Способ определения антиэритроцитарных аллоантител у больных множественной миеломой

Изобретение относится к медицине, и в частности к гематологии, а именно к лечению больных множественной миеломой, получающих лечение лекарственным препаратом Даратумумаб. Способ определения антиэритроцитарных аллоантител у больных множественной миеломой в непрямом антиглобулиновом тесте с использованием предварительной обработки тест-эритроцитов включает предварительную обработку, которую проводят с помощью моноклональных антител анти-CD38 (F(ab')2), взятых в объемном соотношении к пробе, равном 1:5. Изобретение обеспечивает повышение достоверности оценки скрининга аллоантител. 2 пр.

 

Заявляемое изобретение относится к медицине, и в частности к гематологии, а именно к лечению больных множественной миеломой (ММ), получающих лечение лекарственным препаратом Даратумумаб. Оно может найти применение в гематологической практике.

Препарат Даратумумаб (международное непатентованное название) представляет собой человеческое моноклональное антитело к белку CD38 класса IgG. У больных ММ плазматические клетки (злокачественные клоны) экспрессируют большое количество белка молекул CD38, и лечение направлено на выведение этих злокачественных клеток.

Лекарственные препараты на основе моноклональных анти-CD38 антител внедрены в клиническую практику терапии ММ, что значительно улучшило результаты лечения больных множественной миеломой. Однако применение указанного препарата внесло ряд ранее неизвестных проблем при проведении предтрансфузионных тестов.

При комплексном лечении больного с ММ одним из видов терапии является переливание эритроцитарной взвеси (гемокомпонентная терапия). В связи с этим обязательным исследованием является скрининг антиэритроцитарных аллоантител, и его проведение регламентировано руководящими документами. Скрининг аллоантител позволяет выявить у реципиента (больного) аллоантитела, имеющие клиническое значение. Переливание реципиенту донорских эритроцитов, имеющих антиген, к которому у реципиента есть аллоантитела, приведет к развитию у реципиента посттрансфузионного осложнения гемолитического типа. Тяжесть посттрансфузионного осложнения будет зависеть от специфичности и титра антител и своевременно оказанной медицинской помощи. Такие осложнения могут привести к инвалидизации и даже летальному исходу.

Терапия лекарственными препаратами анти-CD38 сопровождается связыванием не только с патологическими клетками, но и с другими клетками, экспрессирующими CD38. Однако лекарственные препараты на основе анти-CD38 моноклональных антител затрудняют интерпретацию скрининга и идентификации аллоантител в непрямом антиглобулиновом тесте (НАГТ), поскольку вызывают панреактивность in vitro, что приводит к получению ложноположительных результатов, препятствующих проведению дальнейшего лечения больного (гемокомпонентной терапии).

Ложноположительный результат приводит к тому, что донорские гемокомпоненты оказываются несовместимыми с реципиентом. Ложноположительные результаты в НАГТ, затрудняющие интерпретацию результатов скрининга аллоантител у таких больных, могут быть получены в течение 6 месяцев после прекращения лечения данными препаратами.

Известен способ определения антиэритроцитарных аллоантител у больных множественной миеломой, получающих лечение Даратумумабом [Chapui C.I.., Nicholson R.T., Aguad M.D. et al.Transfusion 2015; 55(6(pt)2); 1545-1554; Chapui C.I., Aguad M.D., Nicholson R.T. et al. Blood 2015; 126 (Suppl): Abstract 3567], включающий обработку тест-эритроцитов, используемых для скрининга и идентификации антител, дитиотреитолом, денатурирующим белки и фрагменты рецепторов CD38, расположенные на поверхности эритроцитов. Подготовка контрольных образцов заключается в обработке донорских К⁺ эритроцитов дитиотреитолом, инкубации и центрифугировании. Если антигены денатурированы не полностью, то процедура обработки повторяется до тех пор, пока антиген полностью не денатурирует.

Дитиотреитол токсичен, и работа с ним требует особых предосторожностей. Известный способ трудоемок и продолжителен (определение занимает 3-3,5 часа). Однако обработка тест-эритроцитов дитиотреитолом, кроме трудоемкости и продолжительности, имеет существенный недостаток - она нарушает целостность эритроцитов, вызывая денатурацию антигенов систем Kell, Dombrock, Yt и Lutheran, в силу чего определить наличие аллоантител к этим антигенам не представляется возможным.

Целью заявляемого изобретения, кроме сокращения продолжительности процесса, является повышение достоверности оценки скрининга аллоантител и установления специфичности аллоантител у больных ММ, получающих терапию лекарственным препаратом Даратумумаб.

Указанный результат достигается тем, что в способе определения аллоиммунных антиэритроцитарных антител у больных множественной миеломой в непрямом антиглобулиновом тесте с использованием предварительной обработки тест-эритроцитов предварительную обработку проводят с помощью моноклональных антител анти-CD38 (F(ab')2), взятых в объемном соотношении к пробе, равном 1:5. Обработка моноклональных антител анти-CD38 (F(ab')2) не нарушает целостность антигенов эритроцитов, позволяя обнаруживать в НАГТ клинически значимые антитела к антигенам всех систем групп крови эритроцитов, что является несомненным преимуществом в сравнении с общепринятой технологией обработки дитиотреитолом.

Известно использование диагностического реагента - моноклональных антител CD38(F(ab')2) - для типирования антигенов на лейкоцитах [Кудрявцева И.В., Борисов А.Г и др. Росс. Иммунологический журнал, 2015, 9(18), №2, С. 42-47]. Эритроциты не несут молекул CD38, и нам не известно использование моноклональных антител CD38(F(ab')2) для типирования антигенов эритроцитов.

Указанная обработка проводится непосредственно в пробирке (микропробирке) - по 50 мкл тест-эритроцитов (тесты I-II-III панели для скрининга антиэритроцитарных антител) и 10 мкл моноклональных антител CD38 (F(ab')2) помещают в каждую микропробирку. Инкубация проводится в течение 10 мин при температуре+37°С.На этом этапе происходит нейтрализация белков и фрагментов рецепторов CD38.

Далее в этих же микропробирках проводится непрямой антиглобулиновый тест в классической постановке [Минеева Н.В. Группы крови. Основы иммуногематологии, Санкт-Петербург, А-Принт, 2007, 186 с.]: в каждую микропробирку с обработанными тест-эритроцитами добавляется по 25 мкл сыворотки больного, инкубируется 15 мин при температуре +37°С с последующим центрифугированием в течение 10 мин (1000g). Результат оценивается по наличию или отсутствию агглютинации.

При получении положительного результата скрининга (антитела выявлены) необходимо установить специфичность антител, то есть определить, против какого именно антигена направлены антитела (идентификация антител). Идентификация антиэритроцитарных аллоантител проводится с помощью НАГТ с использованием расширенной панели тест-эритроцитов, представленной не менее чем одиннадцатью образцами эритроцитов с различными фенотипами. Указанная обработка проводится непосредственно в пробирке (микропробирке): по 50 мкл тест-эритроцитов (1-11-панель для идентификации антиэритроцитарных антител) и 10 мкл моноклональных антител CD38 (F(ab')2) помещают в каждую микропробирку. Инкубация проводится в течение 10 мин при температуре +37°С с последующим центрифугированием и интерпретацией результата.

Далее способ иллюстрируется примерами конкретного воплощения.

Пример 1

Больной Г. с диагнозом множественная миелома получает терапию лекарственным препаратом Даратумумаб. По клиническим показаниям пациенту назначена трансфузия эритроцитной массы.

При проведении скрининга антиэритроцитарных аллоантител в НАГТ наблюдается агглютинация разной силы реакции (от 1+ до 3+). Сделать заключение о наличии или отсутствии антител, имеющих клиническое значение, невозможно.

Была проведена обработка тест-эритроцитов, используемых для скрининга, моноклональными антителами CD38(F(ab')2). Обработка моноклональными антителами CD38(F(ab')2) устранила неспецифическое связывание тест-эритроцитов. Повторное проведение скрининга показало отсутствие аллоиммунных антител у пациента. Трансфузия эритроцитарной массы успешно проведена.

Реакций и осложнений во время и после трансфузий зарегистрировано не было.

Пример 2

Больная В. с диагнозом множественная миелома получает терапию лекарственным препаратом Даратумумаб. По клиническим показаниям пациентке назначена трансфузия эритроцитной массы.

При проведении скрининга антиэритроцитарных аллоантител в НАГТ наблюдается агглютинация разной силы реакции (от 1+ до 3+). Сделать заключение о наличии или отсутствии антител, имеющих клиническое значение, было невозможно.

Обработка тест-эритроцитов для скрининга моноклональными антителами CD38(F(ab')2) устранила неспецифическое связывание, и при повторном проведении скрининга агглютинация наблюдалась в I и II пробирках, что позволило сделать заключение о наличие клинически значимых антител. В результате идентификации антител с обработанной расширенной панелью тест-эритроцитов была установлена специфичность аллоантител анти-D. Для такого пациента необходим индивидуальный подбор донорской эритроцитарной массы.

На подбор были доставлены 3 дозы эритроцитов, не имеющие антигенов, к которому у реципиента есть аллоантитела. С двумя из трех необработанных образцов эритроцитов доноров пробы плазмы реципиента были несовместимы. После обработки моноклональными антителами к CD38 все образцы донорских эритроцитов были совместимы с плазмой реципиента.

Реакций и осложнений во время и после трансфузий зарегистрировано не было.

Как видно из приведенных данных, обработка тест-эритроцитов для скрининга и идентификации антител диагностическим реагентом «моноклональное антитело анти-CD38 (F(ab')2)» позволяет нейтрализовать неспецифическую агглютинацию в образцах плазмы, содержащей лекарственный препарат Даратумумаб, что дает возможность достоверно определить специфичность клинически значимых антиэритроцитарных аллоиммунных антител. Более того, указанный способ обработки сохраняет целостность антигенов эритроцитов, позволяя обнаруживать в НАГТ клинически значимые антитела к антигенам всех систем групп крови эритроцитов, что имеет важное клиническое значение и является несомненным преимуществом заявляемого способа.

Способ определения антиэритроцитарных аллоантител у больных множественной миеломой в непрямом антиглобулиновом тесте с использованием предварительной обработки тест-эритроцитов, отличающийся тем, что предварительную обработку проводят с помощью моноклональных антител анти-CD38 (F(ab')2), взятых в объемном соотношении к пробе, равном 1:5.