Нанокапсулы, покрытые хитозаном, и их применение

Изобретение может быть использовано в медицине, в фармацевтической, косметической, пищевой промышленности. Предложена нанокапсула, имеющая размер 30-100 нм, в которой наночастица, имеющая размер 5-50 нм и содержащая лекарственное средство и плюроник, покрыта хитозаном, имеющим молекулярную массу 3-20 кДа. Нанокапсула представляет собой препарат для наружного применения на коже и получена способом, включающим первую стадию получения реакционного раствора путем растворения лекарственного средства и плюроника со значением гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) от 8 до 29 в органическом растворителе и осуществления их реагирования при комнатной температуре. На второй стадии получают наночастицу, имеющую размер 5-50 нм, путем добавления каплями реакционного раствора из первой стадии в дистиллированную воду в соответствии с наноосаждением при непрерывном их перемешивании, и удаления органического растворителя из реакционного раствора путем естественного выпаривания. На третьей стадии покрывают наночастицу хитозаном путем добавления к ней хитозана с молекулярной массой 3-20 кДа в дистиллированной воде и перемешивания. Предложены также система доставки лекарственного средства, косметическая композиция и композиция для медицинского устройства, содержащие полученную нанокапсулу. Изобретения позволяют получить нанокапсулы, характеризующиеся высокой стабильностью, повысить проницаемость плохо растворимых лекарственных средств через кожу, обеспечивая их эффективность. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 21 ил., 2 табл., 8 пр.

 

Область техники изобретения

Настоящее раскрытие относится к нанокапсуле, покрытой хитозаном, к ее применению и, более конкретно, к нанокапсуле, в которой наночастица, содержащая плюроник, покрыта хитозаном, а также к ее применению.

Уровень техники изобретения

Наночастицы обычно определяются как частицы вещества диаметром от 1 до 1000 нм, которые больше атома и меньше клетки, и были созданы как вещества, которые могут обеспечивать новые области применения за счет увеличения площади поверхности или эффекта проницаемости при уменьшении их размера. В частности, они находят все более широкое применение в областях электронных компонентов, использующих электромагнитные свойства, в медицинской и косметической отраслях, использующих свойства абсорбции лекарственных средств, в области фотокатализаторов, производстве аккумуляторов и т.д.

Наночастица, как правило, может быть получена из инертного материала, такого как золото, оксид олова, полимерного материала, например, альбумина, и т.д. При внесении в биологическую систему такие частицы проявляют различные физические, химические и биологические свойства, такие как проницаемость через мембраны, оптическая активация, контроль агрегации на молекулярном уровне и т.д., по сравнению с частицами большего диаметра.

Нанокапсула представляет собой шарообразную оболочку нанометрового размера, имеющую пустое внутреннее пространство, в котором могут содержаться различные вещества. Липосома, которая является видом типичной нанокапсулы, представляет собой сферическую везикулу, имеющую по меньшей мере один бислой, состоящий из амфипатических фосфолипидов и других компонентов. Поскольку липосомы способны содержать водорастворимые лекарственные средства во внутреннем пустом пространстве, их используют для доставки лекарственных средств. Однако области применения таких липосом ограничены, поскольку они структурно нестабильны и имеют плохую проницаемость. Таким образом, было проведено множество испытаний для улучшения стабильности и проницаемости полых капсул, что привело к успеху в создании нанокапсул, образованных из полимеров.

В области медицины было проведено много исследований по применению наноносителей, содержащих различные лекарственные средства, для доставки лекарственных средств через клеточные мембраны для проявления лечебного действия лекарственных средств. Следует отметить типичные носители лекарственных средств. Во-первых, липосома представляет собой носитель, состоящий из фосфолипидов, и может содержать как липофильные, так и гидрофильные лекарственные средства. Липосомы образованы из биосовместимых материалов и не обладают токсичностью, а их поверхности можно соответствующим образом модифицировать в зависимости от целей. Однако липосомы могут быть захвачены ретикулоэндотелиальной системой в гепатоцитах или спленоцитах, подвергнуться быстрому клиренсу из крови и разрушению, так что цели достигает небольшое число липосом. Чтобы преодолеть этот недостаток, липосомы подвергают модификации поверхности полиэтиленгликолем (ПЭГ) для увеличения времени удерживания в крови in vivo или обработке различными антителами или лигандами для усиления нацеливания. Мицелла служит носителем и образована сополимерами, имеющими гидрофильные и гидрофобные цепи. Мицелла в воде образует сферический агрегат с гидрофобными областями, секвестрированными в центре мицеллы. Исследования по повышению растворимости и биодоступности нерастворимых лекарственных средств за счет включения нерастворимых лекарственных средств в ядро мицелл продолжаются (KWON, Ik Chan, 2010).

Помимо разработки новых материалов функциональных косметических средств для отбеливания кожи, уменьшения морщин, антиоксидантной защиты и борьбы со старением, важной задачей в косметической промышленности является разработка технологии увеличения скорости чрескожной абсорбции при нанесении на кожу. Кожа функционирует как барьер для активных ингредиентов, так что активные ингредиенты, даже обладая превосходной эффективностью, не могут проявлять свои эффекты при нанесении на кожу. Таким образом, одна из самых больших проблем в индустрии косметических средств заключается в обеспечении абсорбции активных ингредиентов и максимизации их эффективности без раздражения кожи. С этой целью было предложено множество способов, способствующих абсорбции активных ингредиентов. В настоящее время продолжается активный поиск, охватывающий эффекты, от местных до системных, и демонстрирующий, что составы «масло в воде» (М/В) с размером 500 нм или меньше с большей вероятностью проникают в кожу (KIM, Eun Ju et al., 2010).

Подход к разработке составов преимущественно изучали в сравнении с другими способами повышения скорости чрескожной абсорбции. Подход к разработке составов в основном можно разделить на пять форм. Первый подход заключается в чувствительном к рН полимерном гидрогеле. То есть для косметического продукта, полученного в форме полимерного гидрогеля с чувствительностью к рН, может быть полезна система, которая сохраняет нестабильный к внешней среде активный ингредиент стабильным и позволяет активному ингредиенту быстро высвобождаться и абсорбироваться в кожу при нанесении на кожу. Второй подход представляет собой полимерную мицеллу, которая имеет гидрофильные полимеры и гидрофобные полимеры, конъюгированные друг с другом в форме блок-сополимеров, и, таким образом, эффективна для диспергирования гидрофобного активного ингредиента в водной жидкой фазе. В-третьих, наноэмульсия, являющаяся видом эмульсии, характеризуется размером частиц от 100 до 500 нм и не подвергается агрегации или слиянию между частицами в отличие от обычных эмульсий с сохранением таким образом долгосрочной стабильности даже в условиях низкой вязкости. В-четвертых, предлагается липосома, состоящая из липидного бислоя, структурно подобного клеточным мембранам или межклеточным липидам рогового слоя, и, таким образом, сливающаяся с клеточными мембранами для эффективной доставки активного ингредиента в клетки. Наконец, предлагаются этосомы и эластичные липосомы. Разработанные для усиления проницаемости через кожу этосомы и эластичные липосомы, в отличие от липосом, имеют мембраны, которые более гибкие и легче деформируются (Chung, J.Y., et al., 2014).

В пищевой промышленности в основном используются наночастицы или капсулы. Они защищают питательные ингредиенты от внешних факторов, таких как свет, кислород, влажность, температура и т.д., чтобы уменьшить потерю питательных ингредиентов, и обладают преимуществами, включающими в себя повышение ценности, физиологической активности, стабильности и целевого контроля, таким образом находя различные применения даже в высокоценных продуктах в будущем. Являясь небольшими по размеру и с большой площадью поверхности, по сравнению с традиционными веществами пищевых продуктов, вещества пищевых продуктов, к которым применялась нанотехнология, демонстрируют улучшенную проницаемость и время удерживания частиц и капсул, и, таким образом, предполагается, что их абсорбция и биодоступность in vivo увеличатся. Помимо улучшенной растворимости и диспергируемости вещества обладают способностью проходить через труднопроходимый липидный бислой клеток и, таким образом, могут применяться для эффективного применения функциональных материалов (KIM, Sae Hoon et al., 2014).

Приводящий к настоящему раскрытию, интенсивный и тщательный поиск, проведенный авторами настоящего изобретения при разработке системы для доставки физиологически эффективных веществ, обеспечил создание способа изготовления нанокапсул, которые обладают превосходной стабильностью и характеризуются размером частиц 500 нм или меньше и, в частности, 200 нм или меньше, и выявление того, что при изготовлении данным способом нанокапсулы, содержащие загруженные в них нерастворимые лекарственные средства, проявляют высокую проницаемость через кожу и гарантируют чрескожную доставку лекарственного средства и эффективность лекарственного средства в организме. Также обнаружили, что при введении изготовленных нанокапсул перорально биодоступность активных ингредиентов повышалась.

В качестве предшествующего уровня техники, в патенте Кореи №1698809 раскрывается многослойная наночастица, содержащая нерастворимое лекарственное средство, плюроник и хитозан с дополнительным включением соединения на основе гликоля в первое ядро, содержащее лекарственное средство, и соединение полиоксиэфира или соединение полиоксикасторового масла в содержащем полоксамер втором слое, которая по конфигурации отличается от наночастицы, состоящей только из нерастворимого лекарственного средства и плюроника в соответствии с настоящим раскрытием. Кроме того, в патенте Кореи №1748127 раскрывается покрытая хитозаном наночастица, содержащая лекарственное средство и плюроник (полоксамер), которую получают путем добавления плюроника и сополимера молочной и гликолевой кислот СМГК к лекарственному средству с получением наночастицы и покрытия наночастицы хитозаном. Наночастица по конфигурации отличается от нанокапсулы, полученной путем покрытия состоящей только из лекарственного средства и плюроника наночастицы хитозаном. Нигде в указанном документе не описан превосходный эффект проникновения через кожу нанокапсулы в соответствии с настоящим раскрытием.

В непатентном документе Escobar-Chavesz, J.J., et al., (2006) раскрываются фармацевтические составы, наночастицы, чувствительность к температуре и кожная доставка в отношении геля плюроника с указанием на проницаемость через кожу хитозана. Однако нигде в указанном документе не раскрываются нанокапсула, в которой содержащая лекарственное средство и плюроник наночастица покрыта хитозаном, и ее эффекты повышенной проницаемости через кожу.

Раскрытие изобретения

Техническая задача

Один аспект настоящего раскрытия заключается в обеспечении покрытой хитозаном нанокапсулы и способа ее изготовления.

Другой аспект настоящего раскрытия заключается в обеспечении композиции, содержащей нанокапсулу, для применения в различных целях.

Решение задачи

Настоящее раскрытие относится к нанокапсуле, в которой наночастица, содержащая активный агент и плюроник, покрыта хитозаном.

Нанокапсула может быть изготовлена с помощью первой стадии получения реакционного раствора путем растворения активного агента и плюроника в органическом растворителе и осуществления его реагирования при комнатной температуре; второй стадии получения наночастицы путем добавления каплями реакционного раствора из первой стадии в дистиллированную воду, непрерывного перемешивания его и удаления органического растворителя из реакционного раствора путем естественного выпаривания; и третьей стадии покрытия наночастицы из второй стадия путем добавления к ней хитозана.

Активный агент может быть использован в количестве от 0 (исключительно) до 20 массовых долей (включительно) в расчете на 100 массовых долей плюроника.

Активный агент может представлять собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из: противоракового средства, иммунодепресанта, антиоксиданта, противовоспалительного средства, средства против морщин, препарата против выпадения волос, ранозаживляющего средства, средства для отбеливания кожи, пищевой добавки, иммуногена, белка в качестве терапевтического средства, средства для реваскуляризации, противогрибкового средства, антибиотика, противовирусного средства, седативного средства, анальгетика, антивозрастного средства, средства против морщин, средства для отбеливания кожи, средства для депигментации кожи, блокирующего ультрафиолетовое излучение средства, красителя, окрашивающего средства, дезодорирующего средства и освежителя воздуха.

Активный агент может представлять собой жирорастворимое или нерастворимое лекарственное средство. Жирорастворимое или нерастворимое лекарственное средство может представлять собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из: жирорастворимых или нерастворимых противораковых средств, включающих в себя паклитаксел, доцетаксел и тетрадрин, жирорастворимых или нерастворимых иммунодепрессантов, включающих в себя циклоспорин А и дексаметазон, жирорастворимых или нерастворимых антиоксидантов, включающих в себя токоферила ацетат, астаксантин, куркумин и аскорбилпальмитат, жирорастворимых или нерастворимых противовоспалительных средств, включающих в себя декспантенол и сложный фенетиловый эфир кофеиновой кислоты (САРЕ (от англ. - caffeic acid phenethyl ester)), жирорастворимых или нерастворимых средств против морщин, включающих в себя ретинилпальмитат, жирорастворимых или нерастворимых препаратов против выпадения волос, включающих в себя миноксидил и финастерид, жирорастворимых или нерастворимых ранозаживляющих средств, включающих в себя экстракт Centella asiatica и бета-ситостерол, жирорастворимых или нерастворимых средств для отбеливания кожи, включающих в себя аскорбилтетраизопальмитат, и жирорастворимых или нерастворимых пищевых добавок, включающих в себя тетрапептидный коллаген.

Активный агент может быть растворимым в воде лекарственным средством, которое может представлять собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из: растворимых в воде противораковых средств, включающих в себя доксорубицин; растворимых в воде противовоспалительных средств, включающих в себя фосфолипазу А2 (PLA2); растворимых в воде иммуногенов, включающих в себя овальбумин; растворимых в воде белков в качестве терапевтических средств, включающих в себя бычий сывороточный альбумин; растворимых в воде ранозаживляющих средств, включающих в себя основной фактор роста фибробластов (b - FGF (от англ. - basic fibroblast growth factor)); и растворимых в воде средств для реваскуляризации, включающих в себя фактор роста эндотелия сосудов (VEGF (от англ. - vascular endothelial growth factor)).

Плюроник может представлять собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из плюроника L35, плюроника L43, плюроника L44, плюроника L64, плюроника F68, плюроника Р84, плюроника Р85, плюроника F87, плюроника F88, плюроника F98, плюроника Р103, плюроника Р104, плюроника Р105, плюроника F108, плюроника Р123 и плюроника F127.

Размер наночастицы может варьировать от 5 до 80 нм и предпочтительно от 5 до 50 нм, как измерено при 32,5-37°С.

Хитозан может характеризоваться молекулярной массой 3-100 кДа.

Хитозан может содержаться в количестве 0,001-200 массовых долей на 100 массовых долей плюроника.

Нанокапсула может характеризоваться размером частиц 700 нм или меньше, как измерено при 32,5-37°С. Размер частиц нанокапсулы может составлять предпочтительно 30-500 нм, более предпочтительно 30-300 нм и наиболее предпочтительно 30-100 нм при 32,5-37°С.

Органический растворитель на первой стадии может представлять собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из ацетона, ДМСО (диметилсульфоксида), этанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана, хлороформа и дихлорметана.

На второй стадии дистиллированная вода может быть использована в объеме, в 4 раза превышающем объем органического растворителя из первой стадии.

Нанокапсула может усиливать проницаемость через кожу в 2 раза, предпочтительно в 5 раз, более предпочтительно в 10 раз и еще более предпочтительно в 14 раз по сравнению с активным агентом отдельно.

Кроме того, настоящее раскрытие относится к системе доставки лекарственного средства, косметической композиции, оздоровительной функциональной пищевой композиции, композиции для медицинских инструментов и композиции для предметов, необходимых для повседневной жизни, каждая из которых содержит нанокапсулу.

Ниже приводится подробное описание настоящего раскрытия.

Настоящее раскрытие относится к покрытой хитозаном нанокапсуле и конкретно к нанокапсуле, в которой наночастица, содержащая активный агент и плюроник, покрыта хитозаном.

Используемый в настоящем документе термин «нанокапсула» относится к полой сферической капсуле в наномасштабе, пустое ядро которой может загружаться различными веществами, например, активным агентом.

Нанокапсула в соответствии с настоящим раскрытием может быть получена с использованием способа, известного из уровня техники, предпочтительно наноосаждения, способа ресуспендирования мембраны и более предпочтительно способа наноосаждения.

Наиболее предпочтительно, нанокапсула может быть изготовлена с использованием способа, включающего первую стадию получения реакционного раствора путем растворения активного агента и плюроника в органическом растворителе и осуществления реагирования их при комнатной температуре с получением реакционного раствора; вторую стадию получения наночастицы путем добавления каплями реакционного раствора из первой стадии в дистиллированную воду, непрерывного перемешивания его и удаления органического растворитель реакционного раствора путем естественного выпаривания; и третью стадию покрытия наночастицы из второй стадия путем добавления к ней хитозана.

Органический растворитель на первой стадии может представлять собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из без ограничения ацетона, ДМСО (диметилсульфоксида), этанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана, хлороформа и дихлорметана. Органический растворитель предпочтительно представляет собой по меньшей мере один выбранный из группы, состоящей из ацетона, тетрагидрофурана, этанола и ацетонитрила и более предпочтительно ацетона.

На второй стадии дистиллированная вода может быть использована в объеме, в 2-10 раз, предпочтительно в 2-5 раз и более предпочтительно в 4 раза превышающем объем органического растворителя из первой стадии. Если дистиллированную воду используют в объеме, менее чем в два раза превышающем объем органических растворителей, то может происходить частичное осаждение, а если он выше в 10 раз, то хитозановое покрытие может быть нестабильным, или концентрация нанокапсул может быть разбавлена, что нежелательно, поскольку требует дополнительного способа обогащения.

Активный агент является эффективным веществом, растворимым в воде или жирорастворимым, и может представлять собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей без ограничения из: противоракового средства, иммунодепрессанта, антиоксиданта, противовоспалительного средства, средства против морщин, препарата против выпадения волос, ранозаживляющего средства, средства для отбеливания кожи, пищевой добавки, иммуногена, белка в качестве терапевтического средства, средства для реваскуляризации, противогрибкового средства, антибиотика, противовирусного средства, седативного средства, анальгетика, антивозрастного средства, средства против морщин, средства для отбеливания кожи, средства для депигментации кожи, блокирующего ультрафиолетовое излучение средства, красителя, окрашивающего средства, дезодорирующего средства и освежителя воздуха.

Активный агент может содержаться в минимальном количестве, необходимом для обеспечения его действия и эффективности, до 20 массовых долей, то есть в количестве от 0 массовых долей (исключительно) до 20 массовых долей, в расчете на 100 массовых долей плюроника. Предпочтительно, активный агент может содержаться в количестве от 0 массовых долей (исключительно) до 10 массовых долей. Если количество активного агента превышает 20 массовых долей, то наночастицы становятся слишком большими по размеру или не могут переносить весь активный агент, оказываясь неспособными транспортировать точное эффективное количество активного агента.

Согласно настоящему раскрытию «плюроник» (полоксамер) представляет собой гидрофильный полимер, характеризующийся чувствительностью к температуре, и существуют производные с различными значениями ГЛБ (гидрофильно-липофильного баланса). Плюроник может представлять собой по меньшей мере один, выбранный из плюроников с ГЛБ 8-29, например, из группы, состоящей из: плюроника L35, плюроника L43, плюроника L44, плюроника L64, плюроника F68, плюроника Р84, плюроника Р85, плюроника F87, плюроника F88, плюроника F98, плюроника Р103, плюроника Р104, плюроника Р105, плюроника F108, плюроника Р123 и плюроника F127, и предпочтительно из плюроников с ГЛБ 15-29, например, из группы, состоящей без ограничения из: плюроника L35, плюроника L44, плюроника L64, плюроника F68, плюроника Р85, плюроника F87, плюроника F88, плюроника F98, плюроника Р105, плюроника F108 и плюроника F127.

Наночастица содержит активный агент и плюроник и является чувствительной к температуре, поэтому ее размер варьирует в зависимости от температуры, при которой проводят измерение. В частности, размер частиц может увеличиваться с понижением температуры.

Размер наночастицы может составлять 5-80 нм и предпочтительно 5-50 нм, как измерено при 32,5-37°С.

Используемый в настоящем документе термин «хитозан» относится к полисахариду, который получают путем частичного деацетилирования хитина. Хитозан является нетоксичным, биосовместимым и в высокой степени биоразлагаемым полимером с высокой гидрофильностью и мукоадгезивностью. Проявляя тенденцию к высокой растворимости и положительному заряду в кислой среде, хитозан легко прикрепляется к таким участкам, как слизистые оболочки. Кроме того, хитозан обладает противомикробным действием и кровоостанавливающим эффектом. Как правило, хитозан в высокой степени растворим в кислотном растворе, таком как уксусная кислота, молочная кислота и т.д. При нанесении на тело человека раствор хитозана в кислоте может вызвать раздражение кожи или нарушение из-за изменения рН в организме человека.

Напротив, хитозан в соответствии с настоящим раскрытием, который легко растворяется в воде, может преодолеть проблемы, возникающие при применении хитозана, растворенного в кислотном растворе. Хитозан может характеризоваться молекулярной массой 3-100 кДа, предпочтительно 3-20 кДа и более предпочтительно 3-10 кДа. Хитозан с молекулярной массой, превышающей 100 кДа, нежелателен из-за его плохой растворимости в воде.

Хитозан может содержаться в количестве 200 массовых долей или меньше, предпочтительно в количестве 0,001-200 массовых долей и более предпочтительно в количестве 0,001-100 массовых долей на 100 массовых долей плюроника. Менее 0,001 массовой доли хитозана слишком мало, чтобы покрыть наночастицу в достаточной степени, из-за чего сложно обеспечивать положительный заряд на поверхности наночастицы. Если хитозан используется в количестве более 200 массовых долей, нанокапсула становится слишком большой или подвергается частичному осаждению.

Нанокапсула проявляет чувствительность к температуре, и размер частиц увеличивается с понижением температуры. Нанокапсула имеет размер частиц 1000 нм или меньше, как измерено при 10°С, и уменьшается в размере при температурах выше 10°С.

Нанокапсула предпочтительно характеризуется размером частиц предпочтительно 700 нм или меньше при 32,5-37°С, более предпочтительно размером частиц 30-500 нм, еще более предпочтительно размером частиц 30-300 нм и наиболее предпочтительно размером частиц 30-100 нм. При размере частиц, превышающем 700 нм, нанокапсула плохо проникает через кожу при нанесении на кожу.

Пустое ядро нанокапсулы может загружаться различными активными агентами. Кроме того, нанокапсула набухает при низких температурах из-за ее чувствительности к температуре, что позволяет вводить активные агенты между плюроновыми материалами, обеспечивающими состав нанокапсулы, в результате чего могут удерживаться как жирорастворимые, так и растворимые в воде активные агенты.

Будучи покрытыми хитозаном, нанокапсулы являются положительно заряженными на своей поверхности и тем самым могут усиливать проницаемость через кожу и мукоадгезивность.

Проницаемость через кожу покрытой хитозаном нанокапсулы значительно выше, чем проницаемость полимерных капсул (PluNC) без хитозана, и в шесть или более раз выше, чем у большинства коммерчески доступных липосомных составов, а также может увеличиваться в два или более раз, предпочтительно в пять или более раз, более предпочтительно в 10 или более раз, а еще более предпочтительно в 14 или более раз по сравнению с нанокапсулами, обработанными только активным агентом.

Нанокапсулу получают путем физического связывания между плюрониками, составляющими наночастицу, и хитозаном, нанесенным на наночастицу, и не требуется отдельный способ изготовления полимера, в отличие от наночастиц, изготовленных с использованием полимеров плюроника и хитозана, полученных за счет химических связей между плюрониками и хитозаном, и, таким образом, токсичность связующего, используемого для получения полимера, можно не принимать во внимание.

Более того, настоящее раскрытие относится к системе доставки лекарственного средства, содержащей нанокапсулу.

В соответствии с настоящим раскрытием термин «система доставки лекарственного средства» относится к системе для доставки терапевтически эффективного лекарственного средства в in vivo участок при необходимости этого. Разработанную для эффективного переноса необходимого количества лекарственного средства в ткань при необходимости этого, систему доставки лекарственного средства можно понимать как композицию лекарственного средства, воздействие лекарственного средства, способ составления или состав лекарственного средства.

Система доставки лекарственного средства может представлять собой нанокапсулу, содержащую терапевтически эффективное лекарственное средство.

Лекарственное средство может представлять собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей без ограничения из противоракового средства, иммунодепрессанта, антиоксиданта, противовоспалительного средства, средства против морщин, препарата против выпадения волос, ранозаживляющего средства, средства для отбеливания кожи, пищевой добавки, иммуногена, белка в качестве терапевтического средства, средства для реваскуляризации, противогрибкового средства, антибиотика, противовирусного средства, седативного средства, анальгетика, антивозрастного средства, средства против морщин, средства для отбеливания кожи, средства для депигментации кожи, блокирующего ультрафиолетовое излучение средства, красителя, окрашивающего средства, дезодорирующего средства и освежителя воздуха.

Примеры противогрибкового средства включают в себя без ограничения полиены, такие как амфотерецин В, нистатин, фунгицидин и т.д., азолы, такие как кетоконазол, итраконазол и т.д., аллиламины, такие как бутенафин, тербинафин, нафтифин и т.д., эхинокандины, такие как анидулафунгин, каспофунгин и т.д., и другие противогрибковые средства, такие как ауроны, бензойная кислота, циклопирокс, флуцитозин, гризеофульвин и т.д.

Антибиотик может быть выбран без ограничения из пенициллинов, цефалоспоринов, полимиксинов, сульфонамидов, хинолинов, рифампицина, аминогликозидов, макролидов, тетрациклинов.

Противовирусное средство может представлять собой без ограничения средство против вируса гриппа, например, амантадин, римантадин, осельтамивир, занамивир и т.д.; средство против вируса герпеса, например, видарабин, ацикловир, фоскарнет и т.д.; средство против вируса гепатита В, например, ламивудин, энтекавир, тенофовир и т.д.; или средство против вируса иммунодефицита человека ВИЧ, например, зидовудин, диданозин, залцитабин, эфавиренц, рилпивирин, саквинавир, ритонавир, ралтегравир, эльвитегравир, долутегравир, энфувиртид и т.д.

Седативное средство может представлять собой без ограничения золпидем, диазепам или морфин.

В объем анальгетиков входят без ограничения ацетаминофен, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, морфин, фентанил, оксикодон и гидроморфон.

Примеры ранозаживляющего средства включают в себя без ограничения центеллу азиатскую, коллаген и эпителиальный фактор роста (EGF (от англ. epithelial growth factor)).

Противовоспалительное средство может представлять собой без ограничения мелоксикам, силибинин, индометацин, прополис, сложный фенетиловый эфир кофеиновой кислоты и т.д.

Примером противоракового средства может быть без ограничения паклитаксел, эстроген, доксорубицин, 5-фторурацил, попинавир, нимусулид, прогестерон, репаглинид, тетрациклин, полностью транс-ретиноевая кислота, лютеолин, ингибитор рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR (от англ. - vascular endothelial growth factor receptor)), модулятор Wnt (производное от англ. Wg (wingless - бескрылый) и Int)/β-катенина, ингибитор hedgehog и модулятор PI3K (от англ. phosphoinositol-3-kinase - фосфоинозитол-3-киназа)/Akt (от англ. - RAC-alpha serine/threonine-protein kinase - RAC-альфа серин/треонинпротеинкиназа)/mTOK (от англ. mammalian target of rapamycin - мишень рапамицина млекопитающих).

Иммунодепрессант может представлять собой без ограничения циклоспорин А, такролимус, метотрексат, рапамицин или сиролимус.

Препарат против выпадения волос, который относится к веществу, эффективному для предупреждения выпадения волос или стимулирования возобновления роста волос, может включать в себя без ограничения финастерид, миноксидил, циклоспорин А, натуральный препарат против выпадения волос, например, экстракт Coicis semen, экстракт Rubus coreanus, экстракт Glycyrrhiza radix, экстракт Thuja orientalis, экстракт Angelical radix, экстракт Cornus officinalis и т.д., или пептид, который эффективен для стимулирования возобновления роста волос.

Активный агент может быть жирорастворимым или нерастворимым лекарственным средством, которое может представлять собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из жирорастворимых или нерастворимых противораковых средств, включающих в себя паклитаксел, доцетаксел и тетрадрин, жирорастворимых или нерастворимых иммунодепрессантов, включающих в себя циклоспорин А и дексаметазон, жирорастворимых или нерастворимых антиоксидантов, включающих в себя токоферила ацетат, астаксантин, куркумин и аскорбилпальмитат, жирорастворимых или нерастворимых противовоспалительных средств, включающих в себя декспантенол и сложный фенетиловый эфир кофеиновой кислоты (САРЕ), жирорастворимых или нерастворимых средств против морщин, включающих в себя ретинилпальмитат, жирорастворимых или нерастворимых препаратов против выпадения волос, включающих в себя миноксидил и финастерид, жирорастворимых или нерастворимых ранозаживляющих средств, включающих в себя экстракт Centella asiatica и бета-ситостерол, жирорастворимых или нерастворимых средств для отбеливания кожи, включающих в себя аскорбилтетраизопальмитат, и жирорастворимых или нерастворимых пищевых добавок, включающих в себя тетрапептидный коллаген.

Активный агент может быть растворимым в воде лекарственным средством, которое может представлять собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из растворимых в воде противораковых средств, включающих в себя доксорубицин; растворимых в воде противовоспалительных средств, включающих в себя фосфолипазу А2 (PLA2 (от англ. phospholipase А2)); растворимых в воде иммуногенов, включающих в себя овальбумин; растворимых в воде белков в качестве терапевтических средств, включающих в себя бычий сывороточный альбумин; растворимых в воде ранозаживляющих средств, включающих в себя фактор роста фибробластов (b-FGF); и растворимых в воде средств для реваскуляризации, включающих в себя фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).

Система доставки лекарственного средства может содержать нанокапсулу и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Согласно традиционным способам система доставки лекарственного средства может быть изготовлена в виде пероральных составов, таких как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропы, аэрозоли и т.д.; средства для наружного применения; суппозитории и стерильные инъекционные растворы. Примеры носителя, вспомогательного вещества и разбавителя, подлежащих объединению в фармацевтическую композицию, могут включать в себя лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Для состава могут быть использованы традиционно используемые наполнители, заполнители, связующие, смачивающие средства, разрыхлители, разбавители, такие как поверхностно-активные вещества или вспомогательные вещества. Примеры твердых составов для перорального введения могут включать в себя таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и т.д. Такие твердые составы получают, например, путем добавления к нанокапсуле по меньшей мере одного вспомогательного вещества, например, крахмала, карбоната кальция, сахарозы, лактозы, желатина и т.д. Кроме того, смазывающие средства, такие как стеарат магния, тальк и т.д., могут быть использованы в дополнение к простым вспомогательным веществам. Примеры жидких препаратов для перорального введения включают в себя суспензии, пероральные растворы, эмульсии, сиропы и т.д., а также различные виды вспомогательных веществ, например, смачивающие средства, подсластители, ароматизаторы, консерванты и т.д., могут быть использованы в дополнение к простым разбавителям, таким как вода и жидкий парафин. Препараты для парентерального введения включают в себя стерильные водные растворы, неводные растворители, суспензии, эмульсии, лиофилизированные препараты и суппозитории. Примеры неводных растворителей для суспензий могут включать в себя пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, инъекционный сложный эфир, такой как этилолат и т.д. Примеры основ для суппозиториев включают в себя витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, laurinum, глицерожелатин и т.д.

Кроме того, препараты наружного применения на коже могут быть получены без ограничения в форме мазей, лосьонов, аэрозолей, пластырей, кремов, гелеобразующих средств или гелей. Препарат наружного применения на коже может содержать усилитель проницаемости, например, в частности, диметилсульфоксид, диметилацетамид, диметилформамид, поверхностно-активное вещество, спирт, ацетон, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль без ограничения. Частота нанесения препарата наружного применения на коже может в значительной степени варьировать в зависимости от различных факторов, включающих в себя возраст, пол и массу субъекта, подлежащего лечению, конкретного заболевания или патологического состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания или патологического состояния, пути введения и решения назначающего лечение врача. Препарат наружного применения на коже рекомендуется наносить от десяти раз в сутки до десяти раз в месяц, предпочтительно от четырех раз в сутки до четырех раз в неделю, более предпочтительно от трех раз в сутки до трех раз в неделю, еще более предпочтительно один или два раза в сутки.

Система доставки лекарственного средства в соответствии с настоящим раскрытием может быть введена млекопитающим, таким как мыши, домашние животные, люди, животные-компаньоны и т.д., различными путями. Могут быть предусмотрены все способы введения. Например, введение можно осуществлять пероральным, ректальным, внутривенным, внутримышечным, подкожным, кожным, дуральным или интрацеребровентрикулярным путями, с предпочтением чрескожного введения.

Настоящее раскрытие относится к косметической композиции, содержащей нанокапсулу.

Нанокапсула может содержать функциональное косметическое вещество, которое обладает функцией отбеливания кожи, уменьшения морщин, антиоксидации, антивозрастного действия, противовоспалительного действия, блокирования ультрафиолетового УФ излучения и т.д.

Примеры отбеливающего кожу вещества включают в себя без ограничения экстракт Paper mulberry, арбутин, этиласкорбиловый эфир, растворимый в масле экстракт из корня солодки, аскорбилгликозид, ниацинамид, α-бисаболол и аскорбилтетраизопальмитат.

Примеры связанного с морщинами функционального вещества включают в себя без ограничения витамин А, производные витамина А (ретинилпальмитат, ретинилацетат и т.д.), аденозин и полиэтоксилированный ретинамид.

Примеры антиоксидантного функционального вещества могут представлять собой без ограничения витамин А, производные витамина А, витамин Е, производные витамина Е, каротин, ликопен, лютеин, коэнзим Q10 и астаксантин.

Косметическая композиция может включать в себя вспомогательное средство, традиционно используемое в области косметологии, такое как гидрофильный или липофильный гелеобразующий агент, гидрофильный или липофильный активный агент, консервант, антиоксидант, растворитель, ароматизатор, наполнитель, блокатор, пигмент, дезодорирующее средство, краситель и т.п., в дополнение к нанокапсулам.

Количество вспомогательного средства находится на уровне, приемлемом в уровне техники. В любом случае вспомогательные средства и их соотношения могут быть выбраны так, чтобы не оказывать отрицательного воздействия на желаемые свойства косметической композиции в соответствии с настоящим раскрытием.

Косметическая композиция может быть получена по меньшей мере в одном составе, выбранном из группы, состоящей без ограничения из лосьона, смягчителя кожи, тоника для кожи, ампулы, вяжущего средства, крема, тонального крема, эссенции, упаковки, упаковки с маской, мыла, очищающего средства для тела, очищающей пенки, шампуня, ополаскивателя, средства для ухода за волосами, масла для волос, масла для тела и лосьона для тела.

Косметической композиция может быть использована каждый день, а также может быть использована в течение неопределенного периода времени. Предпочтительно количество, частоту и продолжительность применения можно регулировать в соответствии с возрастом пользователя, состоянием кожи или типом кожи.

Кроме того, настоящее раскрытие относится к оздоровительной функциональной пищевой композиции, содержащей нанокапсулу.

Нанокапсула может включать в себя оздоровительный функциональный пищевой материал.

Оздоровительное функциональное пищевое вещество может представлять собой витамин, минерал, пробиотик, биоактивный пептид, антиоксидант, растительный стерол, экстракт растения, коэнзим Q10, омега-3, астаксантин и т.п. Предпочтительно, это может быть без ограничения трипептид коллагена, масло красного женьшеня, астаксантин и омега-3.

Оздоровительная функциональная пищевая композиция может включать в себя нанокапсулу и ситологически приемлемую дополнительную добавку.

Оздоровительная функциональная пищевая композиция в соответствии с настоящим раскрытием может иметь форму таблеток, капсул, пилюль или жидкостей, и примеры, к которым могут быть добавлены нанокапсулы в соответствии с настоящим раскрытием, включают в себя различные продукты питания, напитки, жевательные резинки, чаи, витаминные комплексы, оздоровительные функциональные пищевые продукты и т.д.

Согласно другому аспекту настоящего раскрытия представлено медицинское устройство, содержащее нанокапсулу в соответствии с настоящим раскрытием.

Медицинское устройство может представлять собой наполнитель, покрывающее рану средство, материал костного трансплантата, материал покрытия имплантата, средство для эмболизации, диагностическое средство или подобное.

Согласно другому аспекту настоящего раскрытия представлена композиция для предметов, необходимых для повседневной жизни, содержащая нанокапсулу в соответствии с настоящим раскрытием.

Композиция для предметов, необходимых для повседневной жизни, может представлять собой без ограничения краситель, окрашивающее средство, дезодорирующее средство и освежитель воздуха.

Полезные эффекты настоящего изобретения

Настоящее раскрытие относится к покрытой хитозаном нанокапсуле и ее применению. В соответствии с настоящим раскрытием был установлен способ изготовления нанокапсулы, характеризующейся размером частиц 500 нм или меньше и, в частности, 200 нм или меньше, и отличной стабильностью, и при изготовлении этим способом нанокапсулы, содержащие загруженные в них нерастворимые лекарственные средства, проявляли высокую проницаемость через кожу, гарантированную чрескожную доставку лекарственных средств и эффективность лекарственных средств в организме. Также обнаружили, что при введении изготовленных нанокапсул перорально биодоступность активных ингредиентов увеличивалась.

Следовательно, предполагают, что покрытые хитозаном нанокапсулы в соответствии с настоящим раскрытием найдут применение при разработке системы доставки, которая может доставлять нерастворимые лекарственные средства или эффективные ингредиенты с заметно повышенной эффективностью в организм человека и животных, таких как домашний скот, животные-компаньоны и т.д., в медицинской, косметической и пищевой промышленностях.

Краткое раскрытие графических материалов

На фиг. 1 показаны диаметры полученных наночастиц в соответствии с типами плюроника и температурами.

На фиг. 2 показаны характеристики покрытых хитозаном нанокапсул в соответствии с типами плюроника, анализируемых на предмет (а) морфологического свойства, (b) размера, (с) полидисперсности и (d) заряда поверхности.

На фиг. 3 показаны характеристики покрытых хитозаном нанокапсул в соответствии с молекулярными массами хитозана, анализируемых на предмет (а) размера, (b) полидисперсности, (с) заряда поверхности и (d) морфологии.

На фиг. 4 показаны характеристики покрытых хитозаном нанокапсул в соответствии с типами растворителя, анализируемых на предмет (а) размера, (b) полидисперсности и (с) заряда поверхности.

На фиг. 5 показаны размеры частиц в соответствии со способами получения покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них лекарственные средства в соответствии с настоящим раскрытием.

На фиг. 6 показаны размеры частиц покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них лекарственные средства, в соответствии с соотношениями смешивания растворителя и деионизированной воды при изготовлении их с использованием наноосаждения.

На фиг. 7 показана цитотоксичность покрытых хитозаном нанокапсул в соответствии с настоящим раскрытием.

На фиг. 8 показаны характеристики покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них паклитаксел и доцетаксел, в соответствии с загруженными количествами лекарственных средств, анализируемых на предмет (а) размера, (b) полидисперсности и (с) заряда поверхности.

На фиг. 9 показаны характеристики покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них (а) циклоспорин А и (b) дексаметазон, в соответствии с загруженными количествами лекарственных средств, анализируемых на предмет размера, полидисперсности и заряда поверхности.

На фиг. 10 показаны характеристики покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них (а) ретинилпальмитат и (b) токоферила ацетат, в соответствии с загруженными количествами лекарственных средств, анализируемых на предмет размера, полидисперсности и заряда поверхности.

На фиг. 11 показаны характеристики покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них (а) миноксидил и (b) финастерид, в соответствии с загруженными количествами лекарственных средств, анализируемых на предмет размера, полидисперсности и заряда поверхности.

На фиг. 12 показаны характеристики размера и дисперсности нанокапсул в соответствии с температурами.

На фиг. 13 показаны характеристики покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженный в них доксорубицин, в соответствии с загруженными количествами лекарственного средства.

На фиг. 14 показаны характеристики покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженный в них овальбумин, в соответствии с загруженными количествами лекарственного средства.

На фиг. 15 показаны характеристики покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженный в них бычий сывороточный альбумин, в соответствии с загруженными количествами лекарственного средства.

На фиг. 16 показано, осаждаются или не осаждаются покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие циклоспорин A (CsA@ChiNC), нильский красный (нильский красный@ChiNC) или пирен (пирен@ChiNC).

На фиг. 17 показаны характеристики покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них лекарственные средства (CsA (от англ. - cyclosporin А - циклоспорин А) и RP (от англ. - retinyl palmitate -ретинилпальмитат)), до и после сушки замораживанием.

На фиг. 18 показана проницаемость через кожу лекарственных средств в соответствии с типами хитозана.

На фиг. 19 показана проницаемость через кожу покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженное в них лекарственное средство (нильский красный) в соответствии с настоящим раскрытием.

На фиг. 20 показаны эффекты покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженное в них лекарственное средство (нильский красный) в соответствии с настоящим раскрытием, в отношении доставки лекарственного средства в кожу.

На фиг. 21 показаны эффекты возобновления роста волос в соответствии с чрескожной доставкой лекарственного средства (циклоспорина A, CsA) с помощью покрытой хитозаном нанокапсулы, содержащей загруженное в нее лекарственное средство в соответствии с настоящим раскрытием.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

Далее будут подробно раскрыты предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничивается раскрываемыми в настоящем документе вариантами осуществления и может быть осуществлено в других формах. Скорее, варианты осуществления представлены для того, чтобы сделать раскрываемое в настоящем документе настоящее изобретение исчерпывающим и полным, а также для того, чтобы в достаточной мере разъяснить специалистам в данной области идею настоящего изобретения.

Пример 1. Получение покрытой хитозаном нанокапсулы

Пример 1-1. Оптимизация получения наночастицы в соответствии с видом плюроника

Плюроник (полоксамер) представляет собой неионный триблок-сополимер, состоящий из центральной гидрофобной цепи поли(пропиленоксида) (РРО (от англ. - poly(propylene oxide))), фланкированной двумя гидрофильными цепями поли(этиленоксида) (РЕО (от англ. - poly(ethylene oxide))), то есть РЕО-РРО-РЕО, который является типичным чувствительным к температуре полимером, характеризующимся зависимым от температуры обратимым переходом внутренних структур. Существуют производные плюроника с различными значениями ГЛБ (гидрофильно-липофильного баланса) в зависимости от числа молей блоков РЕО и РРО в них. ГЛБ в плюрониках может влиять на получение наночастиц из плюроников. Таким образом, размеры наночастиц измеряли в соответствии с видами плюроников.

Наночастицы получали с использованием плюроников с ГЛБ 2-29. Более конкретно, 20 мг плюроника растворяли в 1 мл ацетона с получением реакционного раствора. Капли реакционного раствора медленно добавляли к 4 мл деионизированной воды, которую перемешивали при 530 оборотах в минуту. После реагирования при комнатной температуре в течение 12 часов или дольше ацетон удаляли путем естественного выпаривания с получением наночастиц, состоящих из плюроника. Наночастицы, полученные таким образом, анализировали на предмет размеров с использованием анализатора размера частиц (Zetasizer, Nono-Zs, Malvern) и трансмиссионной электронной микроскопии. Результаты показаны на фиг. 1.

Как можно видеть на фиг. 1, измеренные наночастицы, состоящие из плюроника F127, имеют диаметр 200 нм или меньше при 25°С, и их диаметр варьирует от 5 нм до 80 нм при 32,5°С - 37°С, при этом средний диаметр составляет 50 нм. Что касается плюроника F68, его измеренный диаметр составляет 300 нм или меньше при 25°С и 200 нм или меньше при 32,5°С - 37°С.

В дополнение к плюронику F127 и плюронику F68 обнаружили, что наночастицы, состоящие из плюроников с ГЛБ 2-29, имеют диаметр 200 нм при 32,5°С - 37°С.

Из раскрываемого выше понятно, что размеры частиц можно контролировать в соответствии с температурами с использованием плюроников. Конструировали нанокапсулы с диаметром 100 нм или меньше. С этой целью диаметр наночастиц оптимизировали до 5-80 нм и предпочтительно 5-50 нм с использованием плюроников с ГЛБ 2-29.

Пример 1-2. Оптимизация получения нанокапсулы в соответствии с видом плюроника

Изучали оптимальные условия для получения нанокапсул в соответствии с видами плюроников. С этой целью наночастицы получали с использованием плюроников, соответствующих ГЛБ 2-29 в приведенной ниже таблице 1, и покрывали хитозаном с получением нанокапсул.

Вкратце, 20 мг каждого плюроника растворяли в 1 мл ацетона и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем раствор полимера медленно каплям добавляли к 4 мл деионизированной воды при перемешивании при 400 оборотах в минуту. Из полученных таким образом полимерных наночастиц удаляли ацетон в течение 6 часов под вытяжным шкафом. В конце добавляли 20 мг хитозана со степенью деацетилирования 90% и молекулярной массой 10 кДа к каждой полимерной наночастице с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 часов с получением покрытых хитозаном нанокапсул. Покрытые хитозаном нанокапсулы (ChiNC), сконструированные в соответствии с видами плюроников, анализировали на предмет размера, диспергируемости и заряда поверхности с использованием электрофоретического светорассеивающего спектрофотометра (ELS-Z2, Otsuka), и результаты показаны на фиг. 2.

Как можно видеть на фиг. 2, покрытые хитозаном нанокапсулы (ChiNC), сконструированные из пяти плюроников (F127, Р123, Р188, L35 и L81), различающихся по показателям ГЛБ (гидрофильного и липофильного баланса), путем наноосаждения, были стабильными без образования осадков со всеми видами плюроников.

При получении из F127 и Р123 покрытые хитозаном нанокапсулы, измеряемые на предмет стабильности, имели диаметр 100 нм или меньше, например, диаметр, варьирующий от 30 нм до 80 нм, со средним диаметром 60 нм при 32,5°С - 37°С. Диаметр покрытых хитозаном нанокапсул, полученных из Р188 и L35, варьировал от 209 нм до 688 нм со средним диаметром 500 нм. Диаметр покрытых хитозаном нанокапсул, полученных из L81, составлял до 1,4 мкм. Покрытые хитозаном нанокапсулы, полученные из F127, Р123, Р188 и L35, характеризовались степенью дисперсности 0,3 или меньше, как правило, демонстрируя монодисперсность. Покрытые хитозаном нанокапсулы, полученные из L81, имели микроразмеры, демонстрируя до некоторой степени большую дисперсность. Измеренный заряд поверхности в среднем составлял приблизительно +20 мВ, поскольку капсулы из плюроника были прочно покрыты хитозаном.

Из результатов понятно, что плюроники с ГЛБ от 8 до 29 подходят для оптимизации составов покрытых хитозаном нанокапсул. В зависимости от видов плюроников и температур могут быть сформированы покрытые хитозаном нанокапсулы с диаметром 700 нм или меньше, 30-500 нм, 30-300 нм или 30-100 нм.

Хотя микрокапсулы не являются наноразмерными, они могут быть сконструированы даже с индексом ГЛБ 8 или меньше, что говорит о том, что при необходимости могут быть сконструированы покрытые хитозаном капсулы нано- и микроразмеров, например, для нанесения на локальные участки.

Пример 1-3. Оптимизация получения покрытой хитозаном нанокапсулы в соответствии с молекулярной массой хитозана

На основании результатов примеров 1-1 и 1-2 установили оптимальные условия с учетом состояний плюроника для получения покрытых хитозаном нанокапсул в соответствии с молекулярными массами хитозана (3 кДа - 100 кДа).

Для получения покрытых хитозаном нанокапсул в соответствии с настоящим раскрытием использовали биосовместимый материал плюроник F127 (полоксамер 407), который был одобрен FDA (от англ. - Food and Drug Administration - Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств). Покрытые хитозаном нанокапсулы получали с использованием наноосаждения. Вкратце, 20 мг плюроника F127 растворяли в 1 мл ацетона с получением реакционного раствора, который затем медленно каплям добавляли к 4 мл деионизированной воды при перемешивании при 530 оборотах в минуту. В ходе реакции при комнатной температуре в течение 12 часов ацетон удалялся посредством естественного выпаривания с получением наночастиц, состоящих из плюроника (PluNC). Хитозан добавляли к PluNC и смешивали при комнатной температуре в течение одного часа или дольше с получением покрытых хитозаном нанокапсул (ChiNC) в соответствии с настоящим раскрытием. С этой целью PluNC покрывали хитозаном с молекулярными массами 3, 10, 20, 50 и 100 кДа. ChiNC, полученные в соответствии с молекулярными массами хитозана, анализировали на предмет морфологии, размера, индекса полидисперсности (PDI (от англ. - polydispersity index)) и заряда поверхности с помощью анализатора размера частиц (Zetasizer, Nono-Zs, Malvern) и трансмиссионной электронной микроскопии. Результаты показаны на фиг.3.

Хитозан смешивали в количестве 0,001-200 массовых долей с плюроником. Если количество хитозана составляло менее чем 0,001 массовой доли, то наночастицы были недостаточно покрыты хитозаном, что затрудняло проявление положительных зарядов на поверхности. Более чем 200 массовых долей хитозана делали нанокапсулы слишком крупными по размеру или приводили к частичному осаждению. В последующих экспериментах плюроник смешивали с хитозаном в равных количествах.

Как показано на фиг. 3, что касается размера частиц (а), при покрытии хитозаном с молекулярной массой 20 кДа наночастицы формировались в покрытые хитозаном нанокапсулы ChiNC (ChiNC 3K, ChiNC 10K и ChiNC 20K), диаметр которых составлял 100 нм или меньше, тогда как применение хитозана с молекулярной массой 50 кДа и 100 кДа давало покрытые хитозаном нанокапсулы ChiNC (ChiNC 50K и ChiNC 100K), диаметр которых составлял приблизительно 200 нм. В отношении полидисперсности (b), покрытые хитозаном нанокапсулы с молекулярной массой 20 кДа или меньше ChiNC (ChiNC 3K, ChiNC 10K и ChiNC 20K), как наблюдали, характеризовались индексом полидисперсности 0,2 или меньше, тогда как у покрытых хитозаном нанокапсул с молекулярными массами 50 кДа и 100 кДа ChiNC (ChiNC 50K и ChiNC 100K) измеряли индекс полидисперсности приблизительно 0,2-0,3. Что касается заряда поверхности (с), наблюдали, что сам по себе PluNC, который не покрыт хитозаном, характеризовался отрицательным зарядом приблизительно -5 мВ, при этом будучи покрытыми хитозаном капсулы характеризовались положительным зарядом независимо от их молекулярной массы. Кроме того, морфологическое обследование показывало сферические структуры в нанокапсулах, что указывает на то, что нанокапсула увеличивается в размере с повышением молекулярной массы хитозана (d).

Хотя это не показано в настоящем документе, хитозан с молекулярной массой более чем 100 кДа должен был быть растворен в уксусной кислоте перед нанесением на частицы. Однако при растворении такого большого хитозана в уксусной кислоте для покрытия происходило осаждение, снижающее стабильность состава.

Из результатов становится понятно, что в покрытых хитозаном нанокапсулах в соответствии с настоящим раскрытием хитозан может быть устойчиво нанесен на наночастицы, состоящие из плюроников, в соответствии со способом получения, и что молекулярные массы хитозана, подлежащего нанесению, влияют на размер и дисперсность нанокапсул. Кроме того, хитозан с молекулярной массой 3-20 кДа позволял конструировать нанокапсулы, которые были небольшими и однородными по размеру и приобретали стабильность состава.

Пример 1-4. Оптимизация получения покрытой хитозаном нанокапсулы в соответствии с растворителем

Оптимизацию осуществляли в отношении растворителя, используемого в способе получения покрытых хитозаном нанокапсул.

В качестве выбранных растворителей анализировали ацетон (АСЕ (от англ. - acetone)), этанол (ЕТН (от англ. - ethanol)), тетрагидрофуран (ТГФ), хлороформ (CHL (от англ. - chloroform)) и дихлорметан (ДХМ). При использовании таких растворителей могут быть созданы платформы для загрузки различных лекарственных средств (активных агентов), различающихся растворимостью в растворителях.

Сначала 20 мг плюроника F127 растворяли в 1 мл каждого из ацетона, этанола и тетрагидрофурана в соответствии с наноосаждением с последующим реагированием в течение 2 часов. Затем реакционную смесь медленно каплями добавляли к 4 мл деионизированной воды при перемешивании при 400 оборотах в минуту с получением полимерных нанокапсул, из которых затем удаляли растворители в течение 6 часов под вытяжным шкафом. В конце добавляли 20 мг хитозана (деацетилирование 90%, молекулярная масса 10 кДа) к нанокапсулам из каждого растворителя и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов с получением покрытых хитозаном нанокапсул.

Для хлороформа использовали одиночную эмульсию. Раствор 20 мг плюроника F127 в 1 мл хлороформа подвергали реагированию в течение 2 часов. После этого реакционную смесь медленно добавляли каплями к 4 мл деионизированной воды, которую перемешивали при 400 оборотах в минуту, с получением наночастиц, которые затем диспергировали с использованием гомогенизатора перед удалением растворителя в течение 2 часов с помощью вакуумной сушки. Наконец, к полимерным нанокапсулам добавляли 20 мг хитозана (деацетилирование 90%, молекулярная масса 10 кДа) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов с получением покрытых хитозаном нанокапсул.

Покрытые хитозаном нанокапсулы 10 кДа (ChiNC 10K), полученные в соответствии с наноосаждением и одиночной эмульсией, анализировали на предмет размера, дисперсности и заряда поверхности с использованием электрофоретического светорассеивающего спектрофотометра (ELS-Z2, Otsuka).

Как можно видеть на фиг.4, хитозановые нанокапсулы (ChiNC 10K), полученные с помощью наноосаждения с использованием органических растворителей ацетона (АСЕ), этанола (ЕТН) и тетрагидрофурана (ТГФ), все из которых хорошо смешивались с водой, имели размер 60 нм и индекс полидисперсности (PDI) 0,3 или меньше, демонстрируя монодисперсность.

Напротив, покрытые хитозаном нанокапсулы (ChiNC 10K), полученные с помощью одиночной эмульсии с использованием хлороформа (CHL), который представляет собой органический растворитель с плохой смешиваемостью с водой, характеризовались размером приблизительно 750 нм (таким же, как в дихлорметане) и демонстрировали большой индекс полидисперсности (PDI) по сравнению с покрытыми хитозаном нанокапсулами, полученными с помощью наноосаждения с использованием ацетона (АСЕ), этанола (ЕТН) и тетрагидрофурана (ТГФ). Однако все группы покрытых хитозаном нанокапсул характеризовались зарядом поверхности приблизительно 20 мВ, демонстрируя, что покрытые хитозаном полимерные капсулы, то есть покрытые хитозаном нанокапсулы, могут быть стабильно сконструированы с использованием различных растворителей и способов.

Пример 1-5. Разработка способа получения загруженной лекарственным средством нанокапсулы

Покрытые хитозаном нанокапсулы, загруженные лекарственным средством, получали путем наноосаждения и ресуспендирования мембраны и характеризовали в соответствии со способами получения. С этой целью в качестве лекарственного средства использовали нерастворимое вещество циклоспорин (далее в настоящем документе называемое «CsA»).

При ресуспендировании мембраны растворяли 0,2 мг (2 масс.%) или 0,6 мг (6 масс.%) CsA вместе с 10 мг плюроника F126 в 1 мл ацетона и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов с получением реакционного раствора. Реакционный раствор выдерживали в течение 2 часов под вытяжным шкафом для образования мембраны при испарении ацетона. К сформированной мембране добавляли 5 мл деионизированной воды, перемешивали в течение 30 минут или дольше и смешивали с хитозаном 10 кДа такой же массой, что и масса плюроника, с получением нанокапсулы.

В другом способе наноосаждения 0,2 мг или 0,6 мг CsA перемешивали вместе с 10 мг плюроника F126 в 1 мл ацетона при комнатной температуре в течение 2 часов с получением реакционного раствора, который затем медленно добавляли каплями к 4 мл деионизированной воды при перемешивании при 530 оборотах в минуту. Смесь перемешивали в течение 4 часов под вытяжным шкафом, так что ацетон самопроизвольно испарялся. К деионизированной воде, содержащей наночастицы с удаленным ацетоном, состоящие из плюроника, добавляли хитозан 10 кДа в том же количестве, что и количество плюроника, с последующим перемешиванием с получением нанокапсул. Измеряли размер частиц нанокапсул с использованием анализатора размера частиц и трансмиссионной электронной микроскопии. Результаты показаны на фиг. 5.

Как можно видеть на фиг. 5, не содержащие CsA нанокапсулы были в приблизительно 2 раза меньше по размеру при получении путем наноосаждения, чем при получении путем ресуспендирования мембраны. Содержащие CsA нанокапсулы при получении путем ресуспендирования мембраны в большой степени отличались друг от друга размером частиц в зависимости от содержания CsA. Нанокапсулы частично агрегировали при содержании CsA 6 масс.%. Напротив, разница в размере частиц в зависимости от содержания CsA среди содержащих CsA нанокапсул, полученных путем наноосаждения, была невелика по сравнению с таковой среди наночастиц, полученных путем ресуспендирования мембраны, посредством чего нанокапсулы можно было стабильно конструировать в пределах определенного диапазона размеров без агрегации. Капсулы характеризовались размером 100 нм или меньше при содержании CsA 2 масс.% и размером 200 нм или меньше при содержании CsA 6 масс.%.

Данные показывают, что наноосаждение предпочтительно применяют для конструирования покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженное в них лекарственное средство в соответствии с настоящим раскрытием, чтобы улучшить стабильность состава.

Пример 1-6. Соотношение растворителя и дистиллированной воды при наноосаждении

Нанокапсулы, полученные путем наноосаждения, измеряли по размеру в соответствии с соотношением ацетона в качестве растворителя реакционного раствора и деионизированной воды, используемых в получении наночастиц в ходе процедуры примера 1-5.

Покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие загруженное в них лекарственное средство, получали таким путем, как наноосаждение в примере 1-5, за исключением того, что лекарственное средство загружали при содержании 6 масс.% с ацетоном и деионизированной водой, смешанными в соотношении 1:5 или 1:4. Нанокапсулы анализировали на предмет размера частиц, и результаты показаны на фиг. 6. С этой целью размеры нанокапсул измеряли до и после покрытия хитозаном.

Как показано на фиг. 6, нанокапсулы формировали с размером 100 нм или меньше как до, так и после добавления хитозана, при смешивании в соотношении 1:4 ацетона с деионизированной водой в отличие от нанокапсул, сформированных в соотношении 1:5 ацетона и деионизированной воды.

Результат говорит о том, что покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие загруженное в них лекарственное средство в соответствии с настоящим раскрытием, могут быть получены с размером, обеспечивающим стабильность, путем наноосаждения с использованием растворителя и деионизированной воды в соотношении 1:4.

Хотя это и не показано в настоящем документе, растворители ДМСО (диметилсульфоксид), этанол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, хлороформ и дихлорметан также могут обеспечивать конструирование нанокапсул стабильных размеров, если их использовать с деионизированной водой в соотношении 1:4 (см. пример 1-4).

Пример 2. Анализ на предмет цитотоксичности покрытой хитозаном нанокапсулы

Покрытые хитозаном нанокапсулы (ChiNC), полученные в примере 1-3, анализировали на предмет цитотоксичности.

Высевали клетки NIH3T3 при плотности 10000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 8-12 часов. Затем клетки обрабатывали с помощью 10 мкг/мл, 20 мкг/мл, 50 мкг/мл или 100 мкг/мл PluNC или ChiNC, оба полученные в примере 1-3, в течение 24 часов и анализировали на предмет жизнеспособности клеток с использованием ССK8 (набора 8 для подсчета клеток) в соответствии с инструкциями изготовителя. Результаты показаны на фиг. 7. С этой целью жизнеспособность клеток для каждой группы обработки выражали относительно 100% для необработанных клеток NIH3T3 в качестве контроля.

Как показано на фиг. 7, PluNC или ChiNC обеспечивали жизнеспособность клеток 90% или выше при всех концентрациях.

Данные показывают, что покрытые хитозаном нанокапсулы в соответствии с настоящим раскрытием являются в высокой степени биосовместимыми без цитотоксичности.

Пример 3. Условия получения для покрытой хитозаном нанокапсулы, содержащей загруженный в нее нерастворимый (жирорастворимый) активный агент

В соответствии с настоящим раскрытием устанавливали условия получения для покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих активные агенты, особенно жирорастворимые противораковые средства (паклитаксел, доцетаксел), противовоспалительные средства (дексаметазон), иммунодепрессанты (циклоспорин А), антиоксиданты (токоферила ацетат), средства против морщин (ретинилпальмитат), препараты против выпадения волос (миноксидил, финастерид) и антивозрастные средства (токоферила ацетат, ретинилпальмитат).

Раствор доцетаксела, паклитаксела, дексаметазона, токоферила ацетата, циклоспорина А или ретинилпальмитата в 1 мл ацетона смешивали и подвергали реагированию с 20 мг плюроника F127 в течение 2 часов. Затем реакционную смесь медленно каплям добавляли к 4 мл деионизированной воды при перемешивании при 400 оборотах в минуту для получения загруженных лекарственным средством полимерных нанокапсул, из которых затем удаляли ацетон в течение 6 часов под вытяжным шкафом. В конце добавляли 20 мг хитозана (деацетилирование 90%, молекулярная масса 10 кДа) к полимерным нанокапсулам и перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре с получением покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженное в них лекарственное средство. Лекарственные средства, которые оставались незагруженными, удаляли путем ультрафильтрации (фильтр Amicon Ultra-15).

Отдельно раствор финастерида, миноксидила, токоферила ацетата или ретинилпальмитата в 1 мл этанола смешивали и подвергали реагированию с 20 мг плюроника F127 в течение 2 часов. Затем реакционную смесь медленно каплями добавляли к 4 мл деионизированной воды при перемешивании при 400 оборотах в минуту для получения загруженных лекарственным средством полимерных нанокапсул, из которых затем удаляли этанол в течение 6 часов под вытяжным шкафом. В конце добавляли 20 мг хитозана (деацетилирование 90%, молекулярная масса 10 кДа) к полимерным нанокапсулам и перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре с получением покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженное в них лекарственное средство. Лекарственные средства, которые оставались незагруженными, удаляли путем ультрафильтрации (фильтр Amicon Ultra-15).

Полученную таким образом загруженную лекарственным средством ChiNC 10K анализировали на предмет размера, дисперсности и заряда поверхности с использованием электрофоретического светорассеивающего спектрофотометра (ELS-Z2, Otsuka).

Пример 3-1. Получение покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них паклитаксел и доцетаксел

Как показано на фиг. 8, можно было получать загруженные паклитакселом (РТХ (от англ. - paclitaxel)) нанокапсулы, и загрузка не оказывала существенного влияния на размер, дисперсность и заряд поверхности, пока не достигала 0,1 масс.%. При содержании загрузки 0,2 масс.% нанокапсулы расширялись до диаметра до 3 мкм, но не выпадали в осадок. Таким образом, обнаружили, что могут быть получены покрытые хитозаном микрокапсулы, содержащие загруженное в них лекарственное средство, для местного применения. Однако частичное осаждение происходило, когда лекарственное средство содержание загрузки достигало 0,5 масс.%.

Наблюдали, что доцетаксел (DOC (от англ. - docetaxel)) стабильно загружался в покрытые хитозаном нанокапсулы с содержанием до 2 масс. %. Кроме того, выясняли условия изготовления состава, которые гарантируют загрузку лекарственного средства с содержанием до 3 масс.% без осаждения. Таким образом, могут быть получены покрытые хитозаном нанокапсулы и покрытые хитозаном микрокапсулы, каждая из которых содержит загруженное в них противораковое средство.

Пример 3-2. Получение покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них циклоспорин А и дексаметазон

Как можно видеть на фиг. 9, циклоспорин A (CsA) стабильно загружался в содержании до 5 масс.% в покрытые хитозаном нанокапсулы. Кроме того, определяли условия составления, которые гарантировали загрузку лекарственного средства в содержании до 10 масс.% без осаждения. Получали покрытые хитозаном нанокапсулы при содержании загрузки 5 масс.%. Принимая во внимание применимость немного более крупных покрытых хитозаном нанокапсул для местной терапии, лекарственное средство можно было загружать в содержании до 10 масс.%. Кроме того, анализ чувствительности к температуре показал, что покрытые хитозаном нанокапсулы имели размер частиц 700 нм или больше при 10°С и 100 нм или меньше (30-100 нм) при 32,5°С или 37°С.

Дексаметазон (DEX (от англ. - dexamethasone)) мог быть оптимально загружен в содержании до 3 масс.%, и при содержании загрузки до 5 масс.% не происходило осаждения, так что можно было получать покрытые хитозаном нанокапсулы размером 900 нм.

Пример 3-3. Получение покрытой хитозаном нанокапсулы, содержащей загруженные в нее ретинилпальмитат и токоферила ацетат

Как показано на фиг. 10, наблюдали, что ретинилпальмитат (RP (от англ. - retinyl palmitate)) стабильно загружается в содержании до 5 масс.% в покрытых хитозаном нанокапсул. Кроме того, при содержании загрузки 10 масс.% покрытые хитозаном нанокапсулы имели размер до 100 нм, но оставались неизменными по дисперсности и заряду поверхности. Таким образом, их стабильно получали с содержанием загрузки без осаждения.

Как можно понять из данных приведенной ниже таблицы 2, ретинилпальмитат может быть загружен в качестве активного агента в содержании до 20 масс.%, поскольку нанокапсулы, хотя и увеличивались в размере, не сильно различались с точки зрения дисперсности и заряда поверхности при содержании загрузки.

Что касается токоферила ацетата (ТА (от англ. - tocopheryl acetate)), его оптимальное содержание загрузки составляло до 2 масс.%, при этом осаждение не происходило до 5 масс.%. Таким образом, можно получать покрытые хитозаном нанокапсулы размером 90 нм с загруженным в них лекарственным средством.

Пример 3-4. Получение покрытой хитозаном нанокапсулы, содержащей загруженные в нее миноксидил и финастерид

Как можно видеть на фиг. 11, миноксидил (MX (от англ. - minoxidil)) не оказывал существенного влияния на размер, дисперсность и заряд поверхности покрытых хитозаном нанокапсул до тех пор, пока его содержание загрузки не достигало 5 масс. %, и, таким образом, его можно было необязательно загружать в покрытые хитозаном нанокапсулы.

Кроме того, финастерид (FS (от англ. - finasteride)) мог быть оптимально загружен в содержании до 0,1 масс.% и не вызывал осаждения в содержании до 2 масс.%, что позволяло получать покрытые хитозаном микрокапсулы размером до 4 мкм. Кроме того, покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие загруженное в них лекарственное средство в количестве 5 масс.%, сильно отличались с точки зрения дисперсности и заряда поверхности от покрытых хитозаном нанокапсул, не содержащих загруженные в них лекарственные средства. Таким образом, оптимальное условие получения составляло до 0,1 масс.%. Для применения при местной доставке посредством микрокапсул лекарственное средство можно было загружать в содержании до 2 масс.%.

Как указано выше, установили условия получения покрытых хитозаном нанокапсул размером 100 нм или меньше, в которые были загружены нерастворимые (жирорастворимые) активные агенты в содержании, варьирующем от 0,1 масс.% до 20 масс.%. Следовательно, их можно применять для оптимизации условий получения покрытых хитозаном нанокапсул, в которых были загружены активные агенты, такие как тетрадрин, астаксантин, куркумин, аскорбилпальмитат, сложный фенетиловый эфир кофеиновой кислоты (САРЕ), Centella asiatica, бета-ситостерол, аскорбилтетраизопальмитат, тетрапептидный коллаген и т.д.

Пример 4. Условия получения покрытой хитозаном нанокапсулы, содержащей загруженный в нее растворимый в воде активный агент

В соответствии с настоящим раскрытием устанавливали условия получения покрытых хитозаном нанокапсул, в которые были загружены растворимые в воде лекарственные средства, включающие в себя противораковые средства (доксорубицин), иммуногены (овальбумин), белки в качестве терапевтических средств и лекарственные препараты (бычий сывороточный альбумин, БСА).

Раствор 20 мг плюроника F127 в 1 мл ацетона подвергали реагированию в течение 2 часов. Затем реакционный раствор медленно каплям добавляли к 4 мл деионизированной воды при перемешивании при 400 оборотах в минуту с получением полимерных наночастиц, из которых удаляли ацетон в течение 6 часов под вытяжным шкафом. В конце добавляли 20 мг хитозана (деацетилирование 90%, молекулярная масса 10 кДа) к полимерным наночастицам и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов с получением покрытых хитозаном нанокапсул.

Растворимое в воде лекарственное средство (доксорубицин, БСА или овальбумин) добавляли к полученным таким образом покрытым хитозаном нанокапсулам, а затем инкубировали при 4°С в течение 2 часов. Лекарственные средства, которые оставались незагруженными, удаляли путем ультрафильтрации (фильтр Amicon Ultra-15) с последующей оптимизацией условий загрузки.

Незагруженные лекарственные средства анализировали с помощью абсорбции (480 нм) для доксорубицина и с помощью абсорбции (580 нм) посредством анализа с кумасси синим для БСА и овальбумина.

Покрытые хитозаном нанокапсулы (ChiNC 10K), содержащие загруженные в них растворимые в воде лекарственные средства, анализировали на предмет размера, дисперсности и заряда поверхности с помощью электрофоретического светорассеивающего спектрофотометра (ELS-Z2, Otsuka).

Пример 4-1. Получение покрытой хитозаном нанокапсулы, содержащей загруженный в нее доксорубицин

В отличие от жирорастворимых лекарственных средств, растворимые в воде лекарственные средства загружали при низкой температуре (4°С) с использованием чувствительных к температуре характеристик покрытых хитозаном нанокапсул (расширение объема до размера 1 мкм при 4°С), как показано на фиг. 12.

Покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие загруженный в них доксорубицин (DOX (от англ. - doxorubicin)), были подобны друг другу с точки зрения размера, дисперсности и заряда поверхности, как показано на фиг. 13. В частности, лекарственное средство можно было стабильно загружать в содержании до 10 масс.%. Хотя это не показано на фиг. 13, микрокапсулы могут быть сформированы даже при содержании загрузки 20 масс.%.

Оптимальное содержание загрузки составляло 6 масс.%, как было измерено с помощью анализа абсорбции.

Пример 4-2. Получение покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженный в них овальбумин

Как показано на фиг. 14, покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие загруженный в них овальбумин (OVA (от англ. - ovalbumin)), были похожи между собой по размеру, дисперсности и заряду поверхности без осаждения до содержания загрузки 5 масс.%. Анализ абсорбции показывал, что содержание загрузки 3 масс.% было оптимальным.

Пример 4-3. Получение покрытой хитозаном нанокапсулы, содержащей загруженный в нее бычий сывороточный альбумин (БСА)

Как показано на фиг. 15, покрытые хитозаном нанокапсулы были подобными по размеру, дисперсности и заряду поверхности до тех пор, пока БСА (67 кДа), который является модельным лекарственным средством для различных белков в качестве терапевтических средств, не был загружен с содержанием до 5 масс.%. Нанокапсулы обеспечивают стабильную загрузку в них лекарственного средства без осаждения. Оптимальное содержание загрузки составляло 4 масс.%, как измерено с помощью анализа абсорбции.

Как указано выше, устанавливали условия получения покрытых хитозаном нанокапсул размером 100 нм или меньше, в которые были загружены растворимые в воде активные агенты с содержанием, варьирующим от 0,1 масс.% до 20 масс.%. Соответственно, они могут быть применены для оптимизации условий получения покрытых хитозаном нанокапсул, в которые были загружены активные агенты, такие как фосфолипаза А2 (PLA2), основной фактор роста фибробластов (b-FGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и т.д.

Пример 5. Стабильность состава покрытой хитозаном нанокапсулы, содержащей загруженное в нее лекарственное средство

Пример 5-1. Стабильность состава покрытой хитозаном нанокапсулы, содержащей загруженное в нее лекарственное средство

На основе установленных способа и условия получения покрытых хитозаном нанокапсул в примере 4 получали покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие загруженные в них лекарственные средства, при этом нерастворимый циклоспорин A (CsA) использовали в качестве нерастворимого лекарственного средства, а общедоступные лекарственные средства нильский красный и пирен использовали в качестве модельных нерастворимых лекарственных средств.

Вместе с 10 мг плюроника F126 0,2 мг или 0,5 мг CsA, нильского красного или пирена добавляли к 1 мл ацетона и смешивали при комнатной температуре в течение 2 часов с получением реакционной смеси, которую затем медленно добавляли каплями к 4 мл деионизированной воды при перемешивании при 530 оборотах в минуту. Перемешивание продолжали в течение 4 часов под вытяжным шкафом для обеспечения произвольного выпаривания ацетона. После удаления ацетона наночастицы, состоящие из плюроника, в деионизированной воде смешивали с такой же массой хитозана 10 кДа, что и масса плюроника, с получением покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них лекарственные средства (CsA@ChiNC, нильский красный@ChiNC и пирен@ChiNC, соответственно). CsA@ChiNC, нильский красный@ChiNC и пирен@ChiNC анализировали на предмет стабильности путем мониторинга осаждения при отстаивании их при комнатной температуре. Результат приведен на фиг. 16.

Как можно видеть на фиг. 16, никакие из CsA@ChiNC, нильский красный@ChiNC и пирен@ChiNC не осаждались.

Из данных понятно, что покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие загруженные в них лекарственные средства в соответствии с настоящим раскрытием, являются стабильными сточки зрения состава.

Пример 5-2. Стабильность к лиофилизации покрытой хитозаном нанокапсулы, содержащей загруженное в нее лекарственное средство

Состав покрытой хитозаном нанокапсулы анализировали на предмет стабильности, особенно стабильности в деионизированной воде и фосфатно-солевом буферном растворе ФСБ, до и после лиофилизации.

На фиг. 17 показана стабильность покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них циклоспорин А и ретинилпальмитат (RP), как измерено при условиях 37°С и 100 оборотах в минуту. Как можно видеть, аналогичные размеры выявляли как в деионизированной воде, так и в ФСБ через 4 недели, что говорит о том, что нанокапсулы можно стабильно поддерживать.

Также подтверждали высокую стабильность покрытых хитозаном нанокапсул, поскольку наблюдали, что они не претерпевают ни изменений размера, ни осаждения до и после лиофилизации (до сушки замораживанием СЗ или Д.З. (до сушки замораживанием) и после СЗ или П.З. (после сушки замораживанием)). В частности, нанокапсулы легко ресуспендировать даже в отсутствие криопротектора в ходе лиофилизации.

Пример 6. Эффект чрескожной доставки лекарственного средства покрытой хитозаном нанокапсулы, содержащей загруженное в нее лекарственное средство

Составы для чрескожной доставки лекарственных средств или активных ингредиентов всегда были предметами, вызывающими повышенный интерес в фармацевтической и косметической областях. Покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие загруженные в них лекарственные средства в соответствии с настоящим раскрытием, анализировали на предмет эффективности доставки лекарственного средства.

Пример 6-1. Оптимизация типа хитозана для проникновения в кожу с помощью системы диффузионных ячеек Франца

В примере 1-3 выяснили, что покрытые хитозаном наночастицы с молекулярной массой 20 кДа или меньше (ChiNC 3K, ChiNC 10K и ChiNC 20K) стабильно образуют наночастицы хитозана размером 100 нм или меньше. Чтобы определить, какие покрытые хитозаном наночастицы оптимизированы для проницаемости через кожу, использовали систему диффузионных ячеек Франца.

В системе диффузионных ячеек Франца состав, включающий в себя лекарственное средство, вносили в донорскую камеру, в то время как принимающую камеру заполняли физиологическим раствором, таким как ФСБ (фосфатно-солевой буферный раствор), с проницаемым слоем, таким как проницаемая мембрана, кожа животного или культура клеток кожи, зафиксированным между донорской камерой и принимающей камерой. Проницаемость через кожу можно определять путем измерения количества лекарственного средства, диффундирующего из донорской камеры в принимающую камеру.

В системе диффузионных ячеек Франца 5 мл ФСБ (рН 7,4, содержащего 0,05% полисорбата 80) добавляли в принимающую камеру, кожу трупа человека размером 1,5 × 1,5 см фиксировали между принимающей камерой и донорской камерой и каждый образец помещали в донорскую камеру. В принимающей камере устанавливали условия 37°С и 600 оборотов в минуту и извлекали по 500 мкл образца в моменты времени отбора образцов 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 18 и 24 часа. Определяли количество лекарственного средства, проходящего через кожу, в зависимости от времени с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ. Результаты показаны на фиг. 18.

Как показано на фиг. 18, CsA показал самую высокую проницаемость через кожу при нанесении покрытых хитозаном нанокапсул, полученных из хитозана 10 кДа (ChiNC 10K). Статистически значимое отличие от хитозана 3 кДа оценивали как результат более высокого заряда поверхности у ChiNC 10K, чем у ChiNC 3K, как показано на фиг. 3.

Нанокапсулы с хитозаном (ChiNC 10K), полученные из хитозана 10 кДа, существенно повышали проницаемость через кожу по сравнению с полимерными капсулами без покрытия хитозаном (PluNC) и обеспечивали проницаемость через кожу, в шесть или более раз превосходящую таковую наиболее часто используемого липосомного состава.

В результате оценивания применения RP в качестве лекарственного средства RP демонстрировал в 14 или более раз более высокую проницаемость кожи при загрузке до оптимального состояния ChiNC 10K, чем при тестировании RP самого по себе в качестве контроля, что говорит о том, что хитозан 10 кДа может улучшить проницаемость лекарственных средств через кожу.

Пример 6-2. Измерение проницаемости через кожу покрытой хитозаном нанокапсулы с использованием системы диффузионных ячеек Франца

Проницаемость через кожу нанокапсул и покрытых хитозаном нанокапсул измеряли с использованием системы диффузионных ячеек Франца таким же образом, как в примере 6-1.

В донорскую камеру добавляли покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие 2 масс.% нильского красного (нильский Красный@ChiNC) в количестве 2 мг/мл. В качестве контроля использовали нильский красный отдельно или содержащие нильский красный нанокапсулы без покрытия хитозаном (нильский Красный@PluNC). После того, как для принимающей камеры устанавливали условия 37°С и 600 оборотов в минуту, из принимающей камеры отбирали по 500 мкл образца в моменты времени отбора образцов 0,5, 1,2,3, 8, 12 и 24 часа. Измеряли флуоресценцию в образцах, отобранных в предварительно определенные моменты времени. Результаты показаны на фиг. 19.

Как показано на фиг. 19, нильский красный отдельно почти не проникал через кожу, тогда как проницаемость через кожу повышалась при применении нильский красный @PluNC и нильский красный @ChiNC. В частности, нильский красный @ChiNC повышает проницаемость через кожу в четыре или более раз по сравнению с нильский красный @PluNC.

Результаты демонстрируют превосходную проницаемость через кожу покрытых хитозаном нанокапсул, содержащих загруженные в них лекарственные средства в соответствии с настоящим раскрытием.

Пример 7. Чрескожная доставка на животной модели

Пример 7-1. Чрескожная доставка нильского красного посредством покрытой хитозаном нанокапсулы на животной модели

Покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие 2 масс.% нильского красного (нильский красный@ChiNC), полученные в примере 4, контролировали так, чтобы они имели концентрацию 2 мг/мл, и наносили дозой 300 мкл в течение 5 суток на выбритый участок спины каждой мыши. После этого отбирали образцы кожи спины и фиксировали в течение 12 часов в 10% нейтральном формалине. Фиксированную кожу заливали средой для получения срезов при оптимальной температуре ОСТ (от англ. - optimal cutting temperature - оптимальная температура получения срезов) и мгновенно замораживали жидким азотом при -20°С или ниже с последующим разрезанием на блоки толщиной 20 мкм с помощью машины для получения замороженных срезов. Блоки прикрепляли к предметному стеклу для получения образцов кожной ткани. Их промывали деионизированной водой и под флуоресцентным микроскопом наблюдали распределение нильского красного в коже. Результаты показаны на фиг. 20.

Как показано на фиг. 20, при нанесении на кожу нильский красный@ChiNC нильский красный обнаруживали в тканях кожи.

Из данных можно понять, что покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие загруженные в них лекарственные средства в соответствии с настоящим раскрытием, могут доставлять лекарственные средства через кожу.

Пример 7-2. Эффективность лекарственного средства при чрескожной доставке

Циклоспорин А используется в качестве терапевтического средства при псориазе и атопии и, как сообщается, оказывает влияние на возобновление роста волос. Однако доставка циклоспорина А в кожу ограничена, поскольку он нерастворим в воде из-за его высокой гидрофобности. Таким образом, циклоспорин А следует растворять в органическом растворителе, таком как ацетон, перед нанесением на кожу. Однако при нанесении на кожу такой органический растворитель может раздражать кожу и вызывать потерю кожного барьера.

Таким образом, эффективное проникновение циклоспорина А в кожу без раздражения или повреждения кожи может повысить его эффективность возобновления роста волос, что обеспечивает превосходный терапевтический эффект в отношении выпадения волос. Таким образом, покрытые хитозаном нанокапсулы в соответствии с настоящим раскрытием исследовали на предмет чрескожной доставки циклоспорина А с точки зрения его эффекта возобновления роста волос.

Проводили эксперименты по возобновлению роста волос. С этой целью самкам черных мышей С57В/6 возрастом 7 недель брили спину в соответствии с рекомендациями платформы Министерства по безопасности пищевых продуктов и лекарственных средств. Бритых мышей делили на группы, получавшие обработку физиологическим раствором (контроль (CTL (от англ. - control))), циклоспорином А в ацетоне (CsA) и покрытыми хитозаном нанокапсулами, содержащими 5 масс.% циклоспорина А, полученными в примере 4 (CsA@ChiNC). Каждый образец наносили пять раз в неделю в течение 4 недель (разовая доза 50 мг/кг для CsA). Эффекты возобновления роста волос исследовали невооруженным глазом, и результаты показаны на фиг. 21.

Как показано на фиг. 21, при обработке циклоспорином А в ацетоне (CsA) у всех пяти мышей наблюдали рост шерсти на неделе 4, на которой получали максимальный эффект возобновления роста шерсти, тогда как шерсть отрастала естественным путем со скоростью менее 5% в контроле (CTL). Считали, что у группы, получавшей обработку CsA отдельно, кожные ткань и барьер были повреждены ацетоном, в котором был растворен CsA, так что лекарственное средство CsA проникало в поврежденную кожу.

Возобновление роста шерсти наблюдали у четырех из пяти мышей в группе в обрабатываемой CsA@ChiNC группе. CsA@ChiNC демонстрировал эффект возобновления роста волос на 80% по сравнению с CsA отдельно.

Кроме того, у мышей в каждой группе отбирали образцы кожи спины и анализировали на предмет количества и размера фолликулов, и результаты представлены на фиг. 21 (b) и (с).

Как показано на фиг. 21 (b) и (с), одинаковое количество и размер волосяных фолликулов выявляли у групп, получавших CsA в ацетоне (D) и CsA@ChiNC (С).

Данные показывают, что покрытые хитозаном нанокапсулы, содержащие загруженные в них лекарственные средства в соответствии с настоящим раскрытием, превосходны с точки зрения проницаемости через кожу и эффективности чрескожной доставки лекарственных средств и могут быть использованы в качестве технологии платформы для переноса нерастворимых лекарственных средств в организмы человека и животных.

Пример 8. Повышение биодоступности активного ингредиента с помощью перорального введения нанокапсулы

Нанокапсулы, содержащие загруженный в них циклоспорин A (CsA), перорально вводили самцам крыс Sprague-Dawley (200-250 г). С этой целью вводили нанокапсулы, содержащие загруженный в них CsA при 5 масс. % (1 мл деионизированной воды, 50 мг/кг), с использованием иглы для кормления. Отбирали образцы крови через 2, 4, 6, 8, 12 и 24 часа после введения и количественно анализировали с помощью ВЭЖХ.

Время полужизни в крови и биодоступность CsA повышались в группе, обрабатываемой покрытыми хитозаном нанокапсулами, по сравнению с группой, обрабатываемой нанокапсулами без хитозана.

Кроме того, для применения в эксперименте по возобновлению роста волос самкам черных мышей С57В/6 возрастом 7 недель брили спину в соответствии с рекомендациями платформы Министерства по безопасности пищевых продуктов и лекарственных средств, как в примере 7. Перорально вводили растворы CsA и CsA@ChiNC три раза в неделю в течение 4 недель, как раскрывается выше. Более высокие эффекты возобновления роста волос наблюдали в группе, которой вводили CsA@ChiNC, по сравнению с группой, которой вводили CsA. Считали, что этот результат связан с улучшенной биодоступностью покрытых хитозаном нанокапсул, что демонстрирует то, что система доставки лекарственного средства с использованием покрытых хитозаном нанокапсул в соответствии с настоящим раскрытием обладает превосходным эффектом доставки лекарственного средства.

1. Нанокапсула, имеющая размер 30-100 нм, в которой наночастица, имеющая размер 5-50 нм и содержащая лекарственное средство и плюроник, покрыта хитозаном, имеющим молекулярную массу 3-20 кДа,

при этом лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из паклитаксела, доцетаксела, тетрадрина, циклоспорина А, дексаметазона, токоферила ацетата, астаксантина, куркумина, аскорбилпальмитата, сложного фенетилового эфира кофеиновой кислоты (САРЕ), ретинилпальмитата, миноксидила, финастерида, Centella asiatica, бета-ситостерола, аскорбилтетраизопальмитата, трипептидного коллагена, доксорубицина, фосфолипазы А2 (PLA2), овальбумина, бычьего сывороточного альбумина, основного фактора роста фибробластов (b-FGF) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), и

при этом нанокапсула представляет собой препарат для наружного применения на коже и получена способом, включающим

первую стадию получения реакционного раствора путем растворения лекарственного средства и плюроника со значением гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) от 8 до 29 в органическом растворителе и осуществления их реагирования при комнатной температуре;

вторую стадию получения наночастицы, имеющей размер 5-50 нм, путем добавления каплями реакционного раствора из первой стадии в дистиллированную воду в соответствии с наноосаждением при непрерывном их перемешивании, и удаления органического растворителя из реакционного раствора путем естественного выпаривания; и

третью стадию покрытия наночастицы из второй стадии хитозаном путем добавления к ней хитозана с молекулярной массой 3-20 кДа в дистиллированной воде и перемешивания.

2. Нанокапсула по п. 1, где лекарственное средство применяется в количестве от более чем 0 массовых долей до 20 массовых долей на 100 массовых долей плюроника.

3. Нанокапсула по п. 1, где плюроник представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из плюроника L35, плюроника L43, плюроника L44, плюроника L64, плюроника F68, плюроника Р84, плюроника Р85, плюроника F87, плюроника F88, плюроника F98, плюроника Р103, плюроника Р104, плюроника Р105, плюроника F108, плюроника Р123 и плюроника F127.

4. Нанокапсула по п. 1, где хитозан применяется в количестве 0,001-200 массовых долей на 100 массовых долей плюроника.

5. Нанокапсула по п. 1, где органический растворитель на первой стадии представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из ацетона, диметилсульфоксида (ДМСО), этанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана, хлороформа и дихлорметана.

6. Нанокапсула по п. 1, где объем дистиллированной воды на второй стадии в 4 раза превышает объем органического растворителя на первой стадии.

7. Система доставки лекарственного средства, содержащая нанокапсулу по п. 1.

8. Косметическая композиция, содержащая нанокапсулу по п. 1.

9. Композиция для медицинского устройства, содержащая нанокапсулу по п. 1, причем медицинское устройство выбрано из группы, состоящей из покрывающего рану средства и средства для эмболизации.