Производное полипептида и способ его получения

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым производным пептидов с увеличенным периодом полувыведения из организма субъекта, и может быть применимо в медицине. Изобретение раскрывает ацилированное по аминокислотному остатку лизина производное полипептида, выбираемого из группы, состоящей из: инсулина, глюкагоноподобного пептида-1, паратиреоидного гормона, и их комбинаций. Экспериментальные результаты показывают, что указанное производное полипептида характеризуется существенно увеличенным периодом полувыведения, сохраняя при этом свою биологическую активность. Изобретение может быть использовано при лечении остеопороза, диабета и гипергликемии. 7 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 10 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биомедицины и, в частности, к производному полипептида и к способу его получения.

Уровень техники

По результатам фармакокинетических исследований было установлено, что выведение in vivo лекарственных препаратов на основе полипептидов/белков осуществляется, в основном, через механизмы распада, экскреции, опосредуемого рецепторами эндоцитоза и т.д. Полипептидные факторы с молекулярной массой менее 20 кДа без труда отфильтровываются гломерулами в процессе метаболизма; во время прохождения через почечные канальцы они частично распадаются под воздействием протеаз и выводятся с мочой, что обусловливает их короткий период полувыведения. Возьмем, к примеру, ГПП-1; в общем случае, продолжительность его биологического периода полувыведения in vivo составляет 20 минут. Часто для получения терапевтического эффекта требуется применение лекарственных средств в высоких дозах. Длительные и частые инъекции не только увеличивают страдания пациентов и стоимость лечения, но также часто являются причиной возникновения ряда серьезных побочных эффектов. Важной тенденцией в процессе вспомогательной разработки первого поколения генно-инженерных лекарственных препаратов на основе полипептидов/белков стало стремление к созданию полипептидных/белковых препаратов пролонгированного действия. В настоящее время пролонгирование периода полувыведения белковых препаратов, в основном, достигается двумя способами. С одной стороны, это - увеличение молекулярной массы белкового препарата для снижения скорости клубочковой фильтрации и иммуногенности гетерологичных белков, что позволяет снизить их почечный клиренс in vivo. С другой стороны, используется способ непрерывного и медленного высвобождения действующего вещества для поддержания его концентрации на постоянном уровне и, следовательно, пролонгирования его времени действия. В состав обычно используемых методов входят следующие операции: приготовление веществ замедленного высвобождения, конструирование мутантов, химическое модифицирование и слияние генов и т.д.

Таким образом, в настоящем изобретении период полувыведения белков или полипептидов, находящихся в крови, может быть пролонгирован за счет модификации жирных кислот крови и обеспечения наличия нековалентной связи между жирной кислотой и альбумином.

Сущность изобретения

Цель настоящего изобретения - создать новое производное полипептида, которое характеризовалось бы более длительным действием.

Первый объект настоящего изобретения касается получения производного полипептида, содержащего следующее:

(a) полипептид; и

(b) модифицированную группу L, связанную с сайтом лизина полипептида, как показано в Формуле I,

где волнистая линия обозначает связь с сайтом лизина, am целое число из диапазона 0-8; а, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n - целое число из диапазона от 14 до 16.

В другом предпочтительном варианте осуществления группа L выбирается из группы, состоящей из следующих элементов:

В еще одном предпочтительном варианте осуществления полипептид выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: один из инсулинов, ГПП-1, ПТГ, а также комбинации указанных элементов.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: одно из производных инсулина, одно из производных ГПП-1, одно из производных ПТГ, а также комбинации указанных элементов.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 4, 5 или 6.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ГПП-1 имеет последовательность, показанную в любом из SEQ ID NO: 7-9.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ПТГ имеет

последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида имеет структуру, показанную ниже, где является инсулином, ГПП-1 или ПТГ:

где m целое число из диапазона 0-8; а, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n целое число из диапазона от 14 до 16.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов:

где является инсулином, ГПП-1 или ПТГ.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: L0-CFA16-полипептид, L2-CFA16-полипептид, L3-CFA16-полипептид, L4-GFA16-полипептид, L5-CFA16-полипептид или L6-GFA16-полипептид.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления L0-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где является полипептидом:

В еще одном предпочтительном варианте осуществления L2-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где является полипептидом:

В еще одном предпочтительном варианте осуществления L3-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где является полипептидом:

В еще одном предпочтительном варианте осуществления L4-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где является полипептидом:

В еще одном предпочтительном варианте осуществления L5-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где является полипептидом:

В еще одном предпочтительном варианте осуществления L6-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где является полипептидом:

В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит цепь А и цепь В.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит человеческий инсулин или животный инсулин; и, предпочтительно, человеческий инсулин.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления животный инсулин содержит свиной инсулин и бычий инсулин.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А и цепь В инсулина, кроме того, содержат одну или более одной дисульфидных связей.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит естественный инсулин, предшественник инсулина или один из вариантов инсулина.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное инсулина содержит предшественник инсулина и модифицированную группу L.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 4, 5 или 6.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, и цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 5 или 6.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, и цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4 или 6.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с сайтом лизина (K).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с ε-амино группой лизина (K).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит мотив РК, DKT, РКТ или КРТ, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит мотив ТРК, ТКР или TDK, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит мотив YTPK, YTDKT, YTPKT или YTKPT, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L связана с 28-м или 29-м лизином (K) цепи В.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с 29-м лизином (K) последовательности, как показано в SEQ ID NO: 3, 4 или 6.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 4 или 6, и модифицированная группа L связана с 29-м лизином (K) последовательности, как показано в SEQ ID NO: 3, 4 или 6.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5, и модифицированная группа L связана с 28-м лизином (K) последовательности, как показано в SEQ ID NO: 5.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное инсулина выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: L0-GFA16-инсулин, L2-GFA16-инсулин, L3-GFA16-инсулин, L4-GFA16-инсулин, L5-GFA16-инсулин или Ь6-GFA16-инсулин.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное ГПП-1 содержит аналог ГПП-1 и модифицированную группу L.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ГПП-1 имеет последовательность, показанную в любом из SEQ ID NO: 7-9.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с сайтом лизина (K).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с ε-амино группой лизина (K).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ГПП-1 содержит мотив АКБ, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ГПП-1 содержит мотив AAKEF, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L связана с 20-м или 26-м лизином (K) цепи.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное ГПП-1 выбирается из группы, состоящей из следующих компонентов: L0-GFA16-GLP-1, L2-GFA16-GLP-1, L3-GFA16-GLP-1, L4-GFA16-GLP-1, L5-GFA16-GLP-1 или L6-GFA16-GLP-1.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное ПТГ содержит аналог ПТГ и модифицированную группу L.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ПТГ имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с сайтом лизина (K).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с ε-амино группой лизина (K).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ПТГ содержит мотив RKR, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ПТГ содержит мотив LRKRL, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L связана с 26-м лизином (K) ПТГ.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное ПТГ выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: L0-GFA16-ПТГ, L2-GFA16-ПТГ, L3-GFA16-ПТГ, L4-GFA16-ПТГ, L5-GFA16-ПТГ или L6-GFA16-ПТГ.

Второй объект настоящего изобретения касается фармацевтической композиции, содержащей производное полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения, а также фармацевтически приемлемый носитель.

Третий объект настоящего изобретения касается использования производного полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения, для получения лекарств или препаратов для профилактики и/или лечения остеопороза, диабета, гипергликемии и других заболеваний, при которых снижение уровня глюкозы в крови дает положительный эффект.

Четвертый объект настоящего изобретения касается способа получения производного полипептида; указанный способ содержит следующие этапы:

(1) в присутствии лизина группы X, пирролизил-тРНК-синтетазы и связанной с ней гомологичной тРНК культивируют штамм, содержащий кодирующую последовательность инсулина, где кодирующая последовательность полипептида в составе указанной кодирующей последовательности заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина) и, следовательно, продуцирует производное полипептида, содержащее следующие компоненты:

(a) полипептидную цепь; и

(b) модифицированную группу L, связанную с сайтом лизина полипептида, причем модифицированная группа L представляет собой группу X, как определено в первом объекте настоящего изобретения; и, необязательно,

(2) отделяют производное полипептида от продуктов ферментации.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления полипептид выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: один из инсулинов, ГПП-1, ПТГ, а также комбинации указанных элементов.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: одно из производных инсулина, одно из производных ГПП-1, одно из производных ПТГ, а также комбинации указанных элементов.

Пятый объект настоящего изобретения касается способа получения производного полипептида; указанный способ содержит следующие этапы:

(1) в присутствии соединения согласно Формуле III, пирролизил-тРНК-синтетазы и связанной с ней гомологичной тРНК культивируют штамм, содержащий кодирующую последовательность полипептида, где кодирующая лизин последовательность полипептида в составе указанной кодирующей последовательности заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина) и, следовательно, продуцирует соединение согласно Формуле IV; и

(2) проводят реакцию между соединением согласно Формуле IV и соединением согласно Формуле V в инертном растворителе, обеспечивая, таким образом, получение производного полипептида,

где а, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n целое число из диапазона от 14 до 16 в Формуле V.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления полипептид выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: один из инсулинов, ГПП-1, ПТГ или комбинации указанных элементов.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: одно из производных инсулина, одно из производных ГПП-1, одно из производных ПТГ или комбинации указанных элементов.

Шестой объект настоящего изобретения касается способа получения производного полипептида, где указанный способ содержит следующие этапы:

(1) в присутствии соединения согласно Формуле VI, пирролизил-тРНК-синтетазы и связанной с ней гомологичной тРНК культивируют штамм, содержащий кодирующую последовательность полипептида, где кодирующая лизин последовательность полипептида в составе указанной кодирующей последовательности заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина) и, следовательно, продуцирует соединение согласно Формуле VII; и

(2) проводят реакцию между соединением согласно Формуле VII и соединением согласно Формуле VIII в инертном растворителе, обеспечивая, таким образом, получение производного полипептида,

где а, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n целое число из диапазона от 14 до 16 в Формуле VIII.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления полипептид выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: один из инсулинов, ГПП-1, ПТГ или комбинации указанных элементов.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: одно из производных инсулина, одно из производных ГПП-1, одно из производных ПТГ или комбинации указанных элементов.

Седьмой объект настоящего изобретения касается промежуточного соединения, в состав которого входят следующие компоненты:

(a) полипептид, представляющий собой инсулин, ГПП-1 или ПТГ; и

(b) модифицированная группа L, связанная с сайтом лизина полипептида, где модифицированная группа L представляет собой группу, соответствующую показанной в Формуле А,

где волнистая линия обозначает связь с сайтом лизина, a m - целое число из диапазона 0-8.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления промежуточное соединение имеет структуру, показанную в Формуле IV, где является инсулином, ГПП-1 или ПТГ.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления промежуточное соединение используется для получения производного полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения.

Настоящее изобретение, кроме того, предусматривает использование промежуточного соединения согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, где промежуточное соединение используется для получения производного полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения.

Следует понимать, что в пределах объема настоящего изобретения вышеупомянутые технические признаки настоящего изобретения и технические признаки, конкретно описанные ниже (например, варианты осуществления), могут быть объединены друг с другом для образования нового или предпочтительного технического решения; описание указанных признаков не будет при этом далее повторяться снова и снова вследствие ограниченного объема данного документа.

Подробное описание

После проведения обширных и интенсивных исследований изобретатели неожиданно получили производное полипептида. Экспериментальные результаты показывают, что указанное производное полипептида характеризуется существенно увеличенным периодом полувыведения, сохраняя при этом свою биологическую активность. Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает фармацевтическое использование указанного производного полипептида и его функциональность в лечении и профилактике диабета, способствовании остеогенезу костных клеток и т.д. Руководствуясь вышеизложенным, изобретатели представили настоящее изобретение.

Идеальный эффект от применения инсулина медленного действия достигается при перестройке базового уровня секреции инсулина у пациентов с диабетом с использованием как можно меньшего количества инъекций инсулина. Одним из путем получения инсулина медленного действия является химическая модификация. Химические модификаторы должны характеризоваться устойчивой структурой, нетоксичностью, неантигенностью и приемлемой молекулярной массой. Специфическая химическая модификация согласно настоящему изобретению может обеспечить продление периода полувыведения инсулинов и снизить степень их антигенности при одновременном сохранении их биологической активности. Модифицированное производное инсулина согласно данному изобретению представляет собой полимерное соединение, характеризующееся хорошей биосовместимостью и нетоксичностью по отношению к организму человека; при этом лекарственные препараты характеризуются увеличенной растворимостью в воде. Применение указанного производного может также обеспечить пониженные почечный клиренс / скорость клубочковой фильтрации и увеличение периода полувыведения лекарственных препаратов при их циркуляции in vivo, что в конечном итоге обеспечивает их пролонгированное действие. Инсулины, ГПП-1 и ПТГ белки, содержащие бутинилоксикарбонил-лизин согласно настоящему изобретению, связываются с ацильными соединениями жирных кислот путем проведения клик-реакции для получения серий производных ГПП-1 и производных ПТГ со значительно пролонгированными периодами полувыведения.

Термины

Перед представлением описания настоящего изобретения необходимо указать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными способами и экспериментальными условиями вследствие высокой степени вариабельности указанных способов и условий. Необходимо также понимать, что термины, использованные в данном документе, предназначены лишь для описания конкретных вариантов осуществления, а не ограничения объема настоящего изобретения, который ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения.

При использовании в данном документе термин «около» может относиться к варьированию значения не более чем на 1% по отношению к конкретно приведенному значению. Например, в контексте данного документа, выражение «около 100» включает в себя все значения от 99 до 101 (например, 99,1; 99,2; 99,3; 99,4 и т.д.).

В контексте данного документа термин «содержать» или «включать в себя» может быть неограничивающим, частично ограничивающим и ограничивающим. Другими словами, такой термин также включает в себя значения «в значительной степени состоящий из» или «состоящий из».

ГПП-1

ГПП-1 представляет собой глюкозозависимый полипептидный гормон инкретин, стимулирующий секрецию инсулина для предотвращения гипогликемии. Глюкозозависимый характер стимулирования секреции инсулина позволяет избежать риска развития гипогликемии, часто присутствующего при лечении диабета. Благодаря указанным физиологическим функциям ГПП-1 имеет широкие перспективы стать одним из терапевтических лекарственных средств при лечении диабета 2-го типа. Как правило, ГПП-1 функционирует в качестве рецептора ГПП-1 (т.е., ГПП-1 Р) на мембранах островных (3-клеток поджелудочной железы для стимулирования секреции инсулина. Тем не менее, хотя естественный ГПП-1 и характеризуется многочисленными преимуществами при лечении диабета, он быстро расщепляется in vivo дипептидилпептидазой-IV (т.е. DPP-IV) и быстро отфильтровывается и метаболизируется почками. Таким образом, нам необходимо модифицировать естественный ГПП-1 для «отсеивания» аналогов ГПП-1, которые могут сопротивляться процессу расщепления под воздействием DPP-IV и могут избегать быстрой фильтрации и метаболизирования почками.

ГПП-1 характеризуется функцией секреции глюкозависимого инкретина, предотвращает дегенерацию островных β-клеток поджелудочной железы, стимулирует пролиферацию и дифференциацию β-клеток, индуцирует транскрипцию генов, стимулирует биосинтез предшественников инсулина, повышает чувствительность к инсулину; повышает секрецию соматостатина и подавляет процессы продуцирования инсулина и глюкагона (которые также являются глюкозозависимыми).

Паратиреоидный гормон (ПТГ)

Паратиреоидный гормон (ПТГ) представляет собой одноцепной полипептидный белок, содержащий 84 аминокислоты и выделяемый паращитовидной железой. Он является одним из наиболее важных пептидных гормонов, регулирующих метаболизм кальция и фосфора, а также ремоделирование костной ткани. Основными физиологическими функциями чПТГ (т.е. человеческого ПТГ) являются стимулирование остеогенеза костных клеток, стимулирование реабсорбции кальция, секреция фосфора в почках и реконструкция костной ткани. Главным недостатком ПТГ является то, что молекула чПТГ не содержит цистеина и является очень нестабильной in vivo. Интактный ПТГ имеет малую молекулярную массу и без труда отфильтровывается гломерулами, в связи с чем длительность его периода полувыведения является малой. Период полувыведения при подкожной или внутримышечной инъекции составляет, в общем случае, около 12 часов. Для достижения терапевтического эффекта в общем случае необходим частый прием лекарственных препаратов в высоких дозах (т.е., выполнение подкожной инъекции один раз в день в течение нескольких месяцев). Тем не менее, частое введение лекарственных препаратов и длительный период терапии трудно переносятся пациентами и могут приводить к возникновению головной боли, рвоты, лихорадки и к другим неблагоприятным реакциям в клинических условиях, что приводит к частым нарушениям режима лечения пациентами. Следовательно, существует насущная необходимость в создании препаратов ПТГ (или подобных им) с пролонгированным действием, которые могли бы быть модифицированы с использованием паратиреоидных гормонов для продления их периода полувыведения.

Ацильные соединения жирных кислот

Полипептиды (например, инсулины, ГПП-1 и ПТГ), содержащие бутинилоксикарбонил-лизин согласно настоящему изобретению, связываются с ацильными соединениями жирных кислот путем проведения клик-реакции для получения серий производных полипептида со значительно пролонгированными периодами полувыведения.

Ацильное соединение жирных кислот в настоящем изобретении содержит 14-18 атомов углерода; его структура показана в следующих Формуле V или Формуле VIII:

где a, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n - целое число из диапазона от 14 до 16.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ацильное соединение жирных кислот выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: LO-GFA, L2-GFA, L3-GFA, L4-GFA, L5-GFA или L6-GFA.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ацильное соединение жирных кислот выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: L0-GFA16, L2-GFA16, L3-GFA16, L4-GFA16, L5-GFA16 или L6-GFA16.

Производные полипептидов

При использовании в данном документе термины «аналог полипептида», «производное полипептида» и «производное согласно настоящему изобретению» используются взаимозаменяемо и все относятся к производному полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения.

В настоящем изобретении, кроме того, представлено производное полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения.

Более конкретно, указанное производное полипептида содержит следующие элементы:

(a) полипептидную цепь; и

(b) модифицированную группу L, связанную с сайтом лизина полипептида, где модифицированная группа L представляет собой группу X, соответствующую показанной в Формуле I,

где волнистая линия обозначает связь с сайтом лизина, a m целое число из диапазона 0-8; а, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n - целое число из диапазона от 14 до 16.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида содержит производное инсулина, производное ГПП-1, производное ПТГ, а также комбинации указанных элементов.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 4, 5 или 6.

GIVEQCСТSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)

GIVEQCCTSICSLYQLENYCG (SEQ ID NO: 2)

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 3)

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK (SEQ ID NO: 4)

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO: 5)

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO: 6)

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ГПП-1 имеет последовательность, показанную в любом из SEQ ID NO: 7-9.

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 7)

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 8)

HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 9) (где X представляет собой 2-аминоизомасляную кислоту (Aib))

В еще одном предпочтительном варианте осуществления ПТГ имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10.

SVSEIQLMHNLGRHLNSMERVEWLRKRLQDVHNF (SEQ ID NO.: 10)

В настоящем изобретении производное инсулина содержит инсулин, предшественник инсулина и один из вариантов инсулина. Указанный вариант инсулина отличается от любой формы инсулина естественного происхождения, но по-прежнему может выполнять функцию, подобную функции человеческого инсулина, а именно, контролировать уровень глюкозы в крови организма человека. Путем генетического изменения основообразующей ДНК удается изменить последовательность аминокислот инсулина и, таким образом, свойства, определяющие характер его абсорбции, распределения, метаболизма и секреции. Улучшения касаются создания аналогов инсулина, которые более легко абсорбируются участком инъекции и, таким образом, действуют быстрее в сравнении с вводимыми подкожно естественными инсулинами. Они предназначены для создания терапевтического уровня инсулинов (т.е., обеспечения присутствия прандиального инсулина), необходимого при приеме пищи, в то время как указанные аналоги инсулина, высвобождаемые медленно в течение периода времени длительностью от 8 часов до 24 часов, предназначены для создания базального уровня инсулинов (т.е., обеспечения присутствия базального инсулина) в течение суток, особенно ночью. В состав быстродействующих аналогов инсулина входят инсулин лизпро (Eli Lilly and Company) и инсулин аспарт (Novo Nordisk Company), в то время как в состав аналогов инсулина медленного действия входят инсулин НПХ, инсулин глулизин (Sanofi Aventis Company), инсулин детемир (Novo Nordisk Company) и инсулин гларгин (Sanofi Aventis Company).

В контексте данного документа термин «вариант» включает в себя любой вариант, в котором (а) один или несколько аминокислотных остатков заменены естественным или неестественным аминокислотным остатком; (b) порядок следования двух или более аминокислотных остатков изменен на противоположный; (с), (а) и (b) верны одновременно; (d) между любыми двумя аминокислотными остатками присутствует спейсерная группа; (е) один или несколько аминокислотных остатков присутствуют в пептоидной форме; (f) главная цепь (NCC) в одном или нескольких аминокислотных остатках пептида модифицирована, или же присутствует любая комбинация признаков от (а) до (f). Предпочтительно, вариант должен соответствовать признаку (а), (b) или (с).

Более предпочтительно, один или несколько аминокислотных остатков заменяются одним или несколькими аминокислотными остатками. И еще более предпочтительно, один аминокислотный остаток заменятся другим аминокислотным остатком. Предпочтительно, замена должна быть гомологичной.

Могут происходить гомологичные замены (термины «замена» и «замещение», используемые в данном документе, относятся к замене существующих аминокислотных остатков возможными остатками), т.е., однотипные замены, например, замена одного основного остатка другим основным, замена одного кислотного остатка другим кислотным, замена одного ионизированного остатка другим ионизированным и т.д. Могут происходить также и негомологичные замены, т.е., замены, при которых один вид остатка заменяется другим видом остатка, или же при которых в состав заменяемых элементов в качестве альтернативы входят неестественные аминокислоты, такие как орнитин, 2-аминоизомасляная кислота-орнитин, норлейцин-орнитин, пиридилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин. Более подробную информацию можно найти в следующей таблице. Одновременно может модифицироваться более одного аминокислотного остатка. В контексте данного документа аминокислоты классифицируются с разбиением на следующие категории: основные: Н, K, R; кислотные: D, Е; неполярные: A, F, G, I, L, М, Р, V, W; полярные: С, N, Q, S, Т, Y.

В добавление к спейсерным группам аминокислот (таким как глицин или остатки β-аланина), в состав подходящих спейсерных групп, которые могут вставляться между любыми двумя аминокислотными остатками в носителе, входят следующие: алкильные группы, такие как метил, этил или пропил. Специалистам в данной области техники понятно, что может существовать и другой вариант указанной формы, а именно, тип (е), содержащий один или несколько аминокислотных остатков в пептоидной форме. Для исключения любых недоразумений необходимо указать, что термин «пептоидная форма», используемый в данном документе, указывает на то, что заместитель α-С располагается на атоме N остатка, а не на вариантных аминокислотных остатках α-С. Процедура приготовления пептидов в пептоидной форме известна в данной области техники, например, из документа Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134. Модификация по типу (f) может быть выполнена способом, описанным в Международном издании PCT/GB 99/01855. Наблюдаемые в любом из положений аминокислотные варианты (предпочтительно, типов (а) или (b)), предпочтительно, должны быть независимыми. Как было указано выше, одновременно может встречаться более одной гомологичной или негомологичной замены. Другие варианты могут быть получены путем изменения направления последовательности некоторых аминокислотных остатков внутри общей последовательности на противоположное. В одном из вариантов осуществления замещающий аминокислотный остаток выбирается среди следующих элементов: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамат, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валин.

Производные полипептидов согласно настоящему изобретению могут существовать в форме их солей или эфиров, особенно фармацевтически приемлемых солей или эфиров.

В состав фармацевтически приемлемых солей соединений согласно настоящему изобретению входят пригодные кислые добавочные соли или соответствующие основные соли. Информацию о пригодных фармацевтически приемлемых солях можно найти в обзорной статье Berge et al. J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977). Они могут использоваться в комбинации с сильными неорганическими кислотами, например, минеральными кислотами (такими как серные кислоты, фосфорные кислоты или галогеноводородные кислоты), с сильными органическими карбоновыми кислотами, такими как незамещенные или замещенные (например, замещенные галогеном) алкилкарбоновые кислоты (например, уксусные кислоты) с количеством атомов углерода от 1 до 4; с насыщенными или ненасыщенными дикарбоновыми кислотами, такими как щавелевые кислоты, малоновые кислоты, янтарные кислоты, малеиновые кислоты, фумаровые кислоты, фталевые кислоты или терефталевые кислоты; с оксикарбоновыми кислотами, такими как аскорбиновые кислоты, гликолевые кислоты, молочные кислоты, яблочные кислоты, виннокаменные кислоты или лимонные кислоты; с аминокислотами, такими как аспарагиновые кислоты или глутаматы; с бензойными кислотами; или же с органическими сульфоновыми кислотами, такими как незамещенные или замещенные (например, замещенные галогеном) (С1-С4)-алкил- или арил-сульфоновые кислоты (например, метансульфоновая кислота или п-толуолсульфоновая кислота) для образования солей.

Настоящее изобретение, кроме того, включает в себя сольватные формы производных настоящего изобретения. Указанные формы включены в термины, используемые в формуле изобретения. Настоящее изобретение, кроме того, относится к различным кристаллическим формам, полиморфам и (безводным) гидратным формам аналогов настоящего изобретения. В фармацевтической промышленности был разработан метод разделения химических соединений, находящихся в любой из указанных форм, путем внесения небольших изменений в способ очистки и/или способ отделения растворителя, используемого при синтетическом приготовлении соединения.

Настоящее изобретение, кроме того, включает в себя пролекарственные формы производных настоящего изобретения. Такие пролекарства в общем случае представляют собой производные данного изобретения, в которых одна или несколько приемлемых групп модифицируются таким образом, что модификация может быть обращена при приеме пролекарства человеком или млекопитающим. Хотя для завершения процесса обращения in vivo вместе с указанными пролекарствами может приниматься и второй препарат, указанное обращение, как правило, осуществляется с использованием ферментов, которые в естественном виде присутствуют в организме человека или млекопитающего. Примеры указанных модификаций включают в себя эфиры (включая любые из описанных выше), где процесс обращения может быть осуществлен с использованием эстеразы. Специалистам в этой области техники известны и другие системы.

По сравнению с предшествующим уровнем техники основными преимуществами настоящего изобретения являются следующие:

(1) По сравнению с предшествующим уровнем техники производные инсулина и производные ГПП-1 согласно настоящему изобретению характеризуются более длительным, устойчивым и долгосрочным эффектом снижения уровня глюкозы в крови, а также существенно пролонгированными периодами полувыведения.

(2) Применение производных инсулина и производных ГПП-1 согласно настоящему изобретению не вызывает гипогликемию и позволяет снизить количество выполняемых инъекций, сопряженных с возникновением небольших побочных эффектов.

(3) По сравнению с предшествующим уровнем техники производные ПТГ согласно настоящему изобретению характеризуются более длительным и устойчивым действием препарата и существенно пролонгированным периодом полувыведения.

(4) Применение производных ПТГ согласно настоящему изобретению позволяет снизить количество выполняемых инъекций, сопряженных с возникновением небольших побочных эффектов.

(5) Способ получения лекарственных средств согласно настоящему изобретению, характеризующийся малым количеством побочных продуктов, высоким выходом полезного продукта, низкой стоимостью и значительной простотой процесса, пригоден для крупномасштабного производства. Отсутствует необходимость в проведении бромцианового расщепления, окислительного гидролиза сульфитов и связанных с ними этапов очистки, а также отсутствует необходимость использования меркаптанов или гидрофобных адсорбирующих смол в высоких концентрациях. Данный способ характеризуется малым количеством этапов очистки и низкой стоимостью производства.

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется ниже на конкретных примерах. Следует понимать, что эти примеры предназначены только для иллюстрирования изобретения, а не для ограничения объема настоящего изобретения. Методики проведения экспериментов без каких-либо особых условий, описанных в следующих примерах, реализовывались, как правило, в обычных условиях (например, в условиях, описанных в публикации Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Guide (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), или же в соответствии с инструкциями производителя. Если не указано иное, все процентные доли и части рассчитываются по массе. Если не указано иное, все использованные в следующих примерах экспериментальные материалы и реагенты являются серийно выпускаемыми.

Пример 1. Синтез белков рекомбинантных инсулинов, содержащих бутинилоксикарбонил-лизин

Фрагмент ДНК, кодирующий белок рекомбинантного инсулина, содержащего бутинилоксикарбонил-лизин, который, в свою очередь, содержит аминокислотную последовательность согласно показанному в SEQ ID NO: 11, был получен в результате химического синтеза, в процессе которого кодирующая последовательность 80-го лизина (K) была заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина). Затем фрагмент ДНК, использованный для кодирования всей аминокислотной последовательности согласно показанному в SEQ ID NO: 11, клонировался в модифицированный вектор pBAD-HisA. Полученная плазмида использовалась для обеспечения экспрессии белка рекомбинантного инсулина, содержащего в себе структуру бутинилоксикарбонил-лизина. Плазмида и ферментная плазмида pEvol-pylRs-pylT совместно трансформировались в штамм Е. coli Тор 10. Трансформационный раствор культивировался в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Отбиралась одна колония, которая затем культивировалась на шейкере постоянной температуры (при 220 об/мин) в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Затем ночная культура вносилась в 100 мл жидкой среды Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл, и культивировалась при температуре 37°С до достижения уровня значений 2-4 оптической плотности ODeoo. Затем к среде добавлялся 25% раствор арабинозы до достижения окончательной концентрации 0,25% и добавлялось 0,1 М трет-бутинилоксикарбонил-лизинового раствора до достижения окончательной концентрации 5 мМ для индуцирования экспрессии гибридного белка. Раствор культуры культурировался в течение 16-20 часов, а затем осуществлялась процедура сбора центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин, 4°С).

Аминокислотная последовательность согласно SEQ ID NO: 11:

MVSKGEELFTGVTYKTRAEVKFEGDDDDDKTLVNRIELKGIDFENLYFQG

RFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN,

где 80-й K является лизином, к которому ковалентно присоединялась бутинилоксикарбониловая группа.

Экспрессия гибридных белков осуществлялась в форме нерастворимых «внутриклеточных включений». Для высвобождения внутриклеточных включений клетки Е. coli разрушались с использованием гомогенизатора высокого давления. Клеточный детрит и растворимые белки хоста, Е. coli, удалялись посредством центрифугирования при 5000g. Внутриклеточные включения вымывались с использованием раствора, содержащего Tween 80, ЭДТА и NaCl, а затем 1-2 раза вымывались чистой водой. Смытые внутриклеточные включения растворялись в 7,5 М раствора мочевины, содержащего 2-10 мМ (3-меркаптоэтанола (рН 10,5-11,5), так что концентрация общего белка после растворения достигала 10-25 мг/мл. Образец разбавлялся 5-10 раз, выдерживался при температуре 4-8°С; затем производилось его складывание обычным способом в течение 14-30 часов при рН 10,5-11,7. Процедура ферментативного переваривания с использованием трипсина и карбоксипептидазы В выполнялась в течение 10-20 часов при температуре 18-25°С; значение рН поддерживалось в диапазоне 8,0-9,5. Затем для прекращения процесса ферментативного переваривания добавлялся 0,45 М раствор сульфата аммония. Результаты ВЭЖХ анализа в режиме обращения фазы показывают, что выход продукта на указанном этапе ферментативного переваривания составлял более 90%. Аналог инсулина, получаемый после ферментативного переваривания с участием трипсина и карбоксипептидазы В, был назван «бутинилоксикарбонил-лизин-человеческий инсулин». Образец осветлялся в процессе мембранной фильтрации. После первоначальной очистки в процессе гидрофобной хроматографии с использованием 0,45 М раствора сульфата аммония в качестве буфера А и чистой воды в качестве буфера В получался неочищенный экстракт бутинилоксикарбонил-лизин-человеческого инсулина со степенью чистоты 90%, подтвержденной электрофорезом. После выполнения очистки с использованием полимерного заполнителя с обращенной фазой и заполнителя С8 с обращенной фазой в конце концов получался бутинилоксикарбонил-лизин-человеческий инсулин со степенью чистоты выше 99%.

Пример 2. Синтез L0-GFA16-инсулинов (n равно 14)

Так как ацильное соединение жирной кислоты имело азидную группу, введение белка инсулина с терминальным алкином осуществлялось с использованием принципа «клик-химии»; алкин при этом реагировал с азидом для образования 1,2,3-триазольного кольца, с формированием поперечной межмолекулярной связи. В чистую центрифужную трубку объемом 1,5 мл помещалось 4 мкл сернокислой меди (50 мкМ), затем по порядку добавлялось 3 мкл ВТТАА (300 мкМ) и 10 мкл соединения IV (белка]/[-(бутинилоксикарбонил)-лизин-человеческого инсулина) (приблизительно 5 мкМ), приготовление которого было описано в Примере 1. В это время раствор мог быть разбавлен до достижения надлежащего значения объема или концентрации белка. Для инициирования реакции к этому раствору добавлялись 1 мкл L0-GFA16 (1 мкМ) и 2 мкл аскорбата натрия (2,5 мМ). После выдерживания в течение приблизительно 1 часа при комнатной температуре добавлялось 5 мкл буфера для образца SDS-PAGE и осуществлялся нагрев до температуры 100°С в течение 10 минут. Анализ раствора завершался с использованием 12% SDS-PAGE. Было осуществлено извлечение геля с последующим его анализом с использованием процедуры гелевой визуализации и флуоресцентного анализа; затем было произведено его окрашивание кумасси бриллиантовым синим.

Пример 3. Синтез L2-GFA16-инсулинов, L3-GFA16-инсулинов, L4-СРА16-инсулинов, L5-СРА16-инсулинов и L6-СРА16-инсулинов (n равно 14)

В чистую центрифужную трубку объемом 1,5 мл помещалось 4 мкл сернокислой меди (50 мкМ), затем по порядку добавлялось 3 мкл ВТТАА (300 мкМ) и 10 мкл соединения IV (белка K-(бутинилоксикарбонил)-лизин-человеческого инсулина) (приблизительно 5 мкМ), приготовление которого было описано в Примере 1. В это время, возможно, необходимо добавить воду для разбавления раствора до достижения надлежащего значения объема или концентрации белка. Для инициирования реакции к этому раствору добавлялись 1 мкл L2-GFA16 (1 мкМ) и 2 мкл аскорбата натрия (2,5 мМ). После выдерживания в течение приблизительно 1 часа при комнатной температуре добавлялось 5 мкл буфера для образца SDS-PAGE и осуществлялся нагрев до температуры 100°С в течение 10 минут. Анализ раствора завершался с использованием 12% SDS-PAGE. Было осуществлено извлечение геля с последующим его анализом с использованием процедуры гелевой визуализации и флуоресцентного анализа; затем было произведено его окрашивание кумасси бриллиантовым синим.

Аналогично, для завершения клик-реакции с целью получения указанных ниже продуктов использовались, соответственно, соединение IV, приготовление которого было описано в Примере 1, и L3-GFA16, L4-GFA16, L5-GFA16, L6-GFA16; структура указанных компонентов показана ниже.

Пример 4. Фармакокинетические исследования действия производных инсулина согласно настоящему изобретению у крыс

В эксперименте принимали участие группа вещества сравнения и группа исследуемого вещества. Осуществлялась подкожная однократная инъекция человеческих инсулинов и L6-GFA16-инсулинов по 0,45 мг/кг соответственно. Кровь для анализа отбиралась у животных из каждой группы через 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 5 ч, 7 ч, 12 ч и 24 ч после выполнения инъекции. Для обнаружения присутствия различных аналогов инсулина использовался метод LC-MS/MS. Для подготовки статистических данных, касающихся концентрации веществ в плазме крови, использовалось программное обеспечение для метаболического кинетического анализа данных WinNonlin 7.0, а для расчета фармакокинетических параметров (Таблица 1) использовался метод некомпартментального моделирования (NCA). Результаты, приведенные в Таблице 1, указывают на получение сходных значений времени обнаружения пиковой концентрации лекарственных веществ для каждой из групп животных, а именно, 0,5-1 часов. Длительность периодов полувыведения Ь6-GFA16-инсулинов превышала соответствующий параметр для рекомбинантных человеческих инсулинов в 3-4 раза. Время воздействия лекарственных веществ in vivo оказалось пролонгированным, а экспозиционные дозы увеличенными.

Эксперименты, описанные выше, повторялись аналогичным образом, за исключением факта использования L0-GFA16-инсулинов, L2-GFA16-инсулинов, L3-GFA16-инсулинов, L4-GFA16-инсулинов и L5-GFA16-инсулинов согласно настоящему изобретению. Результаты показали, что длительность периодов полувыведения производных инсулина согласно настоящему изобретению оказалась существенно пролонгированной, а показатели биологической активности - сохранены.

Пример 5. Синтез белков ГПП-1, содержащих бутинилоксикарбонил-лизин

Фрагмент ДНК, кодирующий белок ГПП-1, содержащего бутинилоксикарбонил-лизин, который, в свою очередь, содержит аминокислотную последовательность согласно показанному в SEQ ID NO: 12, был получен в результате химического синтеза, в процессе которого кодирующая последовательность 70-го лизина (K) была заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина). Затем фрагмент ДНК, использованный для кодирования всей аминокислотной последовательности согласно показанному в SEQ ID NO: 12, клонировался в модифицированный вектор pBAD-HisA. Полученная плазмида использовалась для обеспечения экспрессии белка GLP-1, содержащего в себе структуру бутинилоксикарбонил-лизина. Плазмида и ферментная плазмида pEvol-pylRs-pylT совместно трансформировались в штамм Е. coli Тор 10. Трансформационный раствор культивировался в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Отбиралась одна колония, которая затем культивировалась на шейкере постоянной температуры (при 220 об/мин) в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Затем ночная культура вносилась в 100 мл жидкой среды Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл, и культивировалась при температуре 37°С до достижения уровня значений 2-4 оптической плотности OD600. Затем к среде добавлялся 25% раствор арабинозы до достижения окончательной концентрации 0,25% и добавлялось 0,1 М трет-бутинилоксикарбонил-лизинового раствора до достижения окончательной концентрации 5 мМ для индуцирования экспрессии гибридного белка. Раствор культуры культурировался в течение 16-20 часов, а затем осуществлялась процедура сбора центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин, 4°С).

Аминокислотная последовательность согласно SEQ ID NO: 12:

MVSKGEELFTGVTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFENLYFQGDDDDK

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG, где 70-й K является лизином, к которому ковалентно присоединялась бутинилоксикарбониловая группа.

Экспрессия гибридных белков осуществлялась в форме нерастворимых «внутриклеточных включений». Для высвобождения внутриклеточных включений клетки Е. coli разрушались с использованием гомогенизатора высокого давления. Клеточный детрит и растворимые белки хоста, Е. coli, удалялись посредством центрифугирования при 5000g. Внутриклеточные включения вымывались с использованием раствора, содержащего Tween 80, ЭДТА и NaCl, а затем 1-2 раза вымывались чистой водой. Смытые внутриклеточные включения растворялись в 7,5 М раствора мочевины, содержащего 2-10 мМ (3-меркаптоэтанола (рН 10,5-11,5), так что концентрация общего белка после растворения достигала 10-25 мг/мл. Образец разбавлялся 5-10 раз, выдерживался при температуре 4-8°С; затем производилось его складывание обычным способом в течение 14-30 часов при рН 10,5-11,7. После осветления раствора для рефолдинга производились отделение и очистка гибридного белка с использованием слабоанионного заполнителя при рН 9,0, и степень чистоты целевого белка достигала 80%, что подтверждалось электрофорезом. Образец подвергался элюированию с использованием высокосолевой среды. После обессоливания проводилась процедура ферментативного переваривания с использованием энтерокиназы в течение 10-20 часов при температуре 25°С; значение рН поддерживалось в диапазоне 8,0-9,0. Результаты ВЭЖХ анализа в режиме обращения фазы показывают, что выход продукта на указанном этапе ферментативного переваривания составлял более 90%о. Аналог ГПП-1, получаемый после ферментативного переваривания с использованием энтерокиназы, был назван бутинилоксикарбонил-лизин-ГПП-1. После проведения ферментативного переваривания он очищался с использованием гидрофобного заполнителя для экстракции бутинилоксикарбонил-лизин-ГПП-1; степень чистоты последнего, подтвержденная электрофорезом, достигала 90%.

Пример 6. Синтез L0-GFA16-ГПП-1 (n равно 14)

Так как ацильное соединение жирной кислоты имело азидную группу, введение белка ГПП-1 с терминальным алкином осуществлялось с использованием принципа «клик-химии»; алкин при этом реагировал с азидом для образования 1,2,3-триазольного кольца, с формированием поперечной межмолекулярной связи. В чистую центрифужную трубку объемом 1,5 мл помещалось 4 мкл сернокислой меди (50 мкМ), затем по порядку добавлялось 3 мкл ВТТАА (300 мкМ) и 10 мкл соединения IV (белка N-(бутинилоксикарбонил)-лизин-ГПП-1) (приблизительно 5 мкМ), приготовление которого было описано в Примере 5. В это время раствор мог быть разбавлен до достижения надлежащего значения объема или концентрации белка. Для инициирования реакции к этому раствору добавлялись 1 мкл L0-GFA16 (1 мкМ) и 2 мкл аскорбата натрия (2,5 мМ). После выдерживания в течение приблизительно 1 часа при комнатной температуре добавлялось 5 мкл буфера для образца SDS-PAGE и осуществлялся нагрев до температуры 100°С в течение 10 минут. Анализ раствора завершался с использованием 12% SDS-PAGE. Было осуществлено извлечение геля с последующим его анализом с использованием процедуры гелевой визуализации и флуоресцентного анализа; затем было произведено его окрашивание кумасси бриллиантовым синим.

Пример 7. Синтез L2-GFA16-ГПП-1, L3-GFA16-ГПП-1, L4-GFA16-ГПП-1, L5-GFA16-ГПП-1 и L6-GFA16-ГПП-1 (n равно 14)

В чистую центрифужную трубку объемом 1,5 мл помещалось 4 мкл сернокислой меди (50 мкМ), затем по порядку добавлялось 3 мкл ВТТАА (300 мкМ) и 10 мкл соединения IV (белка N-(бутинилоксикарбонил)-лизин-ГПП-1) (приблизительно 5 мкМ), приготовление которого было описано в Примере 5. В это время, возможно, необходимо добавить воду для разбавления раствора до достижения надлежащего значения объема или концентрации белка. Для инициирования реакции к этому раствору добавлялись 1 мкл L2-GFA16 (1 мкМ) и 2 мкл аскорбата натрия (2,5 мМ). После выдерживания в течение приблизительно 1 часа при комнатной температуре добавлялось 5 мкл буфера для образца SDS-PAGE и осуществлялся нагрев до температуры 100°С в течение 10 минут. Анализ раствора завершался с использованием 12% SDS-PAGE. Было осуществлено извлечение геля с последующим его анализом с использованием процедуры гелевой визуализации и флуоресцентного анализа; затем было произведено его окрашивание кумасси бриллиантовым синим.

Аналогично, для завершения клик-реакции с целью получения указанных ниже продуктов использовались, соответственно, соединение IV, приготовление которого было описано в Примере 5, и L3-GFA16, L4-GFA16, L5-GFA16, L6-GFA16; структура указанных компонентов показана ниже.

Пример 8. Фармакокинетические исследования действия производных ГПП-1 согласно настоящему изобретению у крыс

В эксперименте принимали участие группа вещества сравнения и группа исследуемого вещества. Осуществлялась подкожная однократная инъекция ГПП-1 и L6-CFA16-ГПП-1 по 0,5 мг/кг. Кровь для анализа отбиралась у животных из каждой группы через 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 5 ч, 7 ч, 12 ч и 24 ч после выполнения инъекции. Для обнаружения присутствия различных аналогов GLP-1 использовался метод LC-MS/MS. Для подготовки статистических данных, касающихся концентрации веществ в плазме крови, использовалось программное обеспечение для метаболического кинетического анализа данных WinNonlin 7.0, а для расчета фармакокинетических параметров (Таблица 2) использовался метод некомпартментального моделирования (NCA).

Результаты, приведенные в Таблице 2, указывают на получение сходных временных значений пиковой концентрации лекарственных веществ для каждой из групп животных, а именно, 4,8 мин. Время воздействия L6-GFA16-ГПП-1 in vivo оказалось пролонгированным, а экспозиционные дозы увеличенными.

Эксперименты, описанные выше, повторялись аналогичным образом, за исключением факта использования L0-GFA16-ГПП-1, L2-GFA16-ГПП-1, L3-GFA16-ГПП-1, L4-GFA16-ГПП-1 и L5-GFA16-ГПП-1 согласно настоящему изобретению. Результаты показали, что длительность периодов полувыведения производных ГПП-1 согласно настоящему изобретению оказалась существенно пролонгированной, а показатели биологической активности - сохранены.

Пример 9. Синтез белков ПТГ, содержащих бутинилоксикарбонил-лизин

Фрагмент ДНК, кодирующий белок ПТГ, содержащего бутинилоксикарбонил-лизин, который, в свою очередь, содержит аминокислотную последовательность согласно показанному в SEQ ID NO: 13, был получен в результате химического синтеза, при котором кодирующая последовательность 76-го лизина (K) была заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина). Затем фрагмент ДНК, использованный для кодирования всей аминокислотной последовательности согласно показанному в SEQ ID NO: 13, клонировался в модифицированный вектор pBAD-HisA. Полученная плазмида использовалась для обеспечения экспрессии белка ПТГ, содержащего в себе структуру бутинилоксикарбонил-лизина. Плазмида и ферментная плазмида pEvol-pylRs-pylT совместно трансформировались в штамм Е. coli Тор 10. Трансформационный раствор культивировался в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Отбиралась одна колония, которая затем культивировалась на шейкере постоянной температуры (при 220 об/мин) в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Затем ночная культура вносилась в 100 мл жидкой среды Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл, и культивировалась при температуре 37°С до достижения уровня значений 2-4 оптической плотности OD600. Затем к среде добавлялся 25% раствор арабинозы до достижения окончательной концентрации 0,25% и добавлялось 0,1 М трет-бутинилоксикарбонил-лизинового раствора до достижения окончательной концентрации 5 мМ для индуцирования экспрессии гибридного белка. Раствор культуры культурировался в течение 16-20 часов, а затем осуществлялась процедура сбора центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин, 4°С). Аминокислотная последовательность согласно SEQ ID NO: 13:

MVSKGEELFTGVTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFENLYFQGDDDDK

SVSEIQLMHNLGRHLNSMERVEWLRKRLQDVHNF, где 76-й K является лизином, к которому ковалентно присоединялась бутинилоксикарбониловая группа.

Экспрессия гибридных белков осуществлялась в форме нерастворимых «внутриклеточных включений». Для высвобождения внутриклеточных включений клетки Е. coli разрушались с использованием гомогенизатора высокого давления. Клеточный детрит и растворимые белки хоста, Е. coli, удалялись посредством центрифугирования при 5000g. Внутриклеточные включения вымывались с использованием раствора, содержащего Tween 80, ЭДТА и NaCl, а затем 1-2 раза вымывались чистой водой. Смытые внутриклеточные включения растворялись в 7,5 М раствора мочевины, содержащего 2-10 мМ β-меркаптоэтанола (рН 10,5-11,5), так что концентрация общего белка после растворения достигала 10-25 мг/мл. Образец разбавлялся 5-10 раз, выдерживался при температуре 4-8°С; затем производилось его складывание обычным способом в течение 14-30 часов при рН 10,5-11,7. После осветления раствора для рефолдинга производились отделение и очистка гибридного белка с использованием слабоанионного заполнителя при рН 9,0, и степень чистоты целевого белка достигала 80%, что подтверждалось электрофорезом. Образец подвергался элюированию с использованием высокосолевой среды. После обессоливания проводилась процедура ферментативного переваривания с использованием энтерокиназы в течение 10-20 часов при температуре 25°С; значение рН поддерживалось в диапазоне 8,0-9,0. Результаты ВЭЖХ анализа в режиме обращения фазы показывают, что выход продукта на указанном этапе ферментативного переваривания составлял более 90%. Аналог ПТГ, получаемый после ферментативного переваривания с использованием энтерокиназы, был назван бутинилоксикарбонил-лизин-ПТГ. После проведения ферментативного переваривания он очищался с использованием гидрофобного заполнителя для экстракции бутинилоксикарбонил-лизин-ПТГ; степень чистоты последнего, подтвержденная электрофорезом, достигала 90%.

Использовались те же самые методы, что описаны и в Примерах 6 и 7. Для синтеза L0-GFA16-ПТГ, L2-GFA16-ПТГ, L3-GFA16-ПТГ, L4-GFA16-ПТГ, L5-GFA16-ПТГ и L6-GFA16-ПТГ белки ГПП-1, содержащие (бутинилоксикарбонил)-лизин, заменялись белками ПТГ, содержащими (бутинилоксикарбонил)-лизин.

Пример 10. Фармакокинетические исследования действия производных ПТГ-1 согласно настоящему изобретению у крыс

В эксперименте принимали участие группа вещества сравнения и группа исследуемого вещества. Осуществлялась подкожная однократная инъекция ПТГ-1 и L6-GFA16-ПТГ-l по 8,6 мкг/кг соответственно. Кровь для анализа отбиралась у животных из каждой группы через 0 мин, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, и 4 ч после выполнения инъекции. Для обнаружения присутствия различных аналогов ПТГ-1 использовался метод LC-MS/MS. Для подготовки статистических данных, касающихся концентрации веществ в плазме крови, использовалось программное обеспечение для метаболического кинетического анализа данных WinNonlin 7.0, а для расчета фармакокинетических параметров (Таблица 3) использовался метод некомпартментального моделирования (NCA). Результаты, приведенные в Таблице 3, указывают на пролонгацию периода обнаружения пиковой концентрации L6-GFA16-ПТГ для каждой из групп животных приблизительно до 1,6 ч. Время воздействия лекарственных веществ in vivo оказалось пролонгированным, а экспозиционные дозы увеличенными.

Эксперименты, описанные выше, повторялись аналогичным образом, за исключением факта использования L0-GFA16-ПТГ, L2-GFA16-ПТГ, L3-GFA16-ПТГ, L4-GFA16-ПТГ и L5-GFA16-ПТГсогласно настоящему изобретению. Результаты показали, что длительность периодов полувыведения производных ПТГ согласно настоящему изобретению оказалась существенно пролонгированной, а показатели биологической активности - сохранены.

Все документы, упомянутые в настоящем изобретении, включены в настоящий документ в виде ссылок, как если бы они были включены при помощи ссылок по отдельности. Кроме того, необходимо понимать, что после ознакомления с вышеуказанными идеями настоящего изобретения специалисты в этой области техники могут вносить в изобретение различные изменения и модификации, а также что указанные эквиваленты также попадают под сферу действия формулы изобретения, прилагаемой к данной заявке.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> NНИНГБО КУНПЕНГ БИОТЕКХ КО., ЛТД.

<120> ПРОИЗВОДНОЕ ПОЛИПЕПТИДА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

<130> P2018-1748

<150> CN201910390476.3

<151> 2019-05-10

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность Цепи A Инсулина

<400> 1

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

20

<210> 2

<211> 21

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность Цепи A Инсулина

<400> 2

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Gly

20

<210> 3

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность Цепи B Инсулина

<400> 3

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

20 25 30

<210> 4

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность Цепи B Инсулина

<400> 4

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

20 25

<210> 5

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность Цепи B Инсулина

<400> 5

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr

20 25 30

<210> 6

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность Цепи B Инсулина

<400> 6

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr

20 25 30

<210> 7

<211> 31

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность GLP-1

<400> 7

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 8

<211> 31

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность GLP-1

<400> 8

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 9

<211> 31

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность GLP-1

<400> 9

His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 10

<211> 34

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность PTH

<400> 10

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Arg Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 11

<211> 103

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность Бутинилоксикарбонил-лизина

<400> 11

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Thr Tyr Lys Thr

1 5 10 15

Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Asp Asp Asp Asp Lys Thr Leu

20 25 30

Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Glu Asn Leu Tyr Phe

35 40 45

Gln Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu

50 55 60

Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

65 70 75 80

Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr

85 90 95

Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100

<210> 12

<211> 81

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность Бутинилоксикарбонил-лизина

<400> 12

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Thr Tyr Lys Thr

1 5 10 15

Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu

20 25 30

Leu Lys Gly Ile Asp Phe Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Asp Asp

35 40 45

Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu

50 55 60

Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

65 70 75 80

Gly

<210> 13

<211> 84

<212> ПРТ

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> Аминокислотная Последовательность Бутинилоксикарбонил-лизина

<400> 13

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Thr Tyr Lys Thr

1 5 10 15

Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu

20 25 30

Leu Lys Gly Ile Asp Phe Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Asp Asp

35 40 45

Asp Lys Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His

50 55 60

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Arg Leu Gln Asp

65 70 75 80

Val His Asn Phe

<---

1. Производное полипептида для пролонгирования периода полувыведения полипептида, которое включает:

(a) полипептид; и

(b) модифицированную группу L, связанную с сайтом лизина полипептида, как показано в Формуле I,

где волнистая линия обозначает положение связи с сайтом лизина, а m – целое число из диапазона 0-8; a, b, c, d, e и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n – целое число из диапазона от 14 до 16;

и полипептид выбирается из группы, состоящей из: инсулина, глюкагоноподобного пептида-1, паратиреоидного гормона, и их комбинаций.

2. Производное полипептида по п. 1, где группа L выбирается из группы, состоящей из:

, ,

,

,

, или

3. Производное полипептида по п. 1, где производное полипептида имеет структуру, показанную ниже

где является инсулином, глюкагоноподобным пептидом-1, или паратиреоидным гормоном;

где m – целое число из диапазона 0-8;

a, b, c, d, e и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n – целое число из диапазона от 14 до 16.

4. Производное полипептида по п. 1, где цепь A инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2; и/или

цепь B инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 4, 5 или 6; и/или

глюкагоноподобный пептид-1 имеет последовательность, показанную в любом из SEQ ID NO: 7-9; и/или

паратиреоидный гормон имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10.

5. Фармацевтическая композиция для лечения остеопороза, диабета и гипергликемии, содержащая эффективное количество производного полипептида по п. 1, а также фармацевтически приемлемый носитель.

6. Применение производного полипептида по п. 1 для получения лекарств или препаратов для профилактики или лечения остеопороза, диабета, гипергликемии и других заболеваний, при которых снижение уровня глюкозы в крови дает положительный эффект.

7. Способ получения производного полипептида по п.1, содержащий следующие этапы:

(1) в присутствии лизина группы X, пирролизил-тРНК-синтетазы и связанной с ней гомологичной тРНК культивируют штамм, содержащий кодирующую последовательность инсулина, где кодирующая лизин последовательность полипептида в составе указанной кодирующей последовательности заменена TAG для кодирования производного лизина и, следовательно, продуцирует производное полипептида, содержащее следующие компоненты:

(a) полипептидную цепь; и

(b) модифицированную группу L, связанную с сайтом лизина полипептида, где модифицированная группа L представляет собой группу X, соответствующую определению п. 1 формулы; и, необязательно,

(2) отделяют производное полипептида от продуктов ферментации.

8. Способ получения производного полипептида по п. 1, содержащий следующие этапы:

(1) в присутствии соединения согласно Формуле III, пирролизил-тРНК-синтетазы и связанной с ней гомологичной тРНК культивируют штамм, содержащий кодирующую последовательность полипептида, где кодирующая лизин последовательность полипептида в составе указанной кодирующей последовательности заменена TAG для кодирования производного лизина и, следовательно, продуцирует соединение согласно Формуле IV; и

→

где является инсулином, глюкагоноподобным пептидом-1, или паратиреоидным гормоном;

(2) проводят реакцию между соединением согласно Формуле IV и соединением согласно Формуле V в инертном растворителе, обеспечивая, таким образом, получение производного полипептида,

соединения согласно Формуле V,

где a, b, c, d, e и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n – целое число из диапазона от 14 до 16 в Формуле V.

9. Способ получения производного полипептида по п. 1, содержащий следующие этапы:

(1) в присутствии соединения согласно Формуле VI, пирролизил-тРНК-синтетазы и связанной с ней гомологичной тРНК культивируют штамм, содержащий кодирующую последовательность полипептида, где кодирующая лизин последовательность полипептида в составе указанной кодирующей последовательности заменена TAG для кодирования производного лизина и, следовательно, продуцирует соединение согласно Формуле VII; и

→

где является инсулином, глюкагоноподобным пептидом-1, или паратиреоидным гормоном;

(2) проводят реакцию между соединением согласно Формуле VII и соединением согласно Формуле VIII в инертном растворителе, обеспечивая, таким образом, получение производного полипептида,

соединения согласно Формуле VIII

где a, b, c, d, e и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n – целое число из диапазона от 14 до 16 в Формуле VIII.

10. Промежуточное соединение для получения производного полипептида по п.1 с пролонгированным периодом полувыведения, которое включает:

(a) полипептид, представляющий собой инсулин, глюкагоноподобный пептид-1, или паратиреоидный гормон; и

(b) модифицированную группу L, связанную с сайтом лизина полипептида, где модифицированная группа L представляет собой группу, соответствующую показанной в Формуле A,

Формула A

где волнистая линия обозначает положение связи с сайтом лизина, а m – целое число из диапазона 0-8.