Компоненты на основе микроорганизма рода bacillus для ингибирования или замедления роста enterococcus spp. у животных
Владельцы патента RU 2789148:
ДЮПОН НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АПС (DK)
Изобретение относится к способу ингибирования или замедления роста представителей патогенных Enterococcus cecorum у домашней птицы. Предложенный способ включает введение животному эффективного количества по меньшей мере одного из штаммов микроорганизма для приема в пищу, выбранного из группы штамма 2084 Bacillus под № доступа NRRl B–50013 и штамма 15A–P4 Bacillus под № доступа ATCC 15 PTA–6507. Изобретение обеспечивает эффективное ингибирование или замедление роста представителей патогенных Enterococcus cecorum у домашней птицы. 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 табл., 3 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Область техники, к которой относится настоящее изобретение, связана с применением компонентов на основе Bacillus для ингибирования или замедления роста Enterococcus spp. у животных.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Enterococcus представляет собой крупный род молочнокислых бактерий, относящихся к типу Firmicutes. Enterococci являются грамположительными кокками, которые часто встречаются в виде пар (диплококки) или коротких цепей, и лишь по физическим характеристикам их затруднительно отличить от стрептококков. Enterococci являются факультативными анаэробными организмами, т. е. они способны к клеточному дыханию как в богатых кислородом, так и в бедных кислородом средах. Несмотря на то, что они не могут формировать споры, энтерококки являются выносливыми в отношении широкого спектра условий окружающей среды: экстремальных температур (10–45°C), pH (4,5–10,0) и высоких концентраций хлорида натрия. Представителей рода Enterococcus до 1984 года классифицировали как Streptococcus группы D, когда анализ геномной ДНК показал, что было бы целесообразно классифицировать их в отдельный род. Известно, что некоторые виды Enterococcus являются условно–патогенными микроорганизмами, если они попадают за пределы кишечника. Это имеет место в отношении E. avium, E. gallinarum и E. cecorum, причем E. cecorum важен с точки зрения экономических потерь, которые несут птицеводы в серийном производстве бройлерных кур.
Enterococcus cecorum является естественным обитателем кишечника птиц и других позвоночных, таких как лошади, крупный рогатый скот, свиньи, собаки, кошки, канарейки, голуби, индейки и мускусные утки. Его считают новым патогеном у домашней птицы и других видов птиц. В качестве основных патологических изменений у инфицированных кур были описаны некроз головки бедренной кости и спондилит.
Нарушения или поражения нормальной функции кишечника могут привести к перемещению Enterococcus cecorum, являющегося частью нормальной кишечной флоры, в позвоночник птиц. Инфекции позвоночника, вызванные Enterococcus cecorum, приводят к образованию очагов поражения в позвоночнике и суставах, хромоте и смертельному исходу при состоянии, известном как энтерококковый спондилолистез или "синдром взъерошенной спины".
Спондилит, который владельцы птицеводческих предприятий называют "синдромом взъерошенной спины", уже много лет известен в промышленном производстве и обычно наблюдается у тяжелых быстрорастущих птиц, особенно у самцов и бройлеров–производителей (Aziz, T. & Barnes, H.J. (2009). Spondylitis is emerging in broilers. World Poultry, 25, 19).
Высокопатогенные и устойчивые к антибиотикам штаммы Enterococcus cecorum продолжают наносить экономический ущерб промышленному разведению бройлерных кур. Таким образом, было показано, что стандартные гигиенические процедуры и антимикробная терапия на фермах являются недостаточными для борьбы со вспышками патогенных Enterococcus spp., особенно Enteroccocus cecorum.
Следовательно, необходима безопасная и эффективная альтернатива для осуществления контроля этого важного нового патогена.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном варианте осуществления раскрыт способ ингибирования или замедления роста всех или части представителей патогенных Enteroccocus spp. у животного, который предусматривает введение животному эффективного количества по меньшей мере одного компонента на основе микроорганизма рода Bacillus, выбранного из группы, состоящей из микробного препарата для приема в пищу на основе микроорганизма рода Bacillus, содержащего один или несколько бактериальных штаммов рода Bacillus, супернатанта, полученного из культуры Bacillus, или их комбинации.
Во втором варианте осуществления микробный препарат для приема в пищу на основе микроорганизма рода Bacillus выбран из группы, состоящей из Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis и Bacillus subtilis.
В третьем варианте осуществления микробный препарат для приема в пищу на основе микроорганизма рода Bacillus выбран из одного или нескольких следующих штаммов: штамма 2084 Bacillus под № доступа NRRl B–50013, штамма LSSAO1 Bacillus под № доступа NRRL B–50104 и штамма 15A–P4 Bacillus под № доступа ATCC PTA–6507.
В четвертом варианте осуществления животное может быть животным с однокамерным желудком, предпочтительно может быть домашней птицей.
В пятом варианте осуществления животное может быть животным с многокамерным желудком.
В шестом варианте осуществления по меньшей мере один компонент на основе микроорганизма рода Bacillus можно вводить непосредственно животному с кормом для животных, причем либо как содержащийся в корме, либо добавляя поверх корма, либо в форме жидкости, такой как вода.
В седьмом варианте осуществления компонент на основе микроорганизма рода Bacillus можно вводить животному в форме, выбранной из группы, состоящей из кормового продукта, композиции кормовой добавки, премикса или в такой жидкости, как вода.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1 показано среднее значение ингибирования в отношении штаммов E. cecorum, собранных в американском и европейском птицеводстве, с помощью штаммов Enviva® PRO.
На фигуре 2 приведены данные по кинетике роста штамма G84–68 E. cecorum с/без BS8 Bacillus.
На фигуре 3 приведены данные по кинетике роста штамма D45–08 E. cecorum с/без BS8 Bacillus.
На фигуре 4 приведен профиль ингибирования роста штамма 11976–2 Enterococcus cecorum, инкубированного с или без бесклеточного супернатанта (CFS) BS8 Bacillus, 15AP4 Bacillus или 2084 Bacillus.
На фигуре 5 показана противомикробная активность CFS 15AP4, BS8 и 2084 B. amyloliquefaciens подвида plantarum в отношении VTT E–97776T Enterococcus gallinarum, которая выражена как % ингибирования в конечной точке, точно соответствующей достижению кривой контрольного патогена OD 0,4.
На фигуре 6 показаны профили роста E 84197 Enterococcus avium, инкубированного с или без CFS штамма 2084 Bacillus.
На фигуре 7 показана противомикробная активность CFS DSM7T Bacillus amyloliquefaciens, DSM10T B. subtilis и DSM13T B. licheniformis в отношении 10 клинических изолятов Enterococcus cecorum, которая выражена как % ингибирования в конечной точке, точно соответствующей достижению кривой контрольного патогена OD 0,4.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Все цитируемые патенты, заявки на патенты и публикации включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В данном раскрытии используют ряд терминов и сокращений. Если четко не указано иное, то применяют следующие определения.
Подразумевается, что формы единственного числа элемента или компонента являются неограничивающими в отношении числа примеров (т. е. случаев) элемента или компонента. Поэтому единственное число следует понимать как включающее одно или по меньшей мере одно, а форма единственного числа для обозначения элемента или компонента также включает множественное число, за исключением случаев, когда явно подразумевается единственное число.
Термин "включающий" означает наличие установленных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, которые изложены в формуле изобретения, но так, чтобы он не исключал наличие или добавление одного или нескольких признаков, целых чисел, стадий, компонентов или их групп. Термин "включающий" подразумевают как включающий варианты осуществления, охватываемые терминами "по сути состоящий из" и "состоящий из". Подобным образом, термин "по сути состоящий из" подразумевают как включающий варианты осуществления, охватываемые термином "состоящий из".
Все диапазоны, при наличии таковых, являются включающими и комбинируемыми. Например, при упоминании диапазона "от 1 до 5" упомянутый диапазон следует рассматривать как включающий диапазоны "от 1 до 4", "от 1 до 3", "1–2", "1–2 и 4–5", "1–3 и 5" и т. п.
Используемый в данном документе в отношении числового значения термин "приблизительно" относится к диапазону +/– 0,5 от числового значения, если указанный термин иным образом конкретно не определен в контексте. Например, фраза "значение pH, составляющее приблизительно 6" относится к значениям pH от 5,5 до 6,5, если конкретно не определено иное значение pH.
Подразумевается, что каждая максимальная числовая граница, раскрываемая в настоящем описании, включает каждую нижнюю числовую границу, как если бы такие нижние числовые границы были бы явно приведены в данном документе. Каждая минимальная числовая граница, раскрываемая в настоящем описании, будет включать каждую верхнюю числовую границу, как если бы такие верхние числовые границы были бы явно приведены в настоящем документе. Каждый числовой диапазон, раскрываемый в настоящем описании, будет включать каждый более узкий числовой диапазон, который находится в пределах такого более широкого числового диапазона, как если бы все такие более узкие числовые диапазоны были явно приведены в настоящем документе.
Термины "Enterococcus" и "Enterococcus spp." используют взаимозаменяемо, и в контексте данного документа они обозначают большой род молочнокислых бактерий, принадлежащий к типу Firmicutes. Enterococci являются грамположительными кокками, которые часто встречаются в виде пар (диплококки) или коротких цепей, и лишь по физическим характеристикам их затруднительно отличить от стрептококков. Enterococci являются факультативными анаэробными организмами, т. е. они способны к клеточному дыханию как в богатых кислородом, так и в бедных кислородом средах. Несмотря на то, что они не могут формировать споры, энтерококки являются выносливыми в отношении широкого спектра условий окружающей среды: экстремальных температур (10–45°C), pH (4,5–10,0) и высоких концентраций хлорида натрия. Представителей рода Enterococcus до 1984 года классифицировали как Streptococcus группы D, когда анализ геномной ДНК показал, что было бы целесообразно классифицировать их в отдельный род.
Термины "Enterococcus cecorum" и "E. cecorum" применяются в данном документе взаимозаменяемо. E. cecorum является видом рода Enterococcus и является бактерией кишечного тракта многих домашних животных.
Термины "животное" и "субъект" применяются в данном документе взаимозаменяемо. Животное включает всех нежвачных (включая людей) и жвачных животных. В конкретном варианте осуществления животное представляет собой нежвачное животное, такое как лошадь и животное с однокамерным желудком. Примеры животных с однокамерным желудком включают без ограничения свиней и домашних свиней, таких как поросята, свиньи на доращивании, свиноматки; домашнюю птицу, такую как индейки, утки, куры, бройлерные цыплята, несушки; рыбу, такую как лосось, форель, тилапия, сомы и карпы; и ракообразных, таких как мелкие креветки и крупные креветки. В дополнительном варианте осуществления животное может быть животным с многокамерным животным, таким как жвачное животное, в том числе без ограничения крупный рогатый скот, телята, козы, овцы, жирафы, бизон, лось, вапити, яки, индийские буйволы, олени, верблюды, альпаки, ламы, антилопа, вилорог и нильгау.
Термин "жвачное животное", используемый в данном документе, относится к млекопитающему, которое способно получать питательные вещества из пищи растительного происхождения путем ферментирования ее в специализированном желудке перед перевариванием, главным образом, посредством воздействий микроорганизмов. Процесс как правило требует отрыгивания и повторного пережевывания ферментированного содержимого рубца (известного как жвачка). Процесс повторного пережевывания жвачки для дополнительного измельчения растительного материала и стимулирования переваривания называют жеванием жвачки. Ориентировочно 150 видов жвачных животных включают как одомашненные, так и дикие виды. Жвачные животные включают без ограничения крупный рогатый скот, коров, коз, овец, жирафов, яков, оленей, вапити, антилоп, буйволов и т. п.
Используемый в данном документе термин "КОЕ" обозначает "колониеобразующие единицы" и является мерой жизнеспособных клеток, где колония представляет совокупность клеток, полученную из одной клетки–предшественника.
Используемый в данном документе термин "микробный препарат для приема в пищу" ("DFM") представляет собой источник живых (жизнеспособных) встречающихся в природе микроорганизмов. DFM может содержать один или несколько таких встречающихся в природе микроорганизмов, таких как бактериальные штаммы. Категории DFM включают спорообразующие бактерии, такие как Bacillus и Clostridium, а также не образующие спор бактерии, такие как молочнокислые бактерии, дрожжи и грибы. Таким образом, термин DFM охватывает одно или несколько из следующего: бактерии для приема в пищу, дрожжи для приема в пищу, дрожжи или грибы для приема в пищу и их комбинации.
Bacillus и Clostridium представляют собой уникальные грамположительные палочки, которые образуют споры. Эти споры очень стабильны и могут выдерживать такие условия окружающей среды, как тепло, влагу и определенный диапазон рН. Эти споры прорастают в активные вегетативные клетки при проглатывании животным и могут быть использованы в молотых и гранулированных рационах. Молочнокислые бактерии представляют собой грамположительные кокки, продуцирующие молочную кислоту, которые являются антагонистами патогенных организмов. Поскольку молочнокислые бактерии, по–видимому, до некоторой степени являются чувствительными к нагреванию, их не используют в гранулированных рационах в таком виде, и они должны быть защищены (иметь покрытие). Типы молочнокислых бактерий включают Bifidobacterium, Lactobacillus и Enterococcus.
Термин "микробный препарат для приема в пищу на основе микроорганизма рода Bacillus" означает микробный препарат для приема в пищу, содержащий один или несколько бактериальных штаммов рода Bacillus.
Применяемый в данном документе термин "компонент на основе микроорганизма рода Bacillus" относится к (i) микробному препарату для приема в пищу на основе микроорганизма рода Bacillus, содержащему один или несколько бактериальных штаммов рода Bacillus, (ii) супернатанту, полученному из культуры Bacillus, или (iii) комбинации (i) и (ii).
"Корм" и "пищевой продукт" соответственно означают любой натуральный или искусственный рацион, пищу или подобное или компоненты такой пищи, предназначенные или пригодные для употребления в пищу, принятия внутрь, переваривания животным, отличным от человека, и человеком соответственно.
Используемый в данном документе термин "пищевой продукт" применяется в широком смысле и охватывает пищевой продукт и продукты питания для людей, а также пищевой продукт для животных, отличных от человека (т. е. корм).
Термин "корм" используется в отношении продуктов, которыми кормят животных при выращивании сельскохозяйственных животных. Термины "корм" и "корм для животных" используются взаимозаменяемо. В предпочтительном варианте осуществления пищевой продукт или корм подходит для потребления нежвачными и жвачными животными.
Используемый в данном документе термин "пробиотик" определяет живые микроорганизмы (в том числе, например, бактерии или дрожжи), которые, например, при приеме внутрь или местном применении в достаточных количествах благоприятно воздействуют на организм–хозяин, т. е. обеспечивая одно или несколько очевидных преимуществ для здоровья организма–хозяина. Пробиотики могут улучшать баланс микробиоты на поверхностях одной или нескольких слизистых оболочек. Например, поверхность слизистой оболочки может находиться в кишечнике, мочевыводящих путях, дыхательных путях или на коже. Используемый в данном документе термин "пробиотик" также охватывает живые микроорганизмы, которые могут стимулировать значимые ветви иммунной системы и в то же время уменьшать воспалительные реакции на поверхности слизистой оболочки, например, кишечника. Несмотря на то, что не существует верхних или нижних пределов для употребления пробиотиков, было высказано предположение о том, что по меньшей мере 106–1012, предпочтительно по меньшей мере 106–1010, предпочтительно 108–109 КОЕ в виде суточной дозы будут эффективны для достижения благоприятных эффектов в отношении здоровья субъекта.
Термин "пребиотик" обозначает неперевариваемый ингредиент пищевого продукта, который благоприятно воздействует на хозяина путем избирательного стимулирования роста и/или активности одной или ограниченного числа полезных разновидностей бактерий.
Используемый в данном документе термин "патоген" означает любого возбудителя заболевания. Такие возбудители могут включать без ограничения бактериальных, вирусных, грибковых возбудителей и т. п.
Термины "происходящий из" и "полученный из" относятся не только к белку, продуцируемому или способному продуцироваться штаммом рассматриваемого организма, но также к белку, кодируемому последовательностью ДНК, выделенной из такого штамма, и продуцируемому в организме–хозяине, содержащем такую последовательность ДНК. Кроме того, данный термин относится к белку, который кодируется последовательностью ДНК синтетического происхождения и/или последовательностью ДНК, происходящей от кДНК, и который имеет отличительные характеристики рассматриваемого белка.
Термин "эффективное количество" означает достаточное количество указанного компонента.
Как отмечалось выше, Enteroccocus cecorum считают новым патогеном в птицеводстве, и он может приводить к значительным потерям в стадах бройлеров и бройлеров–производителей. E. cecorum все чаще признают в качестве возбудителя энтерококкового спондилита, ранее называемого энтерококковым остеоартритом позвоночника (EVOA) у кур. Вспышки заболевания диагностировались в основном в стадах бройлерных кур, выращенных в условиях системы интенсивного производства. Клинически пораженные птицы страдали двигательными проблемами из–за компрессии спинного мозга в грудных позвонках в результате вызванного E. cecorum остеомиелита и из–за некроза головки бедренной кости. Вспышки заболевания могут привести к высокой распространенности заболевания, смертности, выбраковке, отбраковке тушек и могут привести к серьезным экономическим потерям за короткий промежуток времени. Более того, в отношении изолятов E. cecorum была не только продемонстрирована повышенная патогенность, но и повышенная устойчивость к противомикробным средствам.
Таким образом, описываемый в данном документе способ предлагает альтернативу применению антибиотиков, поскольку устойчивость к противомикробным средствам все больше становится основной глобальной угрозой здоровью.
В одном варианте осуществления в данном документе описан способ ингибирования или замедления роста всех или части представителей патогенных Enteroccocus spp. у животного, который предусматривает введение животному эффективного количества по меньшей мере одного компонента на основе микроорганизма рода Bacillus, выбранного из группы, состоящей из микробного препарата для приема в пищу на основе микроорганизма рода Bacillus, содержащего один или несколько бактериальных штаммов рода Bacillus, супернатанта, полученного из культуры Bacillus, или их комбинации.
DFM, описанные в данном документе, содержат по меньшей мере один жизнеспособный микроорганизм, такой как жизнеспособный бактериальный штамм, или жизнеспособные дрожжи, или жизнеспособный гриб. Предпочтительно DFM содержит по меньшей мере одну жизнеспособную бактерию.
В одном варианте осуществления DFM может представлять собой спорообразующий бактериальный штамм, и, следовательно, термин DFM может подразумевать, что DFM состоит из спор или содержит споры, например, бактериальные споры. Таким образом, используемый в данном документе термин "жизнеспособный микроорганизм" может включать споры микроорганизмов, такие как эндоспоры или конидии. В качестве альтернативы, DFM в композиции кормовой добавки, описанной в данном документе, может не состоять из или может не содержать споры микроорганизмов, например, эндоспоры или конидии.
Микроорганизм может представлять собой встречающийся в природе микроорганизм или он может представлять собой трансформированный микроорганизм. Предпочтительно микроорганизм представляет собой комбинацию по меньшей мере трех подходящих микроорганизмов, таких как бактерии, которые можно выделять.
Описанный в данном документе DFM может содержать микроорганизмы из одного или нескольких следующих родов: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium, Paenibacillus и Megasphaera и их комбинации.
Предпочтительно DFM содержит один или несколько бактериальных штаммов, выбранных из следующих Bacillus spp: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus licheniformis.
В контексте данного документа род "Bacillus" включает все виды в пределах рода "Bacillus", известные специалистам в данной области техники, в том числе без ограничения B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. gibsonii, B. pumilis и B. thuringiensis. Понятно, что род Bacillus продолжает подвергаться таксономической реорганизации. Таким образом, предполагается, что род включает виды, которые были переклассифицированы, в том числе без ограничения такие организмы, как Bacillus stearothermophilus, который в настоящее время называется "Geobacillus stearothermophilus", или Bacillus polymyxa, которым теперь является "Paenibacillus polymyxa". Выработка резистентных эндоспор в стрессовых условиях окружающей среды считается определяющим признаком рода Bacillus, хотя данная характеристика также применима к недавно названным Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus, и Virgibacillus.
Предпочтительно DFM может представлять собой один или несколько из бактериальных штаммов, встречающихся в Enviva® PRO, который коммерчески доступен от Danisco A/S. Enviva® PRO представляет собой комбинацию из штамма 2084 Bacillus под № доступа NRRl B–50013, штамма LSSAO1 Bacillus под № доступа NRRL B–50104 и штамма 15A–P4 Bacillus под № доступа ATCC PTA–6507 (как раскрыто в US 7754469 B, включенном в данный документ посредством ссылки).
В другом аспекте DFM можно дополнительно комбинировать со следующими Lactococcus spp: Lactococcus cremoris и Lactococcus lactis и их комбинациями.
DFM можно дополнительно комбинировать со следующими Lactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii и Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii , Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum,Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus zeae и комбинациями любых из них.
В еще одном аспекте DFM можно дополнительно комбинировать со следующими Bifidobacteria spp: Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis, и Bifidobacterium angulatum, и любыми их комбинациями.
Можно упомянуть бактерии следующих видов: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilis, Enterococcus, Enterococcus spp., и Pediococcus spp, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Megasphaera elsdenii, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius, Propionibacteria sp и их комбинации.
Описанный в данном документе микробный препарат для приема в пищу, содержащий один или несколько бактериальных штаммов, может содержать один тип (род, вид и штамм) или может содержать смесь родов, видов и/или штаммов. Предпочтительно описываемый в данном документе микробный препарат для приема в пищу содержит один или несколько бактериальных штаммов из рода Bacillus.
В подходящем случае композицию по настоящему раскрытию можно комбинировать с одним или несколькими из продуктов или микроорганизмов, содержащихся в таких продуктах, которые раскрыты в WO2012110778 и обобщенны следующим образом:
штамм 2084 Bacillus subtilis под № доступа NRRl B–50013, штамм LSSAO1 Bacillus subtilis под № доступа NRRL B–50104 и штамм 15A–P4 Bacillus subtilis под № доступа ATCC PTA–6507 (от Enviva® PRO® (ранее известный как Avicorr®); штамм C3102 Bacillus subtilis (из Calsporin®); штамм PB6 Bacillus subtilis (из Clostat®); Bacillus pumilis (8G–134); NCIMB 10415 Enterococcus (SF68) (из Cylactin®); штамм C3102 Bacillus subtilis (из Gallipro® и GalliproMax®); Bacillus licheniformis (из Gallipro®Tect®); Enterococcus faeciul, Lactobacillus salivarius, L. reuteri, Bifidobacterium animalis и Pediococcus acidilactici (из Poultry Star®); Lactobacillus, Bifidobacterium и/или Enterococcus из Protexin®); штамм QST 713 Bacillus subtilis (из Proflora®); CECT–5940 Bacillus amyloliquefaciens (из Ecobiol® и Ecobiol® Plus); SF68 Enterococcus faecium (из Fortiflora®); Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis (из BioPlus2B®); молочнокислые бактерии 7 Enterococcus faecium (из Lactiferm®); штамм Bacillus (из CSI®); Saccharomyces cerevisiae (из Yea–Sacc®); Enterococcus (из Biomin IMB52®); Pediococcus acidilactici, Enterococcus, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius (из Biomin C5®); Lactobacillus farciminis (из Biacton®); Enterococcus (из Oralin E1707®); Enterococcus (2 штамма), DSM 1103 Lactococcus lactis (из Probios–pioneer PDFM®); Lactobacillus rhamnosus и Lactobacillus farciminis (из Sorbiflore®); Bacillus subtilis (из Animavit®); Enterococcus (из Bonvital®); Saccharomyces cerevisiae (из Levucell SB 20®); Saccharomyces cerevisiae (из Levucell SC 0 и SC10® ME); Pediococcus acidilacti (из Bactocell); Saccharomyces cerevisiae (из ActiSaf® (ране BioSaf®)); NCYC Sc47 Saccharomyces cerevisiae (из Actisaf® SC47); Clostridium butyricum (из Miya–Gold®); Enterococcus (из Fecinor and Fecinor Plus®); NCYC R–625 Saccharomyces cerevisiae (из InteSwine®); Saccharomyces cerevisia (из BioSprint®); Enterococcus и Lactobacillus rhamnosus (из Provita®); Bacillus subtilis и Aspergillus oryzae (из PepSoyGen–C®); Bacillus cereus (из Toyocerin®); NCIMB 40112/CNCM I–1012 Bacillus cereus var. toyoi (из TOYOCERIN®), Lactobacillus plantarum (из LactoPlan®) или другие DFM, такие как Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis (из BioPlus® YC) и Bacillus subtilis (из GalliPro®).
Также возможно комбинировать DFM, описанный в данном документе, с дрожжами из родов и видов: Debaryomyces hansenii, Hanseniaspora uvarum, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia angusta, Pichia anomala, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus (синоним Saccharomyces carlsbergensis) и нитчатыми грибами из рода Aspergillus.
Предпочтительно описанный в данном документе DFM содержит микроорганизмы, которые в целом признаны безопасными (GRAS) и предпочтительно одобрены в отношении статуса GRAS, и/или им был присвоен статус "Квалифицированная презумпция безопасности" Европейским управлением по безопасности пищевых продуктов (EFSA).
В некоторых вариантах осуществления важно, чтобы DFM был устойчив к нагреванию, т. е. был термостойким. Это особенно актуально, если корм сформирован в гранулы. Таким образом, DFM может представлять собой термостойкий микроорганизм, такой как термостойкие бактерии, например спорообразующие бактерии, включая, например, Bacillus spp. Бациллы способны формировать стабильные эндоспоры при неблагоприятных для роста условиях и являются крайне устойчивыми к воздействию высоких температур, pH, влажности и дезинфицирующих средств. Если бактерия/DFM не обладает способностью образовывать споры, то она должна быть защищена для выживания при обработке корма, как описано ниже.
DFM на основе Bacillus, который описан в данном документе, может ингибировать или замедлять рост всех или части Enterococcus spp., например E. cecorum. Другими словами, DFM на основе Bacillus, который описан в данном документе, является антипатогенным. Используемый в данном документе термин "антипатогенный" означает, что DFM противодействует эффекту (отрицательному эффекту) патогена, в данном случае патогенным Enterococcus spp., например E. cecorum.
Например, можно применять следующий анализ, называемый "Анализ DFM", для определения пригодности микроорганизма выступать в качестве DFM или, в данном варианте осуществления, DFM на основе Bacillus, который описан в данном документе. Такой DFM–анализ можно проводить следующим образом.
Полностью выращенную культуру штамма Bacillus центрифугировали и стерилизовали фильтрацией (0,2 мкм) с целью получения стерильного бесклеточного супернатанта (CFS). Каждую лунку 96–луночного микротитровального планшета заполняют 180 мкл суспензии (1%) патогена/BHI (или соответствующей реды для роста). Лунки с положительным контролем заполняют дополнительными 20 мкл той же самой бульонной питательной среды, тогда как тестируемые лунки заполняют 20 мкл тестируемого CFS. Отрицательные контроли содержат только бульонную питательную среду или питательную среду с добавлением 20 мкл CFS. Затем 96–луночный микротитровальный планшет инкубируют в аэробных условиях при 37°C в течение 14 часов на стационарном устройстве Flex для регистрации поглощающей способности, при этом данные передают непосредственно на компьютер для анализа с целью построения кривой кинетики роста. Измерения проводили каждые 15 минут. Результаты представляют в виде % ингибирования, сравнивая контроль при OD=0,4 (только патоген) и обработанный образец (патоген, инкубированный с CFS Bacillus). Задержку роста рассчитывают как разницу во времени до достижения OD 0,4 между контрольными лунками и лунками с добавлением CFS. Все анализы проводят в двух повторностях. Разделение средних проводили с помощью HSD Тьюки в JMP 11; различия считали достоверными при P<0,05.
Антипатогенные DFM включают одну или несколько из следующих бактерий и описаны в WO2013029013:
штамм 3BP5 Bacillus subtilis под № доступа NRRL B–50510,
штамм 918 Bacillus subtilis под № доступа ATCC NRRL B–50508 и
штамм 1013 Bacillus subtilis под № доступа ATCC NRRL B–50509.
Компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, который описан в данном документе, можно получать в виде культуры(культур) и носителя(носителей) (если применимо) и можно вносить в ленточную или лопастную мешалку и смешивать в течение приблизительно 15 минут, однако время можно увеличивать или уменьшать. Компоненты смешивают таким образом, что в результате получают однородную смесь культур и носителей. Конечный продукт предпочтительно представляет собой сухой сыпучий порошок. Соответственно, компонент на основе микроорганизма рода Bacillus может предусматривать микробный препарат для приема в пищу на основе микроорганизма рода Bacillus, содержащий один или несколько бактериальных штаммов рода Bacillus, супернатант, полученный из культуры Bacillus, или комбинацию. Такой компонент на основе микроорганизма рода Bacillus затем можно добавлять в корм для животных или кормовой премикс. Его можно добавлять поверх корма для животных ("засыпка"), или его можно добавлять в жидкость, такую как питьевая вода животного.
Включение отдельных штаммов в DFM на основе Bacillus, который описан в данном документе, можно производить с соблюдением пропорций в диапазоне от 1% до 99% и предпочтительно от 25% до 75%.
Подходящие дозы, описываемого в данном документе компонента на основе микроорганизма рода Bacillus в корме для животных могут варьировать от приблизительно 1×103 КОЕ/г корма до приблизительно 1×1010 КОЕ/г корма, в подходящем случае от приблизительно 1×104 КОЕ/г корма до приблизительно 1×108 КОЕ/г корма, в подходящем случае от приблизительно 7,5×104 КОЕ/г корма до приблизительно 1×107 КОЕ/г корма.
Средний специалист в данной области безо всяких сложностей будет имеет представление о конкретных видах и/или штаммах микроорганизмов из родов, описанных в данном документе, которые применяются в пищевой и/или сельскохозяйственной промышленностях, и которые в целом считаются подходящими для употребления животными. Корма для животных могут включать растительный материал, такой как кукуруза, пшеница, сорго, соевые бобы, канола, подсолнечник или смеси любого из этих растительных материалов, или источники растительных белков для домашней птицы, свиней, жвачных животных, аквакультуры и домашних животных.
Термины "корм для животных", "корм" и "кормовой продукт" используются взаимозаменяемо и могут включать один или несколько кормовых материалов, выбранных из группы, включающей a) зерновые культуры, такие как мелкозерновые (например, пшеницу, ячмень, рожь, овес и их комбинации) и/или крупнозерновые, такие как маис или сорго; b) отходы от переработки зерновых культур, такие как кукурузная глютеновая мука, сушеная барда с растворимыми веществами (DDGS) (в частности сушеная барда с растворимыми веществами на основе кукурузы (cDDGS)), пшеничные отруби, пшеничная крупка, пшеничные мелкие отруби, рисовые отруби, рисовая шелуха, овсяная шелуха, ядро кокосового ореха и цитрусовый жом; c) белок, полученный из источников, таких как соя, подсолнечник, арахис, люпин, виды гороха, конские бобы, хлопчатник, канола, рыбная мука, сухой белок плазмы крови, мясо–костная мука, картофельный белок, сыворотка, копра, кунжут; d) масла и жиры, полученные из растительных и животных источников, и/или e) минералы и витамины.
В случае применения в качестве корма или при получении корма, такого как функциональный корм, компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, описанный в данном документе, можно применять в сочетании с одним или несколькими из приемлемого в пищевом отношении носителя, приемлемого в пищевом отношении разбавителя, приемлемого в пищевом отношении наполнителя, приемлемого в пищевом отношении вспомогательного вещества, активного в пищевом отношении ингредиента. Например, можно упомянуть по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из белка, пептида, сахарозы, лактозы, сорбита, глицерина, пропиленгликоля, хлорида натрия, сульфата натрия, ацетата натрия, цитрата натрия, формиата натрия, сорбата натрия, хлорида калия, сульфата калия, ацетата калия, цитрата калия, формиата калия, ацетата калия, сорбата калия, хлорида магния, сульфата магния, ацетата магния, цитрата магния, формиата магния, сорбата магния, метабисульфита натрия, метилпарабена и пропилпарабена.
В предпочтительном варианте осуществления компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, описанный в данном документе, можно смешивать с кормовым компонентом с образованием кормового продукта. Используемый в данном документе термин "кормовой компонент" означает весь кормовой продукт или его часть. Часть кормового продукта может означать один составляющий компонент кормового продукта или более чем один составляющий компонент кормового продукта, например 2, или 3, или 4, или более. В одном варианте осуществления термин "кормовой компонент" охватывает премикс или составляющие компоненты премикса. Предпочтительно корм может представлять собой фураж или его премикс, комбикорм или его премикс. Композицию кормовой добавки, содержащую компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, описанный в данном документе, можно смешивать с комбикормом или премиксом комбикорма или фуражом, компонентом фуража или премиксом фуража.
Термин фураж, используемый в данном документе, означает любую пищу, которая предоставляется животному (в отличие от пищи, которую животное добывает самостоятельно). Фураж охватывает растения, которые были срезаны.
Термин фураж включает сено, солому, силос, прессованные и гранулированные корма, масла и смешанные рационы, а также проросшие зерновые и бобовые.
Кормовое вещество можно получить из одного или нескольких из растений, выбранных из: люцерны (люцерны посевной), ячменя, ледвенца рогатого, представителей рода капусты, капусты огородной сорта Chau moellier, кормовой капусты, семени рапса (канолы), репы (брюквы), турнепса, клевера, гибридного клевера, красного клевера, подземного клевера, белого клевера, травы, травы райграса французского высокого, овсяницы, бермудской травы, костра, трехзубки, видов мятлика (из смешанных в природе пастбищных трав), ежи сборной, райграса многолетнего, тимофеевки луговой, кукурузы (маиса), проса, овса, сорго, соевых бобов, деревьев (всходов подстриженных деревьев для сена из деревьев), пшеницы и бобовых.
Термин "комбикорм" означает промышленный корм в форме муки, гранулы, орешков, жмыха или крошки. Комбикорма можно смешивать с использованием различного сырья и добавок. Эти смеси составляют в соответствии с конкретными требованиями для целевого животного.
Комбикорма могут быть полными кормами, которые обеспечивают все ежедневно необходимые питательные вещества, концентратами, которые обеспечивают часть рациона (белковую, энергетическую), или добавками, которые обеспечивают только дополнительные питательные микроэлементы, такие как минералы и витамины.
Основными ингредиентами, используемыми в комбикорме, являются кормовые зерновые, которые включают кукурузу, соевые бобы, сорго, овес и ячмень.
В подходящем случае премикс, как обозначается в данном документе, может быть композицией, состоящей из микроингредиентов, таких как витамины, минералы, химические консерванты, антибиотики, продукты ферментации и другие необходимые ингредиенты. Премиксами обычно являются композиции, подходящие для смешивания c промышленными рационами.
Любой кормовой продукт, описанный в данном документе, может содержать один или несколько кормовых материалов, выбранных из группы, состоящей из a) злаков, таких как мелкозерновые (например, пшеница, ячмень, рожь, овес и их комбинации) и/или крупнозерновые, такие как маис или сорго; b) отходов от переработки зерновых, таких как кукурузная глютеновая мука, сушеная барда с растворимыми веществами (DDGS), пшеничные отруби, пшеничная крупка, пшеничные мелкие отруби, рисовые отруби, рисовая шелуха, овсяная шелуха, ядро кокосового ореха и цитрусовый жом; c) белка, полученного из таких источников, как соя, подсолнечник, арахис, люпин, виды гороха, конские бобы, хлопчатник, канола, рыбная мука, сухой белок плазмы, мясо–костная мука, картофельный белок, молочная сыворотка, копра, кунжут; d) масел и жиров, полученных из растительных и животных источников; e) минералов и витаминов.
Более того, такой кормовой продукт может содержать по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% по весу кукурузной и соевой муки, или кукурузы и необезжиренной сои, или пшеничной муки, или кормовой муки из жмыха семян подсолнечника.
Дополнительно или в качестве альтернативы кормовой продукт может содержать по меньшей мере один кормовой материал с высоким содержанием клетчатки и/или по меньшей мере один продукт переработки по меньшей мере одного кормового материала c высоким содержанием клетчатки для получения кормового продукта с высоким содержанием клетчатки. Примеры кормовых материалов с высоким содержанием клетчатки включают пшеницу, ячмень, рожь, овес, отходы от переработки зерновых, такие как кукурузная глютеновая мука, сушеная барда с растворимыми веществам (DDGS), пшеничные отруби, пшеничная крупка, пшеничные мелкие отруби, рисовые отруби, рисовая шелуха, овсяная шелуха, ядро кокосового ореха и цитрусовый жом. Некоторые источники белка также можно рассматривать как источники с высоким содержанием клетчатки: белок, полученный из таких источников, как подсолнечник, люпин, конские бобы и хлопчатник.
Как описано в данном документе, корм может представлять собой одно или несколько из следующего: комбикорм и премикс, включая гранулы, орешки или жмых (для крупного рогатого скота); сельскохозяйственная культура или остатки сельскохозяйственных культур: кукуруза, соевые бобы, сорго, овес, ячмень, кукурузная солома с початками, копра, солома, мякина, отходы сахарной свеклы; рыбная мука; свежесрезанная трава и другие кормовые растения; мясо–костная мука; меласса; масличный жмых и прессованный жмых; олигосахариды; консервированные кормовые растения: сено и силос; водоросли; семена и зерна, цельные или подготовленные дроблением, измельчением и т. д.; проросшие зерновые и бобовые; экстракт дрожжей.
Используемый в данном документе термин корм также охватывает в некоторых вариантах осуществления корм для домашних животных. Корм для домашних животных представляет собой материал растительного или животного происхождения, предназначенный для потребления домашними животными, такой как корм для собак или корм для кошек. Корм для домашних животных, такой как корм для собак и кошек, может быть либо в сухой форме, такой как гранулированный корм для собак, либо во влажной консервированной форме. Корм для кошек может содержать аминокислоту таурин.
Термин корм может также охватывать в некоторых вариантах осуществления корм для рыб. Корм для рыб в норме содержит питательные макроэлементы, микроэлементы и витамины, необходимые для поддержания здоровья рыб, содержащихся в неволе. Корм для рыб может быть в форме хлопьевидной частицы, гранулы или таблетки. Гранулированные формы, некоторые из которых быстро тонут в воде, часто используют для более крупных видов рыбы или видов, питающихся на дне. Некоторые корма для рыб также содержат добавки, такие как бета–каротин или половые гормоны для искусственного усиления окраски декоративных рыб.
Термин "корм" также охватывает корм для птиц, включая корм, применяемый как в кормушках для птиц, так и для кормления домашних птиц. Обычно корм для птиц содержит разные семена, но также может включать нутряное сало (говяжий или бараний жир).
Используемый в данном документе термин "приведенный в контакт" относится к опосредованному или непосредственному применению композиции кормовой добавки по отношению к продукту (например, корму). Примеры способов применения, которые можно использовать, включают без ограничения обработку продукта в материалом, содержащим композицию кормовой добавки, непосредственное применение путем смешивания композиции кормовой добавки с продуктом, нанесение распылением композиции кормовой добавки на поверхность продукта или погружение продукта в препарат на основе композиции кормовой добавки.
Компонент на основе микроорганизма рода Bacillus предпочтительно можно смешать с продуктом (например, кормовым продуктом). В качестве альтернативы его можно включать в эмульсию или сырьевые ингредиенты кормового продукта.
Для некоторых путей применения важно, чтобы он был доступен на поверхности или для поверхности продукта, подлежащего воздействию/обработке.
Компонент на основе микроорганизма рода Bacillus можно применять для вкрапления, покрытия и/или пропитывания продукта (например, кормового продукта или сырьевых ингредиентов кормового продукта) контролируемым количеством компонента на основе микроорганизма рода Bacillus.
DFM, содержащий по меньшей мере один бактериальный штамм, можно добавлять в подходящих концентрациях, например в концентрациях в конечном кормовом продукте, которые обеспечивают суточную дозу от приблизительно 2×103 КОЕ/г корма до приблизительно 2×1011 КОЕ/г корма, в подходящем случае от приблизительно 2×106 до приблизительно 1×1010, в подходящем случае от приблизительно 3,75×107 КОЕ/г корма до приблизительно 1×1010 КОЕ/г корма.
Предпочтительно компонент на основе микроорганизма рода Bacillus будет термостабильным в отношении термической обработки до приблизительно 70°C; до приблизительно 85°C или до приблизительно 95°C. Термическую обработку можно проводить в течение от приблизительно 30 секунд до нескольких минут. Термин "термостабильный" означает, что по меньшей мере приблизительно 50% компонента на основе микроорганизма рода Bacillus, который присутствовал/был активен перед нагреванием до определенной температуры, по–прежнему присутствуют/являются активными после его охлаждения до комнатной температуры. В особенно предпочтительном варианте осуществления компонент на основе микроорганизма рода Bacillus гомогенизируют для получения порошка.
В качестве альтернативы компонент на основе микроорганизма рода Bacillus составляют в виде гранул, как описано в WO2007/044968 (называемых гранулами TPT), включенной в данный документ посредством ссылки.
В другом предпочтительном варианте осуществления, когда композицию кормовой добавки составляют в виде гранул, эти гранулы содержат гидратированную барьерную соль, покрывающую белковое ядро. Преимуществом такого солевого покрытия является улучшенная термоустойчивость, улучшенная стабильность при хранении и защита от других кормовых добавок, в противном случае неблагоприятно воздействующих на по меньшей мере одну протеазу и/или DFM, содержащий один или несколько бактериальных штаммов. Предпочтительно соль, используемая для солевого покрытия, характеризуется активностью воды, составляющей более 0,25, или постоянной влажностью более 60% при 20°C. Предпочтительно солевое покрытие содержит Na2SO4.
Корм, содержащий компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, можно получать с применением способа гранулирования корма. Необязательно стадия гранулирования может включать обработку паром или стадию кондиционирования перед формированием гранул. Смесь, содержащую порошок, можно поместить в кондиционирующее устройство, например смеситель со впрыском пара. Смесь нагревают в кондиционирующем устройстве до определенной температуры, такой как 60–100°С, причем, как правило, температуры составляют 70°С, 80°С, 85°С, 90°С или 95°С. Время пребывания можно варьировать от секунд до минут и даже часов. Например, 5 секунд, 10 секунд, 15 секунд, 30 секунд, 1 минута, 2 минуты, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут и 1 час.
Что касается гранулы, по меньшей мере одно покрытие может содержать увлажняющий гидратирующий материал, который составляет по меньшей мере 55% вес/вес гранулы; и/или по меньшей мере одно покрытие может содержать два покрытия. Эти два покрытия могут представлять собой увлажняющее гидратирующее покрытие и влагоизолирующее покрытие. В некоторых вариантах осуществления увлажняющее гидратирующее покрытие может составлять от 25% до 60% вес/вес гранулы, а влагоизолирующее покрытие может составлять от 2% до 15% вес/вес гранулы. Увлажняющее гидратирующее покрытие может быть выбрано из неорганических солей, сахарозы, крахмала и мальтодекстрина, а влагоизолирующее покрытие может быть выбрано из полимеров, смол, молочной сыворотки и крахмала.
Гранула может быть получена с помощью способа гранулирования корма, и при этом способ предварительной обработки корма можно проводить при температуре от 70°C до 95°C в течение нескольких минут, например при температуре от 85°C до 95°C.
Компонент на основе микроорганизма рода Bacillus может быть составлен в виде гранулы для корма для животных, содержащей: ядро; активное средство, при этом активное средство гранулы сохраняет по меньшей мере 80% активности после хранения и после осуществления способа гранулирования с паровым нагревом, где гранула представляет собой ингредиент; влагоизолирующее покрытие и увлажняющее гидратирующее покрытие, которое составляет по меньшей мере 25% вес/вес гранулы, при этом гранула характеризуется активностью воды менее 0,5 до осуществления способа гранулирования с паровым нагревом.
Гранула может иметь влагоизолирующее покрытие, выбранное из полимеров и смол, а увлажняющий гидратирующий материал может представлять собой неорганическую соль. Увлажняющее гидратирующее покрытие может составлять от 25% до 45% вес/вес гранулы, а влагоизолирующее покрытие может составлять от 2% до 10% вес/вес гранулы.
Гранула может быть получена с помощью способа гранулирования с паровым нагревом, который может проводиться при 85°C–95°C в течение нескольких минут.
В качестве альтернативы композиция находится в виде жидкого состава, подходящего для потребления, при этом предпочтительно такая потребляемая жидкость содержит одно или несколько из следующего: буфер, соль, сорбит и/или глицерин.
Кроме того, композиция кормовой добавки может быть составлена путем нанесения, например распыления, компонента на основе микроорганизма рода Bacillus на субстрат–носитель, такой как, например, молотая пшеница.
В одном варианте осуществления такая композиция кормовой добавки, содержащая компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, описанный в данном документе, может быть составлена в виде премикса. Только в качестве примера, премикс может содержать один или несколько кормовых компонентов, таких как один или несколько минералов и/или один или несколько витаминов.
В качестве альтернативы композиция находится в виде жидкого состава, подходящего для потребления, при этом предпочтительно такая потребляемая жидкость содержит одно или несколько из следующего: буфер, соль, сорбит и/или глицерин.
Кроме того, композиция кормовой добавки может быть составлена путем нанесения, например распыления, компонента на основе микроорганизма рода Bacillus на субстрат–носитель, такой как, например, молотая пшеница.
В одном варианте осуществления такой компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, описанный в данном документе, может быть составлен в виде премикса. Только в качестве примера, премикс может содержать один или несколько кормовых компонентов, таких как один или несколько минералов и/или один или несколько витаминов.
Будет понятно, что раскрытый в данном документе компонент на основе микроорганизма рода Bacillus является подходящим для добавления в любой соответствующий кормовой материал.
Используемый в данном документе термин кормовой материал означает основной кормовой материал для потребления животным. Далее будет понятно, что он может содержать, например, по меньшей мере одну или несколько разновидностей необработанных зерновых, и/или обработанный растительный материал, и/или материал животного происхождения, такой как соевая мука или костная мука.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что разные животные нуждаются в разных кормовых продуктах, и даже одному и тому же животному могут требоваться различные кормовые продукты в зависимости от цели, ради которой выращивают животное.
Предпочтительно кормовой продукт может содержать кормовые материалы, включающие маис или кукурузу, пшеницу, ячмень, тритикале, рожь, рис, тапиоку, сорго и/или любые продукты переработки, а также богатые белком компоненты, такие как соевая мука, мука из рапсового семени, мука из канолы, мука из семян хлопчатника, мука из семян подсолнечника, мука из продуктов переработки животных, и их смеси. Более предпочтительно кормовой продукт может содержать животные жиры и/или растительные масла.
Необязательно кормовой продукт может также содержать дополнительные минералы, такие как, например, кальций, и/или дополнительные витамины. Предпочтительно кормовой продукт представляет собой смесь кукурузной и соевой муки.
В другом аспекте представлен способ получения кормового продукта. Кормовой продукт обычно получают в кормодробилках, в которых сырьевые материалы сначала измельчают до подходящего размера частиц, а затем смешивают с соответствующими добавками. Затем кормовой продукт может быть получен в виде кашицы или гранул; причем в отношении последних, как правило, предусматривается способ, при котором температуру повышают до заданного уровня, а затем корм пропускают через матрицу с получением гранул конкретного размера. Гранулам позволяют остыть. Впоследствии можно добавлять жидкие добавки, такие как жир и фермент. Получение кормового продукта также может включать дополнительную стадию, которая включает экструзию или разбухание перед осуществлением гранулирования, в частности с помощью подходящих методик, которые могут включать по меньшей мере применение пара.
Кормовой продукт может являться кормовым продуктом для животного с однокамерным желудком, такого как домашняя птица (например, бройлер, несушка, бройлеры–производители, индейка, утка, гуси, водоплавающая птица), свинья (все возрастные категории), домашний питомец (например, собаки, кошки) или рыба, предпочтительно кормовой продукт предназначен для домашней птицы.
Компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, описанный в данном документе, можно помещать поверх корма для животных, т. е. засыпать. В качестве альтернативы компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, описанный в данном документе, можно добавлять в жидкость, такую как питьевая вода животного.
Используемый в данном документе термин "приведенный в контакт" относится к опосредованному или непосредственному применению компонента на основе микроорганизма рода Bacillus, описанного в данном документе, по отношению к продукту (например, корму).
Примеры способов применения, которые можно использовать, включают без ограничения обработку продукта в материале, содержащем компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, непосредственное применение путем смешивания композиции кормовой добавки, содержащей компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, как описано в данном документе, с продуктом, нанесение распылением такой композиции кормовой добавки на поверхность продукта или погружение продукта в препарат на основе композиции кормовой добавки. В одном варианте осуществления композицию кормовой добавки, содержащую компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, как описано в данном документе, предпочтительно смешивают с продуктом (например, кормовым продуктом). В качестве альтернативы композицию кормовой добавки можно включать в эмульсию или сырьевые ингредиенты кормового продукта. Это позволяет улучшить характеристики композиции.
Способ получения описанного в данном документе компонента на основе микроорганизма рода Bacillus может также включать дополнительную стадию гранулирования порошка. Порошок можно смешивать с другими компонентами, известными из уровня техники. Порошок или смесь, содержащую порошок, можно продавливать через форму, а полученные нити разрезать на подходящие гранулы различной длины.
Необязательно стадия гранулирования может включать обработку паром или стадию кондиционирования перед формированием гранул. Смесь, содержащую порошок, можно поместить в кондиционирующее устройство, например смеситель со впрыском пара. Смесь нагревают в кондиционирующем устройстве до заданной температуры, например 60–100ºC, типичные температуры будут составлять 70ºC, 80ºC, 85ºC, 90ºC или 95ºC. Время пребывания может варьировать от секунд до минут и даже часов. Например, 5 секунд, 10 секунд, 15 секунд, 30 секунд, 1 минута, 2 минуты, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут и 1 час.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что разные животные нуждаются в разных кормовых продуктах, и даже одному и тому же животному могут требоваться различные кормовые продукты в зависимости от цели, ради которой выращивают животное.
Необязательно кормовой продукт может также содержать дополнительные минералы, такие как, например, кальций, и/или дополнительные витамины. В некоторых вариантах осуществления кормовой продукт представляет собой смесь кукурузной и соевой муки.
Кормовой продукт обычно получают в кормодробилках, в которых сырьевые материалы сначала измельчают до подходящего размера частиц, а затем смешивают с соответствующими добавками. Затем кормовой продукт может быть получен в виде кашицы или гранул; причем в отношении последних, как правило, предусматривается способ, при котором температуру повышают до заданного уровня, а затем корм пропускают через матрицу с получением гранул конкретного размера. Гранулам позволяют остыть. Впоследствии можно добавлять жидкие добавки, такие как жир и фермент. Получение кормового продукта также может включать дополнительную стадию, которая включает экструзию или разбухание перед осуществлением гранулирования, в частности с помощью подходящих методик, которые могут включать по меньшей мере применение пара.
Как отмечено выше, компонент на основе микроорганизма рода Bacillus и/или содержащий его кормовой продукт можно применять в любой подходящей форме. Его можно применять в форме твердых или жидких препаратов или их альтернативных вариантов. Примеры твердых препаратов включают порошки, пасты, болюсы, капсулы, драже, таблетки, присыпки и гранулы, которые могут быть смачиваемыми, высушенными распылительной сушкой или лиофилизированными. Примеры жидких препаратов включают без ограничения водные, органические или водно–органические растворы, суспензии и эмульсии.
В некоторых вариантах применения композиции кормовой добавки можно смешивать с кормом или вводить в питьевую воду.
Компонент на основе микроорганизма рода Bacillus предусматривает смешивание компонента на основе микроорганизма рода Bacillus, описанного в данном документе, с приемлемым для корма носителем, разбавителем или наполнителем и (необязательно) упаковку.
Кормовой продукт и/или компонент на основе микроорганизма рода Bacillus можно комбинировать по меньшей мере c одним минералом и/или по меньшей мере одним витамином. Полученные таким образом композиции могут упоминаться в данном документе как премикс. Кормовой продукт может содержать по меньшей мере 0,0001% по весу компонента на основе микроорганизма рода Bacillus. В подходящем случае кормовой продукт может содержать по меньшей мере 0,0005%; по меньшей мере 0,0010%; по меньшей мере 0,0020%; по меньшей мере 0,0025%; по меньшей мере 0,0050%; по меньшей мере 0,0100%; по меньшей мере 0,020%; по меньшей мере 0,100%, по меньшей мере 0,200%; по меньшей мере 0,250%; по меньшей мере 0,500% по весу компонента на основе микроорганизма рода Bacillus.
Предпочтительно пищевой продукт или компонент на основе микроорганизма рода Bacillus может дополнительно содержать по меньшей мере один физиологически приемлемый носитель. Физиологически приемлемый носитель предпочтительно выбран из по меньшей мере одного из мальтодекстрина, известняка (карбоната кальция), циклодекстрина, пшеницы или компонента пшеницы, сахарозы, крахмала, Na[2]SО[4], талька, PVA и их смесей. В дополнительном варианте осуществления пищевой продукт или корм может дополнительно содержать хелатор ионов металлов. Хелатор ионов металлов может быть выбран из EDTA или лимонной кислоты.
В одном варианте осуществления компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, описанный в данном документе (либо капсулированный, либо не капсулированный), может быть составлен по меньшей мере с одним физиологически приемлемым носителем, выбранным по меньшей мере из одного из мальтодекстрина, известняка (карбоната кальция), циклодекстрина, пшеницы или компонента пшеницы, сахарозы, крахмала, Na2SO4, талька, PVA, сорбита, бензоата, сорбата, глицерина, сахарозы, пропиленгликоля, 1,3–пропандиола, глюкозы, парабенов, хлорида натрия, цитрата, ацетата, фосфата, кальция, метабисульфита, формиата и их смесей.
В некоторых вариантах осуществления компонент на основе микроорганизма рода Bacillus, описанный в данном документе, будет находиться в физиологически приемлемом носителе. Подходящими носителями могут быть крупные медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полипептиды, липосомы, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Можно использовать фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты. Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут дополнительно содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Дополнительно, в таких композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие средства или регулирующие рН буферные вещества. Такие носители позволяют составлять фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензий для приема пациентом внутрь. После составления их можно вводить непосредственно субъекту. Субъектами, подлежащими лечению, могут быть животные.
Неограничивающие примеры композиций и способов, раскрытых в данном документе, включают:
1. Способ ингибирования или замедления роста всех или части представителей патогенных Enteroccocus spp. у животного, который предусматривает введение животному эффективного количества по меньшей мере одного компонента на основе микроорганизма рода Bacillus, выбранного из группы, состоящей из микробного препарата для приема в пищу на основе микроорганизма рода Bacillus, содержащего один или несколько бактериальных штаммов рода Bacillus, супернатанта, полученного из культуры Bacillus, или их комбинации.
2. Способ согласно варианту осуществления 1, где микробный препарат для приема в пищу на основе микроорганизма рода Bacillus выбран из группы, состоящей из Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis и Bacillus subtilis.
3. Способ согласно варианту осуществления 1 или 2, где микробный препарат для приема в пищу на основе микроорганизма рода Bacillus выбран из одного или нескольких из следующих штаммов: штамма 2084 Bacillus под № доступа NRRl B–50013, штамма LSSAO1 Bacillus под № доступа NRRL B–50104 и штамма 15A–P4 Bacillus под № доступа ATCC PTA–6507.
4. Способ согласно варианту осуществления 1, 2 или 3, где животное представляет собой животное с однокамерным желудком.
5. Способ согласно варианту осуществления 1, 2 или 3, где животное представляет собой животное с многокамерным желудком.
6. Способ согласно варианту осуществления 1, 2, 3 или 4, где животное с однокамерным желудком представляет собой домашнюю птицу.
7. Способ по любому из указанных выше вариантов осуществления 1–6, где по меньшей мере один компонент на основе микроорганизма рода Bacillus вводят непосредственно животному с кормом для животных, причем либо как содержащийся в корме, либо добавляя поверх корма, либо в форме жидкости, такой как вода.
8. Способ по любому из вариантов осуществления 1–7, где по меньшей мере один компонент на основе микроорганизма рода Bacillus вводят животному в форме, выбранной из группы, состоящей из кормового продукта, композиции кормовой добавки, премикса или жидкости, такой как вода.
ПРИМЕРЫ
Если в данном документе не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994) и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) предоставляют для специалиста общий словарь для многих терминов, используемых в данном раскрытии.
Настоящее изобретение дополнительно определено в следующих примерах. Следует понимать, что примеры, хотя и показывают определенные варианты осуществления, приводятся исключительно в целях иллюстрации. Из приведенного выше обсуждения и примеров специалист в данной области техники сможет установить существенные характеристики настоящего изобретения, и не отклоняясь от его идеи и объема, сможет осуществить различные изменения и модификации для его адаптации к различным вариантам применения и условиям.
Пример 1
Штаммы Enterococcus cecorum и Bacillus
Собирали пятьдесят два штамма Enterococcus cecorum из коллекций культур в Северной Америке и Европе, которые подытожены в приведенной ниже таблице 1. Во время сбора акцент делали на выборе в качестве источника штаммов Enterococcus cecorum, выделенных из внекишечных поражений и подтвержденных вспышек спондилита, что позволяло убедиться в том, что тестируемые штаммы были вирулентными и способны вызывать заболевание.
Таблица 1. Штаммы Enterococcus cecorum, использованные в данном исследовании
|
Внутреннее обозначение
штамма |
Географическое происхождение | Биологическое происхождение |
Год
выделения |
Источник |
| 11915–3 | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 11937–2 | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 11944–2 | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 12108–2 | Делавэр, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 11976–5 | Северная Каролина, США | Цекальный мазок | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 12123–1 | Делавэр, США | ЖКТ | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 12476–5 | Делавэр, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 11914–3 | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 12147–1 ** | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 14191–2 | Миннесота, США | Спинальный абсцесс | 2014 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 14201–1 | Миннесота, США | Спинальный абсцесс | 2014 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 11920–1 | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 12161–6 | Северная Каролина, США | ЖКТ | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 14194–5 | Миннесота, США | Спинальный абсцесс | 2014 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 11955–1 | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 14192–2 | Миннесота, США | Спинальный абсцесс | 2014 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 11976–2 | Северная Каролина, США | Цекальный мазок | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 11952–1 | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 12163–2 | Северная Каролина, США | ЖКТ | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 14202–4 | Миннесота, США | Спинальный абсцесс | 2014 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 11960–1 | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 12696M–1 ** | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 12418–1 | Миннесота, США | ЖКТ | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 11957–3 ** | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 12435–3 | Миннесота, США | Слепые кишки | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 11951–1 ** | Северная Каролина, США | Спинальный абсцесс | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 12119–2 | Делавэр, США | ЖКТ | 2013 | Внутренняя коллекция DuPont |
| 904971 | Пенсильвания, США | желточный мешок 2 | Университет штата Пенсильвания | |
| 903797 | Пенсильвания, США | коленный сустав курицы | Университет штата Пенсильвания | |
| 900118 | Пенсильвания, США | Печень | Университет штата Пенсильвания | |
| 843323 | Пенсильвания, США | кость курицы | Университет штата Пенсильвания | |
| 842805 | Пенсильвания, США | перикард курицы | Университет штата Пенсильвания | |
| 841976 | Пенсильвания, США | кость мертвой курицы 1 | Университет штата Пенсильвания | |
| 840394 | Пенсильвания, США | кость курицы 2 | Университет штата Пенсильвания | |
| 840387 | Пенсильвания, США | коленный сустав курицы | Университет штата Пенсильвания | |
| 910525 | Пенсильвания, США | Спинальный абсцесс | Университет штата Пенсильвания | |
| 209247 | Пенсильвания, США | Костный мозг | Университет штата Пенсильвания | |
| E.58,33 | Бельгия | головка бедренной кости | 2014 | PoulPharm |
| E.53,14 | Бельгия | бедренная кость | 2014 | PoulPharm |
| E.59,56 ** | Бельгия | головка бедренной кости | 2014 | PoulPharm |
| F.68,19 ** | Бельгия | сустав | 2015 | PoulPharm |
| C.34,19 ** | Бельгия | Костный мозг | 2013 | PoulPharm |
| D.42,11 | Бельгия | сустав | 2013 | PoulPharm |
| D.44,11 ** | Бельгия | Костный мозг | 2014 | PoulPharm |
| D.45,08 | Бельгия | сустав | 2014 | PoulPharm |
| G.84,68 | Бельгия | Костный мозг | 2015 | PoulPharm |
| J.5,76 | Бельгия | скакательный сустав | 2015 | PoulPharm |
| G.77,23 | Бельгия | костный мозг из бедренной кости | 2015 | PoulPharm |
| G.75,17 ** | Бельгия | суставная поверхность | 2015 | PoulPharm |
| G.80,72 | Бельгия | головка бедренной кости | 2015 | PoulPharm |
| G.79,39 | Бельгия | костный мозг | 2015 | PoulPharm |
| J.6,81 | Бельгия | костный мозг из бедренной кости | 2015 | PoulPharm |
** – штамм, использованный при тестировании штаммов не из коллекции DuPont
Тестировали ингибирующий потенциал в общей сложности 11 штаммов Bacillus. В их число входили как запатентованные компанией DuPont штаммы DFM, так и Bacillus, выделенные из продуктов DFM конкурентов, которые подытожены в таблице 2. Все тестируемые штаммы Bacillus коммерчески доступны для применения в птицеводстве. Enviva® PRO, который коммерчески доступен от Danisco A/S, представляет собой комбинацию из штамма 2084 Bacillus под № доступа NRRl B–50013, штамма LSSAO1 Bacillus под № доступа NRRL B–50104 и штамма 15A–P4 Bacillus под № доступа ATCC PTA–6507 (как раскрыто в US 7754469 B, включенном в данный документ посредством ссылки).
Таблица 2. Штаммы DFM Bacillus, протестированные в данном исследовании
|
Внутреннее обозначение
штамма |
Коммерческое обозначение
штамма |
Вид (заявленный на этикетке) |
Коммерческое
название продукта |
Производящая компания |
| BS8 | NRRL B–50104 | Bacillus amyloliquefaciens | Enviva® PRO | DuPont |
| 2084 | NRRL B–50013 | Bacillus amyloliquefaciens | Enviva® PRO | DuPont |
| 15A–P4 | PTA–6507 | Bacillus amyloliquefaciens | Enviva® PRO | DuPont |
| CS1 | C–3102 DSM15544 |
Bacillus subtilis | Calsporin | Calpis |
| 2B1 | DSM5750 | Bacillus subtilis | BioPlus 2B | Chr Hansen |
| 2B2 | DSM5749 | Bacillus licheniformis | BioPlus 2B | Chr Hansen |
| #11/1 | DSM17299 | Bacillus subtilis | Gallipro | Chr Hansen |
| #12/1 | DSM17236 | Bacillus licheniformis | Gallipro Tect | Chr Hansen |
| #10/4 | Bacillus subtilis | Sporulin | Novus | |
| #10B/1 | Bacillus subtilis | Sporulin | Novus | |
| #10B/4 | Bacillus subtilis | Sporulin | Novus |
Все продукты Bacillus, не производимые компанией DuPont, были приобретены и выделены в трех повторностях из 3 отдельных серийных партий. Все штаммы идентифицировали, чтобы убедиться, что выделенные штаммы соответствовали заявленным на этикетке продукта штаммам. Не производимые компанией DuPont продукты были протестированы на подгруппе из 9 изолятов из полной коллекции Enterococcus cecorum, как обозначено в приведенной выше таблице 2.
Пример 2
Получение бесклеточных супернатантов (CFS) и рост штаммов Enterococcus cecorum, Enterococcus avium и Enterococcus gallinarum
Инокуляционную петлю использовали для инокуляции пробирки для шейкера объемом 30 мл c 10 мл триптического соевого бульона (TSB) замороженной исходной культурой Bacillus. Пробирку инкубировали в инкубаторе при 32oC в течение 24 часов и встряхивали на скорости 130 для выращивания Bacillus.
После инкубации колб в течение 18 часов проверяли оптическую плотность (OD) на спектрометре (длина волны 600 нм, поглощающая способность 0). Для создания холостого контроля в кювету вносили пипеткой 2 мл стерильного TSB. 10–кратное разведение Bacillus создавали путем внесения пипеткой в каждую кювету 1,8 мл стерильного TSB и 0,2 мл 18–часовой культуры. Кюветы закрывали и переворачивали для обеспечения тщательного перемешивания. Поглощающая способность разведений Bacillus , как было установлено, составляла от 0,25 до 0,3 (образцы с результатами считывания поглощающей способности ниже 0,25 инкубировали повторно до тех пор, пока поглощающая способность не достигала приемлемых уровней).
Культуру Bacillus из каждой колбы переносили в стерильные центрифужные сосуды объемом 250 мл и центрифугировали при 10000 об./мин. в течение 10 минут. После центрифугирования супернатанты каждого типа Bacillus переносили на установленный на сосуде бутылочный фильтр Nalgene и прокачивали в конические пробирки объемом 50 мл.
Эту процедуру проводили для всех штаммов Bacillus. Затем бесклеточный супернатант (CFS) замораживали при –80oC до возникновения необходимости использования.
Отобранными из подвергнутых глубокой заморозке исходных культур штаммами E. cecorum инокулировали бульон с BHI (инфузиями из головного мозга и сердца) и чашку с агаровой средой с BHI (для проверки чистоты) и инкубировали в течение ночи при 37oC. Перед включением в анализ все штаммы пересевали по меньшей мере дважды для обеспечения адаптации к ростовой среде.
Все анализы проводили в двух повторностях для каждого DFM на основе Bacillus, указанного в приведенной выше таблице 2.
Во избежание термического шока для клеток Enterococcus cecorum перед проведением анализа 20 мл бульона с BHI инкубировали в течение 1 часа.
В УФ–обработанный 96–луночный микротитровальный планшет с плоскодонными лунками вносили среду (бульон с BHI) и CFS, а также целевой микроорганизм следующим образом:
положительный контроль: 200 мкл среды+2 мкл бактерии (1%);
отрицательный контроль: 200 мкл среды;
лунка для анализа CFS: 180 мкл среды+20 мкл CFS+2 мкл бактерии (1%);
отрицательная лунка с CFS: 180 мкл среды+20 мкл CFS.
Планшеты инкубировали в течение 14 часов при 37oC в стационарном устройстве Flex для регистрации поглощающей способности, при этом данные передавались непосредственно на компьютер для анализа. Измерения проводили каждые 15 минут.
Результаты представляли в виде % ингибирования, сравнивая контроль при OD=0,4 (только E. cecorum) и обработанный образец (E. cecorum, инкубированный с CFS Bacillus). Среди 42 отдельных штаммов среднее значение ингибирования каждым из 3 штаммов Enviva® PRO (компонентом на основе Bacillus) составляло >85%, как показано на фигуре 1. Было определено, что >50% ингибирование считалось приемлемым, а ≥75% ингибирование считалось превосходным. Ингибирование более 100% свидетельствовало о том, что изолят патогена подвергался не ингибированию, лизису посредством активности Bacillus.
В таблице 3 показано среднее значение ингибирования роста 51 штамма Enterococcus cecorum штаммами Enviva® PRO. Все штаммы были способны к значительному ингибированию роста Enterococcus cecorum в сравнении с E. cecorum, инкубированным без CFS Bacillus. Наиболее эффективным штаммом был 15AP4 (компонент на основе микроорганизма рода Bacillus) со средним значением ингибирования 88,79%, хотя различия между штаммами не были статистически значимыми.
Таблица 3. Среднее значение ингибирования штаммов Enterococcus cecorum, собранных в американском и европейском птицеводстве, посредством 3 штаммов DFM Bacillus (компонента на основе микроорганизма рода Bacillus)
| Европейские штаммы | Американские штаммы | Все штаммы | ||||
| Среднее значение Ингибиро вания, % |
SEM | Среднее значение ингибиро вания, % |
SEM | Среднее значение Ингиби рования, % |
SEM | |
| 15AP4 | 88,27 | 2,887 | 89,03 | 3,086 | 88,79 | 2,30 |
| BS2084 | 89,87 | 2,887 | 88,08 | 2,955 | 88,60 | 2,233 |
| BS8 | 86,80 | 2,887 | 84,24 | 2,955 | 84,99 | 2,233 |
| P–значение | 0,7552 | 0,4898 | 0,4054 |
В таблице 4 показано среднее значение ингибирования роста подгруппы из 9 штаммов Enterococcus cecorum 12 штаммами Bacillus. Наиболее эффективным штаммом был BS2084 (компонент на основе микроорганизма рода Bacillus) со средним значением ингибирования 85,33%. Наименее эффективным штаммом Bacillus был 2B2 со средним значением ингибирования –80,17%, что свидетельствовало о том, что Enterococcus cecorum росли быстрее в присутствии CFS Bacillus (компонента на основе микроорганизма рода Bacillus), чем в условиях его отсутствия. Имелись значительные различия в эффективности среди штаммов Bacillus.
Таблица 4. Среднее значение ингибирования роста 11 штаммов Enterococcus cecorum 11 штаммами DFM Bacillus
| 15AP4 | BS2084 | BS8 | CS1 | #11/1 | #12/1 | #10/4 | #10B/1 | #10B/4 | 2B1 | 2B2 | |
| 11951–1 | 73,90 | 89,09 | 73,49 | –23,50 | 47,98 | 31,67 | 36,26 | – | – | 37,57 | 31,80 |
| 11957–3 | 102,15 | 102,39 | 99,83 | 97,67 | –6,57 | 25,89 | –11,83 | 52,68 | –6,57 | –55,86 | –2,80 |
| 11960–1 | 93,12 | 88,99 | 74,47 | 83,30 | –54,90 | –5,51 | 32,99 | 94,25 | 51,11 | –83,02 | –50,94 |
| 12696M–1 | 32,17 | 49,62 | 67,50 | 99,12 | –0,10 | 15,12 | –15,19 | 100,36 | 73,90 | –17,63 | –6,77 |
| C.34,19 | 89,79 | 77,34 | 75,19 | 99,35 | –6,28 | 5,25 | –25,09 | 94,81 | 53,57 | –67,24 | –40,41 |
| D.42,11 | 98,69 | 99,40 | 99,30 | 86,33 | –67,20 | –35,45 | –29,53 | 50,36 | 25,55 | –128,06 | –54,36 |
| E.59,56 | 50,60 | 84,74 | 71,20 | 86,33 | –16,02 | –6,04 | –8,02 | 82,07 | 57,95 | –146,62 | –87,93 |
| F.68,19 | 89,38 | 83,21 | 78,16 | 79,76 | –4,68 | –9,61 | –13,67 | 66,94 | 23,08 | –121,79 | –41,97 |
| G.75,17 | 100,99 | 93,22 | 97,43 | 79,76 | –81,97 | –9,07 | –77,68 | 69,90 | 32,96 | –138,92 | –35,45 |
| Среднее значение1 | 81,20a | 85,33a | 81,84a | 76,46a | –21,04c | 1,36bc | –12,41bc | 76,46a | 38,94ab | –80,17d | –32,09cd |
| Станд. ошиб. | 8,176 | 5,168 | 4,365 | 12,771 | 13,391 | 6,883 | 11,287 | 6,861 | 8,948 | 20,559 | 11,624 |
1P–значение=P<0,0001; значения a, b,c в ряду без общих верхних индексов, характеризуются значимыми различиями при P<0,05
ССЫЛКА: Verslyppe B, De Smet W, De Baets B, De Vos P, Dawyndt P 2014. StrainInfo introduces electronic passports for microorganisms. Syst Appl Microbiol. 37(1):42–50.
Данные в таблице 5 демонстрируют противомикробную активность CFS 15AP4, BS8 и 2084 B. amyloliquefaciens подвида plantarum (компонента на основе микроорганизма рода Bacillus) в отношении VTT E–97776T Enterococcus gallinarum.
Таблица 5. In vitro замедление роста культуры VTT E–97776T Enterococcus gallinarum, индуцированное компонентом на основе Bacillus, представляющим собой CFS 15AP4, BS8 и 2084 Bacillus amyloliquefaciens подвида plantarum.
На фигуре 1 и 2 показано среднее значение ингибирования для штаммов E. cecorum, собранных в американском и европейском птицеводстве соответственно.
На фигуре 3 приведены данные по кинетике роста E. cecorum с/без штаммов Enviva® PRO. Некоторые E. cecorum не подвергались полному ингибированию супернатантами Bacillus, т. е. компонентом на основе Bacillus. В конце 14–часового периода инкубации концентрации патогена были одинаковыми для контрольных и подвергнутых обработке чашек, но увеличивалась лаг–фаза и замедлялся экспоненциальный рост. Учитывая время прохождения через кишечник домашней птицы, такой результат будет означать, что (несмотря на отсутствие общего ингибирования) компонент на основе микроорганизма рода Bacillus может предупреждать пролиферацию патогена во время его прохождения через кишечник, снижая риск адгезии и перемещения за его пределы. Другие штаммы как замедляли, так и ингибировали рост через 14–часовой период, что продемонстрировано на фигуре 4.
На фигуре 5 показана противомикробная активность CFS 15AP4, BS8 и 2084 B. amyloliquefaciens подвида plantarum (компонента на основе микроорганизма рода Bacillus) в отношении VTT E–97776T Enterococcus gallinarum, которая выражена как % ингибирования в конечной точке, точно соответствующей достижению кривой контрольного патогена OD 0,4.
На фигуре 6 показаны профили роста E 84197 Enterococcus avium, инкубированного с или без CFS штамма 2084 Bacillus (компонента на основе микроорганизма рода Bacillus).
На фигуре 7 показана противомикробная активность CFS штамма DSM7T Bacillus amyloliquefaciens, DSM10T B. subtilis и DSM13T B. licheniformis в отношении 10 клинических изолятов Enterococcus cecorum, выделенных из птицеводческой системы в США и в Бельгии, которая выражена как % ингибирования в конечной точке, точно соответствующей достижению кривой контрольного патогена OD 0,4 (черные столбцы соответствуют среднему значению % ингибирования).
В предыдущей работе было показано, что у бройлеров развивается сепсис в диапазоне 1–3 недель в ходе производства, что видно как по прямому ингибированию, так и по замедлению достижения E. cecorum фазы экспоненциального роста. Дополнение корма для домашней птицы описанным(описанными) в данном документе DFM на основе Bacillus может замедлять колонизацию кишечника, адгезию и последующую инвазию, что означает снижение частоты проявления клинических симптомов среди птиц, достигающих убойного возраста.
Эти данные достаточно убедительны в сравнении с диапазонами ингибирования других протестированных патогенов. Эффект также выглядел достаточно постоянным для всего диапазона протестированных изолятов E. cecorum, несмотря на естественное варьирование эффективности Bacillus.
Результаты in vitro, представленные в данном документе, демонстрируют, что дополнение корма для домашней птицы компонентом на основе Bacillus, описанном в данном документе, может быть очень эффективным при ингибировании или замедлении роста всего или части нового патогена, представляющего собой E. cecorum, а также ингибировании или замедлении роста Enterococcus spp. у животных (как продемонстрировано на фигуре 5).
Пример 3
Компоненты на основе микроорганизма рода Bacillus для ингибирования или
замедления роста Enterococuss spp. у животных
Типовой штамм в "Международном кодексе номенклатуры бактерий" определен как "номенклатурный тип вида" и является "исходной точкой", с которой сравнивают все остальные штаммы для определения, принадлежат ли они к этому виду. Включение типовых штаммов каждого из видов бактерий (см. приведенную ниже таблицу 6), включенных в данное исследование, позволяло производить сравнение ингибирующего потенциала штаммов, характеризуемых как "пробиотические", со штаммами, принадлежащими к тому же виду, но не характеризуемыми как "пробиотические". В данном случае гипотеза заключалась в том, что пробиотические свойства являются уникальными для конкретных штаммов, и эти свойства не могут быть перенесены на никакие другие штаммы, принадлежащие к тому же виду. Только те штаммы, которые были тщательно охарактеризованы и оценены, могут быть обозначены как "пробиотические". Типовые штаммы, включенные в данный эксперимент, являлись репрезентативными для трех различных видов Bacillus, родственных исследуемым в данном документе штаммам. Их происхождение и неисчерпывающий перечень эквивалентных штаммов, доступных в других коллекциях культур, представлены в таблице 6.
Таблица 6. Типовые штаммы, использованные в данном исследовании, их происхождение и неисчерпывающий перечень эквивалентов в других коллекциях культур (адаптировано из Verslyppe et al., 2014; http://www.straininfo.net/)
| Виды бактерий | Bacillus amyloliquefaciens | Bacillus subtilis | Bacillus licheniformis |
| Типовые штаммы, использованные в данном исследовании | B. amyloliquefaciens DSM7T | B. subtilis DSM10T | B. licheniformis DSM13T |
| Происхождение типовых штаммов, использованных в данном исследовании | DSMZ, Германия | DSMZ, Германия | DSMZ, Германия |
| Американская коллекция типовых культур ATCC США | ATCC 23350T | ATCC 6051T | ATCC 14580T |
| Центр сбора и исследования биоресурсов, BCRC, Тайвань | BCRC 11601T | BCRC 10255T | BCRC 11702T |
| Коллекция культур VTT, Финляндия | VTT E–80124T | VTT E–97009T | VTT E–95571T |
| Центр биологических ресурсов NBRC, Япония | NBRC 15535T | NBRC 12210T NBRC 13719T; NBRC 16412T | NBRC 12200T |
| Национальные коллекции промышленных пищевых и морских бактерий NCIMB, Великобритания | NCIMB 12077T | NCIMB 3610T | NCIMB 50016T; NCIMB 9375T |
| Коллекция культур Службы сельскохозяйственных исследований NRRL, США | NRRL B–14393T | NRRL B–4219T | NRRL NRS–1264T |
| Бельгийские координированные коллекции микроорганизмов LMG/Коллекция бактерий LMG | LMG 12234T | LMG 7135T | LMG 12363T; LMG 12407T; LMG 6933T |
| Коллекция культур CCUG, Университет Гетеборга, Швеция | CUCG 163BT | CCUG 7422T | |
| Коллекция Института им. Пастера CIP, Франция | CIP 52,65T; CIP 5265T | CIP 52,71T | |
| Корейская коллекция типовых культур KCTC, Корея (Республика) | KCTC 3555T | KCTC 1753T |
Противомикробную активность этих трех типовых штаммов оценивали в отношении набора из 10 изолятов Enterococcus cecorum (таблица 7), как описано ранее.
Таблица 7. Характеристики применяемых в данном исследовании клинических изолятов Enterococcus cecorum, полученных из птицеводческого производства.
| Географический рынок | Предмет | Номер штамма | Происхождение изолята | Биологическое происхождение | Дата выделения | Коллекция |
| NAM1 | Клиническое заболевание | 12147–1 | Маунтеэйр, Северная Каролина | Спинальный абсцесс | (23.05.2013) | WAU_US |
| NAM | Клиническое заболевание | 12696M–1 | Маунтеэйр, Северная Каролина | Спинальный абсцесс | 09.12.13 | WAU_US |
| NAM | Клиническое заболевание | 11951–1 | Маунтеэйр, Северная Каролина | Мазок спинального абсцесса | (10.05.13) | WAU_US |
| NAM | Клиническое заболевание | 11957–3 | Маунтеэйр, Северная Каролина | Мазок спинального абсцесса | (10.05.13) | WAU_US |
| EU2 | Клиническое заболевание | C.34,19 | BE3 | костный мозг бройлера | 05.08.2013 | Poulpharm_BE |
| EU | Клиническое заболевание | D.42,11 | BE | Сустав, из производства | 28.11.2013 | Poulpharm_BE |
| EU | Клиническое заболевание | E.59,56 | BE | головка бедренной кости, производитель | 10.09.2014 | Poulpharm_BE |
| EU | Клиническое заболевание | F.68,19 | BE | Сустав, из производства | 12.01.2015 | Poulpharm_BE |
| EU | Клиническое заболевание | G.75,17 | BE | суставная поверхность, производство бройлеров | 04.05.2015 | Poulpharm_BE |
1=Северная Америка
2=Европа
3= Бельгия
Процент ингибирования роста десяти патогенных изолятов Enterococcus cecorum каждым из CFS, полученным из 3 различных типовых штаммов, представлен на фигуре 7. В отличие от 3 штаммов B. amyloliquefaciens из Enviva Pro (15AP4; BS8 и 2084) (см. приведенную выше таблицу 4) типовой штамм DSM7T B. amyloliquefaciens не проявлял противомикробной активности в отношении тестируемых патогенов (фиг. 7). В этом эксперименте CFS из типового штамма (DSM7T) B. amyloliquefaciens способствовал росту патогена и не был способен ингибировать ни один из протестированных патогенов. Эти результаты подтверждают штаммоспецифичность противомикробного свойства. Присвоение пробиотического статуса в отношении конкретного штамма является результатом научного скринингового подхода, целью которого является выявление данного штамма или штамма среди тысяч штаммов, который характеризуется уникальностью и, следовательно, может обеспечивать преимущества для хозяина, а также экономическую ценность.
Таким образом, неожиданным стало обнаружение того, что DSM13T B. licheniformis проявлял большую противомикробную активность (в среднем 68,58%) в отношении патогенных изолятов E. cecorum в сравнении с коммерческими пробиотическими штаммами B. licheniformis и #10/4 с показателями, составляющими 1,36% и –12,41% соответственно (таблица 4). Типовой штамм DSM10T B. subtilis проявлял процент ингибирования, равный в среднем 26%, который, тем не менее, был более высоким в сравнении со средним процентом, проявляемым коммерческим пробиотическим штаммом #11/1 B. subtilis (–21%) (фиг. 7 и таблица 4).
1. Способ ингибирования или замедления роста представителей патогенных Enterococcus cecorum у домашней птицы, который включает введение животному эффективного количества по меньшей мере одного из штаммов микроорганизма для приема в пищу, выбранного из группы штамма 2084 Bacillus под № доступа NRRl B–50013 и штамма 15A–P4 Bacillus под № доступа ATCC 15 PTA–6507.
2. Способ по п. 1, где по меньшей мере один микроорганизм для приема в пищу вводят непосредственно животному с кормом для животных, причем либо как содержащийся в корме, либо добавляя поверх корма, либо в форме жидкости.
3. Способ по п. 1, где по меньшей мере один микроорганизм для приема в пищу вводят животному в форме, выбранной из группы, состоящей из кормового продукта, композиции кормовой добавки, премикса или жидкости.
