Питательная среда для микроклонального размножения гречихи посевной

Авторы патента:

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2789883:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки" (ФГБНУ "ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки") (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагаемая питательная среда для микроклонального размножения гречихи посевной содержит аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый семиводный, кальций хлористый двухводный, борную кислоту, марганец сернокислый четырехводный, кобальт хлористый шестиводный, медь сернокислую пятиводную, цинк сернокислый семиводный, натрий молибденовокислый двухводный, калий йодистый, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, сахарозу, агар и воду. Отличительной особенностью питательной среды является то, что в ее состав дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт рейнутрии японской в количестве 1-5 мл/л среды. Предлагаемое изобретение позволит значительно стимулировать рост и развитие регенерантов F. esculentum, повысить коэффициент размножения и выход черенков, уменьшить сроки получения нормально развитых регенерантов, а также способствовать усилению корнеобразования, что увеличит степень приживаемости микроклонов в новых питательных субстрактах. 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для ускоренного размножения гречихи посевной in vitro.

Известна питательная среда для регенерации растений яблони из семядолей (патент RU №2134506, МПК А01Н 4/00, 1999 г.) где в питательную среду Мурасиге-Скуга добавляют стимулятор роста - настойку стеркулии 30-75 мл/л.

Недостатком изобретения является незначительный ареал произрастания растения, дороговизна препарата, частое его отсутствие в аптечной сети и высокий расход настойки.

Известна питательная среда для индукции каллуса и микроклонального размножения персика из незрелых зародышей (патент RU 2128429, МПК А01Н 4/00, 1999 г.), составленная по прописи среды Мурасиге-Скуга, содержащая в качестве стимулятора роста сок каланхоэ.

Недостаток изобретения заключается в незначительном ареале произрастания растения, высокие нормы расхода препарата.

Известна питательная среда для микроклонального размножения подвоев яблони (патент RU 2111652, МПК А01Н 4/00, 1998 г.), составленная по прописи среды Мурасиге-Скуга, содержащая в качестве стимулятора роста экстракт родиолы.

Недостатком данного изобретения является краснокнижный статус родиолы, что затрудняет использование данного растения в качестве сырья для экстракта.

Известна питательная среда для микроклонального размножения косточковых культур (патент RU 2045891, МПК А01Н 3/00, 1995 г.), где в среду Мурасиге-Скуга добавляют стимулятор роста - экстракт алоэ.

Недостаток изобретения - дороговизна препарата алоэ и высокая норма расхода препарата.

Известна питательная среда для микроклонального размножения груши (патент RU 2141524, МПК А01Н 4/00,), составленная по прописи среды Мурасиге-Скуга, содержащая в качестве стимулятора роста настойку лимонника.

Недостатком изобретения является ограниченный ареал распространения растения и высокая норма расхода препарата.

Известна питательная среда для регенерации растений абрикоса из незрелых зародышей (патент RU 2198505, МПК А01Н 3/00, 2003 г.), составленная по прописи среды Мурасиге-Скуга, содержащая в качестве стимулятора роста экстракт элеутерококка.

Аналогично Д.Г. Шорников предложил использовать спиртовой экстракт корня элеутерококка для стимуляции побегообразования эксплантов элеутерококка колючего (Шорников Д.Г. Совершенствование технологии размножения редких садовых растений в культуре in vitro и оценка их потенциала устойчивости к абиотическим стрессорам: диссертация канд. с.-х. наук. Мичуринск. 2008. 192 с.).

Недостатком предлагаемой питательный среды является ограниченный ареал распространения растения и дороговизна препарата.

В исследованиях М.Т. Упадышева выявлено, что фенольные соединения повышали эффективность размножения растений на этапах пролиферации, укоренения и адаптации (патент RU 2111653, МПК А01Н 4/00, 1998 г; А.с., RU, №1706481, МПК А01Н 4/00, 1992 г.)

Для биотехнологического размножения гречихи известны различные варианты питательных сред, в том числе с использованием стимуляторов (регуляторов) роста (Барсукова Е.Н. Использование метода культуры ткани в селекции гречихи. Дисс… канд. с.-х. наук, Благовещенск, 2000; Takahata Y. Plant regeneration from cultured immature inflorescence of Common Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) and Perennial Buckwheat (F. cymosum Meisn.), Japan J. Breed. (1988), 38(4), 409-413; Klcova L., Gubišova M. Evaluation of different approaches to buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) micropropagation, Czech J. Genet. Plant Breed. (2008), 44 (2), 66-72; Dobránszki J. Role of cytokinins and explant type in shoot multiplication of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) in vitro, Eur. J. Plant Sci. Biotechnol. (2009), 3 (1), 66-70; Slavinska J., Kantartsi K., Obendorf R. In vitro organogenesis of Fagopyrum esculentum Moench (Polygonaceae) as a method to study seed set in buckwheat, Eur. J. Plant Sci. Biotechnol. (2009), 3, 75-78 c.)

Недостатками этих сред являются невысокие темпы роста и развития эксплантов и коэффициента размножения, дороговизна применяемых стимуляторов роста.

Наиболее близкой по технической сущности к изобретению является питательная среда с минеральной основой по Мурасиге-Скуга (далее - МС) (Murashige, Т., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tussue cultures. Physiol. Plant. (1962), 15, 473-497. DOI 10.1098/rstb.2000.0713.), дополненная рекомендуемым соотношением компонентов согласно исследованиям Н.И. Румянцевой и др. (Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.Э. и др. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи. Физиология растений (1989), 36(1), 187-194; Румянцева Н.И. Морфогенез в культуре тканей гречихи: теоретические и прикладные аспекты. Дис.… канд. биол. наук. Казань, 1990. 217 с.) и использованная в работе Е.Н. Барсуковой (Барсукова Е.Н. Использование метода культуры ткани в селекции гречихи. Дисс.…канд. с.-х. наук, Благовещенск, 2000. 160 с.). В состав среды прототипа входят компоненты, представленные в табл. 1. Данная среда имеет недостатки. В процессе микроклонального размножения на МС не всегда наблюдаются высокие темпы роста и развития растений, может замедляться или отсутствовать ризогенез, что снижает коэффициент размножения и возможность полноценной приживаемости микроклонов, а также увеличивает длительность технологического процесса. Введение в среду регуляторов роста - фитогормонов (ауксины, кинетины) как природного, так и

синтетического происхождения, увеличивает эффективность регенерации, но при этом повышается стоимость питательной среды, что приводит к возрастанию себестоимости получаемых растений-регенерантов. Кроме этого, для приготовления среды используют гидролизат казеина, что также ведет к существенным дополнительным затратам.

Цель изобретения - сокращение сроков получения нормально развитых растений-регенерантов и уменьшение стоимости питательной среды.

Указанная цель достигается тем, что в питательную среду для микроклонального размножения гречихи посевной, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый семиводный, кальций хлористый двухводный, борную кислоту, марганец сернокислый четырехводный, кобальт хлористый шестиводный, медь сернокислую пятиводную, цинк сернокислый семиводный, натрий молибденовокислый двухводный, калий йодистый, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, сахарозу, агар и воду, согласно изобретения в ее состав дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт рейнутрии японской в количестве 1-5 мл/л среды.

По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемой питательной среды для микроклонального размножения гречихи посевной является:

1. «…в ее состав дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт рейнутрии японской…», что позволяет:

- достичь положительного эффекта, заключающегося в увеличении морфологических показателей культивируемых in vitro растений и увеличить коэффициент размножения;

- уменьшить срок получения нормально развитых растений-регенерантов, усилить ризогенез и как следствие, способность микроклонов лучше приживаться и быстрее адаптироваться к новым питательным субстрактам;

- в питательную среду не добавлять гидролизат казеина, а использовать дешевое и доступное сырье растения рейнутрии японской, дающего большую вегетативную массу, что в совокупности снизит стоимость питательной среды и себестоимость получаемых микроклонов.

2. «…в количестве 1-5 мл/л среды», что позволяет:

- экономно использовать экстракт рейнутрии японской и избежать перерасхода действующего биологически активного вещества.

Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели, доказывают, что заявляемая питательная среда для микроклонального размножения гречихи посевной обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решений, дает основание сделать вывод, что заявляемая питательная среда имеет изобретательский уровень.

Техническим результатом изобретения является использование в качестве стимулятора роста и развития микроклонов деалкоголизированного экстракта рейнутрии японской в количестве 1-5 мл/л среды, полученного из дешевого, доступного сырья при одновременном снижении расхода препарата.

Предлагаемая питательная среда для микроклонального размножения гречихи посевной иллюстрируется приведенным ниже примером ее осуществления. Жидкий концентрированный экстракт рейнутрии японской (Reynoutria japonica Houtt.) получают следующим образом. Листья растений высушивают воздушно-теневым методом до уровня влажности 12%, измельчают на мельнице марки ЛЗМ для размола сухих проб до фракции 1 мм, экстрагируют С₂Н₂ОН 70% (EtOH 70%) с использованием емкости с кипящей водой при температуре 95°С, проводят вакуум-фильтрацию и переносят полученные извлечения в мерные колбы (100 мл). В результате получают экстракт темно-зеленого цвета с коричневым оттенком и травяным ароматом. Готовый препарат хранят в герметически закрывающейся емкости из темного стекла в холодильнике. Перед внесением в питательную среду необходимое количество экстракта диалкоголизируют выпариванием на водяной бане при температуре +90°С до исчезновения запаха спирта и доводят дистиллированной водой до начального объема.

Пример. В качестве объектов исследований использовали регенераты гречихи посевной двух сортов - Изумруд (индетерминантного типа) селекции ФНЦ агробиотехнологии Дальнего Востока им. А.К. Чайки и Дикуль (детерминантного типа) селекции ВНИИ зерновых культур, введенных в культуру in vitro. Асептические одноузловые черенки длиной 15-20 мм с пазушной почкой пассировали на питательную среду с минеральной основой по Мурасиге-Скуга, (без гидролизата казеина) содержащую 20 г/л сахарозы, 6 г/л агара и деалкоголизированный экстракт рейнутрии японской из расчета 1 мл/л, 5 мл/л, 10 мл/л по вариантам опыта (табл. 2). Контрольный вариант - прототип - питательная среда без добавления гидролизата казеина и экстракта рейнутрии. Повторность опыта - трехкратная. Изолированные in vitro объекты культивировали в пробирках с ватно-марлевыми пробками при освещении 4 тыс.лк, температуре 22-25°С, фотопериоде 16 ч в условиях культуральной комнаты. Продолжительность пассажа составила 21 сутки. Приготовление и стерилизация бокса, посуды, инструментов проводилась по общепринятой методике.

Результаты работы приведены в таблице 3. Количество междоузлий на стебле у гречихи посевной является важным показателем, определяющим

эффективность микроклонального размножения путем микрочеренкования. По сравнению с прототипом (контролем) у исследуемых сортов в вариантах с использованием экстракта рейнутрии японской значительно увеличивается (в 2,3-7,5 раза) высота растения (за исключением варианта 1 мл/л содержания компонента в среде для сорта Изумруд) и соответственно, количество междоузлий и коэффициента размножения растений, который выше в 1,7-2,7 раза, а также количество листьев и длина листовой пластинки регенерантов.

Важнейший показатель, характеризующий адаптивные возможности растений - ризогенез. На среде с экстрактом количество и длина корней значительно выше, чем на контроле и составила в среднем 2,33-4,33 шт. и 30,23-110,33 мм соответственно. Большой эффект экстракта отмечен при культивировании сорта Дикуль, особенно в отношении корнеобразования. При этом для обоих сортов максимальный эффект отмечен для питательной среды, содержащей 1-5 мл/л экстракта. Концентрации экстракта в питательной среде до 1 мл/л не приводит к существенному возрастанию эффекта. Отсутствие в среде гидролизата казеина, а также использование дешевого и доступного сырья для приготовления экстракта является фактором, снижающим себестоимость питательной среды.

Таким образом питательная среда для микроклонального размножения гречихи посевной с добавлением деалкоголизированного водного раствора EtOH 70% экстракта рейнутрии японской в диапозоне концентрации 1-5 мл на литр среды значительно стимулирует рост и развитие регенерантов F. esculentum, повышает коэффициент размножения и выход черенков для микроклонального размножения, уменьшая сроки получения нормально развитых регенерантов, а также способствует усилению корнеобразования, что увеличивает степень приживаемости микроклонов в новых питательных субстратах.

Питательная среда для микроклонального размножения гречихи посевной, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый семиводный, кальций хлористый двухводный, борную кислоту, марганец сернокислый четырехводный, кобальт хлористый шестиводный, медь сернокислую пятиводную, цинк сернокислый семиводный, натрий молибденовокислый двухводный, калий йодистый, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, сахарозу, агар и воду, отличающаяся тем, что в ее состав дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт рейнутрии японской в количестве 1-5 мл/л среды.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии ускоренного размножения пробирочных растений картофеля в условиях in vitro. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения картофеля, включающий размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей макросоли, микросоли, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, глюкозу, агар.

Способ микроклонального размножения картофеля в культуре in vitro // 2788851

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению стандартных микрорастений картофеля. Представляет собой культивирование микрочеренков картофеля на питательной среде с подобранным составом: макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге и Скуг уменьшают в два раза, вводят агар-агар 6500 мг/л, кинетин 0,02 мг/л, ИУК 0,5 мг/л, сахарозу 15000 мг/л, пиридоксин 1 мг/л, тиамин 0,2 мг/л, аскорбиновую кислоту 0,2 мг/л, гидролизат казеина 40 мг/л.

Способ получения холодоустойчивого посадочного материала батата // 2787700

Изобретение представляет собой способ получения холодоустойчивого посадочного материала батата, относится к области сельского хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для получения холодоустойчивого посадочного материала. В изобретении полученную из сегментов стебля и листовых пластинок микроклонов батата каллусную ткань культивируют in vitro в условиях действия пониженных положительных температур (+4-6°С) на питательной среде по прописи Мурасига и Скуга, содержащей препарат Мивал в концентрации 150 мг/л, и из живых, устойчивых к гипотермическому стрессу каллусных клеток получают растения - регенеранты.

Устройство для забора каллусной ткани // 2786914

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к растениеводству, и может быть использовано для стерильного забора каллусной ткани древесных и кустарниковых растений. Устройство для забора каллусной ткани выполнено в виде разборного инструмента, включающего полую трубку с рукоятью и мандрен с рукоятью.

Способ получения субстанции из каллусных культур зверобоя продырявленного (hypericum perforatum l.) // 2786911

Способ получения субстанции из каллусных культур зверобоя продырявленного (Hypéricum perforátum L.) относится к области биотехнологии. Способ осуществляют путем ступенчатой стерилизации семян зверобоя продырявленного, для чего первоначально обрабатывают растительные экспланты в мыльном растворе, затем отмывают дистиллированной водой, далее в ламинарном боксе помещают в 70% спирт на 1 минуту, а затем в основной стерилизующий раствор, которым выступает белизна 50% или 100% при воздействии в течение 10-20 минут, или перекись водорода 36% при воздействии в течение 15 минут, или сулема 0,1% при воздействии в течение не более 15 минут.

Способ сохранения растений in vitro // 2785761

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ сохранения растительного материала in vitro, где используют модификации разработанных ранее протоколов, заключающийся в асептическом культивировании растений при оптимальных условиях, в изолировании эксплантов для хранения и их переносе на специальные питательные среды в сосуды для хранения, в сохранении сосудов с образцами растительного материала в условиях ингибирования роста и состоящий из последовательно выполняемых этапов: культивирование in vitro растительного материала в оптимальных для роста условиях, сохранение образцов растительного материала на модифицированных питательных средах, дополненных 3-9 мМ глюконата кальция - С12H22СаО14 или нитрата кальция, 6-10% сахарозой, 4-6 г/л маннита, 0,2-0,5 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,01-0,05 мг/л индолилмасляной кислоты, 0,2-1 мг/л паклобутразола [1-(4-хлорофенил)-4,4-диметил-2(1,2,4-триазол-1-ил)пентан-3-ол] и 10-12 г/л агар-агара при +1-20°С на свету (4-16 часовой день при освещенности 0,5-1,0 клк) или в темноте в присутствии или в отсутствие тиосульфата серебра в капсулах альгината кальция.

Способ адаптации in vitro земляники в двухслойном субстрате // 2785462

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ адаптации in vitro земляники в двухслойном субстрате, включающий посадку растений в субстрат, состоящий из смеси торфа и почвы, увлажненный раствором Мурасиге и Скуга, где растения высаживают в двухслойный субстрат, состоящий из верхнего слоя в виде обеззараженной муки природного цеолита фракциями 0,014-0,01 мм, нижний слой состоит из субстрата, выполненного в виде необеззараженной смеси торфа и почвы в соотношении 1:1, при этом обеззараженную муку природного цеолита получают путем прокаливания в сушильном шкафу при 1000°С в течение 8-10 минут, высота слоев торфа составляет 3 см, почвы 3 см, обеззараженной муки природного цеолита 5 см.

Способ получения подвойного материала л-2 в условиях in vitro // 2783895

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения оптимизированной питательной среды для подвойного материала (Л-2) в условиях in vitro, при котором сначала происходит черенкование пробирочных растений и высадка одноузловых черенков на агаризованную питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы и витамины на основе прописи питательной среды Мурасиге и Скуга.

Способ адаптации микроклонов ежевики // 2783512

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ адаптации микроклонов ежевики, включающий этап адаптации, где в качестве субстрата используют торфоперлитную смесь, перед высадкой в боксы корни растений освобождают от остатков питательной среды MS, промывают в дистиллированной воде, затем промывают в растворе перманганата калия, высаживают во влажный субстрат, доводят влажность субстрата до 85% дистиллированной водой и закрывают прозрачной крышкой, при этом поддерживают температуру воздуха 22-23°С днем и 18-20°С ночью, освещение 2000-2500 люкс при продолжительности светового дня 12 часов, на третьи сутки проводят вентиляцию для снижения влажности, затем постепенно каждый день увеличивают поступление более сухого воздуха из окружающей среды в адаптационный бокс и на 7-10 сутки полностью открывают адаптационный бокс.

Способ микроклонального размножения гречихи in vitro // 2783357

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагаемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro включает культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы и 6 г/л агар-агара.

Способ получения новых генотипов гречихи in vitro // 2789885

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагаемый способ получения новых генотипов гречихи in vitro включает культивирование микрочеренков с пазушной почкой на среде Мурасига и Скуга, содержащей аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый семиводный, кальций хлористый двухводный, железо сернокислое семиводное, борную кислоту, марганец сернокислый четырехводный, кобальт хлористый шестиводный, медь сернокислую пятиводную, натрий молибденовокислый двухводный, калий йодистый, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, гидролизат казеина, сахарозу, агар и воду, получение пробирочных растений, их черенкование и субкультивирование на среде Мурасига и Скуга. Отличительной особенностью способа является то, что черенки культивируют на среде Мурасига и Скуга с добавлением цинка сернокислого семиводного в количестве 1010-1313 мг/л среды в течение 30-33 дней, проводят анализ генетической изменчивости полученных линий растений-регенерантов методом ПЦР и биометрический анализ высаженных в лизиметры растений-регенерантов, отбирают линии с наибольшим уровнем генетических различий и с улучшенными показателями хозяйственно-полезных признаков. Предлагаемое изобретение позволит расширить генетическое разнообразие исходного материала для селекции гречихи за счет применения высоких концентраций ионов цинка, ускорить процесс отбора новых генотипов в культуре in vitro. 1 ил., 4 табл.