Способ оценки прогрессирования хронического пародонтита и набор реагентов для его осуществления

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. Предложены способ и набор реагентов для оценки прогрессирования хронического пародонтита. Проводят мультиплексную ПЦР в режиме реального времени. При наличии положительных сигналов по каналу ROX образцы идентифицируются как содержащие ДНК Porphyromonas gingivalis, а при наличии положительного сигнала по каналу HEX образцы идентифицируются как содержащие ДНК Filifactor alocis при одновременном положительном сигнале по каналу Су5 ДНК человека в качестве внутреннего положительного контроля. В случае выявления Porphyromonas gingivalis диагностируют прогрессирование хронического пародонтита степени В. При одновременном наличии Porphyromonas gingivalis и Filifactor alocis диагностируют прогрессирование хронического пародонтита степени С. Предложенная группа изобретений позволяет выявить начало воспаления и выделить тех пациентов, которые предрасположены к прогрессированию заболевания в будущем, и существенно сократить время исследования и сроки последующего лечения. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике воспалительных заболеваний пародонта, и может быть использовано для оценки прогрессирования хронического пародонтита.

Воспалительные заболевания пародонта - одни из наиболее часто встречающихся патологических состояний: тяжелый пародонтит является шестым по распространенности заболеванием во всем мире [1]. Болезни пародонта имеют сложный этиопатогенез и возникают в результате сочетания целого ряда факторов, приводящих к разрушению пародонта, необратимой резорбции костной ткани и потере зубов [2]. Социально-медицинское значение проблемы заболеваний пародонта в последние годы значительно возросло в связи с признанием того факта, что микробное поражение пародонта тесно связано с рядом системных заболеваний [3, 4].

В настоящее время признается полимикробная природа пародонтита, а воспалительный ответ организма человека на пародонтопатогенные бактерии считается решающим фактором в развитии и прогрессировании заболевания [5, 6]. При этом введено понятие ключевого пародонтопатогена, роль которого по всеобщему признанию отводится бактериям вида Porphyromonas gingivalis из-за их способности модифицировать нормальный состав микробиоты полости рта до более патогенного, что ускоряет потерю костной массы и развитие системных эффектов [3, 7, 8]. Этот пародонтопатоген характеризуется использованием тактик, позволяющих ему ослаблять или обманывать иммунную систему хозяина, поскольку обладает очень широким спектром факторов вирулентности, включая протеолитические ферменты (гингипаины), капсулу, эндотоксины, фимбрии, нуклеозиддифосфаткиназу, церамиды [9, 10]. С внедрением технологий метагеномного анализа появился еще один претендент на роль ключевого пародонтопатогена - Filifactor alocis

- бактерии, трудно культивируемые на искусственных питательных средах [11], встречающиеся почти исключительно при наличии воспаления тканей пародонта [12], обладающие устойчивостью к оксидативному стрессу [13] и уникальным набором свойств, которые обеспечивают их чрезвычайно выраженную способность к формированию микробных ассоциаций с Porphyromonas gingivalis и многими другими пародонтопатогенами [14, 15].

Методы, используемые сегодня в клинической практике для диагностики заболеваний пародонта, не позволяют выявить начало воспаления и выделить тех пациентов, которые предрасположены к прогрессированию заболевания в будущем, а современные диагностические подходы основываются почти исключительно на клинической оценке стоматологического статуса [16, 17].

В соответствии с последней международной классификацией заболеваний пародонта (2018 г. ) принято выделять три степени прогрессирования: А - медленное прогрессирование - нет потери прикрепления десны в течение 5 лет, В - средняя скорость прогрессирования

- за 5 лет потеря прикрепления менее 2 мм, С - быстрая скорость прогрессирования - потеря прикрепления больше 2 мм за 5 лет [18]. Такой клинический подход позволяет констатировать степень прогрессирования заболеваний пародонта, но не прогнозировать ее. В последние годы перспективным для прогноза стали считать исследование микробиома зубодесневой борозды с обнаружением в ее составе бактерий-пародонтопатогенов.

Выявление пародонтопатогенов в составе поддесневой биопленки до недавнего времени было основано преимущественно на классических методах выделения микробов на питательных средах с последующей их родовой и видовой идентификацией и определением чувствительности к антибиотикам. При недостатках этих методов, включаюпщх долгосрочность, необходимость использования большого количества питательных сред, специальные условия культивирования и транспортировки, высокую вероятность неверной идентификации микроорганизмов, следует учитывать, что обозначенные нами ключевые пародонтопатогены (Porphyromonas gingivalis, Filifactor alocis) являются трудно культивируемыми, а их определение с помощью серологических методов, ДНК - ДНК гибридизации, электрофореза технологически сложны и затратны для использования в клинической практике [19].

Наиболее перспективным с этой точки зрения является молекулярно-генетический метод, позволяющий выявить фрагменты геномов нескольких видов пародонтопатогенов с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Эти молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики стали применяться в различных странах мира с конца 1990-х годов.

Так, благодаря получению олигонуклеотидных праймеров для Actinobacillus actinomycetemcomitans, Tannerella forsytia (Bacterides forsythus), Fusobacterium nucleatum и Porphyromonas gingivalis, был разработан метод мультиплексной ПЦР для быстрого и высоко эффективного обнаружения указанных пародонтопатогенов [20]. Еще одно изобретение посвящено набору олигонуклеотидов для ПЦР, состоящему из пары праймеров (прямого и обратного) и зонда, разработанных на основе последовательностей, характерных для гена 16S рРНК или гена 23 S рРНК Treponema denticola, Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum и Aggregatibacter actinomycetemcomitans', предназначенных для обнаружения пародонтопатогенных бактерий с использованием данного набора [21]. Изобретение канадских исследователей относится к зондам и праймерам для обнаружения в биологическом материале из ротовой полости несколько иного набора пародонтопатогенов, таких как Bacteroides forsythus, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и Prevotella nigrescens [22]. Для обнаружения более широкого спектра пародонтопатогенов предложен праймер и зонд, имеющий последовательность оснований от SEQ ID NO: 1 до 30, которые можно комплементарно комбинировать с геномом Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Peptostreptococcus micros, Eikenella corrodens или Eubacterium nodatum [23].

Обнаружение пародонтопатогенов широко используется для диагностики воспалительных заболеваний пародонта на начальной стадии с целью прогнозирования различной системной патологии, включая заболевания сердечно-сосудистой системы, связанные с заболеваниями пародонта [24], а также для оценки рисков заболеваний пародонта, в частности, с использованием классифицированных результатов определения в качестве индексов [25, 26].

Прототипом изобретения послужило исследование A-A1-Alimi et al. [27], в котором в состав большой группы пародонтопатогенов, тестируемых методом моноплексной, но не мультиплексной ПЦР в реальном времени, входили Porphyromonas gingivalis и Filifactor alocis.

Однако, данное исследование не идентифицируют одновременно ДНК двух ключевых пародонтопатогенных бактерий Filifactor alocis и Porphyromonas gingivalis.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа оценки прогрессирования хронического пародонтита путем идентификации в поддесневой биопленке ключевых пародонтопатогенов Filifactor alocis и Porphyromonas gingivalis методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и создание набора реагентов для его осуществления.

Технический результат заключается в том, что предложенный способ оценки прогрессирования хронического пародонтита и набор для его осуществления позволяют выявить начало воспаления и выделить тех пациентов, которые предрасположены к прогрессированию заболевания в будущем и существенно сократить время исследования и сроки последующего лечения.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, связанная единым изобретательским замыслом для достижения единого технического результата.

Предложен способ оценки прогрессирования хронического пародонтита, предусматривающий взятие биологического материала из зубодесневой борозды, выделение из него ДНК, проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием набора реагентов для ПЦР-реакционной смеси, амплификацию, включающую денатурацию при 95°С в течение 3 мин -1 цикл, циклирование при 95°С - 10 сек, 60°С - 20 сек, считывание при 72°С - 20 сек в течение 45 циклов, с последующей оценкой по кривым накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных каналов: ROX, HEX и Су5 и при наличии положительных сигналов по каналу ROX образцы идентифицируются, как содержащие ДНК Porphyromonas gingivalis, а при наличии положительного сигнала по каналу HEX образцы идентифицируются, как содержащие ДНК Filifactor alocis при одновременном положительном сигнале по каналу Су5 ДНК человека в качестве внутреннего положительного контроля взятия биологического материала и в случае обнаружения у пациентов Filifactor alocis при величине AUC=0,9, вероятность прогрессирования хронического пародонтита увеличивается, а также в случае одновременного обнаружения у пациентов Filifactor alocis и Porphyromonas gingivalis при величине AUC=0,932, вероятность быстрого прогрессирования в группе пациентов с хроническим пародонтитом степени С увеличивается.

Предложен также набор реагентов для оценки прогрессирования хронического пародонтита, содержащий:

- прямой олигонуклеотидный праймер (FaF1) 5' - gca ggt ggt tta аса agt tag tgg - 3', концентрация С_к=6 pmol/μl, обратный олигонуклеотидный праймер (FaR1) 5' - ata tct acg cat ttc acc get аса - 3', концентрация Ск=6 pmol/μl, специфичные для фрагмента генома Filifactor alocis, и зонд (FaZ1) FAM-gag tgc agg aga gga aag tgg aat tec t-BHQ1, концентрация С_к=3 pmol/μl;

- два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие участок ДНК, специфичный для генома Porphyromonas gingivalis с последовательностями (P.g.f2) 5' - agb mam tac cga tgt ggg ttg cgc - 3', (P.g.r2) 5' - ggt gaa aac cgt ctt ccc ttc gg - 3', зонд (P g z) ROX-tcg tta tgg cac tta age cga ca-BHQ2, с концентрацией каждого праймера и зонда равна 10 pmol/μl;

- внутренний контрольный образец на ДНК человека (112.f) 5' - aat gtg taa ctc gac cct gca cc- 3', (112.r) 5' - ctg gga cct ctt cca gga agt ctt- 3', конечная концентрация каждого праймера равна 10 pmol/μl и зонд (112.z) CY5-gct cac tct gtt cag cag tga aac tct-BHQ2, с концентрацией 5 pmol/μl;

- положительный контрольный образец ДНК, включающий ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 126 п. н. генома Filifactor alocis, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 118 п. н. генома Porphyromonas gingivalis, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 87 п. н. генома человека;

- реакционная смесь для амплификации, содержащая 5^X ПЦР буфер (трис-(гидроксиметил)-аминометан, 670 mM;

- аммоний сернокислый, 170 mM;

- магний хлористый, 25 mM;

- Твин-20, 0,1%;

- вода деионизированная (рН 8,8);

- дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) с концентрацией - 0,2 mM;

- taq-полимеразу для "горячего старта" с концентрацией - 1,5 ед.;

- магний хлористый с концентрацией - 2,5 mM.

Олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие участок ДНК, специфичные для генома Filifactor alocis и Porphyromonas gingivalis, синтезированы нами на основе последовательностей, находящихся в составе генов 16S рРНК соответствующих бактерий и входящих в базу данных генетических последовательностей GenBank [28].

В таблице 1 представлен состав реакционной ПЦР смеси, используемой при выполнении мультиплексной ПЦР (на 1 пробу).

В таблице 2 представлены характеристики олигонуклеотидных праймеров и зондов, входящих в состав набора реагентов мультиплексной ПЦР для способа генодиагностики заболеваний пародонта.

При апробации набора и клинических испытаний способа оценки степени прогрессирования хронического пародонтита в исследование были включены 46 человек, из числа которых были сформированы 3 группы исследования:

- 1-я (основная) группа включала 15 пациентов, у которых хронический пародонтит имел среднюю скорость прогрессирования (степень В);

- в состав 2-й группы исследования входили 15 человек с хроническим пародонтитом быстрой скорости прогрессирования (степень С);

-3-я группа служила контролем и содержала 16 условно здоровых людей, не страдающих хроническим пародонтитом (без признаков воспалительных изменений в тканях десны).

Пациенты первых двух групп наблюдались на кафедрах пародонтологии и пропедевтики стоматологических заболеваний ФГБОУ ВО "Московский медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова" Минздрава России на протяжении не менее 5 лет. Контрольная группа здоровых лиц формировалась из контингента, обратившегося к стоматологам по поводу санации полости рта. Группы исследования содержали примерно равное число мужчин и женщин в возрасте 45-65 лет. Стоматологический статус больных хроническим пародонтитом оценивался в соответствии с Международной классификацией заболеваний пародонта 2018 г. [29], критериями разграничения средней и быстрой (В и С) степени прогрессирования заболевания при генерализованном характере поражения служили: В - потеря прикрепления (индекс CAL) за 5 лет менее 2 мм, С - потеря прикрепления за 5 лет 2 и более мм.

На фигуре 1 представлены проценты встречаемости F. alocis, Р. gingivalis и ассоциации этих бактерий в группах больных хроническим пародонтитом степеней В и С и в контроле.

В материале из зубодесневой борозды у здоровых людей частота встречаемости Porphyromonas gingivalis составила 19%. При степени В частота выявления этих бактерий возрастала до 40%, а при степени С - до 93%. Как показывает фигура 2, построение ROC-кривых для определения диагностической значимости обнаружения этих бактерий в биологическом материале из зубодесневой борозды показало, что у больных хроническим пародонтитом степени В при сравнении с контролем величина AUC составляла 0,6, то есть не соответствовала высокой диагностической значимости. При хроническом пародонтите степени С AUC в результате построения ROC-кривой по величине (0,873) соответствовала высокой диагностической значимости.

Частота обнаружения Filifactor alocis при хроническом пародонтите степени В составила 87%, в то время как у здоровых людей эти бактерии не регистрировали. При хроническом пародонтите степени С наличие Filifactor alocis было отмечено во всех случаях (100%). Диагностическое значение определения Filifactor alocis для оценки степени прогрессирования хронического пародонтита с помощью мультиплексной ПЦР по данным построения ROC-кривой, в отличие от Porphyromonas gingivalis, было максимально высоким (AUC 0,9-1,0) независимо от быстроты прогрессирования хронического пародонтита.

Особо следует подчеркнуть, что одновременное наличие Porphyromonas gingivalis и Filifactor alocis при хроническом пародонтите степени В было отмечено в 33% случаев, а у больных хроническим пародонтитом, степени С - в 93% случаев. Построение ROC-кривых для ассоциации Porphyromonas gingivalis и Filifactor alocis при хроническом пародонтите степени В в сравнении с контролем не подтвердило высокой диагностической значимости (AUC=0,6), а при хроническом пародонтите степени С AUC была очень высокой - 0,932 (фигуры 1, 2 и 3).

Изобретение иллюстрируется следующим клиническим примером:

Пример 1. У пациентки К., 48 лет, с клиническим диагнозом «Хронический пародонтит, степень В» провели исследование содержания Filifactor alocis и Porphyromonas gingivalis в зубодесневой борозде с помощью ПЦР в реальном времени с целью уточнения этиологического диагноза и оценки прогрессирования.

Взятие биологического материала проводили утром натощак до использования зубной щетки и других средств гигиены. В области зубодесневой борозды стоматологическими аппликаторами №1 ("микробрашами") отобрали образцы биопленок в стерильные пластиковые пробирки типа Eppendorf, содержащие 0,5 мл физиологического раствора.

ДНК выделяли методом ускоренной пробоподготовки с помощью коммерческого набора реагентов Реалекс (ООО «НПФ «Генлаб», Москва) согласно инструкции. Для этого пробирки с исследуемым материалом центрифугировали 10 мин. при 10000 об/мин. Супернатант удалили и добавили в каждую пробу по 100 мкл "Реалекса" при тщательном перемешивании. После инкубации в течение 10 мин при 56°С перемешивали содержимое пробирок на вортексе в течение 5 сек. и инкубировали еще 10 мин. при 99°С и, перемешав на вортексе в течение 5 сек., снова центрифугировали их 30 сек. при 10000 об/мин. Супернатанты переносили в новые пробирки.

Реакционную ПЦР смесь готовили согласно таблице 1.

В тонкостенные амплификационные микропробирки вместимостью 200 мкл вносили по 21 мкл реакционной смеси, 0,3 мкл ДНК-полимеразы (удельная активность полимеразы - 5 ед. в мкл). Для предотвращения испарения проб осторожно наслаивали по 25 мкл вазелинового масла. В пробирку, промаркированную ОК (отрицательный контроль) вносили 5 мкл ОК под масло, в опытные пробирки по 5 мкл ДНК клинических образцов, в пробирку, промаркированную ПК (положительный контроль) - 5 мкл ПК под масло. Плотно закрывали крышки, центрифугировали пробирки для сброса капель и переносили в амплификатор CFX 96 («Bio-Rad», США).

Постановка ПЦР в режиме реального времени. Режим амплификации: 95°С - 3 мин. - 1 цикл; 95°С - 10 сек., 60°С - 20 сек. + считывание, 72°С - 20 сек., 45 циклов.

Анализ и интерпретацию результатов проводили с помощью программного обеспечения прибора CFX 96 («Bio-Rad», США). Детекцию осуществляли по каналам ROX, HEX и Су 5. По каналу ROX идентифицировали образцы, содержащие ДНК Porphyromonas gingivalis, каналу HEX - ДНК Filifactor alocis при наличии положительной реакции по каналу Су5 (внутренний положительный контроль забора биологического материала - ДНК человека).

В образце А) из зубодесневой борозды зуба 16 одновременно выявлены специфические фрагменты ДНК Porphyromonas gingivalis (цикл 25) и Filifactor alocis (цикл 27). В образце В) из пародонтального кармана зуба 24 выявлен специфический фрагмент ДНК Filifactor alocis (цикл 26). Был сделан вывод о наличии в зубодесневой борозде зуба 16 двух видов пародонтопатогенов и одного - в зубе 24. Учитывая высокий риск прогрессирования воспалительного процесса в пародонтальных тканях, даны рекомендации лечащему врачу о необходимости проведения системной антибиотикотерагши (амоксициллин/клавуланат натрия 1,0 г /сутки).

Способ иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг. 1. Процент встречаемости F. alocis, P. gingivalis и ассоциации этих бактерий в группах больных хроническим пародонтитом степеней В и С и в контроле;

Фиг. 2. ROC-кривые диагностической значимости результатов мультиплексной ПЦР в величинах площади под кривой (AUC) по идентификации F. alocis, P. gingivalis и ассоциации этих бактерий в группе больных хроническим пародонтитом степени В;

Фиг. 3 ROC-кривые диагностической значимости результатов мультиплексной ПНР в величинах площади под кривой (AUC) по идентификации F. alocis, P. gingivalis и ассоциации этих бактерий в группе больных хроническим пародонтитом степени С.

Таким образом, диагностическое значение одновременного обнаружения Porphyromonas gingivalis и Filifactor alocis для выявления прогрессирования заболеваний пародонта методом мультиплексной ПЦР с помощью набора реагентов данного изобретения, показывает очень надежный критерий неблагоприятного течения заболевания.

Литература:

1. Tonetti M.S., Jepsen S., Jin L., Otomo-Corgel J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: a call for global action // J Clin Periodontal. 2017; 44 (5): 456-462.

2. Rafiei M., Kiani F., Sayehmiri K. et al. Prevalence of anaerobic bacteria (P.gingivalis) as major microbial agent in the incidence periodontal ddiseases by meta-analysis // J Dent (Shiraz). 2018; 19 (3): 232-242.

3. Hajishengallis G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation // Nat Rev Immunol. 2015; 15 (1): 30-44.

4. Bui F.Q., Almeida-da-Silva C.L.C., Huynh B. et al. Association between periodontal pathogens and systemic disease // J Biomed Sci. 2019; 42 (1): 27-35.

5. Локтионов А.Л., Конопля A.M., Лунев M.A., Караулов A.B. Иммунные и оксидантные нарушения в патогенезе воспалительных заболеваний пародонта // Иммунология. 2015; 36 (5): 319-328.

6. Cekici A., Kantarci A., Hasturk Н., Van Dyke Т.Е. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease // Periodontal 2000. 2014; 64 (1): 57-80.

7. Hajishengallis G., Darveau R.P., Curtis M.A. The keystone-pathogen hypothesis // Nat Rev Microbiol. 2012; 10 (10): 717-725.

8. Honda K. Porphyromonas gingivalis sinks teeth into the oral microbiota and periodontal disease // Cell Host Microbe. 2011; 10 (5): 423-425.

9. Krauss J.L., Potempa J., Lambris J.D., Hajishengallis G. Complementary Tolls in the periodontium: how periodontal bacteria modify complement and Toll-like receptor responses to prevail in the host // Periodontology. 2010; 52 (1): 141-162.

10. Hajishengallis G. Immune evasion strategies ofPorphyromonas gingivalis IIJ Oral Biosci. 2011; 53 (3): 233-240.

11. Hiranmayi K.V., Sirisha К., Ramoji Rao M.V., Sudhakar P. Novel pathogens in periodontal microbiology // J Pharm Bioallied Sci. 2017; 9 (3): 155-163.

12. Kumar P.S., Leys E.J., Bryk J.M. et al. Changes in periodontal health status are associated with bacterial community shifts as assessed by quantitative 16S cloning and sequencing // J Clin Microbiol. 2006; 44 (10): 3665-3673.

13. Moffatt C.E., Whitmore S.E., Griffen A.L. et al. Filifactor alocis interactions with gingival epithelial cells // Mol Oral Microbiol. 2011; 26 (6): 365-373.

14. Aruni A.W., Chioma O., Fletcher H.M. Filifactor alocis: The newly discovered kid on the block with special talents // J Dent Res. 2014; 93 (8): 725-732.

15. Wang Q., Wright C.J., Dingming H. et al. Oral community interactions of Filifactor alocis in vitro // PLoS One. 2013; 8(10): e76271.

16. Offenbacher S., Barros S.P., Beck J.D. Reminking periodontal inflammation // J Periodontal. 2008; 79 (Suppl 8): 1577-1584.

17. Tabak L.A. Point-of-care diagnostics enter the mouth // Ann N Y Acad Sci. 2007; 1098: 7-14.

18. Caton J.G., Armitage G., Berglundh T. et al. A new classification scheme for periodontal and peri-implant diseases and conditions - Introduction and key changes from the 1999 classification // J Periodontal. 2018; 89 (Suppl 1): 1-8.

19. Eick S., Pfister W. Comparison of microbial cultivation and a commercial nucleic acid based method for detection of periodontopathogenic species in subgingival plaque samples // J Clin Periodontal. 2002; 29: 638-644.

20. Patent CN 101270381 A- publ. 2008-09-24. Multiple PCR fast detecting method for oral cavity pathogen. Inventors Xiao S., Zhang Т., Liu X., Liu Y; SHUIQING XIAO, China.

21. Patent JP 2016192950 A publ. 2016-11-17. Oligonucleotide set for detecting periodontal disease bacteria, and detection method of periodontal disease bacteria. Inventors Gokyu M., Hamaide E., Ikeda Y., Izumi Y., Kobayashi H., Matsuura Т., Morita I., Nagao M, Takahashi Y.; DAINIPPON PRINTING CO LTD; UNIV TOKYO MEDICAL & DENTAL, Japan.

22. Patent CA 2228836 A1 publ. - 1999-08-04. Detection of periodontal pathogens including Bacteroides forsythus, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia and Prevotella nigrescens. Inventors Guillot E., Menard C, Mouton C; UNIV LAVAL, Canada.

23. Patent KR 20150129484 A publ. 2015-11-20. Primers and probes for detecting bacteria related to periodontal disease and method of detecting the same and use thereof. Inventors Shin E.S., Song K.H.; HUSTEPS INC, Korea.

24. Patent WO 2009005178 A1 publ. 2009-01-08. Microarrays for detection and identification of microorganisms associated with periodontal diseases and method for diagnosis of infectious oral diseases using the microarray. Inventors Choi Y.M., Jang H.J., Kim СМ.; Choi Y.M., GENEIN CO LTD, Jang H.J., Kim СМ., PUSAN NAT UNIV IND COOP FOUND, Korea.

25. Patent JP 2011193810 A publ. 2011-10-06. Method for evaluating risk of periodontal disease. Inventors Fujinaka E., Nakamura J., Sakamoto K., Takeshita Т., Yamashita Y.; KAO CORP; UNIV KYUSHU, Japan.

26. Patent KR 101306162B1 publ. 2013-09-09. A kit for diagnosing periodontal disease. Inventors Moon H.R.; SPECIALTY LAB SOLUTION CO LTD, Korea.

27. Al-Alimi A., Taiyeb-Ali Т., Jaafar N., Al-hebshi NN. Qat Chewing and Periodontal Pathogens in Health and Disease: Further Evidence for a Prebiotic-Like Effect // Biomed Res Int. 2015; 2015: 291305.

28. Benson D.A., Cavartaugh M., Clark K. et al. GenBank // Nucleic Acids Research. 2013; 41 (Dl): D36-D42.

29. Graetz C, Mann L., Krois J., Salzer S., Kahl M., Springer С et al. Comparison of periodontitis patients' classification in the 2018 versus 1999 classification//J. Clin. Periodontol. 2019; 46(9): 908-17

1. Способ оценки прогрессирования хронического пародонтита, предусматривающий взятие биологического материала из зубодесневой борозды, выделение из него ДНК, проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием набора реагентов для ПЦР реакционной смеси, амплификацию, включающую денатурацию при 95°С в течение 3 мин - 1 цикл, циклирование при 95°С - 10 с, 60°С - 20 с, считывание при 72°С - 20 с в течение 45 циклов, с последующей оценкой по кривым накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных каналов: ROX, HEX и Су5 и при наличии положительных сигналов по каналу ROX образцы идентифицируются как содержащие ДНК Porphyromonas gingivalis, а при наличии положительного сигнала по каналу HEX образцы идентифицируются как содержащие ДНК Filifactor alocis при одновременном положительном сигнале по каналу Су5 ДНК человека в качестве внутреннего положительного контроля взятия биологического материала и в случае выявления Porphyromonas gingivalis диагностируют прогрессирование хронического пародонтита степени В, а при одновременном наличии Porphyromonas gingivalis и Filifactor alocis диагностируют прогрессирование хронического пародонтита степени С.

2. Набор реагентов для оценки прогрессирования хронического пародонтита, содержащий:

- прямой олигонуклеотидный праймер (FaF1) 5' - gca ggt ggt tta аса agt tag tgg - 3', концентрация Ск=6 pmol/μl, обратный олигонуклеотидный праймер (FaR1) 5' - ata tct acg cat ttc acc get аса - 3', концентрация Ск=6 pmol/μ1, специфичные для фрагмента генома Filifactor alocis, и зонд (FaZ1) HEX-gag tgc agg aga gga aag tgg aat tec t-BHQ1, концентрация Ск=3 pmol/μ1;

- два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие участок ДНК, специфичный для генома Porphyromonas gingivalis с последовательностями (P.g.f2) 5' - agb mam tac cga tgt ggg ttg cgc - 3', (P.g.r2) 5' - ggt gaa aac cgt ctt ccc ttc gg - 3', зонд (P.g.z) ROX - tcg tta tgg cac tta age cga ca - BHQ2, концентрация каждого праймера и зонда равна 10 pmol/μ1;

- внутренний контрольный образец на ДНК человека (112.f) 5' - aat gtg taa etc gac cct gca cc - 3', (112.r) 5' - ctg gga cct ctt cca gga agt ctt - 3', конечная концентрация каждого праймера равна 10 pmol/μl и зонд (112.z) CY5 - gct cac tct gtt cag cag tga aac tct - BHQ2, с концентрацией 5 pmol/μ1;

- положительный контрольный образец ДНК, включающий ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 126 п.н. генома Filifactor alocis, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 118 п.н. генома Porphyromonas gingivalis, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 87 п.н. генома человека;

- реакционная смесь для амплификации, содержащая 5Х ПЦР буфер трис-(гидроксиметил)-аминометан, 670 mM;

- аммоний сернокислый, 170 mM;

- магний хлористый, 25 mM;

- Твин-20, 0,1%;

- вода деионизированная (рН 8,8);

- дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) с концентрацией 0,2 mM;

- taq-полимераза для "горячего старта" с концентрацией 1,5 ед.;

- магний хлористый с концентрацией 2,5 mM.