Сконструированный ботулинический нейротоксин

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных полипептидов ботулинического нейротоксина (BoNT), и может быть использовано в медицине для лечения состояния, связанного с нежелательной нейрональной активностью. Предложены полипептиды BoNT с модифицированным рецептор-связывающим доменом Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_C), имеющим аминокислотные мутации, которые модифицируют связывание BoNT с человеческим синаптотагмином II (Syt II). Изобретение обеспечивает получение полипептидов BoNT с усиленным связыванием с человеческим Syt II. 16 н. и 28 з.п. ф-лы, 24 ил., 8 табл., 6 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки Соединенных Штатов

№ 62/378967, поданной 24 августа 2016 г., содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ПОДДЕРЖКА

[0002] Это изобретение было сделано при государственной поддержке по программе НИЗ 1R21NS082830, проводимой Национальным институтом здравоохранения. Государство имеет определенные права на это изобретение.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0003] Описание данного изобретения ссылается на Перечень последовательностей (поданный в электронной форме в виде файла.txt под названием «0342941_0602_SL.TXT» 24 августа 2017 г.). Файл.txt был создан 22 августа 2017 г., а его размер составляет 106905 байт. Полное содержание Перечня последовательностей включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0004] Данное изобретение относится к области модифицированных нейротоксинов и их применения для лечения медицинских и эстетических нарушений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0005] Ботулинические нейротоксины представляют семейство бактериальных токсинов, включающее семь основных серотипов (BoNT/A-G) (1). Действие этих токсинов состоит в блокировании высвобождения нейромедиаторов из нейронов, что приводит к парализации животных и людей. В последние годы BoNT широко использовали для лечения растущего перечня патологических состояний: локальные инъекции минимального количества токсинов могут ослаблять нейрональную активность в целевых участках, что может быть полезным при многих патологических состояниях, а также в косметических целях (7-9).

[0006] BoNT/A и BoNT/B являются единственными двумя BoNT, которые на сегодняшний день одобрены FDA для применения на людях (7-9). Они представляют собой токсины, выделенные из бактерий без каких-либо модификаций в последовательности (что определяется как дикий тип или ДТ). При расширении применения BoNT появились сообщения об ограничениях и нежелательных явлениях. Основным ограничением является генерация нейтрализующих антител у пациентов, что делает последующее лечение неэффективным (11). Прекращение применения BoNT часто оставляет пациентов без каких-либо иных эффективных путей лечения/облегчения их нарушений. Возможность ответа антител напрямую связана как с дозами токсина, так и с частотой проведения инъекций (11). Следовательно, это ограничение возникает, в основном, при лечении мышечных спазмов, которое включает применение относительно высоких доз токсинов.

[0007] Основные нежелательные явления часто связаны с лечением мышечных спазмов, но не с косметическими применениями. Это связано с тем, что нежелательные явления обусловлены большей частью диффузией токсинов в другие участки организма, а возможность диффузии токсинов напрямую связана с вводимыми дозами. Нежелательные явления характеризуются диапазоном от временных несерьезных явлений, таких как птоз и двоение в глазах, до опасных для жизни явлений и даже летального исхода. В письме-петиции, поданном Dr. Sidney Wolfe в FDA в 2008 г., было задокументировано всего 180 случаев серьезных нежелательных явлений, включая 16 летальных исходов. В результате теперь FDA требует, чтобы на всех BoNT-продуктах было «предостережение в черной рамке», информирующее о риске распространения токсинов, после аналогичных предупреждений, изданных в Европейском Союзе.

[0008] Так как генерация нейтрализующих антител и диффузия токсинов напрямую связаны с вводимыми дозами, существует острая необходимость в снижении доз токсинов (с поддержанием таких же уровней активности токсинов), что означает, что должна быть повышена эффективность отдельных молекул токсинов. Такие модифицированные BoNT с улучшенной специфичностью в отношении нейронов также снизят любые потенциальные нецелевые эффекты вследствие неспецифического проникновения в другие типы клеток.

[0009] BoNT обнаруживают нейроны и проникают в них путем связывания специфических рецепторов посредством своих рецептор-связывающих доменов, что хорошо описано в литературе (BoNT-H_C, Фиг. 1A, B) ¹. Связывание с рецепторами обуславливает эффективность и специфичность BoNT в отношении распознавания нейронов. Улучшение способности BoNT связывать рецепторы повысит их эффективность и специфичность в отношении целевых нейронов. Были идентифицированы рецепторы для большинства BoNT (Фиг. 1C). BoNT/B, D-C и G используют два гомологичных белка синаптических везикул, синаптотагмин I и II (Syt I/II) в качестве своих рецепторов ^13-18, тогда как BoNT/A, E, D и F используют другой белок синаптических везикул, SV2. Кроме белковых рецепторов, для всех BoNT требуются липидные корецепторные ганглиозиды (Фиг. 1D), которые в больших количествах присутствуют на поверхности нейронов ²⁷. Из двух изоформ Syt Syt II имеет в ~10 раз большую аффинность связывания в отношении BoNT/B, чем Syt I, и также является доминантной изоформой, экспрессируемой в окончаниях двигательных нейронов, которые представляют собой нейроны-мишени для BoNT (Фиг. 2A). Следовательно, Syt II считается основным рецептором токсинов в случае BoNT/B, D-C и G, тогда как Syt I является второстепенным рецептором токсинов на окончаниях двигательных нейронов. Это наблюдается в случае грызунов и, вероятно, справедливо для большинства млекопитающих.

[0010] Кто-то может сказать, что BoNT и так имеют высокую специфичность в отношении нейронов, и спросить, возможно ли дополнительно улучшить их связывание с нейронами? Ответом будет «Да» в случае людей, по меньшей мере, частично в свете недавнего открытия, что человеческий Syt II характеризуется сильно сниженным связыванием и функционированием как рецептор для BoNT/B вследствие уникального аминокислотного изменения относительно Syt II грызунов (крыс/мышей) в участке связывания токсина. Это замена фенилаланина (F) на лейцин (L) в позиции 54 (мышиная последовательность Syt II) (как показано в US 9598685, Фиг. 2B). Выравнивание последовательностей позволило обнаружить, что фенилаланин в этой позиции является высококонсервативным как в Syt I, так и в Syt II среди позвоночных, включая утконосов, рыб, грызунов и обезьян ⁴⁸. Только Syt II человека и шимпанзе содержит в этой позиции лейцин. В результате изменения этого остатка Syt II человека и шимпанзе характеризуется сильно сниженным связыванием с BoNT/B, D-C и G (как показано в US 9598685, Фиг. 2C) и является значительно менее эффективным в опосредовании проникновения BoNT/B (как показано в US 9598685, Фиг. 2D) по сравнению с мышиным Syt II. Так как Syt I человека и шимпанзе содержит фенилаланин в данной позиции и может связывать BoNT/B, D-C и G (как показано в US 9598685, Фиг. 2E), у людей высокоаффинный рецептор для BoNT/B, D-C и G ограничен второстепенным рецептором Syt I. Эти открытия позволяют объяснить клинические наблюдения, согласно которым необходима намного большая доза BoNT/B, чем BoNT/A (который связывает другой рецептор), для достижения таких же уровней терапевтического эффекта у пациентов. Ранее эти наблюдения связывали с другими причинами, такими как процентное содержание активного нейротоксина в используемых препаратах. Недавние наблюдения подобной разницы в связывании BoNT/B с человеческим Syt II по сравнению с Syt II других видов позволяют предположить, что в связывание с человеческим Syt II могут быть вовлечены разные остатки BoNT/B. Следовательно, модификация последовательности в BoNT/B, которая, как ожидается, будет влиять на связывание с Syt II грызунов, может иметь непредсказуемые эффекты на связывание BoNT/B с человеческим Syt II.

[0011] Таким образом, существует потребность в улучшении связывания BoNT/B с человеческим рецептором Syt II в качестве способа повышения его эффективности и специфичности в отношении целевых человеческих нейронов и снижения доз токсинов, необходимых в терапевтических применениях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] Как сказано выше, нейротоксины Clostridium botulinum нашли применение в медицине, как в лечении патологических состояний, так и в косметических целях. Полипептид C. botulinum дикого типа, серотипа B, штамма 4 не связывает человеческий рецептор Syt II с высокой аффинностью и не приводит к эффективному ингибированию нежелательной нейрональной активности. В данном документе описаны сайт-направленные мутации в рецептор-связывающем домене серотипа B, штамма 4 (BoNT/B4), которые резко повышают способность модифицированного рецептор-связывающего домена (BoNT/B4 H_c) связывать человеческий рецептор Syt II. Повышение связывания модифицированного H_c-домена BoNT/B4 с рецептором hSyt II повышает способность полипептидов BoNT, содержащих этот домен, ингибировать нейрональную активность и делает полипептиды BoNT, содержащие такой домен, значительно более эффективными и менее вероятно вызывающими нежелательный иммунный ответ в случае терапевтических, а также косметических применений.

[0013] В одном аспекте в данном документе описан полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащий: a) протеазный домен; b) сайт расщепления протеазами; c) домен транслокации; и d) модифицированный рецептор-связывающий домен Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c), который связывает человеческий Syt II.

[0014] В одном варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен полипептида BoNT содержит мутации замены V1113K, S1117P, S1196A и I1197P.

[0015] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен полипептида BoNT дополнительно содержит одну или более мутаций замены, соответствующих мутациям замены в серотипе B, штамме 4, выбранным из группы, состоящей из: Q1191C, Q1191V, Q1191L, Q1191Y, Q1191M, Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинаций. В другом варианте реализации изобретения модифицированный (B4-H_c) содержит две мутации замены, соответствующие мутациям замены в серотипе B, штамме 4, выбранным из группы, состоящей из: Q1191C, Q1191V, Q1191L, Q1191Y, Q1191M, Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C и Y1183P.

[0016] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен полипептида Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c) дополнительно содержит две или более мутаций замены, соответствующих мутациям замены в серотипе B, штамме 4, при этом одна из мутаций замены выбрана из группы, состоящей из Q1191M, Q1191C, Q1191V, Q1191L и Q1191Y.

[0017] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен полипептида Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c) дополнительно содержит две или более мутаций замены, соответствующих мутациям замены в серотипе B, штамме 4, при этом одна из мутаций замены соответствует Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, Y1199F или Y1199L в серотипе B, штамме 4.

[0018] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен полипептида Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c) дополнительно содержит две мутации замены, выбранные из мутаций замены, соответствующих Q1191M и W1178Q, Q1191C и W1178Q, Q1191V и W1178Q, Q1191L и W1178Q, Q1191Y и W1178Q, Q1191M и Y1183P, Q1191M и Y1183C, Q1191C и Y1183P, Q1191C и Y1183C, Q1191V и Y1183P, Q1191V и Y1183C, Q1191L и Y1183P, Q1191L и Y1183C, Q1191Y и Y1183P, Q1191Y и Y1183C, W1178Q и Y1183P, и W1178Q и Y1183C в серотипе B, штамме 4. В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен полипептида Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c) дополнительно содержит две мутации замены, соответствующие Q1191M и W1178Q в серотипе B, штамме 4. В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен полипептида Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-Hc) дополнительно содержит две мутации замены, соответствующие Q1191M и W1183P в серотипе B, штамме 4. В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен полипептида Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-Hc) дополнительно содержит две мутации замены, соответствующие Q1191M и W1183C в серотипе B, штамме 4.

[0019] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен полипептида Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-Hc) дополнительно содержит три мутации замены. В другом варианте реализации изобретения три дополнительные мутации замены находятся в позициях, соответствующих Q1191, W1178 и Y1183 серотипа B, штамма 4. В другом варианте реализации изобретения три дополнительные мутации замены соответствуют Q1191M, W1178Q и Y1183P серотипа B, штамма 4.

[0020] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен дополнительно содержит мутацию замены, соответствующую мутации замены в серотипе B, штамме 4, выбранной из группы, состоящей из: Q1191C; Q1191V; Q1191L; Q1191Y; Q1191M; Y1199W; Y1199E; и Y1199H.

[0021] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен дополнительно содержит мутацию замены, соответствующую мутации замены Q1191M в серотипе B, штамме 4.

[0022] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен дополнительно содержит две мутации замены, соответствующие мутации замены в серотипе B, штамме 4, выбранной из группы, состоящей из: первой мутации, выбранной из Q1191C; Q1191 ; Q1191L; Q1191Y; и Q1191M; и второй мутации, выбранной из: Y1199W; Y1199E; и Y1199H.

[0023] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен дополнительно содержит одну или более мутаций замены, соответствующих мутации замены в серотипе B, штамме 4, выбранной из группы, состоящей из: W1178Y; W1178Q; W1178A; W1178S; Y1183C; Y1183P и их комбинаций.

[0024] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен содержит две мутации замены, соответствующие Q1191M и Y1199W, Q1191M и W1178Q, Q1191C и Y1199W, Q1191C и W1178Q, Q1191V и Y1199W или Q1191V и W1178Q, в серотипе B, штамме 4.

[0025] В другом варианте реализации изобретения модифицированный (B-H_c) содержит три мутации замены в позициях, которые соответствуют Q1191, W1178 и Y1183 серотипа B, штамма 4. В другом варианте реализации изобретения три мутации замены соответствуют Q1191M, W1178Q и Y1183C серотипа B, штамма 4.

[0026] Также в данном документе предложена нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид BoNT, описанный в любом аспекте или варианте реализации изобретения в данном документе, или вектор нуклеиновой кислоты, содержащий такую нуклеиновую кислоту, функционально связанную с последовательностями, которые обеспечивают экспрессию полипептида BoNT. Также в данном документе предложена клетка, содержащая такую нуклеиновую кислоту или вектор нуклеиновой кислоты, и/или клетка, экспрессирующая такой полипептид BoNT.

[0027] В одном аспекте в данном документе описан полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащий: a) протеазный домен; b) сайт расщепления протеазами; c) домен транслокации; и d) модифицированный рецептор-связывающий домен Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c), содержащий мутации замены V1113K, S1117P, S1196A и I1197P и дополнительно содержащий мутацию замены в позиции, соответствующей S1201 серотипа B, штамма 4.

[0028] В одном варианте реализации любого из предыдущих аспектов протеазный домен, домен транслокации и сайт расщепления протеазами полипептида BoNT относятся к серотипу, выбранному из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F, G и их комбинаций.

[0029] В другом варианте реализации любого из предыдущих аспектов протеазный домен, домен транслокации и сайт расщепления протеазами относятся к серотипу B, штамму 1.

[0030] В другом варианте реализации любого из предыдущих аспектов протеазный домен, домен транслокации и сайт расщепления протеазами относятся к серотипу А, штамму 1.

[0031] В другом варианте реализации изобретения сайт расщепления протеазами происходит из серотипа А, серотипу B или представляет собой химерный сайт расщепления серотипов А и B.

[0032] В другом аспекте в данном документе описан полипептид, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен тяжелой цепи Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c), который связывает человеческий Syt II.

[0033] В одном варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен содержит мутации замены V1113K, S1117P, S1196A и I1197P.

[0034] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен дополнительно содержит одну или более мутаций замены, соответствующих мутациям замены в серотипе B, штамме 4, выбранным из группы, состоящей из: Q1191C, Q1191V, Q1191L, Q1191Y, Q1191M, Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинаций.

[0035] В другом варианте реализации изобретения модифицированный (B4-H_c) содержит две мутации замены, соответствующие мутациям замены в серотипе B, штамме 4, выбранным из группы, состоящей из: Q1191C, Q1191V, Q1191L, Q1191Y, Q1191M, Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C и Y1183P.

[0036] В другом варианте реализации изобретения модифицированный B4-H_c дополнительно содержит две или более мутаций замены, соответствующих мутациям замены в серотипе B, штамме 4, при этом одна из мутаций замены выбрана из группы, состоящей из Q1191M, Q1191C, Q1191V, Q1191L и Q1191Y.

[0037] В другом варианте реализации изобретения модифицированный B4-H_c дополнительно содержит две или более мутаций замены, соответствующих мутациям замены в серотипе B, штамме 4, при этом одна из мутаций замены соответствует Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, Y1199F или Y1199L в серотипе B, штамме 4.

[0038] В другом варианте реализации изобретения модифицированный B4-H_c дополнительно содержит две мутации замены, выбранные из мутаций замены, соответствующих Q1191M и W1178Q, Q1191C и W1178Q, Q1191V и W1178Q, Q1191L и W1178Q, Q1191Y и W1178Q, Q1191M и Y1183P, Q1191M и Y1183C, Q1191C и Y1183P, Q1191C и Y1183C, Q1191V и Y1183P, Q1191V и Y1183C, Q1191L и Y1183P, Q1191L и Y1183C, Q1191Y и Y1183P, Q1191Y и Y1183C, W1178Q и Y1183P, и W1178Q и Y1183C в серотипе B, штамме 4.

[0039] В другом варианте реализации изобретения две мутации замены соответствуют Q1191M и W1178Q в серотипе B, штамме 4.

[0040] В другом варианте реализации изобретения две мутации замены соответствуют Q1191M и W1183P в серотипе B, штамме 4.

[0041] В другом варианте реализации изобретения две мутации замены соответствуют Q1191M и W1183C в серотипе B, штамме 4.

[0042] В другом варианте реализации изобретения модифицированный (B4-H_c) дополнительно содержит три мутации замены. В другом варианте реализации изобретения три дополнительные мутации замены находятся в позициях, соответствующих Q1191, W1178 и Y1183 серотипа B, штамма 4. В другом варианте реализации изобретения три дополнительные мутации замены соответствуют Q1191M, W1178Q и Y1183P серотипа B, штамма 4.

[0043] В другом аспекте в данном документе описана химерная молекула, содержащая первую часть, которая представляет собой модифицированный рецептор-связывающий домен Clostridial botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c), связанную со второй частью, при этом модифицированный B4-H_c связывается с человеческим Syt II.

[0044] В одном варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен Clostridial botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c) содержит мутации замены V1113K, S1117P, S1196A и I1197P.

[0045] В другом варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен Clostridial botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c) дополнительно содержит одну или более мутаций замены, выбранных из группы, состоящей из: Q1191M, Q1191C, Q1191V, Q1191L, Q1191Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинаций.

[0046] В другом варианте реализации изобретения модифицированный B4-H_c дополнительно содержит две мутации замены, выбранные из группы, состоящей из: Q1191M, Q1191C, Q1191V, Q1191L, Q1191Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C и Y1183P.

[0047] В другом аспекте в данном документе описана химерная молекула, содержащая первую часть, которая представляет собой модифицированный рецептор-связывающий домен Clostridial botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c), связанную со второй частью, при этом модифицированный B4-H_c содержит две или более мутаций замены, соответствующих мутации замены в серотипе B, штамме 4, и связывает человеческий Syt II, при этом одна из мутаций замены, выбрана из группы, состоящей из: Q1191M, Q1191C, Q1191V, Q1191L и Q1191Y.

[0048] В другом варианте реализации изобретения одна из мутаций замены соответствует W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C или Y1183P в серотипе B, штамме 4.

[0049] В другом варианте реализации изобретения две мутации замены соответствуют Q1191M и W1178Q, Q1191C и W1178Q, Q1191V и W1178Q, Q1191L и W1178Q, Q1191Y и W1178Q, Q1191M и Y1183P, Q1191M и Y1183C, Q1191C и Y1183P, Q1191C и Y1183C, Q1191V и Y1183P, Q1191V и Y1183C, Q1191L и Y1183P, Q1191L и Y1183C, Q1191Y и Y1183P, Q1191Y и Y1183C, W1178Q и Y1183P, и W1178Q и Y1183C в серотипе B, штамме 4.

[0050] В другом варианте реализации изобретения модифицированный (B-H_c) содержит три мутации замены. В другом варианте реализации изобретения три мутации замены находятся в позициях, которые соответствуют Q1191, W1178 и Y1183 серотипа B, штамма 4. В другом варианте реализации изобретения три мутации замены соответствуют Q1191M, W1178Q и Y1183P серотипа B, штамма 4.

[0051] В другом варианте реализации изобретения первая часть и вторая часть связаны ковалентно.

[0052] В другом варианте реализации изобретения первая часть и вторая часть связаны нековалентно.

[0053] В другом варианте реализации изобретения вторая часть выбрана из группы, состоящей из малой молекулы, нуклеиновой кислоты, короткого полипептида и белка.

[0054] В другом варианте реализации изобретения вторая часть представляет собой биоактивную молекулу.

[0055] В другом варианте реализации изобретения вторая часть представляет собой терапевтический полипептид или неполипептидный лекарственный препарат.

[0056] В другом аспекте в данном документе описана фармацевтическая композиция, содержащая полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT) или химерную молекулу, описанные в данном документе, или содержащая нуклеиновую кислоту или вектор нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид BoNT, описанный в данном документе.

[0057] В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

[0058] В другом аспекте в данном документе описан набор, содержащий фармацевтическую композицию, описанную в данном документе. Набор может содержать инструкции по терапевтическому введению фармацевтической композиции.

[0059] В другом аспекте в данном документе описан способ получения полипептида ботулинического нейротоксина (BoNT), включающий этапы культивирования описанной в данном документе клетки, которая содержит нуклеиновую кислоту или вектор нуклеиновой кислоты, кодирующие описанные в данном документе полипептид BoNT или химерный полипептид BoNT, в условиях, в которых происходит выработка указанных полипептида BoNT или химерного полипептида BoNT.

[0060] В одном варианте реализации изобретения этот способ дополнительно включает один или более из следующих этапов: выделение полипептида BoNT из культуры; очистка полипептида BoNT; активация полипептида BoNT; или получение полипептида BoNT в виде готовой формы.

[0061] В другом аспекте в данном документе описан способ лечения патологического состояния, связанного с нежелательной нейрональной активностью, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества описанных в данном документе полипептида BoNT или химерного полипептида BoNT, или фармацевтической композиции, содержащей такой полипептид, чтобы таким образом осуществить его контакт с одним или более нейронами, проявляющими нежелательную нейрональную активность, чтобы таким образом лечить патологическое состояние.

[0062] В одном варианте реализации изобретения патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из спастической дисфонии, спастической кривошеи, дистонии мышц гортани, оромандибулярной дистонии, дистонии мышц языка, дистонии мышц шеи, фокальной дистонии мышц кисти, блефароспазма, косоглазия, одностороннего лицевого спазма, нарушения мышц век, церебрального паралича, фокальной спастичности и других нарушений голоса, спастического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечностей, судорог, дрожания, бруксизма, анальной трещины, ахалазии, нарушения глотания и других нарушений мышечного тонуса и других нарушений, характеризуемых непроизвольными движениями мышечных групп, слезотечения, гипергидроза, повышенного слюноотделения, повышенной желудочно-кишечной секреции, нарушений секреции, боли от мышечных спазмов, головной боли, мигрени и дерматологических или эстетических/косметических патологических состояний.

[0063] В другом аспекте в данном документе описан полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), описанный в данном документе, химерный полипептид BoNT, описанный в данном документе, или фармацевтическая композиция, содержащая такие полипептид BoNT или химерный полипептид, для применения в медицине.

[0064] В другом аспекте в данном документе описан полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), описанный в данном документе, химерный полипептид BoNT, описанный в данном документе, или фармацевтическая композиция, содержащая такие полипептид BoNT или химерный полипептид, для применения в лечении патологического состояния, связанного с нежелательной нейрональной активностью.

Определения

[0065] В контексте данного документа термин «аффинность связывания» относится к силе связывающей активности молекулы в отношении конкретной рецепторной системы. В общем случая высокая аффинность связывания является результатом действия большей межмолекулярной силы между связывающим доменом и его рецепторной системой, тогда как низкая аффинность связывания включает действие меньшей межмолекулярной силы между лигандом и его рецептором. Высокая аффинность связывания включает большее время удержания для связывающего домена и сайта связывания его рецептора, чем в случае низкой аффинности. Следовательно, применение молекулы с высокой аффинностью связывания подразумевает, что для максимальной занятости сайтов связывания рецепторной системы и стимуляции физиологического ответа требуется меньшая концентрация этой молекулы. И наоборот, низкая аффинность связывания подразумевает необходимость относительно высокой концентрации молекулы перед тем, как будут достигнуты максимальная занятость рецепторных сайтов связывания рецепторной системы и максимальный физиологический ответ. Таким образом, описанный в данном документе ботулинический нейротоксин с повышенной активностью связывания вследствие высокой аффинности связывания позволит осуществлять введение сниженных доз токсина, тем самым снижая или предотвращая появление нежелательных побочных явлений, связанных с распространением токсина в нецелевые участки.

[0066] Один из параметров, который часто используется для измерения аффинности связывания, определяется как K_Д связывания. Так как K_Д определяется как соотношение между константой диссоциации (K_дисс.) и константой ассоциации (K_асс.), чем ниже значение K_Д, тем выше аффинность связывания.

[0067] В контексте данного документа термин «существенно повышенное связывание», употребляемый для описания аффинности связывания молекулы нейротоксина C. botulinum или домена BoNT/B-Hc, или их рецептор-связывающего фрагмента, описанных в данном документе, с конкретным рецептором (например, человеческим Syt II или человеческим Syt I), относится к повышению аффинности связывания в отношении конкретного рецептора, которая существенно повышена (например, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% относительно аффинности связывания молекулы дикого типа) по сравнению с незамещенной версией молекулы. В одном варианте реализации изобретения повышение связывания замещенной молекулы демонстрируется аффинностью связывания, которая на порядок или более превышает аффинность связывания незамещенной молекулы (например, нейротоксина с молекулой H_C BoNT природного происхождения). Другими словами, K_Д замещенной молекулы на порядок или более ниже, чем K_Д незамещенной молекулы. В одном варианте реализации изобретения повышение связывания демонстрируется аффинностью связывания, которая существенно выше (например, 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X и т. д.), чем аффинность связывания незамещенной молекулы. Другими словами, K_Д замещенной молекулы существенно ниже (например, 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X и т. д.), чем K_Д незамещенной молекулы. В одном варианте реализации изобретения демонстрируемое повышение связывания находится в диапазоне K_Д от около 0,59 мкм до 5,82 мкм. В одном варианте реализации изобретения демонстрируемое повышение связывания находится в диапазоне K_Д от около 0,59 мкм до 4,3 мкм. В одном варианте реализации изобретения повышение связывания демонстрируется K_Д ≤ 5,82 мкм. В одном варианте реализации изобретения повышение связывания демонстрируется K_Д ≤ 4,30 мкм. В одном варианте реализации изобретения повышение связывания демонстрируется K_Д ≤ 2,9 мкм. В одном варианте реализации изобретения повышение связывания демонстрируется K_Д около 0,59 мкм.

[0068] В одном варианте реализации изобретения K_Д замещенной молекулы в отношении человеческого Syt II составляет ≤ 10 мкм, предпочтительно ≤ 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 мкм, более предпочтительно ≤ 1 или 0,6 мкм. В одном варианте реализации изобретения K_Д замещенной молекулы в отношении человеческого Syt I составляет ≤ 10 мкм, предпочтительно ≤ 9, 8, 7, 6, 5, 4 мкм, более предпочтительно ≤ 3 мкм. В одном варианте реализации изобретения K_Д замещенной молекулы в отношении человеческого Syt II составляет ≤ 7 мкм, а K_Д замещенной молекулы в отношении человеческого Syt I составляет ≤ 6 мкм. В предпочтительном варианте реализации изобретения K_Д замещенной молекулы в отношении человеческого Syt II составляет ≤ 1 мкм, а K_Д замещенной молекулы в отношении человеческого Syt I составляет ≤ 3 мкм.

[0069] В одном варианте реализации изобретения повышение связывания приводит к выявляемому связыванию с человеческим Syt I в отсутствие корецепторов ганглиозидов, как показано в экспериментальных примерах, описанных в данном документе.

[0070] Термины «существенно повышенное связывание» или «существенно сниженное связывание», употребляемые для описания аффинности связывания связывающего фрагмента BoNT/B-H_C, получаемого с помощью описанных в данном документе точечных мутаций, относятся, соответственно, к повышению или снижению аффинности связывания модифицированного связывающего домена (например, экспрессируемого в виде выделенного фрагмента или в контексте более крупной конструкции полипептида нейротоксина) с конкретным рецептором (например, человеческим Syt II или человеческим Syt I), как обсуждалось непосредственно выше.

[0071] В контексте данного документа термин «существенно сниженное связывание», употребляемый для описания аффинности связывания молекулы ботулинического нейротоксина или его связывающего фрагмента (например, BoNT/B-Hc), описанных в данном документе, с конкретным рецептором (например, человеческим Syt I или человеческим Syt II), относится к снижению аффинности связывания в отношении конкретного рецептора, которая существенно снижена (например, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% относительно аффинности связывания молекулы дикого типа) по сравнению с незамещенной версией молекулы. В одном варианте реализации изобретения снижение связывания замещенной молекулы приводит к аффинности связывания, которая на порядок или более меньше, чем аффинность связывания незамещенного нейротоксина (например, нейротоксина с молекулой H_C BoNT природного происхождения). Другими словами, K_Д замещенной молекулы на порядок или более выше, чем K_Д незамещенного нейротоксина. В одном варианте реализации изобретения снижение связывания замещенной молекулы приводит к аффинности связывания, которая существенно ниже (например, 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X и т. д.), чем аффинность связывания незамещенной молекулы. Другими словами, K_Д замещенной молекулы существенно выше (например, 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X и т. д.), чем K_Д незамещенной молекулы. В одном варианте реализации изобретения существенное снижение связывания приводит к отсутствию выявляемого связывания с человеческим Syt I в отсутствие корецепторов ганглиозидов.

[0072] В контексте данного документа термин «ботулинический нейротоксин» означает любой полипептид, который может задействовать полный клеточный механизм, посредством которого токсин C. botulinum попадает в нейрон и ингибирует высвобождение нейромедиаторов. Этот механизм включает связывание токсина C. botulinum с низко- или высокоаффинным рецепторным комплексом, интернализацию токсина, транслокацию легкой цепи токсина в цитоплазму и ферментативную модификацию субстрата токсина C. botulinum. Термины «полипептид» и «белок» взаимозаменяемо употребляются в данном документе в связи с молекулой нейротоксина C. botulinum и ее фрагментами.

[0073] В контексте данного документа «модифицированный рецептор-связывающий домен» или «модифицированный H_C», облегчает связывание молекулы нейротоксина C. botulinum, в которой он содержится, с рецептором для нейротоксина C. botulinum, расположенным на поверхности клетки-мишени. Такую молекулу, как правило, создают с помощью генетических рекомбинантных технологий. Модифицированный H_C обладает активностью связывания в отношении рецептора для нейротоксина C. botulinum, находящегося на поверхности клетки-мишени. В контексте данного документе термин «активность связывания» означает, что одна молекула напрямую или не напрямую контактирует с другой молекулой посредством, по меньшей мере, одной межмолекулярной или внутримолекулярной силы, включая, без ограничений, ковалентную связь, ионную связь, металлическую связь, водородную связь, гидрофобное взаимодействие, ван-дер-ваальсово взаимодействие и т. п. или любую их комбинацию. «Связанный» и «связывать» также считаются терминами для определения связывания.

[0074] В контексте данного документа термин «протеазный домен токсина C. botulinum» означает домен токсина C. botulinum, который может осуществлять этап ферментативной модификации мишени в процессе интоксикации. Таким образом, протеазный домен токсина C. botulinum специфически нацелен на субстрат токсина C. botulinum и включает протеолитическое расщепление субстрата токсина C. botulinum, например, белков SNARE, таких как субстрат SNAP-25, субстрат VAMP и субстрат синтаксин.

Неограничивающие примеры протеазных доменов токсина C. botulinum приведены в таблице 1.

[0075] В контексте данного документа термин «домен транслокации токсина C. botulinum» или «H_N» означает домен токсина C. botulinum, который может осуществлять этап транслокации в процессе интоксикации, который опосредует транслокацию легкой цепи токсина C. botulinum. Таким образом, H_N облегчает перемещение легкой цепи токсина C. botulinum через мембрану и включает перемещение легкой цепи токсина C. botulinum через мембрану внутриклеточной везикулы в цитоплазму клетки. Неограничивающие примеры H_N включают BoNT/A H_N, BoNT/B H_N, BoNT/C1 H_N, BoNT/D H_N, BoNT/E H_N, BoNT/F H_N и BoNT/G H_N, аминокислотные последовательности которых приведены в таблице 1 и на Фиг. 8 и Фиг. 10 - Фиг. 16.

[0076] В контексте данного документа термин «рецептор-связывающий домен C. botulinum» является синонимом с термином «H_C-домен» и означает любой рецептор-связывающий домен C. botulinum, природного происхождения, который может осуществлять этап связывания клетки в процессе интоксикации, включая, например, связывание токсина C. botulinum со специфической к токсину C. botulinum рецепторной системой, находящейся на поверхности плазматической мембраны клетки-мишени. Предполагается, что изменение активности связывания может быть достигнуто, например, посредством замещения целого H_C-домена C. botulinum H_C модифицированными (например, усиленным) H_C-доменом.

[0077] В контексте данного документа термин «клетка-мишень токсина C. botulinum» означает клетку, которая представляет собой клетку природного происхождения, интоксикацию которой может вызвать токсин C. botulinum природного происхождения, включая, без ограничений, двигательные нейроны; сенсорные нейроны; автономные нейроны; например, симпатические и парасимпатические нейроны; непептидергические нейроны, такие как, например, холинергические нейроны, адренергические нейроны, норадренергические нейроны, серотонинергические нейроны, GABAергические нейроны; и пептидергические нейроны, такие как, например, нейроны субстанции Р, нейроны кальцитонин-ген-связанного пептида, нейроны вазоактивного интестинального пептида, нейроны нейропептида Y и холецистокининовые нейроны.

[0078] Под «выделенным» подразумевается, что материал в разной степени очищен от компонентов, которые обычно сопровождают его в нативном состоянии. «Выделение» указывает на степень отделения от исходного источника или окружения, например, от фланкирующих аминокислот (например, в контексте выделенного полипептидного фрагмента), или от клетки или материала биологического образца.

[0079] Термин «очищенный» употребляется для обозначения субстрата, такого как полипептид, который является «по существу чистым» в отношении других компонентов препарата (например, других полипептидов). Он может относиться к полипептиду, который является, по меньшей мере, на около 50%, 60%, 70% или 75%, предпочтительно, по меньшей мере, на около 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, на около 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на около 95% чистым в отношении других компонентов. Перефразируя, можно сказать, что термины «по существу чистый» или «существенно очищенный», употребляемые по отношению к полипептиду, относятся к препарату, который содержит менее чем около 20%, более предпочтительно менее чем около 15%, 10%, 8%, 7%, наиболее предпочтительно менее чем около 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее 1% одного или более других компонентов (например, других полипептидов или клеточных компонентов).

[0080] В контексте данного документа термины «консервативная» или «консервативная мутация замены» относятся к мутации, в которой аминокислоту заменяют другой аминокислотой, имеющей аналогичные свойства, так, что специалист в области пептидной химии может ожидать, что вторичная структура, химические свойства и/или гидропатическая природа полипептида останутся практически неизменными. Следующие группы аминокислот традиционно заменяли друг на друга в качестве консервативных изменений: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, try, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; и (5) phe, tyr, trp, his. Другие общепринятые консервативные замены перечислены ниже:

[0081] Термин «мутация замены» без отсылки к конкретной аминокислоте может включать любую аминокислоту, отличную от остатка дикого типа, обычно находящегося в этой позиции. Такие замены могут представлять собой замещение неполярными (гидрофобными) аминокислотами, такими как глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан и пролин. Замены могут представлять собой замещение полярными (гидрофильными) аминокислотами, такими как серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Замены могут представлять собой замещение электрически заряженными аминокислотами, например, отрицательно электрически заряженными аминокислотами, такими как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, и положительно электрически заряженными аминокислотами, такими как лизин, аргинин и гистидин.

[0082] Описанные в данном документе мутации замены, как правило, будут представлять собой замещение отличным аминокислотным остатком природного происхождения, но в некоторых случая также может быть осуществлена замена аминокислотными остатками неприродного происхождения. В контексте данного документа аминокислоты неприродного происхождения представляют собой непротеиногенные (т. е. не кодирующие белок) аминокислоты, которые имеют природное происхождение или синтезируются химически. Примеры включают, но не ограничиваются этим, β-аминокислоты (β3 и β2), гомоаминокислоты, производные пролина и пировиноградной кислоты, 3-замещенные производные аланина, производные глицина, замещенные в кольце производные фенилаланина и тирозина, аминокислоты с линейным ядром, диаминокислоты, D-аминокислоты и N-метиламинокислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота может быть замещенной или незамещенной. Замещенная аминокислота или заместитель могут представлять собой галогенизированную ароматическую или алифатическую аминокислоту, галогенизированную ароматическую или алифатическую модификацию в гидрофобной боковой цепи или алифатическую или ароматическую модификацию.

[0083] Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которого достаточно, чтобы обеспечить терапевтически существенное снижение одного или более симптомов патологического состояния при введении типичному субъекту, имеющему это патологическое состояние. Терапевтически существенное снижение симптома составляет, например, около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 90%, около 100% или более по сравнению с контролем или не проходящим лечение субъектом.

[0084] Термины «лечить» или «лечение» относятся к терапевтическому лечению, целью которого является устранение или уменьшение симптомов. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются этим, устранение симптомов, облегчение симптомов, снижение степени патологического состояния, стабилизацию (т. е. отсутствие ухудшения) патологического состояния, торможение или замедление прогрессирования патологического состояния.

[0085] В контексте данного документа термин «субъект» относится к человеку или животному. Обычно животное представляет собой позвоночное, такое как примат, грызун, домашнее животное или игровое животное. Приматы включают шимпанзе, яванских макаков, паукообразных обезьян и макаков, например, резус. Грызуны включают мышей, крыс, лесных сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и игровые животные включают коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, быков, кошачьих, например, домашних кошек, собачьих, например, собак, лис, волков, птиц, например, кур, эму, страусов, и рыб, например, форелей, сомов и лососей. Пациенты или субъекты включаю любую подгруппу вышеперечисленных субъектов, например, всех вышеперечисленных субъектов, но за исключением одной или более групп или одного или более видов, такую как люди, приматы или грызуны. В определенных вариантах реализации описанных в данном документе аспектов субъект представляет собой млекопитающее, например, примата, например, человека. Термины «пациент» и «субъект» взаимозаменяемо употребляются в данном документе. Субъект может быть мужского или женского пола. Субъект может быть полностью развитым субъектом (например, взрослым) или субъектом, находящимся в процессе развития (например, ребенком, младенцем или плодом).

[0086] Предпочтительно субъект представляет собой млекопитающее. Млекопитающее может представлять собой человека, отличного от человека примата, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь или корову, но не ограничивается этими примерами. Млекопитающих, отличных от людей, можно преимущественно использовать в качестве субъектов, которые представляют животные модели нарушений, связанных с нежелательной нейрональной активностью. Кроме того, описанные в данном документе способы и композиции можно применять для лечения домашних животных и/или домашних любимцев.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0087] Файл этого патента или заявки содержит, по меньшей мере, один графический материал, выполненный в цвете. Копии этого патента или публикации патентной заявки с цветными графическими материалами будут предоставлены патентным ведомством после запроса и проведения необходимой оплаты.

[0088] Фиг. 1A-Фиг. 1D. (опубликованные данные по известному уровню техники) иллюстрируют схематические модели нацеливания BoNT на нейроны (Фиг. 1A), общая белковая структура (Фиг. 1B), список идентифицированных рецепторов (Фиг. 1C) и структурная модель связывания BoNT/B со своими рецепторами Syt и ганглиозидами (Фиг. 1D). (Фиг. 1A) Схематическое представления действия BoNT: BoNT распознают нейроны посредством связывания со своими специфическими рецепторами (этап 1), проникают в нейроны посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (этап 2), затем происходит транслокация легкой цепи BoNT через эндосомальные мембраны в цитозоль (этап 3), где эти легкие цепи действуют подобно протеазам, расщепляя белки хозяина-мишени (этап 4). Фиг. 1A взята из Arnon, S. et al, JAMA, 285:1059, 2001 24. (Фиг. 1B) BoNT состоят из легкой цепи и тяжелой цепи, соединенных дисульфидной связью. Тяжелую цепь можно дополнительно разделить на два домена: домен транслокации (H_N) и рецептор-связывающий домен (H_C). Эти функциональные домены допускают переключение между разными BoNT. Например, BoNT/B-H_C можно использовать для замещения BoNT/A-H_C для создания химерных токсинов. (Фиг. 1C) Список идентифицированных рецепторов токсинов. (Фиг. 1D) Структурная модель, показывающая связывание BoNT/B со своим белковым рецептором, Syt (I/II), а также липидными корецепторами, ганглиозидами, на поверхности клетки. Фиг. 1D взята из Chai et al, Nature, 444:1096, 2006³¹.

[0089] Фиг. 2A-Фиг. 2E. Бактериальный двугибридный скрининг (BACTH) позволил идентифицировать точечные мутации, которые усиливали связывание BoNT/B с h-Syt II. (Фиг. 2A) Верхняя панель: выравнивание последовательностей сайтов связывания BoNT/B в человеческом Syt II (h-Syt II, SEQ ID NO: 6) по сравнению с мышиным Syt II (m-Syt II, SEQ ID NO: 5). Нижняя панель: Вид в увеличенном масштабе поверхности раздела между H_CB и Syt II: остатки-мишени в BoNT/B для исследований мутагенеза помечены зеленым (светло-серым). Остатки Syt II отмечены пурпурным (темно-серым) с выделением F54, F55, и I58 (в прямоугольниках). (Фиг. 2B) Схематическая иллюстрация создания библиотек мутантных H_CB и анализа BATCH. (Фиг. 2C) Перечень положительных мутаций, определенных в анализе BATCH, которые приводили к появлению синих колоний. (Фиг. 2D) мутантов H_CB, перечисленных на панели С, дополнительно анализировали в анализе активности β-галактозидазы, который отображает уровень восстановленной аденилатциклазы. (n=6, *p < 0,05). (Фиг. 2E) мутации H_CB в сайтах E1191 исследовали в анализе с соосаждением, используя иммобилизованный m-Syt II (остатки 1-87) или мышиный Syt II (1-87), содержащий мутацию F54L, которая имитирует последовательность h-Syt II (обозначенную как h-Syt II). Выявление связанных вариантов H_CB проводили с помощью анализа иммуноблоттинга с выявлением метки HA, слитой с H_CB. Дополнительные мутации H_CB приведены на Фиг. 18 и Фиг. 21.

[0090] Фиг. 3A-Фиг. 3C. Комбинационные мутации в H_CB усиливали его связывание с h-Syt II и Syt I. (Фиг. 3A) Двойные мутации H_CB исследовали в анализе с соосаждением в отношении их способности связывать m-Syt II по сравнению с h-Syt II. Три двойные мутации, которые демонстрировали стабильное связывание с h-Syt II, отмечены красным (жирным). (Фиг. 3B) Количественную оценку связывания H_CB с h-Syt II проводили с помощью анализа БСИ. Репрезентативные кривые ассоциации и диссоциации приведены для H_CB ДТ и трех мутантов H_CB: E1191M/S1199Y, E1191V/S1199W и E1191C/S1199W. Параметры связывания для всех 12 двойных мутаций перечислены в таблице 4, а их репрезентативные кривые связывания приведены на Фиг. 19. (Фиг. 3C) Связывание H_CB ДТ, H_CB (E1191M) и H_CB (E1191M/S1199Y) с иммобилизованным GST-меченым h-Syt I (остатки 1-80) исследовали в анализе с соосаждением в присутствии (+) и отсутствие (-) ганглиозидов (Гангл.). Для связывания H_CB ДТ с h-Syt I необходимо присутствие корецепторов ганглиозидов, тогда как H_CB (E1191M) и H_CB (E1191M/S1199Y) связываются с h-Syt I в отсутствие ганглиозидов.

[0091] Фиг. 4A-Фиг. 4B. H_CB_MY демонстрировал стабильное связывание с гуманизированными нейронами, которые экспрессируют h-Syt II. (Фиг. 4A) Гуманизированные нейроны создавали посредством НД эндогенного Syt I и экспрессии полноразмерного h-Syt II в культуре крысиных кортикальных нейронов. Нейроны, которые экспрессируют полноразмерный m-Syt II или m-Syt II (F54L), служили в качестве дополнительного контроля. Эти нейроны подвергали воздействию H_CB ДТ с последующим анализом иммуноокрашивания. Выявление связанного H_CB проводили с помощью метки HA, слитой с H_CB. Синапсин метили как маркер для синаптических окончаний. H_CB ДТ связывался с синапсами нейронов ДТ, но не нейронов НД-Syt I. Экспрессия полноразмерного m-Syt II посредством лентивирусной трансдукции восстанавливала связывание H_CB, тогда как экспрессия полноразмерного m-Syt II (F54L) или полноразмерного h-Syt II не смогла восстановить связывание. (Фиг. 4B) НД Syt I элиминировал связывание H_CB_MY с нейронами. Связывание восстанавливали экспрессией полноразмерного m-Syt II, m-Syt II (F54L) или h-Syt II.

[0092] Фиг. 5A-Фиг. 5C. BoNT/B_MY демонстрировал повышенную эффективность в блокировании нейропередачи в гуманизированных нейронах. (Фиг. 5A) Гуманизированные нейроны создавали, как описано на Фиг. 4A. Эти нейроны подвергали воздействию градиента концентраций полноразмерного BoNT/B ДТ или BoNT/B_MY в течение 24 часов. Клеточные лизаты собирали и проводили анализ иммуноблоттинга. Β-тубулин служил в качестве внутреннего контроля нагрузки. BoNT/B_MY сильнее расщеплял VAMP2 чем BoNT/B ДТ при тех же концентрациях, что указывает, что BoNT/B_MY более эффективно проникал в нейроны, чем BoNT/B ДТ. (Фиг. 5B-Фиг. 5C) Гуманизированные нейроны подвергали воздействию градиента концентраций BoNT/B ДТ или BoNT/B_MY в течение 24 часов, а затем записывали активность mIPSC методом фиксации потенциала для цельных клеток. На панели B (Фиг. 5B) приведены репрезентативные записи mIPSC при 30 пм токсинов. На панели С (Фиг. 5C) приведена активность mIPSC в зависимости от концентрации токсинов, нормализованная относительно нейронов, которые не подвергали воздействию токсинов. Число записанных нейронов для каждой точки указывали в скобках. Запись для такого же числа нейронов проводили для BoNT/B ДТ и BoNT/B_MY. Определенная концентрация полумаксимального ингибирования (IC₅₀) составляла 89 пм для BoNT/B ДТ и 7,8 пм для BoNT/B_MY, демонстрируя, что повышение связывания с человеческими рецепторами повышало эффективность токсина на функциональном уровне в нейронах.

[0093] Фиг. 6A-Фиг. 6D. Вариации последовательностей в подтипах BoNT/B влияют на их способность связывать h-Syt II. (Фиг. 6A) Выравнивание последовательностей подтипов BoNT/B в области вблизи остатков E1191/S1199 в BoNT/B, включая BoNT/B1 (SEQ ID NO: 9); BoNT/B2 (SEQ ID NO: 10); BoNT/B3 (SEQ ID NO: 11); BoNT/B4 (SEQ ID NO: 12); BoNT/B5 (SEQ ID NO: 13); BoNT/B6 (SEQ ID NO: 14); BoNT/B7 (SEQ ID NO: 15); BoNT/B8 (SEQ ID NO: 16). (Фиг. 6B) H_CB4, который содержит Q1191 и Y1199, не связывался с h-Syt II в анализе фиксации потенциала. (Фиг. 6C) Существует шесть остатков, являющихся разными для H_CB4 и H_CB, среди 19 ключевых остатков, которые формируют связывающий карман для Syt I/II. Замещение всех шести остатков в H_CB4 соответствующими остатками в H_CB создавало мутантный H_CB4 (обозначаемый как «шесть мутаций»: V1113K/S1117P/S1196A/I1197P/A1182T/N1185Y), который может связываться с h-Syt II. Выравнивание последовательностей между H_CB1 и H_CB4 приведено на Фиг. 7. (Фиг. 6D) Связывание H_cB и H_cB4 с иммобилизованным GST-меченым h-Syt I исследовали в анализе с соосаждением. Для связывания H_cB с h-Syt I необходимо присутствие ганглиозидов, тогда как H_cB4 способен связывать h-Syt I без ганглиозидов в анализе с соосаждением.

[0094] Фиг. 7. Выравнивание Hc-домена аминокислотных последовательностей BoNT/B1 (SEQ ID NO: 17) и BoNT/B4 (SEQ ID NO: 18). Выравнивание Hc-домена полипептидных последовательностей BoNT/B1 и B4 позволяет выделить те аминокислоты, которые отличаются для этих двух штаммов серотипа B. Аминокислоты B4 V1113, S1117, S1196 и I1197 идентифицированы как остатки, которые модулируют способность Hc-домена B4 связывать молекулу человеческого Syt II. Фиг. 7 также подтверждает информацию, приведенную в таблице 5, с указанием звездочками 19 ключевых остатков, образующих Syt II-связывающий карман.

[0095] Фиг. 8 представляет аминокислотную последовательность BoNT/B-Hc (штамм 1; штамм Okra BoNT/B1). Остатки 857-1291 BoNT/B, штамм 1, GenBank: AB232927.1, (SEQ ID NO: 19).

[0096] Фиг. 9 представляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую BoNT/B-Hc (штамм B1, штамм Okra), остатки 857-1291 BoNT/B, штамм 1, на основании GenBank: AB232927.1), которая была оптимизирована для экспрессии в E. coli (SEQ ID NO: 20).

[0097] Фиг. 10 иллюстрирует аминокислотную последовательность серотипа А C. botulinum (1296 а. к.) (SEQ ID NO: 21).

[0098] Фиг. 11 иллюстрирует аминокислотную последовательность серотипа B C. botulinum (1291 а. к.) (SEQ ID NO: 22).

[0099] Фиг. 12 иллюстрирует аминокислотную последовательность серотипа С1 C. botulinum (1291 а. к.) (SEQ ID NO: 23).

[00100] Фиг. 13 иллюстрирует аминокислотную последовательность серотипа D C. botulinum (1276 а. к.) (SEQ ID NO: 24).

[00101] Фиг. 14 иллюстрирует аминокислотную последовательность серотипа Е C. botulinum (1252 а. к.) (SEQ ID NO: 25).

[00102] Фиг. 15 иллюстрирует аминокислотную последовательность серотипа F C. botulinum (1274 а. к.) (SEQ ID NO: 26).

[00103] Фиг. 16 иллюстрирует аминокислотную последовательность серотипа G C. botulinum (1297 а. к.) (SEQ ID NO: 27).

[00104] Фиг. 17 иллюстрирует аминокислотную последовательность серотипа B C.botulinum, штамм Eklund 17B (BoNT/B4) Genbank Ref: EF051570.1 (SEQ ID NO: 28).

[00105] Фиг. 18 иллюстрирует эффекты 13 разных одиночных мутаций замены на связывание мутированного H_C-домена BoNT/B1 с мышиным и человеческим Syt II.

[00106] Фиг. 19 иллюстрирует кривые биослоевой интерферометрии для связывания с человеческим Syt II для всех 12 комбинаций между первичными мутациями E1191M/C/V/Q, с совместимыми вторичными мутациями S1199W/Y и W1178Q, а также тройной мутацией E1191M/S1199W/W1178Q. Аффинность связывания (K_Д) всех 12 мутантов в отношении h-Syt II определяли, используя анализ биослоевой интерферометрии (БСИ) с параметрами, перечисленными в таблице 4.

[00107] Фиг. 20 иллюстрирует измерение методом анализа БСИ аффинности связывания двух основных H_C-доменных мутантов BoNT/B1 (E1191M/S1199Y и E1191V/S1199Y) в отношении h-Syt I. H_CB, содержащий E1191M/S1199Y (H_CB_MY) или E1191V/S1199Y (H_CB_VY), демонстрировал K_Д 2,9 мкм и 5,82 мкм соответственно.

[00108] Фиг. 21 иллюстрирует связывание H_cB-мутантов с m-Syt II и h-Syt II, которое исследовали в анализе с соосаждением, описанном на Фиг. 2E.

[00109] Фиг. 22 иллюстрирует связывание мутантного H_cB4 с m-Syt II и h-Syt II.

[00110] Фиг. 23A-Фиг. 23B иллюстрирует, что BoNT/B_MY, вырабатываемый в E.coli, является активным и может нейтрализоваться антителами к BoNT/B. Фиг. 23A) Полноразмерные BoNT/B и BoNT/B_MY очищали из E.coli. Эти токсины активировались эндопротеиназой Lys-C. Анализ ДСН-ПААГ позволил выявить, что токсин BoNT/B ДТ является на ~93% чистым, причем ~80% находится в двухцепочечной форме, а токсин BoNT/B_MY является на ~86% причем ~99% находится в двухцепочечной форме. Фиг. 23B) Культивируемые крысиные кортикальные нейроны подвергали воздействию BoNT/B_MY (1 нм в культуральной среде, 16 ч), который предварительно инкубировали с кроличьим поликлональным анти-BoNT/B антителом (разведение 1:200 в культуральной среде) или трехвалентной лошадиной антисывороткой против BoNT/A, B и E (разведение 1:40 в культуральной среде). Лизаты нейронов собирали через 16 ч. Расщепление VAMP2 анализировали в анализе иммуноблоттинга. BoNT/B_MY является активным, так как он расщеплял VAMP2 в нейронах. Как кроличье поликлональное анти-BoNT/B антитело, так и трехвалентная лошадиная антисыворотка легко нейтрализовали BoNT/B_MY. Актин служил в качестве внутреннего контроля нагрузки. Эти результаты подтверждают, что мутации E1191M/S1199Y не меняют иммуногенность BoNT/B.

[00111] Фиг. 24A-Фиг. 24B иллюстрирует сравнение между Syt I и Syt II и между человеческим и мышиным Syt I в области связывания BoNT/B. Фиг. 24A) Выравнивание последовательностей и структурное сравнение между мышиными Syt I (SEQ ID NO: 7) и Syt II (SEQ ID NO: 8). звездочками указаны консервативные остатки, которые взаимодействуют с BoNT/B, что можно видеть в модели структуры BoNT/B (вверху), связанного с Syt I (внизу, светло-серый цвет) и Syt II (внизу, темно-серый цвет). Связывание Syt I с BoNT/B моделировали на основании доступных кристаллических структур BoNT/B-Syt II (PDB: 4KBB). Фиг. 24B) Выравнивание последовательности человеческого Syt I (SEQ ID NO: 4) по сравнению с мышиным/крысиным Syt I (SEQ ID NO: 29) в пределах BoNT/B-связывающего домена. Жирным выделено единственное отличие, E45 в человеческом Syt I и Q в мышином/крысином-Syt I. Эта модель иллюстрирует, что боковая цепь остатка 45 (указанная стрелкой) выступает наружу из сайта связывания и не взаимодействует с BoNT/B.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[00112] Аспекты данного изобретения относятся к созданию полипептидов и нуклеиновых кислот, кодирующих такие полипептиды, содержащие модифицированный рецептор-связывающий домен Clostridium botulinum (например, серотипа B (B-H_c)), и, в частности, к полипептидам нейротоксина C. botulinum (BoNT), которые характеризуются улучшенным связыванием со своими человеческими рецепторами посредством включения модифицированного рецептор-связывающего домена, и нуклеиновым кислотам, кодирующим такие полипептиды. По результатам этих исследований можно создавать новое поколение терапевтических BoNT, которые содержат определенные в данном документе модифицированные рецептор-связывающие домены, с улучшенной эффективностью и специфичностью в отношении нацеливания на человеческие нейроны по сравнению с применяемыми на сегодняшний день BoNT.

[00113] Ранее было определено, что связывание полипептидов H_c BoNT/B с молекулой человеческого рецептора Syt II может быть существенно повышено с помощью мутаций в остатках, соответствующих остаткам Hc BoNT/B1 E1191 и S1199. Смотрите PCT/US2016/024211, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. В частности, мутация H_C-домена BoNT/B1 в остатке E1191 на Q, M, C, V, L или Y повышала связывание hSyt II по сравнению с ДТ. Мутация E1191M обеспечивала наиболее резкое повышение связывания, но E1191Q также существенно стимулировала связывание. Смотрите, например, Фиг. 2D и E. Комбинация мутации H_c BoNT/B1 E1191M с мутацией остатка S1199 на Y дополнительно повышала связывание молекулы BoNT/B1 с рецептором hSyt II. Двойные мутанты демонстрировали сильное связывание с человеческими нейронами, которые экспрессируют молекулу рецептора hSyt II, и демонстрировали повышенную эффективность блокирования нейропередачи. Смотрите Фиг. 4 и 5.

[00114] Было отмечено, что H_c-домен BoNT серотипа B4 (BoNT/B4) ДТ содержит глутамин и тирозин в позициях, соответствующих E1191 и S1199 молекулы серотипа B1, и, следовательно, соответствует двойному мутанту E1191Q, S1199Y молекулы серотипа B1, который, как можно ожидать, будет стимулировать сильное связывание. Интересно, что несмотря на содержание глутамина и тирозина в этих позициях в белке серотипа B1, который стимулирует связывание и активность нейротоксина серотипа B1, молекула B4 дикого типа не демонстрирует эффективное связывание с молекулой рецептора hSyt II. Таким образом, аминокислоты, отличные от Q1191 и Y1199 молекулы B4, должны быть важными для связывания с молекулой hSyt II.

[00115] Как описано в примерах данного документа, было обнаружено, что проведение мутаций четырех из девятнадцати аминокислот H_c-домена молекулы, которые отличаются для серотипов B1 и B4, обеспечивало сильное связывание hSyt II по сравнению с молекулой серотипа B4. В частности, было обнаружено, что аминокислоты B4 V1113, S1117, S1196 и I1197 являются важными для связывания B4 с hSyt II. Мутация этих остатков на соответствующие остатки молекулы серотипа B1 обеспечивала сильное связывание по сравнению с молекулой серотипа B4, что означает, что мутации B4 V1113K, S1117P, S1196A и I1197P обеспечивали сильное связывание hSyt II. Таким образом, H_c-доменный мутант B4, содержащий эти мутации помимо Q1191 и Y1199 природного происхождения, можно использовать в препаратах модифицированного нейротоксина C. botulinum для терапевтических или косметических применений. Также следует понимать, что можно ожидать, что дополнительная модификация H_c-мутанта B4, включающая внесение мутаций V1113K, S1117P, S1196A и I1197P, например, мутаций, которые стимулируют связывание молекулы серотипа B1 с hSyt II, отдельно или в комбинации, будет стимулировать связывание модифицированного Hc-домена серотипа B4. Таким образом, также можно ожидать, что в B4-мутанте, содержащем мутации V1113K, S1117P, S1196A, и I1197P, дополнительная мутация, например, Q1191 на, например, C, V, L, Y, M и/или Y1199 на, например, W, E или H будет положительно влиять на связывание. Как один из примеров, вероятно, что нейротоксин BoNT, содержащий H_c-доменный мутант B4, содержащий мутации V1113K, S1117P, S1196A и I1197P плюс мутацию Q1191M, также будет демонстрировать сильное связывание и влияние на активность нейропередачи.

[00116] Далее приведено дополнительное описание исследований, которые привели к описанным в данном документе открытиям, и особенностей, которые специалисту в данной области техники следует учитывать, чтобы применять их в способах и композициях, описанных в данном документе.

Варианты реализации изобретения

[00117] Открытие того, что BoNT/B является менее специфическим и эффективным у людей вследствие своей неспособности связывать человеческий Syt II, может объяснить необходимость сравнительно высоких доз по сравнению с BoNT/A. Более высокие дозы BoNT/B соответствуют увеличению шансов стимуляции ответа антител или возникновения серьезных побочных явлений. Следовательно, повышение связывания BoNT/B с человеческим рецептором Syt II для повышения его эффективности и специфичности в отношении нацеливания на человеческие нейроны должно позволить снизить количество применяемых доз токсинов в терапевтических применениях.

[00118] Аспекты этого изобретения основаны на открытии, что модификация последовательности H_C BoNT серотипа B4 модифицирует связывание этого фрагмента, содержащего рецептор-связывающий домен, с человеческим рецептором Syt II. Были определены конкретные модификации, которые повышают связывание, создавая, таким образом, домен, который связывает человеческий Syt II с высокой аффинностью. В контексте полноразмерного белка BoNT модифицированный BoNT/B4-H_C, сохраняет эти связывающие свойства. Включение модифицированного рецептор-связывающего домена с повышенным связыванием в молекулу, содержащую другие домены BoNT, позволяет создавать полноразмерную молекулу BoNT с аналогичным образом повышенным связыванием рецептора. Следовательно, создаются новые версии BoNT с высокоаффинным связыванием с человеческим Syt II. BoNT с существенно повышенным связыванием можно применять в аналогичных видах терапии, но в меньших дозах, чем доступные на сегодняшний день молекулы BoNT, обеспечивая, таким образом, более безопасные способы лечения.

[00119] Полипептиды BoNT, включая полноразмерные полипептиды BoNT и фрагменты или домены полипептидов BoNT, описанные в данном документе (например, модифицированный BoNT/H_C), а также молекулы нуклеиновых кислот, которые их кодируют, явным образом включены в это изобретение. Эти полипептиды и молекулы нуклеиновых кислот можно создавать с помощью технологий рекомбинантных ДНК, известных в данной области техники. Такие полипептиды или полинуклеотиды, как правило, называются «рекомбинантными полипептидами» или «рекомбинантными нуклеиновыми кислотами».

Белок ботулинического нейротоксина

[00120] Один аспект этого изобретения относится к белку ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащему модифицированный рецептор-связывающий домен (например, Clostridium botulinum серотипа B4), как описано в данном документе. Белок BoNT дополнительно содержит протеазный домен, домен транслокации и сайт расщепления протеазами. Как правило, они расположены в одном полипептиде в линейном порядке от амино- к карбокси-концу: протеазный домен, сайт расщепления протеазами, домен транслокации и модифицированный рецептор-связывающий домен. Однако ожидается, что разные варианты расположения различных доменов будут демонстрировать нормальную функциональность. В одном варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен содержит одну или более мутаций замены, которые приводят к существенному повышению связывания с человеческим рецептором Syt I и/или человеческим рецептором Syt II.

[00121] Белок BoNT может дополнительно содержать домен, который применяется для очистки молекулы, такой как гексагистидиновая метка (His6) (SEQ ID NO: 1), или эпитопная метка, такая как гемагглютининовая метка (HA) (YPYDVPDYA) (SEQ ID NO: 2). В данной области техники известны различные домены, которые используются в таких целях.

[00122] Общая структура BoNT проиллюстрирована на Фиг. 1B. BoNT состоит из трех доменов, каждый из которых имеет специальную и независимую функцию: протеазный домен (также называемый легкой цепью), домен транслокации (H_N) и рецептор-связывающий домен (H_C). Было показано, что домены различных штаммов нейротоксинов C. botulinum являются во многом взаимозаменяемыми (как продемонстрировано химерными токсинами природного происхождения, такими как BoNT/CD, который состоит из легкой цепи и H_N из BoNT/C и H_C из BoNT/D (52), в патенте США 8052979, включенном в данный документ посредством ссылки). Белок может находиться в одноцепочечной форме или в двухцепочечной форме. Двухцепочечная форма является результатом природного процессинга протеазами сайта расщепления протеазами, расположенного между протеазным доменом и доменом транслокации. Белок сохраняется в двухцепочечной форме после процессинга протеазами за счет наличия дисульфидной связи.

[00123] Штаммы Clostridium botulinum вырабатывают несколько антигенно-отличных типов ботулинических токсинов, которые были идентифицированы при исследовании вспышек ботулизма у людей (BoNT/A, /B, /E и /F), животных (BoNT/C1 и /D) или выделены из почвы (BoNT/G). Хотя все серотипы BoNT имеют сходные структурные и фармакологические свойства, каждый из них также демонстрирует гетерогенные бактериологические характеристики. Генетическое разнообразие штаммов C. botulinum подробно описано в Hill et al. (Journal of Bacteriology, Vol. 189, No. 3, p. 818-832 (2007)) (53), содержание которой включено в данный документ посредством ссылки. В одном варианте реализации изобретения BoNT согласно изобретению имеет домены, которые все принадлежат одному серотипу (A, B, C, D, E, F или G). В одном варианте реализации изобретения один или более из этих доменов одного серотипа отличаются относительно своего штамма и/или подтипа.

[00124] Токсины различных серотипов/штаммов C. botulinum характеризуются одинаковой организацией функциональных доменов и общей структурной архитектурой. Каждый из токсинов C. botulinum транслируется в виде одноцепочечного полипептида массой приблизительно 150 кДа, который впоследствии протеолитически расщепляется в пределах дисульфидной петли протеазами природного происхождения, такими как, например, эндогенная протеаза токсина C. botulinum или протеаза природного происхождения, вырабатываемая в окружающей среде. Этот посттрансляционный процессинг приводит к образованию двухцепочечной молекулы, содержащей приблизительно 50 кДа легкую цепь (LC) и приблизительно 100 кДа тяжелую цепь (HC), удерживаемые вместе одной дисульфидной связью и нековалентными взаимодействиями. Каждая зрелая двухцепочечная молекула содержит три функционально отличных домена: 1) протеолитический домен, расположенный в LC, который содержит металлопротеазную область, характеризуемую цинк-зависимой эндопептидазной активностью, которая специфическим образом нацелена на коровые компоненты аппарата высвобождения нейромедиаторов; 2) домен транслокации, содержащийся в амино-концевой половине HC (H_N), который облегчает высвобождение LC из внутриклеточных везикул в цитоплазму клетки-мишени; и 3) связывающий домен, находящийся в карбокси-концевой половине HC, который определяет активность связывания и специфичность связывания токсина с рецепторным комплексом, расположенным на поверхности клетки-мишени. Расположение конкретных доменов в токсинах различных серотипов/штаммов приведено в таблице 1:

ТАБЛИЦА 1

Домены токсинов C. botulinum из различных серотипов/штаммов

Токсин	LC	HN	HC
BoNT/A	M1-K448	A449-K871	N872-L1296
BoNT/B	M1-K441	A442-S858	E859-E1291
BoNT/C1	M1-K449	T450-N866	N867-E1291
BoNT/D	M1-R445	D446-N862	S863-E1276
BoNT/E	M1-R422	K423-K845	R846-K1252
BoNT/F	M1-K439	A440-K864	K865-E1274
BoNT/G	M1-K446	S447-S863	N864-E1297

[00125] Полные аминокислотные последовательности токсинов приведены на Фиг. 10-16. Полная аминокислотная последовательность полипептида нейротоксина BoNT/B4 (также называемого штаммом Eklund) приведена на Фиг. 17.

[00126] Связывающая, транслокационная и протеазная активность этих трех функциональных доменов необходимы для токсичности. Общий механизм клеточной интоксикации, посредством которого токсины C. botulinum проникают в нейрон и ингибируют высвобождение нейромедиаторов, является аналогичным вне зависимости от серотипа или подтипа. Не ограничиваясь теорией, считается, что механизм интоксикации включает, по меньшей мере, четыре этапа: 1) связывание рецептора, 2) интернализация комплекса, 3) транслокация легкой цепи и 4) протеазная модификация мишени. Этот процесс инициируется, когда H_C-домен токсина C. botulinum связывается с токсин-специфическим рецептором, расположенным на поверхности плазматической мембраны клетки-мишени. Считается, что специфичность связывания рецепторного комплекса обеспечивается, частично, специфическими комбинациями ганглиозидов и белковых рецепторов. После связывания комплексы токсин/рецептор интернализуются посредством эндоцитоза, а интернализованные везикулы распределяются по конкретным внутриклеточным путям. Этап транслокации инициируется окислением компартмента везикулы. После транслокации эндопептидаза легкой цепи токсина высвобождается из внутриклеточной везикулы в цитозоль, где она специфическим образом нацеливается на один из трех белков, известных как коровые компоненты аппарата высвобождения нейромедиаторов (везикуло-ассоциированный мембранный белок (VAMP)/синаптобревин, синаптосомально-ассоциированный белок массой 25 кДа (SNAP-25) и синтаксин). Эти коровые компоненты необходимы для стыковки и слияния синаптической везикулы с нервным окончанием и являются представителями семейства растворимых белковых рецепторов присоединения N-этилмалеимид-чувствительного фактора (SNARE). BoNT/A и BoNT/E расщепляют SNAP-25 в карбокси-концевой области, высвобождая девяти- или двадцати шести-аминокислотный сегмент, соответственно, а BoNT/C1 также расщепляет SNAP-25 вблизи карбокси-конца. Серотипы botulinum BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G и столбнячного токсина действуют на консервативную центральную часть VAMP и высвобождают амино-концевую часть VAMP в цитозоль. BoNT/C1 расщепляет синтаксин в одном сайте вблизи поверхности цитозольной плазматической мембраны. Избирательный протеолиз синаптических SNARE является причиной блокирования высвобождения нейромедиаторов токсинами C. botulinum in vivo. Белки-мишени токсинов C. botulinum SNARE являются обычными для экзоцитоза во многих не-нейрональных типах клеток; в этих клетках, как и в нейронах, активность пептидазы легкой цепи ингибирует экзоцитоз, смотрите, например, Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).

Домены и химерные нейротоксины

[00127] Описанные в данном документе ботулинические нейротоксины содержат модифицированный рецептор-связывающий домен (H_C). Модифицированный рецептор-связывающий домен демонстрирует существенно повышенное связывание с одним или более человеческими рецепторами, обычно связываемыми и используемыми одним или более штаммами токсинов C. botulinum (например, Syt II, Syt I). Модифицированный рецептор-связывающий домен будет представлять собой модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа B4 (описанный в данном документе). Он может относиться к такому же или отличному серотипу, штамму/подтипу, что и один или более доменов в BoNT. Примеры конкретных модифицированных рецептор-связывающих доменов приведены в данном документе. Описанный в данном документе выделенный полипептид модифицированного рецептор-связывающего домена также включен в данное изобретение, как и выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которой он кодируется.

[00128] Ботулинический нейротоксин согласно данному изобретению также содержит протеазный домен, также называемый в данной области техники вариантом легкой цепи. Вариант легкой цепи может представлять собой вариант легкой цепи природного происхождения, например, изоформу легкой цепи токсина C. botulinum и подтип легкой цепи токсина C. botulinum; или вариант легкой цепи токсина C. botulinum неприродного происхождения, например, вариант легкой цепи токсина C. botulinum с консервативной заменой. Протеазный домен может принадлежать любому серотипу (A, B, C, D, E, F или G), штамму или подтипу (как описано в данном документе). Он может относиться к такому же или отличному серотипу, штамму/подтипу, что и один или более доменов в BoNT. В одном варианте реализации изобретения протеазный домен принадлежит серотипу B. В одном варианте реализации изобретения протеазный домен принадлежит серотипу А.

[00129] Ботулинический нейротоксин согласно данному изобретению также содержит домен транслокации токсина (H_N). Домен транслокации токсина может принадлежать любому серотипу (A, B, C, D, E, F или G), штамму или подтипу (как описано в данном документе). Он может относиться к такому же или отличному серотипу, штамму/подтипу, что и один или более доменов в BoNT. В одном варианте реализации изобретения H_N принадлежит серотипу B. В одном варианте реализации изобретения H_N принадлежит серотипу А.

[00130] Различные домены, описанные в данном документе (например, H_N, H_C или протеазный домен), включают, без ограничений, варианты природного происхождения, например, изоформы и подтипы; варианты неприродного происхождения, например, мутации с консервативными заменами. Вариант неприродного происхождения относится к домену, который имеет, по меньшей мере, одно аминокислотное изменение относительно соответствующей области эталонных последовательностей (например, из таблицы 1 или Фиг. 8 или 10-17) и может быть описан с помощью процента идентичности с соответствующей областью этой эталонной последовательности.

[00131] Хотя понятно, что описанные в данном документе варианты ботулинического нейротоксина будут содержать модифицированный H_C-домен серотипа B4, специалистам в данной области техники известно, что в рамках каждого серотипа токсина C. botulinum могут быть варианты доменов C. botulinum природного происхождения, которые несколько отличаются по аминокислотной последовательности, а также нуклеиновые кислоты, кодирующие эти белки. Вариант домена (например, легкой цепи, H_N или H_C) токсина C. botulinum природного происхождения, предусмотренный для применения при создании BoNT согласно данному изобретению, может функционировать по существу таким же образом, что и эталонный домен токсина C. botulinum, который лежит в основе варианта домена C. botulinum природного происхождения, и может быть замещен эталонным доменом токсина C. botulinum.

[00132] Неограничивающим примером варианта домена токсина C. botulinum природного происхождения является изоформа домена токсина C. botulinum, такая как, например, изоформа домена BoNT/A, изоформа домена BoNT/B, изоформа домена BoNT/C1, изоформа домена BoNT/D, изоформа домена BoNT/E, изоформа домена BoNT/F и изоформа домена BoNT/G. Изоформа домена токсина C. botulinum может функционировать по существу таким же образом, что и эталонный домен токсина C. botulinum, который лежит в основе изоформы домена токсина C. botulinum, и может быть замещена эталонным доменом токсина C. botulinum.

[00133] Другим неограничивающим примером варианта домена токсина C. botulinum природного происхождения является подтип домена токсина C. botulinum, такой как, например, домен из подтипа BoNT/A1, BoNT/A2,BoNT/A3, BoNT/A4, BoNT/A5; домен из подтипа BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B4, BoNT/B5, BoNT/B6, BoNT/B7; домен из подтипа BoNT/C1-1, BoNT/C1-2, BoNT/D-C; домен из подтипа BoNT/E1, BoNT/E2, BoNT/E3, BoNT/E4, BoNT/E5, BoNT/E6, BoNT/E7, BoNT/E8; и домен из подтипа BoNT/F1, BoNT/F2, BoNT/F3, BoNT/F4, BoNT/F5, BoNT/F6, BoNT/F7. Подтип домена токсина C. botulinum может функционировать по существу таким же образом, что и эталонный домен токсина C. botulinum, который лежит в основе подтипа домена токсина C. botulinum, и может быть замещен эталонным доменом токсина C. botulinum.

[00134] В контексте данного документа термин «вариант неприродного происхождения» (например, вариант легкой цепи токсина C. botulinum, H_C и H_N ) означает домен C. botulinum, получаемый посредством вмешательства человека, включая, без ограничений, домены, получаемые путем генной инженерии и применением случайного мутагенеза или рационального конструирования, и домены C. botulinum, получаемые с помощью химического синтеза. Неограничивающим примеры вариантов доменов C. botulinum неприродного происхождения включают, например, консервативные варианты доменов C. botulinum. В контексте данного документа термин «консервативный вариант домена C. botulinum» означает домен C. botulinum, который содержит, по меньшей мере, одну аминокислоту, замещенную другой аминокислотой или аминокислотным аналогом, которые имеют, по меньшей мере, одно свойство, аналогичное оригинальной аминокислоте из последовательности эталонного домена C. botulinum (например, таблица 1 и Фиг. 8 и 10-17). Вариант может содержать одну, две, три, четыре, пять или более консервативных аминокислотных замен по сравнению с последовательностью эталонного домена. Примеры свойств включают, без ограничений, аналогичные размер, топографию, заряд, гидрофобность, гидрофильность, липофильность, способность в ковалентному связыванию, способность к водородному связыванию, физико-химические свойства и т. п. или любую их комбинацию. Консервативный вариант домена C. botulinum может функционировать по существу таким же образом, что и эталонный домен токсина C. botulinum, который лежит в основе консервативного варианта домена токсина C. botulinum, и может быть замещен эталонным доменом C. botulinum в любом аспекте данного изобретения.

[00135] Вариант домена токсина C. botulinum неприродного происхождения может содержать одну или более замещенных аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более) по сравнению с эталонным доменом токсина C. botulinum, который лежит в основе домена токсина C. botulinum природного происхождения. Вариант домена токсина C. botulinum неприродного происхождения также может характеризоваться 95% или более (например, 96%, 97%, 98% или 99%) аминокислотной идентичности с доменом токсина C. botulinum, который лежит в основе домена C. botulinum природного происхождения.

[00136] Различные нейротоксины C. botulinum неприродного происхождения или их конкретные домены описаны в Международных патентных публикациях WO95/32738, WO96/33273, WO98/07864 и WO99/17806, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Описанный в данном документе нейротоксин C. botulinum или его конкретный домен обычно будет содержать аминокислотные остатки природного происхождения, но в некоторых случаях также могут присутствовать аминокислотные остатки неприродного происхождения. Следовательно, так называемые «пептидные миметики» и «пептидные аналоги», которые могут включать отличные от аминокислот структуры, которые имитируют структуру конкретной аминокислоты или конкретного пептида, также можно использовать в контексте этого изобретения. Такие миметики или аналоги в общем случае демонстрируют аналогичные физические характеристики, такие как размер, заряд или гидрофобность, и соответствующую пространственную ориентацию, которые встречаются у их природных пептидных эквивалентов. Конкретным примером соединения пептидного миметика является соединение, в котором амидная связь между одной или более аминокислотами замещена, например, углерод-углеродной связью или другой неамидной связью, как хорошо известно в данной области техники (смотрите, например, Sawyer, в Peptide Based Drug Design, pp. 378-422, ACS, Washington D.C. 1995).

[00137] Описанный в данном документе модифицированный ботулинический нейротоксин содержит модифицированный рецептор-связывающий домен C. botulinum серотипа B4 (BoNT/B-H_C), который содержит четыре мутации замены относительно H_C-домена дикого типа или штамма Eklund: V1113K, S1117P, S1196A и I1197P. Эти заместительные варианты приводят к существенному повышению связывания с человеческим рецептором Syt II. Аминокислотная последовательность BoNT/B4-H_C штамма Eklund, используемая в качестве эталонной матрицы в данном изобретении, приведена на Фиг. 17 (также смотрите эталонную последовательность NCBI: YP_ 001893661.1, Genbank Ref: EF051570.1). Создание более длинных молекул, которые содержат модифицированный B4-H_c, таких как полный BoNT или полипептид, содержащий модифицированный B-H_C, явным образом предусматривается в данном документе.

[00138] Диффузия токсинов и генерация нейтрализующих антител являются проблемами, связанными с BoNT/B, но не ограниченными им, так как их также наблюдали для BoNT/A. Улучшение аффинности связывания BoNT/A со своим рецептором SV2 могло бы решить эти проблемы. Так как связывание BoNT/B с Syt I/II характеризуется намного большей аффинностью, чем связывание BoNT/A с SV2, модифицированный рецептор-связывающий домен BoNT/B (BoNT/B-H_C) со способностью связывать человеческий Syt II также можно использовать для замещения BoNT/A-H_C для создания модифицированного химерного BoNT/A, который может иметь большую эффективность и специфичность в отношении человеческих нейронов, чем BoNT/A ДТ. (49-51).

[00139] Дополнительно предусматривается, что вышеописанный модифицированный H_C B4 можно использовать для замещения H_C во всех других серотипах/штаммах BoNT. Следовательно, другой аспект этого изобретения относится к полипептиду BoNT, модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа B4 (H_C), сопряженный с одним или более доменами другого серотипа (A, C, D, E, F или G), штамма или подтипа, для получения, таким образом, химерного нейротоксина. H_C-область каждого BoNT хорошо определена, а в молекуле BoNT можно проводить замену соответствующих H_C-областей (например, посредством генной инженерии). Такие манипуляции обычно осуществляются специалистом-практиком посредством стандартного ПЦР-слияния ДНК, кодирующей BoNT/B-H_C, с легкой цепью (LC) и доменом транслокации (H_N) или H_N-LC других BoNT, которые были хорошо изучены в данной области техники. Кроме того, замещение также можно проводить, используя С-концевую часть BoNT/B-H_C (обозначаемую H_CC), которая представляет собой область, содержащую сайт связывания для белковых рецепторов и ганглиозидов в каждом BoNT. Получаемые в результате химерные токсины будут обладать способностью нацеливания на человеческие нейроны посредством связывания с человеческим Syt I/II. В качестве неограничивающего примера можно использовать модифицированный BoNT/B4-H_C (или BoNT/B4-H_CC) для замещения H_C (или H_CC) BoNT/A. Получаемые в результате полипептиды входят в объем данного изобретения. Эти химерные токсины могут иметь более высокую эффективность и специфичность нацеливания на человеческие нейроны, чем BoNT/A ДТ. Такой химерный токсин BoNT/A может быть использован для терапевтических применений у людей и обеспечивать значительное улучшение по сравнению с BoNT/A ДТ.

[00140] Один аспект относится к выделенному, очищенному полипептиду рецептор-связывающего домена, описанному в данном документе. В одном варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен представляет собой модифицированный BoNT/B4-H_C. В одном варианте реализации изобретения B4-H_c создан из отличного штамма и/или подтипа BoNT путем замены аминокислот, которые соответствуют конкретной (-ым) позиции (-ям) в B4, описанным в данном документе. В одном варианте реализации изобретения H_C относится к подтипу B1, B2, B3, B5, B6 или B7. В одном варианте реализации изобретения модифицированный B-Hc не принадлежит штамму 3, 7 или 8.

[00141] Данное изобретение включает мутантный полноразмерный BoNT, который содержит модифицированный H_C (например, B4-H_C) с описанными в данном документе аминокислотными заменами, для терапевтических применений на людях. В одном варианте реализации изобретения полноразмерный BoNT содержит модифицированный H_C (например, B4-H_C) с аминокислотными заменами V1113K, S1117P, S1196A и I1197P и дополнительно содержит аминокислотную замену в одной или более комбинациях аминокислотных остатков, соответствующих позициям Q1191, Y1199, Y1183 и W1178 в B4 (например, выбранных из перечисленных в таблице 2). В одном варианте реализации изобретения BoNT содержит модифицированный H_C B4 с аминокислотными заменами V1113K, S1117P, S1196A и I1197P, и одну дополнительную аминокислотную замену, как описано в данном документе. В одном варианте реализации изобретения BoNT содержит модифицированный H_C B4 с аминокислотными заменами V1113K, S1117P, S1196A и I1197P, и две дополнительные аминокислотные замены, как описано в данном документе. В одном варианте реализации изобретения BoNT содержит модифицированный H_C B4 с аминокислотными заменами V1113K, S1117P, S1196A и I1197P, и три дополнительные аминокислотные замены, как описано в данном документе. В одном варианте реализации изобретения модифицированный B-Hc не принадлежит штамму 3, 7 или 8.

[00142] Получаемый в результате токсин BoNT может характеризоваться существенно повышенным связыванием с человеческим Syt II, и, следовательно, будет обеспечивать большую эффективность и специфичность в отношении нацеливания на человеческие нейроны, чем BoNT ДТ. Получаемый в результате мутант может дополнительно сохранять аналогичное связывание с человеческим Syt I, характеризоваться существенно повышенным связыванием с человеческим Syt I или характеризоваться существенно сниженным связыванием с человеческим Syt I. Полипептиды и химерные полипептиды

[00143] Другой аспект этого изобретения относится к полипептиду, содержащему модифицированный рецептор-связывающий домен BoNT/B4. В одном варианте реализации изобретения модифицированный Hc, в контексте полипептида, характеризуется существенно повышенным связыванием с человеческим Syt II и/или Syt I по сравнению с аналогичным полипептидом с аминокислотами ДТ в конкретных позициях модифицированного Hc (эквивалент серотипа B4 дикого типа). В одном варианте реализации изобретения модифицированный H_c серотипа B4 создан из отличного серотипа, штамма и/или подтипа BoNT путем замены аминокислот, которые соответствуют конкретной (-ым) позиции (-ям) в B4, описанным в данном документе. В одном варианте реализации изобретения модифицированный B-Hc не принадлежит штамму 3, 7 или 8. В одном варианте реализации изобретения получаемый в результате полипептид обладает способностью к нацеливанию на человеческие нейроны посредством связывания с человеческим Syt I/II.

[00144] Полипептид, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен, может представлять собой слитый белок рецептор-связывающего домена и другого функционального полипептида (например, функционального полипептида, используемого в 2-гибридной системе (приманка или жертва, такие как T18 или T25, или глутатион-S-трансфераза (GST)). Также он может относиться к химерной полипептидной молекуле. В альтернативном варианте он может представлять собой слияние модифицированного рецептор-связывающего домена и полипептидной метки в целях идентификации и/или целях очистки (например, гексагистидиновой метки (His6) (SEQ ID NO: 1) или эпитопной метки, такой как гемагглютининовая метка (HA) (YPYDVPDYA) (SEQ ID NO: 2), или GST), многие из которых известны и обычно используются в данной области техники. Слияние может содержать участок из аминокислот между соответствующими функциональными доменами, который облегчает связывание, служит в качестве сайта расщепления или для сохранения независимой конформации и/или функции. В одном варианте реализации изобретения связь сохраняет функцию модифицированного рецептор-связывающего домена. В одном варианте реализации изобретения связь маскирует функцию модифицированного рецептор-связывающего домена. Другой аспект этого изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует любой из таких полипептидов.

[00145] Модифицированный BoNT/B4 H_C может быть связан с другими агентами (например, белками, малыми молекулами, короткими полипептидами, нуклеиновыми кислотами) ковалентно (например, в виде слитого белка) или нековалентно. Таким образом, другой аспект этого изобретения относится к химерной молекуле, содержащей первую часть, которая представляет собой модифицированный рецептор-связывающий домен C.botulinum (например, серотипа B4), описанный в данном документе, связанную со второй частью. Вторая часть молекулы может представлять собой биоактивную (или «биологически активную») молекулу, такую как терапевтический агент (например, полипептидный или неполипептидный лекарственный препарат, такой как малая молекула или нуклеиновая кислота). Связь между первой и второй частями молекулы может быть ковалентной (например, в форме слитого белка) или нековалентной. Способы такого связывания известны в данной области техники и могут легко применяться специалистом-практиком. Одним из применений химерной молекулы согласно изобретению является применение ее в качестве инструмента доставки в нейроны-мишени в организме человека. Например, модифицированный BoNT/H_C может быть связан с другими терапевтическими агентами, чтобы служить нацеливающим носителем для доставки терапевтических агентов в нейроны в организме человека посредством связывания с человеческим Syt I и/или Syt II.

Модификации рецептор-связывающего домена (Hc)

[00146] Как обсуждалось в данном документе, это изобретение относится к модифицированному Hc и полипептидам, содержащим такой модифицированный Hc (например, BoNT или слияние, или химерный полипептид). Модификацию аминокислотной последовательности Hc, используемую для создания различных полипептидов согласно изобретению, можно осуществлять различными способами, известными специалисту-практику. Примеры включают, без ограничений, нацеленный мутагенез (сайт-направленный мутагенез) или случайный мутагенез каждого аминокислотного остатка в пределах области, связывающей Syt I/II. Эти Syt-связывающие области были хорошо определены в предыдущих исследованиях в отношении мышиных или крысиных рецепторов Syt, но не были четко определены в случае взаимодействия между BoNT/B-H_c и человеческими рецепторами Syt. Разные подтипы BoNT/B или другие серотипы, которые связываются с Syt I/II (D-C или G), можно использовать в качестве матрицы для создания одинаковых или сходных мутаций путем генерации соответствующих мутаций, описанных в данном документе для B4-H_C. Соответствующую позицию выбранных для проведения мутации остатков можно легко определить по выравниванию последовательностей с подтипом B4. Получаемые в результате полипептидные продукты включены в данное изобретение, как и полипептиды, содержащие указанные продукты, и молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие указанные полипептиды и продукты.

[00147] Модификации аминокислотной последовательности H_C для получения модифицированного рецептор-связывающего домена могут представлять собой мутацию одного остатка на отличную аминокислоту (замена в одном сайте), мутацию сразу нескольких остатков (замена в нескольких сайтах), делецию одного или более остатков (делеция) и вставку одного или более остатков (вставка), а также их комбинации. Способы белковой мутации хорошо известны в данной области техники (например, направленные замены в одном сайте или более сайтах в ДНК, кодирующей последовательность BoNT/H_C).

[00148] В одном варианте реализации изобретения модифицируют один или более остатков в H_C, которые контактируют с крысиным Syt II или окружающими областями, согласно литературным данным по рецептор-связывающему домену BoNT/B (29) _ENREF_29 и известной структуре BoNT/B-Syt II (PDB ID: 2NM1). Они включают, без ограничений, позиции, которые соответствуют позициям Y1181, I1197, S1196, F1204, F1194, S1117, W1178, Y1183, V1118, S1116, V1113, K1192, Y1199, S1201, Q1191, E1245, Y1256, D1115 и E1203 в BoNT/B4. В одном варианте реализации изобретения кроме замен V1113K, S1117P, S1196A и I1197P проводят систематическую замену одного или более из этих остатков другими аминокислотами. Также предусматриваются комбинации различных модификаций, включая, без ограничений, мутации двух или более перечисленных позиций любым количеством аминокислот, перечисленных в данном документе.

[00149] Замены в нескольких сайтах (например, 2 или 3) можно создавать, комбинируя мутации в этих идентифицированных ключевых остатках. Такие мутанты с заменой в нескольких сайтах могут характеризоваться дополнительным повышением связывания с h-Syt II и могут дополнительно сохранять или характеризоваться повышенным связыванием с человеческим Syt I. В одном варианте реализации изобретения модифицированный H_C B4 содержит четыре аминокислотные замены относительно последовательности B4 дикого типа, V1113K, S1117P, S1196A и I1197P и дополнительно содержит одну или более мутаций замены, соответствующих мутациям замены в серотипе B, штамме 4, выбранным из Q1191C, Q1191V, Q1191L, Q1191Y, Q1191M, Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинаций.

[00150] Также предусматривается модифицированный H_C B4 с мутациями замены V1113K, S1117P, S1196A и I1197P и мутацию замены одной аминокислоты, приведенную ниже в таблице 2, как и его включение в различные полипептиды, описанные в данном документе.

Таблица 2

Q1191M	Y1183C	Y1199H	S1117Y
Q1191E	Y1183P	Y1199S	V1118M
Q1191C	Y1183M	Y1199W	S1196Y
Q1191V	W1178Q	Y1199F	Y1181M
Q1191L	W1178Y	Y1199L
Q1191Y	W1178A	S1201V
Q1191T	W1178S	S1117P
Q1191I	Y1199E	S1117M

[00151] В одном варианте реализации изобретения модифицированный H_C B4 характеризуется повышенным связыванием с hSyt II по сравнению с аналогичным полипептидом, имеющим аминокислоты ДТ в этих конкретных позициях (также называемым в данном документе эквивалентом дикого типа). В одном варианте реализации изобретения созданный мутант также сохраняет или характеризуется существенно повышенным связыванием с человеческим Syt I по сравнению с эквивалентом дикого типа.

[00152] В одном варианте реализации изобретения H_C содержит две аминокислотные мутации, которые соответствуют приведенным в таблице 3 для серотипа B, штамма 4:

Таблица 3

Q1191M и Y1199W	Q1191V и Y1199H
Q1191M и Y1199E	Q1191L и Y1199W
Q1191M и Y1199H	Q1191L и Y1199E
Q1191C и Y1199W	Q1191L и Y1199H
Q1191C и Y1199E	Q1191Y и Y1199W
Q1191C и Y1199H	Q1191Y и Y1199E
Q1191V и Y1199W	Q1191Y и Y1199H
Q1191V и Y199E

Молекулы нуклеиновых кислот

[00153] Другой аспект этого изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует описанный в данном документе полипептид (например, модифицированный рецептор-связывающий домен или полипептид, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен, или ботулинический нейротоксин, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен, описанный в данном документе). В одном варианте реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную на Фиг. 9. Специалист-практик может получать такие молекулы нуклеиновых кислот, например, с помощью технологий рекомбинантных ДНК. Необходимую мутацию замены аминокислоты осуществляют, например, путем модификации кодирующей ДНК. Например, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие описанные в данном документе полипептиды, создают путем мутации кодона нуклеиновой кислоты, кодирующего конкретную аминокислоту, до необходимой аминокислоты, используя генетический код, приведенный ниже:

TTT	Phe		TCT	Ser		TAT	Tyr		TGT	Cys
TTC	Phe		TCC	Ser		TAC	Tyr		TGC	Cys
TTA	Leu		TCA	Ser					TGA
TTG	Leu		TCG	Ser					TGG	Trp
CTT	Leu		CCT	Pro		CAT	His		CGT	Arg
CTC	Leu		CCC	Pro		CAC	His		CGC	Arg
CTA	Leu		CCA	Pro		CAA	Gln		CGA	Arg
CTG	Leu		CCG	Pro		CAG	Gln		CGG	Arg
ATT	Ile		ACT	Thr		AAT	Asn		AGT	Ser
ATC	Ile		ACC	Thr		AAC	Asn		AGC	Ser
ATA	Ile		ACA	Thr		AAA	Lys		AGA	Arg
ATG	Met*		ACG	Thr		AAG	Lys		AGG	Arg
GTT	Val		GCT	Ala		GAT	Asp		GGT	Gly
GTC	Val		GCC	Ala		GAC	Asp		GGC	Gly
GTA	Val		GCA	Ala		GAA	Glu		GGA	Gly
GTG	Val		GCG	Ala		GAG	Glu		GGG	Gly

[00154] В одном варианте реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты оптимизирована для экспрессии в E.coli (например, последовательность нуклеиновой кислоты на основании GenBank AB232927.1, релевантная часть которой приведена на Фиг. 9).

[00155] Другой аспект этого изобретения относится к вектору нуклеиновой кислоты, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе. В одном варианте реализации изобретения вектор представляет собой экспрессионный вектор. Такой экспрессионный вектор называется в данном документе экспрессионной конструкцией и содержит описанную в данном документе молекулу нуклеиновой кислоты, функционально связанную с экспрессионным вектором, применяемым для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в клетке или бесклеточном экстракте. Для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей нейротоксин C. botulinum согласно данному изобретению можно использовать широкий ряд экспрессионных векторов, включая, без ограничений, вирусный экспрессионный вектор; прокариотический экспрессионный вектор; эукариотические экспрессионные векторы, такие как, например, дрожжевой экспрессионный вектор, экспрессионный вектор насекомых и экспрессионный вектор млекопитающих; и экспрессионный вектор бесклеточного экстракта. Следует также понимать, что экспрессионные векторы, применяемые для практической реализации аспектов этих способов, могут включать те, которые экспрессируют нейротоксин C. botulinum под управлением конститутивного, тканеспецифического, клеточноспецифического или индуцибельного промоторного элемента, энхансерного элемента или их обоих. Неограничивающие примеры экспрессионных векторов, наряду с общепринятыми реагентами и условиями для получения и применения экспрессионной конструкции из таких экспрессионных векторов, легко доступны от коммерческих поставщиков, которые включают, без ограничений, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, Calif.; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.; Invitrogen, Inc, Carlsbad, Calif.; EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wis.; QIAGEN, Inc., Valencia, Calif.; и Stratagene, La Jolla, Calif. Выбор, создание и применение соответствующего экспрессионного вектора являются рутинными процедурами, входящими в компетенцию специалистов в данной области техники и описанными в данном документе.

Клетки

[00156] Другой аспект этого изобретения относится к клетке, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты или экспрессионную конструкцию, описанные в данном документе. Клетка может быть предназначена для увеличения числа копий нуклеиновой кислоты или для экспрессии нуклеиновой кислоты, или обоих вариантов. Такие клетки включают, без ограничений, прокариотические клетки, включая, без ограничений, штаммы аэробных, микроаэрофильных, капнофильных, факультативных, анаэробных, грамотрицательных и грамположительных бактериальных клеток, таких как полученные из, например, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens и Salmonella typhimurium; и эукариотические клетки, включая, без ограничений, штаммы дрожжей, такие как, например, полученные из Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Yarrowia lipolytica; клетки и линии клеток насекомых, полученные от насекомых, таких как, например, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster и Manduca sexta; и клетки и линии клеток млекопитающих, полученные из клеток млекопитающих, таких как, например, мыши, крысы, хомяки, свиные, бычьи, лошадиные, приматы и люди. Линии клеток могут быть получены из Американской коллекции типовых культур, Европейской коллекции клеточных культур и Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур. Неограничивающие примеры конкретных протоколов для отбора, получения и применения соответствующей линии клеток описаны, например, в INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4.sup.th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3.sup.rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, выше, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2.sup.nd ed. 2002); и CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, выше, (2004). Эти протоколы представляют собой рутинные процедуры, входящие в компетенцию специалистов в данной области техники и описанные в данном документе.

[00157] Клетка может быть предназначена для экспрессии нуклеиновой кислоты для создания, таким образом, кодируемого полипептида. Таким образом, другой аспект этого изобретения относится к способу получения белка ботулинического нейротоксина, выделенного H_C или полипептида, содержащего модифицированный H_C, описанных в данном документе. Такие полипептиды получают путем культивирования клетки-хозяина, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, в контексте экспрессионной конструкции. Культивирование проводят в условиях, подходящих для выработки полипептида BoNT. Экспрессируемый полипептид можно выделять из культуры, очищать и получать в виде готовой формы, как известно в данной области техники. Экспрессируемый полипептид также можно в случае необходимости активировать известными в данной области техники способами. Один из способов активации экспрессируемого полипептида состоит в расщеплении (или никинге) протеазами до активной двухцепочечной формы. Такие способы можно адаптировать из известных в данной области техники, например, описанных Peter F. Bonventre and Lloyd L. Klempe (J. Bacteriol 1960, 79(1): 23 и Michaeal L. Dekleva and Bibhuti R. DasGupta (Biochemical and Biophysical Research Communicaitons 1989, 162: 767-772).

Фармацевтические композиции

[00158] Другой аспект данного изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей нейротоксин C. botulinum или химерную молекулу, описанные в данном документе. В одном варианте реализации изобретения описанный в данном документе полипептид является активным ингредиентом в композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель (называемой в данном документе фармацевтической композицией). «Фармацевтически приемлемый носитель» означает любые фармацевтически приемлемые средства для смешивания и/или целевой доставки композиции субъекту. В контексте данного документа термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или базовый раствор, такие как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или инкапсулирующий материал, которые помогают поддерживать или сохранять полипептид BoNT в форме, подходящей для доставки субъекту. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и совместимости с введением субъекту, например, человеку. Такие композиции можно специально готовить для введения одним или более путями, такими как описанные в данном документе пути. Также в композиции могут быть включены дополнительные активные ингредиенты. Когда агент, готовую форму или фармацевтическую композицию, описанные в данном документе, вводят субъекту, предпочтительно вводят терапевтически эффективное количество. В контексте данного документа термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое приводит к улучшению или лечению патологического состояния. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическую композицию готовят для введения путем инъекции. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит ботулинический нейротоксин, инкапсулированный в микросферах. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит ботулинический нейротоксин, приготовленный для трансэпителиальной доставки. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит ботулинический нейротоксин, приготовленный для замедленного высвобождения.

[00159] В одном варианте реализации изобретения ботулинический нейротоксин, полипептид или химерная молекула согласно данному изобретению находятся в форме для контролируемого высвобождения. Такие композиции и способы введения описаны в патентной публикации США № 2007/0020295, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

[00160] Ботулинический нейротоксин может быть получен путем создания и выращивания культур Clostridium botulinum в ферментере, а затем сбора о очистки ферментированной смеси в соответствии с известными процедурами. Все серотипы ботулинического токсина изначально синтезируются в виде неактивных одноцепочечных белков, которые должны расщепляться или никоваться протеазами, чтобы стать нейроактивными. Бактериальные штаммы, которые вырабатывают ботулинические токсины серотипов A и G, имеют эндогенные протеазы и, следовательно, серотипы A и G можно выделять из бактериальных культур преимущественно в активной форме. В противоположность этому, ботулинические токсины серотипов C₁, D и E синтезируются непротеолитическими штаммами и, следовательно, являются, как правило, неактивированными при выделении из культуры. Серотипы B и F вырабатываются как протеолитическими, так и непротеолитическими штаммами и, следовательно, могут быть выделены как в активной, так и в неактивной форме. Протеолитические штаммы, которые вырабатывают, например, ботулинический токсин типа B, могут расщеплять только часть вырабатываемого токсина. Точное соотношение расщепленных и нерасщепленных молекул зависит от продолжительности инкубации и температуры культуры. Следовательно, определенный процент препарата, например, ботулинического токсина типа B, может быть неактивным. В одном варианте реализации изобретения нейротоксин согласно данному изобретению находится в активном состоянии. В одном варианте реализации изобретения нейротоксин находится в неактивном состоянии. В одном варианте реализации изобретения предусматривается комбинация из активного и неактивного нейротоксина.

Наборы

[00161] Также в данное изобретение включен набор, содержащий BoNT или полипептид, описанные в данном документе (например, в форме фармацевтической композиции). Набор может содержать одну или более композиций, описанных в данном документе, упакованных во флаконе. Набор может дополнительно содержать средство или устройство для доставки для терапевтического введения композиции и/или инструкции для терапевтического введения. Набор может содержать все компоненты, упакованные в формованный контейнер.

[00162] Другой аспект этого изобретения относится к средству или устройству для доставки для введения описанных в данном документе фармацевтических композиций, предварительно заполненному фармацевтической композицией (например, для однократного применения). Такие устройства могут представлять собой шприц или микроигольное устройство для доставки композиций. Шприц может представлять собой одноразовый предварительно заполненный шприц с эффективным количеством композиции. Микроигольное устройство может содержать одну или более микроигл, покрытых описанной в данном документе композицией, например, как описано в патентной публикации США 2010/0196445, содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.

Способы лечения

[00163] Данное изобретение также включает способы лечения патологического состояния, которое обычно лечат нейротоксином (например, патологические состояния скелетных мышц, патологические состояния гладких мышц, гландулярные патологические состояния, нейромышечное нарушение, вегетативное нарушение, боль или эстетическое/косметическое состояние). Такие патологические состояния связаны с нежелательной нейрональной активностью, что может определить специалист-практик. Способ включает этап введения терапевтически эффективного количества BoNT или полипептида/химерной молекулы, описанных в данном документе (например, фармацевтической композиции), в соответствующее место организма млекопитающего для снижения нежелательной нейрональной активности для лечения, таким образом, патологического состояния. Введение проводят путем, который обеспечивает контакт эффективного количества композиции с нейронами, демонстрирующими нежелательную активность.

[00164] Конкретные патологические состояния, для которых предусматривается возможность лечения обсуждаемыми в данном документе способами, включают, без ограничений, спастическую дисфонию, спастическую кривошею, дистонию мышц гортани, оромандибулярную дистонию, дистонию мышц языка, дистонию мышц шеи, фокальную дистонию мышц кисти, блефароспазм, косоглазие, односторонний лицевой спазм, нарушения мышц век, церебральный паралич, фокальную спастичность и другие нарушения голоса, спастический колит, нейрогенный мочевой пузырь (т. е. заболевание, включающее недержание мочи, такое как, например, нейрогенная сверхактивность мышцы-сжимателя или идиопатическая гиперактивность мочевого пузыря), рак предстательной железы и другие формы рака, анизмус, спастичность конечностей, судороги, дрожание, бруксизм, анальную трещину, ахалазию, нарушения глотания и другие нарушения мышечного тонуса и другие нарушения, характеризуемые непроизвольными движениями мышечных групп, слезотечение, гипергидроз, повышенное слюноотделение, повышенную желудочнокишечную секрецию, а также другие нарушения секреции, боль от мышечных спазмов, невропатическую боль, воспалительную боль, головную боль, такую как мигрень, зуд (чесотку), акне. Кроме того, данное изобретение можно применять для лечения дерматологических или эстетических/косметических состояний, например, уменьшения межбровных складок, уменьшения кожных морщин. Данное изобретение также можно применять для лечения спортивных травм. Другие применения включают лечение нарушений, таких как повышенное слюноотделение или повышенное потоотделение. Кроме того, BoNT/B необходим в качестве альтернативного токсина для лечения пациентов, у которых выработались нейтрализующие антитела против BoNT/A.

[00165] Кроме того, модифицированный нейротоксин можно вводить для лечения других нейромышечных нарушений, используя хорошо известные способы, которые обычно применяют с botulinum типа A. Например, данное изобретение можно применять для лечения боли, например, головной боли, боли от мышечных спазмов и различных форм воспалительной боли. В патенте США № 5721215 авторства Aoki и патенте США № 6113915 авторства Aoki описаны способы применения ботулинического токсина типа А для лечения боли. Содержание этих двух патентов в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.

[00166] Нарушения вегетативной нервной системы также можно лечить модифицированным нейротоксином. Например, гландулярная дисфункция является нарушением вегетативной нервной системы. Гландулярная дисфункция включает повышенное потоотделение и повышенное слюноотделение. Дыхательная дисфункция является другим примером нарушения вегетативной нервной системы. Дыхательная дисфункция включает хроническое обструктивное заболевание легких и астму. Sanders et al. в патенте США № 5766605 описывают способы лечения вегетативной нервной системы; например, лечения нарушений вегетативной нервной системы, таких как повышенное потоотделение, повышенное слюноотделение, астма и т. д., с применение ботулинических токсинов природного происхождения. Содержание Sander et al. в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. В одном варианте реализации изобретения можно применять способы, по существу аналогичные описанным Sanders et al., используя модифицированный нейротоксин, для лечения нарушений вегетативной нервной системы, таких как обсуждались выше. Например, модифицированный нейротоксин можно применять местным образом к носовой полости млекопитающего в количестве, достаточном для дегенерации холинергических нейронов вегетативной нервной системы, которые регулируют выделение слизи в носовой полости.

[00167] Боль, которую можно лечить модифицированным нейротоксином, включает боль вследствие мышечного напряжения или спазма или боль, которая не связана с мышечным спазмом. Например, Binder в патенте США № 5714468 сообщает, что головную боль, вызванную сосудистыми нарушениями, мышечным напряжением, невралгией и нейропатией, можно лечить ботулиническим токсином природного происхождения, например, Botulinum типа A. Содержание Binder в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. В одном варианте реализации изобретения можно применять способы, по существу аналогичные описанным Binder, но используя модифицированный нейротоксин, для лечения головной боли, в особенности вызванной сосудистыми нарушениями, мышечным напряжением, невралгией и нейропатией. Боль, вызванную мышечным спазмом, также можно лечить путем введения модифицированного нейротоксина. Например, в WO2006001676 (Kang Ahn) описаны способы применения ботулинического нейротоксина для лечения боли в коленном суставе, вызванной защемлением подкожного нерва, в WO2008059126 (Christine Favre et al.) описаны способы применения ботулинического нейротоксина для лечения боли, индуцированной химиотерапией, в WO2008090287 (Christine Favre et al.) описаны способы применения ботулинического нейротоксина для лечения боли, индуцированной анти-ВИЧ лечением, в WO2009130600 (Christine Favre et al.) описаны способы применения ботулинического нейротоксина для лечения боли, связанной с диабетической нейропатией, а в WO2007144493 (Michel Auguet et al.) описаны способы применения ботулинического нейротоксина в комбинации с опиатным производным для лечения боли. Содержание WO2006001676, WO2008059126, WO2008090287, WO2009130600, WO2007144493 в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. Кроме того, модифицированный нейротоксин можно вводить млекопитающему для лечения боли, которая не связана с мышечным нарушением, таким как спазм. В одном широком варианте реализации изобретения способы согласно данному изобретению для лечения не связанной со спазмом боли включают центральное введение или периферическое введение модифицированного нейротоксина.

[00168] Острую или хроническую боль, которая не связана с мышечным спазмом, также можно облегчать путем локального, периферическое введение модифицированного нейротоксина в место фактической или ощущаемой боли у млекопитающего. В одном варианте реализации изобретения модифицированный нейротоксин вводят подкожно в месте боли или вблизи него, например, в месте пореза или вблизи него. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный нейротоксин вводят внутримышечно в месте боли или вблизи него, например, в месте нахождения кровоподтека или вблизи него у млекопитающего. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный нейротоксин вводят напрямую в сустав млекопитающего для лечения или облегчения боли, вызванной артритическими состояниями. Также частые повторные инъекции или инфузии модифицированного нейротоксина в место периферической боли входят в объем данного изобретения.

[00169] Пути введения для таких способов известны в данной области техники и могут быть легко адаптированы к способам, описанным в данном документе, специалистом-практиком (смотрите, например, Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), в редакции Anthony Fauci et al., 14-ое издание, опубликованное McGraw Hill). В качестве неограничивающего примера лечение нейромышечного нарушения может включать этап местного введения эффективного количества молекулы в мышцу или группу мышц, лечение вегетативного нарушения может включать этап местного введения эффективного количества молекулы в железу или железы, а лечение боли может включать этап введения эффективного количества молекулы в месте боли. Кроме того, лечение боли может включать этап введения эффективного количества модифицированного нейротоксина в спинной мозг.

[00170] Также предусматривается, что модифицированные H_C B4, описанные в данном документе, можно применять в качестве средства доставки в нейроны-мишени и другие типы клеток, которые экспрессируют человеческий синаптотагмин II у людей. Например, модифицированный H_C, ковалентно или нековалентно связанный с другой биоактивной молекулой (например, терапевтическим агентом) с образованием, таким образом, химерной молекулы, описанной в данном документе, может служить в качестве нацеливающего носителя для доставки биоактивной молекулы в нейроны и другие типы клеток, которые экспрессируют человеческий синаптотагмин II у людей, посредством связывания с человеческим Syt I и/или Syt II. Таким образом, другой аспект этого изобретения относится к применению химерной полипептидной молекулы, описанной в данном документе, для доставки биоактивной молекулы в нейрон субъекта-человека. Вторая часть молекулы может представлять собой биоактивную молекулу, такую как терапевтический агент (например, полипептид или лекарственный препарат). Связь между первой и второй частями молекулы может быть ковалентной (например, в форме слитого белка) или нековалентной. Способы такого связывания известны в данной области техники и могут легко применяться специалистом-практиком. Химерную полипептидную молекулу вводят путем, которые приводит к контакту полипептида с нейронами, экспрессирующими рецептор, с которым специфически связывается модифицированный B-H_C (нейронами-мишенями), как описано в данном документе.

Выявление рецептор-связывающей активности

[00171] Другой аспект этого изобретения относится к способу исследования модифицированного рецептор-связывающего домена BoNT в отношении его способности связываться с рецептором (например, человеческим Syt I или человеческим Syt II, или человеческим SV2). В этом способе используется 2-гибридная аналитическая система и используются слитые белки, созданные из рецептора и из модифицированного Hc, соответственно слитые (экспрессируемые в виде слитых белков) с соответствующими субъединицами «приманка» и «жертва», используемыми в 2-гибридном анализе (например, система активации транскрипции Gal 4, в которой используется домен активации и ДНК-связывающий домен). 2-гибридный анализ обычно проводят в дрожжах (S. cerevisiae), но аналогичные аналитические системы были разработаны для применения в других одноклеточных организмах, а также в E. coli. Эти системы сравнимы между собой. В одном варианте реализации изобретения используют 2-гибридный анализ с бактериальной аденилатциклазой (Karimova et al., Proc Natl Acad Sci U S A. May 12, 1998; 95(10): 5752-5756, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки). В этой системе используются T18 и T25 в качестве приманки и жертвы и могут использоваться клетки BTH101 E. coli.

[00172] Модифицированный Hc экспрессируется в виде слитого белка T18 (называемого первым слитым белком) в E. coli 2-гибридного анализа. В этом способе рецептор (или его связывающий фрагмент, такой как h-Syt II, а. к. 1-87) коэкспрессируется в виде слитого белка T25 (называемого вторым слитым белком) в E. coli 2-гибридного анализа. В анализе используется положительный индикатор взаимодействия между соответствующими молекулами посредством их соответствующих слияний. Одним возможным положительным индикатором является проявление цвета. Клональные колонии E. coli, экспрессирующие первый и второй слитые белки, выращивают на твердой среде, содержащей соответствующие селективную и репортерную среды (например, ампициллин, канамицин, X-gal и IPTG), в течение времени, необходимого для генерации положительного показателя (например, генерации цвета) в положительных колониях. Связывание модифицированного связывающего домена с фрагментом рецептора приведет к появлению положительного показателя (например, экспрессии гена LacZ и в результате генерации синего цвета в колониях, растущих в планшетах X-gal).

[00173] Колонии анализируют в отношении такого положительного показателя (например, проявления цвета) в сравнении с соответствующим контролем (положительным и отрицательным). Анализ может быть визуальным или осуществляться машиной. Используют соответствующий отрицательный контроль, который не обеспечивает появление положительного показателя (например, экспрессии LacZ) (например, клональную колонию, в которой отсутствует ключевой компонент аналитической системы, такую как колония, в которой приманка и жертва экспрессируются без слияния). Также можно использоваться соответствующий сильный положительный контроль. Одним из примеров сильного положительного контроля для человеческого рецептора Syt II в анализе является B1-Hc с мутацией замены в E1191 (M/C/V или Q). Также можно использовать слабый положительный контроль для определения силы связывания. Одним из примеров слабого положительного контроля для человеческого рецептора Syt II в анализе является B1-Hc с мутацией замены в W1178 (Q/Y/A или S). Выявление положительного показателя (например, проявления цвета) указывает на то, что модифицированный Hc связывает рецептор. Выявления сильного положительного показателя, такого как сильное проявление цвета (например, больше, чем в случае слабого положительного контроля), указывает на то, что указанный модифицированный Hc связывает рецептор с высокой аффинностью.

[00174] Модифицированный Hc, применяемый в анализе, может представлять собой любой модифицированный Hc, описанный в данном документе. В качестве неограничивающего примера модифицированный Hc может содержать одну, две или три мутации замены, такие как описаны в данном документе. Модифицированный Hc может относиться к любому серотипу/штамму или подтипу, описанным в данном документе.

[00175] Описанные в данном документе. Варианты реализации изобретения и нижеприведенные примеры предназначены исключительно для иллюстративных целей, а различные модификации или изменения, очевидные для специалистов в данной области техники, включены в объем этого изобретения.

[00176] Если в данном документе не указано иное, научные и технические термины, используемые в связи с данной заявкой, имеют значения, которые обычно подразумеваются специалистами в данной области техники. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в форме единственного числа включают множественное число, а термины в форме множественного числа включают единственное число.

[00177] Следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реагентами и т. д., описанными в данном документе, и, следовательно, может варьироваться. Используемая в данном документе терминология предназначена лишь для описания конкретных вариантов реализации изобретения и не подразумевает ограничения объема данного изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения.

[00178] За исключением рабочих примеров или там, где указано иное, все числа, выражающие количество ингредиентов или реакционные условия, используемые в данном документе, следует понимать как модифицируемые во всех случаях термином «около». Термин «около», используемый для описания данного изобретения, в процентном отношении означает±1%.

[00179] С одной стороны, данное изобретение относится к описанным в данном документе композициям, способам и их соответствующим компонентам, важным для изобретения, но при этом оно открыто для включения неустановленных элементов, важных или нет («содержащий»). В некоторых вариантах реализации изобретения другие элементы, предназначенные для включения в описание композиции, способа или их соответствующего компонента, ограничены теми, которые не оказывают материального влияния на базовые и новые характеристики этого изобретения («состоящий преимущественно из»). Это в одинаковой мере применимо к этапам в описанных способах, а также к композициям и их компонентам. В других вариантах реализации подразумевается, что предметы изобретения, композиции, способы и их соответствующие компоненты, описанные в данном документе, исключают любой элемент, не считающийся важным элементом для компонента, композиции или способа («состоящий из»).

[00180] Все указанные патенты, патентные заявки и публикации явным образом включены в данный документ посредством ссылки в целях описания и раскрытия, например, методологий, описанных в таких публикациях, которые могут быть использованы в связи с данным изобретением. Эти публикации приведены исключительно в отношении их содержания до даты подачи данной заявки. Ничто в этой связи не следует воспринимать как признание того, что авторы изобретения не имеют права датировать такое описание задним числом по причине более раннего изобретения или по любой другой причине. Все утверждения относительно даты или утверждения относительно содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не являются признанием корректности этих дат или содержания этих документов.

[00181] Это изобретение дополнительно проиллюстрировано нижеприведенными примерами, которые не следует воспринимать как дополнительно ограничивающие его.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Идентификация одиночных мутаций, которые повышают связывание BoNT/B с h-Syt II

[00182] Была разрешена сокристаллическая структура BoNT/B, связанного с крысиным Syt II (19,20). Это обеспечило прочную базу для отбора всего девятнадцати остатков в области взаимодействия BoNT/B-Syt II для исследований мутагенеза (Фиг. 2А, таблица 5). Одна из стратегий состояла в насыщении каждой из этих 19 позиций всеми 20 возможными аминокислотами с целью идентификации всех мутаций одного остатка, которые повышали связывание с h-Syt II. Для осуществления этого мы использовали двугибридный подход с бактериальной аденилатциклазой (BACTH) (**33). Вкратце, H_C из BoNT/B (H_CB) субклонировали в вектор с расщепленным фрагментом (обозначаемым как T18) бактериальной аденилатциклазы. Эту слитую конструкцию T18-H_CB амплифицировали методом ПЦР, используя праймеры, содержащие случайные три нуклеотида (NNN) в выбранной позиции, создавая пул конструкций, которые кодируют все 20 возможных аминокислот в выбранном сайте (Фиг. 2B). Этот пул конструкций затем котрансформировали в бактерии (штамм BTH101 E.coli) вместе с конструкцией, которая конститутивно экспрессирует фрагмент h-Syt II, содержащий токсин-связывающий сайт (остатки 1-87), слитый со второй половиной расщепленной бактериальной аденилатциклазы (обозначаемой как T25). Связывание H_CB с h-Syt II сводит вместе T18 и T25 и восстанавливает активность аденилатциклазы, что приводит к экспрессии гена lacZ и приводит к появлению синих колоний в планшетах X-Gal (Фиг. 2B).

[00183] Четыре локации демонстрировали наличие синих колоний E1191 (22,7% от общего числа колоний), W11178 (7,8%), Y1183 (4,0%) и S1199 (5,1%) (таблица 6). Из этих синих колоний выделяли плазмиды и секвенировали их, выявляя мутации в каждом сайте E1191M/C/V/Q/L/Y, Y1183/C/P, S1199W/E/Y/H, W1178Y/Q/A/S (Фиг. 2C). Эти мутации дополнительно проверяли, измеряя уровни β-галактозидазы в бактериях, которые отображают восстановленную активность аденилатциклазы. Четыре мутации в сайтах E1191, E1191M/C/V/Q, демонстрировали наибольшую активность β-галактозидазы среди всех мутаций (Фиг. 2D). Дополнительно мы исследовали мутации в E1191 в анализе с соосаждением. GST-тэгированный фрагмент мышиного Syt II дикого типа (ДТ) (m-Syt II, остатки 1-87) использовали в качестве положительного контроля. Фрагмент человеческого Syt II создавали с помощью мутации F54 в мышином Syt II (1-87) на L, имитируя, таким образом, человеческую последовательность (под названием h-Syt II). GST-меченые фрагменты Syt II иммобилизовали на гранулах и использовали для соосаждения H_CB. Выявление связанного H_CB проводили с помощью слитой HA-метки в анализе иммуноблоттинга. E1191M/C/V/Q приводили к существенным уровням связывания с h-Syt II (Фиг. 2E). Другие мутации в E1191, а также мутации в других сайтах не приводили к существенному связыванию с h-Syt II (Фиг. 18). Подтверждая то, что ранее было проиллюстрировано на Фиг. 18, Фиг. 21 также иллюстрирует, что другие мутации не приводили к существенному связыванию с h-Syt II. Вместе эти данные демонстрируют, что H_CB, содержащий мутации E1191M/C/V/Q, позволял достичь улучшения способности связывать h-Syt II.

Пример 2. Комбинационные мутации в H_CB дополнительно усиливали его связывание с h-Syt II

[00184] Далее мы исследовали, можно ли дополнительно повысить связывание H_CB (E1191M/C/V/Q) с h-Syt II путем внесения вторичной мутации в отличной локации. Двойные мутации создавали, комбинируя E1191M с изменениями в остатках, идентифицированными в скрининге BACTH, в сайтах 1183, 1199 и 1178 (Фиг. 2C). Эти 10 двойных мутантов анализировали в отношении их способности связывать h-Syt II в анализе с соосаждением (Фиг. 3A). Три из них, E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y и E1191M/W1178Q, демонстрировали стабильное связывание с h-Syt II, тогда как комбинация E1191M с Y1183C/P снижала связывание с h-Syt II (Фиг. 3A). С учетом того, что E1191 пространственно близок к Y1183 (Фиг. 2A), можно предположить потенциальный структурный конфликт при мутации как E1191, так и Y1183.

[00185] Далее мы исследовали все 12 комбинаций между первичными мутациями E1191M/C/V/Q с совместимыми вторичными мутациями S1199W/Y и W1178Q, а также тройной мутацией E1191M/S1199W/W1178Q. Аффинность связывания (K_Д) всех 12 мутантов в отношении h-Syt II определяли, используя анализ биослоевой интерферометрии (БСИ) с параметрами, перечисленными в таблице 4, и репрезентативными кривыми, приведенными на Фиг. 19. Вкратце, GST-меченые фрагменты Syt иммобилизовали на зонде, который подвергали воздействию очищенного H_CB в разных концентрациях (фаза ассоциации, Фиг. 3B) с последующими этапами промывки (фаза диссоциации, Фиг. 3B). Связывание H_CB ДТ с m-Syt II служило положительным контролем, который демонстрировал K_Д 0,13 мкм (таблица 4). Связывание H_CB ДТ с h-Syt II было слишком слабым, чтобы его легко можно было определить за порогом обнаружения, с оценочной K_Д > 20 мкм (Фиг. 3B, таблица 4). Мутант E1191M обеспечивал K_Д связывания 6,7 мкм с h-Syt II. Большинство двойных мутантов дополнительно улучшали аффинность связывания со значениями K_Д от 0,59 мкм до 4,3 мкм (Фиг. 19, таблица 4). Два двойных мутанта с наилучшими показателями, E1191M/S1199Y (K_Д=0,72 мкм) и E1191V/S1199Y (K_Д=0,59 мкм), обеспечивали аффинность, на порядок большую, чем мутант E1191M (Фиг. 3B, таблица 4). Двойной мутант E1191Q/W1178Q был единственным, который не связывался с h-Syt II. Тройной мутант E1191M/S1199W/W1178Q демонстрировал аффинность связывания, аналогичную с двойным мутантом E1191M/S1199W, что указывает на то, что добавление третьего сайта мутации не обеспечивает дополнительное улучшение (таблица 4).

Пример 3. Мутанты H_CB демонстрировали повышенное связывание с h-Syt I

[00186] Далее исследовали, могут ли мутанты H_CB связываться с h-Syt I. Фиг. 24B иллюстрирует сравнение между Syt I и Syt II и между человеческим и мышиным Syt I в области связывания BoNT/B, описанной в данном документе. Связывание H_CB ДТ с Syt I можно выявить только в присутствии корецепторов ганглиозидов в анализе с соосаждением. Это связано с тем, что Syt I демонстрирует меньшую аффинность связывания в отношении BoNT/B по сравнению с Syt II (15,28). Мы обнаружили, что оба мутанта E1191M и E1191M/S1199Y связывались с h-Syt I в отсутствие ганглиозидов в анализе с соосаждением (Фиг. 3C), что позволяет предположить, что эти мутанты могут характеризоваться повышенным связыванием с h-Syt I. Мы определили аффинность связывания двух мутантов с наилучшими показателями (E1191M/S1199Y и E1191V/S1199Y) в отношении h-Syt I, используя анализ БСИ. H_CB, содержащий E1191M/S1199Y (H_CB_MY) или E1191V/S1199Y (H_CB_VY), демонстрировал K_Д 2,9 мкм и 5,82 мкм соответственно. С учетом того, что связывание H_CB ДТ с h-Syt I было слишком слабым, чтобы его легко можно было определить (таблица 4, Фиг. 20), мутанты H_CB не только повышали связывание с h-Syt II, но также с h-Syt I. Так как H_CB_MY демонстрировал повышенную аффинность связывания с h-Syt I и меньшую константу диссоциации в отношении Syt I и Syt II по сравнению с H_CB_VY, мы выбрали этого мутанта для изучения дополнительных характеристик.

Пример 4. H_CB_MY связывается с h-Syt II на нейрональных поверхностях

[00187] Далее исследовали, может ли мутант H_CB_MY связываться с h-Syt II на физиологически релевантных нейрональных поверхностях. Для этого использовали культивируемые крысиные кортикальные нейроны, которые экспрессируют Syt I, но не Syt II (13). Таким образом, нокдаун (НД) Syt I позволял создавать нейроны с отсутствием эндогенных рецепторов. Экспрессия полноразмерного h-Syt II в этих нейронах с НД Syt I позволяла создавать «гуманизированные» нейроны с одним h-Syt II в качестве рецептора токсина (18). Как и ожидалось, H_CB ДТ демонстрировал сильное связывание с крысиными нейронами, которое прекращалось после нокдауна эндогенного Syt I. Экспрессия полноразмерного m-Syt II, но не h-Syt II и не m-Syt II, содержащего мутацию F54L, восстанавливала связывание H_CB ДТ (Фиг. 4A). В противоположность этому, H_CB_MY демонстрировал стабильное связывание с нейронами, которые экспрессировали m-Syt II, h-Syt II или m-Syt II (F54L), демонстрируя, что H_CB_MY характеризуется повышенной способностью связывать h-Syt II на нейрональных поверхностях (Фиг. 4B).

Пример 5. Мутант BoNT/B демонстрировал повышенную эффективность в блокировании нейропередачи в гуманизированных нейронах

[00188] Чтобы получить ответ на ключевой вопрос, транслируется ли повышение связывания с h-Syt II в улучшенную эффективность на функциональном уровне в нейронах, полноразмерный BoNT/B ДТ и двойной мутантный токсин E1191M/S1199Y (BoNT/B_MY) получали рекомбинантным способом в E.coli (Фиг. 23). Гуманизированные нейроны подвергали воздействию градиента токсинов ДТ или BoNT/B_MY. Расщепление VAMP2 исследовали в анализе иммуноблоттинга. Как проиллюстрировано на Фиг. 5A, большее количество VAMP2 было расщеплено в нейронах, которые подвергали воздействию BoNT/B_MY, по сравнению с нейронами, которые подвергали воздействию BoNT/B ДТ, при каждой концентрации токсина, что указывает на то, что BoNT/B_MY нацеливался и проникал в нейроны более эффективно, чем токсин ДТ.

[00189] Далее отслеживали высвобождение нейромедиаторов, записывая малые ингибиторные постсинаптические токи (mIPSC), используя метод фиксации потенциала для цельных клеток. Частота mIPSC отображает активность высвобождения нейромедиаторов в популяции нейронов. Проникновение BoNT/B в пресинаптические окончания блокирует высвобождение нейромедиаторов, тем самым снижая частоту mIPSC (Фиг. 5B). Гуманизированные нейроны подвергали воздействию градиента BoNT/B ДТ или BoNT/B_MY. Как проиллюстрировано на Фиг. 5C, BoNT/B_MY демонстрировал сильное повышение эффективности с концентрацией полумаксимального ингибирования (IC₅₀) в ~11 раз меньшей, чем для токсина ДТ. Эти данные демонстрируют, что повышение связывания с человеческими рецепторами приводило к повышению эффективности токсина на функциональном уровне в нейронах.

Пример 6. Подтип BoNT/B4 содержит Q1191/Y1199, но не связывается с h-Syt II

[00190] И наконец, исследовали, существуют ли какие-либо вариации последовательностей природного происхождения в подтипах BoNT/B, которые могут влиять на связывание с h-Syt II. На сегодняшний день известно восемь подтипов BoNT/B (BoNT/B1-B8, при этом BoNT/B1 является прототипом BoNT/B) с вариациями последовательностей до 7% (34). Выравнивание последовательностей выявило вариации в E1191 и S1199 (Фиг. 6A). Интересно, что встречались случаи E1191Q (BoNT/B4, /B8) и S1199Y (BoNT/B2, /B3, /B4, /B7). Это даже является комбинацией E1191Q и S1199Y в B4 - этот двойной мутант в BoNT/B1 приводил к стабильному связыванию с h-Syt II (таблица 4). Однако H_CB4 не связывался с h-Syt II в анализе с соосаждением (Фиг. 6B). Вероятно, это связано с изменением других остатков в H_CB4 относительно BoNT/B1. Среди девятнадцати ключевых остатков в областях связывания BoNT/B-Syt существует четыре других остатка, которые являются разными для BoNT/B1 и B4 (Фиг. 7). Действительно, замена всех четырех остатков в H_CB4 соответствующими остатками в BoNT/B1 повышала его связывание с h-syt II (Фиг. 6C). Подтверждая то, что ранее было проиллюстрировано на Фиг. 6C, Фиг. 22 также иллюстрирует, что все четыре остатка в H_CB4 с соответствующими остатками в BoNT/B1 приводили к созданию мутанта H_cB4, который может связываться с h-Syt II. Интересно, что H_CB4 демонстрировал стабильное связывание с h-Syt I в отсутствие ганглиозидов, что позволяет предположить, что этот подтип характеризуется лучшей аффинностью связывания с Syt I, чем BoNT/B1 (Фиг. 6D).

Обсуждение

[00191] Комбинируя метод рационального конструирования на основании доступной кокристаллической структуры комплекса BoNT/B-Syt II с методом BACTH, который состоит в насыщении всех возможных одиночных точечных мутаций в каждом из выбранных целевых участков, идентифицировали ряд точечных мутаций в BoNT/B1, которые улучшали связывание с h-Syt II. Эти точечные мутации дополнительно исследовали в разных комбинациях, выявляя двойных мутантов, которые демонстрировали высокую аффинность к h-Syt II. Кроме того, полноразмерный BoNT/B1, содержащий две из этих мутаций, демонстрировал в ~11 раз большую эффективность, чем BoNT/B1 ДТ на гуманизированных нейронах, демонстрируя, что повышение связывания с рецепторами токсинов транслируется в большую эффективность на функциональном уровне в нейронах.

[00192] Было обнаружено, что остаток E1191 в BoNT/B1 является критической позицией для связывания как h-Syt I, так и h-Syt II. Этот остаток расположен на периферии области взаимодействия BoNT/B•Syt II, где с помощью внесения M/C/V/Q возможно обеспечить образование этими остатками новых/дополнительных связей с Syt II, а также удаление потенциально неблагоприятного отрицательного заряда, тем самым повышая общую аффинность связывания. Кроме h-Syt II, мутация E1191M также повышает аффинность связывания с Syt I. Ранее было показано, что E1191L повышает связывание BoNT/B с Syt I (35). Также было обнаружено, что замена E1191 на L или Y демонстрировала повышение связывания с h-Syt II, но в гораздо меньшей степени, чем M/C/V/Q. Следовательно, эти результаты позволяют предположить, что 1191 расположен в ключевой позиции для модуляции аффинности связывания между BoNT/B и Syt I/II, не нарушая общую поверхность связывания.

[00193] Скрининг BACTH позволил идентифицировать другие мутации в BoNT/B, которые приводили только к небольшому повышению связывания с h-Syt II, включая W1178Y/Q/A/S, Y1183C/P и S1199W/E/Y/H. Ранее сообщалось, что S1199Y повышал связывание BoNT/B с Syt II, возможно, в результате π-стэкингового взаимодействия между S1199Y и F47 Syt II (19). Что интересно, анализ последовательностей подтипов BoNT/B выявил вариации остатков в некоторых из этих сайтов. Например, сайт 1199 может представлять собой S, Y или H, а сайт 1191 может представлять собой E, K или Q. Можно ожидать, что такие изменения в остатках будут менять аффинность связывания с Syt I или Syt II. Например, BoNT/B4 демонстрирует более сильное связывание с h-Syt I, чем BoNT/B1, вероятно из-за того, что он содержит Q в сайте 1191 и Y в сайте 1199. Оказалось, что природа уже собрала некий репертуар остатков по их способности менять взаимодействия токсин-рецептор в этих двух ключевых локациях, определенных нами в скрининге BACTH. С увеличением числа выявленных подтипов токсинов, вариации последовательностей природного происхождения в H_C-доменах токсинов обеспечивают богатый источник для разработки остатков, которые могут модулировать взаимодействия токсин-рецептор.

[00194] BoNT/DC и BoNT/G распознают одни и те же поверхностные остатки Syt I/II, что и BoNT/B, и оба демонстрировали сниженное связывание с h-Syt II (18). Были разрешены кокристаллические структуры BoNT/DC в комплексе с Syt I/II (36); следовательно, аналогичный подход с нацеливанием на ключевые остатки в области связывания может позволить идентифицировать конкретные мутации в BoNT/DC, которые повышают его аффинность в отношении h-Syt II.

[00195] Следует отметить, что известно, что люди менее чувствительны к BoNT/D вследствие изменения в одном остатке в человеческом субстрате VAMP1, от M48 (номер в последовательности мышиного VAMP1) у мышей до I48 у людей. С остатком I в этой локации BoNT/D демонстрировал существенно сниженную эффективность расщепления (37-39). С учетом того, что BoNT/DC использует тот же самый протеазный домен, что и BoNT/D, люди менее чувствительны к BoNT/DC вследствие изменения в одном остатке в рецепторе и изменения в одном остатке в субстрате. Хотя нельзя исключать возможность, что эти два изменения являются случайными, возможно, что BoNT мог стать фактором отбора в эволюции человека (37).

[00196] Медицинское применение BoNT является удивительным примером превращения смертельного токсина в эффективные терапевтические средства. С быстрым распространением этого медицинского применения существует растущий интерес в конструировании BoNT для улучшения терапевтической эффективности и снижения нежелательных явлений (40-44). Предыдущие исследования показали, что замена H_C из BoNT/A на H_C из BoNT/B приводила к получению химерного BoNT/AB с повышенной эффективностью в мышиной ткани (45,46). Эти результаты позволяют предположить возможность применения H_CB для создания химерного BoNT/AB, который потенциально может дополнительно улучшить эффективность BoNT/A у людей. Следовательно, идентифицированные в данном документе мутанты BoNT/B могут позволить разработать новое поколение терапевтических токсинов с улучшенной эффективностью у людей. Кроме того, такой модифицированный BoNT/B и его H_C также будут ценными научными инструментами и средствами доставки для нацеливания на человеческие нейроны.

Материалы и способы

Материалы и конструкции.

[00197] Следующие антитела приобретали у указанных поставщиков: к синапсину I (клон 46.1, Synaptic Systems), VAMP2 (клон 69.1, Synaptic Systems), HA (16B12, Covance) и β-тубулину III (ab18207, Abcam). Смешанные ганглиозиды из мозга быка приобретали у Matreya LLC (Pleasant Gap, PA) и восстанавливали в Трис-буферном солевом растворе (ТБС: 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl), как было описано ранее (14). кДНК, кодирующие H_CB (остатки 857-1291, Genbank: ACA46990.1) и H_CB4 (Genbank: EF051570) были кодон-оптимизированы для экспрессии в E. coli и синтезированы Genscript Inc. (New Brunswick, NJ). Следующие кДНК были любезно предоставлены указанными группами: крысиного Syt I (T.C. Sudhof, Palo Alto, CA), мышиного Syt II (M. Fukuda, Ibaraki, Japan), человеческого Syt I (R.B. Sutton, Lubbock, TX). ДНК, кодирующую H_CB, субклонировали в вектор pET28a с His6-меткой (SEQ ID NO: 1) и HA-меткой (YPYDVPDYA) (SEQ ID NO: 2), слитыми с его N-концом. Мутации в H_CB создавали с помощью ПЦР, используя набор для сайт-направленного мутагенеза (Agilent Technologies, CA). GST-меченые фрагменты Syt I/II и мутант Syt II F54L были описаны ранее (15,18,23).

Получение и активация полноразмерного BoNT/B и BoNT/B_MY.

[00198] кДНК, кодирующая полноразмерный неактивный BoNT/B_R370A,Y373F (доступ B1INP5), была кодон-оптимизирована для экспрессии в E.coli. Ее клонировали в pET32a посредством NdeI/BamHI для добавления гексагистидиновой аффинной метки (SEQ ID NO: 1) в С-конец. Конструкцию возвращали в ее активную ДТ-форму стандартным сайт-направленным мутагенезом (Agilent). Мутации E1191M/S1199Y вносили для получения двойного мутанта BoNT/B_MY. Конструкции трансформировали в E. coli (штамм BL21 DE3), выращивали в mTB+100 мкг/мл ампициллина и индуцировали 1 мМ IPTG при 16°C в течение 20 ч. Бактерии собирали и лизировали обработкой ультразвуком в 5 мл 0,5 М NaCl в 50 мМ Трис, pH 8, и 0,5 мкл бензоназы на грамм осадка. Исходный лизат очищали центрифугированием при 4000x g в течение 1 ч и проводили захват BoNT/B в HP-колонке HisTrap (GE) и элюировали 0,1 М имидазола в 0,5 М NaCl в 50 мМ Трис, pH 8, методом ЖХБР (GE). Элюат обессоливали в 125 мМ NaCl в 50 мМ Трис, pH 8, используя колонку для обессоливания HiPrep 26/10 (GE), а затем концентрировали до 0,6 мг/мл, используя центробежный фильтр с 10 кДа НОММ. Концентрат обрабатывали 0,1 мкг/мл эндопротеиназы Lys-C в течение 2 ч при 37 °C, а затем доводили до 1 М (NH₄)₂SO₄ перед финальной очисткой методом хроматографии с гидрофобным взаимодействием с фенил-сефарозой HP (GE). Белки элюировали от 1 М до 0 М (NH₄)₂SO₄ в линейном градиенте 50 мМ Трис, pH 8. Объединяли фракции, содержащие двухцепочечный BoNT/B, обессоливали. концентрировали и хранили при -80 °C.

BACTH (двугибридный анализ с бактериальной аденилатциклазой).

[00199] Анализ BACTH проводили в соответствии с инструкциями производителя (Euromedex). Для скрининга были отобраны две совместимые плазмиды, pUT18C и pKT25. Люминальный домен H-Syt II (остатки 1-80) клонировали в pKT25 для создания pKT25-h-Syt II. H_CB клонировали в pUT18C для получения T18-H_CB. Мутантные библиотеки H_CB создавали с помощью праймеров, содержащих случайные нуклеотидные триплеты (NNN) в указанных позициях. Каждую библиотеку котрансформировали с плазмидой pKT25-h-Syt II в индикаторный штамм E. coli BTH101 посредством электропорации и проводили скрининг в LB-агарных планшетах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл канамицина, 0,5 мМ IPTG и 40 мкг/мл X-Gal. Планшеты инкубировали при 30°C в течение 64 часов. Плазмиды выделяли из синих колоний и секвенировали. Общее число колоний определялся по возможности покрытия всех 20 аминокислот в выбранном сайте мутации. Его рассчитывали по уравнению Кларка-Карбона: P=1-(1-f)^N, где f отображает число возможных остатков (здесь f=1/20, так как существует 20 разных аминокислот), а N - общее число колоний. При минимальном числе колоний в этом анализе, равном 380, вероятность покрытия всех 20 аминокислот в каждой позиции составляет > 99,8%.

Анализ активности β-галактозидазы.

[00200] Этот анализ проводили, как было описано ранее (47). Вкратце, клетки E. coli BTH101 с представляющими интерес плазмидами инокулировали в среду LB, содержащую антибиотики и IPTG (0,5 мМ). Культуру выращивали в течение ночи при 37°C до достижения стационарной фазы. ОП₆₀₀ культуры записывали перед сбором. Культуру центрифугировали, а клеточный осадок дважды промывали ФСБ и ресуспендировали в Z-буфере (60 мМ Na₂HPO₄, 40 мМ Na₂HPO₄, 10 мМ KCl, 1 мМ MgSO4 и 20 мМ ДТТ). После этого добавляли 1:10 (об./об.) хлороформа и 1:20 (об./об.) 0,1% ДСН и хорошо смешивали для пермеабилизации клеток. Затем смесь смешивали с o-нитрофенил-п-галактозидом (4 мг/мл в Z-буфере) в соотношении 5:1 и инкубировали при 28°C в течение 10 минут. Реакцию останавливали, добавляя 80 мкл 1 М Na₂CO₃. Активность β-галактозидазы рассчитывали как A₄₂₀/OП₆₀₀.

GST-анализ с соосаждением.

[00201] Проводили два типа анализа с соосаждением. Первый использовали для быстрого исследования связывания мутантного H_CB с GST-меченым m-Syt II (остатки 1-87) и мутантным m-Syt II (F54L), который имитирует человеческий Syt II (обозначаемый как h-Syt II). Вкратце, 6 мл E. coli, экспрессирующих H_CB, осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 800 мкл ТБС, обрабатывали ультразвуком, а затем инкубировали с 2% Тритон X-100 в течение 1 ч при 4 °C. Затем образцы осаждали центрифугированием в течение 15 мин в микроцентрифуге при 4°C. Супернатанты собирали и использовали для анализа с соосаждением, инкубируя с 10 мкг белков GST-Syt, иммобилизованных на глутатион-сефарозных гранулах (GE bioscience, Piscataway, NJ) при 4°C в течение 1 ч. Образцы три раза промывали промывочным буфером (ТБС с 0,5% Тритон X-100) и анализировали методом иммуноблоттинга, используя анти-HA антитело. Для мутантов, которые демонстрировали повышенное связывание с h-Syt II, изучали дополнительные характеристики, очищая этих мутантов H_CB в виде His6-меченых белков («His6» описана в SEQ ID NO: 1). Затем проводили анализ с соосаждением, используя очищенный H_CB (100 нм) и иммобилизованный GST-Syt II в 100 мкл буфера ТБС плюс 0,5% Тритон X-100 в присутствии или отсутствие ганглиозидов (60 мкг/мл) в течение 1 ч при 4 °C. Гранулы промывали три разы, используя буфер ТБС плюс 0,5% Тритон X-100. Десять процентов связанного материала подвергали ДСН-ПААГ с последующим анализом иммуноблоттинга.

Анализ биослоевой интерферометрии.

[00202] Аффинность связывания между вариантами H_CB и Syt I/Syt II определяли в анализе БСИ с помощью системы Blitz (ForteBio). Вкратце, GST-тэгированный Syt I или Syt II (20 мкг/мл) иммобилизовали на анти-GST биосенсорах Dip и Read^TM (ForteBio) и уравновешивали буфером ФСБ. Затем биосенсоры подвергали воздействию ряда концентраций H_CB с последующей промывкой ФСБ. Аффинность связывания (K_Д) рассчитывали, используя программное обеспечение системы Blitz, придерживаясь инструкций производителя (ForteBio).

Культура нейронов, лентивирус и анализ связывания/проникновения токсина.

[00203] Крысиные кортикальные нейроны получали из эмбрионов E18-19, как было описано ранее (14). Конструкции для экспрессии НД-Syt I, m-Syt II и h-Syt II в нейронах были описаны ранее (18). Лентивирусы добавляли в культуры нейронов на DIV5 (сутки in vitro), а эксперименты по связыванию/проникновению токсинов проводили на DIV12-14. Токсины разводили в буфере с высоким содержанием K⁺ (87 мМ NaCl, 56 мМ KCl, 1,5 мМ KH₂PO₄, 8 мМ Na₂HPO₄, 0,5 мМ MgCl₂ и 1 мМ CaCl) и предварительно нагревали до 37 °C. Нейроны подвергали воздействию вышеуказанных токсин-содержащих буферов в течение 5 мин при 37°C с последующей промывкой ФСБ. Эти нейроны либо подвергали анализу иммуноблоттинга, либо инкубировали в не содержащей токсины среде еще в течение 24 часов с последующим анализом иммуноблоттинга.

Запись mIPSC.

[00204] Записи методом фиксации потенциала для цельных клеток получали для культуры кортикальных нейронов на DIV 14-18 (DIV 14-18). Раствор в пипетках содержал (в мМ): 135 CsCl, 10 ГЭПЭС, 1 ЭГТА, 1 Na-ГТФ, 4 Mg-АТФ и 10 QX-314 (pH 7,4, доведенного CsOH). Сопротивление пипеток, заполненных внутриклеточным раствором, варьировалось от 4 до 5 МОм. После образования цельноклеточной конфигурации и уравновешивания внутриклеточного раствора в пипетке сопротивление для образцов доводили до 10 МОм. Синаптические токи отслеживали с помощью усилителя EPC-10/2 (HEKA) при исходном потенциале -70 мВ. Раствор в ванне содержал (в мМ): 140 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl, 1 MgCl2, 10 ГЭПЭС, 10 глюкозы (pH 7,4, доведенной NaOH). Спонтанные ингибиторные постсинаптические токи (sIPSC) и вызванные ингибиторные постсинаптические токи (eIPSC) фармакологически ингибировали добавлением блокаторов рецепторов AMPA и NMDA, CNQX и APV, во внеклеточный раствор бани. Спонтанные малые ингибиторные постсинаптические токи (mIPSC) отслеживали в присутствии тетродотоксина (TTX) для блокирования потенциала действия. Данные анализировали, используя Clampfit 10 (Molecular Devices), программное обеспечение Origin8 (Mocrocal Inc.), программное обеспечение MiniAnalysis (Synaptosoft) и Igor (Wavemetrics). Статистический анализ проводили с применением t-критерия Стьюдента (*P < 0,01). Все данные приведены как среднее ± СПС

Ссылки

1. Schiavo G, Matteoli M, & Montecucco C (2000) Neurotoxins affecting neuroexocytosis. Physiol Rev 80(2):717-766.

2. Montal M (2010) Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu Rev Biochem 79:591-617.

3. Jahn R & Scheller RH (2006) SNAREs--engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol 7(9):631-643.

4. Sutton RB, Fasshauer D, Jahn R, & Brunger AT (1998) Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 A resolution. Nature 395(6700):347-353.

5. Sudhof TC & Rothman JE (2009) Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science 323(5913):474-477.

6. Arnon SS, et al. (2001) Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. Jama 285(8):1059-1070.

7. Johnson EA (1999) Clostridial toxins as therapeutic agents: benefits of nature's most toxic proteins. Annu Rev Microbiol 53:551-575.

8. Aoki KR (2004) Botulinum toxin: a successful therapeutic protein. Curr Med Chem 11(23):3085-3092.

9. Montecucco C & Molgo J (2005) Botulinal neurotoxins: revival of an old killer. Curr Opin Pharmacol 5(3):274-279.

10. Dolly JO, Lawrence GW, Meng J, & Wang J (2009) Neuro-exocytosis: botulinum toxins as inhibitory probes and versatile therapeutics. Curr Opin Pharmacol 9:326-335.

11. Lange O, et al. (2009) Neutralizing antibodies and secondary therapy failure after treatment with botulinum toxin type A: much ado about nothing? Clin Neuropharmacol 32(4):213-218.

12. Comella CL, et al. (2005) Comparison of botulinum toxin serotypes A and B for the treatment of cervical dystonia. Neurology 65(9):1423-1429.

13. Dong M, Tepp WH, Liu H, Johnson EA, & Chapman ER (2007) Mechanism of botulinum neurotoxin B and G entry into hippocampal neurons. J Cell Biol 179(7):1511-1522.

14. Peng L, Tepp WH, Johnson EA, & Dong M (2011) Botulinum neurotoxin D uses synaptic vesicle protein SV2 and gangliosides as receptors. PLoS Pathog 7(3):e1002008.

15. Dong M, et al. (2003) Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells. J Cell Biol 162(7):1293-1303.

16. Nishiki T, et al. (1994) Identification of protein receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes. J Biol Chem 269(14):10498-10503.

17. Rummel A, Karnath T, Henke T, Bigalke H, & Binz T (2004) Synaptotagmins I and II act as nerve cell receptors for botulinum neurotoxin G. J Biol Chem 279(29):30865-30870.

18. Peng L, et al. (2012) Botulinum neurotoxin D-C uses synaptotagmin I/II as receptors and human synaptotagmin II is not an effective receptor for type B, D-C, and G toxins. J Cell Sci.

19. Jin R, Rummel A, Binz T, & Brunger AT (2006) Botulinum neurotoxin B recognizes its protein receptor with high affinity and specificity. Nature 444(7122):1092-1095.

20. Chai Q, et al. (2006) Structural basis of cell surface receptor recognition by botulinum neurotoxin B. Nature 444(7122):1096-1100.

21. Benoit RM, et al. (2014) Structural basis for recognition of synaptic vesicle protein 2C by botulinum neurotoxin A. Nature 505(7481):108-111.

22. Dong M, et al. (2008) Glycosylated SV2A and SV2B mediate the entry of botulinum neurotoxin E into neurons. Mol Biol Cell 19(12):5226-5237.

23. Dong M, et al. (2006) SV2 is the protein receptor for botulinum neurotoxin A. Science 312(5773):592-596.

24. Mahrhold S, Rummel A, Bigalke H, Davletov B, & Binz T (2006) The synaptic vesicle protein 2C mediates the uptake of botulinum neurotoxin A into phrenic nerves. FEBS Lett 580(8):2011-2014.

25. Rummel A, et al. (2009) Botulinum neurotoxins C, E and F bind gangliosides via a conserved binding site prior to stimulation-dependent uptake with botulinum neurotoxin F utilising the three isoforms of SV2 as second receptor. J Neurochem 110(6):1942-1954.

26. Fu Z, Chen C, Barbieri JT, Kim JJ, & Baldwin MR (2009) Glycosylated SV2 and gangliosides as dual receptors for botulinum neurotoxin serotype F. Biochemistry 48(24):5631-5641.

27. Montecucco C (1986) How do tetanus and botulinum toxins bind to neuronal membranes? TIBS (11):314-317.

28. Nishiki T, et al. (1996) The high-affinity binding of Clostridium botulinum type B neurotoxin to synaptotagmin II associated with gangliosides GT1b/GD1a. FEBS Lett 378(3):253-257.

29. Pang ZP, et al. (2006) Synaptotagmin-2 is essential for survival and contributes to Ca2+ triggering of neurotransmitter release in central and neuromuscular synapses. J Neurosci 26(52):13493-13504.

30. Brin MF, et al. (1999) Safety and efficacy of NeuroBloc (botulinum toxin type B) in type A-resistant cervical dystonia. Neurology 53(7):1431-1438.

31. Pappert EJ & Germanson T (2008) Botulinum toxin type B vs. type A in toxin-naive patients with cervical dystonia: Randomized, double-blind, noninferiority trial. Mov Disord 23(4):510-517.

32. Brodsky MA, Swope DM, & Grimes D (2012) Diffusion of botulinum toxins. Tremor Other Hyperkinet Mov (N Y) 2.

33. Karimova G, Pidoux J, Ullmann A, & Ladant D (1998) A bacterial two-hybrid system based on a reconstituted signal transduction pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 95(10):5752-5756.

34. Hill KK, Xie G, Foley BT, & Smith TJ (2015) Genetic diversity within the botulinum neurotoxin-producing bacteria and their neurotoxins. Toxicon 107(Pt A):2-8.

35. Rummel A, et al. (2007) Identification of the protein receptor binding site of botulinum neurotoxins B and G proves the double-receptor concept. Proc Natl Acad Sci U S A 104(1):359-364.

36. Berntsson RP, Peng L, Svensson LM, Dong M, & Stenmark P (2013) Crystal structures of botulinum neurotoxin DC in complex with its protein receptors synaptotagmin I and II. Structure 21(9):1602-1611.

37. Peng L, et al. (2014) Widespread sequence variations in VAMP1 across vertebrates suggest a potential selective pressure from botulinum neurotoxins. PLoS Pathog 10(7):e1004177.

38. Yamasaki S, et al. (1994) Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J Biol Chem 269(17):12764-12772.

39. Eleopra R, et al. (2013) Botulinum neurotoxin serotype D is poorly effective in humans: an in vivo electrophysiological study. Clin Neurophysiol 124(5):999-1004.

40. Pirazzini M, et al. (2013) Neutralisation of specific surface carboxylates speeds up translocation of botulinum neurotoxin type B enzymatic domain. FEBS Lett 587(23):3831-3836.

41. Sikorra S, et al. (2016) Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin A Substrate Binding Pockets and Their Re-Engineering for Human SNAP-23. J Mol Biol 428(2 Pt A):372-384.

42. Chen S & Barbieri JT (2009) Engineering botulinum neurotoxin to extend therapeutic intervention. Proc Natl Acad Sci U S A 106(23):9180-9184.

43. Guo J, Pan X, Zhao Y, & Chen S (2013) Engineering Clostridia Neurotoxins with elevated catalytic activity. Toxicon 74:158-166.

44. Masuyer G, Chaddock JA, Foster KA, & Acharya KR (2014) Engineered botulinum neurotoxins as new therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol 54:27-51.

45. Wang J, et al. (2012) Longer-acting and highly potent chimaeric inhibitors of excessive exocytosis created with domains from botulinum neurotoxin A and B. Biochem J 444(1):59-67.

46. Rummel A, Mahrhold S, Bigalke H, & Binz T (2011) Exchange of the H(CC) domain mediating double receptor recognition improves the pharmacodynamic properties of botulinum neurotoxin. FEBS J 278(23):4506-4515.

47. Tao L & Biswas I (2013) ClpL is required for folding of CtsR in Streptococcus mutans. J Bacteriol 195(3):576-584.

48. Craxton, A manual collection of Syt, Esyt, Rph3a, Rph3al, Doc2, and Dblc2 genes from 46 metazoan genomes--an open access resource for neuroscience and evolutionary biology. BMC Genomics 11:37 (2010).

49. Kozaki et al., Characterization of Clostridium botulinum type B neurotoxin associated with infant botulism in japan. Infect. Immun. 66:4811-4816 (1998).

50. Ihara et al., Sequence of the gene for Clostridium botulinum type B neurotoxin associated with infant botulism, expression of the C-terminal half of heavy chain and its binding activity. Biochim. Biophys. Acta 1625:19-26 (2003).

51. Rummel et al., The HCC-domain of botulinum neurotoxins A and B exhibits a singular ganglioside binding site displaying serotype specific carbohydrate interaction. Mol. Microbiol. 51:631-643 (2004).

52. Moriishi et al., Mosaic structures of neurotoxins produced from Clostridium botulinum types C and D organisms. Biochim. Biophys. Acta 1307:123-126 (1996).

53. Hill et al., Genetic diversity among Botulinum Neurotoxin-producing clostridial strains. J. Bacteriol. 189:818-832 (2007).

Таблица 4: Взаимодействия между GST-Syt II/Syt I и вариантами H_CB по определению БСИ.

Лиганд	HCB	kасс. (1/Мс)	Погрешность kасс.	kдисс. (1/с)	Погрешность kдисс.	KД (мкм)
GST-m- Syt II	ДТ	1,47×104	5,89×102	1,98×10-3	5,18×10-5	0,13
GST-h- Syt II	ДТ	Н/Д	Н/Д	Н/Д	Н/Д	> 20
	E1191M	5,21×103	2,11×102	3,51×10-2	4,62×10-4	6,7
	E1191M, S1199W	1,65×104	3,87×102	1,81×10-2	1,79×10-4	1,10
	E1191M, S1199Y	1,56×104	3,72×102	1,13×10-2	1,74×10-4	0,72
	E1191M, W1178Q	2,23×104	1,33×103	3,52×10-2	8,25×10-4	1,58
	E1191C, S1199W	1,32×104	4,70×102	1,19×10-2	8,90×10-4	0,90
	E1191C, S1199Y	1,47×104	4,96×102	1,44×10-2	1,91×10-4	0,98
	E1191C, W1178Q	6,89×103	5,18×102	2,96×10-2	3,23×10-4	4,30
	E1191Q, S1199W	8,28×103	5,50×102	2,21×10-2	3,34×10-4	2,67
	E1191Q, S1199Y	2,42×104	1,16×103	2,85×10-2	4,60×10-4	1,18
	E1191Q, W1178Q	Н/Д	Н/Д	Н/Д	Н/Д	> 20
	E1191V, S1199W	1,86×104	6,49×102	1,30×10-2	2,44×10-4	0,70
	E1191V, S1199Y	2,31×104	9,18×102	1,35×10-2	2,68×10-4	0,59
	E1191V, W1178Q	6,08×103	4,64×102	1,83×10-2	2,75×10-4	3,01
E1191M, S1199W, W1178Q	1,52×104	3,49×102	1,72×10-2	1,71×10-4	1,13
GST-h- Syt I	ДТ	Н/Д	Н/Д	Н/Д	Н/Д	> 20
	E1191M, S1199Y	4,82×103	2,96×102	1,40×10-2	4,55×10-4	2,90
E1191V, S1199Y	2,71×103	9,11×101	1,58×10-2	2,10×10-4	5,82

Таблица 5: Перечень 19 ключевых остатков в BoNT/B, которые образуют связывающий карман для Syt I/II, выбранных на основании доступной кокристаллической структуры BoNT/B в комплексе с Syt II (19,20).

Остаток в BoNT/B	Близко к остатку X в Syt II	Остаток в BoNT/B	Близко к остатку X в Syt II
1113	57	1194	47, 50, 51 и 54
1115	53	1196	47 и 50
1116	53 и 57	1197	47 и 50
1117	50, 53 и 54	1199	47
1118	54 и 57	1201	47 и 51
1178	50	1203	51 и 55
1181	47	1204	51, 54 и 55
1183	54 и 55	1245	57
1191	58	1256	57
1192	57

Таблица 6: Обобщенные данные из скрининга BACTH по числу колоний в каждом сайте мутагенеза

Позиция остатка в BoNT/B	Число исследованных колоний	Число синих колоний	Процентная доля синих колоний
1113	935	0	0
1115	382	0	0
1116	> 1000	0	0
1117	> 1000	0	0
1118	> 1000	0	0
1178	380	29	7,6
1181	440	0	0
1183	980	39	4,0
1191	874	198	22,7
1192	> 1000	0	0
1194	620	0	0
1196	> 1000	0	0
1197	> 1000	0	0
1199	624	32	5,1
1201	634	0	0
1203	612	0	0
1204	764	0	0
1245	394	0	0
1256	488	0	0

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ПРЕЗИДЕНТ И ЧЛЕНЫ КОЛЛЕДЖА ГАРВАРДА (PRESIDENT AND FELLOWS OF

HARVARD COLLEGE)

<120> СКОНСТРУИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ НЕЙРОТОКСИН

<130> 0342941-0602

<140>

<141>

<150> 62/378,967

<151> 2016-08-24

<160> 29

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетическая

6xHis-метка"

<400> 1

His His His His His His

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 2

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 3

<211> 22

<212> Белок

<213> Mus sp.

<400> 3

Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Gln Lys Phe Met

1 5 10 15

Asn Glu Leu His Lys Ile

20

<210> 4

<211> 22

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Glu Lys Phe Met

1 5 10 15

Asn Glu Leu His Lys Ile

20

<210> 5

<211> 22

<212> Белок

<213> Mus sp.

<400> 5

Gly Glu Ser Gln Glu Asp Met Phe Ala Lys Leu Lys Glu Lys Phe Phe

1 5 10 15

Asn Glu Ile Asn Lys Ile

20

<210> 6

<211> 22

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gly Glu Ser Gln Glu Asp Met Phe Ala Lys Leu Lys Glu Lys Leu Phe

1 5 10 15

Asn Glu Ile Asn Lys Ile

20

<210> 7

<211> 14

<212> Белок

<213> Mus sp.

<400> 7

Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Gln Lys Phe Met Asn Glu Leu

1 5 10

<210> 8

<211> 14

<212> Белок

<213> Mus sp.

<400> 8

Asp Met Phe Ala Lys Leu Lys Glu Lys Phe Phe Asn Glu Ile

1 5 10

<210> 9

<211> 26

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 9

Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser

1 5 10 15

Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln

20 25

<210> 10

<211> 26

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 10

Lys Asp Phe Lys Glu Glu Glu Lys Lys Leu Phe Leu Ala Asn Ile Tyr

1 5 10 15

Asp Ser Asn Glu Phe Tyr Lys Thr Ile Gln

20 25

<210> 11

<211> 26

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 11

Lys Asp Phe Lys Lys Lys Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Asn Ile Tyr

1 5 10 15

Asp Ser Asn Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln

20 25

<210> 12

<211> 26

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 12

Lys Asn Phe Lys Glu Gln Glu Gln Lys Leu Phe Leu Ser Ile Ile Tyr

1 5 10 15

Asp Ser Asn Glu Phe Tyr Lys Thr Ile Gln

20 25

<210> 13

<211> 26

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 13

Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser

1 5 10 15

Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln

20 25

<210> 14

<211> 26

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 14

Lys Asn Phe Lys Lys Lys Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser

1 5 10 15

Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln

20 25

<210> 15

<211> 26

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 15

Lys Asn Phe Lys Gly Gln Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Asn Ile Tyr

1 5 10 15

Asp Ser Asn Glu Phe Tyr Lys Thr Ile Gln

20 25

<210> 16

<211> 27

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 16

Lys Asp Phe Lys Gly Gln Lys Glu Gln Lys Leu Phe Leu Ala Asn Ile

1 5 10 15

His Asp Ser Asn Glu Phe Tyr Lys Thr Ile Gln

20 25

<210> 17

<211> 434

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 17

Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn

1 5 10 15

Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp

20 25 30

Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala

35 40 45

Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser

50 55 60

Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr

65 70 75 80

Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile

85 90 95

Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn

100 105 110

Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val

115 120 125

Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg

130 135 140

Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr

145 150 155 160

Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu

165 170 175

Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp

180 185 190

Arg Thr Gln Phe Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu

195 200 205

Leu Ser Gln Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser

210 215 220

Glu Tyr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu

225 230 235 240

Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys

245 250 255

Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln

260 265 270

Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe

275 280 285

Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val

290 295 300

Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu

305 310 315 320

Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu

325 330 335

Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln

340 345 350

Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe

355 360 365

Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His

370 375 380

Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe

385 390 395 400

Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn

405 410 415

Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp

420 425 430

Thr Glu

<210> 18

<211> 434

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 18

Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Arg Asp Asn

1 5 10 15

Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp

20 25 30

Gly Val Lys Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala

35 40 45

Asp Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser

50 55 60

Met Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr

65 70 75 80

Arg Asn Asp Asp Ile Gln Asn Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile

85 90 95

Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn

100 105 110

Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val

115 120 125

Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg

130 135 140

Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Leu Asp Asn Ala Lys Ile Tyr

145 150 155 160

Ile Asn Gly Thr Leu Glu Ser Asn Met Asp Ile Lys Asp Ile Gly Glu

165 170 175

Val Ile Val Asn Gly Glu Ile Thr Phe Lys Leu Asp Gly Asp Val Asp

180 185 190

Arg Thr Gln Phe Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Gln

195 200 205

Leu Asn Gln Ser Asn Ile Lys Glu Ile Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser

210 215 220

Glu Tyr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu

225 230 235 240

Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Val

245 250 255

Lys Asp Ser Ser Val Gly Glu Ile Leu Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Gln

260 265 270

Asn Ser Asn Tyr Ile Asn Tyr Arg Asn Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe

275 280 285

Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val

290 295 300

Arg Lys Glu Asp Tyr Ile His Leu Asp Phe Val Asn Ser Asn Glu Glu

305 310 315 320

Trp Arg Val Tyr Ala Tyr Lys Asn Phe Lys Glu Gln Glu Gln Lys Leu

325 330 335

Phe Leu Ser Ile Ile Tyr Asp Ser Asn Glu Phe Tyr Lys Thr Ile Gln

340 345 350

Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe

355 360 365

Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Asp Ile Gly Leu Ile Gly Ile His

370 375 380

Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Val Leu Arg Lys Lys Tyr Lys Asp Tyr Phe

385 390 395 400

Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Lys

405 410 415

Ser Asn Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp

420 425 430

Thr Glu

<210> 19

<211> 435

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 19

Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr

20 25 30

Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser

35 40 45

Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn

50 55 60

Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys

65 70 75 80

Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile

85 90 95

Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly

100 105 110

Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser

115 120 125

Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn

130 135 140

Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg

165 170 175

Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile

180 185 190

Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr

195 200 205

Glu Leu Ser Gln Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr

210 215 220

Ser Glu Tyr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys

225 230 235 240

Glu Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu

245 250 255

Lys Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn

260 265 270

Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys

275 280 285

Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile

290 295 300

Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln

305 310 315 320

Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys

325 330 335

Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile

340 345 350

Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu

355 360 365

Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile

370 375 380

His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr

385 390 395 400

Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr

405 410 415

Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly

420 425 430

Trp Thr Glu

435

<210> 20

<211> 1308

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 20

aacagcgaaa tcctgaacaa cattattctg aacctgcgct ataaagataa caacctgatt 60

gatctgagcg gctatggcgc gaaagtggaa gtgtatgatg gcgtggaact gaacgataaa 120

aaccagttca aactgaccag ctctgcgaac agcaaaattc gtgtgaccca gaaccagaac 180

attatcttca acagcgtgtt tctggatttt agcgtgagct tttggattcg catcccgaaa 240

tataaaaacg atggcatcca gaactatatc cacaacgaat acaccattat caactgcatg 300

aaaaacaaca gcggctggaa aattagcatt cgtggcaacc gtattatttg gaccctgatc 360

gatattaacg gcaaaaccaa aagcgtgttc ttcgaataca acatccgcga agatatcagc 420

gaatacatta accgctggtt ctttgtgacc attaccaaca acctgaacaa cgcgaaaatt 480

tatatcaacg gtaaactgga aagcaacacc gatatcaaag atatccgcga agtgattgcg 540

aacggcgaaa tcatctttaa actggatggc gatattgatc gtacccagtt catctggatg 600

aaatacttca gcatcttcaa caccgaactg agccagagca acattgaaga acgctacaaa 660

atccagagct atagcgaata cctgaaagat ttttggggca atccgctgat gtataacaaa 720

gagtattaca tgttcaacgc gggtaacaaa aacagctata tcaaactgaa aaaagatagc 780

ccggtgggcg aaattctgac ccgtagcaaa tataaccaga acagcaaata catcaactat 840

cgcgatctgt atatcggcga aaaatttatc attcgccgca aaagcaacag ccagagcatt 900

aacgatgata tcgtgcgcaa agaagattat atctacctgg attttttcaa cctgaaccag 960

gaatggcgcg tttataccta taaatatttc aaaaaagagg aagagaaact gtttctggcc 1020

ccgattagcg atagcgatga attttacaac accatccaaa ttaaagaata cgatgaacag 1080

ccgacctata gctgccagct gctgtttaaa aaagatgaag aaagcaccga tgaaattggc 1140

ctgattggca tccatcgttt ctatgaaagc ggcatcgtgt tcgaagaata taaagattat 1200

ttctgcatca gcaaatggta tctgaaagaa gtgaaacgca aaccgtataa cctgaaactg 1260

ggctgcaact ggcagtttat tccgaaagat gaaggctgga ccgaataa 1308

<210> 21

<211> 1296

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 21

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 22

<211> 1291

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 22

Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn

1 5 10 15

Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn

65 70 75 80

Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile

100 105 110

Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu

115 120 125

Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly

165 170 175

Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln

180 185 190

Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe

245 250 255

Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile

275 280 285

Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn

290 295 300

Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr

305 310 315 320

Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly

325 330 335

Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu

340 345 350

Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys

355 360 365

Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys

370 375 380

Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile

385 390 395 400

Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr

420 425 430

Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp

435 440 445

Val Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser

450 455 460

Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gln Ser Asn

465 470 475 480

Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp

485 490 495

Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr

500 505 510

Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys

515 520 525

Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln

530 535 540

Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp

545 550 555 560

Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp

565 570 575

Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly

580 585 590

Trp Val Lys Gln Ile Val Asn Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser

595 600 605

Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro

645 650 655

Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys

675 680 685

Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp

690 695 700

Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr

705 710 715 720

Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr

725 730 735

Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asp

740 745 750

Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gln Ala Ile

755 760 765

Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met

770 775 780

Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Glu Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn

785 790 795 800

Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr

805 810 815

Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Val Asn Lys Tyr Leu

820 825 830

Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Ile

835 840 845

Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile

850 855 860

Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly

865 870 875 880

Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys

885 890 895

Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr

900 905 910

Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val

915 920 925

Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn

930 935 940

Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile

965 970 975

Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg

980 985 990

Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu

1010 1015 1020

Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly

1025 1030 1035

Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe

1040 1045 1050

Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln

1055 1060 1065

Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr

1070 1075 1080

Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr

1085 1090 1095

Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys

1100 1105 1110

Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn

1115 1120 1125

Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu

1130 1135 1140

Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp

1145 1150 1155

Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn

1160 1165 1170

Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys

1175 1180 1185

Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu

1190 1195 1200

Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr

1205 1210 1215

Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp

1220 1225 1230

Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile

1235 1240 1245

Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr

1250 1255 1260

Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys

1265 1270 1275

Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1280 1285 1290

<210> 23

<211> 1291

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 23

Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asp Asn

1 5 10 15

Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr Leu Ala Asn Glu

20 25 30

Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp Val Ile Pro Asp

35 40 45

Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys Pro Pro Arg Val

50 55 60

Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Ser Asp Lys Asp Pro Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg

85 90 95

Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Thr

100 105 110

Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile Asn Thr Phe Asp

115 120 125

Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr Arg Gln Gly Asn

130 135 140

Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Val Ile Ile Thr Gly

145 150 155 160

Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr Phe Lys Leu Thr

165 170 175

Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gln Glu Gly Phe Gly Ala Leu Ser Ile Ile

180 185 190

Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn Ala Thr Asn Asp

195 200 205

Val Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys Met Asp Pro Ile

210 215 220

Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His Asn Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gln Thr Ile Ser Ser Val Thr Ser Asn Ile

245 250 255

Phe Tyr Ser Gln Tyr Asn Val Lys Leu Glu Tyr Ala Glu Ile Tyr Ala

260 265 270

Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Lys Tyr

275 280 285

Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn Lys Tyr Ile Gly

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe Val Val Glu Ser

325 330 335

Ser Gly Glu Val Thr Val Asn Arg Asn Lys Phe Val Glu Leu Tyr Asn

340 345 350

Glu Leu Thr Gln Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala Lys Ile Tyr Asn

355 360 365

Val Gln Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Val Tyr Thr Pro Val Thr

370 375 380

Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Val Tyr Asp Ile Gln Asn Gly Phe Asn

385 390 395 400

Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Val Leu Phe Met Gly Gln Asn Leu Ser

405 410 415

Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Val Asn Pro Glu Asn Met Leu Tyr Leu

420 425 430

Phe Thr Lys Phe Cys His Lys Ala Ile Asp Gly Arg Ser Leu Tyr Asn

435 440 445

Lys Thr Leu Asp Cys Arg Glu Leu Leu Val Lys Asn Thr Asp Leu Pro

450 455 460

Phe Ile Gly Asp Ile Ser Asp Val Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys

465 470 475 480

Asp Ile Asn Glu Glu Thr Glu Val Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Ser

485 490 495

Val Asp Gln Val Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gln Leu

500 505 510

Asp Leu Leu Tyr Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly

515 520 525

Glu Asn Gln Val Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gln Asn Val Asp Tyr Leu

530 535 540

Asn Ser Tyr Tyr Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asp Asn Val Glu

545 550 555 560

Asp Phe Thr Phe Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala

565 570 575

Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Val Asn Ala Gly

580 585 590

Val Gln Gly Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Val Val Glu Asp

595 600 605

Phe Thr Thr Asn Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp

610 615 620

Val Ser Ala Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn

625 630 635 640

Ser Val Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Val Thr Gly Val

645 650 655

Thr Ile Leu Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly

660 665 670

Ala Phe Val Ile Tyr Ser Lys Val Gln Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys

675 680 685

Thr Ile Asp Asn Cys Leu Glu Gln Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser

690 695 700

Tyr Glu Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gln Phe

705 710 715 720

Asn Asn Ile Ser Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gln Ala Gly

725 730 735

Ala Ile Lys Ala Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser

740 745 750

Asp Lys Glu Asn Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu

755 760 765

Asp Val Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg

770 775 780

Glu Cys Ser Val Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile

785 790 795 800

Asp Glu Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn

805 810 815

Leu Ile Asp Ser His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Lys Leu

820 825 830

Lys Ala Lys Val Asn Asn Ser Phe Gln Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile

835 840 845

Phe Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr

850 855 860

Phe Asn Asn Ile Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Arg Lys

865 870 875 880

Asn Thr Leu Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Ser Glu Glu

885 890 895

Gly Asp Val Gln Leu Asn Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly

900 905 910

Ser Ser Gly Glu Asp Arg Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn

915 920 925

Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile

930 935 940

Arg Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp

945 950 955 960

Ser Val Lys Asn Asn Ser Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe

965 970 975

Leu Val Phe Thr Leu Lys Gln Asn Glu Asp Ser Glu Gln Ser Ile Asn

980 985 990

Phe Ser Tyr Asp Ile Ser Asn Asn Ala Pro Gly Tyr Asn Lys Trp Phe

995 1000 1005

Phe Val Thr Val Thr Asn Asn Met Met Gly Asn Met Lys Ile Tyr

1010 1015 1020

Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr

1025 1030 1035

Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile Thr Phe Glu Ile Asn Lys Ile

1040 1045 1050

Pro Asp Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp Ser Asp Asn Ile Asn Met

1055 1060 1065

Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Glu Leu Asp Gly Lys

1070 1075 1080

Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr Thr Asn Val Val

1085 1090 1095

Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Asp Leu Arg Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr

1100 1105 1110

Met Val Asn Ile Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Met Tyr Ala Asn Ser

1115 1120 1125

Arg Gln Ile Val Phe Asn Thr Arg Arg Asn Asn Asn Asp Phe Asn

1130 1135 1140

Glu Gly Tyr Lys Ile Ile Ile Lys Arg Ile Arg Gly Asn Thr Asn

1145 1150 1155

Asp Thr Arg Val Arg Gly Gly Asp Ile Leu Tyr Phe Asp Met Thr

1160 1165 1170

Ile Asn Asn Lys Ala Tyr Asn Leu Phe Met Lys Asn Glu Thr Met

1175 1180 1185

Tyr Ala Asp Asn His Ser Thr Glu Asp Ile Tyr Ala Ile Gly Leu

1190 1195 1200

Arg Glu Gln Thr Lys Asp Ile Asn Asp Asn Ile Ile Phe Gln Ile

1205 1210 1215

Gln Pro Met Asn Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ala Ser Gln Ile Phe Lys

1220 1225 1230

Ser Asn Phe Asn Gly Glu Asn Ile Ser Gly Ile Cys Ser Ile Gly

1235 1240 1245

Thr Tyr Arg Phe Arg Leu Gly Gly Asp Trp Tyr Arg His Asn Tyr

1250 1255 1260

Leu Val Pro Thr Val Lys Gln Gly Asn Tyr Ala Ser Leu Leu Glu

1265 1270 1275

Ser Thr Ser Thr His Trp Gly Phe Val Pro Val Ser Glu

1280 1285 1290

<210> 24

<211> 1276

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 24

Met Thr Trp Pro Val Lys Asp Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asp

1 5 10 15

Asn Asp Ile Leu Tyr Leu Arg Ile Pro Gln Asn Lys Leu Ile Thr Thr

20 25 30

Pro Val Lys Ala Phe Met Ile Thr Gln Asn Ile Trp Val Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Phe Ser Ser Asp Thr Asn Pro Ser Leu Ser Lys Pro Pro Arg Pro

50 55 60

Thr Ser Lys Tyr Gln Ser Tyr Tyr Asp Pro Ser Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Glu Gln Lys Asp Thr Phe Leu Lys Gly Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg

85 90 95

Ile Asn Glu Arg Asp Ile Gly Lys Lys Leu Ile Asn Tyr Leu Val Val

100 105 110

Gly Ser Pro Phe Met Gly Asp Ser Ser Thr Pro Glu Asp Thr Phe Asp

115 120 125

Phe Thr Arg His Thr Thr Asn Ile Ala Val Glu Lys Phe Glu Asn Gly

130 135 140

Ser Trp Lys Val Thr Asn Ile Ile Thr Pro Ser Val Leu Ile Phe Gly

145 150 155 160

Pro Leu Pro Asn Ile Leu Asp Tyr Thr Ala Ser Leu Thr Leu Gln Gly

165 170 175

Gln Gln Ser Asn Pro Ser Phe Glu Gly Phe Gly Thr Leu Ser Ile Leu

180 185 190

Lys Val Ala Pro Glu Phe Leu Leu Thr Phe Ser Asp Val Thr Ser Asn

195 200 205

Gln Ser Ser Ala Val Leu Gly Lys Ser Ile Phe Cys Met Asp Pro Val

210 215 220

Ile Ala Leu Met His Glu Leu Thr His Ser Leu His Gln Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Asn Ile Pro Ser Asp Lys Arg Ile Arg Pro Gln Val Ser Glu Gly

245 250 255

Phe Phe Ser Gln Asp Gly Pro Asn Val Gln Phe Glu Glu Leu Tyr Thr

260 265 270

Phe Gly Gly Leu Asp Val Glu Ile Ile Pro Gln Ile Glu Arg Ser Gln

275 280 285

Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gly His Tyr Lys Asp Ile Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Asn Asn Ile Asn Lys Thr Ile Pro Ser Ser Trp Ile Ser Asn Ile Asp

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Ile Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Lys Asp Asn

325 330 335

Thr Gly Asn Phe Val Val Asn Ile Asp Lys Phe Asn Ser Leu Tyr Ser

340 345 350

Asp Leu Thr Asn Val Met Ser Glu Val Val Tyr Ser Ser Gln Tyr Asn

355 360 365

Val Lys Asn Arg Thr His Tyr Phe Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Phe

370 375 380

Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ile Tyr Thr Ile Arg Asp Gly Phe Asn

385 390 395 400

Leu Thr Asn Lys Gly Phe Asn Ile Glu Asn Ser Gly Gln Asn Ile Glu

405 410 415

Arg Asn Pro Ala Leu Gln Lys Leu Ser Ser Glu Ser Val Val Asp Leu

420 425 430

Phe Thr Lys Val Cys Leu Arg Leu Thr Lys Asn Ser Arg Asp Asp Ser

435 440 445

Thr Cys Ile Lys Val Lys Asn Asn Arg Leu Pro Tyr Val Ala Asp Lys

450 455 460

Asp Ser Ile Ser Gln Glu Ile Phe Glu Asn Lys Ile Ile Thr Asp Glu

465 470 475 480

Thr Asn Val Gln Asn Tyr Ser Asp Lys Phe Ser Leu Asp Glu Ser Ile

485 490 495

Leu Asp Gly Gln Val Pro Ile Asn Pro Glu Ile Val Asp Pro Leu Leu

500 505 510

Pro Asn Val Asn Met Glu Pro Leu Asn Leu Pro Gly Glu Glu Ile Val

515 520 525

Phe Tyr Asp Asp Ile Thr Lys Tyr Val Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr

530 535 540

Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asn Asn Val Glu Asn Ile Thr Leu

545 550 555 560

Thr Thr Ser Val Glu Glu Ala Leu Gly Tyr Ser Asn Lys Ile Tyr Thr

565 570 575

Phe Leu Pro Ser Leu Ala Glu Lys Val Asn Lys Gly Val Gln Ala Gly

580 585 590

Leu Phe Leu Asn Trp Ala Asn Glu Val Val Glu Asp Phe Thr Thr Asn

595 600 605

Ile Met Lys Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Val Ile

610 615 620

Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Ser Ala Leu Arg

625 630 635 640

Gly Asn Phe Asn Gln Ala Phe Ala Thr Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu

645 650 655

Glu Gly Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Val Phe Thr Phe

660 665 670

Tyr Ser Ser Ile Gln Glu Arg Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Glu Asn

675 680 685

Cys Leu Glu Gln Arg Val Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Gln Trp Met

690 695 700

Val Ser Asn Trp Leu Ser Arg Ile Thr Thr Gln Phe Asn His Ile Asn

705 710 715 720

Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Ser Tyr Gln Ala Asp Ala Ile Lys Ala

725 730 735

Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn

740 745 750

Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Val Lys Ile

755 760 765

Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Val

770 775 780

Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile Asp Glu Leu Asn

785 790 795 800

Lys Phe Asp Leu Arg Thr Lys Thr Glu Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser

805 810 815

His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Arg Leu Lys Ala Lys Val

820 825 830

Asn Glu Ser Phe Glu Asn Thr Met Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr

835 840 845

Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Ser Ile

850 855 860

Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Ala Leu Val

865 870 875 880

Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Gly Asp Asn Val Gln

885 890 895

Leu Asn Thr Ile Tyr Thr Asn Asp Phe Lys Leu Ser Ser Ser Gly Asp

900 905 910

Lys Ile Ile Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Tyr

915 920 925

Glu Asn Ser Ser Val Ser Phe Trp Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Thr

930 935 940

Asn Ser His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Ser Ile Glu Gln Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Leu Cys Ile Arg Asn Gly Asn Ile Glu Trp Ile Leu Gln

965 970 975

Asp Val Asn Arg Lys Tyr Lys Ser Leu Ile Phe Asp Tyr Ser Glu Ser

980 985 990

Leu Ser His Thr Gly Tyr Thr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Ile Met Gly Tyr Met Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Glu Leu

1010 1015 1020

Lys Gln Ser Gln Lys Ile Glu Asp Leu Asp Glu Val Lys Leu Asp

1025 1030 1035

Lys Thr Ile Val Phe Gly Ile Asp Glu Asn Ile Asp Glu Asn Gln

1040 1045 1050

Met Leu Trp Ile Arg Asp Phe Asn Ile Phe Ser Lys Glu Leu Ser

1055 1060 1065

Asn Glu Asp Ile Asn Ile Val Tyr Glu Gly Gln Ile Leu Arg Asn

1070 1075 1080

Val Ile Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Pro Leu Lys Phe Asp Thr Glu

1085 1090 1095

Tyr Tyr Ile Ile Asn Asp Asn Tyr Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Pro

1100 1105 1110

Glu Ser Asn Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Pro Asp Arg Ser Lys

1115 1120 1125

Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Ile Thr Ile Lys Ser Val Ser Asp Lys

1130 1135 1140

Asn Pro Tyr Ser Arg Ile Leu Asn Gly Asp Asn Ile Ile Leu His

1145 1150 1155

Met Leu Tyr Asn Ser Arg Lys Tyr Met Ile Ile Arg Asp Thr Asp

1160 1165 1170

Thr Ile Tyr Ala Thr Gln Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn Cys Val

1175 1180 1185

Tyr Ala Leu Lys Leu Gln Ser Asn Leu Gly Asn Tyr Gly Ile Gly

1190 1195 1200

Ile Phe Ser Ile Lys Asn Ile Val Ser Lys Asn Lys Tyr Cys Ser

1205 1210 1215

Gln Ile Phe Ser Ser Phe Arg Glu Asn Thr Met Leu Leu Ala Asp

1220 1225 1230

Ile Tyr Lys Pro Trp Arg Phe Ser Phe Lys Asn Ala Tyr Thr Pro

1235 1240 1245

Val Ala Val Thr Asn Tyr Glu Thr Lys Leu Leu Ser Thr Ser Ser

1250 1255 1260

Phe Trp Lys Phe Ile Ser Arg Asp Pro Gly Trp Val Glu

1265 1270 1275

<210> 25

<211> 1252

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 25

Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg

1 5 10 15

Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser

20 25 30

Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile

35 40 45

Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys

65 70 75 80

Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn

85 90 95

Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro

100 105 110

Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp

115 120 125

Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu

130 135 140

Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr

145 150 155 160

Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His

165 170 175

Gly Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe

180 185 190

Arg Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu

195 200 205

Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala

210 215 220

Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu

225 230 235 240

Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr

260 265 270

Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys

275 280 285

Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu

290 295 300

Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn

305 310 315 320

Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu

325 330 335

Phe Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile

340 345 350

Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile

355 360 365

Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe

370 375 380

Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr

385 390 395 400

Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val

405 410 415

Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly

420 425 430

Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile

435 440 445

Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr

450 455 460

Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala

465 470 475 480

Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala

485 490 495

Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His

500 505 510

Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val

515 520 525

Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala

530 535 540

Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile

545 550 555 560

Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile

565 570 575

Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr

580 585 590

Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu

595 600 605

Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala

610 615 620

Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu

625 630 635 640

Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser

645 650 655

Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys

660 665 670

Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn

675 680 685

Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met

690 695 700

Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu

705 710 715 720

Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn

725 730 735

Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser

740 745 750

Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser

755 760 765

Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu

770 775 780

Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His

785 790 795 800

Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr

805 810 815

Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp

820 825 830

Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys

835 840 845

Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp

850 855 860

Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys

865 870 875 880

Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser

885 890 895

Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr

900 905 910

Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn

915 920 925

Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg

930 935 940

Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile

945 950 955 960

Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn

965 970 975

Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe

980 985 990

Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn

995 1000 1005

Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile

1010 1015 1020

His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr

1025 1030 1035

Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu

1040 1045 1050

Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn

1055 1060 1065

Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp

1070 1075 1080

Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile

1085 1090 1095

Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser

1100 1105 1110

Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys

1115 1120 1125

Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg

1130 1135 1140

Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His

1145 1150 1155

Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys

1160 1165 1170

Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val

1175 1180 1185

Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn

1190 1195 1200

Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr

1205 1210 1215

Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr

1220 1225 1230

Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly

1235 1240 1245

Trp Gln Glu Lys

1250

<210> 26

<211> 1274

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 26

Met Pro Val Ala Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp

1 5 10 15

Asp Thr Ile Leu Tyr Met Gln Ile Pro Tyr Glu Glu Lys Ser Lys Lys

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Glu Ile Met Arg Asn Val Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Asn Thr Ile Gly Thr Asn Pro Ser Asp Phe Asp Pro Pro Ala Ser

50 55 60

Leu Lys Asn Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Thr

65 70 75 80

Asp Ala Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Lys Thr Thr Ile Lys Leu Phe Lys

85 90 95

Arg Ile Asn Ser Asn Pro Ala Gly Lys Val Leu Leu Gln Glu Ile Ser

100 105 110

Tyr Ala Lys Pro Tyr Leu Gly Asn Asp His Thr Pro Ile Asp Glu Phe

115 120 125

Ser Pro Val Thr Arg Thr Thr Ser Val Asn Ile Lys Leu Ser Thr Asn

130 135 140

Val Glu Ser Ser Met Leu Leu Asn Leu Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro

145 150 155 160

Asp Ile Phe Glu Ser Cys Cys Tyr Pro Val Arg Lys Leu Ile Asp Pro

165 170 175

Asp Val Val Tyr Asp Pro Ser Asn Tyr Gly Phe Gly Ser Ile Asn Ile

180 185 190

Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Glu Tyr Thr Phe Asn Asp Ile Ser Gly

195 200 205

Gly His Asn Ser Ser Thr Glu Ser Phe Ile Ala Asp Pro Ala Ile Ser

210 215 220

Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Arg

225 230 235 240

Gly Val Thr Tyr Glu Glu Thr Ile Glu Val Lys Gln Ala Pro Leu Met

245 250 255

Ile Ala Glu Lys Pro Ile Arg Leu Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly

260 265 270

Gln Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Met Lys Glu Lys Ile Tyr Asn

275 280 285

Asn Leu Leu Ala Asn Tyr Glu Lys Ile Ala Thr Arg Leu Ser Glu Val

290 295 300

Asn Ser Ala Pro Pro Glu Tyr Asp Ile Asn Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe

305 310 315 320

Gln Trp Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asn Ala Asp Gly Ser Tyr Thr Val

325 330 335

Asn Glu Asn Lys Phe Asn Glu Ile Tyr Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr

340 345 350

Glu Ser Asp Leu Ala Asn Lys Phe Lys Val Lys Cys Arg Asn Thr Tyr

355 360 365

Phe Ile Lys Tyr Glu Phe Leu Lys Val Pro Asn Leu Leu Asp Asp Asp

370 375 380

Ile Tyr Thr Val Ser Glu Gly Phe Asn Ile Gly Asn Leu Ala Val Asn

385 390 395 400

Asn Arg Gly Gln Ser Ile Lys Leu Asn Pro Lys Ile Ile Asp Ser Ile

405 410 415

Pro Asp Lys Gly Leu Val Glu Lys Ile Val Lys Phe Cys Lys Ser Val

420 425 430

Ile Pro Arg Lys Gly Thr Lys Ala Pro Pro Arg Leu Cys Ile Arg Val

435 440 445

Asn Asn Ser Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Ser Ser Tyr Asn Glu

450 455 460

Asn Asp Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Thr Asn Leu Asn

465 470 475 480

Asn Asn Tyr Arg Asn Asn Leu Asp Glu Val Ile Leu Asp Tyr Asn Ser

485 490 495

Gln Thr Ile Pro Gln Ile Ser Asn Arg Thr Leu Asn Thr Leu Val Gln

500 505 510

Asp Asn Ser Tyr Val Pro Arg Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Glu Ile

515 520 525

Glu Glu Tyr Asp Val Val Asp Phe Asn Val Phe Phe Tyr Leu His Ala

530 535 540

Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Thr Asn Ile Ser Leu Thr Ser Ser Ile

545 550 555 560

Asp Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ser Lys Asp Ile Phe Phe Ser Ser Glu

565 570 575

Phe Ile Asp Thr Ile Asn Lys Pro Val Asn Ala Ala Leu Phe Ile Asp

580 585 590

Trp Ile Ser Lys Val Ile Arg Asp Phe Thr Thr Glu Ala Thr Gln Lys

595 600 605

Ser Thr Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Val

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Ile Ile Ile Glu Ala Glu Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly Val Gly Ile Leu Leu Glu Phe Val Pro

645 650 655

Glu Leu Thr Ile Pro Val Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Ser Tyr Glu Asn Lys Asn Lys Ala Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ser

675 680 685

Leu Ile Glu Arg Glu Ala Lys Trp Lys Glu Ile Tyr Ser Trp Ile Val

690 695 700

Ser Asn Trp Leu Thr Arg Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu

705 710 715 720

Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asp Ala Ile Lys Thr Ala

725 730 735

Ile Glu Tyr Lys Tyr Asn Asn Tyr Thr Ser Asp Glu Lys Asn Arg Leu

740 745 750

Glu Ser Glu Tyr Asn Ile Asn Asn Ile Glu Glu Glu Leu Asn Lys Lys

755 760 765

Val Ser Leu Ala Met Lys Asn Ile Glu Arg Phe Met Thr Glu Ser Ser

770 775 780

Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Ala Lys Val Gly Lys Leu

785 790 795 800

Lys Lys Tyr Asp Asn His Val Lys Ser Asp Leu Leu Asn Tyr Ile Leu

805 810 815

Asp His Arg Ser Ile Leu Gly Glu Gln Thr Asn Glu Leu Ser Asp Leu

820 825 830

Val Thr Ser Thr Leu Asn Ser Ser Ile Pro Phe Glu Leu Ser Ser Tyr

835 840 845

Thr Asn Asp Lys Ile Leu Ile Ile Tyr Phe Asn Arg Leu Tyr Lys Lys

850 855 860

Ile Lys Asp Ser Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys Phe

865 870 875 880

Ile Asp Ile Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asn Val

885 890 895

Tyr Ile Tyr Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Ser Arg

900 905 910

Leu Ser Glu Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn Ser

915 920 925

Arg Tyr Gln Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys His

930 935 940

Tyr Lys Pro Met Asn His Asn Arg Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met

945 950 955 960

Gly Asn Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Arg Thr Val Arg Asp

965 970 975

Cys Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Ser Gly Asn Lys Glu Asn

980 985 990

Leu Ile Phe Arg Tyr Glu Glu Leu Asn Arg Ile Ser Asn Tyr Ile Asn

995 1000 1005

Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn Ser

1010 1015 1020

Arg Ile Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Val Glu Lys Ser Ile Ser

1025 1030 1035

Asn Leu Gly Asp Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile

1040 1045 1050

Val Gly Cys Asp Asp Glu Thr Tyr Val Gly Ile Arg Tyr Phe Lys

1055 1060 1065

Val Phe Asn Thr Glu Leu Asp Lys Thr Glu Ile Glu Thr Leu Tyr

1070 1075 1080

Ser Asn Glu Pro Asp Pro Ser Ile Leu Lys Asn Tyr Trp Gly Asn

1085 1090 1095

Tyr Leu Leu Tyr Asn Lys Lys Tyr Tyr Leu Phe Asn Leu Leu Arg

1100 1105 1110

Lys Asp Lys Tyr Ile Thr Leu Asn Ser Gly Ile Leu Asn Ile Asn

1115 1120 1125

Gln Gln Arg Gly Val Thr Glu Gly Ser Val Phe Leu Asn Tyr Lys

1130 1135 1140

Leu Tyr Glu Gly Val Glu Val Ile Ile Arg Lys Asn Gly Pro Ile

1145 1150 1155

Asp Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg Lys Asn Asp Leu Ala

1160 1165 1170

Tyr Ile Asn Val Val Asp Arg Gly Val Glu Tyr Arg Leu Tyr Ala

1175 1180 1185

Asp Thr Lys Ser Glu Lys Glu Lys Ile Ile Arg Thr Ser Asn Leu

1190 1195 1200

Asn Asp Ser Leu Gly Gln Ile Ile Val Met Asp Ser Ile Gly Asn

1205 1210 1215

Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn Asn Gly Ser Asn Ile Gly

1220 1225 1230

Leu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Leu Val Ala Ser Ser Trp Tyr

1235 1240 1245

Tyr Asn Asn Ile Arg Arg Asn Thr Ser Ser Asn Gly Cys Phe Trp

1250 1255 1260

Ser Ser Ile Ser Lys Glu Asn Gly Trp Lys Glu

1265 1270

<210> 27

<211> 1297

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 27

Met Pro Val Asn Ile Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asn Asn

1 5 10 15

Asp Asp Ile Ile Met Met Glu Pro Phe Asn Asp Pro Gly Pro Gly Thr

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Arg Ile Ile Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu

35 40 45

Arg Phe Thr Tyr Gly Phe Gln Pro Asp Gln Phe Asn Ala Ser Thr Gly

50 55 60

Val Phe Ser Lys Asp Val Tyr Glu Tyr Tyr Asp Pro Thr Tyr Leu Lys

65 70 75 80

Thr Asp Ala Glu Lys Asp Lys Phe Leu Lys Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Asn Ser Lys Pro Ser Gly Gln Arg Leu Leu Asp Met Ile

100 105 110

Val Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ala Ser Thr Pro Pro Asp Lys

115 120 125

Phe Ala Ala Asn Val Ala Asn Val Ser Ile Asn Lys Lys Ile Ile Gln

130 135 140

Pro Gly Ala Glu Asp Gln Ile Lys Gly Leu Met Thr Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Ser Asp Asn Phe Thr Asp Ser Met Ile

165 170 175

Met Asn Gly His Ser Pro Ile Ser Glu Gly Phe Gly Ala Arg Met Met

180 185 190

Ile Arg Phe Cys Pro Ser Cys Leu Asn Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Asp Thr Ser Ile Phe Ser Arg Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Ile Ser Asn Leu Pro Ile Thr Pro Asn Thr Lys Glu Phe

245 250 255

Phe Met Gln His Ser Asp Pro Val Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly His Asp Pro Ser Val Ile Ser Pro Ser Thr Asp Met Asn Ile

275 280 285

Tyr Asn Lys Ala Leu Gln Asn Phe Gln Asp Ile Ala Asn Arg Leu Asn

290 295 300

Ile Val Ser Ser Ala Gln Gly Ser Gly Ile Asp Ile Ser Leu Tyr Lys

305 310 315 320

Gln Ile Tyr Lys Asn Lys Tyr Asp Phe Val Glu Asp Pro Asn Gly Lys

325 330 335

Tyr Ser Val Asp Lys Asp Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ala Leu Met

340 345 350

Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ile Lys Thr

355 360 365

Arg Tyr Ser Tyr Phe Ser Glu Tyr Leu Pro Pro Ile Lys Thr Glu Lys

370 375 380

Leu Leu Asp Asn Thr Ile Tyr Thr Gln Asn Glu Gly Phe Asn Ile Ala

385 390 395 400

Ser Lys Asn Leu Lys Thr Glu Phe Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Asn

405 410 415

Lys Glu Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Leu Glu His Leu Val Ile Tyr Arg

420 425 430

Ile Ala Met Cys Lys Pro Val Met Tyr Lys Asn Thr Gly Lys Ser Glu

435 440 445

Gln Cys Ile Ile Val Asn Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asn Lys

450 455 460

Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Ala Lys Ala Glu Thr Ile Ala Tyr Asn

465 470 475 480

Thr Gln Asn Asn Thr Ile Glu Asn Asn Phe Ser Ile Asp Gln Leu Ile

485 490 495

Leu Asp Asn Asp Leu Ser Ser Gly Ile Asp Leu Pro Asn Glu Asn Thr

500 505 510

Glu Pro Phe Thr Asn Phe Asp Asp Ile Asp Ile Pro Val Tyr Ile Lys

515 520 525

Gln Ser Ala Leu Lys Lys Ile Phe Val Asp Gly Asp Ser Leu Phe Glu

530 535 540

Tyr Leu His Ala Gln Thr Phe Pro Ser Asn Ile Glu Asn Leu Gln Leu

545 550 555 560

Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ala Leu Arg Asn Asn Asn Lys Val Tyr Thr

565 570 575

Phe Phe Ser Thr Asn Leu Val Glu Lys Ala Asn Thr Val Val Gly Ala

580 585 590

Ser Leu Phe Val Asn Trp Val Lys Gly Val Ile Asp Asp Phe Thr Ser

595 600 605

Glu Ser Thr Gln Lys Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Asp Val Ser Ile

610 615 620

Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala

625 630 635 640

Lys Glu Asn Phe Lys Asn Ala Phe Glu Ile Gly Gly Ala Ala Ile Leu

645 650 655

Met Glu Phe Ile Pro Glu Leu Ile Val Pro Ile Val Gly Phe Phe Thr

660 665 670

Leu Glu Ser Tyr Val Gly Asn Lys Gly His Ile Ile Met Thr Ile Ser

675 680 685

Asn Ala Leu Lys Lys Arg Asp Gln Lys Trp Thr Asp Met Tyr Gly Leu

690 695 700

Ile Val Ser Gln Trp Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile

705 710 715 720

Lys Glu Arg Met Tyr Asn Ala Leu Asn Asn Gln Ser Gln Ala Ile Glu

725 730 735

Lys Ile Ile Glu Asp Gln Tyr Asn Arg Tyr Ser Glu Glu Asp Lys Met

740 745 750

Asn Ile Asn Ile Asp Phe Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Asn Gln Ser

755 760 765

Ile Asn Leu Ala Ile Asn Asn Ile Asp Asp Phe Ile Asn Gln Cys Ser

770 775 780

Ile Ser Tyr Leu Met Asn Arg Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu

785 790 795 800

Lys Asp Phe Asp Asp Asn Leu Lys Arg Asp Leu Leu Glu Tyr Ile Asp

805 810 815

Thr Asn Glu Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Val Asn Ile Leu Lys Ser Lys

820 825 830

Val Asn Arg His Leu Lys Asp Ser Ile Pro Phe Asp Leu Ser Leu Tyr

835 840 845

Thr Lys Asp Thr Ile Leu Ile Gln Val Phe Asn Asn Tyr Ile Ser Asn

850 855 860

Ile Ser Ser Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu

865 870 875 880

Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val

885 890 895

Ile Phe Asn Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu

900 905 910

Asn Ser Asn Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser

915 920 925

Met Phe Asp Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr

930 935 940

Asn Asn Asn Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile

945 950 955 960

Ser Cys Ile Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn

965 970 975

Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile

980 985 990

Phe Phe Glu Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys

995 1000 1005

Trp Phe Ser Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn

1010 1015 1020

Ile Tyr Ile Asn Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn

1025 1030 1035

Leu Asp Arg Ile Asn Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile

1040 1045 1050

Asn Cys Thr Asp Thr Thr Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn

1055 1060 1065

Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr

1070 1075 1080

Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn

1085 1090 1095

Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Gln Tyr Tyr Leu Phe Asn Gln Gly Met

1100 1105 1110

Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr Phe Ser Lys Ala Ser Met Gly Glu

1115 1120 1125

Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn Asn Ala Ala Ile Asn Tyr Gln

1130 1135 1140

Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile Ile Lys Lys Ala Ser Asn

1145 1150 1155

Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val Arg Glu Gly Asp Tyr

1160 1165 1170

Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu Ser Tyr Arg Val

1175 1180 1185

Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln Leu Phe Leu

1190 1195 1200

Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu Gln Ile

1205 1210 1215

Lys Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu Cys

1220 1225 1230

Glu Lys Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe

1235 1240 1245

Val Lys Asp Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe

1250 1255 1260

Cys Ile Ser Gln Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn

1265 1270 1275

Lys Leu Arg Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu

1280 1285 1290

Gly Trp Thr Glu

1295

<210> 28

<211> 1291

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 28

Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn

1 5 10 15

Asp Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn

65 70 75 80

Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile

100 105 110

Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu

115 120 125

Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Pro Gly Glu Val Glu Gln Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly

165 170 175

Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln

180 185 190

Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe

245 250 255

Phe Met Gln Ser Thr Asp Thr Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Ser Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile

275 280 285

Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn

290 295 300

Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr

305 310 315 320

Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly

325 330 335

Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asn Lys Leu Tyr Lys Ser Leu

340 345 350

Met Phe Gly Phe Thr Glu Ile Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys

355 360 365

Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys

370 375 380

Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile

385 390 395 400

Ser Asp Lys Asn Met Gly Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr

420 425 430

Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Ile Cys Ile Asp

435 440 445

Val Asp Asn Glu Asn Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser

450 455 460

Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Val Glu Tyr Asn Thr Gln Asn Asn

465 470 475 480

Tyr Ile Gly Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp

485 490 495

Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr

500 505 510

Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys

515 520 525

Lys Val Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln

530 535 540

Thr Phe Pro Leu Asn Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp

545 550 555 560

Asp Ala Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp

565 570 575

Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly

580 585 590

Trp Val Lys Gln Ile Val Asp Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser

595 600 605

Ser Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Ser Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ser Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro

645 650 655

Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Val Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys

675 680 685

Arg Val Glu Lys Trp Ile Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp

690 695 700

Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr

705 710 715 720

Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr

725 730 735

Lys Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Glu Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asn

740 745 750

Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Asp Gly Ile Asn Gln Ala Met

755 760 765

Asp Asn Ile Asn Asp Phe Ile Asn Glu Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met

770 775 780

Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn

785 790 795 800

Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr

805 810 815

Leu Ile Gly Ser Val Glu Asp Glu Lys Ser Lys Val Asp Lys Tyr Leu

820 825 830

Lys Thr Ile Ile Pro Phe Asp Leu Ser Thr Tyr Thr Asn Asn Glu Ile

835 840 845

Leu Ile Lys Ile Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile

850 855 860

Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Arg Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly

865 870 875 880

Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Lys Leu Asn Asp Lys

885 890 895

Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asp Ser Lys Ile Arg Val Thr

900 905 910

Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Met Phe Leu Asp Phe Ser Val

915 920 925

Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Arg Asn Asp Asp Ile Gln Asn

930 935 940

Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile

965 970 975

Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg

980 985 990

Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Leu Asp Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Thr Leu Glu

1010 1015 1020

Ser Asn Met Asp Ile Lys Asp Ile Gly Glu Val Ile Val Asn Gly

1025 1030 1035

Glu Ile Thr Phe Lys Leu Asp Gly Asp Val Asp Arg Thr Gln Phe

1040 1045 1050

Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Gln Leu Asn Gln

1055 1060 1065

Ser Asn Ile Lys Glu Ile Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr

1070 1075 1080

Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr

1085 1090 1095

Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Val

1100 1105 1110

Lys Asp Ser Ser Val Gly Glu Ile Leu Ile Arg Ser Lys Tyr Asn

1115 1120 1125

Gln Asn Ser Asn Tyr Ile Asn Tyr Arg Asn Leu Tyr Ile Gly Glu

1130 1135 1140

Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp

1145 1150 1155

Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile His Leu Asp Phe Val Asn

1160 1165 1170

Ser Asn Glu Glu Trp Arg Val Tyr Ala Tyr Lys Asn Phe Lys Glu

1175 1180 1185

Gln Glu Gln Lys Leu Phe Leu Ser Ile Ile Tyr Asp Ser Asn Glu

1190 1195 1200

Phe Tyr Lys Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr

1205 1210 1215

Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp

1220 1225 1230

Asp Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Val

1235 1240 1245

Leu Arg Lys Lys Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr

1250 1255 1260

Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Lys Ser Asn Leu Gly Cys

1265 1270 1275

Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1280 1285 1290

<210> 29

<211> 22

<212> Белок

<213> Неизвестно

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестного:

последовательность Syt I мыши/крысы"

<400> 29

Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Gln Lys Phe Met

1 5 10 15

Asn Glu Leu His Lys Ile

20

<---

1. Полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащий:

a) протеазный домен;

b) сайт расщепления протеазами;

c) домен транслокации и

d) модифицированный рецептор-связывающий домен Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c), который по меньшей мере на 95% идентичен таковому эталонного B4-H_c с SEQ ID NO: 28 и содержит модификацию последовательности относительно SEQ ID NO: 28, где указанная модификация последовательности содержит мутации замены V1113K, S1117P, S1196A и I1197P,

где указанный модифицированный рецептор-связывающий домен показывает усиленное связывание с человеческим синаптотагмином II (Syt II).

2. Полипептид BoNT по п. 1, где указанная модификация последовательности дополнительно содержит одну или более мутаций замены, выбранных из группы, состоящей из:

Q1191C, Q1191V, Q1191L, Q1191Y, Q1191M, Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинаций.

3. Полипептид BoNT по п. 2, где указанная модификация последовательности содержит две мутации замены из группы, состоящей из:

Q1191C, Q1191V, Q1191L, Q1191Y, Q1191M, Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C и Y1183P.

4. Полипептид BoNT по п. 1, где указанная модификация последовательности дополнительно содержит две или более мутаций замены, где одна из указанных дополнительных мутаций замены выбрана из группы, состоящей из Q1191M, Q1191C, Q1191V, Q1191L и Q1191Y.

5. Полипептид BoNT по п. 1, где указанная модификация последовательности дополнительно содержит две или более мутаций замены, где одна из указанных дополнительных мутаций замены соответствует Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, Y1199F или Y1199L.

6. Полипептид BoNT по п. 1, где указанная модификация последовательности дополнительно содержит две мутации замены, соответствующие Q1191M и W1178Q, Q1191C и W1178Q, Q1191V и W1178Q, Q1191L и W1178Q, Q1191Y и W1178Q, Q1191M и Y1183P, Q1191M и Y1183C, Q1191C и Y1183P, Q1191C и Y1183C, Q1191V и Y1183P, Q1191V и Y1183C, Q1191L и Y1183P, Q1191L и Y1183C, Q1191Y и Y1183P, Q1191Y и Y1183C, W1178Q и Y1183P, и W1178Q и Y1183C.

7. Полипептид BoNT по п. 4, где указанные две мутации замены соответствуют Q1191M и W1178Q.

8. Полипептид BoNT по п. 4, где указанные две мутации замены соответствуют Q1191M и W1183P.

9. Полипептид BoNT по п. 4, где указанные две мутации замены соответствуют Q1191M и W1183C.

10. Полипептид BoNT по п. 1, где указанная модификация последовательности дополнительно содержит три мутации замены.

11. Полипептид BoNT по п. 10, где указанные три дополнительные мутации замены находятся в позициях, которые соответствуют Q1191, W1178 и Y1183.

12. Полипептид BoNT по п. 10, где указанные три дополнительные мутации замены соответствуют Q1191M, W1178Q и Y1183P.

13. Полипептид BoNT по любому из пп. 1-12, где указанные протеазный домен, домен транслокации и сайт расщепления протеазами происходят из серотипа, выбранного из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F, G и их комбинаций.

14. Полипептид BoNT по п. 13, где указанные протеазный домен, домен транслокации и сайт расщепления протеазами происходят из серотипа B, штамма 1.

15. Полипептид BoNT по п. 13, где указанные протеазный домен и домен транслокации относятся к серотипу А, штамму 1.

16. Полипептид BoNT по п. 13, где указанный сайт расщепления протеазами происходит из серотипа А, серотипа B или представляет собой химерный сайт расщепления серотипов А и B.

17. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид BoNT по любому из пп. 1-16.

18. Вектор для увеличения числа копий нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 17.

19. Вектор для экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 17.

20. Клетка E.coli для увеличения числа копий нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид BoNT, содержащая вектор для увеличения числа копий по п. 18.

21. Клетка E.coli для экспрессии полипептида BoNT, содержащая экспрессионный вектор по п. 19.

22. Полипептид для лечения состояния, связанного с нежелательной нейрональной активностью, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c), который по меньшей мере на 95% идентичен таковому эталонного B4-H_c с SEQ ID NO: 28 и содержит модификацию последовательности относительно SEQ ID NO: 28, где указанная модификация последовательности содержит мутации замены V1113K, S1117P, S1196A и I1197P,

где указанный модифицированный рецептор-связывающий домен показывает усиленное связывание с человеческим синаптотагмином II (Syt II).

23. Полипептид по п. 22, где указанная модификация последовательности дополнительно содержит одну или более мутаций замены, выбранных из группы, состоящей из:

Q1191C, Q1191V, Q1191L, Q1191Y, Q1191M, Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинаций.

24. Полипептид по п. 23, где указанная модификация последовательности содержит две мутации замены, выбранные из группы, состоящей из:

Q1191C, Q1191V, Q1191L, Q1191Y, Q1191M, Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C и Y1183P.

25. Полипептид по п. 22, где указанная модификация последовательности дополнительно содержит две или более мутаций замены, где одна из указанных дополнительных мутаций замены выбрана из группы, состоящей из Q1191M, Q1191C, Q1191V, Q1191L и Q1191Y.

26. Полипептид по п. 22, где указанная модификация последовательности дополнительно содержит две или более мутаций замены, где одна из указанных дополнительных мутаций замены соответствует Y1199W, Y1199E, Y1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, Y1199F или Y1199L.

27. Полипептид по п. 22, где указанная модификация последовательности дополнительно содержит две мутации замены, соответствующие Q1191M и W1178Q, Q1191C и W1178Q, Q1191V и W1178Q, Q1191L и W1178Q, Q1191Y и W1178Q, Q1191M и Y1183P, Q1191M и Y1183C, Q1191C и Y1183P, Q1191C и Y1183C, Q1191V и Y1183P, Q1191V и Y1183C, Q1191L и Y1183P, Q1191L и Y1183C, Q1191Y и Y1183P, Q1191Y и Y1183C, W1178Q и Y1183P, и W1178Q и Y1183C.

28. Полипептид по п. 25, где указанные две мутации замены соответствуют Q1191M и W1178Q.

29. Полипептид по п. 25, где указанные две мутации замены соответствуют Q1191M и W1183P.

30. Полипептид по п. 25, где указанные две мутации замены соответствуют Q1191M и W1183C.

31. Полипептид по п. 22, где указанная модификация последовательности дополнительно содержит три мутации замены.

32. Полипептид по п. 31, где указанные три дополнительные мутации замены находятся в позициях, которые соответствуют Q1191, W1178 и Y1183.

33. Полипептид по п. 32, где указанные три дополнительные мутации замены соответствуют Q1191M, W1178Q и Y1183P.

34. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп. 22-33.

35. Вектор для увеличения числа копий нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 34.

36. Вектор для экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 34.

37. Клетка E.coli для увеличения числа копий нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид BoNT, содержащая вектор для увеличения числа копий по п. 35.

38. Клетка E.coli для экспрессии полипептида BoNT, содержащая экспрессионный вектор по п. 36.

39. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, связанного с нежелательной нейрональной активностью, содержащая полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT) по любому из пп. 1-16 или полипептид по любому из пп. 22-33 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

40. Набор для терапевтического введения фармацевтической композиции, содержащий фармацевтическую композицию по п. 39 и инструкции по терапевтическому введению указанной фармацевтической композиции.

41. Способ получения полипептида ботулинического нейротоксина (BoNT), включающий этапы:

культивирования клетки E.coli, содержащей экспрессионный вектор, посредством чего получают указанный полипептид BoNT,

где указанный экспрессионный вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид BoNT,

где указанный полипептид BoNT содержит:

a) протеазный домен;

b) сайт расщепления протеазами;

c) домен транслокации и

d) модифицированный рецептор-связывающий домен Clostridium botulinum серотипа B, штамма 4 (B4-H_c), который по меньшей мере на 95% идентичен таковому эталонного B4-H_c с SEQ ID NO: 28 и содержит модификацию последовательности относительно SEQ ID NO: 28, где указанная модификация последовательности содержит мутации замены V1113K, S1117P, S1196A и I1197P,

где указанный модифицированный рецептор-связывающий домен показывает усиленное связывание с человеческим синаптотагмином II (Syt II), и

получения указанного полипептида BoNT из указанной клеточной культуры.

42. Способ по п. 41, дополнительно включающий один или более из следующих этапов:

- выделение полипептида BoNT из культуры,

- очистка полипептида BoNT,

- активация полипептида BoNT и/или

- получение полипептида BoNT в виде готовой формы.

43. Способ лечения патологического состояния, связанного с нежелательной нейрональной активностью, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества полипептида BoNT по любому из пп. 1-16 или полипептида по любому из пп. 22-33, чтобы таким образом осуществить их контакт с одним или более нейронами, проявляющими нежелательную нейрональную активность, чтобы таким образом лечить указанное патологическое состояние.

44. Способ по п. 43, где патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из спастической дисфонии, спастической кривошеи, дистонии мышц гортани, оромандибулярной дистонии, дистонии мышц языка, дистонии мышц шеи, фокальной дистонии мышц кисти, блефароспазма, косоглазия, одностороннего лицевого спазма, нарушения мышц век, церебрального паралича, фокальной спастичности и других нарушений голоса, спастического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечностей, судорог, дрожания, бруксизма, анальной трещины, ахалазии, нарушения глотания и других нарушений мышечного тонуса и других нарушений, характеризуемых непроизвольными движениями мышечных групп, слезотечения, гипергидроза, повышенного слюноотделения, повышенной желудочно-кишечной секреции, нарушений секреции, боли от мышечных спазмов, головной боли, мигрени и дерматологических или эстетических/косметических патологических состояний.