Лекарственное средство для лечения псориаза и способ его получения

Группа изобретений относится к медицине, в частности к лекарственному средству для лечения псориаза, а также к способу его получения. Настоящее лекарственное средство содержит от 800 до 1000 г таллового жира, от 250 до 350 г смолы лиственницы, от 450 до 550 г пчелиного воска, от 2 до 3 г камеди, от 40 до 50 г прополиса, от 200 до 250 г Alkanna tinctoria, от 200 до 250 г квасцов, от 150 до 200 г можжевелового дегтя. Осуществление группы изобретений позволяет расширить арсенал лекарственных средств для лечения псориаза, а также уменьшить толщину эпидермиса, снизить пролиферацию лимфоцитов и быстрее достичь положительного эффекта от лечения. 2 н.п. ф-лы, 9 ил.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к лекарственному средству, разработанному для лечения псориаза, и к способу его получения.

Уровень техники, к которому относится изобретение

Псориаз представляет собой системное воспалительное заболевание, характеризующееся белой кожной сыпью на красном основании. Псориаз в основном наблюдается на коленях и локтях и вызывает тяжелый зуд у пациентов. Хотя неясно, чем вызывается псориаз, который является неинфекционным заболеванием, известно, что стрессовые факторы являются пусковым эффектом для псориаза в случаях, когда механизм защиты организма ослабевает.

В 2008 году наблюдение, что крем, содержащий имиквимиб (IMQ) в качестве активного ингредиента (Aldara содержит 5% имиквимиба, коммерческое название), используемый местным путем для лечения генитальных бородавок, имеет побочный эффект в виде индукции псориаз-подобных очагов повреждения у человека, и выявление того же эффекта у мышей, привлекло внимание к этому крему [1]. В исследованиях было убедительно показано, что IMQ, который связывается с Toll-подобными рецепторами TLR7 и TLR8 и активирует системный каскад воспаления в качестве иммунного активатора, индуцирует системный ответ после местного применения у мышей, что приводит к псориазу [2, 3, 4, 5, 6]. В настоящее время было решено установить шесть основных гистопатологических и иммуногистохимических положений для эффективности и стандартизации доклинических испытаний псориаза в модели на мышах. Они являются следующими:

1. Наблюдение гиперпролиферации эпидермальных кератиноцитов и изменения эпидермальной дифференцировки,

2. Папилломатоз,

3. Инфильтрация T-клеток, дендритных клеток, макрофагов и нейтрофилов,

4. Наблюдение функциональных ролей T-клеток,

5. Изменения васкуляризации дермы, и

6. Способность демонстрировать ответ на средства против заболевания.

В настоящее время IMQ-индуцируемую модель используют в качестве идеальной доклинической модели, которая удовлетворяет указанным шести положениям.

Хотя еще не существует способа лечения, который полностью излечивает псориаз, дерматологи пытаются его контролировать посредством различных лекарственных средств. Подкожные иммунологические средства, которые недавно начали использовать, к сожалению, не являются частой и подходящей возможностью при лечении заболевания вследствие их серьезных побочных эффектов (таких как иммуносупрессия, токсичность и т.д.), госпитализации и затруднений наблюдения, высокой стоимости и неспособности предотвращать рецидив заболевания [7].

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка лекарственного состава для лечения псориаза.

Подробное описание изобретения

На прилагаемых чертежах проиллюстрировано "лекарственное средство для лечения псориаза и способ его получения", где;

На фиг.1 представлено графическое изображение толщины эпидермиса.

На фиг.2 представлено графическое изображение анализа пролиферации лимфоцитов.

На фиг.3 представлено графическое изображение анализа T-регуляторных клеток в культуре лимфоцитов.

На фиг.4 представлено графическое изображение соотношения массы селезенки и массы тела.

На фиг.5 представлено графическое изображение изменения толщины уха на протяжении эксперимента.

На фиг.6 представлено графическое изображение изменения покраснения кожи на протяжении эксперимента.

На фиг.7 представлено графическое изображение изменения толщины кожи на протяжении эксперимента.

На фиг.8 представлено графическое изображение изменения образования бляшек на коже на протяжении эксперимента.

На фиг.9 представлено графическое изображение изменения общего индекса площади и тяжести псориаза (PASI) на протяжении эксперимента.

Лекарственное средство для лечения псориаза по настоящему изобретению содержит от 800 до 1000 г таллового жира, от 250 до 350 г смолы лиственницы, от 450 до 550 г пчелиного воска, от 2 до 3 г камеди, от 40 до 50 г прополиса, от 200 до 250 г Alkanna tinctoria, от 200 до 250 г квасцов, от 150 до 200 г можжевелового дегтя. Способ продуцирования лекарственного средства против псориаза по настоящему изобретению включает стадии

- плавления таллового жира при 300°C посредством непрерывного перемешивания его с пчелиным воском,

- добавления сначала камеди, а затем прополиса, к полученной расплавленной смеси,

- добавления к смеси растертой смолы лиственницы вместе с квасцами,

- наконец, добавления к смеси растертой Alkanna tinctoria и можжевелового дегтя,

- получения однородной смеси посредством непрерывного перемешивания,

- фильтрации однородной смеси,

- получения лекарственного средства для лечения псориаза, который является конечный продуктом, в форме элюата.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, полученный элюат применяют в качестве мази путем нанесения его на поверхность кожи пациента с псориазом, где заметен очаг повреждения.

Экспериментальные исследования

Моделирование псориаза у мышей и применение лекарственного средства

Крем под названием Aldara (Meda Pharma, 3M Health Care), содержавший 5% имиквимиб (IMQ), наносили один раз в сутки в течение 6 суток на побритые спины и правые уши взрослым самцам мышей BALB/c в возрасте 8-11 недель, так чтобы всего было нанесено 62,5 мг крема в сутки на животное, тем самым обеспечивая псориатическое воспаление в модели на животных. На побритые области животных в контрольной группе наносили вазелин. В группе положительного контроля перорально вводили 1 мг/кг Mtx (метотрексат) в сутки. Лекарственное средство вводили перорально в дозе 5 мг/кг один раз в сутки в ходе эксперимента. Введение лекарственного средства животным в группе, где тестировали полутерапевтический эффект лекарственного средства, начинали через 1 сутки после начала индукции псориаза посредством IMQ, и продолжали до конца периода эксперимента. Массу тела, и покраснение, шелушение и утолщение кожи определяли и оценивали каждые сутки в соответствии с индексом площади и тяжести псориаза (PASI) для мониторинга общего состояния здоровья животных и индукции псориаза посредством IMQ. В соответствии с моделью, утолщение кожи правого уха также регистрировали регулярно с дня начала эксперимента.

В конце применения животных подвергали анестезии изофлураном, а затем умерщвляли посредством смещения шейных позвонков. Размер и массу тканей селезенки регистрировали.

Анализ толщины эпидермиса

Образцы кожи, взятые со спины мышей, которых обрабатывали IMQ, после иссечения, фиксировали в формалине и приготавливали парафиновые блоки. Для каждого животного получали десять срезов толщиной 10 микрометров с равными интервалами. Срезы окрашивали трихромом по Массону, и получали их изображения с помощью микроскопа. Толщину эпидермиса вычисляли путем вычисления среднего значения для измерений, проведенных в 5 различных точках для каждого среза.

Выделение, окрашивание и стимуляция T-лимфоцитов из ткани селезенки

После иссечения ткани селезенки разделяли на части меньшего размера скальпелем в чашке Петри, содержавшей среду RPMI, затем их тщательно измельчали посредством пастеровской пипетки и промывали, не позволяя разделения. После пропускания суспензии клеток через 70-мкм фильтр, ее отбирали в PBS и центрифугировали в течение 10 минут при 2000 об/мин. Преципитированные клетки растворяли в стерильном лизирующем растворе, содержавшем 0,037 г/л EDTA, 1 г/л бикарбоната калия и 8,29 г/л хлорида аммония, и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Супернатант, полученный после центрифугирования при 800 об/мин в течение 10 минут, растворяли в PBS и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 минут. Преципитированные клетки растворяли в 10 мл среды cRPMI и определяли количество клеток.

К выделенным клеткам добавляли CFSE для окрашивания. Этот процесс и остальные действия проводили в темноте. Затем клетки, инкубированные при +4°C в течение 6 минут, помещали в cRPMI и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут. К преципитированным клеткам добавляли cRPMI, а затем их вновь центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Преципитированные клетки ресуспендировали в среде cRPMI и определяли количество клеток. В каждую лунку высевали 55×10⁵ клеток. Лимфоциты стимулировали CD3 и CD28. Культуры помещали в инкубатор при 37°C на 3 суток.

Анализ пролиферации лимфоцитов

Выделенные лимфоциты наносили в каждую лунку 48-луночных планшетов в концентрации 5×10⁵ клеток на лунку. Лимфоциты, окрашенные CFSE, культивировали в течение 3 суток для анализа пролиферации. Получали нестимулированные и стимулированные антителом против CD3+CD28 (CDmix) культуры лимфоцитов в каждой группе. На третьи сутки проводили анализ пролиферации лимфоцитов посредством проточной цитометрии. Флуоресцентное окрашивание посредством CFSE может быть определено в FL-1 в проточной цитометрии. После анализа пролиферацию T-клеток сравнивали в присутствии или в отсутствии стимулов.

Анализ T-регуляторных клеток в культурах лимфоцитов

После культивирования выделенных лимфоцитов в течение 3 суток исследовали количества CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ клеток. После однородной диссоциации клеток посредством пипетирования в лунках, их отбирали из этого однородного раствора и помещали в проточно-цитометрические пробирки. Клетки, к которым добавляли PBS, центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. В пробирки добавляли CD4 и CD25, и встряхивали и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 20 минут. Затем добавляли буферный раствор для окрашивания и центрифугировали при 250 г в течение 10 минут. К осадку клеток добавляли буфер FoxP3, их встряхивали и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут. Затем их центрифугировали при 500 g в течение 5 минут. К осадку клеток добавляли буфер для окрашивания, и их встряхивали и центрифугировали при 500 г в течение 5 минут. К осадку клеток добавляли раствор C буфера FoxP3, и их встряхивали и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Затем добавляли буферный раствор для окрашивания, и центрифугировали при 500 g в течение 5 минут. Этот процесс повторяли еще один раз для осадка клеток. Затем добавляли антитело FoxP3 и проводили процесс встряхивания медленно. Их инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 30 мнут, а затем добавляли буферный раствор для окрашивания и центрифугировали при 500 g в течение 5 минут. К осадку клеток добавляли буферный раствор для анализа, и их анализировали в устройстве для проточной цитометрии.

В литературе часто можно увидеть применение при псориазе лекарственных средств, полученных с использованием традиционных способов [3]. В частности, в китайской и индийской медицине определенные смеси трав используются в данной области столетиями. Недавно, было обнаружено, что эти традиционные лекарственные средства проходят тестирование в контролируемых доклинических испытаниях. Важной причиной этого является простота применения стандартизированной модели на мышах с IMQ, которая стала широко предпочитаемой для практики доказательной медицины при псориазе. При исследовании химического поведения этих соединений из трав, которые традиционно используются при псориазе и сходных кожных заболеваниях, обнаруживаются выраженные противовоспалительные свойства этих смесей. Эти противовоспалительные системные признаки кажутся перспективными, несмотря на ограниченное количество положительных данных как в доклинической, так и в клинической гистопатологии [3]. Авторы изобретения продемонстрировали, что лекарственное средство, которое разработано для лечения псориаза и полученное в форме вышеупомянутого состава, является эффективным в патофизиологии псориаза, посредством тестирования его в модели на мышах с IMQ аналогично образцам в литературе.

Активность продукта может быть продемонстрирована с помощью графиков, полученных в ходе разработки изобретения, следующим образом:

Фиг.1. В экспериментах, проведенных на мышах, наблюдали значительное снижение толщины эпидермиса по сравнению с контрольной группой в результате применения лекарственного средства при измерении, проведенном для образцов, полученных из кожи, на которую наносили IMQ. Было описано, что это снижение было более значительным по сравнению с мышами, которым вводили MTX.

Фиг.2. Пролиферация лимфоцитов согласуется с патологией псориаза. Было обнаружено, что пролиферация клеток у мышей, которым наносили лекарственное средство, значительно снижалась по сравнению с мышами, которым вводили IMQ и MTX.

Фиг.3. В культурах лимфоцитах, в которых проводили анализ T-регуляторных клеток, было обнаружено, что количество CD4⁺/CD25⁺/FoxP3⁺ клеток было более высоким у мышей, которым вводили лекарственное средство, чем у мышей, которым вводили IMQ.

Фиг.4. Не наблюдалось значимых различий между группами с точки зрения индекса массы тела/селезенки.

Фиг.5. В результате измерений, проведенных в областях ушей, на которые наносили IMQ, у мышей на протяжении эксперимента, не было обнаружено изменений в группе с нанесением вазелина, в то время как в других группах происходило утолщение; однако между группами не наблюдали значимых отличий.

Фиг.6. В соответствии с оценкой покраснения в соответствии со шкалой PASI для области спины мышей, на которую наносили IMQ, было обнаружено, что покраснение уменьшалось у мышей, которым наносили лекарственное средство, на 6-сутки. В соответствии с оценкой толщины по шкале PASI для области спины мышей, на которую наносили IMQ, было определено, что толщина уменьшалась как в группе MTX (на 5-е сутки), так и в группе лекарственного средства (на 4-е сутки).

Фиг.7. В соответствии с оценкой образования бляшек по шкале PASI для области спины мышей, на которую наносили IMQ, было обнаружено, что шелушение уменьшалось в группах как MTX, так и лекарственного средства, на 4-е сутки.

Фиг.8. В соответствии с общей оценкой по шкале PASI наблюдалось снижение как в группе MTX, так и в группе лекарственного средства, на 4-е сутки.

ССЫЛКИ:

[1]. Walter, A., Schäfer, M., Cecconi, V., Matter, C., Urosevic-Maiwald, M., Belloni, B., Schönewolf, N., Dummer, R., Bloch, W., Werner, S., Beer, H. D., Knuth, A. and van den Broek, M., 2013. Aldara activates TLR7-independent immune defence. Nature Communications, 4, 1560.

[2]. Nadeem, A., Al-Harbi, N. O., Al-Harbi, M. M., El-Sherbeeny, A. M., Ahmad, S. F., Siddiqui, N., Ansari, M. A., Zoheir, K. M., Attia, S. M., Al-Hosaini, K. A. and Al-Sharary, S. D., 2015. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation is suppressed by BET bromodomain inhibitor in mice through RORC/IL-17A pathway modulation. Pharmacological Research, 99, 248-257.

[3]. Arora, N., Shah, K. and Pandey-Rai, S., 2016. Inhibition of imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis in mice by herbal extracts from some Indian medicinal plants. Protoplasma, 253 (2), 503-515.

[4]. Chen, H. H., Chao, Y. H., Chen, D. Y., Yang, D. H., Chung, T. W., Li, Y. R. and Lin, C. C., 2016. Oral administration of acarbose ameliorates imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis in a mouse model. International immunopharmacology, 33, 70-82.

[5]. Di, T. T., Ruan, Z. T., Zhao, J. X., Wang, Y., Liu, X., Wang, Y. and Li, P., 2016. Astilbin inhibits Th17 cell differentiation and ameliorates imiquimod-induced psoriasis-like skin lesions in BALB/c mice via Jak3/Stat3 signaling pathway. International immunopharmacology, 32, 32-38.

[6]. Jia, H. Y., Shi, Y., Luo, L. F., Jiang, G., Zhou, Q., Xu, S. Z. and Lei, T. C., 2016. Asymmetric stem-cell division ensures sustained keratinocyte hyperproliferation in psoriatic skin lesions. International journal of molecular medicine, 37(2), 359-368.

[7]. Krueger, J. G. and Bowcock, A., 2005. Psoriasis Pathophysiology: Current Concepts of Pathogenesis. Ann Rheum Dis, 64, il30.

1. Лекарственное средство для лечения псориаза, содержащее от 800 до 1000 г таллового жира, от 250 до 350 г смолы лиственницы, от 450 до 550 г пчелиного воска, от 2 до 3 г камеди, от 40 до 50 г прополиса, от 200 до 250 г Alkanna tinctoria, от 200 до 250 г квасцов, от 150 до 200 г можжевелового дегтя.

2. Способ получения лекарственного средства для лечения псориаза по п.1, характеризующийся стадиями:

- плавления таллового жира при 300°C посредством непрерывного перемешивания его с пчелиным воском,

- добавления сначала камеди, а затем прополиса к полученной расплавленной смеси,

- добавления к смеси растертой смолы лиственницы вместе с квасцами,

- наконец, добавления к смеси растертой Alkanna tinctoria и можжевелового дегтя,

- получения однородной смеси посредством непрерывного перемешивания,

- фильтрации однородной смеси,

- получения лекарственного средства для лечения псориаза, которое является конечным продуктом, в форме элюата.