Ингибиторы il-8 для применения в лечении некоторых сарком
Владельцы патента RU 2787821:
РИСЕРЧ ИНСТИТЬЮТ ЭТ НЭШНУАЙД ЧИЛДРЕН'С ХОСПИТАЛ (US)
ДОМПЕ' ФАРМАЧЕУТИЧИ С.П.А. (IT)
Группа изобретений относится к области медицины, а именно относится к применению ингибитора IL-8 для профилактики и/или лечения метастазов в легких, связанных с остеосаркомой, где ингибитор IL-8 представляет собой R(-)-2-[(4-трифторметансульфонилокси)фенил]-N-метансульфонил пропионамид или его фармацевтически приемлемую соль, также относится к фармацевтической композиции для применения в профилактике и/или лечении метастазов в легких, связанных с остеосаркомой, содержащей ингибитор IL-8 и фармацевтически приемлемые эксципиенты и/или разбавители, где ингибитор IL-8 представляет собой R(-)-2-[(4-трифторметансульфонилокси)фенил]-N-метансульфонил пропионамид или его фармацевтически приемлемую соль, также относится к продукту или набору для профилактики и/или лечения метастазов в легких, связанных с остеосаркомой, включающему: А) ингибитор IL-8, который представляет собой R(-)-2-[(4-трифторметансульфонилокси)фенил]-N-метансульфонил пропионамид или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтическую композицию, и B) ингибитор IL-6, представляющий собой 2-(7-фторпирроло[1,2-а]хиноксалин-4-ил)2-пиразинкарбоновой кислоты гидразид, А) и В) представляют собой две отдельные композиции для одновременного, раздельного или последовательного применения. Группа изобретений обеспечивает уменьшение или предотвращение возникновения метастазов в легких, связанных с остеосаркомой. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.
Область техники
Настоящее изобретение относится к ингибиторам IL-8 для профилактики и/или лечения некоторых сарком, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, продукту/набору, включающему ингибитор IL-8 с ингибитором IL-6 или с химиотерапевтическим средством.
Уровень техники
Саркомы костей и мягких тканей представляют собой группу редких гетерогенных форм рака, которые в совокупности составляют примерно 1% всех диагностированных злокачественных новообразований. Саркомы представляют собой проблему для врачей, так как они являются редкими и диагноз является часто запоздалым.
Существует более ста различных морфологических подтипов саркомы. Наиболее распространенными типами саркомы костей являются остеосаркома, хондросаркома, саркома Юинга и хордома. Саркомы мягких тканей развиваются из клеток мягких тканей, включая гладкомышечные клетки (лейомиосаркомы), жировые клетки (липосаркомы), грубоволокнистую соединительную ткань (фибросаркомы), скелетные мышцы (рабдомиосаркомы), синовиальную оболочку (синовиальные саркомы), кровеносные сосуды (ангиосаркомы), грудные железы (филлоидная фиброаденома) и нервы (опухоли нервных стволов).
Остеосаркома (OS) представляет собой агрессивное злокачественное новообразование, которое возникает из примитивно трансформированных клеток мезенхимального происхождения (и, таким образом, саркомы), и которое проявляет остеобластическую дифференцировку и продуцирует злокачественный остеоид.
Это наиболее распространенная гистологическая форма первичного рака костей, и она наиболее распространена у подростков и молодых людей.
Полная радикальная хирургическая резекция единым блоком рака является предпочтительным методом лечения остеосаркомы. Хотя около 90% пациентов имеют возможность провести операцию по сохранению конечностей, осложнения, особенно инфекция, расшатывание протеза и несращение кости, или локальный рецидив опухоли, могут вызвать необходимость в дальнейшей операции или ампутации.
Стандартная терапия представляет собой комбинацию ортопедической операции сохранения конечностей, когда это возможно (или ампутация в некоторых случаях) и химиотерапии.
Cаркома Юинга (ES) представляет собой высокоагрессивную опухоль кости с пиковой заболеваемостью среди подростков. Она имеет высокую склонность к метастазированию, что связано с печальными показателами выживаемости примерно 25% (Satterfield, L. et al, Int. J. Cancer, 141: 2062-2075; 2017; Beverly A. Teicher et al, Ann Saudi Med., 31(2): 174-182; 2011).
Члены семейства опухолей саркомы Юинга (ESFT) включают опухолеассоциированные транслокации, которые вызывают онкогенные факторы транскрипции, чаще всего EWS/FLI1. EWS/FLI1 играет доминирующую роль в развитии опухоли, модулируя экспрессию сотен генов-мишеней. Здесь, влияние ингибирования EWS/FLI1 посредством RNAi-опосредованного нокдауна, на клеточную сигнализацию было исследовано с использованием фосфопротеомики на основе масс-спектрометрии для количественной оценки глобальных изменений в фосфорилировании. Этот непредвзятый подход выявил сотни уникальных фосфопептидов, обогащенных такими процессами, как регуляция клеточного цикла и организация цитоскелета. В частности, профилирование фосфотирозина выявило повышенную регуляцию фосфорилирования STAT3 при нокдауне EWS/FLI1. Однако одноклеточный анализ показал, что это был не клеточно-автономный эффект дефицита EWS/FLI1, а скорее сигнальный эффект, возникающий в клетках, в которых нокдаун не происходит. Кондиционированных сред из нокдаун-клеток было достаточно, чтобы индуцировать фосфорилирование STAT3 в контрольных клетках, подтверждая присутствие растворимого фактора, который может активировать STAT3. Анализ цитокинов и эксперименты по ингибированию лигандов/рецепторов показали, что эта активация происходит, в частности, через IL6-зависимый механизм. Взятые вместе, данные подтверждают модель, в которой дефицит EWS/FLI1 приводит к секреции растворимых факторов, таких как IL6, которые активируют передачу сигналов STAT в клетках-свидетелях, которые поддерживают экспрессию EWS/FLI1. Кроме того, было показано, что эти растворимые факторы защищают от апоптоза (Jennifer L. Anderson et al; Mol Cancer Res; 12(12); 2014; Andrej Lissat et al, BMC Cancer, 15: 552; 2015).
Рабдомиосаркома (RMS) представляет собой агрессивную и очень злокачественную форму рака, которая развивается из скелетных (поперечно-полосатых) мышечных клеток, которые не смогли полностью дифференцироваться. Обычно считается, что это заболевание детского возраста, так как подавляющее большинство случаев встречается у лиц моложе 18 лет.
Несмотря на то, что она является относительно редким видом рака, она составляет примерно 40% всех зарегистрированных сарком мягких тканей. RMS может встречаться в любом месте тела, но в основном встречается в области головы, шеи, глазной орбиты, мочеполовой системы, половых органах и конечностях.
Лечение рабдомиосаркомы представляет собой многодисциплинарную практику, включающую хирургическое вмешательство, химиотерапию, облучение и, возможно, иммунотерапию. Хирургия, как правило, является первым шагом в комбинированном терапевтическом подходе. Резектабельность варьируется в зависимости от места опухоли, а RMS часто находится в местах, которые не позволяют провести полную хирургическую резекцию без значительного осложнения и потери функции. Менее 20% RMS опухолей полностью резецируются с негативными краями. К счастью, рабдомиосаркомы, как правило, являются химиочувствительными, приблизительно в 80% случаев они отвечают на химиотерапию. Многокомпонентная химиотерапия показана всем пациентам с рабдомиосаркомой. До применения адъювантной и неоадъювантной терапии с использованием химиотерапевтических средств выживаемость при лечении исключительно хирургическим путем составила <20%. Современные показатели выживаемости при адъювантной терапии составляют приблизительно 60-70%.
Метастазы убивают пациентов с солидными опухолями. Нигде это не проявляется более чем в остесаркоме. Смертельный рак костей остеосаркома (ОС) убивает главным образом посредством метастазирования в легкие. Механизмы, вызывающие этот легочный тропизм, остаются неизвестными. Независимо от того, присутствуют ли у пациентов метастазы при постановке диагноза, или если метастазы возникают через много лет после завершения терапии, пациенты с локализованным заболеванием имеют относительно благоприятную общую выживаемость в течение 5 лет на уровне 70%, в то время как пациенты с метастазированием в легкие имеют очень плохую выживаемость в течение 2 лет на уровне 15% (Allison D. C. et al; Sarcoma 2012, 704872; 2012).
Несмотря на бесчисленные попытки усилить терапию или найти новые методы лечения метастатических заболеваний, ни одно лечение не привело к значительному улучшению результатов за последние 40 лет. Очевидно, что для достижения прогресса в лечении метастатической остеосаркомы потребуются новые подходы (Luetke A. et al.; Cancer Treat. Rev. 40, 523-32; 2014). Крупные консорциумы исследователей в этой области предположили, что дальнейшие успехи в лечении остеосаркомы вряд ли будут достигнуты без улучшения понимания биологии метастазирования и разработки лекарств, нацеленных на эти пути. (Khanna C. et al; Clin Cancer Res; 20(16); 1-10; 2014).
Некоторые предшествующие уровни техники относятся к выявлению факторов риска, связанных с исходом у детей с метастатической рабдомиосаркомой (Oberlin O. et al; Journal of Clinical Oncology, 2008 May 10; 26(14): 2384-2389) and to the outcomes in children with rhabdomyosarcoma (RMS) and lung-only metastatic disease (J. Pediatr. Surg., 2005 Jan.; 40(1):256-62).
Терапия, которая предотвращает появление метастазов в легких у детей и подростков с остеосаркома, спасла бы жизнь более чем 70% тех, кто в настоящее время умирает от своего заболевания.
Интерлейкин-8 (IL-8; CXCL8) считается основным медиатором рекрутирования PMN (полиморфноядерных нейтрофилов) и вовлечен в несколько патологий, включая псориаз, ревматоидный артрит, хроническую обструктивную болезнь легких и реперфузионное повреждение трансплантированного органа (Griffin et al, Arch Dermatol 1988, 124: 216; Fincham et al, J Immunol 1988, 140: 4294; Takematsu et al, Arch Dermatol 1993, 129: 74; Liu et al, 1997, 100:1256; Jeffery, Thorax 1998, 53: 129; Pesci et al, Eur Respir J. 1998, 12: 380; Lafer et al, Br J Pharmacol. 1991, 103: 1153; Romson et al, Circulation 1993, 67: 1016; Welbourn et al, Br J Surg. 1991, 78: 651; Sekido et al, Nature 1993, 365, 654). Биологическая активность IL-8 опосредуется взаимодействием с двумя рецепторами, CXCR1 и CXCR2, принадлежащими к семейству 7TM-GPCR, которые экспрессируются на поверхности PMN человека. Хотя CXCR1 является селективным, связывая с высокой аффинностью только два хемокина, CXCL6 и IL-8, и демонстрируя гораздо более высокую аффинность к IL-8 (Wolf et al, Eur J Immunol 1998, 28: 164), человеческий CXCR2 является более промискуитентным рецептором, связывающим ряд различных цитокинов и хемокинов. Следовательно, CXCR2 опосредует активность ряда различных биологических молекул.
Интерлейкин-6 (IL-6) представляет собой плейотропный цитокин с множественными функциями в иммунной регуляции, воспалении и онкогенезе. Связывание IL-6 с рецептором IL-6 (IL-6R) индуцирует гомодимеризацию и рекрутирование гликопротеина 130 (gp130), что приводит к активации нисходящего сигнального пути.
Gp130 является частью рецепторных сигнальных комплексов по меньшей мере для 8 цитокинов (IL-6, IL-11, IL-27, LIF, CNTF, OSM, CT-1 и CLC). Связывание лиганда индуцирует ассоциацию gp130 с цитокинспецифической цепью рецептора-a с последующей активацией нисходящих сигнальных каскадов, включая пути JAK/STAT, RAS/RAF/MAPK и PI3K/AKT. Было показано, что фосфорилирование gp130 в Ser782 понижающе регулирует экспрессию gp130 на клеточной поверхности. Как повсеместно экспрессируемый рецептор, gp130 участвует в широком спектре важных биологических процессов, включая воспаление, аутоиммунитет, рак, поддержание стволовых клеток и эмбриональное развитие (Mol Cancer Ther; 12(6); 937-49; 2013).
Сущность изобретения
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что ингибирование IL-8 способно уменьшить или предотвратить возникновение метастазов в легких, связанных с остеосаркомой, саркомой Юинга или рабдомиосаркомой. В частности, комбинация ингибитора IL-8 с ингибитором IL-6 оказалась более эффективной.
Авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили, что ингибитор IL-8 является полезным для профилактики и/или лечения первичной опухоли остеосаркомы, саркомы Юинга или рабдомиосаркомы. Предпочтительно, когда ингибитор IL-8 комбинируют с химиотерапевтическим средством.
Соответственно, первым объектом настоящего изобретения является ингибитор IL-8, предпочтительно антитело или маломолекулярная молекула, предпочтительно ингибитор CXCR1, более предпочтительно ингибитор двойных CXCR1/CXCR2, для использования в профилактике и/или лечении саркомы костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними.
Вторым объектом настоящего изобретения является применение указанного ингибитора IL-8, как определено выше, для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечении сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними.
Третьим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и/или лечения сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества указанного ингибитора IL-8.
Четвертый объект изобретения представляет собой фармацевтическую композицию для профилактики и/или лечения сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними, включающую ингибитор IL-8 согласно изобретению и фармацевтически приемлемые эксципиенты и/или разбавители.
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления указанная фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними, более предпочтительно метастазов в легких, дополнительно включает по меньшей мере один ингибитор IL-6 и/или по меньшей мере один ингибитор gp130.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления указанная фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними, более предпочтительно первичной опухоли, дополнительно включает по меньшей мере одно химиотерапевтическое средство.
Пятым и шестым объектом настоящего изобретения являются продукт или набор для применения при лечении и/или профилактике сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, включающие ингибитор IL-8, как определено выше, и одно или несколько фармацевтически активных соединений для одновременного, раздельного или последовательного использования.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
- На фиг. 1 показано, что экспрессия IL6 и IL8 коррелирует с метастатической эффективностью и метастатическим поведением в ксенотрансплантатных моделях метастазирования. Мышей CB17-SCID, инокулированных 1×106 клетками OS, подвергали эвтаназии через 49 дней после инокуляции. a) Общая картина блоков легких, взятых у этих мышей, свидетельствует о заметно большей эффективности колонизации OS-17 по сравнению с другими клеточными линиями. b) Окрашивания H&E из срезов залитых парафином левых долей подсчитывали для количественного определения количества метастазов на срез. c) Количественная оценка показывает значительно более высокое количество метастазов в срезах OS-17 относительно OHS. d) Определение концентраций IL-6 и Il-8 в 72-часовых супернатантах из культур каждой клеточной линии выявляет значительную экспрессию обоих цитокинов в метастатических клетках OS-17 относительно любой неметастатической клеточной линии. e)-f) Оценка способности реагировать на сигналы IL-6 и IL-8 с использованием трансвелл-анализа миграции.
- На фиг.2 показан эффект DF2156A отдельно или в комбинации с sc144 для снижения хемотаксических ответов на сыворотку в клетках OS-17. Клетки OS культивировали на мембране камеры системы Трансвелл, затем подвергали переносу в камеру, содержащую RPMI с 2,5% FBS (pos ctl) или только RPMI (neg ctl). Другие лунки, содержащие 2,5% FBS в нижней камере, обрабатывали 1 мкМ sc144, 10 нМ DF2156A или обоими. Через 24 часа верхние камеры очищали, окрашивали мембраны и подсчитывали клетки.
- На фиг.3 показаны эффекты ингибирования пути IL-6 и IL-8 на метастатическую колонизацию легких. Мышей, инокулированных 1×106 клетками OS-17-luc, обрабатывали фармакологическими ингибиторами IL-6 (sc144), IL-8 (DF2156A) или обоими. A) Биолюминесцентную визуализацию завершали через 28 дней после инокуляции. B) Анализ выживания мышей, показанный в А).
- На фиг.4 показан PD анализ в легочной ткани мышей, получавших DF2156A и sc144. Мышей, получавших инъекции DF2156A или sc144 ежедневно, подвергали эвтаназии через 24 часа после их 14-й дозы препарата. Легкие, собранные от этих мышей, обрабатывали с использованием стандартного FFPE, затем разрезали и окрашивали IHC для pFAK (ниже IL-8) или pSTAT3 (ниже IL-6). Блокада рецепторов уменьшала количество наблюдаемой активации и количество инфильтрирующих клеток, даже при минимальных концентрациях.
- На фиг.5 показан эффект комбинации DF2156A с sc144 в профилактике метастазирования в легкие в нескольких моделях ОС. После инокуляции клеток OS мыши получали либо носитель, либо лечение sc144 и DF2156A в течение 42 дней. В то время, когда одна мышь в каждой группе соответствовала критериям конечной точки, всех мышей в этом исследовании подвергали эвтаназии и собирали легкие, подсчитывали метастатические поражения.
Подробное описание изобретения
Как будет подробно описано в экспериментальном разделе, авторы настоящего изобретения обнаружили, что молекулы, действующие как ингибиторы активности IL-8, обладают терапевтической эффективностью на животных моделях саркомы. Кроме того, авторы настоящего изобретения также обнаружили, что ингибирование IL-8 способно противодействовать возникновению метастазирования в легкие. В частности, комбинированное ингибирование IL-8 и IL-6 предотвращает метастазирование.
Соответственно, первым объектом настоящего изобретения является ингибитор IL-8 для применения при лечении и/или профилактике сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга или рабдомиосаркомы.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления указанный ингибитор IL-8 предназначен для применения в профилактике и/или лечении метастазов в легких, связанных с остеосаркомой, саркомой Юинга или рабдомиосаркомой.
Термин «ингибитор IL-8» в соответствии с настоящей заявкой относится к любому соединению, способному ингибировать, частично или полностью, биологическую активность IL-8. Такое соединение может действовать путем уменьшения экспрессии или активности IL-8 или путем ингибирования запуска внутриклеточной сигнализации, активируемой рецепторами IL-8. Предпочтительно, чтобы указанный ингибитор IL-8 был способен ингибировать, по меньшей мере 50%, предпочтительно, по меньшей мере 60%, хемотаксиса, индуцированного IL-8, в PMN при концентрации, равной или ниже 500 нМ, предпочтительно ниже 100 нМ.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления ингибитор IL-8 всех объектов настоящего изобретения ингибирует активность IL-8, опосредованную рецептором CXCR1 или опосредованную рецепторами как CXCR1, так и CXCR2.
Предпочтительно в соответствии с этим вариантом осуществления указанный ингибитор IL-8 представляет собой либо аллостерический ингибитор, либо ортостерический антагонист рецептора CXCR1 или обоих рецепторов CXCR1 и CXCR2.
Предпочтительно указанный ингибитор IL-8 является селективным по отношению к рецептору CXCR1 или является одинаково высокоактивным по отношению к рецепторам CXCR1 и CXCR2.
Под «селективным к CXCR1» в соответствии с настоящим изобретением подразумевается соединение, которое показывает значение IC50, по меньшей мере 2, предпочтительно 3, log выше к CXCR1, чем к CXCR2. (Bertini R. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (2004), 101 (32), pp. 11791-11796).
Под «одинаково высокоактивным по отношению к CXCR1 и CXCR2» подразумевается соединение, которое показывает значение IC50 в диапазоне 10 пикомолярных (10-11M) - 1 микромолярных (10-6M) в отношении CXCR1 и CXCR2. (Bertini R. et al., Br. J. Pharm. (2012), 165, pp. 436-454).
Более предпочтительно, ингибитор IL-8 согласно изобретению имеет значение IC50 по отношению к рецептору CXCR1 в низком наномолярном диапазоне, предпочтительно в 0,02-5 наномолярном диапазоне.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, также в сочетании с предшествующим вариантом осуществления, указанный ингибитор IL-8 выбран из маломолекулярных молекул и антител, более предпочтительно, представляет собой маломолекулярную молекулу.
Ингибиторы IL-8 в соответствии с приведенным выше определением, способные ингибировать активность IL-8, опосредованную рецептором CXCR1 или опосредованную обоими рецепторами CXCR1 и CXCR2, известны в данной области.
Предпочтительные ингибиторы IL-8 согласно изобретению выбраны из производных 1,3-тиазол-2-иламинофенилпропионовой кислоты, производных 2-фенилпропионовой кислоты и их фармацевтически приемлемых солей.
Среди вышеуказанных соединений указанное производное 1,3-тиазол-2-иламинофенилпропионовой кислоты предпочтительно представляет собой соединение формулы (I):
или его фармацевтически приемлемую соль, где
-R1 представляет собой водород или CH3;
-R2 представляет собой водород или линейный C1-C4 алкил, предпочтительно, представляет собой водород;
-Y представляет собой гетероатом, выбранный из S, O и N; предпочтительно представляет собой S;
-Z выбран из галогена, линейного или разветвленного C1-C4 алкила, C2-C4 алкенила, C2-C4 алкинила, C1-C4 алкокси, гидроксила, карбоксила, C1-C4 ацилокси, фенокси, циано, нитро, амино, C1-C4 ациламино, галоген C1-C3 алкила, галоген C1-C3 алкокси, бензоила, линейного или разветвленного C1-C8 алкансульфоната, линейного или разветвленного C1-C8 алкансульфонамида, линейного или разветвленного C1-C8 алкилсульфонилметила; предпочтительно представляет собой трифторметил;
-X представляет собой ОН или остаток формулы NHR3; где R3 выбран из:
- водорода, гидроксила, линейного или разветвленного C1-C6 алкила, C3-C6 циклоалкила, C2-C6 алкенила, C1-C5 алкокси,
или C1-C6 фенилалкила, где алкильная, циклоалкильная или алкенильная группа может быть замещена COOH остатком
- остатка формулы SO2R4, где R4 представляет собой C1-C2 алкил, C3-C6 циклоалкил, C1-C3 галогеналкил.
Предпочтительно в указанных выше соединениях Х представляет собой OH.
Среди вышеуказанных соединений особенно предпочтительными являются соединения указанной формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли, где:
R1 представляет собой CH3;
R2 представляет собой водород или линейный C1-C4 алкил, предпочтительно, представляет собой водород;
Y представляет собой гетероатом, выбранный из S, O и N; предпочтительно представляет собой S;
Z выбран из галогена, линейного или разветвленного C1-C4 алкила, C2-C4 алкенила, C2-C4 алкинила, C1-C4 алкокси, гидроксила, карбоксила, C1-C4 ацилокси, фенокси, циано, нитро, амино, C1-C4 ациламино, галоген C1-C3 алкила, галоген C1-C3 алкокси, бензоила, линейного или разветвленного C1-C8 алкансульфоната, линейных или разветвленных C1-C8 алкансульфонамидов, линейного или разветвленного C1-C8 алкилсульфонилметила; предпочтительно представляет собой трифторметил;
X представляет собой ОН или остаток формулы NHR3; где R3 выбран из:
- водорода, гидроксила, линейного или разветвленного C1-C6 алкила, C3-C6 циклоалкила, C2-C6 алкенила, C1-C5 алкокси,
или C1-C6 фенилалкила, где алкильная, циклоалкильная или алкенильная группа может быть замещена COOH остатком
- остатка формулы SO2R4, где R4 представляет собой C1-C2 алкил, C3-C6 циклоалкил, C1-C3 галогеналкил.
Предпочтительно в этих соединениях Х представляет собой ОН.
Среди вышеуказанных соединений особенно предпочтительными являются также соединения указанной формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли, где
R1 представляет собой водород;
R2 представляет собой водород или линейный C1-C4 алкил, предпочтительно, представляет собой водород;
Y представляет собой гетероатом, выбранный из S, O и N; предпочтительно представляет собой S;
Z выбран из галогена, линейного или разветвленного C1-C4 алкила, C2-C4 алкенила, C2-C4 алкинила, C1-C4 алкокси, гидроксила, карбоксила, C1-C4 ацилокси, фенокси, циано, нитро, амино, C1-C4 ациламино, галоген C1-C3 алкила, галоген C1-C3 алкокси, бензоила, линейного или разветвленного C1-C8 алкансульфоната, линейных или разветвленных C1-C8 алкансульфонамидов, линейного или разветвленного C1-C8 алкилсульфонилметила; предпочтительно выбран из трифторметила;
X представляет собой ОН или остаток формулы NHR3; где R3 выбран из
- водорода, гидроксила, линейного или разветвленного C1-C6 алкила, C3-C6 циклоалкила, C2-C6 алкенила, C1-C5 алкокси,
или C1-C6 фенилалкила, где алкильная, циклоалкильная или алкенильная группа может быть замещена COOH остатком;
- остатка формулы SO2R4, где R4 представляет собой C1-C2 алкил, C3-C6 циклоалкил, C1-C3 галогеналкил. Более предпочтительно X представляет собой NH2.
Предпочтительно в указанных выше соединениях Х представляет собой OH.
Среди вышеуказанных соединений особенно предпочтительными являются также соединения указанной формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли, где:
R1 представляет собой водород или CH3;
R2 представляет собой водород или линейный C1-C4 алкил, предпочтительно, представляет собой водород;
Y представляет собой гетероатом, выбранный из S, O и N; предпочтительно представляет собой S;
Z выбран из линейного или разветвленного C1-C4 алкила, линейного или разветвленного C1-C4 алкокси, галоген C1-C3 алкила и галоген C1-C3 алкокси; предпочтительно выбран из метила, метокси, трифторметокси, трифторметила, более предпочтительно представляет собой трифторметил;
X представляет собой OH.
Среди вышеуказанных соединений особенно предпочтительными являются также соединения указанной формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли, где:
R1 представляет собой CH3;
R2 представляет собой водород или линейный C1-C4 алкил, предпочтительно, представляет собой водород.
Y представляет собой гетероатом, выбранный из S, O и N; предпочтительно представляет собой S.
Z выбран из линейного или разветвленного C1-C4 алкила, линейного или разветвленного C1-C4 алкокси, галоген C1-C3 алкила и галоген C1-C3 алкокси; предпочтительно выбран из метила, метокси, трифторметокси, трифторметила, более предпочтительно представляет собой трифторметил.
Среди вышеуказанных соединений особенно предпочтительными являются также соединения указанной формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли, где
R1 представляет собой водород;
X представляет собой OH;
R2 представляет собой водород или линейный C1-C4 алкил, предпочтительно, представляет собой водород;
Y представляет собой гетероатом, выбранный из S, O и N; предпочтительно представляет собой S;
Z выбран из линейного или разветвленного C1-C4 алкила, линейного или разветвленного C1-C4 алкокси, галоген C1-C3 алкила и галоген C1-C3 алкокси; предпочтительно представляет собой трифторметил.
Предпочтительно во всех вышеуказанных соединениях формулы (I), где R1 представляет собой водород, хиральный атом углерода фенилпропионовой группы находится в S-конфигурации.
Особенно предпочтительными являются соединения формулы (I) по изобретению, выбранные из 2-метил-2-(4-{[4-(трифторметил)-1,3-тиазол-2-ил]амино}фенил)пропановой кислоты (в настоящем описании обозначена также как DF2726Y) и ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно ее натриевая соль (в настоящем описании обозначена также как DF2726A) и 2-(4-{[4-(трифторметил)-1,3-тиазол-2-ил]амино}фенил)пропановой кислоты и ее фармацевтически приемлемых солей, предпочтительно (2S)-2-(4-{[4-(трифторметил)-1,3-тиазол-2-ил]амино}фенил)пропановой кислоты (также известная как DF2755Y) и ее натриевой соли, также известной как DF2755A.
Соединения формулы (I) раскрыты в WO2010/031835, в которой также раскрыт их способ синтеза, их активность в качестве ингибиторов IL-8, а также их применение в лечении IL-8-зависимых патологий, таких как транзиторная ишемия головного мозга, буллезный пемфигоид, ревматоидный артрит, идиопатический фиброз, гломерулонефрит и повреждения, вызванные ишемией и реперфузией.
Среди указанных выше ингибиторов IL-8 указанное производное 2-фенилпропионовой кислоты предпочтительно представляет собой соединение формулы (II):
(II)
или его фармацевтически приемлемую соль,
где
R4 представляет собой линейный или разветвленный C1-C6 алкил, бензоил, фенокси, трифторметансульфонилокси; предпочтительно он выбран из бензоила, изобутила и трифторметансульфонилокси. Кроме того, согласно предпочтительному варианту осуществления R4 находится в положении 3 или 4 фенильного кольца, более предпочтительно представляет собой 3-бензоил, 4-изобутил или 4-трифторметансульфонилокси.
R5 представляет собой H или линейный или разветвленный C1-C3 алкил, предпочтительно, представляет собой H.
R6 представляет собой линейный или разветвленный C1-C6 алкил или трифторметил; предпочтительно представляет собой линейный или разветвленный C1-C6 алкил, более предпочтительно представляет собой CH3.
Среди вышеуказанных соединений предпочтительными являются соединения формулы (II) или их фармацевтически приемлемые соли, где:
R4 представляет собой C1-C6 алкил или бензоил; предпочтительно находится в положениях 3 и 4, более предпочтительно представляет собой 3-бензоил или 4-изобутил.
R5 представляет собой H или линейный или разветвленный C1-C3 алкил, предпочтительно, представляет собой H,
R6 представляет собой линейный или разветвленный C1-C6 алкил или трифторметил; предпочтительно представляет собой линейный или разветвленный C1-C6 алкил, более предпочтительно представляет собой CH3.
Среди вышеуказанных соединений предпочтительными являются соединения формулы (II) или их фармацевтически приемлемые соли, где:
R4 представляет собой трифторметансульфонилокси, предпочтительно 4-трифторметансульфонилокси,
R5 представляет собой H или линейный или разветвленный C1-C3 алкил, предпочтительно, представляет собой H,
R6 представляет собой линейный или разветвленный C1-C6 алкил или трифторметил; предпочтительно представляет собой линейный или разветвленный C1-C16 алкил, более предпочтительно представляет собой CH3.
Среди вышеуказанных соединений также предпочтительными являются соединения формулы (III):
(III)
или их фармацевтически приемлемые соли,
где
R’ представляет собой водород;
R представляет собой остаток формулы SO2Ra, где Ra представляет собой линейный или разветвленный C1-C4 алкил или галоген C1-C3 алкил, предпочтительно представляет собой CH3.
Предпочтительно в вышеуказанном соединении формулы (II) или (III) хиральный атом углерода фенилпропионовой группы находится в R-конфигурации.
Особенно предпочтительные соединения формулы (II) согласно изобретению выбраны из R-(-)-2-(4-изобутилфенил)пропионил метансульфонамида (также известного как репариксин) и его фармацевтически приемлемых солей. Предпочтительно указанное соединение представляет собой лизиновую in situ соль R(-)-2-(4-изобутилфенил)пропионил метансульфонамида (в настоящем документе также обозначенного как DF1681B).
Другими особенно предпочтительными соединениями формулы (II) или (III) по изобретению являются 2-(4-трифторметансульфонилокси)фенил]-N-метансульфонил пропионамид и его фармацевтически приемлемые соли, предпочтительно его натриевая соль, предпочтительно R(-)-2-[(4-трифторметансульфонилокси)фенил]-N-метансульфонил пропионамид (также известный как DF2156Y) и его натриевая соль (также известная как ладариксин или DF2156A).
Ингибиторы IL-8 формулы (II) и (III) раскрыты в WO0024710 и WO2005/090295, которые также раскрывают способ их синтеза, их активность в качестве ингибиторов IL-8, а также их применение в качестве ингибиторов хемотаксиса нейтрофилов и дегрануляции, индуцированной с помощью IL-8 и при лечении зависимых от IL-8 патологий, таких как псориаз, язвенный колит, меланома, хронические обструктивные заболевания легких (ХОБЛ), буллезный пемфигоид, ревматоидный артрит, идиопатический фиброз, гломерулонефрит и повреждения, вызванные ишемией и реперфузией.
Вторым объектом настоящего изобретения является применение ингибитора IL-8 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга или рабдомиосаркомы.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанное лекарственное средство предназначено для лечения и/или профилактики метастазов в легких, связанных с саркомами костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга или рабдомиосаркомы.
Третьим объектом настоящего изобретения является способ лечения и/или профилактики сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга или рабдомиосаркомы, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ингибитора IL-8, как определено выше.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанный способ предназначен для лечения и/или профилактики метастазов в легких, связанных с саркомами костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга или рабдомиосаркомы.
Используемый в настоящем описании термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, достаточному для достижения лечения или профилактики заболевания. Определение эффективных количеств находится в пределах компетенции специалистов в данной области на основании достижения желаемого эффекта. Эффективное количество будет зависеть от факторов, включая, но не ограничиваясь ими, массу субъекта и/или степень заболевания или нежелательного состояния, от которого страдает субъект.
Термины «лечение» и «профилактика», используемые в настоящем документе, относятся к ликвидации/облегчению или предотвращению/задержке начала, соответственно, расстройства, которое лечат, или одного или нескольких связанных с ним симптомов, несмотря на то, что пациент все еще может страдать от основного заболевания.
Четвертым объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая ингибитор IL-8, как определено выше, для применения в лечении и/или профилактике сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними, в сочетании с фармацевтически приемлемыми эксципиентами и/или разбавителями.
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления указанная фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними, более предпочтительно метастазов в легких, дополнительно включает по меньшей мере один ингибитор IL-6 и/или по меньшей мере один ингибитор gp130.
Термин «ингибитор IL-6» в соответствии с настоящей заявкой относится к любому соединению, способному ингибировать, частично или полностью, биологическую активность IL-6.
Термин «ингибитор gp130» в соответствии с настоящей заявкой относится к любому соединению, способному ингибировать, частично или полностью, биологическую активность gp130.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления указанная фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними, более предпочтительно первичной опухоли, дополнительно включает по меньшей мере одно химиотерапевтическое средство.
Пятым объектом настоящего изобретения является продукт или набор, включающий: A) ингибитор IL-8, как определено выше, для применения при лечении и/или профилактике сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними, или фармацевтическую композицию, как определено выше, и B) по меньшей мере один ингибитор IL-6 и/или по меньшей мере один ингибитор gp130, A) и B), представляют собой две отдельные композиции для одновременного, раздельного или последовательного использования. Предпочтительно, для использования при лечении и/или профилактике метастазов в легких, связанных с остеосаркомой, саркомой Юинга или рабдомиосаркомой.
Согласно одному предпочтительному варанту осуществления указанный ингибитор gp130 выбран из группы, включающей 2-(7-фторпирроло[1,2-а]хиноксалин-4-ил)2-пиразинкарбоновой кислоты гидразид (SC144), ралоксифен и (4R)-3-((2S,3S)-3-гидрокси-2-метил-4-метиленнонаноил)-4-изопропилдигидрофуран-2(3H)-он (LMT-28) (Tae-Hwe Heo et al.; Oncotarget, Vol. 7, No. 13, 15460- 15473; 2016).
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления указанный ингибитор IL-6 выбран из группы, включающей SC144, вобарилизумаб, силтуксимаб, сирукумаб, олокизумаб, клазакизумаб, MAb 1339, тоцилизумаб и сарилумаб (Tae-Hwe Heo et al.; Oncotarget, Vol. 7, No. 13, 15460- 15473; 2016).
Предпочтительно указанный ингибитор IL-6 представляет собой SC144.
Шестым объектом настоящего изобретения является продукт или набор, включающий: A’) ингибитор IL-8, как определено выше, для применения при лечении и/или профилактике сарком костей и мягких тканей, предпочтительно остеосаркомы, саркомы Юинга, рабдомиосаркомы или метастазов в легких, связанных с ними, или фармацевтическую композицию, как определено выше, и B’) по меньшей мере, одно химиотерапевтическое средство, A’) и B’), представляют собой две отдельные композиции для одновременного, раздельного или последовательного применения. Предпочтительно, для применения при лечении и/или профилактике первичной опухоли остеосаркомы, саркомы Юинга или рабдомиосаркомы.
Предпочтительно указанное химиотерапевтическое средство выбрано из группы, включающей доксорубицин, цисплатин, метотрексат, ифосфамид, эпирубицин, этопозид, циклофосфамид, винкристин и актиномицин D.
Для цели настоящего изобретения ингибиторы IL-8 в соответствии с настоящим изобретением получают в виде фармацевтических композиций, подходящих для применения посредством перорального введения, таких как таблетки, капсулы, сиропы, предпочтительно в форме составов с контролируемым высвобождением, или путем парентерального введения, предпочтительно в форме стерильных растворов, подходящих для внутривенного или внутримышечного введения. Фармацевтические композиции могут быть получены в соответствии с общепринятыми способами, например, как описано в Remington, "The Science and Practice of Pharmacy", 21st ed. (Lippincott Williams and Wilkins).
Средняя суточная доза зависит от нескольких факторов, таких как тяжесть заболевания, состояние, возраст, пол и масса пациента. Доза обычно будет варьироваться от 1 до 1500 мг соединений формулы (I) в день, необязательно разделенных на несколько приемов.
Изобретение будет дополнительно проиллюстрировано более подробно в следующем экспериментальном разделе.
Экспериментальный раздел
Способы
Клеточные линии и первичные клеточные культуры. OS-17 получали из ксенотрансплантата OS-17 и приобретали у Istituti Ortopedici Rizzoli, Bologna, Italy. OS-25 и OHS были подарком лаборатории Dr. Fodstad’s lab при Radium Hospital в Осло. Все поддерживались в RPMI (Corning #10-040-CV), дополненной 10% FBS (Atlanta Biologicals #S11150H). Клетки 143B и K7M2 получали из ATCC (ATCC #CRL8303 и #CRL2836) и выращивали в DMEM (Corning #10-013-CV), дополненной 10% FBS. OSCA-8 и OSCA-16 были предоставлены Jamie Modiano и Университетом Миннесоты и выращены в RPMI с 10% FBS. Гладкомышечные клетки легкого (ATCC #PCS-130-10) выращивали в базальной среде васкулярных клеток (ATCC #PCS-100-030), дополненной набором для роста гладкомышечных клеток сосудов (ATCC #PCS-100-042). Клетки HUVEC (Lonza CC-2517) выращивали в эндотелиальной базальной среде (Lonza #CC-5036), дополненной EGM-plus single quote (Lonza #CC-4542). Фибробласты легких человека (ATCC #PCS-201-013) выращивали в EMEM (ATCC #30-2003), дополненной 10% FBS. Клетки HBEC3-KT (ATCC #CRL-4051) выращивали в базальной среде эпителиальных клеток дыхательных путей (ATCC #PCS-300-030), дополненной набором для роста эпителиальных клеток бронхов (ATCC #PCS-300-040). Макрофаги получали из моноцитов, выделенных из цельной крови (полученной с помощью утвержденного IRB протокола для закупки свежей человеческой крови) с использованием магнитного микроносителя CD14 системы отбора (Miltenyi #130-050-201) с последующим 72-часовым культивированием в XVIVO бессывороточной среде (Lonza #04-380Q), дополненной ежедневно 20 нг/мл рекомбинантного человеческого M-CSF (BioLegend #574802). Для экспериментов по совместному культивированию культуры в каждой группе (совместное культивирование и родственные монокультуры) проводили с использованием смеси 1:1 двух соответствующих сред для роста для контроля различий в компонентах среды.
IL-6 и IL-8 ELISA. Бесклеточные супернатанты из 72-часовых культур каждой клеточной линии, выполненные в 24-луночных планшетах, оценивали на концентрации IL-6 и IL-8 с использованием наборов для выявления R&D DuoSet ELISA Development Kits (#DY206 и #DY208), используемых в соответствии с рекомендациями производителя.
Анализы методом зарастания царапины (“заживление ран”). Монослойные культуры линий клеток OS-17 или OHS разрушали с использованием Essen Incucyte WoundMaker (набор Essen Cell Migration Kit #4493). Отдельные лунки затем последовательно визуализировали с использованием Essen Incucyte Zoom. Проводили анализ и количественно определяли ширину раны с использованием модуля для анализа миграции клеток Essen’s Integrated Cell Migration Analysis Module (Essen # 9600-0012).
Анализы трансвелл миграции и инвазии. Клетки 1×104 OS помещали во вставки для трансвелл (или Falcon #353097 для миграции, или Corning #354483 для Matrigel инвазии анализов), содержащие соответствующие хемотаксические факторы. После 24 часов инкубации трансвеллы осушали, а верхние камеры/верхние поверхности мембран соскребали с помощью полиэфирного тампона. Мембраны окрашивали, используя набор красителей Dif-Quik (Siemens #B4132-1A), и сушили, затем визуализировали на инвертирующем микроскопе. Клетки определяли количественно с помощью инструментов для подсчета Adobe Photoshop. Для экспериментов, связанных с хемотаксисом IL-6 и IL-8, среда содержала 1% FBS в обеих камерах, с рекомбинантным белком, добавленным в нижнюю камеру, для получения 50 нг/мл IL6 (BioLegend #570804) или 100 нг/мл IL-8 (BioLegend #574204). Для экспериментов с использованием сыворотки в качестве хемоаттрактанта верхние камеры содержали только RPMI, а нижние камеры содержали 1% или 2,5% сыворотки. Там, где было отмечено, в верхнюю и нижнюю камеры добавляли 20 мкг/мл нейтрализующих антител либо к IL6 (Abcam #AB6672), либо к IL-8 (Abcam #AB18672), или к обоим. В экспериментах по тестированию способности малых молекул блокировать индуцированную сывороткой миграцию/инвазию в среду добавляли 1 мкМ sc144 (Sigma #SML0763) и/или 100 нМ DF2156A (Dompe Pharmaceuticals, Милан, Италия).
Пролиферация клеток OS. Клетки, высеянные при 20% конфлюэнтности, культивировали в среде для роста, как указано выше, содержащей ингибиторы, как указано на каждой фигуре. Пролиферацию последовательно количественно определяли с использованием Insency Zoom от Essen Biosciences в течение периода времени, отмеченного на каждой фигуре.
Формирование колонии. 1×104 Клеток OS высевали в 1,5 мл 0,5% мягкого агара (Lonza SeaPlaque GTG Agarose, #50111 в порошкообразной RPMI #430-1800 от Gibco) на 1,5 мл слоя 1% мягкого агара в 6-луночные планшеты, затем покрывали 500 мл RPMI. Если отмечено, лекарственное средство добавляли к слою RPMI в количестве, достаточном для получения указанной концентрации при диффузии как в среде, так и в агаре.
Исследования выживания в модели ксенотрансплантата. Мышам CB17-SCID возрастом 6-8 недель (Envigo C.B-17/IcrHsd-Prkdcscid), инокулированным через хвостовую вену 1×106 клеток OS-17 (день 0), ежедневно вводили sc144 (10 мг/кг SC (подкожно) один раз в день, Sigma #SML0763), DF2156A (30 мг/кг IP (интраперитонеально) один раз в день) или оба, начиная через 24 часа после инокуляции. sc144 получали растворением при нагревании в DMSO с получением раствора 40 мг/кг, который немедленно разбавляли до 2 мг/кг с использованием 40% пропиленгликоля/1% Tween-20 в воде. В среднем 20 г мыши получали 100 мкл на дозу. Дозы sc144 получали свежими каждый день. DF2156A получали растворением в PBS для создания раствора 6 мг/мл для аналогичных доз 100 мкл у 20 г мыши. Лечение продолжали 42 дня, затем прекращали. Мышей контролировали с помощью двухкратного еженедельного взвешивания и улучшения оценки физического состояния (eBCS (28)). Мышей с >10% потерей массы или eBCS <8 подвергали эвтаназии и собирали ткани, легкие инсуффлировали, фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, затем погружали и обрабатывали, как описано выше. Мышей, не демонстрирующих бремя метастазирования (предположительно умирающих от других причин), подвергают цензуре в анализе выживаемости. Это включает 2 мышей, получающих комбинированную терапию, одну, получающую sc144, и одну контрольную мышь.
Временная точка исследований лечения. Мышам CB17-SCID 6-8 недель инокулировали 1×106 клеток 143B, OSCA-8, OSCA-16 или K7M2 (для клеток K7M2 использовали иммунокомпетентных мышей Balb/c). Через 24 часа после инокуляции начинали лечение мышей ежедневно с sc144 и/или DF2156A, которое продолжалось в течение 42 дней, как описано выше. Затем за мышами наблюдали, как описано выше, пока одна мышь из любой данной группы клеточных линий не достигла конечной точки. Если легкие, взятые у этой сторожевой мыши, имели признаки метастатического заболевания, всех мышей из этой группы подвергали эвтаназии, легкие собирали, инсуффлировали, фиксировали, погружали и окрашивали. Центральный участок левой доли, окрашенный H&E, исследовали с помощью микроскопии для подсчета метастатических поражений квалифицированным экспертом, работающим с обезличенными данными.
Статистический анализ. Данные были графически обработаны и проанализированы с помощью Graphpad Prism 7. Используемые конкретные статистические критерии и проведенные сравнения указаны в подписи к каждой фигуре. Там, где это необходимо, корректировку для множественных сравнений проводили с использованием метода Бенджамини-Хохберга для контроля уровня ложноположительных результатов 0,05.
Пример 1
Продукция IL-6 и IL-8 коррелирует с метастатическим потенциалом в мышиных моделях c ксенотрансплантатом колонизации легких .
Авторы настоящего изобретения протестировали панель клеточных линий остеосаркомы на их способность колонизировать легкое мыши. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что клетки OS-17 при введении в кровообращение через хвостовую вену создают метастатические локусы с очень высокой эффективностью, в то время как клеточные линии OHS демонстрируют значительно более низкую метастатическую эффективность (фиг.1). Этот эффект оставался неизменным в течение нескольких пассажей клеток и нескольких анализов. Авторы настоящего изобретения проверили эти клеточные линии на продуцирование IL-6 и IL-8, подвергая бесклеточные супернатанты анализу ELISA (фиг. 1d), который выявил сильную корреляцию между продукцией опухолевых клеток обоих этих цитокинов и способностью клеточной линии колонизировать мышиное легкое.
IL-6 и IL-8 стимулируют хемокинез и направленную миграцию в клетках OS, независимо от метастатического потенциала
Чтобы продемонстрировать, поддерживают ли эти высоко- и плохо-метастатические клеточные линии функции, которые отвечают на эти цитокины, авторы изобретения провели как анализ методом зарастания царапины (анализы ранозаживления), так и анализ трансвелл миграции, для оценки ответа. Стандартизированные раны, созданные в монослоях клеток OS-17 и OHS, более эффективно закрывались при культивировании в средах, дополненных IL-6 и/или IL-8, демонстрируя, что любой цитокин может стимулировать хемокинез (повышенную подвижность клеток) в любой клеточной линии, независимо от какой-либо основной продукции этого цитокина. Эти клетки демонстрируют аналогичные результаты в анализах, тестирующих направленную миграцию. Клетки OS-17 и OHS, выращенные в верхней камере системы трансвелл, демонстрируют сильную направленную миграцию в ответ на хемотаксические градиенты либо IL-6, либо IL-8.
Эффект DF2156A отдельно или в комбинации с sc144 для предотвращения направленной миграции и инвазии клеток OS
Для определения важности этих цитокинов для миграции клеток OS в гораздо более широкой среде возможных хемотаксических факторов, авторы настоящего изобретения исследовали эффект, который может иметь блокада IL-6 и/или IL-8 при использовании сыворотки в качестве хемоаттрактанта. Обе клеточные линии продемонстрировали очень сильную как трансвелл-миграцию, так и инвазию через матригельный барьер в ответ на хемотаксический градиент сыворотки (фиг. 1e-f). Некоторое снижение хемотаксического ответа было очевидным, когда к культуральной среде добавляли IL-6 или IL-8 блокирующие антитела, хотя гораздо более глубокий эффект наблюдался при объединении антител. Более глубокий эффект наблюдали в аналогичных экспериментах с использованием низкомолекулярных ингибиторов рецепторов для IL-6 и IL-8 (sc144, который стимулирует деградацию gp130 по новому механизму и DF2156A, аллостерический ингибитор CXCR1 и CXCR2). При ингибировании на уровне рецепторов блокада любого пути достаточна для предотвращения направленной миграции и инвазии (фиг. 2), что свидетельствует о том, что необходим некоторый уровень активации этих путей, вероятно, не-IL-6 и не-IL-8 цитокинами, чтобы клетки OS, продуцировали эти типы поведения. Оба ингибитора значительно снизили количество миграции клеток OS.
Пример 2
Эффект DF2156A отдельно или в комбинации с sc144 на профилактику метастазирования в легкие
Для оценки функциональной важности путей IL-6 и IL-8 для метастазирования в легкие OS авторы настоящего изобретения использовали ксенотрансплантатные модели. Мышам Balb-SCID, инокулированным через хвостовую вену 1×106 меченными люциферазой клетками OS-17, вводили sc144 (ингибитор gp130), DF2156A (ингибитор CXCR1/2) или оба. Мыши продолжали получать лечение в течение 42 дней, после чего лечение прекращали. Прижизненная визуализация для оценки опухолевой нагрузки in vivo осуществляли через 14 и 24 дня с использованием стандартных биолюминесцентных методов. Биолюминесцентная визуализация позволила предположить значительное снижение опухолевой нагрузки в легких у мышей, получавших комбинированную терапию, по сравнению с теми, кто не получал лечения или терапию одним средством (фиг. 3А). Важно отметить, что визуализация показала не миграцию опухолевых клеток в другие органы, а общую потерю биолюминесценции, что указывает на снижение общей выживаемости циркулирующих опухолевых клеток. Двух мышей из каждой группы лечения одним средством умерщвляли через 24 часа после 14-й дозы лекарственного средства для оценки фармакодинамики (PD) ингибирования мишени. Легкие от этих мышей, окрашенных IHC для pFAK (DF2156A) или pSTAT3 (gp130), демонстрировали устойчивое ингибирование мишени (то есть устойчивую лекарственную активность) при минимальном дозировании (фиг.4).
После лечения мышей затем наблюдали до проявления признаков клинического ухудшения: потеря массы >10% или улучшение оценки физического состояния (eBCS) <8, определенные конечные критерии оценки исследования. В конечной точке мышей умерщвляли с использованием утвержденных методов, а легкие собирали, инсуффлировали, фиксировали, заливали, разрезали и окрашивали. Анализ выживаемости (фиг. 3В) показал, что почти у всех мышей, не получавших ни лекарства, ни терапию одним средством, развился летальный метастаз в легких через 60 дней. В частности, у мышей, не получавших лекарственное средство, развивались летальные метастазы в легких раньше, чем у мышей, получавших одно средство. В то время как большинство мышей, получавших комбинированную терапию (ингибитор gp130+ингибитор CXCR1/2), оставались здоровыми в течение >100 дней. Мыши, у которых не было явных метастазов в легких на срезах легких, были подвергнуты цензуре на основании анализа выживаемости (n=2).
Пример 3
Эффект комбинации DF2156A с sc144 в профилактике метастазирования в легкие у нескольких моделей OS
Чтобы гарантировать, что результаты, полученные в этих исследованиях, были широко применимы и не были уникальными для иммунодефицитных ксенотрансплантатов или клеток OS-17, авторы настоящего изобретения повторили эксперименты, связанные с лечением, используя ряд различных моделей. Они включали сингенную, иммунокомпетентную модель с использованием клеточной линии, полученной из самостоятельно возникающей OS у мыши Balb/c (K7M2), ксенотрансплантатные модели собачьей OS (OSCA-8 и OSCA-16) и дополнительные ксенотрансплантатные модели человеческой OS (143B). Мышей, инокулированных опухолевыми клетками, обрабатывали либо без лекарственного средства, либо комбинированными sc144 и DF2156A в течение 42 дней. В то время, когда по меньшей мере одна мышь из любой группы (любой клеточной линии) достигала конечной точки с подтвержденным метастазированием в легкие, все мыши из этой группы подвергали эвтаназии, легкие собирали и количественно определяли метастатические поражения. Способность двойного ингибирования gp130-CXCR1/2 предотвращать развитие метастатических поражений легких оставалась неизменной в разных моделях (фиг. 5).
1. Применение ингибитора IL-8 для профилактики и/или лечения метастазов в легких, связанных с остеосаркомой, где ингибитор IL-8 представляет собой R(-)-2-[(4-трифторметансульфонилокси)фенил]-N-метансульфонил пропионамид или его фармацевтически приемлемую соль.
2. Применение по п.1, где указанное соединение представляет собой натриевую соль R(-)-2-[(4-трифторметансульфонилокси)фенил]-N-метансульфонил пропионамида.
3. Фармацевтическая композиция для применения в профилактике и/или лечении метастазов в легких, связанных с остеосаркомой, содержащая ингибитор IL-8, определенный в п.1, и фармацевтически приемлемые эксципиенты и/или разбавители.
4. Фармацевтическая композиция по п.3, дополнительно содержащая ингибитор IL-6, представляющий собой 2-(7-фторпирроло[1,2-а]хиноксалин-4-ил)2-пиразинкарбоновой кислоты гидразид.
5. Продукт для профилактики и/или лечения метастазов в легких, связанных с остеосаркомой, включающий:
А) ингибитор IL-8, определенный в п.1, или фармацевтическую композицию по п.3, и
B) ингибитор IL-6, определенный в п.4,
А) и В) представляют собой две отдельные композиции для одновременного, раздельного или последовательного применения.
6. Набор для профилактики и/или лечения метастазов в легких, связанных с остеосаркомой, включающий:
А) ингибитор IL-8, определенный в п.1, или фармацевтическую композицию по п.3, и
B) ингибитор IL-6, определенный в п.4,
А) и В) представляют собой две отдельные композиции для одновременного, раздельного или последовательного применения.
