Конъюгаты антитело-лекарственное средство и их применение

Изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство (ADC), имеющему повышенную загрузку лекарственного средства, который получен с использованием одного или более чем одного остатка цистеина или остатка производного цистеина в качестве связанных с лекарственным средством носителей и конъюгирования одного или более чем одного лекарственного средства одновременно по ограниченному количеству сайтов связывания антитела или может быть получен с лекарственным средством с низкой токсичностью, таким образом, что получают продукт ADC с более широким терапевтическим окном. Кроме того, поскольку множество молекул лекарственного средства могут быть конъюгированы по одному сайту связывания, когда получают ADC, имеющий такое же значение DAR, полученный продукт ADC обладает лучшей однородностью. Используемое количество антитела, требуемое для приготовления, также может быть существенно уменьшено. Полученные ADC все еще могут достигать такого же ингибирующего или уничтожающего действия в отношении опухолевых клеток при том, что общее количество конъюгированных молекул лекарственного средства существенно уменьшено по сравнению с ADC, способными связывать только одну молекулу лекарственного средства по одному и тому же сайту. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 2 табл., 9 пр.

 

Область изобретения

Описание настоящего изобретения относится к области биомедицины, и, в частности, к конъюгату антитело-лекарственное средство, в котором в качестве линкера использован один или более чем один остаток цистеина или его производных, и их применениям, и линкер может быть загружен по желанию одним или более чем одним лекарственным средством по ограниченному сайту связывания антитела.

Предшествующий уровень техники

Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) относится к классу биологических лекарственных средств, в которых активное лекарственное средство связано с антителом через химический линкер. ADC похожи на высокоточную управляемую оружейную систему, в которой активное лекарственное средство используется в качестве снаряда для точного уничтожения пораженных заболеванием клеток, направляемого антителом. Таким образом, в ADC комбинированы двойные преимущества высокой силы цитотоксических лекарственных средств и высокой степени нацеленности на мишень антитела. На конец июля 2019 года по всему миру было одобрены всего шесть лекарственных средств, конъюгированных с антителом (Таблица 1).

Вследствие не уникальности отобранных сайтов связывания на антителе и сложности реакции лигирования реальный получающийся в результате продукт ADC представляет собой смесь ADC, содержащую различные количества антител, связанных с различными количествами лекарственных средств по различным сайтам. Гетерогенность получаемого лекарственного средства ADC создает значительные трудности для производства и контроля качества лекарственных средств. При анализе однородности продукта существует важный показатель, а именно величина DAR (отношение лекарственного средства к антителу), которая представляет собой среднее количество лекарственных средств, которые может нести одна единица антитела. Если величина DAR является слишком маленькой, то молекул лекарственного средства, которые несет антитело, слишком мало, что может влиять на общую эффективность лекарственного средства. Тем не менее, если средняя величина DAR является слишком высокой, то антитело загружено слишком большим количеством молекул лекарственного средства, что приводит к общей нестабильности ADC, изменению его фармакокинетических параметров и может увеличивать клиренс из плазмы крови, уменьшать период полувыведения и увеличивать системную токсичность лекарственного средства.

В настоящее время существуют три классических способа связывания для ADC, один из которых представляет собой амидное связывание, другой представляет собой тиольное связывание, а третий представляет собой перекрестное связывание.

Амидное связывание заключается в связывании лекарственного средства с остатком лизина (Lys) антитела при помощи линкера. В первом поколении лекарственного средства ADC милотарг использован такой путь амидного связывания. В IgG (иммуноглобулин G) содержится приблизительно одна сотня лизинов, связывание может происходить по приблизительно 40 открытым остаткам лизина на легкой цепи и тяжелой цепи антитела, и каждое антитело может быть связано с множеством молекул лекарственного средства в различных количествах путем связывания через лизин. Таким образом, ADC, получаемые путем амидного связывания, являются высоко гетерогенными, и продукт обладает чрезвычайно плохой однородностью, что серьезно влияет на PK/PD и терапевтический диапазон лекарственного средства (see http://www.sohu.com/a/277791166_464404).

При тиольном связывании межцепочечная дисульфидная связь антитела сначала разрушается с образованием свободного остатка цистеина (Cys), который дополнительно связан с комплексом линкер-лекарственное средство, обладающим способностью сочетаться с остатком цистеина. Поскольку в IgG есть только 4 пары межцепочечных дисульфидных связей, после разрушения всех межцепочечных дисульфидных связей могут образовываться 8 свободных остатков цистеина, таким образом, средняя величина DAR для ADC, получаемых путем монотиольного связывания, составляет 0-8. Хотя тиольное связывание может обеспечивать более хороший контроль для множества лекарственных средств на каждом антителе, разрушение межцепочечной дисульфидной связи значительно уменьшает стабильность антитела.

Перекрестное связывание представляет собой новый тип связывания, который разработан на основе тиольного связывания. Наподобие тиольного связывания межцепочечная дисульфидная связь антитела сначала разрушается с образованием двух свободных остатков, которые далее одновременно связываются. Поскольку на одном антителе есть только 4 пары межцепочечных дисульфидных связей, после разрушения всех межцепочечных дисульфидных связей имеется 8 свободных цистеиновых остатков, таким образом, ADC, образованные путем установления мостиковых связей, имеют среднюю величину DAR 0-4. По сравнению с тиольным связыванием образование мостиковых связей может обеспечивать более хороший контроль однородности продукта и может в значительной степени обеспечить стабильность антитела после связывания. Тем не менее, DAR для образования мостиковых связей составляет до 4, то есть до 4 лекарственных средств могут быть связаны с одним антителом. Количество антигенов на поверхности опухолевых клеток ограничено, и уровень экспрессии антигена, требующийся для эффективной активности ADC, варьирует в зависимости от характеристик различных антигенов. Для ADC требуется по меньшей мере 1×10⁴ антигенов/клетку для обеспечения доставки летального количества цитотоксичного лекарственного средства. В идеале, антиген, на который нацелено антитело в ADC, должен однородно экпрессироваться на поверхности опухолевых клеток с высоким числом копий (более 10⁵/клетку). Опухолевые клетки обычно имеют ограниченное количество антигенов на своей поверхности (приблизительно от 5000 до 10⁶ антигенов/клетку), хотя ADC имеют DAR 3,5-4 (например, брентуксимаб ведотин имеет среднее DAR, равное 4, и трастузумаб эмтанзин имеет среднее DAR, равное 3,5), что приводит к тому, что количество лекарственного средства, доставляемого до опухолевых клеток, является очень низким, приводя к меньшему эффекту в отношении опухолевых клеток. Последнее, как предполагают, представляет собой одну из основных причин клинических неудач в отношении ADC.

Вследствие ограниченного количества антигенов на поверхности опухолевых клеток, для того, чтобы обеспечить возможность эффективного уничтожения опухолевых клеток ограниченным количеством лекарственных средств, которые несут антитела, часто в клинике используют небольшие молекулы, обладающие особенно сильной токсичностью. В настоящее время небольшие молекулы, используемые в ADC, в основном включают классы ауристатина, майтанзина, калихеамицина, доксорубицина и тому подобное. Эти небольшие молекулы обладают более сильным уничтожающим действием в отношении раковых клеток по сравнению с традиционными химиотерапевтическими лекарственными средствами. Как правило, уничтожение клеток-мишеней может достигаться при помощи дозы в среднем от четырех до шести молекул. Тем не менее, если эти высокотоксичные небольшие молекулы лекарственного средства утрачивают мишень в организме, они являются смертельными для пациента. Кроме того, поскольку эти небольшие молекулы особенно токсичны (например DM1 обладает IC₅₀ (средней ингибирующей концентрацией), составляющей приблизительно 10^-11 моль/л для множества клеток, DM4 обладает IC₅₀, составляющей приблизительно 10^-12 моль/л (ссылка 1: Widdison WC, Wilhelm SD, Cavangh EE, et al. Semisynthetic maytansine analogues for the targeted treatment of cancer [J]. J Med Chem, 2006, 49: 4392-4408; ссылка 2: Lambert JM. Antibody-maytansinoid conjugates: a new strategy for the treatment of Cancer [J]. Drugs Future, 2010, 35: 471-480.), и MMAE обладает IC₅₀, составляющей приблизительно 10^-11-10^-9 моль/л). Если существуют условия, такие как утрата мишени и раннее высвобождение лекарственного средства, то существуют очень большие риски для пациентов. FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов) провело объединенный анализ для 20 исследуемых новых лекарственных препаратов (IND) и обнаружило, что токсичность лекарственных средств ADC в отношении животных в основном определяется гематопоэтической токсичностью, гепатотоксичностью и репродуктивной токсичностью, и некоторые из них также обладают кожной токсичностью и нефротоксичностью, где гематопоэтическая токсичность, гепатотоксичность и репродуктивная токсичность напрямую связаны с низкомолекулярными цитотоксическими лекарственными средствами (ссылка 3: Saber Н, Leighton JK. An FDA oncology analysis of antibody-drug conjugates [J]. Regul Toxicol Pharmacol, 2015, 71(3): 444-452). Тем не менее, если используется низкомолекулярное лекарственное средство, обладающее низкой токсичностью, тогда загружаемое количество низкомолекулярного лекарственного средства часто является слишком низким, таким образом, что получаемый от лекарственного средства эффект является слишком низким, приводя к клинической неудаче.

Краткое изложение сущности изобретения

Для решения вышеприведенных проблем в описании настоящего изобретения предложен новый конъюгат антитело-лекарственное средство, обладающий способностью связываться с большим количеством активных лекарственных средств, и технические решения согласно описанию настоящего изобретения являются следующими.

В описании настоящего изобретения предложен конъюгат антитело-лекарственное средство, представленный формулой (I)-(IV):

где,

А представляет собой антитело или его функциональный связывающий фрагмент;

B₁, В₂, В₃, … и B_n представляют собой цистеин или его производное, и они могут быть одинаковыми или разными; B₁ и В₂, В₂ и В₃, …, B_n-1 и B_n связаны посредством пептидной связи в результате реакции дегидрирования с конденсацией;

каждый из L₁, L₂, L₃, L₄, … и L_n+1 независимо представляет собой линкер, и они могут быть одинаковыми или разными; L₁ связан ковалентно с N-концом B₁, L₂ и B₁, L₃ и В₂, L₄ и В₃, … L_n+1 и B_n связаны ковалентно посредством тиольной группы, и L₂ и D₁, L₃ и D₂, L₄ и D₃, … L_n+1 и D_n связаны ковалентно;

каждый из D₁, D₂, D₃, … и D_n независимо представляет собой активное лекарственное средство, и они могут быть одинаковыми или разными;

Z представляет собой группу, связанную ковалентно с карбонильной группой в B₁ в формуле (I), карбонильной группой в В₂ в формуле (II), карбонильной группой в В₃ в формуле (III) или карбонильной группой в B_n в формуле (IV);

n представляет собой целое число, равное или большее чем 4, которое представляет собой количество ответвлений, связывающихся с активными лекарственными средствами; и

m выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

Кроме того, структуры B₁, В₂, В₃, …, B_n представлены формулой (V), соответственно:

где р выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

Кроме того, Z выбран из группы, состоящей из:

ОН, SH, NH₂,

Кроме того, конъюгат антитело-лекарственное средство имеет структуру, представленную формулой (VI-1)-(VI-5):

где,

А представляет собой антитело или его функциональный связывающий фрагмент;

каждый из L₁, L₂, L₃, L₄, и L₅ независимо представляют собой линкеры, которые могут быть одинаковыми или разными;

каждый из D₁, D₂, D₃ и D₄ независимо представляют собой активные лекарственные средства, которые могут быть одинаковыми или разными; и

m выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

Кроме того, L₁ ковалентно связан с амино остатком или тиольным остатком антитела; предпочтительно, L₁ ковалентно связан с тиольной группой антитела; более предпочтительно, L₁ ковалентно связан с тиольным остатком, образованным в результате разрушения межцепочечной дисульфидной связи антитела.

Кроме того, L₁, L₂, L₃, L₄, … и L_n+1 представляют собой расщепляемый линкер, комбинацию расщепляемых линкеров или нерасщепляемый линкер.

Кроме того, расщепляемый линкер включает пептидный линкер и полисульфидную связь, и где пептидный линкер содержит 2-20 аминокислот, предпочтительно пептидный линкер выбран из группы, состоящей из -валин-цитруллин- (-Val-Cit-), -глицин-глицин-фенилаланин-глицин- (-Gly-Gly-Phe-Gly-), -валин-аланин- (-Val-Ala-), -валин-лизин- (-Val-Lys-), -валин-аргинин- (-Val-Arg-), -фенилаланин-цитруллин- (-Phe-Cit-), -фенилаланин-лизин- (-Phe-Lys-), -фенилаланин-аргинин- (-Phe-Arg-) и их комбинации; и полисульфидная связь содержит 2-8 атомов серы, предпочтительно полисульфидная связь выбрана из группы, состоящей из дисульфидной связи (-S-S-), трисульфидной связи (-S-S-S-) и тетрасульфидной связи (-S-S-S-S-).

В некоторых конкретных воплощениях L₁ может быть выбран из следующих структур:

В некоторых конкретных воплощениях L₂, L₃, L₄, … L_n+1 могут быть выбраны из следующих структур:

Кроме того, антитело или его функциональный связывающий фрагмент включает моноклональное антитело, поликлональное антитело, фрагмент антитела, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv, одноцепочечный Fv ("scFv"), диатело, линейное антитело, биспецифическое антитело, мультиспецифическое антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, полностью человеческое антитело или слитый белок, содержащий антигенсвязывающий фрагмент антитела; предпочтительно, антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или полностью человеческое антитело.

Кроме того, антитело представляет собой антитело IgG или его функциональный связывающий фрагмент, предпочтительно, антитело представляет собой антитело IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄.

Кроме того, активное лекарственное средство представляет собой цитотоксическую молекулу, фактор клеточной дифференцировки, трофический фактор стволовой клетки, стероидное лекарственное средство, лекарственное средство для лечения аутоиммунного заболевания, противовоспалительное лекарственное средство или лекарственное средство для лечения инфекционного заболевания.

Кроме того, цитотоксическая молекула включает, без ограничения, ингибитор тубулина или агент, повреждающий ДНК; предпочтительно, ингибитор тубулина включает цитотоксическую молекулу доластатинов и ауристатинов, цитотоксическую молекулу майтанзинов; агент, повреждающий ДНК, включает калихеамицины, дуокармицины, пирролобензодиазепин (PBD), производное антрамицина, камптотецины и их производные и SN-38; кроме того, предпочтительно, цитокиновая молекула ауристатинов включает ММАЕ (монометилауристатин Е), MMAF (монометилауристатин F), и их производное; и цитотоксическая молекула майтанзинов включает DM1, DM4 и их производное; и, кроме того, предпочтительно, цитотоксическая молекула включает следующие молекулы:

Кроме того, структуры конъюгата антитело-лекарственное средство представлены следующими:

где,

А представляет собой антитело или его функциональный связывающий фрагмент; и

m выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, и 8.

В описании настоящего изобретения также предложена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество любого из вышеприведенных конъюгатов антитело-лекарственное средство, или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом.

В описании настоящего изобретения также предложено применение любого из вышеприведенных конъюгатов антитело-лекарственное средство при получении лекарственного средства для лечения рака.

В описании настоящего изобретения предложен конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), в котором один или более чем один цистеин или его производные использованы в качестве линкеров для связывания с одним или более чем одним лекарственным средством в ограниченных сайтах связывания антитела, облегчая получение ADC с более высокой загрузкой лекарственного средства. Теоретически, поскольку могут быть получены ADC с более высокой загрузкой, лекарственные средства для связывания могут быть выбраны из большего диапазона таким образом, что для получения продуктов ADC могут быть использованы лекарственные средства с меньшей токсичностью, посредством этого обеспечивая получение продуктов ADC, имеющих широкое терапевтическое окно. Кроме того, поскольку множество лекарственных средств может быть связано с одним сайтом связывания, продукты ADC, полученные при помощи способа в соответствии с описанием настоящего изобретения, обладают лучшей однородностью в случае той же самой величины DAR. Кроме того, количество антитела, требующееся для получения, может быть существенно уменьшено, таким образом, уменьшая стоимость. Кроме того, неожиданно обнаружено, что количество антитела, требующееся для получения, может быть существенно уменьшено, таким образом, уменьшая стоимость. По сравнению с конъюгатами антитело-лекарственное средство, связанными только с одним лекарственным средством, конъюгаты антитело-лекарственное средство, получаемые при помощи способа в соответствии с описанием настоящего изобретения, имеют то же самое ингибирующее или уничтожающее действие в отношении опухолевых клеток при использовании меньшего количества лекарственных средств для связывания с тем же самым сайтом.

Подробное описание изобретения

Определения

Различные термины, связанные с различными частями описания, использованы в описании и формуле изобретения. Если не указано иное, то такие термины приведены в обычном для уровня техники значении. Другие специально определенные термины следует понимать в соответствии с приведенными здесь определениями.

Используемые здесь термины единственного числа используются в соответствии со стандартной практикой и, если в контексте не указано иное, обозначают один или более чем один. Таким образом, например "конъюгат антитело-лекарственное средство" включает комбинацию двух или более чем двух конъюгатов антитело-лекарственное средство и тому подобное.

Понятно, что в описании изобретения используется фраза "содержат/включают/включают в себя", кроме того, также предложены похожие термины, такие как "состоящие из…" и/или "по существу состоящие из…".

Хотя числовые диапазоны и приближенные значения параметров представлены в широком объеме описания настоящего изобретения, числовые величины, представленные в конкретных примерах, были приведены настолько точно, насколько возможно. Тем не менее, любая числовая величина может по своей природе содержать некоторые ошибки вследствие стандартных отклонений, представленных в соответствующих измерениях. Кроме того, все раскрытые здесь диапазоны следует понимать как охватывающие любые и все поддиапазоны. Например, приведенный диапазон от "1 до 10" следует рассматривать как охватывающий любые и все поддиапазоны между минимум 1 и максимум 10 (включая крайние точки); то есть включены все поддиапазоны, начинающиеся с минимум 1 или больше, например от 1 до 6,1, и поддиапазоны, оканчивающиеся максимально 10 или меньше, такие как от 5,5 до 10. Кроме того, любую ссылку, обозначенную как "включенная сюда" следует понимать как включенную во всей своей полноте.

Используемый в описании настоящего изобретения указывает на то, что группа, содержащая связана с другой группой химической связью.

Связывающая единица и линкер в описании настоящего изобретения могут быть использованы взаимозаменяемо; активная единица, лекарственное средство и ядовитое вещество в описании настоящего изобретения могут быть использованы взаимозаменяемо.

Термин "антиген" в описании настоящего изобретения относится к любой молекуле, которая вызывает иммунный ответ или обладает способностью быть связанным с антителом или связывающейся с антигеном молекулой. В иммунный ответ может быть вовлечено продуцирование антител или активация специфических иммунокомпетентных клеток либо и то, и другое. Специалисту в данной области техники легко понятно, что любая макромолекула, включая почти все белки или пептиды, может действовать в качестве антигена. Как правило, антиген может экспрессироваться эндогенно, то есть экспрессироваться геномной ДНК, или он может экспрессироваться рекомбинантно, или он может быть синтезирован химически. "Антиген", к которому относится описание настоящего изобретения, в частности относится к таким опухолеассоциированным антигенам, которые хорошо известны в области техники, и могут быть получены при помощи хорошо известных в области техники способов приготовления антитела. Для разработки эффективных на клеточном уровне мишеней для диагностики и лечения рака исследователи пытаются найти трансмембранные или другие опухолеассоциированные полипептиды. Эти мишени обладают способностью специфически экспрессироваться на поверхности одной или более чем одной раковой клетки при небольшой экспрессии или ее отсутствии на поверхности одной или более чем одной нераковой клетки. Как правило, такие опухолеассоциированные полипептиды сверхэкспрессированы на поверхности раковых клеток по сравнению с поверхностью нераковых клеток. Идентификация таких опухолеассоциированных факторов может в значительной степени усиливать специфические характеристики нацеливания лечения рака, основанного на антителе. Опухолеассоциированные антигены включают, без ограничения, опухолеассоциированные антигены (1)-(36), перечисленные ниже. Для удобства, относящаяся к антигену информация, хорошо известная в области техники, представлена ниже, включая название, другие названия и номер доступа Genbank. Нуклеиновокислотные и белковые последовательности, соответствующие опухолеассоциированным антигенам, можно найти в общедоступных базах данных, таких как Genbank. Опухолеассоциированные антигены, на которые нацелены соответствующие антитела, включают все варианты и гомологи аминокислотной последовательности, имеющие по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90% или 95% гомологии с реальной подтвержденной последовательностью или обладающие полностью идентичными биологическими свойствами и характеристиками с последовательностями вышеупомянутого опухолеассоциированного антигена. Опухолеассоциированные антигены (1)-(37) являются следующими:

(1) BMPR1B (рецептор морфогенетического белка кости 1В, номер доступа Genbank NM_001203);

(2) Е16 (LAT1, SLC7A5, номер доступа Genbank NM_003486);

(3) STEAP1 (имеющий шесть трансмембранных доменов эпителиальный антиген предстательной железы 1, номер доступа Genbank NM_012449);

(4) 0772Р (СА125, MUC16, номер доступа Genbank AF361486);

(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, потенцирующий фактор мегакариоцитов, мезотелин, номер доступа Genbank NM_005823);

(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, представитель 2 семейства растворимых носителей 34 (фосфат натрия), натрий-зависимый переносчик фосфата 3b II типа, номер доступа Genbank NM_006424);

(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, сигнальный белок головного мозга 5b Hlog, домен sema, семь тромбоспондиновых повторов (тип 1 и подобные типу 1), трансмембранный домен (ТМ) и короткий цитоплазматический домен, (сигнальный белок головного мозга) 5В, номер доступа Genbank АВ040878);

(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN кДНК 2700050C12, ген RIKEN кДНК 2700050C12, номер доступа Genbank AY358628);

(9) ETBR (эндотелиновый рецептор типа В, номер доступа Genbank AY275463);

(10) MSG783 (RNF124, гипотетический белок FLJ20315, номер доступа Genbank NM_017763);

(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, ассоциированный с раком предстательной железы ген 1, ассоциированный с раком предстательной железы белок 1, имеющий шесть транс мембранных доменов эпителиальный антиген предстательной железы 2, имеющий шесть трансмембранных доменов белок предстательной железы, номер доступа Genbank AF455138);

(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, временный рецепторный потенциальный катионный канал, подсемейство М, представитель 4, номер доступа Genbank NM_017636);

(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, полученный из тератомы фактор роста, номер доступа Genbank NP_003203 или NM_003212);

(14) CD21 (CR2 (рецептор комплемента 2) или C3DR (C3d/рецептор вируса Эпштейна-Барр) или Hs.73792, номер доступа Genbank М26004);

(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (ассоциированный с иммуноглобулином бета), В29, номер доступа Genbank NM_000626);

(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (содержащий домен SH2 фосфатазный якорный белок 1a), SPAP1B, SPAP1C, номер доступа Genbank NM_030764);

(17) HER2 (ErbB2, номер доступа Genbank M11730);

(18) NCA (CEACAM6, номер доступа Genbank M18728);

(19) MDP (DPEP1, номер доступа Genbank ВС017023);

(20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, номер доступа Genbank AF184971);

(21) Бревикан (BCAN, BEHAB, номер доступа Genbank AF229053);

(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, номер доступа Genbank NM_004442);

(23) ASLG659 (B7h, номер доступа Genbank AX092328);

(24) PSCA (предшественник антигена стволовых клеток предстательной железы, номер доступа Genbank AJ297436);

(25) GEDA (номер доступа Genbank AY260763);

(26) BAFF-R (рецептор активирующего В-клетки фактора, рецептор BLyS 3, BR3, номер доступа Genbank AF116456);

(27) CD22 (изотип В-клеточного рецептора CD22-B, номер доступа Genbank AK026467);

(28) CD79a (CD79A, CD79α, ассоциированный с иммуноглобулинами альфа, способный ковалентно взаимодействовать с Igβ (CD79B) и образовывать комплекс с молекулами IgM на поверхности, трансдуцировать сигналы к специфичным для В-клеток белкам, вовлеченным в дифференцировку В-клеток, номер доступа Genbank NP_001774.1);

(29) CXCR5 (рецептор лимфомы Беркитта 1, рецептор, связанный с G-белком, активируемый хемокином CXCL13, играющий роль в миграции лимфоцита и в гуморальной защите, в инфицировании HIV-2 (вирус иммунодефицита человека 2) и, возможно, в AIDS (синдром приобретенного иммунодефицита), лимфоме, миеломе и лейкозе, номер доступа Genbank NP_001707.1);

(30) HLA-DOB (бета-субъединица молекулы МНС класса II (антиген Ia), которая связывается с пептидом и презентирует его CD4+ Т-лимфоидным клеткам, номер доступа Genbank NP_002111.1);

(31) Р2Х5 (зависимый от лиганда пуринового рецептора Р2Х ионный канал 5, ионный канал, управляемый внеклеточным АТР (аденозинтрифосфатом), который может быть вовлечен в синаптическую передачу и регенерацию нейронов, и дефицит которого может приводить к патофизиологическим состояниям идиопатической нестабильности детрузора, номер доступа Genbank NP_002552.2);

(32) CD72 (антиген дифференцировки В-клеток CD72, Lyb-2, номер доступа Genbank NP_001773.1);

(33) LY64 (лимфоцитарный антиген 64 (RP105), семейство мембранных белков I типа (LRR), богатых лейциновыми повторами, которые регулируют активацию и апоптоз В-клеток, и утрата функции ассоциирована с увеличенной активностью заболевания у пациентов, с системной красной волчанкой, номер доступа Genbank NP_005573.1);

(34) FcRH1 (белок, подобный рецептору Fc 1, предполагаемый рецептор домена Fc иммуноглобулинов, который содержит подобные Ig и ITAM домены типа С2, может играть роль в дифференцировке В-лимфоцитов, номер доступа Genbank NP_443170.1);

(35) IRTA2 (ассоциированный с транслокацией рецептор 2 иммуноглобулинового суперсемейства, предполагаемый иммунорецептор, который может играть роль в развитии В-клеток и образовании лимфомы; генетические расстройства, вызываемые транслокацией, возникают при некоторых В-клеточных злокачественных новообразованиях, номер доступа Genbank NP_112571.1);

(36) TENB2 (предполагаемый трансмембранный протеогликан, ассоциированный с семейством ростовых факторов EGF/херегулин и фоллистатином, номер доступа Genbank AF179274);

(37) Другие родственные антигены.

Термин "антитело" в описании настоящего изобретения используется в самом широком объеме и охватывает различные структуры антитела, включая, без ограничения, моноклональное антитело, поликлональное антитело, мультиспецифическое антитело (например биспецифическое антитело) и фрагмент антитела. Как правило, антитело может содержать по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи, связанные друг с другом дисульфидными связями, или их антигенсвязывающие фрагменты. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три константных домена: CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит константный домен: CL. Кроме того, вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи можно разделить на гипервариабельные области, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), перемежаемые более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи содержит три CDR и четыре FR, расположенные от N-конца с С-концу в следующей последовательности: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константная область Ab (антитела) может опосредовать связывание иммуноглобулинов с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки), и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Если не указано иное, то термин "антитело" в описании настоящего изобретения охватывает интактный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. Антигенсвязывающий фрагмент может быть получен при помощи методик рекомбинантной ДНК или посредством ферментативного или химического расщепления интактного антитела. Антигенсвязывающие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, доменное антитело (dAb), фрагмент, включающий область, определяющую комплементарность (CDR), одноцепочечное антитело (scFv), химерное антитело, двухвалентное антитело, трехвалентное антитело, тетравалентное антитело и полипептид, который содержит по меньшей мере фрагмент иммуноглобулина, который является достаточным для того, чтобы придать полипептиду специфическое связывание с антигеном. Термин "антитела" в описании настоящего изобретения также включает встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе (рекомбинантно полученные) антитела, человеческие и антитела, не являющиеся человеческими, моноспецифическое антитело, мультиспецифическое антитело (включая биспецифическое антитело), иммуноглобулин, синтетическое антитело, тетрамерное антитело, содержащее две молекулы тяжелой цепи и две молекулы легкой цепи, мономер легкой цепи антитела, мономер тяжелой цепи антитела, димер легкой цепи антитела, димер тяжелой цепи антитела, пары легкая цепь антитела-тяжелая цепь антитела, внутриклеточное антитело (смотри, например Stocks, (2004) Drug Discovery Today 9(22): 960-66), слитое соединение антитела (этот термин охватывает конъюгат антитело-лекарственное средство и иногда относится здесь к "конъюгату антитела"), гетероконъюгатное антитело, однодоменное антитело, моновалентное антитело, одноцепочечное антитело или одноцепочечный Fv (scFv), камелизированное антитело, аффитело, фрагмент Fab, фрагмент F(ab')₂, связанное дисульфидной связью Fv (sdFv), антиидиотипическое (анти-Id) антитело (включая, например, анти-анти-Id антитело), минитело, доменное антитело, синтетическое антитело (иногда называемое здесь "имитирующим антителом") и его антигенсвязывающий фрагмент.

Термин "функциональный фрагмент" в описании настоящего изобретения относится к фрагменту антитела, состоящему из частичной последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи, от которой имеет происхождение антитело, или содержащему ее. Частичная последовательность обладает способностью сохранять такую же специфичность связывания, как и антитело, от которого она имеет происхождение, и достаточной аффинностью, предпочтительно по меньшей мере равной 1/100 аффинности антитела, от которого она имеет происхождение, более предпочтительно по меньшей мере 1/10. Такой функциональный фрагмент содержит минимум 5 аминокислот, предпочтительно 10, 15, 25, 50 и 100 последовательных аминокислот последовательности антитела, от которой он имеет происхождение.

Термин "гуманизированное антитело" относится к антителу, содержащему область CDR, имеющую происхождение из антитела, не являющегося человеческим, а другой фрагмент антитела получен из одного (или нескольких) человеческого(их) антител(а). Кроме того, для сохранения аффинности связывания некоторые остатки скелета (называемого FR) могут быть модифицированы (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988). Гуманизированное антитело или его фрагмент в соответствии с описанием настоящего изобретения могут быть получены при помощи методик, известных специалистам в данной области техники (например, как описано в источниках: Singer et al., J. Immun. 150: 2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; или Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992).

Термин "химерное антитело" относится к антителу, в котором последовательность вариабельной области имеет происхождение из одного вида, а последовательность константной области имеет происхождение из другого вида, например антитело, имеющее последовательность вариабельной области, имеющую происхождение из мышиного антитела, и последовательность константной области, имеющую происхождение из человеческого антитела. Химерное антитело или его фрагмент в соответствии с описанием настоящего изобретения могут быть получены с использованием методик генетической рекомбинации. Например, химерное антитело может быть получено путем клонирования рекомбинантной ДНК, содержащей промотор и последовательность, кодирующую вариабельную область не являющегося человеческим, в частности мышиного, моноклонального антитела в соответствии с описанием настоящего изобретения, а также последовательность, кодирующую константную область человеческого антитела. Химерное антитело в соответствии с описанием настоящего изобретения, кодируемое таким рекомбинантным геном, будет представлять собой, например, мышино-человеческую химеру, специфичность которой определяется вариабельной областью, имеющей происхождение от мышиной ДНК, и изотип которой определяется константной областью, имеющей происхождение от человеческой ДНК. В отношении способов получения химерных антитела, например, можно сделать ссылку на Verhoeyn et al. (BioEssays, 8: 74, 1988).

Термин "моноклональное антитело" относится к получению молекулы антитела, имеющей композицию одной молекулы. Моноклональное антитело демонстрирует единичную связывающую специфичность и аффинность в отношении конкретного эпитопа.

В некоторых конкретных воплощениях антитела в соответствии с описанием настоящего изобретения включают, без ограничения: муромомаб-CD3, абциксимаб, ритуксимаб, даклизумаб, паливизумаб, инфликсимаб, трастузумаб, этанерцепт, базиликсимаб, гемтузумаб, алемтузумаб, ибритумомаб, адалимумаб, алефацепт, омализумаб, эфализумаб, тозитумомаб, цетуксимаб, АВТ-806, бевацизумаб, натализумаб, ранибизумаб, панитумумаб, экулизумаб, рилонацепт, цертолизумаб, ромиплостим, AMG-531, голимумаб, устекинумаб, АВТ-874, белатацепт, белимумаб, атацицепт, антитело против CD20, канакинумаб, тоцилизумаб, атезолизумаб, меполизумаб, пертузумаб, HuMax CD20, тремелимумаб, тицилимумаб, ипилимумаб, IDEC-114, интузумаб, HuMax EGFR, афлиберцепт, HuMax-CD4, теплизумаб, отеликсузумаб, катумаксомаб, антитело против EpCAM IGN101, адакимумаб, ореговомаб, динутуксимаб, гирентуксимаб, денозумаб, бапинеузумаб, мотавизумаб, эфумгумаб, раксибакумаб, LY2469298 и велтузумаб.

Термин "линкер" в описании настоящего изобретения относится к молекуле, имеющей бифункциональную группу или полифункциональную группу, которые могут взаимодействовать соответственно с белком/молекулой антитела и молекулой лекарственного средства, и, таким образом, служит в качестве "мостика" для связывания белка/антитела с молекулой лекарственного средства. В соответствии с механизмом высвобождения лекарственного средства в клетках, "линкер" или "линкер конъюгата антитело-лекарственное средство" можно разделить на два класса: нерасщепляемый линкер и расщепляемый линкер.

Нерасщепляемый линкер представляет собой относительно стабильный линкер, структуру которого трудно подвергнуть деградации или разрушить in vivo. Для конъюгата антитело-лекарственное средство, содержащего нерасщепляемый линкер, механизм высвобождения лекарственного средства представляет собой следующее: конъюгат связывается с антигеном и затем захватывается путем эндоцитоза; антитело гидролизуется в лизосоме, и высвобождается активная молекула, состоящая из небольшой молекулы лекарственного средства, линкера и аминокислотных остатков антитела. Получающееся в результате изменение структуры не уменьшает цитотоксичность лекарственного средства. Тем не менее, поскольку активная молекула заряжена (за счет аминокислотных остатков), она не может проникать в соседние клетки. Таким образом, такие активные лекарственные средства не могут уничтожать соседние опухолевые клетки, которые не экспрессируют антиген-мишень (клетки, отрицательные по антигену) (эффект "свидетеля") (Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13). Обычные нерасщепляемые линкеры представляют собой линкеры МС и линкеры МСС и т.п.:

Расщепляемый линкер, как подразумевает название, может расщепляться в клетках-мишенях и высвобождать активное лекарственное средство (саму небольшую молекулу лекарственного средства). Расщепляемый линкер можно разделить на два основных класса: химически неустойчивый линкер и ферментативно неустойчивый линкер.

Химически неустойчивый линкер может избирательно расщепляться вследствие различных плазматических и цитоплазматических свойств. Такие свойства включают рН, концентрацию глутатиона и тому подобное.

рН-чувствительный линкер, часто называемый неустойчивым к действию кислоты линкером. Такой линкер является относительно стабильным в нейтральном окружении в крови (рН 7,3-7,5), но гидролизуется в слегка кислых эндосомах (рН 5,0-6,5) и лизосомах (рН 4,5-5,0). В большей части конъюгатов антитело-лекарственное средство первого поколения используется этот тип линкера, такой как гидразон, карбонат, ацеталь, кетали. Конъюгаты антитело-лекарственное средство, в которых используется этот тип линкера, как правило, обладают более коротким периодом полувыведения (2-3 суток) вследствие ограниченной стабильности неустойчивого к действию кислоты линкера в плазме крови. Этот короткий период полувыведения до некоторой степени ограничивает применение рН-чувствительного линкера в конъюгатах антитело-лекарственное средство нового поколения.

Глутатион-чувствительный линкер также известен как дисульфидный линкер. Высвобождение лекарственного средства вызывается различием между высокой концентрацией (в миллимолярном диапазоне) внутриклеточного глутатиона и относительно низкой концентрацией глутатиона (микромолярный диапазон) в крови. Это особенно актуально для опухолевых клеток, в которых низкое содержание кислорода приводит к усиленной редуктазной активности, таким образом, приводя к более высокой концентрации глутатиона. Дисульфидная связь является термодинамически стабильной и, таким образом, обладает более хорошей стабильностью в плазме крови.

Ферментативно неустойчивый линкер, такой как пептидный линкер, обладает способностью лучше контролировать высвобождение лекарственного средства. Пептидный линкер обладает способностью эффективно расщепляться протеазой в лизосомах, таких как катепсин В или плазмин (содержание такого фермента увеличивается в некоторых опухолевых тканях). Предполагают, что эта пептидная связь является очень стабильной в плазме крови, поскольку внеклеточный неподходящий рН, а также сывороточные ингибиторы протеазы как правило приводят к инактивации протеазы за пределами клетки. Вследствие высокой стабильности в плазме крови и хорошей внутриклеточной избирательности и эффективности расщепления, ферментативно неустойчивые линкеры широко используются в качестве расщепляемых линкеров для конъюгатов антитело-лекарственное средство. Типичные ферментативно неустойчивые линкеры представляют собой линкеры vc и тому подобные.

Суицидный линкер, как правило, является химерным между расщепляемым линкером и активным лекарственным средством или сам является частью расщепляемого линкера. Механизм суицидного линкера заключается в том, что когда расщепляемый линкер разрушается в подходящих условиях, суицидный линкер может спонтанно осуществлять структурную перестройку для высвобождения связанного с ним активного лекарственного средства. Обычные суицидные линкеры являются такими, как пара-аминобензиловые спирты (РАВ).

Термин "активное лекарственное средство" в описании настоящего изобретения широко относится к любому соединению, обладающему желаемой биологической активностью и реакционноспособной функциональной группой для получения конъюгата в соответствии с описанием настоящего изобретения. Желаемая биологическая активность включает способность диагностировать, исцелять, облегчать, лечить, предупреждать заболевания у людей и других животных. Поскольку непрерывно открывают и разрабатывают новые лекарственные средства, эти новые лекарственные средства также должны быть включены в лекарственные средства в соответствии с описанием настоящего изобретения. В частности, эти лекарственные средства включают, без ограничения, цитотоксическое лекарственное средство, фактор клеточной дифференцировки, трофический фактор стволовой клетки, стероидное лекарственное средство, лекарственное средство для лечения аутоиммунного заболевания, противовоспалительное лекарственное средство или лекарственное средство против инфекционного заболевания. Более конкретно, эти лекарственные средства включают, без ограничения, ингибитор тубулина или ДНК, агент, повреждающий РНК. Предпочтительно, активные лекарственные средства, охваченные в описании настоящего изобретения, включают, без ограничения, следующие:

(а) эрлотиниб, бортезомиб, фулвестрант, сутент, летрозол, иматиниба мезилат, PTK787/ZK222584, оксалиплатин, 5-фторурацил, фолиновую кислоту, рапамицин, лапатиниб, лонафаниб, сорафениб, гефитиниб, AG1478, AG1571, тиотепу, циклофосфамид, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопу, карбоквон, метуредопу, уредопу, этиленимин, альтретамин, триэтилен меламин, триэтилен фосфорамид, триэтилен тиофосфорамид, триметилол меламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, топотекан, бриостатин, каллистатин, СС-1065, адозелезин, карзелезин, бизелезин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, KW-2189, СВ1-ТМ1, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, дихлорметил диэтиламин, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимнустин, калихеамицин, калихеамицин γ1, калихеамицин ω1, динемицин, динемицин А, клодронат, эсперамицин, неокарзиностатин хромофор, аклациномизин, актиномицин, аутрармицин (authrarmycin), азасерин, блеомицин, актиномицин С, карабицин, карминомицин, карзинофиллин, хромомицин, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, морфолино адриамицин, цианоморфолино адриамицин, 2-пирролино-адриамицин, липосомальный адриамицин, дезоксиадриамицин, эпирубицин, эзорубицин, марцелломицин, митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, 5-фторурацил, деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, альдофосфамида гликозид, митотан, трилостан, фолиновую кислоту, ацеглатон, альдофосфамида гликозид, аминолевулиновую кислоту, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазиквон, элформитин, эллиптиния ацетат, этоглюцид, нитрат галлия, гидроксимочевину, лентинан, лонидамин, майтанзин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраерин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, гидразид 2-этил, прокарбазин, полисахарид-k, разоксан, ризомицин, сизофиран, спирогерманий, тенуазоновую кислоту, триазиквон, 2,2',2''-трихлортриэтиламин, токсин Т-2, верракурин А, роридин А, и ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, дибромманнит, митолактол, пипоброман, безводный цитозин, арабинозид, циклофосфамид, тиотепу, паклитаксел, полученный путем инженерии с альбумином препарат наночастиц паклитаксела, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, карбоплатин, винбластин, платину, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, митоксантрон, тенипозид, эдатраксат, дауномицин, аминоптерин, кселоду, ибандронат, СРТ-11, ингибитор топоизомеразы RFS 2000, дифторметилорнитин, ретиноевую кислоту, капецитабин или любые их фармацевтически приемлемые соли, сольваты или кислоты;

(б) монокин, лимфокин, традиционный полипептидный гормон, паратиреоидный гормон, тироксин, релаксин, прорелаксин, гликопротеиновый гормон, фолликулостимулирующий гормон, тиреотропный гормон, лютеинизирующий гормон, печеночный фактор роста, фактор роста фибробластов, пролактин, плацентарный лактоген, фактор некроза опухоли-α, фактор некроза опухоли-β, мюллерово ингибирующее вещество, пептид, родственный мышиному гонадотропину, ингибин, активин, фактор роста эндотелия сосудов, тромпопоэтин, эритропоэтин, остеоиндуктивный фактор, интерферон, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, колониестимулирующий фактор («CSF»), макрофагальный CSF, гранулоцитарно-макрофагальный CSF, гранулоцитарный CSF, интерлейкин (IL), IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, фактор некроза опухоли, TNF-α, TNF-β, полипептидный фактор, LIF, лиганд kit или любую их комбинацию;

(в) дифтерийный токсин, ботулинический токсин, столбнячный токсин, дизентерийный токсин, холерный токсин, аманитин, производные аманитина, α-аманитин, пирролобензодиазепин, производные пирролобензодиазепина, тетродотоксин, бреветоксин, сигуатоксин, рицин, токсин AM, микротубулин лизин, гелданамицин, майтанзиновое соединение, калихеамицин, даунорубицин, адриамицин, метотрексат, виндезин, SG2285, доластатин, аналог доластатина, ауристатин, криптофицин, камптотецин, производное и метаболит камптотецина, ризомицин, производное ризомицина, СС-1065, аналог или производное СС-1065, дуокармицин, энедииновые антибиотики, эсперамицин, эпотилон, азонафид, аплидин, анатоксин или любую их комбинацию;

(г) аффинный лиганд, где аффинный лиганд представляет собой субстрат, ингибитор, стимулятор, нейромедиатор, радиоактивный изотоп или любую их комбинацию;

(д) радиоактивную метку, ³²Р, ³⁵S, флуоресцентный краситель, электронно-плотный реагент, фермент, биотин, стрептавидин, дигитоксин, гаптен, иммуногенный белок, молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, комплементарную мишени, или любую их комбинацию;

(е) иммуномодулирующее соединение, противораковый агент, противовирусный агент, антибактериальный агент, противогрибковый агент и противопаразитарный агент или любую их комбинацию;

(ж) тамоксифен, ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, налоксифен, LY117018, онапристон или торемифен;

(з) 4(5)-имидазол, аминоглутетимид, мегестрол ацетат, экземестан, летрозол или анастрозол;

(и) флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид, госерелин или троксацитабин;

(к) ингибитор ароматазы;

(л) ингибитор протеинкиназы;

(м) ингибитор липидкиназы;

(и) антисмысловой олигонуклеотид;

(о) рибозим;

(п) вакцину; и

(р) антиангиогенный агент.

В некоторых воплощениях описания настоящего изобретения "активное лекарственное средство" выбрано из группы, состоящей из: майтанзинов, ингибиторов V-АТФазы, проапоптотических агентов, ингибиторов Be12, ингибиторов McL1, ингибиторов HSP90 (белка теплового шока 90), ингибиторов IAP (ингибитора активатора плаз миноге на), ингибиторов mTOr (мишени рапамицина в клетках млекопитающих), стабилизаторов микротрубочек, дестабилизаторов микротрубочек, ауристатинов, доластатинов, MetAP (метионин аминопептидаза), ингибиторов выхода из ядра белка CRM1, ингибиторов DPPIV (дипептидилпептидазы IV), ингибиторов протеасомы, ингибиторов реакции переноса фосфорила в митохондриях, ингибиторов синтеза белка, киназных ингибиторов, ингибиторов CDK2 (циклинзависимой киназы 2), ингибиторов CDK9, кинезиновых ингибиторов, ингибиторов HDAC (деацетилазы гистонов), агентов, повреждающих ДНК, агентов, алкилирующих ДНК, агентов, интеркалирующих ДНК, агентов, связывающихся с малой бороздкой ДНК, ингибиторов DHFR (дигидрофолатредуктазы), а также доластатиновых пептидов, предшественников витамина А и фолиевой кислоты.

В некоторых воплощениях в соответствии с описанием настоящего изобретения "активное лекарственное средство" представляет собой цитотоксическое лекарственное средство (например, антиметаболит, противоопухолевый антибиотик, алкалоид), иммуностимулятор или радиоизотоп. Предпочтительно, лекарственное средство может быть выбрано из группы, состоящей из аманитинов, антрациклинов, баккатинов, камптотецинов, цематотинов, колхицинов, колцемидов, комбретастатинов, криптофицинов, дискодермолидов, доцетаксела, доксорубицина, эхиномицинов, элеутеробинов, эпотилонов, эстрамустинов, лекситропсинов, майтанзинов, метотрексата, нетропсинов, пуромицинов, ризоксинов, таксанов, тубулизинов или алкалоидов барвинка. Более предпочтительно, лекарственное средство может быть выбрано из группы, состоящей из MMAD (монометилауристатина D) и его производных, ММАЕ (монометилауристатина Е) и его производных, MMAF (монометилауристатина F) и его производных, мерденсинового производного M1, мертансинового производного М4, дуокармицина и его производных, калихеамицина и его производных, PBDA (пирролобензодиазепинов), доксорубицина, алкалоидов барвинка, метотрексата, винбластина, даунорубицина и его производных, тубулинсинов и их производных.

В некоторых конкретных воплощениях "активное лекарственное средство" представляет собой майтанзин или майтанзиноиды. Майтанзин ингибирует клеточную пролиферацию путем ингибирования тубулина, образующего микротрубочку (Science 1975, 189, 1002-1005; US 5208020). Майтанзиноиды представляют собой производные майтанзина. Как майтанзин, так и майтанзиноиды являются в высокой степени цитотоксическими, но они имеют существенные ограничения в отношении клинического применения при терапии рака, главным образом вследствие низкой селективности этих молекул в отношении опухоли. Тем не менее, указанная высокая цитотоксичность делает их предпочтительными группировками лекарственного средства для конъюгатов антитело-лекарственное средство. Ниже приведены майтанзин, майтанзиноиды и три молекулярные структуры майтанзиноидов, которые часто используют в применениях конъюгатов антитело-лекарственное средство.

Основное исходное вещество для синтеза майтанзиноидов представляет собой майтанзинол, который в основном получают путем гидролиза ансамитоцинов. Ансамитоцины можно получить путем ферментации. Об ансамитоциновых производных (WO 2012/061590) и аланил майтанзиноле (US 2012/0121615) также сообщали как о лекарственном средстве для конъюгатов антитело-лекарственное средство.

В некоторых конкретных воплощениях "активное лекарственное средство" представляет собой ауристатины. Ауристатины представляют собой аналоги доластатина 10, который представляет собой биоактивный полипептид, выделенный из морского моллюска морского зайца (US 7498298). Доластатин 10 ингибирует полимеризацию тубулина путем связывания с тубулином (та же самая область связывания, что и для винкристина). Бее из доластатина 10, ауристатина РЕ и ауристатина Е представляют собой линейные полипептиды, содержащие четыре аминокислоты (три являются уникальными для доластатиновых соединений) и С-концевую амидную группу. Два типичных ауристатина: монометилауристатин Е (ММАЕ) и монометилауристатин F (MMAF) представляют собой предпочтительные группировки лекарственного средства для конъюгатов антитело-лекарственное средство.

В некоторых конкретных воплощениях "активное лекарственное средство" представляет собой тубулизины. Тубулизины представляют собой класс природных продуктов, экстрагированных из миксобактерий, которые могут эффективно ингибировать полимеризацию тубулина и, таким образом, обладают антимитотической активностью. Среди тубулизинов тубулизин D обладает наилучшей активностью. Тубулизин D представляет собой тетрапептидное соединение, которое содержит O-ацил/N,O-ацетальные функциональные группы в своей структуре и, таким образом, он является нестабильным в кислых и основных условиях. В US 2011/0021568 и US 2013/0224228, соответственно, раскрыты серии аналогов тубулизина, в которых вышеупомянутые лабильные функциональные группы удалены, при том, что сохраняется высокая жизнеспособность клетки.

В некоторых конкретных воплощениях "активное лекарственное средство" представляет собой калихеамицины. Калихеамицины представляют собой противоопухолевые антибиотики, которые вызывают апоптоз посредством связывания с малой бороздкой ДНК и способствуют расщеплению двуцепочечной ДНК по специфическому сайту. Калихеамицины обладают высокой активностью на субпикомолярном уровне in vitro при низком терапевтическом индексе, что препятствует их клиническим применениям Тем не менее, указанная высокая активность делает их идеальными кандидатами для конъюгатов антитело-лекарственное средство (таких как гемгузумаб и инотузумаб озогамицин).

В некоторых конкретных воплощениях "активное лекарственное средство" представляет собой доксорубицины. Доксорубицин используют в качестве химиотрепаветического лекарственного средства, поскольку он может интеркалировать в структуру двойной спирали ДНК для блокирования репликации ДНК. Теи не менее, вследствие низкой цитотоксичности доксорубицинов (для раковых клеточных линий, имеющих происхождение из человека, медиана ингибирующей концентрации составляет 0,1-0,2 микромоль, тогда как цитотоксические лекарственные средства для конъюгатов антитело-лекарственное средство обычно обладают субнаномолярным уровнем активности), его не используют широко в коньюгатах антитело-лекарственное средство.

В некоторых конкретных воплощениях "активное лекарственное средство" представляет собой бензодипирролы (дуокармицины, СС-1065 и тому подобные) и другие циклопропапирролоинд-4-оновые (CPI) производные. Эти соединения представляют собой сильные агенты в отношении связывания и алкилирования малой бороздки ДНК. Циклопропабензиндол-4-оновые (CBI) аналоги обладают более стабильной химической структурой, более высокой биологической активностью, и их легче синтезировать по сравнению с родительскими соединениями, содержащими природные CPI алкилированные субъединицы. Типичное производное CBI представляет собой фенольное защищенное гидроксилом производное CBI (см. фигуру ниже) с ослабленной токсичностью пролекарства и увеличенной растворимостью в воде.

В некоторых конкретных воплощениях "активное лекарственное средство" представляет собой пирроло[2,1-с][1,4]бензодиазепины (PBD) или димеры PBD. PBD представляют собой класс природных продуктов, продуцируемых стрептомицетами, и его уникальная особенность заключается в способности образовывать не скрученные ковалентные присоединения в малой бороздке ДНК, конкретно в последовательности пурин-гуанин-пурин. Использование PBD в качестве малой молекулы для нацеливания на последовательности ДНК и в качестве нового противоракового и антибактериального лекарственного средства привлекает растущий интерес (Biochemistry 2008, 47, 11818-11829). Гибкая углеродная цепь используется для связывания С8/С8' гидроксильных групп двух единиц PBD, и получающийся в результате димер обладает усиленной биологической активностью (WO 2011/130616). Полагают, что димер PBD может образовывать селективное в отношении последовательности повреждение ДНК, такое как обратимое 5'-Pu-GATC-Py-3' межцепочечное перекрестное связывание, приводящее к его биологической активности. Было доказано, что эти соединения представляют собой очень сильные цитотоксические лекарственные средства и могут быть использованы в качестве кандидатов для конъюгатов антитело-лекарственное средство.

В других конкретных примерах "активное лекарственное средство" не ограничивается классами, упомянутыми выше, но также включает все лекарственные средства, подходящие для конъюгатов антитело-лекарственное средство.

Термин "фармацевтическая композиция" в описании настоящего изобретения обозначает комбинацию по меньшей мере одного лекарственного средства и возможно фармацевтически приемлемого носителя или эксципиента, которые комбинированы вместе для достижения конкретной задачи. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция включает комбинации, которые разделены во времени и/или пространственно, до тех пор, пока они обладают способностью действовать вместе для достижения задач в соответствии с описанием настоящего изобретения. Например, компоненты фармацевтической композиции можно вводить субъекту в совокупности или по отдельности. Когда компоненты фармацевтической композиции вводят субъекту по отдельности, эти компоненты можно вводить субъекту одновременно или последовательно. Предпочтительно, фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду, забуференный водный раствор, изотонический солевой раствор, такой как PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), глюкозу, маннит, декстрозу, лактозу, крахмал, стеарат магния, целлюлозу, карбонат магния, 0,3% глицерин, гиалуроновую кислоту, этанол или полиалкиленгликоль, такой как полипропиленгликоль, триглицерид и тому подобное. Тип используемого фармацевтически приемлемого носителя зависит, в числе прочего, от того, готовят ли композицию в соответствии с описанием настоящего изобретения для перорального, интраназального, внутрикожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. Композиция в соответствии с описанием настоящего изобретения может содержать увлажнитель, эмульгатор или буферное вещество в качестве добавки.

Фармацевтическая композиция, вакцина или фармацевтический препарат в соответствии с описанием настоящего изобретения можно вводить посредством любого подходящего пути, например вводить перорально, назально, внутрикожно, подкожно, внутримышечно или внутривенно.

Термин "эффективное количество" в описании настоящего изобретения охватывает количество, достаточное для уменьшения интенсивности или предупреждения симптома или состояния медицинского заболевания. Эффективное количество также обозначает количество, достаточное для того, чтобы обеспечить или облегчить диагностику. Эффективное количество для конкретного пациента или ветеринарного субъекта может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, методологического пути и вводимой дозы, и тяжести побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или схему дозирования, которая позволяет избежать значительных побочных эффектов или токсических эффектов.

Примеры

Описание настоящего изобретения дополнительно проиллюстрировано ниже в сочетании с конкретными примерами. Следует понимать, что примеры использованы исключительно для иллюстрации описания настоящего изобретения, и не предполагается, что они ограничивают объем настоящего изобретения. Экспериментальные способы в следующих примерах, в которых не уточнены конкретные условия, обычно осуществляются в соответствии с обычными условиями или в соответствии с условиями, рекомендованными производителем, и реактивы неуточненного происхождения представляют собой обычные реактивы, имеющиеся в продаже. Если не указано иное, то все процентные доли, доли, отношения или части представляют собой массовые.

Единица массы по объему в описании настоящего изобретения хорошо известна специалистам в данной области техники и, например, относится к массе растворенного вещества в 100 мл раствора.

Если не определено иное, то все используемые здесь дисциплины и научные термины имеют такие же значения, как известные специалистам в данной области техники. Кроме того, в способах в соответствии с описанием настоящего изобретения можно использовать любые способы и вещества, схожие с изложенными или эквивалентные изложенным. Предпочтительные описанные здесь примеры и вещества приведены исключительно для иллюстративных задач.

Пример 1. Получение соединения 1

145,4 мг малеимидокапроновой кислоты растворяли в 10 мл DMF (диметилформамид), добавляли 244,7 мг HATU (1-бис(диметиламино)метилен-1Н-1,2,3-триазоло-4,5-b-пиридиний-3-оксид-гексафторфосфат) и 226 мкл DIPEA (диизопропилэтиламин) и перемешивали при комнатной температуре. 201,9 мг MMAF (монометилауристатин F) растворяли в 5 мл DMF (диметилформамид) и медленно по каплям добавляли в вышеприведенную реакционную систему, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и очистку осуществляли посредством препаративной жидкостной хроматографии с получением 90,3 мг продукта (малеимидокапроил-MMAF, Mc-MMAF), с выходом 36%. LC-MS (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия): (М+Н)⁺ 924,8, (М-Н)^- 923,2.

36,1 мг малеимидокапроил-MMAF растворяли в 1,5 мл DMF, добавляли 5,6 мг Cys-Cys и 2,1 мкл DIPEA и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Добавляли 1,1 мг Cys-Cys и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли 17,7 мг сукцинимидилового эфира 6-(малеимидо)капроновой кислоты и 25 мкл DIPEA и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и очистку осуществляли посредством препаративной жидкостной хроматографии с получением 20,0 мг соединения 1 с выходом 45%. LC-MS: (М+2Н)²⁺ 1134,1, (М-2Н)^2- 1132,2.

Пример 2. Получение соединения 2

Малеимидокапроил-MMAF получали в соответствии со способом Примера 1. 40,1 мг малеимидокапроил-MMAF растворяли в 1,5 мл DMF, добавляли 4,4 мг Cys-Cys-Cys и 2,1 мкл DIPEA и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли 1,8 мг Cys-Cys-Cys и реакцию продолжали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли 0,9 мг Cys-Cys-Cys и реакцию продолжали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли 13,5 мг сукцинимидилового эфира 6-(малеимидо)капроновой кислоты и 21 мкл DIPEA и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и очистку осуществляли посредством препаративной жидкостной хроматографии с получением 23,1 мг соединения 2 с выходом 49%. LC-MS: (М+3Н)³⁺ 1648,4, (М-3Н)^3- 1646,3.

Пример 3. Получение соединения 3

Малеимидокапроил-MMAF получали в соответствии со способом Примера 1. 31,6 мг малеимидокапроил-MMAF растворяли в 2 мл DMF и затем добавляли 3,9 мг Cys-Cys и 2,9 мкл DIPEA, смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Добавляли 1,2 мг Cys-Cys и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Добавляли 0,8 мг Cys-Cys и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. 12,1 мг 1,3,5-триакрилоилгексагидро-1,3,5-триазин-меркаптоуксусной кислоты и 10,4 мг TSTU растворяли в 1,5 мл DMF и добавляли 17 мкл DIPEA, смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем смесь добавляли в вышеприведенную реакционную систему и перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и очистку осуществляли посредством препаративной жидкостной хроматографии с получением 18,4 мг соединения 3 с выходом 29%. LC-MS: (М+2Н)²⁺ 1199,3, (М-2Н)^2- 1197,4.

Пример 4. Получение соединения 4

Малеимидокапроил-MMAF получали в соответствии со способом Примера 1. 55,0 мг малеимидокапроил-MMAF растворяли в 1,5 мл N,N-диметилформамида, добавляли 11,6 мг Cys-Cys и 4,3 мкл N,N-диизопропилэтиламина и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. 36,1 мг MP2-PNP (2-(2-малеимидоэтокси)этил(4-нитрофенил)карбоната) добавляли в реакционную систему, затем добавляли 51 мкл N,N-диизопропилэтиламина и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и очистку осуществляли посредством препаративной жидкостной хроматографии с получением 18,0 мг соединения 4 с выходом 27%. LC-MS: (M+2H)²⁺ 1142,3, (M-2H)^2- 1141,1.

Пример 5. Получение соединения 5

Малеимидокапроил-MMAF получали в соответствии со способом Примера 1. 55,0 мг малеимидокапроил-MMAF растворяли в 1,5 мл N,N-диметилформамида, добавляли 11,6 мг Cys-Cys и 4,3 мкл N,N-диизопропилэтиламина и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. 71,0 мг Mal-пропионамид-PEG8-пропионат-Osu добавляли в реакционную систему, затем добавляли 51 мкл N,N-диизопропилэтиламина и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и очистку осуществляли посредством препаративной жидкостной хроматографии с получением 19,3 мг соединения 5 с выходом 28%, LC-MS: (М+2Н)²⁺ 1324,1, (М-2Н)^2- 1324,0.

Пример 6. Получение соединения 6

Малеимидокапроил-MMAF получали в соответствии со способом Примера 1. 63,0 мг малеимидокапроил-MMAF растворяли в 2,0 мл N,N-диметилформамида, добавляли 13,3 мг Cys-Cys и 4,8 мкл N,N-диизопропилэтиламина и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. 86,6 мг Mc-VC-PAB-PNP добавляли в реакционную систему и затем добавляли 58 мкл N,N-диизопропилэтиламина и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и очистку осуществляли посредством препаративной жидкостной хроматографии с получением 47,4 мг соединения 6 с выходом 52%, LC-MS: (М+2Н)²⁺ 1336,0, (М-2Н)^2- 1334,6.

Пример 7. Получение соединения 7

Малеимидокапроил-MMAF получали в соответствии со способом Примера 1. 46,6 мг малеимидокапроил-MMAF растворяли в 2,0 мл N,N-диметилформамида, добавляли 10,9 мг Cys-Cys и 3,6 мкл N,N-диизопропилэтиламина и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. 84,4 мг PY-MAA-VC-PAB-PNP добавляли в реакционную систему и затем добавляли 48 мкл N,N-диизопропилэтиламина и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и очистку осуществляли посредством препаративной жидкостной хроматографии с получением 31,0 мг соединения 7 с выходом 43%, LC-MS: (М+2Н)²⁺ 1401,2, (М-2Н)^2- 1399,4.

Пример 8. Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC)

Общие способы синтеза конъюгатов антитело-лекарственное средство являются следующими.

Способ А: Антитело против Her-2 разбавляли до получения раствора 10 мг/мл с использованием буфера PBS (рН=7,4), добавляли 2,4 молярных эквивалента ТСЕР и смесь перемешивали путем встряхивания в течение 1 часа. Добавляли 5,0 молярных эквивалентов линкер-лекарственное средство и смесь перемешивали путем встряхивания и давали возможность пройти реакции в течение 1 ч. После завершения реакции оставшиеся небольшие молекулы удаляли путем ультрафильтрации. Получающийся в результате раствор наносили на колонку для гидрофобной хроматографии (HIC-HPLC) для анализа DAR, распределения лекарственного средства и процентной доли свободного антитела.

Способ В: Антитело против Her-2 разбавляли до получения раствора 10 мг/мл с использованием буфера борная кислота-бура (рН=9), добавляли 5 молярных эквивалентов ТСЕР и смесь перемешивали путем встряхивания в течение 1 часа. Добавляли 6,0 молярных эквивалентов линкер-лекарственное средство и смесь перемешивали путем встряхивания и давали возможность пройти реакции в течение 3 ч. После завершения реакции оставшиеся небольшие молекулы удаляли путем ультрафильтрации. Получающийся в результате раствор наносили на колонку для гидрофобной хроматографии (HIC-HPLC) для анализа DAR, распределения лекарственного средства и процентной доли свободного антитела.

Следующие соединения получали посредством вышеприведенных общих способов получения ADC (А представляет собой антитело или его функциональный связывающий фрагмент, m равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8).

Пример 9. Ингибирующее действие ADC в отношении линии опухолевых клеток SK-BR-3

Опухолевые клетки SK-BR-3 (человеческие клетки рака молочной железы) разрушали и собирали путем центрифугирования. Клетки подсчитывали и разбавляли до клеточной суспензии 0,5-1,5×10⁵ клеток/мл. 100 мкл клеточной суспензии добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. Планшет инкубировали в течение ночи в инкубаторе при 37°С с 5% СО₂. В следующие сутки добавляли ADC с 9 соответствующими градиентами концентраций, клетки без обработки ADC использовали в качестве контрольной группы. После 72 часов культивирования набор для подсчета Cell Counting Kit-8 (набор CCK-8 для краткости) использовали для анализа активности, и 96-лучночный планшет после развития окрашивания использовали для регистрации величины OD (оптической плотности) при 450 нм при помощи считывающего устройства для микропланшетов. Программное обеспечение Prism использовали для расчета IC₅₀ (средней ингибирующей концентрации) на основе величин OD. Когда сглаженная кривая представляется как "S-curve" и R²≥0,95, тогда величина IC₅₀ является подходящей и ее учитывают.

Авторы изобретения отобрали ADC-0 с величиной DAR 3,87 (Сравнительный пример 1), ADC-0 с величиной DAR 7,18 (Сравнительный пример 2), ADC-10 с величиной DAR 4,3 (Сравнительный пример 3) и ADC-34 с величиной DAR 4,29 (Сравнительный пример 4) для экспериментов по ингибированию, проводимых на линии опухолевых клеток SK-BR-3. Величины IC₅₀ для них представлены в Таблице 2.

В Сравнительном примере 2 величина DAR увеличивалась до 7,18 посредством увеличения количества сайтов MMAF, связанных с антителом. По сравнению со Сравнительным примером 1, когда достигался такой же эффект, Сравнительный пример 2 может эффективно уменьшать использование антитела (то есть количество антитела в ADC, и если утрата антитела в способе синтеза не учитывается, то использование антитела равно концентрации ADC), тогда как использование MMAF увеличивается на 19,3%.

В Сравнительном примере 3 два MMAF были связаны с одним линкером и величина DAR (4,3) была сравнима с величиной DAR для Сравнительного примера 1 (3,87). По сравнению со Сравнительным примером 1, когда достигался такой же эффект, в Сравнительном примере 3 эффективно уменьшалось использование антитела на 65,9%, и использование MMAF на 24,3%.

В Сравнительном примере 4 три MMAF были связаны с одним линкером и величина DAR была сравнима с величиной DAR для Сравнительного примера 1. По сравнению со Сравнительным примером 1 в Сравнительном примере 4 эффективно уменьшалось использование антитела на 85,5%, и использование MMAF на 51,8%.

Исходя из вышеприведенных данных по сравнению, ADC-10 и ADC-34 демонстрируют более высокую активность в отношении клеток. Этот эффект не является следствием только улучшенного эффекта ADC посредством увеличения количества MMAF в антителе. Он также демонстрирует, что в случае, когда ADC несет то же самое количество MMAF, путем связывания множества цитотоксических лекарственных средств с одним сайтом количество антитела и используемое количество лекарственных средств в значительной степени уменьшается, обеспечивая неожиданный технический эффект. И за счет одного сайта связывания с множеством лекарственных средств можно также эффективно улучшить однородность продуктов ADC и это способствует продукции лекарственного средства и процессу контроля качества.

Описание настоящего изобретения проиллюстрировано конкретными примерами. Тем не менее, специалисту в данной области техники понятно, что описание настоящего изобретения не ограничено конкретными примерами, и специалисты в данной области техники могут осуществить различные модификации и изменения в объеме описания настоящего изобретения, и различные технические признаки, упомянутые в описании, можно комбинировать друг с другом в зависимости от сущности и объема описания настоящего изобретения. Такие модификации и вариации находятся в объеме описания настоящего изобретения.

1. Конъюгат антитело-лекарственное средство, представленный формулой (II) или формулой (III):

где А представляет собой антитело или его функциональный связывающий фрагмент;

B₁, В₂ и В₃ могут быть одинаковыми или разными; B₁ и В₂, В₂ и В₃ связаны посредством пептидной связи в результате реакции дегидрирования с конденсацией;

каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо представляет собой линкер и они могут быть одинаковыми или разными; L₁ связан ковалентно с N-концом B₁, L₂ и B₁, L₃ и В₂, L₄ и В₃ связаны ковалентно посредством тиольной группы и L₂ и D₁, L₃ и D₂, L₄ и D₃ связаны ковалентно;

каждый из D₁, D₂ и D₃ независимо представляет собой активное лекарственное средство и они могут быть одинаковыми или разными;

Z ковалентно связана с карбонильной группой в В₂ в формуле (II) или карбонильной группой в В₃ в формуле (III);

n представляет собой целое число, равное или большее чем 4, которое представляет собой количество ответвлений, связывающихся с активными лекарственными средствами; и

m выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8;

структуры B₁, В₂ и В₃, соответственно, представлены формулой (V):

где р выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; и

Z выбран из группы, состоящей из ОН, SH и NH₂.

2. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, имеющий структуру, представленную формулой (VI-2), (VI-3) или (VI-5):

где А представляет собой антитело или его функциональный связывающий фрагмент;

каждый из L₁, L₂, L₃ и L₄ независимо представляет собой линкер и они могут быть одинаковыми или разными;

каждый из D₁, D₂ и D₃ независимо представляет собой активное лекарственное средство и они могут быть одинаковыми или разными; и

m выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

3. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1, 2, где L₁ ковалентно связан с амино остатком или тиольным остатком антитела; предпочтительно L₁ ковалентно связан с тиольной группой антитела; более предпочтительно L₁ ковалентно связан с тиольным остатком, образованным в результате разрушения межцепочечной дисульфидной связи антитела.

4. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-3, где L₁, L₂, L₃ и L₄ представляют собой расщепляемый линкер, комбинацию расщепляемых линкеров или нерасщепляемый линкер.

5. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 4, где расщепляемый линкер включает пептидный линкер и полисульфидную связь и где

пептидный линкер содержит от 2 до 20 аминокислот, предпочтительно пептидный линкер выбран из группы, состоящей из -валин-цитруллин- (-Val-Cit-), -глицин-глицин-фенилаланин-глицин- (-Gly-Gly-Phe-Gly-), -валин-аланин- (-Val-Ala-), -валин-лизин- (-Val-Lys-), -валин-аргинин- (-Val-Arg-), -фенилаланин-цитруллин-(-Phe-Cit-), -фенилаланин-лизин- (-Phe-Lys-), -фенилаланин-аргинин- (-Phe-Arg-) и их комбинации; и

полисульфидная связь содержит от 2 до 8 атомов серы, предпочтительно полисульфидная связь выбрана из группы, состоящей из дисульфидной связи (-S-S-), трисульфидной связи (-S-S-S-) и тетрасульфидной связи (-S-S-S-S-).

6. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-5, где L₁ включает следующие структуры:

7. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-6, где L₂, L₃ и L₄ включают следующие структуры:

8. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-7, где антитело или его функциональный связывающий фрагмент включает моноклональное антитело, поликлональное антитело, фрагмент антитела, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, одноцепочечный Fv ("scFv"), диатело, линейное антитело, биспецифическое антитело, мультиспецифическое антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, полностью человеческое антитело или слитый белок, содержащий антигенсвязывающий фрагмент антитела; предпочтительно антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или полностью человеческое антитело.

9. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 8, где антитело представляет собой антитело IgG (иммуноглобулин G) или его функциональный связывающий фрагмент, предпочтительно антитело выбрано из группы, состоящей из антител IgG₁, IgG₂, IgG₃ и IgG₄.

10. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-9, где активное лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из цитотоксической молекулы, фактора клеточной дифференцировки, трофического фактора стволовой клетки, стероидного лекарственного средства, лекарственного средства для лечения аутоиммунного заболевания, противовоспалительного лекарственного средства и лекарственного средства для лечения инфекционного заболевания.

11. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 10, где цитотоксическая молекула включает ингибитор тубулина и агент, повреждающий ДНК;

предпочтительно ингибитор тубулина включает цитотоксическую молекулу доластатинов и ауристатинов, цитотоксическую молекулу майтанзинов; агент, повреждающий ДНК, включает калихеамицины, дуокармицины, пирролобензодиазепин (PBD), производное антрамицина, камптотецины и их производные и SN-38;

более предпочтительно цитокиновая молекула ауристатинов включает ММАЕ (монометилауристатин Е), MMAF (монометилауристатин F) и их производное; и цитотоксическая молекула майтанзинов включает DM1, DM4 и их производное; и

более предпочтительно цитотоксическая молекула включает следующие структуры:

12. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-11, имеющий следующую структуру:

где А представляет собой антитело или его функциональный связывающий фрагмент; и

m выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8.

13. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая эффективное количество конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-12 или его фармацевтически приемлемой соли вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом.

14. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-12 для изготовления лекарственного средства для лечения рака.