Способ получения комплекса физиологически активных веществ из дрожжей
О П И С А Н И Е 302368
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советских
Социалистических
Республик
Зависимое от авт. свидетельст ва №
МПК С 12k 5/00
А Oln 15/00
Заявлено 19.1.1970 (№ 1395929/30-15) с присоединением заявки №
Приоритет
Опубликовано 28.1Ъ .1971. Бюллетень № 15
Дата опубликования описания 07.Х.1971
Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров
СССР
УДК 577.15.072:632. .981 (088,8) Авторы изобретения
С. Н. Московец, A. Г. Коваленко и В. П. Чернецкий
Заявитель
Институт микробиологии и вирусологии им. акад, Д. К. Заболотного
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ДРОЖЖЕЙ
Известен способ получения комплекса физиологически активных веществ, который включает операции освобождения дрожжевых клеток, концентрирования культуральной жидкости и центрифугирования.
С целью получения комплекса, ингибирующего вирус табачной мозаики и Х-вируса картофеля, концентрирование проводят в вакууме, целевой продукт осаждают органическим растворителем, обрабатывают рибонеуклеазой, фенолом, органическим растворителем и подвергают диализу.
Известно, что дрожжи, например Candida
tropiса11э, Candida arborea, продуцируют вещества, ингибирующие активность фитопатогенных вирусов — вирус табачной мозаики и Х-вирус картофеля.
Применение антивирусных веществ совместно с культур альной жидкостью затруднено в связи с необходимостью хранения и транспортировки, а также в связи с низкой концентрацией активного начала в нативны. . биомассах.
Предлагается способ получения комплекса физиологически активных веществ из дрожжей, предпочтительно из дрожжей Candida
tropicalis 3b и Candida arborea КАМ-1, который, заключается в следующем.
Культур альную жидкость, предварительно освобожденную от дрожжевых клеток, концентрируют до 1/10 первоначального объема упариванием (t(45 Ñ) в вакууме, затем центрифугируют при 100000 g в течение 3—
4 час. Осадок отбрасывают, а из надосадочной жидкости вещества осаждают 80%-ным этанолом. Растворенный в воде (1(45 С) осадок обрабатывают вначале рибонуклеазой (30 мкг/и,г в 0,001 М NaC1, 2 час при 25 С), а затем фенолом (1: 1,30 мин) или фенольнохлороформной смесью (9:1). Реакционную смесь центрифугируют при 3000 g в течение
45 — 50 лин, фенольную фазу отбрасывают, а водную диализирую т через целофан против воды не менее 48 час. Из диализата ингибитор два-три раза переосаждают 80%-,ным этанолом. После этого его окончательно осаждают безводным этанолом, промывают этанольно-эфирной смесью (1: 1), эфиром и высушивают в вакууме.
20 В качестве исходного материала для получения ингибитора по предлагаемому способу наряду с культуральными жидкостями может
vcïoëüçoâàòüñÿ также водный экстракт гомогенизированных клеток дрожжей, а также дрожжевой экстракт.
Пример 1. Для выделения ингибитора были взяты культуральные жидкости дрожжей Candida tropicalis 31> и Candida arborea
КАЧ-1, выращенных на солодовом сусле (7
30 по Балингу) при 28 С в течение трех суток.
302368
Таблица
Химический состав антивирусных препаратов, выделенных из дрожжей
1 едуцирующие вещества, %
НуклеиноБелки, Источник получения препаратов вые кисЛОТЫ, после гидролиза до гидролиза
2,2 — 2,7
90,1
3,1
Дрожжевой экстракт
0,18
Candide tr0picali 3b, культуральная жидкость
82,2
2,6 — 2,9
0,25
Candide arborea КАМ-1, культуральна я жидкость
3,9 — 4,3
91,6 1,1
0,26
Таблица 2
Влияние препарата, выделенного из дрожжевого экстракта, на накопление Х-вируса картофеля в растениях табака сорта Самсун 3073 — 1969 г.
Титр Х-вируса в растениях (в некрозах на листьях Gamphrena (globosa) На 15-й день после заражения
На 30-" день после заражения
Варианты опыта процент от контроля процент от контроля опыт контроль опыт контроль
Растения, обработанные иигибитором за один день до заражения, 0,1%
9,6
191
260
73,5
73
130
20,5
То же, за три дня до заражения
То же, за пять дней до заражения
Го же, за семь дней до заражения
Го же, 0 01%
173
75,2
190
26,8
214
88,8
137
36,7
138
100,7
36
44,4
118
120
90,6
Исходный вес сухих веществ этих культуральных жидкостей соответственно составлял
30 и 27 г. По предлагаемому способу из них получено 0,51 и 0,52 г соответственно очищенных препаратов, что составляет 1,7 и
1,9% сухого веса исходного продукта„Воздушно сухие препараты имели вид белых порошков. Их влажность не превышала 9,0—
9,4%. Препараты хорошо растворялись в воде и физиологическом растворе. Седиментационным анализом установлена высокая степень гомогенности полученных препаратов.
Пример 2. Получение вирусного ингибитора из гомогената клеток дрожжей Candide
tropicalis ЗЬ и Candide агЬогеа КАМ-1.
1,54 г дрожжевых клеток, предварительно отмытых от культуральной жидкости физиологическим раствором, растирали в присутствии абразивов и 1 — 2 ял дистиллированной воды. Из полученного гомогената экстрагировали водорастворимые вещества, которые служили исходным материалом для выделения ингибитора по предлагаемому способу. Из этого экстракта вы делено 0,035 г очищенного ингибитора, т. е. 2 3% от веса взятой микробной массы. По внешнему вирду и физическим свойствам эти препараты не отличались от препаратов, полученных аналогичным способом из культуральных жидкостей дрожжей.
Из 27,8 г дрожжевого экстракта по предлагаемому способу получено 1,25 г очищенного препарата ингибитора, т. е. 4,5% от веса исходного продукта. Влажность воздуха сухого препарата 8,8%, цвет — белый или слабокоричневый. По други м показателям этот препарат не отличается от препаратов, вы10 деленных из культур альных жидкостей вышеуказанных видов дрожжей.
Полученные препараты в концентрации
0,001 — 0,1% в опытах in vitro подавляют об15 разование некрозов, вызванных Х-вирусом картофеля и вирусом табачной мозаики на листьях тест-растений Datura stramonium 1. и Datura Metel Z. на 77,5 — 100%. Они обладают также высокой антивирусной активно20 стью при системной инфекции, вь1званной
Х-вирусом картофеля в растениях табака прп профилактическом применении. Антивирусная активность выделенных препаратов примерно в 50 — 1000 раз превышает антивирус25 ную активность исходного м атери ал а.
В табл. 1 приведены сведения о химическом составе получаемых препаратов, а в табл. 2 и 3 результаты их испытаний.
302368
Таблица 3
Подавление инфекционности Х-вируса картофеля исходным материалом и полученными из него препаратами (опыты in vitro) Количество некрозов на 10 — 15 половинках листьев Datura
stramonium
Количество некрозов на 6 — 15 половинках листьев Datura
stramonium
Очищенные препараты исходного материала
Концентрация сухих веществ, Исходный материал концентрация, 00 номера препаратов снижение, контопыт контснижение, опыт роль роль
Дрожжевой экстракт
1
0,1
57
338
100,0
98,1
81,7
612
904
381
96,7
93,7
11,5
13
123
107
0,1
0,01
0,0014
Candide trooicalis ЗЬ, культуральная жидкость
469
207
1
0,1
633
194
61,5
25,8
16
154
82
100,0
93,9
79,2
0,1, 0,01
0,001
C andi de trop ica1is ЗЬ, водный экстракт гомогената клеток
3, 0,1
0,01
О 01
133
0,5
0,05
109
О
16
100,0
88,0
78,3
294
97,6
58,9,О
Candide arborea КАМ-1, культуральная жидкость
302
518
28
0,1
0,001 .
0,01
172
734
693
58,9
23,9
81,3
82,5
77,5
Предмет изобретения
Состаив.ель М. Дранишников
Техред Л. Л. Евдонов Корректор Е. Н. Миронова
Редактор Д, Пинчук
Заказ 2635/16 Изд. № 1134 Тираж 473 Подписное
ЦНИИПИ Комитета по делам изобретешш и открытий при Совете М.шпстров СССР
Москва, >К-35, Раушская нao., д. 4 5
Типография, пр. Сапунова.
Способ получения комплекса физиологически активных веществ из дрожжей, включающий операци1и освобождения от дрожжевых клеток, концентрирования культуральной жидкости или дрожжевого экстракта и центрифугирования, отличающийся тем, что, с целью получения комплекса, ингибирующего вирус табачной мозаики и Х-вируса картофеконцентрирование культуральной 2KHjji