Водная композиция для обнаружения просачивания физиологических жидкостей

Группа решений относится к медицине, а именно к водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока и способу определения места просачивания с использованием предложенной композиции. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока содержит от 5 до 25% мас. гелеобразующего агента, увеличивающего вязкость композиции, причем указанный гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого крахмала или поперечно-сшитого декстрана, где степень поперечного сшивания, выраженная как массовое отношение сшиватель:крахмал или как отношение сшиватель:декстран, составляет от 12 до 20% мас., и буферные вещества, при этом концентрация буфера составляет от 0,1 до 30 мМ, и, таким образом, указанная композиция является забуференной, при этом указанная композиция дополнительно содержит от 0,001 до 0,5% мас. рН-индикатора, при этом рН композиции по меньшей мере на 0,1 единицы рН ниже или выше, чем pKa рН-индикатора, при этом рН композиции составляет от 4 до 6 и pKa рН-индикатора составляет от 6 до 8. Способ обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе включает нанесение водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока на поджелудочную железу во время операции на поджелудочной железе и обнаружение и локализацию возможного просачивания панкреатического сока на поверхности ткани поджелудочной железы по изменению цвета водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока. Вышеописанная группа позволяет создать водную композицию для обнаружения просачивания панкреатического сока, которая позволяет быстро и точно определить конкретное место локализации просачивания. 2 н. и 19 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 25 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к композиции для обнаружения просачивания физиологических жидкостей и к ее применению для обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе, например, с частичной резекцией поджелудочной железы.

Уровень техники

Рак поджелудочной железы является четвертой основной причиной смертности от рака в мире, причем резекция поджелудочной железы является единственно возможным способом лечения. Ежегодно во всем мире проводят десятки тысяч подобных операций. Частым тяжелым и дорогостоящим осложнением является послеоперационный свищ поджелудочной железы, вызванный просачиванием панкреатического сока, что является наиболее важной нерешенной проблемой операций на поджелудочной железе. Просачивание панкреатического сока создает не только риск бактериальных инфекций, но и растворение соседних органов, таких как кишечник или кровеносные сосуды, вследствие самопереваривающего действия панкреатического сока, что может вызывать тяжелое кровотечение и даже смерть.

Таким образом, просачивание панкреатического сока является самой важной патологической проблемой при резекции поджелудочной железы. Несмотря на то, что исследованы различные технологии панкреатэктомии для иссечения поджелудочной железы и ушивания, а также технологии послеоперационного ведения пациента, просачивание панкреатического сока все еще встречается с частотой от 30% до 50%. Поскольку каждый случай послеоперационного свища поджелудочной железы потенциально угрожает жизни, крайне необходимо раннее обнаружение. Трудность с просачиванием панкреатического сока заключается в том, что просачивание макроскопически незаметно, и в настоящее время хирурги не могут видеть, наличие и место просачивания из остатка поджелудочной железы во время операций на поджелудочной железе. Поэтому современные интраоперационные подходы к предотвращению или устранению просачивания панкреатического сока являются неточными, поскольку в клинической практике не существует надежных и осуществимых способов, позволяющих визуализировать просачивание панкреатического сока.

Во время частичной панкреатэктомии трудно полностью предотвратить просачивание панкреатического сока, поскольку отверстия в протоковой системе поджелудочной железы на поверхности среза ткани поджелудочной железы малы и едва заметны, поэтому трудно проводить направленное ушивание. Кроме того, ткань поджелудочной железы является очень мягкой, поэтому хирургическое ушивание следует выполнять очень осторожно во избежание разрывов.

В настоящее время в качестве косвенного способа обнаружения просачивания панкреатического сока после частичной резекции поджелудочной железы используют измерение концентрации амилазы, которая является гликолитическим ферментом, во внутрибрюшинной отделяемой жидкости. Однако такая технология несовершенна, поскольку является косвенной и не обеспечивает возможность непосредственного обнаружения и локализации просачивания панкреатического сока во время операции на поджелудочной железе. Таким образом, необходимо обеспечить технологию, которая может визуализировать и локализовать просачивание бесцветного и прозрачного панкреатического сока уже во время операции.

В EP 2857830 и в родственной публикации Mori et al в Gastroenterology (cf. 2015; 149: с. 1334-1336) описан флуоресцентный зонд, который, согласно утверждению, может обеспечивать быстрое обнаружение и визуализацию наличия просачивания панкреатического сока во время или после операции. Несмотря на заявленную способность обеспечивать быстрое обнаружение и визуализацию с высокой степенью чувствительности, недостатком указанного зонда является необходимость освещения УФ светом и использования светоизолирующих очков для визуализации просачивания. Кроме того, химические реакции, которые, в конечном итоге, обеспечивают визуализацию просачивания, занимают несколько минут до визуализации просачивания, тем самым заметно нарушая «ход выполнения хирургической операции». Кроме того, как известно, флуоресцентные зонды обычно имеют потенциально токсичные побочные эффекты, а УФ излучение может приводить к повреждению ДНК. Таким образом, предложенный подход к визуализации является весьма сложным, неэффективным и небезопасным для реализации в клиниках. Кроме того, недостатком используемой лекарственной формы является некоторая неточность, т.е. может быть трудно локализовать точное место просачивания.

В CN 105334209 и CN 105203541 описан проявитель панкреатического сока. Проявитель панкреатического сока содержит кислотно-основное соединение-индикатор, например, тимоловый синий и бромтимоловый синий. Проявитель панкреатического сока предложен в разных лекарственных формах, выбранных из группы, состоящей из лосьона, спрея, индикаторной бумаги, индикаторной марли, ваты и ватной палочки. Как и флуоресцентный зонд из EP 2857830, недостатком предложенных проявителей панкреатического сока является неточность, т.е. может быть трудно установить точное место просачивания, а также необходимость удаления лекарственной формы после ее использования.

С учетом трудности при осуществлении целенаправленного лечения ткани поджелудочной железы, крайне необходима быстрая и точная локализация конкретного места просачивания. Кроме того, необходимо обеспечить разлагаемые средства визуализации, которые обеспечивают возможность повторного нанесения для перепроверки достаточного ушивания, и которые не требуют удаления по окончании операции. Кроме того, также необходимо обеспечить средства визуализации для обнаружения просачивания панкреатического сока при лапароскопических операциях.

Сущность изобретения

Таким образом, настоящее изобретение направлено на устранение, облегчение, исключение или преодоление одной или более из вышеуказанных недоработок, существующих в данной области техники, и недостатков, по отдельности или в любой комбинации посредством обеспечения, в соответствии с первым аспектом изобретения, водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости, содержащей гелеобразующий агент, агентов для повышения вязкости указанной композиции и буферных агентов, таким образом, предложенная композиция является забуференной. Гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого α-глюкана. Предложенная композиция дополнительно содержит рН-индикатор. рН композиции по меньшей мере на 0,1 единицы рН ниже или выше, чем pKa рН-индикатора.

В соответствии с одним вариантом реализации, гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого крахмала. Таким образом, композиция может содержать от 5до 25% мас. микросфер поперечно-сшитого крахмала, предпочтительно от 10 до 20% мас. микросфер поперечно-сшитого крахмала, более предпочтительно от 13 до 17% мас. микросфер поперечно-сшитого крахмала. Степень поперечного сшивания, выраженная как массовое отношение сшиватель:крахмал, может составлять от 12 до 20% мас., например, от 13,5 до 18,5% мас. или от 15,0 до 17,0% мас. В соответствии с альтернативным вариантом реализации, гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого декстрана.

pKa рН-индикатора может составлять от 5 до 9; предпочтительно от 6 до 8; более предпочтительно от 6,5 до 7,5. Таким образом, рН-индикатор может представлять собой бромтимоловый синий, и композиция может содержать от 0,001 до 0,5% мас., например, от 0,005 до 0,25% мас. или от 0,01 до 0,1% мас. бромтимолового синего. Кроме того, рН композиции может составлять от 4 до 7; предпочтительно от 5 до 6. Буферные вещества, присутствующие в композиции для обеспечения забуференной композиции, могут присутствовать в количестве от 0,1 до 30 мМ, предпочтительно от 0,5 до 10 мМ, более предпочтительно от 1,0 до 5 мМ.

В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения, водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости представляет собой водную композицию для обнаружения просачивания панкреатического сока. рН такой водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока составляет от 4 до 6, а pKa рН-индикатора составляет от 6 до 8; предпочтительно от 6,5 до 7,5.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена такая водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока для применения для обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе, например, с частичной резекцией поджелудочной железы.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе. Предложенный способ включает:

- нанесение водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока; и

- обнаружение и локализацию возможного просачивания панкреатического сока на поверхности ткани поджелудочной железы по изменению цвета водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока.

Дополнительные преимущественные признаки настоящего изобретения определены в зависимых пунктах формулы изобретения. Кроме того, преимущественные признаки настоящего изобретения проработаны в вариантах реализации, описанных в данном документе.

Подробное описание изобретения

Для обеспечения средства обнаружения просачивания панкреатического сока с целью удовлетворения потребностей в данной области техники рассмотрены различные концепции. Было обнаружено, что недостатком порошкообразных средств, например, пропитанных индикатором микросфер поперечно-сшитого крахмала, является неудобство при работе и применении. Кроме того, нанесенный порошок легко смывается панкреатическим соком, что обусловливает неточность обнаружения, если вообще существует возможность обнаружения. Кроме того, ни одна попытка преодоления недостатков сухих порошков посредством нанесения их на ленту или замены их на бумажные салфетки или марлю, пропитанную индикатором, не была успешной и не обеспечила возможность точного обнаружения.

Затем для преодоления указанных недостатков и обеспечения средств обнаружения просачивания панкреатического сока, с целью удовлетворения потребностей в данной области техники, были рассмотрены жидкие, а не сухие, твердые или иммобилизованные средства обнаружения просачивания панкреатического сока. Таким образом, была предложена водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости, содержащая индикатор просачивания.

Установлено, что использование рН-индикатора в качестве индикатора просачивания обеспечивает быструю реакцию на изменение рН, обусловленное просачиванием панкреатического сока, при условии, что рН композиции отличается от pKa рН-индикатора, и такое изменение рН приводит к изменению цвета рН-индикатора. рН панкреатического сока выше (примерно 8,3-8,5), чем рН нормальной интерстициальной жидкости (рН примерно 7,4). Используя подходящий рН-индикатор, например, бромтимоловый синий, можно обнаружить просачивание панкреатического сока. Кроме того, рН композиции не только должен отличаться от pKa рН-индикатора. Также наблюдали, что композиция должна содержать буферные вещества для обеспечения забуференной композиции. Буфер обеспечивает возможность усиления контраста между положительным и отрицательным обнаружением.

Кроме того, для обеспечения водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости с повышенной точностью, необходимо увеличить вязкость водной композиции. Например, нанесение рН-индикатора, растворенного в воде, например, посредством разбрызгивания, не обеспечивает точное обнаружение. Однако было обнаружено, что добавление гелеобразующего агента, повышающего вязкость требуемым образом, обеспечивает получение четкой границы между положительным и отрицательным обнаружением. Увеличение вязкости композиции снижает диффузию в композиции, представленной в форме геля или полутвердой массы. Снижение диффузии в композиции означает, что изменение рН вследствие просачивания панкреатического сока, которое вызывает изменение цвета композиции (в диапазоне рН от 6,0 до 7,6 бромтимоловый синий меняет цвет с желтого на синий), становится более локализованным и, следовательно, повышается точность. Таким образом, точность обнаружения просачивания физиологической жидкости с помощью предложенной композиции может быть улучшена посредством добавления гелеобразующего агента, повышающего вязкость композиции.

Так, в соответствии с одним вариантом реализации, предложена водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости, содержащая гелеобразующий агент в форме микросфер поперечно-сшитого α-глюкана. Предложенная композиция дополнительно содержит рН-индикатор. Для обеспечения видимого изменения цвета в ответ на изменение рН, рН композиции по меньшей мере на 0,1 единицы рН ниже или выше, чем pKa рН-индикатора.

Например, для бромтимолового синего, имеющего pKa 7,0, рН композиции должен составлять 6,9 или менее, или 7,1 или более. Для обеспечения более заметного изменения цвета, рН композиции может быть по меньшей мере на 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 единицы рН ниже или выше, чем pKa рН-индикатора. В соответствии с одним вариантом реализации, рН композиции по меньшей мере на 1,0 единицы рН ниже или выше, чем pKa рН-индикатора.

Для обнаружения просачивания панкреатического сока, рН композиции предпочтительно ниже, чем pKa рН-индикатора, поскольку рН интерстициальной жидкости ниже, чем рН панкреатического сока. Так, рН композиции может быть по меньшей мере на 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 единицы рН ниже, чем pKa рН-индикатора. В соответствии с одним вариантом реализации, рН композиции по меньшей мере на 1,0 единицы рН ниже, чем pKa рН-индикатора.

Кроме того, обнаружено, что композиция должна содержать буферные вещества, т.е. композиция должна быть забуферена. Таким образом, в соответствии с одним вариантом реализации, композиция является забуференной. Буферные вещества могут присутствовать в общем количестве от 0,1 до 30 мМ, например, от 0,5 до 10 мМ или от 1,0 до 5 мМ. Слишком высокая концентрация буферных веществ может приводить к отсутствию изменения цвета или к задержке изменения цвета. Недостатком задержки изменения цвета является не только более позднее обнаружение, но и снижение точности. Кроме того, слишком низкая концентрация буферных веществ может приводить к неточному обнаружению просачивания и возможно даже к ложноположительному результату.

Введение буферных соединений в композицию обеспечивает более надежное обнаружения просачивания физиологических жидкостей с помощью предложенной водной композиции. Кроме того, интерстициальная жидкость и панкреатический сок отличаются не только по рН, но и по буферной силе. Если интерстициальная жидкость существенно не меняет рН забуференной композиции, то панкреатический сок, имеющий более высокую буферную силу вследствие высоких концентраций бикарбоната в панкреатическом соке, может увеличивать рН и забуференной водной композиции для обнаружения просачивания физиологических жидкостей и тем самым вызывать изменение цвета водной композиции для обнаружения просачивания физиологических жидкостей. Панкреатический сок содержит высокие концентрации бикарбоната для нейтрализации кислотного желудочного сока. Таким образом, забуферивание водной композиции для обнаружения просачивания физиологических жидкостей может быть преимущественным для дополнительного повышения точности композиции.

Как понятно специалистам в данной области техники, для получения забуференной композиции можно использовать различные буферные системы. Как описано выше, забуференная композиция может иметь рН от 4 до 7, например, от 5 до 7, от 5 до 6 или от 6 до 7. Таким образом, композиция может содержать фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). В соответствии с одним вариантом реализации, композиция содержит фосфатный и/или цитратный буфер. Композиция может содержать от 0,1 до 30 мМ фосфата, например, от 0,5 до 10 мМ или от 1,0 до 5 мМ фосфата. В данном контексте концентрация фосфата относится к общей концентрации различных фосфатных частиц (например, HPO₄^2- и H₂PO₄^-).

Кроме того, буферные вещества могут быть на основе соединения, выбранного из группы, состоящей из фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, молочной кислоты, PIPES (пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты)), MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты) или смеси одного или нескольких указанных соединений. Однако предпочтительно, буферные вещества основаны на эндогенном соединении(ях), например, на фосфорной кислоте, лимонной кислоте, уксусной кислоте и/или молочной кислоте.

В зависимости от рН-индикатора, предложенную композицию можно использовать для обнаружения различных видов физиологических жидкостей, например, желчи, которая подобно панкреатическому соку является слабощелочной, или желудочного сока, который является кислотным. Желчь секретируется желчным пузырем. Таким образом, предложенную водную композицию для обнаружения просачивания физиологических жидкостей можно использовать для обнаружения просачивания желчи, например, после травмы или в комплексе с операцией на желчном пузыре. Не ограничиваясь приведенными значениями, pKa рН-индикатора может составлять от 5 до 9; предпочтительно от 6 до 8; более предпочтительно от 6,5 до 7,5. Установлено, что для обнаружения просачивания панкреатического сока подходит pKa в диапазоне от 6 до 8, предпочтительно в диапазоне от 6,5 до 7,5. Указанный диапазон также является предпочтительным для обнаружения просачивания желчи. В соответствии с одним вариантом реализации, рН-индикатор представляет собой бромтимоловый синий. Бромтимоловый синий имеет не только подходящее значение pKa, но и демонстрирует резкий цветовой контраст между низким (желтый) и высоким (темно-синий) рН. Кроме того, резким является также контраст между цветом индикатора (темно-синий) и тканью и кровью. Кроме того, рН-индикатор может представлять собой феноловый красный (3-амино-7-диметиламино-2метилфеназина гидрохлорид) или нейтральный красный (также известный как фенолсульфонфталеин или 3,3-бис(п-гидроксифенил)-2,1-3H-бензоксатиол-1,1-диоксид).

Для обнаружения просачивания желудочного сока pKa рН-индикатора может составлять от 4 до 6. Как понятно специалистам в данной области техники, известно множество рН-индикаторов, имеющих pKa в указанном диапазоне, и, следовательно, соответствующее изменение цвета. Например, можно упомянуть рН-индикаторы бромкрезоловый зеленый (2,6-дибром-4-[7-(3,5-дибром-4-гидрокси-2-метилфенил)-9,9-диоксо-8-окса-9λ6-тиабицикло[4.3.0]нона-1,3,5-триен-7-ил]-3-метилфенол), метиловый красный (2-{[4-(диметиламино)фенил]диазенил}бензойная кислота) и метиловый пурпурный (регистрационный номер CAS: 1340-02-9).

Как уже упомянуто, рН композиции должен отличаться от pKa рН-индикатора. рН предложенной композиции может составлять от 4 до 7, предпочтительно от 5 до 6. Обнаружено, что слабокислотное значение рН является преимущественным для обнаружения просачивания панкреатического сока.

Как уже было описано, предложенная водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости содержит гелеобразующий агент в форме микрочастиц поперечно-сшитого α-глюкана для повышения вязкости композиции. Композиция с повышенной вязкостью имеет более высокую точность, т.е. изменение цвета происходит только вблизи просачивания при нанесении, например, на остаточную ткань поджелудочной железы после панкреатэктомии. Следует отметить, что несмотря на то, что увеличение вязкости повышает точность, оно также может замедлять изменение цвета. Несмотря на то, что более вязкая композиция может обеспечивать более точную локализацию просачивания, недостатком слишком вязкой композиции может быть медленное изменение цвета в ответ на просачивание. Кроме того, слишком жидкую или слишком вязкую композицию труднее наносить.

Предпочтительно, композиция заметно разжижается при сдвиге и/или является (псевдо)пластичной бингамовой жидкостью. Композиция, которая разжижается при сдвиге и/или является (псевдо)пластичной бингамовой жидкостью, остается на месте после ее нанесения и не растекается. Кроме того, такую композицию можно без труда наносить, например, с помощью шприца, учитывая ее свойства разжижения при сдвиге (т.н. «эффект кетчупа»).

В соответствии с одним вариантом реализации, водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости содержит от 5 до 25% мас., например, от 10 до 20% мас., от 13 до 17% мас. или от 14 до 16% мас. гелеобразующего агента. Как описано ниже, микросферы поперечно-сшитого крахмала являются предпочтительным гелеобразующим агентом.

На вязкость композиции влияет не только концентрация гелеобразующего агента, но и концентрация соли, т.е. ионная сила. Увеличение силы раствора оказывает эффект снижения вязкости. Концентрация выше 1 М существенно влияет на вязкость. Такое снижение вызвано образованием ионных пар между заряженными ионами и макромолекулами в матрице. Введение ионов приводит при более низких концентрациях к снижению притягивающего взаимодействия между макромолекулами (биополимерами) вследствие эффекта поглощения соли.

В соответствии с одним вариантом реализации, ионная сила водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости составляет от 50 до 500 мМ, например, от 100 до 250 мМ или от 125 до 175 мМ. Ионная сила в диапазоне от 100 до 250 мМ, например, от 125 до 175 мМ, может быть особенно предпочтительна, если гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого крахмала.

Обнаружено, что гелеобразующий агент предпочтительно представляет собой микросферы поперечно-сшитого полисахарида, такие как микросферы поперечно-сшитого полимера α-D-глюкозы (т.е. α-глюкана), например, микросферы поперечно-сшитого крахмала или микросферы поперечно-сшитого декстрана. Микросферы поперечно-сшитого полисахарида, например, микросферы поперечно-сшитого крахмала, обеспечивают получение композиции, разжижающейся при сдвиге и/или представляющей собой (псевдо)пластичную бингамовую жидкость. Как описано выше, композиция, которая разжижается при сдвиге и/или является (псевдо)пластичной бингамовой жидкостью, остается на месте после ее нанесения и не растекается. Кроме того, такую композицию можно без труда наносить, например, с помощью шприца, учитывая ее свойства разжижения при сдвиге (т.н. «эффект кетчупа»).

Кроме того, было обнаружено, что при использовании в качестве гелеобразующего агента микросфер поперечно-сшитого полисахарида, например, микросфер поперечно-сшитого крахмала проще определить состав водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости с получением вязкости, подходящей для обнаружения просачивания физиологической жидкости. Набухшие микросферы усиливают внутреннее трение водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости. В результате консистенция водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости является такой, что с ней гораздо проще работать и ее легче наносить. Кроме того, это также ускоряет действие индикатора в том смысле, что цветовая индикация становится более точной по местоположению.

Кроме того, микросферы крахмала и поперечно-сшитого крахмала являются биоразлагаемыми. Это означает, что водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости, содержащая в качестве гелеобразующего агента микросферы крахмала или поперечно-сшитого крахмала, или подобный гелеобразующий агент, не требует удаления, а разлагается in situ. Однако поперечное сшивание подразумевает, что микросферы поперечно-сшитого крахмала разлагаются медленнее, чем нативный крахмал. С учетом высокой концентрации амилазы в панкреатическом соке, разложение гелеобразующего агента может быть слишком быстрым, если гелеобразующий агент представляет собой крахмал, не подверженный поперечному сшиванию.

В качестве альтернативы микросферам поперечно-сшитого крахмала, в качестве гелеобразующего агента можно использовать микросферы поперечно-сшитого декстрана. Декстран отличается от крахмала, главным образом, разветвленностью вследствие α-1,3-связей. Поскольку декстран имеет сильно разветвленную структуру и другое распределение гликозидных связей, он не может расщепляться под действием α-амилазы или лишь частично расщепляется α-амилазой. Таким образом, большая часть декстрана, введенного в организм человека парентерально, выводится через почки, а не расщепляется α-амилазой до глюкозы. Однако некоторые клетки в организме человека могут расщеплять декстран до глюкозы.

В соответствии с альтернативным вариантом реализации, гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого декстрана. С учетом устойчивости к расщеплению под действием α-амилазы, микросферы поперечно-сшитого декстрана могут обеспечивать более стойкое обнаружение просачивания, чем микросферы поперечно-сшитого крахмала. Поскольку декстран уже используют в клинических условиях, например, для внутривенных растворов в качестве объемообразующего агента и в качестве средства для парентерального питания, то ограниченное расщепление под действием α-амилазы не считается неприемлемым для предложенного применения в качестве гелеобразующего агента в предложенной водной композиции для обнаружения просачивания физиологических жидкостей. Для некоторых применений использование микросфер поперечно-сшитого декстрана в качестве гелеобразующего агента может быть даже предпочтительным.

В соответствии с одним вариантом реализации, гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого крахмала. Микросферы поперечно-сшитого крахмала состоят из крахмала растительного происхождения (например, картофеля), поперечно-сшитого для получения микросфер. Как известно специалистам в данной области техники, крахмал представляет собой природный полимер, построенный из смеси двух полимерных цепей, разветвленный полимер глюкозы (цепи α-4-глюкозы с α6-разветвлениями). Он является природным веществом, встречающимся в растениях и у животных, где он служит для запасания энергии. Указанный полимер состоит из амилозы (с длинной цепью и низкой степенью разветвленности) и амилопектина (с высокой степенью разветвленности и короткой цепью). Соотношение между указанными двумя полимерами варьируется в зависимости от источника. Как известно в данной области техники, разлагаемые микросферы поперечно-сшитого крахмала (DSM) получают в процессе эмульгирования, в котором происходит поперечное сшивание полимерных цепей в сферическую форму. Микрочастицы крахмала или модифицированного крахмала описаны в известном уровне техники (например, D.R. Lu et al “Starch-based completely biodegradable polymer materials” eXPRESS polymer Letters, том. 3, № 6 (2009), с. 366-375; P.B. Malafaya et al. ”Starch-based microspheres produced by emulsion crosslinking with a potential media dependent responsive behavior to be used as drug delivery carriers” J. Mater. Sci: Mater Med (2006), 17:371-377). В данной области техники микросферы поперечно-сшитого крахмала известны как образующие часть разлагаемых систем для доставки лекарственных соединений. Крахмал в микросферах поперечно-сшитого крахмала может представлять собой гидролизованный крахмал. Степень гидролиза можно использовать для регулирования свойств готовых микросфер поперечно-сшитого крахмала.

При поперечном сшивании крахмала с целью получения микросфер поперечно-сшитого крахмала используют сшивающий агент, например, эпихлоргидрин. В соответствии с одним вариантом реализации, гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого крахмала, сшитого с помощью эпихлоргидрина.

Микросферы поперечно-сшитого декстрана могут быть получены соответствующим образом.

Поскольку уровни амилазы в панкреатическом соке существенно выше, чем нормальные концентрации в организме, то время разложения микросфер на основе крахмала, соответственно, также сокращено.

Степень поперечного сшивания влияет на устойчивость к расщеплению амилазой. Более высокая степень поперечного сшивания обеспечивает более высокую устойчивость к расщеплению. Степень поперечного сшивания предпочтительно является такой, что микросферы поперечно-сшитого крахмала остаются интактными в течение по меньшей мере 5 минут после воздействия обнаруживаемой физиологической жидкости для обеспечения возможности обнаружения просачивания с достаточной точностью. Однако слишком высокая степень поперечного сшивания может негативно влиять на свойства композиции, например, вязкость и время обнаружения.

В соответствии с одним вариантом реализации, степень поперечного сшивания, выраженная как массовое отношение сшиватель : крахмал, должна составлять от 12 до 20% мас., например, от 13,5 до 18,5% мас. или от 15,0 до 17,0% мас. Считается, что для обнаружения панкреатического сока предпочтительной является степень поперечного сшивания примерно 25% мас. Такие же диапазоны относятся к микросферам поперечно-сшитого декстрана.

Микросферы поперечно-сшитого крахмала разлагаются in vivo под действием амилазы плазмы до олигосахаридов, мальтозы и, в конечном итоге, до глюкозы, которая входит в нормальный метаболизм.

Поскольку водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости при использовании в качестве водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока предназначена для использования в брюшной полости, то гелеобразующий агент предпочтительно должен быть биоразлагаемым. Использование биоразлагаемого гелеобразующего агента подразумевает, что гелеобразующий агент не обязательно необходимо полностью удалять перед сшиванием брюшной полости. Для лапароскопических операций особенно предпочтительно или даже почти необходимо, чтобы гелеобразующий агент был биоразлагаемым. Микросферы поперечно-сшитого крахмала представляют собой предпочтительный пример биоразлагаемого гелеобразующего агента.

Микросферы поперечно-сшитого крахмала, а также микросферы поперечно-сшитого декстрана могут быть представлены в различных размерах и могут иметь различное распределение частиц по размеру. Фигуры, представленные ниже, относятся к микросферам поперечно-сшитого крахмала в набухшем состоянии, в котором они находятся в водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости. Такие же диапазоны применимы к микросферам поперечно-сшитого декстрана. Обнаружено, что микросферы поперечно-сшитого крахмала или микросферы поперечно-сшитого декстрана не должны быть слишком мелкими, чтобы обладать заметными свойствами разжижения при сдвиге и/или (псевдо)пластичными свойствами бингамовой жидкости. Таким образом, в соответствии с одним вариантом реализации, средний объемный диаметр (D[4,3]), определенный в соответствии с ISO 13320:2009 с помощью лазерной дифракции, составляет от 100 до 1000 мкм, например, от 250 до 750 мкм. Кроме того, медианный объемный диаметр D[v, 0,5], определенный в соответствии с ISO 13320:2009, обычно немного меньше, чем средний объемный диаметр. Кроме того, медианный объемный диаметр D[v, 0,5], определенный в соответствии ISO 13320:2009, также может составлять от 100 до 1000 мкм, например, от 250 до 750 мкм, хотя он меньше, чем средний объемный диаметр. Кроме того, распределение частиц по размеру может быть таким, что 90% частиц, измеренных в соответствии ISO 13320:2009, имеют объемный диаметр (D[v, 0,9]) менее 300-2000 мкм, например, менее 500-1500 мкм. Кроме того, распределение частиц по размеру может быть таким, что 10% частиц, измеренных в соответствии с ISO 13320:2009, имеют объемный диаметр (D[v, 0,1]) менее 50-600 мкм, например, менее 100-500 мкм, т.е. 90% частиц имеют диаметр по меньшей мере 50-600 мкм, например, по меньшей мере 100-500 мкм.

В соответствии с одним вариантом реализации, распределение по размеру микросфер поперечно-сшитого крахмала, присутствующего в водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости, является таким, что:

- средний объемный диаметр (D[4,3]), определенный в соответствии с ISO 13320:2009 с помощью лазерной дифракции, составляет от 100 до 1000 мкм, например, от 250 до 750 мкм; и/или

- объемный диаметр D[v, 0,9], определенный в соответствии с ISO 13320:2009 с помощью лазерной дифракции, составляет от 300 до 2000 мкм, например, от 500 до 1500 мкм; и/или

- объемный диаметр D[v, 0,1], определенный в соответствии с ISO 13320:2009 с помощью лазерной дифракции, составляет от 50 до 600 мкм, например, от 100 до 500 мкм.

Тип и количество гелеобразующего агента в водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости влияет на вязкость композиции. В соответствии с одним вариантом реализации, водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости содержит:

- от 5 до 25% мас., например, от 10 до 20% мас., от 13 до 17% мас. или от 14 до 16% мас. гелеобразующего агента, например, микросфер поперечно-сшитого крахмала;

- от 0,001 до 0,5% мас., например, от 0,005 до 0,25% мас. или от 0,01 до 0,1% мас. рН-индикатора, например, бромтимолового синего; и

- по меньшей мере 75% мас., например, по меньшей мере 80% мас. воды.

Предпочтительно, микросферы поперечно-сшитого крахмала в таком варианте реализации имеют степень поперечного сшивания от 12 до 20% мас., например, от 13,5 до 18,5% мас. или от 15,0 до 17,0% мас. Кроме того, концентрация буфера может составлять от 0,1 до 30 мМ, например, от 0,5 до 10 мМ или от 1,0 до 5 мМ. Буфер может представлять собой фосфатный буфер. Кроме того, водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости может быть на основе солевого раствора. Предпочтительно, предложенная водная композиция содержит фосфатно-солевой буферный раствор для обеспечения забуференной изотонической композиции. Ионная сила водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости, в соответствии с данным вариантом реализации, может составлять от 100 до 200 мМ, предпочтительно от 125 до 175 мМ.

Предпочтительные аспекты (поперечное сшивание, размер и т.д.), предложенные выше в отношении микросфер поперечно-сшитого крахмала, в равной степени применимы к микросферам поперечно-сшитого декстрана. Таким образом, в соответствии с одним вариантом реализации, средний объемный диаметр (D[4,3]) микросфер поперечно-сшитого декстрана, определенный в соответствии с ISO 13320:2009 с помощью лазерной дифракции, составляет от 100 до 1000 мкм, например, от 250 до 750 мкм. Кроме того, медианный объемный диаметр D[v, 0,5], определенный в соответствии с ISO 13320:2009, обычно немного меньше, чем средний объемный диаметр. Кроме того, медианный объемный диаметр D[v, 0,5], определенный в соответствии ISO 13320:2009, также может составлять от 100 до 1000 мкм, например, от 250 до 750 мкм, хотя он меньше, чем средний объемный диаметр. Кроме того, распределение частиц по размеру может быть таким, что 90% частиц, измеренных в соответствии ISO 13320:2009, имеют объемный диаметр (D[v, 0,9]) менее 300-2000 мкм, например, менее 500-1500 мкм. Кроме того, распределение частиц по размеру может быть таким, что 10% частиц, измеренных в соответствии с ISO 13320:2009, имеют объемный диаметр (D[v, 0,1]) менее 50-600 мкм, например, менее 100-500 мкм, т.е. 90% частиц имеют диаметр по меньшей мере 50-600 мкм, например, по меньшей мере 100-500 мкм. Кроме того, в соответствии с одним вариантом реализации, степень поперечного сшивания микросфер поперечно-сшитого декстрана, выраженная как массовое отношение сшиватель:декстран, должна составлять от 12 до 20% мас., например, от 13,5 до 18,5% мас. или от 15,0 до 17,0% мас. Считается, что для обнаружения панкреатического сока предпочтительной является степень поперечного сшивания примерно 25% мас.

В соответствии с одним вариантом реализации, распределение по размеру микросфер поперечно-сшитого декстрана, присутствующего в водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости, является таким, что:

- средний объемный диаметр (D[4,3]), определенный в соответствии с ISO 13320:2009 с помощью лазерной дифракции, составляет от 100 до 1000 мкм, например, от 250 до 750 мкм; и/или

- объемный диаметр D[v, 0,9], определенный в соответствии с ISO 13320:2009 с помощью лазерной дифракции, составляет от 300 до 2000 мкм, например, от 500 до 1500 мкм; и/или

объемный диаметр D[v, 0,1], определенный в соответствии с ISO 13320:2009 с помощью лазерной дифракции, составляет от 50 до 600 мкм, например, от 100 до 500 мкм.

рН-индикатор должен присутствовать в количестве, достаточном для получения окрашенной композиции, по меньшей мере выше или ниже его pKa. Таким образом, концентрация рН-индикатора может составлять по меньшей мере 0,001% мас., например, по меньшей мере 0,005% мас. или 0,01% мас. Кроме того, с точки зрения безопасности, концентрация рН-индикатора не должна быть слишком высокой. Таким образом, концентрация рН-индикатора может составлять 0,5% мас. или менее, например, 0,25% мас. или 0,1% мас. или менее.

Для увеличения срока годности водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости она может дополнительно содержать консервант. Примеры консервантов известны специалистам в данной области техники и включают, среди прочих, молочную кислоту и бензойную кислоту. С учетом того, что предложенная композиция обычно является слабокислотной, можно обойтись даже без добавления консерванта.

Кроме того, предложенная водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости может содержать хлорид натрия (NaCl) для регулирования тоничности и обеспечения изотоничной композиции. Для получения забуференной изотоничной водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости можно использовать фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) для растворения гелеобразующего агента.

В соответствии с предпочтительным вариантом реализации, водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости представляет собой водную композицию для обнаружения просачивания панкреатического сока. рН такой водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока составляет от 4 до 6. Кроме того, а pKa рН-индикатора составляет от 6 до 8, например, от 6,5 до 7,5. рН-индикатор в предложенной водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока может быть выбран из группы, состоящей из бромтимолового синего, фенолового красного и нейтрального красного; и предпочтительно рН-индикатор представляет собой бромтимоловый синий.

Такую водную композицию для обнаружения просачивания панкреатического сока можно использовать для обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе, например, с частичной панкреатэктомией. Таким образом, один вариант реализации относится к водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока для применения для обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе, например, с частичной панкреатэктомией. При таком использовании водную композицию для обнаружения просачивания поджелудочного сока наносят на поджелудочную железу во время операции на поджелудочной железе. Предложенную водную композицию для обнаружения просачивания панкреатического сока можно наносить с помощью шприца. Предпочтительно, водную композицию для обнаружения просачивания панкреатического сока наносят на поджелудочную железу сплошным слоем. Сплошной слой может быть обеспечен посредством нанесения извилистой полоски из шприца на поджелудочную железу. Толщина нанесенного слоя должна быть по возможности одинаковой. Слишком толстый слой может затруднять визуализацию просачивания.

Благодаря своим свойствам, композиция сохраняет первоначальный цвет (желтый в случае использования бромтимолового синего), если отсутствует просачивание панкреатического сока. Просачивание панкреатического сока вызывает локальное увеличение рН композиции, что приводит к локальному изменению цвета (на синий или зеленовато-синий в случае использования бромтимолового синего), и это является не только показателем количества, но и точного места просачивания. Таким образом, хирург понимает, что ушивание или анастомоз остатка поджелудочной железы является недостаточным и необходима дополнительная обработка перед ушиванием брюшной полости, или что необходимо изменить периоперационное ведение, например, установить дренаж, использовать лекарственные препараты или проводить лечение в отделении интенсивной терапии. Кроме того, хирург также получает ориентир в отношении точного расположения просачивания на поверхности ткани. Последнее является важным руководством для направленной обработки места сшивания; например, наложения дополнительной лигатуры.

Дополнительный вариант реализации настоящего изобретения относится к способу обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе. В таком способе водную композицию для обнаружения просачивания панкреатического сока наносят на поджелудочную железу во время операции на поджелудочной железе, например, после обычного ушивания остатка поджелудочной железы при дистальной панкреатэктомии с использованием лигатуры, такой как поперечные нерассасывающиеся швы в один стежок, или с использованием степлера. Как уже описано, просачивание панкреатического сока обнаруживают и локализуют на поверхности ткани по изменению цвета водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока, нанесенной на указанную поверхность. Предложенный способ может включать дополнительную стадию остановки обнаруженного просачивания, например, посредством направленного наложения лигатуры, например, нерассасывающихся швов в один стежок/x-образных швов, или с использованием степлера. Поскольку водную композицию для обнаружения просачивания панкреатического сока наносят на поверхность ткани посредством интраабдоминальной инъекции, ее можно использовать как для открытых хирургических операций, так и при лапараскопии или роботизированной хирургии.

В соответствии с другим вариантом реализации, водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости представляет собой водную композицию для обнаружения просачивания желчи. рН такой водной композиции для обнаружения просачивания желчи составляет от 4 до 6. Кроме того, а pKa рН-индикатора составляет от 6 до 8, например, от 6,5 до 7,5. рН-индикатор в предложенной водной композиции для обнаружения просачивания желчи может быть выбран из группы, состоящей из бромтимолового синего, фенолового красного и нейтрального красного; и предпочтительно рН-индикатор представляет собой бромтимоловый синий.

Такую водную композицию для обнаружения просачивания желчи можно использовать для обнаружения просачивания желчи в комплексе с операцией на органах брюшной полости, например, после частичной резекции печени по причине доброкачественных или злокачественных заболеваний, при травме печени или трансплантации печени. Таким образом, один вариант реализации относится к водной композиции для обнаружения просачивания желчи для использования для обнаружения просачивания желчи в комплексе с рассечением поверхности печени, травматическим повреждением печени или билиодигестивным анастомозом. При таком использовании водную композицию для обнаружения просачивания желчи наносят на поверхность ткани, т.е. на капсулу печени, поверхность паренхимального разреза или билиодигестивный анастомоз. Благодаря своим свойствам, композиция сохраняет первоначальный цвет (желтый в случае использования бромтимолового синего), если отсутствует просачивание желчи. Просачивание желчи вызывает локальное увеличение рН композиции, что приводит к локальному изменению цвета (на синий или зеленовато-синий в случае использования бромтимолового синего), и это является не только показателем наличия, но и точного места просачивания желчи. Таким образом, хирург понимает, что ушивание остатка печени или билиодигестивный анастомоз является недостаточным и необходима дополнительная обработка перед ушиванием брюшной полости, или что необходимо изменить периоперационное ведение, например, установить дренаж, использовать лекарственные препараты или проводить лечение в отделении интенсивной терапии. Кроме того, хирург также получает ориентир в отношении количества и точного места просачивания желчи. Последнее является важным руководством для направленного ушивания просачивающейся поверхности ткани печени или билиодигестивного анастомоза, например, для наложения лигатуры, обработки с помощью степлера или наклеивания биологических или искусственных пластырей для стяжки. Поскольку водную композицию для обнаружения просачивания желчи наносят на поверхность ткани посредством интраабдоминальной инъекции, ее можно использовать как для открытых хирургических операций, так и при лапараскопии или роботизированной хирургии. Без дополнительного уточнения, можно предположить, что специалисты в данной области техники, используя приведенное выше описание, будут использовать настоящее изобретение в самом полном объеме. Таким образом, описанные выше конкретные предпочтительные варианты реализации следует понимать лишь как иллюстрацию, но никоим образом не как ограничение настоящего изобретения.

Несмотря на то, что настоящее изобретение описано выше со ссылкой на конкретные варианты реализации, оно не ограничено конкретной формой, представленной в данном документе. Напротив, настоящее изобретение ограничено лишь сопроводительной формулой изобретения, и другие варианты реализации, отличные от описанных выше конкретных вариантов реализации, в равной степени возможны в пределах объема прилагаемой формулы изобретения, например, те, которые отличны от описанных выше.

В формуле изобретения термин «содержит/содержащий» не исключает присутствие других элементов или стадий. Кроме того, несмотря на то, что отдельные признаки могут быть включены в различные пункты формулы изобретения или в различные варианты реализации, они могут быть преимущественно объединены, и включение в различные пункты формулы изобретения или варианты реализации не подразумевает, что комбинация признаков не является возможной и/или преимущественной.

Кроме того, формы единственного числа не исключают формы множественного числа. Термины в единственном числе, «первый», «второй» и т.д. не исключают множество.

Краткое описание графических материалов

Эти и другие аспекты, признаки и преимущества, обеспечиваемые настоящим изобретением, станут понятны и разъяснены в следующем описании иллюстративных вариантов реализации настоящего изобретения, в которых сделана ссылка на сопроводительные графические материалы, в которых:

Фиг. 1 представляет собой последовательность фотографий, сделанных во время операции на поджелудочной железе (дистальной панкреатэктомии). На фиг. 1a представлена сшитая часть поджелудочной железы, оставшейся после дистальной панкреатэктомии. Просачивание незаметно для невооруженного глаза. Однако, как можно видеть на фиг. 1b, просачивание визуализируется (ср. стрелки) с помощью предложенной водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости. На фиг. 1c показана поджелудочная железа после направленного ушивания локализованного просачивания. Наконец, как показано на фиг. 1d, повторное нанесение водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости согласно настоящему изобретению подтверждает, что направленное ушивание локализованного просачивания (ср. Фиг. 1b) было успешным.

На фиг. 2 показаны уровни п-амилазы сразу после операции на поджелудочной железе (DO) и до D7 (с дополнительными швами и без дополнительных швов после обнаружения просачивания панкреатического сока); и

На фиг. 3 показаны уровни липазы в различных группах животных сразу после и до 7 дня после операции на поджелудочной железе (с дополнительными швами и без дополнительных швов после обнаружения просачивания поджелудочного сока).

Экспериментальная часть

Следующие примеры являются лишь примерами, и их не следует понимать как ограничение объема настоящего изобретения. Напротив, настоящее изобретение ограничено лишь сопроводительной формулой изобретения.

Материал

Из трех различных типов использованных микросфер поперечно-сшитого крахмала (по размеру и степени поперечного сшивания), два были получены своими силами на заводе Magle AB (Кристианстад, Швеция), как описано ниже, а третий (Arista®) был приобретен у компании Davol Inc. Все остальные химические вещества и реагенты, использованные для получения микросфер поперечно-сшитого крахмала и на последующих стадиях получения гидрогелей аналитической марки, приобретали у компании VWR International AB, если не указано иное. Нативный картофельный крахмал приобретали у компании Lyckeby Starch (Кристианстад, Швеция).

Общая информация

Вкратце, микросферы поперечно-сшитого крахмала первых двух типов получали посредством:

- Гидролиза нативного крахмала с получением более коротких полимерных цепей;

- Восстановления концевых альдегидных групп во избежание уменьшения изменения цвета;

- Получения эмульсии, содержащей сферические капли крахмала;

- Поперечного сшивания крахмала в каплях с получением микросфер поперечно-сшитого крахмала; и

- Промывания микросфер поперечно-сшитого крахмала.

Свойства полученных микросфер поперечно-сшитого крахмала, как известно в данной области техники, зависят от ряда факторов, включая:

- степень гидролиза, т.е. длину полимерных цепей (на которую влияют рН, продолжительность и температура реакции);

- размер микросфер (на который влияют тип эмульгатора, длина полимерных цепей и скорость перемешивания); и

- степень поперечного сшивания (на которую влияет массовое отношение эпихлоргидрин:крахмал).

Получение раствора гидролизованного крахмала (HST)

В первый реактор загружают очищенную воду при перемешивании при комнатной температуре. Затем в первый реактор загружают концентрированную соляную кислоту. Затем к разбавленной кислоте по частям загружают нативный картофельный крахмал при перемешивании. Повышают температуру рубашки. Смесь перемешиванию при повышенной температуре до достижения требуемой степени гидролиза. По завершении времени реакции температуру рубашки понижают до комнатной температуры. Кислотную реакционную смесь гасят посредством контролируемого добавления гидроксида натрия. Внутренняя температура не должна превышать температуру реакции во время загрузки основания. К полученной смеси добавляют боргидрид натрия при перемешивании и в контролируемых условиях при комнатной температуре. После полного растворения боргидрида смесь перемешивают до завершения реакции.

Получение микросфер

Во второй реактор загружают толуол и Rhodafac PA17 (эмульгатор) в контролируемых условиях и перемешивают при повышенной температуре до полного растворения Rhodafac. Затем во второй реактор загружают содержимое первого реактора, содержащего гидролизованный и восстановленный нативный крахмал, при высокой скорости перемешивания до получения стабильной суспензии. Скорость перемешивания и, следовательно, состав суспензии регулируют в зависимости от получаемого диапазона микросфер. К суспензии при контролируемых условиях добавляют эпихлоргидрин. Количество загружаемого сшивающего агента зависит от получаемого диапазона микросфер. Реакционную смесь выдерживают при повышенной температуре в течение ночи. Загружают этанол и понижают температуру рубашки до комнатной температуры, и неочищенный продукт выпадает в осадок. Прозрачную верхнюю фазу откачивают.

Выделение продукта

К неочищенному продукту при перемешивании добавляют этанол. Затем после получения однородной смеси ее оставляют для образования осадка. Верхнюю фазу откачивают. Указанную последовательность повторяют три раза.

К смеси продукта при перемешивании добавляют очищенную воду. Затем к суспензии при перемешивании добавляют уксусную кислоту до достижения рН 4-5. Загружают этанол. По достижении однородности смесь оставляют для образования осадка, а затем откачивают верхнюю фазу.

В реактор загружают предварительно полученный водный раствор этанола (20% мас.), смесь перемешивают. По достижении однородности смесь оставляют для образования осадка, а затем откачивают верхнюю фазу. Указанную последовательность повторяют четыре раза.

Повторяют описанный выше прием без осаждения, и собирают смесь через нижний клапан и отфильтровывают.

Продукт промывают абсолютным этанолом и фильтруют. Процесс промывания повторяют пять раз.

Продукт сушат в лотке из нержавеющей стали при 60°С под вакуумом и просевают через 400 мкм сито (первого типа) с получением микросфер в диапазоне размеров (влажное состояние; диспергированные в очищенной воде) от 32 до 900 мкм, или через 600 мкм сито (второго типа) с получением микросфер в диапазоне размеров (влажное состояние; диспергированные в очищенной воде) от 50 до 1200 мкм.

Типы микросфер

Используя описанный способ, получали два типа микросфер поперечно-сшитого крахмала. Частицы первого типа имели средний объемный диаметр (D[4,3]) примерно 450 мкм (влажное состояние; диспергированные в очищенной воде) и степень поперечного сшивания примерно 14%. Получали частицы второго типа, имеющие средний объемный диаметр (D[4,3]) примерно 620 мкм (влажное состояние; диспергированные в очищенной воде) и степень поперечного сшивания примерно 15%.

Как уже описано, третьим типом микросфер был продукт Arista® производства компании Davol Inc. Указанные микросферы имеют средний объемный диаметр (D[4,3]) примерно 138 мкм (влажное состояние; диспергированные в очищенной воде) и степень поперечного сшивания примерно 11%.

Получение композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока

Для получения композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока загружали нативный картофельный крахмал (ср. пример 21 и 22), микросферы (15 г) первого, второго или третьего типа в 25 мл этанольного раствора, содержащего бромтимоловый синий (0,2% мас./мас.). Полученную смесь перемешивали 30 минут при комнатной температуре, после чего смесь сушили под вакуумом при 60°С в течение ночи.

Высушенный продукт, базовую смесь (15 г) растворяли в 100 мл очищенной воды или предварительно полученного раствора, содержащего солевой раствор и фосфатный буфер, и необязательно подкисляли посредством добавления соляной кислоты. Смесь перемешивали при комнатной температуре до получения однородного раствора, затем однородным базовым гелем наполняли шприцы.

Указанным способом получали 25 композиций для обнаружения просачивания панкреатического сока. Модификации указанного способа, а также тип микросфер для получения каждого примера указаны ниже.

Пример 1: Базовую смесь, содержащую микросферы третьего типа, загружали в очищенную воду, 100 мл, и подкисляли соляной кислотой (0,1 М). Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 2: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в очищенную воду, 100 мл, без подкисления. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 3: Базовую смесь, содержащую микросферы третьего типа, загружали в очищенную воду, 100 мл, и подкисляли, используя 5 мл соляной кислоты (0,1 М). Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 4: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 83 мл солевого раствора и 1 мл фосфатного буфера при рН 6,4. рН полученного геля доводили до 4,5, используя 0,1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 5: Базовую смесь (20,5 г), содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 100 мл солевого раствора. Раствор подкисляли, используя 0,1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 6: Базовую смесь (29,5 г), содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 150 мл солевого раствора. Раствор доводили до рН 4,5, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 7: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 85 мл солевого раствора и 1,13 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Раствор доводили до рН 4,6, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 8: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 85 мл солевого раствора и 1,13 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Раствор доводили до рН 5,0, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 9: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 85 мл солевого раствора и 1,13 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Раствор доводили до рН 4,3, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 10: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 85 мл солевого раствора и 0,565 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Раствор доводили до рН 4,5, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 11: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 85 мл солевого раствора и 0,565 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Раствор доводили до рН 4,8, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 12: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 85 мл солевого раствора и 2,26 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Раствор доводили до рН 4,1, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 13: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 85 мл солевого раствора и 2,26 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Раствор доводили до рН 4,7, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 14: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 83 мл солевого раствора и 0,1 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. рН геля доводили до 5,8, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы и стерилизовали в автоклаве.

Пример 15: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 83 мл солевого раствора и 0,457 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. рН геля доводили до 4,7, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы и стерилизовали в автоклаве.

Пример 16: Базовую смесь, содержащую микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 83 мл солевого раствора и 0,125 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. рН геля доводили до 4,5, используя 0,1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы и стерилизовали паром в автоклаве.

Пример 17: 48 г базовой смеси, содержащей микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 230 мл солевого раствора и 0,345 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. рН геля доводили до 4,6, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 18: 48 г базовой смеси, содержащей микросферы второго типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 230 мл солевого раствора и 0,345 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. рН геля доводили до 4,6, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы и стерилизовали паром в автоклаве.

Пример 19: 31 г базовой смеси, содержащей микросферы второго типа, за исключением того, что диапазон размеров частиц (влажное состояние; диспергированные в очищенной воде) микросфер составлял от 150 до 2000 мкм, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 140 мл солевого раствора и 0,21 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. рН геля доводили до 4,6, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 20: 28 г базовой смеси, содержащей микросферы второго типа, за исключением того, что диапазон размеров частиц (влажное состояние; диспергированные в очищенной воде) микросфер составлял от 150 до 1600 мкм, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 130 мл солевого раствора и 0,195 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. рН геля доводили до 4,5, используя 1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 21: 10 г базовой смеси, содержащей нативный картофельный крахмал, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 120 мл солевого раствора, 4,4 г глицерина и 0,075 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Смесь нагревали до 70°C и перемешивали в течение 30 минут. рН геля доводили до 4,5, используя 0,1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 22: 10 г базовой смеси, содержащей нативный картофельный крахмал, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 120 мл солевого раствора, 4,4 г глицерина и 0,05 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Смесь нагревали до 70°C и перемешивали в течение 30 минут. рН геля доводили до 4,5, используя 0,1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 23: Базовую смесь, содержащую микросферы первого типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 87 мл солевого раствора и 0,124 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Смесь нагревали до 70°C и перемешивали в течение 30 минут. рН геля доводили до 4,4, используя 0,1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 24: Базовую смесь, содержащую микросферы первого типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 87 мл солевого раствора и 0,124 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Смесь нагревали до 70°C и перемешивали в течение 30 минут. рН геля доводили до 4,4, используя 0,1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Пример 25: Базовую смесь, содержащую микросферы первого типа, загружали в предварительно полученный раствор, содержащий 83 мл солевого раствора и 0,124 мл 1 М фосфатного буфера при рН 5,8. Смесь нагревали до 70°C и перемешивали в течение 30 минут. рН геля доводили до 4,6, используя 0,1 М соляную кислоту. Смесь перемешивали до получения однородной суспензии. Затем однородным гелем наполняли шприцы.

Проверка in vitro

Полученные водные композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости (т.е. примеры 1-25) оценивали in vitro, используя смоченную слюной фильтровальную бумагу, свежую ткань поджелудочной железы свиньи и свежий панкреатический сок человека. Ткань поджелудочной железы свиньи была подарена региональной скотобойней (Fleischversorgungszentrum, Мангейм), и ее хранили при температуре 2°C до использования в экспериментах в течение 12 часов после вскрытия. Панкреатический сок человека аспирировали из свежего хирургического образца пациентов после информированного согласия в соответствии с Хельсинской декларацией (одобренной этической комиссией Гейдельбергского университета; голоса 301/2001, 159/2002). In vitro способы обеспечивали точно контролируемое тестирование с ограниченной сложностью. Таким образом, образцы можно быстро проверить на a) практичность использования, b) время реакции, c) четкость изображения и d) точность обнаружения и мгновенного обратного ответа для разработчиков, что обеспечивает возможность быстрой оптимизации индикатора.

При in vitro тестировании можно сделать некоторые выводы:

- Было обнаружено, что степень поперечного сшивания примерно 12,5% мас. (ср. пример 3) слишком мала для обеспечения оптимальных свойств, поскольку композиция, по-видимому, разлагалась слишком быстро. Увеличение степени поперечного сшивания до примерно 16% мас. (ср. примеры 2, 11, 14, 16 и 17) обеспечивало достаточную стойкость композиции к расщеплению под действием амилазы в панкреатическом соке (т.е. композиция была стабильной в течение по меньшей мере 5 минут);

- Количество микросфер в композиции влияет на вязкость композиции. Сделан вывод, что содержание микросфер менее 10% мас. (ср. примеры 21 и 22) обеспечивало получение слишком жидких композиций для достижения оптимальных свойств, а содержание микросфер 20% мас. или более (ср. пример 5) обеспечивало получение слишком густой композиции для достижения оптимальных свойств. Концентрация микросфер от 13 до 18% мас. (ср. примеры 1, 2, 6-20, 23 и 24) обеспечивало получение композиции, простой в обращении, которая обеспечивает быстрое, т.е. в течение 5 минут, и точное обнаружение просачивания;

- Предпочтительно поддерживать как можно более низкую концентрацию рН-индикатора. Однако она должна быть достаточно высокой для обеспечения явно заметного обнаружения просачивания. Концентрация BTB менее 0,04% мас. (ср. примеры 1 и 2) обеспечивает несколько слабое окрашивание, хотя и видимое; и

- Композиции, не содержащие буфер, обеспечивают менее точное обнаружение просачивания. Кроме того, композиция с высокой буферной силой (ср. примеры 5-9, 12 и 13) обеспечивает медленное обнаружение, а буферная сила от 1 до 10 мМ (ср. примеры 10, 11 и 14-24) обеспечивает быстрое и точное обнаружение просачивания.

Проверка in vivo

На основании in vitro проверки, проводили также оценку некоторых водных композиций для обнаружения просачивания физиологических жидкостей (т.е. примеры 1-25) в животной модели. Проект испытания на животных был одобрен региональным административным органом ( Karlsruhe в соответствии с законом Deutsches TierSchG (закон об обращении с животными, Германия) §8, пункт 1, ссылочный номер 35-9835.81/G-184/16) для разработки и тестирования индикатора на домашних свиньях (sus scrofa domestica), которым проводили операцию на поджелудочной железе. Операцию проводили под общим наркозом, используемым для людей.

В первой апробации концепции (n = 10 животных) проводили проверку предварительных водных композиций для обнаружения просачивания физиологических жидкостей (примеры 1-5) на их техническую применимость и характеристики в конечных операциях на поджелудочной железе (дистальная панкреатэктомия, DP, см. ниже). Параллельно с in vitro экспериментами оценивали следующие характеристики: a) практичность использования, b) время реакции, c) четкость изображения и d) точность обнаружения, после чего проводили оценку повреждения исходной ткани, вызванного индикатором, с помощью послеоперационного гистологического анализа остатка поджелудочной железы.

Второй эксперимент (n = 8 животных) состоял из первоначальной дистальной панкреатэктомии (ср. ниже) с последующим наблюдением в течение 48 часов локальной цитотоксичности и системных побочных эффектов, оказываемых водными композициями для обнаружения просачивания физиологических жидкостей (примеры 5-25), и окончательной повторной операцией с оценкой внутрибрюшинных патологий и забором образцов ткани для гистологического анализа. В соответствии с дизайном исследования в трех группах, животных делили на группу с отрицательным результатом по индикатору, а в случае обнаружения просачивания с помощью индикатора, животных случайным образом разделяли на группу с положительным результатом по индикатору без дополнительного ушивания и на группу с положительным результатом по индикатору с целенаправленным дополнительным ушиванием. Таким образом, можно исследовать чувствительность и специфичность, а также влияние скорректированного ушивания на образование послеоперационного свища поджелудочной железы. Во время наблюдения отмечено краткосрочное влияние применения водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости на биологический организм по клинической оценке, дополненной лабораторным анализом образцов крови и перитонеальной жидкости. Клинические параметры включали признаки инфекции или послеоперационного свища поджелудочной железы, анализ крови включал маркеры воспаления, анемии или панкреатита в крови, а также просачивание панкреатического сока в перитонеальную жидкость.

Эксперимент номер три (n = 16 животных) проводили аналогично второму эксперименту, но время наблюдения увеличивали до 8 дней для проведения оценки возможного среднесрочного и долгосрочного влияния применения водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости на биологический организм. На основании клинических данных, известно, что за это время почти все послеоперационные свищи поджелудочной железы становятся клинически заметными. Напротив, при отсутствии осложнений через одну неделю после операции, указанный срок можно рассматривать как среднее время до выписки из больницы, который определяет основной период клинического ведения.

Дистальная панкреатэктомия (DP)

Брюшную полость вскрывали посредством срединной лапаротомии и раскрывали сальниковую сумку для обнажения поджелудочной железы. После раскрытия хирургически отделяли последние 2-3 см поджелудочной железы (селезеночную долю свиньи) от окружающей перитонеальной ткани и отрезали скальпелем дистальные 2 см поджелудочной железы. Кровотечение останавливали с помощью нерассасывающихся швов в один стежок/x-образных швов (не более 3 на одно животное). Ушивание остатка поджелудочной железы проводили с помощью поперечных нерассасывающихся швов в один стежок (1х/см поверхности). Затем зашитый остаток поджелудочной железы промывали и очищали солевым раствором.

После промывания на всю поверхность остатка поджелудочной железы наносили водную композицию для обнаружения просачивания физиологической жидкости в соответствии с представленным выше описанием. При нанесении композиция была желтой, но локально меняла цвет на синевато-зеленый в случае просачивания панкреатического сока вследствие недостаточного ушивания в некоторых местах. Указанная реакция индикатора происходит мгновенно, т.е. в течение нескольких секунд. Благодаря вязкости композиции, изменение цвета происходит только в непосредственной близости к месту просачивания.

В случае просачивания панкреатического сока, можно осуществить тщательное ушивание остатка с помощью нерассасывающихся швов в один стежок/х-образных швов поверх выявленных мест просачивания. Затем место ушивания можно контролировать посредством неограниченного повторения нанесения предложенной композиции.

Наконец, гелеобразную композицию удаляли марлей и промывали солевым раствором. Затем в остаток поджелудочной железы устанавливали абдоминальную силиконовую дренажную трубку для послеоперационного отсасывания и анализа жидкости; и зашивали брюшную стенку.

Токсикология и цитотоксичность

Токсикологию PAN оценивали посредством in vivo анализа фармакокинетики продуктов его разложения в течение 48 часов. Кроме того, анализировали острое локальное повреждение ткани, вызванное индикатором в течение нескольких минут, а также макроскопические внутрибрюшинные побочные эффекты и локальные гистологические эффекты указанного устройства в течение 8 дней. Наконец, анализировали цитотоксичность продуктов его разложения в отношении панкреатических клеток-мишеней.

Для токсикологической оценки гидрогеля индикатора PAN проводили фармакокинетические исследования, измеряя концентрации продуктов разложения указанного устройства в компонентах физиологической жидкости в зависимости от времени после абдоминального применения в операции на поджелудочной железе. Брали образцы крови из воротной вены и перитонеальной жидкости из интраоперационного места или из послеоперационной дренажной трубки. Моменты времени отбора образцов относительно нанесения индикатора: 0 минут (исходное значение до нанесения индикатора), 1, 5, 30, 60 и 120 минут, 1 и 2 день после операции. Поскольку в состав входит вода и разлагаемые компоненты в форме микросфер крахмала, необходимо провести оценку лишь дополнительного компонента, бромтимолового синего (BTB). Необходимо определить, остался ли BTB и сколько BTB осталось в организме после нанесения в область операции на поджелудочной железе, всосалось в кровоток воротной вены и прошло через печеночный метаболизм и достигло центрального венозного кровотока. Так, брали образцы различных отделов организма в течение времени, описанного выше. Поскольку ожидаемое количество BTB для измерения является чрезвычайно малым, использовали очень чувствительный метод обнаружения с помощью жидкостной хроматомасс-спектрометрии высокого давления (ВЭЖХ-МС).

У всех свиней после мгновенного и резкого увеличения концентрации BTB в дренажной жидкости после нанесения индикатора наблюдали постепенное снижение с небольшим обнаруживаемым содержанием BTB на 1 день после операции (<20 нг/мл) и отсутствием обнаруживаемого количества BTB на 2 день после операции в дренажной жидкости всех свиней. В крови воротной вены обнаруживали небольшое количество BTB только у одной свиньи через 5 и 30 минут после нанесения. У остальных свиней и в остальные моменты времени не обнаруживали BTB (таблица 1).

Таблица 1. Концентрация BTB в дренаже и в крови воротной вены, соответственно

Концентрация BTB в дренажной жидкости в различные моменты времени [нг/мл]
№ животного	0 мин.	1 мин.	5 мин.	30 мин.	60 мин.	120 мин.	1 день	2 день
Tox 1	0	2060	7650	3280	1140	619	32,1	-
Tox 2	0	9220	389	10,7	9,27	263	18,9	0
Tox 3	0	3600	2560	1220	1270	631	14,4	0
Tox 4	7,44	2010	2070	712	224	121	2,98	0
Среднее	1,9	4222,5	3167,3	1305,7	660,8	408,5	17,1	0
Концентрация BTB в крови воротной вены в различные моменты времени [нг/мл]
№ животного	0 мин.	1 мин.	5 мин.	30 мин.	60 мин.	120 мин.	1 день	2 день
Tox 1	0	0	0	0	0	0	0	0
Tox 2	0	0	0	0	0	0	0	0
Tox 3	0	0	0	0	0	0	0	0
Tox 4	0	0	2,02	2,11	0	0	0	0
Среднее	0	0	0,51	0,53	0	0	0	0

Для проверки краткосрочных локальных гистопатологических изменений в поджелудочной железе, вызванных индикатором, брали, в целом, 24 свежих образца ткани поджелудочной железы у шести свиней для гистопатологического анализа. У каждой свиньи брали четыре поперечных среза равного размера (2 см) и обрабатывали PAN или солевым раствором (контроль) в течение 5 или 10 минут. Через 5 или 10 минут индикатор смывали и сразу фиксировали ткань поджелудочной железы и заливали в парафиновые блоки для гистологического анализа.

Гистология показала отсутствие существенного локального повреждения, панкреатита или цитотоксичности. На наблюдали различий гистопатологической оценки острого повреждения поджелудочной железы между экспериментальной и контрольной группами.

Цитотоксичность под действием PAN дополнительно проверяли в анализе в клеточной культуре. Метаболическую активность жизнеспособных клеток оценивали с помощью флуоресцентной фотометрии метаболизированного резофурина из резазурина после инкубации с увеличивающимся количеством BTB. Гидрогели индикатора PAN содержали BTB в концентрации почти 0,5 мг/мл. Таким образом, проверяли растворы BTB с концентрациями 0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 1,5 мг/мл и 5,5 мг/мл, соответственно. Цитотоксичность определяли как жизнеспособность клеток менее 70%. Для 0,5-1,5 мг/мл BTB цитотоксичность не обнаружена. BTB в концентрации 5,5 мг/мл обусловливал слабую цитотоксичность.

Сравнение: индикатор(+) с дополнительным ушиванием, индикатор(+) без дополнительного ушивания и индикатор(-)

Влияние целенаправленного ушивания остатка поджелудочной железы на основании показаний индикатора в отношении уменьшения свища поджелудочной железы оценивали посредством изучения уровней п-амилазы и п-липазы в дренажной жидкости.

Индикатор тестировали после дистальной панкреатэктомии у живых свиней. Свиней разделяли на экспериментальные группы в соответствии с реакцией индикатора, визуализирующей просачивание из остатка поджелудочной железы, ушитого стандартным образом, и обозначали как группы с «отрицательным / положительным результатом по индикатору». В случае «положительной» реакции индикатора животных случайным образом разделяли на группу, в которой осуществляли направленное ушивание на основании данных индикатора («дополнительное ушивание»), и на группу, в которой не осуществляли дополнительное ушивание визуализированного просачивания. Рандомизацию проводили методом жеребьевки.

Группа 1: Положительный результат по индикатору, без дополнительного ушивания;

Группа 2: Положительный результат по индикатору, с дополнительным ушиванием; и

Группа 3: Отрицательный результат по индикатору.

Для оценки влияния целенаправленного ушивания измеряли уровни α-амилазы и липазы в сыворотке и дренажной жидкости на 0-8 дни (ср. результат, представленный на фиг. 2 и 3). Повышенные концентрации ферментов поджелудочной железы в брюшной полости/асцит после операции указывают на наличие и интенсивность биохимического просачивания секрета поджелудочной железы, которое может приводить к образованию послеоперационного свища поджелудочной железы. Значения на 0 день означают исходное состояние, а следующие значения относятся к послеоперационному курсу. В соответствии с международными определениями, начиная с третьего дня после операции, уровни ферментов должны падать ниже значения, которое в 3 раза меньше установленного верхних предельных нормальных концентраций в сыворотке, для исключения наличия биохимического просачивания. Если клинические проявления дополняют существующее биохимическое просачивание, то в соответствии с указанным определением может быть диагностирован послеоперационный свищ поджелудочной железы.

После операции концентрации панкреатических ферментов в абдоминальном дренаже существенно отличались между экспериментальными группами. Наблюдали существенное повышение уровня амилазы в экспериментальной группе 1 (с положительным результатом по индикатору, без дополнительного лечения), по сравнению с экспериментальной группой 3 (с отрицательным результатом по индикатору) (фиг. 2). В течение следующих дней, с 5 дня по 7 день, тенденция к повышению сохранялась, но постепенно уменьшалась. Интересно, что изменение уровня концентрации в группе 1 (с положительным результатом по индикатору, без дополнительного лечения) было высоким, со стандартным отклонением >10000 Е/л на 1 день и >5000 Е/л на 2 день, 3 день, 5 день и 7 день. Отклонение в группе 2 (с положительным результатом по индикатору, с дополнительным ушиванием) и особенно в группе 3 (с отрицательным результатом по индикатору) было гораздо меньше, и стандартные отклонения всегда составляли <3500 Е/л и <1500 Е/л, соответственно.

Целенаправленное зашивание в экспериментальной группе 2 (с положительным результатом по индикатору, с дополнительным ушиванием) обеспечивало определенное снижение концентраций ферментов в дренажной жидкости, по сравнению с экспериментальной группой 1 (положительный результат по индикатору, без дополнительного лечения). Снижение уровней ферментов в дренаже было столь явным, что уже не была заметна разница при сравнении группы 2 (с положительным результатом по индикатору, с дополнительным лечением) и группы 3 (с отрицательным результатом по индикатору) (p>0,05 для всех послеоперационных дней).

Значения содержания липазы в дренаже анализировали на 0-7 дни. Было показано, что липаза, как и амилаза, является ранним индикатором просачивания панкреатического сока. Как и ожидалось, уровни липазы в дренаже изменялись параллельно (ср. фиг. 2) изменению уровней амилазы в дренаже, коррелируя с просачиванием панкреатического сока. В соответствии с результатами измерения уровня амилазы, наблюдали гораздо более высокие концентрации липазы в дренаже 1 экспериментальной группы (с положительным результатом, без дополнительного лечения), по сравнению с 3 группой (с отрицательным результатом), а во 2 группе наблюдали снижение (с положительным результатом, с дополнительным ушиванием).

Выводы

Разработана новая водная композиция для in vitro обнаружения просачивания физиологических жидкостей. Предложенную водную композицию для обнаружения просачивания физиологических жидкостей проверяли и адаптировали in vivo так, чтобы ее, в конечном итоге, можно было легко наносить на остаток поджелудочной железы или анастомотическую ткань в качестве быстро действующей водной композиции для обнаружения просачивания физиологической жидкости. Проверка концепции показала, что предложенная композиция точно и быстро визуализирует просачивание панкреатического сока по краю резекции в свиной модели дистальной панкреатэктомии.

Чувствительность и специфичность композиции в отношении просачивания панкреатического сока составили 100%. Визуальное разрешение было меньше одной капли (<500 мкм в диаметре). Таким образом, стало возможным целенаправленное ушивание места просачивания после проверки непроницаемости посредством неограниченного количества повторных нанесений предложенного индикатора.

В среднесрочных и долгосрочных обсервационных исследованиях свиней предложенная композиция не оказывает существенного вредного воздействия на организм. Важно, что не возникают системные побочные эффекты. На уровне поджелудочной железы предложенная композиция не вызывает существенный панкреатит, кровотечение или цитотоксичность, что подтверждено с помощью гистологии. Обнаруженное просачивание панкреатического сока, визуализированное по положительной реакции индикатора, во всех случаях определенно приводит к возникновению послеоперационного свища поджелудочной железы, что не только подтверждается повышенными концентрациями панкреатических ферментов в перитонеальной жидкости в первые дни после операции, но и сопровождается специфическими медицинскими состояниями, такими как замедленное опорожнение желудка или внутрибрюшинный абсцесс. Напротив, целенаправленное ушивание места просачивания обеспечивает существенное уменьшение процента послеоперационных свищей поджелудочной железы, как можно видеть по резкому снижению уровней панкреатических ферментов в перитонеальной жидкости, с последующим быстрым выздоровлением животных.

Указанная водная композиция для обнаружения просачивания физиологических жидкостей обеспечивает простую и быструю визуализацию просачивания панкреатического сока в экспериментальных операциях на поджелудочной железе без существенных побочных эффектов или токсичности и обеспечивает возможность количественного определения и точной локализации просачивания панкреатического сока непосредственно во время операции. Визуализация обеспечивает возможность коррекции периоперативного ведения, а также целенаправленного ушивания места просачивания, существенно уменьшая возникновение послеоперационных свищей поджелудочной железы.

Кроме того, подтверждено, что предложенная водная композиция для обнаружения просачивания физиологической жидкости является безопасной, т.е. не связана с каким-либо существенным цитотоксичным эффектом. Кроме того, проверено, что предложенный гель может способствовать снижению послеоперационного риска после операции на поджелудочной железе.

1. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока, содержащая от 5 до 25% мас. гелеобразующего агента, увеличивающего вязкость композиции, причем указанный гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого крахмала или поперечно-сшитого декстрана, где степень поперечного сшивания, выраженная как массовое отношение сшиватель:крахмал или как отношение сшиватель:декстран, составляет от 12 до 20% мас., и буферные вещества, при этом концентрация буфера составляет от 0,1 до 30 мМ, и, таким образом, указанная композиция является забуференной, при этом указанная композиция дополнительно содержит от 0,001 до 0,5% мас. рН-индикатора, при этом рН композиции по меньшей мере на 0,1 единицы рН ниже или выше, чем pKa рН-индикатора, при этом рН композиции составляет от 4 до 6 и pKa рН-индикатора составляет от 6 до 8.

2. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по п. 1, отличающаяся тем, что гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого крахмала.

3. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по п. 1, отличающаяся тем, что гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого декстрана.

4. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по п. 2 или 3, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит от 10 до 20% мас. микросфер поперечно-сшитого крахмала или микросфер поперечно-сшитого декстрана, более предпочтительно от 13 до 17% мас. микросфер поперечно-сшитого крахмала или микросфер поперечно-сшитого декстрана.

5. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по пп. 2, 3 или 4, отличающаяся тем, что степень поперечного сшивания, выраженная как массовое отношение сшиватель:крахмал или как отношение сшиватель:декстран, составляет от 13,5 до 18,5% мас. или от 15,0 до 17,0% мас.; предпочтительно микросферы поперечно-сшитого крахмала или микросферы поперечно-сшитого декстрана сшиты с помощью эпихлоргидрина.

6. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по любому из пп. 2-5, отличающаяся тем, что средний объемный диаметр (D[4,3]), измеренный в соответствии с ISO 13 320:2009 с помощью лазерной дифракции, микросфер поперечно-сшитого крахмала или микросфер поперечно-сшитого декстрана, присутствующих в композиции, составляет от 100 до 1000 мкм, например от 250 до 750 мкм.

7. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что рН композиции по меньшей мере на 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 единицы рН ниже или выше, чем pKa рН-индикатора; предпочтительно рН композиции по меньшей мере на 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 единицы рН ниже, чем pKa рН-индикатора.

8. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что pKa рН-индикатора составляет предпочтительно от 6,5 до 7,5.

9. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что рН-индикатор представляет собой бромтимоловый синий, предпочтительно указанная композиция содержит от 0,001 до 0,5% мас., например от 0,005 до 0,25% мас. или от 0,01 до 0,1% мас. бромтимолового синего.

10. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что рН композиции составляет предпочтительно от 5 до 6.

11. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что буферные вещества присутствуют в количестве предпочтительно от 0,5 до 10 мМ, более предпочтительно от 1,0 до 5 мМ.

12. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по п. 11, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит фосфатный буфер.

13. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по любому из пп. 1-12, содержащая:

- от 10 до 20% мас., например от 13 до 17% мас. или от 14 до 16% мас. гелеобразующего агента, указанный гелеобразующий агент представляет собой микросферы поперечно-сшитого крахмала;

- от 0,001 до 0,5% мас., например от 0,005 до 0,25% мас. или от 0,01 до 0,1% мас. рН-индикатора, предпочтительно указанный рН-индикатор представляет собой бромтимоловый синий;

- по меньшей мере 75% мас. воды; и

- необязательно фосфатно-солевой буферный раствор;

причем:

микросферы поперечно-сшитого крахмала, при их наличии, имеют степень поперечного сшивания от 12 до 20% мас., например от 13,5 до 18,5% мас. или от 15,0 до 17,0% мас.; и

- концентрация буфера составляет от 0,1 до 30 мМ, например от 0,5 до 10 мМ или от 1,0 до 5 мМ.

14. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по любому из пп. 1-13, дополнительно содержащая:

- консервант; и/или

- солевой раствор.

15. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по пп. 1-14, отличающаяся тем, что рН композиции составляет от 4 до 6; и при этом pKa рН-индикатора составляет от 6 до 8; предпочтительно от 6,5 до 7,5.

16. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по п. 15, отличающаяся тем, что рН-индикатор выбран из группы, состоящей из бромтимолового синего, фенолового красного, антоцианинов и нейтрального красного.

17. Водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока по п. 15 или 16, отличающаяся тем, что указанная водная композиция для обнаружения просачивания панкреатического сока предназначена для применения для обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе, например с частичной панкреатэктомией.

18. Способ обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе, включающий:

- нанесение водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока по п. 15 или 16 на поджелудочную железу во время операции на поджелудочной железе; и

- обнаружение и локализацию возможного просачивания панкреатического сока на поверхности ткани поджелудочной железы по изменению цвета водной композиции для обнаружения просачивания панкреатического сока.

19. Способ обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе по п. 18, отличающийся тем, что водную композицию для обнаружения просачивания панкреатического сока наносят после ушивания остатка поджелудочной железы при дистальной панкреатэктомии посредством наложения лигатуры.

20. Способ обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе по п. 18 или 19, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает стадию:

- остановки обнаруженного просачивания.

21. Способ обнаружения просачивания панкреатического сока в комплексе с операцией на поджелудочной железе по п. 20, отличающийся тем, что просачивание останавливают посредством наложения лигатуры или с помощью степлера.