Плазмидный вектор pesb для оценки устойчивости neisseria gonorrhoeae к бета-лактамным антибиотикам и способ его конструирования

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и медицине и представляет собой сконструированный плазмидный вектор, содержащий ген, кодирующий β-лактамазу расширенного спектра действия, способную гидролизовать пенициллины и цефалоспорины, и предназначенный для репликации в клетках Escherichia coli и Neisseria gonorrhoeae. Плазмида содержит плазмидную ДНК pbla_TEM-135 N. gonorrhoeae, из которой вырезан фрагмент гена bla и заменен на аналогичный фрагмент гена bla с мутацией GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser), что позволяет экспрессировать β-лактамазу расширенного спектра действия ТЕМ-20, способную гидролизовать пенициллины и цефалоспорины. Изобретение также раскрывает способ конструирования плазмидного вектора. Настоящее изобретение позволяет получить плазмидный вектор для оценки устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, включая препараты выбора для лечения гонококковой инфекции - цефалоспорины III поколения. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и медицине представляет собой сконструированный in vitro плазмидный вектор pESB, содержащий ген bla_TEM-20, кодирующий β-лактамазу расширенного спектра действия, который обладает способностью реплицироваться как в клетках E. coli, так и в клетках и N. gonorrhoeae и придает клеткам устойчивость к β-лактамным антибиотикам, включая пенициллины и цефалоспорины. Изобретение также включает способ конструирования плазмидного вектора pESB.

Уровень техники

Развитие множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) у возбудителя гонореи микроорганизма Neisseria gonorrhoeae представляет серьезную проблему. ВОЗ включила N. gonorrhoeae в список из 12 патогенов, представляющих глобальную угрозу и требующих безотлагательной разработки новых лекарственных препаратов (Tacconelli Е., Carrara Е., et al. Lancet Infect Dis. 2018, v. 18 (3), p. 318-327, doi:10.1016/S1473-3099(17)30753-3). Особое опасение вызывает то, что для каждого из препаратов, применяемых для лечения гонореи, обнаруживаются устойчивые к ним изоляты (Unemo М. and Shafer W.M. Clin Microbiol Rev. 2014, v. 27 (3), p. 587-613, doi:10.1128/CMR.00010-14). В настоящее время основным средством терапии гонококковой инфекции являются препараты бета-лактамного ряда: цефалоспорины III поколения - цефтриаксон и цефиксим (WHO Guidelines for the Treatment of Neisseria gonorrhoeae. 2016). Однако чувствительность гонококка к цефалоспоринам снижается с каждым годом, и в нескольких странах уже были зарегистрированы подтвержденные неудачи лечения цефтриаксоном в силу формирования устойчивости N. Gonorrhoeae к данному препарату (Attram N., Agbodzi В., et al. PloS One. 2019, v. 14 (10), p. E0223598, doi:10.1371/journal.pone.0223598; Unemo M., Seifert H.S., et al. Nat Rev Dis Primers. 2019, v. 5 (1), p. 79, doi:10.1038/s41572-019-0128-6).

Антимикробное действие бета-лактамных антибиотиков основано на подавлении образования пептидогликановых связей, что нарушает синтез клеточной стенки бактерий. Резистентность к этим препаратам N. Gonorrhoeae объясняется мутациями в хромосомных генах ponA, penA, porB и mitrR, а также наличием гена bla, кодирующего β-лактамазу - фермент, гидролизующий связь C-N в β-лактамном кольце антибиотика (Tooke C.L., Hinchliffe P., et al. J Mol Biol. 2019, v. 431 (18), p. 3472-3500, doi:10.1016/j.jmb.2019.04.002).

У N. Gonorrhoeae нет β-лактамаз, кодируемых хромосомными генами. Ген устойчивости bla имеет длину 861 п.о. и расположен на плазмиде. В настоящее время у гонококка насчитывают семь типов плазмид, ассоциированных с устойчивостью к пенициллинам: Asian (7426 bp), African (5599 bp), Toronto/Rio (5154 bp), Nimes (6798 bp), New Zealand (9309 bp), Johannesburg (4865 bp) and Australian (3269 bp) (Muller E.E., Fayemiwo S.A., et al. J Antimicrob Chemother. 2011, v. 66 (7), p.1514-7, doi:10.1093/jac/dkr162). Наличие фермента β-лактамазы вызывает значительное повышение уровня устойчивости N. Gonorrhoeae к пенициллинам (МПК_пен ≥ 16 мг/л) по сравнению с хромосомными мутациями (МПК_пен = 0,12-1 мг/л) (Shaskolskiy В., Dementieva Е., et al. PloS One. 2019, v. 14 (7), p. E0220339, doi:10.1371/joumal.pone.0220339).

В литературе представлена номенклатура β-лактамаз (ТЕМ-1, ТЕМ-2 и т.д.) в зависимости от аминокислотных последовательностей кодируемых ими белков (Leflon-Guibout V., Heym В., et al. Antimicrob Agents Chemother. 2000, v. 44 (11), p. 3232-4, doi:10.1128/AAC.44.11.3232-3234.2000). Традиционно пеницилиназа-продуцирующие изоляты N. Gonorrhoeae (PPNG) содержат плазмиду с геном bla_TEM-1, но в последнее время вариант гена bla_TEM-135 все чаще встречается в мировой популяции N. Gonorrhoeae. Ген bla_TEM-135 отличается от bla_TEM-1 одной заменой тимина на цитозин в 182 кодоне: Met182Thr (ATG→ACG). Однако варианты фермента ТЕМ-1 и ТЕМ-135 относятся к β-лактамазам обычного спектра действия и не способны гидролизовать цефалоспорины.

Гену bla_TEM-135 требуется всего одна нуклеотидная замена GGT→AGT, которая приведет к замене аминокислоты глицин на серии в кодоне 238 (Gly238Ser), что позволит экспрессировать β-лактамазу типа ТЕМ-20 т.н. «расширенного спектра действия», способную гидролизовать цефалоспорины. Существует риск появления у гонококков β-лактамаз расширенного спектра действия, что может поставить под вопрос применение цефалоспоринов III поколения в качестве основного препарата для терапии гонококковой инфекции. Этот вариант β-лактамазы уже встречается в природе, например у кишечной палочки Escherichia coli (Adator Е.Н., Narvaez-Bravo С., et al. Microorganisms. 2020, v. 8 (6), p. Doi:10.3390/microorganisms8060885). Наличие в клетке плазмиды pbla_TEM-20 приводит к повышению уровня МПК цефалоспоринов (Jeong S.H., Bae I.K., et al. J Clin Microbiol. 2004, v. 42 (7), p. 2902-6, doi:10.1128/JCM.42.7.2902-2906.2004), что обусловлено изменением конформации активного центра фермента за счет замены Gly238Ser, повышением его гибкости и формированием способности гидролизовать цефалоспорины, при этом сохраняя способность гидролизовать пенициллины.

Для оценки устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам используются искусственные векторы. Известны гонококковые челночные плазмидные векторы, которые реплицируются как в N. Gonorrhoeae, так и в Е. Coli., за счет наличия совместимых участков начала репликации (ориджинов репликации) и генов, которые кодируют белки инициации репликации. Например, вектор pFP10 получен из β-лактамазной плазмиды гонококка для экспрессии флуоресцентного белка (GFP) (Pagotto F.J., Salimnia Н., et al. Gene. 2000, v. 244 (1-2), p. 13-9, doi:10.1016/s0378-1119(99)00557-0). Вектор pLES2 был использован для создания трансляционной репортерной системы lacZ (Stein D.C., Silver L.E., et al. Gene. 1983, v. 25 (2-3), p. 241-7, doi:10.1016/0378-1119(83)90228-7). Эти векторы также содержат ген bla_TEM-1, кодирующий β-лактамазу обычного спектра действия. Однако до сих пор не было сконструировано искусственных векторных плазмидных ДНК, способных реплицироваться как в Е. Coli, так и в N. gonorrhoeae, и кодировать β-лактамазу расширенного спектра действия типа ТЕМ-20.

Из анализа уровня техники можно сделать вывод, что в настоящее время существует необходимость разработки плазмидного вектора для оценки устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, включая препараты выбора для лечения гонококковой инфекции - цефалоспорины III поколения.

Раскрытие сущности изобретения

В настоящем изобретении предложен плазмидный вектор pESB для оценки устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, в том числе к пенициллину и препаратам выбора - цефалоспоринам III поколения (цефтриаксону и цефиксиму), сконструированный на основе плазмидной ДНК pbla_TEM-135, полученной из N. gonorrhoeae и фрагмента гена bla с заменой глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser) GGT→AGT. позволяющий экспрессировать β-лактамазу расширенного спектра действия ТЕМ-20, способную гидролизовать пенициллины и цефалоспорины.

Предлагаемый плазмидный вектор выгодно отличается от известных из уровня техники изобретений тем, что может реплицироваться в грамотрицательных бактериях, таких как Е. coli и N. gonorrhoeae, в силу присутствия в структуре вектора специфичных ориджинов репликации (ori1, ori2, ori3), а также генов repA и repB, кодирующих белки инициации репликации. Благодаря наличию совместимых сайтов репликации с непатогенными бактериями, плазмидный вектор pESB может быть сконструирован и получен путем трансформации клеток Е. coli, что избавляет от необходимости манипуляций с патогенными видами бактерий, требующих соответствующих условий безопасности. Заявленный вектор может использоваться в клеточных моделях для оценки уровней устойчивости Е. coli и N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам β-лактамного ряда, включая пенициллины и цефалоспорины разных поколений.

В своем первом аспекте данное изобретение обеспечивает плазмидный вектор pESB для оценки устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, содержащий фрагмент плазмидной ДНК pbla_TEM-135 N. gonorrhoeae и фрагмент гена bla с мутацией GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser), позволяющий экспрессировать β-лактамазу расширенного спектра действия ТЕМ-20, способную гидролизовать пенициллины и цефалоспорины.

В одном из воплощений плазмидный вектор характеризуется тем, что обладает способностью к репликации как в клетках Е. coli, так и в клетках N. gonorrhoeae за счет наличия участков начала репликации, совместимых с грамотрицательными бактериями.

В еще одном из воплощений плазмидный вектор характеризуется тем, что с его помощью можно проводить оценку устойчивости клеток N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, включая пенициллины и цефалоспорины, посредством трансформации клеток N. gonorrhoeae плазмидным вектором pESB, с последующим выращиванием клеток на селективной среде, содержащей пенициллины или цефалоспорины, и регистрацией выросших колоний клеток.

В своем следующем аспекте данное изобретение обеспечивает способ конструирования плазмидного вектора pESB для оценки устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, содержащего плазмидную ДНК pbla_TEM-135 N. gonorrhoeae и фрагмент гена bla с мутацией GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser), позволяющего экспрессировать β-лактамазу расширенного спектра действия, способную гидролизовать пенициллины и цефалоспорины, и обладающего способностью к репликации в клетках Е. coli и N. gonorrhoeae. Способ включает следующие стадии:

а) выделение плазмиды pbla_TEM-135 из клинического штамма N. gonorrhoeae, обладающего природной устойчивостью к пенициллинам.

б) получение ПЦР-фрагмента путем амплификации фрагмента гена bla из плазмидной ДНК pbla_TEM-135 с одновременным сайт-направленным мутагенезом, обеспечивающим внесение мутации GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser) гена bla, с использованием праймеров, последовательности которых представлены в Перечне последовательностей, SEQ ID: 1 и SEQ ID: 2;

в) последовательная обработка ПЦР-фрагмента и плазмиды pbla_TEM-135 эндонуклеазами для получения липких концов.

г) обработка лигазной смесью линеаризованной плазмиды pbla_TEM-135 и ПЦР-фрагмента с липкими концами с целью образования фосфодиэфирных связей между линеаризованной плазмидой и ПЦР-фрагментом для получения плазмиды с целевым ПЦР-фрагментом;

г) трансформация клеток E. coli, полученной плазмидой с целевым ПЦР-фрагментом, а также выращивание клеток с последующим пересевом на селективную среду, содержащую цефтриаксон - цефалоспорин III поколения.

д) отбор устойчивых к цефтриаксону колоний Е. coli с последующим выделением плазмидной ДНК в виде конечного плазмидного вектора pESB.

Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из прилагаемых фигур, подробного описания и формулы изобретения.

Краткое описание фигур и таблиц

Фигура 1. Карта плазмидного вектора pESB длиной 5154 пар оснований, содержащего ген устойчивости bla_TEM-20 (ampR) к β-лактамным антибиотикам, включая пенициллины, цефалоспорины. Вектор включает в себя три участка начала репликации (ori1, ori2, ori3), совместимых с грамотрицательными бактериями, а также гены repA и repB кодирующие белки инициации репликации.

Фигура 2. Результаты оценки устойчивости штаммов N. gonorrhoeae к цефалоспорину III поколения (цефиксим) с помощью диско-диффузионного метода. Ингибирующая зона действия антибиотика сопоставима с МПК штамма и выражена в миллиметрах. Чем больше ингибирующая зона (зона отсутствия роста), тем чувствительнее штамм к данному АМП. На фотографии (а) показана зона отсутствия роста (~65 мм) контрольного штамма дикого типа АТСС 49226 на среде с цефиксимом, охарактеризованного как чувствительного к цефалоспоринам. На фотографии (б) показана зона отсутствия роста (~10 мм) штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226, трансформированного плазмидным вектором pESB, экспрессирующим β-лактамазу расширенного спектра действия ТЕМ-20, охарактеризованного как устойчивого к цефалоспоринам.

Таблица 1. Результаты оценки устойчивости Neisseria gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам методом серийных разведений на селективной среде с антимикробными препаратами. Оценка чувствительности по критерию EUCAST (S - чувствительный; R - устойчивый).

Осуществление изобретения

Целью изобретения являлось создание плазмидного вектора pESB для оценки устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, включая пенициллины и цефалоспорины. Вектор на основе плазмиды pbla_TEM-135 N. gonorrhoeae и фрагмента гена bla с мутацией GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser), позволяет экспрессировать β-лактамазу расширенного спектра действия ТЕМ-20, способную гидролизовать пенициллины и цефалоспорины. Предлагаемый плазмидный вектор может реплицироваться в грамотрицательных бактериях, таких как Е. coli и N. gonorrhoeae благодаря наличию специфичных ориджинов репликации (ori1, ori2, ori3) а также генов repA и repB, кодирующих белки инициации репликации. С помощью плазмидного вектора pESB можно проводить оценку устойчивости клеток N. gonorrhoeae к пенициллинам и цефалоспоринам, посредством трансформации клеток N. gonorrhoeae плазмидным вектором pESB, с последующим выращиванием клеток на селективной среде, содержащей пенициллины или цефалоспорины, и регистрацией выросших колоний клеток.

Заявленное изобретение включает также способ конструирования плазмидного вектора pESB.

Конструирование предложенного вектора может быть осуществлено с помощью следующих способов:

I) Химический синтез как конечного плазмидного вектора pESB. так и части гена bla с мутацией GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser) (такие услуги предоставляет, например, компания ЗАО «Евроген» https://evrogen.ru/services/ges/gene-synthesis);

II) В силу естественной компетентности N. gonorrhoeae для создания плазмидного вектора pESB может быть применен метод гомологичной рекомбинации фрагментов ДНК. Одним из таких фрагментов является часть гена bla с заменой GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser), полученная методом синтеза, либо методом с помощью ПЦР с одновременным сайт-направленным мутагенезом, обеспечивающим внесение мутации GGT→AGT. Однако метод гомологичной рекомбинации подразумевает включение уникальных последовательностей DUS длиной 10-12 пар оснований, с помощью которых происходит фланкирование части гена bla с заменой GGT→AGT. Последовательности DUS распознаются бактерией N. gonorrhoeae с помощью пилей IV типа, после чего происходит захват целевого фрагмента части гена bla с заменой GGT→AGT. После проведения процедуры трансформации в хромосоме гонококка должен произойти процесс гомологичной рекомбинации, в результате чего естественными механизмами клетки будет проведена замена части гена bla в плазмиде pbla_TEM-135 клинического штамма N. gonorrhoeae, обладающего природной устойчивостью к пенициллинам, на фрагмент гена bla с заменой GGT→AGT, после чего можно будет произвести отбор устойчивых к цефтриаксону колоний N. gonorrhoeae с последующим выделением плазмидной ДНК в виде конечного плазмидного вектора pESB. Этот метод описан и уже успешно применятся как для внесения целевых генетических замен, так и для замены целых локусов в бактериальной хромосоме (Callaghan М.М. and Dillard J.P. Methods Mol Biol. 2019, v. 1997 p. 143-162, doi:10.1007/978-1-4939-9496-0_10; Dillard J.P. Curr Protoc Microbiol. 2011, v. Chapter 4 p. Unit4A 2, doi:10.1002/9780471729259.mc04a02s23; Duffin P.M. and Seifert H.S. FEMS Microbiol Lett. 2012, v. 334 (1), p. 44-8, doi:10.1111/j.1574-6968.2012.02612.x).

III) Направленное редактирование плазмиды pbla_TEM-135 клинического штамма N. gonorrhoeae, обладающего природной устойчивостью к пенициллинам. Внесение замены GGT→AGT в ген bla, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser) с помощью мутагенной цепной реакции с применением методик генетического редактирования по типу CRISPR-Cas с последующим выделением плазмидной ДНК в виде конечного плазмидного вектора pESB

IV) Предпочтительным способом конструирования заявленного вектора является выделение плазмиды pbla_TEM-135 из клинического штамма N. gonorrhoeae, обладающего природной устойчивостью к пенициллинам, и конструирование на ее основе вектора pESB путем получения ПЦР-фрагмента гена bla заданной длины с одновременным ПЦР сайт-направленным мутагенезом, обеспечивающим внесение мутации GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser), с последующей заменой части гена bla в исходной плазмиде pbla_TEM-135 с помощью рестрикции и лигирования вставки в вектор. На следующих этапах производится трансформация клеток E. coli полученной плазмидой с замененной частью гена bla, выращивание клеток с последующим пересевом на селективную среду, содержащую цефалоспорин III поколения, наконец, отбор устойчивых к цефтриаксону колоний Е. coli с последующим выделением плазмидной ДНК в виде конечного плазмидного вектора pESB;

Заявленное изобретение подразумевает процедуру оценки устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам. Процедура оценки устойчивости включает измерение МПК штамма антимикробным препаратам. Реализация оценки устойчивости может быть осуществлена с помощь следующих способов:

I) Метод серийных разведений антибиотика с последующим добавлением его в плотную среду и культивированием микроорганизма. Микроорганизм высевают на чашки Петри, содержащие селективную среду с разными концентрациями антимикробного препарата. После инкубирования в оптимальных для данного микроорганизма условиях проводится оценка наличия/отсутствия роста бактерий на чашках Петри. По результатам измерений штамму дается характеристика в соответствии с установленными критериями: (S-чувствительный, I-промежуточная устойчивость, R-устойчивый).

II) Метод серийных разведений антибиотика с последующим добавлением его в жидкую культуральную среду. Данный метод подразумевает посев штамма в стерильные флаконы, содержащие жидкую среду с разной концентрацией антимикробного препарата. После инкубирования в оптимальных условиях роста микроорганизма производится оценка наличия/отсутствия роста бактерий на жидкой среде (визуальная и/или количественная регистрация мутности среды). По результатам измерений штамму дается характеристика в соответствии с установленными критериями: (S-чувствительный, I-промежуточная устойчивость, R-устойчивый).

III) Предпочтительным метолом опенки устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам является диско-диффузионый метод, включающий измерение (в миллиметрах) ингибирующей зоны действия антибиотика на плотной среде, которая сопоставима с МПК штамма. Чем больше ингибирующая зона (зона отсутствия роста), тем чувствительнее штамм к данному АМП. По результатам измерений зоны отсутствия роста, штамму дается характеристика в соответствии с установленными критериями: (S-чувствительный, I-промежуточная устойчивость, R-устойчивый).

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Пример 1. Процедура конструирования плазмидного вектора pESB, содержащего фрагмент плазмидной ДНК pbla_TEM-135 N. gonorrhoeae и фрагмент гена bla с мутацией GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser), позволяющий экспрессировать β-лактамазу расширенного спектра действия ТЕМ-20, способную гидролизовать пенициллины и цефалоспорины.

В ходе исследования были отобраны клинические изоляты N. gonorrhoeae из коллекции Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России (ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России), созданной и поддерживаемой в рамках программы RU-GASP (Kubanov A., et al. J Clin Microbiol. 2019, 57:e02024-18. p. doi: 10.1128/JCM.02024-18). На базе ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России, располагающего соответствующими условиями безопасности и лицензиями на работу с микроорганизмами I и II групп патогенности, проводились эксперименты с изолятами N. gonorrhoeae, включая трансформацию, оценку роста генно-инженерных штаммов, определение значений МИК к пенициллину и цефалоспоринам III и IV поколения.

В качестве основного штамма для работы с плазмидным вектором был использован контрольный штамм АТСС 49226, а также клинический образец 12/17/23, обладающий природной устойчивостью к пенициллинам (МПК_пен ≥ 16 мг/л), полученный в 2017 году из Чувашии (Shaskolskiy В., et al. PLoS One. 2019, v. 14 (7), p. e0220339, doi:10.1371/journal.pone.0220339). У данного штамма ранее была обнаружена плазмида pbla_TEM-135 типа Рио/Торонто. Верификацию штаммов N. gonorrhoeae проводили с помощью прибора Viatec 2, по протоколу согласно указаниям производителя.

Клинический образец 12/17/23 с плазмидой pbla_TEM-135 пересеивают на шоколадный агар с добавлением ростовых добавок BD IsoVitaleX Enrichment и бензилпенициллина с конечной концентрацией 16 мг/л. Инкубируют ночь при температуре 37°С и СО₂ 5-10%. Выделение плазмиды pbla_TEM-135 длиной 5154 п.о. проводят при помощи набора NEB Monarch Plasmid Miniprep Kit /T1010 (New England Biolabs, Великобритания) согласно протоколу производителя.

Проводят амплификацию фрагмента гена bla и получают ПЦР-фрагмент длиной 309 п.о. с одновременным сайт-направленным мутагенезом, обеспечивающим внесение мутации GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser) гена bla, с использованием праймеров, последовательности которых представлены SEQ ID: 1 и SEQ ID: 2 в Перечне последовательностей. В качестве матрицы используют плазмидную ДНК pbla_TEM-135, выделенную ранее из N. gonorrhoeae. Полученную ПЦР смесь наносят на электрофорезный гель с добавлением 2% агарозы и бромистого этидия. Полоски ДНК нужной длины вырезаюи и выделяют с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу производителя.

Проводят последовательную обработку ПЦР-фрагмента длиной 309 п.о. и плазмиды pbla_TEM-135 эндонуклеазами рестрикции pvuI и bsaI для получения липких концов. Выполняют обработку лигазной смесью линеаризованной плазмиды pbla_TEM-135 и ПЦР-фрагмента с липкими концами, полученных ранее, в соотношении 3-10 кратный молярный избыток фрагмента по отношению к плазмиде, с целью образования фосфодиэфирных связей между линеаризованной плазмидой и ПЦР-фрагментом, для получением конечного плазмидного вектора pESB (Фигура 1).

Готовят лигазную смесь, внося в пробирку следующие реагенты (из расчета на 1 реакцию):

- 5х Quick ligation буфер, 2 мкл;

- Линеаризованная плазмида pbla_TEM-135, 10-100нг;

- Вставка - ПЦР-фрагмент (3-10-кратный молярный избыток вставки по отношению к линеаризованной плазмиде pbla_TEM-135);

- Стерильная вода, до 9 мкл;

- Т4 ДНК лигаза, 1 мкл;

Суммарный объем реакционной смеси - 20 мкл

Проводят трансформацию клеток E. coli лигазной смесью с плазмидным вектором pESB, для трансформации используют готовые компетентные клетки (NEB 10-beta Competent Е. coli/C3019H. New England Biolabs, Великобритания) по стандартному протоколу производителя. В качестве контроля трансформации используют вектор рис 19 (K+), а также одну пробирку без добавления ДНК (NEB 10-beta Competent Е. coli/C3019H, WT - дикий тип) в качестве отрицательного контроля. Проводят выращивание клеток с последующим пересевом на селективную среду, содержащую цефтриаксон - цефалоспорин III поколения с конечной концентрацией ≥ 16 мг/л.

Выросшие на селективной среде с цефтриаксоном колонии E. coli собирают культуральной петлей в PBS и выделяют плазмидную ДНК с помощью набора Evrogen Plasmid Miniprep/BC021S (ЗАО «Евроген», Россия). Полученный вектор pESB проверяют с помощью ПЦР-системы, описанной ранее (Shaskolskiy В., et al. PLoS One. 2019, v. 14 (7), p. e0220339, doi:10.1371/journal.pone.0220339), а также проводят секвенирование по Сэнгеру гена bla для регистрации наличия/отсутствия ПЦР-вставки-фрагмента гена bla с мутацией GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серии в кодоне 238 (Gly238Ser), позволяющий экспрессировать β-лактамазу расширенного спектра действия ТЕМ-20, способную гидролизовать пенициллины и цефалоспорины.

Пример 2. Процедура оценки устойчивости Neisseria gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, включая пенициллины и цефалоспорины III и IV поколений, с использованием метода серийных разведений на плотной среде.

Трансформацию штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226 созданным плазмидным вектором pESB проводят методом электропорации. Оптимальным условием трансформации являлось ресуспензирование в 0.3М сахарозе ночной культуры клеток, собранной с чашки стерильной культуральной петлей. Промывку суспензии клеток от остатков шоколадного агара производят методом последовательного осаждения и ресуспезирования 2-3 раза при 12000 RPM в 0.3М сахарозе. 100 мкл очищенной суспензии клеток и 10-100 нг плазмидного вектора pESB переносят в кювету для электропорации с зазором 2 мм. Электропорацию проводят, подавая однократные импульсные разряды с параметрами: 2.5 кВ, 200Ω и 25 μF. Охлажденную суспензию клеток высевают на чашки с шоколодным агаром с последующем смывом и пересевом на чашки с селективным антибиотиком (Пенициллин (PEN), Ампициллин (AMP), Цефтриаксон (CRO), Цефиксим (CFM), Цефотаксим (СТХ), Цефуроксим (СХМ), Цефипим (FEP) производства (Sigma-Aldrich, США). Инкубируют ночь при температуре 37 С° и CO2 5-10%, после чего проводят регистрацию выросших колоний клеток. Результаты оценки устойчивости Neisseria gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам методом серийных разведений на чашках Петри, содержащих селективную среду с антимикробным препаратом, приведен в Таблице 1.

Таким образом, штамм N. gonorrhoeae АТСС 49226, исходно чувствительный к β-лактамным антибиотикам (пенициллинам и цефалоспоринам III и IV поколений), становится устойчивым к антимикробным препаратам данных классов после трансформации заявленным в настоящем изобретении плазмидным вектором pESB.

Пример 3. Процедура оценки устойчивости Neisseria gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, с использованием диско-диффузионного метода

Трансформацию штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226 созданным плазмидным вектором pESB проводят методом электропорации. Оптимальным условием трансформации являлось ресуспензирование в 0.3М сахарозе ночной культуры клеток, собранной с чашки стерильной культуральной петлей. Промывку суспензии клеток от остатков шоколадного агара проводят методом последовательного осаждения и ресуспезирования 2-3 раза при 12000 RPM в 0.3М сахарозе. 100 мкл очищенной суспензии клеток и 10-100 нг плазмидного вектора pESB переносят в кювету для электропорации с зазором 2 мм. Электропорацию проводят, подавая однократные импульсные разряды с параметрами 2.5 кВ, 200Ω и 25 μF. Охлажденную суспензию клеток после электропорации высевают на чашки с шоколадным агаром с последующем смывом и пересевом на чашки Петри с шоколадным агаром с добавлением ростовой добавки BD IsoVitaleX Enrichmen и нанесенным ватным диском цефиксима. Результаты роста контрольного штамма без трансформации вектором pESB и штамма, для которого выполнена трансформация, приведены на Фигуре 2. На чашке (Фигура 2(a)) показаны результаты культивирования контрольного штамма N. gonorrhoeae (АТСС49226). На чашке (Фигура 2(б)) культивирован штамм N. gonorrhoeae (АТСС49226), трансформированный созданным плазмидным векторм pESB. На верхнюю часть агара обеих чашек нанесен ватный диск с содержанием цефиксима (цефалоспорин III поколения) не менее 5 мкг. Ингибирующая зона действия антибиотика на чашке (а) составляет 65 мм, что соответствует контрольному штамму N. gonorrhoeae (АТСС49226) и характеризует его как чувствительный (S) к данному антимикробному препарату. Ингибирующая зона действия антибиотика на чашке (б) составляет 10 мм что соответствует цефалоспориназо-продуцирующему штамму N. gonorrhoeae с плазмидным вектором pESB и характеризует этот штамм как резистентный (R) к цефиксиму.

С использованием диско-диффузионного метола также подтверждают устойчивость к цефалоспорину III поколения штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226, трансформированного заявленным в настоящем изобретении плазмидным вектором pESB.

Таким образом, представленное изобретение представляет собой сконструированный плазмидный вектор, содержащий ген, кодирующий β-лактамазу расширенного спектра действия, способную гидролизовать пенициллины и цефалоспорины, и предназначенный для репликации в клетках Escherichia coli и Neisseria gonorrhoeae. Штаммы N. gonorrhoeae, трансформированные данным вектором, могут быть использованы для оценки устойчивости к β-лактамным антибиотикам и для проверки новых антимикробных препаратов β-лактамного ряда.

Все патенты, публикации, научные статьи, и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем отсылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде.

Хотя предпочтительные воплощения настоящего изобретения и их преимущества были подробно описаны выше, специалист в данной области сможет внести различные изменения, дополнения, не выходя при этом за рамки данного изобретения, которые определяются прилагаемой ниже формулой изобретения.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки.

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской

академии наук (ИМБ РАН)

<120> ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pESB ДЛЯ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ NEISSERIA

GONORRHOEAE К БЕТА-ЛАКТАМНЫМ АНТИБИОТИКАМ И СПОСОБ ЕГО

КОНСТРУИРОВАНИЯ

<130> pESB

<140> 111

<141> 2021-11-22

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> Neisseria gonorrhoeae

<220>

<223> праймер прямой

<400> 1

ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag g (SEQ ID NO: 1) 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Neisseria gonorrhoeae

<220>

<223> праймер обратный

<400> 2

aatgataccg cgagacccac gctcactggc t (SEQ ID NO: 2) 31

<---

1. Плазмидный вектор pESB для оценки устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, содержащий плазмидную ДНК pbla_TEM-135 N. gonorrhoeae, из которой вырезан фрагмент гена bla и заменен на аналогичный фрагмент гена bla с мутацией GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серин в кодоне 238 (Gly238Ser), что позволяет экспрессировать β-лактамазу расширенного спектра действия ТЕМ-20, способную гидролизовать пенициллины и цефалоспорины.

2. Плазмидный вектор по п. 1, характеризующийся тем, что он обладает способностью к репликации как в клетках E. coli, так и в клетках N. gonorrhoeae за счет наличия участков начала репликации, совместимых с грамотрицательными бактериями.

3. Плазмидный вектор по п. 1, характеризующийся тем, что с его помощью можно проводить оценку устойчивости клеток N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, включая пенициллины и цефалоспорины, посредством трансформации клеток N. gonorrhoeae плазмидным вектором pESB, с последующим выращиванием клеток на селективной среде, содержащей β-лактамный антибиотик, регистрацией отсутствия роста клеток при определенной минимальной подавляющей концентрации β-лактамного антибиотика в среде и установлением устойчивости клеток N. gonorrhoeae согласно критериям EUCAST.

4. Способ конструирования плазмидного вектора pESB для оценки устойчивости N. gonorrhoeae к β-лактамным антибиотикам, содержащего плазмидную ДНК pbla_TEM-135 N. gonorrhoeae, из которой вырезан фрагмент гена bla и заменен на аналогичный фрагмент гена bla с мутацией GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серин в кодоне 238 (Gly238Ser), что позволяет экспрессировать β-лактамазу расширенного спектра действия TEM-20, способную гидролизовать пенициллины и цефалоспорины, и обладающего способностью к репликации в клетках E. coli и N. gonorrhoeae, включающий:

а) выделение плазмиды pbla_TEM-135 из клинического штамма N. gonorrhoeae, обладающего природной устойчивостью к пенициллинам;

б) получение ПЦР-фрагмента путем амплификации фрагмента гена bla из плазмидной ДНК pbla_TEM-135 с одновременным сайт-направленным мутагенезом, обеспечивающим внесение мутации GGT→AGT, приводящей к замене глицина на серин в кодоне 238 (Gly238Ser) гена bla;

в) последовательную обработку ПЦР-фрагмента, полученного по п. 4(б), и плазмиды pbla_TEM-135 эндонуклеазами рестрикции для получения липких концов;

г) обработку лигазной смесью линеаризованной плазмиды pbla_TEM-135 и ПЦР-фрагмента с липкими концами, полученных в п. 4(в), с целью образования фосфодиэфирных связей между линеаризованной плазмидой и ПЦР-фрагментом для получения плазмиды с целевым ПЦР-фрагментом;

д) трансформацию клеток Е. coli полученной в п. 4(г) плазмидой с целевым ПЦР-фрагментом, выращивание клеток с последующим пересевом на селективную среду, содержащую цефтриаксон - цефалоспорин III поколения;

е) отбор устойчивых к цефтриаксону колоний E. coli с последующим выделением плазмидной ДНК в виде конечного плазмидного вектора pESB.