мл РНК, 22% сахарозы и 20 мМ NaCl и составы замораживали три раза.
Образование РНК-липоплексов при концентрациях РНК от 0,1 до 0,5 мг/мл во время образования РНК-липоплексов приводит к сопоставимым характеристикам частиц (фиг. 15). Характеристики частиц для таких частиц также сохраняются при трехкратном замораживании, что указывает на очень надежный производственный процесс в отношении изменений концентрации РНК (фиг. 16). Поскольку нет никаких указаний на ограничение концентрации РНК во время приготовления РНК-липоплексов, описанная схема считается подходящей для приготовления РНК-липоплексов при концентрации РНК до 5 мг/мл.
Описанный процесс автоматизированного изготовления РНК-липоплексов позволяет воспроизводимо получать стабильные РНК-липоплексы с различными соотношениями зарядов.
Способ: Чтобы доказать надежность полуавтоматического приготовления РНК-липоплексов в отношении заряда, данный параметр систематически варьировался от 1,0:2,0 до 2,1:2,0 и от 2,0:1,0 до 5,0:1:0. Размеры частиц и полидисперсность РНК-липоплексов анализировали с помощью измерений фотонной корреляционной спектроскопии (PCS).
Результаты: Не было обнаружено влияния изменения соотношения зарядов на размер РНК-липолексов и полидисперсность между соотношением зарядов 1,0:2,0 и 2,1:2,0 (фиг. 17). Таким образом, считается, что диапазон от 1,0:2,0 до 2,1:2,0 дает препараты РНК-липоплексов с эквивалентным качеством. Кроме того, стабильные частицы с определенным размером и полидисперсностью были образованы при соотношении зарядов 3,0:1,0 и 5,0:1,0 (фиг. 18).
Пример 22: Концентрация соли во время образования РНК-липоплексов
Для автоматизированного изготовления РНК-липоплексов, обладающих высокой биологической активностью, необходимы контролируемые ионные условия во время образования РНК-липоплексов. Чтобы обеспечить биологическую активность, образование РНК-липоплексов должно проводиться в присутствии от 45 до 300 мМ NaCl. Другие ионные соединения, такие как, например, EDTA, HEPES и т.д., вносят вклад в ионную силу и могут снизить требуемую минимальную концентрацию NaCl.
Способ: РНК-липоплексы были автоматически приготовлены при различных концентрациях NaCl во время образования РНК-липоплексов. Размеры частиц и полидисперсность РНК-липоплексов анализировали с помощью измерений фотонной корреляционной спектроскопии (PCS). Кроме того, биоактивность липоплексов исследовали путем измерения сигнала люциферазы in vitro.
Результаты: Характеристики частиц можно было контролировать путем регулирования ионной силы. Увеличение концентрации соли в процессе изготовления приводило к незначительному увеличению размера частиц (фиг. 19). Было обнаружено, что концентрация соли оказывает влияние на биологическую активность. Увеличение концентрации соли в процессе изготовления вызывало увеличение биологической активности (фиг. 20). Следовательно, концентрация NaCl при образовании РНК-липоплексов не должна быть ниже 45 мМ NaCl.
Пример 23: Стабилизация РНК-липоплексов
Буферные системы, такие как HEPES, уксусная кислота/ацетат натрия и фосфат натрия для стабилизации РНК в липоплексах в диапазоне рН от 5,5 до 6,7, могут быть использованы для стабилизации РНК в РНК-липоплексах как в присутствии, так и в отсутствие криопротектора. Было обнаружено, что система карбоната натрия не приводит к сопоставимой эффективности стабилизации.
Способ: Для исследования оптимального диапазона рН и тестирования пригодности различных буферных средств, охватывающих различные диапазоны рН (HEPES рН 6,8-8,2, уксусная кислота/ацетат натрия рН 3,7-5,6, фосфат натрия рН 5,8-8,0 и карбонат натрия рН 6,2-8,6). РНК-липоплексы первоначально инкубируют в условиях стресса (40°С) в отсутствие крио протектора. Целостность РНК анализировали с помощью капиллярного электрофореза на протяжении 21 дня. Чтобы исследовать оптимальный диапазон рН в присутствии типичного крио протектора, РНК-липоплексы инкубировали в присутствии HEPES и сахарозы при 40°С и целостность РНК анализировали в течение 21 дня.
Результаты: В то время как для буферных систем HEPES, уксусной кислоты/ацетата натрия и фосфата натрия были получены сопоставимые результаты, карбонатная система не привела к сопоставимой стабилизации РНК (фиг. 21). Целостность РНК зависит от значения рН состава. Было определено, что оптимальный диапазон рН находится в диапазоне рН от 5,5 до 7,4. В присутствии типичной криопротекторной сахарозы был определен диапазон рН от 5,5 до 8,0, что привело к лучшей стабилизации РНК (фиг. 22).
Ионы двухвалентных металлов могут появляться во время синтеза РНК, из вспомогательных веществ рецептур или из стеклянных контейнеров и могут влиять на стабильность РНК. Динатриевая соль EDTA образует стабильные водорастворимые комплексы с ионами щелочноземельных и тяжелых металлов. Динатриевая соль EDTA вносит вклад в концентрацию ионов, присутствующих во время образования РНК-липоплексов, и тем самым снижает концентрацию NaCl, необходимую для получения биоактивных РНК-липоплексов. Образование РНК-липоплекса в присутствии EDTA (от 0 до 20 мМ) возможно с помощью описанного процесса.
Способ: РНК-липоплексы образовывались в присутствии возрастающих концентраций EDTA (до 18 мМ) и при разведении инкубировались при пониженном содержании EDTA (от 0,1 мМ до 5,4 мМ) при 40°С. Целостность РНК анализировали в качестве ключевого физико-химического параметра на протяжении 21 дня.
Результаты: Обнаружено, что образование РНК-липоплексов в присутствии высоких концентраций EDTA (до 18 мМ) приводит к характеристикам частиц, эквивалентным таковым в препарате в присутствии более низких концентраций. Не было обнаружено существенных различий между различными группами, содержащими от 0,01% (масса : объем) (0,1 мМ) до 0,2% (масса : объем) (5,4 мМ) EDTA (фиг. 23) во время хранения. Поскольку динатриевая соль EDTA вносит вклад в концентрацию ионов, присутствующих во время образования РНК-липоплекса, и может работать как поглотитель ионов двухвалентных металлов, потенциально снижающих целостность РНК, присутствие концентраций EDTA до 20 мМ во время образования РНК-липоплекса считается преимущественным.
Пример 24: Оптимизация содержания NaCl и криопротектора
Подогнанные ионные условия должны подгоняться во время изготовления РНК-липоплексов, длительного хранения и применения к пациенту (фигура 24). Концентрация NaCl может составлять от 45 до 300 мМ во время образования РНК-липоплексов; от 10 до 50 мМ при длительном хранении РНК-липоплексов в замороженном состоянии; и от 80 до 150 мМ после оттаивания и разбавления физиологическим раствором.
Для каждой концентрации NaCl≤70 мМ было найдено соответствующее содержание криопротектора, которое не следует снижать, чтобы обеспечить стабилизацию характеристик частиц при многократном замораживании. В качестве криопротектора можно использовать моно- и бимолекулярные сахара, такие как глюкоза, сахароза, маннит, трегалоза, сорбит, триолы, такие как глицерин, и их смеси в концентрациях от 12,5 до 35,0% (масс./об.). Стабилизационная эффективность сорбита ниже по сравнению с упомянутыми последними соединениями, и аргинин неэффективно стабилизирует РНК-липоплексы во время замораживания.
Способы: Различные соединения, представляющие моносахариды (глюкоза и сорбит), дисахариды (сахароза и трегалоза), аминокислоты (аргинин, пролин), триолы (глицерин), а также крио протекторные системы, содержащие смеси различных сахаров (маннит и сахароза), были исследованы для выявления подходящих криопротекторов (фиг. 25 и 26). Поэтому РНК-липоплексы замораживали в присутствии возрастающих концентраций данных соединений. Чтобы идентифицировать минимальное содержание криопротектора при определенной концентрации NaCl, РНК-липоплексы замораживали в присутствии возрастающих количеств сахарозы или трегалозы в качестве типичных криопротекторов (таблица 7). Образцы первоначально замораживали один раз, чтобы определить диапазон концентраций криопротектора, который необходимо детально исследовать. В третьем эксперименте эффективность стабилизации размера частиц ставилась под сомнение замораживанием РНК-липоплексов до 10 раз в присутствии криопротектора трегалозы (таблица 8).
Результаты: В то время как аргинин явно дестабилизирует РНК-липоплексы, другие крио протекторы, в целом, применимы для стабилизации РНК-липоплексов во время замораживания (фиг. 25 и 26). Глицерин, маннит и сахароза (1:1, масс. : масс.), пролин и сорбит могут быть использованы в качестве криопротекторов для РНК-липоплексов. Помимо аргинина, все дополнительно протестированные стабилизаторы выглядят подходящими, что указывает на то, что широкий спектр аминокислот, сахаров и смесей таких соединений подходит для стабилизации РНК-липоплексов во время замораживания. Стабилизационная эффективность сорбита ниже по сравнению с упомянутыми последними соединениями.
При детальном исследовании необходимого количества криопротектора при каждой концентрации NaCl (таблица 8) была обнаружена прямая корреляция между концентрацией NaCl и необходимой концентрацией криопротектора после одной стадии замораживания (фиг. 27 и 28). В то время как приемлемое сохранение размера частиц после одной стадии замораживания для от 0 до 60 мМ NaCl наблюдалось при 20% (масс./об.) сахарозы или дигидрата трегалозы, была обнаружена недостаточная стабилизация для более низкого процентного содержания криопротектора (например, ≤15% для 60 мМ NaCl; ≤10% для 40 мМ NaCl; ≤5% для 20 мМ NaCl). В пределах исследуемого диапазона не было обнаружено различий между сахарозой и трегалозой.
При анализе размера РНК-липоплексных частиц после 1, 2, 3, 5 и 10-кратного замораживания в присутствии комбинаций NaCl и трегалозы, показанных в таблице 9.3.2, были получены следующие результаты. В то время как при концентрации 50 мМ NaCl для стабилизации характеристик РНК-липоплексных частиц даже после 10-кратного замораживания (фиг. 29) было достаточно ≥12,5% трегалозы, при 70 мМ NaCl для минимальной стабилизации требовалось ≥12,5% и ≥22,5% требовалось для точного сохранения размера частиц (фиг. 30). При 90 мМ NaCl для минимальной стабилизации требовалось ≥15,0% трегалозы, и точное сохранение размера частиц не могло быть достигнуто даже при самой высокой исследуемой концентрации в 27,5% (фиг. 31).
Пример 25: Комбинация соли и криопротекторов для длительного хранения
Для длительного хранения при данной температуре следует использовать комбинации NaCl и криопротектора, перечисленные в таблице 9.
Способы:
Для того, чтобы исследовать минимальное содержание криопротектора для долгосрочного хранения при -15 до -30°С при определенной концентрации NaCl, РНК-липоплексы были заморожены в присутствии комбинаций NaCl и либо сахарозы, либо трегалозы. Образцы замораживали при - 30°С и затем переносили в соответствующую температуру для длительного хранения (-15 или -30°С). После определенного периода хранения образцы анализировали и сохранение коллоидной стабильности анализировали путем измерения размера частиц с использованием PCS.
Результаты: В то время как характеристики РНК-липоплексных частиц могли сохраняться во время замораживания в присутствии до 70 мМ NaCl, в данных экспериментах можно было наблюдать дополнительный эффект, способствующий дестабилизации коллоидной стабильности. Также была подтверждена приемлемая стабилизация характеристик частиц после замораживания, например, для комбинации 60 мМ NaCl и 20% сахарозы, с течением времени размер частиц данных композиций значительно увеличился (фиг. 32 и 33) при температуре хранения -15°С. Данный эффект уменьшался при хранении при -30°С (фиг. 34 и 35).
Стабильность РНК-липоплексов при заданном содержании NaCl зависит от количества криопротектора. Количество криопротектора, необходимого для стабилизации, увеличивается с увеличением содержания соли в растворе для хранения. Данный эффект не зависит от типа сахара, используемого в качестве криопротектора. Композиции РНК-липоплексов для длительного хранения в замороженном состоянии при -15 или -30°С должны включать содержание криопротектора, указанное в таблице 9.
Пример 26: Длительное хранение с различными криопротекторами
Стабилизация в течение 9 месяцев в присутствии 22% (масс./об.) моно- или бимолекулярных сахаров возможна с от 10 до 40 мМ NaCl. Данные составы могут быть заморожены при температуре от -15 до -40°С и могут храниться при соответствующей температуре для длительного хранения. В присутствии от 12,6 до 16,8% (масс./об.) декстрана возможны от 10 до 30 мМ NaCl.
Способ: Для исследования минимального содержания типичных криопротекторов, таких как сахароза, трегалоза, глюкоза и их смеси, включая декстраны, необходимого для длительного хранения при температуре -20°С, РНК-липоплексы замораживали при фиксированном содержании криопротектора в сочетании с различными концентрациями NaCl. Для мономерных или димерных молекулярных криопротекторов, таких как глюкоза, сахароза и трегалоза, была подобрана концентрация 22% (масс./об.). Данные составы замораживали и хранили при от -15 до -40°С, и долгосрочную стабильность исследовали путем измерения размера частиц с использованием PCS после определенного времени хранения.
Для составов, содержащих смеси полимерного декстрана, композиции, указанные в таблице 9.5.1, были скорректированы. Образцы замораживали и хранили при -20°С. После определенного времени хранения образцы анализировали и сохранение коллоидной стабильности анализировали путем измерения размера частиц.
Результаты: Для всех исследованных мономерных или димерных молекулярных криопротекторов была найдена максимальная концентрация NaCl, которая не должна превышаться для обеспечения долгосрочной стабилизации РНК-липоплексов в замороженном состоянии. Принимая во внимание, что 60 и 80 мМ NaCl приводили к быстрой дестабилизации липоплексов, коллоидные свойства могли сохраняться в течение по меньшей мере 9 месяцев, когда концентрация NaCl составляла ≤40 мМ при хранении при -20°С (таблица 10 и фиг. от 36 до 38). Не было обнаружено различий в стабилизационной эффективности для сахарозы, трегалозы и глюкозы. Для состава, включающего 20 мМ NaCl, не было обнаружено различий в долговременной стабильности, когда образцы замораживали и хранили при температуре от -15 до -40°С (фиг. 39).
Поскольку составы, содержащие декстран, были исследованы с более низким содержанием крио протекторов (от 12,6 до 16,8% (масс./об.)), эффективность стабилизации сравнима или лучше при сравнении с моно- или бимолекулярными сахарами (фиг. 40).
Пример 27: Лиофильная сушка
a) Замораживание-оттаивание
Для определения наиболее эффективной концентрации крио/лиопротекторов были проведены исследования по размораживанию-оттаиванию. РНК-липоплексные композиции размораживали в 5 мМ HEPES, 80 мМ NaCl, 2,6 мМ EDTA с добавлением 10%, 15%, 20%, 25% и 30% трегалозы. Размер частиц определяли до и после хранения при -20°С. Агрегация частиц наблюдалась в составах, замороженных в отсутствие трегалозы, и размер их частиц не определялся. Согласно фигуре 41, композиции, замороженные с крио/лиопротектором, показали зависимую от концентрации криозащиту, размер частиц увеличивается при более низких концентрациях лио/криопротектора. При 22% масс./об. трегалозы наблюдалось только минимальное увеличение размера частиц при Sf/Si (Sf = конечный размер, Si = начальный размер), равном 1,04, который, будучи менее 1,3, все еще считается приемлемым. При более низких концентрациях трегалозы отношения Sf/Si были выше. Соотношения Sf/Si, полученные из исследований замораживания-оттаивания, коррелировали с соотношениями Sf/Si, полученными от тех же составов после лиофильной сушки и восстановления.
b) Восстановление и стабильность частиц
РНК-липоплексные составы, приготовленные в 5 мМ HEPES, 2,6 мМ EDTA, 0 мМ, 10 мМ, 20 мМ, 30 мМ, 40 мМ, 50 мМ, 60 мМ, 80 мМ NaCl и 5%, 10%, 15% и 22% трегалозы, подвергали лиофильной сушке. Все лиофильно высушенные образцы показали хороший внешний вид кека. Образцы восстанавливали в исходном объеме 0,9%-ным раствором NaCl. Все лиофильно высушенные составы РНК-липоплекса мгновенно растворялись при восстановлении с 0,9%-ным раствором NaCl или WFI. Определяли изменение размера частиц в лиофильно высушенных РНК-липоплексных составах, приготовленных в 22%-ной трегалозе после восстановления с 0,9%-ным раствором NaCl или водой.
Согласно фигуре 42, размер частиц оставался стабильным во всех лиофильно высушенных РНК-липоплексных составах, содержащих трегалозу, после лиофильной сушки и восстановления. Небольшое уменьшение размера РНК-липоплексов наблюдалось, когда лиофильно высушенные образцы восстанавливали с 0,9%-ным NaCl по сравнению с лиофильно высушенными образцами, восстановленными с водой. Была обнаружена корреляция между соотношением NaCl и трегалозы и стабильностью частиц. Размер РНК-липоплексных частиц увеличивался в композициях, полученных при более низких концентрациях трегалозы и более высоких концентрациях NaCl.
c) Эксперименты на культуре клеток с лиофильно высушенными РНК-липоплексными составами
Были проведены эксперименты по трансфекции in vitro лиофильно высушенных РНК-липоплексных составов, кодирующих люциферазу, приготовленных в 22%-ной трегалозе при различных концентрациях NaCl. Лиофильно высушенные образцы восстанавливали с 0,9%-ным раствором NaCl.
Согласно фигуре 43, лиофильно высушенные РНК-липоплексные составы, приготовленные в 22%-ной трегалозе при различных концентрациях NaCl, показали сходные уровни трансфекции luc-РНК в дендритных клетках. Корреляции между концентрацией NaCl, присутствующей в РНК-липоплексном составе, и трансфекцией РНК in vitro не обнаружено. Лиофильно высушенные образцы показали сходную или даже лучшую трансфекцию luc-РНК по сравнению с контролем со свежим РНК-липоплексом.
d) Исследования по стабильности
Лиофильно высушенные РНК-липоплексные составы, содержащие 10% трегалозы, 22% трегалозы и 0 мМ, 20 мМ, 40 мМ, 60 мМ и 80 мМ NaCl, исследовали в целях изучения стабильности при 4°С, 25°С и 40°С (1 месяц и 6 месяцев). После восстановления в исходном объеме 0,9%-ным раствором NaCl образцы характеризовали по размеру частиц и целостности РНК (% полноразмерной РНК).
Согласно фигурам 44 и 45, размеры различных РНК-липоплексов существенно не изменялись с течением времени независимо от состава или температуры хранения. Интересно, что более низкие количества криопротектора (например, 10%) достаточны для поддержания стабильности частиц в лиофилизированной композиции, тогда как в случае замороженной композиции требуется его большее количество (например, 22%). Целостность РНК (% полноразмерной РНК) в лиофильно высушенных образцах после 6 месяцев хранения при 4°С варьировалась от 94% до 100% и для составов РНК(лип), хранящихся при 25°С, варьировалась от 85% до 94%. Однако никакой корреляции с соотношением концентрации трегалозы и концентрации NaCl или временем хранения не было выявлено.
1. Способ непрерывного поточного изготовления РНК-липоплексных частиц, включающий смешивание
(i) раствора, содержащего РНК, и имеющего ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от около 50 мМ до около 300 мМ; и
(ii) раствора, содержащего катионные липосомы, в контролируемых условиях смешивания РНК и катионных липосом, таким образом, чтобы были получены РНК-липоплексные частицы, имеющие средний диаметр, который находится в диапазоне от около 300 нм до около 500 нм, и имеющие индекс полидисперсности менее чем 0,2, в котором объединенный поток первого раствора и второго раствора характеризуется числом Рейнольдса более 300.
2. Способ по п. 1, в котором раствор, содержащий катионные липосомы, представляет собой липосомный коллоид, получаемый способом, включающим инжектирование липидного раствора в этаноле в водную фазу с получением липосомного коллоида, где концентрация по меньшей мере одного из липидов в липидном растворе соответствует равновесной растворимости по меньшей мере одного липида в этаноле или превышает ее.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором раствор, содержащий РНК, и раствор, содержащий катионные липосомы, являются водными растворами.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором применяется скорость потока, которая позволяет смешивать раствор, содержащий РНК, и раствор, содержащий катионные липосомы.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором поток характеризуется числом Рейнольдса от около 500 до около 2100.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором контролируемые условия смешивания включают контроль за соотношением компонентов при смешивании раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором контролируемые условия смешивания включают контроль относительных объемов раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, которые должны быть смешаны.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором соотношение компонентов при смешивании РНК и катионных липосом контролируется путем использования идентичных смешиваемых объемов (об./об.) раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, и корректировки концентраций РНК и катионных липосом в соответствующих растворах.
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором контролируемые условия смешивания выбраны для поддержания характеристик РНК-липоплексных частиц, избегая при этом закупоривания.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где способ включает использование смесительного элемента Y- или Т-типа.
11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором смесительный элемент Y-типа или Т-типа имеет диаметр от около 1,2 мм до около 50 мм.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где способ включает использование шприцевого насоса, в котором два шприца, причем один содержит раствор, содержащий катионные липосомы, и другой содержит раствор, содержащий РНК, вставлены параллельно в один и тот же насос.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где способ включает использование герметичного сосуда, мембранного насоса, шестеренного насоса, насоса с магнитной левитацией или перистальтического насоса в сочетании с датчиками скорости потока, необязательно с петлей обратной связи для контроля в режиме онлайн и регулирования скорости потока в реальном времени.
14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором смесь раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего липосомы, содержит хлорид натрия в концентрации от около 50 мМ до около 300 мМ или имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от около 50 мМ до около 300 мМ.
15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором смесь раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего липосомы, имеет ионную силу, составляющую по меньшей мере около 50 мМ.
16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором в паттерне рассеяния рентгеновских лучей РНК-липоплексы характеризуются одним брегговским пиком при около 1 нм-1, причем ширина пика составляет менее чем 0,2 нм-1.
17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который находится в диапазоне от около 350 нм до около 400 нм.
18. Композиция для доставки РНК в клетки-мишени, содержащая РНК-липоплексные частицы, которые получены способом по любому из пп. 1-17, где РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид и имеют средний диаметр, который находится в диапазоне от около 300 нм до около 500 нм, и индекс полидисперсности менее чем 0,2.
19. Композиция по п. 18, где РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0.
