Последовательность нуклеотидов, кодирующая β-n-ацетилгексозаминидазу aggregatibacter actinomycetemcomitans, и генетические конструкции, её содержащие

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена нуклеиновая кислота, выбранная из SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, кодирующая β-N-ацетилгексозаминидазу Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Также предложены плазмидный экспресссионный вектор, содержащий одну из указанных нуклеиновых кислот, штамм Escherichia coli, содержащий один из указанных векторов и продуцирующий β-N-ацетилгексозаминидазу. Группа изобретений позволяет получить высокоактивный фермент β-N-ацетилгексозаминидазу в растворимой форме. 5 н.п. ф-лы, 7 ил., 4 пр.

 

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к ферментам, разрушающим биопленку.

Сообщества микроорганизмов, образующих суперструктуры на поверхности раздела фаз и заключенных в синтезируемый матрикс, называют биопленками. В отличие от планктонной формы микроорганизмы в биопленках имеют измененный фенотип. Биопленки могут образовываться на различных органах и тканях в организме человека и животных, а также на корнях и других частях растений. Бактерии, живущие внутри биопленок, проявляют значительно более высокую устойчивость к антибиотикам и другим лекарственным препаратам, что крайне затрудняет борьбу с инфекциями, вызванными различными патогенными бактериями. Среди всех инфекционных поражений около 65-80% вызываются бактериями, формирующими биопленки [Хмель И.А. Биопленки бактерий и связанные с ними трудности медицинской практики. URL: https://img.ras.ru/files/center/biofilms.doc, дата посещения 09.08.2021]. Так например, биопленки, формируемые микроорганизмами Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli обычно вызывают внутрисосудистую катетер-ассоциированную инфекцию, а биопленки Staphylococcus aureus связаны с инфекцией, развивающейся на металлических имплантатах [Е. Barth, Q.M. Myrvik, W.Wagner, A.G. Gristina, In vitro and in vivo comparative colonization of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis on orthopaedic implant materials, Biomaterials 10 (5) (1989) 325-328; J. Dankert, A.H. Hogt, J. Feijen, Biomedical polymers: bacterial adhesion, colonization, and infection, Crit. Rev. Biocompat. 2 (1986) 219-301]. В пищевой промышленности образование биопленок на продуктах повышает риск заражения патогенными микроорганизмами пищи и возникновения в результате этого значимых инфекций у людей. Матрикс микробных биопленок представляет собой сложную гетерогенную структуру, в которую входят белки, нуклеиновые кислоты, липиды, фосфолипиды и другие вещества. Основными компонентами матрикса являются экзогенные полисахариды, синтезируемые микроорганизмами [Karatan, Е. and Watnick, P. Signals, regulatory net works, and materials, that build and break bacterial bio films, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2009, vol. 73, pp. 310-347]. Экзополисахариды (ЭПС) обеспечивают структурную стабильность биопленки, адгезию и агрегацию микроорганизмов, физическую и химическую защиту бактерий от действия противомикробных препаратов и эффекторов иммунной системы макроорганизма. Ферментативная деградация матрикса рассматривается как многообещающий метод разрушения биопленок [Kaplan, J.B. Therapeutic potential of biofilm dispersing enzymes, Appl. Microb. Cell Physiol., 2009, vol. 32, pp. 545-554] для борьбы с микробным заражением и загрязнением. Многообещающими являются биологические методы деструкции биопленок с использованием ферментов, таких как протеазы, дезоксирибонуклеаза и гликозидазы, для гидролиза ЭПС, поскольку без ЭПС клетки бактерий легко доступны для антимикробных агентов.

β-N-ацетилгексозаминидаза, обнаруженная у грамотрицательной факультативно аэробной бактерии из ротовой полости человека Aggregatibacter actinomycetemcomitans, в 2003 году была названа дисперсии Б (DispersinB®, DspB) [Kaplan JB, Ragunath С, Ramasubbu N, Fine DH. (2003). Detachment of Actinobacillus actinomycetemcomitans Biofilm Cells by an Endogenous β-Hexosaminidase Activity. J Bacteriol 185: 4693-4698]. Этот фермент специфически гидролизует (β-1,6)-гликозидные связи поли-N-ацетилглюкозамина (PNAG) - полисахарида матрикса биопленки, который обеспечивает межклеточную адгезию и прикрепление к абиотическим поверхностям клеток. Дефицит железа вызывает Fur-опосредованную активацию dspB, позволяя A. actinomycetemcomitans ускользать из окружающей среды с дефицитом железа [Stacy A, Abraham N, Jorth Р, Whiteley М. (2016). Microbial Community Composition Impacts Pathogen Iron Availability during Polymicrobial Infection. PLoS Pathog 12:e1006084]. Гены, гомологичные dspB A. actinomycetemcomitans, присутствуют в геноме нескольких других бактерий, но нет доказательств того, что кодируемые белки являются функциональными ферментами DspB. Однако очищенный фермент DspB способен диспергировать не только предварительно сформированные биопленки А. actinomycetemcomitans, но также и те, которые образованы различными бактериями, продуцирующими PNAG. Хотя в геноме видов Staphylococcus нет гомолога dspB, DspB способствует диспергированию биопленок у штаммов, которые используют PNAG в качестве доминирующего компонента их матрикса [Kaplan JB, Ragunath С, Velliyagounder K, Fine DH, Ramasubbu N. (2004). Enzymatic Detachment of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Antimicrob Agents Chemother 48: 2633-2636; Chaignon P, Sadovskaya I, Ragunah C, Ramasubbu N, Kaplan JB, Jabbouri S. (2007). Susceptibility of staphylococcal biofilms to enzymatic treatments depends on their chemical composition. Appl Microbiol Biotechnol 75: 125-132; Izano EA, Amarante MA, Kher WB, Kaplan JB. (2008). Differential Roles of Poly-NAcetylglucosamine Surface Polysaccharide and Extracellular DNA in Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Biofilms. Appl Environ Microbiol 74: 470-176]. Каплан предположил, что DspB можно использовать в качестве агента для удаления биопленки S. epidermidis с медицинских устройств [Kaplan JB. (2009). Therapeutic potential of biofilm-dispersing enzymes. Int J Artif Organs 32: 545-554]. Комбинация DspB с антисептиками дает синергетическую анти-биопленочную активность широкого спектра действия и антимикробную активность против S. aureus, S. epidermidis и Е. coli in vitro и in vivo [Darouiche RO, Mansouri MD, Gawande PV, Madhyastha S. (2009). Antimicrobial and antibiofilm efficacy of triclosan and DispersinB® combination. J Antimicrob Chemother 64: 88-93].

Аминокислотная последовательность DspB расшифрована [GeneBank: AAP31025.1], также известна из уровня техники последовательность гена, кодирующего DspB [патент US7294497B2].

Для производства рекомбинантных ферментов наиболее удобной, изученной и экономически оправданной является бактериальная система на основе штаммов Escherichia coli.

Из патента на изобретение US 7294497 известны аминокислотная последовательность DspB [GeneBank ААР31025.1] и природная последовательность гена, кодирующего дисперсии Б.

Из патента на изобретение US 7989604 известна последовательность нуклеотидов, кодирующая дисперсии Б для экспрессии в Е. coli. Экспрессированный в клетках Е. coli штамма BL21(DE3) белок характеризуется молекулярной массой 41 кДа. Выход дисперсина Б составил 30 мг белка на литр культуры. Дисперсии Б показал специфичность для гликозидной связи 1→4 β-замещенного N-ацетилглюкозамина. Гликозилгидролазная активность дисперсина Б была оптимальной при рН 5,0, 30°С. Однако сложные рекомбинантные белки, синтезируемые в гетерогенном организме, зачастую формируют не корректную третичную структуру, что снижает их эффективность в дальнейшем или требует дополнительной процедуры фолдинга.

Известно, что для создания штамма, продуцирующего белок интереса наиболее эффективно, применяется биоинформационный метод так называемой кодонной оптимизации, позволяющий добиться высокого выхода чужеродного белка.

Использование кодонной оптимизации для синтеза дисперсина Б в клетках Е. coli известны из уровня техники [Bales Р. (2014) Exopolysaccharide analysis and eps depolymerases as possible biofilm control strategies. Master of Science Thesis at https://drum.lib.umd.edu/handle/1903/15745, дата обращения 27 июля 2021 г.], однако не раскрыта конкретная последовательность нуклеотидов, кодирующая белок интереса.

В целом генетический код консервативен среди организмов. Однако предпочтение кодонов варьируется между организмами: в разных организмах выбор частых и редких синонимичных кодонов различен. В то же время этот выбор более или менее постоянен в разных генах одного генома. Согласно современным данным, использование пар кодонов, которые наиболее распространены для определенного организма, может увеличить скорость синтеза белка на соответствующей мРНК и, как следствие, увеличить уровень синтеза целевого белка [Coleman, J.R., et al., Virus attenuation by genome-scale changes in codon pair bias. Science, 2008. 320(5884): p. 1784-7]. Оптимизация последовательностей ДНК для экспрессии белка в определенном организме выполняется с использованием специализированных программ. Основная идея оптимизации заключается в том, что для кодирования определенной аминокислоты используется кодон, наиболее встречаемый в белок-кодирующих последовательностях данного организма, например, такой механизм заложен в программу OPTIMIZER [, P., et al., OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res, 2007. 35(Web Server issue): p.W126-31]. Для того, чтобы оценить, насколько часто в определенной последовательности используются наиболее распространенные кодоны применяется CAI (Codon Adaptation Index) [Sharp, P.M. and W.H. Li, The codon Adaptation Index-a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications. Nucleic acids research, 1987. 15(3): p.1281-1295]. В широком диапазоне видов и геномов встречаемость пар кодонов смещена, относительно предсказанных значений встречаемости [Boycheva, S., G. Chkodrov, and I. Ivanov, Codon pairs in the genome of Escherichia coli. Bioinformatics, 2003. 19(8): p.987-98]. Поэтому, в ходе оптимизации кроме встречаемости кодонов следует учитывать также и реальную встречаемость пар кодонов. Для этого используется СРВ (Codon Pair Bias), показатель, измеряющий для последовательности частоту встречаемости пар кодонов [, A., et al., Codon optimization: a mathematical programing approach. Bioinformatics, 2020. 36(13): p.4012-4020].

Для оптимизации последовательности ДНК, кодирующей дисперсии В, использовалась программа MaxCPBstCAI [, A., et al., Codon optimization: a mathematical programing approach. Bioinformatics, 2020. 36(13): p.4012-4020]. Данная программа представляет собой Python скрипт, который с помощью библиотеки gurobipy строит математическую модель и находит решение средствами программы для оптимизации Gurobi [Gurobi Optimization, L., Gurobi Optimizer Reference Manual. 2020]. В данной программе модель оптимизируется таким образом, чтобы максимизировать СРВ при CAI, не опускающемся ниже определенного значения.

Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, являлось получение последовательности нуклеотидов, кодирующей β-N-ацетилгексозаминидазу, для цитоплазматической экспрессии в клетках Е. coli с высокой продуктивностью, то есть с выходом β-N-ацетилгексозаминидазы на уровне не менее 50% от общего количества клеточного белка по данным денситометрии. Еще одной технической задачей было получение рекомбинантного белка, синтезируемого в клетках штамма-продуцента таким образом, чтобы в растворимой форме было не менее 60% белка. Также технической задачей было получение генетической конструкции на основе клеток Escherichia coli, продуцирующей β-N-ацетилгексозаминидазу.

Технический результат достигался созданием последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, кодирующей β-N-ацетилгексозаминидазу Aggregatibacter actinomycetemcomitans (GeneBank AAP31025.1, UniProt Q840G9).

Последовательность нуклеотидов, выбранная из SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, была введена в плазмидный экспрессионный вектор рЕТ28а для создания штамма - продуцента β-N-ацетилгексозаминидазы.

Полученный плазмидный экспрессионный вектор был введен в клетки Е. coli штамма Escherichia coli BL21(DE3) генотип: MiniF lysY (Cam^R) / fhuA2 lacZ::T7 gene 1 [lon] ompT ahpC gal λatt::pcDsbC (Spec^R, lacI^q) ΔtrxB sulA11 R(mcr-73::miniTn10-Tet^S)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10-Tet^S) endA1 Δgor Δ(mcrC-mrr)114::IS10. В результате был получен штамм - продуцент β-N-ацетилгексозаминидазы, который характеризуется следующими культурально-морфологическими и физико-биохимическими свойствами: грамотрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,5×2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Факультативные анаэробы. Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих канамицин в концентрации 30 мкг/мл, например, на среде LB. На агаризованной среде - колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно. Интервал для культивирования - 28-30°С, оптимум роста при 30°C.

Условия хранения штамма:

- замороженным при минус 80°С (до 12 месяцев) в 25%-ном растворе глицерина в питательной среде LB (Бакто-триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, хлористый натрий - 10 г/л, рН 6.8),

Полученные штаммы Е. coli BL21bAcNhis (содержит SEQ ID NO:3) и BL21bAcChis (содержит SEQ ID NO:4) хранятся в коллекции микроорганизмов ООО «Иннова плюс».

Культивирование Escherichia coli BL21bAcNhis и BL21bAcChis в питательной среде LB с селективным антибиотиком (канамицин, 30 мкг/мл) и последующая индукция 1 мМ ИПТГ позволяют получать рекомбинантную β-N-ацетилгексозаминидазу, слитую с 6xHis-тэгом с целью облегчения очистки и сайтом расщепления TEV протеазой. Взятый за основу для трансформации штамм Е. coli экспрессирует DsbC периплазматическую изомеразу дисульфидной связи. Предполагается, что эта гидрофобная область в этом белке опосредует шаперонные свойства DsbC, ее сверхэкспрессия значительно увеличивает количество правильно свернутого белка in vivo как в периплазме, так и в цитоплазме [Kurokawa Y, Yanagi Н, Yura Т: Overproduction of bacterial protein disulfide isomerase (DsbC) and its modulator (DsbD) markedly enhances periplasmic production of human nerve growth factor in Escherichia coli. J Biol Chem 2001, 276:14393-14399, Jurado P, Ritz D, Beckwith J, de Lorenzo V, Fernandez LA: Production of functional single-chain Fv antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol 2002, 320:1-10].

Последовательности нуклеотидов по настоящему изобретению были получены известными из уровня техники методами биоинформатики с использованием программного обеспечения Signa1IP v.5.0 и MaxCPBstCAI. Молекулы ДНК с разработанными оптимизированными последовательностями, кодирующие β-N-ацетилгексозаминидазу с сайтами рестрикции и с N- и С-концевым His-тагом, были синтезированы известными из уровня техники способами химико-ферментативного синтеза [Young L, Dong Q. Two-step total gene synthesis method. Nucleic Acids Res. 2004;32(7):e59. Published 2004 Apr 15. doi:10.1093/nar/gnh058].

Для получения штамма-продуцента была создана векторная конструкция на основе коммерчески доступного плазмидного вектора рЕТ28а (Novagen, Merck). Его схема представлена на Фит.1. Экспрессионные плазмиды серии рЕТ широко используются для получения рекомбинантных белков в Escherichia coli. Штудиер и его коллеги описали первую экспрессионную плазмиду рЕТ более тридцати лет назад [William Studier, F., et al.,Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, in Methods in Enzymology. 1990, Academic Press, p.60-89 и Rosenberg, A.H., et al., Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene, 1987. 56(1): p.125-135]. Они интегрировали сильный промотор ϕ10 для РНК-полимеразы Т7 (промотор Т7) и терминатор транскрипции Тϕ (терминатор Т7) в каркас плазмиды pBR322 и установили номенклатуру рЕТ (плазмида для экспрессии с помощью РНК-полимеразы Т7). Впоследствии Novagen и Invitrogen расширили серию до 103 уникальных плазмид экспрессии. Эти плазмиды экспрессии поддерживают высокие уровни транскрипции в штаммах Escherichia coli, которые содержат лизогенизированный фрагмент фага DE3, кодирующий РНК-полимеразу Т7 [Rosano, G.L. and Е.А. Ceccarelli, Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol, 2014. 5: p. 172]. Вектор pET28a (Фиг. 1) является одним из самых популярных векторов рЕТ-системы - высокоэффективной системы с отрицательным контролем экспрессии для производства рекомбинантных белков под регуляцией Т7 промотора. Плазмида также содержит ген аминофосфотрансферазы, фосфорилирующей молекулу канамицина, тем самым обеспечивая устойчивость к этому антибиотику, что позволяет проводить селекцию клеток, трансформация которых интересующей конструкцией прошла успешно.

Штаммы - продуценты β-N-ацетилгексозаминидазы Aggregatibacter actinomycetemcomitans получали на основе коммерчески доступного штамма Escherichia coli BL21(DE3). Клетки Е. coli трансформировали плазмидными экспрессионными векторами по настоящему изобретению pET28a-dsp-NHis и pET28a-dsp-CHis с использованием известных из уровня техники методик.

В результате были получены штаммы Е. coli BL21bAcNhis и BL21bAcChis, экспрессирующие β-N-ацетилгексозаминидазу Aggregatibacter actinomycetemcomitans, в которых уровень экспрессии β-N-ацетилгексозаминидазы составляет 50% от общего клеточного белка. При этом штамм BL21bAcNhis содержит 63,8% β-N-ацетилгексозаминидазы в растворимой форме, а штамм BL21bAcChis - 90,6%. Ферментативная активность полученного белка примерно в 7 раз превышает активность, необходимую для разрушения биопленок.

Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами:

На Фиг. 1 демонстрируется схема структуры вектора рЕТ28а. MCS - сайт множественного клонирования, где KanR - ген устойчивости к канамицину, lacI - ген, кодирующий lac-репрессор, pBR322 ori - последовательность сайта начала репликации из плазмиды pBR322.

На Фиг. 2 представлены данные предсказания отсутствия сигнальных пептидов SignalP 5.0.

На Фиг. 3 демонстрируется аминокислотная последовательность белка β-N-ацетилгексозаминидазы с 6xHis на N-конце (SEQ ID NO: 1). Желтым отмечен 6xHis, серым - линкер, зеленым - сайт расщепления TEV протеазой.

На Фиг. 4 демонстрируется аминокислотная последовательность белка β-N-ацетилгексозаминидазы с 6xHis на С-конце (SEQ ID NO:2). Желтым отмечен 6xHis, серым - линкер, зеленым - сайт расщепления TEV протеазой.

На Фиг. 5 демонстрируется оптимизированная нуклеотидная последовательность β-N-ацетилгексозаминидазы с His-tag на N-конце последовательности (SEQ ID NO:3). Желтым отмечены сайт рестрикции NcoI - XhoI, красным - два стоп кодона.

На Фиг. 6 демонстрируется оптимизированная нуклеотидная последовательность β-N-ацетилгексозаминидазы с His-tag на С-конце последовательности (SEQ ID NO:4). Желтым отмечены сайт рестрикции NcoI - XhoI, красным - два стоп кодона.

На Фиг. 7 демонстрируется электрофореграмма целевого белка β-N-ацетилгексозаминидазы, полученная с помощью вертикального диск-электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. М - Маркер Bio-Rad Precision Plus Protein Dual Color Standards, #1610374, 1-3 - клетки штамма BL21bAcChis, 1 - общий лизат, 2 - растворимая фракция, 3 -нерастворимая фракция; 4-6 - клетки штамма BL21bAcChis, 4 - общий лизат, 5 - растворимая фракция, 6 - нерастворимая фракция. Стрелкой отмечен целевой белковый продукт.

Сущность и промышленная применимость изобретения поясняются следующими примерами:

Пример 1. Получение последовательности нуклеотидов, кодирующей β-N-ацетилгексозаминидазу.

Пример 1.1. Получение кодонно оптимизированной последовательности нуклеотидов, кодирующей β-N-ацетилгексозаминидазу (биоинформатические методы)

В качестве исходной аминокислотной последовательности белка β-N-ацетилгексозаминидазы из Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Dispersin В, DspB) использовали последовательность из базы данных UniProt с идентификационным номером Q840G9.

Анализ последовательности с помощью программы SignalIP v.5.0 [Almagro Armenteros, J.J., Tsirigos, K.D., , С.K. et al. SignalP 5.0 improves signal peptide predictions using deep neural networks. Nat Biotechnol 37, 420-423 (2019). https://doi.org/10.1038/s41587-019-0036-z] показал, что в ней отсутствуют сигнальные последовательности, подлежащие удалению при дизайне нуклеотидной последовательности (Фиг. 2).

β-N-ацетилгексозаминидаза состоит из 361 аминокислоты, молекулярная масса составляет 40,963 кДа и pI 5,7.

Для облегчения условий очистки β-N-ацетилгексозаминидазы к аминокислотной последовательности был добавлен афинный таг - 6xHis, а за ним последовательность линкера SSGGS и сайт расщепления TEV-протеазой ENLYFQ. Выбор конца, на котором добавляется His-метка, зависит от характеристик белка. Некоторые концы скрыты внутри ядра белка, а другие важны для функциональной активности или структуры белка. В этой связи были сконструированы аминокислотные последовательности с N - и С - концевым His-тагом, представленные на Фиг. 3 (SEQ ID NO:1) и Фиг. 4 (SEQ ID NO:2) соответственно. Молекулярная масса dspB-His равна 43,2 кДа, изоэлектрическая точка - 5,93.

Аминокислотная последовательность была преобразована в нуклеотидную последовательность с учетом кодонового предпочтения Е. coli с помощью программы MaxCPBstCAI [, A., et al., Codon optimization: a mathematical programing approach. Bioinformatics, 2020. 36(13): p.4012-4020].

Дополнительно на 5'- и 3'-концы оптимизированной последовательности были добавлены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции - NcoI и XhoI соответственно. На 3'-конец также добавлены два стоп-кодона для увеличения вероятности терминации трансляции. Полученные последовательности представлены на Фиг. 5 (SEQ ID NO:3) и Фиг. 6 (SEQ ID NO:4).

Пример 1.2. Синтез кодонно оптимизированной последовательности нуклеотидов, кодирующей β-N-ацетилгексозаминидазу

Разработанные оптимизированные последовательности нуклеотидов с N- и С-концевым His-тагом, кодирующие β-N-ацетилгексозаминидазу с сайтами рестрикции, были получены известными из уровня техники способами химико-ферментативного синтеза [Young L, Dong Q. Two-step total gene synthesis method. Nucleic Acids Res. 2004;32(7):e59. Published 2004 Apr 15. doi:10.1093/nar/gnh058].

Пример 2. Получение штамма - продуцента β-N-ацетилгексозаминидазы

Пример 2.1. Синтез плазмидного экспрессионного вектора.

Для получения штамма-продуцента была создана векторная конструкция на основе коммерчески доступного плазмидного вектора рЕТ28а (Novagen, Merck). Его схема представлена на Фиг. 1. Экспрессионные плазмиды серии рЕТ широко используются для получения рекомбинантных белков в Escherichia coli. Штудиер и его коллеги описали первую экспрессионную плазмиду рЕТ более тридцати лет назад [William Studier, F., et al.,Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, in Methods in Enzymology. 1990, Academic Press, p. 60-89 и Rosenberg, A.H., et al., Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene, 1987. 56(1): p. 125-135]. Они интегрировали сильный промотор ϕ10 для РНК-полимеразы Т7 (промотор Т7) и терминатор транскрипции Тϕ (терминатор Т7) в каркас плазмиды pBR322 и установили номенклатуру рЕТ (плазмида для экспрессии с помощью РНК-полимеразы Т7). Впоследствии Novagen и Invitrogen расширили серию до 103 уникальных плазмид экспрессии. Эти плазмиды экспрессии поддерживают высокие уровни транскрипции в штаммах Escherichia coli, которые содержат лизогенизированный фрагмент фага DE3, кодирующий РНК-полимеразу Т7 [Rosano, G.L. and Е.А. Ceccarelli, Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol, 2014. 5: p. 172]. Вектор pET28a (Ошибка! Источник ссылки не найден. Фиг. 1) является одним из самых популярных векторов рЕТ-системы - высокоэффективной системы с отрицательным контролем экспрессии для производства рекомбинантных белков под регуляцией Т7 промотора. Плазмида также содержит ген аминофосфотрансферазы, фосфорилирующей молекулу канамицина, тем самым обеспечивая устойчивость к этому антибиотику, что позволяет проводить селекцию клеток, трансформация которых интересующей конструкцией прошла успешно.

Рестрикцию амплифицированного гена с последовательностью SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 и вектора рЕТ28а проводили в рекомендуемых фирмой-производителем (NEB, США) для выбранных рестриктаз (NcoI -XhoI) буферных растворах в течение 1 часа при 37°С при концентрации рестриктаз равных 5-ти единицам фермента на 1 мкг ДНК. Обработанный рестриктазами целевой ген (SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4) очищали с использованием парамагнитных частиц (Agencourt AMPure ХР, Beckman Coulter Life Sciences). Последовательности целевого гена после этого лигировали в вектор рЕТ28а с использованием лигазы Т4 (NEB, Ipswich, MA). Трансформировали лигированные плазмидные ДНК в электрокомпетентные клетки Escherichia coli DH5alpha (ElectroMAX™ DH5α-E Competent Cells, Thermo Fisher Sci.) методом электропорации с использованием электропоратора GenePulserXcell (Bio-Rad, США). Получение плазмид проводили с использованием набора ZR Plasmid Miniprep - Classic (Zymo Research, США) в соответствии с инструкцией производителя. Выделение плазмидной ДНК из культуры Escherichia coli DH5alpha проводили с использованием набора ZR Plasmid Miniprep-Classic (Zymo Research, США) в соответствии с инструкцией производителя. Плазмидную ДНК выбранных клонов секвенировали по методу Сэнгера ABI и протокола Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing protocol® (Applied Biosystems, Life Technologies). В результате были получены два плазмидных экспрессионных вектора, несущих ген β-N-ацетилгексозаминидазы: pET28a-dsp-NHis (содержит SEQ ID NO:3) и pET28a-dsp-CHis (содержит SEQ ID NO:4)

Пример 2.2. Трансформация клеток Е. coli.

Для экспрессии гена β-N-ацетилгексозаминидазы использовали описанные в предыдущем примере плазмидные экспрессионные векторы pET28a-dsp-NHis и pET28a-dsp-CHis, и электрокомпетентные клетки Е. coli BL21(DE3). Трансформацию проводили с помощью аппарата GenePulserXcell (Bio-Rad, США) согласно инструкции производителя. Положительные трансформанты отбирали на агаризованной среде LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина, что гарантировало содержание плазмиды в отобранных колониях.

В результате были получены штаммы Е. coli BL21bAcNhis и BL21bAcChis, содержащие последовательности SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 соответственно. Штаммы хранятся в коллекции микроорганизмов ООО «Иннова плюс».

Пример 3. Получение β-N-ацетилгексозаминидазы.

Пример 3.1. Индукция экспрессии белка β-N-ацетилгексозаминидазы и проверка его растворимости.

Культивирование Е. coli BL21bAcNhis и BL21bAcChis проводили в питательной среде LB с 0,2% глюкозы и 30 мкг/мл канамицина при 30°С до индукции и при 25°C в течение 16 часов после индукции при 250 об/мин. Начальная плотность засева составляла 0,1 ед. ОП₆₀₀, при достижении оптической плотности 0,5-0,7 ед. ОП₆₀₀ вносили индуктор изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в концентрации 1 мМ. После культивирования культуральную жидкость центрифугировали при 4800 g и 4°С. Осадок замораживали при минус 80°С в течение 40-60 минут. После чего клетки разрушали лизирующим буфером (20 мМ Tris-НС1, рН 8,0) в соотношении 1:10. Полученную суспензию гомогенизировали ультразвуком и получали общий лизат, отбирали пробу для вертикального диск-электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Лизат центрифугировали при 10000 g и 4°С в течение 45 минут. Из супернатанта (растворимая фракция) отбирали пробу для электрофореза. Осадок вновь обрабатывали лизирующим буфером в соотношении 1:10 и центрифугировали при 10000 g и 4°С в течение 45 минут. После центрифугирования осадок смешивали с лизирующим буфером в соотношении 1:10 (нерастворимая фракция) и отбирали пробу для электрофореза. Затем проводили вертикальный диск-электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с использованием прибора Mini-PROTEAN® Tetra (Bio-Rad, США) при следующих условиях: напряжение 200 B в течение 40±5 минут. Результаты анализировали денситометрическим методом в программе TotalLab v2.01 (Фиг. 7). В результате анализа было выявлено, что уровень экспрессии β-N-ацетилгексозаминидазы составляет 50% от общего клеточного белка. В случае экспрессии гена β-N-ацетилгексозаминидазы с С-концевым His тагом в растворимой форме присутствовало 90,6% целевого белка, а при экспрессии гена β-N-ацетилгексозаминидазы с N-концевым His тагом - 63,8% целевого белка.

Пример 4. Свойства β-N-ацетилгексозаминидазы.

Активность полученного фермента была измерена с использованием раствора субстрата, содержащего 5 мМ 4-нитрофенил-N-ацетил-бета-D-галактозаминида, 50 мМ натрий фосфатного буфера с рН 6,0 и 100 мМ хлорида натрия. 10 мкл фермента добавляли к 200 мкл раствора субстрата и инкубировали 10 мин при температуре 40°С в термостатируемом шейкере для микротитровальных планшетов. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл 10 М гидроксида натрия. Результаты оценивали с использованием планшетного спектрофотометра при длине волны 405 нм. 1 единица активности фермента (U) оценивается как количество фермента, катализирующего образование 1 цмоль натрия п-нитрофенолята в течение 1 мин при описанных условиях реакции.

Активность полученного фермента составила 2,78±0,17 U/мг. Для разрушения биопленок, образуемых Staphylococcus aureus, достаточно 0,4 U/мл активности фермента.

Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Последовательность нуклеотидов, кодирующая β-N-ацетилгексозаминидазу Aggregatibacter actinomycetemcomitans, и генетические конструкции, ее содержащие» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.

--->

Перечень последовательностей нуклеотидов и аминокислот

<110> Общество с ограниченной ответственностью «Иннова плюс»

Innova plus LLC

<120> Последовательность нуклеотидов, кодирующая

β-N-ацетилгексозаминидазу Aggregatibacter actinomycetemcomitans,

и генетические конструкции, её содержащие

<130>

<160> 4

<210> 1

<211> 381

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(381)

<223> Аминокислотная последовательность β-N-ацетилгексозаминидазы

с 6×His на N-конце

<400> 1

Met Gly His His His His His His Ser Ser Gly Gly Ser Glu Asn Leu

1 5 10 15

Tyr Phe Gln Gly Asn Cys Cys Val Lys Gly Asn Ser Ile Tyr Pro Gln

20 25 30

Lys Thr Ser Thr Lys Gln Thr Gly Leu Met Leu Asp Ile Ala Arg His

35 40 45

Phe Tyr Ser Pro Glu Val Ile Lys Ser Phe Ile Asp Thr Ile Ser Leu

50 55 60

Ser Gly Gly Asn Phe Leu His Leu His Phe Ser Asp His Glu Asn Tyr

65 70 75 80

Ala Ile Glu Ser His Leu Leu Asn Gln Arg Ala Glu Asn Ala Val Gln

85 90 95

Gly Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Phe Leu

100 105 110

Ser Tyr Arg Gln Leu Asp Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Lys Ala Lys Gly

115 120 125

Ile Glu Leu Ile Pro Glu Leu Asp Ser Pro Asn His Met Thr Ala Ile

130 135 140

Phe Lys Leu Val Gln Lys Asp Arg Gly Val Lys Tyr Leu Gln Gly Leu

145 150 155 160

Lys Ser Arg Gln Val Asp Asp Glu Ile Asp Ile Thr Asn Ala Asp Ser

165 170 175

Ile Thr Phe Met Gln Ser Leu Met Ser Glu Val Ile Asp Ile Phe Gly

180 185 190

Asp Thr Ser Gln His Phe His Ile Gly Gly Asp Glu Phe Gly Tyr Ser

195 200 205

Val Glu Ser Asn His Glu Phe Ile Thr Tyr Ala Asn Lys Leu Ser Tyr

210 215 220

Phe Leu Glu Lys Lys Gly Leu Lys Thr Arg Met Trp Asn Asp Gly Leu

225 230 235 240

Ile Lys Asn Thr Phe Glu Gln Ile Asn Pro Asn Ile Glu Ile Thr Tyr

245 250 255

Trp Ser Tyr Asp Gly Asp Thr Gln Asp Lys Asn Glu Ala Ala Glu Arg

260 265 270

Arg Asp Met Arg Val Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ala Lys Gly Phe Thr

275 280 285

Val Leu Asn Tyr Asn Ser Tyr Tyr Leu Tyr Ile Val Pro Lys Ala Ser

290 295 300

Pro Thr Phe Ser Gln Asp Ala Ala Phe Ala Ala Lys Asp Val Ile Lys

305 310 315 320

Asn Trp Asp Leu Gly Val Trp Asp Gly Arg Asn Thr Lys Asn Arg Val

325 330 335

Gln Asn Thr His Glu Ile Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ile Trp Gly Glu

340 345 350

Asp Ala Lys Ala Leu Lys Asp Glu Thr Ile Gln Lys Asn Thr Lys Ser

355 360 365

Leu Leu Glu Ala Val Ile His Lys Thr Asn Gly Asp Glu***

370 375 380 381

<210> 2

<211> 380

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(380)

<223> Аминокислотная последовательность β-N-ацетилгексозаминидазы

с 6×His на С-конце

<400> 2

Met Gly Asn Cys Cys Val Lys Gly Asn Ser Ile Tyr Pro Gln Lys Thr

1 5 10 15

Ser Thr Lys Gln Thr Gly Leu Met Leu Asp Ile Ala Arg His Phe Tyr

20 25 30

Ser Pro Glu Val Ile Lys Ser Phe Ile Asp Thr Ile Ser Leu Ser Gly

35 40 45

Gly Asn Phe Leu His Leu His Phe Ser Asp His Glu Asn Tyr Ala Ile

50 55 60

Glu Ser His Leu Leu Asn Gln Arg Ala Glu Asn Ala Val Gln Gly Lys

65 70 75 80

Asp Gly Ile Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Phe Leu Ser Tyr

85 90 95

Arg Gln Leu Asp Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Lys Ala Lys Gly Ile Glu

100 105 110

Leu Ile Pro Glu Leu Asp Ser Pro Asn His Met Thr Ala Ile Phe Lys

115 120 125

Leu Val Gln Lys Asp Arg Gly Val Lys Tyr Leu Gln Gly Leu Lys Ser

130 135 140

Arg Gln Val Asp Asp Glu Ile Asp Ile Thr Asn Ala Asp Ser Ile Thr

145 150 155 160

Phe Met Gln Ser Leu Met Ser Glu Val Ile Asp Ile Phe Gly Asp Thr

165 170 175

Ser Gln His Phe His Ile Gly Gly Asp Glu Phe Gly Tyr Ser Val Glu

180 185 190

Ser Asn His Glu Phe Ile Thr Tyr Ala Asn Lys Leu Ser Tyr Phe Leu

195 200 205

Glu Lys Lys Gly Leu Lys Thr Arg Met Trp Asn Asp Gly Leu Ile Lys

210 215 220

Asn Thr Phe Glu Gln Ile Asn Pro Asn Ile Glu Ile Thr Tyr Trp Ser

225 230 235 240

Tyr Asp Gly Asp Thr Gln Asp Lys Asn Glu Ala Ala Glu Arg Arg Asp

245 250 255

Met Arg Val Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ala Lys Gly Phe Thr Val Leu

260 265 270

Asn Tyr Asn Ser Tyr Tyr Leu Tyr Ile Val Pro Lys Ala Ser Pro Thr

275 280 285

Phe Ser Gln Asp Ala Ala Phe Ala Ala Lys Asp Val Ile Lys Asn Trp

290 295 300

Asp Leu Gly Val Trp Asp Gly Arg Asn Thr Lys Asn Arg Val Gln Asn

305 310 315 320

Thr His Glu Ile Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ile Trp Gly Glu Asp Ala

325 330 335

Lys Ala Leu Lys Asp Glu Thr Ile Gln Lys Asn Thr Lys Ser Leu Leu

340 345 350

Glu Ala Val Ile His Lys Thr Asn Gly Asp Glu Asn Leu Tyr Phe Gln

355 360 365

Gly Ser Ser Gly Gly Ser His His His His His His***

370 375 380

<210> 3

<211> 1157

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(1157)

<223> Оптимизированная нуклеотидная последовательность

β-N-ацетилгексозаминидазы с His-tag на N-конце последовательности

<400> 3

CC ATG GGG CAT CAT CAT CAT CAT CAC TCC AGC GGC GGC AGT GAA AAT 47

Met Gly His His His His His His Ser Ser Gly Gly Ser Glu Asn

1 5 10 15

CTC TAT TTC CAG GGC AAC TGC TGC GTG AAA GGC AAC AGC ATT TAT CCG 95

Leu Tyr Phe Gln Gly Asn Cys Cys Val Lys Gly Asn Ser Ile Tyr Pro

20 25 30

CAA AAA ACA TCA ACA AAG CAA ACC GGG CTG ATG CTC GAT ATC GCC AGA 143

Gln Lys Thr Ser Thr Lys Gln Thr Gly Leu Met Leu Asp Ile Ala Arg

35 40 45

CAT TTC TAC AGC CCG GAA GTG ATT AAA AGT TTT ATC GAC ACC ATC AGC 191

His Phe Tyr Ser Pro Glu Val Ile Lys Ser Phe Ile Asp Thr Ile Ser

50 55 60

CTT TCC GGC GGT AAC TTC CTG CAT CTG CAT TTC TCT GAC CAT GAA AAC 239

Leu Ser Gly Gly Asn Phe Leu His Leu His Phe Ser Asp His Glu Asn

65 70 75

TAC GCC ATT GAA AGC CAT TTG CTC AAT CAG CGG GCA GAA AAC GCC GTT 287

Tyr Ala Ile Glu Ser His Leu Leu Asn Gln Arg Ala Glu Asn Ala Val

80 85 90 95

CAG GGA AAA GAC GGT ATT TAT ATC AAT CCT TAC ACC GGT AAA CCG TTC 335

Gln Gly Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Phe

100 105 110

CTC TCT TAT CGC CAG CTT GAT GAT ATC AAA GCC TAT GCC AAA GCG AAA 383

Leu Ser Tyr Arg Gln Leu Asp Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Lys Ala Lys

115 120 125

GGG ATT GAG CTG ATT CCT GAA CTC GAC AGC CCG AAC CAT ATG ACC GCC 431

Gly Ile Glu Leu Ile Pro Glu Leu Asp Ser Pro Asn His Met Thr Ala

130 135 140

ATT TTC AAA CTG GTG CAA AAA GAT CGC GGC GTG AAA TAT TTG CAG GGG 479

Ile Phe Lys Leu Val Gln Lys Asp Arg Gly Val Lys Tyr Leu Gln Gly

145 150 155

CTG AAA TCG CGC CAG GTT GAT GAT GAA ATT GAT ATC ACC AAC GCC GAC 527

Leu Lys Ser Arg Gln Val Asp Asp Glu Ile Asp Ile Thr Asn Ala Asp

160 165 170 175

AGC ATC ACC TTT ATG CAG TCG CTG ATG AGT GAA GTG ATT GAT ATT TTT 575

Ser Ile Thr Phe Met Gln Ser Leu Met Ser Glu Val Ile Asp Ile Phe

180 185 190

GGC GAT ACC AGC CAG CAT TTC CAT ATT GGC GGC GAT GAG TTT GGT TAC 623

Gly Asp Thr Ser Gln His Phe His Ile Gly Gly Asp Glu Phe Gly Tyr

195 200 205

AGC GTT GAA AGT AAT CAT GAG TTT ATC ACT TAC GCC AAT AAA CTC TCT 671

Ser Val Glu Ser Asn His Glu Phe Ile Thr Tyr Ala Asn Lys Leu Ser

210 215 220

TAT TTC CTG GAA AAA AAA GGG CTG AAA ACG CGG ATG TGG AAC GAC GGT 719

Tyr Phe Leu Glu Lys Lys Gly Leu Lys Thr Arg Met Trp Asn Asp Gly

225 230 235

TTG ATT AAA AAT ACC TTT GAG CAA ATC AAC CCG AAT ATT GAA ATC ACT 767

Leu Ile Lys Asn Thr Phe Glu Gln Ile Asn Pro Asn Ile Glu Ile Thr

240 245 250 255

TAC TGG AGT TAT GAC GGC GAT ACC CAG GAT AAA AAT GAA GCG GCA GAG 815

Tyr Trp Ser Tyr Asp Gly Asp Thr Gln Asp Lys Asn Glu Ala Ala Glu

260 265 270

CGT CGC GAT ATG CGC GTT TCG CTG CCG GAA CTG CTG GCG AAA GGT TTT 863

Arg Arg Asp Met Arg Val Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ala Lys Gly Phe

275 280 285

ACC GTG CTG AAC TAC AAC AGC TAT TAT CTC TAT ATC GTT CCG AAA GCC 911

Thr Val Leu Asn Tyr Asn Ser Tyr Tyr Leu Tyr Ile Val Pro Lys Ala

290 295 300

TCG CCA ACC TTC AGC CAG GAT GCG GCA TTT GCC GCA AAA GAT GTT ATC 959

Ser Pro Thr Phe Ser Gln Asp Ala Ala Phe Ala Ala Lys Asp Val Ile

305 310 315

AAA AAC TGG GAT CTC GGC GTC TGG GAT GGC AGA AAT ACC AAA AAC CGG 1007

Lys Asn Trp Asp Leu Gly Val Trp Asp Gly Arg Asn Thr Lys Asn Arg

320 325 330 335

GTA CAA AAT ACC CAT GAA ATC GCC GGG GCG GCG CTT TCC ATC TGG GGA 1055

Val Gln Asn Thr His Glu Ile Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ile Trp Gly

340 345 350

GAA GAT GCG AAA GCG CTG AAA GAT GAA ACC ATT CAG AAA AAT ACC AAA 1103

Glu Asp Ala Lys Ala Leu Lys Asp Glu Thr Ile Gln Lys Asn Thr Lys

355 360 365

TCG CTG CTG GAA GCG GTG ATT CAT AAA ACC AAC GGC GAT GAA TAA TGA 1151

Ser Leu Leu Glu Ala Val Ile His Lys Thr Asn Gly Asp Glu

370 375 380 381

CTC GAG 1157

<210> 4

<211> 1154

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<222> (1)…(1154)

<223> Оптимизированная нуклеотидная последовательность

β-N-ацетилгексозаминидазы с His-tag на C-конце последовательности

<400> 4

CC ATG GGG AAC TGC TGC GTG AAA GGC AAC AGC ATT TAT CCG CAA AAA 47

Met Gly Asn Cys Cys Val Lys Gly Asn Ser Ile Tyr Pro Gln Lys

1 5 10 15

ACA TCA ACA AAG CAA ACC GGG CTG ATG CTC GAT ATC GCC AGA CAT TTC 95

Thr Ser Thr Lys Gln Thr Gly Leu Met Leu Asp Ile Ala Arg His Phe

20 25 30

TAC AGC CCG GAA GTG ATT AAA AGT TTT ATC GAC ACC ATC AGC CTT TCC 143

Tyr Ser Pro Glu Val Ile Lys Ser Phe Ile Asp Thr Ile Ser Leu Ser

35 40 45

GGC GGT AAC TTC CTG CAT CTG CAT TTC TCT GAC CAT GAA AAC TAC GCC 191

Gly Gly Asn Phe Leu His Leu His Phe Ser Asp His Glu Asn Tyr Ala

50 55 60

ATT GAA AGC CAT TTG CTC AAT CAG CGG GCA GAA AAC GCC GTT CAG GGA 239

Ile Glu Ser His Leu Leu Asn Gln Arg Ala Glu Asn Ala Val Gln Gly

65 70 75

AAA GAC GGT ATT TAT ATC AAC CCT TAC ACC GGT AAA CCG TTC CTC TCT 287

Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Phe Leu Ser

80 85 90 95

TAT CGC CAG CTT GAT GAT ATC AAA GCC TAT GCC AAA GCG AAA GGG ATT 335

Tyr Arg Gln Leu Asp Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Lys Ala Lys Gly Ile

100 105 110

GAG CTG ATT CCT GAA CTC GAC AGC CCG AAC CAT ATG ACC GCC ATT TTC 383

Glu Leu Ile Pro Glu Leu Asp Ser Pro Asn His Met Thr Ala Ile Phe

115 120 125

AAA CTG GTG CAA AAA GAT CGC GGC GTG AAA TAT TTG CAG GGG CTG AAA 431

Lys Leu Val Gln Lys Asp Arg Gly Val Lys Tyr Leu Gln Gly Leu Lys

130 135 140

TCG CGC CAG GTT GAT GAT GAA ATT GAT ATC ACC AAC GCC GAC AGC ATC 479

Ser Arg Gln Val Asp Asp Glu Ile Asp Ile Thr Asn Ala Asp Ser Ile

145 150 155

ACC TTT ATG CAG TCG CTG ATG AGT GAA GTG ATT GAT ATT TTT GGC GAT 527

Thr Phe Met Gln Ser Leu Met Ser Glu Val Ile Asp Ile Phe Gly Asp

160 165 170 175

ACC AGC CAG CAT TTC CAT ATT GGC GGC GAT GAG TTT GGT TAC AGC GTT 575

Thr Ser Gln His Phe His Ile Gly Gly Asp Glu Phe Gly Tyr Ser Val

180 185 190

GAA AGT AAT CAT GAG TTT ATC ACT TAC GCC AAT AAA CTC TCT TAT TTC 623

Glu Ser Asn His Glu Phe Ile Thr Tyr Ala Asn Lys Leu Ser Tyr Phe

195 200 205

CTG GAA AAA AAA GGG CTG AAA ACG CGG ATG TGG AAC GAC GGT TTG ATT 671

Leu Glu Lys Lys Gly Leu Lys Thr Arg Met Trp Asn Asp Gly Leu Ile

210 215 220

AAA AAT ACC TTT GAG CAA ATC AAC CCG AAT ATT GAA ATC ACT TAC TGG 719

Lys Asn Thr Phe Glu Gln Ile Asn Pro Asn Ile Glu Ile Thr Tyr Trp

225 230 235

AGT TAT GAC GGC GAT ACC CAG GAT AAA AAT GAA GCG GCA GAG CGT CGC 767

Ser Tyr Asp Gly Asp Thr Gln Asp Lys Asn Glu Ala Ala Glu Arg Arg

240 245 250 255

GAT ATG CGC GTT TCG CTG CCG GAA CTG CTG GCG AAA GGT TTT ACC GTG 815

Asp Met Arg Val Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ala Lys Gly Phe Thr Val

260 265 270

CTG AAC TAC AAC AGC TAT TAT CTC TAT ATC GTT CCG AAA GCC TCG CCA 863

Leu Asn Tyr Asn Ser Tyr Tyr Leu Tyr Ile Val Pro Lys Ala Ser Pro

275 280 285

ACC TTC AGC CAG GAT GCG GCA TTT GCC GCA AAA GAT GTT ATC AAA AAC 911

Thr Phe Ser Gln Asp Ala Ala Phe Ala Ala Lys Asp Val Ile Lys Asn

290 295 300

TGG GAT CTC GGC GTC TGG GAT GGC AGA AAT ACC AAA AAC CGG GTA CAA 959

Trp Asp Leu Gly Val Trp Asp Gly Arg Asn Thr Lys Asn Arg Val Gln

305 310 315

AAT ACC CAT GAA ATC GCC GGG GCG GCG CTT TCC ATC TGG GGA GAA GAT 1007

Asn Thr His Glu Ile Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ile Trp Gly Glu Asp

320 325 330 335

GCG AAA GCG CTG AAA GAT GAA ACC ATT CAG AAA AAT ACC AAA TCG CTG 1055

Ala Lys Ala Leu Lys Asp Glu Thr Ile Gln Lys Asn Thr Lys Ser Leu

340 345 350

CTG GAA GCG GTG ATT CAT AAA ACC AAC GGC GAT GAA AAT CTC TAT TTC 1103

Leu Glu Ala Val Ile His Lys Thr Asn Gly Asp Glu Asn Leu Tyr Phe

355 360 365

CAG GGT TCT TCC GGC GGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAT TAA TGA CTC 1151

Gln Gly Ser Ser Gly Gly Ser His His His His His His

370 375 380

GAG 1154

<---

1.	Нуклеиновая кислота, выбранная из SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, кодирующая β-N-ацетилгексозаминидазу Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
2.	Плазмидный экспрессионный вектор pET28a-dsp-NHis, полученный на основе плазмидного вектора рЕТ28а и содержащий нуклеиновую кислоту по п. 1 SEQ ID NO: 3.
3.	Плазмидный экспрессионный вектор pET28a-dsp-CHis, полученный на основе плазмидного вектора рЕТ28а и содержащий последовательность по п. 1 SEQ ID NO: 4.
4.	Штамм Escherichia coli BL21bAcNhis – продуцент β-N-ацетилгексозаминидазы Aggregatibacter actinomycetemcomitans, полученный на основе штамма Escherichia coli BL21(DE3) и содержащий вектор по п. 2.
5.	Штамм Escherichia coli BL21bAcChis – продуцент β-N-ацетилгексозаминидазы Aggregatibacter actinomycetemcomitans, полученный на основе штамма Escherichia coli BL21(DE3) и содержащий вектор по п. 3.