Конъюгат лиганд-лекарственное средство аналога экзатекана, способ его получения и его применение

Изобретение относится к области органической химии, а именно к конъюгату лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли формулы (Pc-L-Y-Dr), где Y представляет собой -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-; Ra и Rb представляют собой атом водорода; R1 представляет собой C3-6 циклоалкил или C3-6 циклоалкил-C1-6 алкил; R2 представляет собой атом водорода; или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C3-6 циклоалкил; m составляет 0 или 1; n составляет от 1 до 10, которое может представлять собой целое или десятичное число; Pc представляет собой антитело; и L представляет собой линкерное звено. Также изобретение относится к соединению формулы (D1) или к его фармацевтически приемлемой соли, соединению формулы (La-Y-Dr) или к его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции для лечения рака, связанного с экспрессией HER2 или B7H3, содержащая конъюгат лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-L-Y-Dr) или его фармацевтически приемлемой соли, или соединение формулы (D1), или его фармацевтически приемлемой соли, применению конъюгата лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-L-Y-Dr) или его фармацевтически приемлемой соли или соединения формулы (D1). Технический результат: лечение рака, связанного с экспрессией HER2 или B7H3 конъюгатом формулы (Pc-L-Y-Dr) или соединением формулы (D1). 5 н. и 23 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 59 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к конъюгату лиганд-лекарственное средство аналога экзатекана с новой структурой. В частности, настоящее изобретение относится к конъюгату лиганд-лекарственное средство аналога экзатекана со структурной единицей Y, способу его получения, фармацевтической композиции, содержащей указанный конъюгат, и применению конъюгата или фармацевтической композиции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Химиотерапия остается одной из самых важных противораковых терапий, наряду с хирургией, лучевой терапией и таргетной терапией. Хотя существует много типов высокоэффективных цитотоксинов, различие между опухолевыми и нормальными клетками очень мало, что ограничивает широкое клиническое применение этих противораковых соединений вследствие токсического побочного эффекта. Лекарственные средства на основе антител стали препаратами первой линии для противоопухолевой терапии вследствие специфичности противоопухолевых моноклональных антител к поверхностному антигену опухолевых клеток. Однако, когда антитело используется отдельно в качестве противоопухолевого лекарственного средства, эффективность часто оказывается неудовлетворительной.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) позволяют комбинировать моноклональное антитело или фрагмент антитела с биологически активным цитотоксином через химически стабильный линкер, используя все преимущества специфичности связывания антитела с поверхностными антигенами нормальных клеток или опухолевых клеток и высокой эффективности цитотоксина, избегая при этом низкой эффективности антител и токсического побочного эффекта цитотоксина. Это означает, что по сравнению с обычными химиотерапевтическими лекарственными средствами, конъюгаты антител и лекарственных средств могут точно связываться с опухолевыми клетками и уменьшать воздействие на нормальные клетки (Milliard А, (2013) Nature Reviews Drug Discovery, 12:329-332; DiJoseph JF, Armellino DC, (2004) Blood, 103:1807-1814).

В 2000 г. первый конъюгат антитела и лекарственного средства Mylotarg (гемтузумаб озогамицин, Wyeth Pharmaceuticals) был одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) для лечения острого миелоидного лейкоза (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; US 4970198; US 5079233; US 5585089; US 5606040; US 5693762; US 5739116; US 5767285; US 5773001).

В августе 2011 г. Adcetris (брентуксимаб ведотин, Seattle Genetics Inc.) был одобрен в результате ускоренной процедуры рассмотрения US FDA для лечения лимфомы Ходжкина и рецидивирующей анапластической крупноклеточной лимфомы (Wet Biotechnol (2003) 21(7):778-784; WO 2004010957; WO 2005001038; US 7090843A; US 7659241; WO 2008025020). Adcetris® является новым таргетным лекарственным средством ADC, которое позволяет лекарственному средству воздействовать непосредственно на мишень CD30 в клетках лимфомы, запускать эндоцитоз и, следовательно, индуцировать апоптоз опухолевых клеток.

И Mylotarg, и Adcetris являются таргетными препаратами для лечения гематологических опухолей, организационная структура которых относительно проста по сравнению с солидными опухолями. В феврале 2013 года Kadcyla (адо-трастузумаб эмтанзин, T-DM1) был одобрен FDA для лечения пациентов с распространенным или метастатическим раком молочной железы, которые являются HER2-положительными, с устойчивостью к трастузумабу (торговое название: Герцептин) и устойчивостью к паклитакселу (WO 2005037992; US 8088387). Kadcyla представляет собой первое лекарственное средство ADC, одобренное FDA для лечения солидных опухолей.

Существует несколько типов цитотоксических малых молекул, используемых в конъюгате антитело-лекарственное средство, одним из которых являются производные камптотецина, которые проявляют противоопухолевый эффект за счет ингибирования топоизомеразы I. Документы, сообщающие о применении производного камптотецина, экзатекана (химическое название: (1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]имидазо[1,2-b]хинолин-10,13(9Н,15Н)-дион) в конъюгате антитело-лекарственное средство (ADC), включают WO 2014057687, Clinical Cancer Research (2016) 22 (20): 5097-5108, и Cancer Sci (2016) 107: 1039-1046. Однако по-прежнему необходимы дальнейшие разработки лекарственных средств ADC с большей эффективностью.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для улучшения лиганда, особенно эффекта связывания между антителом и лекарственным средством, в настоящем описании предложен конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, где конъюгат лиганд-лекарственное средство содержит структуру формулы (-D):

где:

Y выбран из группы, состоящей из -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-, -O- CR1R2-( CRaRb)m-, -O-CR1R2-, -NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)- и -S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-;

Ra и Rb являются одинаковыми или разными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, атома дейтерия, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила, алкокси, гидрокси, амино, циано, нитро, гидроксиалкила, циклоалкила и гетероциклила;

или Ra и Rb совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

R1 выбран из группы, состоящей из галогена, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, гетероциклила, арила и гетероарила;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

или Ra и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

где волнистая линия в -D представляет собой атом водорода или ковалентную связь с линкерным звеном или антителом, которое связывается с антигеном, экспрессируемым клеткой-мишенью;

m представляет собой целое число от 0 до 4.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложенный конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой соединение формулы (-D1 или его конъюгат лиганд-лекарственное средство, или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где:

R1 представляет собой циклоалкилалкил или циклоалкил, и предпочтительно С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогеналкила и С3-6 циклоалкила, и предпочтительно атома водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил;

волнистая линия в формуле -D1 представляет собой атом водорода или ковалентную связь с линкерным звеном или антителом, которое связывается с антигеном, экспрессируемым клеткой-мишенью;

m составляет 0 или 1.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложенный конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой конъюгат лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-L-Y-Dr) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где:

Y выбран из группы, состоящей из -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-, -O- CR1R2-( CRaRb)m-, -O-CR1R2-, -NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)- и -S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-;

Ra и Rb являются одинаковыми или разными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, атома дейтерия, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила, алкокси, гидрокси, амино, циано, нитро, гидроксиалкила, циклоалкила и гетероциклила;

или Ra и Rb совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

R1 выбран из группы, состоящей из галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

или Ra и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

m представляет собой целое число от 0 до 4;

n составляет от 1 до 10, которое может представлять собой целое или десятичное число;

Рс представляет собой лиганд; и L представляет собой линкерное звено.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате

-Y- представляет собой -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-;

Ra и Rb являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, атома дейтерия, галогена и алкила;

R1 представляет собой С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогеналкила и С3-6 циклоалкила, и предпочтительно атома водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил;

m составляет 0 или 1.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически 30 приемлемой соли или сольвате, структурное звено -Y- представляет собой -O-(CH2)m-CR1R2-C(O)-;

R1 представляет собой С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогеналкила и С3-6 циклоалкила;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил;

m составляет 0 или 1.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате, структурное звено -Y- представляет собой -O-(CH2)m-CR1R2-C(O)-;

R1 представляет собой С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 представляет собой атом водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил; m составляет 0 или 1.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате, структурное звено -Y- представляет собой -O-(CH2)m-CR1R2-C(O)-;

R1 представляет собой С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 представляет собой атом водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил; m составляет 0.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате, структурное звено -Y- выбрано из группы, состоящей из:

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате, концевой О в -Y- присоединен клинкерному звену L.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения предложенный конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой конъюгат лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-L-D1) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где:

R1 представляет собой циклоалкилалкил или циклоалкил, и предпочтительно С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогеналкила и С3-6 циклоалкила, и предпочтительно атома водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил;

m составляет 0 или 1;

n составляет от 1 до 10, которое может представлять собой целое или десятичное число;

Рс представляет собой лиганд; и L представляет собой линкерное звено.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате согласно настоящему изобретению n составляет от 2 до 8, которое может представлять собой целое или десятичное число; и предпочтительно n составляет от 3 до 8, которое может представлять собой целое или десятичное число.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате согласно настоящему изобретению линкерное звено L представляет собой -L1-L2-L3-L4-,

L1 выбран из группы, состоящей из -(сукцинимид-3-ил-N)-W-С(O)-, -CH2-C(O)-NR3-W-C(O)- и -C(O)-W-C(O)-, где W выбран из группы, состоящей из C1-8 алкила, C1-8 алкилциклоалкила и линейного гетероалкила, содержащего от 1 до 8 атомов, гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где C1-8 алкил, циклоалкил и линейный гетероалкил, каждый независимо, необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L2 выбран из группы, состоящей из -NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- и химической связи, где р1 представляет собой целое число от 1 до 20; и L2 предпочтительно представляет собой химическую связь;

L3 представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, причем аминокислоты необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L4 выбран из группы, состоящей из -NR5(CR6R7)t-, -C(O)NR5, -C(O)NR5(CH2)t- и химической связи, где t представляет собой целое число от 1 до 6; и L4 предпочтительно представляет собой -NR5(CR6R7)t-;

R3, R4 и R5 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

R6 и R7 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате линкерное звено L1 выбрано из группы, состоящей из -(сукцинимид-3-ил-N)-(СН2)s1-С(O)-, -(сукцинимид-3-ил-N)-СН2-циклогексил-С(O)-, -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH2CH2O)s2-СН2СН2-С(O)-, -CH2-C(O)-NR3-(CH2)s3-C(O)- и -C(O)-(CH2)s4C(O)-, где s1 представляет собой целое число от 2 до 8, s2 представляет собой целое число от 1 до 3, s3 представляет собой целое число от 1 до 8, и s4 представляет собой целое число от 1 до 8; и s1 предпочтительно составляет 5.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате линкерное звено L2 выбрано из группы, состоящей из -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)- и химической связи, где р1 представляет собой целое число от 6 до 12.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате L4 выбран из -NR5(CR6R7)t-, R5 выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, R6 и R7 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, t составляет 1 или 2, и предпочтительно 2; L4 предпочтительно представляет собой NR5CR6R7-; и L4 более предпочтительно представляет собой -NHCH2-.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате, линкерное звено -L- представляет собой -L1-L2-L3-L4-,

L1 представляет собой и s1 представляет собой целое число от 2 До 8;

L2 представляет собой химическую связь;

L3 представляет собой тетрапептидный остаток;

L4 представляет собой -NR5(CR6R7)t-, R5 выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, R6 и R7 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, и t составляет 1 или 2.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате, линкерное звено -L- представляет собой -L1-L2-L3-L4-,

L1 представляет собой -(сукцинимид-3-ил-N)-СН2-циклогексил-С(O)-;

L2 представляет собой -NR4(CH2CH2O)9CH2C(O)-;

L3 представляет собой тетрапептидный остаток;

L4 представляет собой -NR5(CR6R7)t-, R5 выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, R6 и R7 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, и t составляет 1 или 2.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате пептидный остаток L3 представляет собой аминокислотный остаток, состоящий из одной, двух или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из фенилаланина (Е), глицина (G), валина (V), лизина (К), цитруллина, серина (S), глутаминовой кислоты (Е) и аспарагиновой кислоты (N), предпочтительно аминокислотный остаток, состоящий из одной, двух или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из фенилаланина и глицина, более предпочтительно тетрапептидный остаток, и наиболее предпочтительно тетрапептидный остаток GGFG (глицин-глицин-фенилаланин-глицин).

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате, конец L1 линкерного звена -L- соединен с лигандом, и конец L4 линкерного звена -L- соединен с Y.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате -L-Y- представляет собой:

L1 выбран из группы, состоящей из -(сукцинимид-3-ил-N)-(СН2)s1-С(O)- и -(сукцинимид-3-ил-N)-СН2-циклогексил-С(O)-;

L2 представляет собой -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)- или химическую связь, а р1 представляет собой целое число от 6 до 12;

L3 представляет собой тетрапептидный остаток GGFG;

R1 представляет собой циклоалкилалкил или циклоалкил, и предпочтительно С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогеналкила и С3-6 циклоалкила, и предпочтительно атома водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил;

R5 выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, и R6 и R7 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила;

s1 представляет собой целое число от 2 до 8; и предпочтительно 5;

m представляет собой целое число от 0 до 4.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате -L-Y- представляет собой:

и предпочтительно представляет собой:

L2 представляет собой -NR4(CH2CH2O)9CH2C(O)-;

L3 представляет собой тетрапептидный остаток GGFG;

R1 представляет собой циклоалкилалкил или циклоалкил, и предпочтительно С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогеналкила и С3-6 циклоалкила, и предпочтительно атома водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил;

R5 выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, и R6 и R7 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила;

m представляет собой целое число от 0 до 4.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в предложенном конъюгате лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-L-Y-Dr) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате -L-Y- представляет собой:

L2 представляет собой химическую связь;

L3 представляет собой тетрапептидный остаток GGFG;

R1 представляет собой циклоалкилалкил или циклоалкил, и предпочтительно С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогеналкила и С3-6 циклоалкила, и предпочтительно атома водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил;

R5 выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, и R6 и R7 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила;

s1 представляет собой целое число от 2 до 8; и предпочтительно 5;

m представляет собой целое число от 0 до 4.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, где конъюгат лиганд-лекарственное средство содержит структуру формулы (-L-Y-):

которую можно применять для образования конъюгата лиганд-лекарственное средство путем соединения лекарственного средства и лиганда через линкерный фрагмент;

где:

L1 выбран из группы, состоящей из -(сукцинимид-3-ил-N)-(СН2)s1-С(O)- и -(сукцинимид-3-ил-N)-СН2-циклогексил-С(O)-;

L2 представляет собой -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)- или химическую связь, а р1 представляет собой целое число от 1 до 20;

L3 представляет собой тетрапептидный остаток GGFG;

R1 представляет собой циклоалкилалкил или циклоалкил, предпочтительно С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогеналкила и С3-6 циклоалкила, и предпочтительно атома водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил;

R5, R6 и R7 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила;

s1 представляет собой целое число от 2 до 8;

m представляет собой целое число от 0 до 4.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, где конъюгат лиганд-лекарственное средство содержит структуру формулы (-L-Y-):

где:

L2 представляет собой химическую связь;

L3 представляет собой тетрапептидный остаток GGFG;

R1 представляет собой циклоалкилалкил или циклоалкил, и предпочтительно С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогеналкила и С3-6 циклоалкила, и предпочтительно атома водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил;

R5 выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, и R6 и R7 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила;

s1 представляет собой целое число от 2 до 8;

m представляет собой целое число от 0 до 4.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения предложенный конъюгат лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-L-Y-Dr) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой конъюгат лиганд-лекарственное средство формулы (Рс-Ц-Y-Dr) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где:

W выбран из группы, состоящей из C1-8 алкила, C1-8 алкилциклоалкила и линейного гетероалкила, содержащего от 1 до 8 атомов, гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где C1-8 алкил, циклоалкил и линейный гетероалкил, каждый независимо, необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L2 выбран из группы, состоящей из -NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- и химической связи, где р1 представляет собой целое число от 1 до 20;

L3 представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, аминокислота может быть замещенной или незамещенной, при замещении, замещающая группа (группы) может быть замещена в любой доступной точке соединения, замещающая группа (группы) может представлять собой одну или более группу (группы), независимо выбранную из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

R1 выбран из группы, состоящей из галогена, циклоалкилалкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, гетероциклила, арила и гетероарила, предпочтительно циклоалкилалкила или циклоалкила, и более предпочтительно С3-6 циклоалкилалкила или С3-6 циклоалкила;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, гетероциклила, арила и гетероарила, и предпочтительно атома водорода; или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

R4 и R5 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

R6 и R7 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

m представляет собой целое число от 0 до 4;

n представляет собой ненулевое целое или десятичное число от 0 до 10, предпочтительно целое или десятичное число от 1 до 10;

Рс представляет собой лиганд.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения предложенный конъюгат лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-La-Y-Dr) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой конъюгат лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-Lb-Y-Dr) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где:

s1 представляет собой целое число от 2 до 8; и предпочтительно 5;

Рс, R1, R2, R5~R7, тип являются такими, как определено в формуле (Pc-La-Y-Dr).

Линкерное звено -L-Y- конъюгата лиганд-лекарственное средство согласно настоящему изобретению включает, но не ограничивается ими:

Конъюгаты лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-L-Y-Dr) согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими:

где Рс и n являются такими, как определено в формуле (Pc-La-Y-Dr).

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате Рс представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, при этом антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, гуманизированного антитела и полностью гуманизированного антитела, предпочтительно моноклонального антитела.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбрано из группы, состоящей из aHTH-HER2 (ErbB2) антитела, анти-EGFR антитела, анти-В7-Н3 антитела, анти-c-Met антитела, aHTH-HER3 (ErbB3) антитела, aHTH-HER4 (ErbB4) антитела, анти-CD20 антитела, анти-CD22 антитела, анти-CD30 антитела, анти-CD33 антитела, анти-CD44 антитела, анти-CD56 антитела, анти-CD70 антитела, анти-CD73 антитела, анти-CD105 антитела, анти-СЕА антитела, анти-АЗЗ антитела, анти-Cripto антитела, анти-EphA2 антитела, анти-G250 антитела, анти-MUCI антитела, анти-Льюис Y антитела, анти-VEGFR антитела, анти-GPNMB антитела, антитела к Интегрину, анти-PSMA антитела, антитела к Тенасцину С, aHTH-SLC44A4 антитела и антитела к Мезотелину и их антигенсвязывающих фрагментов.

В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в конъюгате лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвате антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбрано из группы, состоящей из Трастузумаба, Пертузумаба, Нимотузумаба, Эноблитузумаба, Эмибетузумаба, Инотузумаба, Пинатузумаба, Брентуксимаба, Гемтузумаба, Биватузумаба, Лорвотузумаба, cBR96 и Глематумамаба и их антигенсвязывающих фрагментов.

Конъюгаты лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-L-Y-Dr) согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, следующие формулы:

где n представляет собой ненулевое целое или десятичное число от 0 до 10, предпочтительно n представляет собой целое или десятичное число от 1 до 10; более предпочтительно n составляет от 2 до 8, которое может быть целым или десятичным числом; и наиболее предпочтительно n составляет от 3 до 8, которое может быть целым или десятичным числом.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено соединение формулы (D) или его таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смесь, или его фармацевтически приемлемая соль,

где:

Y выбран из группы, состоящей из -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-, -O-CR1R2-(CRaRb)m -, -O-CR1R2-, -NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)- и -S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-;

Ra и Rb являются одинаковыми или разными и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, атома дейтерия, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила, алкокси, гидрокси, амино, циано, нитро, гидроксиалкила, циклоалкила и гетероциклила;

или Ra и Rb совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

R1 выбран из группы, состоящей из галогена, циклоалкилалкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

или Ra и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

m представляет собой целое число от 0 до 4.

В предпочтительном варианте осуществления другого аспекта настоящего изобретения предлагаемое соединение формулы (D) или его таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смесь, или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой соединение формулы (D^ или его таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смесь, или его фармацевтически приемлемую соль,

где: R1 представляет собой С3-6 циклоалкилалкил или С3-6 циклоалкил;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогеналкила и С3-6 циклоалкила;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил; m составляет 0 или 1.

Соединения формулы (D) согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими:

или их таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смесь, или их фармацевтически приемлемую соль.

В предпочтительном варианте осуществления другого аспекта настоящего изобретения предложено соединение формулы (La-Y-Dr) или его таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смесь, или его фармацевтически приемлемая соль:

где

W выбран из группы, состоящей из C1-8 алкила, C1-8 алкилциклоалкила и линейного гетероалкила, содержащего от 1 до 8 атомов, гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где C1-8 алкил, циклоалкил и линейный гетероалкил, каждый независимо, необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

L2 выбран из группы, состоящей из -NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- и химической связи, где р1 представляет собой целое число от 1 до 20;

L3 представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, причем аминокислоты необязательно дополнительно замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила, при замещении, замещающая группа (группы) может быть замещена в любой доступной точке соединения, замещающая группа (группы) представляет собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из галогена, гидрокси, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкокси и циклоалкила;

R1 выбран из группы, состоящей из галогена, циклоалкилалкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила;

R2 выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкоксиалкила, гетероциклила, арила и гетероарила; или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклоалкил или гетероциклил;

R4 и R5 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

R6 и R7 являются одинаковыми или разными, и каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила;

m представляет собой целое число от 0 до 4.

В предпочтительном варианте осуществления другого аспекта настоящего изобретения предлагаемое соединение формулы (La-Y-Dr) или его таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смесь, или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой соединение формулы (Lb-Y-Dr) или его таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смесь, или его фармацевтически приемлемую соль,

где R1, R2, R5~R7, s1 и m являются такими, как определено в формуле (La-Y-Dr). Соединения формулы (La-Y-Dr) согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими:

или их таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смесь, или их фармацевтически приемлемую соль.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения соединения формулы (D1) или его таутомера, мезомера, рацемата, энантиомера, диастереомера или их смеси, или его фармацевтически приемлемой соли, включающий следующие стадии:

конденсация соединения формулы (Y1) и соединения формулы (Dr) с получением соединения формулы (D1),

где: R1, R2 и m являются такими, как определено в формуле (D1).

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения соединения формулы (Lb-Y-Dr) или его таутомера, мезомера, рацемата, энантиомера, диастереомера или их смеси, или его фармацевтически приемлемой соли, включающий следующие стадии:

конденсация соединения формулы (IA) и соединения формулы (IB) с получением соединения формулы (Lb-Y-Dr),

где: R1, R2, R5~R7, s1 и m являются такими, как определено в формуле (Lb-Y-Dr).

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения соединения формулы (Lb-Y-Dr) или его таутомера, мезомера, рацемата, энантиомера, диастереомера или их смеси, или его фармацевтически приемлемой соли, включающий следующие стадии:

конденсация соединения формулы (IA) и соединения формулы (IB) с получением соединения формулы (Lb-Y-Dr),

где: R1, R2, R5~R7, s1 и m являются такими, как определено в формуле (Lb-Y-Dr).

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения конъюгата лиганд-лекарственное средство формулы (Рс-La-Y-Dr) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, включающий следующую стадию, на которой:

Рс связывается с соединением формулы (La-Y-Dr) после восстановления с получением соединения формулы (Рс-La-Y-Dr); восстановитель предпочтительно представляет собой ТСЕР;

где:

Рс представляет собой лиганд;

W, L2, L3, R1, R2, R5~R7, m и n являются такими, как определено в формуле (Рс-La-Y-Dr).

Другой аспект настоящего изобретения также относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество конъюгата лиганд-лекарственное средство или соединения или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата согласно настоящему изобретению, и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.

Другой аспект настоящего изобретения также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (D) или его таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смесь или его фармацевтически приемлемую соль согласно настоящему изобретению, и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.

Другой аспект настоящего изобретения также относится к конъюгату лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвату, содержащему лиганд и лекарственное средство, связанное с лигандом, причем лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из соединения формулы (D), соединения формулы (La-Y-Dr) или его таутомера, мезомера, рацемата, энантиомера, диастереомера или их смеси или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящему изобретению, причем лекарственное средство предпочтительно связано с лигандом через линкер, и лиганд предпочтительно представляет собой моноклональное антитело.

Другой аспект настоящего изобретения также относится к способу получения конъюгата лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, включающему стадию связывания соединения формулы (D), соединения формулы (La-Y-Dr) или его таутомера, мезомера, рацемата, энантиомера, диастереомера или их смеси, или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящему изобретению, с лигандом, предпочтительно через линкер, и лиганд предпочтительно представляет собой моноклональное антитело.

Другой аспект настоящего изобретения также относится к конъюгату лиганд-лекарственное средство или соединению или его фармацевтически приемлемой соли или сольвату согласно настоящему изобретению, для применения в качестве лекарственного средства.

Другой аспект настоящего изобретения также относится к применению конъюгата лиганд-лекарственное средство или соединения, или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата или фармацевтической композиции, содержащей то же самое, согласно настоящему изобретению, для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения опухоли, и предпочтительно опухоль представляет собой рак, связанный с экспрессией HER2, HER3 или EGFR.

Другой аспект настоящего изобретения также относится к применению конъюгата лиганд-лекарственное средство или соединения, или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата или фармацевтической композиции, содержащей то же самое, согласно настоящему изобретению, для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения рака, при этом рак предпочтительно выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичников, рака шейки матки, рака матки, рака простаты, рака почки, рака уретры, рака мочевого пузыря, рака печени, рака желудка, рака эндометрия, рака слюнной железы, рака пищевода, меланомы, глиомы, нейробластомы, саркомы, рака легкого (например, мелкоклеточного рака легкого и немелкоклеточного рака легкого), рака толстой кишки, рака прямой кишки, коло ректального рака, лейкоза (например, острого лимфолейкоза, острого миелоидного лейкоза, острого промиелоцитарного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, хронического лимфолейкоза), рака костей, рака кожи, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, рака простаты и лимфомы (например, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы или рецидивирующей анапластической крупноклеточной лимфомы).

Другой аспект настоящего изобретения также относится к способу лечения и/или предотвращения опухоли, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества конъюгата лиганд-лекарственное средство или соединения или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, или фармацевтической композиции, содержащей то же самое, согласно настоящему изобретению, и предпочтительно опухоль представляет собой рак, связанный с экспрессией HER2, HER3 или EGFR.

Другой аспект настоящего изобретения также относится к способу лечения или предотвращения рака, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества конъюгата лиганд-лекарственное средство или соединения или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, или фармацевтической композиции, содержащей то же самое, согласно настоящему изобретению, при этом рак предпочтительно выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичников, рака шейки матки, рака матки, рака простаты, рака почки, рака уретры, рака мочевого пузыря, рака печени, рака желудка, рака эндометрия, рака слюнной железы, рака пищевода, меланомы, глиомы, нейробластомы, саркомы, рака легкого (например, мелкоклеточного рака легкого и немелкоклеточного рака легкого), рака толстой кишки, рака прямой кишки, кол о ректального рака, лейкоза (например, острого лимфолейкоза, острого миелоидного лейкоза, острого промиелоцитарного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, хронического лимфолейкоза), рака костей, рака кожи, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы и лимфомы (например, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы или рецидивирующей анапластической крупноклеточной лимфомы).

Активное соединение может быть приготовлено в форме, подходящей для введения любым подходящим путем, и активное соединение предпочтительно находится в форме стандартной дозы или в форме, в которой пациент может самостоятельно вводить разовую дозу. Форма стандартной дозы соединения или композиции согласно настоящему изобретению может представлять собой таблетку, капсулу, саше, микстуру в бутылках, порошок, гранулу, пастилку, суппозиторий, порошок для восстановления или жидкий препарат.

Дозировка соединения или композиции, используемых в способе лечения согласно настоящему изобретению, обычно будет варьироваться в зависимости от тяжести заболевания, массы тела пациента и относительной эффективности соединения. Однако, как правило, подходящая стандартная доза может составлять от 0,1 до 1000 мг.

В дополнение к активному соединению фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также содержать одно или более вспомогательных веществ, включая наполнитель (разбавитель), связующее вещество, смачивающий агент, разрыхлитель, вспомогательное вещество и тому подобные. В зависимости от способа введения композиция может содержать от 0,1 до 99% масс, активного соединения.

Фармацевтическая композиция, содержащая активный ингредиент, может быть в форме, подходящей для перорального введения, например, в форме таблетки, троше, пастилки, водной или масляной суспензии, диспергируемого порошка или гранулы, эмульсии, твердой или мягкой капсулы, сиропа или эликсира. Композиция для перорального применения может быть приготовлена любым известным в данной области способом приготовления фармацевтической композиции. Такая композиция может содержать связующие вещества, наполнители, смазывающие вещества, разрыхлители или фармацевтически приемлемые смачивающие агенты и тому подобное. Такая композиция также может содержать один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из подсластителей, вкусоароматических агентов, красителей и консервантов, чтобы обеспечить приятный и приемлемый на вкус фармацевтический состав.

Водная суспензия содержит активный ингредиент в смеси с вспомогательными веществами, подходящими для получения водной суспензии. Водная суспензия может также содержать один или более консервантов, один или более красителей, один или более вкусоароматических агентов и один или более подсластителей.

Масляную суспензию можно приготовить путем суспендирования активного ингредиента в растительном масле. Масляная суспензия может содержать загуститель. Вышеупомянутые подсластители и вкусоароматические агенты могут быть добавлены для получения приемлемого на вкус состава.

Фармацевтическая композиция также может представлять собой диспергируемый порошок и гранулы для приготовления водной суспензии, при этом предложено добавление воды к активному ингредиенту для смешивания с одним или более диспергирующими агентами, смачивающими агентами, суспендирующими агентами или консервантами. Также могут быть добавлены другие вспомогательные вещества, такие как подсластители, вкусоароматические агенты и красители. Эти композиции можно сохранить путем добавления антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению также может быть в форме эмульсии масло-в-воде.

Фармацевтическая композиция может быть в форме стерильного водного раствора для инъекций. Приемлемыми носителями или растворителями, которые можно применять, являются вода, раствор Рингера или изотонический раствор хлорида натрия. Стерильный состав для инъекций может представлять собой стерильную микроэмульсию масло в воде для инъекций, в которой активный ингредиент растворен в масляной фазе. Например, активный ингредиент растворяют в смеси соевого масла и лецитина. Затем масляный раствор добавляют к смеси воды и глицерина и обрабатывают с образованием микроэмульсии. Раствор для инъекций или микроэмульсию можно вводить в кровоток пациента путем местной болюсной инъекции. В качестве альтернативы, раствор и микроэмульсию предпочтительно вводить способом, который поддерживает постоянную циркулирующую концентрацию соединения согласно настоящему изобретению. Чтобы поддерживать эту постоянную концентрацию, можно применять устройство для непрерывной внутривенной доставки. Примером такого устройства является насос для внутривенного введения Deltec CADD-PLUS. ТМ. 5400.

Фармацевтическая композиция может быть в форме стерильной водной или масляной суспензии для инъекций для внутримышечного и подкожного введения. Такая суспензия может быть приготовлена с подходящими диспергирующими веществами или смачивающими агентами и суспендирующими агентами, как описано выше, в соответствии с известными методами. Стерильный состав для инъекций может также представлять собой стерильный раствор или суспензию для инъекций, приготовленную в нетоксичном приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе. Более того, стерильные нелетучие масла можно легко применять в качестве растворителя или суспендирующей среды.

Соединение согласно настоящему изобретению можно вводить в форме суппозитория для ректального введения. Данные фармацевтические композиции могут быть приготовлены путем смешивания лекарственного средства с подходящим нераздражающим вспомогательным веществом, которое является твердым при обычных температурах, но жидким в прямой кишке, тем самым расплавляясь в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такие материалы включают масло какао, глицерин желатин, гидрогенизированное растительное масло, смесь полиэтиленгликолей различной молекулярной массы и их сложные эфиры жирных кислот.

Специалистам в данной области хорошо известно, что дозировка лекарственного средства зависит от множества факторов, включая, помимо прочего, следующие факторы: активность конкретного соединения, возраст пациента, масса тела пациента, общее состояние здоровья пациента, поведение пациента, диета пациента, время введения, путь введения, скорость выведения, комбинация лекарственных средств и тому подобного. Кроме того, оптимальное лечение, такое как режим лечения, суточная доза соединения формулы (I) или тип его фармацевтически приемлемой соли, можно проверить в соответствии с традиционными терапевтическими схемами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1А: Результаты испытаний стабильности ADC-19 согласно настоящему изобретению в плазме.

Фигура 1В: Результаты испытаний стабильности ADC-18 согласно настоящему изобретению в плазме.

Фигура 1С: Результаты испытаний стабильности ADC-20 согласно настоящему изобретению в плазме.

Фигура 2: Оценка эффективности ADC-21 и ADC-24 согласно настоящему изобретению на мышах с опухолью JIMT-1.

Фигура 3: Оценка эффективности ADC согласно настоящему изобретению на голых мышах с ксенотрансплантатом опухоли клеток рака молочной железы человека SK-BR-3.

Фигура 4: Результаты испытаний стабильности ADC-25 согласно настоящему изобретению в плазме.

Фигура 5: Эффективность ADC согласно настоящему изобретению на голых мышах с ксенотрансплантатом опухоли астробластомы головного мозга человека U87MG.

Фигура 6: Эффективность ADC согласно настоящему изобретению на голых мышах с ксенотрансплантатом опухоли метастатических клеток плевральной жидкости карциномы пищевода человека Detroit 562.

Фигура 7: Эффективность ADC согласно настоящему изобретению на голых мышах с ксенотрансплантатом опухоли глиомы человека U87MG.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, согласуются с общим пониманием специалистов в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы в практике или при тестировании настоящего изобретения, в настоящей заявке описаны предпочтительные способы и материалы. При описании и предварительном рассмотрении настоящего изобретения используются следующие термины в соответствии со следующими определениями.

Когда в настоящем изобретении используется торговое наименование, заявитель подразумевает включение препаратов, генерического лекарственного средства и активных ингредиентов продукта под торговым наименованием.

Если не указано иное, термины, используемые в описании и формуле изобретения, имеют значения, описанные ниже.

«Лиганд» представляет собой макромолекулярное соединение, способное распознавать и связываться с антигенами или рецепторами, ассоциированными с клеткой-мишенью. Роль лиганда заключается в доставке лекарственного средства, связанного с лигандом, к популяции клеток-мишеней. Такие лиганды включают, но не ограничиваются ими, гормоны белковой природы, лектины, факторы роста, антитела или другие молекулы, способные связываться с клетками. В варианте осуществления настоящего изобретения лиганд представлен посредством Рс. Лиганд может образовывать связь со связывающим звеном через гетероатом на лиганде. Лиганд предпочтительно представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, гуманизированного антитела, полностью гуманизированного антитела или мышиного антитела и предпочтительно моноклонального антитела.

Термин «лекарственное средство» относится к цитотоксическому лекарственному средству, которое представлено как Dr, является химической молекулой, которая может сильно нарушить нормальный рост опухолевых клеток. В принципе, все цитотоксические лекарственные средства могут убивать опухолевые клетки в достаточно высокой концентрации. Однако оно может вызывать апоптоз нормальных клеток и серьезные побочные эффекты, убивая опухолевые клетки, вследствие отсутствия специфичности. Данный термин включает токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, радиоизотопы (например, радиоизотопы At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 и Lu), токсичные лекарственные средства, химиотерапевтические лекарственные средства, антибиотики и нуклеолитические ферменты, и предпочтительно токсичные лекарственные средства.

Термин «линкерное звено», «связывающий фрагмент» или «связывающее звено» относится к химическому структурному фрагменту или связи, который связан с лигандом на одном конце и связан с лекарственным средством на другом конце или связан с другими линкерами, а затем связан с лекарственным средством. Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения представлены посредством L и L1-L4, где конец L1 связан с лигандом, а конец L4 связан с лекарственным средством (Dr) через структурное звено Y.

Линкер, включая удлиняющее звено, спейсерное звено и аминокислотное звено, можно синтезировать способами, известными в данной области техники, такими как описанные в US 2005-0238649 А1. Линкер может представлять собой «отщепляемый линкер», который способствует высвобождению лекарственного средства в клетке. Например, можно применять кислото-неустойчивый линкер (например, гидразон), чувствительный к протеазе (например, чувствительный к пептидазе) линкер, чувствительный к свету линкер, диметиловый линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al, Cancer Research 52: 127-131 (1992); U.S. Pat. No. 5,208,020).

Термин «конъюгат лиганд-лекарственное средство» обозначает, что лиганд связан с биологически активным лекарственным средством через стабильное связывающее звено. В настоящем описании «конъюгат лиганд-лекарственное средство» предпочтительно представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), что означает, что моноклональное антитело или фрагмент антитела связаны с токсичным лекарственным средством, обладающим биологической активностью, через стабильное связывающее звено.

Трехбуквенные коды и однобуквенные коды аминокислот, используемые в настоящем описании, описаны в J. biol. chem, 243, р 3558 (1968).

Термин «антитело» относится к иммуноглобулину, структуре из четырех пептидных цепей, связанных между собой межцепочечной дисульфидной связью между двумя идентичными тяжелыми цепями и двумя идентичными легкими цепями. Разные константные области тяжелой цепи иммуноглобулина имеют разные аминокислотные составы и последовательности, следовательно, обладают разной антигенностью. Соответственно, иммуноглобулины можно разделить на пять типов или так называемых изотипов иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgAn IgE, с соответствующими тяжелыми цепями μ, δ, γ, α и ε соответственно. В соответствии с аминокислотным составом шарнирной области и количеством и расположением дисульфидных связей тяжелой цепи, один и тот же тип lg можно дополнительно разделить на разные подтипы, например, IgG можно разделить на lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4. Легкую цепь можно разделить на к- или А-цепи на основе различных константных областей. Каждые пять типов lg могут иметь цепь к или λ. Антитела, описанные в настоящем изобретении, предпочтительно представляют собой специфические антитела против антигенов клеточной поверхности на клетках-мишенях, неограничивающими примерами являются одно или более из следующих антител: анти-HER2 (ErbB2) антитело, анти-EGFR антитело, анти-В7-Н3 антитело, анти-c-Met антитело, анти-HER3 (ErbB3) антитело, анти-HER4 (ErbB4) антитело, анти-CD20 антитело, анти-CD22 антитело, анти-CD30 антитело, анти-CD33 антитело, анти-CD44 антитело, анти-CD56 антитело, анти-CD70 антитело, анти-CD73 антитело, анти-CD105 антитело, анти-СЕА антитело, анти-А33 антитело, анти-Cripto антитело, анти-EphA2 антитело, анти-G250 антитело, анти-MUCI антитело, анти-Льюис Y антитело, анти-VEGFR антитело, анти-GPNMB антитело, антитело к Интегрину, анти-PSMA антитело, антитело к Тенасцину С, анти-SLC44A4 антитело или антитело к Мезотелину, и предпочтительно Трастузумаб (торговое название Герцептин), Пертузумаб (также известный как 2С4, торговое название Perjeta), Нимотузумаб (торговое название Taixinsheng), Эноблитузумаб, Эмибетузумаб, Инотузумаб, Пинатузумаб, Брентуксимаб, Гемтузумаб, Биватузумаб, Лорвотузумаб, cBR96 и Глематумамаб.

Последовательность из примерно 110 аминокислот, примыкающая к N-концу тяжелых цепей или легких цепей антитела, является сильно вариабельной, известной как вариабельная область (Fv область); остальная часть аминокислотной последовательности, примыкающая к С-концу, является относительно стабильной и известна как константная область. Вариабельная область включает три гипервариабельных области (HVR) и четыре относительно консервативных каркасных области (FR). Три гипервариабельные области, которые определяют специфичность антитела, также известны как области, определяющие комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR) или каждая вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) состоит из трех областей CDR и четырех областей FR, которые последовательно расположены от аминоконца до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Три CDR области легкой цепи обозначают как LCDR1, LCDR2 и LCDR3; и три CDR области тяжелой цепи обозначают как HCDR1, HCDR2 и HCDR3.

Антитела согласно настоящему изобретению включают мышиные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела и полностью гуманизированные антитела, и предпочтительно гуманизированные антитела и полностью гуманизированные антитела.

Термин «мышиное антитело» в настоящем изобретении относится к антителу, полученному из мыши в соответствии со знаниями и навыками в данной области техники. Во время приготовления испытуемому субъекту вводят специфический антиген, а затем выделяют гибридому, экспрессирующую антитело, которое обладает желаемой последовательностью или функциональными характеристиками.

Термин «химерное антитело» означает антитело, полученное путем слияния вариабельной области мышиного антитела с константной областью человеческого антитела, и химерное антитело может ослаблять иммунный ответ, индуцированный мышиным антителом. Для создания химерного антитела создают гибридому, секретирующую мышиное специфическое моноклональное антитело, и ген вариабельной области клонируют из мышиной гибридомной клетки; затем при необходимости клонируют ген константной области человеческого антитела; и ген константной области человека соединяют с геном вариабельной области мыши с образованием химерного гена, который впоследствии вставляют в вектор экспрессии; наконец, молекула химерного антитела экспрессируется в эукариотической или прокариотической системе.

Термин «гуманизированное антитело», которое также известно как антитело с привитой CDR, относится к антителу, полученному путем прививания мышиных последовательностей CDR в каркасную область вариабельной области человеческого антитела, т.е. к антителу, продуцируемому с различными типами последовательностей каркасной области антитела зародышевой линии человека. Гуманизированное антитело может преодолевать гетерологичные ответы, вызванные большим количеством белковых компонентов мыши, переносимых химерным антителом. Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступной базы данных ДНК, охватывающей последовательности генов антител зародышевой линии, или из опубликованных ссылок. Например, последовательности ДНК зародышевой линии генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека также можно найти в базе данных последовательностей зародышевой линии человека «VBase» (доступной во всемирной сети по адресу: www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), а также у Kabat, Е.A., et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Чтобы избежать снижения активности, вызванного снижением иммуногенности, каркасные последовательности в вариабельной области человеческого антитела можно подвергать минимальным обратимым мутациям или обратным мутациям для поддержания активности. Гуманизированное антитело согласно настоящему изобретению также включает гуманизированное антитело, в котором созревание аффинности CDR осуществляется с помощью фагового отображения. Документы, которые дополнительно описывают способы применения мышиных антител, участвующих в гуманизации, включают, например, Queen et al., Proa, Natl.Acad.Sci.USA, 88, 2869, 1991, и Winter and colleagues' method [Jones et al., Nature, 321, 522(1986), Riechmann et al., Nature, 332, 323-327(1988), Verhoeyen et al., Science, 239, 1534(1988)].

Термин «полностью гуманизированное антитело» также известен как «полностью гуманизированное моноклональное антитело», где вариабельная область и константная область антитела имеют человеческое происхождение, что исключает иммуногенность и побочные эффекты. Разработка моноклональных антител проходит четыре этапа, а именно: мышиное моноклональное антитело, химерное моноклональное антитело, гуманизированное моноклональное антитело и полностью гуманизированное моноклональное антитело. Антитело согласно настоящему изобретению представляет собой полностью гуманизированное моноклональное антитело. Сопутствующие технологии получения полностью гуманизированных антител в основном включают технологию гибридомы человека, технологию трансформированных EBV В-лимфоцитов, технологию фагового отображения, технологию получения антител трансгенных мышей, технологию получения единичных В-клеток и тому подобное.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к одному или более фрагментам антитела, сохраняющим способность к специфическому связыванию с антигеном. Было показано, что фрагменты полноразмерного антитела можно применять для достижения функции связывания с антигеном. Примеры связывающих фрагментов в термине «антигенсвязывающий фрагмент» включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из домена VL, VH, CL и СН1; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, соединенных дисульфидной связью в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1; (iv) Fv фрагмент, состоящий из доменов VH и VL одноэлементного антитела; (v) однодоменный или фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546), состоящий из домена VH; и (vi) выделенную область, определяющую комплементарность, (CDR) или (vii) комбинацию двух или более выделенных CDR, необязательно соединенных синтетическим линкером. Кроме того, хотя домен VL и домен VH фрагмента Fv кодируются двумя отдельными генами, они могут быть соединены синтетическим линкером с применением рекомбинантных способов, тем самым генерируя единую белковую цепь одновалентной молекулы, образованной спариванием домена VL и VH (называемый одноцепочечным Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science: 242:423-426, и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Это одноцепочечное антитело также предназначено для включения в термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Такие фрагменты антител получают с применением обычных методов, известных специалистам в данной области техники, и проверяют на наличие функциональных фрагментов с применением того же способа, что и для интактного антитела. Антигенсвязывающие участки можно получить с помощью технологии рекомбинантной ДНК или ферментативного или химического разрушения интактного иммуноглобулина. Антитела могут представлять собой антитела разных изотипов, например, IgG (например, подтип lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4), антитела lgA1, lgA2, IgD, IgE или IgM.

Fab представляет собой фрагмент антитела, полученный обработкой молекулы антитела IgG папаином (который расщепляет аминокислотный остаток в положении 224 Н-цепи). Фрагмент Fab имеет молекулярную массу примерно 50000 и обладает антигенсвязывающей активностью, в которой примерно половина N-концевой стороны Н-цепи и вся L-цепь связаны друг с другом посредством дисульфидной связи.

F(ab')2 представляет собой фрагмент антитела, полученный путем гидролиза ниже расположенной части двух дисульфидных связей в шарнирной области IgG пепсином, который имеет молекулярную массу примерно 100000, обладает антигенсвязывающей активностью и включает две области Fab, которые связаны в положении шарнирной области.

Fab' представляет собой фрагмент антитела, полученный расщеплением дисульфидной связи в шарнирной области указанного выше F(ab')2, который имеет молекулярную массу примерно 50000 и обладает антигенсвязывающей активностью.

Более того, Fab' можно получить путем вставки ДНК, кодирующей Fab' фрагмент антитела, в прокариотический вектор экспрессии или эукариотический вектор экспрессии, который затем вводят в прокариот или эукариот для экспрессии Fab'.

Термин «одноцепочечное антитело», «одноцепочечный Fv» или «scFv» относится к молекуле, содержащей вариабельный домен тяжелой цепи антитела (или область; VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (или область; VL), соединенные линкером. Такие молекулы scFv могут иметь общую структуру NH2-VL-линкер-VH-COOH или NH2-VH-линкер-VL-СООН. Подходящий линкер в предшествующем уровне техники состоит из повторяющейся аминокислотной последовательности GGGGS или ее варианта, например, с применением варианта с 1-4 повторами (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Другие линкеры, которые можно применять в настоящем изобретении, описаны в Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.

Термин «CDR» относится к одной из шести гипервариабельных областей в вариабельном домене антитела, который в первую очередь способствует связыванию антигена. Одно из наиболее часто используемых определений шести CDR предложено в Kabat Е. A. et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication 91-3242. В данном контексте определение CDR по Кэботу применяется только к CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи (CDR L1, CDR L2, CDR L3 или L1, L2, L3), а также к CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи (CDR Н2, CDR Н3 или Н2, Н3).

Термин «каркас антитела» относится к части вариабельного домена VL или VH, которая служит каркасом для антигенсвязывающей петли (CDR) вариабельного домена. По сути, он представляет собой вариабельный домен без CDR.

Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к сайту антигена, с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитопы обычно включают по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 смежных или несмежных аминокислот в уникальной пространственной конформации. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Термины «специфическое связывание», «селективное связывание», «селективно связывает» и «специфическое связывание» относятся к связыванию антитела с эпитопом на заранее определенном антигене. Обычно антитело связывается с аффинностью (KD) менее примерно 10-7 М, например приблизительно менее примерно 10-8 М, 10-9 М или 10-10М или менее.

Термин «молекула нуклеиновой кислоты» относится к молекуле ДНК и молекуле РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК. Нуклеиновая кислота является «эффективно связанной», когда она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, если промотор или энхансер влияет на транскрипцию кодирующей последовательности, промотор или энхансер эффективно связывается с кодирующей последовательностью.

Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В одном варианте осуществления вектор представляет собой «плазмиду», которая относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую можно лигировать дополнительный сегмент ДНК. В другом варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительный сегмент ДНК может быть лигирован в вирусный геном. Раскрытые в настоящей заявке векторы способны к саморепликации в клетке-хозяине, в которую они были введены (например, бактериальный вектор, имеющий точку начала репликации бактерий и эписомальный вектор млекопитающего), или могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяин, тем самым осуществляя репликацию вместе с геномом хозяина (например, неэписомальный вектор млекопитающего).

Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области, например, в Cold Spring Harbor Antibody Technical Guide, Chapters 5-8 and 15. Антигенсвязывающий фрагмент также может быть получен обычными способами. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению генетически сконструированы для добавления одной или более областей FR человека в нечеловеческие области CDR. Последовательность(и) зародышевой линии человека FR может быть получена с помощью выравнивания баз данных генов вариабельных областей зародышевых линий человеческого антитела IMGT и с помощью программного обеспечения МОЕ с веб-сайта ImMunoGeneTics (IMGT), доступного по адресу https://imgt.cines.fr или в Journal of Immunoglobulins 20011SBN012441351.

Термин «клетка-хозяин» относится к клетке, в которую был введен вектор экспрессии. Клетки-хозяева могут включать бактериальные, микробные, растительные или животные клетки. Бактерии, подверженные трансформации, включают представителей Enterobacteriaceae, таких как штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, такие как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Подходящие микроорганизмы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие линии клеток-хозяев животных включают клетки СНО (линия клеток яичника китайского хомячка) и NSO клетки.

Сконструированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению можно получить и очистить обычными способами. Например, последовательность(и) кДНК, кодирующая тяжелую цепь и легкую цепь, может быть клонирована и рекомбинирована в вектор экспрессии GS. Вектор экспрессии рекомбинантного иммуноглобулина можно стабильно трансфицировать в клетки СНО. В случае рекомендуемой существующей технологии, системы экспрессии млекопитающих могут приводить к гликозилированию антител, особенно в высококонсервативном N-концевом сайте области Fc. Положительные клоны накапливают в бессывороточной среде в биореакторе для получения антител. Культуральная среда, содержащая секретируемое антитело, может быть очищена обычным способом. Например, очистку проводят с применением колонки А или G Sepharose FF, которая содержит подобранный буфер. Неспецифически связанные компоненты удаляют элюированием. Связанное антитело элюируют способом градиента рН, и фрагменты антитела обнаруживают с помощью SDS-PAGE и собирают.Антитело можно фильтровать и концентрировать обычным способом. Растворимые агрегаты и мультимеры также можно удалить обычными способами, такими как гель-фильтрация или ионный обмен. Полученный продукт следует немедленно заморозить, например, при -70°С, или лиофилизировать.

Термин «пептид» относится к фрагменту соединения между аминокислотой и белком, состоящему из двух или более молекул аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями. Пептиды представляют собой структурные и функциональные фрагменты белков. Гормоны, ферменты и тому подобные по существу являются пептидами.

Термин «сахарид» относится к биологической макромолекуле, состоящей из трех элементов: С, Н и О, который можно разделить на моносахариды, дисахариды и полисахариды.

Термин «флуоресцентный зонд» относится к разновидности флуоресцентных молекул с характерной флуоресценцией в ультрафиолетовой, видимой и ближней инфракрасной областях. Свойства флуоресценции флуоресцентного зонда (длины волн возбуждения и излучения, интенсивность, время жизни и поляризация и т.д.) могут с чувствительностью варьироваться в зависимости от свойств окружающей среды, таких как полярность, показатель преломления, вязкость и т.д. Нековалентное взаимодействие между флуоресцентным зондом и нуклеиновой кислотой (ДНК или РНК), белком или другой макромолекулярной структурой позволяет изменять одно или более флуоресцентных свойств, которые можно использовать для изучения свойства и поведения макромолекулярного вещества.

Термин «токсичное лекарственное средство» относится к веществу, которое ингибирует или останавливает функционирование клеток и/или вызывает гибель или разрушение клеток. Токсичные лекарственные средства включают токсины и другие соединения, которые можно применять для лечения опухолей.

Термин «токсин» относится к любому веществу, которое может оказывать вредное воздействие на рост или пролиферацию клеток. Токсины могут представлять собой низкомолекулярные токсины и их производные из бактерий, грибов, растений или животных, включая производные камптотецина, такие как экзатекан, майтанзиноид и его производные (CN 101573384), такие как DM1, DM3, DM4, ауристатин F (AF) и его производные, такие как MMAF, ММАЕ, 3024 (WO 2016/127790 А1, соединение 7), дифтерийный токсин, экзотоксин, цепь рицина А, цепь абрина А, модекцин, а-сарцин, токсичный белок Aleutites fordii, токсичный белок диантина, токсичный белок Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены.

Термин «химиотерапевтическое лекарственное средство» относится к химическому соединению, которое можно применять для лечения опухолей. Это определение также включает антигормональные агенты, которые действуют посредством модулирования, уменьшения, блокировки или подавления эффектов гормонов, способствующих росту рака, которые часто применяют в форме системной или холистической терапии. Они могут представлять собой гормоны. Примеры химиотерапевтических лекарственных средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа; циклофосфамид (CYTOXAN™); алкилсульфонат, такой как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридин, такой как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; азиридин и метиламеламин, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид,

триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, нитробина гидрохлорид; мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин С, калихеамицин, карабицин, хромомицин, карзинофилин, хромомицин, актиномицин D, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-окси-1_-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицин, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин; стрептозоцин, туберкулоцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги птерина, такие как флударабин, 6-меркаптоптерин, тиометоптерин (thiomethopterin), тиогуаноптерин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азуридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксиуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналины, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; пополнители фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидгликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эльфомитин; эллиптиния ацетат; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пинтостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; дибромодульцит; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-С"); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, такие как паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси) и доцетаксел (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Франция); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навельбин; новантрон; тенипозид; даунорубицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота, эсперамицины; капецитабин; и фармацевтически приемлемую соль, кислоту или производное любого из вышеуказанных веществ. Данное определение также включает антигормональные агенты, которые могут модулировать или ингибировать действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включая тамоксифен, ралоксифен, ингибитор ароматазы 4(5)-имидазол, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и фарестон; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемую соль, кислоту или производное любого из вышеуказанных веществ.

Термин «алкил» относится к насыщенной алифатической углеводородной группе, которая представляет собой группу с прямой или разветвленной цепью, содержащую от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно алкил, содержащий от 1 до 12 атомов углерода, более предпочтительно алкил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, и наиболее предпочтительно алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода. Неограничивающие примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метилпропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил, н-гептил, 2- метилгексил, 3-метилгексил, 4-метилгексил, 5-метилгексил, 2,3-диметилпентил, 2,4-диметилпентил, 2,2-диметилпентил, 3,3-диметилпентил, 2-этилпентил, 3-этилпентил, н-октил, 2,3-диметилгексил, 2,4-диметилгексил, 2,5-диметилгексил, 2.2- диметилгексил, 3,3-диметилгексил, 4,4-диметилгексил, 2-этилгексил, 3-этилгексил, 4-этилгексил, 2-метил-2-этилпентил, 2-метил-3-этилпентил, n-нонил, 2-метил-2-этилгексил, 2-метил-3-этилгексил, 2,2-диэтилпентил, н-децил, 3.3-диэтилгексил, 2,2-диэтилгексил и их различные разветвленные изомеры. Более предпочтительно, алкильная группа представляет собой низший алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода, и неограничивающие примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, н-гексил, 1-этил-2-метилпропил, 1,1,2-триметилпропил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2-этилбутил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 2,3-диметилбутил и тому подобные. Алкил может быть замещенным или незамещенным. При замещении замещающая группа (группы) может быть замещена в любой доступной точке соединения. Замещающая группа (группы) предпочтительно представляет собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, тиола, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклилтио и оксо.

Термин «гетероалкил» относится к алкилу, содержащему один или более гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где алкил представляет собой такой, как определено выше.

Термин «алкилен» относится к насыщенной линейной или разветвленной алифатической углеводородной группе, имеющей два остатка, образованных удалением двух атомов водорода от одного и того же атома углерода или двух разных атомов углерода исходного алкана. Алкилен представляет собой линейную или разветвленную группу, содержащую от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 12 атомов углерода и более предпочтительно от 1 до 6 атомов углерода. Неограничивающие примеры алкилена включают, но не ограничиваются ими, метилен (-СН2-), 1,1-этилен (-СН(СН3)-), 1,2-этилен (-СН2СН2)-, 1,1-пропилен (-СН(СН2СН3)-), 1,2-пропилен (-СН2СН(СН3)-), 1,3-пропилен (-СН2СН2СН2-), 1,4-бутилен (-СН2СН2СН2СН2-), 1,5-пентилен (-СН2СН2СН2СН2СН2-) и тому подобное. Алкилен может быть замещенным или незамещенным. При замещении замещающая группа (группы) может быть замещена в любой доступной точке соединения. Замещающая группа (группы) предпочтительно представляет собой одну или более групп, независимо необязательно выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, тиола, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероалкокси, циклоалкилтио, гетероциклилтио и оксо.

Термин «алкокси» относится к группе -О-(алкил) или -O-(незамещенный циклоалкил), где алкил и циклоалкил являются такими, как определено выше. Неограничивающие примеры алкокси включают метокси, этокси, пропокси, бутокси, циклопропилокси, циклобутилокси, циклопентилокси, циклогексилокси. Алкокси может быть необязательно замещенным или незамещенным. При замещении замещающая группа (группы) предпочтительно представляет собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, тиола, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио и гетероциклилтио.

Термин «циклоалкил» относится к насыщенной или частично ненасыщенной моноциклической или полициклической углеводородной замещающей группе, имеющей от 3 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 3 до 12 атомов углерода, более предпочтительно от 3 до 10 атомов углерода и наиболее предпочтительно от 3 до 8 атомов углерода. Неограничивающие примеры моноциклического циклоалкила включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогексадиенил, циклогептил, циклогептатриенил, циклооктил и тому подобное. Полициклический циклоалкил включает циклоалкил, имеющий спирокольцо, конденсированное кольцо или кольцо с внутренним мостиком.

Термин «гетероциклил» относится к 3-20-членной насыщенной или частично ненасыщенной моноциклической или полициклической углеводородной группе, в которой один или более атомов в кольце представляют собой гетероатомы, выбранные из группы, состоящей из N, О и S(O)m (где m представляет собой целое число от 0 до 2), но за исключением -О-О-, -O-S- или -S-S- в кольце, и остальные атомы в кольце представляют собой атомы углерода. Предпочтительно гетероциклил имеет от 3 до 12 атомов в кольце, где от 1 до 4 атомов представляют собой гетероатомы; и более предпочтительно от 3 до 10 атомов в кольце. Неограничивающие примеры моноциклического гетероциклила включают пирролидинил, пиперидинил, пиперазинил, морфолинил, тиоморфолинил, гомопиперазинил и тому подобное. Полициклический гетероциклил включает гетероциклил, имеющий спирокольцо, конденсированное кольцо или кольцо с внутренним мостиком.

Термин «спирогетероциклил» относится к 5-20-членной полициклической гетероциклильной группе с отдельными кольцами, соединенными через один общий атом (называемый спироатомом), где один или более атомов в кольце представляют собой гетероатомы, выбранные из группы, состоящей из N, О и S(O)m (где m представляет собой целое число от 0 до 2), причем остальные атомы в кольце представляют собой атомы углерода, где кольца могут содержать одну или более двойных связей, но ни одно из колец не имеет полностью сопряженной - электронной системы. Спирогетероциклил предпочтительно представляет собой 6-14-членный спирогетероциклил, и более предпочтительно 7-10-членный спирогетероциклил. По количеству спироатомов, общих между кольцами, спирогетероциклил можно разделить на моноспиро-гетероциклил, диспиро-гетероциклил или полиспиро-гетероциклил, и спирогетероциклил предпочтительно представляет собой моноспиро-гетероциклил или диспиро-гетероциклил, и более предпочтительно 4-членный/4-членный, 4-членный/5-членный, 4-членный/6-членный, 5-членный/5-членный или 5-членный/6-членный моноспиро-гетероциклил. Неограничивающие примеры спирогетероциклила включают:

Термин «конденсированный гетероциклил» относится к 5-20-членной полициклической гетеро цикл ильной группе, где каждое кольцо в системе имеет общую соседнюю пару атомов с другим кольцом, где одно или более колец могут содержать одну или более двойных связей, но ни одно из колец не имеет полностью сопряженной тт-электронной системы, и в при этом один или более атомов в кольце являются гетероатомами, выбранными из группы, состоящей из N, О и S(O)m (где m представляет собой целое число от 0 до 2), а оставшиеся атомы в кольце являются атомами углерода. Конденсированный гетероциклил предпочтительно представляет собой 6-14-членный конденсированный гетероциклил, и более предпочтительно 7-10-членный конденсированный гетероциклил. По количеству колец-членов конденсированный гетероциклил можно разделить на бициклический, трициклический, тетрациклический или полициклический конденсированный гетероциклил, и конденсированный гетероциклил предпочтительно представляет собой бициклический или трициклический конденсированный гетероциклил, и более предпочтительно 5-членный/5-членный или 5-членный/6-членный бициклический конденсированный гетероциклил. Неограничивающие примеры конденсированного гетероциклила включают:

Термин «мостиковый гетероциклил» относится к 5-14-членной полициклической гетероциклильной группе, в которой каждые два кольца в системе имеют два общих атома, не связанных друг с другом, причем кольца могут иметь одну или более двойных связей, но ни одно из колец не имеет полностью сопряженной тт-электронной системы, и в которой один или более атомов в кольце представляют собой гетероатомы, выбранные из группы, состоящей из N, О и S(O)m (где m представляет собой целое число от 0 до 2), а остальные атомы в кольце представляют собой атомы углерода. Мостиковый гетероциклил предпочтительно представляет собой 6-14-членный мостиковый гетероциклил, и более предпочтительно 7-10-членный мостиковый гетероциклил. По количеству членов-колец мостиковый гетероциклил может быть разделен на бициклический, трициклический, тетрациклический или полициклический мостиковый гетероциклил, и мостиковый гетероциклил предпочтительно представляет собой бициклический, трициклический или тетрациклический мостиковый гетероциклил или, более предпочтительно, бициклический или трициклический мостиковый гетероциклил. Неограничивающие примеры гетероциклила с внутренним мостиком включают:

Гетероциклильное кольцо может быть конденсировано с кольцом арила, гетероарила или циклоалкила, где кольцо, связанное с исходной структурой, представляет собой гетероциклил. Их неограничивающие примеры включают:

и подобные.

Гетероциклил может быть необязательно замененным или незамещенным. При замещении замещающая группа (группы) предпочтительно представляет собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, тиола, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио, гетероциклилтио и оксо.

Термин «арил» относится к 6-14-членному полностью углеродному моноциклическому кольцу или полициклическому конденсированному кольцу (то есть каждое кольцо в системе разделяет соседнюю пару атомов углерода с другими кольцами в системе), имеющему сопряженную -электронную систему, предпочтительно 6-10-членному арилу, например фенилу и нафтилу, и предпочтительно фенилу. Арильное кольцо может быть конденсировано с кольцом гетероарила, гетероциклила или циклоалкила, где кольцо, связанное с исходной структурой, представляет собой арильное кольцо. Их неограничивающие примеры включают:

Арил может быть замещенным или незамещенным. При замещении замещающая группа (группы) предпочтительно представляет собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, тиола, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио и гетероциклилтио.

Термин «гетероарил» относится к 5-14-членной гетероароматической системе, содержащей от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из О, S и N. Гетероарил предпочтительно представляет собой 5-10-членный гетероарил, более предпочтительно 5 или 6-членный гетероарил, например, фурил, тиенил, пиридил, пирролил, N-алкилпирролил, пиримидинил, пиразинил, имидазолил, тетразолил и тому подобное. Гетероарильное кольцо может быть конденсировано с кольцом арила, гетероциклила или циклоалкила, где кольцо, связанное с исходной структурой, представляет собой гетероарильное кольцо. Их неограничивающие примеры включают:

Гетероарил может быть необязательно замещенным или незамещенным. При замещении замещающая группа (группы) предпочтительно представляет собой одну или более групп, независимо выбранных из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, алкокси, алкилтио, алкиламино, галогена, тиола, гидрокси, нитро, циано, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила, циклоалкокси, гетероциклоалкокси, циклоалкилтио и гетероциклилтио.

Термин «аминозащитная группа» относится к группе, которая предотвращает аминогруппу от реакции, когда другие части молекулы подвергаются реакции, и которая может быть легко удалена. Неограничивающие примеры включают 9-флуоренилметилоксикарбонил, трет-бутокси карбон ил, ацетил, бензил, аллил, п-метоксибензил и тому подобные. Эти группы могут быть необязательно замещены посредством от одного до трех заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена, алкокси и нитро. Аминозащитная группа предпочтительно представляет собой 9-флуоренилметилоксикарбонил.

Термин «циклоалкилалкил» относится к алкильной группе, замещенной одним или более, предпочтительно одним, циклоалкилом(ами), где алкил и циклоалкил представляют собой, как определено выше.

Термин «галогеналкил» относится к алкильной группе, замещенной одним или более галогенами, где алкил представляет собой, как определено выше.

Термин «дейтерированный алкил» относится к алкильной группе, замещенной одним или более атомами дейтерия, где алкил представляет собой такой, как определено выше.

Термин «гидрокси» относится к группе -ОН.

Термин «галоген» относится к фтору, хлору, брому или йоду.

Термин «амино» относится к группе -NH2.

Термин «нитро» относится к группе -NO2.

Термин «амид» относится к группе-C(O)N(алкил) или -С(O)N(циклоалкил), где алкил и циклоалкил представляют собой, как определено выше.

Термин «алкоксикарбонил» относится к группе -С(O)O(алкил) или -С(O)O(циклоалкил), где алкил и циклоалкил представляют собой, как определено выше.

Настоящее изобретение также включает соединения формулы (I) в различных дейтерированных формах. Каждый из доступных атомов водорода, присоединенный к атому углерода, может быть независимо заменен атомом дейтерия. Специалисты в данной области техники могут синтезировать соединение формулы (I) в дейтерированной форме со ссылкой на соответствующую литературу. Соединение формулы (I) в дейтерированной форме может быть получено с использованием коммерчески доступных дейтерированных исходных материалов, или они могут быть синтезированы обычными методами с применением дейтерированных реагентов, включая, помимо прочего, дейтерированный боран, тридейтерированный боран в тетрагидрофуране, дейтерированный литий-алюминий гидрид, дейтерированный йодэтан, дейтерированный йодметан и тому подобное.

«Необязательный» или «необязательно» означает, что событие или обстоятельство, описанное впоследствии, может, но не обязательно, произойти, и такое описание включает ситуацию, в которой событие или обстоятельство происходит или не происходит. Например, «гетероциклил, необязательно замещенный алкилом» означает, что алкильная группа может присутствовать, но не обязательно, и такое описание включает ситуацию, когда гетероциклил замещен алкилом и гетероциклил не замещен алкилом.

«Замещенный» относится к одному или более атомам водорода в группе, предпочтительно до 5, а более предпочтительно от 1 до 3 атомам водорода, независимо замещенным соответствующим числом заместителей. Разумеется, заместители существуют только в возможном для них химическом положении. Специалист в данной области техники может без чрезмерных усилий определить, является ли замещение возможным или невозможным, экспериментально или теоретически. Например, комбинация амино или гидрокси, имеющая свободный водород и атомы углерода, имеющие ненасыщенные связи (например, олефиновые), может быть нестабильной.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к смеси одного или более описанных в настоящей заявке соединений или их физиологически/фармацевтически приемлемых солей или пролекарств с другими химическими компонентами и другими компонентами, такими как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Назначение фармацевтической композиции состоит в том, чтобы облегчить введение соединения в организм, что способствует абсорбции активного ингредиента, чтобы проявлять биологическую активность.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» или «фармацевтическая соль» относится к соли конъюгата лиганд-лекарственное средство согласно настоящему изобретению или к соли соединения согласно настоящему изобретению, которая является безопасной и эффективной для млекопитающих и имеет желаемую биологическую активность. Конъюгат лиганд-лекарственное средство согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну аминогруппу, поэтому он может образовывать соль с кислотой. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых солей включают гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, бисульфат, цитрат, ацетат, сукцинат, аскорбат, оксалат, нитрат, сорбат, гидрофосфат, дигидрофосфат, салицилат, гидроцитрат, тартрат, малеат, фумарат, формиат, бензоат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, п-тол уол сул ьфо нат.

Термин «сольват» относится к фармацевтически приемлемому сольвату, образованному конъюгатом лиганд-лекарственное средство согласно настоящему изобретению с одной или более молекулами растворителя. Неограничивающие примеры молекул растворителя включают воду, этанол, ацетонитрил, изопропанол, ДМСО, этилацетат.

Термин «загрузка лекарственным средством» относится к среднему количеству цитотоксических лекарственных средств, загруженных на каждый лиганд в соединении формулы (I), и также может быть выражена как отношение количества лекарственного средства к количеству антитела. Загрузка лекарственным средством может находиться в диапазоне от 0 до 12, предпочтительно от 1 до 10 цитотоксических лекарственных средств (D) на лиганд (Рс). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения загрузка лекарственным средством выражается как n, а примерные значения могут составлять в среднем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Среднее количество лекарственных средств на молекулу ADC после реакции сочетания может быть определено обычными способами, такими как УФ/видимая спектроскопия, масс-спектрометрия, тест ELISA и определение характеристик посредством ВЭЖХ.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения цитотоксическое лекарственное средство конъюгировано с N-концевой аминогруппой и/или е-аминогруппой остатков лизина в лиганде через связывающее звено. Обычно количество молекул лекарственного средства, конъюгированных с антителом в реакции сочетания, будет меньше теоретического максимума.

Следующие неограничивающие способы могут быть использованы для контроля загрузки конъюгатов лиганд-цитотоксическое лекарственное средство:

(1) регулирование молярного отношения связывающего реагента к моноклональному антителу,

(2) контроль времени и температуры реакции,

(3) выбор различных реагентов реакции.

Приготовление обычных фармацевтических композиций можно найти в Китайской фармакопее.

Термин «носитель», используемый в композиции согласно настоящему изобретению, относится к системе, которая может изменять способ проникновения лекарственного средства в организм человека и его распределения, контролировать скорость высвобождения лекарственного средства и доставлять лекарственное средство к органу-мишени. Системы носителя для высвобождения и нацеливания лекарственного средства могут уменьшить деградацию и потерю лекарственного средства, уменьшить побочные эффекты и улучшить биодоступность. Например, полимерные поверхностно-активные вещества, которые можно применять в качестве носителей, могут самоорганизовываться с образованием различных форм агрегатов благодаря своей уникальной амфифильной структуре. Предпочтительные примеры включают мицеллы, микроэмульсии, гели, жидкие кристаллы, пузырьки и тому подобное. Эти агрегаты обладают способностью инкапсулировать молекулы лекарственного средства, имея при этом хорошую проницаемость для мембраны, и могут использоваться в качестве превосходного носителя лекарственного средства.

Термин «вспомогательное вещество» представляет собой добавку в фармацевтическом составе, отличную от основного лекарственного средства, которое также может называться адъювантом, такое как адгезивы, наполнители, разрыхлители, смазывающие вещества в таблетках; части матрицы в полутвердых препаратах мази и крема; консерванты, антиоксиданты, вкусоароматические агенты, ароматизаторы, сорастворители, эмульгаторы, солюбилизаторы, регуляторы осмотического давления, красители в жидких препаратах и тому подобные.

Термин «разбавитель», также известный как наполнитель, в первую очередь предназначен для увеличения массы и объема таблетки. Добавление разбавителя обеспечивает определенный объем, снижает отклонение дозы основных компонентов и улучшает профиль сжатия лекарственного средства. Когда таблетка содержит масляный компонент, добавляют абсорбент для абсорбции маслянистого вещества, тем самым сохраняя «сухое» состояние, чтобы облегчить формирование таблетки. Например, разбавитель включает крахмал, лактозу, неорганические соли кальция, микрокристаллическую целлюлозу и тому подобное.

Фармацевтическая композиция может быть в форме стерильного водного раствора для инъекций. Приемлемыми носителями или растворителями, которые можно применять, являются вода, раствор Рингера или изотонический раствор хлорида натрия. Стерильный состав для инъекций может представлять собой стерильную микроэмульсию масло в воде для инъекций, в которой активный ингредиент растворен в масляной фазе. Например, активный ингредиент растворяют в смеси соевого масла и лецитина. Затем масляный раствор добавляют к смеси воды и глицерина и обрабатывают с образованием микроэмульсии. Раствор для инъекций или микроэмульсию можно вводить в кровоток пациента путем местной болюсной инъекции. В качестве альтернативы, раствор и микроэмульсию предпочтительно вводить способом, который поддерживает постоянную циркулирующую концентрацию соединения согласно настоящему изобретению. Чтобы поддерживать эту постоянную концентрацию, можно применять устройство для непрерывной внутривенной доставки. Примером такого устройства является насос для внутривенного введения Deltec CADD-PLUS. ТМ. 5400.

Фармацевтическая композиция может быть в форме стерильной водной или масляной суспензии для инъекций для внутримышечного и подкожного введения. Такая суспензия может быть приготовлена с подходящими диспергирующими веществами или смачивающими агентами и суспендирующими агентами, как описано выше, в соответствии с известными методами. Стерильный состав для инъекций может также представлять собой стерильный раствор или суспензию для инъекций, приготовленную в нетоксичном приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, например, раствор готовят в 1,3-бутандиоле. Более того, стерильные нелетучие масла можно легко применять в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно применять любые смешанные нелетучие масла, включая синтетические моно- или диглицериды. Более того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, также можно применять для получения инъекции.

Настоящее изобретение относится к отщепляемому линкерному плечу с определенной структурой и активному веществу с определенной структурой, а также к конъюгату антитело-лекарственное средство (ADC), состоящему из линкерного плеча, активного вещества и антитела. Данный ADC представляет собой комплекс, образованный путем связывания токсичного вещества с антителом через спейсер. Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) разрушается в организме с высвобождением активных молекул, тем самым проявляя противоопухолевый эффект.

Способ синтеза согласно настоящему изобретению

Для осуществления задачи настоящего изобретения в настоящем изобретении применяют следующие технические решения:

Схема I:

Способ получения соединения формулы (D1) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата согласно настоящему изобретению включаетследующую стадию:

взаимодействие соединения формулы (Y1) и соединения формулы (Dr) в присутствии конденсирующего агента и необязательно в щелочных условиях с получением соединения формулы (D1),

где: R1, R2 и m являются такими, как определено в формуле (D1).

Реагент, обеспечивающий щелочные условия, включает органические и неорганические основания. Органические основания включают, но не ограничиваются ими, триэтиламин, диэтиламин, N-метилморфолин, пиридин, гексагидропиридин, N,N-диизопропилэтиламин, н-бутиллитий, диизопропиламид лития, ацетат калия, трет-бутоксид натрия и трет-бутоксид калия. Неорганические основания включают, но не ограничиваются ими, гидрид натрия, фосфат калия, карбонат натрия, карбонат калия, карбонат цезия, гидроксид натрия и гидроксид лития.

Конденсирующий агент может быть выбран из группы, состоящей из 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида, 1-гидроксибензотриазола, 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорида, N,N-дициклогексилкарбодиимида, N,N-диизопропилкарбодиимид, O-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилмочевины тетрафторбората, 1-гидроксибензотриазола, 1-гидрокси-7-азобензотриазола, O-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилмочевины гексафторфосфата, 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилмочевины гексафторфосфата, бензотриазол-1 -илокситрис(диметиламино)фосфония гексафторфосфата и бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинил фосфор гексафторфосфата, и предпочтительно 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида, 1-гидроксибензотриазола и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорида.

Схема II:

Способ получения соединения формулы (Lb-Y-Dr) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата согласно настоящему изобретению включает следующие стадии:

Этап 1: соединение формулы (IB-1) и экзатекана метансульфонат (1b) взаимодействуют в присутствии конденсирующего агента и, необязательно, в щелочных условиях с получением соединения формулы (IB-2);

Этап 2: с соединения формулы (IB-2) снимают защиту с получением соединения формулы (IB);

Этап 3: соединение формулы (IA) и соединение формулы (IB) взаимодействуют в присутствии конденсирующего агента и, возможно, в щелочных условиях с получением соединения формулы (Lb-Y-Dr),

где:

R+ представляет собой аминозащитную группу, и предпочтительно представляет собой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc);

R1, R2, R5~R7, s1 и m являются такими, как определено в формуле (Lb -Y-Dr). Реагент, обеспечивающий щелочные условия, включает органические и неорганические основания. Органические основания включают, но не ограничиваются ими, триэтиламин, диэтиламин, N-метилморфолин, пиридин, гексагидропиридин, N,N-диизопропилэтиламин, н-бутиллитий, диизопропиламид лития, ацетат калия, трет-бутоксид натрия и трет-бутоксид калия. Неорганические основания включают, но не ограничиваются ими, гидрид натрия, фосфат калия, карбонат натрия, карбонат калия, карбонат цезия, гидроксид натрия и гидроксид лития.

Конденсирующий агент выбран из группы, состоящей из 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида, 1-гидроксибензотриазола, 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорида, N,N'-дициклогексилкарбодиимида, N,N'-диизопропилкарбодиимид, O-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилмочевины тетрафторбората, 1-гидроксибензотриазола, 1-гидрокси-7-азобензотриазола, O-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилмочевины гексафторфосфата, 2-(7-азобензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилмочевины гексафторфосфата, бензотриазол-1 -илокситрис(диметиламино)фосфония гексафторфосфата и бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинил фосфор гексафторфосфата, и предпочтительно 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида, 1-гидроксибензотриазола и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорида.

Схема III:

Способ получения соединения формулы (Рс-La-Y-Dr) настоящего изобретения включаетследующую стадию:

Рс подвергают реакции с соединением формулы (La-Y-Dr) после восстановления с получением соединения формулы (Рс-La-Y-Dr); восстанавливающий агент предпочтительно представляет собой ТСЕР, в частности, предпочтительно восстанавливает дисульфидную связь на антителе; где:

Рс представляет собой лиганд;

W, L2, L3, R1, R2, R5~R7, m и n являются такими, как определено в формуле (Рс-La-Y-Dr).

Настоящее изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на следующие примеры, но примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Способы проведения испытаний в примерах настоящего изобретения, для которых не указаны конкретные условия, осуществляли в соответствии с обычными условиями или условиями, рекомендованными производителями материалов или продуктов. Реагенты, для которых не указаны конкретные источники, являются обычными реагентами, приобретаемыми на рынке.

ПРИМЕРЫ

Структуры соединений идентифицируют с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или масс-спектрометрии (MS). ЯМР определяют на приборе Bruker AVANCE-400. Растворителями для определения являются дейтерированный диметилсульфоксид (ДМСО-d6), дейтерированный хлороформ (CDCl3) и дейтерированный метанол (CD3OD), а внутренний стандарт представляет собой тетраметилсилан (TMS). Химические сдвиги приведены в 10-6 (ppm).

МС определяют с помощью масс-спектрометра FINNIGAN LCQAd (ESI) (производитель: Thermo, тип: Finnigan LCQ advantage MAX).

СВЭЖХ осуществляют с помощью жидкостного хроматографа/масс-спектрометра Waters Acquity UPLC SQD.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводят на жидкостном хроматографе высокого давления Agilent 1200DAD (хроматографическая колонка Sunfire С18 150 × 4,6 мм) и жидкостном хроматографе высокого давления Waters 2695-2996 (хроматографическая колонка Gimini С18 150 × 4,6 мм).

УФ-ВЭЖХ определяют на УФ-спектрофотометре Thermo nanodrop2000. Степень ингибирования пролиферации и значения IC50 определяют с помощью считывающего устройства для микропланшетов PHERAstarFS (BMG Co., Германия). Пластины силикагеля Yantai Huanghai HSGF254 или Qingdao GF254 применяли в качестве пластины для тонкослойной хроматографии на силикагеле (ТСХ). Размер пластины силикагеля, используемой в ТСХ, составляет от 0,15 мм до 0,2 мм, а размер пластины силикагеля, используемой при очистке продукта, составляет от 0,4 мм до 0,5 мм.

Силикагель Yantai Huanghai размером от 200 до 300 меш обычно применяют в качестве носителя для колоночной хроматографии.

Известные исходные материалы согласно настоящему изобретению могут быть получены известными в данной области способами или могут быть приобретены у ABCR GmbH & Co. KG, Acros Organnics, Aldrich Chemical Company, Accela ChemBio Inc., Dari chemical Company и т.д.

Если не указано иное, реакции проводят в атмосфере аргона или азота.

«Атмосфера аргона» или «атмосфера азота» означает, что реакционная колба оснащена баллоном с аргоном или азотом (примерно 1 л).

«Атмосфера водорода» означает, что реакционная колба оснащена баллоном с водородом (примерно 1 л).

Реакцию гидрирования под давлением проводили с применением прибора для гидрирования Parr 3916ЕКХ и генератора водорода Qinglan QL-500 или с применением прибора для гидрирования HC2-SS.

В реакциях гидрирования реакционную систему обычно вакуумируют и заполняют водородом, и вышеуказанную операцию повторяют три раза.

Микроволновый реактор типа СЕМ Discover-S 908860 применяли в реакциях с использованием микроволн.

Если не указано иное, реакционный раствор относится к водному раствору.

Если не указано иное, температура реакции составляет комнатную температуру.

Комнатная температура от 20°С до 30°С является наиболее подходящей температурой реакции.

Приготовление буфера PBS (рН=6,5) в примерах: 8,5 г KH2PO4, 8,56 г K2HPO4·3H2O, 5,85 г NaCl и 1,5 г ЭДТА помещали в колбу объемом 2 л, смесь подвергали ультразвуковой обработке для полного растворения и хорошо встряхивали для получения буфера.

Система элюентов в колоночной хроматографии и система проявляющих растворителей в тонкослойной хроматографии для очистки соединений включают: А: систему дихлорметана и изопропанола, В: систему дихлорметана и метанола, С: систему петролейного эфира и этилацетата. Объемное соотношение растворителя регулируется в соответствии с полярностью соединений, и небольшое количество кислотного реагента или щелочного реагента, такого как триэтиламин, также может быть добавлено для корректировки.

Некоторые из соединений настоящего изобретения охарактеризованы с помощью Q-TOF LC/MS. Для Q-TOF LC/MS применяли Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole-Time of Flight масс-спектрометр и Agilent 1290-lnfinity UHPLC (Agilent Poroshell 300SB-C8 5 мкм, колонка 2,1 × 75 мм).

Пример 1

N-((1S,9S)-9-Этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклопропан-1-карбоксамид 1

1 мл N,N-диметилформамида добавляли к экзатекана метансульфонату 1b (2,0 мг, 3,76 мкмоль, полученному согласно способу, описанному в патентной заявке "ЕР 0737686 А1"), и раствор охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Одну каплю триэтиламина добавляли по каплям, и реакционный раствор перемешивали до прозрачности. 1-Гидроксициклопропилкарбоновую кислоту 1а (1,4 мг, 3,7 мкмоль, полученную согласно известному способу, описанному в патентной заявке "Tetrahedron Letters, 25(12), 1269-72; 1984") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (3,8 мг, 13,7 мкмоль) последовательно добавляли к реакционному раствору. После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 2 часов. Добавляли 5 мл воды к реакционному раствору для гашения реакции, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 1 (1,6 мг, выход: 82,1%).

MS m/z (ESI): 520,2 [М+1]

1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 7,90-7,84 (m, 1Н), 7,80-7,68(m, 1Н), 5,80-5,70 (m, 1Н), 5,62-5,54(m, 2Н), 5,44-5,32 (m, 2Н), 5,28-5,10(m, 2Н), 3,40-3,15 (m, 3Н), 2,44 (s, 3Н), 2,23(t, 1Н), 2,06-1,75 (m, 2Н), 1,68-1,56 (m, 1Н), 1,22-1,18 (m, 2Н), 1,04-0,98 (m, 2Н), 0,89 (t, 3Н).

Пример 2

(S)-2-Циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индол изино[1,2-b]хинол ин-1-ил)-2-гидроксиацетамид 2-А

(R)-2-Циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксиацетамид 2-В

2 мл этанола и 0,4 мл N.N-диметилформамида добавляли к 1b (4 мг, 7,53 мкмоль). Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. 0,3 мл N-метилморфолина добавляли по каплям, и реакционный раствор перемешивали до прозрачности. 2-Циклопропил-2-гидроксиуксусную кислоту 2а (2,3 мг, 19,8 мкмоль, полученную согласно способу, описанному в патентной заявке "WO 2013106717"), 1-гидроксибензотриазол (3 мг, 22,4 мкмоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (4,3 мг, 22,4 мкмоль) последовательно добавляли к реакционному раствору. После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение одного часа. Баню с ледяной водой удаляли и реакционный раствор нагревали до 30°С и перемешивали в течение 2 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, и полученное неочищенное соединение 2 очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (2-А: 1,5 мг, 2-В: 1,5 мг).

MS m/z (ESI): 534,0 [М+1].

Соединение 2-В с единственной конфигурацией (с более коротким временем удерживания)

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,06 минут, чистота: 88% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1*50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,37 (d, 1Н), 7,76 (d, 1Н), 7,30 (s, 1Н), 6,51 (s, 1Н), 5,58-5,56 (m, 1Н), 5,48 (d, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,32-5,29 (m, 2H), 3,60 (t, 1H), 3,19-3,13 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,20-2,14 (m, 1H), 1,98 (q, 2H), 1,87-1,83 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,34-1,28 (m, 1 H), 0,86 (t, 3H), 0,50-0,39 (m, 4H).

Соединение 2-A с единственной конфигурацией (с более длительным временем удерживания)

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,10 минут, чистота: 86% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1*50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,35 (d, 1Н), 7,78 (d, 1Н), 7,31 (s, 1Н), 6,52 (s, 1Н), 5,58-5,53 (m, 1Н), 5,42 (s, 2Н), 5,37 (d, 1Н), 5,32 (t, 1Н), 3,62 (t, 1Н), 3,20-3,15 (m, 2Н), 2,40 (s, 3Н), 2,25-2,16 (m, 1Н), 1,98 (q, 2Н), 1,87-1,82 (m, 1Н), 1,50-1,40 (m, 1Н), 1,21-1,14 (m, 1Н), 0,87 (t, 3Н), 0,47-0,35 (m, 4Н).

Пример 3

(S)-N-((1S,9S)-9-Этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-3,3,3-трифтор-2-гидроксипропанамид 3-А

(R)-N-((1S,9S)-9-Этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-3,3,3-трифтор-2-гидроксипропанамид 3-В

2 мл этанола и 0,4 мл N,N-диметилформамида добавляли к 1b (5,0 мг, 9,41 мкмоль), и раствор охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. 0,3 мл N-метилморфолина добавляли по каплям, и реакционный раствор перемешивали до прозрачности. 3,3,3-трифтор-2-гидроксипропионовую кислоту 3а (4,1 мг, 28,4 мкмоль, поставщик: Alfa), 1-гидроксибензотриазол (3,8 мг, 28,1 мкмоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (5,4 мг, 28,2 мкмоль) последовательно добавляли к реакционному раствору. После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 10 минут. Баню с ледяной водой удаляли и реакционный раствор нагревали до 30°С и перемешивали в течение 8 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, и полученное неочищенное соединение 3 очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (1,5 мг, 1,5 мг).

MS m/z (ESI): 561,9 [М+1].

Соединение с единственной конфигурацией (с более коротким временем удерживания)

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,11 минут, чистота: 88% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1*50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,94 (d, 1Н), 7,80 (d, 1Н), 7,32 (s, 1Н), 7,20 (d, 1Н), 6,53 (s, 1Н), 5,61-5,55 (m, 1Н), 5,45-5,23 (m, 3Н), 5,15-5,06 (m, 1Н), 4,66-4,57 (m, 1Н), 3,18-3,12 (m, 1Н), 2,40 (s, 3Н), 2,26-2,20 (m, 1Н), 2,16-2,08 (m, 1Н), 2,02-1,94 (m, 1Н), 1,89-1,82 (m, 1 H), 1,50-1,40 (m, 1 H), 0,87 (t, 3Н).

Соединение с единственной конфигурацией (с более длительным временем удерживания)

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,19 минут, чистота: 90% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1*50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,97 (d, 1Н), 7,80 (d, 1Н), 7,31 (s, 1Н), 7,16 (d, 1Н), 6,53 (s, 1Н), 5,63-5,55 (m, 1Н), 5,45-5,20 (m, 3Н), 5,16-5,07 (m, 1Н), 4,66-4,57 (m, 1Н), 3,18-3,12 (m, 1Н), 2,40 (s, 3Н), 2,22-2,14 (m, 1Н), 2,04-1,95 (m, 2Н), 1,89-1,82 (m, 1Н), 1,50-1,40 (m, 1Н), 0,87 (t, 3Н).

Пример 4

N-((1S,9S)-9-Этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклопентан-1-карбоксамид 4

1 мл N.N-диметилформамида добавляли к 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль), и раствор охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Одну каплю триэтиламина добавляли по каплям, и реакционный раствор перемешивали до прозрачности. 1-Гидрокси-циклопентанкарбоновую кислоту 4а (2,2 мг, 16,9 мкмоль, полученную согласно способу, описанному в патентной заявке "WO 2013106717") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (4,7 мг, 16,9 мкмоль) последовательно добавляли к реакционному раствору. После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 1 часа, добавляли 5 мл воды к реакционному раствору для гашения реакции, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 4 (2,5 мг, выход: 80,9%).

MS m/z (ESI): 548,0 [М+1].

1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 7,73-7,62 (m, 2Н), 5,75-5,62 (m, 1Н), 5,46-5,32 (m, 2Н), 5,26-5,10 (m, 1Н), 3,30-3,10 (m, 1Н), 2,43 (s, 3Н), 2,28-2,20 (m, 2Н), 2,08-1,84 (m, 8Н), 1,69-1,58 (m, 2Н), 1,04-1,00 (m, 2Н), 0,89 (t, 3Н).

Пример 5

N-((1S,9S)-9-Этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-(гидроксиметил)циклопропан-1-карбоксамид 5

1 мл N,N-диметилформамида добавляли к 1b (2,0 мг, 3,76 мкмоль), и раствор охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Одну каплю триэтиламина добавляли по каплям, и реакционный раствор перемешивали до прозрачности. 1-(Гидроксиметил)-циклопентанкарбоновую кислоту 5а (0,87 мг, 7,5 мкмоль, полученную согласно способу, описанному в патентной заявке "WO 201396771") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (2 мг, 7,24 мкмоль) последовательно добавляли к реакционному раствору. После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 2 часов, добавляли 5 мл воды к реакционному раствору для гашения реакции, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 5 (1,0 мг, выход: 50%).

MS m/z (ESI): 533,9 [М+1].

1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 8,07 (s, 1Н), 7,23-7,18 (m, 2Н), 6,71-6,64 (m, 1Н), 6,55-6,51 (m, 1Н), 5,36-5,27 (m, 2Н), 4,67-4,61 (m, 2Н), 3,53-3,48 (m, 1Н), 3,30-3,22 (m, 2Н), 3,18-3,13 (m, 1Н), 2,71-2,61 (m, 2Н), 2,35-2,28 (m, 1Н), 2,04-1,91 (m, 4Н), 1,53-1,40 (m, 3Н), 0,91 -0,75 (m, 4Н).

Пример 6

N-((1S,9S)-9-Этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-(гидроксиметил)циклобутан-1-карбоксамид 6

1 мл N,N-диметилформамида добавляли к 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль), и раствор охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Одну каплю триэтиламина добавляли по каплям, и реакционный раствор перемешивали до прозрачности. 1-(Гидроксиметил)циклобутан-1-карбоновую кислоту 6а (2,2 мг, 16,9 мкмоль, полученную согласно известному способу, описанному в патентной заявке "Journal of the American Chemical Society, 2014, vol.136, #22, p. 8138-8142") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (4,7 мг, 16,9 мкмоль) последовательно добавляли к реакционному раствору. После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 1 часа, добавляли 5 мл воды к реакционному раствору для гашения реакции, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (5 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 6 (2,1 мг, выход: 67,9%).

MS m/z (ESI): 548,0 [М+1].

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 7,85-7,62 (m, 1Н), 6,88 (br, 1Н), 5,87-5,48 (m, 2Н), 5,47-5,33 (m, 1 Н), 5,31-5,06 (m, 1Н), 4,25-3,91 (m, 2Н), 3,25 (br, 1Н), 2,60-2,32 (m, 3Н), 2,23 (t, 1Н), 2,15-1,95 (m, 3Н), 1,70-1,56 (m, 2Н), 1,41-1,17 (m, 9Н), 1,03 (s, 1Н), 0,95-0,80 (m, 2Н).

Пример 7

N-((1S,9S)-9-Этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-1-гидроксициклобутан-1-карбоксамид 7

2 мл этанола и 0,4 мл N.N-диметилформамида добавляли к 1b (3,0 мг, 5,64 мкмоль), и раствор охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. 0,3 мл N-метилморфолина добавляли по каплям, и реакционный раствор перемешивали до прозрачности. 1-Гидроксициклобутанкарбоновую кислоту 7а (2,0 мг, 17,22 мкмоль, поставщик: PharmaBlock Sciences), 1-гидроксибензотриазол (2,3 мг, 17,0 мкмоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (3,2 мг, 16,7 мкмоль) последовательно добавляли к реакционному раствору. После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при 0-5°С в течение 10 минут. Баню с ледяной водой удаляли и реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 7 (2,5 мг, выход: 83,1%).

MS m/z (ESI): 534,0 [М+1].

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,28 (d, 1Н), 7,75 (d, 1Н), 7,29 (s, 1Н), 6,51 (s, 1Н), 6,12 (s, 1Н), 5,59-5,51 (m, 1Н), 5,41 (s, 2Н), 5,20-5,01 (m, 2Н), 3,27-3,17 (m, 1Н), 3,15-3,05 (m, 1Н), 2,71-2,63 (m, 1Н), 2,37 (s, 3Н), 2,12-2,05 (m, 1Н), 2,03-1,94 (m, 2Н), 1,92-1,78 (m, 4Н), 1,50-1,42 (m, 1 Н), 0,90-0,83 (m, 4Н).

Пример 8

1-(((S)-7-Бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазаикозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[бе]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8

Этап 1

Бензил

1-((2-((((9Н-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)и,иклопропан-1-карбоксилат 8с

Бензил 1-гидроксициклопропан-1-карбоксилат 8а (104 мг, 0,54 ммоль, полученный согласно способу, описанному в патентной заявке "US 2005/20645") и (2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метилацетат 8b (100 мг, 0,27 ммоль, полученный согласно способу, описанному в патентной заявке "CN 105829346") добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 5 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой, после чего добавляли трет-бутоксид калия (61 мг, 0,54 ммоль). Баню с ледяной водой удаляли, и реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 минут. 20 мл ледяной воды добавляли к реакционному раствору, который затем экстрагировали этилацетатом (5 мл × 2) и хлороформом (5 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученный остаток растворяли в 3 мл 1,4-диоксана. Добавляли 0,6 мл воды, бикарбонат натрия (27 мг, 0,32 ммоль) и 9-флуорен метил хлороформат (70 мг, 0,27 ммоль), и реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 20 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 8 с (100 мг, выход: 73,6%).

MS m/z (ESI): 501,0 [М+1]

Этап 2

1-((2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклопропан-1-карбоновая кислота 8d

8с (50 мг, 0,10 ммоль) растворяли в 3 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (V:V=2:1), после чего добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (25 мг, содержание: 10%). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор фильтровали через целит, и остаток на фильтре промывали тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке продукта 8d (41 мг, выход: 100%).

MS m/z (ESI): 411,0 [М+1].

Этап 3

(9Н-Флуорен-9-ил)метил (2-(((1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)карбамоил)цик лопропокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 8е

1b (7 мг, 0,013 ммоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли одну каплю триэтиламина, 8d (7 мг, 0,017 ммоль) в 0,5 мл N,N-диметилформамида, и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (7 мг, 0,026 ммоль), и реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 35 минут. Добавляли 10 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (5 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 8е (8,5 мг, выход: 78,0%).

MS m/z (ESI): 828,0 [М+1].

Этап 4

1-((2-Аминоацетамидо)метокси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8f

8е (4 мг, 4,84 мкмоль) растворяли в 0,2 мл дихлорметана, после чего добавляли 0,1 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к кашице, и верхний слой гексана сливали, что повторяли трижды. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта 8f (2,9 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 606,0 [М+1].

Этап 5

1-(((S)-7-Бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазаикозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[ае]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 8

Неочищенное соединение 8f (2,9 мг, 4,84 мкмоль) растворяли в 0,5 мл N.N-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли (S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-диоксо-1Н-пиррол-1-ил)гексанамидо)ацетамидо)ацетамидо)-3-фенилпропионовую кислоту 8g (2,7 мг, 5,80 мкмоль, полученную согласно способу, описанному в патентной заявке "ЕР 2907824") в 0,3 мл N,N-диметилформамида, и добавляли 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (2,7 мг, 9,67 мкмоль), и реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 30 минут. Ледяную баню удаляли, и реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 15 минут. Реакционный раствор очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 8 (2 мг, выход: 39,0%).

MS m/z (ESI): 1060,0 [М+1].

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 9,01 (d, 1Н), 8,77 (t, 1Н), 8,21 (t, 1Н), 8,08-7,92 (m, 2Н), 7,73 (d, 1Н), 7,28 (s, 1Н), 7,24-7,07 (m, 4Н), 6,98 (s, 1Н), 6,50 (s, 1Н), 5,61 (q, 1Н), 5,40 (s, 2Н), 5,32 (t, 1Н), 5,12 (q, 2Н), 4,62 (t, 1Н), 4,52 (t, 1Н), 4,40-4,32 (m, 1Н), 3,73-3,47 (m, 8Н), 3,16-3,04 (m, 2Н), 2,89 (dd, 1Н), 2,69-2,55 (m, 2Н), 2,37-2,23 (m, 4Н), 2,12-1,93 (m, 4Н), 1,90-1,74 (m, 2Н), 1,52-1,38 (m, 4Н), 1,33-1,11 (m, 5Н), 0,91-0,81 (m, 4Н).

Пример 9

N-((2R,10S)-10-Бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 9-А N-((2S,10S)-10-Бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 9-В

Этап 1

Бензил 2-циклопропил-2-гидроксиацетат 9а

2а (1,3 г, 11,2 ммоль, полученный согласно способу, описанному в патентной заявке "WO 2013/106717") растворяли в 50 мл ацетонитрила, и затем последовательно добавляли карбонат калия (6,18 г, 44,8 ммоль), бензилбромид (1,33 мл, 11,2 ммоль) и тетрабутиламмония йодид (413 мг, 1,1 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов, и фильтровали через целит. Остаток на фильтре промывали этилацетатом (10 мл), и фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 9а (2 г, выход: 86,9%).

Этап 2

Бензил

10-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 9b

9а (120,9 мг, 0,586 ммоль) и 8b (180 мг, 0,489 ммоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 4 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли трет-бутоксид калия (109 мг, 0,98 ммоль), и удаляли баню с ледяной водой. Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 40 минут.10 мл ледяной воды добавляли к реакционному раствору, который затем экстрагировали этилацетатом (20 мл × 2) и хлороформом (10 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученный остаток растворяли в 4 мл диоксана. Добавляли 2 мл воды, бикарбонат натрия (49,2 мг, 0,586 ммоль) и 9-флуорен метил хлороформат (126 мг, 0,49 ммоль), и реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли 20 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 9b (48 мг, выход: 19%).

MS m/z (ESI): 515,0 [М+1].

Этап 3

10-Циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оевая кислота 9с

9b (20 мг, 0,038 ммоль) растворяли в 4,5 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (V:V=2:1), после чего добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (12 мг, содержание: 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор фильтровали через целит, и остаток на фильтре промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта 9 с (13 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 424,9 [М+1].

Этап 4

(9Н-Флуорен-9-ил)метил(2-(((1-циклопропил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-2-оксоэтокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 9d

1b (10 мг, 18,8 мкмоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 1 мл 1\1,1М-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли одну каплю триэтиламина, неочищенное соединение 9с (13 мг, 30,6 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (16,9 мг, 61,2 мкмоль), и реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 40 минут. Добавляли 10 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 9d (19 мг, выход: 73,6%).

MS m/z (ESI): 842,1 [М+1].

Этап 5

2-((2-Аминоацетамидо)метокси)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)ацетамид 9е

9d (19 мг, 22,6 мкмоль) растворяли в 2 мл дихлорметана, после чего добавляли 1 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 1 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к остатку для получения кашицы, и супернатант сливали после отстаивания для удержания твердого вещества. Твердый остаток концентрировали при пониженном давлении с помощью масляного насоса досуха с получением неочищенного продукта 9е (17 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 638ДМ+18].

Этап 6

N-((2R,10S)-10-Бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 9-А

N-((2S,10S)-10-Бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 9-В

Неочищенное соединение 9е (13,9 мг, 22,4 мкмоль) растворяли в 0,6 мл N,N-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли 8д (21,2 мг, 44,8 мкмоль) в 0,3 мл N,N-диметилформамида, и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (18,5 мг, 67,3 мкмоль), и реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 10 минут. Ледяную баню удаляли, и реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа с получением соединения 9. Реакционный раствор очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта (9-А: 2,4 мг, 9-В: 1,7 мг).

MS m/z (ESI): 1074,4 [М+1].

Соединение 9-А с единственной конфигурацией (с более коротким временем удерживания):

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,14 минут, чистота: 85% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1*50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,60 (t, 1Н), 8,51-8,49 (d, 1Н), 8,32-8,24 (m, 1Н), 8,13-8,02 (m, 2Н), 8,02-7,96 (m, 1Н), 7,82-7,75 (m, 1Н), 7,31 (s, 1Н), 7,26-7,15 (m, 4Н), 6,99 (s, 1Н), 6,55-6,48 (m, 1Н), 5,65-5,54 (m, 1Н), 5,41 (s, 2Н), 5,35-5,15 (m, 3Н), 4,74-4,62 (m, 1Н), 4,54-4,40 (m, 2Н), 3,76-3,64 (m, 4Н), 3,62-3,48 (m, 2Н), 3,20-3,07 (m, 2H), 3,04-2,94 (m, 1H), 2,80-2,62 (m, 1H), 2,45-2,30 (m, 3Н), 2,25-2,15 (m, 2H), 2,15-2,04 (m, 2H), 1,93-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 5H), 0,87 (t, 3H), 0,64-0,38 (m, 4H).

Соединение 9-В с единственной конфигурацией (с более длительным временем удерживания):

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,16 минут, чистота: 89% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1*50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,68-8,60 (m, 1Н), 8,58-8,50 (m, 1Н), 8,32-8,24 (m, 1Н), 8,13-8,02 (m, 2Н), 8,02-7,94 (m, 1Н), 7,82-7,75 (m, 1Н), 7,31 (s, 1Н), 7,26-7,13 (m, 3Н), 6,99 (s, 1Н), 6,55-6,48 (m, 1Н), 5,60-5,50 (m, 1Н), 5,41 (s, 2Н), 5,35-5,15 (m, 2Н), 4,78-4,68 (m, 1Н), 4,60-4,40 (m, 2Н), 3,76-3,58 (m, 4Н), 3,58-3,48 (m, 1Н), 3,20-3,10 (m, 2Н), 3,08-2,97 (m, 2Н), 2,80-2,72 (m, 2Н), 2,45-2,30 (m, 3Н), 2,25-2,13 (m, 2Н), 2,13-2,04 (m, 2Н), 2,03-1,94 (m, 2Н), 1,91-1,78 (m, 2Н), 1,52-1,39 (m, 3Н), 1,34-1,12 (m, 4Н), 0,91-0,79 (m, 3Н), 0,53-0,34 (m, 4Н).

Пример 10

N-((25,105)-10-Бензил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)карбамоил)-1,1,1-трифтор-6,9,12,15-тетраоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 10-А

N-((2R,10S)-10-Бензил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)карбамоил)-1,1,1-трифтор-6,9,12,15-тетраоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 10-В

Бензил 3,3,3-трифтор-2-гидроксипропаноат 10а

3а (1,80 г, 12,5 ммоль) растворяли в 100 мл ацетонитрила, и затем последовательно добавляли карбонат калия (5,17 г, 37,5 ммоль), бензил бромид (4,48 мл, 37,5 ммоль) и тетрабутиламмония йодид (231 мг, 0,63 ммоль). Реакционный раствор нагревали до 60°С и перемешивали в течение 5 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 10а (980 мг, выход: 33,5%).

1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 7,43-7,36 (m, 5Н), 5,34 (s, 2Н), 4,53 (s, 1Н), 3,44 (s, 1Н).

Этап 2

Бензил

1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-10-(трифторметил)-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 10b

8b (63 мг, 0,17 ммоль) и 10а (80 мг, 0,34 ммоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 3 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли трет-бутоксид калия (38 мг, 0,34 ммоль), и удаляли баню с ледяной водой. Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 20 минут.10 мл ледяной воды добавляли к реакционному раствору, который затем экстрагировали этилацетатом (20 мл × 2) и хлороформом (10 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали, и полученный остаток растворяли в 2 мл диоксана. Добавляли 0,4 мл воды, бикарбонат натрия (19 мг, 0,23 ммоль) и 9-флуорен метил хлороформат (49 мг, 0,19 ммоль), и реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 20 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 10b (51 мг, выход: 55,3%).

MS m/z (ESI): 559,9 [М+18].

Этап 3

1-(9Н-Флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-10-(трифторметил)-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оевая кислота 10 с

10b (15 мг, 0,28 ммоль) растворяли в 3 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (V:V=2:1), после чего добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (15 мг, содержание: 10%). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор фильтровали через целит, и остаток на фильтре промывали тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта 10 с (13 мг).

MS m/z (ESI): 452,9 [М+1].

Этап 4 (9Н-Флуорен-9-ил)метил(2-((((3-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,1,1-трифтор-3-оксопропан-2-ил)окси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 10d

1b (10 мг, 18,8 мкмоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли одну каплю триэтиламина, 10 с (13 мг, 28,7 мкмоль) в 0,5 мл N,N-диметилформамида, и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (11 мг, 39,7 мкмоль), и реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 30 минут. Добавляли 10 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органическую фазу объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 10d (16 мг, выход: 97,8%).

MS m/z (ESI): 870ДМ+1].

Этап 5

2-((2-Аминоацетамидо)метокси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-3,3,3-трифторпропанамид 10е

10d (16 мг, 18,4 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана, после чего добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к остатку для получения кашицы, и супернатант сливали после отстаивания в течение некоторого времени для удержания твердого вещества, что повторяли трижды. Твердый остаток концентрировали при пониженном давлении с помощью масляного насоса досуха с получением неочищенного продукта 10е (12 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 647,9 [М+1].

Этап 6

N-((2S,10S)-10-Бензил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)карбамоил)-1,1,1-трифтор-6,9,12,15-тетраоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 10-А

N-((2R,10S)-10-Бензил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)карбамоил)-1,1,1-трифтор-6,9,12,15-тетраоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 10-В

Неочищенное соединение 10е (12 мг, 18,5 мкмоль) растворяли в 1,0 мл N,N-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли 8g (14 мг, 29,6 мкмоль) в 0,3 мл N,N-диметилформамида, и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (15 мг, 54,2 мкмоль), и реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 30 минут. Ледяную баню удаляли, и реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа с получением соединения 10. Реакционный раствор очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанных в заголовке продуктов (2,7 мг, 2,6 мг).

MS m/z (ESI): 1102,0 [М+1].

Соединение с единственной конфигурацией (с более коротким временем удерживания):

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,18 минут, чистота: 91% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1*50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,97 (d, 1Н), 8,85-8,76 (m, 1Н), 8,37-8,27 (m, 1Н), 8,12-8,02 (m, 1Н), 8,02-7,95 (m, 1Н), 7,80 (d, 1Н), 7,31 (s, 1Н), 7,26-7,10 (m, 4Н), 6,99 (s, 1Н), 6,66 (br, 1Н), 6,52 (s, 1Н), 5,65-5,54 (m, 1Н), 5,41 (s, 1Н), 5,37-5,25 (m, 3Н), 5,23-5,13 (m, 1Н), 4,81-4,68 (m, 2Н), 4,51-4,41 (m, 1Н), 3,78-3,45 (m, 6Н), 3,21-3,13 (m, 1Н), 3,02-2,93 (m, 1Н), 2,77-2,63 (m, 2Н), 2,45-2,29 (m, 3Н), 2,24-2,05 (m, 3Н), 2.04-1,93 (m, 5Н), 1,90-1,75 (m, 2Н), 1,52-1,38 (m, 4Н), 0,90-0,78 (m, 5Н).

Соединение с единственной конфигурацией (с более длительным временем удерживания):

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,23 минут, чистота: 90% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1*50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 9,05 (d, 1Н), 8,97-8,88 (m, 1Н), 8,35-8,27 (m, 1Н), 8,11-8,03 (m, 1Н), 8,02-7,95 (m, 1Н), 7,80 (d, 1Н), 7,34 (s, 1Н), 7,29-7,13 (m, 4Н), 6,99 (s, 1Н), 6,66 (br, 1Н), 6,54 (s, 1Н), 5,64-5,55 (m, 1Н), 5,43 (s, 1Н), 5,36-5,20 (m, 3Н), 4,92-4,85 (m, 1Н), 4,82-4,72 (m, 2Н), 4,52-4,42 (m, 1Н), 3,77-3,48 (m, 6Н), 3,21-3,14 (m, 1Н), 3,03-2,95 (m, 1Н), 2,79-2,65 (m, 2Н), 2,47-2,28 (m, 3Н), 2,25-2,05 (m, 3Н), 2.05-1,94 (m, 5Н), 1,91-1,76 (m, 2Н), 1,52-1,37 (m, 4Н), 0,92-0,77 (m, 5Н).

Пример 11

1-(((S)-7-Бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазаикозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[ае]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 11

Бензил

1-((2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклобутан-1-карбоксилат 11b

Бензил 1-гидроксициклобутан-карбоксилат 11а (167 мг, 0,81 ммоль, полученный согласно известному способу, описанному в патентной заявке " Journal of Medicinal Chemistry, 2013, vol. 56, # 13, p. 5541-5552") и 8b (150 мг, 0,41 ммоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 5 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой, после чего добавляли трет-бутоксид калия (92 мг, 0,82 ммоль). Баню с ледяной водой удаляли, и реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 минут. 20 мл ледяной воды добавляли к реакционному раствору, который затем экстрагировали этилацетатом (5 мл × 2) и хлороформом (5 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали, и полученный остаток растворяли в 3 мл диоксана. Добавляли 0,6 мл воды, бикарбонат натрия (41 мг, 0,48 ммоль) и 9-флуорен метил хлороформат (105 мг, 0,41 ммоль), и реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 20 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 11 b (37 мг, выход: 17,6%).

MS m/z (ESI): 514,6 [М+1].

Этап 2

1-((2-((((9Н-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклобутан-1-карбоновая кислота 11с

11b (37 мг, 71,9 мкмоль) растворяли в 3 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (V:V=2:1), после чего добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (15 мг, содержание: 10%). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционный раствор фильтровали через целит, и остаток на фильтре промывали тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке продукта 11 с (35 мг, выход: 82%), который применяли непосредственно на следующем этапе.

Этап 3

(9Н-Флуорен-9-ил)метил(2-(((1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)карбамоил)циклобутокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 11d

1b (10 мг, 0,018 ммоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли одну каплю триэтиламина, 11 с (13 мг, 0,031 ммоль) в 0,5 мл N,N-диметилформамида, и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (25 мг, 0,091 ммоль), и реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 40 минут. Добавляли 8 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (5 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (8 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей Ас получением указанного в заголовке продукта 11d (19 мг, выход: 73,9%).

MS m/z (ESI): 842,3 [М+1].

Этап 4

1-((2-Аминоацетамидо)метокси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 11е

11d (19 мг, 22,6 мкмоль) растворяли в 2 мл дихлорметана, после чего добавляли 1 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 1 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 4 мл н-гексана добавляли к кашице, и верхний слой гексана сливали, что повторяли трижды. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта 11е (15 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

Этап 5

1-(((S)-7-Бензил-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,5,8,11,14-пентаазаикозил)окси)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 11

Неочищенное соединение 11е (2 мг, 3,22 мкмоль) растворяли в 0,5 мл N,N-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли 8g (1,5 мг, 3,17 мкмоль) в 0,3 мл N,N-диметилформамида, и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (2,7 мг, 9,67 мкмоль), и реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционный раствор концентрировали досуха с помощью ротационного выпаривания с помощью масляного насоса для удаления ДМФА. Остатки растворяли в ДХМ и очищали тонкослойной хроматографией дважды (полярность проявляющего раствора: ДХМ/МеОН=10/1) с получением указанного в заголовке продукта 11 (1 мг, выход: 28,8%).

MS m/z (ESI): 1073,6 [М+1].

1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 8,70-8,60 (m, 1Н), 8,28-8,19 (m, 1Н), 8,13-7,91 (m, 3Н), 7,79-7,71 (d, 1Н), 7,29 (s, 1Н), 7,25-7,09 (m, 4Н), 6,98 (s, 1Н), 6,71-6,62 (m, 1Н), 6,55-6,47 (m, 1Н), 5,64-5,54 (m, 2Н), 5,40 (s, 1Н), 5,35-5,27 (t, 2Н), 5,17-5,10 (m, 2Н), 4,60-4,51 (m, 1Н), 4,51-4,35 (m, 2Н), 3,93-3,78 (m, 3Н), 3,71-3,59 (m, 3Н), 3,01-2,88 (m, 3Н), 2,70-2,64 (m, 2Н), 2,44-2,30 (m, 3Н), 2,28-2,14 (m, 3Н), 2,11-1,92 (m, 6Н), 1,90-1,76 (m, 3Н), 1,51-1,39 (m, 4Н), 0,92-0,75 (m, 6Н).

Пример 12

(S)-3-Циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагид ро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксипропанамид 12-А

(R)-3-Циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксипропанамид 12-В

Этап 1

3-Циклопропил-2-гидроксипропановая кислота 12b

12а (0,5 г, 3,87 ммоль, поставщик: Adamas) растворяли в 35 мл смеси растворителей воды и уксусной кислоты (V:V=4:1), и раствор охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. 2М водный раствор нитрита натрия (0,53 г, 7,74 ммоль) добавляли по каплям, и реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 часов. Твердый хлорид натрия добавляли к реакционному раствору для насыщения водной фазы. Раствор экстрагировали этилацетатом (8 мл × 8), сушили над безводным сульфатом натрия, и фильтровали. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке продукта 12b (0,45 г, выход: 89,3%).

Этап 2

(S)-3-Циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-и]хинолин-1-ил)-2-гидроксипропанамид 12-А

(R)-3-Циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксипропанамид 12-В

1,5 мл этанола и 1,5 мл N,N-диметилформамида добавляли к 1b (45 мг, 0,085 ммоль). Раствор трижды продували аргоном. 0,1 мл N-метилморфолина добавляли по каплям, и реакционный раствор перемешивали до прозрачности. 12b (90 мг, 0,691 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (34 мг, 0,251 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (49 мг, 0,256 ммоль) последовательно добавляли к реакционному раствору. После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, и полученное неочищенное соединение 12 очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: Sharpsil-T С18 5 мкм 21,2*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин) с получением указанного в заголовке продукта (7 мг, 15 мг).

MS m/z (ESI): 547,9 [М+1].

Соединение с единственной конфигурацией (с более коротким временем удерживания)

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,345 минут, чистота: 72% (колонка: ZORBAX Ecliphase Plus С18 1,8 мкм 2,1*50mm, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,42 (d, 1Н), 7,78 (d, 1Н), 7,30 (s, 1Н), 6,51 (s, 1Н), 5,60-5,50 (m, 2Н), 5,42 (s, 1Н), 5,19 (q, 2Н), 4,02-4,00 (m, 1Н), 3,21-3,11 (m, 2Н), 2,39 (s, 3Н), 2,21-2,07 (m, 2Н), 2,05-1,95 (m, 1Н), 1,92-1,68 (m, 4Н), 1,53-1,41 (m, 1Н),0,87 (t, 3Н), 0,48-0,34 (m, 2Н), 0,14-0,01 (m, 2Н).

Соединение с единственной конфигурацией (с более длительным временем удерживания)

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,399 минут, чистота: 88% (колонка: ZORBAX Ecliphase Plus С18 1,8 мкм 2,1*50mm, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,36 (d, 1Н), 7,77 (d, 1Н), 7,31 (s, 1Н), 6,51 (s, 1Н), 5,58-5,51 (m, 1 Н), 5,48 (d, 1Н), 5,42 (s, 1 Н),5,20 (q, 2Н), 4,09-4,02 (m, 1Н), 3,22-3,11 (m, 2Н), 2,39 (s, 3Н), 2,27-2,06 (m, 2Н), 2,05-1,95 (m, 1 Н), 1,93-1,81 (m, 2Н), 1,65-1,43 (m, 2Н), 1,32-1,21 (m, 1H),0,87(t, 3Н), 0,48-0,33 (m, 2Н),0,14-0,01 (m, 2Н).

Пример 13 (эталонный пример)

N-((1S,9S)-9-Этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)-2-гидроксиацетамид

Указанное в заголовке соединение 13 получали согласно способу, описанному в Примере 76 на странице 147 описания патентной заявки ЕР 2907824 А1.

Пример 14

N-((2R,10S)-10-Бензил-2-(циклопропилметил)-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 14-А

N-((2S,10S)-10-Бензил-2-(циклопропилметил)-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 14-В

Этап 1

Бензил 3-циклопропил-2-гидроксипропаноат 14а

12b (200 мг, 1,54 ммоль) растворяли в 20 мл ацетонитрила, и затем последовательно добавляли карбонат калия (1,06 г, 7,68 ммоль), бензил бромид (0,16 мл, 1,34 ммоль) и тетрабутиламмония йодид (28 мг, 0,07 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов, и фильтровали через целит. Остаток на фильтре промывали этилацетатом (10 мл), и фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 14а (140 мг, выход: 41,3%).

Этап 2

Бензил

10-(циклопропилметил)-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 14b

14а (94 мг, 0,427 ммоль) и 8b (130 мг, 0,353 ммоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 10 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой, после чего добавляли трет-бутоксид калия (79 мг, 0,704 ммоль). Баню с ледяной водой удаляли, и реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 10 минут. 20 мл ледяной воды добавляли к реакционному раствору, который затем экстрагировали этилацетатом (10 мл × 4). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия, и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 14b (50 мг, выход: 26,8%).

MS m/z (ESI): 529,2 [М+1].

Этап 3

10-(Циклопропилметил)-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оевая кислота 14с

14b (27 мг, 0,051 ммоль) растворяли в 3 мл этилацетата, после чего добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (7 мг, содержание: 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор фильтровали через целит, и остаток на фильтре промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта 14 с (23 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 439,1 [М+1].

Этап 4

(9Н-Флуорен-9-ил)метил(2-((((3-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)окси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 14d

1b (22 мг, 42,38 мкмоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 3 мл N,N-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Триэтиламин (4,3 мг, 42,49 мкмоль) добавляли по каплям, и затем добавляли неочищенное соединение 14 с (23 мг, 51,1 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (17,6 мг, 63,6 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 40 минут. Добавляли 15 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (8 мл × 3). Органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (15 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 14d (29 мг, выход: 79,9%).

MS m/z (ESI): 856,1 [М+1].

Этап 5

2-((2-Аминоацетамидо)метокси)-3-и,иклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)пропанамид 14е

14d (29 мг, 33,9 мкмоль) растворяли в 0,8 мл дихлорметана, после чего добавляли 0,4 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 1 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к остатку для получения кашицы, и супернатант сливали после отстаивания в течение некоторого времени, что повторяли трижды. Остатки концентрировали при пониженном давлении с помощью масляного насоса досуха с получением неочищенного продукта 14е (22 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 634,1 [М+1].

Этап 6

N-((2R,10S)-10-Бензил-2-(циклопропилметил)-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 14-А

N-((2S,10S)-10-Бензил-2-(циклопропилметил)-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид 14-В

Неочищенное соединение 14е (22 мг, 33,9 мкмоль) растворяли в 2,5 мл N,N-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Последовательно добавляли 8д (24 мг, 50,8 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (14 мг, 50,6 мкмоль). Баню с ледяной водой удаляли, и реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа с получением соединения 14. Реакционный раствор очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин) с получением указанных в заголовке продуктов (2 мг, 2 мг).

MS m/z (ESI): 1088,4 [М+1].

Соединение с единственной конфигурацией (с более коротким временем удерживания):

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,18 минут, чистота: 88% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1*50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

Соединение с единственной конфигурацией (с более длительным временем удерживания):

Анализ СВЭЖХ: время удерживания: 1,23 минут, чистота: 96% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1*50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил).

Пример 15

1-((S)-9-Бензил-22-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,8,11,14,17-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазадокозил)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3,4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 15

Этап 1

Бензил

1-(10-(9Н-флуорен-9-ил)-5,8-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазадецил)циклопропан-1-карбоксилат 15b

8b (500 мг, 1,35 ммоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 6 мл тетрагидрофурана. Бензил 1-гидроксиметилциклопропан-1-карбоксилат 15а (233 мг, 1,13 ммоль; полученный согласно способу, описанному в Примере 22-2 на странице 262 описания патентной заявки "ЕР 2862856 А1") добавляли в реакционную колбу. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой, после чего добавляли гидрид натрия (54 мг, 1,35 ммоль). Баню с ледяной водой удаляли, и реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 40 минут. Реакционный раствор охлаждали до 0°С, к которому добавляли 20 мл ледяной воды. Раствор экстрагировали этилацетатом (5 мл × 2) и хлороформом (5 мл × 5). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 15b (15 мг, выход: 2,5%).

MS m/z (ESI): 515,2 [М+1].

Этап 2

1-(10-(9Н-Флуорен-9-ил)-5,8-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазадецил)циклопропан-1-карбоновая кислота 15с

15b (15 мг, 0,029 ммоль) растворяли в 2 мл этилацетата, после чего добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (3 мг, содержание: 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 4,5 часов. Реакционный раствор фильтровали через целит, и остаток на фильтре промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке продукта 15 с (11 мг, выход: 89%).

MS m/z (ESI): 425,2 [М+1].

Этап 3

(9Н-Флуорен-9-ил)метил(2-((((1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)карбамоил)циклопропил)метокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 15d

1b (10 мг, 0,021 ммоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли одну каплю триэтиламина, 15с (11 мг, 0,026 ммоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (10,7 мг, 0,039 ммоль). После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляли 10 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (5 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 15d (19 мг, выход: 87,0%).

MS m/z (ESI): 842,2 [М+1].

Этап 4

1-(((2-Аминоацетамидо)метокси)метил)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагид ро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 15е

15d (19 мг, 22,56 мкмоль) растворяли в 2 мл дихлорметана, после чего добавляли 1 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении при 0°С. Добавляли 1 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к кашице, и верхний слой гексана сливали, что повторяли трижды. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта 15е (13,9 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 620,1 [М+1].

Этап 5

1-((S)-9-Бензил-22-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,8,11,14,17-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазадокозил)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклопропан-1-карбоксамид 15

Неочищенное соединение 15е (13,9 мг, 22,4 мкмоль) растворяли в 1 мл г\1,Г\1-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли 8g (15,8 мг, 33,4 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (9,3 мг, 33,6 мкмоль). Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 60 минут. Реакционный раствор очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 15 (2,5 мг, выход: 10,3%).

MS m/z (ESI): 1074,2 [М+1].

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,51-8,37 (m, 1Н), 8,22 (t, 1Н), 8,14-8,02 (m, 2Н), 8,011-7,94 (m, 1Н), 7,82-7,73 (m, 1Н), 7,29 (s, 1Н), 7,26-7,10 (m, 3Н), 6,98 (s, 1Н), 6,53-6,47 (m, 1Н), 5,62-5,50 (m, 1Н), 5,45-5,36 (m, 1Н), 5,35-5,23 (m, 2Н), 5,13-5,02 (m, 2Н), 4,61-4,50 (m, 2Н), 4,42-4,28 (m, 2Н), 3,76-3,61 (m, 3Н), 3,60-3,45 (m, 3Н), 3,27-3,23 (m, 1Н), 3,20-2,81 (m,7Н), 2,75-2,61 (m, 3Н), 241-2,28 (m, 3Н), 2,23-2,13 (m, 2Н), 2,11-2,01 (m, 1Н), 2,03-1,94 (m, 1Н), 1,90 (s, 1Н), 1,87-1,74 (m, 2Н), 1,53-1,36 (m, 3Н), 1,29-1,08 (m, 4Н), 0,90-0,68 (m, 4Н).

Пример 16

1-((S)-9-Бензил-22-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,8,11,14,17-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазадокозил)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагид ро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 16

Этап 1

1-(Гидроксиметил)циклобутан-1-карбоновая кислота 16b

Этил 1-(гидроксиметил)циклобутанкарбоксилат 16а (250 мг, 1,58 ммоль, поставщик: Alfa) растворяли в метаноле (2 мл) и воде (1 мл), после чего добавляли гидроксид натрия (126 мг, 3,15 ммоль). Реакционный раствор нагревали до 40°С и перемешивали в течение 3 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении для удаления органического растворителя. Раствор экстрагировали эфиром (10 мл), и водную фазу собирали. Водную фазу доводили до рН 3-4 с помощью 6н. водного раствора хлористоводородной кислоты и концентрировали при пониженном давлении с получением твердого вещества. Добавляли 3 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении досуха, что повторяли трижды. Остаток сушили с помощью масляного насоса с получением неочищенного продукта 16b (206 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MSm/z (ESI, NEG):129,2 [М-1].

Этап 2

Бензил 1-(гидроксиметил)циклобутан-1-карбоксилат 16с

Неочищенное соединение 16b (206 мг, 1,58 ммоль) растворяли в ацетонитриле (15 мл), после чего добавляли безводный карбонат калия (1,09 г, 7,90 ммоль), тетрабутиламмония йодид (29 мг, 78,51 мкмоль) и бензил бромид (216 мг, 1,26 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционный раствор фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 16с (112 мг, выход: 32,1%).

MS m/z (ESI): 221,1 [М+1].

Этап 3

Бензил

1-(10-(9H-флуорен-9-ил)-5,8-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазадецил)циклобутан-1-карбоксилат 16d

16с (77 мг, 0,35 ммоль) и 8b (100 мг, 0,27 ммоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 3 мл тетрагидрофурана. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой, после чего добавляли трет-бутоксид калия (61 мг, 0,54 ммоль). Реакционный раствор перемешивали на бане с ледяной водой в течение 10 минут.20 мл ледяной воды добавляли к реакционному раствору, который затем экстрагировали этилацетатом (5 мл) и хлороформом (5 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученный остаток растворяли в 3 мл 1,4-диоксана. Добавляли 0,5 мл воды, бикарбонат натрия (27 мг, 0,32 ммоль) и 9-флуорен метил хлороформат (70 мг, 0,27 ммоль), и реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 20 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 16d (24 мг, выход: 16,7%).

MS m/z (ESI): 551,3 [М+23].

Этап 4

1-(10-(9Н-Флуорен-9-ил)-5,8-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазадецил)циклобутан-1-карбоновая кислота 16е

16d (12 мг, 22,7 мкмоль) растворяли в 1,5 мл смеси растворителей тетрагидрофурана и этилацетата (V:V=2:1), после чего добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (5 мг, содержание: 10%). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционный раствор фильтровали через целит, и остаток на фильтре промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта 16е (10 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

Этап 5

(9Н-Флуорен-9-ил)метил(2-((((1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)карбамоил)ци кл обутил)метокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамат 16f

1b (7,5 мг, 0,014 ммоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 1 мл N,N-диметилформамида. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли одну каплю триэтиламина, неочищенное соединение 16е (10 мг) в 0,5 мл N,N-диметилформамида, и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (6 мг, 0,026 ммоль), и реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 30 минут. Добавляли 10 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 16f (10,6 мг, выход: 87,8%).

MS m/z (ESI): 856,2 [М+1].

Этап 6

1-(((2-Аминоацетамидо)метокси)метил)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 16g

16f (10,6 мг, 12,4 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана, после чего добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к кашице, и верхний слой гексана сливали, что повторяли трижды. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта 16д (8 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 634,1 [М+1].

Этап 7

1-((S)-9-Бензил-22-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,8,11,14,17-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазадокозил)-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)циклобутан-1-карбоксамид 16

Неочищенное соединение 16g (8 мг) растворяли в 1 мл N,N-диметилформамида. Добавляли 8д (8,8 мг, 18,6 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (5,2 мг, 18,8 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционный раствор очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин) с получением указанного в заголовке продукта 16 (1,0 мг, выход: 7,2%).

MS m/z (ESI): 1088,0 [М+1].

Пример 17

(1r,4f)-N-((S)-7-Бензил-1-(1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)карбамоил)циклопропокси)-3,6,9,12,15-пентаоксо-17,20,23,26,29,32,35,38,41-нонаокса-2,5,8,11,14-пентаазатритетраконтан-43-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоксамид 17

Этап 1

Трет-бутил 1-фенил-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-декаоксагентриаконтан-31-оат 17b

1-Фенил-2,5,8,11,14,17,20,23,26-нонаоксаоктакозан-28-ол 17а (0,34 г, 0,67 ммоль, поставщик: Bide Pharmatech Ltd.) растворяли в 10 мл дихлорметана, и затем последовательно добавляли оксид серебра (0,24 г, 1,01 ммоль), трет-бутил бромацетат (0,16 г, 0,81 ммоль) и йодид калия (0,07 г, 0,40 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционный раствор фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 17b (0,42 г, выход: 100%).

MS m/z (ESI): 636,3 [М+18].

Этап 2

Трет-бутил 29-гидрокси-3,6,9,12,15,18,21,24,27-нонаоксанонакозан-1-оат 17с

17b (417 мг, 0,67 ммоль) растворяли в 15 мл тетрагидрофурана, после чего добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (110 мг, содержание: 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом, нагревали до 60°С и перемешивали в течение 3 часов. Реакционный раствор фильтровали через целит, и остаток на фильтре промывали тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта 17 с (357 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 546,2 [М+18].

Этап 3

Трет-бутил 29-азидо-3,6,9,12,15,18,21,24,27-нонаоксанонакозан-1-оат 17d

17с (357 мг, 0,675 ммоль) растворяли в 10 мл толуола, после чего добавляли дифенил азид фосфат (279 мг, 1,014 ммоль) и 1,8-диазабициклоундец-7-ен (206 мг, 1,353 ммоль). Реакционный раствор трижды продували аргоном и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего перемешивали при 105°С в течение 19 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и концентрировали. Добавляли 20 мл воды, и раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 4). Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей В с получением неочищенного продукта 17d (412 мг).

MS m/z (ESI): 571,3 [М+18].

Этап 4

Трет-бутил 29-амино-3,6,9,12,15,18,21,24,27-нонаоксанонакозан-1-оат 17е

17d (230 мг, 0,415 ммоль) растворяли в 8 мл тетрагидрофурана, после чего добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (58 мг, содержание: 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционный раствор фильтровали через целит, и остаток на фильтре промывали тетрагидрофураном. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта 17е (220 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 528,2 [М+1].

Этап 5

Трет-бутил

1-((1r,4r)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексил)-1-оксо-5,8,11,14,17,20,23,26,29-нонаокса-2-азагентриаконтан-31-оат 17f

(1r,4r)-4-((2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоновую кислоту (98,5 мг, 0,415 ммоль) растворяли в 10 мл дихлорметана, после чего добавляли 2-(7-оксабензотриазол)-N,N,N',N'-тетраметилмочевина гексафторфосфат (190 мг, 0,500 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (162 мг, 1,253 ммоль). Реакционный раствор трижды продували аргоном, и затем добавляли неочищенное соединение 17е (220 мг, 0,417 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 15 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали дихлорметаном (8 млхЗ). Органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (15 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 17f (122 мг, выход: 39,2%).

MS m/z (ESI): 747,2[М+1].

Этап 6

1-((1r,4r)-4-((2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексил)-1-оксо-5,8,11,14,17,20,23,26,29-нонаокса-2-азагентриаконтан-31-оевая кислота 17д

17f (122 мг, 0,163 ммоль) растворяли в 0,8 мл дихлорметана, после чего добавляли 0,4 мл трифторуксусной кислоты. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. 15 мл дихлорметана добавляли к разбавленному реакционному раствору, и затем концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 10 мл н-гексана, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. Добавляли 10 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении. 10 мл смеси растворителей л-гексан:эфир=5:1 добавляли к кашице, что повторяли трижды до рН, близкого к 7. Раствор концентрировали с помощью масляного насоса досуха с получением указанного в заголовке продукта 17g (98 мг, выход: 86,8%).

MS m/z (ESI): 691,2[М+1].

Этап 7

2,4-диметоксибензил1-((2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)ацетамидо)метокси)циклопропан-1-карбоксилат 17h

8d (164 мг, 0,40 ммоль) растворяли в дихлорметане (5 мл), и затем добавляли 2,4-диметоксибензиловый спирт (81 мг, 0,48 ммоль),

1-этил-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (115 мг, 0,60 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (5 мг, 0,041 ммоль). После завершения добавления реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 20 мл воды, и раствор разделяли после встряхивания. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (8 мл × 3), и органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 17h (124 мг, выход: 55,4%).

MS m/z (ESI): 583,1 [М+23].

Этап 8

2,4-диметоксибензил(S)-1-((11-бензил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазагептадекан-17-ил)окси)циклопропан-1-карбоксилат 17j

17h (39 мг, 69,6 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана, после чего добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к кашице, и верхний слой гексана сливали, что повторяли трижды. Раствор концентрировали при пониженном давлении. Полученный неочищенный продукт растворяли в 2 мл N,N-диметилформамида, после чего добавляли (((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)глицилглицил-L-фенилаланин 17i (35 мг, 69,8 мкмоль, полученный согласно способу, описанному в Примере 7-12 на странице 13 описания патентной заявки "CN 108853514 А") и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (23 мг, 83,1 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 10 мл воды, и раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 17j (48 мг, выход: 83,9%).

MS m/z (ESI): 822ДМ+1].

Этап 9

(S)-1-((11-Бензил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2-окса-4,7,10,13,16-пентаазагептадекан-17-ил)окси)циклопропан-1-карбоновая кислота 17k

17j (48 мг, 58,4 мкмоль) растворяли в 1,4 мл 3% (об./об.) дихлоруксусной кислоты в дихлорметане, и раствор охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли триэтилсилан (21 мг, 180,6 мкмоль), и реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 3 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении на ледяной бане для удаления половины органического растворителя. Добавляли 5 мл эфира, и раствор естественным путем нагревали до комнатной температуры и суспендировали. Белое твердое вещество осаждали и фильтровали. Остаток на фильтре собирали и сушили с помощью масляного насоса с получением указанного в заголовке продукта 17k (33 мг, выход: 84,1%).

Этап 10

(9Н-Флуорен-9-ил)метил((S)-7-бензил-1-(1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12H-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)карбамоил)циклопропокси)-3,6,9,12-тетраоксо-2,5,8,11-тетраазатридекан-13-ил)карбамат 17l

1b (20 мг, 42,4 мкмоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 1 мл 10% (об./об.) метанола в дихлорметане. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли одну каплю триэтиламина, и реакционный раствор перемешивали до растворения 1b. 17k (33 мг, 49,1 мкмоль) растворяли в 1 мл 10% (об./об.) метанола в дихлорметане. Полученный раствор добавляли по каплям к вышеуказанному реакционному раствору, после чего добавляли 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (17,6 мг, 63,6 мкмоль). Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Добавляли 10 мл дихлорметана и 5 мл воды, и раствор перемешивали в течение 5 минут и оставляли для разделения. Собирали органическую фазу. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (10 мл × 3), и органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 171 (37 мг, выход: 80,2%).

MS m/z (ESI): 1090,1 [М+1].

Этап 11

(1r,4r)-N-((S)-7-Бензил-1-(1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)карбамоил)циклопропокси)-3,6,9,12,15-пентаоксо-17,20,23,26,29,32,35,38,41-нонаокса-2,5,8,11,14-пентаазатритетраконтан-43-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1 -карбоксамид 17

17l (15,5 мг, 14,23 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана, после чего добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к кашице, и верхний слой гексана сливали, что повторяли трижды. Раствор концентрировали при пониженном давлении и сушили с помощью масляного насоса. Полученный неочищенный продукт растворяли в 1 мл N,N-диметилформамида. Добавляли 17g (11 мг, 15,92 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (6,0 мг, 21,68 мкмоль). Реакционный раствор трижды продували аргоном, и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционный раствор очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 17 (16 мг, выход: 27,4%).

MS m/z (ESI): 1556,4 [М+18].

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,98 (d, 1Н), 8,76 (s, 1Н), 8,20 (br, 1Н), 8,12-7,95 (m, 3Н), 7,93-7,76 (m, 2Н), 7,75-7,66 (m, 2Н), 7,24 (s, 1Н), 7,20-7,05 (m, 6Н), 6,97 (s, 1Н), 6,64 (br, 1Н), 6,55 (d, 1Н), 6,47 (s, 1Н), 5,61-5,52 (m, 2Н), 5,37 (s, 1Н), 5,33-5,23 (m, 2Н), 5,18 (s, 1Н), 5,13 (s, 1Н), 5,05 (s, 1Н), 5,00 (s, 1Н), 4,65-4,55 (m, 2Н), 4,53-4,45 (m, 1Н), 4,38-4,28 (m, 2Н), 3,84 (s, 2Н), 3,67 (d, 3Н), 3,60-3,40 (m, З3Н), 3,18 (d, 1Н), 3,15-3,08 (m, 3Н), 2,28 (s, 3Н), 2,00-1,92 (m, 3Н), 1,85 (s, 2Н), 1,82-1,73 (m, 2Н), 1,68-1,52 (m, 4Н), 1,29-1,15 (m, 3Н), 0,86-0,76 (m, 5Н).

Пример 18

(1r,4r)-N-((2R, 10S)-10-Бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15,18-гексаоксо-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-декаокса-5,8,11,14,17-пентаазагексатетраконтан-46-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоксамид 18

Этап 1

Бензил (R)-2-циклопропил-2-гидроксиацетат 18а

Бензил (S)-2-циклопропил-2-гидроксиацетат 18b

2а (7,4 г, 63,7 ммоль) растворяли в 200 мл ацетонитрила, и затем последовательно добавляли карбонат калия (35 г, 253,6 ммоль), бензил бромид (9,3 г, 54,4 ммоль) и тетрабутиламмония йодид (500 мг, 1,36 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, и фильтровали через целит. Остаток на фильтре промывали этилацетатом (10 мл), и фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении. 4,1 г полученного остатка очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С. Дополнительно проводили хиральное разделение с получением указанных в заголовке продуктов 18а (1,1 г) и 18b (1,2 г).

Этап 2

Бензил

(R)-10-циклопропил-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат18 с

8b (3,1 г, 8,41 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (55 мл), после чего добавляли 18а (2,0 г, 9,70 ммоль). Реакционный раствор охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой, после чего добавляли трет-бутоксид калия (1,89 г, 16,84 ммоль). Реакционный раствор перемешивали на бане с ледяной водой в течение 10 минут. Добавляли этилацетат (30 мл) и воду (20 мл), и раствор оставляли для разделения. Водную фазу экстрагировали хлороформом (30 мл × 5), и органические фазы объединяли. Органическую фазу концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток растворяли в 1,4-диоксане (32 мл) и воде (8 мл). Добавляли карбонат натрия (1,78 г, 16,79 ммоль) и 9-флуорен метил хлороформат (2,18 г, 8,42 ммоль), и реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Воду (30 мл) добавляли к реакционному раствору, который экстрагировали этилацетатом (50 мл × 3). Органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 18 с (1,3 г, выход: 30,0%).

MS m/z (ESI): 515,2[М+1].

Этап 3

(R)-10-Циклопропил-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оевая кислота 18d

18с (1,29 г, 2,51 ммоль) растворяли в этилацетате (15 мл), после чего добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (260 мг, содержание: 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. Реакционный раствор фильтровали через целит, и остаток на фильтре промывали этилацетатом (20 мл) и метанолом (20 мл). Фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта 18d (980 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 425,1 [М+1].

Этап 4

2,4-диметоксибензил

(R)-10-циклопропил-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 18е

Неочищенное соединение 18d (980 мг, 2,31 ммоль) растворяли в дихлорметане (15 мл), и затем добавляли 2,4-диметоксибензиловый спирт (777 мг, 4,62 ммоль), 1-этил-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (664 мг, 3,46 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (28 мг, 0,23 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении для удаления органического растворителя. Добавляли 20 мл воды, и раствор экстрагировали этилацетатом (50 мл × 3). Органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 18е (810 мг, выход: 61,1%).

MS m/z (ESI): 575,0 [М+1].

Этап 5

2,4-Диметоксибензил

(R)-2-((2-аминоацетамидо)метокси)-2-циклопропилацетат 18f

18е (33 мг, 57,4 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана, после чего добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к кашице, и верхний слой гексана сливали, что повторяли трижды. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта 18f (21 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

Этап 6

2,4-диметоксибензил

(11S,19R)-11-бензил-19-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,18-диокса-4,7,10,13,16-пентаазаикозан-20-оат 18д

Неочищенное соединение 18f (21 мг, 57,4 мкмоль) растворяли в 3 мл N,N-диметилформамида. Добавляли 17i (29 мг, 57,8 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (19 мг, 68,7 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 10 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 18д (37 мг, выход: 77,1%).

MS m/z (ESI): 853,0[М+18].

Этап 7

(11S,19R)-11-Бензил-19-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,18-диокса-4,7,10,13,16-пентаазаикозан-20-оевая кислота 18h

18g (37 мг, 44,3 мкмоль) растворяли в 1,4 мл 3% (об./об.) дихлоруксусной кислоты дихлорметане, и раствор охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли триэтилсилан (15,4 мг, 132,4 мкмоль), и реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 3 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении на ледяной бане для удаления половины органического растворителя. Добавляли 5 мл эфира, и раствор естественным путем нагревали до комнатной температуры и суспендировали. Белое твердое вещество осаждали и фильтровали. Остаток на фильтре собирали и сушили с помощью масляного насоса с получением указанного в заголовке продукта 18h (24 мг, выход: 79,1%).

MS m/z (ESI): 708,2[М+23].

Этап 8

(9Н-Флуорен-9-ил)метил

((2R,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)карбамат 18i

1b (30 мг, 63,6 мкмоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 1 мл 10% (об./об.) метанола в дихлорметане. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли одну каплю триэтиламина, и реакционный раствор перемешивали до растворения 1b. 18h (65 мг, 94,8 мкмоль) растворяли в 1 мл 10% (об./об.) метанола в дихлорметане, и полученный раствор добавляли по каплям к вышеуказанному реакционному раствору, после чего добавляли 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (27 мг, 97,6 мкмоль). Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Добавляли 10 мл дихлорметана и 5 мл воды, и раствор перемешивали в течение 5 минут и оставляли для разделения. Собирали органическую фазу. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (10 мл × 3), и органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 1 Si (25 мг, выход: 35,6%).

MS m/z (ESI): 1104.4[М+1].

Этап 9

(S)-2-(2-(2-Аминоацетамидо)ацетамидо)-N-(2-((((R)-1-циклопропил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-2-оксоэтокси)метил)амино)-2-оксоэтил)-3-фенилпропанамид 18j

18i (12 мг, 10,9 мкмоль) растворяли в 0,6 мл дихлорметана, после чего добавляли 0,3 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к кашице, и верхний слой гексана сливали, что повторяли трижды. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта 18j (10 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

MS m/z (ESI): 881,0 [М+1].

Этап 10

(1r,4r)-N-((2R,10S)-10-Бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15,18-гексаоксо-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-декаокса-5,8,11,14,17-пентаазагексатетраконтан-46-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоксамид 18

Неочищенное соединение 18j (10 мг) растворяли в 1 мл N,N-диметилформамида. Добавляли 17g (8,5 мг, 12,3 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (4,6 мг, 16,6 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут.Реакционный раствор фильтровали, и очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: XBridge Prep C18 OBD 5 мкм 19*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 18 (9,5 мг, выход: 56,2%).

MS m/z (ESI): 1570,2 [М+18].

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,77 (d, 1Н), 8,59-8,55 (m, 1Н), 8,42 (d, 1Н), 8,37-8,28 (m, 1Н), 8,25-8,06 (m, 2Н), 7,96-7,86 (m, 1Н), 7,86-7,70 (m, 2Н), 7,32-7,28 (m, 1Н), 7,25-7,14 (m, 3Н), 6,67 (m, 1Н), 5,96 (s, 1Н), 5,80-5,72 (m, 1Н), 5,62-5,52 (m, 2Н), 5,43-5,30 (m, 3Н), 5,28-5,17 (m, 2Н), 5,12-5,08 (m, 1Н), 4,72-4,35 (m, 8Н), 3,95-3,70 (m, 13Н), 3,35-3,22 (m, 14Н), 2,42-2,32 (m, 3Н), 2,05-1,98 (m, 4Н), 1,88-1,82 (m, 12Н), 1,47-1,39 (m, 3Н), 1,32-1,18 (m, 11 Н), 0,90-0,80 (m, 4Н), 0,52-0,37 (m, 3Н), 0,32-0,18 (m, 2Н).

Пример 19

(1r,4r)-N-((2S,10S)-10-Бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15,18-гексаоксо-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-декаокса-5,8,11,14,17-пентаазагексатетраконтан-46-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбоксамид 19

Этап 1

Бензил

(S)-10-циклопропил-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 19а

18b (252 мг, 1,22 ммоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 4 мл дихлорметана. Реакционный раствор трижды продували аргоном и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой, после чего добавляли трет-бутоксид лития (98 мг, 1,22 ммоль). Реакционный раствор перемешивали на бане с ледяной водой в течение 15 минут и до прозрачности. Добавляли 8b (300 мг, 814,3 мкмоль), и реакционный раствор перемешивали на бане с ледяной водой в течение 2,5 часов. Добавляли воду (10 мл), и раствор разделяли. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (8 мл × 2). Органические фазы объединяли, промывали водой (10 мл × 1) и насыщенным солевым раствором (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с применением системы проявляющих растворителей С с получением указанного в заголовке продукта 19а (282 мг, выход: 67,2%).

Этап 2

(S)-10-Циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оевая кислота 19b

19а (280 мг, 0,554 ммоль) растворяли в 8 мл этилацетата, после чего добавляли палладиевый катализатор на углеродном носителе (84 мг, содержание: 10%, сухой). Реакционный раствор трижды продували водородом и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционный раствор фильтровали через целит, и остаток на фильтре промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта 19b (230 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

Этап 3 2,4-диметоксибензил

(S)-10-циклопропил-1-(9H-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундекан-11-оат 19с

Неочищенное соединение 19b (230 мг, 541,8 мкмоль) растворяли в 7 мл дихлорметана, и затем последовательно добавляли 2,4-диметоксибензиловый спирт (136,7 мг, 812,7 мкмоль), 1-этил-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (155 мг, 808,5 мкмоль) и 4-диметиламинопиридин (6,6 мг, 53,5 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционный раствор разбавляли 10 мл дихлорметана, промывали водой (10 мл × 1) и насыщенным солевым раствором (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 19 с (159 мг, выход: 51,0%).

Этап 4

2,4-диметоксибензил (S)-2-((2-аминоацетамидо)метокси)-2-циклопропилацетат 19d

19с (60 мг, 104,4 мкмоль) растворяли в 1 мл дихлорметана, после чего добавляли 0,5 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к кашице, и верхний слой гексана сливали, что повторяли трижды. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта 19d (21 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

Этап 5

2,4-диметоксибензил

(11S,19S)-11-бензил-19-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,18-диокса-4,7,10,13,16-пентаазаикозан-20-оат 19е

Неочищенное соединение 19d (36 мг, 102,2 мкмоль) растворяли в 4 мл N,N-диметилформамида. Добавляли 17i (52 мг, 103,6 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (34,6 мг, 125,0 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 10 мл воды, и реакционный раствор экстрагировали этилацетатом (10 мл × 3). Органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 19е (70 мг, выход: 80,2%).

Этап 6

(11S,19S)-11-Бензил-19-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6,9,12,15-пентаоксо-2,18-диокса-4,7,10,13,16-пентаазаикозан-20-оевая кислота 19f

19е (70 мг, 83,7 мкмоль) растворяли в 2,5 мл 3% (об./об.) дихлоруксусной кислоты в дихлорметане, и раствор охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли триэтилсилан (29 мг, 249,4 мкмоль), и реакционный раствор перемешивали на ледяной бане в течение 3 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении на ледяной бане для удаления половины органического растворителя. Добавляли 5 мл эфира, и раствор естественным путем нагревали до комнатной температуры и суспендировали. Белое твердое вещество осаждали и фильтровали. Остаток на фильтре собирали и сушили с помощью масляного насоса с получением указанного в заголовке продукта 19f (57 мг, выход: 99,2%).

Этап 7

(9Н-Флуорен-9-ил)метил

((2S,10S)-10-бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15-пентаоксо-3-окса-5,8,11,14-тетраазагексадекан-16-ил)карбамат 19g

1b (30 мг, 63,6 мкмоль) добавляли в реакционную колбу, после чего добавляли 1 мл 10% (об./об.) метанола в дихлорметане. Раствор трижды продували аргоном, и охлаждали до 0-5°С в бане с ледяной водой. Добавляли одну каплю триэтиламина, и реакционный раствор перемешивали до растворения 1b. 19f (57 мг, 83,1 мкмоль) растворяли в 1 мл 10% (об./об.) метанола в дихлорметане, и полученный раствор добавляли по каплям к вышеуказанному реакционному раствору, после чего добавляли 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (26 мг, 93,9 мкмоль). Реакционный раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Добавляли 10 мл дихлорметана и 5 мл воды, и раствор перемешивали в течение 5 минут и оставляли для разделения. Собирали органическую фазу. Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (10 мл × 3), и органические фазы объединяли. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия (10 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали тонкослойной хроматографией с применением системы проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 19д (56 мг, выход: 79,8%).

MS m/z (ESI): 1103,1 [М+1]

Этап 8

(S)-2-(2-(2-Аминоацетамидо)ацетамидо)-N-(2-((((5)-1-циклопропил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-2-оксоэтокси)метил)амино)-2-оксоэтил)-3-фенилпропанамид 19h

19g (4,6 мг, 4,16 мкмоль) растворяли в 1,5 мл дихлорметана, после чего добавляли 0,75 мл диэтиламина. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,6 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении. Добавляли 2 мл толуола, и раствор концентрировали при пониженном давлении, что повторяли дважды. 3 мл н-гексана добавляли к кашице, и верхний слой гексана сливали, что повторяли трижды. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта 19h (4,0 мг), который непосредственно применяли на следующем этапе без очистки.

Этап 9

(1r,4r)-N-((2S,10S)-10-Бензил-2-циклопропил-1-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-1,6,9,12,15,18-гексаоксо-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-декаокса-5,8,11,14,17-пентаазагексатетраконтан-46-ил)-4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1 -карбоксамид 19

Неочищенное соединение 19h (4,0 мг) растворяли в 1 мл N,N-диметилформамида. Добавляли 17д (2,9 мг, 4,2 мкмоль) и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (1,5 мг, 5,4 мкмоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 40 минут. Реакционный раствор фильтровали, и очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19*250 мм; подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH4OAc), В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие фракции собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке продукта 19 (2,1 мг, выход: 32,4%).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,71-8,62 (m, 1Н), 8,59-8,51 (m, 1Н), 8,34-8,26 (m, 1Н), 8,14-8,02 (m, 2Н), 7,95-7,86 (m, 1Н), 7,83-7,69 (m, 2Н), 7,35-7,31 (m, 1Н), 7,29-7,11 (m, 3Н), 7,01 (s, 1Н), 6,72-6,50 (m, 3Н), 5,59-5,50 (m, 2Н), 5,42 (s, 2Н), 5,38-5,18 (m, 3Н), 4,79-4,69 (m, 2Н), 4,61-4,42 (m, 3Н), 3,91 (s, 2Н), 3,79-3,65 (m, 4Н), 3,63-3,44 (m, 13Н), 3,41-3,30 (m, 2Н), 3,26-3,09 (m, 5Н), 3,08-2,84 (m, 4Н), 2,81-2,64 (m, 3Н), 2,42-2,28 (m, 3Н), 2,24-2,12 (m, 2Н), 2,05-1,93 (m, 4Н), 1,89-1,77 (m, 2Н), 1,72-1,56 (m, 3Н), 1,53-1,38 (m, 3Н), 1,34-1,10 (m, 11Н), 0,94-0,78 (m, 5Н), 0,52-0,35 (m, 3Н).

Пример 20 (эталонный пример)

Указанное в заголовке соединение 20 получали на основании способа, описанного в Примере 58 на странице 163 описания патентной заявки CN 104755494 A.

Следующие антитела получали в соответствии с общепринятыми способами, например, путем конструирования вектора, трансфекции эукариотических клеток, например, путем трансфекции НЕK293 (Life Technologies кат.№11625019), очистки и экспрессии клеток.

Ниже приведена последовательность Трастузумаба:

Легкая цепь

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,082 мл, 0,82 мкмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 2,5 мл, 9,96 мг/мл, 0,168 мкмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл. 2,0 мл раствора отбирали для следующей реакции.

Соединение 10, которое имеет более короткое время удерживания (2,1 мг, 2,02 мкмоль), растворяли в 0,10 мл ДМСО, и затем добавляли к 2,0 мл вышеуказанного раствора. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-1 формулы FADC-1 (5,0 мг/мл, 1,1 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=5,09.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,082 мл, 0,82 мкмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 2,5 мл, 9,96 мг/мл, 0,168 мкмоль) при 37°С.Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл. 2,0 мл раствора отбирали для следующей реакции.

Соединение 10, которое имеет более длительное время удерживания (2,1 мгт 2,02 мкмоль), растворяли в 0,10 мл ДМСО, и затем добавляли к 2,0 мл вышеуказанного раствора. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-2 формулы FADC-1 (4,95 мг/мл, 1,1 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=7,39.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,082 мл, 0,82 мкмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 2,5 мл, 9,96 мг/мл, 0,168 мкмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл. 2,0 мл раствора отбирали для следующей реакции.

Соединение 8 (2,1 мг, 2,02 мкмоль) растворяли в 0,10 мл ДМСО, и затем добавляли к 2,0 мл вышеуказанного раствора. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-3 формулы FADC-3 (5,24 мг/мл, 1,1 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=7,36.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,173 мл, 1,73 мкмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 3,74 мл, 13,38 мг/мл, 0,338 мкмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 6,7 мг/мл. 1,3 мл раствора отбирали для следующей реакции.

Соединение 9, имеющее более короткое время удерживания, соединение 9-А (1,0 мг, 0,93 мкмоль) растворяли в 0,10 мл ДМСО, и затем добавляли к 1,3 мл вышеуказанного раствора. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции.

Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-4 формулы FADC-4A(1,72 мг/мл, 2,36 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=7,39.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,067 мл, 0,67 мкмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 3,0 мл, 6,70 мг/мл, 0,136 мкмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане, и 0,614 мл раствора отбирали для следующей реакции.

Соединение 9, имеющее более короткое время удерживания, соединение 9-А (0,5 мг, 0,42 мкмоль) растворяли в 0,031 мл ДМСО, и затем добавляли к 0,614 мл вышеуказанного раствора. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-5 формулы FADC-4A (3,08 мг/мл, 0,82 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=3,16.

Пример 26 ADC-6

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,173 мл, 1,73 мкмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 3,74 мл, 13,38 мг/мл, 0,338 мкмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 6,7 мг/мл. 0,75 мл раствора отбирали для следующей реакции.

Соединение 9, имеющее более длительное время удерживания, соединение 9-В (0,68 мг, 0,63 мкмоль) растворяли в 0,10 мл ДМСО, и затем добавляли к 0,75 мл вышеуказанного раствора. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-6 формулы FADC-4B (1,78 мг/мл, 1,78 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=3,94.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,173 мл, 1,73 мкмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Пертузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 5,0 мл, 10 мг/мл, 0,338 мкмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл. 1,0 мл раствора отбирали для следующей реакции.

Соединение 8 (0,65 мг, 0,6 мкмоль) растворяли в 0,1 мл ДМСО, и затем добавляли к 1,0 мл вышеуказанного раствора. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-7 формулы FADC-7 (1,42 мг/мл, 2,15 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=6,91.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,173 мл, 1,73 мкмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Пертузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 5,0 мл, 10 мг/мл, 0,338 мкмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл. 1,6 мл раствора отбирали для следующей реакции.

Соединение 10, которое имеет более корокое время удерживания (1,04 мг, 1,0 мкмоль) растворяли в 0,1 мл ДМСО, и затем добавляли к 1,6 мл вышеуказанного раствора. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-8 формулы FADC-8 (2,14 мг/мл, 2,31 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=6,58.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 мМ, 0,173 мл, 1,73 мкмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Пертузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 5,0 мл, 10 мг/мл, 0,338 мкмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане и разбавляли до 5,0 мг/мл. 0,8 мл раствора отбирали для следующей реакции.

Соединение 9, имеющее более короткое время удерживания, соединение 9-А (0,55 мг, 0,5 мкмоль) растворяли в 0,1 мл ДМСО, и затем добавляли к 0,8 мл вышеуказанного раствора. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-9 формулы FADC-9A (2,27 мг/мл, 1,11 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью УФ-ВЭЖХ: n=3,16.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 19,76 мл, 197,6 мкмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,574 мг/мл, 38,78 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 14, которое имеет более корокое время удерживания (0,64 мг, 588 нмоль) растворяли в 40 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-10 формулы FADC-10 (5,48 мг/мл, 1,03 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=6,25.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 22,24 мл, 222,4 мкмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,646 мг/мл, 43,64 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 14, соединение, имеющее более длительное время удерживания (0,72 мг, 662 нмоль), растворяли в 40 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-11 формулы FADC-10 (2,13 мг/мл, 1,87 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=7,03.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 25,0 мкл, 250,0 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,726 мл, 49,05 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 15 (0,81 мг, 754 нмоль) растворяли в 40 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-12 формулы FADC-12 (3,34 мг/мл, 1,45 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=6,93.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 9,88 мкл, 98,8 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,287 мл, 19,39 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 16 (0,32 мг, 294 нмоль) растворяли в 20 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-13 формулы FADC-13 (2,37 мг/мл, 0,88 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=6,53.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 20,38 мкл, 203,8 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,592 мл, 40,0 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 17 (0,92 мг, 598 нмоль) растворяли в 40 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-14 формулы FADC-14 (0,30 мг/мл, 12,0 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=7,61.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 20,38 мкл, 203,8 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,592 мл, 40,0 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 18 (0,93 мг, 599 нмоль) растворяли в 40 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-15 формулы FADC-15 (0,32 мг/мл, 11,8 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=7,89.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 18,25 мкл, 182,5 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,53 мл, 35,8 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 19 (0,83 мг, 534 нмоль) растворяли в 35 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-16 формулы FADC-16 (0,32 мг/мл, 12,0 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=7,43.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 43,2 мкл, 432 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 2,0 мл, 135,12 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9, имеющее более короткое время удерживания, соединение 9-А (2,22 мг, 2067 нмоль) растворяли в 175 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-17 формулы FADC-4A (1,32 мг/мл, 12,0 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=5,42.

Пример 38ADC-18 (эталонный пример)

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 51,7 мкл, 517 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 1,5 мл, 101,3 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (2,0 мг, 1934 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-18 формулы FADC-18 (0,79 мг/мл, 13,0 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=7,23.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 46,9 мкл, 469 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 1,36 мл, 91,9 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9, имеющее более короткое время удерживания, соединение 9-А (2,0 мг, 1862 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-19 формулы FADC-4A (0,73 мг/мл, 13,0 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=6,26.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 51,7 мкл, 517 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 1,5 мл, 101,3 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 10, соединение, имеющее более длительное время удерживания (2,0 мг, 1815 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-20 формулы FADC-1 (0,73 мг/мл, 13,0 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=7,43.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 63,9 мкл, 639 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 1,86 мл, 125,4 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (2,07 мг, 2001 нмоль) растворяли в 150 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-21 формулы FADC-18 (2,91 мг/мл, 4,44 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=7,23.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 64,9 мкл, 649 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 1,88 мл, 127,2 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9, имеющее более короткое время удерживания, соединение 9-А (2,1 мг, 1955 нмоль) растворяли в 150 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-22 формулы FADC-4A (3,56 мг/мл, 3,98 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=6,79.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 11,89 мл, 118,9 мкмоль)добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 345 мл, 23,31 мкмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3,5 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (362 мг, 350 мкмоль) растворяли в 7,12 мл MeCN и 3,56 мл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали на установке для ультрафильтрации забуференным PBS водным раствором, содержащим 2% (об./об.) MeCN и 1% (об./об.) ДМСО (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5) и водным раствором, забуференным янтарной кислотой (0,01 М водный раствор, забуференный янтарной кислотой, с рН=5,3) Сахарозу добавляли до 60 мг/мл, и Твин 20 добавляли до 0,2 мг/мл. Раствор поместили в бутылки и лиофилизировали с получением образца лиофилизированного порошка иллюстративного продукта ADC-23 формулы FADC-18, который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=7,05.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 11,44 мл, 114,4 мкмоль)добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела Трастузумаба (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 332 мл, 22,43 мкмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3,5 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9, имеющее более короткое время удерживания, соединение 9-А (241 мг, 224 мкмоль) растворяли в 13,76 мл MeCN и 6,88 мл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали на установке для ультрафильтрации забуференным PBS водным раствором, содержащим 4% (об./об.) MeCN и 2% (об./об.) ДМСО (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5) и водным раствором, забуференным янтарной кислотой (0,01 М водный раствор, забуференный янтарной кислотой, с рН=5,3) Сахарозу добавляли до 60 мг/мл, и Твин 20 добавляли до 0,2 мг/мл. Раствор поместили в бутылки и лиофилизировали с получением образца лиофилизированного порошка иллюстративного продукта ADC-24 формулы FADC-4A, который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=7,07.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 73,7 мкл, 740 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела В7НЗ антитела 1F9DS (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 2,14 мл, 144,60 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9, имеющее более короткое время удерживания, соединение 9-А (3,0 мг, 2793 нмоль) растворяли в 150 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-25 формулы FADC-25 (1,28 мг/мл, 13,0 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=6,87.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 30,1 мкл, 300 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела В7Н3 антитела 1F9DS (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,89 мл, 60,14 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (1,0 мг, 967 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-26 формулы FADC-26 (1,61 мг/мл, 4,0 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=6,15.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 30,1 мкл, 300 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела В7НЗ антитела 1F9DS (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,89 мл, 60,14 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9, имеющее более короткое время удерживания, соединение 9-А (1,02 мг, 950 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-27 формулы FADC-25 (1,94 мг/мл, 3,5 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=6,11.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 81,3 мкл, 810 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела В7Н3 антитела 1F9DS (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 2,36 мл, 159,47 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (3,0 мг, 2901 нмоль) растворяли в 150 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-28 формулы FADC-26 (1,29 мг/мл, 13,0 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=7,46.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 28,6 мкл, 290 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела В7НЗ антитела 1F9DS (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,80 мл, 50,06 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 9, имеющее более короткое время удерживания, соединение 9-А (1,29 мг, 1201 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-29 формулы FADC-25 (2,63 мг/мл, 2,4 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=7,24.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 29,1 мкл, 290 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела В7Н3 антитела 1F9DS (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,86 мл, 58,4 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 20 (1,0 мг, 967 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-30 формулы FADC-26 (1,61 мг/мл, 4,0 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=6,15.

Приготовленный водный раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) (10 мМ, 30,1 мкл, 300 нмоль) добавляли к забуференному PBS водному раствору антитела В7НЗ антитела 1F9DS (0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5; 10,0 мг/мл, 0,89 мл, 60,14 нмоль) при 37°С. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 37°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане.

Соединение 8 (1,0 мг, 943 нмоль) растворяли в 100 мкл ДМСО, и затем добавляли к вышеуказанному реакционному раствору. Реакционный раствор помещали в шейкер с водяной баней, и встряхивали при 25°С в течение 3 часов перед остановкой реакции. Реакционный раствор обессоливали и очищали с помощью гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 М забуференный PBS водный раствор с рН=6,5, содержащий 0,001 М ЭДТА) с получением забуференного PBS раствора иллюстративного продукта ADC-31 формулы FADC-31 (1,47 мг/мл, 4,5 мл), который хранили при 4°С.

Среднее значение, рассчитанное с помощью UV-Vis: n=6,33.

Анализ загрузки лекарственным средством в исходном растворе ADC Экспериментальная цель и принцип

Исходный раствор ADC представляет собой разновидность лекарственного средства, конъюгированного с антителами. Его механизм лечения заболевания заключается в доставке молекул токсина в клетки путем нацеливания антитела, тем самым убивая клетки. Загрузка лекарственным средством играет решающую роль для эффективности лекарственного средства. Загрузку лекарственным средством в исходном растворе ADC определяли способом с применением ультрафиолета.

Способ проведения эксперимента

Кювету, содержащую буфер сукцината натрия, помещали в контрольную ячейку для измерения поглощения и в ячейку для измерения поглощения для измерения образца соответственно. После вычитания холостого опыта кювету, содержащую тестируемый раствор, помещали в ячейку для измерения поглощения образца, и оптическую плотность измеряли при 280 нм и 370 нм.

Расчет результатов: Загрузку лекарственным средством в исходном растворе ADC определяли с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии (прибор: ультрафиолетовый спектрофотометр Thermo nanodrop2000). Его принцип заключается в том, что общая абсорбция исходного раствора ADC на определенной длине волны равна сумме абсорбции цитотоксического препарата и абсорбции моноклонального антитела на этой длине волны, то есть:

εDrug-280: среднее значение молярного коэффициента поглощения лекарственного средства при 280 нм составляет 5100;

Слекарств.средства: концентрация лекарственного средства;

εmab-280: среднее значение молярного коэффициента поглощения исходного раствора трастузумаба или исходного раствора пертузумаба при 280 нм составляет 214600;

Cmab: концентрация исходного раствора трастузумаба или исходного раствора пертузумаба;

b: длина оптического пути составляет 1 см.

Таким же образом можно получить уравнение полного поглощения образца при 370 нм:

εDrug-370: среднее значение молярного коэффициента поглощения лекарственного средства при 370 нм составляет 19000;

Слекарств.средства: концентрация лекарственного средства;

εmab-370: среднее значение молярного коэффициента поглощения исходного раствора трастузумаба или исходного раствора пертузумаба при 370 нм составяет 0;

Cmab: концентрация исходного раствора трастузумаба;

b: длина оптического пути составляет 1 см.

Загрузку лекарственным средством можно рассчитать с помощью двух уравнений (1) и (2) в комбинации с коэффициентом экстинкции и данными концентрации моноклонального антитела и лекарственного средства на двух длинах волн обнаружения.

Загрузка лекарственным средством = Слекарств.средства/Cmab.

Биологический анализ

Пример испытания 1: In vitro испытание ингибирования пролиферации опухолевых клеток соединением формулы (D)

I. Задача испытания

Задачей данного испытания является проверка in vitro ингибирующего эффекта лекарственного соединения формулы (D) согласно настоящему изобретению на пролиферацию клеток U87MG (банк клеток Китайской академии наук, каталожный №TCHu138) и опухолевых клеток SK-BR-3 (клетки рака молочной железы человека, АТСС, арт. № НТВ-30). Клетки обрабатывали различными концентрациями соединения in vitro. После 6 дней культивирования пролиферацию клеток определяли с помощью реагента CTG (люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®, Promega, арт.номер: G7573), и активность соединения in vitro оценивали в соответствии со значением IC50.

II. Способ проведения испытания

Способ проведения испытания для проверки ингибирования пролиферации in vitro настоящими соединениями на опухолевых клетках описан ниже на примере способа испытания ингибирования пролиферации in vitro на клетках U87MG. Данный способ также применим, но не ограничивается ими, к испытаниям ингибирования пролиферации in vitro на других опухолевых клетках.

1. Культивирование клеток: Клетки U87MG и клетки SK-BR-3 культивировали в среде ЕМЕМ, содержащей 10% FBS (GE, арт.номер SH30024.01), и среде McCoy 5А, содержащей 10% FBS (Gibco, арт.номер 16600-108), соответственно.

2. Подготовка клеток: Клетки U87MG и SK-BR-3 в фазе логарифмического роста промывали один раз посредством PBS (фосфатный буфер, Shanghai Basal Media Technologies Co., Ltd.), а затем добавляли 2-3 мл трипсина (0,25% Трипсин-ЭДТА (1×), Gibico, Life Technologies) для гидролиза в течение 2-3 мин. После полного гидролиза клеток добавляли 10-15 мл среды для культивирования клеток. Расщепленные клетки элюировали и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отбрасывали, и добавляли 10-20 мл среды для культивирования клеток для ресуспендирования клеток с получением суспензии отдельных клеток.

3. Посев клеток: моносуспензии клеток U87MG и SK-BR-3 хорошо перемешивали, и плотность клеток доводили до 2,75 × 103 клеток/мл и 8,25 × 103 клеток/мл с помощью среды для культивирования клеток, соответственно. Суспензию клеток с доведенной плотностью хорошо перемешивали и добавляли в 96-луночный планшет для культивирования клеток в количестве 180 мкл/лунку. 200 мкл культуральной среды добавляли в периферические лунки 96-луночного планшета. Планшет инкубировали в инкубаторе в течение 24 часов (37°С, 5% CO2).

4. Состав соединения: соединение растворяли в ДМСО (диметилсульфоксид, Shanghai Titan Technology Co., Ltd.) с получением исходного раствора с начальной концентрацией 10 мМ.

Начальная концентрация низкомолекулярного соединения составляла 500 нМ, и способ приготовления представлял собой следующий.

30 мкл различных испытуемых образцов соответственно добавляли в первую колонку 96-луночного планшета с U-образным дном для приготовления препарата с концентрацией образца 100 мкМ. В каждую лунку со второй по 11-ю колонку добавляли 20 мкл ДМСО. 10 мкл образца из первой колонки добавляли к 20 мкл ДМСО во второй колонке и хорошо перемешивали, из которых отбирали 10 мкл и добавляли в третью колонку, и так далее до 10-й колонки. 5 мкл лекарственного средства из каждой лунки планшета для приготовления препарата добавляли к 95 мкл культуральной среды ЕМЕМ и хорошо перемешивали для последующего применения.

Начальная концентрация ADC составляла 10 нМ или 500 нМ, и способ приготовления представлял собой следующий.

В первую колонку 96-луночного планшета соответственно добавляли 100 мкл различных испытуемых образцов с концентрацией образца 100 нМ или 5 мкМ. 100 мкл PBS добавляли в каждую лунку со второй по 11-ю колонку. 50 мкл образца из первой колонки добавляли к 100 мкл PBS во второй колонке и хорошо перемешивали, из которых отбирали 50 мкл и добавляли в третью колонку, и так далее до 10-й колонки с 3-кратным разведением.

5. Содержание образца: 20 мкл приготовленных испытуемых образцов в различных концентрациях добавляли в планшет для культивирования, каждый образец тестировали в двух повторах. Планшет инкубировали в инкубаторе в течение 6 дней (37°С, 5% CO2).

6. Процедура окрашивания: вынимали 96-луночный планшет для культивирования клеток, добавляли 90 мкл раствора CTG в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут.

7. Считывание планшета: вынимали 96-луночный планшет для культивирования клеток и помещали в считывающее устройство для микропланшетов (BMG labtech, PHERAstar FS) для измерения хемилюминесценции.

III. Анализ данных

Данные были проанализированы с помощью Microsoft Excel и Graphpad Prism 5. Результаты показаны в следующей таблице.

Таблица 1. Величина IC50 ингибирования in vitro низкомолекулярных фрагментов согласно настоящему изобретению в отношении пролиферации клеток SK-BR-3 и клеток U87

Вывод: Низкомолекулярный фрагмент согласно настоящему изобретению обладает очевидной ингибирующей активностью в отношении пролиферации клеток SK-BR-3 и клеток U87, а хиральный центр оказывает определенное влияние на ингибирующую активность соединения.

Пример испытания 2: in vitro испытание ингибирования пролиферации опухолевых клеток конъюгатом антитело-лекарственное средство согласно настоящему изобретению, нацеленным на HER2

Задачей данного испытания является проверка in vitro ингибирующего эффекта конъюгата антитело-лекарственное средство согласно настоящему изобретению, нацеленного на HER2, на пролиферацию клеток SK-BR-3 (клетки рака молочной железы человека, АТСС, арт.номер НТВ-30) и клеток MDA-MB-468 (клетки рака молочной железы человека, АТСС, арт.номер НТВ-132). Клетки обрабатывали различными концентрациями соединений in vitro. После 6 дней культивирования пролиферацию клеток определяли с помощью реагента CTG, и активность соединений in vitro оценивали в соответствии со значением IC50.

В соответствии со способом проведения испытания в примере испытания 1 испытуемые клетки представляли собой клетки SK-BR-3 и клетки MDA-MB-468, и в качестве среды для культивирования клеток применяли среду McCoy 5А, содержащую 10% FBS (Gibco, ар. номер 16600-108), среду ЕМЕМ, содержащую 10% FBS (GE, арт.номер SH30024.01) и среду L-15, содержащую 10% FBS (ThermoFisher, арт.номер 11415-114). Плотность жизнеспособных клеток трех клеточных линий доводили до 8,33 × 103 клеток/мл, 8,33 × 103 клеток/мл и 1,39 × 104 клеток/мл с помощью среды для культивирования клеток, соответственно. Суспензию клеток с доведенной плотностью хорошо перемешивали и добавляли в 96-луночный планшет для культивирования клеток в количестве 180 мкл/лунку. Родственные соединения были испытаны, и результаты показаны в таблице ниже.

Таблица 2. Значение IC50 in vitro ингибирования пролиферации опухолевых клеток конъюгатом антитело-лекарственное средство согласно настоящему изобретению, нацеленным на HER2

Заключение: конъюгат HER2-нацеленное антитело-лекарственное средство согласно настоящему изобретению обладает очевидной ингибирующей активностью в отношении пролиферации HER2-положительных клеток SK-BR-3. Между тем он обладает слабой ингибирующей активностью в отношении пролиферации HER2-отрицательных клеток MDA-MB-468. Следовательно, он обладает хорошей селективностью.

Пример испытания 3: Тест стабильности в плазме Her2-ADC

Образец ADC-19, образец ADC-18, образец ADC-20, плазма человека, плазма обезьяны (Shanghai Medicilon Inc.) и 1% раствор BSA (Sigma) PBS (Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.) были соответственно отфильтрованы через фильтр 0,22 мкм для стерилизации. ADC-19, ADC-18 и ADC-20 добавляли к указанной выше стерильной плазме или 1% раствору BSA PBS до конечной концентрации 200 мкг/мл соответственно, которую затем инкубировали в инкубаторе для клеток при 37°С, и день начала инкубации регистрировали как день 0. Образцы собирали в день 7, день 14 и день 21 для детекции свободного токсина.

25 мкл образца добавляли в 96-луночный планшет. Добавляли 50 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта (100 нг/мл камптотецина в ацетонитриле) и 150 мкл ацетонитрила. Раствор встряхивали в течение 5 минут и центрифугировали в течение 10 минут (4000 об/мин). Отбирали 5 мкл раствора для анализа ЖХ/МС/МС (Applied Biosystems, Inc., США).

Результаты показывают, что ADC-19 является достаточно стабильным в плазме человека, плазме обезьяны и 1% растворе BSA PBS. Скорость высвобождения свободного токсина не превышала 2,1% и стала стабильной на 14-й день. Результаты показаны на Фигуре 1А.

ADC-18 имеет низкую стабильность в плазме человека и плазме обезьяны, а максимальная скорость высвобождения свободного токсина составила 14,5% и 8,10% соответственно. Он является стабильным в 1% растворе BSA PBS. Результаты показаны на Фигуре 1 В.

ADC-20 имеет низкую стабильность в плазме человека, плазме обезьяны и 1% растворе BSA PBS, а самая высокая скорость высвобождения свободного токсина составила 21,7%, 29,7% и 21,7% соответственно. Он всегда находился в состоянии разложения в 1% растворе BSA PBS. Результаты показаны на Фигуре 1С. Результаты показаны на Фигуре 1С.

Пример испытания 4: Оценка эффективности на мышах с опухолью JIMT-1 I. Задача испытания

Голых мышей Nunu использовали в качестве испытуемых животных для оценки эффективности Her2-ADC антител T-DM1, ADC-21 и ADC-24 в отношении голых мышей с опухолью, полученной трансплантацией устойчивых к трастузумабу (герцептину) клеток рака молочной железы человека JIMT-1, после внутрибрюшинной инъекции.

II. Испытуемые лекарственные средства и материалы

1. Испытуемые лекарственные средства

T-DM1 (получен согласно заявке на патент US 20050169933)

ADC-21:3 мг/кг

ADC-21:10 мг/кг

ADC-24:3 мг/кг

ADC-24:10 мг/кг

Холостой: PBS

2. Способ приготовления: все лекарственные средства были разбавлены и приготовлены с PBS.

3. Испытуемые животные

Голые мыши Nunu, приобретенные в лаборатории Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.

III. Способ проведения испытания

Клетки JIMT-1 (Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd.) (5 × 106 клеток/мышь, с содержанием матригеля 50%) инокулировали подкожно в правое ребро мыши. После роста опухоли в течение 8 дней и достижения размера 203,09±11,94 мм3, животных случайным образом разделили на 6 групп по 8 животных в группе (d1).

Лекарственные средства вводили внутрибрюшинно всего 2 раза. Объем опухоли и массу тела измеряли два раза в неделю, и данные регистрировали.

Для статистики данных использовали статистическое программное обеспечение Excel 2003: среднее значение рассчитывали как avg; значение SD рассчитывали как STDEV; значение SEM рассчитывали как STDEV/SQRT; значение Р между разными группами рассчитывали как TTEST.

Объем опухоли (V) рассчитывали по формуле: V=1/2×Llength×Lshort2

Относительный объем (RTV)=VT/V0

Степень ингибирования опухоли (%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%),

где V0 и VT представляют объем опухоли в начале испытания и в конце испытания соответственно. CRTV и TRTV представляют собой относительный объем опухоли холостой контрольной группы (носитель, PBS) и испытуемой группы в конце испытания, соответственно.

IV. Результаты испытания

Результаты испытания показаны на Фигуре 2. Лекарственные средства вводили внутрибрюшинно 2 раза, и испытание завершали на 34 день наблюдения. T-DM1 (10 мг/кг) не оказывает ингибирующего действия на опухоль; ADC-21 (3 мг/кг) демонстрирует степень ингибирования опухоли 46,22% (Р<0,01); ADC-21 (10 мг/кг) демонстрирует степень ингибирования опухоли 56,77% (Р<0,001); ADC-24 (3 мг/кг) демонстрирует степень ингибирования опухоли 62,77% (Р<0,001); и ADC-24 (10 мг/кг) демонстрирует степень ингибирования опухоли 76,32% (Р<0,001). При той же дозе эффект ингибирования опухоли ADC-24 значительно лучше, чем у ADC-21.

Пример испытания 5: Оценка эффективности на мышах с опухолью SK-BR-3

I. Задача испытания

Голых мышей Nunu использовали в качестве испытуемых животных для оценки эффективности Her2-ADC антител ADC-21 и ADC-24 в отношении голых мышей с опухолью, полученной трансплантацией клеток рака молочной железы человека SK-BR-3, после внутрибрюшинной инъекции.

II. Испытуемые лекарственные средства и материалы

1. Испытуемые лекарственные средства

ADC-21:1 мг/кг

ADC-21:6 мг/кг

ADC-22:1 мг/кг

ADC-22:6 мг/кг

Холостой: PBS

2. Способ приготовления: все лекарственные средства были разбавлены и приготовлены с PBS.

3. Испытуемые животные

Голые мыши Nunu, приобретенные в лаборатории Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.

III. Способ проведения испытания

Клетки SK-BR-3 (АТСС) (5 × 106 клеток/мышь, с содержанием матригеля 50%) инокулировали подкожно в правое ребро мыши. После роста опухоли в течение 20 дней и достижения размера 153,34±11,73 мм3, животных случайным образом разделили на 5 групп по 8 животных в группе (d0).

Лекарственные средства вводили путем внутрибрюшинной инъекции однократно. Объем опухоли и массу тела измеряли два раза в неделю, и данные записывали.

Для статистики данных использовали статистическое программное обеспечение Excel 2003: среднее значение рассчитывали как avg; значение SD рассчитывали как STDEV; значение SEM рассчитывали как STDEV/SQRT; значение Р между разными группами рассчитывали как TTEST.

Объем опухоли (V) рассчитывали по формуле: V=1/2×Llength×Lshort2

Относительный объем (RTV)=VT/V0

Степень ингибирования опухоли (%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%),

где V0 и VT представляют объем опухоли в начале испытания и в конце испытания соответственно. CRTV и TRTV представляют собой относительный объем опухоли холостой контрольной группы и испытуемой группы в конце испытания, соответственно.

IV. Результаты испытания

Результаты испытания показаны на Фигуре 3. Лекарственные средства вводили путем внутрибрюшинной инъекции однократно, и испытание завершали на 28 день наблюдения. ADC-21 (1 мг/кг) демонстрирует степень ингибирования опухоли 15,01%; и ADC-21 (6 мг/кг) демонстрирует степень ингибирования опухоли 77,4%, что значительно отличается от таковой для холостого контроля (Р <0,001). ADC-22 (1 мг/кг) демонстрирует степень ингибирования опухоли 19,82%; и ADC-22 (6 мг/кг) демонстрирует степень ингибирования опухоли 98,38% (Р <0,001). При той же дозе 6 мг/кг эффект ингибирования опухоли для ADC-22 значительно лучше, чем эффект для ADC-21.

Пример испытания 6: Испытание стабильности в плазме

Образец ADC-25 хорошо перемешивали с плазмой человека, плазмой обезьян и 1% раствором BSA PBS соответственно до конечной концентрации 100 мкг/мл и фильтровали для стерилизации. Смесь инкубировали на водяной бане при 37°С, и день начала инкубации регистрировали как день 0. Образцы собирали в день 7, день 14 и день 21 для детекции свободного токсина.

Образцы, собранные в разные моменты времени, охлаждали до комнатной температуры и хорошо перемешивали на вортексе. 25 мкл образца добавляли в 96-луночный планшет. Добавляли 50 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта (100 нг/мл камптотецина в ацетонитриле) и 150 мкл ацетонитрила. Раствор встряхивали в течение 5 минут и центрифугировали в течение 10 минут (4000 об/мин). Отбирали 5 мкл раствора для анализа ЖХ/МС/МС.

Результаты показаны на Фигуре 4 ADC-25 является достаточно стабильным в плазме человека, плазме обезьяны и 1% растворе BSA PBS. Скорость высвобождения свободного токсина не превышала 2% и стала стабильной на 14-й день.

Пример испытания 7: Оценка эффективности ADC на голых мышах с ксенотрансплантатом опухоли астробластомы головного мозга человека U87MG

I. Задача испытания

Голых мышей BALB/cA-nude использовали в качестве испытуемых животных для оценки эффективности соединения ADC согласно настоящему изобретению в отношении ксенотрансплантата опухоли астробластомы головного мозга человека U87MG у голых мышей.

II. Испытуемые лекарственные средства и материалы

1. Испытуемые лекарственные средства

ADC-27 (3 мг/кг)

ADC-26 (3 мг/кг)

Холостой: PBS буферный раствор (рН 7,4)

2. Способ приготовления: PBS буферный раствор (рН 7,4).

3. Испытуемые животные

Голые мыши BALB/cA-nude, приобретенные в Shanghai JieSiJie Laboratory Animal Co., Ltd.

III. Способ проведения испытания

Для испытания применяли голых мышей BALB/cA-nude (самки, возраст от 6 до 7 недель). Клетки U87MG астробластомы головного мозга человека (астробластома головного мозга человека, банк клеток Китайской академии наук, каталожный номер №ТСНи138) инокулировали подкожно. На 10 день после инокуляции животных случайным образом группировали по 8 животных на группу (DO), и лекарственные средства вводили внутрибрюшинной инъекцией один раз в неделю 3 раза. Объем опухоли и массу тела измеряли от 2 до 3 раз в неделю, и данные записывали. Формула расчета объема опухоли (V) представляет собой следующую:

V=1/2×a×b2

где а и b представляют собой длину и ширину, соответственно.

Относительный объем (RTV)=VT/V0

Степень ингибирования опухоли (%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)

где V0 и VT представляют объем опухоли в начале испытания и в конце испытания соответственно. CRTV и TRTV представляют собой относительный объем опухоли контрольной группы (холостая) и испытуемой группы в конце испытания, соответственно.

IV. Результаты испытания

Внутрибрюшинное введение (i.p.) проводили 1 раз в неделю 3 раза. На 22 день наблюдения степень ингибирования опухоли для ADC-27 (3 мг/кг) достигла 63,3% (Р <0,0001); и степень ингибирования опухоли для ADC-26 (3 мг/кг) достигла 49,1%. ADC-27 демонстрирует более сильную противоопухолевую эффективность, чем ADC-26.

Во время введения животные в каждой группе демонстрируют нормальную массу тела, что позволяет предположить, что ADC не имеет явных побочных эффектов. Результаты испытания показаны в таблице 3 и на Фигуре 5. Испытуемые антитела могут эффективно ингибировать рост ксенотрансплантата опухоли U87MG у голых мышей с опухолью и проявлять дозозависимый характер.

Пример испытания 8: Эффективность оценки ADC на голых мышах с ксенотрансплантатом опухоли метастатических клеток плевральной жидкости карциномы пищевода человека Detroit 562.

I. Задача испытания

Голых мышей BALB/cA-nude использовали в качестве испытуемых животных для оценки эффективности соединения ADC согласно настоящему изобретению в отношении ксенотрансплантата опухоли метастатических клеток плевральной жидкости карциномы пищевода человека Detroit 562 у голых мышей.

II. Испытуемые лекарственные средства и материалы 1.

Испытуемые лекарственные средства

ADC-29 (3 мг/кг)

ADC-28 (3 мг/кг)

Отрицательный контроль ADC (3 мг/кг): конъюгат лиганд-токсин, образованный путем связывания мишени, не являющейся В7Н3, с соединением 20.

2. Способ приготовления: все лекарственные средства были разбавлены и приготовлены с PBS.

3. Испытуемые животные

Голые мыши BALB/cA-nude, приобретенные в Changzhou Cavens Laboratory Animal Co.,Ltd.

III. Способ проведения испытания

Для испытания применяли голых мышей BALB/cA-nude (самки, возраст от 6 до 7 недель). Метастатические клетки плевральной жидкости карциномы пищевода человека Detroit 562 (АТСС, каталожный номер #АТСС® CCL-138™) инокулировали подкожно. На 10 день после инокуляции животных случайным образом группировали по 8 животных на группу (DO), и лекарственные средства вводили внутрибрюшинной инъекцией один раз в неделю 3 раза. Объем опухоли и массу тела измеряли от 2 до 3 раз в неделю, и данные записывали. Формула расчета объема опухоли (V) представляет собой следующую:

V=1/2×a×b2

где а и b представляют собой длину и ширину, соответственно.

Относительный объем (RTV)=VT/V0

Степень ингибирования опухоли (%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)

где V0 и VT собой представляют объем опухоли в начале испытания и в конце испытания соответственно. CRTV и TRTV представляют собой относительный объем опухоли контрольной группы (отрицательный контроль) и испытуемой группы в конце испытания, соответственно.

IV. Результаты испытания

Внутрибрюшинное введение проводили 1 раз в неделю 3 раза. На 28 день наблюдения степень ингибирования опухоли для ADC-29 (3 мг/кг, 3mрк) достигла 72,27% (Р <0,001); и степень ингибирования опухоли для ADC-28 (3 мг/кг, 3mрк) достигла 56,2% (Р <0,001). ADC-29 демонстрирует более сильную противоопухолевую эффективность, чем ADC-28.

Во время введения животные в каждой группе демонстрируют нормальную массу тела, что позволяет предположить, что ADC не имеет явных побочных эффектов. Результаты испытания показаны в таблице 4 и на Фигуре 6. Испытуемые антитела могут эффективно ингибировать рост ксенотрансплантата опухоли Detroit 562 у голых мышей с опухолью и проявлять дозозависимый характер.

Пример испытания 9: Оценка эффективности на мышах с опухолью U87-MG

I. Задача испытания

Голых мышей BALB/c использовали в качестве испытуемых животных для оценки эффективности конъюгата В7Н3-антитело-лекарственное средство, вводимого внутрибрюшинной инъекцией, в модели ксенотрансплантата опухоли клеток глиомы U87MG.

II. Испытуемые лекарственные средства и материалы

1. Испытуемые лекарственные средства

ADC-30 1 мг/кг

ADC-30 3 мг/кг

ADC-31 1 мг/кг

ADC-31 3 мг/кг

Холостой: PBS

2. Способ приготовления: все лекарственные средства были разбавлены и приготовлены с PBS.

3. Испытуемые животные

Голые мыши BALB/cA-nude, приобретенные в Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd.

III. Способ проведения испытания

Клетки U87MG (астробластома головного мозга человека, банк клеток Китайской академии наук, каталожный номер №TCHu138) (2,5×106 клеток/мышь) инокулировали подкожно в правое ребро мыши. После роста опухоли в течение 14 дней и достижения размера 167,49 мм3, животных случайным образом разделили на 5 групп по 8 животных в группе (d1).

Лекарственные средства вводили посредством внутрибрюшинной инъекции один раз в неделю всего 3 раза. Объем опухоли и массу тела измеряли два раза в неделю, и данные записывали.

Для статистики данных использовали статистическое программное обеспечение Excel 2003: среднее значение рассчитывали как avg; значение SD рассчитывали как STDEV; значение SEM рассчитывали как STDEV/SQRT; значение Р между разными группами рассчитывали как TTEST.

Объем опухоли (V) рассчитывали по формуле: V=1/2×Llength×Lshort2

Относительный объем (RTV)=VT/V0

Степень ингибирования опухоли (%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)

где V0 и VT представляют собой объем опухоли в начале испытания и в конце испытания соответственно. CRTV и TRTV представляют собой относительный объем опухоли холостой контрольной группы (носитель) и испытуемой группы в конце испытания, соответственно.

IV. Результаты испытания

Результаты испытания показаны на Фигуре 7. Внутрибрюшинное введение проводили 1 раз в неделю всего 3 раза. На 18 день наблюдения степень ингибирования опухоли для ADC-30 (1 мг/кг) достигла 0,31%; степень ингибирования опухоли для ADC-30 (3 мг/кг) достигла 45,23% (Р <0,0001); степень ингибирования опухоли для ADC-31 (1 мг/кг) достигла 39,22% (Р <0,01); и степень ингибирования опухоли для ADC-31 (3 мг/кг) достигла 80,24% (Р <0,0001). При той же дозе эффект ингибирования опухоли для ADC-31 значительно лучше, чем для ADC-30.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD.

SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.

<120> КОНЪЮГАТ ЛИГАНД-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО АНАЛОГА ЭКЗАТЕКАНА,

СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Цепь

<223> Легкая цепь Трастузумаба

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 2

<211> 450

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Цепь

<223> Тяжелая цепь Трастузумаба

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 3

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Цепь

<223> Легкая цепь Пертузумаба

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 4

<211> 449

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Цепь

<223> Тяжелая цепь Пертузумаба

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 5

<211> 215

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Цепь

<223> Легкая цепь B7H3 антитела 1F9DS

<400> 5

Asp Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

His Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Met

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Ile His Val Asp Arg

85 90 95

Asp Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys

210 215

<210> 6

<211> 449

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Цепь

<223> Тяжелая цепь B7H3 антитела 1F9DS

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Arg Leu Tyr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<---

1. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль, где указанный конъюгат лиганд-лекарственное средство содержит структуру формулы (Pc-L-Y-Dr):

,

где:

Y представляет собой -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-;

Ra и Rb представляют собой атом водорода;

R1 представляет собой C3-6 циклоалкил или C3-6 циклоалкил-C1-6 алкил;

R2 представляет собой атом водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C3-6 циклоалкил;

m составляет 0 или 1;

n составляет от 1 до 10, которое может представлять собой целое или десятичное число;

Pc представляет собой антитело; и

L представляет собой линкерное звено.

2. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль, по п.1, в котором Y выбран из группы, состоящей из

3. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-2, в котором концевой О в Y присоединен к линкерному звену L.

4. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, который представляет собой конъюгат лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-L-D1) или его фармацевтически приемлемую соль:

,

где R1 представляет собой С3-6 циклоалкил-С1-6 алкил или С3-6 циклоалкил;

R2 представляет собой атом водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-6 циклоалкил;

m составляет 0 или 1;

n составляет от 1 до 10, которое может представлять собой целое или десятичное число;

Рс представляет собой антитело; и

L представляет собой линкерное звено.

5. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-4, в котором n составляет от 2 до 8, которое может представлять собой целое или десятичное число.

6. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по п. 5, в котором n составляет от 3 до 8, которое может представлять собой целое или десятичное число.

7. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-6, в котором линкерное звено -L- представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где

L1 представляет собой -(сукцинимид-3-ил-N)-W-С(O)-, где W выбран из группы, состоящей из C1-8 алкила и C1-8 алкил-C3-6 циклоалкила;

L2 выбран из группы, состоящей из -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)- и химической связи, где р1 представляет собой целое число от 6 до 12;

L3 представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, выбранных из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты;

L4 представляет собой -NR5(CR6R7)t-,

R4 и R5 представляют собой атом водорода;

R6 и R7 представляют собой атом водорода;

t составляет 1 или 2.

8. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по п. 7, в котором L1 выбран из группы, состоящей из -(сукцинимид-3-ил-N)-(СН2)s1-С(O)- и -(сукцинимид-3-ил-N)-СН2-циклогексил-С(O)-, где s1 представляет собой целое число от 2 до 8.

9. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по п. 7 или 8, в котором L2 представляет собой химическую связь.

10. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 7-9, в котором L3 представляет собой тетрапептидный остаток.

11. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по п.10, в котором L3 представляет собой тетрапептидный остаток глицин-глицин-фенилаланин-глицин.

12. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-7, в котором линкерное звено -L- представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где

L1 представляет собой и s1 представляет собой целое число от 2 до 8;

L2 представляет собой химическую связь;

L3 представляет собой тетрапептидный остаток;

L4 представляет собой -NR5(CR6R7)t-, R5, R6 и R7 представляет собой атом водорода, и t составляет 1 или 2.

13. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-7, в котором линкерное звено -L- представляет собой -L1-L2-L3-L4-, где

L1 представляет собой -(сукцинимид-3-ил-N)-СН2-циклогексил-С(O)-;

L2 представляет собой -NR4(CH2CH2O)9CH2C(O)-;

L3 представляет собой тетрапептидный остаток;

L4 представляет собой -NR5(CR6R7)t-, при этом R5, R6 и R7 представляют собой атом водорода, и t составляет 1 или 2.

14. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 7-13, в котором конец L1 линкерного звена -L- соединен с антителом, и конец L4 линкерного звена -L- соединен с Y.

15. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по п. 14, который представляет собой конъюгат лиганд-лекарственное средство формулы (Pc-Lb-Y-Dr) или его фармацевтически приемлемую соль:

где:

s1 представляет собой целое число от 2 до 8;

R1 представляет собой C3-6 циклоалкил-C1-6 алкил или C3-6 циклоалкил;

R2 представляет собой атом водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C3-6 циклоалкил;

m составляет 0 или 1;

n составляет от 1 до 10, которое может представлять собой целое или десятичное число;

R5, R6 и R7 представляют собой атом водорода, и t составляет 1 или 2;

Pc представляет собой антитело.

16. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по п. 15, в котором s1 представляет собой 5.

17. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-16, выбранный из группы, состоящей из:

где:

n составляет от 1 до 10, которое может представлять собой целое или десятичное число;

Pc представляет собой антитело.

18. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-17, в котором Pc представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из химерного антитела, гуманизированного антитела и полностью гуманизированного антитела.

19. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по п. 18, в котором антитело представляет собой анти-HER2 (ErbB2) антитело или анти-B7-H3 антитело.

20. Конъюгат лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-19, выбранный из группы, состоящей из:

где n является таким, как указано в п. 1.

21. Соединение формулы (D1):

или его фармацевтически приемлемая соль,

где:

R1 представляет собой C3-6 циклоалкил-C1-6 алкил или C3-6 циклоалкил;

R2 представляет собой атом водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C3-6 циклоалкил;

m составляет 0 или 1.

22. Соединение формулы (D1) по п. 21, выбранное из группы, состоящей из:

23. Соединение формулы (La-Y-Dr):

или его фармацевтически приемлемая соль,

где:

W выбран из группы, состоящей из C1-8 алкила и C1-8 алкил-C3-6 циклоалкила;

L2 выбран из группы, состоящей из -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)- и химической связи, где p1 представляет собой целое число от 1 до 20;

L3 представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, выбранных из группы, состоящей из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты;

R1 представляет собой C3-6 циклоалкил или C3-6 циклоалкил-C1-6 алкил;

R2 представляет собой атом водорода;

или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C3-6 циклоалкил;

R4 и R5 представляют собой атом водорода;

R6 и R7 представляют собой атом водорода;

m составляет 0 или 1.

24. Соединение формулы (La-Y-Dr) по п. 23, которое представляет собой соединение формулы (Lb-Y-Dr):

или его фармацевтически приемлемую соль,

где R1, R2, R5~R7 и m являются такими, как определено в п. 23, s1 представляет собой целое число от 2 до 8.

25. Соединение формулы (La-Y-Dr) по п. 23, выбранное из группы, состоящей из:

26. Фармацевтическая композиция для лечения рака, связанного с экспрессией HER2 или B7H3, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгата лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-20, или соединения формулы (D1), или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 21-22, и фармацевтически приемлемый(ые) носитель(и), разбавитель(и) или вспомогательное(ые) вещество(а).

27. Применение конъюгата лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-20, соединения формулы (D1) или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 21-22 или фармацевтической композиции по п. 26 для получения лекарственного средства для лечения рака, связанного с экспрессией HER2 или B7H3.

28. Применение по п. 27, где рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичников, рака шейки матки, рака матки, рака простаты, рака почки, рака уретры, рака мочевого пузыря, рака печени, рака желудка, рака эндометрия, рака слюнных желез, рака пищевода, меланомы, глиомы, нейробластомы, саркомы, рака легкого, рака толстой кишки, рака прямой кишки, колоректального рака, лейкоза, рака костей, рака кожи, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы и лимфомы.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к лечению HER2-положительных видов рака. Предложены способы лечения или замедления прогрессирования HER2-положительного рака у нуждающегося в этом субъекта, включающие назначение субъекту схемы лечения, включающей антитело к HER2, например трастузумаб, и зависимое от Т-клеток биспецифическое (TDB) антитело к HER2.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с CD3 человека и с CD3 яванского макака, и их применение для лечения или профилактики злокачественного новообразования.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая композицию для применения в лечении или предотвращении воспалительного, аутоиммунного или инфекционного заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом (варианты), способ получения композиции (варианты) и способ очистки композиции (варианты).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым биспецифическим антителам, и может быть использовано в медицинской практике. Изобретение раскрывает биспецифическое антитело, специфически связывающееся с поверхностным антигеном CD3 иммунных клеток и антигеном ВСМА на поверхности опухолевых клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных связывающих рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) белков с анкириновыми повторами, и может быть использовано в медицине для лечения HER2 экспрессирующего рака. Предложен рекомбинантный бипаратопный связывающий белок, вызывающий антагонизм передачи сигнала ErbB, который содержит два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении HER2 и два сконструированных домена с анкириновыми повторами со специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение позволяет получить мутантный полипептидный линкер, разработанный из шарнирной последовательности IgG1 с удаленными сайтами гликозилирования.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам на основе рецептора TGF-бета, и может быть использовано в медицине для лечения PD-L1-опосредованной опухоли. Предложен бифункциональный слитый белок, содержащий нацеливающую часть - антитело против PD-L1 и внеклеточный домен TGF-бета RII.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к цитотоксической клетке, представляющей собой макрофаг, которая содержит CAR и аденовирусный компонент Ad5f35, а также к содержащей ее композиции. Также раскрыт способ приготовления указанной цитотоксической клетки, предусматривающий введение CAR в макрофаг с использованием аденовирусного вектора Ad5f35.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ лечения субъекта, представляющего собой человека, имеющего рак, включающий этап введения анти-CD25 антитела субъекту и применение анти-CD25 антитела для лечения солидной опухоли у субъекта, при этом указанное анти-CD25 антитело представляет собой антитело IgG1 человека, которое связывается с высокой аффинностью с по меньшей мере одним активирующим рецептором Fcγ, выбранным из FcγRI, FcγRIIc и FcγRIIIa, и элиминирует инфильтрирующие опухоль регуляторные Т-клетки.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено связывающее HER2 антитело, включающее введенные остатки Cys для сайт-специфического конъюгирования.

Группа изобретений относится к лечению HER2-положительных видов рака. Предложены способы лечения или замедления прогрессирования HER2-положительного рака у нуждающегося в этом субъекта, включающие назначение субъекту схемы лечения, включающей антитело к HER2, например трастузумаб, и зависимое от Т-клеток биспецифическое (TDB) антитело к HER2.
Наверх